CN110218763A - 一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法，该方法包括以下步骤：S1.将待测食用生蛋样品进行匀浆；S2.将蛋液样品稀释后进行蛋白降解处理和去脂处理；S3.将处理后的蛋液样品进行膜过滤；S4.将过滤后的蛋液样品进行离心洗涤并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮；S5.使用致病菌特异性探针对蛋液悬浮液进行第一荧光标记，并使用核酸染料对所述蛋液悬浮液进行第二荧光标记；S6.使用高灵敏度流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光进行检测；该方法适用于各种食用生蛋及液蛋样品的检测，可对样品中的目标致病菌和总菌数进行同时定量检测，包括各种致病菌、非致病菌等。

Description

一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法
技术领域
本公开涉及食品卫生领域，具体地，涉及一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法。
背景技术
鸡蛋因其含有蛋白质、脂肪、微量元素等丰富的营养物质，且其价格低廉、生物利用率高、含有植物类蛋白均缺乏的色氨酸，而成为消费者不可或缺的食物，也因此被成为“完美食物”。
然而，鸡蛋在生产、贮藏及销售等环节容易受到细菌的污染，污染菌包括非致病菌及致病菌两大类。受非致病菌污染的鸡蛋一般不会直接引起人体疾病，但是，鸡蛋的营养价值、加工价值及贮存时间都会降低。因此，鸡蛋中细菌总菌数量成为衡量鸡蛋质量的一个标准。受致病菌污染的鸡蛋则会严重影响人体健康甚至危及生命。目前为止，大多数与鸡蛋相关的疫情都归因于沙门氏菌属，尤其以肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌最为常见。沙门氏菌病是一种流行的全球食源性传染病疾病，感染者主要表现为轻度至中度肠胃炎，包括腹泻、腹部绞痛、呕吐等。据美国疾病中心统计，在美国，沙门氏菌每年导致120万人患病，23000人住院，450人死亡。鉴于鸡蛋的食用量较大，通过同时定量检测鸡蛋中致病菌和非致病菌含量以确保鸡蛋安全性及质量尤为重要。
在食品工业中，平板计数法是检测食品中细菌含量的“金标”方法。但是，该方法操作繁琐、耗时；另外，食品中的一部分细菌处于“存活但不能培养”或者难培养的状态，使得平板计数法受到很大局限；再者，当使用平板计数法检测致病菌含量时，操作步骤需包括使用显色培养基、生化实验、血清学鉴定等，进一步限制了平板计数法使用范围。需要我们注意的是，平板计数法无法实现在同一次试验中完成对致病菌和非致病菌的同时检测。综上，平板计数法难以满足快速、高通量、致病菌和非致病菌同时定量分析的要求。近些年，大量文献报道了食品中细菌快速检测的方法。这些方法包括：1)ATP生物荧光法、分光光度法及电阻抗法等方法可实现广谱细菌的定量检测，然而，该类方法无法同时对特异性致病菌和非致病菌进行检测；2)以PCR为代表的分子生物学方法和以抗体为代表的免疫学方法可实现特异性致病菌的检测，但不具备广谱性，且以上所述方法均为集权平均分析方法，间接反映细菌浓度，由于细菌个体的代谢水平、酶含量和酶活等信号都有很大区别，集权平均分析方法在实际样品检测时往往不准确。
流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种对悬液中的细胞或细胞大小的颗粒进行单颗粒水平快速定量检测分析和分选的技术，因其具有检测速度快、精度高和多参数分析等特点，在细菌检测和鉴定方面独具优势，已成为产品质量控制、细菌致病机理以及微生物群落结构研究的重要手段。该方法可以快速、准确、特异性地检测食品中的致病菌和非致病菌的含量。目前，采用FCM检测食品或环境样本中的细菌主要是基于细菌核酸染色及免疫荧光法。但是，当FCM检测的对象为食用生蛋类样品时，存在以下问题：①粘稠状的蛋液无法满足FCM进样要求，经常发生仪器进样管的堵塞；②假阳性率较高；③检测信噪比较低。因此，当FCM检测对象为食用生蛋样品时，检测的进行极为困难。
发明内容
本公开的目的是提供一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数同时定量检测的方法，该方法能检测蛋液中的各种细菌，包括各种致病菌和非致病菌。
为了实现上述目的，本公开提供一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法，该方法包括以下步骤：
S1.将待测食用生蛋样品进行匀浆，得到蛋液样品；
S2.将所述蛋液样品稀释后进行蛋白降解处理和去脂处理，以降解所述蛋液样品中的蛋白成分和脂肪成分，得到处理后的蛋液样品；
S3.将所述处理后的蛋液样品进行膜过滤，得到过滤后的蛋液样品，所述膜过滤所采用的过滤膜的孔径为5～10μm；
S4.将所述过滤后的蛋液样品进行离心洗涤并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，得到蛋液悬浮液；
S5.使用致病菌特异性探针对所述蛋液悬浮液进行第一荧光标记，并使用核酸染料对所述蛋液悬浮液进行第二荧光标记，得到检测上样悬浮液；
S6.使用高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光进行检测，并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋中的致病菌数量，根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋样品中的细菌总数量。
可选地，步骤S1中，所述匀浆的条件包括：温度为4～37℃，转速为10～300rpm，时间为5～60min。
可选地，步骤S2中，所述稀释所采用的稀释剂为磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水；相对于0.1mL的所述蛋液样品，所述稀释剂的用量为1～1000μL；
所述蛋白降解处理使用蛋白酶进行，所述蛋白酶为蛋白酶K、胰蛋白酶和弹性蛋白酶中的至少一种，所述蛋白酶的终浓度为0.1～10mg/mL；所述蛋白降解处理的条件包括：温度为10～50℃，时间为5～30min；所述去脂处理使用的去脂试剂为Triton X-100、NonidetP 40或TWEEN-20，所述去脂试剂的终浓度为0.1～10体积％；所述去脂处理的条件包括：温度为0～50℃，时间为5～30min。
可选地，步骤S4中，所述离心的时间为1～30min，转速为1000～10000rpm。
可选地，步骤S5中，所述致病菌特异性探针为标记了荧光染料的特异性抗体探针、标记了荧光染料的特异性适配子探针或标记了荧光染料的抗菌肽，所述荧光染料为有机染料、量子点或荧光蛋白；所述第一荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为4～50℃，时间为1～120min；
所述核酸染料为EB染料、PI染料、TOTO系列染料、TO-PRO系列染料、SYTOX系列染料、SYTO系列染料、SYBR系列染料、DAPI染料或Hoechst染料；所述第二荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为4～50℃，时间为1～60min。
可选地，步骤S5中，以0.1mL的所述蛋液悬浮液为基准，所述致病菌特异性探针用量为0.01～100μg，所述核酸染料的浓度为0.1～100μM。
可选地，步骤S6中，使用高灵敏流式细胞术如纳米流式检测仪对所述检测上样悬浮液中颗粒的400～800nm的散射光和荧光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋中的致病菌数量，根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋样品中的细菌总数量。
可选地，所述纳米流式检测仪的操作包括：
a.使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述检测上样悬浮液聚焦为微米级样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的细菌，且所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；
b.向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.01～10毫秒，优选为0.2～2毫秒；
c.将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由探测区发出的光信号；
d.将通过透镜系统收集到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个细菌所发出的光的电信号；
e.根据所述电信号对所述细菌进行定量分析。
可选地，所述探测区的体积为1～5000fL，优选为50～500fL；所述样品液流的直径为0.1～20μm，优选为1～5μm；所述样品液流的流量为1～500nL/min，优选为1～100nL/min；所述鞘液的流速为1～100cm/sec，优选为1～10cm/sec；所述测量光的光束直径为所述样品液流的直径的1～150倍，优选为2～50倍。
可选地，所述食用生蛋包括鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋、鸽蛋和鸵鸟蛋中的至少一种；
所述致病菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、葡萄球菌、变形杆菌、产碱杆菌、枯草杆菌、巴氏杆菌、果胶杆菌、禽杆菌、哈夫尼菌、梭菌、巨型球菌和黄干菌中的至少一种。
通过上述技术方案，本公开首先对待测食用生蛋类样品进行蛋白质及脂类降解、膜过滤和离心洗涤等预处理，以去除待测食用生蛋类样品中的蛋白及脂肪液滴，同时降低样品的荧光信号背景；然后利用核酸染料和特异性探针同时对样品进行荧光标记，再应用高灵敏流式细胞术对细菌荧光信号进行检测，从而实现对食用生蛋样品中细菌的识别和定量。本公开提供的方法适用于各种食用生蛋类样品，能够对特异性致病菌和总菌进行同时定量检测，不仅可以实现食品工业卫生和质量指标的监督，还可以在第一时间获得准确致病菌种类，为因食源性致病菌而患病的患者争取最佳治疗时间及相应药物治疗，为食品安全及准确筛查食源性致病菌种类提供有力保障。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本公开提供的对食用生蛋中的致病菌及总菌数定量检测的方法的流程示意图，其中，(a)匀浆稀释后的蛋液样品，(b)为将(a)进行蛋白质降解和去脂处理后的蛋液样品，(c)为将(b)进行膜过滤，离心洗涤，并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮得到的蛋液悬浮液，(d)为对(c)进行第一荧光标记和第二荧光标记后的得到的检测上样悬浮液，(e)为采用纳米流式检测仪对(d)的检测上样悬浮液检测后得到的双荧光散点图结果；
图2是本公开使用的纳米流式检测仪中的光路示意图；
图3是实施例1中对蛋液前处理方法的有效性及其对细菌检测的影响进行考察。其中，a为未处理蛋液显微镜检测结果(内嵌图显示离心后蛋液成分有沉淀产生)；b为蛋液经过蛋白酶降解和去脂处理后的显微镜检测结果(内嵌图显示为离心后蛋液成分未出现明显沉淀)；c和d分别为蛋液经过前处理后上样检测的散射信号和荧光信号图；e和f分别为细菌经过前处理，使用核酸染料SYTO62进行染色后上样检测的散射信号和荧光信号图；g为细菌经过前处理后，使用核酸染料SYTO 62进行染色并上样检测的散射信号和第二荧光信号双变量散点图；h为未经过前处理的的细菌悬浮液的散射信号和第二荧光信号双变量散点图。图3中，c和e是样品的散射信号脉冲时序图，其中，横坐标代表时间，纵坐标代表散射光信号强度；d和f是样品的荧光信号脉冲时序图，图中的横坐标代表时间，纵坐标代表荧光信号强度。
图4是实施例2中对含有人为添加细菌的蛋液样品的检测结果。其中，a为采用本公开的方法的检测结果；b为传统平板培养法的检测结果；c为本公开的方法与传统平板培养法所得检测结果的线性关系。图4a表示使用核酸染料SYTO 62对含有人为添加细菌的蛋液样品进行染色并上样检测结果图，图中表示样品的散射信号与第二荧光信号的双变量散点图，其中，横坐标代表散射信号强度，纵坐标代表第二荧光信号强度。
图5是实施例3中对人为添加实验室培养致病菌和非致病菌的蛋液样品的检测结果。其中，a为分别添加了致病菌鼠伤寒沙门氏菌和非致病菌大肠杆菌K12的蛋液样品的检测结果；b为理论添加致病菌和非致病菌的比例与实际检测得到的比例的线性关系。图5a为样品的第一荧光信号与第二荧光信号的双变量散点图，虚线圈出的散点代表蛋类样品中的致病菌，其余代表非致病菌。
图6是实施例4中对市售鸡蛋蛋液样品的细菌定量检测结果，其中a1-a3为市售鲜鸡蛋的检测结果，b1-b4为家中放置变质的市售鸡蛋的检测结果。图6中，a1和b1是样品的散射信号脉冲时序图，其中，横坐标代表时间，纵坐标代表散射光信号强度；a2和b2是样品的第一荧光信号脉冲时序图，图中横坐标代表时间，纵坐标代表荧光信号强度；a3和b3是样品的第二荧光信号脉冲时序图，图中横坐标代表时间，纵坐标代表荧光信号强度；b4表示b2与b3的双变量散点图，横线上方区域代表蛋类样品中的致病菌，横线下方区域代表非致病菌。
附图标记说明
1 激光器 2 半波片
3 偏振分束器 4 反射镜
5 消色差双胶合透镜 6 流通池
7 物镜 8 第一二向色滤波片
9 第一光电倍增管 10 第二二向色滤波片
11 第一带通滤波片 12 长通滤波片
13 第二光电倍增管 14 第二带通滤波片
15 第三光电倍增管
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法，该方法包括以下步骤：
S1.将待测食用生蛋样品进行匀浆，得到蛋液样品；
S2.将所述蛋液样品稀释后进行蛋白降解处理和去脂处理，以降解所述蛋液样品中的蛋白成分和脂肪成分，得到处理后的蛋液样品；
S3.将所述处理后的蛋液样品进行膜过滤，得到过滤后的蛋液样品，所述膜过滤所采用的过滤膜的孔径为5～10μm；
S4.将所述过滤后的蛋液样品进行离心洗涤并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，得到蛋液悬浮液；
S5.使用致病菌特异性探针对所述蛋液悬浮液进行第一荧光标记，并使用核酸染料对所述蛋液悬浮液进行第二荧光标记，得到检测上样悬浮液；
S6.使用高灵敏流式细胞术如纳米流式检测仪对所述检测上样悬浮液中颗粒的400～800nm的散射光和荧光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋中的致病菌数量，根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋样品中的细菌总数量。
本公开首先对待测食用生蛋类样品进行蛋白质及脂类降解、膜过滤和离心洗涤等预处理，以去除待测食用生蛋类样品中的蛋白及脂肪液滴，同时降低样品的荧光信号背景；然后利用核酸染料和特异性探针对样品进行荧光标记，再应用纳米流式检测仪对细菌荧光信号进行检测，从而实现对食用生蛋样品中细菌的识别和定量。
根据本公开，步骤S1中，所述匀浆的操作为本领域技术人员所熟知，例如可以为，将待测食用生蛋样品置于无菌超净台，对蛋壳表面消毒以去除蛋壳表面细菌，然后取出蛋内容物置于无菌锥形品中在一定转速下进行摇匀；其目的是通过将蛋清和蛋黄进行混合以打破蛋清抑菌作用，同时确保对整蛋取样的完整性。所述匀浆的条件可以包括：温度为4～37℃，转速为10～300rpm，时间为5～60min。
根据本公开，由于蛋液样品呈浓稠胶状体，步骤S2中，将匀浆后的得到所述蛋液样品进行稀释可以增加后续处理步骤的有效性，同时避免蛋液粘连容器及检测仪器。所述稀释的倍数可以根据需要进行调整，例如可以为1～100倍。所述稀释所采用的稀释剂可以为磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水。相对于0.1mL的所述蛋液样品，所述稀释剂的用量可以为1～1000μL。
根据本公开，步骤S2中，稀释后所得蛋液样品中的蛋白成分和脂质成分含量较高，且形成粒径较大的脂肪滴，这些因素将会堵塞及干扰纳米流式检测仪对蛋液样品中细菌的检测。因此，将稀释后所得蛋液样品使用蛋白酶进行蛋白降解处理，以降解样品中的蛋白成分，然后进行去脂处理，以降解样品中的脂质成分。进一步地，所述蛋白降解处理可以使用蛋白酶进行，所述蛋白酶为蛋白酶K、胰蛋白酶和弹性蛋白酶中的至少一种，所述蛋白酶的终浓度可以为小于5mg/mL，所述蛋白降解处理的条件可以包括：温度为10～50℃，时间为5～30min。所述去脂处理使用的去脂试剂可以为Triton X-100、Nonidet P 40或TWEEN-20，所述去脂试剂的终浓度的体积分数为：0.1～10％；所述去脂处理的条件包括：温度为0～50℃，时间为5～30min。
根据本公开，步骤S3中，将所述处理后的蛋液样品进行膜过滤，得到过滤后的蛋液样品，这一步能够将样品中可能存在的大颗粒团聚物质减少到最低且不影响细菌回收率。
根据本公开，步骤S4中，所述离心的时间可以为1～30min，转速可以为1000～10000rpm。然后将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，所述悬浮介质可以为本领域的常规种类，例如磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水。
根据本公开，步骤S5中，核酸染料能够对所述蛋液悬浮液中的所有细菌颗粒进行标记，所述细菌包括致病菌和非致病菌，而所述致病菌特异性探针则只对其中的致病菌进行标记，也就是说，经过第一荧光标记和第二荧光标记后，所述蛋液悬浮液中的致病菌被两种探针同时标记，在步骤S6中将同时发射两种荧光，而非致病菌仅发射核酸染料荧光，两种探针的荧光发射波段不同，因而在步骤S6中可根据荧光信号检测得到非致病菌的数量和细菌总数量。
进一步地，所述致病菌特异性探针可以为标记了荧光染料的特异性抗体探针、标记了荧光染料的特异性适配子探针或标记了荧光染料的抗菌肽，所述荧光染料可以为有机染料、量子点或荧光蛋白；所述第一荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为4～50℃，时间为1～60min；以0.1mL的所述蛋液悬浮液为基准，所述致病菌特异性探针用量可以为0.1～100μg，优选为1～50μM。所述核酸染料可以为EB(溴化乙锭)染料、PI(碘化吡啶)染料、TOTO系列染料、TO-PRO系列染料、SYTOX系列染料、SYTO系列染料、SYBR系列染料、DAPI染料或Hoechst染料；所述第二荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为4～50℃，时间为1～60min；以0.1mL的所述蛋液悬浮液为基准，所述核酸染料的浓度可以为1～100μM，优选为1～50μM。
根据本公开，所述检测上样悬浮液中的颗粒包括致病菌、非致病菌及残留杂质颗粒，都具有散射信号，为了进一步使致病菌、非致病菌颗粒被明确分辨，该方法还可以包括：步骤S6中，使用高灵敏流式细胞术如纳米流式检测仪对所述检测上样悬浮液中颗粒的400～800nm的散射光和荧光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋中的致病菌数量，根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋样品中的细菌总数量。根据所述检测上样悬浮液中的颗粒的散射光可以判断杂质颗粒。通过对比纳米流式检测仪的散射通道、第一荧光及第二荧光通道，可准确判断杂质颗粒、致病菌和非致病菌。
根据本公开，所述纳米流式检测仪的操作可以包括：
a.使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述检测上样悬浮液聚焦为微米级样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的细菌，且所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；
b.向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.01～10毫秒，优选为0.2～2毫秒；
c.将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由探测区发出的光信号；
d.将通过透镜系统收集到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个细菌所发出的光的电信号；
e.根据所述电信号对所述细菌进行定量分析。
其中，所述鞘液可以为流式细胞术中常规使用的各种鞘液，例如水、生理盐水和磷酸盐缓冲液中的至少一种，优选使用水作为鞘液，更优选为超纯水。所述流体动力学聚焦具有流式细胞术中常规的定义，具体是指所述鞘液包绕着样品液体流动，样品液体在所述鞘液的作用下形成液流，即样品液流。可以通过流式细胞术领域常规的调节方法，调节所述细菌在所述检测上样悬浮液中的浓度，使得所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动。
其中，为了进一步提高所述纳米流式检测仪的灵敏度和精确度，所述探测区的体积可以为1～5000fL，优选为50～500fL；所述样品液流的直径可以为0.1～20μm，优选为1～5μm；所述样品液流的流量可以为1～500nL/min，优选为1～100nL/min；所述鞘液的流速可以为1～100cm/sec，优选为1～10cm/sec；所述测量光的光束直径可以为所述样品液流的直径的1～150倍，优选为2～50倍。
其中，在获得所述电信号后，根据所述电信号对所述细菌(包括致病菌和非致病菌)进行定量分析的方法可以为常规的方法，例如将空白样品和/或标准样品(包括内标和外标)与待测样品的电信号进行比较。
根据本公开的方法，其中，所述检测上样悬浮液中颗粒的400～800nm的散射光来自于所述上样悬浮液中的杂质颗粒及所有细菌；荧光信号来自于所述上样悬浮液中的致病菌和其他菌，同时具备第一荧光信号和第二荧光信号的细菌为致病菌，仅有第二荧光信号的为其他菌，仅有散射光信号的为杂质颗粒。这样，根据所述上样悬浮液所得电信号可准确区分出杂质颗粒和细菌颗粒，包括区分致病菌与其他菌。通过对检测到的细菌颗粒进行计数即可准确获得待测食用生蛋样品中目标致病菌及总菌的含量。
本公开使用的纳米流式检测仪能够通过对检测样本中杂质颗粒和细菌颗粒的逐一分析获得颗粒散射和荧光信号的散点图和各参数的统计直方图，不受限于样本中可能含有杂质颗粒而带来的散射光信号及微弱荧光信号的影响。特别需要指出的是，采用纳米流式检测仪对细菌进行检测计数不受细菌荧光强度差异的影响，配合特异性探针，可适用于真实样品中任何细菌的特异检测及总菌定量检测。
本公开提供的方法适用于检测各种食用生蛋样品，例如，所述食用生蛋可以包括鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋、鸽蛋和鸵鸟蛋中的至少一种。所述致病菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、葡萄球菌、变形杆菌、产碱杆菌、枯草杆菌、巴氏杆菌、果胶杆菌、禽杆菌、哈夫尼菌、梭菌、巨型球菌和黄干菌中的至少一种。
本公开提供的方法适用于各种食用生蛋类样品，能够对特异性致病菌和总菌进行同时定量检测，不仅可以实现食品工业卫生和质量指标的监督，还可以在第一时间获得准确致病菌种类，为因食源性致病菌而患病的患者争取最佳治疗时间及相应药物治疗，为食品安全及准确筛查食源性致病菌种类提供有力保障。
以下通过实施例进一步详细说明本公开。
以下实施例中，对食用生蛋样品的检测方法为：参考图2所示的光路系统，用压力为150kPa的氮气将待测的样品悬浮液液体压入密闭的进样管，调节氮气的压力，使得样品液流的流量为5nL/min。其中，所述进样管为内径为40μm、外径为240μm的石英毛细管，毛细管末端被处理成约12度的锥形喷嘴。所述进样管轴向自上而下地插入流通室，所述流通室材质为石英，长方4×4×8mm的长方体腔体，腔内为250×250μm孔道，所述进样管的末端位于所述流通室轴向且距离上端4mm处的位置。所述进样管的末端与激光探测区距离约500μm，波长为488nm的激光经Thorlabs公司的型号为AC050-010-A1的消色差双胶合透镜，聚焦成束腰直径为10μm的激光光束。探测区的体积为0.8pL，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为1毫秒。
由激光器1(购自Coherent(Beijing)Commercial Company Ltd.,型号：apphireLP 488-200CW CDRH USB Laser System)发出的488nm的激光经半波片2、偏振分束器3、反射镜4、消色差双胶合透镜5后照射至位于流通池6的样品管内，蛋液样品由激光照射后发出光信号，物镜7(购自Nikon，型号40×，NA＝0.60)收集，被第一二向色滤光片8(购自SemrockInc.，Rochester，NY，型号：DicF-500)分成两束，波长小于500nm的光信号(散射光)被90°反射入第一光电倍增管9(购自Hamamatsu，Japan，型号R928)中检测，大于500nm的光信号，被第二二向色滤光片10(购自Semrock Inc.，Rochester，NY，型号：DicF-605)分成两束，波长小于605nm的光信号(第一荧光信号)被90°反射，经过第一带通滤波片11(购自SemrockInc.，型号BP520/35)和长通滤光片12(购自Semrock Inc.，型号LP488)，进入第二光电倍增管13(购自Hamamatsu，Japan，型号R928)中检测(该通道检测的荧光信号为致病菌荧光信号)。波长大于605nm的光信号(第二荧光信号)经过第二带通滤波片14(购自Semrock Inc.，型号BP700/40)滤除杂散光及泄露的荧光信号，最终进入第三光电倍增管15(购自Hamamatsu，Japan，型号R928)检测(该通道检测的荧光信号为样品中所有细菌的荧光信号)。
实施例1
本实施例用于说明对食用生蛋的前处理方法的有效性及检验前处理方法对细菌检测的影响，前处理实验细菌为实验室培养获得。
本实施例采用的食用生蛋样本取样方案为：将鲜蛋置于无菌超净台，用75体积％的乙醇擦拭蛋壳，对蛋壳进行消毒处理，然后对蛋壳进行小心破碎，将蛋内容物置于250mL无菌锥形瓶，4℃，250rpm摇匀10min，制备无菌蛋液样本。
取上述制备的无菌蛋液样本0.1mL，添加630μL的PBS，70μL蛋白酶K(20mg/mL)，200μLTriton X-100(10体积％)，总体积为1mL，即蛋液稀释10倍。酶的终浓度为1.4mg/mL，去脂试剂的终浓度为2体积％，接着37℃水浴20min，然后采用5μm微孔膜进行膜过滤，随后进行离心洗涤，每次洗涤弃上清900μL，离心速度为8000rpm，离心时间5min，重复3遍后，PBS重悬，制备得上样样品。上样样品分别用荧光显微镜和纳米流式检测仪进行检测，显微镜图显示未处理的蛋液样本存在较大的颗粒团聚物(图3a)，而经过蛋白酶降解和去脂处理的蛋液样本无明显团聚物，视野内无明显颗粒(图3b)；纳米流式检测光源为488nm激光，检测通道主要为散射通道(DicF-500)和第一荧光通道(LP488,BP520/30)，经过前处理的蛋液样本的检测结果如图3c和3d所示，经过蛋白和脂质的降解、过膜、离心洗涤后，鲜蛋液中的脂质颗粒及蛋白团聚的颗粒被大量降解及滤除，散射通道有信号较低的杂质颗粒，第一荧光通道有极弱的背景荧光信号，该实验表明所采取的蛋液前处理方法可有效去除杂质颗粒的影响。
本实施例采用的实验室培养细菌为大肠杆菌K12，其培养方法为：把细菌接种于2mL液体培养基中培养至OD值等于1左右。取培养好的菌悬液0.1mL，添加0.9mL PBS进行稀释10倍，离心后用PBS重悬，制备得实验室菌液，此时菌浓度约6×108cfu/mL。
取上述实验室菌液0.1mL，添加630μL的PBS，70μL蛋白酶K(20mg/mL)，200μLTritonX-100(10体积％)，总体积为1mL，即菌液稀释10倍。酶的终浓度为1.4mg/mL，去脂试剂的终浓度为2体积％，接着37℃水浴20min，然后采用5μm微孔膜进行膜过滤，随后进行离心洗涤，每次洗涤弃上清900μL，离心速度为8000rpm，离心时间5min，重复3遍后，PBS重悬，制备得前处理菌液样本。取50μL前处理菌液样本，加入0.5μL核酸染料SYTO 62(1mM，购自赛默飞，目录号为S11344)，室温避光孵育10min，制备得前处理菌液上样样品。使用纳米流式检测仪在488nm激光下对其进行检测，检测通道主要为散射通道(DicF-500)和第二荧光通道(DicF-500,DicF-605,BP700/40)，检测结果如图所示，经过前处理的菌液散射信号(图3e)和荧光信号(图3f)一一对应，且信噪比良好；对比经过前处理菌液(图3g)和未经过前处理的菌液(图3h)的散射信号和第二荧光信号的相关散点图，二者基本一致。因此，前处理方法对细菌本身无任何影响。
本实施例可以证明，采用本公开提供的方法能够排除蛋液样品中蛋白质和脂质成分的干扰，且该处理方法对细菌数量及生理状态无任何影响，可用于细菌的准确计数。
实施例2
本实施例用于说明本公开提供的方法对人为添加至食用生蛋中细菌的检测结果与传统平板培养法的检测结果的对比。
本实验通过食用生蛋样品制备蛋液样本的方法与实施例1一致。采用与实施例1中方案进行鲜蛋取样，采用与实施例1一致的细菌培养方法培养大肠杆菌K12。
本实施例采用的有菌蛋液样本制备方案为：取制备好的大肠杆菌K12菌液样本1mL进行离心并重悬至1mL生蛋无菌样本中，涡旋混匀后，得到有菌蛋液样本。
取制备好的有菌蛋液样本0.1mL，添加630μL的PBS，70μL蛋白酶K(20mg/mL)，200μLTriton X-100(10体积％)，总体积为1mL，即蛋液稀释10倍。酶的终浓度为1.4mg/mL，去脂试剂的终浓度为2体积％，接着37℃水浴20min，然后采用5μm微孔膜进行膜过滤，随后进行离心洗涤，每次洗涤弃上清900μL，离心速度为8000rpm，离心时间5min，重复3遍后，PBS重悬，制备得前处理菌液样本。取50μL前处理菌液样本，加入0.1μL核酸染料SYTO 62(1mM，购自赛默飞，目录号为S11344)，室温避光孵育10min，制备得有菌蛋液上样样本。使用纳米流式检测仪在488nm激光下对其进行检测，检测通道主要为散射通道和第二荧光通道(DicF-500,DicF-605,BP700/40)，检测结果如图4a所示。检测得到本实施例的蛋液样品中的大肠杆菌K12的数量为6.73±0.3×107cells/mL。
同样取制备好的有菌蛋液样本0.1mL，利用传统平板法进行点板计数，点板结果如图4b所示。采用平板培养法培养检测得到大肠杆菌K12的数量为6.78±0.8×107cfu/mL。
分别制备大肠杆菌K12数量为6×108cfu/mL、3×108cfu/mL、6×107cfu/mL、3×107cfu/mL、6×106cfu/mL、6×105cfu/mL左右的蛋液样品，分别采用本公开的方法和传统平板培养法对其进行检测，得到的线性关系如图4c所示，横坐标代表传统平板培养法的检测结果，纵坐标代表采用本公开的方法得到的检测结果，可见，二者的计数结果具有很好的线性关系，相关系数R2等于0.9851。
本实施例可以证明，本公开的方法对食用生蛋中细菌的检测和传统方法的检测结果基本一致。
实施例3
本实施例用于说明本公开提供的方法对人为添加至食用生蛋中目标致病菌与非致病菌比例的检测结果与实际添加比例相符合。
本实施例中采用Alexa Fluor 488标记的鼠伤寒沙门氏菌特异性单克隆抗体探针进行第一荧光标记，该抗体购自abcam，货号为ab8247，该抗体特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的脂多糖(LPS)，Alexa Fluor 488购自赛默飞，货号为A2000，Alexa Fluor 488与抗体结合的方法参考赛默飞标记策略，见赛默飞A30006方法。
本实验通过食用生蛋制备蛋液样本的方法与实施例1一致。非致病菌模型大肠杆菌K12浓度与实施例2中保持一致，此时菌浓度约6×108cfu/mL，根据实施例2中计数初始准确浓度为：6.73×108cfu/mL。
同样采用实例1中的方法制备带有鼠伤寒沙门氏菌的致病菌蛋液样本，采用实施例2中纳米流式检测仪对添加鼠伤寒沙门氏菌的蛋液进行计数，并将浓度稀释至6.7×108cfu/mL。
含致病菌及非致病菌的混合蛋液样本制备如下：分别取含致病菌蛋液样本0.5mL、大肠杆菌K12蛋液样本0.5mL，两者混合均匀，制备得致病菌与非致病菌同比例蛋液样本，体积为1mL。细菌添加至蛋液与本实施例1的人为添加细菌样品实验方案一致，制备得到混合菌蛋液样本，此时菌的总浓度为6.7×108cfu/mL左右。
取制备好的混合蛋液样本0.1mL，添加630μL的PBS，70μL蛋白酶K(20mg/mL)，200μLTriton X-100(10体积％)，总体积为1mL，即蛋液稀释10倍。酶的终浓度为1.4mg/mL，去脂试剂的终浓度为2体积％，接着37℃水浴20min，然后采用5μm微孔膜进行膜过滤，随后进行离心洗涤，每次洗涤弃上清900μL，离心速度为8000rpm，离心时间5min，重复3遍，PBS重悬后，取50μL重悬液，加入Alexa Fluor 488标记的鼠伤寒沙门氏菌特异性单克隆抗体探针(700μg/mL)0.7μL，摇床避光孵育，摇床温度37℃，孵育时间30min，转速250rpm。随后，加入0.5μL核酸染料SYTO 62(1mM，购自赛默飞，目录号为S11344)，室温避光孵育10min，制备得含有混合菌液的蛋液上样样品(以1mL的蛋液悬浮液为基准，Alexa Fluor 488标记的鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体探针终浓度为10μg/mL，核酸染料SYTO 62的浓度为10μM)。使用纳米流式检测仪在488nm激光下对其进行检测，检测通道主要为散射通道(DicF-500)第一荧光通道(DicF-500,BP523/35,LP488)和第二荧光通道(DicF-500,DicF-605,BP700/40)，检测结果如图所示5a所示，从第一荧光通道和第二荧光通道关联散点图可以明显区分出致病菌鼠伤寒沙门氏菌和非致病菌大肠杆菌K12，得到致病菌比例为46.3％，与理论值基本一致。
含不同比例致病菌及非致病菌的蛋液样本制备如下：分别取含致病菌样本和非致病菌样本：(0mL+1mL)、(0.05mL+0.95mL)、(0.1mL+0.9mL)、(0.2mL+0.8mL)、(0.7mL+0.3mL)、(1mL+0mL)制备得理论上含致病菌比例分别为：0％、5％、10％、20％、70％及100％，样品前处理及染色步骤与本例中同等比例混合菌一致。使用纳米流式检测仪在488nm激光下对其进行检测，检测通道主要为散射通道(DicF-500)、第一荧光通道(DicF-500,BP523/35,LP488)和第二荧光通道(DicF-500,DicF-605,BP700/40)，检测结果如图所示5b所示，检测混合菌比例与理论比例具有很好的线性关系，相关系数R2等于0.9983。
本实施例可以证明，采用本公开提供的方法可以准确检测出食用生蛋液中混合菌的浓度及致病菌比例。
实施例4
本实施例用于说明本公开提供的方法对市售食用生蛋中目标致病菌与非致病菌检测的实用性。以下以超市购买的新鲜鸡蛋和已知变质鸡蛋进行细菌检测为例。
本实验通过食用生蛋样品制备蛋液样本的方法与实施例1一致,样本取样扩大到1mL，取制备好的混合蛋液样本1mL，添加6300μL的PBS，700μL蛋白酶K(20mg/mL)，2000μLTriton X-100(10体积％)，总体积为10mL，即蛋液稀释10倍。酶的终浓度为1.4mg/mL，去脂试剂的终浓度为2体积％，接着37℃水浴20min，然后采用5μm微孔膜进行膜过滤，随后进行离心洗涤，每次洗涤弃上清9000μL，离心速度为8000rpm，离心时间5min，重复3遍，PBS重悬沉淀物至100μL，取50μL重悬液，按照实施例3进行荧光标记及细菌检测。检测结果如图6所示，检测得本实施例中细菌含量：市售新鲜鸡蛋中细菌的含量为几乎为0，而变质鸡蛋的细菌含量高达2.0×108cfu/mL，其中，致病菌鼠伤寒沙门氏菌含量高达20.1％，从以上结果表明，变质鸡蛋的微生物含量极高，且含有相当数目的致病菌，综上结果，该方法适用性极强，可用于对市售鸡蛋质控。
由实施例1-4可见，本公开的方法能检测食用生蛋中的各种细菌，且同时定量致病菌含量，检测结果精确，适用于真实样品的检测。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1.将待测食用生蛋样品进行匀浆，得到蛋液样品；
S2.将所述蛋液样品稀释后进行蛋白降解处理和去脂处理，以降解所述蛋液样品中的蛋白成分和脂肪成分，得到处理后的蛋液样品；
S3.将所述处理后的蛋液样品进行膜过滤，得到过滤后的蛋液样品，所述膜过滤所采用的过滤膜的孔径为5～10μm；
S4.将所述过滤后的蛋液样品进行离心洗涤并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，得到蛋液悬浮液；
S5.使用致病菌特异性探针对所述蛋液悬浮液进行第一荧光标记，并使用核酸染料对所述蛋液悬浮液进行第二荧光标记，得到检测上样悬浮液；
S6.使用高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光进行检测，并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋中的致病菌数量，根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋样品中的细菌总数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S1中，所述匀浆的条件包括：温度为4～37℃，转速为10～300rpm，时间为5～60min。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S2中，所述稀释所采用的稀释剂为磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水；相对于0.1mL的所述蛋液样品，所述稀释剂的用量为1～1000μL；
所述蛋白降解处理使用蛋白酶进行，所述蛋白酶为蛋白酶K、胰蛋白酶和弹性蛋白酶中的至少一种，所述蛋白酶的终浓度为0.1～10mg/mL；所述蛋白降解处理的条件包括：温度为10～50℃，时间为5～30min；所述去脂处理使用的去脂试剂为Triton X-100、Nonidet P 40或TWEEN-20，所述去脂试剂的终浓度为0.1～10体积％；所述去脂处理的条件包括：温度为0～50℃，时间为5～30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S4中，所述离心的时间为1～30min，转速为1000～10000rpm。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S5中，所述致病菌特异性探针为标记了荧光染料的特异性抗体探针、标记了荧光染料的特异性适配子探针或标记了荧光染料的抗菌肽，所述荧光染料为有机染料、量子点或荧光蛋白；所述第一荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为4～50℃，时间为1～120min；
所述核酸染料为EB染料、PI染料、TOTO系列染料、TO-PRO系列染料、SYTOX系列染料、SYTO系列染料、SYBR系列染料、DAPI染料或Hoechst染料；所述第二荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为4～50℃，时间为1～60min。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S5中，以0.1mL的所述蛋液悬浮液为基准，所述致病菌特异性探针用量为0.01～100μg，所述核酸染料的浓度为0.1～100μM。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S6中，使用高灵敏流式细胞术如纳米流式检测仪对所述检测上样悬浮液中颗粒的400～800nm的散射光和荧光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋中的致病菌数量，根据所述检测上样悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号计算所述待测食用生蛋样品中的细菌总数量。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述高灵敏流式细胞术的操作包括：
a.使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述检测上样悬浮液聚焦为微米级样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的细菌，且所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；
b.向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.01～10毫秒，优选为0.2～2毫秒；
c.将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由探测区发出的光信号；
d.将通过透镜系统收集到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个细菌所发出的光的电信号；
e.根据所述电信号对所述细菌进行定量分析。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述探测区的体积为1～5000fL，优选为50～500fL；所述样品液流的直径为0.1～20μm，优选为1～5μm；所述样品液流的流量为1～500nL/min，优选为1～100nL/min；所述鞘液的流速为1～100cm/sec，优选为1～10cm/sec；所述测量光的光束直径为所述样品液流的直径的1～150倍，优选为2～50倍。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述食用生蛋包括鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋、鸽蛋和鸵鸟蛋中的至少一种；
所述致病菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、葡萄球菌、变形杆菌、产碱杆菌、枯草杆菌、巴氏杆菌、果胶杆菌、禽杆菌、哈夫尼菌、梭菌、巨型球菌和黄干菌中的至少一种。
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