ES2862345T3 - Métodos rápidos para probar la susceptibilidad antimicrobiana - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos que comprende: añadir un antimicrobiano a una suspensión líquida de microorganismos para formar una suspensión líquida de microorganismos en presencia del antimicrobiano; añadir un agente de señalización a la suspensión líquida de microorganismos; incubar la suspensión líquida de microorganismos en presencia del antimicrobiano y el agente de señalización en condiciones que promuevan el crecimiento de los microorganismos, en donde el agente de señalización es capaz de unirse a una superficie de los microorganismos por asociación y/o intercalación; separar los microorganismos unidos por el agente de señalización del agente de señalización no unido; y determinar los niveles de señal asociados con los microorganismos en comparación con uno o más controles, en donde el número de agentes de señalización que se asocian con y/o se intercalan en la superficie del microorganismo es proporcional al área superficial del microorganismo, lo que determina así la susceptibilidad antimicrobiana de los microorganismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos rápidos para probar la susceptibilidad antimicrobiana

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reclama prioridad y beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. 62/281,698, presentada el 21 de enero de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. 62/298,821, presentada el 23 de febrero de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. 62/326,545, presentada el 22 de abril de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. 62/338,376, presentada el 18 de mayo de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. 62/370,579, presentada el 3 de agosto de 2016; y la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. 62/383,198, presentada el 2 de septiembre de 2016.

Antecedentes de la invención

Las infecciones microbianas resistentes a antimicrobianos se asocian con resultados clínicos deficientes que incluyen un aumento de la morbilidad, mortalidad y costos de atención médica entre los pacientes infectados. La prevalencia de estos organismos en tales instalaciones en los Estados Unidos ha aumentado constantemente durante los últimos 30 años. La prueba de susceptibilidad antimicrobiana fenotípica (AST) de microorganismos es fundamental para informar a los médicos sobre los regímenes terapéuticos adecuados. Los métodos y sistemas para determinar el estado de resistencia a antibióticos de los microorganismos se divulgan en el documento WO2010/129779. Los métodos, composiciones, estuches y sistemas para la determinación rápida de la susceptibilidad a los antibióticos de un microbio dentro de las horas posteriores a que una muestra se recolecta, se divulgan en el documento WO 2013/130875. El documento WO 2007/136781 describe métodos y estuches para detectar rápidamente tuberculosis u otra infección por micobacterias en una muestra de esputo. Los bacteriófagos se divulgan en el documento WO 2008/064241 en un método para determinar la presencia o ausencia de un microorganismo diana. Puede añadirse un antibiótico a, al menos, una porción de una muestra sobre la que se aplica el método para determinar la susceptibilidad a los antibióticos de los microorganismos diana. Ren y otros ha descrito un ensayo basado en perlas magnéticas y fluroinmunoensayo de resolución temporal para detectar el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en suero humano (Ren y otros (2014): 29(6); 591-597; Luminescence; A rapid and sensitive method based on magnetic beads for the detection of hepatitis B virus surface antigen in human serum), mientras que Taherkhani y otros ha descrito el uso de bacterias magnetotácticas como portadores terapéuticos (Taherkhani y otros (2014): 28 (8); 5049-5060; ACS Nano; Covalent binding of nanoliposomes to the surface of magnetotactic bacteria for the synthesis of self-propelled therapeutic agents). Se ha considerado un método de luminiscencia sensibilizada con europio (ESL) para determinar los residuos de tetraciclina en la leche (Morandi y otros (2008); 2(4); 271-281; Food Analytical Methods; Development and Validation of Europium-Sensitized Luminscence (ESL) Method for the determination of Tetracycline Residues in Milk.

Mediante el uso de los métodos actuales, la determinación de AST típicamente requiere un mínimo de ocho horas, lo que lo convierte en proceso de toda la noche debido al trabajo por turnos en muchos laboratorios de microbiología clínica. Mientras se espera una determinación a partir de los métodos actuales de AST, a los pacientes se les administran a menudo antimicrobianos de amplio espectro que a menudo tienen efectos perjudiciales significativos sobre la salud del paciente y/o contribuyen a la creciente epidemia de resistencia a los antimicrobianos. Además, este retraso en la obtención de información precisa sobre el tratamiento antimicrobiano aumenta las estadías del paciente en los hospitales, lo que aumenta los costos y las molestias para el paciente.

Por consiguiente, existe la necesidad de un método que determine rápidamente la susceptibilidad antimicrobiana de una infección microbiana. El método descrito aquí es además ventajoso porque aborda esta necesidad de una manera rentable porque es compatible con los componentes de hardware de ensayo existentes.

Resumen de la invención

La presente invención permite la determinación rápida de la susceptibilidad a los antibióticos de las infecciones microbianas. La invención se basa en parte en el sorprendente descubrimiento de ensayos de unión a superficie no específicos que proporcionan determinaciones precisas y rápidas de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) en menos de doce horas y, específicamente, en menos de cuatro horas. La presente invención ("AST rápida") proporciona resultados precisos que son consistentes con los resultados obtenidos mediante el uso de los métodos de referencia del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) cuando se prueban con múltiples antimicrobianos y en una pluralidad de microorganismos; sin embargo, la presente invención requiere significativamente menos tiempo para obtener resultados que los métodos del CLSI. Además, la presente invención diferencia con precisión la MIC de un antimicrobiano para cepas microbianas clínicamente relevantes que son resistentes a uno o más antimicrobianos y la MIC del antimicrobiano para cepas del mismo microorganismo que son sensibles a los antimicrobianos. Además, la presente invención puede incluir el uso de agentes de señalización (por ejemplo, compuestos de europio) que se unen a microorganismos de manera no específica en lugar de específicamente (por ejemplo, a través de grupos químicamente conservados o sitios de unión bioquímicamente conservados en microorganismos), lo que expande así la generalización de la presente invención a cualquier microorganismo y permite el inicio de un tratamiento apropiado sin necesidad de identificar primero el microorganismo infeccioso particular. Además, la presente invención permite la amplificación de la señal de manera que los microbios puedan detectarse rápidamente a concentraciones más bajas, por ejemplo, a partir de un cultivo diluido de microorganismos o mediante una muestra biológica de un paciente. Además, la presente invención puede usar formulaciones de europio como resto químico, lo que expande así el rango dinámico de los métodos y permite determinaciones más precisas a partir de una variedad de muestras microbianas. Finalmente, la presente invención es compatible con los equipos existentes, lo que permite una rápida adopción en los laboratorios clínicos actuales. Por consiguiente, la presente invención, en una cantidad de tiempo y gasto muy reducida, en relación con los métodos estándar, puede proporcionar a un paciente un régimen de tratamiento apropiado, es decir, un antimicrobiano específico y en una dosificación particular. Por tanto, la presente invención mejorará los resultados de los pacientes, reducirá los costes hospitalarios y ayudará a reducir la evolución adicional de microorganismos resistentes a los antimicrobianos; por tanto, la presente invención representa un avance significativo en el campo de AST.

La invención se expone en la reivindicación 1 adjunta. Las características preferidas de la invención se establecen en las reivindicaciones dependientes adjuntas.

Cualquier aspecto o caso descrito en la presente descripción puede combinarse con cualquier otro aspecto o caso como se divulga en la presente descripción. Si bien la divulgación se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la divulgación, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las características anteriores y adicionales se apreciarán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada cuando se tome junto con los dibujos adjuntos. Sin embargo, los dibujos son solo para fines ilustrativos; no para limitación.

Figura 1 es un esquema que muestra las etapas generalizadas de la presente invención.

Figura 2A a Figura 2D son gráficos e ilustraciones que muestran características clave de aspectos de la presente invención ("AST rápida").

Figura 3 es un esquema que compara las etapas requeridas en los sistemas de prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) usados actualmente y aspectos de la presente invención.

Figura 4 es un gráfico que muestra el tiempo de demora requerido para obtener resultados mediante el uso de un sistema de AST usado actualmente (es decir, Vitek2 de BioMeriéux).

Figura 5 es un gráfico que muestra una comparación de una determinación de concentración mínima inhibitoria (MIC) de clindamicina en Staphylococcus aureus (ATCC cepa 29213) mediante el uso de la presente invención (técnica "AST rápida") y un crecimiento estándar durante la noche seguido de lectura de densidad óptica (DO) a 600 nm. Los datos mostrados para la "AST rápida", es a partir del punto de cinco minutos después del inicio de la incubación con la solución de detección y representa las desviaciones promedio y estándar de cuatro pocillos, con valores para cada tipo de ensayo en relación con un control libre de antimicrobianos.

Figura 6 es un gráfico que muestra una comparación de una determinación de MIC de ceftazidima en Pseudomonas aeruginosa (ATCC cepa 27853) mediante el uso de la presente invención (técnica "AST rápida") y un crecimiento estándar durante la noche seguido de lectura de densidad óptica (DO) a 600 nm. Los datos mostrados representan las desviaciones promedio y estándar de cuatro pocillos, con valores para cada tipo de ensayo en relación con un control libre de antimicrobianos.

Figura 7 es un gráfico que muestra una comparación de la determinación de MIC mediante el uso de la presente invención ("AST rápida") para dos cepas de Pseudomonas aeruginosa: una cepa susceptible (ATCC cepa 27853) y una cepa resistente (ATCC cepa BAA-2108). Los datos mostrados representan el promedio de cuatro pocillos, con valores para cada ensayo en relación con un control libre de antimicrobianos.

Figura 8 es una tabla que resume los datos del ejemplo 2. Compara las llamadas MIC mediante la técnica de "AST rápida" con aquellas del procedimiento estándar nocturno DO600. Los datos mostrados representan el promedio de cuatro pocillos, con valores para cada tipo de ensayo en relación con un control libre de antimicrobianos.

Figura 9 es un gráfico que muestra una comparación de la señal óptica sin procesar frente a la concentración de Staphylococcus aureus (en UFC/mL) para dos técnicas: la presente invención (técnica de amplificación "AST rápida") y la técnica de densidad óptica estándar a 600 nm (DO600).

Figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de la MIC para la presente invención (el método "AST rápida") en comparación con el método de referencia del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) para siete especies bacterianas patógenas.

Figura 11 es una tabla que identifica las bacterias, los antimicrobianos y el agente de señalización/resto químico usado en el ejemplo 4.

Figura 12A a Figura 12C son tablas que muestran resultados representativos de SensiTitre® para S. aureus (Figura 12A) y K. pneumonía (Figura 12B). No se presentan datos mediante el uso de la presente invención para el experimento de nitrofurantonina S. aureus porque solo dos pocillos se dedicaron a este antimicrobiano.

Figura 13A a Figura 13C es un gráfico que muestra una comparación entre los resultados de MIC obtenidos por la presente invención y el método de referencia de CLSI para los antimicrobianos oxacilina (Figura 13A), vancomicina (Figura 13B) y levofloxacina (Figura 13C) en cepas clínicas de S. aureus.

Figura 14A a Figura 14D es un gráfico que muestra una comparación entre los resultados de MIC obtenidos por la presente invención y el método de referencia de CLSI para los antimicrobianos ampicilina (Figura 14A), ciprofloxacina (Figura 14B), imipenem (Figura 14C) y gentamicina (Figura 14D) en cepas clínicas de E. colí.

Figura 15 es un gráfico que muestra que la presente invención ("AST rápida") produce consistentemente resultados de MIC similares a aquellos obtenidos por el método de referencia estándar de CLSI en el transcurso de un mes en la misma especie clínica de S. aureus.

Figura 16 a Figura 23 son gráficos que comparan los sensibles para una pluralidad de antimicrobianos para una cepa de E. colí químicamente sensible ("QC 25922") y una cepa resistente a los antimicrobianos clínicamente relevante ("Clínica"). Los antimicrobianos usados son Imipenem (Figura 16); Ampicilina (Figura 17); Ceftazidima (Figura 18); Gentamicina (Figura 19); Levofloxacina (Figura 20); Trimetoprima/Sulfametoxazol (SXT) (Figura 21); Ciprofloxacino (Figura 22); y Ceftriaxona (Figura 23).

Figura 24 a Figura 26 son gráficos que comparan los sensibles para una pluralidad de antimicrobianos para una cepa de S. aureus químicamente sensible ("QC cepa 29213"). Los antimicrobianos usados son Vancomicina (Figura 24); Penicilina (Figura 25); y Teicoplanina (Figura 26).

Figura 27 y Figura 28 son gráficos que muestran resultados de MIC mediante el uso de un método de la presente invención directamente en una muestra clínica y comparados con los resultados clínicos obtenidos con un Beckman-Coulter MicroScan Walkaway (en el que se realiza una etapa de subcultivo antes del crecimiento durante la noche). Figura 29 es un gráfico que muestra la fluorescencia detectada (a través de un agente de señalización que comprende europio y el uso de aglutinina de germen de trigo, que se une específicamente a bacterias grampositivas) de una solución bacteriana grampositiva en relación con la concentración de bacterias en la solución. Figura 30 es un gráfico que muestra la fluorescencia detectada (a través de un agente de señalización que comprende europio y uso de polimixina B, que se une específicamente a bacterias gramnegativas) de una solución bacteriana gramnegativa en relación con la concentración de bacterias en la solución.

Figura 31 son gráficos que comparan los valores de MIC obtenidos cuando se usa una formulación de europio unido a un anticuerpo como agente de señalización con los valores de MIC obtenidos cuando se usa un anticuerpoperoxidasa de rábano picante (HRP) como agente de señalización. La MIC para SXT para esta cepa clínica de S. aureus fue <0,5 pg/mL mediante el método del CLSI durante la noche.

Figura 32 son gráficos que muestran las unidades de fluorescencia relativa (RFU) obtenidas para concentraciones bacterianas específicas para dos formulaciones de europio que se unen de forma no específica a superficies bacterianas.

Figura 33 son gráficos que muestran las RFU obtenidas para concentraciones bacterianas específicas de dos especies bacterianas para dos formulaciones de Europio que se unen de forma no específica a superficies bacterianas.

Figura 34 y Figura 35 son gráficos que muestran las RFU obtenidas para concentraciones bacterianas específicas de diversas especies bacterianas para una formulación de Europio que se unen de forma no específica a superficies bacterianas.

Figura 36A a Figura 36C son gráficos que muestran las RFU obtenidas para concentraciones bacterianas específicas de diversas especies bacterianas para una formulación de Europio que se unen de forma no específica a superficies bacterianas cuando se usan diversos lavados que comprenden glutaraldehído.

Figura 37 son gráficos que muestran las RFU obtenidas para concentraciones bacterianas específicas de E. coli para una formulación de europio que se une de forma no específica a superficies bacterianas mediante el uso de un proceso de dos etapas que comprende NH2-PEG-Biotina seguido de estreptavidina-europio (Eu-SAv).

Figura 38 es un gráfico que muestra las RFU obtenidas para concentraciones bacterianas específicas de E. coli para una formulación de europio que se une de forma no específica a superficies bacterianas mediante el uso de un proceso de dos etapas que comprende NHS-LC-LC-Biotina seguido de Eu-SAv.

Figura 39 es un esquema que ilustra el efecto de confusión que tiene el crecimiento filamentoso sobre las determinaciones sobre la base volumétrica de las susceptibilidades antimicrobianas de los microorganismos. Las bacterias susceptibles que entran en el crecimiento filamentoso pueden parecer falsamente resistentes debido a su mayor volumen.

Figura 40 es un esquema que ilustra un método para minimizar la interferencia de microorganismos filamentosos en las determinaciones de AST.

Figura 41 es un gráfico que muestra el resultado de un ensayo mediante el uso de un agente de señalización que comprende una nanopartícula fluorescente para E. coli y E. coli resistente a ampicilina tratadas con y sin 100 pg/mL de ampicilina (una concentración muy por encima de la MIC).

Figura 42 es un gráfico que muestra el resultado de un ensayo mediante el uso de un agente de señalización que comprende una nanopartícula fluorescente para E. coli y con concentraciones variables de ampicilina. Las barras de error muestran la desviación estándar de tres réplicas.

Figura 43 es un gráfico que muestra la capacidad de las perlas magnéticas funcionalizadas con E. coli son capaces de unirse y aislar bacterias intactas a partir de una solución.

Figura 44 es un gráfico que muestra el número de bacterias intactas que se aíslan mediante perlas magnéticas funcionalizadas a partir de soluciones que comprenden cantidades variables de un antimicrobiano.

Figura 45 incluye gráficos que comparan el número de bacterias intactas que se aíslan mediante centrifugación frente a perlas magnéticas funcionalizadas a partir de soluciones que comprenden cantidades variables de un antimicrobiano (aquí, vancomicina "VAN"). La MlC para VAN para esta cepa clínica de S. aureus fue de 8 pg/mL mediante el método del CLSI durante la noche.

Figura 46A a Figura 46C muestran el diseño y funcionamiento de nanoetiquetas de ligando tetraamino metalorgánico (TAML®). Figura 46A es un esquema que muestra los componentes de la nanoetiqueta. Figura 46B es un gráfico que muestra la comparación catalítica de HRP y TAML (recuadro); las líneas discontinuas son los mejores ajustes lineales para cada conjunto de datos con R2 de 0,997 para HRP y 0,987 para TAML. Figura 46C es un gráfico que muestra la comparación de nanoetiqueta TAML frente a HRP para el inmunoensayo de toxina A de C. difficile. En la Figura 46B y Figura 46C, las señales se normalizaron a "1" a concentración cero, los errores se propagaron y las barras de error representan ± 1 desviación estándar. Los experimentos se repitieron tres veces por triplicado con resultados similares.

Definiciones

Para que la presente invención se entienda más fácilmente, primero se definen ciertos términos a continuación. Las definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen a lo largo de la descripción. Como se usa en esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un," "una" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente de cualquier otra manera.

A menos que se indique específicamente o sea obvio a partir del contexto, como se usa en la presente descripción, se entiende que el término "o" es inclusivo y cubre tanto "o" como "y".

Los términos "por ejemplo" y "es decir", tal como se usan en la presente descripción, se usan simplemente a modo de ejemplo, sin limitación intencionada y no deben interpretarse como referencias únicamente aquellos elementos enumerados explícitamente en la descripción.

Los términos "uno o más", "al menos uno", "más de uno" y similares, se entiende que incluyen, pero no se limitan a, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más y cualquier número intermedio.

Por el contrario, el término "no más de" incluye cada valor menor que el valor indicado. Por ejemplo, "no más de 100 nucleótidos" incluye 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 y 0 nucleótidos.

Los términos "pluralidad", "al menos dos", "dos o más", "al menos un segundo" y similares, se entiende que incluyen, pero no se limitan a, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 or 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más y cualquier número intermedio.

A lo largo de la descripción, la palabra "que comprende", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas establecidas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

A menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" se entiende dentro de un rango de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar de la media. "Aproximadamente" puede entenderse estar dentro del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o 0,001 % del valor indicado. A menos que quede de cualquier otra manera claro a partir del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en la presente descripción están modificados por el término "aproximadamente".

Una superficie puede ser una superficie externa de la pared celular, envoltura celular, membrana plasmática o cápsula celular; superficie interna de la pared celular, envoltura celular, membrana plasmática o cápsula celular; o dentro de una pared celular, envoltura celular, membrana plasmática o cápsula celular. La superficie puede incluir estructuras de la célula que se proyectan extracelularmente, que incluyen pero no se limitan a cilio, pilus y flagelo. La superficie puede incluir un orgánulo. La superficie puede incluir proteínas transmembrana, proteínas de la pared celular, proteínas extracelulares, proteínas intracelulares, polisacáridos asociados extracelulares, polisacáridos asociados intracelulares, lípidos extracelulares, lípidos intracelulares, lípidos de membrana, lípidos de la pared celular, proteínas, polisacáridos y/o lípidos integral o asociado con una envoltura celular. La superficie puede incluir un ácido nucleico.

La superficie puede incluir una biomolécula a la que se une o asocia el agente de señalización. Las biomoléculas ilustrativas incluyen peptidoglicanos, mureínas, manoproteínas, porinas, beta-glucanos, quitina, glicoproteínas, polisacáridos, lipopolisacáridos, lipooligosacáridos, lipoproteínas, endotoxinas, ácidos lipoteicoicos, ácidos teicoicos, lípido A, dominios de unión de carbohidratos, bombas de eflujo, otras proteínas asociadas a la pared celular y/o a la membrana celular, otros fosfolípidos aniónicos y una combinación de los mismas.

El crecimiento, como en el crecimiento de microorganismos, incluye una proliferación en número, un aumento de longitud, un aumento en volumen y/o un aumento en el contenido de ácidos nucleicos y/o proteínas de los microorganismos.

Los controles pueden incluir antimicrobianos a los que el microorganismo no es susceptible. Como ejemplos, si el ensayo se usa para determinar la susceptibilidad de bacterias grampositivas, entonces los controles (y las incubaciones de la prueba) pueden incluir uno o más antimicrobianos que se dirigen a bacterias gramnegativas y si el ensayo se usa para determinar la susceptibilidad de microorganismos eucariotas, el control (y las incubaciones de prueba) pueden incluir uno o más antimicrobianos antibacterianos.

Un control puede ser un control positivo medido a partir de microorganismos en condiciones de cualquier otra manera idénticas pero sin antimicrobianos o con uno o más antimicrobianos a los que los microorganismos no son susceptibles.

Se puede medir un control a partir de microorganismos en condiciones de cualquier otra manera idénticas pero sin nutrientes.

Se puede medir un control a partir de microorganismos en condiciones de cualquier otra manera idénticas con una o más toxinas que se sabe que inhiben el crecimiento de los microorganismos.

Los controles pueden ser controles históricos. Aquí, las incubaciones de prueba pueden realizarse después de que se hayan realizado las incubaciones del control.

Alternativamente, los controles pueden realizarse en un cartucho distinto del cartucho que comprende las incubaciones de prueba.

Por "procesado" se entiende una etapa que aísla microorganismos de una muestra biológica, una etapa que aumenta la concentración de microorganismos obtenidos de una muestra biológica y/o una etapa que aumenta el número de microorganismos obtenidos de una muestra biológica, por ejemplo, al cultivar los microorganismos en condiciones que favorezcan la proliferación de los microorganismos.

Los compuestos de esta divulgación incluyen aquellos descritos de forma general en la presente descripción, y se ilustran además mediante las clases, subclases y especies divulgadas en la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, se aplicarán las siguientes definiciones a menos que se indique de cualquier otra manera. Para efectos de esta invención, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75ta Ed. Además, los principios generales de la química orgánica se describen en "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y "March's Advanced Organic Chemistry", 5ta Ed., Ed.: Smith, M.B. y March, J., John Wiley & Sons, Nueva York: 2001. El término "heterociclo", "heterociclilo" o "heterocíclico" como se usa en la presente descripción significa sistemas de anillos no aromáticos, monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos en los que uno o más miembros del anillo son un heteroátomo seleccionado independientemente. En algunos casos, el grupo "heterociclo", "heterociclilo" o "heterocíclico" tiene de tres a catorce miembros del anillo en los que uno o más miembros del anillo es un heteroátomo seleccionado independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo, y cada anillo en el sistema contiene de 3 a 7 miembros del anillo.

El término "heteroátomo" se refiere a uno o más de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo y silicio (que incluye, cualquier forma oxidada de nitrógeno, azufre, fósforo o silicio; la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico o; un nitrógeno sustituible de un anillo heterocíclico, por ejemplo N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR+ (como en pirrolidinilo N-sustituido)).

El término "alcoxi" o "tioalquilo", como se usa en la presente descripción, se refiere a un grupo alquilo, como se definió previamente, unido a través de un átomo de oxígeno ("alcoxi") o azufre ("tioalquilo").

Los términos "haloalquilo", "haloalquenilo", "haloalifático" y "haloalcoxi" significan alquilo, alquenilo o alcoxi, según sea el caso, sustituido con uno o más átomos de halógeno. Este término incluye grupos alquilo perfluorados, tales como -CF3 y -CF2CF3.

Los términos "halógeno", "halo" y "hal" significan F, Cl, Br o I.

Los términos "arilo" y "ar-", usados solos o como parte de un resto más grande, por ejemplo, "aralquilo", "aralcoxi" o "ariloxialquilo", se refieren a un resto de hidrocarburo aromático C6-14 opcionalmente sustituido que comprende de uno a tres anillos aromáticos. Por ejemplo, el grupo arilo es un grupo arilo C6-10 (es decir, fenilo y naftilo). Los grupos arilo incluyen, sin limitación, fenilo, naftilo o antracenilo opcionalmente sustituidos. Los términos "arilo" y "ar-", como se usan en la presente descripción, también incluyen grupos en los que un anillo arilo se fusiona con uno o más anillos cicloalifáticos para formar una estructura cíclica opcionalmente sustituida tal como un anillo tetrahidronaftilo, indenilo o indanilo. El término "arilo" puede usarse indistintamente con los términos "grupo arilo", "anillo arilo" y "anillo aromático".

Los compuestos de esta divulgación pueden existir en forma libre para el tratamiento, o cuando sea apropiado, como una sal farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en la presente descripción, el término "aromático" incluye grupos arilo y heteroarilo como se describe generalmente a continuación y en la presente descripción

El término "alifático" o "grupo alifático", como se usa en la presente descripción, significa un hidrocarburo C1-12 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación. Por ejemplo, los grupos alifáticos adecuados incluyen grupos alquilo, alquenilo y alquinilo lineales o ramificados opcionalmente sustituidos. A menos que se especifique de cualquier otra manera, en diversos casos, los grupos alifáticos tienen 1-12, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4, 1-3 o 1-2 átomos de carbono. Es evidente para un experto en la técnica que, en algunos casos, el grupo "alifático" descrito en la presente descripción puede ser bivalente.

El término "alquilo", usado solo o como parte de un resto más grande, se refiere a un grupo hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, saturado que tiene 1-12, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4, 1-3 o 1-2 átomos de carbono.

El término "alquenilo", usado solo o como parte de un resto más grande, se refiere a un grupo hidrocarburo de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido que tiene al menos un doble enlace y que tiene 2-12, 2-10, 2-8, 2-6, 2-4 o 2-3 átomos de carbono.

El término "alquinilo", usado solo o como parte de un resto más grande, se refiere a un grupo hidrocarburo de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido que tiene al menos un triple enlace y que tiene 2-12, 2-10, 2-8, 2-6, 2-4 o 2-3 átomos de carbono.

A menos que se indique de cualquier otra manera, las estructuras representadas en la presente descripción también pretenden incluir todas las formas isoméricas (por ejemplo, enantioméricas, diastereoméricas y geométricas (o conformacionales)) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico, isómeros de doble enlace (Z) y (E) e isómeros conformacionales (Z) y (E). Por tanto, los isómeros estereoquímicos individuales así como las mezclas enantioméricas, diastereoméricas y geométricas (o conformacionales) de los presentes compuestos están dentro del alcance de la divulgación. A menos que se indique de cualquier otra manera, todas las formas tautoméricas de los compuestos de la divulgación están dentro del alcance de la divulgación. Además, a menos que se indique de cualquier otra manera, las estructuras representadas en la presente descripción también pretenden incluir compuestos que difieren solo en la presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras donde hay un reemplazo de hidrógeno por deuterio o tritio, o un reemplazo de un carbono por un carbono enriquecido con 13C o 14C están dentro del alcance de esta invención. Dichos compuestos son útiles, como ejemplo no limitativo, como herramientas o sondas analíticas en ensayos biológicos:

Debe entenderse que, cuando un compuesto divulgado tiene al menos un centro quiral, la presente divulgación abarca un enantiómero de inhibidor libre a partir del isómero óptico correspondiente, mezcla racémica del inhibidor y mezclas enriquecidas en un enantiómero con respecto a su isómero óptico correspondiente. Cuando una mezcla está enriquecida en un enantiómero con respecto a sus isómeros ópticos, la mezcla contiene, por ejemplo, un exceso enantiomérico de al menos 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, 99 % o 99,5 %.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente el experto en la técnica a la que pertenece esta invención y como se usa en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, la presente descripción, que incluye definiciones, se controlará.

Descripción detallada de la invención

La presente invención permite la determinación rápida de la susceptibilidad a los antibióticos de las infecciones microbianas. La invención se basa en parte en el sorprendente descubrimiento de ensayos de unión a superficie no específicos que proporcionan determinaciones precisas y rápidas de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) en menos de doce horas y, específicamente, en menos de cuatro horas. La presente invención ("AST rápida") proporciona resultados precisos que son consistentes con los resultados obtenidos mediante el uso de los métodos de referencia del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) y cuando se prueba con múltiples antimicrobianos y en una pluralidad de microorganismos; sin embargo, la presente invención requiere significativamente menos tiempo para obtener resultados que los métodos del CLSI. Además, la presente invención diferencia con precisión la MIC de un antimicrobiano para cepas microbianas clínicamente relevantes que son resistentes a uno o más antimicrobianos y la MIC del antimicrobiano para cepas del mismo microorganismo que son sensibles a los antimicrobianos. Además, la presente invención puede incluir el uso de agentes de señalización (por ejemplo, compuestos de europio) que se unen a microorganismos de manera no específica en lugar de específicamente (por ejemplo, a través de grupos químicamente conservados o sitios de unión bioquímicamente conservados en microorganismos), lo que expande así la generalización de la presente invención a cualquier microorganismo y permite el inicio de un tratamiento apropiado sin necesidad de identificar primero el microorganismo infeccioso particular. Además, la presente invención permite la amplificación de la señal de manera que los microbios puedan detectarse rápidamente a concentraciones más bajas, por ejemplo, a partir de un cultivo diluido de microorganismos o mediante una muestra biológica de un paciente. Además, la presente invención puede usar formulaciones de europio como resto químico, lo que expande así el rango dinámico de los métodos y permite determinaciones más precisas a partir de una variedad de muestras microbianas. Finalmente, la presente invención es compatible con los equipos existentes, lo que permite una rápida adopción en los laboratorios clínicos actuales. Por consiguiente, la presente invención, en una cantidad de tiempo y gasto muy reducida, en relación con los métodos estándar, puede proporcionar a un paciente un régimen de tratamiento apropiado, es decir, un antimicrobiano específico y en una dosificación particular. Por tanto, la presente invención mejorará los resultados de los pacientes, reducirá los costes hospitalarios y ayudará a reducir la evolución adicional de microorganismos resistentes a los antimicrobianos; por tanto, la presente invención representa un avance significativo en el campo de AST.

Los aspectos de la presente invención proporcionan resultados de AST fenotípicos precisos y de bajo coste mediante la amplificación química de las superficies de los microorganismos. Este enfoque novedoso ofrece dos avances principales sobre los métodos usados actualmente: 1) Cuantificación del crecimiento de microorganismos al determinar el área superficial relativa, que supera las limitaciones de las plataformas actuales con respecto a los regímenes de crecimiento filamentoso, como son bien conocidos por los expertos en la técnica; y 2) Amplificación de microorganismos con sensibilidad óptima en el rango de 1 * 103 a 1 * 108 UFC/mL mediante el uso de equipo de detección óptica estándar.

Como se divulga en la presente descripción (por ejemplo, en los Ejemplos), se ha demostrado que la presente invención proporciona resultados equivalentes al estándar de oro para una amplia gama de especies de microorganismos, incluidos los seis patógenos (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y species de Enterobacter) ("ESKAPE"). Debido a la generalidad de la presente invención, es flexible, ya que puede adaptarse fácil y económicamente a nuevas cepas de especies de microorganismos y pruebas de diagnóstico.

La presente invención proporciona AST fenotípicos de bajo costo a partir de aislados de colonias microbianas estándar o de muestras de cultivos directos de sangre positiva, en menos de 8 horas, preferentemente menos de 5 horas. Esto permite que los laboratorios de microbiología clínica estándar obtengan resultados de AST fenotípicos en el mismo turno. Los ejemplos de trabajo a continuación demuestran que la amplificación química de las superficies de los microorganismos produce una concentración mínima inhibitoria (MIC) precisa y llamadas de puntos de interrupción en menos de cuatro horas. Esto acortará los tiempos de espera actuales por más de veinte horas y coincidirá con las identificaciones de MALDI-TOF de cultivo directo de sangre positiva que se acercan actualmente a los ensayos de la FDA, así como con las plataformas de identificación de PCR multiplex de cultivo directo de sangre positiva que ya han obtenido la autorización de la FDA. Este diseño permite que la presente invención (plataforma "AST rápida") rompa el equilibrio tradicional entre velocidad y costo. La presente invención es compatible tanto con formatos de microplaca estándar (por ejemplo, que tienen 6, 12, 24, 48, 96, 384 o 1536 pocillos) como con detectores ópticos convencionales.

La identificación y las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (AST) del patógeno invasor con rapidez y precisión permiten la administración oportuna del agente terapéutico más efectivo. Dicho tratamiento mejora la infección, reduce la duración de la estancia de los pacientes hospitalizados y disminuye el tiempo que los pacientes están sujetos a antimicrobianos de amplio espectro, esto último que contribuye a la epidemia mundial de resistencia a los antimicrobianos. Por el contrario, la espera de más de treinta horas actualmente aceptada para la identificación de microorganismos y los resultados de susceptibilidad requiere el uso excesivo de antimicrobianos de amplio espectro y una estadía del paciente más prolongada de lo necesario. Por esta razón, el Consejo Asesor Presidencial para la Lucha contra las Bacterias Resistentes a Antibióticos recientemente hizo del desarrollo y uso de diagnósticos rápidos para la detección de bacterias resistentes a los antibióticos uno de sus principales objetivos.

La presente invención, que genera determinaciones de AST más rápidas y precisas, puede proporcionar beneficios de costes actuales de más de $2000 por paciente. Estos puntos de valor incluyen los más fácilmente cuantificables (duración de la estadía y tratamientos costosos reducidos) y los más intangibles, difíciles de valorar (mortalidad de pacientes e impactos sociales de una mejor administración de antimicrobianos). Algunos de estos valores intangibles, como el valor de la administración de antimicrobianos, pueden volverse más cuantificados a medida que los cuerpos reguladores comiencen a imponer costos a los hospitales por no adoptar programas de administración de antimicrobianos más rigurosos. En septiembre de 2014, se promulgó el Proyecto de Ley 1311 del Senado de California, que requiere además que los hospitales adopten e implementen una política de administración de antimicrobianos de acuerdo con las pautas establecidas por el gobierno federal y las organizaciones profesionales, y establecer un comité multidisciplinario de administración de antimicrobianos supervisado por médicos con al menos un médico o farmacéutico que haya recibido una formación específica relacionada con la administración. En junio de 2016, los Centros de Sistemas de Medicare y Medicaid (CMS) usaron los roles propuestos para promover la administración de antimicrobianos en los hospitales, con muchos expertos de la industria que esperaban que se implementaran incentivos financieros en los próximos dos años. La presente invención promoverá los objetivos del gobierno y de la industria de la salud de una mejor administración de antimicrobianos.

Las etapas generalizadas de aspectos de la presente invención se muestran en la Figura 1. Las imágenes en la Figura 1 muestran un aspecto con distintas etapas del proceso; sin embargo, se pueden automatizar aspectos de la presente invención.

Figura 2A a Figura 2D muestran características de aspectos de la presente invención. FIGURA 2A muestra un rango de sensibilidad de detección para tres patógenos representativos. Las líneas discontinuas muestran niveles de señal de concentración cero. Figura 2B muestra la plataforma prototipo de AST rápida automatizada "Crocodile" (Titertek-Berthold) que puede usarse en la presente invención. Figura 2C es un esquema que muestra la interacción de bacterias aniónicas con nanoetiquetas catiónicas y polímeros. La menor solubilidad de los complejos neutrales resultantes permite unir perlas magnéticas. Figura 2D muestra datos para S. aureus con un panel Gram Positivo Sensi Titre® (GPALL3F) que muestra resultados antimicrobianos bacteriostáticos (clindamicina) y bactericidas (penicilina) en relación con los controles de alto crecimiento y "congelados en el tiempo (FIT)".

Como se conoce por los expertos en la técnica, las plataformas AST pueden producir resultados de concentración mínima inhibitoria (MIC) y/o resultados de susceptibilidad cualitativa (QSR) para cada antimicrobiano ensayado. Se sabe que las MIC son la concentración más baja de antimicrobiano que inhibe el crecimiento de microorganismos y proporciona a los médicos información sobre la dosificación. Los QSR también pueden proporcionar a los médicos información de dosificación similar, pero es posible que no proporcionen una MIC numérica. Los ensayos de AST están configurados predominantemente para probar múltiples antimicrobianos en paralelo para cada muestra biológica obtenida. Para producir resultados de MIC o QSR, se requieren series de diluciones para cada antimicrobiano. Por lo tanto, para los AST en base líquida, denominados "microdilución en caldo" por el CLSI, los ensayos se realizan comúnmente en cartuchos y/o microplacas, lo que permite realizar pruebas paralelas de diferentes antimicrobianos a diferentes concentraciones.

Los tiempos prolongados para obtener una determinación de AST dan como resultado que se entregue información incompleta a los médicos. Estos tiempos prolongados a menudo impiden la identificación de tasas de eficacia antimicrobiana o la cinética de destrucción. Esta información adicional puede ser importante para informar el tratamiento. Los AST actuales, que no se determinan hasta más de seis horas (y generalmente más de doce horas) después de que comienza el tratamiento, a menudo pierden la capacidad de discernir diferencias entre la tasa de eficacia antimicrobiana: un antimicrobiano que mata un microorganismo instantáneamente se ve igual después de doce horas que uno que lo mató en cuatro horas.

La tabla 1 estima los efectos de diferentes tratamientos sobre el número de bacterias después de una incubación de dos horas. Al suponer un tiempo de duplicación de treinta minutos, los controles no tratados deberían aumentar dieciséis veces. Los grupos de tratamiento con un "potente" antimicrobiano (definido como uno que tiene eficacia contra las bacterias, por ejemplo) por encima de la MIC deberían dar como resultado un crecimiento mínimo de microorganismos y, en el caso de antimicrobianos bactericidas, la muerte del microorganismo. Por tanto, se esperan menos bacterias que la concentración inicial. Los grupos de tratamiento con un "potente" antimicrobiano por debajo de su MIC deben dar como resultado un crecimiento de microorganismos igual o menor que el control sin antimicrobianos. Los antimicrobianos de acción lenta, definidos en este caso como aquellos que requieren más de dos horas para matar las bacterias (por ejemplo, como es el caso de los antimicrobianos bacteriostáticos) producirán una señal entre la concentración inicial y el aumento de dieciséis veces.

Tabla 1

La concentración inicial de bacterias de 5*105 UFC/mL se proporciona en el the American Society for Microbiology's "Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing" © 2005, con Marie B. Coyle como editora coordinadora, para la técnica de microdilución en caldo. Dado que cada pocillo contiene aprox. 100 pL, hay aprox. 5*105 bacterias por pocillo. Los tintes fluorescentes estándar comienzan a ser cuantificables a aprox. concentraciones de 0,1 nM, que corresponden a aproximadamente 1,2*1010 moléculas. Así, para un tiempo de duplicación de bacterias de treinta minutos para ser visibles después de dos horas, cada bacteria individual tendría que ser etiquetada con 5*105 moléculas fluorescentes. Las consideraciones prácticas, tales como el fondo fluorescente y la unión no específica, pueden aumentar este número en órdenes de magnitud. Por tanto, para permitir la compatibilidad con detectores ópticos estándar, puede ser ventajoso usar un amplificador químico y/o bioquímico que produzca una señal detectable a concentraciones más bajas.

Sin pretender imponer ninguna teoría, la presente invención se basa en parte en el principio de microdilución en caldo. Un cultivo a evaluarse se diluye, lo más preferente de 1-10*105 UFC/mL, y se introduce en los pocillos que contienen diferentes antimicrobianos a diferentes concentraciones, de manera que las MIC pueden determinarse para un panel adecuado de antimicrobianos. A continuación, la placa se introduce en una incubadora a la temperatura apropiada, lo más preferente 31-37 °C, y en condiciones apropiadas, lo más preferente aeróbicas, para el crecimiento de bacterias. Durante este tiempo, el microorganismo puede crecer.

El caldo puede ser caldo Mueller Hinton ajustado en cationes y puede contener suplementos adicionales conocidos por aquellos expertos en la técnica por ser ventajosos para el crecimiento microbiano, como sangre de caballo lisada, y/o para determinar la eficacia antimicrobiana, tales como concentraciones elevadas de cloruro de sodio. Las microplacas pueden agitarse durante este período de crecimiento, lo que puede ser ventajoso para dispersar nutrientes y/o intercambio de gases y/o antimicrobianos en cada pocillo y/o disminuir la formación de biopelículas.

Dentro de cero a ocho horas después del inicio de AST (lo más preferente de cero a cuatro horas), se añade una cantidad conocida de agente de señalización a cada pocillo. La adición de reactivos (incluidos los generadores de señales) puede realizarse mediante un instrumento automatizado o un instrumento semiautomatizado o puede realizarse manualmente.

Los agentes de señalización (que pueden denominarse "ampollas adhesivas") comprenden un resto capaz de unirse a un microorganismo (por ejemplo, un anticuerpo y/o una lectina que se une a la superficie de un microorganismo, un resto cargado y/o un resto funcional que se une de forma no específica a la superficie del microorganismo) y un resto químico capaz de proporcionar una señal o contribuir a la producción de una señal (por ejemplo, una enzima quimioluminóforo y quelato de lantánido). Las enzimas ilustrativas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa, beta-D-galactosidasa, beta-lactamasa y una combinación de las mismas.

Como se usa en la presente descripción, el generador de señales puede incluir uno o más restos químicos (es decir, "generadores de señales") conjugados con uno o más "receptores de microorganismos." Los generadores de señales incluyen, pero no se limitan a, uno o más catalizadores (incluidas enzimas, nanopartículas de óxido metálico, catalizadores organometálicos, nanopartículas diseñadas para amplificación de la señal (tales como aquellas descritas en las solicitudes provisionales de EE. UU. a las que la presente solicitud reivindica la prioridad), bacteriófagos que comprenden elementos generadores de señales, fluoróforos (incluidos organometálicos que contienen fluoróforos orgánicos, europio o rutenio (II), renio (I), paladio (II), platino (II)) y/o tintes colorimétricos (incluidas las "manchas" orgánicas). Pueden usarse combinaciones de los anteriores, tales como nanopartículas, dendrímeros y/u otras estructuras a nanoescala con enzimas, fluoróforos y/o moléculas organometálicas.

El resto químico puede conjugarse con un agente de señalización antes de poner en contacto el agente de señalización con un microorganismo, mientras que el agente de señalización se pone en contacto inicialmente con un microorganismo, o después de que el agente de señalización ha contactado con un microorganismo.

Cuando los agentes de señalización se añaden a diluciones de AST que contienen un microorganismo, los receptores de agentes de señalización (por ejemplo, restos que pueden unirse de forma específica o no específica a un microorganismo) se asocian con superficies de microorganismos. Así, cuantos más microorganismos intactos, por ejemplo, haya en solución, mayor será el número de agentes de señalización que estarán asociados con estas bacterias. En consecuencia, existe una relación inversa entre el número de bacterias intactas y el número de agentes de señalización que están "libres" en solución, según se define por aquellos que no se unen a bacterias intactas. Tenga en cuenta que los agentes de señalización libres pueden unirse a componentes microbianos solubles si, por ejemplo, los microorganismos se lisan en respuesta al tratamiento antimicrobiano.

El número de agentes de señalización que se asocian y/o se intercalan en las superficies de los microorganismos es proporcional al área superficial del microorganismo. El área superficial del microorganismo está fuertemente asociada con microorganismos verdaderamente resistentes. En particular, en el caso de microorganismos que se hinchan o alargan en respuesta a concentraciones de antimicrobianos de MIC y sub MIC (por ejemplo, bacterias formadoras de filamentos), se sabe que las identificaciones metabólicas y/o volumétricas dan perfiles de susceptibilidad falsos para puntos de tiempo de la AST "rápida", definidos como aquellos de menos de seis horas. Para superar esta limitación, la presente invención traduce el área superficial del microorganismo (en lugar del volumen) en una señal medible, lo más preferente una señal óptica. Los presentes métodos pueden determinar con precisión los perfiles de resistencia de los microorganismos en menos de seis horas.

Para separar los agentes de señalización asociados con y/o intercalados en microorganismos de los agentes de señalización libres, puede ser necesario realizar una o más etapas de separación y/o unión competitiva. Dichas etapas incluyen, pero no se limitan a, centrifugación (por ejemplo, con una fuerza >500*g), filtración (por ejemplo, a través de un filtro que tiene poros menores o iguales a 0,45 micrones, y preferentemente menores o iguales a 0,2 micrones), electroforesis y/o captura magnética; dichas etapas son bien conocidos por los expertos en la técnica. Para promover la unión del agente de señalización y/o reducir el fondo, puede ser además ventajoso, antes de añadir agentes de señalización, separar los microorganismos del líquido en el que se suspendieron durante la incubación. Tales separaciones pueden incluir, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, electroforesis y/o captura magnética.

Cuando estos datos se comparan entre los grupos de tratamiento, pueden determinarse los perfiles de resistencia microbiana, mediante el uso de etapas similares a las determinaciones de AST usadas actualmente. Además, estos datos pueden permitir la determinación de las tasas de eficacia antimicrobiana o la cinética de destrucción.

Pueden añadirse agentes de señalización junto con microorganismos y/o antimicrobianos, de modo que estén presentes durante todo el período de incubación de AST. Este período total puede ser de hasta veinticuatro horas, pero preferentemente dentro de las ocho horas y con mayor preferencia dentro de las cinco horas. Alternativamente, pueden añadirse agentes de señalización a microorganismos y antimicrobianos después de un período de incubación prescrito. Este período puede ser de hasta veinticuatro horas, pero preferentemente dentro de las ocho horas y con mayor preferencia dentro de las cuatro horas.

Los agentes de señalización están diseñados para asociarse y/o intercalarse en superficies de microorganismos, incluidas paredes y/o membranas. Los agentes de señalización diseñados para la asociación comprenden restos de unión que incluyen, pero no se limitan a, uno o más anticuerpos, lectinas, otras proteínas, moléculas pequeñas con uno o más grupos químicos cargados, moléculas pequeñas con uno o más grupos químicos funcionales, fagos, glicoproteínas, péptidos, aptámeros, moléculas pequeñas cargadas, moléculas pequeñas con cargas fijas, polímeros cargados, polímeros cargados con cargas fijas, moléculas pequeñas hidrófobas, péptidos cargados, péptidos cargados con cargas fijas, péptidos con regiones hidrófilas e hidrófobas alternas y/o ligandos de moléculas pequeñas, que pueden ser o no complejos organometálicos. Las moléculas diseñadas para la asociación de microorganismos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Los agentes de señalización pueden permanecer unidos a microorganismos y/o pueden internalizarse, por lo que se incluyen todas las asociaciones. Los agentes de señalización diseñados para la intercalación pueden incluir, pero no se limitan a, pequeñas moléculas hidrófobas, péptidos hidrófobos y/o péptidos con regiones hidrófobas e hidrófilas alternas. Las moléculas diseñadas para la intercalación de microorganismos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Los agentes de señalización pueden ser además específicos para uno o más tipos de microorganismos. Los agentes de señalización pueden tener múltiples receptores. Estos pueden mejorar la unión y/o permitir la unión simultánea a dos o más microorganismos, que pueden servir además para "aglutinar" bacterias. Antes o simultáneamente con la adición de agentes de señalización, puede ser ventajoso ajustar el pH de la solución. Esto puede ser beneficioso para mejorar las interacciones carga-carga entre microorganismos y agentes de señalización. La carga aniónica de los microorganismos puede incrementarse al titular el pH de la solución por encima de neutral (más básico). Por tanto, puede ser beneficioso utilizar restos con una o más cargas catiónicas fijas.

Cabe señalar que el agente de señalización puede unirse específicamente a un microorganismo (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a una especie de microorganismo o una cepa de microorganismo) o puede unirse de manera no específica a un microorganismo (por ejemplo, mediante formación de enlaces covalentes o no covalentes y otra asociación química no específica conocida en la técnica).

Se prefiere que los agentes de señalización se unan a las superficies de los microorganismos nativos.

Alternativamente, pueden añadirse productos químicos y/o bioquímicos que son capaces de asociarse con agentes de señalización al líquido en el que se suspenden los microorganismos durante el crecimiento, de modo que los productos químicos y/o bioquímicos se incorporan a los microorganismos durante la incubación. Esto puede servir para mejorar la asociación del agente de señalización con microorganismos. En casos alternativos, los propios agentes de señalización pueden estar presentes en el líquido en el que se suspenden los microorganismos durante la incubación y pueden incorporarse a los microorganismos durante el crecimiento.

Preferentemente, los agentes de señalización comprenden un generador de señal amplificador, de modo que la señal de cada microorganismo intacto pueda amplificarse más allá del número de agentes de señalización asociados con cada microorganismo. Por ejemplo, la enzima peroxidasa de rábano (HRP) se conoce que es capaz de amplificar señales >1*104 veces. Por lo tanto, si cien moléculas de HRP están unidas a cada superficie de microorganismo, se puede conseguir una amplificación de 106. Esto puede aumentar la velocidad con la que se pueden realizar las determinaciones de AST al permitir la discriminación de concentraciones de microorganismos que de cualquier otra manera no se pueden diferenciar. El uso de formulaciones de europio proporciona de manera similar amplificación de la señal.

Alternativamente, los agentes de señalización pueden comprender precursores de tintes ópticos conocidos por los expertos en la técnica como "tintes de membrana" que están diseñados para aumentar en gran medida la emisión de fluorescencia tras la intercalación en una región hidrófoba, tal como una membrana celular. Los ensayos diseñados con estos agentes de señalización pueden requerir que los microorganismos se concentren en un volumen más pequeño, que enfoca un plano, para producir señales suficientes para que puedan medirse ópticamente con facilidad. Las especies interferentes pueden requerir el uso de fluoróforos de infrarrojos cercanos.

Las técnicas de separación potenciales incluyen, pero no se limitan a, filtración (por ejemplo, a través de un filtro que tiene poros menores o iguales a 0,45 micrones, preferentemente menores o iguales a 0,2 micrones), centrifugación (por ejemplo, con una fuerza >500*g), electroforesis, dielectroforesis y captura magnética. Estas técnicas se emplean para separar los agentes de señalización asociados con los microorganismos, que se adhieren a un filtro, se sedimentan en una centrífuga y/o se separan electroforéticamente y/o magnéticamente, de aquellos que están libres en solución. Los agentes de señalización libres pasan a través de un filtro ("filtrado"), permanecen en solución después de la centrifugación o separación magnética ("sobrenadante") y/o se procesan por separado por electroforesis. La centrifugación puede ser estándar, con gradiente de densidad o centrifugación diferencial. La separación magnética puede requerir la adición de una o más partículas magnéticas dirigidas específicamente para asociarse o unirse a microorganismos. Estos pueden añadirse antes o simultáneamente con la adición del agente de señalización.

Tales técnicas de separación también pueden aislar microorganismos que cambian de morfología en respuesta a un tratamiento antimicrobiano y pueden confundir una determinación. Un ejemplo de tal microorganismo son las bacterias filamentosas que inicialmente se alargan en respuesta al tratamiento antimicrobiano. Este régimen de crecimiento se conoce por los expertos en la técnica. Aislar y excluir bacterias filamentosas de un ensayo, mediante el uso de una técnica de separación descrita en la presente descripción, aumentará la precisión de los resultados obtenidos.

La separación de microorganismos puede mejorarse mediante la asociación de partículas con especies de microorganismos. Por ejemplo, en el caso de la separación magnética, las perlas magnéticas pueden asociarse con microorganismos (de forma específica o no específica). Los restos presentes en las superficies de las perlas magnéticas pueden unirse a la misma superficie (o una biomolécula de los mismos) de microorganismos que el agente singular o una superficie diferente (o una biomolécula del mismo). Las perlas magnéticas pueden tener los mismos y/o diferentes restos que los agentes de señalización. Por ejemplo, si un agente de señalización comprende un anticuerpo que se une a E. coli, entonces se puede funcionalizar una perla magnética con el mismo anticuerpo. En otros ejemplos, el agente de señalización puede incluir un motivo que se une a un microorganismo y la perla magnética está funcionalizada para unirse de forma no específica a los microorganismos.

El uno o más restos de unión asociados con las perlas magnéticas pueden ser idénticos o diferentes al resto químico asociado con o del agente de señalización.

Los uno o más restos de unión asociados con las perlas magnéticas pueden unirse a los microorganismos antes, simultáneamente o después de la unión del agente de señalización con el microorganismo.

Los uno o más restos de unión asociados con las perlas magnéticas pueden asociarse con uno o más polímeros que precipitan microorganismos. El uno o más polímeros que precipitan microorganismos pueden ser catiónicos. El uno o más polímeros que precipitan microorganismos puede ser poli(etilenglicol).

Las perlas magnéticas, como conocen los expertos en la técnica, pueden variar en tamaño de 20 nm a 20 micrones. Después de la separación, pueden realizarse uno o más ensayos para determinar el número de agentes de señalización que quedan después de la separación de microorganismos y/o el número de agentes de señalización eliminados durante la separación de microorganismos (agentes de señalización "libres"). La realización de un ensayo para los agentes de señalización libres proporciona una señal inversamente proporcional a la concentración de microorganismos. En este caso, los agentes de señalización asociados con microorganismos pueden estar unidos o internalizados por microorganismos. Alternativamente, se puede realizar un ensayo para los agentes de señalización asociados con microorganismos. En este caso, a menos que los microorganismos se lisen específicamente, solo los agentes de señalización unidos contribuirán a la señal.

Para maximizar la eficacia de la separación, es decir, minimizar el número de agentes de señalización libres restantes, se pueden realizar una o más etapas de lavado. Estos pueden ser continuos, como en los casos de filtración, captura magnética o electroforesis, y/o discretos, como en los casos de centrifugación o captura magnética.

En casos alternativos, los agentes de señalización pueden no requerir lavado. Este puede ser el caso cuando se usan agentes de señalización de "tinte de membrana". Las moléculas que no están intercaladas en las membranas de los microorganismos tienen actividades ópticas significativamente más bajas que las especies intercaladas, por lo que puede que no sea necesario lavarlas.

Pueden realizarse uno o más lavados antes de añadir agentes de señalización a los microorganismos. Estos lavados pueden, por ejemplo, eliminar las especies interferentes presentes en el líquido en el que se suspendieron los microorganismos durante la incubación.

En otros casos, no se realiza ningún lavado.

El desarrollo de señales puede requerir la adición de una "solución de revelado." Para los agentes de señalización que comprenden catalizadores, la solución de revelado puede comprender uno o más precursores de señal que pueden convertirse en una molécula de señalización óptica y/o eléctricamente activa. Para los agentes de señalización que comprenden moléculas encapsuladas, como dentro de nanopartículas, la solución de revelado puede comprender uno o más reactivos para liberar las especies encapsuladas. En un tiempo especificado después de la adición de la solución de revelado, puede medirse una señal colorimétrica y/o electroquímica. Tales señales incluyen, pero no se limitan a, absorbancia, fluorescencia, fluorescencia de resolución temporal, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, espectroscopía amperométrica, voltamétrica, de impedancia y/o impedancia. Luego, los datos pueden compararse para determinar las AST y MIC, de manera similar a los protocolos de AST actuales.

En casos, la determinación de los niveles de señal incluye medir los niveles de señal asociados con microorganismos intactos. Alternativamente o adicionalmente, determinar los niveles de señal incluye medir los niveles de señal no asociados con microorganismos intactos.

Estos procesos pueden realizarse directamente a partir de cultivos, subcultivos, cultivos de sangre positiva, muestras. Los tratamientos para concentrar microorganismos y/o eliminar posibles especies interferentes pueden realizarse antes de la AST o antes de la adición del agente de señalización.

Los agentes de señalización también pueden usarse con métodos basados en placas para la determinación de AST, tal como la difusión en gradiente. También pueden añadirse simultáneamente tras la adición de microorganismos a las placas o después de un período de incubación establecido. La información espacial para la señal óptica y/o eléctrica es importante en estos casos. Con este enfoque, puede ser preferible un ensayo de agentes de señalización unidos a microorganismos intactos con el fin de retener la información espacial. En este caso, pueden realizarse una o más etapas de lavado antes de la adición de la solución de revelado para eliminar los agentes de señalización libres.

En otros casos, no se realiza ningún lavado.

Alternativamente, los agentes de señalización pueden diseñarse para ser absorbidos por bacterias, por ejemplo, lo que puede lograrse mediante el uso de bacteriófagos. En tales métodos, se realiza un ensayo de agentes de señalización libres.

Alternativamente, puede usarse un enfoque de transferencia de manchas, tal como es el estándar con papel de nitrocelulosa, para transferir bacterias o agentes de señalización libres y luego se realiza un ensayo espacial en el papel secante.

Las etapas de separación pueden no requerirse si el agente de señalización produce una señal al unirse. Alternativamente, puede lograrse un proceso sin etapas de separación si el agente de señalización se vuelve susceptible o resistente a un constituyente específico de la solución reveladora al unirse.

Los datos finales de salida de MIC y/o QSR pueden ser interpretados por un usuario directamente a partir de los datos producidos por los ensayos descritos en la presente descripción. Alternativamente, estos datos pueden procesarse mediante uno o más algoritmos para producir las MIC y/o QSR. Los valores de MIC y/o QSR informados pueden derivarse de uno o más de los ensayos descritos en la presente descripción o pueden derivarse de uno o más de los ensayos descritos en la presente descripción junto con uno o más ensayos conocidos para el crecimiento de microorganismos que incluyen, pero no se limitan a, ensayos de indicador de tinte metabólico, ensayos de indicador de pH, ensayos de ácido nucleico y ensayos de ATP.

Métodos de la presente divulgación

La presente invención es un método para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos que comprende: añadir un antimicrobiano a una suspensión líquida de microorganismos para formar una suspensión líquida de microorganismos en presencia del antimicrobiano; añadir un agente de señalización a la suspensión líquida de microorganismos; incubar la suspensión líquida de microorganismos en presencia del antimicrobiano y el agente de señalización en condiciones que promuevan el crecimiento de los microorganismos, en donde el agente de señalización es capaz de unirse a una superficie de los microorganismos por asociación y/o intercalación; separar los microorganismos unidos por el agente de señalización del agente de señalización no unido; y determinar los niveles de señal asociados con los microorganismos en comparación con uno o más controles, en donde el número de agentes de señalización que se asocian y/o se intercalan en la superficie del microorganismo es proporcional al área superficial del microorganismo, lo que determina así la susceptibilidad antimicrobiana de los microorganismos. Otro aspecto de la presente divulgación es un método para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos. El método incluye las etapas de incubar una suspensión líquida de microorganismos en presencia de un antimicrobiano en condiciones que promueven el crecimiento de los microorganismos; añadir un agente de señalización capaz de unirse a una superficie de los microorganismos; separar los microorganismos unidos por el agente de señalización del agente de señalización no unido; y determinar los niveles de señal asociados con los microorganismos en comparación con uno o más controles, lo que determina así la susceptibilidad antimicrobiana de los microorganismos. En casos, la adición del agente de señalización ocurre antes o durante la etapa de incubación o la adición del agente de señalización ocurre después de la etapa de incubación.

Otro aspecto de la presente divulgación es un método para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos. El método incluye las etapas de incubar una suspensión líquida de microorganismos en un cartucho que comprende una pluralidad de cámaras, cada cámara que contiene uno o más antimicrobianos, en condiciones que promueven el crecimiento de los microorganismos; añadir un agente de señalización a la pluralidad de cámaras, en donde el agente de señalización es capaz de unirse a una superficie de los microorganismos; eliminar el agente de señalización no unido; y determinar los niveles de señalización en la pluralidad de cámaras en comparación con uno o más controles, lo que determina así la susceptibilidad de los microorganismos al uno o más antimicrobianos. En casos, el cartucho incluye además una o más cámaras de control (por ejemplo, al menos 2, 4, 6 , 8, 12, 24, 48, 96, 192, 384, 1536 o más cámaras) que no contienen antimicrobianos o uno o más antimicrobianos para los que los microorganismos no son susceptibles.

En casos de un aspecto anterior, la unión a una superficie de los microorganismos no es específica, por ejemplo, comprende una interacción no covalente y a través de la formación de un enlace covalente.

En casos de un aspecto anterior, el agente de señalización puede incluir un grupo químico y/o bioquímico capaz de unirse a una superficie de los microorganismos, en donde la superficie comprende una o más membranas, paredes, proteínas, orgánulos, sacáridos, lípidos, envoltura celular y/o ácidos nucleicos.

En casos de un aspecto anterior, el agente de señalización puede incluir un grupo químico y/o bioquímico capaz de unirse a una biomolécula de la superficie de los microorganismos, en donde la biomolécula superficial se selecciona de peptidoglicanos, mureínas, manoproteínas, porinas, beta-glucanos, quitina, glicoproteínas, polisacáridos, lipopolisacáridos, lipooligosacáridos, lipoproteínas, endotoxinas, ácidos lipoteicoicos, ácidos teicoicos, lípido A, dominios de unión de carbohidratos, bombas de eflujo, otras proteínas asociadas a la pared celular y/o a la membrana celular, otros fosfolípidos aniónicos y una combinación de los mismos.

En casos de un aspecto anterior, el agente de señalización puede incluir un amplificador de señal y uno o más restos químicos capaces de unirse de forma no específica a una superficie de los microorganismos.

Otro aspecto de la presente divulgación es un método para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos. El método incluye incubar microorganismos en presencia de un agente antimicrobiano y de señalización en condiciones que promuevan el crecimiento de los microorganismos, en donde el agente de señalización comprende un amplificador de señal y uno o más restos químicos capaces de unirse de forma no específica a una superficie de los microorganismos; separar los microorganismos unidos por el agente de señalización del agente de señalización no unido; y determinar los niveles de señal asociados con los microorganismos en comparación con uno o más controles, lo que determina así la susceptibilidad antimicrobiana de los microorganismos.

Otro aspecto de la presente divulgación es un método para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos. El método incluye incubar microorganismos en presencia de un antimicrobiano en condiciones que promuevan el crecimiento de los microorganismos, añadir un agente de señalización que comprende un amplificador de señal y uno o más restos químicos capaces de unirse de forma no específica a una superficie de los microorganismos; separar los microorganismos unidos por el agente de señalización del agente de señalización no unido; y determinar los niveles de señal asociados con los microorganismos en comparación con uno o más controles, lo que determina así la susceptibilidad antimicrobiana de los microorganismos. En casos, el agente de señalización se produce antes, al comienzo o durante la etapa de incubación, preferentemente durante la etapa de incubación. En casos, los microorganismos se incuban en una suspensión líquida.

En casos de un aspecto anterior, la suspensión líquida puede prepararse al inocular un medio líquido con un aislamiento microbiano crecido a partir de una muestra biológica.

En casos de un aspecto anterior, la suspensión líquida de microorganismos puede prepararse a partir de una muestra biológica no procesada, por ejemplo, una muestra biológica no procesada no ha sufrido una etapa de cultivo.

En casos de un aspecto anterior, la suspensión líquida de microorganismos puede prepararse a partir de una muestra biológica cultivada o procesada.

En casos de un aspecto anterior, la muestra biológica se selecciona de sangre, líquido cefalorraquídeo, orina, heces, vaginal, esputo, broncoalveolar, frotis de garganta, nasales/heridas y una combinación de las mismas.

En casos de un aspecto anterior, el método no implica una etapa de capturar microorganismos sobre una superficie sólida antes o durante la incubación.

En casos de un aspecto anterior, el método no incluye una etapa de cultivo de microorganismos sobre una superficie sólida durante o después de la etapa de incubación.

En casos de un aspecto anterior, la incubación puede incluir agitar la suspensión líquida de microorganismos.

En casos de un aspecto anterior, la suspensión líquida de microorganismos puede agitarse mediante agitación mecánica, acústica y/o magnética de forma continua o discreta durante la incubación.

En casos de un aspecto anterior, la incubación se produce a 31-37 °C.

Comparación de la presente invención con los sistemas de AST usados actualmente

La presente invención es superior a los métodos de AST usados actualmente, en parte porque proporciona resultados de AST precisos en significativamente menos tiempo.

Tres sistemas de AST automatizados que se usan actualmente en las clínicas son Vitek2 de BioMeriéux, Phoenix de Beckman Dickinson y MicroScan de Beckman-Coulter. En la figura 3 se muestra una comparación entre las etapas en los sistemas de AST usados actualmente y la presente invención. Los procesos descritos en esta invención pueden realizarse en al menos dos modos. El primero es para aislamientos estándar, sin cambios en los flujos de trabajo de laboratorio actuales. El segundo es directo de cultivos de sangre positiva.

Para el procesamiento de aislamientos estándar, la presente invención es compatible con los flujos de trabajo de laboratorios clínicos existentes y, por lo tanto, no requiere cambios. Como se muestra en la "etapa 8" de la Figura 3, la prueba de susceptibilidad actual (AST) se realiza después del aislamiento de la colonia (etapa 6) y la estandarización de la concentración de microorganismos (etapa 7). En este flujo de trabajo, la presente invención reemplazaría los sistemas actuales en la "etapa 8". Debido a que los resultados de AST con la presente invención están disponibles dentro del turno de un trabajador de la salud (<5 horas), la utilidad puede aumentar la velocidad con la que los pacientes reciben terapias optimizadas (etapa 9) hasta en un día en la práctica. La automatización puede diseñarse para incluir la "etapa 7" y, potencialmente, etapas adicionales en el flujo de trabajo. Tal automatización se conoce por los expertos en la técnica. Tenga en cuenta que la Figura 3 ilustra el flujo de trabajo para las muestras de sangre. Muchos tipos de muestras, tales como orina e hisopos, se pueden sembrar por estrías directamente en las placas (etapa 4). En este caso, la tinción de Gram se puede realizar en la etapa 6.

Para un análisis de sangre, los sistemas de AST usados actualmente requieren un cultivo de sangre obtenido para que sea detectablemente positivo (lo que lleva diez o más horas), seguido de una etapa de subcultivo (de al menos doce horas) y luego una prueba de AST (que requiere un mínimo de ocho horas): esto totaliza más de cuarenta y ocho horas, en dependencia del patógeno, y a menudo lleva más de tres días en la práctica. En la mayoría de los flujos de trabajo, la identificación del organismo ocurre después de la etapa de subcultivo y cada vez más se realiza mediante espectrometría de masas. Dado que tanto los resultados de la identificación como de la AST son necesarios para que los médicos o farmacéuticos prescriban los antimicrobianos dirigidos adecuados, este retraso en los resultados de AST extiende directamente la duración del tratamiento antimicrobiano de amplio espectro. Además, la espera a menudo se ve agravada por la operación de un turno común en muchos laboratorios de microbiología clínica.

Alternativamente, la presente invención puede usarse directamente a partir de cultivos de sangre positiva. Después de la etapa 1 y la etapa 2 estándar de extracción de sangre e incubación/cultivo, si el cultivo es positivo, la botella de cultivo se movería directamente a un aislamiento de microorganismos (etapa 3) y luego a un sistema automatizado (etapa 4). La presente invención puede ser completamente automatizada, que requiere un técnico que solamente cargue el sistema con un cartucho estándar con diluciones de microorganismos y luego inicie el proceso de "AST rápida" de cuatro horas. El técnico de laboratorio recibiría los mismos resultados fenotípicos estándar para la AST de una concentración mínima inhibitoria ("MIC"). Sin embargo, el proceso simplificado reduciría el tiempo hasta la AST en más de veinticuatro horas en teoría, y potencialmente dos días en la práctica, y simplificaría el flujo de trabajo del laboratorio.

Los sistemas de AST usados actualmente realizan variantes del procedimiento de microdilución en caldo del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Las bacterias se inoculan en varios pocillos en paralelo, cada uno de los cuales contiene uno (o más) antimicrobianos a una concentración conocida y un caldo nutritivo. Los pocillos se inoculan a 5*105 UFC/mL para garantizar que las bacterias estén en la fase de crecimiento logarítmico, importante para detectar respuestas precisas a los antimicrobianos. Luego, la detección de microorganismos se realiza visualmente.

La lenta velocidad de las pruebas de AST fenotípicas se debe, en parte, a su dependencia del crecimiento de microorganismos para producir una señal óptica detectable. Las bacterias no se pueden cuantificar mediante mediciones de densidad óptica por debajo de una concentración de ~1*108 UFC/mL, lo que hace que la concentración inicial del CLSI sea invisible durante un mínimo de ocho tiempos de duplicación. Dado que la diferenciación del crecimiento de microorganismos en el pozo de crecimiento más lento a partir del pozo sin crecimiento es fundamental para las determinaciones de concentración mínima inhibitoria (MlC), se requieren tiempos significativamente más largos. Como se conoce por los expertos en la técnica, algunas plataformas existentes superan estos problemas de crecimiento al incluir sondas metabólicas en el líquido en el que se suspenden los microorganismos durante la incubación. Sin embargo, la inclusión de estas sondas puede perder los regímenes de crecimiento, tales como el crecimiento filamentoso, y pueden afectar la precisión de los resultados.

Una vez que han comenzado las etapas específicas de AST, los sistemas de AST usados actualmente todavía requieren típicamente más de ocho horas para reportar resultados para bacterias simples y altamente susceptibles y requieren más de diez horas para patógenos con perfiles de resistencia complejos o cinéticas de crecimiento lento, véase Figura 4.

Además, los sistemas de AST automatizados que se usan actualmente sufren de dos deficiencias que impiden la presentación de resultados precisos en menos de seis horas: 1) errores muy importantes, llamados "susceptibles" inexactos para cepas verdaderamente resistentes; y 2) errores importantes, llamados "resistentes" inexactos para cepas verdaderamente susceptibles. De hecho, estos problemas han requerido que BioMeriéux y BD revisen sus reivindicaciones iniciales de velocidad de cuatro horas para Vitek2® y Phoenix®.

La existencia de errores muy importantes se explica en parte por la energía metabólica gastada por los microorganismos para lograr la resistencia a los antimicrobianos. Los microorganismos resistentes pueden alterar los gastos de energía en respuesta a los antimicrobianos, lo que confunde los resultados de las sondas metabólicas alrededor de la MIC. Estos también pueden resultar de la presencia de aditivos, tales como indicadores redox, en los medios de crecimiento. La prevalencia de errores importantes se debe principalmente al crecimiento filamentoso de ciertas bacterias. Este régimen de crecimiento es una respuesta antimicrobiana común entre las bacterias gramnegativas, en particular a los antimicrobianos que actúan sobre la pared celular, como los p-lactámicos. Las bacterias filamentosas continúan la replicación de su contenido interno pero no se separan. Por tanto, de nuevo, las sondas metabólicas dan resultados erróneos cercanos a MIC. Se demostró que la eliminación de bacterias filamentosas reduce significativamente los errores importantes del método de AST.

Las mediciones del área superficial del microorganismo relativa, como se usa en la presente invención, superan los errores de las sondas metabólicas para AST. Primero, dado que el área superficial relativa no se confunde con cambios en la actividad metabólica, la AST rápida permite llamadas de resistencia rápidas y precisas. En segundo lugar, las mediciones del área superficial evitan las llamadas de sobrerresistencia. Por el contrario a las mediciones volumétricas obtenidas con sondas metabólicas de los sistemas de AST usados actualmente, las mediciones del área superficial permiten una diferenciación precisa entre la resistencia real y crecimiento filamentoso. Como se ilustra en el esquema de la Figura 39, los volúmenes de bacterias filamentosas resistentes y susceptibles son difíciles de distinguir. Pero la falta de tabicación crea un área superficial filamentosa significativamente más baja que la de las bacterias verdaderamente resistentes. Por tanto, al amplificar el área superficial de cada bacteria, la presente invención es capaz de llamar con precisión la MIC de p-lactámicos (ampicilina) de cuatro horas para muestras de E. coli (véanse, los ejemplos a continuación). Como se ilustra en la Figura 39, el diferencial de área superficial entre el alargamiento y la resistencia "verdadera" se acerca a 2/3, lo que puede detectarse con una señal amplificada.

Paciente

Como se usa en la presente descripción, el término "paciente" (también denominado indistintamente como "huésped" o "sujeto") se refiere a cualquier huésped que pueda servir como fuente de una o más de las muestras o especímenes biológicos como se discute en la presente descripción. En ciertos aspectos, el donante será un animal vertebrado, lo que pretende indicar cualquier especie animal (y preferentemente, una especie de mamífero tal como un ser humano). En ciertos casos, un "paciente" se refiere a cualquier huésped animal, que incluye, pero no se limita a, primates humanos y no humanos, aves, reptiles, anfibios, bovinos, caninos, caprinos, caries, corvinas, epines, equinos, felinos, hircines, lapinos, leporinos, lupinos, ovinos, porcinos, racinos, vulpinos y similares, que incluyen, pero no se limitan a, ganado domesticado, animales o aves de pastoreo o migratorias, especímenes exóticos o zoológicos, así como animales de compañía, mascotas y cualquier animal bajo el cuidado de un médico veterinario. Muestras biológicas

La muestra biológica es cualquier muestra que contenga un microorganismo, por ejemplo, una bacteria y una célula fúngica.

Las muestras biológicas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, sangre completa, plasma, suero, esputo, orina, heces, glóbulos blancos, glóbulos rojos, capa leucocitaria, lágrimas, moco, saliva, semen, fluidos vaginales, líquido linfático, amniótico líquido, líquido raquídeo o cefalorraquídeo, derrames peritoneales, derrames pleurales, exudados, punteados, frotis epiteliales, biopsias, muestras de médula ósea, líquidos de quistes o abscesos, líquido sinovial, humor vítreo o acuoso, lavados o aspirados de ojos, lavado broncoalveolar, lavado bronquial, o lavado pulmonar, aspirados pulmonares y órganos y tejidos, que incluyen, pero no se limitan a, hígado, bazo, riñón, pulmón, intestino, cerebro, corazón, músculo, páncreas y similares, hisopos (que incluyen, pero no se limitan a, hisopos de heridas, hisopos bucales, hisopos de garganta, hisopos vaginales, hisopos uretrales, hisopos cervicales, hisopos rectales, hisopos de lesiones, hisopos de abscesos, hisopos nasofaríngeos y similares) y cualquier combinación de los mismos. También se incluyen cultivos de bacterias o aislamientos de bacterias, cultivos de hongos o aislamientos de hongos. El experto en la técnica también apreciará que los aislados, extractos o materiales obtenidos de cualquiera de las muestras biológicas ilustrativas anteriores también están dentro del alcance de la divulgación.

Los microorganismos obtenidos a partir de una muestra biológica pueden cultivarse o procesarse de cualquier otra manera como se realiza habitualmente en la técnica.

Microorganismos ilustrativos

Como se usa en la presente descripción, se pretende que la infección incluya cualquier agente infeccioso de origen microbiano, por ejemplo, una bacteria, una célula fúngica, una arquea y un protozoario. En ejemplos preferidos, el agente infeccioso es una bacteria, por ejemplo, una bacteria grampositiva, una bacteria gramnegativa y una bacteria atípica. El término "microorganismo resistente a los antimicrobianos" es un microorganismo (por ejemplo, bacteria, hongo, arquea y protozoario) que es resistente a uno o más antimicrobianos distintos, es decir, fármacos antibacterianos, fármacos antifúngicos, medicamentos antiarchaea y fármacos antiprotozoarios.

Los microorganismos (por ejemplo, una suspensión líquida de microorganismos) pueden incluir una cepa de microorganismo. Los microorganismos pueden incluir una especie de microorganismo. Los microorganismos pueden incluir más de una cepa de microorganismos. Los microorganismos pueden incluir un orden de microorganismos. Los microorganismos pueden incluir una clase de microorganismos. Los microorganismos pueden incluir una familia de microorganismos. Los microorganismos pueden incluir un reino de microorganismos.

Los microorganismos (por ejemplo, una suspensión líquida de microorganismos) pueden incluir más de una cepa de microorganismos. Los microorganismos pueden incluir más de una especie de microorganismos. Los microorganismos pueden incluir más de un género de microorganismos. Los microorganismos pueden incluir más de un orden de microorganismos. Los microorganismos pueden incluir más de una clase de microorganismos. Los microorganismos pueden incluir más de una familia de microorganismos. Los microorganismos pueden incluir más de un reino de microorganismos.

El microorganismo puede ser una bacteria. Los ejemplos de bacterias incluyen y no se limitan a Acetobacter aurantius, Acinetobacter bitumen, Acinetobacter spp., Actinomyces israelii, Actinomyces spp., Aerococcus spp., Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens, Anaplasma, Anaplasma phagocytophilum, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus spp., Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus Thuringiensis, Bacteroides, Bacteroides fragilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus (también conocida como Prevotella melaninogenica), Bartonella, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bartonella spp., Bordetella, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Bordetella spp., Borrelia burgdorferi, Brucella, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella spp., Brucella suis, Burkholderia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Campylobacter spp., Chlamydia, Chlamydia spp., Chlamydia trachomatis, Chlamydophila, Chlamydophila pneumoniae (anteriormente llamada Chlamydia pneumoniae), Chlamydophila psittaci (anteriormente llamada Chlamydia psittaci), Chlamydophila spp., Clostridium, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens (anteriormente llamada Clostridium welchii), Clostridium spp., Clostridium tetani, Corynebacterium, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Corynebacterium spp., Coxiella burnetii, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia spp., Enterobacter cloacae, Enterobacter spp., Enterococcus, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus galllinarum, Enterococcus maloratus, Enterococcus spp., Escherichia coli, Francisella spp., Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Gardenerella spp., Gardnerella vaginalis, Haemophilius spp., Haemophilus, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus pertussis, Haemophilus vaginalis, Helicobacter pylori, Helicobacter spp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella spp., Lactobacillus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus spp., Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Legionella spp., Leptospira spp., Listeria monocytogenes, Listeria spp., Methanobacterium extroquens, Microbacterium multiforme, Micrococcus luteus, Moraxella catarrhalis, Mycobacterium, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium spp., Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma spp., Neisseria, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Neisseria spp., Nocardia spp., Pasteurella, Pasteurella multocida, Pasteurella spp., Pasteurella tularensis, Peptostreptococcus, Porphyromonas gingivalis, Prevotella melaninogenica (anteriormente llamada Bacteroides melaninogenicus), Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp., Rhizobium radiobacter, Rickettsia, Rickettsia prowazekii, Rickettsia psittaci, Rickettsia quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia spp., Rickettsia trachomae, Rochalimaea, Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia dentocariosa, Salmonella, Salmonella enteritidis, Salmonella spp., Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Shigella spp., Spirillum volutans, Staphylococcus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus spp., Stenotrophomonas maltophilia, Stenotrophomonas spp., Streptococcus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus cricetus, Streptococcus faceium, Streptococcus faecalis, Streptococcus ferus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus spp., Treponema, Treponema denticola, Treponema pallidum, Treponema spp., Ureaplasma spp., Vibrio, Vibrio cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio spp., Vibrio vulnificus, viridans streptococci, Wolbachia, Yersinia, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis., y Yersinia spp.

El microorganismo puede ser un hongo. Los ejemplos de hongos incluyen y no se limita a, Aspergillus spp., Blastomyces spp., Candida spp., Cladosporium, Coccidioides spp., Cryptococcus spp., Exserohilum, fusarium, Histoplasma spp., Issatchenkia spp., mucormycetes, Pneumocystis spp., tiña, scedosporium, Sporothrix, y Stachybotrys spp.

El microorganismo puede ser un protozoario. Los ejemplos de protozoarios incluyen y no se limitan a, Entamoeba histolytica, Plasmodium spp., Giardia lamblia, y Trypanosoma brucei.

Antimicrobianos ilustrativos

Cuando el microorganismo es una bacteria, los antimicrobianos ilustrativos incluyen amikacina, aminoglucósido, aminoglucósido amoxicilina, aminoglucósidos, amoxicilina, amoxicilina/clavulanato, ampicilina, ampicilina/sulbactam, antitoxina, arsfenamina, azitromicina, azlocilina, aztreonam, p-lactámico, bacitracina, capreomicina, carbapenemas, carbenicilina, cefaclor, cefadroxil, cefalexina, cefalotina, cefalotina, cefamandol, cefazolina, cefdinir, cefditoren, cefepima, cefixima, cefoperazona, cefotaxima, cefoxitina, cefpodoxima, cefprozil, ceftarolina, ceftarolina fosamil, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftobripol, ceftriaxona, cefuroxima, cefalosporina, cloranfenicol, cloranfenicol (Bs), ciprofloxacina, claritromicina, clindamicina, clofazimina, cloxacilina, colistina, co-trimoxazol, cicloserina, dalbavancina, dapsona, daptomicina, demeclociclina, diclocacilina, diritromicina, doripenem, doxiciclina, enoxacina, ertapenem, eritromicina, etambutol, etambutol (Bs), etionamida, flucloxacilina, fluoroquinolona, fluoroquinolonas, fosfomicina, furazolidona, ácido fusídico, gatifloxacina, geldanamicina, gemifloxacina, gentamicina, grepafloxacina, herbimicina, imipenem/cilastatina, isoniazida, kanamicina, levofloxacina, lincomicina, linezolida, lomefloxacina, loracarbef, macrólidos, mafenida, meropenem, meticilina, metronidazol, mezlocilina, minociclina, moxifloxacina, mupirocina, nafcilina, nafcilina, ácido nalidíxico, neomicina, netilmicina, nitrofurantoína (Bs), norfloxacina, ofloxacina, oritavancina, oxacilina, oxitetraracilina, penicilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, piperacilina/tazobactam, platensimicina, polimixina B, posizolid, pirazinamida, quinupristina/dalfopristina, radezolid, raxibacumab, rifabutina, rifampicina, rifampina, rifapentina, rifaximina, roxitromicina, sulfadiazina de plata, esparfloxacina, espectinomicina, espectinomicina (Bs), espiramicina, estreptograminas, estreptomicina, sulbactam, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfadimetoxina, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfanilimida, sulfasalazina, sulfisoxazol, sulfonamidocrisoidina, tedizolid, teicoplanina, teixobactina, telavancina, telitromicina, temafloxacina, temocilina, tetraciclina, tiamfenicol, ticarcilina, ticarcilina/clavulanato, ticarcilina/ácido clavulánico, tigeciclina, tigeciclina (Bs), tinidazol, TMP/SMX, trobamicina, torezolid, trimetoprima (Bs), trimetoprima-sulfametoxazol, troleandomicina, trovafloxacina, vancomicina y genéricos de los mismos o una variante de los mismos.

Los antimicrobianos cuyas interacciones con el microorganismo afectan y se ven afectados por las cargas negativas en la superficie del microorganismo incluyen: aminoglucósidos policatiónicos, que al unirse a la superficie celular desplazan los iones Mg 2+, que forman un puente con los componentes de la membrana lipídica, lo que altera así la membrana externa y mejora la absorción del fármaco; polimixinas catiónicas (colistina y polimixina B), cuya unión a la célula del microorganismo también depende de la carga negativa de la membrana y para las que se produce una resistencia tanto mutacional como mediada por plásmidos mediante la reducción de la carga negativa de la membrana; y daptomicina, un lipopéptido que se asemeja a los péptidos antimicrobianos catiónicos de la respuesta inmune innata del huésped y requiere Ca2+ y fosfatidilglicerol para su mecanismo de acción de alteración de la membrana y para el cual la resistencia también puede implicar una alteración en la carga de la superficie celular.

Cuando el microorganismo es un hongo, los antimicrobianos ilustrativos incluyen 5-fluorocitosina, abafungina, albaconazol, alilaminas, anfotericina B, ancobon, anidulafungina, azole, bálsamo de Perú, ácido benzoico, bifonazol, butoconazol, candicidina, caspofungina, ciclopirox, clotrimazol, cresemba, violeta cristal, diflucano, equinocandinas, econazol, efinaconazol, epoxiconazol, fenticonazol, filipina, fluconazol, flucitosina, grifulvin V, griseofulvina, gris-Peg, haloprogina, hamicina, imidazoles, isavuconazol, isavuconazonio, Isoconazol, itraconazol, ketoconazol, limisil, lulicunazol, micafungina, miconazol, natamicina, noxafil, nistatina, omoconazol, onmel, oravig, oxiconazol, posaconazol, propiconazol, ravuconazol, rimocidina, sertaconazol, sporanox, sulconazol, terbinafina, terconazol, tiazoles, tiocarbamato antifúngico, tioconazol, tolnaftato, tiazoles, ácido undecilénico, Vfend, voriconazol y genéricos de los mismos o una variante de los mismos.

Cuando el microorganismo es un protozoario, los antimicrobianos ilustrativos incluyen 8-aminoquinolina, acetarsol, agentes contra amebozoos, ailantona, amodiaquina, anfotericina B, amprolium, agente antitricomonal, aplasmomicina, arstinol, ácido artelínico, arteméter, arteméter/lumefantrina, artemisina, artemotil, arterolano, artesunato, artesunato/amodiaquina, atovacuona, atovacuona/proguanil, azanidazol, azitromicina, benznidazol, broxiquinolina, buparvacuona, carbarsona, carnidazol, chiniofon, cloroquina, clorproguanil, clorproguanil/dapsona, clorproguanil/dapsona/artesunato, clorquinaldol, cromalveolato antiparisíticos, cincona, cipargamina, clazuril, clefamida, clioquinol, coccidiostato, codinaeopsina, cotrifazida, criptolepina, cicloguanil, dehidroemetina, difetarsona, dihidroartemisinina, diloxanida, diminazen, disulfiram, doxiciclina, eflornitina, ELQ-300, emetina, etofamida, excavata antiparisíticos, fumagilina, furazolidona, glicobiarsol, GNF6702, halofantrina, hidroxicloroquina, imidocarb, ipronidazol, corteza de jesuíta, KAF156, lumefantrina, maduramicina, mefloquina, megazol, antimoniato de meglumina, melarsoprol, mepacrina, metronidazol, miltefosina, neurolenina B, nicarbazina, nifurtimox, nimorazol, nitarsona, nitidina, nitrofural, olivacina, ornidazol, oroidin, pamaquina, paromomicina, pentamidina, antimonio pentavalente, fanquinona, fenamidina, piperaquina, primaquina, proguanil, Project 523, propenidazol, pirimetamina, pironaridina, quinfamida, quinina, ronidazol, esquédula romana, SCYX-7158, Secnidazol, Semapimod, estibogluconato de sodio, espiroindolona, sulfadoxina, sulfadoxina-pirimetamina, sulfaleno, suramina, tafenoquina, teclozan, tenonitrozol, tilbroquinol, tinidazol, trimetrexato, agente tripanocida, tintura de Warburg, y genéricos de los mismos o una variante de los mismos.

Un antimicrobiano puede ser un fármaco que opera mediante un mecanismo similar a un fármaco aquí mencionado. En la presente invención pueden usarse otros fármacos antimicrobianos conocidos en la técnica.

Suspensiones líquidas

Una suspensión líquida de microorganismos puede agitarse mediante agitación mecánica, acústica y/o magnética. Ejemplos de agitación mecánica incluyen agitación o balanceo y/o uso de barras de agitación, paletas de agitación, cuchillas de agitación y/o hélices o impulsores de agitación.

La separación de microorganismos se realiza mediante centrifugación (por ejemplo, con una fuerza >500*g), separación magnética, filtración (por ejemplo, a través de un filtro que tiene poros menores o iguales a 0,45 micrones, y preferentemente menores o iguales a 0,2 micrones), electroforesis, dielectroforesis, precipitación, aglutinación o cualquier combinación de los mismas.

El líquido puede incluir un medio de crecimiento, tal como el caldo Mueller Hinton ajustado por cationes. Este medio puede contener uno o más aditivos, conocidos por los expertos en la técnica, para promover el crecimiento y la estabilidad de microorganismos. Además de los diferentes antimicrobianos, los diferentes pocillos de prueba pueden contener uno o más aditivos conocidos por mejorar la precisión de AST para antimicrobianos específicos. Por ejemplo, puede añadirse cloruro de sodio adicional a las pruebas que comprenden oxacilina y puede añadirse calcio adicional a las pruebas que comprenden daptomicina.

Cartucho

El tipo de cartucho no está limitado. Un cartucho es un recipiente que es capaz de contener y permitir el crecimiento de una suspensión líquida de microorganismos. Los ejemplos no limitantes de un cartucho incluyen un frasco de cultivo, una placa de cultivo, una placa de Petri, una placa de bioensayo, un tubo de cultivo, un tubo de ensayo, un tubo de microcentrífuga, una botella, una placa de micropocillos, una placa de multipocillos, una placa de microtitulación, una microplaca. El cartucho puede contener una recámara. El cartucho puede incluir una pluralidad de cámaras, cada cámara es un espacio capaz de contener una suspensión líquida en aislamiento físico de otro espacio; un ejemplo de cámara es un pozo en una placa de paredes múltiples. El cartucho puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 48, 96, 192, 384, 1536 o más cámaras, y cualquier número de cámaras intermedias. Dispositivo óptico

Cualquier dispositivo óptico (por ejemplo, microscopio, lector de microplacas) con una serie de características variables que sea capaz de detectar una señal es útil en la presente invención. Por ejemplo: pueden usarse para la excitación lámpara de amplio espectro (por ejemplo, xenón), lámparas de espectro estrecho, láser, LED, iluminación de multifotón, confocal o de reflexión interna total. Las cámaras (simples o múltiples), simples o matrices (ID o 2D) de fotodiodos, fotodiodos de avalancha, sensores CMOS o CCD, fotomultiplicadores de estado sólido (por ejemplo, fotomultiplicadores de silicio) y/o tubo fotomultiplicador (simple o múltiple) con resolución espectral basada tanto en filtro como en rejilla (una o más longitudes de onda de emisión resueltas espectralmente) son posible en el lado de la detección.

Estuches

Los términos "estuches" y "sistemas", como se usan en la presente divulgación, están destinados a hacer referencia a cosas tales como combinaciones de múltiples agentes de señalización con uno o más tipos de elementos o componentes (por ejemplo, otros tipos de reactivos bioquímicos, reactivos de detección de señales, controles (es decir, controles positivos y negativos, por ejemplo, microorganismos químicamente sensibles/resistentes), medios de separación (por ejemplo, filtros y perlas magnéticas), recipientes, envases tales como envases destinados a la venta comercial, sustratos/cartuchos en los que pueden cultivarse suspensiones de microorganismos, procesadas o contenidas, componentes de hardware electrónico y software registrados en un medio legible por procesador no transitorio).

Otro aspecto de la presente divulgación es un estuche para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos. El estuche incluye un agente de señalización capaz de unirse a una superficie de los microorganismos intactos de interés; una solución para incubar una muestra que contiene microorganismos; y uno o más reactivos para generar señales a partir del agente de señalización.

En casos, el agente de señalización se asocia con uno o más restos de unión capaces de unirse directa o indirectamente a los microorganismos intactos de interés.

En casos, el uno o más restos de unión se seleccionan de anticuerpos, lectinas, péptidos naturales y/o sintéticos, ligandos sintéticos y/o naturales, polímeros sintéticos y/o naturales, glicopolímeros sintéticos y/o naturales, proteínas y/o polímeros de unión a carbohidratos, proteínas y/o polímeros de unión a glicoproteínas, moléculas pequeñas cargadas, otras proteínas, bacteriófagos y/o aptámeros.

En casos, el uno o más restos de unión pueden ser un anticuerpo policlonal y/o monoclonal.

En casos, el uno o más restos de unión pueden ser un ligando y/o péptido sintético y/o natural. El ligando y/o péptido puede seleccionarse de bis(zinc-dipicolilamina), péptido TAT, serina proteasas, catelicidinas, dextrinas catiónicas, ciclodextrinas catiónicas, ácido salicílico, lisina y combinaciones de los mismos.

En casos, el uno o más restos de unión pueden ser un polímero y/o glicopolímero sintético y/o natural. El polímero natural y/o sintético puede ser amilopectina, poli(N-[3-(dimetilamino)propil]metacrilamida), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de poli[2-(N,N-dimetilamino)etilo] y combinaciones de los mismos. El polímero y/o glicopolímero natural y/o sintético puede incluir restos que incluyen, pero no se limita a, quitosano, gelatina, dextrano, trehalosa, celulosa, manosa, dextranos catiónicos y ciclodextranos, o combinaciones de los mismos que incluyen, pero no se limita a, polímeros de cobloqueo, injerto y alternantes.

En casos, el uno o más restos de unión pueden incluir una glicoproteína seleccionada de lectina de unión a manosa, otras lectinas, anexinas y combinaciones de las mismas.

En casos, el uno o más restos

unión pueden incluir dos o más restos de unión.

En casos, el uno o más restos de unión pueden unirse directa o indirectamente a una o más biomoléculas presentes en la superficie del microorganismo. Las biomoléculas ilustrativas incluyen peptidoglicanos, mureínas, manoproteínas, porinas, beta-glucanos, quitina, glicoproteínas, polisacáridos, lipopolisacáridos, lipooligosacáridos, lipoproteínas, endotoxinas, ácidos lipoteicoicos, ácidos teicoicos, lípido A, dominios de unión de carbohidratos, bombas de eflujo, otras proteínas asociadas a la pared celular y/o a la membrana celular, otros fosfolípidos aniónicos y una combinación de los mismas.

En casos, el resto de unión es una nanopartícula.

En casos, el resto de unión es un bacteriófago.

En casos, el uno o más restos

unión pueden unirse específicamente a una o más biomoléculas.

En casos, el uno o más restos

unión pueden unirse a una o más biomoléculas específicas de especie.

En casos, el uno o más restos de unión pueden unirse a los microorganismos de forma no específica, por ejemplo, mediante una interacción no covalente y mediante la formación de un enlace covalente.

En casos, el estuche incluye además perlas magnéticas para separar magnéticamente los microorganismos del sobrenadante.

En casos, las perlas magnéticas están asociadas con uno o más restos de unión que se unen a microorganismos. El uno o más restos de unión asociados con las perlas magnéticas pueden ser idénticos a aquellos asociados con los agentes de señalización. Los uno o más restos de unión asociados con las perlas magnéticas pueden ser diferentes de los asociados con los agentes de señalización.

En casos, las perlas magnéticas tienen diámetros que oscilan entre 20 nm y 20 micrones.

En casos, el estuche incluye además uno o más iones o moléculas pequeñas para mejorar la unión entre los restos de unión y el microorganismo.

En casos, la solución comprende sal <0,15 M.

En casos, el estuche incluye además un agente de unión a microorganismos, y en donde el resto de unión se une a los microorganismos indirectamente a través del agente de unión a microorganismos. El resto de unión puede conjugarse con estreptavidina, neutravidina o avidina y el agente de unión a microorganismos puede biotinilarse. El resto de unión puede ser un anticuerpo que se une a un dominio Fc específico de especie y el agente de unión a microorganismos puede ser un anticuerpo capaz de unirse a los microorganismos con el dominio Fc específico de especie.

En casos, el agente de señalización puede incluir uno o más de un quimioluminóforo, un catalizador o una enzima. La enzima puede ser al menos una de peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa, beta-D-galactosidasa, beta-lactamasa y una combinación de las mismas. El catalizador puede ser un compuesto organometálico.

En casos, el agente de señalización se proporciona en forma de nanopartícula, por ejemplo, el agente de señalización se encapsula dentro de una nanopartícula. La nanopartícula puede ser disociable, lo que puede incluir un óxido metálico; el óxido metálico puede ser o incluir óxido de hierro, óxido de cesio y/o óxido de cerio.

En casos, se realizan cero, uno o dos lavados antes de determinar los niveles de señal.

En casos, se realizan cero, uno o dos lavados antes de la adición de los agentes de señalización.

En casos, el estuche incluye además un reactivo revelador para producir una señal medible.

En casos, el uno o más reactivos incluyen reactivos para una reacción catalítica y un reactivo que detiene la reacción catalítica.

En casos, el estuche comprende además un dispositivo para medir la señal, por ejemplo, una señal óptica y/o eléctrica. La medición óptica puede ser fluorescente, fluorescente de resolución temporal, absorbente y/o luminiscente.

En casos, el estuche comprende además una placa multipocillos, por ejemplo, una placa de 24 pocillos, 96 pocillos, 192 pocillos o 384 pocillos.

En casos, contiene además instrucciones para usar el estuche para realizar un método divulgado en la presente descripción. El estuche puede contener además instrucciones para realizar las etapas realizadas antes o después de uno o más métodos como se describe en la presente descripción.

En un caso, se proporcionan estuches que contienen los reactivos necesarios para llevar a cabo uno o más métodos como se describe en la presente descripción o reactivos necesarios para llevar a cabo etapas antes o después de uno o más métodos como se describe en la presente descripción.

Métodos de tratamiento

Como se usa en la presente descripción, los términos "tratar", "que trata", "tratamiento" y similares se refieren a reducir o mejorar un trastorno y/o un síntoma asociado con el mismo. Se apreciará que, aunque no se excluye, el tratamiento de un trastorno o afección no requiere que el trastorno, afección o síntomas asociados con el mismo se eliminen por completo. El tratamiento puede incluir que un profesional de la salud o un científico de diagnóstico haga una recomendación a un sujeto para un curso de acción o régimen de tratamiento deseado, por ejemplo, una prescripción.

Como se usa en la presente descripción, los términos "prevenir", "que previene", "prevención", "tratamiento profiláctico" y similares se refieren a reducir la probabilidad de desarrollar un trastorno o afección en un sujeto, que no tiene, pero está en riesgo de padecerla o susceptible de desarrollar un trastorno o afección.

El término "métodos de tratamiento" incluye métodos de manejo y, cuando se usa en relación con infecciones, organismos microbianos o infección, incluye la mejora, eliminación, reducción, prevención u otro alivio o tratamiento de los efectos perjudiciales del microbio de infecciones.

Como se usa en la presente descripción, los términos "fármaco", "medicación", "terapéutica", "agente activo", "compuesto terapéutico", "composición" o "compuesto" se usan indistintamente y se refieren a cualquier entidad química, farmacéutica, fármaco, biológica, botánica y similares que se pueden usar para tratar o prevenir una enfermedad, padecimiento, afección o trastorno de la función corporal. Un fármaco puede comprender compuestos tanto conocidos como potencialmente terapéuticos. Puede determinarse que un fármaco es terapéutico al detectar mediante el uso de la detección conocida por los expertos en la técnica. Un "compuesto terapéutico conocido", "fármaco" o "medicación" se refiere a un compuesto terapéutico que se ha demostrado (por ejemplo, mediante ensayos con animales o experiencia previa con la administración a seres humanos) que es efectiva en dicho tratamiento. Un "régimen terapéutico" se refiere a un tratamiento que comprende un "fármaco", "medicación", "terapéutica", "agente activo", "compuesto terapéutico", "composición" o "compuesto" como se divulga en la presente descripción y/o un tratamiento que comprende modificación del comportamiento por parte del sujeto y/o un tratamiento que comprende un medio quirúrgico.

Un antimicrobiano, por ejemplo, un antibiótico, es un agente capaz de matar un microorganismo o inhibir el crecimiento de un microorganismo.

Agentes de señalización y fijación química

En casos, la invención puede emplear un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo. En casos, dicha unión no es específica. En casos, dicha unión es específica.

En casos de la presente divulgación, un agente de señalización está presente durante una etapa de incubación de un método descrito en la presente descripción. En casos, un agente de señalización está presente después de una etapa de incubación de un método descrito en la presente descripción.

En casos, la unión comprende la formación de un enlace covalente. En casos, un agente de señalización es capaz de unirse a la superficie de un microorganismo, en donde dicha unión comprende la formación de un enlace covalente. En casos, un método como se describe en la presente descripción da como resultado la formación de un enlace covalente entre un grupo en la superficie de un microorganismo (por ejemplo, a través de un grupo reactivo tal como un grupo electrófilo o nucleófilo como se describe en la presente descripción) y un agente de señalización como se describe en la presente descripción. En casos, un agente de señalización ha formado un enlace covalente con la superficie de un microorganismo.

En casos, la unión comprende la formación de una interacción no covalente. En casos, un agente de señalización es capaz de unirse a la superficie de un microorganismo, en donde dicha unión comprende la formación de una interacción no covalente. En casos, un método como se describe en la presente descripción da como resultado la formación de interacción no covalente entre un grupo en la superficie de un microorganismo (por ejemplo, a través de un grupo reactivo tal como un grupo electrófilo o nucleófilo como se describe en la presente descripción) y un agente de señalización como se describe en la presente descripción. En casos, un agente de señalización ha formado una interacción no covalente con la superficie de un microorganismo.

En casos, una interacción no covalente comprende: interacción iónica, interacción ion-ion, interacción dipolo-dipolo, interacción ion-dipolo, interacción electrostática, dispersión de London, interacción de van der Waals, enlace de hidrógeno, interacción n- n, interacción hidrófoba, o cualquier combinación de los mismos. En casos, una interacción no covalente es: interacción iónica, interacción ion-ion, interacción dipolo-dipolo, interacción ion-dipolo, interacción electrostática, dispersión de London, interacción de van der Waals, enlace de hidrógeno, interacción n- n, interacción hidrófoba, o cualquier combinación de los mismos.

En casos, una interacción no covalente comprende interacciones iónicas, interacciones de van der Waals, interacciones hidrófobas, interacciones n-n o enlaces de hidrógeno, o cualquier combinación de los mismos. En casos, una interacción no covalente comprende interacción iónica, interacción de van der Waals, enlace de hidrógeno o interacción n- n, o cualquier combinación de las mismas

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un grupo (por ejemplo, un grupo químico o bioquímico) capaz de unirse a las membranas, paredes, proteínas, orgánulos, sacáridos, lípidos, envoltura celular o ácidos nucleicos de los microorganismos, o cualquier otra combinación de los mismos. En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un grupo químico (por ejemplo, un grupo nucleófilo o un grupo electrófilo) capaz de unirse a las membranas, paredes, proteínas, orgánulos, sacáridos, lípidos, envoltura celular o ácidos nucleicos de los microorganismos, o cualquier otra combinación de los mismos. En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un grupo bioquímico capaz de unirse a las membranas, paredes, proteínas, orgánulos, sacáridos, lípidos, envoltura celular o ácidos nucleicos de los microorganismos, o cualquier otra combinación de los mismos.

En casos, la superficie puede incluir una biomolécula a la que se une o asocia el agente de señalización. Las biomoléculas ilustrativas incluyen peptidoglicanos, mureínas, manoproteínas, porinas, beta-glucanos, quitina, glicoproteínas, polisacáridos, lipopolisacáridos, lipooligosacáridos, lipoproteínas, endotoxinas, ácidos lipoteicoicos, ácidos teicoicos, lípido A, dominios de unión de carbohidratos, bombas de eflujo, otras proteínas asociadas a la pared celular y/o a la membrana celular, otros fosfolípidos aniónicos y una combinación de los mismas.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un grupo bioquímico capaz de unirse a las membranas, paredes, proteínas, orgánulos, sacáridos, lípidos, envoltura celular o ácidos nucleicos de los microorganismos, o cualquier otra combinación de los mismos.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un grupo químico (por ejemplo, un grupo funcional nucleófilo o electrófilo) capaz de unirse a las membranas, paredes, proteínas, orgánulos, sacáridos, lípidos, envoltura celular o ácidos nucleicos de los microorganismos, o cualquier otra combinación de los mismos. En casos, dicho grupo químico es un grupo funcional nucleófilo. En casos, dicho grupo químico es un grupo funcional electrófilo.

En casos, un agente de señalización es un agente de señalización bioquímico. En casos, un agente de señalización bioquímica comprende una biomolécula tal como un anticuerpo, ligando, proteína, aptámero, ADNsc, ARNsc o APNsc).

En casos, un agente de señalización es un agente de señalización químico. En casos, un agente de señalización químico es un compuesto químico (por ejemplo, un compuesto químico sintético). En casos, un agente de señalización químico no comprende una biomolécula tal como un anticuerpo, ligando, proteína, aptámero, ADNsc, ARNsc o APNsc).

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende

un grupo enlazador L; y

un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico). En casos, un grupo amplificador es un grupo amplificador 104, que es un amplificador químico o bioquímico. En casos, un grupo amplificador 104 es un amplificador químico. En casos, un grupo amplificador 104 es un amplificador bioquímico.

En casos, un agente de señalización es un compuesto químico. En casos, un compuesto químico comprende un grupo amplificador químico tal como aquellos descritos en la presente descripción).

En casos, un grupo enlazador L comprende la región conservada (Fc) de un anticuerpo.

En casos, un grupo enlazador L es capaz de formar un enlace covalente con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico).

En casos, un grupo enlazador L forma un enlace covalente con un grupo amplificador de señal (por ejemplo, un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico).

En casos, un grupo enlazador L es capaz de formar una o más interacciones no covalentes con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico).

En casos, un grupo enlazador L forma una o más interacciones no covalentes con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico).

En casos, un grupo enlazador L comprende un grupo (por ejemplo, un grupo químico o bioquímico) capaz de unirse a la superficie de un microorganismo. En casos, un grupo enlazador L comprende un grupo (por ejemplo, un grupo químico o bioquímico) que se une a la superficie de un microorganismo.

En casos, un grupo enlazador L comprende un grupo (por ejemplo, un grupo químico o bioquímico) que es capaz de formar un enlace covalente con la superficie de un microorganismo. En casos, un grupo enlazador L comprende un grupo (por ejemplo, un grupo químico o bioquímico) que forma un enlace covalente a la superficie de un microorganismo.

En casos, un grupo enlazador L comprende un grupo (por ejemplo, un grupo químico o bioquímico) que es capaz de formar una o más interacciones no covalentes con la superficie de un microorganismo. En casos, un grupo enlazador L comprende un grupo (por ejemplo, un grupo químico o bioquímico) que forma una o más interacciones no covalentes con la superficie de un microorganismo.

En casos, un grupo enlazador L comprende un resto químico 101, en donde dicho resto químico es capaz de formar una interacción no covalente con la superficie de un microorganismo. En casos, un grupo enlazador L comprende un resto químico 101, en donde dicho resto químico es capaz de formar un enlace covalente con la superficie de un microorganismo. En casos, un grupo enlazador L comprende un resto químico 101, en donde dicho resto químico forma una interacción no covalente con la superficie de un microorganismo. En casos, un grupo enlazador L comprende un resto químico 101, en donde dicho resto químico forma un enlace covalente con la superficie de un microorganismo.

En casos, un grupo enlazador L comprende un resto espaciador 102. En casos, el resto espaciador 102 se une covalentemente al resto químico 101 y/o al resto químico 103. En casos, el resto espaciador 102 se une covalentemente al resto químico 101. En casos, el resto espaciador 102 se une covalentemente al resto químico 103. En casos, el resto espaciador 102 se une covalentemente al resto químico 101 y al resto químico 103. En casos, el resto espaciador 102 forma una interacción no covalente con el resto químico 101 y/o con el resto químico 103. En casos, el resto espaciador 102 forma una interacción no covalente con el resto químico 101. En casos, el resto espaciador 102 forma una interacción no covalente con el resto químico 103. En casos, el resto espaciador 102 forma una interacción no covalente con el resto químico 101 y con el resto químico 103.

En casos, un grupo enlazador L comprende un resto químico 103, en donde dicho resto químico es capaz de formar un enlace covalente con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico). En casos, un grupo enlazador L comprende un resto químico 103, en donde dicho resto químico ha formado un enlace covalente con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico). En casos, un grupo enlazador L comprende un resto químico 103, en donde dicho resto químico es capaz de formar una interacción no covalente con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico). En casos, un grupo enlazador L comprende un resto químico 103, en donde dicho resto químico ha formado una interacción no covalente con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico).

En casos, un agente de señalización es un compuesto químico que comprende un grupo enlazador L que comprende:

un resto químico 101, en donde dicho resto químico es capaz de formar un enlace covalente o una interacción no covalente con la superficie de los microorganismos;

un resto espaciador 102, en donde el resto espaciador se une covalentemente al resto químico 101 y al resto químico 103; y

un resto químico 103, en donde dicho resto químico ha formado o puede formar un enlace covalente con un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico.

En casos, un agente de señalización es un compuesto químico que comprende un grupo enlazador L que comprende:

un resto químico 101, en donde dicho resto químico es capaz de formar un enlace covalente o una interacción no covalente con la superficie de un microorganismo;

un resto espaciador 102, en donde el resto espaciador se une covalentemente al resto químico 101 y al resto químico 103; y

un resto químico 103, en donde dicho resto químico ha formado o puede formar una interacción no covalente con un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico.

En casos, un grupo enlazador comprende un resto químico 101. En casos, un grupo enlazador comprende más de un resto químico 101 (por ejemplo, un grupo enlazador comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 restos químicos 101).

En casos, un grupo enlazador comprende un resto espaciador 102. En casos, un grupo enlazador comprende más de un resto espaciador 102 (por ejemplo, un grupo enlazador comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 restos espaciadores 102). En casos, un grupo enlazador comprende un resto químico 103. En casos, un grupo enlazador comprende más de un resto químico 103 (por ejemplo, un grupo enlazador comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 restos químicos 103).

En casos, un grupo enlazador comprende: un resto químico 101, un resto espaciador 102 y un resto químico 103. En casos, un grupo enlazador consta de: un resto químico 101, un resto espaciador 102 y un resto químico 103.

En casos, un grupo enlazador tiene la estructura de subestructura (I):

-101-102-103-, (I)

en donde

"101" representa un resto químico 101;

"102" representa un resto espaciador 102; y

"103" representa un resto químico 103.

En casos, un resto químico 101 es capaz de formar un enlace covalente con la superficie de un microorganismo. En casos, un resto químico 101 es capaz de formar un enlace covalente con la superficie de un microorganismo en presencia de uno o más agentes que promueven el acoplamiento (también denominados por la presente descripción como agentes de acoplamiento).

En casos, los agentes que promueven el acoplamiento incluyen glutaraldehído, formaldehído, paraformaldehído, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), N,N'diciclohexilcarbodiimida (DCC), N-ciclohexil-N'-(2-morfolinoetil)carbodiimida-metil-p-toluenosulfonato (CMC), diisopropilcarbodiimida (DIC), (1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato) (HATU), reactivo de Woodward, N,W-carbonil diimidazol, N-hidroisuccinimida (NHS) o N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS), o cualquier combinación de los mismos.

En casos, los agentes que promueven el acoplamiento incluyen aldehidos, acrilatos, amidas, imidas, anhídridos, clorotriazinas, epóxidos, isocianatos, isotiocianatos, ácidos orgánicos, monómeros, polímeros, silanos o silcatos, o cualquier combinación de los mismos.

En casos, los agentes que promueven el acoplamiento incluyen una carbodiimida, una sal de fosfonio o una sal de amonio, o cualquier combinación de las mismas.

En casos, los agentes que promueven el acoplamiento incluyen glutaraldehído, N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbonato (EDC), (1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato) (HATU), (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N, N,N,N-tetrametiluronio) (HbTU), N-hidroxisuccinimida (NHS), N,N'-diciclohexilcarbodiimida DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HOOBt), hidroxibenzotriazol (HOBT), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt), (N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDAC), 4-(N,N-dimetilamino)piridina (DMAP), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)-fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tripirrolidino-fosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de bromotripirrolidino-fosfonio (PyBrOP), hexafluorofosfato de 7-aza-benzotriazol-1-iloxi-tripirrolidinofosfonio (PyAOP), hexafluorofosfato de etil ciano(hidroxiimino)acetato-O2)-tri-(1-pirrolidinil)- fosfonio (PyOxim), 3-(dietoxi-fosforiloxi)-1,2,3-benzo[d]triazin-4(3H)-ona (DEPBT), hexafluorofosfato de 2-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilaminio (HCTU), N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(5-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-dimetilamino-morfolino]-uronio (HDMC), hexafluorofosfato de 1-[1-(ciano-2-etoxi-2-oxoetilideneaminooxi)-dimetilamino-morfolino]-uronio (COMU), tetrafluoroborato de 2-(1-oxi-piridin-2-il)-1,1,3,3-tetrametilisotiouronio (TOTT), hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformamidinio (TFFH), N-Etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ), anhídrido de ácido 2-propanofosfónico (PPA), trifosgeno, 1,1'-carbonildiimidazol (CDI), hexafluorofosfato de [(6-nitrobenzotriazol-1-il)oxi]tris(pirrolidino)fosfonio (PyNOP), hexafluorofosfato de [[6-(trifluorometil)benzotriazol-1-il]oxi]tris(pirrolidino)fosfonio (PyFOP), hexafluorofosfato de [[4-nitro-6-(trifluorometil)benzotriazol-1-il]oxi]tris(pirrolidino)fosfonio (PyNFOP), hexafluorofosfato de [(6-nitrobenzo-triazol-1-il)oxi]tris(dimetil-amino)fosfonio (NOP), 1-6-naftalenosulfoniloxi benzotriazol (NSBt), 1-p-naftalenosulfoniloxi-6-nitrobenzotriazol (W-NSBt), hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformamidinio (TFFH), hexafluorofosfato de 6/s(tetrametileno)fluoroformamidinio (BTFFH), hexafluorofosfato de 1,3-dimetil-2-fluoro-4,5-dihidro-1H-imidazolio (DFIH), cloruro cianúrico (CC), o 2,4-dicloro-6-metoxi-1,3,5-triazina (DCMT), y 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT), o cualquier combinación de los mismos. En casos, los agentes que promueven el acoplamiento incluyen EDC, HATU, HBTU, NHS, DCC, HOBT o PyBOP, o cualquier combinación de los mismos.

En casos, los agentes que promueven el acoplamiento incluyen EDC, DCC, CMC, DIC o HATU, o cualquier combinación de los mismos.

En casos, los agentes que promueven el acoplamiento incluyen glutaraldehído, formaldehído o paraformaldehído, o cualquier combinación de los mismos.

En casos, un resto químico 101 es capaz de formar una interacción no covalente con la superficie de un microorganismo (por ejemplo, cualquier interacción no covalente descrita en la presente descripción). En casos, una interacción no covalente comprende: iónica, ion-ion, dipolo-dipolo, ion-dipolo, electrostática, dispersión de London, van der Waals, enlace de hidrógeno, o n- n, o cualquier combinación de los mismos.

En casos, un resto químico 101 es capaz de formar una interacción no covalente con la superficie de un microorganismo, en donde dicha interacción no covalente comprende interacciones iónicas, interacciones de van der Waals, interacciones hidrófobas, interacciones n-n o enlaces de hidrógeno, o cualquier combinación de los mismos. En casos, un resto químico 101 comprende un grupo funcional nucleófilo. En casos, un resto químico 101 comprende un grupo formado a partir de un grupo funcional nucleófilo.

En casos, un grupo funcional nucleófilo es: amino, amido, hidrazino, hidroxiamino, hidroxi o tio. En casos, un grupo funcional nucleófilo es: amino, hidrazino, hidroxiamino o tio. En casos, un grupo funcional nucleófilo comprende: amino, hidrazino, hidroxiamino, hidroxi o tio. En casos, un grupo funcional nucleófilo es carboxamida, N-hidroxicarboxamida, carboxilhidrazida o guanidino.

En casos, un grupo funcional nucleófilo es -NH2, -NHNH2, -CONHOH, -CONHNH2,-ONH2, -OH o -SH. En casos, un grupo funcional nucleófilo es -NH2, - NHNH2, -CONHNH2 o -ONH2.

En casos, un resto químico 101 comprende un grupo funcional electrófilo.

En casos, un resto químico 101 comprende un grupo formado a partir de un grupo funcional electrófilo.

En casos, un grupo funcional electrófilo comprende un aldehído, una cetona, un ácido carboxílico, un éster carboxílico, un haluro de ácido carboxílico (por ejemplo, cloruro de acetilo) o un anhídrido de ácido carboxílico (por ejemplo, anhídrido acético).

En casos, un grupo funcional electrófilo comprende un aldehido, una a-halo cetona, una maleimida, una succinimida, una hidroxisuccinimida, un isotiocianato, un isocianato, una acilazida, un cloruro de sulfonilo, un éster de tosilato, un glioxal, un epóxido, un oxirano, un carbonato, un imidoéster, un anhídrido, un fluorofenil éster, un derivado de hidroximetilfosfina, un carbonato, un haloacetilo, una clorotriazina, un haloacetilo, un haluro de alquilo, una aziridina o un derivado de acriloílo. En casos, un grupo funcional electrófilo es un aldehido, una a-halo cetona, una maleimida, una succinimida, una hidroxisuccinimida, un isotiocianato, un isocianato, una acilazida, un cloruro de sulfonilo, un éster de tosilato, un glioxal, un epóxido, un oxirano, un carbonato, un imidoéster, un anhídrido, un fluorofenil éster, un derivado de hidroximetilfosfina, un carbonato, un haloacetilo, una clorotriazina, un haloacetilo, un haluro de alquilo, una aziridina o un derivado de acriloílo.

En casos, un grupo funcional electrófilo comprende un grupo aldehido, a-halo cetona, maleimida, succinimida o hidroxisuccinimida.

En casos, un grupo funcional electrófilo comprende -CHO,

En casos, un grupo funcional electrófilo comprende -CHO,

En casos, el resto químico 101 comprende un grupo que es alquilo, alquenilo, alquinilo, fenilo, heteroarilo, haloalquilo, hidroxi, carbonilo, haluro de acilo, alcoxicarbonil)oxi, carboxi, halocetona, alcoxi, alcoxiol (hemiacetal o) hemicetal, dialcoxi (por ejemplo, cetal o acetal), trialcoxi (ortoéter), carbamoilo, amino, amonio, imino, imido, succinamido, maleidido, hidroxisuccinamido, biotina, D-Biotina, azido, azo, cianato, isocianato, nitroxi, ciano, isociano, nitrosooxi, nitro, nitroso, oxima, sulfanilo, sulfinilo, sulfonilo, sulfino, sulfo, tiocianato, isotiocianato, tioílo, fosfato o boronato.

En casos, el resto espaciador 102 es hidrófobo. En casos, el resto espaciador 102 es hidrófilo.

En casos, el resto espaciador 102 es peptídico (por ejemplo, derivado de enlaces peptídicos).

En casos, el resto espaciador 102 comprende enlaces inorgánicos. En casos, el resto espaciador 102 comprende enlaces orgánicos. En casos, el resto espaciador 102 comprende únicamente enlaces orgánicos.

En casos, el resto espaciador 102 es oligomérico. En casos, el resto espaciador 102 es polimérico. En casos, el resto espaciador 102 comprende segmentos (por ejemplo, 1 a aproximadamente 300, 1 a aproximadamente 200, 1 a aproximadamente 100, 1 a aproximadamente 50, 1 a aproximadamente 25, o 1 a aproximadamente 10, o 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 segmentos) de metileno (-CH2-), etilenglicol (-CH2CH2O-), iminoetileno (-CH2CH2NH-), alcohol vinílico (-CH2CHOH-)x, ácido láctico (-CH(CH3)-C(O)-O-), ácido acrílico (-CH2CH2(CO2H)-), ácido metacrílico (-CH2C(CHs)(CO2H)-), o metacrilato de metilo (-CH2C(CH3)(CO2CH3)-).

En casos, el resto espaciador 102 comprende un segmento que es

En casos, n, m, p y q; es independientemente un número entero de 1 a aproximadamente 300 (por ejemplo, 1 a aproximadamente 200, 1 a aproximadamente 100, 1 a aproximadamente 50, 1 a aproximadamente 25 o 1 a aproximadamente 10). En casos, cada uno de n, m, p y q es independientemente 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10.

En casos, el resto espaciador 102 comprende

En casos, R' es independientemente hidrógeno o un grupo que es alquilo C1-C12, alquenilo C2-C12 o alquinilo C2-C12. En casos, o es un número entero de 1 a aproximadamente 300 (por ejemplo, 1 a aproximadamente 200, 1 a aproximadamente 100, 1 a aproximadamente 50, 1 a aproximadamente 25 o 1 a aproximadamente 10). En casos, o es independientemente 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10.

En casos, el resto espaciador 102 comprende

En casos, R es independientemente hidrógeno o un grupo que es alquilo C1-C12, alquenilo C2-C12 o alquinilo C2-C12. En casos, r es un número entero de 1 a aproximadamente 300 (por ejemplo, 1 a aproximadamente 200, 1 a aproximadamente 100, 1 a aproximadamente 50, 1 a aproximadamente 25 o 1 a aproximadamente 10). En casos, r es independientemente 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10.

En casos, el resto espaciador 102 comprende

En casos, R es independientemente hidrógeno o un grupo que es alquilo C1-C12, alquenilo C2-C12 o alquinilo C2-C12. En casos, s es un número entero de 1 a aproximadamente 300 (por ejemplo, 1 a aproximadamente 200, 1 a aproximadamente 100, 1 a aproximadamente 50, 1 a aproximadamente 25 o 1 a aproximadamente 10). En casos, s es independientemente 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10.

En casos, el resto espaciador 102 comprende

En casos, t es un número entero de 1 a aproximadamente 300 (por ejemplo, 1 a aproximadamente 200, 1 a aproximadamente 100, 1 a aproximadamente 50, 1 a aproximadamente 25 o 1 a aproximadamente 10). En casos, t es independientemente 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10.

En casos, el resto espaciador 102 comprende:

En casos, el resto espaciador 102 es un polímero que comprende grupos repetidos, que comprenden grupos funcionales alquilo, alcoxi, éster, acrílico, amino, hidroxilo o acilhidrazina, o cualquier combinación de los mismos. En casos, el resto espaciador 102 es:

en donde n, m, p y q son como se definen en la presente descripción

En casos, cada uno de n, m, o, p, q, r, s o t es independientemente un número entero de 1 a 100, de 10 a 90, de 10 a 80, de 10 a 70, de 10 a 60, de 10 a 50, de 10 a 40, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 1 a 10.

En casos, un resto químico 103 comprende un grupo que es un grupo funcional nucleófilo.

En casos, un resto químico 103 comprende un grupo formado a partir de un grupo funcional nucleófilo.

En casos, un grupo funcional nucleófilo es: amino, amido, hidrazino, hidroxiamino, hidroxi o tio. En casos, un grupo funcional nucleófilo es: amino, hidrazino, hidroxiamino o tio.

En casos, un grupo funcional nucleófilo comprende: amino, hidrazino, hidroxiamino, hidroxi o tio. En casos, un grupo funcional nucleófilo es carboxamida, N-hidroxicarboxamida, carboxilhidrazida o guanidino.

En casos, un grupo funcional nucleófilo es -NH2, -NHNH2, -CONHOH, -CONHNH2,-ONH2, -OH o -SH. En casos, un grupo funcional nucleófilo es -NH2, - NHNH2, -CONHNH2 o -ONH2.

En casos, un resto químico 103 comprende un grupo que es un grupo funcional electrófilo.

En casos, un resto químico 103 comprende un grupo formado a partir de un grupo funcional electrófilo.

En casos, un grupo funcional electrófilo comprende un aldehído, una cetona, un ácido carboxílico, un éster carboxílico, un haluro de ácido carboxílico (por ejemplo, cloruro de acetilo) o un anhídrido de ácido carboxílico (por ejemplo, anhídrido acético).

En casos, un grupo funcional electrófilo comprende un aldehído, una a-halo cetona, una maleimida, una succinimida, una hidroxisuccinimida, un isotiocianato, un isocianato, una acilazida, un cloruro de sulfonilo, un éster de tosilato, un glioxal, un epóxido, un oxirano, un carbonato, un imidoéster, un anhídrido, un fluorofenil éster, un derivado de hidroximetilfosfina, un carbonato, un haloacetilo, una clorotriazina, un haloacetilo, un haluro de alquilo, una aziridina o un derivado de acriloílo. En casos, un grupo funcional electrófilo es un aldehido, una a-halo cetona, una maleimida, una succinimida, una hidroxisuccinimida, un isotiocianato, un isocianato, una acilazida, un cloruro de sulfonilo, un éster de tosilato, un glioxal, un epóxido, un oxirano, un carbonato, un imidoéster, un anhídrido, un fluorofenil éster, un derivado de hidroximetilfosfina, un carbonato, un haloacetilo, una clorotriazina, un haloacetilo, un haluro de alquilo, una aziridina o un derivado de acriloílo.

En casos, un grupo funcional electrófilo comprende un grupo aldehido, a-halo cetona, maleimida, succinimida o hidroxisuccinimida.

En casos, un grupo funcional electrófilo comprende -CHO, -C(O)CH2l,

En casos, un grupo funcional electrófilo comprende -CHO, -C(O)CH2l,

En casos, un resto químico 103 comprende una estructura química que es carbonilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, amino, tiol, maleimida, succinimida, hidroxisuccinimida, biotinilo, anhídrido, clorotriazina, epóxido, isocianato o isotiocianato. En casos, dicho grupo que es carbonilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, amino, tiol, maleimida, succinimida, hidroxisuccinimida, biotinilo, anhídrido, clorotriazina, epóxido, isocianato o isotiocianato es capaz de formar un enlace covalente con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104). En casos, dicho grupo que es carbonilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, amino, tiol, maleimida, succinimida, hidroxisuccinimida, biotinilo, anhídrido, clorotriazina, epóxido, isocianato o isotiocianato es capaz de formar interacción no covalente con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104).

En casos, un resto químico 103 se forma a partir de una estructura química que comprende un grupo que es carbonilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, amino, tiol, maleimida, succinimida, hidroxisuccinimida, biotinilo, anhídrido, clorotriazina, epóxido, isocianato o isotiocianato. En casos, dicho grupo que es carbonilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, amino, tiol, maleimida, succinimida, hidroxisuccinimida, biotinilo, anhídrido, clorotriazina, epóxido, isocianato o isotiocianato ha formado un enlace covalente con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104). En casos, dicho grupo que es carbonilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, amino, tiol, maleimida, succinimida, hidroxisuccinimida, biotinilo, anhídrido, clorotriazina, epóxido, isocianato o isotiocianato ha formado una interacción no covalente con un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104).

En casos, un resto químico 103 comprende un grupo que es carbonilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, amino, tiol, maleimida, succinimida, hidroxisuccinimida o biotinilo.

En casos, un resto químico 103 comprende un grupo funcional carbonilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, amino, tiol, maleimida, succinimida, hidroxisuccinimida o biotinilo.

En casos, un resto químico 103 comprende:

En casos, un resto químico 103 comprende un grupo formado a partir de una estructura química que comprende un grupo que es un grupo funcional carbonilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, amino, tiol, maleimida, succinimida, hidroxisuccinimida o biotinilo.

En casos, un grupo enlazador L tiene la estructura de subestructura (II):

en donde

X representa un resto químico 101 (por ejemplo, cualquier resto químico 101 como se describe en la presente descripción;

R representa un resto espaciador 102 (por ejemplo, cualquier resto espaciador 102 como se describe en la presente descripción);

Y representa un resto químico 103 (por ejemplo, cualquier resto químico 103 como se describe en la presente descripción); y

cada uno de j y k es independientemente un número entero de 0 a 100.

En casos, X es

En casos, R es

en donde cada uno de n, m, o, p, q, r, s o t es como se describe en la presente descripción (por ejemplo, un número entero de 1 a aproximadamente 300).

En casos, Y es

En casos, X es capaz de formar un enlace covalente con la superficie de un microorganismo. En casos, X forma un enlace covalente con la superficie de un microorganismo.

En casos, X es capaz de formar una o más interacciones no covalentes con la superficie de un microorganismo. En casos, X forma una o más interacciones no covalentes con la superficie de un microorganismo.

En casos, Y es capaz de formar un enlace covalente con un grupo amplificador 104 (por ejemplo, un amplificador químico o bioquímico). En casos, Y forma un enlace covalente con un grupo amplificador tal como un grupo amplificador 104 (por ejemplo, un amplificador químico o bioquímico.)

En casos, Y es capaz de formar una o más interacciones no covalentes con un grupo amplificador 104 (por ejemplo, un amplificador químico o bioquímico). En casos, Y forma una o más interacciones no covalentes con un grupo amplificador tal como un grupo amplificador 104 (por ejemplo, un amplificador químico o bioquímico). En casos, un grupo enlazador L es:

WGA-biotina, polimixina B-biotina, anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal biotinilado, anticuerpo policlonal biotinilado, quelato de europio-anticuerpo, anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante y variantes de anticuerpo (por ejemplo, Fab: fragmento, unión al antígeno (un brazo); F(ab')2: fragmento, unión al antígeno, que incluye la región bisagra (ambos brazos); Fab': fragmento, que incluye la región bisagra (un brazo); scFv: fragmento variable monocatenario; di-scFv: fragmento variable dimérico monocatenario; sdAb: anticuerpo de dominio único; anticuerpos monoclonales biespecíficos; anticuerpo trifuncional; y BiTE: enlazador de células T biespecífico),

Los grupos amplificadores ilustrativos incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 2016/015027 y en la Solicitud Internacional No. PCT/US16/42589.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un catalizador, un fluoróforo o un tinte colorimétrico. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) es un catalizador, un fluoróforo o un tinte colorimétrico.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende una enzima, un catalizador o una nanopartícula. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) es una enzima, un catalizador o una nanopartícula.

En casos, un grupo amplificador químico comprende un catalizador, un fluoróforo, una nanopartícula o un tinte colorimétrico. En casos, un grupo amplificador químico es un catalizador, un fluoróforo, una nanopartícula o un tinte colorimétrico.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un catalizador. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) es un catalizador.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un fluoróforo. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) es un fluoróforo. Los fluoróforos ilustrativos incluyen aquellos descritos en la tabla 1 de la Solicitud Internacional No. PCT/US16/42589.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un tinte colorimétrico. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) es un tinte colorimétrico.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende una enzima. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) es una enzima.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende una nanopartícula. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) es una nanopartícula.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un lantánido.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un lantánido que es europio, estroncio, terbio, samario o disprosio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un lantánido seleccionado del grupo que consiste de: europio, estroncio, terbio, samario y disprosio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un fluoróforo orgánico.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un fluoróforo que es un complejo de coordinación.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de europio. En casos, un complejo de coordinación es un complejo de coordinación de europio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de rutenio. En casos, un complejo de coordinación es un complejo de coordinación de rutenio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de renio. En casos, un complejo de coordinación es un complejo de coordinación de renio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de paladio. En casos, un complejo de coordinación es un complejo de coordinación de paladio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de platino. En casos, un complejo de coordinación es un complejo de coordinación de platino.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un quimioluminóforo, un punto cuántico, una enzima, un catalizador de coordinación de hierro, un complejo de coordinación de europio, un complejo de coordinación de rutenio, un complejo de coordinación de renio, un complejo de coordinación de paladio, un complejo de coordinación de platino, un complejo de coordinación de samario, un complejo de coordinación de terbio o un complejo de coordinación de disprosio.

En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un quimioluminóforo. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un punto cuántico. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende una enzima. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un catalizador de coordinación de hierro. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de europio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de rutenio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de renio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de paladio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de platino. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de samario. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de terbio. En casos, un grupo amplificador (por ejemplo, un grupo amplificador 104) comprende un complejo de coordinación de disprosio.

En casos, un grupo amplificador 104 comprende un resto que es:

En casos, un grupo amplificador 104 comprende un resto que es:

En casos, un grupo amplificador 104 es un catalizador o una enzima. En casos, un grupo amplificador es peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa, beta-D-galactosidasa o beta-lactamasa.

En casos, el grupo amplificador 104 es peroxidasa de rábano picante.

En casos, el grupo amplificador 104 es un fluoróforo o tinte colorimétrico.

Los fluoróforos y tintes colorimétricos adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en The Molecular Probes® Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11na edición. (2010) y Gomes, Fernandes, y Lima J. Biochem. Biophys. Methods 65 (2005) pp 45-80. Los fluoróforos ilustrativos también incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 2016/015027 y en la Solicitud internacional No. PCT/US16/42589.

Los ejemplos de fluoróforos o tintes colorimétricos adecuados incluyen, pero no se limita a, bromuro de etidio, yoduro de propidio, verde SYTOX, fenantridinas, acridinas, indoles, imidazoles, cianina, TOTO, TO-PRO, SYTO, 5-carboxi-2,7- diclorofluoresceína, 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 5-carboxinaptofluoresceína, 5-carboxitetrametilrodamina (5-TAMRA), 5-FAM (5-carboxifluoresceína), 5-HAT (hidroxi-triptamina), 5-ROX (carboxi-X-rodamina), 6-carboxirodamina 6G, 7-amino-4-metilcumarina, 7-aminoactinomicina D (7-AAD), 7-hidroxi-4-metilcumarina, 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina, ACMA (9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina), acridinas, Alexa Fluor, alizarina, aloficocianina (APC), AMCA (aminometilcumarina), Bodipy, carboxi-X-rodamina, catecolamina, fluoresceína (FITC), hidroxicumarina, lisamina rodamina, monobromobimano, verde oregón, ficoeritrina, SYTO, tiadicarbocianina (DiSC3), tioflavina, X-rodamina, C o isotiocianato de tetrametilrodamina.

En casos, el grupo amplificador 104 es un compuesto organometálico, complejo de metal de transición o un complejo de coordinación. Los ejemplos ilustrativos se describen en, pero no se limitan a EP 0180492, EP 0321 353, EP 0539435, EP 0539477, EP 0569496, EP139675, EP64484, US 4,283,382, US 4,565,790 US 4,719,182, US 4,735,907, US 4,808,541, US 4,927,923, US 5,162,508, US 5,220, 012, US 5,324,825, US 5,346,996, US 5,373,093, US 5,432,101, US 5,457,185, US 5,512,493, US 5,527,684, US 5,534,622, US 5,627,074, US 5,696,240, US 6,100,394, US 6,340,744, US 6,524,727, US 6,717,354, US 7,067320, US 7,364,597, US 7,393,599, US 7,456,023, US 7,465,747, US 7,625,930, US 7,854,919, US 7,910,088, US 7,955,859, US 7,968,904, US 8,007,926, US 8,012,609, US 8,017,254, US 8,018,145, US 8,048,659, US 8,067100, US 8,129,897, US 8,174,001, US 8,183,586, US 8,193,174, US 8,221,719, US 8,288,763, US 8,362,691, US 8,383,249, US 8,492,783, US 8,632,753, US 8,663,603, US 8,722,881, US 8,754,206, US 8,890,402, US 8,969,862, US 9,012,034, US 9,056,138, US 9,118,028, US 9,133,205, US 9,187,690, US 9,193,746, US 9,312,496, US 9,337,432, US 9,343,685, US 9,391,288, y US 9,537,107. Los compuestos organometálicos, complejos de metales de transición o complejos de coordinación ilustrativos también incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 2016/015027 y en la Solicitud Internacional No. PCT/US16/42589.

En casos, el grupo amplificador 104 es un complejo de coordinación de lantánido.

En casos, un complejo de coordinación de lantánido es un complejo entre un lantánido (por ejemplo, Eu o Tb) y un ligando tetradentado.

En casos, un complejo de coordinación de lantánido es un complejo entre un lantánido (por ejemplo, Eu o Tb) y un ligando criptato.

En casos, el grupo amplificador 104 es un complejo de coordinación de lantano (La), cerio (Ce), praseodimio (Pr), neodimio (Pm), samario (Sm), europio (Eu), gadolinio (Gd), terbio (Tb), Disprosio (Dy), holmio (Ho), erbio (Er), tulio (Tm), iterbio (Yb), lutecio (Lu), rutenio (Ru), rodio (Rh), paladio (Pd), osmio (Os), Iridio (Ir) o platino (Pt).

En casos, el grupo amplificador 104 es un complejo de coordinación de un metal de tierras raras que colectivamente se refiere a 17 elementos que consisten de un grupo de 15 elementos desde lantano que tiene un número atómico de 57 hasta lutecio que tiene un número atómico de 71 (lantánidos), y dos elementos adicionales que consisten de escandio que tiene un número atómico de 21 e itrio que tiene un número atómico de 39. Los ejemplos específicos de metales de tierras raras incluyen europio, terbio, lantano, cerio, praseodimio, neodimio, prometio, samario, gadolinio, disprosio, holmio, erbio, tulio, iterbio, lutecio, escandio e itrio, al ser preferibles el europio y el terbio, y al ser el europio más preferible.

En casos, el grupo amplificador 104 es un complejo de coordinación de un lantánido (por ejemplo, europio o terbio) con ácido dietilentriaminotetraacético o un ligando criptato.

En casos, el grupo amplificador 104 es un complejo de coordinación de un lantánido (por ejemplo, europio o terbio) con ácido dietilentriaminotetraacético.

En casos, el grupo amplificador 104 es un complejo de coordinación de un lantánido (por ejemplo, europio o terbio) con un ligando criptato.

En casos, un agente de señalización (por ejemplo, un agente de señalización químico) comprende o se forma a partir de:

En casos, un agente de señalización puede comprender uno o más quelatos de metales paramagnéticos para formar un agente de contraste. Los iones metálicos paramagnéticos preferidos tienen números atómicos 21-29, 42, 44 o 57-83. Esto incluye iones de la serie de metales de transición o lantánidos que tienen uno, y con mayor preferencia cinco o más, electrones desapareados y un momento magnético de al menos 1,7 magnetón de Bohr. Los metales paramagnéticos preferidos incluyen cromo (III), manganeso (II), manganeso (III), hierro (II), hierro (III), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), praseodimio (III), neodimio (III), samario (III), gadolinio (III), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), europio (III) e iterbio (III). Además, un agente de señalización de la presente divulgación también puede comprender una o más partículas superparamagnéticas:

En casos, un agente de señalización puede comprender uno o más metales que están incluidos en un complejo metálico solo con o como parte de un compuesto fluorescente: el complejo metálico incluye complejos metálicos que tienen Al, Zn, Be o similares; un metal de tierra raro como Tb, Eu o Dy; o un metal de transición tal como Pt o Ir como metal central, y que tiene una estructura de oxadiazol, tiadiazol, fenilpiridina, fenilbencimidazol o quinolina como ligando, tal como complejos de aluminio quinolinol, complejos de benzoquinolinol berilio, complejos de benzoxazol zinc, complejos de benzotiazol zinc, complejos de azometil zinc, complejos de porfirina zinc y complejos de europio.

En casos, un agente de señalización puede comprender un luminóforo (donante) con características de alta eficiencia luminiscencia cuántica y largo tiempo de disminución de la luminiscencia (>100 ns). Los luminóforos preferidos son complejos catiónicos, metalorgánicos de paladio, rodio, platino, rutenio, osmio, tierras raras (en particular, europio y lantano). La porción orgánica de estos complejos metalorgánicos puede consistir, por ejemplo, en ligandos del grupo de porfirinas, bipiridilos, fenantrolinas u otros compuestos heterocíclicos.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un anticuerpo (por ejemplo, monoclonal o policlonal), anticuerpos modificados (por ejemplo, anticuerpo monoclonal biotinilado, anticuerpo policlonal biotinilado, quelato de europio-anticuerpo, anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante), variantes de anticuerpo (por ejemplo, Fab: fragmento, unión al antígeno (un brazo); F(ab')2: fragmento, unión al antígeno, que incluye la región bisagra (ambos brazos); Fab': fragmento, que incluye la región bisagra (un brazo); scFv: fragmento variable monocatenario; di-scFv: fragmento variable dimérico monocatenario; sdAb: anticuerpo de dominio único; anticuerpos monoclonales biespecíficos; anticuerpo trifuncional; y BiTE: enlazador de células T biespecífico), WGA- Biotina, Polimixina B-Biotina, lectina, péptido natural, péptidos sintéticos, ligandos sintéticos y/o naturales, polímeros sintéticos y/o naturales, glicopolímeros sintéticos y/o naturales, proteínas y/o polímeros de unión a carbohidratos, proteínas de unión a glicoproteínas y/o polímeros, cargados moléculas pequeñas, otras proteínas, bacteriófagos y/o aptámeros.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier tipo de anticuerpo, anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo descrito en la presente descripción o tipo de anticuerpo, anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo como se conoce en la técnica. Por tanto, "un agente de señalización que comprende un anticuerpo" incluye, como ejemplos, un agente de señalización que comprende un anticuerpo monoclonal no modificado, un fragmento Fab y un anticuerpo trifuncional.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un complejo de coordinación de lantánidos, biotina, anticuerpo y/o una enzima.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende o se forma a partir de una estructura que comprende un anticuerpo, lectina, péptido natural, péptidos sintéticos, ligandos sintéticos y/o naturales, polímeros sintéticos y/o naturales, sintéticos y/o naturales. glicopolímeros, proteínas y/o polímeros de unión a carbohidratos, proteínas y/o polímeros de unión a glicoproteínas, moléculas pequeñas cargadas, otras proteínas, bacteriófagos y/o aptámeros.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un grupo amplificador 104 que comprende un complejo de coordinación de lantánidos y/o una enzima y estreptavidina y/o un anticuerpo y/o aptámero.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un resto de unión que comprende un anticuerpo policlonal y/o monoclonal.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un resto de unión que comprende un anticuerpo modificado. Los anticuerpos modificados ilustrativos incluyen un anticuerpo monoclonal biotinilado, un anticuerpo policlonal biotinilado, un quelato de europio-anticuerpo y un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un resto de unión que comprende una variante de anticuerpo. Las variantes de anticuerpos ilustrativos incluyen Fab: fragmento, unión al antígeno (un brazo); F(ab')2: fragmento, unión al antígeno, que incluye la región bisagra (ambos brazos); Fab': fragmento, que incluye la región bisagra (un brazo); scFv: fragmento variable monocatenario; di-scFv: fragmento variable dimérico monocatenario; sdAb: anticuerpo de dominio único; anticuerpos monoclonales biespecíficos; anticuerpo trifuncional; y BiTE: enlazador de células T biespecífico),

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende WGA-Biotina o Polimixina B-Biotina.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un resto de unión que comprende un ligando y/o péptido sintético y/o natural.

En casos, un ligando y/o péptido se selecciona de bis (zinc-dipicolilamina), péptido TAT, serina proteasas, catelicidinas, dextrinas catiónicas, ciclodextrinas catiónicas, ácido salicílico, lisina y combinaciones de los mismos. En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un resto de unión que comprende un polímero y/o glicopolímero sintético y/o natural.

En casos, un polímero natural y/o sintético es lineal o ramificado y se selecciona de amilopectina, poli(W-[3-(dimetilamino)propil]metacrilamida), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de poli[2-(W,W-dietilamino)etilo] y combinaciones de los mismos.

En casos, un polímero y/o glicopolímero natural y/o sintético comprende restos que incluyen, pero no se limitan a, quitosano, gelatina, dextrano, trehalosa, celulosa, manosa, dextranos y ciclodextranos catiónicos, aminas cuaternarias, tribromuros de piridinio, histidina, lisina, cisteína, arginina, sulfonios, fosfonios o combinaciones de los mismos que incluyen, pero no se limitan a, polímeros de cobloqueo, injerto y alternantes.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un resto de unión que comprende una glicoproteína seleccionada de lectina de unión a manosa, otras lectinas, anexinas y combinaciones de las mismas.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende:

un anticuerpo; y

un complejo de coordinación de europio.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un grupo enlazador L que comprende NH2-PEG-Biotina (2K), NH2-PEG-Biotina (4K), sulfo-NHS-Biotina, WGA-Biotina, o polimixina B-Biotina.

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un complejo de europio que comprende:

En casos, un agente de señalización capaz de unirse a la superficie de un microorganismo comprende un complejo de europio que comprende:

o

Como se divulga en los ejemplos de trabajo a continuación y a lo largo de la descripción y los dibujos, la presente invención proporciona, al menos:

• >89,9 % de concordancia de MIC (dilución ±1) entre los métodos divulgados actualmente y el estándar del CLSI sin errores importantes/muy importantes para setenta y cinco cepas de doce especies bacterianas (incluidas las p-lactámicas con bacilos gramnegativos);

• Las MIC equivalentes entre el método divulgado actualmente para el cultivo directo de sangre positiva y el procesamiento de muestras de cultivos de sangre estándar del CLSI

• Detección de especies grampositivas y negativas hasta 2*103 UFC/mL;

• Unión no específica de un microorganismo por un agente de señalización;

• Uso de formulaciones de europio;

• Uso de dispositivo semiautomático con salida de datos.

La enseñanza adicional relevante para la presente invención se describe en uno o más de los siguientes: EP139675; EP64484; US 2013/0217063; US 2014/0278136; US 2014/0323340; US 2014/0363817; US 2015/0064703; US 2015/0337351; US 2016/0010138; US 3,798,320; US 4,565,790; US 4,647,536; US 4,808,541; US 4,927,923; US 5,457,185; US 5,489,401; US 5,512,493; US 5,527,684; US 5,627,074; US 5,665,554; US 5,695,946; US 6,284,470; US 6,385,272; US 6,844,028; US 7,341,841; US 7,629,029; US 7,868,144; US 8,178,602; US 8,895,255; PCT/US2016/042589; y WO/2016015027.

Cualquiera de los aspectos e instancias anteriores se puede combinar con cualquier otro aspecto o instancia como se divulga en los dibujos, en el resumen de la invención y/o en la descripción detallada, que incluyen los ejemplos a continuación.

Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente descripción pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. Las referencias citadas en la presente descripción no se admiten como técnica anterior a la invención reivindicada. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: La presente invención proporciona una determinación rápida y precisa de la concentración mínima inhibitoria (MIC) de un antimicrobiano

En este ejemplo, la presente invención para determinar rápidamente la concentración mínima inhibitoria (MIC) de un antimicrobiano contra Staphylococcus aureus o Pseudomonas aeruginosa se comparó con un método estándar que requiere una incubación durante la noche de un S. aureus o P. aeruginosa.

Se creció un cultivo de Staphylococcus aureus (ATCC cepa 29213) mediante el uso de caldo Mueller-Hinton (MH) durante la noche a 37 °C con agitación vigorosa. Simultáneamente, se prepararon dos microplacas estériles de 96 pocillos con diluciones en serie de clindamicina de 32 pg/mL a 0,125 pg/mL y un control sin clindamicina, todo en caldo MH. La concentración de S. aureus a partir del cultivo durante la noche fue luego ajustado a 5*105 UFC/mL mediante el uso de la técnica estándar de McFarland para las lecturas de densidad óptica a 600 nm. Las microplacas, cada pocillo que contenía 200 pL, se inocularon con diluciones preparadas de antimicrobiano y se incubaron a 37 °C durante 3,5 horas para determinar la susceptibilidad antimicrobiana mediante el método de la invención (por ejemplo, la técnica "AST rápida") o se incubaron a 37 °C durante la noche (>12 horas) para el control de DO600. La microplaca "AST rápida" se retiró de la incubadora con agitación después de 4 horas y un conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP) de un anticuerpo policlonal de conejo-anti-S. aureus (Fitzgerald Industries International, Inc.) se añadió a cada pocillo. A continuación, la placa se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir la unión y, posteriormente, la microplaca se centrifugó a 4000 * g para sedimentar las bacterias intactas restantes. A continuación, se aspiró el caldo MH y se añadió caldo estéril para un total de 3 lavados. Después de la aspiración final, se añadió una solución de revelado estabilizada que consiste de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno (ThermoFisher) y se monitoreó la densidad óptica a 650 nm y 450 nm durante 10 minutos con un lector de microplacas (Vmax, Molecular Devices). Después de una incubación durante la noche, la microplaca de control de DO600 se retiró de la incubadora y se leyó directamente la densidad óptica a 600 nm (Vmax, Molecular Devices). Finalmente, la MIC se determinó según los estándares del CLSI a partir de los datos, como se muestra en la Figura 5. La MIC determinada por ambas técnicas es la misma: 0,125 pg/mL

De manera similar, se creció un cultivo de Pseudomonas aeruginosa (ATCC cepa 27853) mediante el uso de caldo MH durante la noche a 37 °C con agitación vigorosa. Simultáneamente, se prepararon dos microplacas estériles de 96 pocillos con diluciones seriadas de ceftazidima de 32 pg/mL a 0,125 pg/mL y un control sin ceftazidima, todo en caldo MH. La concentración de P. aeruginosa a partir del cultivo durante la noche fue luego ajustado a 5*105 UFC/mL mediante el uso de la técnica estándar de McFarland para las lecturas de densidad óptica a 600 nm. Estas microplacas, cada pocillo que contenía 200 pL, se inocularon con las diluciones antimicrobianas preparadas y se incubaron a 37 °C durante 3,5 horas para determinar la susceptibilidad antimicrobiana mediante el uso del método de la invención o se incubaron a 37 °C durante la noche (>12 horas) para la DO600 de control. La microplaca "AST rápida" se retiró de la incubadora con agitación después de 4 horas y una solución de un conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP) de un anticuerpo policlonal de conejo-anti-P. aeruginosa (Abcam) se añadió a cada pocillo. A continuación, la placa se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir la unión y, posteriormente, la microplaca se centrifugó a 4000 * g para sedimentar las bacterias intactas restantes. A continuación, se aspiró el caldo MH y se añadió caldo estéril para un total de 3 lavados. Después de la aspiración final, se añadió una solución de revelado estabilizada que consiste de 3,3',5,5'-TMB y peróxido de hidrógeno (ThermoFisher) y se monitoreó la densidad óptica a 650 nm y 450 nm durante 10 minutos con un lector de microplacas (Vmax, Molecular Devices). Los datos mostrados en la Figura 6 representa desde el punto de 5 minutos después del inicio de la incubación con la solución de detección. Después de una incubación durante la noche, la microplaca de control de DO600 se retiró de la incubadora y se leyó directamente la densidad óptica a 600 nm (Vmax, Molecular Devices). Finalmente, la MIC se determinó según los estándares del CLSI a partir de los datos, como se muestra en la Figura 6. La MIC determinada por ambas técnicas es la misma: 4 pg/mL.

La precisión de la presente invención para determinar la MIC se demuestra claramente en que la pendiente de la región descendente de los datos (en la Figura 5 y en la Figura 6) es casi idéntica entre la presente invención y los cultivos durante la noche.

Estos datos muestran que la presente invención es capaz de determinar con precisión la MIC de un antimicrobiano que es al menos tan precisa como un método estándar que requiere una incubación durante la noche de un cultivo bacteriano.

Ejemplo 2: La presente invención proporciona la determinación rápida y precisa de la concentración mínima inhibitoria (MIC) de un antimicrobiano para bacterias resistentes a los antimicrobianos.

En este ejemplo, la presente invención se usó para comparar las MIC de cepas de P. aeruginosa, S. aureus, y E. coli que son resistentes a los antimicrobianos hasta, respectivamente, las MIC de cepas de P. aeruginosa, S. aureus, y E. coli que son sensibles a los antimicrobianos.

La MIC para la cepa de P. aeruginosa susceptible, ATCC 27853, se determinó como se describe en el ejemplo 1, con la diferencia clave de que se usó imipenem como antimicrobiano (se usó una dilución en serie de 32 pg/mL a 0,125 pg/mL). La MIC para la cepa de P. aeruginosa resistente, ATCC BAA-2108, se determinó de forma similar. Se usó la misma microplaca de 96 pocillos para ambas cepas, con 48 pocillos dedicados a cada cepa. El experimento se repitió 3 veces con resultados similares y los datos resultantes se muestran en la Figura 7. La MIC para la cepa susceptible es de 2 pg/mL; la MIC para la cepa resistente es de 32 pg/mL.

Para S. aureus, se usó el mismo procedimiento que se describió anteriormente en el ejemplo 1, con la excepción de que se usó meticilina como antimicrobiano y se usó una cepa resistente, ATCC 43300. Para E. coli, se usó el mismo procedimiento que se describió anteriormente para P. aeruginosa, excepto que se usaron las cepas de E. coli susceptible (25922) y resistente (35218) y se usó ampicilina como antimicrobiano, y un conjugado de HRP de un anticuerpo policlonal de conejo-anti-E. coli (Abcam) se usó como el resto químico que permite que el agente de señalización se una a la bacteria. Los valores de "AST rápida" después de una incubación de cinco minutos con solución de detección se compararon con los controles de DO600 durante la noche, y los datos se compilan en la Figura 8.

Estos datos muestran que la presente invención es capaz de diferenciar con precisión la MIC de un antimicrobiano para una cepa de bacteria que es resistente al antimicrobiano y una cepa de la misma bacteria que es sensible al antimicrobiano.

Ejemplo 3: el ejemplo de referencia de la invención proporciona una señal detectable a una concentración microbiana que es doscientas veces menor concentrada que la requerida para un método estándar

En este ejemplo, la concentración microbiana requerida para proporcionar una señal detectable en el ejemplo se comparó con un método estándar que requiere una incubación durante la noche de un S. aureus.

Se cultivó S. aureus durante la noche como se describe en el ejemplo 1. Se hizo una dilución en serie de la colonia durante la noche en una microplaca de 96 pocillos y se leyó la absorbancia a 600 nm. Estos valores se compararon con los estándares de McFarland para obtener la concentración de bacterias en UFC/mL. La región cuantificable de la curva se muestra en la Figura 9 (DO600); el experimento se repitió tres veces con resultados similares. Se trató una serie de diluciones similar de S. aureus con agentes de señalización específicos a S. aureus durante 20 min, como se describe en el ejemplo 2. Al seguir el procedimiento del ejemplo 2, los microorganismos se centrifugaron y lavaron tres veces y se añadió una solución de detección.

En la Figura 9, se muestra la absorbancia resultante frente a la concentración de S. aureus determinada por el estándar de McFarland. La señal de "AST rápida" es visible a partir de la concentración de bacterias inicial de un experimento de AST estándar del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (es decir, 5*105 UFC/mL), como muestra la flecha. Por el contrario, la señal óptica no permite una cuantificación precisa hasta ~108 UFC/mL.

Estos datos muestran que el método es capaz de proporcionar una señal detectable y utilizable a una concentración de cultivo microbiano que es doscientas veces menor que la requerida para un método estándar.

Ejemplo 4: La presente invención proporciona valores de MIC similares a aquellos obtenidos con el método de referencia del CLSI en múltiples especies y cepas de bacterias patógenas, pero en un tiempo significativamente menor que el requerido para el método del CLSI.

En este ejemplo, la presente invención para determinar rápidamente la MIC de un antimicrobiano para una pluralidad de bacterias patógenas se comparó con el método del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI).

Como se muestra en la Figura 10, las determinaciones de MIC para seis bacterias se obtuvieron después de incubaciones de 3,5 horas, mientras que las determinaciones del método de referencia del CLSI AST se obtuvieron después de dieciséis horas de incubación (para cultivos tratados con ampicilina) o incubaciones de veinticuatro horas (para cultivos tratados con oxacilina). El fármaco, agente de señalización/resto químico ("conjugado anticuerpo-HRP") y las cepas de bacterias se enumeran en la Figura 11. A para el agente de señalización/resto químico, se usó el conjugado de aglutinina de germen de trigo (WGA) HRP para la prueba de S. epidermidis, y el ensayo "AST rápida" sigue el procedimiento del ejemplo 2 anterior. Todos los aislados clínicos fueron muestras anónimas y se subcultivaron un mínimo de dos veces antes de su uso. Se analizaron un total de ochenta y siete muestras individuales, que incluyen, pero no se limitan a, las siguientes especies bacterianas: E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. faecalis, Staphylococci Coagulasa-Negativa, P. mirabilis, E. faecium, E. clocae, y A. baumannii. Cabe señalar que las especies bacterianas probadas en este ejemplo (excepto P. mirabilis) son juntas responsables de>90 % de los cultivos de sangre positiva en muchos laboratorios clínicos. Por tanto, la presente invención tiene una clara relevancia clínica para las enfermedades infecciosas humanas. Los valores de MIC entre la presente invención y el método del CLSI son muy similares, sin embargo, la presente invención requiere una incubación de tres horas y media, mientras que el método del CLSI requiere incubaciones de dieciséis horas o veinticuatro horas.

Estos datos muestran que la presente invención es capaz de determinar con precisión la MIC de un antimicrobiano que es al menos tan precisa como el método del CLSI, pero requiere significativamente menos tiempo determinar la MIC; por tanto, la presente invención reduce enormemente el tiempo antes de que se proporcione a un paciente un régimen de tratamiento apropiado, es decir, un antimicrobiano específico y en una dosificación particular.

Ejemplo 5: Con muestras de S. aureus y K. pneumoniae, en una amplia variedad de antimicrobianos, la presente invención proporciona valores de MIC similares a aquellos obtenidos con el método de referencia del CLSI, pero en un tiempo significativamente menor.

En este ejemplo, la presente invención se usó para determinar rápidamente una pluralidad de MIC de antimicrobianos cuando se trataron S. aureus (una bacteria grampositiva) o K. pneumoniae (una bacteria gramnegativa) y se compararon con los valores de MIC obtenidos por el método del CLSI.

Se usaron placas antimicrobianas secas de panel completo comerciales, SensiTitre® (ThermoFisher) en el método de la presente invención como se describe anteriormente en el ejemplo 2, donde se evaluó la viabilidad bacteriana a las cuatro horas. Los resultados representativos de S. aureus y K. pneumoniae se muestran en la Figura 12A a Figura 12C. Hubo una excelente concordancia entre los valores de MIC obtenidos a partir de la presente invención "AST rápida" y los resultados obtenidos por el CLSI para todos los experimentos excepto el experimento de eritromicina con S. aureus y los experimentos de tetraciclina e imipenem con K. pneumonia; sin embargo, de acuerdo con la FDA, las discrepancias entre la presente invención y los resultados del CLSI son "errores menores", véase, Figura 12C.

Estos datos muestran que la presente invención es capaz de determinar con precisión, para dos especies bacterianas diferentes, una pluralidad de MIC de antimicrobianos que son al menos tan precisos como el método del CLSI, pero requiere significativamente menos tiempo para determinar la MIC; por tanto, la presente invención reduce enormemente el tiempo antes de que se proporcione a un paciente un régimen de tratamiento apropiado, es decir, un antimicrobiano específico y en una dosificación particular.

Ejemplo 6: Mediante el uso de múltiples cepas clínicas de S. aureus y E. coli, en una amplia variedad de antimicrobianos, la presente invención proporciona valores de MIC similares a aquellos obtenidos con el método de referencia del CLSI, pero en un tiempo significativamente menor.

En este ejemplo, la presente invención se usó para determinar rápidamente una pluralidad de MIC de antimicrobianos cuando se trataron S. aureus (una bacteria grampositiva) o K. pneumoniae (una bacteria gramnegativa) y se compararon con los valores de MIC obtenidos por el método del CLSI.

Como en el ejemplo 5, se usó una placa SensiTitre® (ThermoFisher) para realizar estos experimentos. Se usó el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 2, excepto que se añadieron 50 pL de inóculo a cada pocillo, de acuerdo con las instrucciones de ThermoFisher. El método de referencia del CLSI se realizó durante veinticuatro horas (oxacilina y vancomicina) y dieciocho horas (levofloxacina) y para todos los experimentos que usan la presente invención (método "AST rápida") se realizó en cuatro horas (que incluye incubación de tres horas y media). Los resultados se muestran en la Figura 13A a Figura 13C y Figura 14A a Figura 14D. Las líneas oscuras de la Figura 13A a Figura 13C y Figura 14A a Figura 14D muestran los puntos de interrupción del CLSI para cada antimicrobiano. El acuerdo esencial "EA" y el acuerdo categórico "CÁ' están definidos como por la FDA en su documento guía de Clase II para sistemas de AST automatizados. Además, para una especie clínica de S. aureus, se realizaron múltiples ensayos "AST rápida" y ensayos de referencia estándar del CLSI, como se describió anteriormente, en el transcurso de un mes para determinar la consistencia de los resultados; véase, Figura 15. Estos datos muestran que la presente invención (procedimiento "AST rápida") proporciona resultados consistentes con el método de referencia del CLSI cuando se prueba con múltiples antimicrobianos en cepas clínicas de S. aureus y E. coli, pero requiere significativamente menos tiempo para determinar la MIC; por tanto, la presente invención reduce enormemente el tiempo antes de que se proporcione a un paciente un régimen de tratamiento apropiado, es decir, un antimicrobiano específico y en una dosificación particular.

Ejemplo 7: La presente invención proporciona una determinación rápida y precisa de una pluralidad de MIC de antimicrobianos para una bacteria resistente a los antimicrobianos.

En este ejemplo, la presente invención se usó para determinar las MIC de una pluralidad de antimicrobianos para cepas de E. coli que son resistentes a los antimicrobianos hasta las MIC para cepas de E. coli que son sensibles a los antimicrobianos.

Se cultivaron tanto Escherichia coli (cepa QC, ATCC 25922) como la E. coli resistente clínica ("Clínica") en condiciones estériles estándar en caldo Mueller-Hinton (MH) durante la noche a 37 °C con agitación. La concentración de E. coli a partir del cultivo durante la noche fue luego ajustado a 5*105 UFC/mL mediante el uso de la técnica estándar de McFarland para las lecturas de densidad óptica a 600 nm. Simultáneamente, se prepararon dos microplacas estériles de 96 pocillos con diluciones seriadas de un antimicrobiano especificado (véase, a continuación) y un control no antimicrobiano (solución salina), todas en caldo MH. Las microplacas, cada pocillo que contenía 200 pL, se inocularon con diluciones preparadas de antimicrobiano y se incubaron a 37 °C durante 3 horas, 45 minutos para la determinación mediante el uso de la presente invención (la técnica "AST rápida"). Las microplacas de "AST rápida" se retiraron de la incubadora con agitación después de 3 horas, 45 minutos y se centrifugaron durante 2,5 minutos a 2500 g para sedimentar. A continuación, se aspiró el caldo MH y luego se añadieron 100 pL de agua a cada pocillo de ambas microplacas. A continuación, se añadieron a cada pocillo 10 pL del resto químico (en este caso, formulación de criptato de europio) (a 20 ng/pocillo) y se añadieron a cada pocillo 10 pL de glutaraldehído al 5 % (como agente de señalización). A continuación, las dos microplacas se agitaron a 300 rpm durante 30 minutos. Después, ambas placas se centrifugaron durante 2,5 minutos a 2500 g para sedimentar. Se aspiró la solución y se añadió a cada pocilio un lavado de 200 pL de PBS-tween, seguido de una centrifugación para sedimentar. Después de la aspiración de la solución, se realizó un segundo lavado idéntico de 200 pL de PBS-tween, seguido de una centrifugación final para sedimentar. Luego se leyó la placa mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI. Este proceso se llevó a cabo con las siguientes preparaciones antimicrobianas: imipenem a concentraciones diluidas de 8 pg/mL a 0,12 pg/mL (Figura 16); ampicilina a concentraciones diluidas de 32 pg/mL a 0,25 pg/mL (Figura 17); ceftazidima a concentraciones diluidas de 32 pg/mL a 0,03 pg/mL (Figura 18); gentamicina a concentraciones diluidas de 16 pg/mL a 0,06 pg/mL (Figura 19); levofloxacina a concentraciones diluidas de 8 pg/mL a 0,06 pg/mL (Figura 20); Trimetoprima/Sulfametoxazol (SXT) a concentraciones diluidas de 32 pg/mL a 0,5 pg/mL (Figura 21); ciprofloxacina a concentraciones diluidas de 4 pg/mL a 0,015 pg/mL (Figura 22); y ceftriaxona a concentraciones diluidas de 64 pg/mL a 0,12 pg/mL (Figura 23).

Como se vio en la Figura 16 a Figura 23, Escherichia coli (cepa QC, ATCC 25922) y la E. coli resistente clínica ("Clínica") tenían MIC similares para imipenem, ceftazidima, gentamicina, levofloxacina, ciprofloxacina y ceftriaxona, mientras que las dos cepas tenían MlC diferentes para ampicilina y trimetoprima/sulfametoxazol (SXT). Por consiguiente, los datos muestran que la cepa de E. coli resistente clínica es resistente a ampicilina y trimetoprima/sulfametoxazol (SXT). Por lo tanto, si un paciente presenta una infección por esta (o una cepa similar), no deben administrarse ampicilina ni trimetoprima/sulfametoxazol (SXT); en su lugar, deben administrarse imipenem, ceftazidima, gentamicina, levofloxacina, ciprofloxacina y ceftriaxona.

Estos datos muestran que la presente invención es capaz de diferenciar con precisión la MIC de un antimicrobiano para una cepa de bacterias clínicamente relevante que es resistente a uno o más antimicrobianos y la MIC del antimicrobiano para una cepa de la misma bacteria que es sensible al antimicrobiano; por tanto, la presente invención, en una cantidad de tiempo muy reducida en relación con los métodos estándar, puede proporcionar a un paciente un régimen de tratamiento apropiado, es decir, un antimicrobiano específico y en una dosificación particular.

Ejemplo 8: La presente invención proporciona una determinación rápida y precisa de una pluralidad de MIC de antimicrobianos para una bacteria sensible a los antimicrobianos.

En este ejemplo, la presente invención se usó para determinar las MIC de una pluralidad de antimicrobianos para una cepa de S. aureus que es sensible a los antimicrobianos.

Se cultivó S. aureus (cepa QC 29213) en condiciones estériles estándar en caldo Mueller-Hinton (MH) durante la noche a 37 °C con agitación. La concentración de S. aureus a partir del cultivo durante la noche fue luego ajustado a 5*105 UFC/mL mediante el uso de la técnica estándar de McFarland para las lecturas de densidad óptica a 600 nm. Simultáneamente, se prepararon dos microplacas estériles de 96 pocillos con diluciones seriadas de un antimicrobiano especificado (véase, a continuación) y un control no antimicrobiano (solución salina), todas en caldo MH.

Las microplacas, cada pocillo que contenía 100 pL, se inocularon con diluciones preparadas de antimicrobiano y se incubaron a 37 °C durante 3 horas, 45 minutos para la determinación mediante el uso de la presente invención (la técnica "AST rápida"). Las microplacas de "AST rápida" se retiraron de la incubadora con agitación después de 3 horas, 45 minutos y se centrifugaron durante 2,5 minutos a 2500 g para sedimentar. A continuación, se aspiró el caldo MH y se añadieron 100 pl de PBS 25 mM a cada pocillo de ambas microplacas. A continuación, se añadieron a cada pocillo 10 pL del resto químico (en este caso, formulación de criptato de europio) (a 20 ng/pocillo) y se añadieron a cada pocillo 10 pL de glutaraldehído al 0,005 % (como agente de señalización). A continuación, las dos microplacas se agitaron a 300 rpm durante 30 minutos. Después, ambas placas se centrifugaron durante 2,5 minutos a 2500 g para sedimentar. Se aspiró la solución y se añadió a cada pocillo un lavado de 200 pL de PBS-tween, seguido de una centrifugación para sedimentar. Después de la aspiración de la solución, se realizó un segundo lavado idéntico de 200 pL de PBS-tween, seguido de una centrifugación final para sedimentar. Se añadieron a cada pocillo 200 pL de PBS-tween. Luego se leyó la placa mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI. Este proceso se llevó a cabo con las siguientes preparaciones antimicrobianas: vancomicina a concentraciones diluidas de 32 pg/mL a 0,25 pg/mL (Figura 24); penicilina a concentraciones diluidas de 8 pg/mL a 0,0625 pg/mL (Figura 25); y teicoplanina concentraciones diluidas de 16 pg/mL a 0,0125 pg/mL (Figura 26).

Como se vio en la Figura 24 a Figura 26, S. aureus (cepa QC 29213) la presente invención determinó MIC que eran similares a aquellas obtenidas a partir de un método de referencia del CLSI estándar: vancomicina: 0,5-2 pg/mL; penicilina: 0,25-2 pg/mL; y teicoplanina 0,25-1 pg/mL.

Estos datos muestran que la presente invención es capaz de determinar con precisión una pluralidad de MIC de antimicrobianos; por tanto, la presente invención, en una cantidad de tiempo muy reducida en relación con los métodos estándar, puede proporcionar a un paciente un régimen de tratamiento apropiado, es decir, un antimicrobiano específico y en una dosificación particular.

Ejemplo 9: La presente invención proporciona una determinación rápida y precisa de la MIC de un antimicrobiano directamente a partir de muestras de cultivo de sangre y sin la necesidad de subcultivos y una incubación de crecimiento durante la noche.

En este ejemplo, la presente invención se usó para determinar rápidamente la MIC de un antimicrobiano directamente a partir de una muestra de cultivo de sangre.

Se obtuvo una muestra clínica para cada uno E. coli, S. aureus, y K. pneumoniae. Los aislados se transportaron en agar inclinados, se subcultivaron y se almacenaron a -80 °C. Las muestras se sacaron del congelador, se dejaron calentar a temperatura ambiente y se sembró por estrías en una placa petri (ThermoFisher) de agar de soja tríptico (TSA) con sangre de oveja al 5 %. La placa de Petri se colocó en una incubadora a 35 °C durante la noche. Se recogió una sola colonia y se repitió el proceso de siembra por estrías en una placa nueva, seguido de una segunda incubación a 35 °C durante la noche. Se recogieron un total de tres a cinco colonias y se dispersaron en 1 mL de solución salina estéril (Hardy Diagnostics) y la concentración se determinó mediante medición de densidad óptica a 600 nm (Molecular Devices M2). La muestra se diluyó en dos etapas a 2 UFC/mL en 40 mL de caldo Mueller Hinton estéril ajustado a cationes (MHB, Hardy Diagnostics) en un frasco tapado.

El frasco se cargó en una incubadora con agitador durante la noche a 35 °C para imitar el rendimiento de un sistema de cultivo de sangre BD BACTEC®. El frasco se puso a 4 °C después de 10 horas, momento en donde se determinó que la concentración de E. coli era ~1*108 UFC/mL. Ésta es la concentración aproximada a la que los sistemas comerciales de cultivos de sangre, como BD BACTEC y bioMerieux BacT/Alert, registran cultivos de sangre positiva. El tiempo de incubación de 10 horas se determinó al sembrar por estrías muestras de cultivos de sangre en placas petri de TSA con sangre de oveja al 5 %, incubar a 35 °C durante la noche y determinar el recuento de colonias. La muestra de "control" del subcultivo se tomó al sembrar por estrías este cultivo de sangre "positivo" en una placa de TSA e incubar durante la noche a 35 °C. A continuación, se realizó un método de referencia de microdilución en caldo del CLSI estándar, como se describió anteriormente.

A continuación, se realizó la separación basada en centrifugación al seguir el protocolo de SepsiTyper (Bruker Daltonics). Brevemente, se añadió 1 mL de tampón de lisis (Bruker Daltonics) a 5 mL del caldo MHB con 1*108 UFC/mL de E. coli. La mezcla se dividió en alícuotas en seis tubos de microcentrífuga, se agitó durante 10 segundos y luego se centrifugó a 13000 rpm durante 2 min. El sobrenadante se eliminó y desechó, se añadió 1 mL de tampón de lavado (Bruker) a cada tubo y los tubos se centrifugaron a 13000 rpm durante 1 min. El sobrenadante se retiró de nuevo y se descartó. Cada sedimento se resuspendió en 500 pL de solución salina estéril al pipetear hacia arriba y hacia abajo. Las soluciones se mezclaron y la concentración de bacterias se determinó mediante el uso de un estuche de viabilidad celular de bacterias Promega Bactitre-Glo™.

Las muestras se diluyeron en MHB a una concentración de ~5*105 UFC/mL. Luego se realizó un ensayo de "AST rápida" (como se describe en el ejemplo 2) y se compararon las determinaciones de MIC. El método "AST rápida" en muestras clínicas proporcionó valores de MIC similares a los de un método estándar que requiere subcultivo, véase, Figura 27 y Figura 28.

Estos datos muestran que la presente invención (procedimiento "AST rápida"), cuando se usa directamente en muestras clínicas, proporciona resultados consistentes con un método estándar de determinación de MIC que requiere una etapa de subcultivo antes de un crecimiento durante la noche; por tanto, la presente invención reduce enormemente el tiempo antes de que se proporcione a un paciente un régimen de tratamiento apropiado, es decir, un antimicrobiano específico y en una dosificación particular.

Ejemplo 10: La estreptavidina conjugada a europio se une a la aglutinina de germen de trigo biotinilada, que se une específicamente a bacterias grampositivas.

En este ejemplo, se usó europio como un resto químico en agentes de señalización que comprenden aglutinina de germen de trigo, que se une específicamente a bacterias grampositivas.

Se inocularon bacterias (S. aureus) a través de una placa de 96 pocillos en concentraciones que iban de 1x105 a 1x109 en tampón MES a pH 6. A cada pocillo que contenían las bacterias, y a los pocillos de control correspondientes, se le añadieron 2 pg de aglutinina de germen de trigo biotinilada (Sigma) y se dejó incubar la solución de reacción durante 15 minutos para facilitar el marcaje del exterior de las bacterias dentro del pocillo con el reportero elegido. Luego, se añadió una estreptavidina-europio disponible comercialmente (por ejemplo, de Perkin-Elmer) hasta una concentración final por pocillo de 0,4 pg/mL. Después de la incubación durante otros 15 minutos, la placa de prueba se centrifugó, mediante el uso de una Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3, a una velocidad de 2500 x g durante 2,5 minutos para sedimentar las bacterias en el fondo de la placa mientras se dejaba cualquier indicador no asociado en el sobrenadante. A continuación, se aspiró la placa, mediante el uso de un lavador de placas BioTek Multiflo X, para eliminar el sobrenadante y el reportero sin reaccionar, antes de la adición de tampón de lavado. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces más para eliminar completamente cualquier reportero sin reaccionar. Finalmente, a los pocillos aspirados, se añadió el tampón de lectura antes de la adición de la solución de mejora Delfia. A continuación, la placa se incubó durante 15 minutos para permitir la mejora del europio antes de la medición del europio mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en la Figura 29.

Estos datos muestran que el uso de europio como resto químico en un agente de señalización es capaz de cuantificar con precisión las concentraciones bacterianas en una solución.

Ejemplo 11: La estreptavidina conjugada a europio se une a polimixina B biotinilada, que se une específicamente a bacterias gramnegativas.

En este ejemplo, se usó europio como un resto químico en agentes de señalización que comprenden polimixina B, que se une específicamente a bacterias gramnegativas.

Se inocularon bacterias (E coli) a través de una placa de 96 pocillos en concentraciones que iban de 1x105 a 1x109 en tampón MES a pH 6. A cada pocillo que contenía las bacterias, y a los correspondientes pocillos de control, se le añadió polimixina biotinilada (Hycult Biosciences) para una dilución final de 1:200 y se dejó incubar la solución de reacción durante 15 minutos para facilitar el marcaje del exterior de las bacterias dentro del pocillo con el reportero elegido. Luego, se añadió una estreptavidina-europio disponible comercialmente (por ejemplo, de Perkin-Elmer) hasta una concentración final por pocillo de 0,4 pg/mL. Después de la incubación durante otros 15 minutos, la placa de prueba se centrifugó, mediante el uso de una Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3, a una velocidad de 2500 * g durante 2,5 minutos para sedimentar las bacterias en el fondo de la placa mientras se dejaba cualquier indicador no asociado en el sobrenadante. A continuación, se aspiró la placa, mediante el uso de un lavador de placas BioTek Multiflo X, para eliminar el sobrenadante y el reportero sin reaccionar, antes de la adición de tampón de lavado. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces más para eliminar completamente cualquier reportero sin reaccionar. Finalmente, a los pocillos aspirados, se añadió el tampón de lectura antes de la adición de la solución de mejora Delfia. La placa se incubó durante 15 minutos para permitir la mejora del europio antes de la medición del europio mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en la Figura 30.

Estos datos muestran que el uso de europio como resto químico en un agente de señalización es capaz de cuantificar con precisión las concentraciones bacterianas en una solución.

Ejemplo 12: El detector de europio proporciona un rango de señal más amplio y, por lo tanto, datos de MIC más precisos.

Este ejemplo comparó la capacidad de europio y HRP, como restos químicos en agentes de señalización (que comprenden un anticuerpo que se une específicamente a bacterias) para determinar con precisión las CIM.

Mediante el uso de placas de 96 pocillos que contenían caldo Mueller Hinton ajustado con cationes y diluciones antimicrobianas apropiadas, se prepararon bacterias al diluir colonias en solución salina para alcanzar un valor de McFarland de 0,5, que se verificó mediante el uso de un espectrofotómetro. Esto se diluyó 1:20 en solución salina y se agregaron 10 pL de inóculo a cada pocillo. Se incubaron placas de prueba bacterianas antimicrobianas a 35 °C, al agitar a 150 rpm durante 3 horas y 45 minutos. Después de esta incubación, las perlas magnéticas catiónicas y anticuerpos anti-S. aureus (conjugados con peroxidasa de rábano picante o europio; conjugación personalizada realizada por ensayos Cisbio) se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 20 minutos. Mediante el uso de un lavador de placas automatizado, se capturaron perlas magnéticas y el contenido de cada pocillo se lavó tres veces con PBS-Tween20 (0,1 %). A continuación, se obtuvieron imágenes de los pocillos directamente mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo (europio) o TMB se añadió y se dejó incubar durante 15 minutos, después de lo cual se detuvo la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 M y se midió la absorbancia a 450 nm para cada pocillo.

Como se muestra en la Figura 31, mediante el uso de europio como resto químico se determinó la MIC de SXT con mayor precisión que la MIC determinada mediante el uso de HRP como resto químico.

Estos datos muestran que el uso de europio como resto químico en un agente de señalización es capaz de determinar con precisión la MIC de un antimicrobiano.

Ejemplo 13. Las modalidades de las formulaciones de europio, que marcan bacterias de forma no específica, son efectivas para detectar bacterias y cuantificar las concentraciones de bacterias.

En este ejemplo, las formulaciones de se unen de forma no específica a bacterias.

Se inocularon bacterias (E coli) a través de una placa de 96 pocillos en concentraciones que variaban de 1e5 a 1e9 en tampón MES a pH 6 (criptato de europio-diamina) o HEPES pH 7,5 (EuropiumN1-amino). A cada pocillo que contenían las bacterias, y los pocillos de control correspondientes, se añadió como se indica criptato de europiodiamina (compuesto (3); Cisbio) o europio N1-amino (compuesto (6); PerkinElmer) a 66 ng/pocillo, luego EDC/NHS (a 0,1 y 0,3 mg/mL) o glutaraldehído (concentración final al 0,5 %).

Se dejó incubar la solución de reacción durante 30 minutos para facilitar el marcado del exterior de las bacterias dentro del pocillo con el reportero elegido. A continuación, la placa de prueba se centrifugó, mediante el uso de una Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3, a una velocidad de 2500 * g durante 2,5 minutos para sedimentar las bacterias en el fondo de la placa mientras se dejaba cualquier indicador no asociado en el sobrenadante. A continuación, se aspiró la placa, mediante el uso de un lavador de placas BioTek Multiflo X, para eliminar el sobrenadante y el reportero sin reaccionar, antes de la adición de tampón de lavado. Este procedimiento de lavado se repitió una (criptato de europio -diamina) o dos (EuropiumN1-amino) veces adicionales con el fin de eliminar completamente cualquier reportero sin reaccionar. Los pocillos que contenían criptato de europio-diamina se reconstituyeron en tampón de lectura y se leyeron mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en la Figura 32. Finalmente, a los pocillos aspirados tratados con Europio N1-amino, se añadieron el tampón de lectura antes de la adición de la solución de mejora Delfia. La placa se incubó durante 15 minutos para permitir la mejora del europio antes de la medición del europio mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en la Figura 32.

Estos datos muestran que las formulaciones de europio son capaces de cuantificar con precisión las concentraciones bacterianas en una solución cuando las formulaciones de europio se unen de forma no específica a bacterias.

Ejemplo 14. El europio puede unirse a las aminas a través de isotiocianato o a ácidos carboxílicos a través de NH2 para marcar de forma no específica las bacterias cuando se cuantifican las concentraciones de bacterias.

En este ejemplo, las formulaciones de europio se unen de forma no específica a bacterias.

Se inocularon Klebsiella pneumoniae o E. coli a través de una placa de 96 pocillos en concentraciones que variaban de 1x105 a 1x109 en tampón MES a pH 6 (criptato de europio-diamina; compuesto (3)) o HEPES pH 7,5 (EuropiolTC; compuesto (4)). A cada pocillo que contenían las bacterias, y los pocillos de control correspondientes, se añadió como se indica criptato de europio-diamina (Cisbio) o Europio ITC (PerkinElmer) a 66 ng/pocillo, luego EDC/NHS (a 0,1 y 0,3 mg/mL) a los pocillos que contenían criptato de europio.

Se dejó incubar la solución de reacción durante 30 minutos para facilitar el marcado del exterior de las bacterias dentro del pocillo con el reportero elegido. A continuación, la placa de prueba se centrifugó, mediante el uso de una Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3, a una velocidad de 2500 * g durante 2,5 minutos para sedimentar las bacterias en el fondo de la placa mientras se dejaba cualquier indicador no asociado en el sobrenadante. A continuación, se aspiró la placa, mediante el uso de un lavador de placas BioTek Multiflo X, para eliminar el sobrenadante y el reportero sin reaccionar, antes de la adición de tampón de lavado. Este procedimiento de lavado se repitió una (criptato de europio -diamina) o dos (PerkinElmer) veces adicionales con el fin de eliminar completamente cualquier reportero sin reaccionar. Los pocillos que contenían criptato de europio-diamina se reconstituyeron en tampón de lectura y se leyeron mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en la Figura 33. Finalmente, a los pocillos aspirados tratados con Eu-N1, se añadieron el tampón de lectura antes de la adición de la solución de mejora Delfia. La placa se incubó durante 15 minutos para permitir la mejora del europio antes de la medición del europio mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en la Figura 33.

Estos datos muestran que las formulaciones de europio son capaces de cuantificar con precisión las concentraciones bacterianas en una solución cuando las formulaciones de europio se unen de forma no específica a bacterias.

Ejemplo 15: Puede usarse glutaraldehído para unir de forma no específica criptato de europio a la superficie bacteriana.

En este ejemplo, las formulaciones de europio se unen de forma no específica a bacterias con glutaraldehído.

Se inocularon Klebsiella pneumoniae, E coli, o Staph aureus a través de una placa de 96 pocillos en concentraciones que variaban de 1x105 a 1x109 en tampón MES a pH 6. A cada pocillo que contenían las bacterias, y los pocillos de control correspondientes, se añadió criptato de europio-diamina (compuesto (3); Cisbio) a 66 ng/pocillo, luego una solución al 5 % de glutaraldehído a los pocillos que contenían criptato de europio.

Criptato de europio-diamina (Criptato de Eu-diamina)

Se dejó incubar la solución de reacción durante 30 minutos para facilitar el marcado del exterior de las bacterias dentro del pocillo con el reportero elegido. A continuación, la placa de prueba se centrifugó, mediante el uso de una Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3, a una velocidad de 2500 * g durante 2,5 minutos para sedimentar las bacterias en el fondo de la placa mientras se dejaba cualquier indicador no asociado en el sobrenadante. A continuación, se aspiró la placa, mediante el uso de un lavador de placas BioTek Multiflo X, para eliminar el sobrenadante y el reportero sin reaccionar, antes de la adición de tampón de lavado. Este procedimiento de lavado se repitió una vez para eliminar completamente cualquier reportero sin reaccionar. Los pocillos que contenían criptato de europio-diamina se reconstituyeron en tampón de lectura y se leyeron mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en la Figura 34.

Estos datos muestran que las formulaciones de europio son capaces de cuantificar con precisión las concentraciones bacterianas en una solución cuando las formulaciones de europio se unen de forma no específica a bacterias.

Ejemplo 16: Puede usarse EDC/NHS para acoplar de forma no específica criptato de europio a la superficie bacteriana.

En este ejemplo, las formulaciones de europio se unen de forma no específica a bacterias con EDC/NHS.

Se inocularon Klebsiella pneumoniae o E. coli a través de una placa de 96 pocillos en concentraciones que variaban de 1x105 a 1x109 en tampón MES a pH 6. A cada pocillo que contenían las bacterias, y los pocillos de control correspondientes, se añadió criptato de europio-diamina (compuesto (3); Cisbio) a 66 ng/pocillo, luego EDC/NHS (a 0,1 y 0,3 mg/mL) a los pocillos que contenían criptato de europio.

Criptato de europio-diamina (Criptato de Eu-diamina)

Se dejó incubar la solución de reacción durante 30 minutos para facilitar el marcado del exterior de las bacterias dentro del pocillo con el reportero elegido. A continuación, la placa de prueba se centrifugó, mediante el uso de una Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3, a una velocidad de 2500 * g durante 2,5 minutos para sedimentar las bacterias en el fondo de la placa mientras se dejaba cualquier indicador no asociado en el sobrenadante. A continuación, se aspiró la placa, mediante el uso de un lavador de placas BioTek Multiflo X, para eliminar el sobrenadante y el reportero sin reaccionar, antes de la adición de tampón de lavado. Este procedimiento de lavado se repitió una vez para eliminar completamente cualquier reportero sin reaccionar. Los pocillos que contenían criptato de europio-diamina se reconstituyeron en tampón de lectura y se leyeron mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en la Figura 35.

Estos datos muestran que las formulaciones de europio son capaces de cuantificar con precisión las concentraciones bacterianas en una solución cuando las formulaciones de europio se unen de forma no específica a bacterias.

Ejemplo 17: Efecto de los ciclos de lavado con glutaraldehído sobre bacterias marcadas con criptato de forma no específica.

En este ejemplo, las formulaciones de europio se unen de forma no específica a bacterias con varios lavados que comprenden glutaraldehído.

Se inocularon E coli o Staph aureus a través de una placa de 96 pocillos en concentraciones que variaban de 1x105 a 1x109 en tampón MES a pH 6. A cada pocillo que contenían las bacterias, y los pocillos de control correspondientes, se añadió criptato de europio-diamina (compuesto (3); Cisbio) a 66 ng/pocillo, luego una solución al 5 % de glutaraldehído a los pocillos que contenían criptato de europio.

Se dejó incubar la solución de reacción durante 30 minutos para facilitar el marcado del exterior de las bacterias dentro del pocillo con el reportero elegido. A continuación, la placa de prueba se centrifugó, mediante el uso de una Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3, a una velocidad de 2500 * g durante 2,5 minutos para sedimentar las bacterias en el fondo de la placa mientras se dejaba cualquier indicador no asociado en el sobrenadante. A continuación, se aspiró la placa, mediante el uso de un lavador de placas BioTek Multiflo X, para eliminar el sobrenadante y el reportero sin reaccionar, antes de la adición de tampón de lavado. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces para investigar el efecto de múltiples lavados en la calidad general de los datos. Los pocillos que contenían criptato de europio-diamina se reconstituyeron en tampón de lectura y se leyeron mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en las Figura 36A a Figura 36C.

Estos datos muestran que las formulaciones de europio pueden unirse de forma no específica a bacterias mediante el uso de varios lavados que comprenden glutaraldehído.

Ejemplo 18: Un proceso de marcado de dos etapas que usa NH2-PEG-Biotina seguido de estreptavidina-europio (Eu-SAv) puede marcar bacterias de forma no específica.

En este ejemplo, las formulaciones de europio se unen de forma no específica a bacterias mediante el uso de un proceso de dos etapas.

Se inoculó E coli a través de una placa de 96 pocillos en concentraciones que variaban de 1x105 a 1x109 en tampón MES a pH 6. A cada pocillo que contenía las bacterias y los pocillos de control correspondientes, se añadió amina-PEG-biotina (Laysan Bio) a 1 mg/pocillo, luego EDC/n Hs (a 0,1 y 0,3 mg/ml) a los pocillos que contenían amina-PEG-biotina. Se dejó incubar la solución de reacción durante 15 minutos para facilitar la funcionalización del exterior de las bacterias dentro del pocillo con las especies de biotina. A cada pocillo de reacción se añadió estreptavidinaeuropio (Eu-SAv) (PerkinElmer) a 400 ng/pocillo. Se dejó incubar la solución de reacción durante 15 minutos para facilitar el acoplamiento entre la biotina y la estreptavidina. A continuación, la placa de prueba se centrifugó, mediante el uso de una Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3, a una velocidad de 2500 * g durante 2,5 minutos para sedimentar las bacterias en el fondo de la placa mientras se dejaba cualquier indicador no asociado en el sobrenadante. A continuación, se aspiró la placa, mediante el uso de un lavador de placas BioTek Multiflo X, para eliminar el sobrenadante y el reportero sin reaccionar, antes de la adición de tampón de lavado. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces para investigar el efecto de múltiples lavados en la calidad general de los datos. Los pocilios que contenían Eu-SAv se reconstituyeron en tampón de lectura y se leyeron mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en la Figura 37.

Estos datos muestran que las formulaciones de europio pueden unirse de forma no específica a bacterias mediante el uso de un proceso de dos etapas que comprende NH2-PEG-Biotina seguido de Eu-SAv.

Ejemplo 19. Un proceso de etiquetado de bacterias de dos etapas con NHS-LC-LC-Biotina seguido de Eu-SAv puede etiquetar bacterias de manera no específica.

En este ejemplo, las formulaciones de europio se unen de forma no específica a bacterias mediante el uso de un proceso de dos etapas.

Se inoculó E coli a través de una placa de 96 pocillos en concentraciones que variaban de 1x105 a 1x109 en tampón MES a pH 6. A cada pocillo que contenía las bacterias y los pocillos de control correspondientes, se añadió amina-LC-LC-biotina (Thermo-Fisher) a 1 mg/pocillo, luego EDC/NHS (a 0,1 y 0,3 mg/ml) a los pocillos que contenían amina-PEG-biotina. Se dejó incubar la solución de reacción durante 15 minutos para facilitar la funcionalización del exterior de las bacterias dentro del pocillo con las especies de biotina. A cada pocillo de reacción se añadió estreptavidina-europio (PerkinElmer) a 400 ng/pocillo. Se dejó incubar la solución de reacción durante 15 minutos para facilitar el acoplamiento entre la biotina y la estreptavidina. A continuación, la placa de prueba se centrifugó, mediante el uso de una Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3, a una velocidad de 2500 * g durante 2,5 minutos para sedimentar las bacterias en el fondo de la placa mientras se dejaba cualquier indicador no asociado en el sobrenadante. A continuación, se aspiró la placa, mediante el uso de un lavador de placas BioTek Multiflo X, para eliminar el sobrenadante y el reportero sin reaccionar, antes de la adición de tampón de lavado. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces para investigar el efecto de múltiples lavados en la calidad general de los datos. Los pocillos que contenían criptato de europio-diamina se reconstituyeron en tampón de lectura y se leyeron mediante el uso de fluorescencia resuelta en el tiempo en un lector de placas BioTek HI, como se muestra en la Figura 38. Estos datos muestran que las formulaciones de europio pueden unirse de forma no específica a bacterias mediante el uso de un proceso de dos etapas que comprende NHS-LC-LC-Biotina seguido de Eu-SAv.

Ejemplo 20: Pueden aislarse bacterias filamentosas a partir de una solución mediante el uso de un sistema de filtro que tiene poros que varían en tamaño de >0,2 micrones a <10 micrones; lo que proporciona así datos de sensibilidad química más precisos.

Este ejemplo ilustra un caso que usa filtrado para excluir bacterias que han experimentado un crecimiento filamentoso en respuesta al tratamiento antimicrobiano.

Los bacilos gram-negativos, en particular, experimentan primero un crecimiento filamentoso en respuesta a concentraciones sub-inhibitorias de antimicrobianos que actúan sobre la pared celular (como los betalactámicos). Aunque estos eventualmente serán inhibidos, los enfoques de "volumen" metabólico tienen una dificultad significativa para distinguir las bacterias resistentes a los antimicrobianos de las bacterias que han experimentado un crecimiento filamentoso. Cuando no se considera, tal crecimiento filamentoso identifica incorrectamente a una bacteria como más resistente de lo que realmente es. La dificultad para determinar la resistencia a los antimicrobianos mediante el uso de un enfoque de "volumen" se ve en la Figura 39.

Para evitar esto, en un caso, al final de un período de incubación, cada microdilución en caldo se carga en un filtro que comprende uno o más tamaños de poros predeterminados (véase, Figura 40). Los tamaños de poro se eligen de modo que una pluralidad de bacterias "normales" es capaz de pasar a través del filtro, pero las bacterias filamentosas de más de una cierta longitud quedan atrapadas. El tamaño de los poros puede ser>0,2 micrones y <10 micrones.

Este filtro puede diseñarse para el procesamiento de muestras en paralelo, como una placa de 96, 384 o 1586 pocillos. Puede aplicarse un filtro durante el proceso de AST, como se muestra en la Figura 40.

Este ejemplo ilustra además la ventaja clave de diseñar una plataforma de AST rápida que determina la presencia de bacterias intactas por área de superficie en oposición al enfoque metabólico convencional, que es esencialmente una medición volumétrica.

Ejemplo 21: Métodos para preparar y usar un agente de señalización que comprende una nanopartícula fluorescente.

En este ejemplo, se describen métodos para preparar y usar un agente de señalización que comprende una nanopartícula fluorescente.

Primero, se pesaron 20 mg de dilaurato de fluoresceína (FL-DL) en un vial de centelleo de vidrio transparente y se añadieron 1000 mg de etanol. A continuación, se disolvió el FL-DL en el vial mediante agitación con vórtex. Posteriormente, se añadieron a esta mezcla 10 mg de DSPE-PEG-2k-amina (Laysan Bio) y se disolvieron mediante agitación con vórtex. Por separado, se pesaron 40 g de agua DI en un vaso de precipitados y se añadió una barra de agitación. A continuación, se colocó el vaso de precipitados en un agitador magnético y se agitó a 200 rpm. A continuación, se añadió la solución de etanol al vaso de precipitados en forma de gota a gota, y luego se introdujo la solución subsiguiente en un homogeneizador Microfluidics y se procesó una vez a 6000 psi. Luego se añadieron 200 g de agua DI a la mezcla resultante y se usó Filtración de Flujo Tangencial (TFF) para purificar y concentrar las nanopartículas aproximadamente 12 veces a 20 mL y luego se recolectaron en un vial de centelleo de vidrio. Esta formulación de nanopartículas recolectadas se filtró a través de un filtro de 0,2 pm, y el tamaño y la concentración de las nanopartículas se determinaron mediante NanoSight (Malvern), con una lectura de tamaño promedio de 102 nm. Las nanopartículas que contienen fluoróforos se funcionalizaron con moléculas pequeñas cargadas positivamente para formar un agente de señalización útil en la presente divulgación.

Tanto Escherichia coli (ATCC 11303) como E. coli (ATCC 39936) resistente a ampicilina se cultivaron en condiciones estériles estándar en caldo LB a 37 °C. Las concentraciones se determinaron al medir la absorbancia a 600 nm (McFarland), y una concentración de 5*105 UFC/mL se fijó por dilución. A continuación, se pesó la ampicilina en agua estéril y se añadió en concentraciones apropiadas a tubos de microcentrífuga de 3 mL estériles. Las bacterias y las nanopartículas a una concentración de 8*108 nanopartículas/mL se añadieron a estos tubos de microcentrífuga estéril recubiertos con ampicilina. A continuación, los tubos se taparon y se colocaron a 37 °C durante 1,5 horas con agitación continua, después de lo cual se abrieron y cada uno se pasó a través de un filtro de 0,2 pm. A continuación, se añadieron 100 pL de cada filtrado a un pocillo de una placa de 96 pocillos y se añadieron a cada pocillo 150 pL de una solución de revelado (hidróxido de tetrametilamonio al 5 % en etanol). Después de 5 minutos, la placa se leyó a 490 nm de excitación/530 nm de emisión en un lector de microplacas SpectraMax M2 (Molecular Devices).

La Figura 41 muestra el resultado de un ensayo que usa el agente de señalización preparado anteriormente que comprende una nanopartícula. Aquí, Escherichia coli y E. coli resistente a ampicilina tratadas con y sin 100 pg/mL de ampicilina, una concentración muy por encima de la MIC. Se realizó un ensayo de agentes de señalización libres, que no están asociados con bacterias intactas, después que se eliminaran las bacterias intactas mediante filtración a través de un filtro de 0,2 pm. Los grupos de control que no contienen ampicilina muestran señales fluorescentes bajas al igual que el grupo E. coli resistente a ampicilina tratado con ampicilina. Las E. coli tratadas con ampicilina por encima de la MIC muestran un aumento significativo de la fluorescencia, lo que indica la eficacia de este antimicrobiano.

La Figura 42 muestra el resultado de un ensayo para E. coli para concentraciones variables de ampicilina. La señal fluorescente es baja cuando la concentración de ampicilina está por debajo de la MIC, -15 pg/mL, y aumenta a este valor, lo que indica la eficacia del antimicrobiano en este rango

Ejemplo 22: Un ejemplo de referencia que usa perlas magnéticas para aislar bacterias intactas.

En este ejemplo de referencia, se utilizan perlas magnéticas, que están asociadas con un agente capaz de unir bacterias intactas, para aislar bacterias intactas a partir de una solución.

Se prepararon perlas magnéticas reactivas a E. coli a partir de perlas magnéticas de 1 micra activadas con éster de W-hidroxisuccinimidilo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ThermoFisher). Brevemente, las perlas suministradas se capturaron magnéticamente y se aspiró la solución de almacenamiento. A continuación, las perlas se lavaron con ácido clorhídrico 0,1 M enfriado con hielo, seguido de la adición de un anticuerpo policlonal antilipopolisacárido (LPS) objetivo (Antibodies-Online Inc.). La reacción se agitó durante 2 horas, con agitación con vórtex cada 5 minutos durante los primeros 30 minutos, según las instrucciones del fabricante. A continuación, las perlas se lavaron minuciosamente y se almacenaron en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, a 4 °C hasta su uso.

Los agentes de señalización comprenden un resto capaz de unirse a un microorganismo (por ejemplo, un anticuerpo que se une a E. coli) y un resto químico capaz de proporcionar una señal o contribuir a la producción de una señal (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP)).

Las perlas magnéticas anti-LPS y los agente de señalización anti-E. coli se añadieron de forma simultánea a una serie de diluciones de E. coli en caldo MH determinadas por el estándar McFarland. Se dejó que la reacción prosiguiera durante 20 min, seguido de la captura de perlas magnéticas con un soporte magnético de microplaca de 96 pocillos (V&P Scientific). Los pocillos se lavaron tres veces, seguido de la adición de la solución de detección descrita en el ejemplo 1. Se leyeron las densidades ópticas a 450 nm y 650 nm durante 10 min. El valor a los 5 min se representa en la Figura 43.

A continuación, se usó el procedimiento del ejemplo 1 mediante la adición de agentes de señalización y perlas magnéticas funcionalizadas. Sin embargo, aquí, la cepa de S. aureus fue ATCC 12600 y se usaron tres antimicrobianos: certazidima, oxacilina y vancomicina.

Después del período de incubación, se añadieron perlas magnéticas con cargas catiónicas fijas de un tamaño de 0,5 |jm (ChemiCell Fluidmag) simultáneamente con los agentes de señalización. El pH se ajustó a ~8,4 mediante la adición de 50 jL de tampón borato. La microplaca se agitó en un agitador orbital durante 20 minutos. A continuación, la microplaca se colocó sobre una placa de captura magnética que comprendía 24 elementos magnéticos de neodimio N52. Luego se aspiró el caldo MH y se añadió PBS con Tween-20 al 0,1 % para un total de tres lavados. Después de la aspiración final, se añadió una solución de revelado estabilizada que consiste de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno (ThermoFisher) y se monitoreó la densidad óptica a 650 nm y 450 nm durante diez minutos con un lector de microplacas (Vmax, Molecular Devices). Los datos mostrados en la Figura 44 se representan desde el punto de cinco minutos después del inicio de la incubación con la solución de detección. Como era de esperar, las cantidades crecientes de los antimicrobianos, que causan la lisis de las células bacterianas, reducen el número de bacterias intactas.

Estos datos muestran que las partículas magnéticas funcionalizadas pueden capturar bacterias intactas y permitir la cuantificación de las bacterias intactas (cuando se unen a un agente de señalización) después de un tratamiento antimicrobiano. Tal captura magnética puede usarse junto con o en lugar de otras técnicas de separación con el fin de recolectar bacterias intactas para su uso en la presente divulgación.

Ejemplo 23: La centrifugación de soluciones bacterianas proporciona recuentos más precisos de bacterias intactas en comparación con el aislamiento de bacterias intactas mediante perlas magnéticas funcionalizadas.

En este ejemplo, el método para aislar bacterias intactas mediante el uso de perlas magnéticas funcionalizadas (como se describe en el ejemplo 21+) se compara con un método para aislar bacterias intactas mediante el uso de centrifugación.

La captura de bacterias intactas mediante el uso de perlas magnéticas funcionalizadas se realizó como se describió anteriormente. Para los datos de centrifugación, las bacterias se lavaron tres veces mediante un proceso de centrifugación a 2500 * g durante 2,5 minutos, aspiración manual y adición de PBS-Tween. No se usaron perlas magnéticas para lavados por centrifugación. Las bacterias se trataron con concentraciones variables de vancomicina ("VAN").

La Figura 45 muestra que la centrifugación proporciona cifras de bacterias y MIC mucho más altas y más precisas que el aislamiento mediante perlas magnéticas funcionalizadas.

Estos datos muestran que la centrifugación de cultivos bacterianos para aislar bacterias intactas es superior a los métodos que usan partículas magnéticas funcionalizadas. El aislamiento mediante centrifugación puede usarse junto con (por ejemplo, aislamiento magnético) o en lugar de otras técnicas de separación con el fin de recolectar bacterias intactas para usar en la presente divulgación.

Ejemplo 24: La amplificación química a través del amplificador de nanopartículas TAML permite la señalización con una sensibilidad óptima en el rango de 1x103 a 1x108 UFC/mL mediante el uso de un equipo de detección óptica estándar.

En este ejemplo, se describen métodos para preparar y usar un agente de señalización que comprende catalizadores de ligando tetraamino metalorgánico (TAML®).

La amplificación química está habilitada con un amplificador de nanopartículas patentado, que adapta las técnicas de formulación de nanopartículas de vanguardia de la administración de fármacos y un catalizador de molécula pequeña de la química verde. Cada uno comprende "nanoetiqueta" >6*104 densamente empaquetadas catalizadores de ligando tetra-amino organometálico (TAML®) que contienen hierro, protegidos por una cáscara de polímero funcionalizado con ligandos específicos (Figura 46). Cada molécula de TAMl tiene actividades molares 5 veces superiores a aquellas de la peroxidasa de rábano picante, un marcador enzimático de inmunoensayo estándar de oro (Figura 46B). Después de la unión específica, las nanoetiquetas se activan químicamente para liberar su contenido en la solución, lo que permite una catálisis homogénea de la señal óptica. El alto número de catalizadores por evento de unión permite la cuantificación de tan solo 200 bacterias intactas (Figura 46A) y mejoras de sensibilidad de 100 veces con respecto a los inmunoensayos enzimáticos estándar (Figura 46C). Además de obviar la necesidad de desarrollar nuevas tecnologías de detección, la detección óptica estándar permite la compatibilidad con microplacas de panel antimicrobiano seco estándar, tal como las placas SensiTitre.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i . Un método para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos que comprende:

   añadir un antimicrobiano a una suspensión líquida de microorganismos para formar una suspensión líquida de microorganismos en presencia del antimicrobiano;

   añadir un agente de señalización a la suspensión líquida de microorganismos;

   incubar la suspensión líquida de microorganismos en presencia del antimicrobiano y el agente de señalización en condiciones que promuevan el crecimiento de los microorganismos, en donde el agente de señalización es capaz de unirse a una superficie de los microorganismos por asociación y/o intercalación;

   separar los microorganismos unidos por el agente de señalización del agente de señalización no unido; y

   determinar los niveles de señal asociados con los microorganismos en comparación con uno o más controles, en donde el número de agentes de señalización que se asocian con y/o se intercalan en la superficie del microorganismo es proporcional al área superficial del microorganismo,

   lo que determina así la susceptibilidad antimicrobiana de los microorganismos.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el agente de señalización comprende un amplificador de señal y uno o más restos químicos capaces de unirse de forma no específica a una superficie de los microorganismos.
3. 3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la unión a una superficie de los microorganismos comprende una interacción no covalente no específica.
4. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el agente de señalización forma un enlace covalente no específico con la superficie de un microorganismo.
5. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente de señalización es un compuesto

   químico que comprende un grupo enlazador L, en donde

   L forma un enlace covalente con un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico; o L puede formar un enlace covalente con un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico; o

   L forma una o más interacciones no covalentes con un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico; o

   L puede formar una o más interacciones no covalentes con un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico.
6. 6. El método de la reivindicación 5, en donde dicho grupo enlazador L comprende:

   un resto químico 101, en donde dicho resto químico es capaz de formar un enlace covalente o una interacción no covalente con la superficie de un microorganismo;

   un resto espaciador 102, en donde el resto espaciador se une covalentemente al resto químico 101 y al resto químico 103; y

   un resto químico 103, en donde dicho resto químico ha formado o puede formar un enlace covalente con un grupo amplificador 104 que es un amplificador químico o bioquímico.
7. 7. El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde el agente de señalización comprende o se forma a partir de una estructura seleccionada del grupo que consiste de:

   

   

   

   ; y

   
8. 8. El método de la reivindicación 5 o 6 , en donde el resto químico 101 puede formar un enlace covalente con la superficie de un microorganismo en presencia de uno o más agentes que promueven el acoplamiento.
9. 9. El método de la reivindicación 8, en donde uno o más agentes se seleccionan del grupo que consiste de glutaraldehído, formaldehído, paraformaldehído, EDC, DCC, CMC, DIC, HATU, reactivo de Woodward, N,N'-carbonil diimidazol, acrilatos, amidas, imidas, anhídridos, clorotriazinas, epóxidos, isocianatos, isotiocianatos, ácidos orgánicos, monómeros, polímeros, silanos, silcatos, NHS, sulfo-NHS o cualquier combinación de los mismos.
10. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método no implica una etapa de capturar microorganismos en una superficie sólida antes o durante la incubación y/o no incluye una etapa de cultivo de microorganismos en una superficie sólida durante o después de la etapa de incubación.
11. 11. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde uno o más controles comprenden un control positivo medido a partir de microorganismos en condiciones de cualquier otra manera idénticas pero sin antimicrobianos o con uno o más antimicrobianos para los que los microorganismos no son susceptibles.
12. 12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los microorganismos son bacterias, hongos, protozoos y/o arqueas.
13. 13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además una etapa de determinar si un microorganismo es resistente, intermediamente resistente o susceptible a uno o más antimicrobianos y/o determinar una o más concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) de antimicrobianos sobre la base de los niveles de señal asociados con microorganismos intactos.
14. 14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se prueban múltiples antimicrobianos en paralelo.
15. 15. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las identificaciones de microorganismos se realizan a partir de una muestra biológica de la que se obtuvieron los microorganismos y/o a partir de un cultivo derivado de la muestra biológica de la que se obtuvieron los microorganismos.