BR112020017555A2 - Preparação de amostra para teste de suscetibilidade antimicrobiana - Google Patents

Abstract

a invenção refere-se a métodos para preparação de amostra microbiológica a partir de pacientes que provê material de entrada de alta qualidade para teste de suscetibilidade antimicrobiana (ast) sem a necessidade de cultura de placa. certos métodos da presente invenção compreendem etapas de separação múltiplas para purificar amostras microbianas para uso em asts.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PREPARAÇÃO DE AMOSTRA PARA TESTE DE SUSCETIBILIDADE ANTIMICROBIANA”. Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[0001] O presente pedido reivindica prioridade para o pedido provisório US 62/637.786, depositado em 2 de março de 2018, e intitulado “Sample Preparation for Antimicrobial Susceptibility Testing”. O pedido acima é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade e para todos os propósitos. Campo da Invenção

[0002] A presente invenção refere-se à preparação e teste de amostras clínicas microbiológicas. Antecedentes

[0003] Infecções microbianas resistentes a antimicrobianos estão associadas com resultados clínicos pobres incluindo morbidez, mortalidade e custos com cuidados de saúde aumentados dentre os pacientes infectados. A prevalência desses organismos nos Estados Unidos tem aumentado constantemente durante os últimos 30 anos. Teste de susceptibilidade a antimicrobianos fenotípicos (AST) de micro- organismos é crítico para informar a médicos de regimes terapêuticos apropriados. Usando os métodos atuais, determinação de AST tipicamente requer um mínimo de oito horas, fazendo com que seja um processo de um dia para o outro devido à mudança de turno de trabalho em muitos laboratórios de microbiologia clínica. Enquanto aguardando por uma determinação de métodos de AST atuais, os pacientes são frequentemente administrados com antimicrobianos de amplo espectro que frequentemente têm efeitos prejudiciais significantes sobre a saúde do paciente e/ou contribuem para a crescente epidemia de resistência antimicrobiana. Ainda, esse atraso de tempo de obtenção de informação do tratamento antimicrobiano preciso aumenta o tempo que o paciente permanece em hospitais, dessa maneira aumentando os custos e inconveniência para o paciente.

[0004] Contra esse pano de fundo, o governo e acionistas da indústria propuseram regras para promover administração antimicrobiana em hospitais. No entanto, os esforços de administração antimicrobiana podem ser complicados pelas limitações de métodos de AST atuais e práticas de prescrição de antimicrobianos. Os inventores revelaram anteriormente um método para AST rápido, que pode reduzir o tempo requerido para determinações de AST e facilitar a administração antimicrobiana. Por exemplo, sistemas e métodos de AST utilizando sondas fluorescentes que se ligam a superfícies de micro-organismos são descritos na Patente U.S. 9.834.808 de propriedade comum e Publicação PCT WO 2018/119439. Esses sistemas e métodos são vantajosos pelo fato que eles se dirigem a essa necessidade de uma maneira de custo eficaz e podem ser compatíveis com componentes de hardware de ensaio existentes.

[0005] Métodos de AST convencionais utilizam preparação de amostra de cultura à base de placas para purificar micróbios e remover contaminantes de amostras primárias, um processo que requer tipicamente uma cultura de um dia para o outro. Redução ou eliminação da necessidade de cultura à base de placa, de um dia para o outro, poderia potencialmente acelerar a liberação de resultados de AST aos prescreventes, o que por sua vez poderia melhorar os resultados do paciente. Consequentemente, há uma necessidade no campo hoje de processos de preparação de amostra rápidos que mantenham os patógenos microbianos em um estado adequado para realização de AST, enquanto removendo células, tais como células sanguíneas, e espécies solúveis, tais como antibióticos. Sumário

[0006] A presente invenção provê sistemas e métodos para obtenção de um material de entrada de AST adequado diretamente a partir de amostras de paciente e/ou amostras de sangue culturadas determinadas como sendo positivas para crescimento de micro- organismo através de métodos estabelecidos, tal como monitoramento contínuo de cultura de sangue. Os sistemas e métodos descritos abaixo, portanto, permitem processamento rápido de amostras de pacientes para AST e reduzem o tempo para resultado para ensaios de AST rápidos. Em vários aspectos da invenção, a amostra do paciente é uma amostra humana e a amostra humana processada, tal como urina, sangue, fluido sinovial, fluido cerebrospinal, esputo, lavagem broncoalveolar, esfregaço nasal ou esfregaço de ferida. Métodos de processamento da presente invenção podem utilizar enzimas para degradar matrizes de amostra, tal como para esputo, ou fluido para dispersar amostra, tal como para esfregaços. Amostras de sangue podem ser também processadas através de cultura líquida ou “garrafas de sangue”, como conhecido daqueles de habilidade na técnica. Tais amostras podem ser culturas sanguíneas “positivas” ou podem ser de garrafas incubadas a 33-37º C, preferivelmente por 4-10 horas, mas não determinadas como sendo positivas ainda.

[0007] De acordo com esses aspectos da invenção, métodos para separação de micro-organismos a partir de culturas de sangue são providos. As culturas de sangue usadas em certas modalidades da presente invenção podem ser preparadas de qualquer maneira adequada, por exemplo, a partir de culturas de sangue que foram determinadas como sendo positivas usando sistemas de cultura de sangue de monitoramento contínuo, tais como o BACTEC® (Becton- Dickinson), o BacT/Alert® (bioMérieux) e o VersaTrek™ (Thermo Fisher)). Através da utilização de um reagente lítico após uma centrifugação inicial, um método exemplar da presente invenção é capaz de remover adequadamente uma pluralidade de coágulos hemolíticos, células eucarióticas e fragmentos de células eucarióticas que impactam a medição óptica enquanto sendo facilmente automatizado. Especificamente, os métodos descritos aqui superam a necessidade de filtros à base de gel, tais como tubos separadores de soro descritos por Lupetti e outros, ou filtros sólidos, tal como filtro de membrana descrito em Machen e outros PLoS ONE 9(2): e87870 que caracteriza métodos padrão na técnica atuais.

[0008] Em alguns aspectos, a presente invenção descreve um método automatizado para preparação de uma amostra suspeita compreender micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana, compreendendo as etapas de: (a) centrifugação a <1000 RCF; (b) coleta de um primeiro sobrenadante a partir da etapa a); (c) tratamento do primeiro sobrenadante com um ou mais reagentes líticos; centrifugação do primeiro sobrenadante tratado a partir da etapa c a >1000 RCF; e (e) remoção do sobrenadante da etapa d; (f) ressuspensão do pélete de micro-organismo em solução salina ou uma solução-tampão adequada; (g) opcionalmente lavagem do pélete uma ou mais vezes repetindo as etapas d-e, opcionalmente após a etapa f de ressuspensão de pélete; e (h) quantificação da suspensão celular.

[0009] Ainda, o reagente lítico pode incluir, mas não é limitado a, saponinas, tritons, tweens, cloreto de amônio, ésteres de sorbitano, tensoativos de polioxietileno não iônicos. O reagente lítico pode compreender um ou mais compostos solúveis em água em adição a o um ou mais agentes líticos. Os compostos solúveis em água podem incluir, mas não estão limitados a, polianetol sulfato de sódio (SPS), polipropileno glicol (PPG), carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, ácido N-cicloexil-3-aminopropanossulfônico (CAPS), ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), cloreto de sódio. O reagente lítico pode compreender saponina, SPS e PPG. O reagente lítico pode compreender cloreto de amônio e bicarbonato de potássio é adicionado durante a lise. O reagente lítico pode compreender cloreto de amônio e bicarbonato de potássio e EDTA ou sal de sódio de EDTA. O reagente lítico pode compreender Brij97 e CAPS.

[0010] Ainda, o pélete pode não ser lavado. O pélete pode ser lavado uma vez. A lavagem pode ser realizada com solução salina, um tampão neutro ou meios de crescimento. O pélete pode ser ressuspenso seguindo adição de solução de lavagem. O pélete pode não ser ressuspenso seguindo adição de solução de lavagem. O pélete pode ser lavado duas vezes. A lavagem pode ser realizada com solução salina, um tampão neutro ou meio de crescimento. O pélete pode ser ressuspenso seguindo adição de solução de lavagem. O pélete pode não ser ressuspenso seguindo adição de solução de lavagem. As células no pélete ressuspenso podem ser quantificadas opticamente em um ou mais comprimentos de onda entre 500 nm e 700 nm. As células podem ser quantificadas através de um espectrômetro, um espectrofotômetro ou um nefelômetro. As células podem ser quantificadas seguindo tratamento das células suspensas com um ou mais compostos precursores. Os compostos precursores podem incluir, mas não estão limitados a, PicoGreen, laranja acridina, RedSafe, 4’,6’- diamidino-2-fenilindol, brometo de etídio, SYBR green I, SYBR green II, luciferina e resazurina. O composto precursor pode ser adicionado a uma alíquota da suspensão de pélete ressuspenso e essa alíquota é então medida. A primeira centrifugação pode ser 500 RCF. A segunda centrifugação pode ser 2370 RCF. A terceira centrifugação pode ser 2370 RCF. A quarta centrifugação pode ser 2370 RCF. Uma ou mais centrifugações podem ser realizadas em um ângulo fixo <90º. Uma ou mais centrifugações podem ser realizadas em um ângulo fixo de 30º, 45º, 60º em relação ao eixo de rotação.

[0011] Em alguns aspectos, o método pode ser realizado em culturas de sangue positivas de sistemas de monitoramento contínuo. O método pode ser realizado em culturas que se tornaram positivas ≤ 48 horas após introdução no sistema de cultura de sangue de monitoramento contínuo. O método pode ser realizado em amostras de urina. O volume da amostra derivada do paciente é menos do que 20 mL, 15 mL, 10 mL.

[0012] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método automatizado para preparação de uma amostra suspeita compreender micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de suscetibilidade antimicrobiana compreendendo as etapas de: (a) aplicar uma força centrífuga relativa (RCF) de < 1000 × g a uma amostra, dessa maneira produzindo um sobrenadante depletado de partículas; (b) lisar pelo menos uma célula ou plaqueta de paciente no sobrenadante depletado de partículas, dessa maneira produzindo um sobrenadante depletado de células de paciente; (c) aplicar uma RCF de >1000 × g ao sobrenadante depletado de células do paciente, dessa maneira formando um pélete; (d) coletar e ressuspender o pélete; (e) opcionalmente lavar o pélete uma ou mais vezes através da repetição das etapas c e d; e (f) avaliar uma densidade de micróbios em uma solução salina ou solução tamponada.

[0013] Na presente modalidade, o reagente lítico pode incluir, mas não está limitado a, saponinas, tritons, tweens, cloreto de amônio, ésteres de sorbitano, tensoativos de polioxietileno não iônico. O reagente lítico pode compreender um ou mais compostos solúveis em água em adição ao um ou mais agentes líticos. Os compostos solúveis em água podem incluir, mas não estão limitados a, polianetol sulfato (SPS), polipropileno glicol (PPG), carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, ácido N-cicloexil-3-aminopropanossulfônico (CAPS), ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), cloreto de sódio. O reagente lítico pode compreender saponina, SPS e PPG. O reagente lítico pode compreender cloreto de amônio e bicarbonato de potássio é adicionado durante a lise. O reagente lítico pode compreender cloreto de amônio e bicarbonato de potássio e EDTA ou sal de sódio de EDTA. O reagente lítico pode compreender Brij 97 e CAPS.

[0014] Na presente modalidade, o pélete pode não ser lavado. O pélete pode ser lavado uma vez. A lavagem pode ser realizada com solução salina, um tampão neutro ou meio de crescimento. O pélete pode ser lavado duas vezes. A lavagem pode ser realizada com solução salina, um tampão neutro ou meio de crescimento. O pélete pode ser ressuspenso em solução salina, um tampão neutro ou meio de crescimento. As células no pélete ressuspenso podem ser avaliadas opticamente em um ou mais comprimentos de onda entre 500 nm e 700 nm. As células podem ser avaliadas através de um espectrômetro, um espectrofotômetro ou um nefelômetro. As células podem ser quantificadas seguindo tratamento das células suspensas com um ou mais compostos precursores. Os compostos precursores podem incluir, mas não estão limitados a, PicoGreen, laranja acridina, RedSafe, 4’,6’- diamidino-2-fenilindol, brometo de etídio, SYBR green I, SYBR green II, luciferina e resazurina. O composto precursor pode ser adicionado a uma alíquota da suspensão de pélete ressuspensa e essa alíquota é então medida. A primeira centrifugação pode ser 500 RCF. A segunda centrifugação pode ser 2370 RCF. A terceira centrifugação pode ser 2370 RCF. A quarta centrifugação pode ser 2370 RCF. Uma ou mais centrifugações podem ser realizadas em um ângulo fixo <90º. Uma ou mais centrifugações podem ser realizadas em um ângulo fixo de 30º, 45º, 60º em relação ao eixo de rotação.

[0015] Na presente modalidade, o método pode ser realizado em culturas de sangue positivas de sistemas de monitoramento contínuo. O método pode ser realizado em culturas que se tornaram positivas após ≤48 horas após introdução no sistema de cultura de sangue de monitoramento contínuo. O método pode ser realizado em amostras de urina. O volume da amostra derivada do paciente é menos do que 20 mL, 15 mL, 10 mL.

[0016] Em um outro aspecto, a invenção descreve um método automatizado para preparação de uma amostra suspeita compreender micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana compreendendo as etapas de: (a) aplicar uma primeira força centrífuga relativa a uma amostra, dessa maneira produzindo um sobrenadante relativamente clarificado; (b) lisar pelo menos uma célula ou plaqueta do paciente no sobrenadante relativamente clarificado, dessa maneira produzindo um sobrenadante depletado de células do paciente; (c) aplicar uma segunda força centrífuga relativa à amostra da etapa b, dessa maneira formando um pélete; (d) remover o sobrenadante; (e) opcionalmente lavar o pélete uma ou mais vezes repetindo as etapas c e d; (f) ressuspender o pélete em uma solução salina ou tamponada adequada; e (g) avaliar uma densidade de micróbios na solução salina ou tamponada.

[0017] Nesse aspecto, a etapa de lise de pelo menos uma célula do paciente pode compreender contato do sobrenadante clarificado com um reagente lítico selecionado do grupo consistindo em saponinas, tritons, tweens, cloreto de amônio, ésteres de sorbitano, tensoativos de polioxietileno não iônico. O reagente lítico pode compreender um ou mais compostos solúveis em água em adição ao um ou mais agentes líticos. Os compostos solúveis em água podem incluir, mas não estão limitados a, polianetol sulfato (SPS), polipropileno glicol (PPG), carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, ácido N-cicloexil-3- aminopropanossulfônico (CAPS), ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), cloreto de sódio. O reagente lítico pode compreender saponina, SPS e PPG. O reagente lítico pode compreender cloreto de amônio e bicarbonato de potássio é adicionado durante a lise. O reagente lítico pode compreender cloreto de amônio e bicarbonato de potássio e EDTA ou sal de sódio de EDTA. O reagente lítico pode compreender Brij 97 e CAPS.

[0018] Nesse aspecto, o pélete pode não ser lavado. O pélete pode ser lavado uma vez. A lavagem pode ser realizada com solução salina, um tampão neutro ou meio de crescimento. O pélete pode ser lavado duas vezes. A lavagem pode ser realizada com solução salina, um tampão neutro ou meio de crescimento. O pélete pode ser ressuspenso em solução salina, um tampão neutro ou meio de crescimento. As células no pélete ressuspenso podem ser avaliadas opticamente em um ou mais comprimentos de onda entre 500 nm e 700 nm. As células podem ser avaliadas através de um espectrômetro, um espectrofotômetro ou um nefelômetro. As células podem ser quantificadas seguindo tratamento das células suspensas com um ou mais compostos precursores. Os compostos precursores podem incluir, mas não estão limitados a, PicoGreen, laranja acridina, RedSafe, 4’,6’- diamidino-2-fenilindol, brometo de etídio, SYBR green I, SYBR green II, luciferina e resazurina. O composto precursor pode ser adicionado a uma alíquota da suspensão de pélete ressuspenso e essa alíquota é então medida. A primeira RCF aplicada pode ser menor do que a segunda RCF aplicada. A primeira RCF pode ser 500 RCF. A segunda RCF pode ser 2370 RCF. A terceira RCF pode ser 2370 RCF. A quarta RCF pode ser 2370 RCF. Uma ou mais RCFs podem ser realizadas em um ângulo fixo <90º.

[0019] Nesta modalidade, o método pode ser realizado em culturas de sangue positivas de sistemas de monitoramento contínuo. O método pode ser realizado em culturas que se tornaram positivas ≤48 horas após introdução no sistema de cultura de sangue de monitoramento contínuo. O volume da amostra derivada do paciente pode ser menos do que 10 mL.

[0020] Em uma outra modalidade, a presente invenção descreve um método para preparação de uma amostra suspeita compreender micro- organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de suscetibilidade antimicrobiana compreendendo as etapas de: (a) centrifugar a <1000 ×g; (b) coletar o sobrenadante da etapa a, seguido pela centrifugação a >1000 ×g; (c) limpar o pélete resultante da etapa b; (d) ressuspender o pélete; e (e) inocular células microbianas do pélete ressuspenso em cada um da pluralidade de poços de um cassete de AST. O método pode compreender ainda incubar as células ressuspensas sob condições promotoras do crescimento de micro- organismos. O pélete pode ser limpo através de centrifugação invertida. Através de ressuspensão seguido por uma etapa de centrifugação adicional, após o que o sobrenadante é removido. O pélete pode ser ressuspenso em um meio de crescimento. A amostra pode ser separada em alíquotas em dois ou mais reservatórios independentes após ressuspensão do pélete. A medição de concentração de célula pode ser realizada opticamente através de absorbância ou nefelometria. A amostra pode ser urina, sangue, fluido sinovial, fluido cerebrospinal, esputo, lavagem broncoalveolar, esfregaço nasal ou esfregaço de ferida. A amostra pode ser sangue que foi culturado em meio de crescimento líquido. As condições de promoção de crescimento de micro-organismos podem compreender uma temperatura de 33-37º C. As condições de promoção de crescimento de micro-organismo compreendem agitação.

[0021] Também na presente invenção está uma modalidade de um método para preparação de uma amostra suspeita compreender micro- organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana compreendendo as etapas de: (a) pôr uma amostra dentro de um tubo de centrífuga provido com uma membrana de separação; (b) centrifugar a <1000 ×g; (c) lavar a membrana para ressuspender as bactérias depositadas; e (d) medir a concentração de célula ressuspensa. O método compreende ainda incubar as células ressuspensas sob condições de promoção de crescimento de micro-organismo. A amostra pode ser separada em alíquotas em dois ou mais reservatórios independentes após suspensão bacteriana. A medição de concentração de célula pode ser realizada opticamente através de absorbância ou nefelometria. A amostra pode ser urina, sangue, fluido sinovial, fluido cerebrospinal, esputo, lavagem broncoalveolar, esfregaço nasal ou esfregaço de ferida. A amostra pode ser sangue que foi culturado em meio de crescimento líquido. As condições de promoção de crescimento de micro-organismo podem compreender uma temperatura de 33-37º C. As condições de promoção de crescimento de micro-organismos podem compreender agitação.

[0022] A presente invenção discute ainda um método para preparação de uma amostra suspeita compreender micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de suscetibilidade antimicrobiana compreendendo as etapas de: (a) aplicar uma primeira força centrífuga relativa a uma amostra, dessa maneira formando um primeiro pélete e um primeiro sobrenadante; (b) aplicar uma segunda força centrifuga relativa ao primeiro sobrenadante, dessa maneira um segundo pélete e um segundo sobrenadante; (c) limpar o segundo pélete resultante da etapa b; (d) ressuspender o segundo pélete em uma solução salina tamponada; e (e) medir uma concentração de micro- organismos ressuspensos na solução tamponada. Esse método compreende ainda incubar os micro-organismos ressuspensos sob condições de promoção de crescimento de micro-organismo. A primeira força centrífuga relativa pode ser menor do que a segunda força centrífuga relativa. O pélete pode ser limpo através de centrifugação invertida. O pélete pode ser limpo através de ressuspensão seguido por uma etapa de centrifugação adicional, após o que o sobrenadante pode ser removido. O pélete pode ser ressuspenso em um meio de crescimento. A amostra pode ser separada em alíquotas em dois ou mais reservatórios independentes após suspensão do pélete. A medição de concentração de célula pode ser realizada opticamente através de absorbância ou nefelometria. A amostra pode ser urina, sangue, fluido sinovial, fluido cerebrospinal, esputo, lavagem broncoalveolar, esfregaço nasal ou esfregaço de ferida. A amostra pode ser sangue que foi culturado em meio de crescimento líquido. As condições de promoção de crescimento de micro-organismo podem compreender uma temperatura de 33-37º C. As condições de promoção de crescimento de micro-organismos podem compreender agitação.

[0023] Em ainda uma outra modalidade, a presente invenção discute um sistema de separação microbiano in vitro para preparação de uma amostra compreendendo micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana compreendendo: um módulo de manuseamento de fluido configurado para permitir adição de solução a e remoção da amostra; uma centrífuga tendo um eixo longitudinal se estendendo através de um rotor fixo da centrífuga, um eixo normal que é normal ao eixo longitudinal e um ângulo do rotor fixo; um aparelho de vórtex configurado para agitar a amostra; e um aparelho de quantificação de célula configurado para medir uma métrica da amostra. O ângulo pode ser cerca de 30º, 45º, 60º do eixo normal.

[0024] A presente invenção também discute um método para preparação de uma amostra compreendendo micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de suscetibilidade antimicrobiana compreendendo: transferir a amostra por meio de um módulo de manuseamento de fluido para um tubo de amostra; dispor o tubo de amostra em uma centrífuga tendo um rotor fixo em um ângulo com relação a um eixo normal que é normal para um eixo longitudinal da centrífuga; ativar a centrífuga por um período de tempo; remover a porção de um fluido da amostra do tubo de amostra; adicionar uma porção de reagente lítico ao tubo de amostra; submeter o tubo de amostra a um aparelho de vórtex configurado para agitar a amostra; adicionar uma porção de solução salina ou solução tamponada ao tubo de amostra; transferir substancialmente todo o fluido no tubo de amostra para uma cuveta; medir uma métrica da amostra usando um aparelho de quantificação de célula óptico em um ou mais comprimentos de onda entre 500 nm e 700 nm; diluir a suspensão para um nível predefinido; verificar uma métrica da amostra usando o aparelho de quantificação celular; e transferir o fluido para um tubo de saída. Breve Descrição dos Desenhos

[0025] A FIG. 1 mostra um protocolo para a preparação de sangue.

[0026] A FIG. 2 mostra um protocolo para a preparação de urina.

[0027] A FIG. 3 mostra um protocolo para uma preparação alternativa de urina.

[0028] A FIG. 4 mostra um protocolo para uma preparação alternativa de sangue.

[0029] A FIG. 5 mostra um protocolo para o processo automatizado.

[0030] A FIG. 6 mostra os subcomponentes de um aparelho para preparação de uma amostra compreendendo micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para AST incluindo um módulo de manuseamento de fluido configurado para conter a amostra.

[0031] FIG. 7 painéis a-f mostram dados representativos para amostra de E. coli 1 sem reagente lítico.

[0032] FIG. 8 painéis a-f mostram dados representativos para amostra de E. coli 2 sem reagente lítico.

[0033] FIG. 9 painéis a-f mostram dados representativos para K, pneumonia sem reagente lítico.

[0034] FIG. 10 painéis a-d mostram os resultados de um experimento de centrifugação bacteriana, mostrando a relação entre RCF, tempo de centrifugação e concentração de célula.

[0035] A FIG. 11 mostra a formação de péletes microbianos observados em ângulos variáveis em relação ao plano do rotor, da esquerda para a direita, de 90º, 75º, 60º, 45º, 30º e 15º.

[0036] FIG. 12 painéis a-f mostram dados representativos para amostra de E. coli 1 com reagente lítico.

[0037] FIG. 13 painéis a-f mostram dados representativos para S. aureus com reagente lítico.

[0038] FIG. 14 painéis a-f mostram dados representativos para S. aureus sem reagente lítico.

[0039] FIG. 15 painéis a-f mostram dados representativos para E. faecium sem reagente lítico.

[0040] FIG. 16 a-d mostra vários métodos de separação.

[0041] A FIG. 17 mostra os dados representativos para os métodos da FIG. 16. Descrição Detalhada Preparação de Amostras Microbiológicas do Paciente

[0042] A presente invenção provê novos sistemas e métodos para separação de micro-organismos de amostras de paciente primárias e culturadas em líquido tais como culturas de sangue, amostras de urina, amostras de esputo, etc. Alguns métodos de separação de acordo com a presente invenção empregam uma etapa de centrifugação lenta inicial seguido por aplicação de um reagente lítico e são capazes de remover adequadamente uma pluralidade de coágulos hemolíticos, células eucarióticas e fragmentos de células eucarióticas, e outros constituintes que possam impactar as medições ópticas de concentrações de célula bem como resultados de AST. Os métodos produzem ainda uma amostra “limpa” compreendendo uma pluralidade de micro-organismos viáveis em números e concentração suficientes para realizar AST de a partir de ≤20 mL, preferivelmente ≤10 mL, de uma cultura de sangue positiva ou amostra de urina. Ao mesmo tempo, os métodos da presente invenção são simples o suficiente para serem facilmente automatizados. As modalidades da presente invenção podem também obviar a necessidade de filtragem de amostras (por exemplo, usando tubos separadores de soro descritos por Lupetti e outros, ou filtros sólidos, tais como filtro de membrana descritos em Machen e outros. PLos ONE 9(2): e87870), facilitando potencialmente a automação e diminuindo os custos consumíveis.

[0043] Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção são aplicados a culturas de sangue que foram determinadas como sendo positivas usando sistemas de cultura de sangue de monitoramento contínuo, tais como o BACTEC® (Becton-Dickinson), o BacT/Alert® (bioMérieux) e o VersaTrek™ (Thermo Fisher).

[0044] Pode ser vantajoso, particularmente quando preparando uma cultura de sangue ou amostra de urina para AST, separar células microbianas de células eucarióticas e fragmentos de células eucarióticas, e restos não celulares grandes derivados do paciente, bem como de imunopeptídeos solúveis e antibióticos que possam estar presentes (Lupetti e outros, Clin. Microbiol. Infect. 2010; 16: 986-991). As células e fragmentos de células podem comprometer a integridade do resultado do AST e podem também complicar ou inibir enumeração precisa de micro-organismos antes do início do AST. Enumeração de micro-organismo precisa através de densidade óptica e/ou nefelometria pode ser inibida por componentes opticamente ativos, tais como coágulos hemolíticos e plaquetas (Lupetti e outros).

[0045] A literatura ensina que reagentes líticos realizam a mesma coisa que uma centrifugação lenta ou filtro, a saber, remoção de células eucarióticas ou restos (por exemplo, plaquetas, coágulos hemolíticos, etc.) das amostras. Esses estudos sugerem que o uso de ambos reagentes líticos e centrifugação ou filtragem é redundante, e a visão predominante no campo hoje é que um reagente lítico sozinho, quando aplicado a uma cultura de sangue positiva, é suficiente para remover células eucarióticas ou restos.

[0046] Algumas modalidades da presente invenção se baseiam na constatação dos inventores que, seguindo uma centrifugação lenta com uma lise química em culturas de sangue positivas, uma amostra compreendendo micro-organismo final é produzida, a qual é suficientemente livre de células eucarióticas e restos para permitir enumeração microbiana precisa usando medições ópticas, enquanto provendo um material de entrada de alta qualidade de ensaios AST a jusante. Em particular, essa abordagem pode necessitar ≤10 mL de cultura de sangue positiva ou urina para produzir uma amostra compreendendo um número suficiente e quantidade e concentração adequadas de uma pluralidade de micro-organismos viáveis para permitir AST. Mais particularmente, certas modalidades da presente invenção se referem a métodos automatizáveis para produção de amostras de micro-organismo concentradas com uma leitura McFarland de aproximadamente 0,2-0,65 de culturas de sangue positivas sem a necessidade de uma cultura à base de placa interveniente. Aqueles versados na técnica compreenderão que, embora o método de referência de microdiluição de caldo CLSI utilize uma leitura McFarland de 0,5, esse é diluído 200 vezes para teste de AST, dessa maneira concentrações de inóculo menores podem ser utilizadas para AST contanto que volumes adequados estejam presentes.

[0047] De forma geral, algumas modalidades da presente invenção se referem a sistemas e métodos para a preparação de inoculados microbianos clínicos diretamente de amostras de paciente sem a necessidade de purificação adicional através de cultura à base de placa interveniente.

[0048] Um método exemplar da presente invenção compreende quatro etapas primárias. Uma primeira etapa de separação (tal como uma centrifugação lenta) é utilizada para separar (por exemplo, peletizar) coágulos hemolíticos e outros corpos que interferem opticamente do material de amostra restante (por exemplo, o sobrenadante). O material fluido clarificado resultante da primeira separação é tratado com um reagente lítico, que lisa células eucarióticas restantes e/ou fragmentos de célula eucariótica, plaquetas, etc., enquanto deixando intactos os micro-organismos que serão investigados em um ensaio a jusante (por exemplo, um ensaio de AST). O termo “reagente lítico” como aqui usado compreende o uso de detergentes, tais como saponinas, que podem criar poros irreversíveis em células, mas deixam a forma da célula intacta, chamados na literatura de “fantasmas de saponina”. Então, uma segunda etapa de separação (tal como centrifugação rápida) é utilizada para separar (por exemplo, peletizar) o micro-organismo do sobrenadante tratado, seguido por remoção do sobrenadante através de decantação, aspiração, etc. Opcionalmente, uma ou mais etapas de lavagem podem ser realizadas para limpar o pélete e remover as espécies solúveis indesejadas. Finalmente, os micro-organismos de interesse são ressuspensos em solução salina, tampão ou meios de crescimento e a concentração celular é determinada, por exemplo, através de medição óptica.

[0049] A primeira separação é projetada para remover espécies contaminantes que vão interferir com medições ópticas de densidade de célula microbiana. Na prática, isso pode incluir separação (por exemplo, peletização, coleta, etc.) de células eucarióticas e fragmentos de célula e materiais insolúveis (por exemplo, coágulos, agregados de células eucarióticas e restos) de micróbios que serão investigados em um processo a jusante tal como AST. Em várias modalidades, essas separações são obtidas através de, por exemplo, centrifugação.

[0050] Quando centrifugação é usada para a primeira separação (referida como uma “primeira centrifugação”), a velocidade da primeira centrifugação (isto é, a força centrífuga relativa ou RCF) é preferivelmente ajustada para ser suficientemente alta para coletar células eucarióticas e restos enquanto suficientemente baixa para permitir uma pluralidade de micro-organismos e agrupamentos bacterianos, tais como aqueles formados por Staphylococcus aureus, permanecerem em suspensão. Em algumas modalidades, a velocidade é preferivelmente abaixo de 1000 RCF, por exemplo, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ou 100 RCF.

[0051] Um reagente lítico pode ser opcionalmente usado seguindo a primeira centrifugação para reduzir mais a presença de espécies contaminantes não microbianas, por exemplo, através de lise de células eucarióticas e fragmentos de células eucarióticas (por exemplo, plaquetas) enquanto deixando os micróbios que serão investigados por um processo a jusante substancialmente intacto. O termo reagente lítico pode compreender um ou mais agentes líticos incluindo, mas não limitado a, saponinas, cloreto de amônio, triton X, ésteres de sorbitano (por exemplo, Span), tweens e tensoativos polioxietileno 10 óleo éter não iônicos (por exemplo, Brij (comercializado pela Sigma-Aldrich)). O reagente lítico pode compreender ainda um ou mais compostos solúveis em água adicionais incluindo, mas não limitado a, polianetol sulfato de sódio (SPS), polipropileno glicol (PPG), bicarbonato de potássio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, ácido N-ciclo-hexil-3- aminopropanossulfônico (CAPS), ácido etilenodiaminotetra-acético e outros sais. O tempo de tratamento com o reagente lítico é preferivelmente <20 min, sobretudo preferivelmente <5 min. Em uma modalidade exemplar, o agente lítico compreende saponina, SPS e PPG.

[0052] A segunda separação é projetada para separar espécies microbianas de espécies contaminantes restantes bem como quaisquer subprodutos da etapa de lise opcional descrita acima. Em algumas modalidades da invenção, a segunda separação produz um material de entrada enriquecido em micróbios para ensaios a jusante, tal como AST, que é substancialmente livre de espécies contaminantes que possam interferir com as medições ópticas de densidade de micróbios ou que possam afetar o crescimento microbiano. Quando centrifugação é usada para a segunda separação, a velocidade da segunda centrifugação é ajustada suficientemente alta para peletizar micro- organismos e suficientemente baixa para manter viabilidade de micro- organismo máxima. Em algumas modalidades, a velocidade produz uma RCF maior do que 1000 x g, por exemplo, 1100, 1200, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2370 ou 2500 x g.

[0053] Os péletes são então opcionalmente lavados uma ou mais vezes. A lavagem diminui as concentrações de espécies solúveis da cultura de sangue bem como do reagente lítico, uma vez que remoção do sobrenadante sob condições práticas não pode ser completa. O pélete pode ser ressuspenso em solução de lavagem antes da separação. A solução de lavagem pode ser solução salina, tampão ou meio de crescimento. Em uma modalidade exemplar, duas lavagens são realizadas, cada uma com 1 mL de solução salina e sem ressuspensão do pélete. Em uma segunda modalidade exemplar, uma lavagem é realizada com 1 mL de solução salina e com ressuspensão do pélete no tampão de lavagem.

[0054] Quando centrifugação é usada, as velocidades da terceira opcional e de centrifugações adicionais são opcionalmente as mesmas que aquelas da segunda centrifugação.

[0055] Após o pélete final ser ressuspenso em solução salina, tampão ou meio de crescimento, quantificação celular é realizada. Isso pode ser benéfico para assegurar que AST subsequente seja realizado com uma concentração de célula apropriada. As células são preferivelmente quantificadas opticamente através de medições de densidade óptica ou nefelometria. Obter células suficientes para medições pode requerer volumes de amostra iniciais de 2-20 mL, preferivelmente 4-10 mL, das culturas de sangue mais positivas de garrafas BACTEC ou BacT/Alert. A concentração de célula final desejada pode ser determinada ser aproximadamente 0,5 McFarland, como conhecido daqueles versados na técnica.

[0056] Em uma modalidade exemplar, o pélete resultante de uma terceira ou quarta separação é ressuspenso em 1 mL de solução salina. Uma medição de densidade óptica (OD) é então realizada usando um espectrofotômetro em um ou mais comprimentos de onda entre 500-700 nm. Se uma medição correspondendo a uma McFarland > 0,65 for obtida, solução salina adicional pode ser adicionada para diluir a amostra. O volume de solução salina adicional pode ser determinado através da medição de OD de modo que volumes maiores são adicionados para valores de OD maiores. Uma medição de OD subsequente pode então ser obtida. Essa medição seguida por processo de diluição pode ser realizada uma ou mais vezes.

[0057] Em uma modalidade exemplar, uma medição de OD que corresponde a uma McFarland <0,5 pode ser diluída para obter uma concentração McFarland de 0,2 ou menos. Essa informação pode ser então enviada eletronicamente para a plataforma do AST para assegurar que diluições apropriadas sejam obtidas durante inoculação do painel. Alternativamente, uma medição de OD que corresponde a uma McFarland <0,5 pode ser sinalizada para o usuário que micro- organismos insuficientes estão presentes.

[0058] A FIG. 5 mostra a utilidade de um método exemplar para produzir suspensões McFarland de culturas de sangue.

[0059] Alternativamente, uma alíquota do pélete ressuspenso pode ser feita seguido por tratamento com um reagente precursor que permite quantificação celular. Tais reagentes incluem, mas não estão limitados a, PicoGreen, laranja acridina, RedSafe, 4’,6’-diamidino-2-fenilindol, brometo de etídio, SYBR green I, SYBR green II, luciferina e Resazurina. Na presente modalidade, a adição do reagente lítico pode não ser necessária.

[0060] A importância dos métodos é destacada pelo fato que amostras obtidas com as mesmas etapas, mas em uma ordem diferente, não são suficientemente livres de células eucarióticas e restos: tratamento da amostra com o reagente lítico, seguido por movimento giratório lento, seguido por transferência do sobrenadante para um tubo fresco, seguido por um movimento giratório rápido para peletizar os micro-organismos, seguido por lavagens opcionais e quantificação de célula. Resultado visto na FIG. 16C.

[0061] A importância dos métodos é destacada mais pelo fato que amostras obtidas com etapas similares, mas com uma ordem diferente, não são suficientemente livres de células eucarióticas e restos: tratamento da amostra com o reagente lítico, seguido por um movimento giratório rápido para peletizar micro-organismos, seguido por remoção do sobrenadante e ressuspensão do pélete em solução de lavagem, seguido por um movimento giratório lento, seguido por transferência do sobrenadante para um tubo fresco, seguido por um movimento giratório rápido para peletizar os micro-organismo, seguido por lavagens opcionais e quantificação de célula. Resultado visto na FIG. 16B.

[0062] A importância dos métodos é destacada mais pelo fato que amostras obtidas com etapas similares, mas em uma ordem diferente, não são suficientemente livres de células eucarióticas e restos: amostra posta sob movimento giratório em velocidade máxima para sedimentar tudo o que estiver presente, tratamento com reagentes líticos diferentes,

seguido por um movimento giratório rápido para peletizar micro- organismos, seguido por remoção do sobrenadante e peletização da suspensão em solução de lavagem, seguido por um movimento giratório rápido para peletizar os micro-organismos, seguido por lavagens opcionais e quantificação de célula. Resultado visto na FIG. 16A.

[0063] Em modalidades alternativas, a amostra é primeiro centrifugada em uma velocidade suficiente para sedimentar células eucarióticas, mas insuficiente para sedimentar micróbios, <1000 RCF. O sobrenadante é coletado e centrifugado em uma velocidade suficiente para sedimentar micróbios, >1000 RCF. O sobrenadante é decantado, o tubo é invertido e centrifugado em velocidade baixa, <1000 RCF, para secar o pélete. O pélete é então ressuspenso em um meio de crescimento de micro-organismo, tal como Caldo Mueller-Hinton (MHB), formando a “amostra processada”. Medições de densidade óptica, fluorescência e/ou nefelometria são então realizadas para determinar a concentração de células. Se insuficiente para uma leitura, incubações adicionais podem ser realizadas. Após concentração de células suficiente ser obtida, tal como uma concentração McFarland de 0,5, como conhecido daqueles versados na técnica, a amostra pode ser separada em alíquotas em cavidades de um cartucho para realização de AST.

[0064] Em uma modalidade alternativa, a amostra é primeiro centrifugada em velocidade e tempo suficientes para sedimentar todas as células com células menores passando por espaços em células maiores para a parte inferior do pélete, >1000 RCF por >5 min. O sobrenadante é decantado e o pélete de célula grande é aspirado. O pélete restante é ressuspenso e centrifugado em uma velocidade suficiente para sedimentar células eucarióticas, mas insuficiente para sedimentar micróbios, <1000 RCF. O sobrenadante é coletado e centrifugado em uma velocidade suficiente para sedimentar micróbios,

>1000 RCF. O pélete é então ressuspenso em um meio de crescimento de micro-organismo, tal como Caldo Mueller-Hinton (MHB), formando a amostra processada. Medições de densidade óptica, fluorescência e/ou nefelometria são então realizadas para determinar a concentração de células. Se insuficiente para uma leitura, incubações adicionais podem ser realizadas. Após concentração de células suficiente ser obtida, tal como uma concentração McFarland de 0,5, como conhecido daqueles versados na técnica, a amostra pode ser separada em alíquotas em cavidades de um cartucho para realização de AST.

[0065] Em uma modalidade alternativa, a amostra é primeiro posta em um tubo provido com uma membrana de separação e centrifugada em uma velocidade suficiente para puxar a amostra através da membrana, depositando as bactérias sobre a superfície da membrana. A membrana é então lavada com um meio de crescimento de micro- organismo, tal como MHB, para ressuspender as bactérias depositadas. Medições de densidade óptica, fluorescência e/ou nefelometria são então realizadas para determinar a concentração de células. Se insuficiente para uma leitura, incubações adicionais podem ser realizadas. Após concentração de células suficiente ser obtida, tal como uma concentração McFarland de 0,5, como conhecido daqueles versados na técnica, a amostra pode ser separada em alíquotas em cavidades de um cartucho para realização de AST.

[0066] Em várias modalidades descritas aqui ou de outro modo, métodos para preparação de uma amostra compreendendo micro- organismos patogênicos derivados de um paciente para AST podem ser realizados através do uso de um aparelho ou sistema descrito aqui. Com referência à FIG. 5, um sistema automatizado ou semiautomatizado pode ser usado para realizar as etapas dos métodos. Esse sistema pode compreender um módulo de manuseamento de fluido 102 que é configurado para transportar uma amostra para um tubo de amostra 100 configurado para conter a amostra.

O componente de manuseamento de fluido pode ser um manipulador de líquidos automatizado ou similar.

O componente de manuseamento de fluido pode ser configurado de modo que fluidos, recipientes, tubos e/ou amostras são movimentos através do sistema automaticamente com pouco ou nenhum manuseamento do operador necessário.

A automação pode aumentar o resultado enquanto reduzindo o tempo de trabalho e erros.

O tubo de amostra 100 contendo a amostra é transferido para uma centrifuga 104. A centrífuga 104 tem um rotor fixo configurado para manter os tubos de amostra em um ângulo que não 90º em relação a um plano do rotor, plano que compreende um eixo longitudinal devido à simetria de rotores centrífugos.

O ângulo pode ser qualquer ângulo, por exemplo, cerca de 30º, cerca de 45º, cerca de 60º, etc., com relação ao plano do rotor.

Como descrito abaixo, os ângulos utilizados na presente descrição resultam na formação de um pélete bem definido que é posicionado distante da parte inferior do tubo, permitindo aspiração automática de fluido seguindo centrifugação sem risco indevido de perda do material microbiano de interesse.

A centrífuga 104 é ativada por um período de tempo desejado.

Após separação centrífuga, uma porção de um fluido da amostra é removida do tubo de amostra 100. Uma porção de reagente lítico é então adicionada ao tubo de amostra 100. O tubo de amostra 100 é então submetido a um vórtex 106 para agitar e misturar os teores do tubo de amostra 100. Após agitação e mistura, o tubo de amostra 100 é adicionado à centrífuga 104 e é submetido à separação centrífuga.

Após separação, pelo menos uma porção do fluido contido no tubo de amostra 100 é removida.

Então, uma porção de solução salina é adicionada ao tubo de amostra 100. O tubo de amostra 100 é então posto em uma centrífuga 104 e é submetido à separação centrífuga.

Após separação, pelo menos uma porção do fluido contido no tubo de amostra 100 é removida.

Uma porção de solução salina é então adicionada ao tubo de amostra 100. O tubo de amostra é então submetido ao vórtex 106 para agitar e misturar os teores do tubo de amostra 100. Após agitação e mistura, substancialmente todo o fluido no tubo de amostra 100 é transferido para uma cuveta 108. Um aparelho de quantificação de célula 112, por exemplo, um espectrômetro, é então usado para ler uma métrica de absorbância do fluido dentro da cuveta

108. O fluido dentro da cuveta é então diluído para um nível de diluição desejado. O fluido dentro da cuveta 108 é então medido pelo aparelho de quantificação de célula 112 para verificar um nível de concentração do fluido dentro da cuveta 108. O fluido é então transferido da cuveta 108 para um tubo de saída 110.

[0067] Em várias modalidades descritas aqui ou de outro modo, métodos para preparação de uma amostra compreendendo micro- organismos patogênicos derivados de um paciente para AST podem ser realizados usando um aparelho ou sistema descrito aqui. A FIG. 6 ilustra um aparelho 600 para preparação de uma amostra compreendendo micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para AST incluindo um módulo de manuseamento de fluido 602 configurado para transportar uma amostra, por exemplo, para um tubo de amostra. O módulo de manuseamento de fluido 602 pode ser posto em uma centrífuga 606. A centrífuga 606 tem um rotor fixo com um eixo longitudinal I se estendendo através dele e um eixo normal n que é normal para o eixo longitudinal. A centrífuga 606 recebe amostras em um ângulo α com relação ao eixo normal n e/ou em um outro ângulo β com relação ao eixo longitudinal l. Os ângulos α, β podem ser qualquer ângulo, por exemplo, cerca de 30º, cerca de 60º ou similar. Um aparelho de vórtex 610 pode ser atuado para causar um movimento orbital para agitar uma amostra. Um aparelho de quantificação de célula 612, por exemplo, um espectrômetro, pode ser usado para ler uma métrica de absorbância da amostra.

[0068] Muito dessa descrição discutiu um método que inclui uma etapa de reagente de lise. No entanto, os inventores constataram que se essa etapa de reagente de lise for omitida, a amostra resultante pode ser adequada para casos, tal como teste de AST direto, em que não há nenhuma necessidade de quantificação óptica de concentração microbiana. Em uma modalidade exemplar de tal método, centrifugação pode ser usada para separar certas espécies contaminantes (por exemplo, uma etapa de centrifugação lenta pode ser usada para reduzir material coagulado ou outros restos extracelulares grandes, e/ou uma etapa de centrifugação rápida pode ser usada para peletizar micróbios para ressuspensão). Nesse caso, pode ser importante determinar crescimento bacteriano para AST com um ou mais indicadores de viabilidade, tal como Resazurina. Métodos exemplares são revelados na Publicação PCT WO 2018/119439, parágrafos [0008]-[0134], que é aqui incorporada a título de referência.

[0069] As modalidades exemplares descritas acima têm geralmente utilizado centrifugação para separações. No entanto, aqueles de habilidade na técnica compreenderão que outras abordagens de separação podem ser compatíveis com certas modalidades da presente invenção. Por exemplo, alguns métodos da invenção podem utilizar filtragem para separar espécies microbianas a serem investigadas por AST de espécies contaminantes na amostra. Em algumas modalidades, uma primeira etapa de filtragem pode ter um corte de peso molecular alto. Em alguns casos, uma segunda etapa de filtragem pode ter um corte de peso molecular menor do que a primeira.

[0070] A invenção acima focou em modalidades de sistemas e métodos para preparação de amostras microbianas para, por exemplo, AST de amostras de pacientes. Aqueles de habilidade na técnica compreenderão que os métodos descritos acima, enquanto superficialmente similares àqueles atualmente em uso, diferem pelo fato que eles superam, pela primeira vez, um desafio técnico que contribui com atrasos significantes para protocolos de preparação de amostra de AST atuais. A saber, os métodos da presente invenção proveem material de entrada quantificável, de alta qualidade, para AST rápido sem a necessidade de uma etapa de cultura de placa interveniente. Importante, enquanto também permitindo a separação de micro- organismos e agrupamentos bacterianos das células eucarióticas e restos similarmente dimensionados. Na primeira separação, a velocidade é alta o suficiente para coletar células eucarióticas e restos enquanto baixa o suficiente para permitir que micro-organismos e agrupamentos bacterianos, tais como aqueles formados por Staphylococcus aureus, permaneçam em suspensão. Bactérias tais como Staphylococcus aureus tendem a agregar e tal pode ser similar em tamanho a células eucarióticas e fragmentos indesejados (por exemplo, plaquetas). Portanto, um reagente lítico pode ser introduzido, o qual rompe as membranas lipídicas das células eucarióticas remanescentes após a centrifugação lenta inicial, permitindo sua remoção com a segunda etapa de separação, mais rápida, produzindo um material de entrada enriquecido em micróbios para ensaios a jusante, tal como AST, que é substancialmente livre de espécies contaminantes que podem interferir com medições ópticas de densidade de micróbios ou que podem afetar crescimento microbiano.

[0071] Como discutido acima, os métodos são distintos ambos nas próprias etapas bem como na ordem na qual eles são realizados. Isso destaca a natureza inventiva desses métodos, uma vez que é apenas através dessa combinação de etapas que a necessidade de uma etapa de cultura de placa interveniente pode ser removida, eliminando a necessidade de gastar tempo e recursos culturando os micro- organismos presentes na amostra, um impedimento atual para sistemas similares.

Micro-organismos

[0072] Uma infecção pode incluir qualquer agente infecciosos de uma origem microbiana, por exemplo, uma bactéria, uma célula fúngica, uma arquea e um protozoário. Em alguns exemplos, o agente infeccioso é uma bactéria, por exemplo, uma bactéria gram-positiva, uma bactéria gram-negativa e uma bactéria atípica. Um micro-organismo resistente a antimicrobianos pode ser um micro-organismo que é resistência a um antimicrobiano, isto é, fármacos antibacterianos, fármacos antifúngicos, medicações antiarqueas e fármacos antiprotozoários.

[0073] Os micro-organismos (por exemplo, uma suspensão líquida de micro-organismos) podem incluir uma cepa de micro-organismo. Os micro-organismos podem incluir uma espécie de micro-organismo. Os micro-organismos podem incluir mais de uma cepa de micro-organismo. Os micro-organismos podem incluir uma ordem de micro-organismos. Os micro-organismos podem incluir uma classe de micro-organismos. Os micro-organismos podem incluir uma família de micro-organismos. Os micro-organismos podem incluir um reino de micro-organismos.

[0074] Os micro-organismos (por exemplo, uma suspensão líquida de micro-organismos) podem incluir mais de uma cepa de micro- organismo. Os micro-organismos podem incluir mais de uma espécie de micro-organismo. Os micro-organismos podem incluir mais de um gênero de micro-organismo. Os micro-organismos podem incluir mais de uma ordem de micro-organismo. Os micro-organismos podem incluir mais de uma classe de micro-organismo. Os micro-organismos podem incluir mais de uma família de micro-organismo. Os micro-organismos podem incluir mais de um reino de micro-organismo.

[0075] O micro-organismo pode ser uma bactéria. Exemplos de bactérias incluem, mas não estão limitados a, Acetobacter aurantius, Acinetobacter bitumen, Acinetobacter spp., Actinomyces israelii, Actinomyces spp., Aerococcus spp., Agrobacterium radiobacter,

Agrobacterium tumefaciens, Anaplasma, Anaplasma phagocytophilum, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus spp., Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus Thuringiensis, Bacteroides, Bacteroides fragilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus (também conhecida como Prevotella melaninogenica), Bartonella, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bartonella spp., Bordetella, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Bordetella spp., Borrelia burgdorferi, Brucella, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella spp., Brucella suis, Burkholderia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Campylobacter spp., Chlamydia, Chlamydia spp., Chlamydia trachomatis, Chlamydophila, Chlamydophila pneumoniae (anteriormente chamada Chlamydia pneumoniae), Chlamydophila psittaci (anteriormente chamada Chlamydia psittaci), Chlamydophila spp., Clostridium, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens (anteriormente chamada Clostridium welchii), Clostridium spp., Clostridium tetani, Corynebacterium, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Corynebacterium spp., Coxiella burnetii, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia spp., Enterobacter cloacae, Enterobacter spp., Enterococcus, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus galllinarum, Enterococcus maloratus, Enterococcus spp., Escherichia coli, Francisella spp., Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Gardenerella spp., Gardnerella vaginalis, Haemophilius spp., Haemophilus, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus pertussis, Haemophilus vaginalis, Helicobacter pylori, Helicobacter spp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella spp., Lactobacillus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus spp., Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Legionella spp., Leptospira spp., Listeria monocytogenes, Listeria spp., Methanobacterium extroquens, Microbacterium multiforme, Micrococcus luteus, Moraxella catarrhalis, Mycobacterium, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium spp., Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma spp., Neisseria, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Neisseria spp., Nocardia spp., Pasteurella, Pasteurella multocida, Pasteurella spp., Pasteurella tularensis, Peptostreptococcus, Porphyromonas gingivalis, Prevotella melaninogenica (previously called Bacteroides melaninogenicus), Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp., Rhizobium radiobacter, Rickettsia, Rickettsia prowazekii, Rickettsia psittaci, Rickettsia quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia spp., Rickettsia trachomae, Rochalimaea, Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia dentocariosa, Salmonella, Salmonella enteritidis, Salmonella spp., Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Shigella spp., Spirillum volutans, Staphylococcus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus spp., Stenotrophomonas maltophilia, Stenotrophomonas spp., Streptococcus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus cricetus, Streptococcus faceium, Streptococcus faecalis, Streptococcus ferus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior,

Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus spp., Treponema, Treponema denticola, Treponema pallidum, Treponema spp., Ureaplasma spp., Vibrio, Vibrio cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio spp., Vibrio vulnificus, viridans streptococci, Wolbachia, Yersinia, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis e Yersinia spp.

[0076] O micro-organismo pode ser um fungo. Exemplos de fungos incluem, mas não estão limitados a, Aspergillus spp., Blastomyces spp., Candida spp., Cladosporium, Coccidioides spp., Cryptococcus spp., Exserohilum, fusarium, Histoplasma spp., Issatchenkia spp., mucormycetes, Pneumocystis spp., dermatofitose (ringworm), scedosporium, Sporothrix e Stachybotrys spp. O micro-organismo pode ser um protozoário. Exemplos de protozoários incluem, mas não estão limitados a, Entamoeba histolytica, Plasmodium spp., Giardia lamblia e Trypanosoma brucei. Antimicrobianos

[0077] Quando o micro-organismo é uma bactéria, antimicrobianos exemplares incluem Amicacina, Aminoglicosídeo, Aminoglicosídeo amoxicilaina, Aminoglicosídeos, Amoxicilina, Amoxicilian/clavulanato, Ampicilina, Ampicillina/sulbactam, Antitoxina, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, β-lactama, Bacitracina, Capreomicina, Carbapenemas, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefalotina, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoreno, Cefepime, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitina, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftarolina, Ceftarolina fosamil, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporina, Cloranfenicol, Cloramfenicol(Bs),

Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Clofazimina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol, Cicloserina, Dalbavancina, Dapsona, Daptomicina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Etambutol(Bs), Etionamida, Flucloxacilina, Fluorquinolona, Fluorquinolonas, Fosfomicina, Furazolidona, Ácido fusídico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gemifloxacina, Gentamicina, Grepafloxacina, Herbimicina, Imipenem/Cilastatina, Isoniazida, Canamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbefe, Macrolídeos, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minociclina, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Nafcilina, Ácido nalidíxico, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoína(Bs), Norfloxacina, Ofloxacina, Oritavancina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilina G, Penicilina V, Piperacilina, Piperacilina/tazobactam, Platensimicina, Polimixina B, Posizolídeo, Pirazinamida, Quinupristina/Dalfopristina, Radezolídeo, Raxibacumabe, Rifabutina, Rifampicina, Rifampina, Rifapentina, Rifaximina, Roxitromicina, Sulfadiazina de prata, Esparfloxacina, Espectinomicina, Espectinomicina(Bs), Espiramicina, Estreptograminas, Estreptomicina, Sulbactam, Sulfacetamida, Sulfadiazina, Sulfadimetoxina, Sulfametizol, Sulfametoxazol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidocrisoidina, Tedizolida, Teicoplanina, Teixobactina, Telavancina, Telitromicina, Temafloxacina, Temocilina, Tetraciclina, Tiamfenicol, ticarcilina, Ticarcilina/clavulanato, Ticarcilina/ácido clavulânico, Tigeciclina, Tigeciclina(Bs), Tinidazol, TMP/SMX, Tobramicina, Torezolida, Trimetoprim(Bs), Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina, Trovafloxacina, Vancomicina e seus genéricos ou uma variante dos mesmos.

[0078] Antimicrobianos cujas interações com o micro-organismo afetam e são afetadas pelas cargas negativas na superfície do micro- organismo podem incluir: aminoglicosídeos policatiônicos, que quando da ligação à superfície celular deslocam íons de Mg2+, que forma ponte com componentes da membrana lipídica, dessa maneira rompendo a membrana externa e aumentando a absorção de fármaco; polimixinas catiônicas (colistina e polimixina B), cuja ligação à célula do micro- organismo é também dependente da carga negativa da membrana e para a qual ambas resistências mutacional e mediada por plasmídeo ocorrem através da redução da carga negativa da membrana; e daptomicina, um lipopeptídeo que lembra peptídeos antimicrobianos catiônicos de resposta imune inata do hospedeiro e requer Ca 2+ e fosfatidil glicerol para seu mecanismo de ação de rompimento de membrana e para o qual resistência pode também envolver alteração em carga da superfície celular.

[0079] Quando o micro-organismo é um fungo, antimicrobianos exemplares incluem 5-fluorcitosina, Abafungina, Albaconazol, Alilaminas, Anfotericina B, Ancobom, Anidulafungina, Azol, Bálsamo do Peru, Ácido benzoico, Bifonazol, Butoconazol, Candicidina, Caspofungina, Ciclopirox, Clotrimazol, Cresemba, Violeta cristal, Diflucam, Equinocandina, Econazol, Efinaconazol, Epoxiconazol, Fenticonazol, Filipin, Fluconazol, Flucitosina, Grifulvina V, Griseofulvina, Gris-Peg, Haloprogina, Hamicina, Imidazois, Isavuconazol, isavuconazônio, Isoconazol, Itraconazol, Cetoconazol, Lamisil, Luliconazol, Micafungina, Miconazol, Natamicina, Noxafil, Nistatina, Omoconazol, Onmel, Oravige, Oxiconazol, Posaconazol, Propiconazol, Ravuconazol, Rimocidina, Sertaconazol, Esporanox, Sulconazol, Terbinafina, Terconazol, Tiazois, Antifúngico tiocarbamato, Tioconazol, Tolnaftato, Triazois, Ácido undecilênico, Vfend, Voriconazol e genéricos dos mesmos e variantes dos mesmos.

[0080] Quando o micro-organismo é um protozoário,

antimicrobianos exemplares incluem Aminoquinolina, Acetarsol, Agentes contra amoebozoa, Ailantona, Amodiaquina, Anfotericina B, Amprolium, Agente antitricomonal agent, Aplasmomicina, Arstinol, Ácido Artelínico, Artemeter, Artemeter/lumefantrina, Artemisinina, Artemotil, Arterolana, Artesunato, Artesunato/amodiaquina, Atovaquona, Atovaquona/proguanil, Azanidazol, Azitromicina, Benznidazol, Broxiquinolina, Buparvaquona, Carbarsona, Carnidazol, Quiniofona, Cloroquina, Clorproguanil, Clorproguanil/dapsona, Clorproguanil/dapsona/artesunato, Clorquinaldol, Antiparasíticos cromalveolato, Cinchona, Cipargamina, Clazuril, Clefamida, Clioquinol, Coccidiostato, Codinaeopsina, Cotrifazida, Crptolepina, Cicloguanil, Desidroemetina, Difetarsona, Di-hidroartemisinina, Diloxanida, Diminazeno, Disulfiram, Doxiciclina, Eflornitina, ELQ-300, Emetina, Etofamida, Antiparasíticos Excavata, Fumagilina, Furazolidona, Glicobiarsol, GNF6702, Halofantrina, Hidroxicloroquina, Imidocarbe, Ipronidazola, casca do Jesuíta, KAF156, Lumefantrina, Maduramicina, Mefloquina, Megazol, Meglumina antimoniato, Melarsoprol, Mepacrina, Metronidazol, Miltefosina, Neurolenina B, Nicarbazina, Nifurtimox, Nimorazol, Nitarsona, Nitidina, Nitrofural, Olivacina, Ornidazola, Oroidina, Pamaquina, Paromomicina, Pentamidina, Antimônio pentavalente, Fanquinona, Fenamidina, Piperaquina, Primaquina, Proguanil, Project 523, Propenidazol, Pirimetamina, Pironaridina, Quinfamida, Quinina, Ronidazol, Schedula Romana, SCYX-7158, Secnidazol, Semapimode, Estibogluconato de sódio, Espiroindolona, Sulfadoxina, Sulfadoxina-Pirimetamina, Sulfaleno, Suramina, Tafenoquina, Teclozan, Tenonitrozol, Tilbroquinol, Tinidazol, Trimetrexato, Agente tripanocida, Tintura de Warburg e genéricos dos mesmos ou uma variante dos mesmos.

[0081] Um antimicrobiano pode ser um fármaco que opera através de um mecanismo similar a um fármaco aqui mencionado. Outros fármacos antimicrobianos conhecidos na técnica podem ser usados nos métodos descritos aqui. Suspensões Líquidas

[0082] O líquido pode incluir um meio de crescimento, tal como um caldo Mueller Hinton com cátion ajustado. Esse meio pode compreender um aditivo, conhecido daqueles versados na técnica promover crescimento e estabilidade de micro-organismos. Em adição a antimicrobianos diferentes, poços de teste diferentes podem compreender um aditivo conhecido melhorar a precisão de AST para antimicrobianos específicos. Por exemplo, cloreto de sódio adicional pode ser adicionado a testes compreendendo oxacilina e mais cálcio pode ser adicionado a testes compreendendo daptomicina. Amostras Biológicas

[0083] Os micro-organismos descritos aqui podem ser derivados de amostras biológicas. Em algumas modalidades, a amostra biológica é qualquer amostra que compreenda um micro-organismo, por exemplo, uma bactéria ou uma célula fúngica. A amostra biológica pode ser derivada de uma amostra clínica.

[0084] Amostras biológicas exemplares podem incluir, mas não estão limitadas a, sangue integral, plasma, soro, esputo, urina, fezes, células brancas do sangue, placa leucocitária, lágrimas, muco, saliva, sêmen, fluidos vaginais, fluido linfático, fluido amniótico, fluido espinhal ou cerebrospinal, efusões peritoneais, efusões pleurais, exsudatos, punctatos, esfregaços epiteliais, biópsias, amostras da medula óssea, fluidos de cistos ou abcessos, fluido sinovial, humor vítreo ou aquoso, lavagens ou aspiratos dos olhos, lavagem broncoalveolar, lavagem brônquica ou lavagem pulmonar, aspiratos pulmonares e órgãos e tecidos, incluindo, mas não limitado a, fígado, baço, rim, pulmão, intestino, cérebro, coração, músculo, pâncreas, e similar, esfregaços (incluindo, sem limitação, esfregaços de ferida, esfregaços bucais,

esfregaços da garganta, esfregaços nasais, esfregaços vaginais, esfregaços uretrais, esfregaços cervicais, esfregaços retais, esfregaços de lesão, esfregaços de abscesso, esfregaços nasofaringeais e similar) e qualquer combinação dos mesmos. São também incluídas culturas de bactérias ou isolatos de bactérias, culturas fúngicas ou isolatos fúngicos. O versado de habilidade comum na técnica pode também compreender que isolatos, extratos ou materiais obtidos de qualquer uma das amostras biológicas exemplares acima estão também dentro do escopo da presente invenção.

[0085] Micro-organismos obtidos de uma amostra biológica podem ser culturados ou de outro modo processados como é rotineiramente realizado na técnica. Controles Usados em Métodos de AST

[0086] Os controles podem incluir antimicrobianos para os quais o micro-organismo não é suscetível. Como exemplos, se o ensaio for usado para determinar a susceptibilidade de bactérias gram-positivas, então os controles (e as incubações de teste) podem incluir um ou mais antimicrobianos que se direcionam a bactérias gram-negativas, e se o ensaio for usado para determinar a susceptibilidade de micro- organismos eucarióticos, o controle (e as incubações de teste) podem incluir um ou mais antimicrobianos antibacterianos.

[0087] Em algumas modalidades, o controle é um controle positivo medido a partir dos micro-organismos sob condições de outro modo idênticas, mas sem antimicrobianos, ou com um ou mais antimicrobianos para os quais os micro-organismos não são suscetíveis. Em algumas modalidades, o controle é medido a partir de micro-organismos sob condições de outro modo idênticas, mas sem nutrientes. Em algumas modalidades, o controle é medido a partir de micro-organismos sob condições de outro modo idênticas com uma ou mais toxinas conhecidas inibir crescimento dos micro-organismos.

[0088] Controles podem ser controles históricos. Em algumas modalidades, as incubações de teste são realizadas após incubações controle terem sido realizadas. Em algumas modalidades, controles são realizados em um cartucho distinto do cartucho compreendendo as incubações de teste. Cartuchos

[0089] Um cartucho pode ser um recipiente que é capaz de conter e permitir crescimento de uma suspensão líquida de micro-organismos. Exemplos não limitantes de um cartucho podem incluir um frasco de cultura, uma placa de cultura, uma placa de Petri, uma placa de bioensaio, um tubo de cultura, um tubo de teste, um tubo microfuga, uma garrafa, uma placa de microcâmara, uma placa de câmaras múltiplas, uma placa de microtitulação, uma microplaca. O cartucho pode compreender uma câmara. O cartucho pode incluir uma pluralidade de câmaras, cada câmara sendo um espaço capaz de conter uma suspensão líquida em isolamento físico de um outro espaço; um exemplo de uma câmara é uma câmara em uma placa de paredes múltiplas. O cartucho pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 48, 96, 192, 384, 1536, ou mais câmaras, e qualquer número de câmaras entre eles. A parte inferior da câmara de cartucho pode ser plana, redonda ou em formato em V.

[0090] Antimicrobianos presentes dentro de uma pluralidade de câmaras no cartucho podem ser suspensos em um meio. Em algumas modalidades, o antimicrobiano está presente na forma de película antimicrobiana. Em certas modalidades, o antimicrobiano está em forma sólida. Em algumas modalidades, o antimicrobiano sólido é liofilizado e/ou seco. Certas modalidades proveem um ou mais antimicrobianos presentes em uma ou mais câmaras do cartucho como películas antimicrobianas, em forma sólida, liofilizada ou seca antes da introdução de uma suspensão de micro-organismos.

[0091] Uma série de diluição antimicrobiana pode ser congelada, liofilizada ou recém-preparada antes da inoculação em placa com uma amostra. Em alguns casos, inoculação de cartuchos pode ser realizada ou manualmente ou usando um sistema automatizado. Em alguns exemplos, tal como em casos de placas antimicrobianas frescas, um sistema de manuseamento de líquido automatizado pode ser usado para preparar o cartucho com séries de diluição antimicrobiana. Processos de inoculação podem incluir qualquer um de vários processos que podem ser conhecidos na técnica.

[0092] Como descrito aqui, cartuchos podem ser usados para conter várias combinações de fluidos a fim de realizar sequências de teste múltiplas, tal como ensaio de ponto de checagem e uma pluralidade de ensaios de crescimento diferentes. Em algumas modalidades, um cartucho tem um conjunto de câmaras usado para facilitar o um ou mais ensaios de ponto de checagem e um conjunto de câmaras usado para facilitar o um ou mais ensaios de crescimento. A título de exemplo, um cartucho pode incluir uma disposição de câmaras disposta em filas e colunas. O cartucho pode incluir um conjunto de câmaras de controle e um conjunto de câmaras de teste antimicrobiano. O conjunto de câmaras de controle pode incluir duas câmaras e o conjunto de câmaras de teste pode incluir o restante das câmaras ao longo da placa. Em algumas modalidades, o conjunto de câmaras de controle inclui pelo menos duas câmaras, onde uma câmara é uma câmara de crescimento e a outra câmara é uma câmara sem crescimento. Em algumas modalidades, a câmara de crescimento inclui, ou é inoculada para incluir, uma combinação de caldo e amostra de um paciente de modo que os micro-organismos na amostra do paciente possam crescer dentro do caldo durante um período de incubação. Em certas modalidades, antimicrobianos não são adicionados à câmara de ensaio de ponto de checagem. Enquanto isso, em algumas modalidades, a câmara sem crescimento pode incluir, ou ser inoculada para incluir, caldo sem a amostra do paciente (isto é, caldo na ausência dos micro- organismos da amostra do paciente). Em algumas modalidades, antimicrobianos também não são adicionados à câmara sem crescimento. Desta maneira, durante um período de incubação, a câmara sem crescimento pode servir como uma linha basal comparado com a câmara de crescimento em que os micro-organismos podem crescer.

[0093] Em algumas modalidades, cada cartucho inclui um “painel de teste”, uma pluralidade de antimicrobianos distribuídos através de múltiplos poços em uma série de diluição definida para cada antimicrobiano (por exemplo, uma serie de diluição de 2 vezes, uma série de diluição de 10 vezes, etc.). Ainda, cada cartucho ou painel de teste pode conter câmaras de controle, tal como uma câmara de controle de crescimento, uma câmara de controle sem crescimento (contaminação) e/ou uma câmara de controle de solução salina. A câmara de controle de solução salina pode representar controle de FIT aproximadamente igual à concentração inicial de micro-organismos em inóculo. Os cartuchos podem incluir múltiplas câmaras (por exemplo, cartucho de 96 câmaras ou cartucho de 384 câmaras) com uma tampa (por exemplo, uma tampa removível) e um identificador (por exemplo, um código de barras) que define unicamente configuração antibiótica e um código único, que define a placa e pode estar associado com uma amostra de paciente única de acordo com HIPAA.

[0094] As câmaras de teste podem incluir qualquer uma de várias combinações da amostra do paciente e vários tipos e concentrações de antimicrobianos para os quais susceptibilidade pode ser analisada. Fileiras de câmaras podem ser dedicadas a um antimicrobiano particular e concentrações desses antimicrobianos pode variar entre as colunas da mesma fileira. Por exemplo, um cartucho pode ter uma fileira de câmaras contendo penicilina onde cada câmara da esquerda para a direita contém uma concentração alta de penicilina.

[0095] Com certeza, outros exemplos são possíveis. Por exemplo, as câmaras e conjuntos de câmaras diferentes podem ser posicionados em qualquer um de vários locais ao longo do cartucho. Ainda, os conjuntos diferentes de câmaras (por exemplo, câmaras de controle e câmaras de teste) podem incluir mais ou menos câmaras individuais ao longo do cartucho. Ainda, em alguns casos, nem todas as câmaras são usadas/ocupadas durante o teste. Métodos de AST Automatizados

[0096] Os métodos descritos aqui podem ser realizados de uma maneira automatizada usando equipamento comercialmente disponível, equipamento feito sob encomenda ou uma combinação dos mesmos. Automação dos métodos permite desempenho de um número maior de ensaios bem como consistência aumentada dentre os ensaios. Automação pode também aumentar a velocidade e resolução desses métodos. Ensaios de Sonda de Ligação à Superfície

[0097] Ensaios de ligação à superfície (também referidos como ensaios de sonda de ligação à superfície) podem utilizar um agente de sinalização. Agentes de sinalização tipicamente compreendem uma porção capaz de ligação a um micro-organismo (por exemplo, um anticorpo e/ou uma lectina que se liga à superfície de um micro- organismo, uma porção carregada e/ou uma porção funcional que se liga não especificamente à superfície do micro-organismo) e uma porção química capaz de prover um sinal ou contribuição para produção de um sinal (por exemplo, um quimioluminóforo de enzima e quelato de lantanídeo). Enzimas exemplares incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, acetil colinesterase, glicose oxidase, beta- D-galactosidase, beta-lactamase e uma combinação dos mesmos.

[0098] Um gerador de sinal pode incluir uma ou mais porções químicas conjugadas a um ou mais receptores de micro-organismo. Gerados de sinal incluem, mas não estão limitados a, um ou mais catalisadores (incluindo enzimas, nanopartículas de óxido de metal, catalisadores organometálicos, nanopartículas projetadas para amplificação de sinal (tais como aquelas descritas nos Pedidos Provisórios U.S. para os quais o presente pedido reivindica prioridade e incorpora a título de referência em suas totalidades), bacteriófagos compreendendo elementos de geração de sinal, fluoróforos (incluindo fluoróforos orgânicos, európio ou organometálicos contendo rutênio(II), rutênio(I), paládio(II), platina(II) e/ou corantes colorimétricos (incluindo corantes orgânicos). Combinações dos acima podem ser usadas, tais como nanopartículas, dendrímeros e/ou outras estruturas de nanoescala com enzimas, fluoróforos e/ou moléculas organometálicas.

[0099] A porção química pode ser conjugada a um agente de sinalização antes do contato do agente de sinalização com um micro- organismo, enquanto o agente de sinalização é inicialmente contatado com um micro-organismo ou após o agente de sinalização ter contatado um micro-organismo.

[0100] Quando os agentes de sinalização são adicionados a diluições de AST contendo um micro-organismo, receptores de agente de sinalização (por exemplo, porções que podem se ligar especificamente ou não especificamente a um micro-organismo) podem se associar com superfícies do micro-organismo. Portanto, quanto mais micro-organismos intactos, por exemplo, houver em solução, maior o número de agentes de sinalização que será associado com essas bactérias. Consequentemente, há uma relação inversa entre o número de bactérias intactas e o número de agentes de sinalização que são livres em solução, como definido por aqueles não ligados a bactérias intactas. Observar que agentes de sinalização livres podem ser ligados a componentes microbianos solúveis se, por exemplo, micro- organismos lisam em resposta a tratamento antimicrobiano.

[0101] O número de agentes de sinalização que se associam com e/ou intercalam nas superfícies do micro-organismo é proporcional à área de superfície do micro-organismo. A área de superfície do micro- organismo está fortemente associada com micro-organismos verdadeiramente resistentes. Em particular, no caso de micro- organismos que incham ou alongam em reposta a concentrações MIC- e sub-MIC de antimicrobianos (por exemplo, bactérias de formação de filamentos), identificações metabólicas e/ou volumétricas são conhecidas dar perfis de susceptibilidade falsos para pontos de tempo de AST rápidos, definidos como aqueles menores do que seis horas. Para superar essa limitação, a presente invenção traduz a área de superfície do micro-organismo (ao invés do volume) em um sinal mensurável tal como um sinal óptico. Os métodos descritos aqui são também capazes de determinar com precisão perfis de resistência a micro-organismos em menos de seis horas.

[0102] A fim de separar agentes de sinalização associados com e/ou intercalados em micro-organismos dos agentes de sinalização livres, pode ser necessário realizar uma ou mais etapas de separação e/ou ligação competitiva. Tais etapas incluem, mas não estão limitadas a, centrifugação (por exemplo, com uma força g >500 x g), filtragem (por exemplo, através de um filtro tendo poros menores do que ou iguais a 0,45 mícron ou menores do que ou iguais a 0,2 mícron), eletroforese e/ou captura magnética; tais etapas são bem conhecidas daqueles versados na técnica.

[0103] A fim de promover ligação de agente de sinalização e/ou reduzir background, pode ser ainda vantajoso, antes da adição de agentes de sinalização, separar micro-organismos do líquido em que eles estão suspensos durante a incubação. Tais separações podem incluir, mas não estão limitadas a, centrifugação, filtragem, eletroforese e/ou captura magnética.

[0104] Agentes de sinalização podem ser adicionados junto com micro-organismos e/ou antimicrobianos, de modo que eles estejam presentes por todo do período de incubação de AST. Esse período total pode ser de até vinte e quatro horas, ou dentro de oito horas ou dentro de cinco horas. Alternativamente, agentes de sinalização podem ser adicionados a micro-organismos e antimicrobianos após um período de incubação prescrito. Esse período pode ser de até vinte e quatro horas, ou dentro de oito horas ou dentro de quatro horas.

[0105] Agentes de sinalização são projetados para se associarem com e/ou intercalarem em superfícies de micro-organismo, incluindo paredes e/ou membranas. Agentes de sinalização projetados para associação compreendem porções de ligação incluindo, mas não estão limitados a, um ou mais anticorpos, lectinas, outras proteínas, moléculas pequenas com um ou mais grupos químicos carregados, moléculas pequenas com um ou mais grupos químicos funcionais, fagos, glicoproteínas, peptídeos, aptâmeros, moléculas pequenas carregadas, moléculas pequenas com cargas fixas, polímeros carregados, polímeros carregados com cargas fixas, moléculas pequenas hidrofóbicas, peptídeo carregado, peptídeos carregados com cargas fixas, peptídeos com regiões hidrofílicas e hidrofóbicas alternadas e/ou ligantes de molécula pequena, que podem ou não ser complexos organometálicos. Moléculas projetadas para associação a micro- organismos são bem conhecidas daqueles versados na técnica. Agentes de sinalização podem permanecer ligados a micro-organismos ou podem ser internalizados, desta maneira, todas as associações estão incluídas. Agentes de sinalização projetados para intercalação podem incluir, mas não estão limitados a, moléculas hidrofóbicas pequenas, peptídeos hidrofóbicos e/ou peptídeos com regiões hidrofóbicas e hidrofílicas alternadas. Moléculas projetadas para intercalação de micro-organismo são bem conhecidas daqueles versados na técnica. Agentes de sinalização podem ser ainda específicos para um ou mais tipos de micro-organismos. Agentes de sinalização podem ter receptores múltiplos. Esses podem aumentar a ligação e/ou permitir ligação simultânea a dois ou mais micro- organismos, que podem ainda servir para aglutinar bactérias. Antes da ou concomitantemente com a adição de agentes de sinalização pode ser vantajoso ajustar o pH da solução. Isso pode ser benéfico para aumento das interações carga-carga entre micro-organismos e agentes de sinalização. A carga aniônica de micro-organismos pode ser aumentada através da titulação do pH da solução acima do neutro (mais básico). Pode então ser benéfico utilizar porções com uma ou mais cargas catiônicas, fixas.

[0106] É importante que o agente de sinal possa se ligar especificamente a um micro-organismo (por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a uma espécie de micro-organismo ou uma cepa de micro-organismo) ou possa se ligar não especificamente a um micro-organismo (por exemplo, através de formação de uma ligação covalente ou não covalente e uma outra associação química não específica conhecida na técnica).

[0107] Alternadamente, agentes químicos e/ou bioquímicos que são capazes de associação com agentes de sinalização podem ser adicionados ao líquido em que os micro-organismos estão suspensos durante o crescimento, de modo que agentes químicos e/ou bioquímicos sejam incorporados a micro-organismos durante a incubação. Isso pode servir para aumentar a associação do agente de sinalização com micro- organismos. Em modalidades alternativas, os agentes de sinalização em si podem estar presentes no líquido em que os micro-organismos estão suspensos durante incubação e podem ser incorporados a micro-

organismos durante o crescimento.

[0108] Os agentes de sinalização podem compreender um gerador de sinal de amplificador (grupo amplificador), de modo que o sinal de cada micro-organismo intacto pode ser amplificado além do número de agentes de sinalização associados com cada micro-organismo. Por exemplo, a enzima peroxidase de rábano silvestre (HRP) é conhecida ser capaz de amplificar sinais >1x104 vezes. Portanto, se cem moléculas de HPR forem ligadas à superfície de cada micro-organismo, uma amplificação de 106 pode ser obtida. Isso pode aumentar a velocidade com a qual determinações de AST podem ser feitas através da permissão de discriminação de concentrações de micro-organismo que não podem ser de outro modo diferenciadas. Uso de formulações de Európio provê similarmente amplificação de sinal.

[0109] Alternativamente, os agentes de sinalização podem compreender precursores de corante óptico conhecidos daqueles versados na técnica como corantes de membrana que são projetados para aumentar bastante a emissão de fluorescência quando da intercalação em uma região hidrofóbica, tal como uma membrana celular. Ensaios projetados com esses agentes de sinalização podem requerer que micro-organismos sejam concentrados em um volume menor, se aproximando de um plano, para produzir sinais suficientes de modo a serem facilmente opticamente medidos. Espécies de interferência podem requerer o uso de fluoróforos próximos do IR.

[0110] Grupos amplificadores exemplares incluem aqueles descritos nas, por exemplo, Publicação Internacional No. WO 2016/015027 e Pedido Internacional No. PCT/US16/42589, cada um dos quais é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Um grupo amplificador pode compreender um catalisador, um fluoróforo, um corante colorimétrico, uma enzima, um catalisador ou uma nanopartícula. Fluoróforos exemplares incluem aqueles descritos na FIG. 7, Tabela 1 do Pedido Internacional No. PCT/US16/42589, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Um grupo amplificador pode compreender um lantanídeo. Lantanídeos incluem, mas não estão limitados a, európio, estrôncio, térbio, samário ou disprósio.

[0111] Um grupo amplificador pode compreender um fluoróforo orgânico, por exemplo, um complexo de coordenação. O complexo de coordenação pode ser complexo de coordenação de európio, um complexo de coordenação de rutênio, um complexo de coordenação de rênio, um complexo de coordenação de paládio, um complexo de coordenação de platina. Um amplificador pode compreender um quimioluminóforo, um quantum dot, uma enzima, um catalisador de coordenação de ferro, um complexo de coordenação de európio, um complexo de coordenação de rutênio, um complexo de coordenação de rênio, um complexo de coordenação de paládio, um complexo de coordenação de platina, um complexo de coordenação de samário, um complexo de coordenação de térbio ou um complexo de coordenação de disprósio.

[0112] Em algumas modalidades, um grupo amplificador compreende uma porção que é: (III), (IV) ou (V).

[0113] Em algumas modalidades, um grupo amplificador compreende uma porção que é:

(VI); (VII); (VIII);

(IX); ou

(X).

[0114] Um grupo amplificador pode compreender um fluoróforo ou corante colorimétrico. Fluoróforos e corantes colorimétricos adequados são bem conhecidos daqueles versados na técnica e são descritos no The Molecular Probes® Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11a Ed. (2010) e Gomes, Fernandese Lima J. Biochem. Biophys. Methods 65 (2005) pp 45-80, que são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Fluoróforos exemplares também incluem aqueles descritos na, por exemplo, Publicação Internacional No. WO 2016/015027 e Pedido Internacional No. PCT/US16/42589, cada um deles é incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0115] Exemplos de fluoróforos ou corantes colorimétricos adequados incluem, mas não estão limitados a, brometo de etídio, iodeto de propídio, verde SYTOX, fenantridinas, acridinas, indóis, imidazóis, cianina, TOTO, TO-PRO, SYTO, 5-carboxi-2,7- diclorofluoresceína , 5-Carboxifluoresceína (5-FAM), 5- Carboxinaftofluoresceína, 5-Carboxitetrametilrodamina (5-TAMRA), 5- FAM (5-Carboxifluoresceína), 5-HAT (Hidroxi Triptamina), 5-ROX (carboxi-X-rodamina), 6-Carboxirrodamina 6G, 7-Amino-4- metilcumarina, 7-Aminoactinomicina D (7-AAD), 7-Hidroxi-4- metilcoumarina, 9-Amino-6-cloro-2-metoxiacridina, ACMA (9-Amino-6- cloro-2- metoxiacridina), Acridinas, Flúors Alexa, Alizarina, Aloficocianina (APC), AMCA (Aminometilcumarina), Bodipy, Carboxi-X-

rodamina, Catecolamina, Fluoresceína (FITC), Hidroxicumarina, Lissamine Rhodamine, Monobromobimana, Verde Oregon, Ficoeritrina, SYTO, Tiadicarbocianina (DiSC3), Tioflavina, X-Raodamina, C ou TetrametilRodaminaIsoTioCianato.

[0116] Um grupo amplificador pode compreender um composto organometálico, complexo de metal de transição ou complexo de coordenação. Exemplos de tais grupos amplificados incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos na EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 539 435, EP 0 539 477, EP 0 569 496, EP139675, EP64484, US

4.283.382, US 4.565.790, US 4.719.182, US 4.735.907, US 4.808.541, US 4.927.923, US 5.162.508, US 5.220.012, US 5.324.825, US

5.346.996, US 5.373.093, US 5.432.101, US 5.457.185, US 5.512.493, US 5.527.684, US 5.534.622, US 5.627.074, US 5.696.240, US

6.100.394, US 6.340.744, US 6.524.727, US 6.717.354, US 7.067.320, US 7.364.597, US 7.393.599, US 7.456.023, US 7.465.747, US

7.625.930, US 7.854.919, US 7.910.088, US 7.955.859, US 7.968.904, US 8.007.926, US 8.012.609, US 8.017.254, US 8.018.145, US

8.048.659, US 8.067.100, US 8.129.897, US 8.174.001, US 8.183.586, US 8.193.174, US 8.221.719, US 8.288.763, US 8.362.691, US

8.383.249, US 8.492.783, US 8.632.753, US 8.663.603, US 8.722.881, US 8.754.206, US 8.890.402, US 8.969.862, US 9.012.034, US

9.056.138, US 9.118.028, US 9.133.205, US 9.187.690, US 9.193.746, US 9.312.496, US 9.337.432, US 9.343.685, US 9.391.288 e US

9.537.107, que são incorporados a título de referência em sua totalidade. Compostos organometálicos exemplares, complexos de metal de transição ou complexos de coordenação também incluem aqueles descritos na, por exemplo, Publicação Internacional No. WO 2016/015027 e no Pedido Internacional No. PCT/US16/42589, cada um deles é incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0117] Em algumas modalidades, o grupo amplificador é um complexo de coordenação de lantanídeos tal como um complexo entre um lantanídeo (por exemplo, Eu ou Tb) e um ligante tetradentado ou um complexo entre um lantanídeo (por exemplo, Eu ou Tb) e um ligante criptato. Em algumas modalidades, grupo amplificador é um complexo de coordenação de Lantânio (La), Cério (Ce), Praseodímio (Pr), Neodímio (Pm), Samário (Sm), Európio (Eu), Gadolínio (Gd), Térbio (Tb), Disprósio (Dy), Hólmio (Ho), Érbio (Er), Túlio (Tm), Itérbio (Yb), Lutécio (Lu), Rutênio (Ru), Ródio (Rh), Paládio (Pd), Ósmio (Os), Irídio (Ir) ou Platina (Pt). Em algumas modalidades, grupo amplificador é um complexo de coordenação de um metal-terroso raro que se refere coletivamente a 17 elementos consistindo em um grupo de 15 elementos de lantânio tendo um número atômico de 57 para lutécio tendo um número atômico de 71 (lantanídeos), e dois elementos adicionais consistindo em escândio tendo um número atômico de 21 e trítio tendo um número atômico de 39. Exemplos específicos de metais- terrosos raros incluem európio, térbio, lantânio, cério, praseodímio, neodímio, promécio, samário, gadolínio, disprósio, hólmio, érbio, túlio, itérbio, lutécio, escândio e trítio. Em algumas modalidades, grupo amplificador é um complexo de coordenação de um lantanídeo (por exemplo, Európio ou Térbio) com ácido dietilenotriaminotetra-acético ou ligante criptato.

[0118] Exemplos específicos de um agente de sinalização incluem, mas não estão limitados a, porções compreendendo: (1) Eu-cryptate-maleimide Eu-criptato-maleimida

(2); Eu-criptato-NHS Eu-cryptate-NHS

(3) ; Eu-cryptate-diamine Eu-criptato-diamina

(4) ; Eu-N1-ITC (Delfia)

(5) ; Eu-N1-DTA

(6) ; Eu-N1-amino

(7) ; Eu-N1-iodoacetamido

(8); (9); (10); (11); ou (12).

[0119] Um agente de sinalização pode compreender um luminóforo (doador) que exibe eficiência quântica de luminescência alta e tempo de declínio de luminescência longo (>100 ns). Luminóforos exemplares são complexos metalorgânicos, catiônicos, de paládio, ródio, platina, rutênio, ósmio, terrosos raros (em particular, európio e lantânio). A porção orgânica desses complexos metalorgânicos pode consistir, por exemplo, em ligantes do grupo de porfirinas, bipiridilas, fenantrolinas ou outros compostos heterocíclicos.

[0120] Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende um anticorpo (por exemplo, monoclonal ou policlonal), anticorpos modificados (por exemplo, anticorpo monoclonal biotinilado, anticorpo policlonal biotinilado, anticorpo de quelato de európio, anticorpo conjugado a peroxidase de rábano silvestre), variantes de anticorpo (por exemplo, Fab: fragmento, de ligação a antígeno (um braço); F(ab’)2: fragmento, ligação a antígeno, incluindo região de dobra (ambos os braços); Fab’: fragmento, ligação a antígeno, incluindo região de dobra (um braço); scFv: fragmento variável de cadeia simples; di-scFv: fragmento variável de caceia simples dimérico; sdAb: anticorpo de domínio simples; Anticorpos monoclonais biespecíficos; anticorpo trifuncional; e BiTE: enagajador de células T biespecíficos), WGA- Biotina, PolimixinaB-Biotina, lectina, peptídeo natural, peptídeos sintéticos, ligantes sintéticos e/ou naturais, polímeros sintéticos e/ou naturais, glicopolímeros sintéticos e/ou naturais, proteínas e/ou polímeros de ligação a carboidrato, proteínas e/ou polímeros de ligação a glicoproteínas, moléculas pequenas carregadas, outras proteínas, bacteriófagos e/ou aptâmeros.

[0121] Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende ou é formado de uma estrutura compreendendo um anticorpo, lectina, peptídeo natural, peptídeos sintéticos, ligantes sintéticos e/ou naturais, polímeros sintéticos e/ou naturais, glicopolímeros sintéticos e/ou naturais, proteínas e/ou polímeros de ligação a carboidrato, proteínas e/ou polímeros de ligação à glicoproteína, moléculas pequenas carregadas, outras proteínas, bacteriófagos e/ou aptâmeros.

[0122] Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende um grupo amplificador que compreende um complexo de coordenação de lantanídeos e/ou uma enzima e estreptavidina e/ou um anticorpo e/ou aptâmero. Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende uma porção de ligação compreendendo um anticorpo policlonal e/o monoclonal.

[0123] Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende uma porção de ligação compreendendo um anticorpo modificado. Anticorpos modificados exemplares incluem um anticorpo monoclonal biotinilado, anticorpo policlonal biotinilado, um anticorpo de quelato de európio e um anticorpo conjugado a peroxidase de rábano silvestre. Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende uma porção de ligação compreendendo uma variante de anticorpo. Variantes de anticorpo exemplares incluem Fab: fragmento, ligação de antígeno (um braço); F(ab’)2: fragmento, ligação de antígeno, incluindo região de dobra (ambos os braços); Fab’: fragmento, ligação de antígeno, incluindo região de dobra (um braço); scFv: fragmento variável de cadeia simples; di-scFv: fragmento variável de cadeia simples dimérico; sdAb: anticorpo de domínio único; Anticorpos monoclonais biespecíficos; anticorpo trifuncional; e BiTE: engajador de células T biespecífico.

[0124] Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende WGA- Biotina ou PolimixinaB-Biotina. Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende uma porção de ligação compreendendo um ligante e/ou peptídeo sintético e/ou natural. Em algumas modalidades, um ligante e/ou peptídeo é selecionado de bis(zinco-dipicolilamina), peptídeo TAT, serina proteases, catelicidinas, dextrinas catiônicas, ciclodextrinas catiônicas, ácido salicílico, lisina e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende uma porção de ligação compreendendo um polímero sintético e/ou natural e/ou glicopolímero. Em modalidades, um polímero natural e/ou sintético é linear ou ramificado e selecionado de amilopectina, Poli(N-[3- (dimetilamino)propil]metacrilamida), poli(etilenoimina), poli-L-lisina, poli[2-(N,N-dimetilamino)etil metacrilato] e suas combinações. Em algumas modalidades, um polímero e/ou glicopolímero natural e/ou sintético compreende porções incluindo, mas não está limitado a, quitosana, gelatina, dextrano, trealose, celulose, manose, dextranos e ciclodextranos catiônicos, aminas quaternárias, tribrometo de piridínio, histidina, lisina, cisteína, arginina, sulfônios, fosfônio ou suas combinações incluindo, mas não limitado a, polímeros de cobloco, enxerto e alternado. Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende uma porção de ligação compreendendo uma glicoproteína selecionada de lectina de ligação à manose, outras lectinas, anexinas e suas combinações.

[0125] Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende: um anticorpo; e um complexo de coordenação de európio. Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende um grupo ligante L que compreende NH2-PEG-Biotina (2K), NH2-PEG-Biotina (4K), sulfo-NHS- Biotina, WGA-Biotina ou PolimixinaB-Biotina. Em algumas modalidades,

um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro- organismo compreende um complexo de európio compreende: (III), (IV) ou (V).

[0126] Em algumas modalidades, um agente de sinalização capaz de se ligar à superfície de um micro-organismo compreende um complexo de európio compreende: ; ou .

[0127] Alternativamente, os agentes de sinalização podem ser parte de um par, tal como um doador ou aceitadores de FRET/TR-FRET ou pares de oxigênio singleto consistindo em um fotossensibilizador e detector. Ensaios projetados com esses agentes de sinalização podem requerer a separação dos micro-organismos do meio de crescimento inicial, com ressuspensão subsequente em um tampão de reação desejado antes da adição dos reagentes de sinalização. Por outro lado, ensaios projetados com esses agentes de sinalização podem não exigir quaisquer etapas de separação devido à distância relativa necessária exigida para gerar um sinal.

[0128] Exemplos de doadores de FRET/TR-FRET incluem, mas não estão limitados a, organometálico criptato (CisBio) contendo Lantanídeo (Eu, Sm, Dy ou Tb), Lance Eu-W1024 (Perkin Elmer), Lance Eu-W8044 (Perkin Elmer), também qualquer doador de par fluorescente orgânico.

[0129] Exemplos de aceitadores de FRET/TR-FRET incluem, mas não estão limitados a, corantes orgânicos compatíveis, tais como corante ULight (Perkin Elmer), SureLight APC (Perkin Elmer), aloficocianina, Cy5, corante d2 (CisBio), também qualquer aceitador de par fluorescente orgânico.

[0130] Exemplos de fotossensibilizadores de oxigênio singleto incluem, mas não estão limitados a, methuselah Green Carboxy (Ursa Bio), Sensitizer Blue (Ursa Bio), rose Bengal, Eritrosina B, azul de metileno, clorofilas, doador AlphaBead (Perkin Elmer).

[0131] Exemplos de detectores de oxigênio singleto incluem, mas não estão limitados a, verde detector de oxigênio singleto (ThermoFisher), trans-1-(2’-metoxivinil)pireno, Si-DMA (Dojindo), aceitador AlphaBead (Perkin Elmer).

[0132] Exemplos de incorporadores incluem, mas não estão limitados a, etinila-D-alanina (EDA), azido-D-alanina (ADA), D-alaninas fluorescentes descritas em Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Dezembro 7; 51(50); 12519-12523. Exemplos Exemplos 1:

[0133] Sangue humano (5 mL) e bactérias foram adicionados a 20 mL de meio de crescimento BACTEC para obter uma carga bacteriana de 1000 cfu/mL. 12 mL da solução bacteriana foram postos em um tubo Falcon de 15 mL. O tubo foi girado a 500 RCF por 5 minutos. O sobrenadante resultante foi removido e posto em um tubo de 15 mL limpo. O tubo contendo o sobrenadante foi girado a 1350 RCF por 5 minutos, produzindo um pélete de bactérias. O sobrenadante foi removido e o tubo de 15 mL invertido em um tubo de 50 mL. Os tubos foram girados nessa posição a 200 RCF por 1 minuto. O pélete bacteriano resultante foi ressuspenso em 500 uL de MHB. 3 alíquotas de 150 uL foram postas em uma placa de 96 cavidades e o crescimento monitorado opticamente. Após 6 horas, a amostra foi diluída 10 vezes e inoculada em uma placa de AST. Dados de AST foram lidos após 20 horas. Esse processo é ilustrado na FIG. 1. Exemplo 2:

[0134] Uma amostra de urina (2 mL) foi posta em dois tubos de centrífuga LeucoSep de 10 mL. Os tubos foram girados a 500 RCF por 5 minutos. 2 mL de solução salina foram adicionados aos tubos para ressuspender as bactérias, 2 mL foram adicionados uma segunda vez para lavar a membrana. Os teores dos tubos foram combinados e medidos opticamente. A amostra foi diluída e inoculada através de duas placas de AST. As placas foram lidas usando o ensaio SeLux e as orientações CLSI. Esse processo é ilustrado na FIG. 2. Exemplo 3:

[0135] Uma cultura de sangue positiva (PBC) foi removida de sua garrafa. Uma coluna de uma placa de 96 poços foi cheia com 90 μL de solução salina e então 10 μL de PBC foram adicionados. Concomitantemente, 10 μL de 10-3 a 10-8 diluições foram plaqueados em pontos sobre uma placa de ágar e incubados de um dia para o outro. 4 mL de PBC foram adicionados a tubos Sarstedt Screw Cap de 25 mL (2 tubos por PBC por detergente de lise). Os tubos foram centrifugados a 500 RCF por 2 minutos. 3 mL de sobrenadante foram levados para tubos limpos onde 1 mL de detergente de lise (Saponina 3%, Polianetol Sulfonato de Sódio 1,53%, 0,000008% de Polipropileno Glicol [4000 Mn]) foi adicionado e os tubos foram vortexados. Os tubos foram centrifugados a 2370 RCF por 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado, 1 mL de solução salina adicionado e os tubos vortexados. Os tubos foram novamente centrifugados a 2370 RCF por 5 min. O sobrenadante foi novamente aspirado, 1 mL de solução salina adicionado e os tubos vortexados, então combinados em 1 tubo. Os tubos foram centrifugados a 2370 RCF por 5 min. O sobrenadante foi aspirado, 1 mL de solução salina adicionado e os tubos vortexados. Os tubos foram centrifugados a 2370 RCF por 5 min. O sobrenadante foi aspirado, 1 mL de solução salinada adicionado e os tubos vortexados. A suspensão foi levada para uma cuveta e a densidade óptica foi obtida. Uma coluna de uma placa de 96 poços foi cheia com 90 uL de solução salina. 10 μL de ressuspensão foram adicionados aos primeiros poços da fileira e então diluições 1:10 foram feitas para baixo até que diluições de 10-1 a 10-8 foram preparadas. 10 μL de diluições 10-3 a 10-8 foram plaqueadas em pontos sobre uma placa de ágar e incubados de um dia para o outro. Exemplo 4:

[0136] 5 mL de amostra de urina carregada de bactérias são postos em um tubo Falcon de 15 mL. O tubo é girado a 500 RCF por 5 minutos. O sobrenadante desse giro inicial é removido e posto em um tubo de 15 mL limpo. O tubo contendo sobrenadante é girado a 1350 RCF por 5 minutos para peletizar as bactérias. A maioria do sobrenadante é decantada antes de inverter o tubo de 15 mL em um tubo de 50 mL que é então girado a 200 RCF por 1 minuto. O pélete de bactéria resultante é então ressuspenso em 5 mL de solução salina e a concentração de bactérias é determinada opticamente. A amostra é diluída para dar a concentração apropriada para AST e é inoculada através de duas placas de AST separadas. Uma placa é processada usando o ensaio SeLux e a outra é posta em uma incubadora de um dia para o outro para ser lida de acordo com as orientações CLSI. Esse processo é ilustrado na FIG. 3.

Exemplo 5:

[0137] A cultura de sangue positiva (PBC) é removida da garrafa de cultura de sangue. Uma coluna (por PBC) de uma placa de 96 poços é cheia com 90 μL de solução salina. 10 μL de PBS são adicionados aos primeiros poços das fileiras e então diluições 1:10 são feitas para menos até que diluições de 10-1 a 10-8 sejam preparadas. 10 μL de diluições 10-3 a 10-8 são plaqueadas em pontos sobre uma placa de ágar e incubados de um dia para o outro. 4 mL de PBC são adicionados a 2,5 mL de tubos Sarstedt Screw Cap (2 tubos por PBC por detergente de lise). Os tubos são centrifugados a 500 RCF por 2 minutos. 3 mL de sobrenadante por tubo são levados para tubos limpos. 1 mL de Detergente de Lise é adicionado, e os tubos são vortexados (Detergente I2: Saponina 3%, Polianetol Sulfonato de Sódio 1,53%, Polipropileno Glicol 8x10-6% [4000 Mn]). Os tubos são centrifugados a 2370 RCF por 5 minutos. Sobrenadante é aspirado, 1 mL de solução salina é adicionado e os tubos são vortexados. Os tubos são centrifugados a 2370 RCF por 5 minutos. Sobrenadante é aspirado, péletes são lavados com 1 mL de solução salina novamente, e os tubos são vortexados e então combinados em 1 tubo final. Os tubos são centrifugados a 2370 RCF por 5 minutos. Solução salina é aspirada, e 1 mL de solução salina é adicionado, e os tubos são vortexados. Os tubos são centrifugados a 2370 RCF por 5 minutos. Solução salina é aspirada 1 mL de solução salina é adicionado, e os tubos são vortexados. Ressuspensão é levada para uma cuveta e o OD é obtido (1º blanked com solução salina). Uma (por ressuspensão final) de uma placa de 96 poços é cheia com 90 μL de solução salina. 10 μL de ressuspensão são adicionados aos primeiros poços da fileira e então 1:10 diluições são feitas para menos até que diluições de 10-1 a 10-8 sejam preparadas. 10 μL de 10-3 a 10- 8 diluições são plaqueadas em pontos em uma placa de ágar e incubadas de um dia para o outro. Esse processo é ilustrado na FIG. 5 com dados representativos mostrados nas FIGS- 12-13. Exemplo 6:

[0138] 2 mL de sangue de uma garrafa BacTec foram adicionados a um tubo de 5 mL. Centrifugados entre 100-500 RCF durante 1-5 minutos. Retirado 1 mL de sobrenadante para checar OD 600 após centrifugação. O espectrofotômetro foi blanked com sobrenadante de um tubo de 2 mL que foi centrifugado a 2370 RCF (velocidade máx.) por 10 minutos. Esse processo é ilustrado na FIG. 3. Exemplo 7:

[0139] A cultura de sangue positiva (PBC) foi removida da máquina de cultura de sangue. 4 mL de PBC foram adicionados a tubos Sarstedt Screw Cap de 2,5 mL (2 tubos por PBC por detergente de lise). Os tubos foram centrifugados a 500 RCF por 2 minutos. 3 mL de sobrenadante por tubo foram levados para tubos limpos. 1 mL de Detergente de Lise foi adicionado, e os tubos foram vortexados (Detergente I2: Saponina 3%, Polianetol Sulfonato de Sódio 1,53%, Polipropileno Glicol 8x10-6% [400 Mn]). Os tubos foram centrifugados a 2370 RCF por 5 minutos. Sobrenadante foi aspirado, 1 mL de solução salina foi adicionado, e os tubos foram vortexados. Os tubos foram centrifugados a 2370 RCF por 5 minutos. Sobrenadante foi aspirado, os péletes foram lavados com 1 mL de solução salina novamente, e os tubos foram vortexados e então combinados em 1 tubo final. Os tubos foram centrifugados a 2370 RCF por 5 minutos. Solução salina foi aspirada, e 1 mL de solução salina foi adicionado, e os tubos foram vortexados. Os tubos foram centrifugados a 2370 RCF por 5 minutos. Solução salina foi aspirada, e 1 mL de solução salina foi adicionado, e os tubos foram vortexados. Ressuspensão foi levada para uma cuveta e o OD foi obtido (1º blanked com solução salina). Uma coluna (por ressuspensão final) de uma placa de 96 poços foi cheia com 90 μL de solução salina. 10 μL de ressuspensão foram adicionados aos primeiros poços da fileira. Esse processo é ilustrado na FIG. 4. Exemplo 8:

[0140] A cultura de sangue positiva (PBC) foi removida da máquina de cultura de sangue. 6 mL de PBC foram adicionados a um tubo cônico de 15 mL. Os tubos foram centrifugados a 250 RCF por 5 minutos. 5 mL de sobrenadante foram levados para um tubo limpo. Os tubos foram centrifugados a 1350 RCF por 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado, 5 mL de solução salina foram adicionados, e os tubos foram vortexados. Os tubos foram centrifugados a 1350 RCF por 5 minutos. Sobrenadante foi aspirado, os péletes foram ressuspenso com 0,5 mL de solução salina. A ressuspensão foi então tratada como um McFarland 0,5 e usada para inocular um ensaio de AST. Dados representativos desse processo podem ser vistos nas FIGS. 14-15. Incorporação a Título de Referência

[0141] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados aqui são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado estar incorporado a título de referência. No caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer presentes definições, prevalecerá. Equivalentes

[0142] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes para as modalidades específicas descritas aqui. Tais equivalentes pretendem ser compreendidos pelas reivindicações que seguem.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método automatizado para preparação de uma amostra suspeita de compreender micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. centrifugar em RCF <1000; b. coletar um primeiro sobrenadante a partir da etapa a; c. tratar o primeiro sobrenadante com um ou mais reagentes líticos; d. centrifugar o primeiro sobrenadante tratado da etapa c em RCF >1000; e. remover o sobrenadante da etapa d; f. ressuspender o pélete de micro-organismo em solução salina ou uma solução tampão adequada; g. opcionalmente lavar o pélete uma ou mais vezes repetindo as etapas de, opcionalmente após a etapa f de ressuspensão do pélete; e h. quantificar a suspensão celular, opcionalmente medindo a densidade óptica em um ou mais comprimentos de onda entre 500 e 700 nm.

   2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico inclui, mas não está limitado a, saponinas, tritons, tweens, cloreto de amônio, ésteres de sorbitano, tensoativos de polioxietileno sorbitano.

   3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende um ou mais compostos solúveis em água.

   4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os compostos solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polianetolato de sulfato de sódio (SPS), polipropileno glicol (PPG), carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, ácido N- ciclo-hexil-3-aminopropanossulfônico (CAPS), ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), cloreto de sódio.

   5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende saponinas, SPS e PPG.

   6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende cloreto de amônio e bicarbonato de potássio é adicionado durante a lise.

   7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende cloreto de amônio e bicarbonato de potássio e EDTA ou sal de EDTA sódico.

   8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende Brij 97 e CAPS.

   9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o pélete não é lavado.

   10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o pélete é lavado uma vez.

   11. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que a lavagem é realizada com solução salina, um tampão neutro ou meio de crescimento.

   12. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o pélete é ressuspenso seguindo adição de solução de lavagem.

   13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o pélete não é ressuspenso seguindo adição de solução de lavagem.

   14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

   1-9, caracterizado pelo fato de que o pélete é lavado duas vezes.

   15. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as lavagens são realizadas com solução salina, um tampão neutro ou meios de crescimento.

   16. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que os péletes não são ressuspensos seguindo adição de solução de lavagem.

   17. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que os péletes são ressuspensos seguindo adição de solução de lavagem.

   18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o pélete é ressuspenso em solução salina, um tampão neutro ou meios de crescimento.

   19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado pelo fato de que as células no pélete ressuspenso são quantificadas opticamente em um ou mais comprimentos de onda entre 500 nm e 700 nm.

   20. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as celulas são quantificadas por um espectrômetro, um espectrofotômetro ou um nefelômetro.

   21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, caracterizado pelo fato de que as células são quantificadas seguindo tratamento das celulas suspensas com um ou mais compostos precursores.

   22. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que os compostos precursores incluem, mas não estão limitados a, Pico Green, laranja acridina, RedSafe, 4’,6’- diamidino-2-fenilindol, brometo de etídio, verde I SYBR I, verde II SYBR, luciferina e resazurina.

   23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

   16-22, caracterizado pelo fato de que o composto precursor é adicionado a uma alíquota da suspensão de pélete ressuspensa e essa alíquota é então medida.

   24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizado pelo fato de que a primeira centrifugação é 500 RCF.

   25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-24, caracterizado pelo fato de que a segunda centrifugação é 2370 RCF.

   26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizado pelo fato de que a terceira centrifugação é 2370 RCF.

   27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26, caracterizado pelo fato de que a quarta centrifugação é 2370 RCF.

   28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-27, caracterizado pelo fato de que uma ou mais centrifugações são realizadas em um ângulo fixo de <90°.

   29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, caracterizado pelo fato de que uma ou mais centrifugações são realizadas em um ângulo fixo de 30°, 45°, 60° em relação ao eixo de rotação.

   30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em culturas de sangue positivas de sistemas de monitoramento contínuo.

   31. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em culturas que se tornaram positivas ≤48 horas após introdução no sistema de cultura de sangue de monitoramento contínuo.

   32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-31, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em amostras de urina.

   33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32, caracterizado pelo fato de que o volume da amostra derivada do paciente é menos do que 20 mL, 15 mL, 10 mL.

   34. Método automatizado para preparação de uma amostra suspeita de compreender micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana, caracterizado por compreender as etapas de: a. aplicar uma força centrífuga relativa (RCF) de < 1000 × g a uma amostra, dessa maneira produzindo um sobrenadante depletado de partículas; b. lisar pelo menos uma célula ou plaqueta de paciente no sobrenadante depletado de partículas, dessa maneira produzindo um sobrenadante depletado de celulas de paciente; c. aplicar uma RCF de >1000 × g ao sobrenadante depletado de células do paciente, dessa maneira formando um pélete; d. coletar e ressuspender o pélete; e. opcionalmente lavar o pélete uma ou mais vezes através da repetição das etapas c e d; e f. avaliar uma densidade de micróbios em uma solução salina ou solução tamponada.

   35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a lise é feita por um reagente lítico incluindo, mas não limitado a, saponinas, tritons, tweens, cloreto de amônio, ésteres de corbitano, tensoativos polioxietileno não iônicos.

   36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende um ou mais compostos solúveis em água em adição a um ou mais agentes líticos.

   37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que os compostos solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polianetolato de sulfato de sódio (SPS), polipropileno glicol (PPG), carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, ácido N- ciclo-hexil-3-aminopropanossulfônico (CAPS), ácido etilenodiaminotetraa-cético (EDTA), cloreto de sódio.

   38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-37, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende saponina, SPS e PPG.

   39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-37, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende cloreto de amônio e bicarbonato de potássio.

   40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-37, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende cloreto de amino e bicarbonato de potássio e EDTA ou sal de EDTA sódico.

   41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-37, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende Brij 97 e CAPS.

   42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-41, caracterizado pelo fato de que o pélete não é lavado.

   43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-42, caracterizado pelo fato de que o pélete é lavado uma vez.

   44. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que a lavagem é realizada com solução salina, um tampão neutro ou meios de crescimento.

   45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-44, caracterizado pelo fato de que o pélete é lavado duas vezes.

   46. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as lavagens são realizadas com solução salina, um tampão neutro ou meios de crescimento.

   47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

   34-46, caracterizado pelo fato de que o pélete é ressuspenso em solução salina, um tampão neutro ou meios de crescimento.

   48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-47, caracterizado pelo fato de que as células no pélete ressuspenso são avaliadas opticamente em um ou mais comprimentos de onda entre 500 nm e 700 nm.

   49. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as células são avaliadas por um espectrômetro, um espectrofotômetro ou um nefelômetro.

   50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-48, caracterizado pelo fato de que as células são avaliadas seguindo tratamento das células suspensas com um ou mais compostos precursores.

   51. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que os compostos precursores incluem, mas não estão limitados a, PicoGreen, laranja acridin, RedSafe, 4’,6’- diamidino-2-fenilindol, brometo de etídio, verde I SYBR, verde II SYBR II, luciferina e resazurina.

   52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-51, caracterizado pelo fato de que o composto precursor é adicionado a uma alíquota da suspensão de pélete ressuspenso e essa alíquota é então medida.

   53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-52, caracterizado pelo fato de que o primeiro RCF aplicado é RCF

   500.

   54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-53, caracterizado pelo fato de que o segundo RCF aplicado é 2370 RCF.

   55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-54, caracterizado pelo fato de que o terceiro RCF aplicado é 2370

   RCF.

   56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-55, caracterizado pelo fato de que o quarto RCF aplicado é 2370 RCF.

   57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-56, caracterizado pelo fato de que um ou mais RCFs são aplicados em um ângulo fixo de <90°.

   58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-57, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em culturas de sangue positivas de sistemas de monitoramento contínuo.

   59. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em culturas que se tonaram positivas ≤48 horas após introdução no sistema de cultura de sangue de monitoramento contínuo.

   60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-59, caracterizado pelo fato de que o volume da amostra derivada do paciente é menos do que 20 mL, 15mL, 10 mL.

   61. Método automatizado para preparação de uma amostra suspeita de compreender micro-organismos patogênicos derivados de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. aplicar uma primeira força centrífuga relativa a uma amostra, dessa maneira produzindo um sobrenadante relativamente clarificado; b. lisar pelo menos uma célula ou plaqueta do paciente no sobrenadante relativamente clarificado, dessa maneira produzindo um sobrenadante depletado de células do paciente; c. aplicar uma segunda força centrífuga relativa à amostra da etapa b, dessa maneira formando um pélete; d. remover o sobrenadante;

   e. opcionalmente lavar o pélete uma ou mais vezes repetindo as etapas c e d; f. ressuspender o pélete em uma solução salina ou tamponada adequada; e g. avaliar uma densidade de micróbios na solução salina ou tamponada.

   62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a etapa de lise de pelo menos uma célula do paciente compreende contato do sobrenadante clarificado com um reagente lítico selecionado do grupo consistindo em saponinas, tritons, tweens, cloreto de amônio, ésteres de sorbitano, tensoativos de polioxietileno sorbitano.

   63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende um ou mais compostos solúveis em água em adição a um ou mais agentes líticos.

   64. Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que os compostos solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polianetolato de sulfato de sódio (SPS), polipropileno glicol (PPG), carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, ácido N- ciclo-hexil-3-aminopropanossulfônico (CAPS), ácido etilenodiaminotetraa-cético (EDTA), cloreto de sódio.

   65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-64, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende saponina, SPS e PPG.

   66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-64, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende cloreto de amônio e bicarbonato de potássio.

   67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-64, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende cloreto de amônio e bicarbonato de potássio e EDTA ou sal de EDTA sódico.

   68. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-64, caracterizado pelo fato de que o reagente lítico compreende Brij 97 eCAPS.

   69. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-68, caracterizado pelo fato de que o pélete não é lavado.

   70. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-69, caracterizado pelo fato de que o pélete é lavado uma vez.

   71. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que a lavagem é realizada com solução salina, um tampão neutro ou meios de crescimento.

   72. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-71, caracterizado pelo fato de que o pélete é lavado duas vezes.

   73. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as lavagens são realizadas com solução salina, um tampão neutro ou meios de crescimento.

   74. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-73, caracterizado pelo fato de que o pélete é ressuspenso em solução salina, um tampão neutro ou meios de crescimento.

   75. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-74, caracterizado pelo fato de que as células no pélete ressuspenso são avaliadas opticamente em um ou mais comprimentos de onda entre 500 nm e 700 nm.

   76. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as células são avaliadas por um espectrômetro, um espectrofotômetro ou um nefelômetro.

   77. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-76, caracterizado pelo fato de que as células são avaliadas seguindo tratamento das células suspensas com um ou mais compostos precursores.

   78. Método de acordo com a reivindicação anterior,

   caracterizado pelo fato de que os compostos precursores incluem, mas não estão limitados a, PicoGreen, laranja acridina, RedSafe, 4’,6’- diamidino-2-fenilindol, brometo de etídio, verde I SYBR, verde II SYBR, luciferina e resazurina.

   79. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-78, caracterizado pelo fato de que o composto precursor é adicionado a uma alíquota da suspensão de pélete ressuspenso e essa alíquota é então medida.

   80. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-79, caracterizado pelo fato de que a primeira RCF aplicada é menor do que a segunda RCF aplicada.

   81. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-80, caracterizado pelo fato de que a primeira RCF aplicada é RCF

   500.

   82. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-81, caracterizado pelo fato de que a segunda RCF aplicada é 2370 RCF.

   83. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-82, caracterizado pelo fato de que a terceira RCF aplicada é 2370 RCF.

   84. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-83, caracterizado pelo fato de que a quarta RCF aplicada é 2370 RCF.

   85. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-84, caracterizado pelo fato de que uma ou mais RCFs são aplicadas em um ângulo fixo <90°.

   86. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-85, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em culturas de sangue positivas de sistemas de monitoramento contínuo.

   87. Método de acordo com a reivindicação anterior,

   caracterizado pelo fato de que o método é realizado em culturas que se tornaram positivas ≤48 horas após introdução no sistema de cultura de sangue de monitoramento contínuo.

   88. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-87, caracterizado pelo fato de que o volume da amostra derivada do paciente é menos do que 10 mL.

   89. Método para preparação de uma amostra suspeita de compreender micro-organismos patogênicos derivada de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. centrifugar a <1000 ×g; b. coletar o sobrenadante da etapa a, seguido pela centrifugação a >1000 ×g; c. limpar o pélete resultante da etapa b; d. ressuspender o pélete; e e. inocular células microbianas do pélete ressuspenso em cada um da pluralidade de poços de um cassete de AST.

   90. Método de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que compreende ainda incubação das células ressuspensas sob condições de promoção de crescimento de micro- organismo.

   91. Método de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o pélete é limpo através de centrifugação invertida.

   92. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 89-91, caracterizado pelo fato de que o pélete é limpo através de ressuspensão seguido por uma etapa de centrifugação adicional, após o que o sobrenadante é removido.

   93. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 89-92, caracterizado pelo fato de que o pélete é ressuspenso em um meio de crescimento.

   94. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 89-93, caracterizado pelo fato de que a amostra é separada em alíquotas em dois ou mais reservatórios independentes após ressuspensão do pélete.

   95. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 89-94, caracterizado pelo fato de que a medição da concentração de células é realizada opticamente através de absorbância ou nefelometria.

   96. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 89-95, caracterizado pelo fato de que a amostra é urina, sangue, fluido sinovial, fluido cérebro-espinhal, esputo, lavagem broncoalveolar, esfregaço nasal ou esfregaço de ferida.

   97. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 89-96, caracterizado pelo fato de que a amostra é sangue que foi culturado em meio de crescimento líquido.

   98. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as condições que promovem crescimento de micro-organismos compreendem uma temperatura de 33-37°C.

   99. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 89-98, caracterizado pelo fato de que as condições que promovem crescimento de micro-organismo compreendem agitação.

   100. Método para preparação de uma amostra suspeita de compreender micro-organismos patogênicos derivada de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. pôr uma amostra dentro de um tubo de centrífuga provido com uma membrana de separação; b. centrifugar a <1000 ×g; c. levar a membrana para ressuspender as bactérias depositadas; e d. medir a concentração de célula ressuspensa.

   101. Método de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que compreende ainda incubar as células ressuspensas sob condições que promovam crescimento de micro- organismo.

   102. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 100-101, caracterizado pelo fato de que a amostra é separada em alíquotas em dois ou mais reservatórios independentes após ressuspensão das bactérias.

   103. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 100-102, caracterizado pelo fato de que a medição de concentração celular é realizada opticamente através de absorbência ou nefelometria.

   104. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 100-103, caracterizado pelo fato de que a amostra é urina, sangue, fluido sinovial, fluido cérebro-espinhal, esputo, lavagem broncoalveolar ou lavagem de ferida.

   105. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 100-104, caracterizado pelo fato de que a amostra é sangue que foi culturado em meio de crescimento líquido.

   106. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 100-105, caracterizado pelo fato de que as condições de promoção de crescimento de micro-organismo uma temperatura de 33- 37º C.

   107. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 100-106, caracterizado pelo fato de que as condições de promoção de crescimento de micro-organismo compreendem agitação.

   108. Método para preparação de uma amostra suspeita de compreender micro-organismos patogênicos derivada de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: e. aplicar uma primeira força centrífuga relativa a uma amostra, dessa maneira formando um primeiro pélete e um primeiro sobrenadante; f. aplicar uma segunda força centrifuga relativa ao primeiro sobrenadante, dessa maneira um segundo pélete e um segundo sobrenadante; g. limpar o segundo pélete resultante da etapa b; h. ressuspender o segundo pélete em uma solução salina tamponada; e i. medir uma concentração de micro-organismos ressuspensos na solução tamponada.

   109. Método de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que compreende ainda incubação dos micro- organismos ressuspenso sob condições de promoção de crescimento de micro-organismo.

   110. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108-109, caracterizado pelo fato de que a primeira força centrifuga relativa é menor do que a segunda força centrífuga relativa.

   111. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108-110, caracterizado pelo fato de que o pélete é limpo através de centrifugação invertida.

   112. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108-111, caracterizado pelo fato de que o pélete é limpo através de ressuspensão seguido por uma etapa de centrifugação adicional, após o que o sobrenadante é removido.

   113. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108-112, caracterizado pelo fato de que o pélete é ressuspenso em um meio de crescimento.

   114. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108-113, caracterizado pelo fato de que a amostra é separada em alíquotas em dois ou mais reservatórios independentes após ressuspensão do pélete.

   115. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108-114, caracterizado pelo fato de que a medição da concentração celular é realizada opticamente através de absorbância ou nefelometria.

   116. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108-115, caracterizado pelo fato de que a amostra é urina, sangue, fluido sinovial, fluido cérebro-espinhal, esputo, lavagem broncoalveolar, esfregaço nasal ou esfregaço de ferida.

   117. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108-116, caracterizado pelo fato de que a amostra é sangue que foi culturado em meio de crescimento líquido.

   118. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108-117, caracterizado pelo fato de que as condições de promoção de crescimento de micro-organismo compreendem uma temperatura de 33-37°C.

   119. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108-118, caracterizado pelo fato de que as condições de promoção de crescimento de micro-organismo compreendem agitação.

   120. Método de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que a determinação de crescimento segue qualquer uma das reivindicações 109-119.

   121. Sistema de separação microbiano in vitro para preparação de uma amostra compreendendo micro-organismos patogênicos derivada de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana, caracterizado pelo fato de que compreende: um módulo de manuseamento de fluido configurado para permitir adição e remoção de solução da amostra;

   uma centrífuga tendo um eixo longitudinal se estendendo através de um rotor rixo da centrífuga, um eixo normal que é normal para o eixo longitudinal e um ângulo do rotor fixo; um vórtex configurado para agitar a amostra; e um aparelho de quantificação celular configurado para medir uma métrica da amostra.

   122. Sistema de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo fato de que o ângulo de cerca de 30º, 45, 60º do eixo normal.

   123. Método para preparação de uma amostra compreendendo micro-organismos patogênicos derivada de um paciente para teste de susceptibilidade antimicrobiana, caracterizado pelo fato de que compreende: transferir a amostra por meio de um módulo de manuseamento de fluido para um tubo de amostra; dispor o tubo de amostra para uma centrífuga tendo um rotor fixado em um ângulo com relação a um eixo normal que é normal para um eixo longitudinal da centrifuga; ativar a centrífuga por um período de tempo; remover uma porção de um fluido da amostra do tubo de amostra; adicionar uma porção de reagente lítico ao tubo de amostra; submeter o tubo de amostra a um vórtex configurado para agitar a amostra; adicionar uma porção de solução salina ou solução tamponada ao tubo de amostra; transferir substancialmente todo o fluido no tubo de amostra para uma cuveta; medir uma métrica da amostra usando um aparelho de quantificação celular óptico em um ou mais comprimentos de onda entre

   500 nm e 700 nm; diluir a suspensão para um nível predefinido; verificar uma métrica da amostra usando o aparelho de quantificação celular; e transferir o fluido para um tubo de saída.

   Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 85/107 PÔR SOBRE- INVERTER

   NADANTE EM EM TUBO TUBO LIMPO DE 50 mL e CENTRI- E CENTRI- CENTRI-

   FUGAR FUGAR POR DECANTAR REMOVER

   FUGAR POR POR 5 MIN 5 MIN @ O SOBRE- DO TUBO 1 MIN @ @ 500rcf 1350rcf NADANTE DE 50 mL 200rcf 1/17

   Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 86/107

   USAR SOLUÇÃO

   SALINA PARA

   CENTRIFUGAR REMOVER POR 5 MIN BACTÉRIAS DA INOCULAR @ 500rcf MEMBRANA PLACA DE AST 2/17

   Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 87/107 PÔR SOBRE-

   NADANTE INVERTER

   EM TUBO EM TUBO LIMPO E DE 50 mL e CENTRI- CENTRIFU- CENTRIFU- FUGAR POR GAR POR 5 DECANTAR GAR POR 1 REMOVER 5 MIN @ MIN @ O SOBRE- MIN @ DO TUBO 500rcf 1350rcf NADANTE 200rcf DE 50 mL 3/17

   Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 88/107

   LAVAR

   ASPIRATO

   COLETAR PELETE CENTRIF- CENTRIFU- SOBRENA- LAVAR O RESSUS-

   UGAR 4/17

   GAR DANTE PELETE PENSO EM SOBRENA- SANGUE DANTE 270g 2370g 50 ul DE 500g POR POR 5 MIN POR 5 MIN SOLUÇÃO 2 MIN SALINA

   Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 89/107 PONTA ÚNICA- CENTRIFUGAR 1-500

   TRANSFERIR SARSTEDT TUDO PARA O RCF POR 2 MINUTOS TUBO SARSTEDT ADICIONAR 2 mL DE LISE CENTRIFUGAR 2-2370 5-MONOVETTE SCREW TUBO DISPÔR O SOBRENADANTE- CAP 10 mL DA GARRAFA A GRANEL RCF POR 5 MINUTOS TUBO CAP 9 mL DETECTAR O NÍVEL DE

   PARA O TUBO LÍQUIDO E REMOVER 8,0 mL DO TUBO 5/17 DISPÔR O SOBRENADANTE- ADICIONAR 2 mL CENTRIFUGAR 2-2370 RCF POR DISPÔR O ADICIONAR 1 mL

   DETECTAR O NÍVEL DE DE SOLUÇÃO TRANSFERIR TUDO 5 MINUTOS SOBRENADANTE- DE SOLUÇÃO SALINA

   LÍQUIDO E REMOVER SALINA DA PARA A CUVETA

   DETECTAR O NÍVEL DE DA GARRAFA A

   TODO DO FLUIDO GARRAFA A

   LÍQUIDO E REMOVER GRANEL

   GRANEL

   TODO DO FLUIDO LEITURA DE VERIFICAR A TRANSFERIR 1 mL

   ABSORBÂNCIA CONCENTRAÇÃO

   DILUIR CONFORME PARA TUBO

   NECESSÁRIO PARA DE SAÍDA IGUAL A 0,2-0,65 MCFARLAND-MISTURAR COM A PONTA 5X

   DADOS REPRESENTATIVOS Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 91/107 PARA AMOSTRA 1 DE E. COLI

   GENTAMICINA LEVOFLOXACINA

   NITROFURANTOÍNA PENICILINA TETRACICLINA 7/17

   DE UM DIA PARA O OUTRO

   DADOS REPRESENTATIVO Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 92/107 PARA AMOSTRA 2 DE E. COLI

   GENTAMICINA LEVOFLOXACINA

   NITROFURANTOÍNA PENICILINA TETRACICLINA 8/17

   DE UM DIA PARA O OUTRO

   Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 93/107

   DADOS REPRESENTATIVOS PARA K. PNEUMONIAE

   GENTAMICINA

   LEVOFLOXACINA

   PENICILINA 9/17

   TETRACICLINA

   NITROFURANTOÍNA

   DE UM DIA PARA O OUTRO

   MCFARLAND

   INICIAL

   MCFARLAND

   INICIAL EC 25922: OD 600 VS TEMPO DE CENTRIFUGAÇÃO

   BACTERIANA CALCULADA

   CONCENTRAÇÃO TEMPO DE CENTRIFUGAÇÃO (†-0, SOLUÇÃO INICIAL) AS 29213: OD 600 VS TEMPO DE CENTRIFUGAÇÃO

   BACTERIANA CALCULADA

   CONCENTRAÇÃO TEMPO DE CENTRIFUGAÇÃO (†-0, SOLUÇÃO INICIAL)

   AMPICILINA/SULBACTAM CEFUROXIMA CEFTAZIDINA/AVIBACTAM Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 96/107 12/17

   CEFOXITINA COLISINA DOXICICLINA

   DE UM DIA PARA O OUTRO

   OXACICLINA ERAVACICLINA LINEZOLIDA Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 97/107 13/17 OXACICLINA QUINUPRISTINA/DALFOPRISTINA TEDIZOLIDA

   DE UM DIA PARA O OUTRO

   CINDAMICINA CEFTAROLINA DAPTOMICINA Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 98/107 14/17 ERITROMICINA LINEZOLIDA Vancomicina

   DE UM DIA PARA O OUTRO

   CINDAMICINA CEFTAROLINA DAPTOMICINA Petição 870200114595, de 10/09/2020, pág. 99/107 15/17 LINEZOLIDA Vancomicina

   ERITROMICINA

   DE UM DIA PARA O OUTRO