BR112016000087B1 - Método para a determinação rápida de suscetibilidade ou resistência de bactérias a antibióticos - Google Patents

Abstract

método para a determinação rápida de suscetibilidade ou resistência de bactérias a antibióticos a invenção se refere a um método de avaliação rápida da suscetibilidade de uma estirpe de bactérias a um antibiótico inibidor da síntese da parede celular com base em uma avaliação do alargamento das células em resposta a doses do antibiótico inibidor da síntese da parede celular que estão correlacionadas com pontos de quebra de suscetibilidade bacteriana.

Description

[001] O pedido de patente internacional reivindica o benefício de prioridade em relação ao pedido de patente europeia EP 13382271.8, depositado em 4 de julho de 2013, sendo a divulgação aqui incorporada por referência.

Campo da Invenção

[002] A presente invenção se relaciona amplamente com a área de biotecnologia, e mais particularmente com microbiologia pertencendo a saúde humana, saúde veterinária e saúde ambiental. Certas formas de realização descritas se relacionam com métodos para a determinação rápida da suscetibilidade ou resistência de bactérias cultivadas a antibióticos.

Antecedentes da Invenção

[003] O Centro Europeu para Controle de Doenças (ECDC) relata 25.000 mortes anuais devido a patogênicos multirresistentes, por exemplo, patogênicos resistentes a vários antibióticos. Tratamentos com antibióticos iniciais, bem selecionados proporcionam a melhor defesa contra tais patogênicos multirresistentes. Dada a elevada prevalência de resistências, os procedimentos correntes requerem uma cultura bacteriana para identificação do microrganismo seguida por um antibiograma, que requer rotineiramente 2-3 dias de crescimento bacteriano. Só o passo de cultivo de bactérias para construir um antibiograma requer geralmente cerca de um dia de incubação, ou cerca de um mínimo de 18 horas. Portanto existe uma necessidade de determinação rápida de um tratamento com antibióticos tal que um tratamento eficaz possa ser rapidamente administrado.

[004] Uma vez cultivadas, metodologias convencionais avaliam a resistência de bactérias a um antibiótico por uma comparação contra uma Concentração Inibidora Mínima (MIC) estabelecida. A Concentração Inibidora Mínima (MIC) é geralmente considerada como a dose mais baixa de antibiótico que inibe significativamente o crescimento bacteriano como determinado pelas técnicas padrão de microdiluição ou por um teste E. Organizações internacionais como o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) estabelecem as concentrações de cada antibiótico específico que são geralmente usadas como referências de suscetibilidade, resistência intermédia e resistente para cada bactéria específica. Por exemplo, uma estirpe de Acinetobacter baumannii é considerada suscetível a imipenem quando a sua MIC é < 4 μg/mL, intermédia quando a MIC é entre 4 μg/mL e 8 μg/mL, e resistente quando a MIC é > 16 μg/mL.

[005] Existe uma grande preocupação globalmente devido ao aumento progressivo de doenças infecciosas nosocomiais (adquiridas em hospitais) críticas, frequentemente em pacientes imunocomprometidos e frequentemente da Unidade de Cuidados Intensivos (ICU). Por uma variedade de razões, tais infecções podem estar associadas a uma elevada taxa de mortalidade. Os patogênicos podem infetar um paciente através de meios médicos intrusivos, mas necessários, tais como na via respiratória durante ventilação mecânica, no trato urinário ou vasos sanguíneos através de cateteres ou mesmo através de feridas na pele tais como incisões requeridas para qualquer número de procedimentos médicos. Muitos patogênicos associados a estes problemas pertencem à família de bacilos Gram-negativos. Por exemplo, frequentemente Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e algumas enterobactérias são resistentes a vários antibióticos. Dado o tempo relativamente longo necessário para realizar o antibiograma padrão são usualmente empiricamente proporcionados antibióticos. Este tratamento pode ser ineficaz em 20-40 % dos casos, e uma mudança de antibióticos mais tarde pode ter uma probabilidade reduzida de sucesso. Em estes cenários urgentes com risco aumentado de morte ou complicações graves, um sistema rápido de determinar um tratamento com antibióticos eficaz é de grande interesse. Portanto existe uma necessidade da determinação rápida de suscetibilidade bacteriana a antibióticos em dosagens padronizadas, que possa salvar vidas e reduzir os custos dos cuidados de saúde.

[006] A primeira linha de defesa no combate de doenças infecciosas se baseia frequentemente em antibióticos que se sabe serem eficazes com base no patogênico provável envolvido. No entanto, o mau uso ou uso excessivo de antibióticos pode levar a estirpes de bactérias crescentemente resistentes. De modo a prevenir o mau uso, os praticantes podem tentar isolar bactérias de amostras de sangue ou amostras de outro fluido para teste in vitro, tal como um antibiograma, concorrentemente com os antibióticos iniciais.

[007] Um antibiograma resulta de teste clínico de uma estirpe de bactérias isolada in vitro quanto à sua suscetibilidade a antibióticos. Uma metodologia comum para construção de um antibiograma com base em difusão é o método de Kirby-Bauer (Bauer A W, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disc method. Am J Clin Pathol 1966;45:493-496). No método semiquantitativo de Kirby-Bauer, vários discos contendo diferentes antibióticos são colocados em diferentes zonas de cultura de bactérias rica em nutrientes. Como o antibiótico se difunde no ágar para fora do disco, o diâmetro em torno do disco no qual as bactérias não crescem é sugestivo da concentração inibidora mínima (MIC) desse antibiótico para a estirpe de bactérias cultivada. Um método quantitativo pode se basear em uma série de frascos tendo concentrações progressivamente menores do antibiótico em questão. O frasco com a concentração mais baixa de antibiótico no qual as bactérias não conseguem crescer proporciona a concentração inibidora mínima desse antibiótico para a estirpe de bactérias testada.

[008] Cada um dos métodos de difusão e diluição se baseia no princípio de inibição da proliferação bacteriana em um meio rico em nutrientes e isto requer tempo suficiente para muitos ciclos reprodutores de bactérias. Como tal, ambas as metodologias podem requerer um mínimo de entre 18 horas e 24 horas.

[009] Tentativas prévias de melhorar a velocidade de avaliação da suscetibilidade bacteriana a antibióticos têm falhado em proporcionar a redução significativa no tempo requerida para atender às necessidades acima descritas. O WO/1992/019763 descreve um método prévio incorporando um composto fluorogênico contendo nutrientes tendo um repórter fluorescente. Um microrganismo que continua a crescer na presença de um antibiótico metaboliza o composto liberando o repórter fluorescente, ao passo que os processos metabólicos de estirpes suscetíveis liberam menos repórteres fluorescentes. Esta metodologia requer ainda tempo de incubação suficiente permitindo a liberação de um número suficiente de repórteres fluorescentes e pode levar em torno de oito horas para se obterem resultados.

[010] As metodologias acima descritas são baseadas na avaliação do crescimento bacteriano. Os resultados de tais ensaios podem ser acelerados usando uma abordagem de microscopia com lapso de tempo ou microscopia em tempo real. Pode ser empregue software para facilitar a interpretação destes resultados. Sistemas comercializados como o MicroScan WalkAway, Vitek, e Wider podem ser capazes de determinar a suscetibilidade ou resistência a antibióticos de um microrganismo específico em torno de 6-9 horas.

[011] Outra abordagem para avaliação da resposta de uma estirpe bacteriana a um antibiótico é a avaliação sequencial do aumento de sequências de DNA bacteriano específicas, que está diretamente relacionado com o número de bactérias, usando um ensaio da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (q-PCR). Puderam ser obtidos resultados de afetação possível de crescimento bacteriano pelo antibiótico após 6 horas de cultivo (Rolain JM, Mallet MN, Fournier PE, Raoult D. Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing. J Antimicrob Chemother 2004;54:538-541).

[012] Outra abordagem experimental pode ser caracterizada como um sistema de dieletroforese que detecta mudanças na eletrofisiologia da célula após administração do antibiótico (Hoettges KF, Dale JW, Hughes MP. Rapid determination of antibiotic resistance in E. coli using dielectrophoresis. Phys Med Biol 2007;52:6001-6009). Outra possibilidade é a medida do calor liberado pela cultura bacteriana, usando sistemas de microcalorimetria (Baldoni D, Hermann H, Frei R, Trampuz A, Steinhuber A. Performance of microcalorimetry for early detection of methicillin resistance in clinical isolates of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2009; 47:774-776).

[013] No caso de antibióticos que atuam ao nível da parede celular, como as β-lactamas, a Patente europeia EP0135023 descreve substratos específicos para detecção da atividade de proteínas ou enzimas citoplasmáticas liberadas para o meio quando um antibiótico era eficaz. Outra possibilidade é a avaliação de fragmentos de DNA liberados para o meio (Santiso R, Tamayo M, Gosálvez J, Bou G, Fernández MC, Fernández JL. A rapid in situ procedure for determination of bacterial susceptibility or resistance to antibiotics that inhibit peptidoglycan biosynthesis. BMC Microbiol 2011;11:19). As bactérias são aprisionadas em um microgel de agarose em uma lâmina e incubadas com uma solução de lise que afeta somente aquelas células cuja parede celular foi afetada e/ou debilitada pelo antibiótico. Somente estas bactérias liberam o nucleoide, que é visualizado sob microscopia de fluorescência após coloração de DNA com um fluorocrómo com elevada sensibilidade. As bactérias resistentes ao antibiótico não são afetadas pela solução de lise e não liberam o nucleoide, mantendo assim a sua forma padrão. Este procedimento pode ser também adaptado para a determinação da suscetibilidade ou resistência a antibióticos que induzem a fragmentação do DNA bacteriano, como as quinolonas. Para este propósito, a solução de lise tem de ser mais forte, tal que todas as bactérias liberem os nucleoides de um modo detectável. Essas bactérias suscetíveis à quinolona mostram DNA fragmentado, por exemplo, fragmentos de DNA difusos, ao passo que aquelas resistentes revelam nucleoides intactos (Santiso R, Tamayo M, Fernández JL, Fernández MC, Molina F, Gosálvez J, Bou G. Rapid and simple determination of ciprofloxacin resistance in clinical strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol 2009;47: 2593-2595). No entanto, esta metodologia pode ocasionalmente resultar na identificação positiva falsa de uma estirpe suscetível, o que pode consequentemente levar a tratamentos com antibióticos ineficazes. Por exemplo, algumas estirpes de P. aeruginosa que são categorizadas como intermediárias ou resistentes a carbapenemos, seguindo o critério do CLSI, podem liberar o nucleoide por afetação da parede celular, logo podem ser mal identificadas como suscetíveis.

[014] Cada abordagem experimental tem falhado em proporcionar uma medição rápida e precisa da suscetibilidade bacteriana a dosagens padronizadas de antibióticos, e a área continua geralmente a se basear nos métodos de diluição e difusão de construção de um antibiograma.

Sumário da Invenção

[015] Certas formas de realização da invenção reivindicada estão resumidas abaixo. Estas formas de realização não se destinam a limitar o escopo da invenção reivindicada, porém servem como breves descrições de possíveis formas da invenção. A invenção pode englobar uma variedade de formas que diferem destes resumos.

[016] Algumas formas de realização se relacionam com um método de avaliação rápida da suscetibilidade de uma estirpe de bactéria isolada a um antibiótico inibidor da síntese da parede celular. O método pode iniciar pelo estabelecimento de uma cultura de bactérias de uma estirpe de bactéria isolada e por combinação de uma ou mais doses de um antibiótico inibidor da síntese da parede celular com diferentes porções da cultura de bactérias. A concentração de cada uma ou mais doses pode ser correlacionada com limiares de resistência a antibióticos para as bactérias isoladas ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular. A cultura de bactérias e uma ou mais doses de antibiótico podem ser depois incubadas. Após incubação, o comprimento das células ou tamanho das células das bactérias incubadas pode ser avaliado para cada uma da uma ou mais doses de antibiótico inibidor da síntese da parede celular. A suscetibilidade das bactérias isoladas ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular pode ser classificada com base nos comprimentos das células ou tamanhos das células associados a cada dose da uma ou mais doses de antibiótico inibidor da síntese da parede celular.

Breve Descrição das Figuras

[017] A FIG. 1 ilustra um diagrama de fluxo de um método de acordo com certas formas de realização descritas aqui.

[018] A FIG. 2 ilustra imagens de estirpes de A. baumannii incubadas com antibióticos de acordo com certas formas de realização descritas aqui.

[019] Embora a presente invenção possa ser realizada com várias modificações e formas alternativas, formas de realização específicas são ilustradas nas figuras e descritas por meio de exemplos ilustrativos. Deve ser entendido que as figuras e descrições detalhadas não se destinam a limitar o escopo da invenção quanto à forma particularmente descrita, mas que todas as modificações, alternativas, e equivalentes são abrangidas pela essência e pelo escopo das reivindicações destinadas para proteção.

Maneiras para Realizar a Invenção

[020] Como usado ao longo desta descrição, o termo "crescimento", quando usado em conjunção com bactérias, bacteriano, microrganismo e similares, deve ser entendido como um aumento do número de células, tal como a proliferação de bactérias em uma cultura.

[021] Similarmente, termos tais como "inibição do crescimento" devem ser entendidos como se referindo à inibição de um aumento do número de células, tal como inibição da proliferação bacteriana em uma cultura de bactérias.

[022] Como usado ao longo desta descrição e reivindicações, o termo "alargamento", quando usado em conjunção com microrganismo, bactéria, e similares, deve ser entendido como um aumento no comprimento e/ou tamanho de microrganismos individuais, bactérias, e similares.

[023] Formas de realização da presente invenção demonstraram que a atividade de certos antibióticos, e particularmente antibióticos que inibem a síntese da parede celular ou que inibem a síntese de peptidoglicano em diferentes bactérias, pode ser confiavelmente determinada através da avaliação do alargamento do tamanho ou comprimento das células. Para distinguir estirpes suscetíveis de estirpes intermediárias ou resistentes, as bactérias podem ser incubadas com doses de antibióticos que são muito menores do que aquelas empregadas como pontos de quebra suscetível, intermédio ou resistente, estabelecidos pelas organizações internacionais como o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para os antibiogramas padrões com base na avaliação do crescimento bacteriano através de microdiluição ou teste E. As concentrações de antibióticos estabelecidas pelo CLSI são adequadas para discriminar a suscetibilidade ou resistência com base no efeito lítico das células e inibição do crescimento das células.

[024] As concentrações do ponto de quebra de vários antibióticos inibidores da síntese da parede celular indicadas pelo CLSI são mais elevadas do que aquelas concentrações que resultam em alargamento. O alargamento celular pela atividade de antibióticos inibidores da síntese da parede celular pode ser observado quando se incuba com as concentrações estabelecidas pelo CLSI para a suscetibilidade, mesmo em estirpes de bactérias resistentes. Surpreendentemente, a presente invenção proporciona a evidência de que é possível estabelecer uma correlação entre as concentrações do ponto de quebra do CLSI para a suscetibilidade e novas concentrações do ponto de quebra com base na presença ou ausência de alargamento das células em resposta a um antibiótico inibidor da síntese da parede celular. Embora se saiba que vários antibióticos têm efeitos no comprimento de células bacterianas, o alargamento das células bacterianas nunca foi considerado como um parâmetro para determinação da suscetibilidade/resistência de bactérias a estes antibióticos. Para esta finalidade é necessário identificar a concentração mínima do antibiótico acima do qual o alargamento do tamanho ou comprimento das células bacterianas começa a ser significativo em uma estirpe específica de uma espécie específica de bactérias.

[025] As concentrações mínimas de antibióticos que discriminam estirpes suscetíveis, intermediárias e resistentes (ou mesmo somente estirpes suscetíveis e resistentes) a vários antibióticos inibidores da síntese da parede celular podem ser empiricamente correlacionadas para cada espécie de microrganismo a vários antibióticos. Como um exemplo, várias concentrações de antibiótico podem ser incubadas com um grande número de estirpes de bactérias que foram determinadas cada uma como sendo suscetíveis por teste MIC-CLSI. O teste MIC-CLSI pode incorporar metodologias de antibiograma tradicionais, tais como crescimento/decrescimento obtidos por difusão, microdiluição e/ou um teste E. A concentração mínima de antibiótico que resulta no alargamento de estirpes de bactérias identificadas como suscetíveis de acordo com teste MCI-CLSI pode ser considerada como uma concentração correlacionada com o valor de MCI-CLSI para estirpes suscetíveis. Naturalmente, doses mais elevadas de antibióticos, tais como doses correlacionadas com pontos de quebra de resistência intermediária e resistente, demonstrarão também alargamento das células. Alternativamente, um ponto de quebra da suscetibilidade pode ser correlacionado com outras determinações padronizadas da suscetibilidade, ou mesmo uma determinação independente da suscetibilidade.

[026] Para aquelas bactérias que têm valores de MIC-CLSI indicando estirpes intermediárias, várias concentrações de um antibiótico podem ser incubadas com um grande número de estirpes de bactérias que foram determinadas cada uma como sendo intermediariamente resistentes pelo teste MIC-CLSI. A concentração mínima de antibiótico que resulta no alargamento dessas estirpes de bactérias pode ser considerada como uma concentração correlacionada com o limiar de MCI-CLSI para resistência intermédia. Naturalmente, doses mais elevadas, tais como uma dose correlacionada com o ponto de quebra de resistência, resultará também em alargamento das células. Alternativamente, um ponto de quebra intermédio pode ser correlacionado com outras determinações padronizadas da resistência intermediária, ou mesmo uma determinação independente da resistência intermediária.

[027] Finalmente, várias concentrações de antibiótico podem ser incubadas com um grande número de estirpes de bactérias que foram determinadas cada uma como sendo resistentes pelo teste MIC-CLSI. A concentração mínima de antibiótico que resulta no alargamento dessas estirpes de bactérias pode ser considerada como uma concentração correlacionada com o valor de MCI-CLSI para estirpes resistentes. Doses de ou acima da concentração correlacionada com o ponto de quebra de estirpes resistentes podem ou não resultar em alargamento das células, dependendo do nível particular de resistência de uma estirpe particular. Alternativamente, um ponto de quebra resistente pode ser correlacionado com outras determinações padronizadas de bactérias resistentes, ou mesmo uma determinação independente de bactérias resistentes.

[028] Os métodos descritos podem ser incorporados para teste de vários antibióticos que resultam em alargamento das bactérias e podem ser particularmente benéficos no teste de antibióticos inibidores da síntese da parede celular. Uma parede celular bacteriana é construída em um molde que pode ser composto por peptidoglicano ou mureína. Esta é uma cadeia linear constituída por N-acetilglucosamina (NAG) e ácido N- acetilmurâmico (NAM) alternantes. Um tetrapeptídeo está ligado a NAM formando uma ligação interpeptídica com o tetrapeptídeo da cadeia mais próxima, estabilizando e fortalecendo a parede celular.

[029] A principal família de antibióticos que inibem a síntese da parede celular corresponde às β-lactamas. Estes agentes bactericidas interferem com a formação das ligações interpeptídicas através de reações irreversíveis que inibem Proteínas de Ligação da Penicilina (PBPs), serina proteases ou transpeptidases. As cefalosporinas são uma subfamília específica das β-lactamas, compreendendo mais do que 60 antibióticos, agrupados em cinco "gerações", embora o número de gerações esteja sob discussão. As cefalosporinas, como ceftazidima, se ligam a várias PBPs, embora as vezes mostrem uma afinidade específica, como PBP3. Esta ação pode resultar no alargamento das células ou filamentação de bactérias por inibição do desenvolvimento do septo intercelular, que é necessário para a divisão das células.

[030] Os carbapenemos são outra β-lactama, os quais, ao contrário das penicilinas e cefalosporinas, mostram um átomo de carbono na posição 1 do anel de β-lactama, em vez de enxofre. Imipenem, meropenem, ertapenem, faropenem, doripenem, panipenem, e panipenem/betamipron são carbapenemos comuns. Deve ser apreciado que outros antibióticos são também contemplados para uso com certas formas de realização da invenção reivindicada. Por exemplo, se espera que outros antibióticos que inibem a síntese da parede celular proporcionem correlações similares com pontos de quebra de CLSI. Em particular, se espera que esses antibióticos que atuam para inibir a produção de peptidoglicano funcionem de um modo similar.

[031] A FIG. 1 ilustra um fluxograma de um método de acordo com certas formas de realização da invenção. O método pode iniciar em 110 com o passo de estabelecimento de uma cultura de bactérias a partir de uma estirpe de bactérias isolada. As bactérias podem ser coletadas de fluidos corporais de um paciente ou animal para cultivo in vitro por técnicas e protocolos conhecidos. A cultura de bactérias pode ser formada em um caldo líquido, bem como em um ágar rico em nutrientes ou mesmo um ágar mínimo. Em uma forma de realização, as bactérias podem ser formadas em uma cultura pura demonstrando crescimento exponencial. No caso da cultura de bactérias não estar crescendo exponencialmente, a cultura pode ser colocada em um líquido rico em nutrientes, tal como um caldo de cultura, e incubada durante uma hora e meia antes dos passos adicionais. As bactérias coletadas para detecção rápida podem ser quaisquer bactérias causadoras de infecção em um paciente, ou apresentadas em um tecido ou fluidos corporais de um paciente. Embora não limitado pela invenção reivindicada, as infecções que podem ser problemáticas e que podem beneficiar a metodologia acima mencionada podem apresentar bacilos Gram-negativos. Como exemplos não limitantes adicionais, as bactérias podem ser Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, ou outra espécie da família de enterobactérias.

[032] No passo 120, a cultura de bactérias pode ser combinada com uma ou mais doses de um antibiótico. O antibiótico pode compreender um antibiótico inibidor da síntese da parede celular, tal como uma β-lactama (Beta-lactama) ou um glicopeptídeo. Em uma forma adicional de realização não limitante, o antibiótico pode ser selecionado de uma cefalosporina ou carbapenemo. Em uma forma de realização, as concentrações para cada dose de antibióticos podem ser estabelecidas antes do desenvolvimento deste método a partir de uma avaliação empírica de múltiplas estirpes da bactéria incluindo uma ampla gama de MICs, incluindo estirpes suscetíveis, intermediárias e resistentes de acordo com o CLSI, ou a partir de outro corpo competente que promulgue definições similares, tais como o European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ou The British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC). Por exemplo, pode ser estabelecida uma concentração mínima do antibiótico que induza o alargamento das células somente naquelas estirpes de bactérias classificadas como suscetíveis de acordo com os padrões de MIC- CLSI. Esta concentração pode ser considerada correlacionada com o padrão de MCI-CLSI para uma estirpe de bactérias suscetível. Em uma forma de realização, esta concentração correlacionada com a classificação de uma estirpe suscetível pode ser a única concentração desse antibiótico empregue para uma determinação rápida de uma estirpe de bactérias ser suscetível ou não suscetível a um antibiótico particular. Uma forma de realização pode rapidamente proporcionar informação fundamental que um clínico necessita urgentemente. Alternativamente podem ser empregues múltiplas doses a concentrações que são correlacionadas com concentrações mínimas para diferenciação de estirpes de bactérias suscetíveis, intermediárias e resistentes. Ainda em outra forma de realização são proporcionadas dosagens de antibiótico tal que pelo menos uma proporciona inibição significativa no crescimento bacteriano de estirpes de bactérias suscetíveis e é proporcionada pelo menos uma segunda dosagem que inibe significativamente o crescimento bacteriano de bactérias suscetíveis ou intermediárias, mas não bactérias resistentes.

[033] O passo de combinação de uma ou mais doses pode incluir a introdução de uma ou mais concentrações do antibiótico para separar as localizações físicas em uma placa, tal como uma placa de Petri, ou outra superfície de cultura plana. O passo de combinação de uma ou mais doses pode também incluir a introdução de doses em recipientes separados, tais como tubos de teste tendo um caldo de cultura.

[034] Vários passos de teste e exemplos podem ser descritos em termos de um único antibiótico e uma única estirpe de bactérias, mas deve ser apreciado que múltiplos antibióticos podem ser testados de uma vez de acordo com a invenção reivindicada. Por exemplo, uma ou mais doses podem compreender uma única concentração pré-determinada de múltiplos antibióticos, ou podem compreender múltiplas concentrações de uma variedade de antibióticos diferentes.

[035] Uma vez combinados, o antibiótico e a cultura de bactérias podem ser incubados no passo 130. Após uma hora de incubação com o antibiótico, as bactérias podem ser avaliadas quanto ao alargamento em termos de comprimento das células ou tamanho das células no passo 140. O comprimento das células e/ou tamanho das células pode ser avaliado com base em diferenças relativas, tal como comparado contra uma dose de controle (por exemplo, concentração de antibiótico de 0 μg/mL) ou mesmo comparado com medições tiradas antes da incubação com o antibiótico. A avaliação pode ser também baseada em medições quantitativas. A avaliação do alargamento das células pode ser feita por todos os sistemas possíveis de microscopia, tais como campo claro, campo escuro, contraste de fases, contraste interferencial, fluorescência, etc. Em uma forma de realização pode ser empregue software que seja capaz de determinar o comprimento das células ou tamanho das células e que possa adicionalmente incluir instruções para classificação da suscetibilidade com base em medições quantitativas ou comparações relativas. Tal avaliação pode ser feita também com vários sistemas de citometria, como citometria de fluxo ou por filtração através de membranas de diferentes tamanhos de poros ou por qualquer outra metodologia que discrimina tamanhos de células. Em uma forma de realização, vários conjuntos existentes podem ser modificados. Por exemplo, as bactérias podem ser suspensas em um microgel em uma lâmina e incubadas em banhos de álcool crescente, secas e examinadas sob microscopia. A microscopia por fluorescência após a coloração da bactéria aprisionada em microgéis secos, com um fluorocrómo, como Ouro SYBR, proporciona a vantagem adicional de se obterem imagens nítidas perfeitas, sem fundo, com grande qualidade para estabelecer precisamente e com confiança o tamanho ou comprimento das células. A adaptação do procedimento com microgel permite um sistema tecnológico integrado, apresentado como um conjunto que complementa aqueles existentes para uma determinação rápida da suscetibilidade ou resistência a antibióticos que atuam na parede celular.

[036] Logo que o comprimento das células ou alargamento das células seja avaliado, por comparação relativa ou por medição quantitativa, a estirpe de bactérias pode ser classificada. Como um exemplo, a bactéria pode ser classificada como suscetível, intermediária ou resistente, de acordo com as definições proporcionadas pelo CLSI. Com referência à FIG. 2 podem ser feitas classificações rapidamente com base na avaliação do alargamento em resposta a uma ou mais doses do antibiótico. No entanto podem ser também empregues outras definições de outras agências. As concentrações de dose podem ser empiricamente correlacionadas pela mesma metodologia previamente descrita. Como outro exemplo, as concentrações do ponto de quebra MIC do antibiótico estabelecidas pelo CLSI ou outras organizações reguladoras podem ser periodicamente revistas e poderiam ser mudadas. Neste caso, as concentrações do ponto de quebra para o critério de alargamento/não alargamento devem ser correlacionadas com os novos pontos de quebra de MIC. Por exemplo, a metodologia previamente descrita pode ser utilizada para correlacionar dosagens de teste com pontos de quebra da suscetibilidade, tais como pontos de quebra de suscetibilidade descritos em: Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-third informational supplement. Clinical and Laboratory Standards Institute, Vol 33 No 1. Documento do CLSI M100-S23, de janeiro 2013, os conteúdos do qual são incorporados aqui por referência. Similarmente, as dosagens de teste podem ser correlacionadas com pontos de quebra da suscetibilidade definidos por outras organizações, tais como o European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Independentemente dos pontos de quebra da suscetibilidade utilizados, uma determinação muito mais rápida da mesma informação é alcançada através dos passos descritos.

[037] Os passos 110 a 150 podem ser realizados no espaço de uma hora e meia, incluindo uma hora para incubação com o antibiótico e cerca de 15 minutos de preparação do microgel, desidratação com álcoois, secagem, coloração para a determinação do alargamento das células. No entanto, no caso de a cultura de bactérias não estar crescendo exponencialmente, pode ser requerida uma hora e meia extra de incubação em um caldo líquido para estabelecer crescimento exponencial.

Exemplo 1

[038] Concentrações do antibiótico de cefalosporina ceftazidima foram correlacionadas com os pontos de quebra para a classificação de estirpes de Acinetobacter baumannii suscetíveis, intermediárias e resistentes de acordo com os critérios do CLSI. A FIG. 2 mostra imagens de várias estirpes de A. baumannii, incluindo uma estirpe suscetível, uma estirpe intermediária e duas estirpes resistentes à ceftazidima, de acordo com os critérios MIC-CLSI. Várias estirpes de A. baumannii foram incubadas com ceftazidima durante uma hora, depois aprisionadas em um microgel em uma lâmina, desidratadas, coradas com Ouro SYBR e observadas sob microscopia de fluorescência.

[039] A primeira linha da FIG. 2 ilustra imagens de uma estirpe de A. baumannii suscetível (tendo uma MIC de 2,5 μg/mL) exposta a um controle não tendo antibiótico, uma segunda concentração de 2 μg/mL de ceftazidima, uma terceira concentração de 4 μg/mL de ceftazidima, e uma quarta concentração de 8 μg/mL de ceftazidima. A segunda linha da FIG. 2 ilustra imagens de uma estirpe de A. baumannii intermediária (tendo uma MIC de 12 μg/mL) exposta às mesmas concentrações de ceftazidima. A terceira linha ilustra imagens de uma estirpe de A. baumannii resistente (tendo uma MIC de 12 μg/mL) exposta às mesmas concentrações de ceftazidima e quarta linha ilustra uma estirpe altamente resistente. De acordo com os critérios do CLSI, uma estirpe de A. baumannii é classificada como suscetível quando a sua MIC < 8 μg/mL; intermédia quando 8 μg/mL > MIC < 16 μg/mL; e resistente quando MIC > 32 μg/mL.

[040] Novas concentrações dos pontos de quebra de ceftazidima foram apurados a partir de uma inspeção das lâminas ilustradas na FIG. 2. Por exemplo, a estirpe suscetível ilustrada na linha do topo demonstrou alargamento a partir das concentrações 2 μg/mL e superiores. A MIC determinada pelo teste E para a estirpe suscetível foi 2,5 μg/mL. A estirpe intermediária ilustrada na segunda linha demonstrou alargamento começando a concentrações de 8 μg/mL e superiores. A MIC determinada pelo teste E para a estirpe intermediária foi 12 μg/mL. A estirpe resistente ilustrada na terceira linha demonstrou alargamento a partir das concentrações 8 μg/mL e superiores. A MIC determinada pelo teste E para a estirpe suscetível foi 32 μg/mL. A estirpe altamente resistente ilustrada na quarta linha não demonstrou alargamento a qualquer concentração testada. A MIC determinada pelo teste E para a estirpe altamente resistente foi maior do que 256 μg/mL.

[041] Em resumo, as concentrações do ponto de quebra de ceftazidima seguindo o critério de alargamento das células (concentrações de antibiótico, acima das colunas) são 4 vezes menores do que aquelas indicadas pelo CLSI para as MICs. De acordo com o CLSI, as MICs do ponto de quebra foram < 8-16-> 32 μg/mL (suscetível-intermediária- resistente), que estão empiricamente coordenadas com concentrações de < 2-4-> 8 μg/mL no caso de alargamento das células. Com os valores empiricamente correlacionados com critérios para alargamento/não alargamento das células, as estirpes de bactérias suscetíveis e não suscetíveis podem ser determinadas com incubação em 2 μg/mL de antibiótico, em vez de 8 μg/mL requeridos pelo CLSI anteriormente. Mais importantemente, o tempo de incubação requerido para fazer uma determinação do alargamento/não alargamento é drasticamente reduzido em comparação com as metodologias anteriores.

Exemplo 2

[042] Para validar as concentrações do ponto de quebra estabelecidas no Exemplo 1, 320 estirpes de A. baumannii foram processadas. 51 destas estirpes foram determinadas como sendo suscetíveis à ceftazidima de acordo com MIC-CLSI estabelecida por um teste E, 35 estirpes foram determinadas como sendo intermediárias e 234 estirpes foram determinadas como sendo resistentes.

[043] Cada uma das 320 estirpes de Acinetobacter baumannii foi incubada com ceftazidima durante uma hora. Cada dose foi correlacionada com pontos de quebra da suscetibilidade estabelecidos no Exemplo 1. As amostras incubadas foram depois avaliadas sob microscopia quanto ao alargamento. O critério de alargamento/não alargamento foi determinado por uma comparação com uma dose de controle de 0 μg/mL. As amostras foram consideradas como sendo suscetíveis quando demonstraram alargamento em resposta a concentrações 2 μg/mL e superiores. As amostras foram consideradas como sendo intermediárias quando demonstraram alargamento em resposta a concentrações 4 μg/mL e superiores. As amostras foram consideradas como sendo resistentes quando demonstraram alargamento em resposta somente à dose de 8 μg/mL, ou não alargamento a qualquer concentração. Usando o critério de alargamento/não alargamento e as concentrações do ponto de quebra correlacionados, cada uma das 320 estirpes foi corretamente identificada.

Exemplo 3

[044] Klebsiella pneumoniae, outro patogênico significativo em ambiente clínico, foi também testada. De acordo com os critérios do CLSI, uma estirpe de K. pneumoniae é classificada como suscetível à ceftazidima quando a sua MIC < 4 μg/mL e resistente quando MIC >16 μg/mL. Quando se usa o comprimento bacteriano (alargamento), as novas concentrações do ponto de quebra foram empiricamente correlacionadas de modo similar como descrito no Exemplo 1, exceto que, de acordo com os padrões de MIC-CLSI, não foi determinado um valor adicional para a resistência intermediária. Estas concentrações do ponto de quebra correlacionadas para alargamento foram 0,5 μg/mL para estirpes suscetíveis e maiores do que 1,25 μg/mL para estirpes resistentes. Dito de outro modo, as estirpes foram consideradas como sendo suscetíveis quando demonstraram alargamento das células em resposta a concentrações de 0,5 μg/mL e 1,25 μg/mL e foram consideradas como sendo intermediárias quando demonstraram alargamento das células em resposta somente à dose de 1,25 μg/mL. As estirpes foram consideradas como sendo resistentes quando não estava presente nenhum alargamento das células a qualquer uma das concentrações. Foram estudadas 61 estirpes de K. pneumoniae, incluindo 31 suscetíveis, 16 intermediárias e 14 resistentes à ceftazidima, de acordo com o critério padrão de afetação do crescimento como indicado por MIC-CLSI.

[045] Cada estirpe foi incubada com 0,5 μg/mL e 1,25 μg/mL de ceftazidima e avaliada quanto ao alargamento no modo descrito no Exemplo 2. Cada uma das sessenta e uma estirpes foi corretamente identificada usando as novas concentrações do ponto de quebra e avaliação do alargamento/não alargamento.

Exemplo 4

[046] Pseudomonas aeruginosa, uma fonte comum de infecções nosocomiais perigosas, foi também avaliada. De acordo com os critérios do CLSI, uma estirpe de Pseudomonas aeruginosa é classificada como suscetível à ceftazidima quando a sua MIC < 8 μg/mL e resistente quando MIC > 32 μg/mL. Novas concentrações do ponto de quebra para a ceftazidima foram correlacionadas com base no alargamento das células, como descrito no Exemplo 3. Estas concentrações do ponto de quebra correlacionadas para alargamento foram 0,5 μg/mL para estirpes suscetíveis e maiores do que 1,0 μg/mL para estirpes resistentes.

[047] Foram estudadas 130 estirpes de P. aeruginosa, incluindo 117 estirpes suscetíveis à ceftazidima, 8 estirpes intermediárias e 5 estirpes classificadas como resistentes à ceftazidima de acordo com critérios do CLSI. Após incubação durante uma hora com 0,5 μg/mL de ceftazidima e 1 μg/mL de ceftazidima, cada estirpe foi corretamente categorizada com base em uma avaliação do alargamento/não alargamento. As estirpes suscetíveis apareceram alargadas após incubação com 0,5 μg/mL e 1 μg/mL, as estirpes intermediárias somente após 1 μg/mL, ao passo que as estirpes resistentes nunca apareceram alargadas após ambas as doses.

Exemplo 5

[048] P. aeruginosa foi avaliada quanto ao efeito de carbapenemos, meropenem e imipenem, que corroboramos que induzem o alargamento das células nas estirpes suscetíveis desta bactéria. As concentrações do ponto de quebra do CLSI da suscetibilidade e resistência correspondem a MICs < 2 - > 8 μg/mL, respectivamente. Para o alargamento das células, as novas concentrações do ponto de quebra foram muito menores: < 0,2 - > 0,5 μg/mL, para suscetibilidade e resistência, respectivamente. Foram estudadas cento e trinta estirpes de P. aeruginosa, se obtendo 97 suscetíveis, 14 intermediárias e 19 resistentes ao meropenem, seguindo o critério padrão de afetação do crescimento como indicado por MIC-CLSI. Todas estas estirpes foram corretamente categorizadas quando se usaram os novos pontos de quebra para alargamento/não alargamento. As estirpes suscetíveis apareceram alargadas após incubação com 0,2 μg/mL e 0,5 μg/mL, as estirpes intermediárias somente após 0,5 μg/mL, ao passo que as estirpes resistentes nunca apareceram alargadas após ambas as doses.

[049] Os Exemplos 2 e 3 demonstraram que, após incubação de uma cultura crescendo exponencialmente com 2 μg/mL ou 0,5 μg/mL de ceftazidima 1 hora, é possível distinguir se uma estirpe de A. baumannii ou K. pneumoniae, respectivamente, é suscetível ou não à cefalosporina, por exame do alargamento das células. Isto é informação relevante e urgente que o clínico requer para determinar os tratamentos com antibióticos, tais como continuar ou não a usar uma cefalosporina ou mudar de antibióticos. Similarmente, os Exemplos 4 e 5 ilustram que numerosas espécies de microrganismos podem ser rapidamente rastreadas quanto à sua suscetibilidade a antibióticos logo que os valores sejam correlacionados com medições aceites de suscetibilidade e resistência. O tamanho ou comprimento das células bacterianas pode ser aplicado para uma discriminação rápida da suscetibilidade ou resistência a outros antibióticos e espécies bacterianas, logo que as concentrações do ponto de quebra para o alargamento das células que se correlacionam com as concentrações do ponto de quebra padrão para o crescimento das células pelos organismos reguladores específicos sejam obtidas pelas metodologias previamente descritas.

[050] Os técnicos no assunto reconhecerão que a invenção descrita inclui um número de características inventivas, que podem ser proporcionadas em qualquer número de combinação e inclui pelo menos as seguintes:

[051] A1. Um método de avaliação rápida da suscetibilidade de uma estirpe de bactérias isolada a um antibiótico inibidor da síntese da parede celular compreendendo: a) estabelecimento de uma cultura de bactérias a partir de uma estirpe de bactérias isolada; b) combinação de uma ou mais doses de um antibiótico inibidor da síntese da parede celular com a cultura de bactérias, sendo a concentração de cada uma da uma ou mais doses correlacionada com limiares de resistência a antibióticos para a estirpe de bactérias isolada ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular; c) incubação da cultura de bactérias de uma ou mais doses de antibiótico; d) avaliação do comprimento das células ou tamanho das células das bactérias incubadas para cada uma ou mais doses de antibiótico inibidor da síntese da parede celular; e e) classificação da suscetibilidade da estirpe de bactérias isolada ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular com base nos comprimentos das células ou tamanhos das células associados a cada dose ou mais doses de antibiótico inibidor da síntese da parede celular.

[052] A2. O método como reivindicado na reivindicação A1, em que o passo de estabelecimento de uma cultura de bactérias a partir de uma estirpe de bactérias isolada compreende adicionalmente o estabelecimento de uma cultura de bactérias crescente exponencialmente.

[053] A3. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A2, compreendendo adicionalmente o passo de determinação empírica de uma concentração mínima do antibiótico inibidor da síntese da parede celular que resulta em alargamento das células ou um aumento no tamanho das células em estirpes das bactérias que são suscetíveis ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular.

[054] A4. O método como reivindicado na reivindicação A3, em que a concentração mínima do antibiótico inibidor da síntese da parede celular que resulta em um alargamento das células ou um aumento do tamanho das células é menor do que a concentração inibidora mínima (MIC) da estirpe de bactérias ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular para indicação para suscetibilidade.

[055] A5. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A4, em que a concentração de cada uma ou mais doses do antibiótico inibidor da síntese da parede celular é correlacionada com pontos de quebra de classificações de suscetível-intermédio-resistente da estirpe de bactérias ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular.

[056] A6. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A5, em que as concentrações para cada uma ou mais doses são correlacionadas por uma determinação de resposta à dose da presença ou não de alargamento das células ou aumento do tamanho das células de múltiplas estirpes de uma bactéria, em que as múltiplas estirpes demonstram uma gama de resistências a antibióticos pré-determinadas.

[057] A7. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A4, em que a uma ou mais doses de antibiótico inibidor da síntese da parede compreendem uma única dose proporcionada a uma concentração que induz alargamento das células ou um aumento no tamanho das células em estirpes das bactérias que são suscetíveis ao antibiótico inibidor da síntese da parede.

[058] A8. O método como reivindicado na reivindicação A7 em que a estirpe bacteriana é classificada como suscetível ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular se for avaliado um aumento no comprimento das células ou tamanho das células.

[059] A9. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A8, compreendendo adicionalmente o passo de imobilização de uma amostra da cultura de células em uma lâmina antes do passo d).

[060] A10. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A9, em que o passo de avaliação do alargamento das células ou tamanho das células é realizado por microscopia em campo claro, microscopia em campo escuro, microscopia de fluorescência, microscopia de contraste de fases, ou microscopia com luz polarizada.

[061] A11. O método como reivindicado em qualquer reivindicação precedente, em que o passo de avaliação do alargamento das células ou tamanho das células compreende adicionalmente difusão ao longo de um filtro.

[062] A12. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A10, em que o passo de avaliação do alargamento das células ou tamanho das células compreende adicionalmente coloração das bactérias sendo avaliadas.

[063] A13. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1 a A8 ou reivindicação A11, em que o passo de avaliação do alargamento das células ou tamanho das células é realizado por citometria de fluxo.

[064] A14. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A13, em que os passos b) a e) da reivindicação A1 são realizados em até duas horas, em até uma hora e meia, ou em até uma hora.

[065] A15. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A14, em que o passo de estabelecimento de uma cultura de bactérias a partir de uma estirpe de bactérias isolada compreende adicionalmente o isolamento de bactérias responsáveis pela produção de uma doença infecciosa em um paciente.

[066] A16. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A15, em que o antibiótico inibidor da síntese da parede celular compreende um antibiótico que inibe a síntese de peptidoglicano.

[067] A17. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A16, em que o antibiótico inibidor da síntese da parede celular compreende um antibiótico da família das β-lactamas ou um glicopeptídeo.

[068] A18. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A17, em que o antibiótico inibidor da síntese da parede celular compreende uma cefalosporina ou carbapenem.

[069] A19. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A18, em que as bactérias compreendem um bacilo Gram-negativo.

[070] A20. O método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações A1-A19, em que o passo de estabelecimento de uma cultura de bactérias é realizado em um caldo líquido ou um meio ágar.

[071] Como pode ser facilmente entendido a partir do que foi mencionado acima, os conceitos básicos da presente invenção podem ser realizados de uma variedade de maneiras. A invenção envolve numerosas e variadas formas de realização incluindo, mas não limitada ao melhor modo da invenção.

[072] Como tal, as formas de realização ou elementos particulares da invenção divulgados pela descrição ou mostrados nas figuras ou tabelas acompanhando este pedido não se destinam a ser limitantes, apenas mostram exemplos das numerosas e variadas formas de realização genericamente englobadas pela invenção ou equivalentes englobados no que diz respeito a qualquer elemento particular. Adicionalmente, a descrição específica de uma única forma de realização ou elemento da invenção pode não descrever explicitamente todas as formas de realização ou elementos possíveis; muitas alternativas são implicitamente divulgadas pela descrição e figuras.

[073] Além do mais, para os propósitos da presente descrição, o termo "um" ou "uma" entidade se refere a uma ou mais daquelas entidades; por exemplo, "um antibiótico" se refere a um ou mais antibióticos. Como tal, os termos "um" ou "uma", "um(a) ou mais" e "pelo menos um(a)" devem ser entendidos como intermutáveis como usados aqui.

[074] Todos os valores numéricos aqui são assumidos para ser modificados pelo termo "cerca de", seja ou não explicitamente indicado. Para os propósitos da presente invenção, as faixas podem ser expressas como a partir de "cerca de" um valor particular a "cerca de" outro valor particular. Quando uma tal faixa é expressa, outra forma de realização inclui a partir de um valor particular ao outro valor particular. A recitação de faixas numéricas pelos pontos terminais inclui todos os valores numéricos subsomados dentro dessa faixa. Uma faixa numérica de um a cinco inclui, por exemplo, os valores numéricos 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, e assim por diante. Será adicionalmente entendido que os pontos finais de cada uma das faixas são significativos em relação ao outro ponto final, e independente do outro ponto final. Quando um valor é expresso como uma aproximação por uso do antecedente "cerca de" será entendido que o valor particular forma outra forma de realização.

[075] Adicionalmente, quanto a cada termo usado, deve ser entendido que, a não ser que a sua utilização neste pedido seja inconsistente com tal interpretação, definições de dicionário comuns devem ser entendidas como estando incluídas na descrição para cada termo como contido no Random House Webster’s Unabridged Dictionary, Segunda edição, sendo cada definição incorporada deste modo por referência.

[076] A seção de antecedentes deste pedido de patente proporciona uma declaração da área de esforço à qual a invenção pertence. Esta seção pode também incorporar ou conter parafraseamento de certas patentes dos Estados Unidos, pedidos de patentes, publicações, ou assunto da invenção reivindicada úteis no relato de informação, problemas, ou preocupações sobre o estado da técnica ao qual a invenção está dirigida. Não se pretende que qualquer patente dos Estados Unidos, pedido de patente, publicação, declaração ou outra informação citado ou incorporado aqui seja interpretado, compreendido ou considerado como sendo admitido como estado da técnica no que diz respeito à invenção.

[077] As reivindicações apresentadas neste relatório são deste modo incorporadas por referência como parte da descrição da invenção, e o requerente reserva expressamente o direito de usar todo o ou uma parte de tal conteúdo incorporado de tais reivindicações como descrição adicional para suportar qualquer uma ou todas as reivindicações ou qualquer elemento ou componente, e o requerente reserva adicionalmente o direito expressamente de mover qualquer parte ou todo conteúdo incorporado de tais reivindicações ou qualquer elemento ou componente da descrição para as reivindicações ou vice versa como necessário para definir a matéria para a qual é solicitada proteção por este pedido ou por qualquer pedido subsequente ou continuação, divisão, ou pedido de continuação em parte, ou para obter qualquer benefício de redução em taxas nos termos ou para respeitar as leis de patentes, regras ou regulamentos de qualquer país ou tratado, e tal conteúdo incorporado por referência deverá permanecer durante a pendência inteira deste pedido incluindo qualquer subsequente continuação, divisão, ou seu pedido de continuação em parte ou qualquer sua reedição ou extensão.

Claims (19)

1. Método de avaliação rápida da suscetibilidade de uma cepa de bactérias isoladas a um antibiótico inibidor da síntese da parede celular caracterizado por compreender: a) estabelecimento de uma cultura de bactérias a partir de uma cepa de bactérias isoladas; b) combinação de uma ou mais doses de um antibiótico inibidor da síntese da parede celular, correlacionado a, mas diferente de, pontos de interrupção conhecidos de classificações de resistência- intermediária-suscetível de resistência a antibióticos para a cepa isolada específica de uma bactéria ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular, em que pelo menos uma das doses do antibiótico inibidor da síntese da parede celular compreende uma concentração mínima determinada do antibiótico inibidor da síntese da parede celular que resulta no alargamento da célula ou no aumento do tamanho da célula nas cepas das bactérias que são suscetíveis ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular; c) combinação das uma ou mais doses de antibiótico inibidor da síntese da parede celular com as bactérias cultivadas; d) incubação das bactérias cultivadas e de uma ou mais doses de antibiótico inibidor da síntese de parede celular; e) avaliação do comprimento das células ou tamanho das células das bactérias incubadas para cada uma ou mais doses de antibiótico inibidor da síntese da parede celular; e f) classificação da suscetibilidade da cepa de bactérias isoladas ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular com base nos comprimentos das células ou tamanhos das células associados a uma ou mais doses de antibiótico inibidor da síntese da parede celular.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de estabelecimento de uma cultura de bactérias a partir de uma cepa de bactérias isoladas compreender adicionalmente o estabelecimento de uma cultura de bactérias crescente exponencialmente.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a concentração mínima determinada do antibiótico inibidor da síntese da parede celular que resulta em alargamento de células ou em aumento no tamanho das células em cepas de bactérias que são suscetíveis ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular, o antibiótico inibidor da síntese da parede celular compreendendo uma concentração mínima empiricamente determinada do antibiótico inibidor da síntese da parede celular que resulta em alargamento das células ou um aumento no tamanho das células em cepas das bactérias que são suscetíveis ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a concentração mínima do antibiótico inibidor da síntese da parede celular que resulta em um alargamento das células ou um aumento no tamanho das células ser menor do que a concentração inibidora mínima (MIC) da cepa de bactérias ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular para indicação da suscetibilidade.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as concentrações para cada uma ou mais doses do antibiótico inibidor de síntese da parede celular serem correlacionadas por uma determinação de resposta à dose, da presença ou não de alargamento das células ou aumento do tamanho das células de múltiplas cepas de uma bactéria, em que as múltiplas cepas demonstram uma gama de resistências a antibióticos pré- determinadas.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por uma ou mais doses de antibiótico inibidor da síntese da parede compreender uma única dose proporcionada a uma concentração que induz um alargamento das células ou um aumento no tamanho das células em cepas das bactérias que são suscetíveis ao antibiótico inibidor da síntese da parede.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a cepa bacteriana ser classificada como suscetível ao antibiótico inibidor da síntese da parede celular se for avaliado um aumento no comprimento das células ou tamanho das células.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente o passo de imobilização de uma amostra das bactérias incubadas em uma lâmina antes do passo e).

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de avaliação do alargamento das células ou tamanho das células ser realizado por microscopia em campo claro, microscopia em campo escuro, microscopia de fluorescência, microscopia de contraste de fases, ou microscopia com luz polarizada.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de avaliação do alargamento das células ou tamanho das células compreender adicionalmente difusão ao longo de um filtro.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de avaliação do alargamento das células ou tamanho das células compreender adicionalmente coloração das bactérias sendo avaliadas.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de avaliação do alargamento das células ou tamanho das células ser realizado por citometria de fluxo.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os passos b) a f) da reivindicação 1 serem realizados em até duas horas, em até uma hora e meia, ou em até uma hora.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de estabelecimento de uma cultura de bactérias a partir de uma cepa de bactérias isoladas compreender adicionalmente o isolamento de bactérias responsáveis pela produção de uma doença infecciosa em um paciente.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o antibiótico inibidor da síntese da parede celular compreender um antibiótico que inibe a síntese de peptidoglicano.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o antibiótico inibidor da síntese da parede celular compreender um antibiótico da família das β-lactamas ou um glicopeptídeo.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o antibiótico inibidor da síntese da parede celular compreender uma cefalosporina ou carbapenema.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as bactérias compreenderem um bacilo Gram-negativo.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de estabelecimento de uma cultura de bactérias ser realizado em um caldo líquido ou um meio ágar.

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