CN103926189A

CN103926189A - 一种基于流式细胞术快速测定富营养化湖泊异养细菌的方法

Info

Publication number: CN103926189A
Application number: CN201410171582.XA
Authority: CN
Inventors: 龚伊; 汤祥明; 高光; 王博雯; 胡洋
Original assignee: Nanjing Institute of Geography and Limnology of CAS
Current assignee: Nanjing Institute of Geography and Limnology of CAS
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2034-04-25
Also published as: CN103926189B

Abstract

本发明的目的是建立一种快速测定浅水湖泊中总异养细菌的方法，是一种基于流式细胞术的细菌计数方法。首先将样品固定、超声、过滤、SYBRGreenⅠ染色，然后通过流式细胞仪来检测异养细菌，采集前向和侧向散射光、SYBRGreenⅠ绿色荧光信号、自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号，其中用SYBRGreenⅠ绿色荧光信号来设置域值。利用前向与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响，而依据SYBRGreenⅠ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开，最后根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而获得异养细菌的准确数量。该方法省时省力，可开展大规模生态学调查，并且增加了细菌计数的精确度及准确性。

Description

一种基于流式细胞术快速测定富营养化湖泊异养细菌的方法

技术领域

本发明属于环境微生物学领域，涉及一种在浅水湖泊中针对异养细菌的检测方法，通过与流式细胞技术相结合，建立一种应用于大型浅水湖泊异养细菌的快速检测方法。

背景技术

异养细菌是湖泊生态系统微食物网的重要组成部分，在湖泊生态系统的生物地球化学循环和能量流动过程中发挥着重要作用。它们不仅分解有机化合物释放能量，而且能利用藻类所无法吸收的DOM,将之转化为POM,进行二次生产，提高湖泊生态系统总的生态效率。因此，对湖泊生态系统中异养细菌的定量成为研究湖泊生态系统的首要任务。

大量文献表明，DAPI荧光显微镜计数方法目前已经成为在浅水湖泊生态系统上通用的细菌计数方法。它主要通过核酸染料DAPI染色，在荧光显微镜下手工镜检计数。该方法计数比较费时费力，精度比流式细胞术要低，因为荧光显微镜系数（视野面积/膜面积）的确定存在较大的不确定性。一般来说，荧光显微镜计数通常取20个视野，每个样品计数的细菌量有限，不能代表整个样品。而且通过荧光显微镜计数需要过膜，细菌在滤膜表面分布很难达到完全的均匀。

目前通过流式细胞术测定异养细菌数目大部分应用于海洋生态系统，尚未有将流式细胞技术应用于湖泊，特别是浅水富营养化湖泊上的相关报道。而由于湖泊水体中存在大量的颗粒和固相物质，包括很多非生物颗粒，细胞碎屑等，它们会对流式细胞仪造成很大的干扰，背景噪音也随之提高，流式细胞仪分析的难度也加大，已有技术无法有效用于富营养化湖泊异养细菌的快速检索，有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明旨在克服针对现有采用荧光显微镜检测浅水富营养化湖泊异养细菌时计数时间长、结果差异较大等存在的缺陷，提供一种通过与流式细胞技术相结合快速准确检测浅水湖泊异养细菌的方法，该方法省时省力，测定过程干扰小，重复性好，精确度高，可开展大规模的生态学调查。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于流式细胞术快速测定富营养化湖泊异养细菌的方法，包括以下步骤：

(1) 样品固定：在待测样品中加入终浓度为0.5-1.5%，优选1%的固定剂，避光2-4小时；

(2) 样品前处理：吸取至少500ul样品，用无菌水1:8-1:12，优选1:10稀释后进行超声波处理后经300目筛绢过滤；

(3) 样品染色：吸取1ml样品，利用特异性核酸染料SYBR GreenⅠ对样品进行染色；

(4) 样品的流式细胞分析：将样品管放置于流式细胞仪的样品台上，利用流式细胞仪对样品进行测试，采集前向散射光、侧向散射光、FL1通道的核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号、FL3通道的自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号数据；其中以核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号设置域值，利用绿色荧光信号将浅水湖泊中的浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来，同时根据FL3通道采集的自养浮游生物的叶绿素a的红色荧光信号，将细菌与浮游藻类区分开来；

(5) 数据分析：通过流式细胞仪分析软件分析采集到的数据，利用前向散射光与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响；依据核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来；根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而获得样品中异养细菌的准确数量。

其中，所述的固定剂为多聚甲醛，甲醛或戊二醛中的一种或几种，优选多聚甲醛。

其中，特异性核酸染料SYBR GreenⅠ为市售产品，可购自Molecular Probes公司。

上述试验方法中各试验步骤可以优先为如下指标：

步骤(2)中所述的超声波处理条件Es=P*t/V=1400-1600 KJ/L，优选1500KJ/L，其中P为超声功率，t为超声时间，V为样品体积。

本发明通过超声波处理能够将富营养化湖泊中附着在颗粒物及聚集体上的细菌脱落下来和浮游的细菌群体一起转变成单细胞，以便流式细胞仪检测。

进一步地，在控制Es=P*t/V=1400-1600 KJ/L的前提下，本发明优选所述超声功率P为10-100W，超声时间t为2-30min,，优选4-6min，样品体积V为1-100ml。

作为本发明的最佳技术方案，控制步骤(2)中所述的超声波处理条件EsP*t/V=1500KJ/L，其中超声功率P为25W，超声时间t为5min，样品体积V为5ml。

本发明在试验阶段设置了超声功率P为25W，样品体积V为5ml，超声时间t为0,2,4,6,8,10,20,30min,从附图1得知，采样点N2，S2这两个样品在超声时间为4-6min时，细菌的绿色荧光强度和总细菌数都是保持相对稳定，故本发明最优选采用的超声时间为5min。

步骤(3)中向样品中加入特异性核酸染料SYBR GreenⅠ对其进行染色；黑暗静置15-30min以使DNA着色。

本发明验证式地设置了特异性核酸染料SYBR GreenⅠ的浓度为10^-5,5×10^-5,10^-4,5×10^-4,10^-3（如附图2A,2B），结果表明染料浓度为10^-4时，细菌的相对绿色荧光强度和总细菌数达到最大值。同时对于染色时间设置了5,10,20,30,40,60min的不同梯度（如附图2C,2D）,结果显示染色时间为20min时，细菌的相对绿色荧光强度和总细菌数达到最大值。所以，最优选荧光染料先用TE缓冲液进行1:100稀释作为母液，漩涡振荡30-60s，再取母液进行1:100稀释，至终浓度为10^-4（相当于稀释一万倍），向1ml样品中加入10uL母液使特异性核酸染料SYBR GreenⅠ终浓度为10^-4，黑暗静置20min以使DNA着色。在该处理条件下，能够有效稳定地使DNA着色。

其中，所述的TE由Tris和EDTA配置而成的，主要用于溶解DNA，能稳定储存DNA，是一种已知市售实际，本发明优选购自GENEWAY公司。

此外，特异性核酸染料SYBR GreenⅠ的稀释方式可依据实际情况加以调整，具体以能够有效稳定地使DNA着色为准。

步骤(4)利用流式细胞仪对样品进行分析时，根据纯培养细菌在流式细胞图中的分布位置，调节各个检测器的电压值，调整仪器的设置；对异养细菌计数使用双组分绝对计数微球，包括A，B两种比例在4~6:4~6，优选1：1的荧光微球，通过验证它们在每次测定中的比例以确保计数的精确性。

其中，所述步骤4包括：取至少100ul样品置于流式细胞仪样品管中，添加等体积的双组份绝对计数微球，测试时间20-40s，优选30s，采集流式细胞仪的前向散射光、侧向散射光、核酸染料SYBR GreenⅠ荧光信号、浮游藻类的自发叶绿素荧光信号数据。

本发明技术方案中，流式细胞仪分析软件采用Becton Dickinson公司开发的CellQuest软件，应用绝对计数微球(每微升标准小球数为10²²个)测定异养细菌的绝对数量。绝对计数的公式如下：

最终绝对浓度=﹝测定的细胞数/测定的计数微球总数(A+B)﹞*微球的浓度，由于微球的浓度为已知，因此，可直接计算得到最终绝对浓度。

与现有DAPI染色荧光显微镜计数相比，本发明具有以下突出优点：

（1）本发明方法所用时间短，一般1min左右完成一个样品计数，比传统的荧光显微镜方法省时省力，能快速检测出浅水湖泊中异养细菌的数量，非常适合开展大规模生态学调查。

（2）本发明方法精确度高，重复性好，比传统的荧光显微镜方法更具客观性。本发明方法与荧光显微镜计数方法进行了计数结果对比，差异不明显,相关性高。

（3）本发明根据流式细胞技术能够同一时间获取多参数信息的特点，利用蓝藻和绿藻等浮游自养生物含有叶绿素，而异养细菌不含有叶绿素的特点，将一些超微型的蓝绿藻与异养细菌区分开来，从而排除超微型蓝绿藻的影响，实现异养细菌的准确定量，为评价异养细菌在水生生态系统中的重要作用提供可靠依据。

附图说明

图1 为超声条件对样品异养细菌数量和核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光强度的影响的关系曲线图，其中：

A:太湖N2点超声条件对异养细菌绿色荧光强度的影响；

B:太湖S2点超声条件对异养细菌绿色荧光强度的影响；

C: 太湖N2点超声条件对异养细菌数量的影响；

D: 太湖S2点超声条件对异养细菌数量的影响；

图2为核酸染料SYBR GreenⅠ浓度和染色时间影响样品相对绿色荧光强度的关系曲线图，其中：

A:太湖N2点核酸染料SYBR GreenⅠ浓度影响相对绿色荧光强度；

B:太湖S2点核酸染料SYBR GreenⅠ浓度影响相对绿色荧光强度；

C:太湖N2点核酸染料SYBR GreenⅠ染色时间影响相对绿色荧光强度；

D: 太湖S2点核酸染料SYBR GreenⅠ染色时间影响相对绿色荧光强度；

图3A为太湖采样位置图；

图3B为太湖细菌丰度流式细胞计数结果曲线图；

图4为流式细胞仪与荧光显微镜计数的结果相关性分析示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

以下实施例对本发明做进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 大型浅水富营养化湖泊太湖中总异养细菌的计数

2013年2月、5月、8月和11月，用采水器从太湖中采集每个点位的表层水样，一共123个样品(如图3A)，采装入预先灭好菌的EP管中，加入终浓度为1%的固定剂多聚甲醛，保温箱冷藏运输回实验室。

取至少500ul样品，用无菌水1:10稀释，混匀。

取5ml样品用超声波清洗仪（功率为25W）进行超声作用5min,打散成团和附着在其他生物上的细菌。

过300目筛绢去除大颗粒杂质，取1ml滤过的样品，加入10ul 100×的SYBRGreenⅠ染料，避光染色20min。

用标准荧光小球对流式细胞仪进行调节校正，调节液流系统和光学系统，使标准荧光小球在各个检测器通道检测到的荧光信号变异系数低于3%。

根据纯培养细菌在流式细胞图中的分布位置，调节各个检测器的电压值，将仪器的设置调整到合适的状态。对异养细菌计数使用双组分绝对计数微球，包括A,B两种相同比例的荧光微球，通过验证它们在每次测定中的比例可以保证计数的精确性。取100ul样品置于流式细胞仪样品管中，添加等体积的计数微球，测试时间30s，采集流式细胞仪的前向散射光、侧向散射光、核酸染料SYBR GreenⅠ荧光信号、浮游藻类的自发叶绿素荧光信号等数据。

通过流式细胞仪分析软件（BD CellQuest）分析采集到的数据，利用前向散射光与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响；而依据核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来；根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而获得样品中异养细菌的准确数量。最后计算公式绝对计数的公式如下：

最终绝对浓度=﹝测定的细胞数/测定的计数微球总数(A+B)﹞*微球的浓度（已知）

比如2月份3号采样点，流式得到的数据为13549，微球A为4740，微球B 为4680，微球浓度为10²²个/ul，故3号点最终绝对浓度=13549/(4740+4680)* 1022个/ul=1.47*10⁶个/ml）

计数结果(如图3B)太湖水体中总细菌数量基本都在10⁶个/ml数量级，但不同位点间的数量还是存在显著差异（由客观情况本身决定）。

实施例2

与实施例1相比，区别点仅在于：本实施例中，步骤1中，在待测样品中加入终浓度1.5%的固定剂甲醛；步骤2中超声波处理条件Es=P*t/V,其中超声功率P为50W，超声时间t为10min,样品体积V为20ml，Es为1500KJ/L。步骤3黑暗静置15min以使DNA着色。

实施例3

与实施例1相比，区别点仅在于：本实施例中，步骤1中，在待测样品中加入终浓度0.5%的固化剂戊二醛；步骤2中超声波处理条件Es=P*t/V,其中超声功率P为100W，超声时间t为2min,样品体积V为8ml，Es为1500KJ/L。步骤3中黑暗静置30min以使DNA着色。

实施例4 与荧光显微镜计数方法的比较

荧光显微镜技术方法的具体步骤：

1.2013年2月、5月、8月和11月，用采水器从太湖中采集每个点位的表层水样，一共123个样品(如图3A)，装入预先灭好菌的EP管中，加入终浓度为1%的固定剂多聚甲醛，保温箱冷藏运输回实验室。

2.取至少500ul样品，用无菌水1:50稀释，混匀。

3.取5ml样品加入DAPI染料终浓度为2ug/ml,染色10min。

4.通过手持式真空泵（真空压<10mmHg）将样品过滤至0.2um孔径的Millipore黑膜上，将黑膜置于载玻片中央，光面朝上，在膜上滴一滴无荧光的浸镜油，盖上载玻片，在落射荧光显微镜下观察计数。

5.至少随机计数20个视野的总细菌数，每毫升水样细菌数按公式细菌个数（cells/ml） = 20个视野个数的平均值 × 黑膜有效面积/视野面积 × （1ml/过滤到膜上的原水样体积）。

6.实施例1所述流式细胞仪的本发明所述方法与荧光显微镜计数的结果相关性分析如图4所示，结果证明这两种计数方法的相关性较高，相关系数为R2=0.74(P<0.05)，无显著性差异。

以实施例2、3所记载的检测方法进行相同对比试验，得到相同的试验结论。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种基于流式细胞术快速测定富营养化湖泊异养细菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定剂为多聚甲醛，甲醛或戊二醛中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的超声波处理条件Es=P*t/V=1400-1600 KJ/L，优选1500KJ/L，其中P为超声功率，t为超声时间，V为样品体积。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述超声功率P为10-100W，超声时间t为2-30min,样品体积V为1-100ml。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的超声波处理条件Es=P*t/V=1500KJ/L，其中超声功率P为25W，超声时间t为5min，样品体积V为5ml。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中向样品中加入特异性核酸染料SYBR GreenⅠ对其进行染色；黑暗静置15-30min以使DNA着色。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的特异性核酸染料SYBR GreenⅠ先用TE进行1:100稀释作为母液，漩涡振荡30s，再取母液进行1:100稀释，至特异性核酸染料SYBR GreenⅠ终浓度为10^-4，向1ml样品中加入10uL母液使特异性核酸染料SYBR GreenⅠ终浓度为10^-4，黑暗静置20min以使DNA着色。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)利用流式细胞仪对样品进行分析时，根据纯培养细菌在流式细胞图中的分布位置，调节各个检测器的电压值，调整仪器的设置；对异养细菌计数使用双组分绝对计数微球，包括A，B两种比例在4~6:4~6，优选1：1的荧光微球，通过验证它们在每次测定中的比例以确保计数的精确性。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述步骤4包括：取至少100ul样品置于流式细胞仪样品管中，添加等体积的双组份绝对计数微球，测试时间20-40s，优选30s，采集流式细胞仪的前向散射光、侧向散射光、核酸染料SYBR GreenⅠ荧光信号、浮游藻类的自发叶绿素荧光信号数据。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的流式细胞仪分析软件采用Becton Dickinson公司开发的CellQuest软件，应用双组分绝对计数微球测定异养细菌的绝对数量，每ul标准小球数为10²²个；绝对计数的公式如下：

最终绝对浓度=﹝测定的细胞数/测定的计数微球总数(A+B)﹞*微球的浓度。