TWI532840B - 微生物抗藥性與抗生素最小抑制濃度之檢測方法 - Google Patents

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Description

微生物抗藥性與抗生素最小抑制濃度之檢測方法
本發明係關於一種微生物抗藥性與抗生素最小抑制濃度之檢測方法，尤指一種結合介電泳動法與抑制細胞壁合成抗生素檢測桿狀微生物之抗藥性與最小抑制濃度的方法。
目前臨床上評估特定抗生素對病原菌的效果，一般利用體外(in vitro)試驗測定菌株抗生素感受性(antibiotic susceptibility)。這類體外試驗眾多，例如最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測定、紙錠擴散試驗(disk-diffusion test)、棋盤格殺菌試驗(checkerboard test)、最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)測定、殺菌時間曲線試驗(time-kill curves test)等，皆可依時效性、精確性等需求選用。
上述方法中，紙錠擴散試驗是最為普遍及快速的方法，係因其簡單與經濟，但由於其只能提供定性資料，故無法作為藥物劑量調整的依據。因此當需要進行藥物劑量調整時，則可進行最低抑菌濃度(MIC)測定，透過此測定可獲得定量資料，供抗生素用藥依據。
傳統最低抑菌濃度(MIC)測定，一般使用光學測定法，其中當微生物受抗生素作用，然後經過18至24小時培養後，以分光光度計測定培養基濁度，便可藉由吸光值判 定微生物生長是否有受抑制。由此可知，傳統光學測定法至少需要花費18至24小時供微生物生長，倘若菌株屬於生長緩慢類型，則需要更長的培養時間，因此當有時效性的需要時，例如需要檢測菌血症、腦膜炎等微生物感染之急症時，傳統光學測定法常常緩不濟急，難以符合臨床上的需要。
基於傳統檢測方法通常需耗時數天才可獲得結果報告，而無法即時獲得相關資訊，因此急需開發一種可以快速針對微生物檢測抗藥性及抗生素最小抑制濃度之技術，而能夠在1至2小時內得知判斷微生物是否具有抗藥性、測得特定抗生素之最小抑制濃度等，才可符合臨床上的需要，造福社會大眾。
本發明之主要目的係在提供一種微生物抗藥性之檢測方法，其中利用微生物於不同介質具有不同的介電泳動性質，結合抑制微生物細胞壁合成之特定抗生素，運用交流電訊號的非均勻電場作用進行介電泳動，觀察菌體延長與否，藉此判定受測微生物是否具有抗藥性。
為達成上述目的，本發明其中一態樣提供一種微生物抗藥性之檢測方法，包括以下步驟：(A)提供一待測液，其中，該待測液含一微生物；(B)於該待測液中加入一抗生素，其中，該抗生素係用於抑制細胞壁合成；(C)以介電泳動檢測該待測液，並觀察該待測液中該微生物之形態 變化；以及(D)根據該微生物之形態變化，判定該微生物對於該抗生素是否具有抗藥性。
於本發明上述檢測方法中，當微生物確實受到上述類型之抗生素抑制時，由於微生物之細胞壁結構發生改變，導致其外表型態發生變化，進而影響其介電特性，該變化能夠在電場作用力下被辨別，藉此便可判定受測微生物對於測試抗生素不具有抗藥性；反之，當微生物確實不受上述類型之抗生素影響時，由於微生物之細胞壁結構仍相當完整，其外表形態未發生任何變化，因此在介電泳動過程中其介電泳動特性不受影響，故在電場作用力下無法觀察到介電特性發生變化，藉此便可判定受測微生物對於測試抗生素具有抗藥性。
本發明之另一目的係在提供一種抗生素最小抑制濃度之檢測方法，其中利用微生物於不同介質具有不同的介電泳動性質，結合抑制微生物細胞壁合成之特定抗生素，運用交流電訊號的非均勻電場作用進行介電泳動，搭配觀察菌體延長與否以及交越頻率變化，俾能檢測某一抗生素對於一微生物之最小抑制濃度，如此可以有助於臨床醫師用藥的參考。
為達成上述目的，本發明另一態樣提供一種抗生素最小抑制濃度之檢測方法，包括以下步驟：(A)提供一待測液，其中，該待測液含一微生物；(B)於該待測液中加入不同濃度之抗生素，其中，該抗生素係用於抑制細胞壁合成；(C)以介電泳動檢測該待測液，並觀察該待測液中該 微生物之形態變化與交越頻率變化；以及(D)根據該微生物之形態變化與交越頻率變化，判定該抗生素對於該微生物之最小抑制濃度。
於本發明上述檢測方法中，當到達抗生素最小抑制濃度時，可以清楚看出微生物外貌形體發生延長，且交越頻率下降率達到最大；反之，當未達到達抗生素最小抑制濃度時，則難以看出微生物外貌形體發生延長且交越頻率未達最大下降率。
於本發明上述檢測方法中，可受測的微生物以桿菌為主，因桿菌本身形狀即有長短軸之分，若桿菌細胞壁結構受到抗生素影響而難以維持原本形狀，在介電泳動過程之電場作用力下，菌體長軸與短軸受力不同且菌體細胞壁固定形狀的能力減弱，便可觀察到桿菌延長的現象。於本發明一具體實例中，該微生物可為一革蘭氏陰性桿菌，例如大腸桿菌(Escherichia coli)、變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris)、克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、以及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)等。
於本發明上述檢測方法中，該抗生素主要用於影響菌體之細胞壁結構，使其結構強度減弱無法維持菌體原本形狀，因此於本發明進行介電泳動過程中，便可於介電泳動的測試中藉由觀察菌體形狀變化來判定菌體是否有受抗生素抑制。於本發明一具體實例中，該抗生素可為乙內醯胺類抗生素(β-lactam antibiotics)，例如頭孢菌素(cephalosporins)、單醯胺環類(monobactams)、青黴素 (penicillins)、碳氫黴素(carbapenems)、以及其組合等，該些抗生素主要的作用在於抑制細胞壁合成，達到本發明上述減弱菌體細胞壁結構的目的。
於本發明上述檢測方法中，於該步驟(B)中，可於該抗生素加入後，反應持續一預定時間，其中，該預定時間可為60分鐘至120分鐘。
本發明一實施例中，使用乙內醯胺類抗生素作用於腸內屬桿菌，進行抗生素感受性試驗。其中，於含有抗生素之液態培養基中培養微生物1小時至2小時後，取出少量菌液置於晶片上進行介電泳動測試。此外，為了減少更多因人為操作造成的誤差，未來亦可搭配微流體技術，將上述1小時至2小時之微生物培養整合於晶片中，而可同時進行多種藥物感受性試驗；或者利用微機電製程技術完成平面微電極陣列晶片，整合微型電訊號供應器與光學模組完成小型化晶片系統，因此相較於一般類似作用之大型儀器，具有價格低廉之特性，極適合於各階級檢驗單位使用。
一般而言，細菌可藉由對抗生素之通透性變化、結合部位發生改變、或產生分解抗生素之酵素等三種主要機轉而產生抗藥性，一旦細菌具有抗藥性，便不會受到藥物作用而產生菌體延長(cell elongation)的現象。
由此可知，透過觀察菌體是否延長，便可了解微生物是否具有抗藥性。藉此，本發明整個實驗流程僅耗時1小時至2小時，相較於傳統的紙錠擴散法與稀釋法皆需要18小時至24小時才能得知其細菌生長情形。因此，本發明不僅大 幅縮短檢測時間，且能提供抗藥性與否及最小抑制菌濃度之結果。
綜上所述，相較於習知臨床的抗生素感受性試驗需要18小時至24小時才能獲得結果，本發明上述方法能夠在1小時至2小時內得知其最小抑制菌濃度及受測微生物是否具有抗藥性，如此便可大幅縮短測試時間，以應用於臨床醫學的用藥指引與畜牧或漁業中抗生素添加於畜產的飼料之規範，減少致病菌產生抗藥性的機率。
本發明使用抑制細胞壁合成的抗生素(例如乙內醯胺類抗生素)作用於桿狀細菌(例如革蘭氏陰性桿菌)，以介電泳動法量測受抗生素作用之微生物，並觀察其交越頻率與外貌形態變化，藉此快速地判斷最小抑制菌的抗生素濃度與微生物是否具有抗藥性。
乙內醯胺類抗生素包括青黴素(penicillins)、頭孢菌素(cepholasporins)、單醯胺環類(monobactams)、與碳青黴素(carbapenems)，其作用機制是抑制細胞壁的合成。一般而言，微生物在此類抗生素較低濃度下會產生菌體延長的現象，但若濃度過高則會造成菌體裂解而導致微生物死亡。
習知細胞壁破壞或穿孔與否、菌體內細胞質外漏與否，可以明顯區別死亡與存活細菌，此在介電泳動過程中亦會因導電性質不同造成介電泳動性質發生變化，因此透 過介電泳動性質可以判定細菌死活。然而，除此之外，介電泳動特性亦會因細菌外貌形態變化而發生變化，較為細長的細菌受到電場誘發於兩端的表面電荷較多，且產生的偶極矩也較大。如此一來，更容易使得正介電泳力在較低的頻率被誘發出來。
利用上述現象，本發明實施例以腸內菌為主要樣本，如大腸桿菌(Escherichia coli)與克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)，並使用皆為頭孢菌類之抗生素頭孢新力(cephalexin)與頭孢坐林(cefazolin)，當微生物受到此類抗生素作用後，由於細胞壁組成已經發生變化，造成受作用微生物的外貌形態發生變化，進而影響受誘發的介電泳動特性產生變化，因此可利用外貌形態延長與否與交越頻率變化判斷受測微生物是否具有抗藥性及其抗生素之最小抑菌濃度。除此之外，本發明亦使用傳統連續稀釋的培養法作為藥敏分析的對照組，以確認本發明之準確性確實可以如同傳統方法。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。本發明亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。
本發明之實施例中該等圖式均為簡化之示意圖。惟該等圖示僅顯示與本發明有關之元件，其所顯示之元件非為 實際實施時之態樣，其實際實施時之元件數目、形狀等比例為一選擇性之設計，且其元件佈局型態可能更複雜。
製備例一
以玻璃載玻片為基材，主要採用物理氣象沉積法(physical vapor deposition，PVD)，將金屬薄膜沉積於玻璃基材上。其中，藉真空電子束蒸鍍裝置(E-beam VT1-10CE，ULVAC)，於玻璃基材上先沉積上50nm的鉻(Cr)，以做為後續金層與玻璃之間的接著層；接著，再沉積200nm金(Au)作為導電層。
待金屬薄膜沉積完成後，以標準光微影製程(standard photolithography)，於金屬薄膜上形成一光阻層，再利用具有預訂圖形之光罩，使光阻曝光顯影後具有相同圖形後，緊接著利用濕式蝕刻法(Wet etching)，將光阻上的圖形轉移至金屬層，最後去除光阻，便可完成金屬薄膜之圖案化，使金屬薄膜成為整體晶片之微電極陣列，完成晶片製備，其微電極間距為20μm，微電極寬度為50μm。
製備例二
同上述製備例一之方法，不同之處在於使用透明的氧化銦錫(Indium tin oxide，ITO)做為微電極。
實施例一
配置磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline，PBS)，其中含有137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4、 以及1.47mM KH2PO4，pH值為7.4。將通常用於治療尿道感染且屬於β-內醯胺類之口服抗生素頭孢新力(cephalexin，Sigma，USA)，溶解於1倍PBS中，配製成1024μg/mL的儲存濃度。利用此儲存濃度，使用胰化酪蛋白大豆培養液(trypticase soy broth，TBS)將濃度稀釋至4μg/mL及32μg/mL，配製成含不同濃度抗生素的TBS培養液。
一般造成尿道感染之大腸桿菌(Escherichia coli)，選擇ATCC 25922細菌株，以TBS培養液於37℃下震盪培養，並使用密度儀(densitometer，VITEK 2，BioMérieux)將TBS培養液中細菌數調整成約每毫升1.5×106個細菌。
取100μl菌液，與900μl含不同濃度抗生素之TBS培養液混合，細菌數約為每毫升1.5×105個細菌，並於37℃下震盪培養60分鐘後，取1ml至500μl經處理之菌液以3,000rpm至5,000rpm離心3至5分鐘，移除上清液，加入500μl之0.2M 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES)緩衝液(σ=3mS/cm，Invitrogen 1563)，並以旋渦混合器(vortex mixer，Shin Kwang，Taiwan)震盪30秒避免菌體聚集，以進行後續介電泳動測試。
將5μl菌液滴入製備例一晶片的樣本槽中，將微電極陣列連接至函數波產生器(function generator，Fluke 284，USA)，以施加一交流電訊號進行介電泳動。當大腸桿菌由電極間隙的中央往電極邊緣移動時，將此刻之頻率定為交越頻率(crossover frequency，cof)；同時介電泳動期間， 以倒置型顯微鏡(inverted microscope，Olympus IX70，Japan)及電荷耦合元件(charge coupled device，CCD)攝影機(Microfire，Optronics)觀察與記錄大腸桿菌介電泳動情形。
如圖1(a)至(c)所示，當交流電頻率為600kHz，沒受藥物作用的細菌受到負介電泳力排斥於電極中央；隨著抗生素濃度增加至4μg/ml，雖仍有部份菌體受到負介電泳力排斥於電極中央，但已有另外一部份菌體受到正介電泳力吸附於電極邊緣，且菌體已有些許延長現象；而當抗生素濃度高達32μg/ml時，經此濃度的抗生素作用一小時後，全部菌體皆受到正介電泳力吸附於電極邊緣，且菌體皆呈延長狀。另一方面，如圖1(d)至(f)所示，當交流電頻率高達4MHz時，即使沒受藥物作用的細菌，仍會受到正介電泳力吸附於電極邊緣，但此時可以明顯看出菌體沒有延長現象；隨著抗生素濃度增加至4μg/ml，已有部份菌體有些許延長現象；而當抗生素濃度高達32μg/ml時，全部菌體皆呈延長狀。
實施例二
同上述實施例一所述方法，其中配置以下濃度之抗生素：1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、以及64μg/mL，且抗生素作用時間為30分鐘、60分鐘、以及120分鐘。除此之外，使用製備例二之晶片進行測試，且對於介電泳動過程中大腸桿菌的菌體長度，則在 大腸桿菌因電場引起的介電泳動力而直線排列在ITO四項式微電極之間時，以影像軟體(FreePlus32)量測，其結果參考圖2及3。
如圖2(a)所示，經過抗生素作用30分鐘後，尚難以區別菌體外表形態是否有延長的現象；但如圖2(b)所示，經過抗生素作用60分鐘後，已經可以看到菌體外表形態延長的現象隨著抗生素濃度增加而明顯；最後如圖2(c)所示，經過抗生素作用120分鐘後，即使在低濃度的抗生素作用下，仍可由菌體外表形態延長的現象了解抗生素對於細菌具有作用，且此現象亦隨濃度提升而更趨明顯。
如圖3(a)與圖3(c)所示，其係不同抗生素濃度、作用時間與菌體長度等三者之關係圖，由此圖可知細胞長度隨著濃度提升與作用時間延長而增加；如圖3(b)所示，其係不同抗生素濃度、作用時間與交越頻率(cof)等三者之關係圖，由此圖可知當抗生素濃度到達32μg/mL時，經過60分鐘作用，其交越頻率會降至600kHz左右，相較於其他較低抗生素濃度具有較為顯著之差異，如此便可將此定義為抗生素頭孢新力對於大腸桿菌之最小抑制濃度。
實施例三
同上述實施例一所述方法，其中配置2μg/mL濃度之抗生素頭孢坐林(cefazolin)，對於大腸桿菌ATCC 25922、w958、以及BCRC 15501等三種菌株作用120分鐘後，進行介電泳動測試，其中大腸桿菌w958為臨床檢體分離純化出 來的抗藥性菌株(來自成大醫院病理部細菌室)，結果參考圖4(a)至(c)。
如圖4(a)所示，大腸桿菌w958菌體沒有明顯外貌形體延長的現象，此表示大腸桿菌w958對於抗生素頭孢坐林具有抗藥性；反觀，如圖4(b)及(c)所示，大腸桿菌ATCC 25922與BCRC 15501等兩菌株之菌體外貌形體明顯有延長的現象，此表示大腸桿菌ATCC 25922與BCRC 15501可由抗生素頭孢坐林抑制，其兩者皆不具有抗藥性。
比較例一
為了確定本發明上述實施例二所得之最小抑制濃度與習知方法無異，利用傳統瓊脂稀釋法檢測抗生素頭孢新力對於大腸桿菌之最小抑制濃度為何，其結果參考圖5。
如圖5所示，傳統瓊脂稀釋法所測得之最小抑制濃度為32μg/mL至64μg/mL之間，此亦表示本發明實驗例二所測得之最小抑制濃度相當正確。
比較例二
為了確定本發明上述實施例三所得之結論與習知方法無異，利用傳統培養液稀釋法，以不同濃度(0μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL)之抗生素頭孢坐林，對大腸桿菌ATCC 25922、w958、以及BCRC 15501等三種菌株進行檢測，其中No表示未接種菌體，結果參考圖6(a)至(c)。
如圖6(a)所示，其係大腸桿菌w958之測試結果，圖上顯示即使頭孢坐林的濃度高達16μg/mL，大腸桿菌w958仍未受到抑制；反觀，如圖6(b)及(c)，其係大腸桿菌ATCC 25922與BCRC 15501之測試結果，圖上顯示當頭孢坐林的濃度達2μg/mL時，便可以抑制大腸桿菌ATCC 25922與BCRC 15501。此結果亦表示本發明實驗例三所測得之最小抑制濃度相當正確。
綜上所述，基於介電泳動會受細菌活性變化而影響，本發明發現在細菌受到越高濃度的抗生素作用下，會使得菌體延長的速率越快，因此不同長度細菌所誘發出的介電泳力亦會不同，藉此只要在施加固定交流電頻率下，便可由菌體延長與否判定細菌是否有受到抗生素影響，故可判斷菌體是否具有抗藥性。此外，透過施加特定交流電頻率，亦可由交越頻率變化，協同觀察菌體延長現象，判定出特定抗生素對於特定微生物之最小抑制濃度。
雖然，本案發明人曾運用介電泳動技術結合抑制生長用蛋白質合成之丁胺卡那黴素(Amikacin)，判斷最小抑制濃度，但其所需檢驗時間為4小時左右，但本發明所述方法使用抑制細胞壁合成之抗生素，搭配細胞延長之觀察，可將檢驗時間縮短至1小時左右，使檢驗更具有效率。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
圖1係本發明實施例一所述介電泳動測試之顯微鏡照片，其中，(a)至(c)分別為交流電頻率為600kHz下，抗生素濃度為0μg/ml、4μg/ml、及32μg/ml之測試結果；(d)至(f)分別為交流電頻率為4MHz下，抗生素濃度為0μg/ml、4μg/ml、及32μg/ml之測試結果。
圖2係本發明實施例二所述介電泳動測試之顯微鏡照片，其中，(a)係濃度為0μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、及32μg/ml之抗生素作用30分鐘後之測試結果；(b)係濃度為0μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、及32μg/ml之抗生素作用60分鐘後之測試結果；(c)係濃度為0μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、及32μg/ml之抗生素作用120分鐘後之測試結果。
圖3係本發明實施例二所述介電泳動測試之菌體長度、抗生素濃度、反應時間及交越頻率的關係，其中，(a)為菌體長度、抗生素濃度、及反應時間的關係圖；(b)為抗生素濃度、反應時間及交越頻率的關係圖；(c)為菌體長度、抗生素濃度、及反應時間的關係圖。
圖4係本發明實施例三所述介電泳動測試之顯微鏡照片，其中，(a)為大腸桿菌w958之測試結果；(b)為大腸桿菌ATCC 25922之測試結果；(c)為大腸桿菌BCRC 15501之測試結果。
圖5係本發明比較例一所述傳統瓊脂稀釋法測試之培養皿照片。
圖6係本發明比較例二所述培養液稀釋法測試之試管照片，其中，(a)為大腸桿菌w958之測試結果；(b)為大腸桿菌ATCC 25922之測試結果；(c)為大腸桿菌BCRC 15501之測試結果。

Claims (8)

  1. 一種微生物抗藥性之檢測方法，包括以下步驟：(A)提供一待測液，其中，該待測液含一微生物；(B)於該待測液中加入一抗生素，其中，該抗生素係用於抑制細胞壁合成；(C)以介電泳動檢測該待測液，並觀察該待測液中該微生物之形態變化；以及(D)根據該微生物之形態變化，判定該微生物對於該抗生素是否具有抗藥性；其中，該微生物係一革蘭氏陰性桿菌，該抗生素係乙內醯胺類抗生素(β-lactam antibiotics)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之微生物抗藥性之檢測方法，其中，該革蘭氏陰性桿菌係大腸桿菌(Escherichia coli)、變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris)、克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)或綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之微生物抗藥性之檢測方法，其中，該抗生素係選自由頭孢菌素(cephalosporins)、單醯胺環類(monobactams)、青黴素(penicillins)、碳氫黴素(carbapenems)、以及其組合所組群組。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之微生物抗藥性之檢測方法，其中，該步驟(B)中，加入該抗生素後持續一預定時間反應，且該預定時間係60分鐘至120分鐘。
  5. 一種抗生素最小抑制濃度之檢測方法，包括以下步驟：(A)提供一待測液，其中，該待測液含一微生物；(B)於該待測液中加入不同濃度之抗生素，其中，該抗生素係用於抑制細胞壁合成；(C)以介電泳動檢測該待測液，並觀察該待測液中該微生物之形態變化與交越頻率變化；以及(D)根據該微生物之形態變化與交越頻率變化，判定該抗生素對於該微生物之最小抑制濃度；其中，該微生物係一革蘭氏陰性桿菌，該抗生素係乙內醯胺類抗生素(β-lactam antibiotics)。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之抗生素最小抑制濃度之檢測方法，其中，該革蘭氏陰性桿菌係大腸桿菌(Escherichia coli)、變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris)、克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)或綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之抗生素最小抑制濃度之檢測方法，其中，該抗生素係選自由頭孢菌素(cephalosporins)、單醯胺環類(monobactams)、青黴素(penicillins)、碳氫黴素(carbapenems)、以及其組合所組群組。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之抗生素最小抑制濃度之檢測方法，其中，該步驟(B)中，加入該抗生素後持續一預定時間反應，且該預定時間係60分鐘至120分鐘。
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