CN104328199A - 活细菌定量检测技术PMA-qPCR的条件优化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物检测领域，涉及一项检测技术的条件优化方法，尤其涉及一种活细菌定量检测技术：PMA-qPCR的条件优化方法。为了克服在活细菌定量检测中，现有PMA-qPCR技术的条件优化环节成本高、耗时长和操作强度大的不足，本发明提供了一种基于流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）的活细菌定量检测技术PMA-qPCR的条件优化方法，可以直接对PMA处理的细菌细胞进行FCM分析，由于省去了基因组提取和qPCR扩增的操作，因此可以在很低的成本下快速简便地得到最佳的PMA浓度和曝光时间。针对PMA处理条件优化，本发明方法具有快速、简便和低成本的优点。

Description

活细菌定量检测技术PMA-qPCR的条件优化方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及一项检测技术的条件优化方法，尤其涉及一种活细菌定量检测技术：PMA-qPCR的条件优化方法。

背景技术

实时荧光定量PCR即qPCR技术作为特定核酸片段定量的金标准，是目前应用最为广泛和有效的核酸分子定量手段。考虑到细菌数量和其含有的特定核酸分子（如16S rDNA）呈正比例关系，因此qPCR技术也被用于细菌定量检测领域中。然而在实际的微生物生态体系中，有活细菌也存在着死细菌；死细菌虽然已经死亡，但其DNA会在较长时间内存在，因此采用qPCR定量反映的是某种菌总菌的结果。对于微生物体系的解析尤其涉及生态功能的分析，活细菌的数目更加能反映该种菌在生态体系中发挥的实际影响和作用，因此如何排除死细菌的干扰准确定量活细菌变得十分重要，由此催生了PMA-qPCR等活细菌的定量分析技术。

叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide，PMA）是一种对核酸具有高度亲和力的光敏染料，由于不能透过完整的细胞膜，PMA只能修饰细菌死亡后暴露出来的DNA分子。用合适浓度的PMA处理的细菌样品暴露于强光下时，PMA所带的光敏性叠氮基团转化为高活性的氮宾自由基，并与结合位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价氮碳键。这样使得死细菌的DNA获得永久修饰，导致其DNA分子的qPCR扩增被阻断；而活细菌则不受影响。相关研究表明，PMA与qPCR技术结合后可有效的抑制死细菌DNA的扩增，因此PMA-qPCR技术是一种能有效用于细菌活细胞定量检测的分子手段，现在被广泛应用于致病菌或有害菌活菌的定量检测等领域中。

PMA对死细菌DNA的共价结合效率受到多种因素的影响，主要因素有细菌种类、菌液浓度、PMA浓度和曝光时间等。PMA浓度和曝光时间的选择在于：PMA浓度过低或曝光时间过短则不能充分结合和修饰死细菌的DNA；而PMA浓度高到一定程度则会有不容忽视数量的PMA分子渗透进活细菌细胞内，长的曝光时间将增强其对活菌DNA的结合和修饰作用。因此采用PMA-qPCR对某一研究体系中特定活细菌进行定量检测时，往往先在固定的纯菌浓度下探究最佳的PMA处理浓度和曝光时间，之后用于实际从而达到更高的准确率。优化流程（具体的可以参照：李聪聪,PMA-qPCR活菌检测方法的建立与应用.华南理工大学硕士学位论文，2012.等文献）如下：

（1）制备细菌悬液：培养好纯菌后，适当稀释到一定浓度（如OD600=1，即经过稀释使得在600nm下的吸光值为1），取若干份等体积的菌，其中一半采用加热和超声处理结合制备死菌样品，而另外一半不做处理为活菌样品；（2）PMA处理：在不同的PMA浓度和曝光时间下处理（1）中的活菌组和死菌组样品；（3）qPCR扩增和数据分析：提取（2）中经PMA处理的样品的基因组DNA，以此为模板采用该细菌特异性的qPCR引物进行扩增，得到各组的Ct值（qPCR荧光阈值同扩增曲线交点对应的循环数）综合分析选出最佳的PMA处理条件。最低的PMA浓度和曝光时间为死细菌组Ct值稳定时（即不随PMA浓度和曝光时间的增加而发生显著的增高，如Ct值增量不超过1）的处理浓度和时间，最高的PMA浓度和曝光时间为活细菌Ct稳定时的处理浓度和时间；而最佳的PMA处理条件则在最高和最低的PMA浓度和曝光时间之间的实际处理条件中择优选定，这样在保证充分抑制死细菌DNA扩增的同时又不会影响到活细菌DNA的扩增。

然而上述条件优化方法是利用qPCR进行评估和筛选的，需要对PMA处理的样品进行基因组提取和qPCR扩增。以六个PMA处理浓度（如0uM、10uM、20uM、30uM、50uM、100uM，0uM作为空白对照是必需的）和三个曝光时间（5min、8min、10min）为例，则活细菌组和死细菌组合起来一共需要分析36个样品。仅以细菌基因组提取试剂盒花费为5元/样本、DNA的qPCR扩增花费为10元/样本进行估算，在不计其它试剂耗材和不做平行的情况下，一次PMA浓度和曝光时间优化的保守花费为540元。而时间方面，基因组提取需要半天，qPCR扩增需要半天，合起来需要8个小时左右。而且考虑到36个样本如果同时进行基因组提取和qPCR扩增，操作强度大因此对操作要求高，而且很难保证效果一致性，此外可能需要接触有毒试剂，如果分批做则时间和工作量将增加。

通过上述分析可知，现有的PMA-qPCR技术最佳条件的优化方法成本、时间和操作代价大。考虑到PMA处理的细菌细胞带有荧光染料，因此可以避开基因组提取和qPCR扩增直接对细胞进行分析，从而寻求一种快速、简便和经济的方法以筛选出最佳的PMA处理条件。

发明内容

为了克服在活细菌定量检测中，现有PMA-qPCR技术的条件优化环节成本高、耗时长和操作强度大的不足，本发明提供了一种基于流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）的PMA-qPCR条件优化方法，可以直接对PMA处理的细菌细胞进行FCM分析，由于省去了基因组提取和qPCR扩增的操作，因此可以在很低的成本下快速简便地得到最佳的PMA浓度和曝光时间。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

（1）同通常的PMA-qPCR条件优化一样，先制备细菌悬液和进行PMA处理；

（2）采用血球计数板计算所用细菌的大致浓度，根据得到的菌液浓度结果对（1）中不同PMA浓度和曝光时间处理后的纯菌样品，用无菌生理盐水将其都稀释到10⁶-10⁷个/mL范围内；

（3）取500uL（2）中稀释的细菌悬液按照流式细胞仪标准操作规程进行测定，设定检测细胞的数目不少于10000个，采用波长为488nm的激光激发；

（4）测定结束后，首先对无PMA处理的死细菌细胞组即空白对照组，在FSC vs. SSC的细胞二维散点图上圈定细胞群集中的区域，圈定区域内细胞的数量占分析细胞数量的比例应不少于80%；

（5）对（4）中圈定区域内的细菌细胞群做单独分析，横坐标设定为488nm激发光的检测信号记为FITC，在FITC vs. SSC散点图上，用十字界标设门，寻找某一FITC荧光阈值，使得95%以上的死细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域；保存死细菌空白对照组的分析方法，套用到其它PMA处理条件下的死细菌样品；

（6）对比不同PMA处理条件下死细菌的流式细胞分析结果，在某一PMA浓度和曝光时间下，有95%以上的细胞位于（5）中荧光阈值线的右侧区域，并且随着PMA浓度和曝光时间的增加，该比例增加的幅度不会超过2%；则此时的PMA浓度和曝光时间为最优PMA处理条件的下限；

（7）再对无PMA处理的活细菌细胞组，在FSC vs. SSC的细胞二维散点图上圈定细胞群集中的区域，圈定区域内细胞的数量占分析细胞数量的比例应不少于80%；

（8）对（7）中圈定区域内的细菌细胞群做单独分析，横坐标设定为488nm激发光的检测信号记为FITC，在FITC vs. SSC散点图上，用十字界标设门，寻找某一FITC荧光阈值，使得95%以上的活细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域；保存活细菌空白对照组的分析方法，套用到其它PMA处理条件下的活细菌样品；

（9）对比不同PMA处理条件下活细菌的流式细胞分析结果，在某一PMA浓度和曝光时间下，仍有95%以上的细胞位于（8）中荧光阈值线的左侧区域，并且随着PMA浓度和曝光时间的增加，该比例增加的幅度不会超过2%；则此时的PMA浓度和曝光时间为最优PMA处理条件的上限；

（10）最佳的PMA处理条件则在最高和最低的PMA浓度和曝光时间之间的实际处理条件中择优选定。

本发明的有益效果是，基于FCM技术的PMA-qPCR条件优化方法，无需基因组提取和qPCR扩增步骤，可以直接对PMA处理的细菌细胞进行分析，得到同通常基于qPCR的PMA处理条件优化方法一致的效果，因此本发明方法将会以很低的成本，快速简便地得到最佳的PMA浓度和曝光时间。

附图说明

图1是0uM PMA处理死细菌5min即死菌空白对照的FCM图谱，左侧是FSC vs. SSC散点图，右侧是FITC vs. SSC散点图。

图2是0uM PMA处理活细菌5min即活菌空白对照的FCM图谱，左侧是FSC vs. SSC散点图，右侧是FITC vs. SSC散点图。

图3是0uM PMA处理死细菌8min即死菌空白对照的FCM图谱，左侧是FSC vs. SSC散点图，右侧是FITC vs. SSC散点图。

图4是0uM PMA处理活细菌8min即活菌空白对照的FCM图谱，左侧是FSC vs. SSC散点图，右侧是FITC vs. SSC散点图。

具体实施方式

一、FCM用于PMA-qPCR技术中PMA处理环节的条件优化的原理

流式细胞术，即利用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。该技术是细胞周期和DNA倍体分析的常用手段，利用的是核酸染料（如PI、PADI等）与细胞内核酸的结合情况来反映细胞的生理状态。采用qPCR评估PMA处理的细菌细胞样品，实质上是利用Ct值（扩增效应）来反映PMA与死细菌和活细菌细胞内核酸的结合情况，然而核酸染料PMA结合的细胞也可以直接采用流式细胞术评估其核酸状态。经试验表明PMA可以在常用的流式细胞仪激发波长488nm下发出强烈的荧光。

最佳的PMA处理条件，应该使得死细菌细胞的核酸得到充分的结合，同时要在活细菌完整细胞膜的阻挡能力之内。然而实际上，即使是最优的PMA浓度和曝光时间都不可能使得所有死细菌细胞的核酸都有完全、均一而充分的结合和修饰效果，也不可能对所有的活细菌细胞完全没有影响。因此在实际操作中，可以设定一个基本的界限保证绝大多数的细菌细胞，这里确立的原则是：（1）95%以上的死细菌细胞得到充分结合，而不影响95%以上的活细菌细胞；而95%是基本的比例要求，该比例越高越好，最好是能达到97.5%以上；（2）随着PMA浓度和曝光时间的增加，以空白对照样本确定的荧光阈值线为界，细菌细胞内核酸与PMA结合的比例不再发生大幅度的变化，如不会在合理的相邻条件下增加2%以上。在这一原则下，具体分析过程如下：

对于死细菌组，首先分析空白对照即无PMA处理的样品，由于没有加入荧光染料PMA则对于圈定的细胞群，理论上接近100%的细胞无荧光产生，此时在FITC vs. SSC可以选定一FITC荧光阈值（横坐标），使得至少95%以上的细胞都包含于该荧光阈值线的左侧，这一荧光阈值可以认为是荧光本底信号。随着PMA的加入，有一部分细胞由于PMA的充分结合和修饰检测时其荧光值将超过荧光本底，因此将跑到荧光阈值线的右侧；随着PMA浓度和\或曝光时间的增加死细菌越来越多、越来越充分的得到结合和修饰，因此超过荧光阈值的细胞数目将越来越多；直到某一PMA浓度和曝光时间，使得大部分细菌细胞（如95%以上）都跑到荧光阈值线的右侧，并保持稳定而不会随着PMA浓度和\或曝光时间的增加而有大幅度的增加。此时的PMA浓度和曝光时间为PMA处理条件的下限，即至少要使用这一浓度的PMA处理这一时间，才能使得绝大多数死细菌细胞的核酸能够被充分结合和修饰。

对于活细胞组，原理相似。由空白对照即无PMA处理的活菌样品设定荧光阈值线，对于圈定的细胞群，使得至少95%以上的细胞都位于该荧光阈值线的左侧。在低PMA浓度和\或短曝光时间的情况下绝大多数活细菌细胞由于存在完整的细胞膜并不会被PMA结合和修饰，因此大部分细胞仍位于在荧光阈值线左侧区域；随着PMA和\或曝光时间增加，跑到荧光阈值线右侧的活细胞数量会有小幅度的增加（相邻条件间增幅小于1%）；而直到PMA和\或曝光时间增加到某一程度时，由于高PMA浓度的渗透作用和长曝光时间的反应等，导致活细菌由于细胞内核酸被PMA结合和修饰而跑到荧光阈值线的右侧区域的比例显著增加（如相比相邻的低浓度PMA和\或短曝光时间增幅超过1%）。则此时的PMA浓度和曝光时间为PMA处理的上限，即不能超过这一浓度的PMA处理这一时间，否则会有不可忽视比例的活菌细胞被PMA结合和修饰。

低于PMA处理条件的下限和超过PMA处理条件的上限都将影响采用PMA-qPCR对活菌进行精准的定量分析。而最高和最低的PMA浓度和曝光时间之间的实际处理条件都是理想的PMA处理条件，然而实际应用的条件只有一个，因此可以根据实际情况从中择优选定最佳的PMA处理条件。FCM分析PMA处理的细菌样本，除了鞘液、清洗剂等基本消耗外几乎无其它额外的成本，经核算小于2.5元/样本，以36样的优化为例成本在100元以内。此外每样的分析时间在2min内，加上之前的计数（只需计数一次）稀释（所有样本做同样的稀释）等简单操作，36样的优化仅需2h左右。此外，FCM的上机操作十分简便，几乎只需手工换样。因此相较于通常基于qPCR的优化方式采用FCM在成本、时间和操作方面代价都极低。

二、具体操作步骤

（1）同通常的PMA-qPCR条件优化一样，先制备细菌悬液和进行PMA处理；

（2）采用血球计数板计算所用细菌的大致浓度，根据得到的菌液浓度结果对（1）中不同PMA浓度和曝光时间处理后的纯菌样品，用无菌生理盐水将其都稀释到10⁶-10⁷个/mL范围内；

（3）取500uL（2）中稀释的细菌悬液按照流式细胞仪标准操作规程进行测定，设定检测细胞的数目不少于10000个，采用488nm的激光激发；

（4）测定结束后，首先对无PMA处理的死细菌细胞组即空白对照组，在FSC vs. SSC的细胞二维散点图上圈定细胞群集中的区域，圈定区域内细胞的数量占分析细胞数量的比例应不少于80%；

（5）对（4）中圈定区域内的细菌细胞群做单独分析，横坐标设定为488nm激发光的检测信号记为FITC，在FITC vs. SSC散点图上，用十字界标设门，寻找某一FITC荧光阈值，使得95%以上的死细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域；保存死细菌空白对照组的分析方法，套用到其它PMA处理条件下的死细菌样品；

（6）对比不同PMA处理条件下死细菌的流式细胞分析结果，在某一PMA浓度和曝光时间下，有95%以上的细胞位于（5）中荧光阈值线的右侧区域，并且随着PMA浓度和曝光时间的增加，该比例增加的幅度不会超过2%；则此时的PMA浓度和曝光时间为最优PMA处理条件的下限；

（7）再对无PMA处理的活细菌细胞组，在FSC vs. SSC的细胞二维散点图上圈定细胞群集中的区域，圈定区域内细胞的数量占分析细胞数量的比例应不少于80%；

（8）对（7）中圈定区域内的细菌细胞群做单独分析，横坐标设定为488nm激发光的检测信号记为FITC，在FITC vs. SSC散点图上，用十字界标设门，寻找某一FITC荧光阈值，使得95%以上的活细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域；保存活细菌空白对照组的分析方法，套用到其它PMA处理条件下的活细菌样品；

（9）对比不同PMA处理条件下活细菌的流式细胞分析结果，在某一PMA浓度和曝光时间下，仍有95%以上的细胞位于（8）中荧光阈值线的左侧区域，并且随着PMA浓度和曝光时间的增加，该比例增加的幅度不会超过2%；则此时的PMA浓度和曝光时间为最优PMA处理条件的上限；

（10）最佳的PMA处理条件则在最高和最低的PMA浓度和曝光时间之间的实际处理条件中择优选定。

其中，步骤（2）中细菌细胞稀释液浓度控制在10⁶-10⁷个/mL范围内为宜：浓度太低，上机检测时的流速不得不采用高速或中速，影响结果的准确性；浓度太高，一方面细胞容易聚集成团堵塞液路，使液流不稳，另一方面还会使核酸燃料的相对浓度偏低，影响实验结果；不同的PMA处理浓度应该包括无PMA处理的空白对照组；不需要精确计数和稀释，因为后续FCM上机分析环节有设定固定的检测数目如10000个。

其中，对于步骤（4）中的FSC vs. SSC的细胞二维散点图，FSC表示前向偏振光维度作为横坐标，SSC表示侧向偏振光维度作为纵坐标。

其中，对于步骤（4）和步骤（7）中分析区域的选定，无论是死细菌细胞还是活细菌细胞，由于细胞形态和状态不可能完全一致，因此选择细胞集中的区域，这里界定为不少于80%的区域进行分析，不仅不影响最终的结果反而可以很好排除一些细胞形态和状态差异干扰，有助于最佳PMA处理条件的分析。

其中，对于步骤（5）和步骤（8）的FITC vs. SSC二维散点图，十字设门只针对FITC进行分界，因此纵坐标不做区分，设定所有细胞都是SSC阴性；流失细胞仪具备自动保存某一样本分析方法并作为标准分析方法套用到其它样本的功能，因此分别将死细菌组和活细菌组的空白对照样本的分析方法作为标准方法分析组内的其它样本，这里的分析方法主要指空白对照组FSC vs. SSC的圈定区域和确定出的FITC vs. SSC荧光阈值。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。

实施例1：本实施例以大肠杆菌（Escherichia coli）Top 10菌株为研究对象，对于利用PMA-qPCR进行活菌的定量检测，采用基于qPCR的通常方法和基于FCM的新方法优化其最佳PMA处理浓度和曝光时间。本实施例的具体步骤和结果如下：

1、制备大肠杆菌悬液

活菌悬液：将保存在斜面培养基中的大肠杆菌转接到LB摇瓶培养基中，37℃下恒温培养约12h，取30mL均匀菌液于50mL灭菌离心管中，10000rpm离心3 min后弃上清，沉淀用灭菌生理盐水悬浮并混匀，静置1min后10000rpm离心3min，弃上清收集菌体加入30mL灭菌生理盐水悬浮。

死菌悬液：同样取30mL培养好的均匀菌液于50mL灭菌离心管，放入80℃的水浴锅，水浴10min。水浴后，放入超声波清洗器进行5min的超声波处理（频率100Hz），使细胞膜通透。然后10000rpm离心3 min后弃上清，沉淀用灭菌生理盐水悬浮并混匀，静置1min后10000rpm离心3min，弃上清收集菌体加入30mL灭菌生理盐水悬浮。

用分光光度计将菌浓度调节为OD600=1，用血球计数板计算培养的菌液浓度，其浓度约为2×10⁸个/mL。对于活菌悬液和死菌悬液，各取10份菌悬液装入1.5mL灭菌的塑料离心管中，每份0.5mL。

2、PMA处理

PMA储备液：将1mg的PMA溶解于20%的二甲亚砜(DMSO)中，配制成10mM的PMA溶液，于-20℃避光保存。

对于10份活细胞悬液样品和10份死细胞悬液样品，分别加入适量的PMA储备液，使PMA的终浓度分别为0μM、10μM、30μM、50μM、100μM，PMA与菌液充分混匀后在室温条件下避光反应5min，之后将样品置于冰水上（避免过热），在距离样品20cm处利用500W的卤素灯曝光5.0 min和8.0min，曝光期间每隔30s进行充分混匀。曝光交联后将离心管在10000rpm离心5min，弃上清收集菌体，加入1mL无菌生理盐水重悬菌体，然后再进行10000rpm离心5min，弃上清以除去未交联的PMA，加入500uL无菌生理盐水重悬。若要保存，则将样品用500uL无水乙醇重悬，保存于-20℃冰箱，并于3天内进行测定。

3、稀释菌悬液

将各PMA处理条件下的菌悬液用无菌生理盐水稀释20倍使其大致浓度为1×10⁷个/mL。

4、FCM上机检测

取500uL稀释后的细菌悬液按照BD公司Accuri C6流式细胞仪标准操作规程进行测定，设定检测细胞的数目为10000个，采用488nm的激光激发，中等流速模式。

5、FCM结果处理

死菌组：

测定结束后，首先对无PMA处理的死细菌细胞组即空白对照组，在FSC vs. SSC的细胞二维散点图上圈定细胞群集中的区域，圈定区域内细胞的数量占分析细胞数量的比例约为80%；对圈定区域内的细菌细胞群做单独分析：在FITC vs. SSC散点图上，用十字界标设门，界定的FITC荧光阈值使得95%以上的死细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域，结果如图1和图3所示。从图中可以看出，界定的FITC荧光阈值使得95%以上的活细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域，分别达到了97.2%（5min组）和96.9%（8min组）。保存死细菌空白对照组的分析方法，套用到其它PMA处理条件下的死细菌样品，以确定的荧光阈值线为基准各条件下细菌分布比例见表1。死菌是通过加热和超声方式制备的，从图中可以看出形态差异较大，因此本实施例设定的荧光阈值线只能保证97%左右的细胞在其左侧，该比例也仍大于预定的比例即95%。

活菌组：

对无PMA处理的活细菌细胞组即空白对照组，在FSC vs. SSC的细胞二维散点图上圈定细胞群集中的区域，圈定区域内细胞的数量占分析细胞数量的比例约为80%；对圈定区域内的细菌细胞群做单独分析：在FITC vs. SSC散点图上，用十字界标设门，结果如图2和图4所示。从图中可以看出，界定的FITC荧光阈值使得95%以上的活细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域，分别达到了99.9%（5min组）和99.6%（8min组）。保存活细菌空白对照组的分析方法，套用到其它PMA处理条件下的活细菌样品，以确定的荧光阈值线为基准各条件下细菌分布比例见表1。从图中可以看出，活菌形态相对稳定，因此本实施例设定的荧光阈值线保证了99.5%以上的细胞在其左侧。

6、FCM结果分析

对表1的数据进行分析。对于死菌，随着PMA浓度的增加，越过荧光阈值线的死菌越来越多，5min组的最大比例达到了91.8%，8min组的优于5min组的达到97.5%（大于95%）；因此从死菌结合修饰情况考量，应该选择8min组。对于活菌，随着PMA浓度的增加，越过荧光阈值线的活菌有小幅度的上升，然而5min组和8min组在100uM的PMA浓度下比例突然增加均超过了1%，最终都大于2%。因此从活菌受影响的角度考量，PMA浓度应该小于100uM。对于8min组的死菌，排除掉100uM后由于30uM和50uM的PMA作用时被结合的死菌比例分别达到了96.1%和97.5%均超过了95%，且两者差别不大；由于PMA必须从美国Biotium进口价格较为昂贵且污染环境，因此从节约PMA使用的角度来看，最终的PMA处理条件应该是30uM处理8min。

表1 死细菌组和活细菌组的FCM数据（%）

注：左侧表示由无PMA处理的死细菌\活菌样本即空白对照样本确定出的荧光阈值线的左侧，右侧表示荧光阈值线的右侧。

7、最优PMA处理条件评估

为了评估本发明基于FCM的PMA处理条件优化方法的效果，同时对样本采用基于qPCR的最优条件筛选方法，两种方法的结果进行比较。样本制备和前处理条件一样，基因组提取和qPCR扩增参照（李聪聪,PMA-qPCR活菌检测方法的建立与应用.华南理工大学硕士学位论文，2012.等文献）中的方法进行，结果表2所示。

表2 死细菌组和活细菌组qPCR实验的Ct值数据

对于活菌，当PMA浓度小于100uM时，5min组和8min组的Ct均维持在11.8左右，而PMA浓度上升到100uM时，5min组和8min组的Ct均有大幅度的上升（大于12）。因此从活菌的角度考虑，PMA处理的浓度不应该超过100uM。对于死菌，随着PMA浓度的增加，5min组和8min组的Ct均随着上升，然而8min组的Ct同比高于5min组的，显示出了更好的抑制效应。因此从死菌的结合修饰情况考量，应该选择8min组。对于8min组，排除掉100uM后由于30uM和50uM的PMA作用时Ct值分别达到了20.59和20.73，且两者差别不大；从节约PMA的角度来看，最终的PMA处理条件应该是30uM处理8min。

综上可知，本发明方法确定的无论是适用的PMA处理条件范围还是最佳PMA处理条件均和基于qPCR方法的结果是一致的，而相比而言本发明基于FCM的方法相比于通常基于qPCR的方法具有快速、简便和成本低的优势。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种活细菌定量检测技术PMA-qPCR的条件优化方法，其特征是所述方法的步骤如下：

（1）按照常规做法制备细菌悬液和进行PMA处理；

（2）对（1）中得到的不同PMA浓度和曝光时间处理后的纯菌样品，用无菌生理盐水将其都稀释到10⁶-10⁷个/mL范围内；

（3）取500uL（2）中稀释的细菌悬液按照流式细胞仪标准操作规程进行测定，设定检测细胞的数目不少于10000个，采用488nm的激光激发；

（4）测定结束后，首先对无PMA处理的死细菌细胞组即死细菌空白对照组，在FSC vs. SSC的细胞二维散点图上圈定细胞群集中的区域，圈定区域内细胞的数量占分析细胞数量的比例应不少于80%；

（5）对（4）中圈定区域内的细菌细胞群做单独分析，横坐标设定为488nm激发光的检测信号记为FITC，在FITC vs. SSC散点图上，设十字门，寻找某一FITC荧光阈值，使得95%以上的死细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域；保存（4）和（5）对死细菌空白对照组的分析方法，套用到其它PMA处理条件下的死细菌样品；

（6）对比不同PMA处理条件下死细菌的流式细胞分析结果，在某一PMA浓度和曝光时间下，有95%以上的细胞位于（5）中荧光阈值线的右侧区域，并且随着PMA浓度和曝光时间的增加，该比例增加的幅度不会超过2%；则此时的PMA浓度和曝光时间为最优PMA处理条件的下限；

（7）再对无PMA处理的活细菌细胞组即活细菌空白对照组，在FSC vs. SSC的细胞二维散点图上圈定细胞群集中的区域，圈定区域内细胞的数量占分析细胞数量的比例应不少于80%；

（8）对（7）中圈定区域内的细菌细胞群做单独分析，横坐标设定为488nm激发光的检测信号记为FITC，在FITC vs. SSC散点图上，设十字门，寻找某一FITC荧光阈值，使得95%以上的活细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域；保存（7）和（8）对活细菌空白对照组的分析方法，套用到其它PMA处理条件下的活细菌样品；

（9）对比不同PMA处理条件下活细菌的流式细胞分析结果，在某一PMA浓度和曝光时间下，仍有95%以上的细胞位于（8）中荧光阈值线的左侧区域，并且随着PMA浓度和曝光时间的增加，该比例增加的幅度不会超过2%；则此时的PMA浓度和曝光时间为最优PMA处理条件的上限；

（10）最佳的PMA处理条件则在最高和最低的PMA浓度和曝光时间之间的实际处理条件中择优选定。