CN112313495A - 用于抗微生物剂敏感性测试的样品制备 - Google Patents

用于抗微生物剂敏感性测试的样品制备 Download PDF

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Abstract

本公开内容提供了用于来自患者的微生物样品制备的新型方法，所述方法得到了用于抗微生物剂敏感性测试（AST）的高质量输入材料，而无需平板培养。本公开内容的某些方法包括多重分离步骤，以纯化用于AST中的微生物样品。

Description

用于抗微生物剂敏感性测试的样品制备
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年3月2日提交，且名称为“Sample Preparation forAntimicrobial Susceptibility Testing”的美国临时申请62/637,786的优先权。前述申请整体且为了所有目的引入本文作为参考。
公开内容领域
本公开内容涉及临床微生物样品的制备和测试。
背景
抗微生物剂抗性的微生物感染与不良临床结果（包括受感染患者中的发病率、死亡率和健康护理成本增加）相关。在过去的30年中，这些生物在美国的流行率稳步增加。微生物的表型抗微生物剂敏感性测试（AST）对于告知医师适当的治疗方案至关重要。使用目前方法，AST测定一般需要最少8小时，由于许多临床微生物学实验室中的轮班工作而使其成为过夜过程。在等待来自目前AST方法的测定的同时，患者经常被施用广谱抗微生物剂，其经常对患者健康具有显著的不利作用和/或促成正在增加的抗微生物剂抗性流行。此外，获得准确的抗微生物治疗信息的这种时间延迟增加患者在医院中的停留，从而增加患者的成本和不便。
在这种背景下，政府和行业利益相关者已提议了促进医院中的抗微生物剂管理的规定。然而，由于目前AST方法和抗微生物剂处方实践的局限性，抗微生物剂管理努力可能变得很复杂。本发明人先前已公开了用于快速AST的方法，其可以减少AST测定所需的时间并促进抗微生物剂管理。例如，共同拥有的美国专利号9,834,808和PCT公开WO 2018/119439中描述了利用结合微生物表面的荧光探针的AST系统和方法。这些系统和方法的优点在于，它们以经济有效的方式满足了这个需求，并且可以与现有的测定硬件组件兼容。
传统的AST方法利用基于平板的培养物样品制备，以纯化微生物并且从原始样品中去除污染物，该过程通常需要过夜培养。减少或消除关于过夜、基于平板的培养的需求可以潜在地加速将AST结果递交给开处方者，其依次又可以改善患者结果。因而，当今该领域中需要快速的样品制备方法，其将微生物病原体维持在合适的状态下用于执行AST，同时去除细胞如血细胞和可溶性种类如抗生素。
概述
本公开内容提供了用于直接从患者样品和/或培养的血液样品中获得合适的AST输入材料的系统和方法，所述样品通过确定的方法（例如连续的血液培养监测）测定为对于微生物生长呈阳性。因此，下文所述的系统和方法允许用于AST的患者样品的快速处理，并且减少了关于快速AST测定结果的时间。在本公开内容的各个方面，患者样品是人样品或经处理的人样品，例如尿、血液、滑液、脑脊髓液、痰、支气管肺泡灌洗液、鼻拭子或伤口拭子。本公开内容的处理方法可以利用酶来降解样品基质，例如用于痰，或利用流体来分散样品，例如用于拭子。如本领域技术人员已知的，血液样品也可以通过液体培养或“血瓶”进行处理。此类样品可以是“阳性”血液培养物，或者可以来自在33-37℃下优选温育4-10小时，但尚未确定为阳性的瓶。
根据本公开内容的这些方面，提供了从血液培养物中分离微生物的方法。在本公开内容的某些实施方案中使用的血液培养物可以以任何合适的方式，例如由血液培养物进行制备，所述血液培养物已使用连续监测血液培养系统确定为阳性的，所述系统例如BACTEC®（Becton-Dickinson）、BacT/Alert®（bioMérieux）和VersaTrekTM（ThermoFisher）。通过在初始离心后利用裂解剂，本公开内容的示例性方法能够适当地去除影响光学测量的多种溶血凝块、真核细胞和真核细胞片段，同时易于自动化。具体地，本文描述的方法克服了对于基于凝胶的滤器，例如由Lupetti等人描述的血清分离管，或固体滤器，例如在Machen等人PLoS ONE 9（2）：e87870中描述的膜滤器(其表征了目前的领域标准方法)的需要。
在一些方面，本公开内容描述了用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：（a）以<1000 RCF离心；（b）收集来自步骤a的第一上清液；（c）用一种或多种裂解剂处理第一上清液；（d）以>1000 RCF离心来自步骤c的经处理的第一上清液；（e）去除来自步骤d的上清液；（f）将微生物团块重悬浮于盐水或合适的缓冲溶液中；（g）任选地在步骤f的团块重悬浮之后，任选地通过重复步骤d-e，将团块洗涤一次或多次；并且（h）定量细胞悬浮液。
进一步地，裂解剂可以包括但不限于皂苷、tritons、tweens、氯化铵、脱水山梨糖醇酯、非离子型聚氧乙烯表面活性剂。除一种或多种裂解剂之外，裂解剂还可以包含一种或多种水溶性化合物。水溶性化合物可以包括但不限于多聚茴香脑硫酸钠（SPS）、聚丙二醇（PPG）、碳酸钾、碳酸氢钾、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸（CAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠。裂解剂可以包含皂苷、SPS和PPG。裂解剂可以包含氯化铵，并且在裂解期间添加碳酸氢钾。裂解剂可以包含氯化铵和碳酸氢钾以及EDTA或EDTA钠盐。裂解剂可以包含Brij 97和CAPS。
进一步地，可以不洗涤团块。团块可以洗涤一次。洗涤可以用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。团块可以在洗涤溶液添加之后进行重悬浮。团块可以在洗涤溶液添加之后不进行重悬浮。团块可以洗涤两次。洗涤可以用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。团块可以在洗涤溶液添加之后进行重悬浮。团块可以在洗涤溶液添加之后不进行重悬浮。可以在500 nm至700 nm之间的一个或多个波长处，光学定量重悬浮的团块中的细胞。细胞可以通过分光计、分光光度计或浊度计进行定量。细胞可以在用一种或多种前体化合物处理悬浮细胞之后进行定量。前体化合物可以包括但不限于PicoGreen、吖啶橙、RedSafe、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚、溴化乙锭、SYBR绿I、SYBR绿II、萤光素和刃天青。可以将前体化合物加入重悬浮的团块悬浮液的等分试样中，然后测量该等分试样。第一离心可以是500RCF。第二离心可以是2370 RCF。第三离心可以是2370 RCF。第四离心可以是2370 RCF。一次或多次离心可以以<90°的固定角度执行。一次或多次离心可以以相对于旋转轴30°、45°、60°的固定角度执行。
在一些方面，可以对来自连续监测系统的阳性血液培养物执行该方法。可以对引入连续监测血液培养系统内之后≤48小时转阳的培养物执行该方法。可以对尿样品执行该方法。衍生自患者的样品体积小于20 mL、15 mL、10 mL。
在一个实施方案中，本公开内容讨论了用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：（a）对样品施加< 1000 × g的相对离心力（RCF），从而产生微粒耗竭的上清液；（b）在微粒耗竭的上清液中裂解至少一种患者细胞或血小板，从而产生患者细胞耗竭的上清液；（c）对患者细胞耗竭的上清液施加>1000 × g的RCF，从而形成团块；（d）收集并重悬浮团块；（e）任选地通过重复步骤c和d，将团块洗涤一次或多次；并且（f）评价盐水或缓冲溶液中的微生物密度。
在该实施方案中，裂解剂可以包括但不限于皂苷、tritons、tweens、氯化铵、脱水山梨糖醇酯、非离子型聚氧乙烯表面活性剂。除一种或多种裂解剂之外，裂解剂还可以包含一种或多种水溶性化合物。水溶性化合物可以包括但不限于多聚茴香脑硫酸钠（SPS）、聚丙二醇（PPG）、碳酸钾、碳酸氢钾、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸（CAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠。裂解剂可以包含皂苷、SPS和PPG。裂解剂可以包含氯化铵，并且在裂解期间添加碳酸氢钾。裂解剂可以包含氯化铵和碳酸氢钾以及EDTA或EDTA钠盐。裂解剂可以包含Brij 97和CAPS。
在该实施方案中，可以不洗涤团块。团块可以洗涤一次。洗涤可以用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。团块可以洗涤两次。洗涤可以用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。团块可以重悬浮于盐水、中性缓冲液或生长培养基中。可以在500 nm至700 nm之间的一个或多个波长处，光学评价重悬浮的团块中的细胞。细胞可以通过分光计、分光光度计或浊度计进行评价。细胞可以在用一种或多种前体化合物处理悬浮细胞之后进行定量。前体化合物可以包括但不限于PicoGreen、吖啶橙、RedSafe、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚、溴化乙锭、SYBR绿I、SYBR绿II、萤光素和刃天青。可以将前体化合物加入重悬浮的团块悬浮液的等分试样中，然后测量该等分试样。第一离心可以是500 RCF。第二离心可以是2370 RCF。第三离心可以是2370 RCF。第四离心可以是2370 RCF。一次或多次离心可以以<90°的固定角度执行。一次或多次离心可以以相对于旋转轴30°、45°、60°的固定角度执行。
在该实施方案中，可以对来自连续监测系统的阳性血液培养物执行该方法。可以对引入连续监测血液培养系统内之后≤48小时转阳的培养物执行该方法。可以对尿样品执行该方法。衍生自患者的样品体积小于20 mL、15 mL、10 mL。
在另一个方面，本公开内容描述了用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：（a）对样品施加第一相对离心力，从而产生相对澄清的上清液；（b）在相对澄清的上清液中裂解至少一种患者细胞或血小板，从而产生患者细胞耗竭的上清液；（c）对来自步骤b的样品施加第二相对离心力，从而形成团块；（d）去除上清液；（e）任选地通过重复步骤c和d，将团块洗涤一次或多次；（f）将团块重悬浮于合适的盐水或缓冲溶液中；并且（g）评价盐水或缓冲溶液中的微生物密度。
在这个方面，裂解至少一种患者细胞的步骤可以包括使澄清的上清液与选自以下的裂解剂接触：皂苷、tritons、tweens、氯化铵、脱水山梨糖醇酯、非离子型聚氧乙烯表面活性剂。除一种或多种裂解剂之外，裂解剂还可以包含一种或多种水溶性化合物。水溶性化合物可以包括但不限于多聚茴香脑硫酸钠（SPS）、聚丙二醇（PPG）、碳酸钾、碳酸氢钾、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸（CAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠。裂解剂可以包含皂苷、SPS和PPG。裂解剂可以包含氯化铵，并且在裂解期间添加碳酸氢钾。裂解剂可以包含氯化铵和碳酸氢钾以及EDTA或EDTA钠盐。裂解剂可以包含Brij 97和CAPS。
在这个方面，可以不洗涤团块。团块可以洗涤一次。洗涤可以用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。团块可以洗涤两次。洗涤可以用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。团块可以重悬浮于盐水、中性缓冲液或生长培养基中。可以在500 nm至700 nm之间的一个或多个波长处，光学评价重悬浮的团块中的细胞。细胞可以通过分光计、分光光度计或浊度计进行评价。细胞可以在用一种或多种前体化合物处理悬浮细胞之后进行定量。前体化合物可以包括但不限于PicoGreen、吖啶橙、RedSafe、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚、溴化乙锭、SYBR绿I、SYBR绿II、萤光素和刃天青。可以将前体化合物加入重悬浮的团块悬浮液的等分试样中，然后测量该等分试样。所施加的第一RCF可以低于所施加的第二RCF。第一RCF可以是500 RCF。第二RCF可以是2370 RCF。第三RCF可以是2370 RCF。第四RCF可以是2370 RCF。一个或多个RCF可以以<90°的固定角度执行。
在该实施方案中，可以对来自连续监测系统的阳性血液培养物执行该方法。可以对引入连续监测血液培养系统内之后≤48小时转阳的培养物执行该方法。衍生自患者的样品体积可以小于10 mL。
在另一个实施方案中，本公开内容描述了用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：（a）以<1000 ×g离心；（b）收集来自步骤a的上清液，随后以>1000 ×g离心；（c）清洗由步骤b产生的团块；（d）将团块重悬浮；并且（e）将来自重悬浮团块的微生物细胞接种到AST盒的多个孔中的每一个内。该方法可以进一步包括在促进微生物生长的条件下温育重悬浮的细胞。团块可以通过倒置离心进行清洗。团块可以通过重悬浮随后为另外的离心步骤进行清洗，这之后去除上清液。团块可以重悬浮于生长培养基中。在团块重悬浮后，可以将样品等分到两个或更多个独立的储器内。细胞浓度的测量可以通过吸光度或浊度法光学执行。样品可以是尿、血液、滑液、脑脊髓液、痰、支气管肺泡灌洗液、鼻拭子或伤口拭子。样品可以是已在液体生长培养基中培养的血液。促进微生物生长的条件可以包括33-37℃的温度。促进微生物生长的条件包括搅动。
还在本公开内容中的是用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的方法的实施方案，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：（a）将样品置于配备有分离膜的离心管内；（b）以<1000 ×g离心；（c）洗涤膜以重悬浮沉积的细菌；并且（d）测量重悬浮细胞的浓度。该方法进一步包括在促进微生物生长的条件下温育重悬浮的细胞。在细菌重悬浮后，可以将样品等分到两个或更多个独立的储器内。细胞浓度的测量可以通过吸光度或浊度法光学执行。样品可以是尿、血液、滑液、脑脊髓液、痰、支气管肺泡灌洗液、鼻拭子或伤口拭子。样品可以是已在液体生长培养基中培养的血液。促进微生物生长的条件可以包括33-37℃的温度。促进微生物生长的条件可以包括搅动。
本公开内容进一步讨论了用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：（a）对样品施加第一相对离心力，从而形成第一团块和第一上清液；（b）对第一上清液施加第二相对离心力，从而形成第二团块和第二上清液；（c）清洗由步骤b产生的第二团块；（d）将第二团块重悬浮于缓冲溶液中；并且（e）测量重悬浮于缓冲溶液中的微生物浓度。该方法进一步包括在促进微生物生长的条件下温育重悬浮的微生物。第一相对离心力可以低于第二相对离心力。团块可以通过倒置离心进行清洗。团块可以通过重悬浮随后为另外的离心步骤进行清洗，这之后可以去除上清液。团块可以重悬浮于生长培养基中。在团块重悬浮后，可以将样品等分到两个或更多个独立的储器内。细胞浓度的测量可以通过吸光度或浊度法光学执行。样品可以是尿、血液、滑液、脑脊髓液、痰、支气管肺泡灌洗液、鼻拭子或伤口拭子。样品可以是已在液体生长培养基中培养的血液。促进微生物生长的条件可以包括33-37℃的温度。促进微生物生长的条件可以包括搅动。
在又一个实施方案中，本公开内容讨论了用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的体外微生物分离系统，所述样品包含衍生自患者的病原微生物，所述体外微生物分离系统包括：流体处理模块，其被配置为允许溶液对样品的添加以及从样品中的去除；离心机，其具有延伸穿过离心机的固定转子的纵轴、垂直于纵轴的法向轴、以及一定角度的固定转子；旋涡器，其被配置为搅动样品；以及细胞定量器械，其被配置为测量样品的度量。角度可以是距离法向轴约30°、45°、60°。
本公开内容还讨论了用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的方法，所述样品包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括：经由流体处理模块，将样品转移到样品管内；将样品管设置在具有固定转子的离心机内，所述固定转子相对于法向轴成一定角度，所述法向轴垂直于离心机的纵轴；将离心机启动一段时间；从样品管中去除一部分样品流体；将一部分裂解剂加入样品管中；使样品管经受配置为搅动样品的旋涡器；将一部分盐水或缓冲溶液加入样品管中；将样品管中的基本上所有流体都转移到比色杯中；在500 nm至700nm之间的一个或多个波长处，使用光学细胞定量器械来测量样品的度量；将悬浮液稀释至预定水平；使用细胞定量器械来验证样品的度量；并且将流体转移到输出管。
附图简述
图1描绘了用于血液制备的方案。
图2描绘了用于尿制备的方案。
图3描绘了用于尿的替代制备的方案。
图4描绘了用于血液的替代制备的方案。
图5描绘了用于自动化方法的方案。
图6描绘了用于制备用于AST的样品的器械的子组件，所述样品包含衍生自患者的病原微生物，所述子组件包括被配置为容纳样品的流体处理模块。
图7小图a-f描绘了关于不含裂解剂的大肠杆菌（E. coli）样品1的代表性数据。
图8小图a-f描绘了关于不含裂解剂的大肠杆菌样品2的代表性数据。
图9小图a-f描绘了关于不含裂解剂的肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae）的代表性数据。
图10小图a-d描绘了细菌离心实验的结果，其显示了RCF、离心时间和细胞浓度之间的关系。
图11描绘了相对于转子的平面以不同角度观察到的微生物团块的形成，所述不同角度为从左到右90˚、75˚、60˚、45˚、30˚和15˚。
图12小图a-f描绘了关于具有裂解剂的大肠杆菌样品1的代表性数据。
图13小图a-f描绘了关于具有裂解剂的金黄色葡萄球菌（S. aureus）的代表性数据。
图14小图a-f描绘了关于不含裂解剂的金黄色葡萄球菌的代表性数据。
图15小图a-f描绘了关于不含裂解剂的屎肠球菌（E. faecium）的代表性数据。
图16 a-d描绘了各种分离方法。
图17描绘了关于图16的方法的代表性数据。
详述
患者微生物样品的制备
本公开内容提供了用于从原始和液体培养的患者样品中分离微生物的新系统和方法，所述样品例如血液培养物、尿样品、痰样品等。根据本公开内容的一些分离方法采用初始缓慢离心步骤，随后为裂解剂的施加，并且能够适当地去除多种溶血凝块、真核细胞和真核细胞片段，以及可能影响细胞浓度的光学检测和AST结果的其它组成成分。该方法进一步由≤20 mL，优选≤10 mL的阳性血液培养物或尿样品产生“清洁的”样品，其包含以足够数目和浓度的多种活微生物以执行AST。同时，本公开内容的方法足够简单以易于自动化。本公开内容的实施方案还可以消除对于样品过滤的需要（例如，使用由Lupetti等人描述的血清分离管，或固体滤器，例如在Machen等人PLoS ONE 9（2）：e87870中描述的膜滤器），潜在地易于自动化并降低耗材成本。
在一些实施方案中，本公开内容的方法应用于已使用连续监测血液培养系统确定为阳性的血液培养物，所述系统例如BACTEC®（Becton-Dickinson）、BacT/Alert®（bioMérieux）和VersaTrekTM（Thermo Fisher）。
特别是当制备用于AST的血液培养物或尿样品时，将微生物细胞与以下分离可能是有利的：真核细胞和真核细胞片段、以及衍生自患者的大的非细胞碎片、以及可能存在的可溶性免疫肽和抗生素（Lupetti等人Clin. Microbiol. Infect. 2010；16：986-991）。细胞和细胞片段可能损害AST结果的完整性，并且也可能使AST开始之前的准确微生物计数复杂化或受到抑制。通过光密度和/或浊度法的准确微生物计数可能受到光学活性组分，如溶血凝块和血小板抑制（Lupetti等人）。
文献教导了裂解剂完成与缓慢离心或滤器相同的事情，即从样品中去除真核细胞和碎片（例如血小板、溶血凝块等）。这些研究提示裂解剂和离心或过滤两者的使用是冗余的，并且当今该领域中的占优势观点是，当施加于阳性血液培养物时，单独的裂解剂足以去除真核细胞和碎片。
本公开内容的一些实施方案基于发明人的下述发现：通过对阳性血液培养物的缓慢离心以及化学裂解，产生了最终的含微生物样品，其充分不含真核细胞和碎片，以使得使用光学测量的准确微生物计数成为可能，同时得到高质量的输入材料用于下游AST测定。特别地，这种方法可能需要≤10 mL的阳性血液培养物或尿，以产生包含足够数目以及合适数量和浓度的多种活微生物的样品，以使得AST成为可能。更特别地，本公开内容的某些实施方案涉及用于从阳性血液培养物产生浓缩的含微生物样品，而无需中间的基于平板的培养的自动化方法，所述样品具有大约0.2-0.65的McFarland读数。本领域技术人员将了解，尽管CLSI肉汤微量稀释参考方法利用了0.5的McFarland读数，但将其稀释200倍用于AST测试，因此，如果存在合适的体积，则可以将较低的接种物浓度用于AST。
更一般地，本公开内容的一些实施方案涉及直接从患者样品制备临床微生物接种物的系统和方法，而无需通过插入基于平板的培养的另外纯化。
本公开内容的示例性方法包括四个主要步骤。第一分离步骤（例如慢速离心）用于使溶血凝块和其它光学干扰主体与剩余的样品材料（例如上清液）分离（例如形成团块）。由第一分离产生的澄清流体材料用裂解剂进行处理，所述裂解剂裂解剩余的真核细胞和/或真核细胞片段、血小板等，同时留下完整的待在下游测定（例如AST测定）中查询的微生物。如本文使用的，术语“裂解剂”涵盖洗涤剂如皂苷的使用，其可能在细胞中产生不可逆的孔，但留下完整的细胞形状，在文献中称为“皂苷空壳（saponin ghost）”。然后，第二分离步骤（例如快速离心）用于从经处理的上清液中分离（例如形成团块）微生物，随后为通过倾析、抽吸等的上清液去除。任选地，可以执行一个或多个洗涤步骤，以清洗团块并去除不希望有的可溶性种类。最后，将目的微生物重悬浮于盐水、缓冲液或生长培养基中，并且例如通过光学测量来确定细胞浓度。
第一分离设计为去除将干扰微生物细胞密度的光学测量的污染种类。在实践中，这可以包括真核细胞和细胞片段以及不溶性材料（例如凝块、真核细胞聚集体和碎片）与微生物的分离（例如形成团块、收集等），所述微生物将在下游过程例如AST中查询。在各种实施方案中，这些分离通过例如离心来实现。
当将离心用于第一分离（称为“第一离心”）时，第一离心的速度（即，相对离心力或RCF）优选设定得足够高，以收集真核细胞和碎片，同时足够低，以使得多种微生物和细菌簇（例如由金黄色葡萄球菌形成的那些）能够保留在悬浮液中。在一些实施方案中，该速度优选低于1000 RCF，例如900、800、700、600、500、400、300、200或100 RCF。
在第一离心之后，可以任选地使用裂解剂，以进一步减少非微生物污染种类的存在，例如，通过裂解真核细胞和真核细胞片段（例如血小板），同时留下基本上完整的将通过下游过程查询的微生物。术语“裂解剂”可以涵盖一种或多种裂解剂，包括但不限于皂苷、氯化铵、triton X、脱水山梨糖醇酯（例如Span）、tweens和非离子型聚氧乙烯10油酰醚表面活性剂（例如Brij（由Sigma-Aldrich商业化））。裂解剂可以进一步包含一种或多种另外的水溶性化合物，包括但不限于多聚茴香脑磺酸钠（SPS）、聚丙二醇（PPG）、碳酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸钾、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸（CAPS）、乙二胺四乙酸和其它盐。用裂解剂的处理时间优选<20分钟，最优选<5分钟。在一个示例性实施方案中，裂解剂包含皂苷、SPS和PPG。
第二分离设计为将微生物物种与剩余的污染物种类、以及上述任选的裂解步骤的任何副产物分离。在本公开内容的一些实施方案中，第二分离产生用于下游测定例如AST的富含微生物的输入材料，其基本上不含可能干扰微生物密度的光学测量、或可能影响微生物生长的污染种类。当将离心用于第二分离时，第二离心的速度设定得足够高以使微生物形成团块，并且足够低以维持最大限度的微生物生存力。在一些实施方案中，该速度产生大于1000 × g,，例如1100、1200、1250、1500、1750、2000、2250、2370或2500 × g的RCF。
然后任选地将团块洗涤一次或多次。洗涤降低了来自血液培养物的可溶性种类以及裂解剂的浓度，因为在实际条件下的上清液去除不可能是完全的。团块可以在分离之前重悬浮于洗涤溶液中。洗涤溶液可以是盐水、缓冲液或生长培养基。在一个示例性实施方案中，执行两次洗涤，各自用1 mL盐水，并且不伴随团块重悬浮。在第二示例性实施方案中，用1 mL盐水且伴随团块重悬浮于洗涤缓冲液中执行一次洗涤。
当使用离心时，任选的第三离心和进一步离心的速度任选地与第二离心的速度相同。
在将最终团块重悬浮于盐水、缓冲液或生长培养基中之后，执行细胞定量。这对于确保以适当的细胞浓度执行后续AST可能是有益的。优选通过光密度或浊度法测量，对细胞进行光学定量。获得用于此类测量的足够细胞可能需要从来自BACTEC或BacT/Alert瓶的大多数阳性血液培养物中，2-20 mL，优选4-10 mL的起始样品体积。如本领域技术人员已知的，可以将所需的最终细胞浓度确定为大约0.5 McFarland。
在一个示例性实施方案中，将由第三分离或第四分离产生的团块重悬浮于1 mL盐水中。然后在500-700 nm之间的一个或多个波长处，使用分光光度计执行光密度（OD）测量。如果获得对应于McFarland > 0.65的测量，则可以添加另外的盐水以稀释样品。另外盐水的体积可以通过OD测量来确定，使得对于更大的OD值添加更大的体积。然后可以进行后续OD测量。随后为稀释过程的这种测量可以执行一次或多次。
在一个示例性实施方案中，对应于McFarland <0.5的OD测量可以进行稀释，以达到0.2或更低的McFarland浓度。然后可以将该信息以电子方式发送到AST平台，以确保在实验对象组接种过程中达到适当的稀释。可替代地，可以将对应于McFarland <0.5的OD测量标记给使用者：存在不足的微生物。
图5显示了从血液培养物中产生McFarland悬浮液的示例性方法的效用。
可替代地，可以制备重悬浮团块的等分试样，随后为用允许细胞定量的前体试剂的处理。此类试剂包括但不限于PicoGreen、吖啶橙、RedSafe、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚、溴化乙锭、SYBR绿I、SYBR绿II、萤光素和刃天青。在该实施方案中，可能不需要添加裂解剂。
该方法的重要性通过以下事实突出显示：用相同步骤但以不同次序获得的样品不能充分清除真核细胞和碎片：用裂解剂处理样品，随后为缓慢旋转，随后将上清液转移到新管中，随后为快速旋转以使微生物形成团块，随后为任选的洗涤和细胞定量。结果在图16C中可见。
该方法的重要性通过以下事实进一步突出显示：用相似步骤但以不同次序获得的样品不能充分清除真核细胞和碎片：用裂解剂处理样品，随后为快速旋转以使微生物形成团块，随后为上清液去除和团块重悬浮于洗涤液中，随后为缓慢旋转，随后将上清液转移到新管中，随后为快速旋转以使微生物形成团块，随后为任选的洗涤和细胞定量。结果在图16B中可见。
该方法的重要性通过以下事实进一步突出显示：用相似步骤但以不同次序获得的样品不能充分清除真核细胞和碎片：以最快的速度旋转样品以沉降存在的所有物质，用不同的裂解剂处理，随后为快速旋转以使微生物形成团块，随后为上清液去除和团块重悬浮于洗涤液中，随后为快速旋转以使微生物形成团块，随后为任选的洗涤和细胞定量。结果在图16A中可见。
在一个替代实施方案中，首先将样品以足以沉降真核细胞，但不足以沉降微生物的速度<1000 RCF离心。收集上清液，并且以足以沉降微生物的速度>1000 RCF离心。将上清液倾析，将管倒置，并且以<1000 RCF的低速离心，以使团块干燥。然后将团块重悬浮于微生物生长培养基，例如Mueller-Hinton Broth（MHB）内，形成“经处理的样品”。然后执行光密度、荧光和/或浊度法测量，以确定细胞浓度。如果不足以用于读数，则可以执行另外的温育。如本领域技术人员已知的，在达到足够的细胞浓度（例如0.5 McFarland浓度）之后，可以将样品等分到用于执行AST的药液筒的孔内。
在一个替代实施方案中，首先将样品以足以使所有细胞沉降的速度和时间离心，其中较小细胞移动通过较大细胞中的空间到团块的底部，>1000 RCF共>5分钟。将上清液倾析，并且抽吸大细胞团块。将剩余的团块重悬浮，并且以足以沉降真核细胞，但不足以沉降微生物的速度<1000 RCF离心。收集上清液，并且以足以沉降微生物的速度>1000 RCF离心。然后将团块重悬浮于微生物生长培养基，例如Mueller-Hinton Broth（MHB）内，形成经处理的样品。然后执行光密度、荧光和/或浊度法测量，以确定细胞浓度。如果不足以用于读数，则可以执行另外的温育。如本领域技术人员已知的，在达到足够的细胞浓度（例如0.5McFarland浓度）之后，可以将样品等分到用于执行AST的药液筒的孔内。
在一个替代实施方案中，首先将样品置于配备有分离膜的管内，并且以足以将样品穿过膜的速度离心，将细菌沉积到膜的表面上。然后用微生物生长培养基例如MHB洗涤膜，以重悬浮沉积的细菌。然后执行光密度、荧光和/或浊度法测量，以确定细胞浓度。如果不足以用于读数，则可以执行另外的温育。如本领域技术人员已知的，在达到足够的细胞浓度（例如0.5 McFarland浓度）之后，可以将样品等分到用于执行AST的药液筒的孔内。
在本文中或在其它方面描述的各种实施方案中，可以通过使用本文描述的器械或系统来执行用于制备用于AST的样品的方法，所述样品包含衍生自患者的病原微生物。参考图5，可以使用自动化或半自动化系统来执行方法的步骤。这种系统可以包括流体处理模块102，其被配置为将样品转运到被配置为容纳样品的样品管100内。流体处理部件可以是自动化流体处理机等等。流体处理部件可以这样进行配置，使得流体、容器、管和/或样品自动地在整个系统中移动，伴随需要很少操作员处理或不需要操作员处理。这种自动化可以增加流通量，同时减少劳动时间和错误。含有样品的样品管100被转移到离心机104。离心机104具有固定转子，其被配置为以相对于转子平面除90°外的角度保持样品管，所述平面包括由于离心机转子的对称性的纵轴。角度可以是相对于转子平面的任何角度，例如约30°、约45°、约60°等。如下文所述，在本公开内容中利用的角度导致形成远离管底部放置的界限分明的团块，允许在离心后流体的自动化抽吸，而没有目的微生物材料丧失的不当风险。将离心机104启动所需的时间段。在离心分离之后，从样品管100中去除一部分样品流体。然后将一部分裂解剂加入样品管100中。然后使样品管100经受旋涡器106，以搅动并混合样品管100的内容物。在搅动和混合之后，将样品管100加入离心机104中并经受离心分离。在分离之后，将样品管100中包含的至少一部分流体去除。然后，将一部分盐水加入样品管100中。然后将样品管100置于离心机104内并经受离心分离。在分离之后，将样品管100中包含的至少一部分流体去除。然后将一部分盐水加入样品管100中。然后使样品管经受旋涡器106，以搅动并混合样品管100的内容物。在搅动和混合之后，将样品管100中的基本上所有流体都转移到比色杯108中。然后，使用细胞定量器械112，例如分光计，来读取比色杯108内的流体的吸光度度量。然后将比色杯内的流体稀释至所需的稀释水平。然后，通过细胞定量器械112测量比色杯108内的流体，以验证比色杯108内的流体的浓度水平。然后将流体从比色杯108转移到输出管110内。
在本文中或在其它方面描述的各种实施方案中，可以通过使用本文描述的器械或系统来执行用于制备用于AST的样品的方法，所述样品包含衍生自患者的病原微生物。图6示出了用于制备用于AST的样品的器械600，所述样品包含衍生自患者的病原微生物，所述器械600包括流体处理模块602，其被配置为将样品例如转运到样品管。流体处理模块602可以被置于离心机606内。离心机606具有固定转子，其具有延伸穿过其中的纵轴l以及垂直于纵轴的法向轴n。离心机606以相对于法向轴n的角度α和/或以相对于纵轴l的另一角度β接收样品。角度α、β可以是任何角度，例如，约30°、约60°等等。可以启动涡旋器610，以施加轨道运动，以使样品振荡。细胞定量器械612，例如分光计，可以用于读取样品的吸光度度量。
本公开内容的大部分已讨论了包括裂解剂步骤的方法。然而，发明人还已发现，如果省略这个裂解剂步骤，则所得到的样品可能适合于例如直接AST测试的情况，其中无需微生物浓度的光学定量。在此类方法的一个示例性实施方案中，可以使用离心来分离某些污染种类（例如，慢速离心步骤可以用于减少凝结材料或其它大的细胞外碎片，和/或快速离心步骤可以用于使微生物形成团块用于重悬浮）。在这种情况下，用一种或多种生存力指示物（如刃天青）来确定用于AST的细菌生长可能很重要。示例性方法公开于PCT公开WO 2018/119439的第[0008] – [0134]段中，所述PCT公开引入本文作为参考。
上述示例性实施方案一般已利用离心用于分离。然而，本领域技术人员将了解，其它分离方法可以与本公开内容的某些实施方案相容。例如，本公开内容的一些方法可以利用过滤，以使待通过AST查询的微生物物种与样品中的污染种类分离。在一些实施方案中，第一过滤步骤可以具有高截留分子量。在一些情况下，第二过滤步骤可以具有比第一步骤低的截留分子量。
前述公开内容已集中于用于从患者样品制备用于例如AST的微生物样品的系统和方法的实施方案。本领域技术人员将了解，尽管与目前使用的方法表面上相似，但上述方法的不同之处在于：它们首次克服了对目前AST样品制备方案促成重大延迟的技术挑战。即，本公开内容的方法产生了用于快速AST的高质量、可定量的输入材料，而无需中间的平板培养步骤。重要的是，同时还允许微生物和细菌簇与大小相似的真核细胞和碎片的分离。在第一分离中，速度足够高以收集真核细胞和碎片，同时足够低，以使得微生物和细菌簇（例如由金黄色葡萄球菌形成的那些）能够保留在悬浮液中。细菌例如金黄色葡萄球菌趋于聚集，并且因此在大小方面可能类似于不需要的真核细胞或片段（例如血小板）。因此，可以引入裂解剂，所述裂解剂破坏在初始缓慢离心后剩余的真核细胞的脂质膜，允许其由第二个更快的分离步骤去除，产生用于下游测定例如AST的富含微生物的输入材料，其基本上不含可能干扰微生物密度的光学测量、或可能影响微生物生长的污染种类。
如上文讨论的，该方法在步骤本身以及它们在其中执行的次序方面是不同的。这突出显示了这些方法的创造性，因为仅通过这种步骤组合，才可以去除关于中间的平板培养步骤的需要，消除了花费时间和资源来培养样品中存在的微生物的需要，这是对于类似系统的目前障碍。
微生物
感染可以包括任何微生物起源的感染因子，例如细菌、真菌细胞、古生菌和原生动物。在一些实例中，感染因子为细菌，例如革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和非典型细菌。抗微生物剂抗性微生物可以是对抗微生物剂（即抗细菌药物、抗真菌药物、抗古生菌药剂和抗原生动物药物）抗性的微生物。
微生物（例如，微生物的液体悬浮液）可以包括一种菌株的微生物。微生物可以包括一个物种的微生物。微生物可以包括多于一种菌株的微生物。微生物可以包括一个目的微生物。微生物可以包括一个纲的微生物。微生物可以包括一个科的微生物。微生物可以包括一个界的微生物。
微生物（例如，微生物的液体悬浮液）可以包括多于一种菌株的微生物。微生物可以包括多于一个物种的微生物。微生物可以包括多于一个属的微生物。微生物可以包括多于一个目的微生物。微生物可以包括多于一个纲的微生物。微生物可以包括多于一个科的微生物。微生物可以包括多于一个界的微生物。
微生物可以是细菌。细菌的实例包括但不限于橙黄醋杆菌（Acetobacteraurantius）、沥青不动杆菌（Acinetobacter bitumen）、不动杆菌属物种（Acinetobacterspp.）、以色列放线菌（Actinomyces israelii）、放线菌属物种（Actinomyces spp.）、气球菌属物种（Aerococcus spp.）、放射形农杆菌（Agrobacterium radiobacter）、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、无形体属（Anaplasma）、嗜吞噬细胞无形体（Anaplasmaphagocytophilum）、茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）、维涅兰德固氮菌（Azotobacter vinelandii）、芽孢杆菌（Bacillus）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、短芽孢杆菌（Bacillus brevis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、梭状芽孢杆菌（Bacillus fusiformis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）、芽孢杆菌属物种（Bacillusspp.）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus Thuringiensis）、拟杆菌属（Bacteroides）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、牙龈拟杆菌（Bacteroides gingivalis）、产黑色素拟杆菌（Bacteroides melaninogenicus）（也称为产黑色素普雷沃菌（Prevotellamelaninogenica））、巴尔通氏体（Bartonella）、汉氏巴尔通氏体（Bartonella henselae）、五日热巴尔通氏体（Bartonella quintana）、巴尔通氏体属物种（Bartonella spp.）、博德特氏菌（Bordetella）、支气管炎博德特氏菌（Bordetella bronchiseptica）、百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）、博德特氏菌属物种（Bordetella spp.）、伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）、布鲁氏菌（Brucella）、流产布鲁氏菌（Brucella abortus）、羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）、布鲁氏菌属物种（Brucella spp.）、猪布鲁氏菌（Brucellasuis）、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）、鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei）、假鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderiapseudomallei）、肉芽肿鞘杆菌（Calymmatobacterium granulomatis）、弯曲杆菌（Campylobacter）、结肠弯曲杆菌（Campylobacter coli）、胎儿弯曲杆菌（Campylobacterfetus）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）、幽门弯曲杆菌（Campylobacter pylori）、弯曲杆菌属物种（Campylobacter spp.）、衣原体（Chlamydia）、衣原体属物种（Chlamydiaspp.）、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、嗜衣原体（Chlamydophila）、肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumoniae）（先前称为肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae））、鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci）（先前称为鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydia psittaci））、嗜衣原体属物种（Chlamydophila spp.）、梭菌（Clostridium）、肉毒梭菌（Clostridiumbotulinum）、艰难梭菌（Clostridium difficile）、产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）（先前称为魏氏梭菌（Clostridium welchii））、梭菌属物种（Clostridiumspp.）、破伤风梭菌（Clostridium tetani）、棒状杆菌（Corynebacterium）、白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）、梭形棒状杆菌（Corynebacterium fusiforme）、棒状杆菌属物种（Corynebacterium spp.）、伯氏考克斯氏体（Coxiella burnetii）、恰菲埃里希氏体（Ehrlichia chaffeensis）、埃里希氏体属物种（Ehrlichia spp.）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、肠杆菌属物种（Enterobacter spp.）、肠球菌（Enterococcus）、鸟肠球菌（Enterococcus avium）、耐久肠球菌（Enterococcus durans）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、鹑鸡肠球菌（Enterococcus galllinarum）、病臭肠球菌（Enterococcus maloratus）、肠球菌属物种（Enterococcus spp.）、大肠杆菌（Escherichia coli）、弗朗西丝氏菌属物种（Francisellaspp.）、土拉热弗朗西丝氏菌（Francisella tularensis）、具核梭杆菌（Fusobacteriumnucleatum）、加德纳氏菌属物种（Gardenerella spp.）、阴道加德纳氏菌（Gardnerellavaginalis）、嗜血杆菌属物种（Haemophilius spp.）、嗜血杆菌（Haemophilus）、杜克雷嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）、副流感嗜血杆菌（Haemophilus parainfluenzae）、百日咳嗜血杆菌（Haemophilus pertussis）、阴道嗜血杆菌（Haemophilus vaginalis）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、螺杆菌属物种（Helicobacter spp.）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、克雷伯氏菌属物种（Klebsiella spp.）、乳杆菌（Lactobacillus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、乳杆菌属物种（Lactobacillus spp.）、乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、军团菌属物种（Legionella spp.）、细螺旋体属物种（Leptospira spp.）、单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、李斯特氏菌属物种（Listeria spp.）、extroquen甲烷杆菌（Methanobacteriumextroquens）、多形微杆菌（Microbacterium multiforme）、藤黄微球菌（Micrococcusluteus）、卡他莫拉氏菌（Moraxella catarrhalis）、分枝杆菌（Mycobacterium）、鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium）、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）、类白喉分枝杆菌（Mycobacterium diphtheriae）、胞内分枝杆菌（Mycobacterium intracellulare）、麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae）、鼠麻风分枝杆菌（Mycobacterium lepraemurium）、草分枝杆菌（Mycobacterium phlei）、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）、分枝杆菌属物种（Mycobacterium spp.）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、支原体（Mycoplasma）、发酵支原体（Mycoplasma fermentans）、生殖道支原体（Mycoplasmagenitalium）、人型支原体（Mycoplasma hominis）、穿透支原体（Mycoplasma penetrans）、肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）、支原体属物种（Mycoplasma spp.）、奈瑟氏球菌（Neisseria）、淋病奈瑟氏球菌（Neisseria gonorrhoeae）、脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseriameningitidis）、奈瑟氏球菌属物种（Neisseria spp.）、诺卡氏菌属物种（Nocardia spp.）、巴斯德氏菌（Pasteurella）、多杀巴斯德氏菌（Pasteurella multocida）、巴斯德氏菌属物种（Pasteurella spp.）、土拉巴斯德氏菌（Pasteurella tularensis）、消化链球菌（Peptostreptococcus）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、产黑色素普雷沃菌（Prevotella melaninogenica）（先前称为产黑色素拟杆菌（Bacteroidesmelaninogenicus））、变形杆菌属物种（Proteus spp.）、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、假单胞菌属物种（Pseudomonas spp.）、放射根瘤菌（Rhizobiumradiobacter）、立克次氏体（Rickettsia）、普氏立克次氏体（Rickettsia prowazekii）、鹦鹉热立克次氏体（Rickettsia psittaci）、五日热立克次氏体（Rickettsia quintana）、立氏立克次氏体（Rickettsia rickettsii）、立克次氏体属物种（Rickettsia spp.）、沙眼立克次氏体（Rickettsia trachomae）、罗卡利马氏体（Rochalimaea）、汉氏罗卡利马氏体（Rochalimaea henselae）、五日热罗卡利马氏体（Rochalimaea quintana）、龋齿罗氏菌（Rothia dentocariosa）、沙门氏菌（Salmonella）、肠炎沙门氏菌（Salmonellaenteritidis）、沙门氏菌属物种（Salmonella spp.）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）、志贺氏菌属物种（Shigella spp.）、迂回螺菌（Spirillum volutans）、葡萄球菌（Staphylococcus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、葡萄球菌属物种（Staphylococcus spp.）、嗜麦芽糖寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、寡养单胞菌属物种（Stenotrophomonas spp.）、链球菌（Streptococcus）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、鸟链球菌（Streptococcus avium）、牛链球菌（Streptococcus bovis）、大鼠链球菌（Streptococcus cricetus）、屎链球菌（Streptococcus faceium）、粪链球菌（Streptococcus faecalis）、野生链球菌（Streptococcus ferus）、鸡链球菌（Streptococcus gallinarum）、乳酸链球菌（Streptococcus lactis）、温和链球菌（Streptococcus mitior）、缓症链球菌（Streptococcus mitis）、变异链球菌（Streptococcus mutans）、口腔链球菌（Streptococcus oralis）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、鼠链球菌（Streptococcus rattus）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius）、血链球菌（Streptococcus sanguis）、表兄链球菌（Streptococcus sobrinus）、链球菌属物种（Streptococcus spp.）、密螺旋体（Treponema）、齿垢密螺旋体（Treponema denticola）、苍白密螺旋体（Treponemapallidum）、密螺旋体属物种（Treponema spp.）、脲支原体属物种（Ureaplasma spp.）、弧菌（Vibrio）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、逗号弧菌（Vibrio comma）、副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、弧菌属物种（Vibrio spp.）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、草绿色链球菌（viridans streptococci）、沃尔巴克氏体（Wolbachia）、耶尔森氏菌（Yersinia）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）、鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）、假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）和耶尔森氏菌属物种（Yersiniaspp.）。
微生物可以是真菌。真菌的实例包括但不限于曲霉属物种（Aspergillus spp.）、芽生菌属物种（Blastomyces spp.）、假丝酵母属物种（Candida spp.）、枝孢属（Cladosporium）、球孢子菌属物种（Coccidioides spp.）、隐球菌属物种（Cryptococcusspp.）、突脐蠕孢属（Exserohilum）、镰刀菌属（fusarium）、组织胞浆菌属物种（Histoplasmaspp.）、伊萨酵母属物种（Issatchenkia spp.）、毛霉菌属（mucormycetes）、肺囊虫属物种（Pneumocystis spp.）、癣菌（ringworm）、丝孢菌属（scedosporium）、孢子丝菌属（Sporothrix）和葡萄穗霉属物种（Stachybotrys spp.）。微生物可以是原生动物。原生动物的实例包括但不限于溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）、疟原虫属物种（Plasmodium spp.）、兰氏贾第虫（Giardia lamblia）和布氏锥虫（Trypanosoma brucei）。
抗微生物剂
当微生物是细菌时，示例性的抗微生物剂包括阿米卡星、氨基糖苷、氨基糖苷阿莫西林、氨基糖苷类、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸盐、氨苄青霉素、氨苄青霉素/舒巴坦、抗毒素、胂凡纳明、阿奇霉素、阿洛西林、氨曲南、β-内酰胺、杆菌肽、卷曲霉素、碳青霉烯类、羧苄青霉素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻吩（Cefalothin）、头孢噻吩（Cefalotin）、头孢羟唑、头孢唑啉、头孢地尼、头孢托仑、头孢吡肟、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢洛林（Ceftaroline）、头孢洛林酯（Ceftaroline fosamil）、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟、头孢吡普、头孢曲松、头孢呋辛、头孢菌素、氯霉素、氯霉素（Bs）、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、氯法齐明、氯唑西林、粘菌素、复方新诺明、环丝氨酸、达巴万星、氨苯砜、达托霉素、地美环素、双氯西林、地红霉素、多利培南、多西环素、依诺沙星、厄他培南、红霉素、乙胺丁醇、乙胺丁醇（Bs）、乙硫烟胺、氟氯西林、氟喹诺酮、氟喹诺酮类、磷霉素、呋喃唑酮、夫西地酸、加替沙星、格尔德霉素、吉米沙星、庆大霉素、格帕沙星、除莠霉素、亚胺培南/西司他丁、异烟肼、卡那霉素、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、洛美沙星、氯碳头孢、大环内酯类、磺胺米隆、美罗培南、甲氧西林、甲硝哒唑、美洛西林、米诺环素、莫西沙星、莫匹罗星、萘夫西林、萘夫西林、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因（Bs）、诺氟沙星、氧氟沙星、奥利万星、苯唑西林、土霉素、巴龙霉素、青霉素、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、平板霉素、多粘菌素B、泼斯唑来、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普丁、雷得唑来、瑞西巴库、利福布丁、利福平（Rifampicin）、利福平（Rifampin）、利福喷丁、利福昔明、罗红霉素、磺胺嘧啶银、司帕沙星、壮观霉素、壮观霉素（Bs）、螺旋霉素、链阳菌素、链霉素、舒巴坦、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺地托辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑（Sulfanilimide）、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、磺酰胺基柯衣定、特地唑胺、替考拉宁、泰斯巴汀、特拉万星、泰利霉素、替马沙星、替莫西林、四环素、甲砜霉素、替卡西林、替卡西林/克拉维酸盐、替卡西林/克拉维酸、替加环素、替加环素（Bs）、替硝唑、TMP/SMX、妥布霉素、特地佐利、甲氧苄啶（Bs）、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、醋竹桃霉素、曲伐沙星、万古霉素及其泛型或其变体。
其与微生物的相互作用影响微生物表面上的负电荷且受微生物表面上的负电荷影响的抗微生物剂可以包括：聚阳离子氨基糖苷，其在结合细胞表面时置换Mg2+离子，其桥接脂质膜组分，从而破坏外膜并增强药物摄取；阳离子多粘菌素（粘菌素和多粘菌素B），其与微生物细胞的结合也依赖于膜的负电荷，并且关于其的突变和质粒两者介导的抗性通过减少膜负电荷而发生；以及达托霉素，一种脂肽，其类似宿主先天性免疫应答阳离子抗微生物肽，并且需要Ca2+和磷脂酰甘油用于其破坏膜的作用机制，并且关于其的抗性也可以涉及细胞表面电荷中的改变。
当微生物是真菌时，示例性的抗微生物剂包括5-氟胞嘧啶、阿巴芬净、阿巴康唑、烯丙胺类、两性霉素B、Ancobon、阿尼芬净、唑、秘鲁香脂、苯甲酸、联苯苄唑、布康唑、杀假丝菌素、卡泊芬净、环匹罗司、克霉唑、Cresemba、结晶紫、大扶康、棘白菌素类、益康唑、艾氟康唑、氟环唑、芬替康唑、菲律宾菌素、氟康唑、氟胞嘧啶（Flucytosine）、灰黄霉素（Grifulvin）V、灰黄霉素（Griseofulvin）、Gris-Peg、卤普罗近、哈霉素、咪唑类、艾沙康唑、艾沙康唑鎓、异康唑、伊曲康唑、酮康唑、疗霉舒、卢立康唑、米卡芬净、咪康唑、纳他霉素、诺科飞、制霉菌素、奥莫康唑、Onmel、Oravig、奥昔康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、龟裂霉素、舍他康唑、斯皮仁诺（Sporanox）、硫康唑、特比萘芬、特康唑、噻唑类、硫代氨基甲酸酯抗真菌剂、噻康唑、托萘酯、三唑类、十一碳烯酸、威凡（Vfend）、伏立康唑及其泛型或其变体。
当微生物是原生动物时，示例性的抗微生物剂包括8-氨基喹啉、乙酰胂胺、针对变形虫界的药物、臭椿酮、阿莫地喹、两性霉素B、安普罗铵、抗毛滴虫剂、除疟霉素、胂噻醇、蒿醚林酸、蒿甲醚、蒿甲醚/苯芴醇、青蒿素、蒿乙醚、青蒿氧烷、青蒿琥酯、青蒿琥酯/阿莫地喹、阿托伐醌、阿托伐醌/氯胍、阿扎硝唑、阿奇霉素、苄硝唑、溴羟喹啉、布帕伐醌、卡巴胂、卡硝唑、喹碘方、氯喹、氯丙胍、氯丙胍/氨苯砜、氯丙胍/氨苯砜/青蒿琥酯、氯喹那多、囊泡藻界抗寄生虫药、金鸡纳、Cipargamin、克拉珠利、克立法胺、克清诺、球虫抑制药、Codinaeopsin、Cotrifazid、白叶藤碱、环氯胍、去氢依米丁、双苯他胂、二氢青蒿素、二氯尼特、重氮氨苯咪、双硫仑、多西环素、依洛尼塞、ELQ-300、依米丁、依托法胺、古虫界抗寄生虫药、夫马菌素、呋喃唑酮、甘铋胂、GNF6702、卤泛群、羟氯喹、咪多卡、异丙硝唑、金鸡纳[树]皮（Jesuit's bark）、KAF156、苯芴醇、马度米星、甲氟喹、Megazol、葡甲胺锑酸盐、美拉胂醇、麦帕克林、甲硝哒唑、米替福新、神经降压素（Neurolenin）B、尼卡巴嗪、硝呋莫司、尼莫拉唑、硝苯胂酸、两面针碱、硝呋醛、奥里发新（Olivacine）、奥硝唑、乳清群海绵定（Oroidin）、扑疟喹、巴龙霉素、戊烷脒、五价含锑药物、泛喹酮、氧二苯脒、哌喹、伯氨喹、氯胍、项目523、普罗硝唑、乙嘧啶、咯萘啶、喹法米特、奎宁、罗硝唑、Schedula Romana、SCYX-7158、塞克硝唑、塞马莫德、葡萄糖酸锑钠、螺环吲哚酮（Spiroindolone）、磺胺多辛、磺胺多辛-乙嘧啶、磺胺林、苏拉明、他非诺喹（Tafenoquine）、替克洛占、替诺尼唑、甲溴羟喹、替硝唑、三甲曲沙、杀锥虫剂、Warburg酊剂及其泛型或其变体。
抗微生物剂可以是通过类似于本文所述药物的机制起作用的药物。本领域已知的其它抗微生物药物可以用于本文所述的方法中。
液体悬浮液
液体可以包括生长培养基，例如阳离子调节的Mueller Hinton肉汤。这种培养基可以包含本领域技术人员已知促进微生物生长和稳定性的添加剂。除不同的抗微生物剂之外，不同的测试孔可以包含已知改善关于特定抗微生物剂的AST准确度的添加剂。例如，可以将另外的氯化钠加入包含苯唑西林的测试中，并且可以将另外的钙加入包含达托霉素的测试中。
生物样品
本文所述的微生物可以衍生自生物样品。在一些实施方案中，生物样品是含有微生物（例如细菌和真菌细胞）的任何样品。生物样品可以衍生自临床样品。
示例性的生物学样品可以包括但不限于全血、血浆、血清、痰、尿、粪便、白血细胞、红血细胞、血沉棕黄层、泪液、粘液、唾液、精液、阴道液、淋巴液、羊水、脊髓或脑脊髓液、腹膜腔积液、胸腔积液、渗出液、点状物质、上皮涂片、活组织检查、骨髓样品、来自囊肿或脓肿的流体、滑液、玻璃体液或房水、洗眼液或吸出物、支气管肺泡灌洗液、支气管灌洗液或肺灌洗液、肺吸出物、以及器官和组织（包括但不限于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、胰腺等等）、拭子（包括但不限于伤口拭子、口腔拭子、咽喉拭子、鼻拭子、阴道拭子、尿道拭子、宫颈拭子、直肠拭子、病灶拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等等）及其任何组合。还包括的是细菌培养物或细菌分离物、真菌培养物或真菌分离物。普通技术人员还可以了解，从任何上文示例性的生物样品获得的分离物、提取物或材料也处于本发明的范围内。
得自生物样品的微生物可以如本领域常规执行的进行培养或以其它方式进行处理。
AST方法中使用的对照
对照可以包括微生物对于其不敏感的抗微生物剂。例如，如果测定用于确定革兰氏阳性细菌的敏感性，则对照（和测试温育）可以包括靶向革兰氏阴性细菌的一种或多种抗微生物剂，和如果测定用于确定真核微生物的敏感性，则对照（和测试温育）可以包括一种或多种抗细菌的抗微生物剂。
在一些实施方案中，对照是在除了没有抗微生物剂或者具有微生物对于其不敏感的一种或多种抗微生物剂之外，在其它方面等同的条件下从微生物测量的阳性对照。在一些实施方案中，在除了没有营养素之外，在其它方面等同的条件下，从微生物测量对照。在一些实施方案中，在具有已知抑制微生物生长的一种或多种毒素，在其它方面等同的条件下，从微生物测量对照。
对照可以是历史对照。在一些实施方案中，在已执行对照温育之后执行测试温育。在一些实施方案中，对照在与包含测试温育的药液筒不同的药液筒中执行。
药液筒
药液筒可以是能够容纳并允许微生物的液体悬浮液生长的容器。药液筒的非限制性实例可以包括培养瓶、培养皿、皮氏培养皿、生物测定皿、培养管、试管、微量离心管、瓶、微腔板、多腔板、微量滴定板、微孔板。药液筒可以包含一个腔室。药液筒可以包括多个腔室，每个腔室是能够将液体悬浮液保持与另一空间物理隔离的空间；腔室的一个实例是多层板中的腔室。药液筒可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、48、96、192、384、1536个或更多个腔室，以及两者之间的任何数目的腔室。药液筒腔室的底部可以是平坦的、圆形的或V形的。
存在于药液筒上的多个腔室内的抗微生物剂可以悬浮于培养基中。在一些实施方案中，抗微生物剂以抗微生物膜的形式存在。在某些实施方案中，抗微生物剂以固体形式存在。在一些实施方案中，将固体抗微生物剂冻干和/或干燥。某些实施方案提供了在引入微生物的悬浮液之前，在一个或多个药液筒腔室中作为抗微生物膜、以固体形式（冻干或干燥）存在的一种或多种抗微生物剂。
在用样品接种平板之前，抗微生物剂稀释系列可以是冷冻的、冻干的或新鲜制备的。在一些情况下，可以通过手动或使用自动化系统执行药液筒的接种。在一些实例中，如在新鲜抗微生物平板的情况下，自动化液体处理系统可以用于制备具有抗微生物剂稀释系列的药液筒。接种方法可以包括其可以是本领域已知的各种方法中的任一种。
如本文所述，药液筒可以用于含有各种流体组合，以便进行多重测试序列，例如检查点测定和多种不同的生长测定。在一些实施方案中，药液筒具有用于促进一种或多种检查点测定的一组腔室、以及用于促进一种或多种生长测定的一组腔室。例如，药液筒可以包括以行和列排列的腔室阵列。药液筒可以包括一组对照腔室和一组抗微生物剂测试腔室。对照腔室组可以包括两个腔室，并且测试腔室组可以包括沿着平板的腔室的剩余部分。在一些实施方案中，对照腔室组包括至少两个腔室，其中一个腔室是生长腔室，而另一个腔室是非生长腔室。在一些实施方案中，生长腔室包括或被接种以包括肉汤和患者样品的组合，使得患者样品中的微生物可以在温育期过程中在肉汤内生长。在某些实施方案中，抗微生物剂不加入检查点测定腔室中。而在一些实施方案中，非生长腔室可以包括或被接种以包括不含患者样品的肉汤（即，在不存在来自患者样品的微生物的情况下的肉汤）。在一些实施方案中，抗微生物剂也未加入非生长腔室中。因此，在温育期过程中，与微生物可以在其中生长的生长腔室相比，非生长腔室可以充当基线。
在一些实施方案中，每个药液筒包括“测试实验对象组”，对于每种抗微生物剂以限定的稀释系列（例如2倍稀释系列、10倍稀释系列等）跨越多重孔分布的多种抗微生物剂。另外，每个药液筒或测试平板可以含有对照腔室，例如生长对照腔室、非生长（污染）对照腔室和盐水对照腔室。盐水对照腔室可以代表FIT对照，其大约等于接种物中微生物的初始浓度。药液筒可以包括多重腔室（例如96腔室药液筒或384腔室药液筒），其具有盖子（例如可移除的盖）和唯一地定义抗生素配置的标识符（例如条形码）、以及定义平板并且可与符合HIPAA的独特患者样品相关联的独特代码。
测试腔室可以包括患者样品的各种组合中的任一种，以及可以分析关于其的敏感性的各种类型和浓度的抗微生物剂。腔室的行可以专用于特定的抗微生物剂，并且抗微生物剂的浓度可以在同一行的列之间变化。例如，药液筒可以具有一行含有青霉素的腔室，其中从左到右每个腔室含有渐增浓度的青霉素。
当然，其它实例也是可能的。例如，不同的腔室和腔室组可以位于沿着药液筒的各种位置中的任一个处。另外，不同的腔室组（例如对照腔室和测试腔室）可以包括沿着药液筒的更多或更少的单个腔室。另外，在一些情况下，并非所有的腔室在测试期间都被使用/占用。
自动化AST方法
本文所述的方法可以使用商购可得的设备、定制设备或其组合以自动化方式执行。使方法自动化允许执行更大数目的测定以及测定之间增加的一致性。自动化还可以增加这些方法的速度和分辨率。
表面结合探针测定
表面结合测定（也称为表面结合探针测定）可以利用信号传导剂。信号传导剂一般包含能够与微生物结合的部分（例如与微生物表面结合的抗体和/或凝集素、与微生物表面非特异性结合的荷电部分和/或功能部分），以及能够提供信号或促成信号产生的化学部分（例如酶化学发光团和镧系元素螯合物）。示例性的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶及其组合。
信号生成剂可以包括与一种或多种微生物受体缀合的一种或多种化学部分。信号生成剂包括但不限于一种或多种催化剂（包括酶、金属氧化物纳米颗粒、有机金属催化剂、设计用于信号放大的纳米颗粒（例如本申请要求其优先权且整体引入本文作为参考的美国临时申请所述的那些）、包含信号生成元件的细菌噬菌体、荧光团（包括有机荧光团，含有铕或钌（II）、铼（I）、钯（II）、铂（II）的有机金属化合物）、和/或比色染料（包括有机染色剂）。可以使用上述的组合，例如纳米颗粒、树枝状分子和/或具有酶、荧光团和/或有机金属分子的其它纳米级结构。
可以在使信号传导剂与微生物接触之前、信号传导剂最初与微生物接触的同时、或在信号传导剂已与微生物接触之后，使化学部分与信号传导剂缀合。
当将信号传导剂加入含有微生物的AST稀释物中时，信号传导剂受体（例如可以与微生物特异性或非特异性结合的部分）可以与微生物表面结合。因此，微生物越完整，例如，在溶液中，与这些细菌结合的信号传导剂的数目越大。因而，在完整细菌的数目和溶液中游离的信号传导剂的数目（如由未与完整细菌结合的那些所定义的）之间存在反向关系。注意到，如果例如微生物响应于抗微生物剂处理而裂解，则游离的信号传导剂可以与可溶性微生物组分结合。
与微生物表面结合和/或插入微生物表面内的信号传导剂的数目与微生物表面积成正比。微生物表面积与真正的抗性微生物强烈相关。特别地，在响应于MIC和亚MIC浓度的抗微生物剂而膨胀或伸长的微生物（例如形成长丝的细菌）的情况下，已知代谢和/或体积鉴定给出关于“快速”AST时间点（定义为少于6小时的那些）的假敏感性概况。为了克服这种限制，本发明将微生物表面积（而不是体积）转变为可测量的信号，例如光学信号。本文所述的方法能够在少于6小时内准确地确定微生物抗性概况。
为了使与微生物结合和/或插入微生物内的信号传导剂与游离的信号传导剂分离，执行一个或多个分离和/或竞争性结合步骤可能是必要的。此类步骤包括但不限于离心（例如以g力>500 × g）、过滤（例如经由具有小于或等于0.45微米、或者小于或等于0.2微米的孔的滤器）、电泳和/或磁性捕获；此类步骤是本领域的技术人员众所周知的。
为了促进信号传导剂结合和/或减少背景，可能进一步有利的是在添加信号传导剂之前，使微生物与它们在温育期间悬浮于其中的液体分离。此类分离可以包括但不限于离心、过滤、电泳和/或磁性捕获。
信号传导剂可以连同微生物和/或抗微生物剂一起添加，使得它们对于整个AST温育期都存在。这个总时期可以长达24小时，或在8小时内，或在5小时内。可替代地，可以将信号传导剂在规定的温育期之后加入微生物和抗微生物剂中。这个时期可以长达24小时，或在8小时内，或在4小时内。
信号传导剂被设计为与微生物表面结合和/或插入微生物表面中，所述微生物表面包括壁和/或膜。设计用于结合的信号传导剂包含结合部分，其包括但不限于一种或多种抗体、凝集素、其它蛋白质、具有一个或多个荷电化学基团的小分子、具有一个或多个功能性化学基团的小分子、噬菌体、糖蛋白、肽、适体、荷电小分子、具有固定电荷的小分子、荷电聚合物、具有固定电荷的荷电聚合物、疏水性小分子、荷电肽、具有固定电荷的荷电肽、具有交替的亲水性和疏水性区域的肽和/或小分子配体，其可能是或可能不是有机金属络合物。设计用于微生物结合的分子是本领域的技术人员众所周知的。信号传导剂可以保持与微生物结合和/或可以内化，因此包括所有结合。设计用于插入的信号传导剂可以包括但不限于小疏水性分子、疏水性肽和/或具有交替的疏水性和亲水性区域的肽。设计用于微生物插入的分子是本领域的技术人员众所周知的。信号传导剂可以进一步对于一种或多种类型的微生物是特异性的。信号传导剂可以具有多重受体。这些可以增强结合和/或使得能够同时与两种或更多种微生物结合，这可以进一步作用于使细菌凝集。在添加信号传导剂之前或同时，调整溶液pH可能是有利的。这可能有益于增强微生物和信号传导剂之间的电荷-电荷相互作用。通过将溶液pH滴定至高于中性（更碱性），可以增加微生物的阴离子电荷。因此，利用具有一种或多种固定的阳离子电荷的部分可能是有益的。
值得注意的是，信号传导剂可以与微生物特异性结合（例如与微生物物种或微生物菌株特异性结合的抗体）、或者可以与微生物非特异性结合（例如通过通用的共价或非共价键形成和本领域已知的另一种非特异性化学结合）。
可替代地，可以将能够与信号传导剂结合的化学制品和/或生物化学制品加入微生物在生长期间悬浮于其中的液体中，使得化学制品和/或生物化学制品在温育期间掺入微生物内。这可以作用于增强信号传导剂与微生物的结合。在可替代实施方案中，信号传导剂本身可以存在于微生物在温育期间悬浮于其中的液体中，并且可以在生长期间掺入微生物内。
信号传导剂可以包含放大器信号生成剂（放大器基团），使得来自每个完整微生物的信号可以被放大超过与每个微生物结合的信号传导剂的数目。例如，已知酶辣根过氧化物酶（HRP）能够使信号放大>1×104倍。因此，如果100个HRP分子与每个微生物表面结合，则可以实现106的放大。这可以通过使得能够区分无法以其它方式区别的微生物浓度，来增加AST测定可以由其进行的速度。铕制剂的使用类似地提供信号放大。
可替代地，信号传导剂可以包含本领域的技术人员已知作为膜染料的光学染料前体，其被设计为在插入疏水性区域（例如细胞膜）内时极大地增加荧光发射。用这些信号传导剂设计的测定可能需要将微生物浓缩成较小的体积，接近平面，以产生足够的信号，以便容易地进行光学测量。干扰种类可能需要使用近IR荧光团。
示例性的放大器基团包括例如国际公开号WO 2016/015027和国际申请号PCT/US16/42589中所述的那些，所述专利各自整体引入作为参考。放大器基团可以包含催化剂、荧光团、比色染料、酶、催化剂或纳米颗粒。示例性的荧光团包括国际申请号PCT/US16/42589的图7、表1中所述的那些，所述专利整体引入作为参考。放大器基团可以包含镧系元素。镧系元素包括但不限于铕、锶、铽、钐或镝。
放大器基团可以包含有机荧光团，例如配位络合物。配位络合物可以是铕配位络合物、钌配位络合物、铼配位络合物、钯配位络合物、铂配位络合物。放大器可以包含化学发光团、量子点、酶、铁配位催化剂、铕配位络合物、钌配位络合物、铼配位络合物、钯配位络合物、铂配位络合物、钐配位络合物、铽配位络合物或镝配位络合物。
在一些实施方案中，放大器基团包含其为以下的部分：
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。
在一些实施方案中，放大器基团包含其为以下的部分：
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；
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；
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；
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；或
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放大器基团可以包含荧光团或比色染料。合适的荧光团和比色染料是本领域的技术人员众所周知的，并且在The Molecular Probes® Handbook：A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies，第11版（2010），以及Gomes，Fernandes和Lima J. Biochem. Biophys. Methods 65（2005）第45-80页中描述，所述参考文献整体引入本文作为参考。示例性的荧光团还包括例如国际公开号WO 2016/015027和国际申请号PCT/US16/42589中所述的那些，所述专利各自整体引入作为参考。
合适的荧光团或比色染料的实例包括但不限于溴化乙锭、碘化丙锭、SYTOX绿、菲啶类、吖啶类、吲哚类、咪唑类、花青、TOTO、TO-PRO、SYTO、5-羧基-2,7-二氯荧光素、5-羧基荧光素（5-FAM）、5-羧基萘基荧光素、5-羧基四甲基罗丹明（5-TAMRA）、5-FAM（5-羧基荧光素）、5-HAT（羟基色胺）、5-ROX（羧基-X-罗丹明）、6-羧基罗丹明6G、7-氨基-4-甲基香豆素、7-氨基放线菌素D（7-AAD）、7-羟基-4-甲基香豆素、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、ACMA（9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶）、吖啶类、Alexa Fluors、茜素、别藻蓝蛋白（APC）、AMCA（氨基甲基香豆素）、Bodipy、羧基-X-罗丹明、儿茶酚胺、荧光素（FITC）、羟基香豆素、丽丝胺罗丹明、单溴二胺、俄勒冈绿、藻红蛋白、SYTO、硫杂二羰花青（DiSC3）、硫磺素、X-罗丹明、C或四甲基罗丹明异硫氰酸酯。
放大器基团可以包含有机金属化合物、过渡金属络合物或配位络合物。此类放大器基团的实例包括但不限于以下中描述的那些：EP 0 180 492、EP 0 321 353、EP 0 539435、EP 0 539 477、EP 0 569 496、EP139675、EP64484、US 4,283,382、US 4,565,790、US4,719,182、US 4,735,907、US 4,808,541、US 4,927,923、US 5,162,508、US 5,220,012、US5,324,825、US 5,346,996、US 5,373,093、US 5,432,101、US 5,457,185、US 5,512,493、US5,527,684、US 5,534,622、US 5,627,074、US 5,696,240、US 6,100,394、US 6,340,744、US6,524,727、US 6,717,354、US 7,067,320、US 7,364,597、US 7,393,599、US 7,456,023、US7,465,747、US 7,625,930、US 7,854,919、US 7,910,088、US 7,955,859、US 7,968,904、US8,007,926、US 8,012,609、US 8,017,254、US 8,018,145、US 8,048,659、US 8,067,100、US8,129,897、US 8,174,001、US 8,183,586、US 8,193,174、US 8,221,719、US 8,288,763、US8,362,691、US 8,383,249、US 8,492,783、US 8,632,753、US 8,663,603、US 8,722,881、US8,754,206、US 8,890,402、US 8,969,862、US 9,012,034、US 9,056,138、US 9,118,028、US9,133,205、US 9,187,690、US 9,193,746、US 9,312,496、US 9,337,432、US 9,343,685、US9,391,288和US 9,537,107，所述专利整体引入作为参考。示例性的有机金属化合物、过渡金属络合物或配位络合物还包括例如国际公开号WO 2016/015027和国际申请号PCT/US16/42589中所述的那些，所述文献各自整体引入作为参考。
在一些实施方案中，放大器基团是镧系元素配位络合物，例如镧系元素（例如Eu或Tb）和四齿配体之间的络合物或镧系元素（例如Eu或Tb）和穴状配体之间的络合物。在一些实施方案中，放大器基团是镧（La）、铈（Ce）、镨（Pr）、钕（Pm）、钐（Sm）、铕（Eu）、钆（Gd）、铽（Tb）、镝（Dy）、钬（Ho）、铒（Er）、铥（Tm）、镱（Yb）、镥（Lu）、钌（Ru）、铑（Rh）、钯（Pd）、锇（Os）、铱（Ir）或铂（Pt）的配位络合物。在一些实施方案中，放大器基团是稀土金属的配位络合物，所述稀土金属共同指由从原子序数为57的镧到原子序数为71的镥的一组15种元素（镧系元素）、以及由原子序数为21的钪和原子序数为39的钇组成的两种另外元素组成的17种元素。稀土金属的具体实例包括铕、铽、镧、铈、镨、钕、钷、钐、钆、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钪和钇。在一些实施方案中，放大器基团是镧系元素（例如铕或铽）与二亚乙基三胺四乙酸或穴状配体的配位络合物。
信号传导剂的具体实例包括但不限于包含以下的部分：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE016
Figure DEST_PATH_IMAGE018
信号传导剂可以包含发光团（供体），其特点在于发光量子效率高和发光衰减时间长（>100 ns）。示例性的发光团是钯、铑、铂、钌、锇、稀土（特别是铕和镧）的阳离子、金属有机络合物。这些金属有机络合物的有机部分可以由例如来自卟啉类、联吡啶类、菲咯啉类或其它杂环化合物的组的配体组成。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含抗体（例如单克隆或多克隆）、修饰的抗体（例如生物素化的单克隆抗体、生物素化的多克隆抗体、铕螯合物-抗体、辣根过氧化物酶缀合的抗体）、抗体变体（例如Fab：片段，抗原结合（单臂）；F（ab'）2：片段，抗原结合，包括铰链区（双臂）；Fab'：片段，抗原结合，包括铰链区（单臂）；scFv：单链可变片段；二-scFv：二聚单链可变片段；sdAb：单结构域抗体；双特异性单克隆抗体；三功能抗体；和BiTE：双特异性T细胞衔接器）、WGA-生物素、多粘菌素B-生物素、凝集素、天然肽、合成肽、合成和/或天然配体、合成和/或天然聚合物、合成和/或天然糖聚合物、碳水化合物结合蛋白和/或聚合物、糖蛋白结合蛋白和/或聚合物、荷电的小分子、其它蛋白质、细菌噬菌体和/或适体。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结构或由结构形成，所述结构包含抗体、凝集素、天然肽、合成肽、合成和/或天然配体、合成和/或天然聚合物、合成和/或天然糖聚合物、碳水化合物结合蛋白和/或聚合物、糖蛋白结合蛋白和/或聚合物、荷电的小分子、其它蛋白质、细菌噬菌体和/或适体。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含放大器基团，其包含镧系元素配位络合物和/或酶和链霉抗生物素蛋白和/或抗体和/或适体。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含多克隆和/或单克隆抗体。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含修饰的抗体。示例性的修饰的抗体包括生物素化的单克隆抗体、生物素化的多克隆抗体、铕螯合物-抗体和辣根过氧化物酶缀合的抗体。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含抗体变体。示例性的抗体变体包括Fab：片段，抗原结合（单臂）；F（ab'）2：片段，抗原结合，包括铰链区（双臂）；Fab'：片段，抗原结合，包括铰链区（单臂）；scFv：单链可变片段；二-scFv：二聚单链可变片段；sdAb：单结构域抗体；双特异性单克隆抗体；三功能抗体；和BiTE：双特异性T细胞衔接器。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含WGA-生物素或多粘菌素B-生物素。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含合成和/或天然配体和/或肽。在一些实施方案中，配体和/或肽选自双(锌-二吡啶甲基胺)、TAT肽、丝氨酸蛋白酶、cathelicidin、阳离子糊精、阳离子环糊精、水杨酸、赖氨酸及其组合。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含合成和/或天然聚合物和/或糖聚合物。在实施方案中，天然和/或合成聚合物是直链或支链的，并且选自支链淀粉、聚(N-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺)、聚(亚乙基亚胺)、聚-L-赖氨酸、聚[甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙基酯]及其组合。在一些实施方案中，天然和/或合成聚合物和/或糖聚合物包含部分，其包括但不限于壳聚糖、明胶、葡聚糖、海藻糖、纤维素、甘露糖、阳离子糊精和环糊精、季胺、吡啶鎓三溴化物、组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、锍、鏻或其组合，包括但不限于共嵌段、接枝和交替聚合物。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含选自甘露糖结合凝集素、其它凝集素、膜联蛋白及其组合的糖蛋白。
在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含：抗体；和铕配位络合物。在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含接头基团L，其包含NH2-PEG-生物素（2K）、NH2-PEG-生物素（4K）、磺基-NHS-生物素、WGA-生物素或多粘菌素B-生物素。在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含铕络合物，其包含：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含铕络合物，其包含：
Figure DEST_PATH_IMAGE022
可替代地，信号传导剂可以是一对的部分，例如FRET/TR-FRET供体和受体或由光敏剂和检测剂组成的单线态氧对。用这些信号传导剂设计的测定可能需要从初始生长培养基中分离微生物，伴随在添加信号传导剂之前的后续重悬浮于所需的反应缓冲液内。相反，由于生成信号所必需的所需相对距离，用这些信号传导剂设计的测定可能不需要分离步骤。
FRET/TR-FRET供体的实例包括但不限于含镧系元素（Eu、Sm、Dy或Tb）的穴状化合物有机金属（CisBio）、Lance Eu-W1024（Perkin Elmer）、Lance Eu- W8044（PerkinElmer），以及任何有机荧光对供体。
FRET/TR-FRET受体的实例包括但不限于匹配的有机染料，例如ULight染料（Perkin Elmer）、SureLight APC（Perkin Elmer）、别藻蓝蛋白、Cy5、d2染料（CisBio），以及任何有机荧光对受体。
单线态氧光敏剂的实例包括但不限于methuselah Green Carboxy（Ursa Bio）、Sensitizer Blue（Ursa Bio）、孟加拉红、赤藓红B、亚甲基蓝、叶绿素、AlphaBead供体（Perkin Elmer）。
单线态氧检测剂的实例包括但不限于单线态氧检测剂绿色（ThermoFisher）、反式1-(2’-甲氧基乙烯基)芘、Si-DMA（Dojindo）、AlphaBead受体（Perkin Elmer）。
掺入剂的实例包括但不限于Angew Chem Int Ed Engl. 2012年12月7日；51（50）：12519–12523中描述的乙炔基-D-丙氨酸（EDA）、叠氮基-D-丙氨酸（ADA）、荧光D-丙氨酸。
实施例
实施例1：
将人血（5 mL）和细菌加入20 mL BACTEC生长培养基中，以得到1000 cfu/mL的细菌载量。将12 mL细菌溶液置于15 mL的falcon管内。将管以500 RCF旋转5分钟。取出所得到的上清液，并且置于干净的15 mL管内。将含有上清液的管以1350 RCF旋转5分钟，产生细菌团块。去除上清液，并且将15 mL管倒置到50 mL管内。将管在这个位置中以200 RCF旋转1分钟。将所得到的细菌团块重悬浮于500 uL的MHB内。将3个150 uL等分试样置于96孔板内，并且光学监测生长。在6小时后，将样品稀释10倍，并且接种到AST平板上。在20小时后读取AST数据。该过程在图1中示出。
实施例2：
将尿样品（2 mL）置于两个10 mL LeucoSep离心管内。将管以500 RCF旋转5分钟。将2mL盐水加入管中，以重悬浮细菌。第二次添加2 mL，以洗涤膜。将管的内容物合并并且进行光学测量。将样品稀释并接种到两块AST平板上。使用SeLux测定和CLSI指南读取平板。该过程在图2中示出。
实施例3：
从其瓶中取出阳性血液培养物（PBC）。96孔板的一列填充有90 μL盐水，然后添加10 μLPBC。同时，将10 μL 10-3到10-8稀释物点涂到琼脂平板上，并且温育过夜。将4 mL PBC加入2个5 mL Sarstedt Screw Cap管中（2个管/PBC/裂解洗涤剂）。将管以500 RCF离心2分钟。将3 mL上清液移至干净的管中，在其中加入1 mL裂解洗涤剂（3%皂苷、1.53%多聚茴香脑磺酸钠、0.000008%丙二醇[4000 Mn]），并且将管涡旋。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出上清液，加入1 mL盐水，并且将管涡旋。将管再次以2370 RCF离心5分钟。再次抽吸出上清液，加入1 mL盐水，并且将管涡旋，然后合并到1个管内。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出上清液，加入1 mL盐水，并且将管涡旋。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出上清液，加入1 mL盐水，并且将管涡旋。将重悬浮液移至比色杯中，并且获取光密度。96孔板的一列填充有90 uL盐水。将10 μL重悬浮液加入该行的第一个孔中，然后向下制备1:10的稀释物，直至制备10-1至10-8的稀释物。将10 μL 10-3到10-8稀释物点涂到琼脂平板上，并且温育过夜。
实施例4：
将5 mL载有细菌的尿样品置于15mL falcon管内。将管以500 RCF旋转5分钟。取出来自这个初始旋转的上清液，并且置于干净的15mL管内。将含有上清液的管以1350 RCF旋转5分钟，以使细菌形成团块。倾析出大部分上清液，然后将15mL管倒置到50mL管内，所述50mL管然后以200 RCF旋转1分钟。然后将所得到的细菌团块重悬浮于5mL盐水内，然后光学测定细菌浓度。将样品稀释以给出用于AST的适当浓度，然后接种到两块单独的AST平板上。使用SeLux测定处理一块平板，并且将另一块平板置于培养箱中过夜，以根据CLSI指南读取。该过程在图3中示出。
实施例5：
从血液培养瓶中取出阳性血液培养物（PBC）。96孔板的一列（每种PBC）填充有90 μL盐水。将10 μL PBC加入该行的第一个孔中，然后向下制备1:10的稀释物，直至制备10-1至10-8的稀释物。将10 μL 10-3到10-8稀释物点涂到琼脂平板上，并且温育过夜。将4 mL PBC加入2个5 mL Sarstedt Screw Cap管中（2个管/PBC/裂解洗涤剂）。将管以500 RCF离心2分钟。将每管3 mL上清液移至干净的管中。加入1 mL裂解洗涤剂，并且将管涡旋（洗涤剂I2：3%皂苷、1.53%多聚茴香脑磺酸钠、8 × 10-6%丙二醇[4000 Mn]）。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出上清液，加入1 mL盐水，并且将管涡旋。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出上清液，再次用1 mL盐水洗涤团块，并且将管涡旋，然后合并到1个最终管内。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出盐水，并且加入1 mL盐水，并且将管涡旋。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出盐水，并且加入1 mL盐水，并且将管涡旋。将重悬浮液移至比色杯中，并且获取OD（第1次用盐水取空白值）。96孔板的一列（每种最终重悬浮液）填充有90 uL盐水。将10 μL重悬浮液加入该行的第一个孔中，然后向下制备1:10的稀释物，直至制备10-1至10-8的稀释物。将10 μL10-3到10-8稀释物点涂到琼脂平板上，并且温育过夜。该过程在图5中示出，其中代表性数据显示于图12-13中。
实施例6：
将2 mL来自BacTec瓶的血液加入5 mL管中。在1-5分钟内在100-500 RCF之间离心。在离心后，取出1 mL上清液以检查OD 600。分光光度计用来自2 mL管的上清液取空白值，所述2 mL管以2370 RCF（最大速度）离心10分钟。该过程在图3中示出。
实施例7：
从血液培养机中取出阳性血液培养物（PBC）。将4 mL PBC加入2个5 mL SarstedtScrew Cap管中（2个管/PBC/裂解洗涤剂）。将管以500 RCF离心2分钟。将每管3 mL上清液移至干净的管中。加入1 mL裂解洗涤剂，并且将管涡旋（洗涤剂I2：3%皂苷、1.53%多聚茴香脑磺酸钠、8 × 10-6%丙二醇[4000 Mn]）。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出上清液，加入1mL盐水，并且将管涡旋。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出上清液，再次用1 mL盐水洗涤团块，并且将管涡旋，然后合并到1个最终管内。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出盐水，并且加入1 mL盐水，并且将管涡旋。将管以2370 RCF离心5分钟。抽吸出盐水，并且加入1 mL盐水，并且将管涡旋。将重悬浮液移至比色杯中，并且获取OD（第1次用盐水取空白值）。96孔板的一列（每种最终重悬浮液）填充有90 uL盐水。将10 μL重悬浮液加入该行的第一个孔中。该过程在图4中示出。
实施例8：
从血液培养机上取出阳性血液培养物（PBC）。将6 mL PBC加入15mL锥形管中。将管以250 RCF离心5分钟。将5 mL上清液移至干净的管中。将管以1350 RCF离心5分钟。抽吸出上清液，加入5 mL盐水，并且将管涡旋。将管以1350 RCF离心5分钟。抽吸出上清液，将团块用0.5 mL盐水重悬浮。然后将重悬浮液处理为0.5 McFarland，并且用于接种AST测定。来自该过程的代表性数据在图14-15中可见。
引入作为参考
本文提到的所有出版物、专利和专利申请都在此整体引入作为参考，如同每个个别出版物、专利或专利申请特异性地且个别地指出引入作为参考。在冲突的情况下，以本申请，包括本文的任何定义为准。
等价方案
使用不超过常规实验，本领域的技术人员将认识到或者能够确定本文所述的具体实施方案的许多等价方案。此类等价方案预期由随附的权利要求涵盖。

Claims (123)

1.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：
a. 以<1000 RCF离心；
b. 收集来自步骤a的第一上清液；
c. 用一种或多种裂解剂处理第一上清液；
d. 以>1000 RCF离心来自步骤c的经处理的第一上清液；
e. 去除来自步骤d的上清液；
f. 将微生物团块重悬浮于盐水或合适的缓冲溶液中；
g. 任选地在步骤f的团块重悬浮之后，任选地通过重复步骤d-e，将所述团块洗涤一次或多次；和
h. 任选地通过测量在500至700 nm之间的一个或多个波长处的光密度，来定量所述细胞悬浮液。
2.权利要求1的方法，其中所述裂解剂包括但不限于皂苷、tritons、tweens、氯化铵、脱水山梨糖醇酯、非离子型聚氧乙烯表面活性剂。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述裂解剂包含一种或多种水溶性化合物。
4.权利要求3的方法，其中所述水溶性化合物包括但不限于多聚茴香脑硫酸钠（SPS）、聚丙二醇（PPG）、碳酸钾、碳酸氢钾、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸（CAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述裂解剂包含皂苷、SPS和PPG。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述裂解剂包含氯化铵，并且在裂解期间添加碳酸氢钾。
7.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述裂解剂包含氯化铵和碳酸氢钾以及EDTA或EDTA钠盐。
8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述裂解剂包含Brij 97和CAPS。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其中不洗涤所述团块。
10.权利要求1-7中任一项的方法，其中将所述团块洗涤一次。
11.前述权利要求的方法，其中所述洗涤用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。
12.前述权利要求的方法，其中所述团块在洗涤溶液添加之后进行重悬浮。
13.权利要求10的方法，其中所述团块在洗涤溶液添加之后不进行重悬浮。
14.权利要求1-9中任一项的方法，其中将所述团块洗涤两次。
15.前述权利要求的方法，其中所述洗涤用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。
16.前述权利要求的方法，其中所述团块在洗涤溶液添加之后不进行重悬浮。
17.权利要求14的方法，其中所述团块在洗涤溶液添加之后不进行重悬浮。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中将所述团块重悬浮于盐水、中性缓冲液或生长培养基中。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中在500 nm至700 nm之间的一个或多个波长处，光学定量所述重悬浮的团块中的细胞。
20.前述权利要求的方法，其中所述细胞通过分光计、分光光度计或浊度计进行定量。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述细胞在用一种或多种前体化合物处理悬浮细胞之后进行定量。
22.前述权利要求的方法，其中所述前体化合物包括但不限于PicoGreen、吖啶橙、RedSafe、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚、溴化乙锭、SYBR绿I、SYBR绿II、萤光素和刃天青。
23.权利要求16-22中任一项的方法，其中将所述前体化合物加入重悬浮的团块悬浮液的等分试样中，然后测量该等分试样。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述第一离心是500 RCF。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述第二离心是2370 RCF。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述第三离心是2370 RCF。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述第四离心是2370 RCF。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中一次或多次离心以<90°的固定角度执行。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中一次或多次离心以相对于旋转轴30°、45°、60°的固定角度执行。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中对来自连续监测系统的阳性血液培养物执行所述方法。
31.前述权利要求的方法，其中对引入连续监测血液培养系统内之后≤48小时转阳的培养物执行所述方法。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中对尿样品执行所述方法。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中所述衍生自患者的样品体积小于20 mL、15mL、10 mL。
34.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：
a. 对样品施加< 1000 × g的相对离心力（RCF），从而产生微粒耗竭的上清液；
b. 在微粒耗竭的上清液中裂解至少一种患者细胞或血小板，从而产生患者细胞耗竭的上清液；
c. 对患者细胞耗竭的上清液施加>1000 × g的RCF，从而形成团块；
d. 收集并重悬浮所述团块；
e. 任选地通过重复步骤c和d，将所述团块洗涤一次或多次；和
f. 评价盐水或缓冲溶液中的微生物密度。
35.权利要求34的方法，其中通过裂解剂完成所述裂解，所述裂解剂包括但不限于皂苷、tritons、tweens、氯化铵、脱水山梨糖醇酯、非离子型聚氧乙烯表面活性剂。
36.权利要求35的方法，其中除所述一种或多种裂解剂之外，所述裂解剂还包含一种或多种水溶性化合物。
37.权利要求36的方法，其中所述水溶性化合物包括但不限于多聚茴香脑硫酸钠（SPS）、聚丙二醇（PPG）、碳酸钾、碳酸氢钾、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸（CAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠。
38.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述裂解剂包含皂苷、SPS和PPG。
39.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述裂解剂包含氯化铵和碳酸氢钾。
40.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述裂解剂包含氯化铵和碳酸氢钾以及EDTA或EDTA钠盐。
41.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述裂解剂包含Brij 97和CAPS。
42.权利要求34-41中任一项的方法，其中不洗涤所述团块。
43.权利要求34-42中任一项的方法，其中将所述团块洗涤一次。
44.前述权利要求的方法，其中所述洗涤用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。
45.权利要求34-44中任一项的方法，其中将所述团块洗涤两次。
46.前述权利要求的方法，其中所述洗涤用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。
47.权利要求34-46中任一项的方法，其中将所述团块重悬浮于盐水、中性缓冲液或生长培养基中。
48.权利要求34-47中任一项的方法，其中在500 nm至700 nm之间的一个或多个波长处，光学评价所述重悬浮的团块中的细胞。
49.前述权利要求的方法，其中所述细胞通过分光计、分光光度计或浊度计进行评价。
50.权利要求34-48中任一项的方法，其中所述细胞在用一种或多种前体化合物处理悬浮细胞之后进行评价。
51.前述权利要求的方法，其中所述前体化合物包括但不限于PicoGreen、吖啶橙、RedSafe、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚、溴化乙锭、SYBR绿I、SYBR绿II、萤光素和刃天青。
52.权利要求50-51中任一项的方法，其中将所述前体化合物加入重悬浮的团块悬浮液的等分试样中，然后测量该等分试样。
53.权利要求34-52中任一项的方法，其中所施加的第一RCF是500 RCF。
54.权利要求34-53中任一项的方法，其中所施加的第二RCF是2370 RCF。
55.权利要求34-54中任一项的方法，其中所施加的第三RCF是2370 RCF。
56.权利要求34-55中任一项的方法，其中所施加的第四RCF是2370 RCF。
57.权利要求34-56中任一项的方法，其中一个或多个RCF以<90°的固定角度施加。
58.权利要求34-57中任一项的方法，其中对来自连续监测系统的阳性血液培养物执行所述方法。
59.前述权利要求的方法，其中对引入连续监测血液培养系统内之后≤48小时转阳的培养物执行所述方法。
60.权利要求34-59中任一项的方法，其中所述衍生自患者的样品体积小于20 mL、15mL、10 mL。
61.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：
a. 对样品施加第一相对离心力，从而产生相对澄清的上清液；
b. 在相对澄清的上清液中裂解至少一种患者细胞或血小板，从而产生患者细胞耗竭的上清液；
c. 对来自步骤b的样品施加第二相对离心力，从而形成团块；
d. 去除上清液；
e. 任选地通过重复步骤c和d，将所述团块洗涤一次或多次；
f. 将所述团块重悬浮于合适的盐水或缓冲溶液中；和
g. 评价盐水或缓冲溶液中的微生物密度。
62.权利要求61的方法，其中所述裂解至少一种患者细胞的步骤包括使所述澄清的上清液与选自以下的裂解剂接触：皂苷、tritons、tweens、氯化铵、脱水山梨糖醇酯、非离子型聚氧乙烯表面活性剂。
63.权利要求62的方法，其中除所述一种或多种裂解剂之外，所述裂解剂还包含一种或多种水溶性化合物。
64.权利要求63的方法，其中所述水溶性化合物包括但不限于多聚茴香脑硫酸钠（SPS）、聚丙二醇（PPG）、碳酸钾、碳酸氢钾、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸（CAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠。
65.权利要求61-64中任一项的方法，其中所述裂解剂包含皂苷、SPS和PPG。
66.权利要求61-64中任一项的方法，其中所述裂解剂包含氯化铵和碳酸氢钾。
67.权利要求61-64中任一项的方法，其中所述裂解剂包含氯化铵和碳酸氢钾以及EDTA或EDTA钠盐。
68.权利要求61-64中任一项的方法，其中所述裂解剂包含Brij 97和CAPS。
69.权利要求61-68中任一项的方法，其中不洗涤所述团块。
70.权利要求61-69中任一项的方法，其中将所述团块洗涤一次。
71.前述权利要求的方法，其中所述洗涤用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。
72.权利要求61-71中任一项的方法，其中将所述团块洗涤两次。
73.前述权利要求的方法，其中所述洗涤用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。
74.权利要求61-73中任一项的方法，其中将所述团块重悬浮于盐水、中性缓冲液或生长培养基中。
75.权利要求61-74中任一项的方法，其中在500 nm至700 nm之间的一个或多个波长处，光学评价所述重悬浮的团块中的细胞。
76.前述权利要求的方法，其中所述细胞通过分光计、分光光度计或浊度计进行评价。
77.权利要求61-76中任一项的方法，其中所述细胞在用一种或多种前体化合物处理悬浮细胞之后进行评价。
78.前述权利要求的方法，其中所述前体化合物包括但不限于PicoGreen、吖啶橙、RedSafe、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚、溴化乙锭、SYBR绿I、SYBR绿II、萤光素和刃天青。
79.权利要求61-78中任一项的方法，其中将所述前体化合物加入重悬浮的团块悬浮液的等分试样中，然后测量该等分试样。
80.权利要求61-79中任一项的方法，其中所施加的第一RCF低于所施加的第二RCF。
81.权利要求61-80中任一项的方法，其中所施加的第一RCF是500 RCF。
82.权利要求61-81中任一项的方法，其中所施加的第二RCF是2370 RCF。
83.权利要求61-82中任一项的方法，其中所施加的第三RCF是2370 RCF。
84.权利要求61-83中任一项的方法，其中所施加的第四RCF是2370 RCF。
85.权利要求61-84中任一项的方法，其中一个或多个RCF以<90°的固定角度施加。
86.权利要求61-85中任一项的方法，其中对来自连续监测系统的阳性血液培养物执行所述方法。
87.前述权利要求的方法，其中对引入连续监测血液培养系统内之后≤48小时转阳的培养物执行所述方法。
88.权利要求61-87中任一项的方法，其中所述衍生自患者的样品体积小于10 mL。
89.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：
a. 以<1000 ×g离心；
b. 收集来自步骤a的上清液，随后以>1000 ×g离心；
c. 清洗由步骤b产生的团块；
d. 将所述团块重悬浮；和
e. 将来自重悬浮团块的微生物细胞接种到AST盒的多个孔中的每一个内。
90.权利要求89的方法，其进一步包括在促进微生物生长的条件下温育所述重悬浮的细胞。
91.权利要求89的方法，其中所述团块通过倒置离心进行清洗。
92.权利要求89-91中任一项的方法，其中所述团块通过重悬浮随后为另外的离心步骤进行清洗，这之后去除上清液。
93.权利要求89-92中任一项的方法，其中将所述团块重悬浮于生长培养基中。
94.权利要求89-93中任一项的方法，其中在团块重悬浮后，将所述样品等分到两个或更多个独立的储器内。
95.权利要求89-94中任一项的方法，其中所述细胞浓度的测量通过吸光度或浊度法光学执行。
96.权利要求89-95中任一项的方法，其中所述样品是尿、血液、滑液、脑脊髓液、痰、支气管肺泡灌洗液、鼻拭子或伤口拭子。
97.权利要求89-96中任一项的方法，其中所述样品是已在液体生长培养基中培养的血液。
98.前述权利要求中任一项的方法，其中所述促进微生物生长的条件包括33-37℃的温度。
99.权利要求89-98中任一项的方法，其中所述促进微生物生长的条件包括搅动。
100.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：
a. 将样品置于配备有分离膜的离心管内；
b. 以<1000 ×g离心；
c. 洗涤膜以重悬浮沉积的细菌；和
d. 测量重悬浮细胞的浓度。
101.权利要求100的方法，其进一步包括在促进微生物生长的条件下温育所述重悬浮的细胞。
102.权利要求100-101中任一项的方法，其中在细菌重悬浮后，将所述样品等分到两个或更多个独立的储器内。
103.权利要求100-102中任一项的方法，其中所述细胞浓度的测量通过吸光度或浊度法光学执行。
104.权利要求100-103中任一项的方法，其中所述样品是尿、血液、滑液、脑脊髓液、痰、支气管肺泡灌洗液、鼻拭子或伤口拭子。
105.权利要求100-104中任一项的方法，其中所述样品是已在液体生长培养基中培养的血液。
106.权利要求100-105中任一项的方法，其中所述促进微生物生长的条件包括33-37℃的温度。
107.权利要求100-106中任一项的方法，其中所述促进微生物生长的条件包括搅动。
108.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：
a. 对样品施加第一相对离心力，从而形成第一团块和第一上清液；
b. 对第一上清液施加第二相对离心力，从而形成第二团块和第二上清液；
c. 清洗由步骤b产生的第二团块；
d. 将所述第二团块重悬浮于缓冲溶液中；和
e. 测量重悬浮于缓冲溶液中的微生物浓度。
109.权利要求108的方法，其进一步包括在促进微生物生长的条件下温育所述重悬浮的微生物。
110.权利要求108-109中任一项的方法，其中所述第一相对离心力低于所述第二相对离心力。
111.权利要求108-110中任一项的方法，其中所述团块通过倒置离心进行清洗。
112.权利要求108-111中任一项的方法，其中所述团块通过重悬浮随后为另外的离心步骤进行清洗，这之后去除上清液。
113.权利要求108-112中任一项的方法，其中将所述团块重悬浮于生长培养基中。
114.权利要求108-113中任一项的方法，其中在团块重悬浮后，将样品等分到两个或更多个独立的储器内。
115.权利要求108-114中任一项的方法，其中所述细胞浓度的测量通过吸光度或浊度法光学执行。
116.权利要求108-115中任一项的方法，其中所述样品是尿、血液、滑液、脑脊髓液、痰、支气管肺泡灌洗液、鼻拭子或伤口拭子。
117.权利要求108-116中任一项的方法，其中所述样品是已在液体生长培养基中培养的血液。
118.权利要求108-117中任一项的方法，其中所述促进微生物生长的条件包括33-37℃的温度。
119.权利要求108-118中任一项的方法，其中所述促进微生物生长的条件包括搅动。
120.权利要求119的方法，其中生长确定遵循权利要求109-119中任一项。
121.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的体外微生物分离系统，所述样品包含衍生自患者的病原微生物，所述体外微生物分离系统包括：
流体处理模块，其被配置为允许溶液对所述样品的添加以及从所述样品中的去除；
离心机，其具有延伸穿过离心机的固定转子的纵轴、垂直于纵轴的法向轴、以及一定角度的固定转子；
旋涡器，其被配置为搅动所述样品；和
细胞定量器械，其被配置为测量所述样品的度量。
122.权利要求121的系统，其中所述角度是距离所述法向轴约30°、45°、60°。
123.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的方法，所述样品包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括：
经由流体处理模块，将样品转移到样品管内；
将所述样品管设置在具有固定转子的离心机内，所述固定转子相对于法向轴成一定角度，所述法向轴垂直于离心机的纵轴；
将所述离心机启动一段时间；
从所述样品管中去除一部分样品流体；
将一部分裂解剂加入所述样品管中；
使所述样品管经受配置为搅动样品的旋涡器；
将一部分盐水或缓冲溶液加入所述样品管中；
将所述样品管中的基本上所有流体都转移到比色杯中；在500 nm至700 nm之间的一个或多个波长处，使用光学细胞定量器械来测量样品的度量；
将所述悬浮液稀释至预定水平；
使用细胞定量器械来验证所述样品的度量；和
将所述流体转移到输出管。
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