ES2323712T3 - Cepas de bacterias de acido lactico sensibles a los antibioticos. - Google Patents
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Abstract
Método de aislamiento de una cepa de Bifidobacterium sp conteniendo un tetW mutado en su cromosoma, dicha mutación haciendo a la cepa sensible a la tetraciclina y dicha cepa siendo aislada de una cepa progenitora bacteriana resistente a la tetraciclina donde el fenotipo resistente a antibióticos es causado por la expresión de tetW integrado de manera estable en su cromosoma, dicho método comprendiendo la exposición de las células a un mutágeno químico y un mutágeno físico, y donde el método comprende las fases de: 1) cultivar las células progenitoras para obtener un cultivo de células de crecimiento exponencial, 2) transferir una alícuota de las células a un medio fresco conteniendo bromuro de etidio (EtBr), 3) transferir el cultivo a uno o más recipientes para formar una capa de cultivo de 0.5 - 10 mm de espesor; 4) exponer el cultivo a un tratamiento UV, 5) cultivar las células mutadas para obtener un cultivo de células de crecimiento exponencial, 6) transferir una alícuota de bacterias a una o más placas de Petri conteniendo un medio de crecimiento agar adecuado, la alícuota de bacterias es seleccionada para proporcionar colonias individuales, 7) identificar estas colonias que han adquirido una sensibilidad a los antibióticos por réplica en placas de Petri con y sin antibiótico tetraciclina, y 8) aislar, expandir y mantener estas colonias sensibles al antibiótico tetraciclina identificadas como una nueva cepa sensible al antibiótico tetraciclina; y donde la concentración inhibitoria mínima (MIC) de tetraciclina de la cepa progenitora es de al menos 10 microgramos/ml de tetraciclina y la MIC de tetraciclina de la cepa sensible a antibióticos es de 1.5 µg/ml de tetraciclina o menos.
Description
Cepas de bacterias de ácido láctico sensibles a
los antibióticos.
La presente invención pertenece a un método para
obtener nuevas cepas sensibles a antibióticos del género de
Bifidobacterium a partir de Bifidobacteriaceae
resistente a antibióticos comprendiendo un gen cromosómico
codificado resistente a los antibióticos y las cepas que pueden ser
obtenidas por medio del método. En particular, la presente
invención se refiere a nuevas cepas sensibles a antibióticos
obtenidas a partir de cepas probióticas resistentes a antibióticos
y al uso de tales cepas nuevas para la preparación de alimentos o
piensos o una dosis unitaria comprendiendo organismos viables.
Las bacterias que fermentan azúcares con la
producción de ácidos en particular de ácido láctico como componente
metabólico principal son conocidas desde hace mucho tiempo. Tales
bacterias pueden ser encontradas en leche o productos lácteos,
plantas vivas o en descomposición pero también en el intestino del
hombre y de animales. Habitualmente, estas bacterias han sido
definidas como "bacterias de ácido láctico". Bacteria de ácido
láctico designa un grupo más bien heterólogo de bacterias
Gram-positivas, no móviles, microaerofílicas o
anaeróbicas que fermentan el azúcar con la producción de ácidos
incluyendo ácido láctico y comprenden por ejemplo los géneros
Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc y Pediococcus.
Durante siglos, las bacterias de ácido láctico
han sido usadas en la producción de alimentos y piensos incluyendo
más productos lácteos y actualmente las bacterias de ácido láctico
son esenciales en la fabricación de todos los productos lácteos
fermentados como el yogur, el queso y la mantequilla. Además, las
bacterias de ácido láctico son muy usadas en la industria del
tratamiento cárnico, industria de fabricación de vinos, industria de
fabricación de zumos así como en un gran número de otras
industrias.
Los cultivos de bacterias de ácido láctico son
usadas también en gran medida para la bioconservación de productos
alimenticios.
La publicación de una gran cantidad de informes
que aportan documentación sobre el hecho de que varias bacterias
lácticas influyen de manera beneficiosa sobre el bienestar de los
humanos y/o de los animales ha despertado todavía más interés con
respecto a este grupo de bacterias. En particular, se ha descubierto
que cepas específicas de Lactobacillus o
Bifidobacterium eran capaces de colonizar la mucosa
intestinal y ayudar al mantenimiento del bienestar de los
huéspedes.
EP 0 768 375 describe cepas específicas de
Bifidobacterium sp, que son capaces de implantarse en la
flora intestinal y de excluir competitivamente la adhesión de
bacterias patógenas en células intestinales. Estas
Bifidobacteria son indicadas para ayudar en la
inmunomodulación y asimismo en el mantenimiento de la salud de un
individuo. El efecto de inmunomodulación de las
Bifidobacteria puede incluso ser conferido a niños aún no
nacidos. WO 01/97822 por ejemplo describe que la toma por parte de
la madre de una cepa de Bifidobacterium animalis
Bb-12® durante el embarazo reduce la incidencia de
enfermedades atróficas en niños. WO 03/099037 describe también que
la cepa de Bifidobacterium animalis Bb-12®
es capaz de modificar de manera adecuada la respuesta inmunitaria.
Según Masco et al. (2004) la cepa Bifidobacterium
animalis BB-12® debería ser indicada
correctamente como cepa de Bifidobacterium animalis
subespecie lactis Bb-12®.
Los microorganismos probióticos han sido
definidos como "Microorganismos vivos, los cuales, cuando son
administrados en cantidades adecuadas proporcionan un beneficio
para la salud de los huéspedes" (FAO/WHO 2002). Estos últimos
años, se ha acumulado la documentación sobre las propiedades
probióticas de la Bifidobacteria y de otras bacterias
lácticas. En general la actividad probiótica está asociada a cepas
específicas. La cepa Bifidobacterium animalis
Bb-12® mencionada anteriormente así como la cepa
Bifidobacterium lactis HN019 han sido indicadas como
probióticas (WO 01/97822, WO 03/099037, Zhou et al. (2005),
US 6379663).
Al nivel mundial existe un interés público
ampliamente generalizado de que el número de bacterias patógenas
resistentes a antibióticos aumenta de manera importante. Todos los
datos disponibles indican que el aumento de perturbaciones en
bacterias patógenas resistentes a antibióticos es causado por un uso
extensivo y muy abundante de antibióticos en la población en
general así como en la agricultura animal.
Es un hecho bien establecido que muchas
bacterias resistentes a antibióticos incluyen determinantes
genéticos, genes, que confieren la resistencia frente a uno o más
antibióticos. También se conoce bien el hecho de que tales
determinantes genéticos en ciertas circunstancias son transferibles
y pueden proporcionar el fenotipo resistente a antibióticos a
bacterias receptoras. La frecuencia de transferencia depende mucho
del contexto genético particular en el que se encuentran los genes
resistentes a antibióticos. Es decir que los genes resistentes a
antibióticos que residen en plásmidos o en transposones han
demostrado proporcionar el fenotipo resistente a antibióticos a
bacterias receptoras en frecuencias relativamente altas, mientras
que los determinantes codificados cromosómicamente son mucho menos
propensos a moverse.
Por estas razones puede presentar un interés,
incluso ser beneficioso, ingerir bacterias no patógenas si éstas
contienen un determinante resistente a antibióticos. Este interés
es subrayado también en el informe del Comité Científico de la
COMISIÓN EUROPEA sobre nutrición animal (SCAN) en el Criteria for
Assessing the Safety of Micro-Organisms Resistant
to Antibiotics of Human Clinical and Veterinary del 3 Julio de
2001, revisado el 24 de enero de 2003, declarando que la presencia
de un gen de resistencia conocido no es aceptable (página 21).
La resistencia a la tetraciclina es la
resistencia más común a antibióticos bacterianos encontrada en la
naturaleza y de forma similar es el tipo de resistencia más
distribuido en bacterias aisladas de animales (Billington 2002). La
tetraciclina inhibe la síntesis de proteína por enlace a un sitio de
alta afinidad único en la subunidad ribosómica 30S. Con la
tetraciclina en esta posición se evita el enlace de
aminoacil-ARNt a un sitio y por lo tanto se bloque
la síntesis de proteína.
La resistencia a la tetraciclina puede ser
mediada sea por salida activa de tetraciclina desde la célula, por
protección ribosómica por una o más proteína(s)
soluble(s), las proteínas de protección ribosómicas llamadas
también (RPPs), o por inactivación enzimática de tetraciclina.
Recientemente, un nuevo gen de resistencia a la
tetraciclina del tipo protección del ribosoma (Tet'), tetW,
fue identificado en aislados de la panza de Butyrivibrio
fibrisolvens y varias otras bacterias de la panza (Barbosa,
1999).
Aunque el determinante tetW es
distribuido ampliamente entre aislados resistentes a la
tetraciclina de patógenos animales (Billington 2002), fue una
sorpresa para los autores de esta solicitud descubrir que todas las
cepas probióticas conocidas de Bifidobacterium animalis de
subespecie lactis, incluyendo las dos cepas muy conocidas de
Bifidobacterium Bb-12® y DR10^{TM}
transporta un determinante tetW funcional y son resistentes a
la tetraciclina; en particular debido a que se determinó que la
cepa DR10^{TM} y la cepa Bb-12® eran sensibles a
la tetraciclina en un informe reciente (Zhou et al.
2005).
Aunque experimentos extensivos hayan demostrado
que el determinante tetW de cepa Bifidobacterium
animalis de subspecie lactis Bb-12® no es
móvil en situaciones reales, el problema de los determinantes
resistentes a antibióticos en nuestros productos alimentarios sigue
presente. Por consiguiente, hemos realizado varios intentos para
obtener la inactivación o eliminación del gen tetW en
Bifidobacterium animalis de subspecie lactis
Bb-12® por mutagénesis tradicional, implicando
varios mutágenos, así como por manipulación genética directa. No
obstante, hasta ahora ningún intento ha tenido éxito. Se ha
comprobado que una razón importante de los numerosos intentos
fallidos es el hecho de que el tetW está situado sobre el
cromosoma de cepas Bifidobacterium animalis de subspespecie
lactis.
Por esta razón, sería extremadamente ventajoso
establecer un método para la inactivación del gen de resistencia
tetW en Bifidobacteriaceae probiótica. Tal método
podría ayudar también a resolver el problema de proveer variantes
sensibles a los antibióticos de Bifidobacteriaceae probiótica
de interés comercial, resistente a la tetraciclina, que pueda
cumplir con el requisito de ausencia de genes de resistencia a
antibióticos funcionales.
El problema anterior ha sido resuelto por medio
de un método de aislamiento de una cepa sensible a la tetraciclina
de especie Bifidobacterium (Bifidobacteriaceae) de
una cepa progenitora bacteriana resistente a la tetraciclina donde
el fenotipo resistente a antibióticos es causado por la expresión de
un tetW funcional que es estable integrado en su cromosoma.
Dicho método comprende la exposición de las células tanto para un
mutágeno químico como para un mutágeno físico. El método comprende
las fases de: 1) cultivar las células progenitoras para obtener un
cultivo de células de crecimiento exponencial, 2) transferir una
alícuota de las células a un medio fresco comprendiendo bromuro de
etidio (EtBr), 3) transferir el cultivo a uno o más recipientes para
formar una capa de cultivo de 0.5-10 mm de espesor,
4) exponer el cultivo a un tratamiento de UV, 5) cultivar las
células mutadas para obtener un cultivo de células de crecimiento
exponencial, 6) transferir una alícuota de bacterias a una o más
placas de Petri comprendiendo un medio de crecimiento agar adecuado,
la alícuota de bacterias siendo seleccionada para proporcionar
colonias individuales, 7) identificar estas colonias que han
adquirido sensibilidad antibiótica por réplica en placas de Petri
con y sin antibiótico tetraciclina, y 8) aislar, expandir y
mantener estas cepas sensibles a antibióticos identificadas en forma
de nueva cepa sensible al antibiótico tetraciclina.
Este método es aplicable en general a una
especie Bifidobacterium resistente a la tetraciclina con un
tetW funcional estable integrado en su cromosoma, ya que en
dos intentos sólo pudimos aislar variantes sensibles a la
tetraciclina de las dos cepas de Bifidobacterium
BB-12® y HN019 (DR10TM)
Por lo que otros aspectos importantes de la
invención conciernen el suministro de cepas de especie
Bifidobacterium conteniendo una mutación de inactivación en
un tetW codificado cromosómicamente para que la cepa se
vuelva sensible a las tetraciclinas, lo cual es obtenible por el
método mencionado anteriormente, y el uso de tales cepas de
Bifidobacterium para la preparación de un material
indigestible o de un medicamento.
Un resultado importante de la presente invención
es que el inventor es capaz de revelar un método generalmente útil
para obtener nuevas cepas de especie de Bifidobacterium que
contiene un tetW mutado en su cromosoma que hace que la cepa
se vuelva sensible a la tetraciclina y que sea aislada de una cepa
progenitora bacteriana resistente a la tetraciclina donde el
fenotipo resistente a los antibióticos es causado por la expresión
de tetW integrado de forma estable en su cromosoma.
En la técnica se utilizan pruebas de dilución
para determinar las concentraciones inhibitorias mínimas (MICs) de
agentes antimicrobianos y son los métodos de referencia para la
prueba de susceptibilidad antimicrobiana. En las pruebas de
diluciones, se prueban los microorganismos para determinar su
capacidad de producir un crecimiento visible en medios adecuados y
la concentración mínima de un agente antimicrobiano que inhibe el
crecimiento de un microorganismo es definido como MIC.
La expresión "resistente a la tetraciclina"
se refiere a una bacteria que posee una concentración inhibitoria
mínima (MIC) de tetraciclina de al menos 5 microgramos/ml, tal como
al menos 8 microgramos/ml incluyendo al menos 10 microgramos/ml o
incluso al menos 15 microgramos/ml de tetraciclina, determinado por
el método de selección de susceptibilidad "Etest" tal y como
está descrito por Danielsen and Wind (2003). La concentración
mínima inhibitoria es la concentración mínima que produce una
inhibición de crecimiento visible.
En el contexto presente la expresión "sensible
a la tetraciclina" se refiere a una bacteria que tiene una MIC
de 1.5 microgramo/ml de tetraciclina o menos, tal como 1
microgramo/ml o incluso menos de 0.75 microgramos/ml de
tetraciclina, determinado por el método de selección de
susceptibilidad "Etest".
Por "tetraciclinas" o "grupo tetraciclina
de antibióticos" nos referimos al grupo de antibioticos
bacteriostáticos que son producidos por especies
Streptomyces, y sus derivados semisintéticos relacionados.
Las tetraciclinas inhiben ambas bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas y
Rickettsiae. Estas están caracterizadas por un modo de acción que
implica que el antibiótico se enlace reversiblemente al ribosoma
30S e inhiba el enlace de
aminoacil-t-ARN en el sitio aceptor
sobre el ribosoma 70S. Además de la propia tetraciclina, también la
terramicina, demeclociclina, meclociclina, doxiciclina/doxiciclina,
limeciclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina,
rolitetraciclina, aureomicina así como otras clortetraciclinas son
consideradas como elementos del grupo de tetraciclinas. En
consecuencia, también un método, donde la tetraciclina es un
antibiótico seleccionado del grupo de tetraciclina, terramicina,
demeclo-ciclina, meclociclina,
doxiciclina/doxiciclina, limeciclina, metaciclinea minociclina,
oxitetraciclina, rolitetraciclina, aureomicina y otras
clortetraciclinas es una forma de realización de la presente
invención.
Tal y como se menciona, se necesitaron varios
intentos antes de poder desarrollar el presente método. Se
considera que la acción combinada de ambos mutágenos químico y
físico, es decir bromuro de etidio y luz ultravioleta, es esencial
para lograr la mutación del gen tetW.
Para aumentar más la probabilidad de éxito, el
cultivo después de la fase de mutación puede ser sometido a una
fase de enriquecimiento para mutaciones comprendiendo las fases de:
a) transferir una alícuota del cultivo tratado con UV a un medio
fresco conteniendo una dosis de un análogo de penicilina que es
perjudicial para las células de crecimiento exponencial, pero
tolerable para células de no crecimiento, y b) cultivar las células
en dicho análogo de penicilina comprendiendo un medio en condiciones
que van a promover el crecimiento exponencial en la ausencia de un
análogo de penicilina.
Considerando que tal "proceso de selección por
ampicilina" ha sido establecido correctamente y utilizado con
frecuencia para bacterias Gram-negativas desde 1972
(Miller 1972), es sorprendente que el "proceso de selección por
ampicilina" según nuestro mejor conocimiento no haya sido
utilizado antes en un protocolo de mutación dirigido contra
Bifidobacteriaceae Gram-positivas.
Aunque algunas Bifidobacteriaceae pueden
crecer en condiciones aeróbicas, se considera como ventajoso el
hecho de realizar el cultivo con una tensión de oxígeno reducida,
por ejemplo mediante el suministro del medio de crecimiento con
hidrocloruro de cisteína tal y como está descrito en el ejemplo
1.
En general, el doble enfoque mutagénico de la
presente invención es considerado como una escala más fuerte con
respecto a los mutágenos cuando son usados individualmente. Como
está ilustrado en el ejemplo 1 la acción combinada de EtBr y la
exposición a una luz UV reduce considerablemente la viabilidad de
las células inmediatamente después de los tratamientos por
EtBr-UV. Se considera que este doble enfoque fuerte
es esencial para realizar la inactivación eficaz de tetW en
Bifidobacteriaceas. Por este motivo, en una forma de
realización importante de la presente invención el tratamiento UV es
aplicado para obtener una reducción del número de células vivas
medida por unidades formadoras de colonias (CFUs) de menos del 20%,
tal como menos del 15% o incluso menos del 10% con respecto al
número de CFUs del cultivo inmediatamente antes del tratamiento
UV.
En una forma de realización preferida la
concentración de EtBr es fijada entre 10 y 30 microgramos/ml, y en
otras formas de realización, el análogo de penicilina usado en el
"proceso de enriquecimiento por ampicilina" es ampicilina
usada con una dosis de 50-300 microgramos/ml en el
medio.
En general, como las bifidobacterias son
consideradas como organismos probióticos (Yazid, 2000) se tendrá en
cuenta que la resistencia a la tetraciclina es distribuida
ampliamente entre las bifidobacterias.
\newpage
La resistencia a la tetraciclina y a la
minociclina ha sido observada en cepas de Bifidobacterium
catenulatum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium
pseudocatenulatum, Bifidobacterium asteroids, Bifidobacterium
infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium
animalis y subespecies de éstas (Yazid (2000), Lim (1983), Scott
(2000), este estudio). De manera importante, el tetW ha sido
observado en cepas resistentes a la tetraciclina de
Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum,
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis,
Bifidobacterium animalis y subespecies de éstas (Scott et
al. 2000, Moubareck et al. 2005, este estudio).
Por lo tanto, en formas de realización
preferidas actualmente, la especie bacteriana es seleccionada del
grupo consistente en Bifidobacteriaceas que contiene un tetW
funcional para que las bacterias se vuelvan resistentes a la
tetraciclina.
Especies de Bifidobacterium útiles
incluyen Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis,
Bifidobacterium asteroids, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium
breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium infantis,
Bifidobacterium lactis, Bifdobacterium longum y
Bifidobacterium pseudocatenulatum.
La invención no se limita, sin embargo, a estas
Bifidobacteriaceas particulares mencionadas anteriormente. El
experto en la técnica reconocerá aquellas Bifidobacteriaceas que
pueden ser útiles en el método según la invención, así como otras
bacterias probióticas que contengan un tetW funcional que
las hace resistentes a la tetraciclina.
En la forma de realización preferida del método
la cepa progenitora es una cepa de Bifidobacterium animalis
de subespecie lactis. En particular un método, donde la cepa
progenitora es una cepa de Bifidobacterium animalis de
subspecie lactis CHCC5445 (BB-12®),
depositada el 30 de Septiembre de 2003 según el tratado de Budapest
sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos para los objetivos del proceso de patente con la
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bajo el
número de registro DSM15954 o donde la cepa progenitora es una cepa
de Bifidobacterium animalis de subespecie lactis
CHCC7158, depositada el 28 de abril de 2005 según el tratado de
Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos para los objetivos del proceso de patente con la
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el
número de registro DSM 17280.
Es necesario enfatizar que la nomenclatura de
Bifidobacterium animalis de subespecies lactis ha
cambiado estos últimos años.
Inicialmente la cepa de Bifidobacterium
BB-12® fue descrita como una Bifidobacterium
bifidum. Posteriormente se descubrió que la Bifidobacterium
animalis era más adecuada, aunque la cepa no es una
Bifidobacterium animalis típica. La cepa difiere en varios
aspectos de la Bifidobacterium animalis tal y como está
descrito por Meile et al (1997), quienes sugirieron
establecer una especie nueva, Bifidobacterium lactis.
Este nombre de especie fue validado más tarde en la lista nº. 62 en
IJSB (1997). El estatus de especie de Bifidobacterium lactis
ha sido discutido desde la publicación de Meiles. Recientemente,
Cai et al. (2000) publicaron resultados de hibridación de
ADN-ADN, que mostraban que la Bifidobacterium
lactis no difería suficientemente de la Bifidobacterium
animalis para permitir un estatus de especie. En base a estos
resultados el Comité Internacional de Bacteriología Sistemática,
Subcomité sobre la taxonomía de Bifidobacterium,
Lactobacillus y organismos relacionados han decidido que la
Bifidobacterium lactis no puede ser reconocida como
especie válida (Minutes, IJSEM, 2001). Teniendo en cuenta que un
análisis polifásico taxonómico ha sido realizado y publicado para
conseguir la creación de dos subespecies dentro de la
Bifidobacterium animalis (Masco et al, 2004), la
BB-120 pertenece a una de las subespecies, B.
animalis de subespecie lactis. En base a las huellas
digitales de ADN no damos cuenta de que también la cepa de
Bifidobacterium conocida DR10^{TM} debería ser designada
de manera adecuada B. animalis de subespecie lactis.
En la literatura la cepa DR10^{TM} está indicada también como
Bifidobacterium lactis HN019 (Zhou 2005) y Bifido
HOWARU^{TM} (www.danisco.com).
Como se ha ilustrado en el ejemplo 2, el método
de la presente invención puede implicar dos clases de nuevos
aislados sensibles a antibióticos, una clase que expresa un nivel
intermedio de sensibilidad a la tetraciclina, es decir aislados con
una MIC que varía entre 2 y 4 \mug/ml de tetraciclina, y aislados
con un MIC inferior a 1.5 \mug/ml de tetraciclina tal como 0.75 o
incluso 0.5 \mug/ml de tetraciclina. Hasta ahora sólo hemos
identificado aislados con un tetW inactivado en aislados con
una MIC inferior a 1.5 \mug/ml de tetraciclina, y en todos los
casos utilizamos Bifidobacteriacea con una MIC superior a 10
microgramos/ml de tetraciclina en forma de células progenitoras.
Por lo tanto, en una forma de realización preferida de la presente
invención existe un método de aislamiento de una cepa sensible a la
tetraciclina de Bifidobacterium sp (Bifidobacteriacea)
a partir de una cepa progenitora bacteriana resistente a la
tetraciclina donde la concentración inhibitoria mínima (MIC) de
tetraciclina de la cepa progenitora es de al menos 10
microgramos/ml de tetraciclina y el MIC de la cepa sensible a
antibióticos es de 1 microgramo/ml de tetraciclina o menos.
Como el grupo tetraciclina de antibióticos
comparten el mismo modo de acción se considera que, en general, la
inactivación de tetW producirá un cambio de sensibilidad
para cualquier grupo tetraciclina de antibióticos de tamaño similar
con respecto al cambio observado con tetraciclina. En consecuencia
una forma de realización de la invención es un método de
aislamiento de una cepa de Bifidobacterium sp.
(Bifidobacteriacea) que es sensible a una o más tetraciclinas
a partir de una cepa progenitora bacteriana que es resistente a una
o más tetraciclinas y donde la concentración inhibitoria mínima
(MIC) de dicho antibiótico de la cepa progenitora es al menos 10
veces superior a la MIC de la cepa sensible a antibióticos.
\newpage
Ejemplos del grupo tetraciclina de antibióticos
son representados por el grupo de antibióticos comprendiendo
tetraciclina, terramicina, demeclociclina, meclociclina,
doxiciclina/doxiciclina, limeciclina, metaciclina, limeciclina,
minociclina, rolitetraciclina, aureomicina y otras
clortetraciclinas.
Hasta ahora según nuestro conocimiento todas las
cepas probióticas de Bifidobacterium animalis de subespecie
lactis, y un número importante de otras
Bifidobacteriaceae transportan un determinante tetW
funcional para que éstas se hagan resistentes a la tetraciclina. El
inventor de la presente invención descubrió de forma inesperada que
era posible proveer Bifidobacteriaceae que transportan un
determinante tetW inactivado.
Como se ilustra en los ejemplos es posible por
lo tanto obtener variantes de cepas probióticas conocidas de
Bifidobacterium sp. conteniendo un tetW mutado,
codificado cromosómicamente para que la cepa sea sensible a la
tetraciclina. Se considera que el suministro de estas cepas nuevas
es la forma de realización preferida de la presente invención.
La nueva cepa puede en principio ser una
variante o mutación de cualquier Bifidobacterium que
transporte un tetW codificado cromosómicamente para que la
cepa se vuelva resistente a la tetraciclina. Se pueden seleccionar
células adecuadas del grupo Bifidobacteriacea comprendiendo
Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum,
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis,
Bifidobacterium animalis y subespecie de éstas. En particular
las células clasificadas como Bifidobacterium animalis de
subespecie lactis son preferidas.
En general las nuevas cepas bacterianas, que
tienen una concentración inhibitoria mínima (MIC) de antibiótico
que es al menos 10 veces inferior a la MIC de la cepa progenitora
resistente a antibióticos, son las preferidas.
Unas cepas preferidas son aquellas que poseen
una MIC de 1.5 microgramo/ml de tetraciclina o menos, tal como 1
microgramo/ml o incluso menos de 0.75 microgramo/ml de tetraciclina
determinado por el método de selección de susceptibilidad
"Etest".
Tales cepas que albergan un tetW mutado
son formas de realización particularmente preferidas de la
invención.
La mutación de inactivación del gen tetW
que hace que las nuevas cepas se vuelvan sensibles a la
tetraciclina puede estar descrita típicamente con respecto a la
secuencia de gen tetW de la célula progenitora
pertinente.
Tal y como está descrito en los ejemplos, se
pueden obtener cepas sensibles a la tetraciclina adecuadas con un
tetW inactivado introduciendo mutaciones específicas en el
gen tetW.
En una forma de realización preferida de la
invención un codón de parada "ópalo" ha sido introducido en el
tetW para cambiar parte del tetW codificado
cromosómicamente caracterizada por la secuencia TCG CTG GGA TAC TTG
AAC CAG AGT [SEC ID 1] a TCG CTG GGA TAC TGA ACC AGA GTT [SEC ID
2], la base suprimida en el tetW funcional está indicada en
subrayado. Por lo tanto una Bifidobacteria que comprenda la
secuencia: GGA TAC TGA ACC [SEC ID 3] en su gen tetW es una
forma de realización preferida de la presente invención. También
observamos que el gen tetW puede ser inactivado, y producir
la sensibilidad a la tetraciclina, cambiando la parte de
tetW codificado cromosómicamente que comprende la secuencia:
CAG AGC GTG GTT CAG TCT GTT CGG [SEC ID 4] a CAG AGC GTG GTT TAG
TCT GTT CGG [SEC ID 5] esta mutación introduce un codón de parada
"ámbar" en tetW y la base mutada en el tetW
funcional está subrayada. Tal Bifidobacteria que comprende la
secuencia: GTG GTT TAG TCT [SEC ID 6] en su gen tetW es otra
forma de realización preferida de la presente invención. Una cepa
bacteriana en la que el gen tetW comprende al menos una
secuencia seleccionada del grupo de SEC ID NO:3 [GGA TAC TGA ACC] y
SEC ID NO: 6 [GTG GTT TAG TCT] es también una forma de realización
de la presente invención.
La introducción de los codones de parada
"ópalo" y "ámbar" en la región de codificación de
proteínas del gen tetW representa dos eventos moleculares
muy diferentes. En el caso de la mutación "ópalo" una base fue
suprimida mientras que en el caso del ámbar una base mutó (en el
caso de un par C a T, es decir una transición de base).
Se debe enfatizar el hecho de que el tetW
de una Bifidobacteria puede ser inactivado por otro tipo de
mutaciones en otros sitios de tetW. En la medida en que la
cepa de Bifidobacterium contiene un tetW mutado,
codificado cromosómicamente para que la cepa sea sensible a la
tetraciclina y que pueda ser obtenida por el método de la presente
invención, las cepas sensibles a la tetraciclina obtenidas son
formas de realización de la presente invención.
La forma de realización preferida de la presente
invención es la cepa bacteriana que está identificada como cepa
Bifidobacterium animalis de subespecie lactis
CHCC8902 (Bb-12Tet-S139) y
depositada el 28 de Abril de 2005 según el tratado de Budapest
sobre el Reconocimiento Internacional de Depósito de
Microorganismos con objetivos del proceso de patente con la
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bajo el
número de registro DSM17281. Esta cepa sensible a la tetraciclina
contiene la mutación "ópalo" en su tetW. Esta cepa es
particularmente preferida ya que es una mutación de las cepas de
Bifidobacterium probióticas conocidas BB-12®.
Además CHCC8902 contiene una única deleción de base en tetW
caracterizada por un nivel de reversión relativamente bajo inferior
a 1.6 x 10^{-9} que hace que éste sea particularmente adecuada
para una ingestión en grande cantidades (véase ejemplo 4).
Otra forma de realización preferida de la
presente invención es la cepa bacteriana identificada como cepa
Bifidobacterium animalis de subespecie lactis
CHCC9070 (DR10Tet-S9X) y depositada el 28 de abril
de 2005 según el tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos con objetivos de
proceso de patente con la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen bajo el número de registro DSM17282. Esta cepa
sensible a la tetraciclina contiene la mutación "ámbar" en su
tetW. Esta cepa es también preferida ya que es una mutación
de la conocida cepa de Bifidobacterium probiótica DR10^{TM}
(CHCC7158). CHCC9070 (DR10Tet-S9X) contiene una
única transición de base en tetW. Como se prevé en la
literatura existente sobre transiciones básicas, el nivel de
reversión es superior a por ejemplo los mutantes de deleción. En el
caso de CHCC9070 que contiene el nivel de mutación atrasado 1.8 x
10^{-8}. Aunque CHCC9070 es más propensa a la reversión que
CHCC8902, la cepa sigue relativamente estable y por consiguiente
adecuada para la ingestión.
Las Bifidobacterias y otras bacterias de
ácido láctico son usadas comúnmente como cultivos iniciadores para
un objetivo tecnológico en la producción de varios alimentos. La
industria más conocida que utiliza cultivos iniciadores es la
industria lechera, por consiguiente para la preparación de un
material ingerible o un cultivo bacteriano.
No obstante tal y como se ha mencionado, las
Bifidobacterias pueden servir también como probióticos es
decir como organismos no patógenos, que tienen beneficios para la
salud cuando son tomados oralmente en alimentos o cápsulas.
Objetivos comunes de acción probiótica son los trastornos
intestinales (por ejemplo diarrea del turista, diarrea asociada a
antibióticos) o síntomas intestinales (hinchazón, flatulencia,
malestar). Además, una gama más amplia de ventajas (por ejemplo, de
propiedades anticolesterolémicas, anticancerígenas e
inmunoestimuladoras) es citada también en la literatura
probiótica.
Los términos "tracto gastrointestinal" o
"intestinal" son usados en el presente contexto de forma
intercambiable y se refieren a ambos tractos gastrointestinales
superior e inferior que incluyen la boca, el esófago, el estómago,
el intestino delgado incluyendo el duodeno, el yeyuno y el íleon, y
el intestino grueso comprendiendo el colon y el intestino
ciego.
Las bacterias de esta invención puede ser
proporcionadas en forma de producto alimentario fermentado o en
forma de dosis formuladas como una pastilla (incluyendo comprimidos
masticables), cápsula (sea de tipo duro o blando), polvo,
granulado, preparación líquida, suspensión, suplemento oral seco,
suplemento oral húmedo, formulación de alimento en tubo seca o
formulación de alimento en tubo húmeda.
En una forma de realización el material
ingerible es un alimento fermentado o producto alimentario
preparado mediante el uso de las Bifidobacterias de la
presente invención. El alimento fermentado o producto alimentario
puede ser procesado también. En varias situaciones se ha visto que
la bacteria produce compuestos saludables durante la fermentación.
En estos casos, puede ser ventajoso fraccionar y/o sobreconcentrar
fracciones del producto alimentario fermentado. Incluso se puede
imaginar que en ciertas situaciones puede ser apropiado procesar
también el producto alimentario fermentado por pasteurización
incluso cuando las Bifidobacterias adecuadas sean inactivadas
por tal proceso.
No obstante en general se considera como
beneficioso que el material ingerible comprenda
Bifidobacterias vivas en una cantidad de aproximadamente
10^{5} CFU/g hasta aproximadamente 10^{12} CFU/g de material
ingerible, ya que las células vivientes son un prerequisito para
obtener el efecto probiótico.
Se considera que las bifidobacterias de la
presente invención pueden ser usadas para la preparación de una
gama amplia de materiales ingeribles como la leche, cuajada,
productos fermentados a base de leche, leche acidificada, yogur,
yogur helado, leche en polvo, polvos a base de leche, concentrado de
leche, queso, productos de queso para untar, preparaciones de
bebidas, helados, polos, productos a base de cereales fermentados,
preparados para bebés y leche de soja.
Otra forma de realización importante de la
presente invención es el uso de las Bifidobacterias de la
presente invención para preparar una composición para el
tratamiento, prevención de una enfermedad, síndrome o condición, o
para mejorar la digestión de nutrientes, o para mejorar el estado
de salud general de un ser humano o de un animal vertebrado.
Como las Bifidobacterias son consideradas
en general como organismos probióticos (Yazid, 2000) el uso de
Bifidobacteria de la presente invención como probiótico es
una forma de realización preferida. La composición probiótica de la
presente invención puede ser cualquier material ingerible
seleccionado del grupo comprendiendo leche, cuajada, productos
fermentados a base de leche, leche acidificada, yogur, yogur
helado, leche en polvo, polvos a base de leche, concentrado de
leche, queso, productos de queso para untar, preparaciones de
bebidas, helados, productos fermentados a base de cereales,
preparaciones para bebés, comprimidos, suspensiones bacterianas
líquidas, suplemento oral seco, suplemento oral húmedo, alimentos
en tubo seco o alimentos en tubo húmedo que es producido usando las
Bifidobacterias de esta invención.
En otra forma de realización, la composición
comprende también un soporte aceptable farmacéuticamente. Como se
utiliza en este caso, el término "soporte aceptable
farmacéuticamente" define uno o más diluyentes de relleno sólido
o líquido, o sustancias de encapsulado que son adecuadas para una
administración a un humano o a un animal y que es/son compatibles
con los organismos activos probióticamente. El término
"compatible" se refiere a componentes de la composición
farmacéutica que pueden ser mezclados con el probiótico para que no
se produzca ninguna interacción ya que reduciría esencialmente la
eficacia probiótica de los organismos seleccionados para la
invención en condiciones de uso habituales. Los soportes aceptables
farmacéuticamente deben tener una pureza bastante alta y una
toxicidad bastante baja para que sean adecuados para una
administración en seres humanos y animales en tratamiento.
En formas de realización útiles, el material
ingerible según la invención es adecuado para la prevención o
tratamiento de una enfermedad, el síndrome o condición siendo
seleccionado del grupo que incluye los trastornos asociados a
antibióticos, gastroenteritis, diarrea incluyendo la diarrea del
turista y diarrea infantil aguda, intolerancia a la lactosa,
infecciones gastrointestinales y colonización del tracto
gastrointestinal por bacterias patógenas incluyendo Helicobacter
pylori y Clostridium difficile, síndrome de intestino
irritable (IBS), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) y otros
síndromes inmunomodulativos, cáncer de colon, infecciones
urogenitales y tumores, infecciones vaginales, alergia
(especialmente eczema atópico), vacunación, colesterolemia e
hipertensión.
En otras formas de realización útiles, el
material ingerible según la invención es adecuado para la
prevención o infecciones de tratamiento con patógenos tales como
por ejemplo Heliobacter pylori, Campylobacter pyloridis,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis,
Hemophilus influenzae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marcescens,
Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas maltofilia, Salmonella sp.
y hongos tal como Candida albicans y Aspergillus
fumigatus, y combinaciones de estas especies.
En los últimos años los rotavirus y otros virus
entéricos han sido identificados como una causa principal de
diarrea infecciosa. De manera interesante ambas
Bifidobacterias BB-12® y HN019 (DR10^{TM})
han demostrado prevenir o tratar eficazmente infecciones, incluso
con estos patógenos. Por ello, en formas de realización útiles, el
material ingerible según la invención es usado para la prevención o
tratamiento de infecciones con rotavirus y otros virus
entéricos.
Puede ser útil combinar dos o más supuestos
organismos activos probióticamente mencionados anteriormente, como
por ejemplo una preparación comprendiendo una especie Lactobacillus
y una especie Bifidobacterium.
La Bifidobacterium animalis de subespecie
lactis BB-12® (CHCC5445), es una cepa
extremadamente importante para la salud y el bienestar de los
mamíferos debido a sus capacidades probióticas (por ejemplo efecto
estabilizante inmunológico en humanos, control de una microflora
equilibrada en el tracto digestivo reduciendo así o actuando como
inhibidores de varios síndromes epidemiólogicos, etc.). También la
Bifidobacterium animalis de subespecie lactis HN019
(DR1O^{TM}, CHCC7158), posee un historial importante de actividad
probiótica. Aunque estas dos cepas encierran un gen activo
codificante de resistencia a la tetraciclina, la resistencia a
antibióticos bacteriana más prominente encontrada en la naturaleza
(Chopra y Roberts, 2001), ambas han sido usadas durante muchos años
en la producción de alimentos, y según nuestros conocimientos sin
provocar ningún daño, al contrario sólo se han reconocido efectos
positivos en el uso de estas cepas. No obstante, el hecho de que
ambas cepas contengan un tetW activo en su genoma presenta la
posibilidad teórica de transferencia de la resistencia a la
tetraciclina a otras - y quizás a bacterias nocivas en el sistema
digestivo humano. Este riesgo aumenta si las bacterias de donante
ingeridas sobreviven en el intestino en grandes cantidades, como es
el caso con el uso típico de bacterias probióticas. La inactivación
del gen tetW en las dos variantes, como se ha demostrado
aquí, elimina el riesgo de una transferencia horizontal de genes
resistentes a antibióticos funcionales. Aparte de la lesión en el
tetW las dos cepas sensibles a la tetraciclina son
probablemente isogénicas con sus cepas madre como se sugiere en el
ejemplo 5 y en el ejemplo 6, por lo que se puede considerar que las
dos cepas sensibles a la tetraciclina poseen la mayoría sino todas
las características para que BB-12® y HN019
(DR10^{TM}) sean probióticas.
El rendimiento y propiedades de aplicación son
tratados con respecto a la producción, la estabilidad incluyendo
experimentos animales (ejemplo 7) para confirmar las
características probióticas de la Bbl2Tet-S139
(CHCC8902) y de la DR10Tet-S9X (CHCC9070).
Además, las pruebas de laboratorio que implican
una electroforesis en gel bidimensional para otra caracterización
de las cepas mutantes son realizadas para verificar los
antecedentes isogénicos con las cepas de tipo salvaje.
- 1)
- - la inactivación del gen de resistencia a la tetraciclina, tetW, de Bifidibacterium animalis de especie lactis BB-12® y Bifidibacterium animalis de lactis HN019 (DR1O^{TM}) fue establecido por una combinación del mutagen intercalado, bromuro de etidio, e irradiación de ultra violeta sucesiva.
- 2)
- - dos de los aislados sensibles a la tetraciclina resultantes, uno producido a partir de BB-12® y otro producido a partir de HN019 (DR10^{TM}) fueron incapaces de crecer en un caldo MRS con tetraciclina en una concentración superior a 0.5 \mug/ml.
- 3)
- - la caracterización de uno de los aislados del mutante, Bb12Tet-139 (un derivado de CHCC5445) demostró un desplazamiento de marco en una posición de nucleótidos # 1405 en el gen tetW produciendo inmediatamente un codón de parada ópalo de 170 aminoácidos sin el producto genético. En el otro mutante, un codón de parada ámbar DR10Tet-S9X (un derivado de CHCC7158) fue introducido (posición de nucleótidos # 424), 498 aminoácidos sin el producto genético.
- 4)
- - el nivel de reversión para Bb12Tet-5139 es inferior a 1.6 X 10^{-9} y el nivel de mutación de retorno para Bb12Tet-S9X es 1.8 x 10^{-3}.
- 5)
- - el crecimiento, perfil de ADN de índices de acidificación y el transcriptoma (ejemplo 6) de los mutantes tetW no eran diferentes a las cepas de tipo salvaje respectivas.
- 6)
- - los análisis de los aislados mutantes no revelaron ninguna redisposición o modificación más que para el tetW, del ADN genómico determinado a partir de la huella genética de ADN y unos análisis transcriptómicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención es ilustrada también en los
siguientes ejemplos y tablas donde
Tabla 1. Es una descripción de los
oligonucleótidos usados para un análisis de PCR y una secuenciación
del ADN del gen tetW codificante de resistencia a la
tetraciclina de BB-12®y HN019.
Tabla 2. Es la secuencia de ADN de tetW y
el gen transposasa superior, tps, de Bifidobacteria animalis
de subespecie lactis BB-12® (SEC ID 22).
Secuencia nucleótida del transposón tetW
inactivo de Bifidobacterium animalis de subespecie
lactis BB-12®. La secuencia fue obtenida por
secuenciación en Chr. Hansen A/S y verificada en comparación con
una similar obtenida por Danone. En la parte superior está el marco
de lectura abierto codificante de transposasa, nt. #
4-966, con el aminoácido representado según la
secuencia de ADN (M. W. aprox. 35 kDa). La secuencia nt. #
1318-2334 es el gen codificante resistente a la
tetraciclina, tetW, con el aminoácido subrayado debajo de la
secuencia de ADN. (M. W. aprox. 70 kDa).
La mutación ámbar en posición nucleótida (nt) #
1741 (nt # 424 con respecto al codón de iniciación de tetW)
para la cepa sensible a la tetraciclina, DR10Tet-S9X
(CHCC9070), está indicada encima de la secuencia de ADN.
La mutación de desplazamiento de marco de
lectura en posición nt # 2722 (nt #1405 con respecto al codón de
iniciación) para la cepa sensible a la tetraciclina,
Bbl2Tet-S139 (CHCC8902), está indicada encima de la
secuencia de ADN.
*): indica un codón de parada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un proceso mutagénico fuerte y doble para
inactivar la resistencia a la tetraciclina intrínseca del genoma de
cepa Bifidobacterium animalis de especie lactis
BB-12® y cepa HN019 (DR10^{TM}). Esto incluía el
tratamiento de las células con el mutágeno, bromuro de etidio
(EtBr) seguido de una irradiación de ultravioleta en una escala más
fuerte que la que existe normalmente cuando los mutágenos son
usados individualmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron cepas de Bifidobacterium
animalis de subespecie lactis BB-12® y
HN019 (DR10^{TM}) a partir de la colección de cultivo de Chr.
Hansen A/S, Horsholm, Dinamarca. La cepa de B. animalis de
subespecie lactis BB-12® tiene el número de
registro CHCC5445 en la colección de cultivo Hansen, está
depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ) bajo el número de registro DSM15954. La cepa de
B. animalis de subespecie lactis HN019 (DR10^{TM})
fue aislada de un producto de fórmula para bebés disponible
comercialmente con la marca Fernleaf DR-10 bifidus y
vendido en Taiwán en 2000. Posee el número de registro CHCC7158 en
la colección de cultivo Hansen y está depositada con DSMZ bajo el
número de registro DSM 17280.
Las dos cepas que son resistentes a la
tetraciclina (al menos 15 \mug/ml, determinada por el
procedimiento Etest,
Danielsen and Wind, 2003), fueron cultivadas rutinariamente en condiciones anaeróbicas a 37ºC en un caldo
Difco-MRS (deMan 1960), provisto con 0.05% de hidrocloruro de cisteína (Cisteína-HCl, productos químicos Merck) así como en agar MRS (1.5% de agar) con la misma concentración de Cisteína-HCl y 15 \mug de tetraciclina
por ml.
Danielsen and Wind, 2003), fueron cultivadas rutinariamente en condiciones anaeróbicas a 37ºC en un caldo
Difco-MRS (deMan 1960), provisto con 0.05% de hidrocloruro de cisteína (Cisteína-HCl, productos químicos Merck) así como en agar MRS (1.5% de agar) con la misma concentración de Cisteína-HCl y 15 \mug de tetraciclina
por ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Una alícuota (2%) de una BB-12®
crecida en MRS durante toda la noche fue transferida a un caldo MRS
fresco (10 ml sin tetraciclina) conteniendo 20 \mug/ml de bromuro
de etidio (EtBr) e incubado hasta una densidad óptica [OD] a 600 nm,
0.35. Las células de crecimiento exponencial fueron posteriormente
sometidas a una irradiación UV (enlazador cruzado de UV,
Stratagene) en una placa de Petri abierta durante 5 min. (70
mJ/cm^{2}). El tratamiento UV fue repetido una vez después de un
intervalo oscuro de 5 min. a temperatura ambiente. El tratamiento
fue ajustado para obtener una letalidad de aproximadamente el 90%.
La letalidad fue determinada como se indica a continuación. La
viabilidad de las células inmediatamente después de los
tratamientos EtBr-UV fue determinada por réplica en
placas de células en agar MRS sin tetraciclina y la letalidad fue
calculada a partir de la CFU observada.
Un ml del cultivo mutagenizado fue transferido
entonces a 9 ml de MRS fresco sin la adición de EtBr y fueron
dispuestos después para crecer durante un periodo de 16 horas a
37ºC en total oscuridad, en cuyo punto las partes alícuotas de las
células tratadas fueron reinoculadas (1% [vol/vol]) en caldo MRS
fresco y dispuestas para crecer durante 16 horas más.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el cribado de aislados sensibles a la
tetraciclina después de un proceso de enriquecimiento por
ampicilina (Miller, 1972) adaptado a la Bifidobacteriaceae.
En resumen, el procedimiento de enriquecimiento por ampicilina fue
realizado transfiriendo una alícuota (1%) de un cultivo durante toda
el noche en un medio MRS fresco (10 ml) y el crecimiento de las
células hasta un OD_{600} de 0.2 sin la adición de tetraciclina.
0.5 ml de este cultivo fue usado para inocular 10 ml de caldo MRS
conteniendo 10 microgramos/ml de tetraciclina e incubado durante 2
horas a 37ºC en una tensión de oxígeno reducida, después de lo cual
se añadió la ampicilina en una concentración final de 150
microgramos/ml, y el cultivo fue incubado de forma continua durante
16 horas a 37ºC. Como la ampicilina mata sólo células crecientes
(es decir, células Tet^{R}) y no células no divisoras (es decir
células mutantes Tet^{S}), la adición de ampicilina puede ser
considerada como una fase de enriquecimiento para el aislamiento
posterior de mutantes Tet^{S}. Las células fueron recogidas por
centrifugado (4,000 x g durante 5 min a 4ºC) y lavadas dos veces
con un caldo MRS fresco.
Siguiendo el enriquecimiento de ampicilina, el
cribado de aislados sensibles a la tetraciclina fue realizado por
medio de una réplica en placas de alícuotas de las células lavadas
en agar MRS en una dilución apropiada para producir aproximadamente
150 colonias por placa después de la incubación a 37ºC durante 20
horas.
Las colonias sensibles a la tetraciclina fueron
identificadas por réplica en placas sobre agar MRS sin antibióticos
y el agar MRS conteniendo 10 \mug de tetraciclina por ml, sobre
el cual los aislados sensibles a la tetraciclina fueron incapaces
de crecer. Finalmente, las colonias sensibles a la tetraciclina
fueron cultivadas en caldo MRS. El ADN genómico total fue aislado
de los clones sensibles a la tetraciclina y de la cepa resistente a
la tetraciclina para una caracterización intensiva.
El cribado de réplica produjo 155 aislados
sensibles a la tetraciclina a partir de CHCC5445 de un total de
aproximadamente 4,000 colonias seleccionadas. A partir de CHCC7158,
43 colonias sensibles a la tetraciclina fueron aisladas de
aproximadamente 1,000 células. Todas estas colonias fueron probadas
también en un caldo MRS líquido conteniendo tetraciclina (10
\mug/ml). Una fracción esencial de positivos falsos (aprox. 85%)
fue controlada para crecer en estas condiciones. Los aislados
sensibles a la tetraciclina restantes fueron expuestos entonces a
una selección de susceptibilidad Etest según los métodos descritos
por M. Danielsen y A. Wind (2003), para determinar su umbral
sensible a la tetraciclina. En la mayoría de los casos está situado
en un rango entre 2 y 4 \mug/ml. Sólo dos aislados, uno derivado
de CHCC5445, llamado Bbl2Tet-S139, y uno derivado de
CHCC7158, llamado DR10Tet-S9X, demostraron tener
una sensibilidad superior a la tetraciclina con un valor MIC de 0.5
\mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN genómico fue preparado a partir del
BB-12® de tipo salvaje y los dos aislados sensibles
a la tetraciclina por el uso del protocolo Easy-ADN
para el aislamiento de ADN de bacterias
Gram-positivas según las instrucciones del
fabricante (Qiagen).
El gen tetW de las variantes sensibles
fue caracterizado por los análisis de PCR según el protocolo de
Innis y Gelfand (1990), y secuenciación de ADN para probar
mutaciones posibles en este gen. El marco de lectura abierto entero
(ORF, aprox. 2.0 kb) de tetW fue amplificado a partir de
cada aislado en tres fragmentos en superposición (A, B y C) de
aprox. 75 bp cada uno con tres conjuntos de cebadores (tabla 1,
tabla 2).
El fragmento A (aprox. 785 bp) fue amplificado
con un cebador de sentido: tetWx.D1, derivado de una
secuencia 296 bp hacia arriba del codón de iniciación del gen
tetW y cebador de antisentido: tetWx.R2, derivado del
ORF de tetW. El fragmento B (aprox. 935 bp) fue amplificado
con un cebador de sentido: tetWx.D4 y cebador de
antisentido: tetWx.R5 del ORF de tetW. El fragmento C
(920 bp) fue amplificado con un cebador de sentido: tetWx.D3
derivado del ORF y un cebador de antisentido: tetWx.R4 262
bp hacia abajo del codón de terminación del gen tetW.
Los fragmentos amplificados de las tres
reacciones de PCR fueron sometidos a una electroforesis en gel de
agarosa (0.7%) y teñidos en EtBr e identificados con una
iluminación UV. Las bandas correspondiente a los tres fragmentos de
gen amplificados fueron cortadas del gel y el ADN extraído (kit de
extracción de gel QlAquick de Qiagen). Los productos de PCR
purificados fueron clonados en el vector plásmido,
pCR2.1-TOPO (Invitrogen), para una determinación de
secuencia nucleótida usando los cebadores directos e inversos
M13.
La secuenciación de ADN del gen tetW de
cada uno de los aislados individuales sensibles a la tetraciclina
con valores Etest de 2-4 \mug/ml demostraron que
el gen de resistencia a la tetraciclina no estaba afectado o mutado
en estos aislados, y era 100% homólogo al gen tetW en el
BB-12® de tipo salvaje representado en la tabla
2.
La secuenciación de los genes tetW a
partir de los dos aislados con valores Etest de tetraciclina de 0.5
\mug de tetraciclina/ml demostró que el gen tetW era
afectado en ambos casos. El Bb12Tet-S139 (un
derivado de CHCC5445) demostró un desplazamiento del marco de
lectura en una posición de nucleótidos #1405, donde un residuo de
timidina fue suprimido tal como se ilustra más abajo y en la tabla
2.
La ilustración anterior muestra una secuencia
parcial del gen tetW en CHCC5445. El residuo de timidina
subrayado en BB-12® (nt: 1405 en la secuencia de
tetW) es eliminado en el mutante de desplazamiento del marco
de lectura, Bb12Tet-S139, produciendo un codón de
parada ópalo/sin sentido de 170 aminoácidos sin el producto de gen
tetW de tipo salvaje.
[nt #1405 tiene el número de posición nt # 2722
en la secuencia en la tabla 2, SEC ID XX].
La secuenciación de ADN del gen tetW del
otro aislado sensible a la tetraciclina
DR10Tet-S9X, un derivado de cepa HN019 (CHCC7158),
demostró una transición de una citidina para un residuo de timidina
en una posición de nucleótidos # 424 generando así inmediatamente un
codón de parada translacional ámbar como se representa más abajo y
en la tabla 2.
La ilustración anterior muestra una secuencia
parcial del gen tetW en CHCC7158, que es idéntica al gen
tetW en CHCC5445. El residuo de citidina subrayado en HN019
(nt: 424) es sustituido con un residuo de timidina en la cepa
mutante, dando como resultado un codón de parada ámbar/sin sentido
de 498 aminoácidos sin el producto de gen tetW de tipo
salvaje. [nt # 424 tiene el número de posición nt # 1741 en la
secuencia de ADN en la tabla 2, SEC ID XX].
Un ml de un cultivo crecido durante toda la
noche de la cepa mutante Bb12Tet-S139 (1.6 X
10^{-9} células/ml) fue repartido con 50 \mul cada uno sobre 20
placas de Petri (diámetro: 13.8 cm) con agar MRS provisto con
tetraciclina (15 \mug/ml). Después de 24 horas de incubación
anaeróbica a 37ºC ninguna colonia podía ser detectada en las placas
demostrando que el nivel de reversión era inferior a 1.6 x
10^{-9}.
La misma prueba de estabilidad fue realizada
para la cepa DR10Tet-S9X. Un cultivo de esta cepa
durante toda la noche (1.1 X 10^{-9} de células/ml) fue asimismo
repartido con 50 \mul cada uno sobre 20 placas de Petri con Agar
MRS provisto con tetraciclina (15 \mug/ml). Después del periodo
de incubación 19 colonias resistentes a la tetraciclina fueron
detectadas. El nivel de reversión para la mutación ámbar fue
calculado a 1.8 x 10^{-8}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se comparó el crecimiento de
Bbl2Tet-S139 y DR10Tet-S9X (por
triplicado) con su cepas madre, CHCC5445 y CHCC7158,
respectivamente, crecimiento en condiciones similares en caldo MRS
(200 ml con Cisteína-HCl) durante un periodo de 24
horas. Se controlaron las muestras midiendo la densidad óptica a
600 nm durante todo el periodo de incubación. Los índices de
crecimiento para ambos mutantes fueron similares al los de las cepas
progenitoras de tipo salvaje indicando que el tratamiento
mutagénico de los aislados sensibles a la tetraciclina no parecía
un obstáculo para los genes en sus vías fermentativas.
\vskip1.000000\baselineskip
La acidificación (caldo MRS), que es la
conversión de piruvato en ácido láctico, fue controlada (por
duplicado) durante un periodo de 6 horas y comparada con las cepas
madre respectivas crecidas en las mismas condiciones. No se observó
ninguna diferencia en el nivel de acidificación entre los derivados
mutantes de CHCC5445 y CHCC7158 y sus cepas madre.
\vskip1.000000\baselineskip
La electroforesis en gel de campo pulsado del
ADN digerido con SpeI y XbaI de las dos cepas mutantes tetW,
fue realizada según métodos estándares (Hung and Bandziulis, 1990),
y no reveló ningún reordenamiento del modelo cromosómico digerido
con SpeI o XbaI en comparación con las cepas de tipo salvaje
respectivas. Esto demuestra un antecedente isogénico global de los
mutantes y las cepas madre.
\vskip1.000000\baselineskip
Hemos secuenciado y establecido previamente el
conjunto de biochips de genoma para BB-12®
(presentado por Garrigues et al.). En resumen, la
BB-12® fue secuenciada aleatoriamente, dando como
resultado 56 secuencias contiguas. A través de otro análisis de
ensamblaje era evidente que sólo faltaba un par de porcentaje de
secuencia. En la secuencia de genoma de casi 2.0 Mb se
identificaron 1612 CDSs (secuencias de codificación) putativas. Un
oligómero 65-75 específico fue diseñado para cada
gen con unas pocas excepciones, tales como genes putativos muy
pequeños. Para un par de genes, varios oligos fueron diseñados. En
total, 1569 oligos fueron diseñados a partir de la secuencia.
Además más de 100 oligos de control fueron diseñados. Los oligos
fueron impresos en muestras UltraGAPS (Corning B. V.,
Schiphol-Rijk, Países Bajos) en cuatro copias
repetidas tal como se ha descrito previamente (Pedersen et
al. 2005).
\newpage
Las muestras de ARN fueron recogidas en ARN
protegido, (QIAGEN Valencia, CA, EEUU) para estabilizar el perfil
de expresión y el ARN total fue aislado (RNeasy, Qiagen). 10 \mug
de ARN fue copiado en ADNc usando el CyScribe
Post-Labelling Kit con 1.65 \mug de nonámero
aleatorio como cebador (Amersham Biociencias, Hillerr d,
Dinamarca). La condición de prueba fue marcada con Cy5 y la
condición de referencia con Cy3. Las dos muestras fueron unidas y
la mitad fue hibridizada en el conjunto. En vez del 50% de formamida
recomendado en el protocolo, se usó el 60% (estas condiciones
fueron establecidas previamente usando los oligos de control).
Después de aproximadamente 18h de hibridación el conjunto fue
lavado (Corning B.V.), escaneado, y preanalizado como se ha
descrito anteriormente (Pedersen et al. 2005). Los datos de
conjunto fueron importados en Acuity 4.0 (Axon Instruments Inc.,
Union City, CA, USA) donde fue normalizado por LOWESS. Se creó un
conjunto de datos con todos los puntos identificados. Se eliminaron
los oligos donde sólo 0, 1, o 2 de los 4 puntos repetidos habían
sido identificados. De manera similar se eliminaron los oligos
donde la desviación estándar entre el Iog2(ratio)s
normalizado era >0.5.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión génica de
Bbl2Tet-139S fue comparada con Bb12 usando el
conjunto de biochips del genoma. Se inocularon cultivos fijos de
ambas cepas al 1% (OD600=0.06) en MRS fresco +0.05% de cisteína
\cdot HCl precalentados a 37ºC. El OD600 fue entonces medido cada
30min. En la gama OD de 0.1-1.0 UA (unidades
absorbentes) el crecimiento fue exponencial. El índice de
crecimiento específico, p, fue 0.50 h^{-1} (R2=0.9977) y 0.51
h^{-1} (R2=0.9953) para BB-12® y Bb12Tet- S139,
respectivamente. Por lo tanto no hay ninguna diferencia significante
entre los índices de crecimiento de las dos cepas. A partir de las
muestras de ARN en OD=1.0 UA (después de seis horas y media de
crecimiento) los biochips fueron producidos.
Bb12Tet-S139 y BB-12® fueron la
prueba y condición de referencia, respectivamente. De los 1569
genes representados en el biochip se obtuvieron datos reguladores
significantes de 1271 genes.
Por regla general, un gen es a menudo
considerado como expresado de manera diferente si es regulado >2
por exceso o por defecto entre dos condiciones (véase por ejemplo
Pedersen et al. 2005). Ninguno de los 1271 genes en el
conjunto de datos fueron superiores a >2 veces expresados de
manera diferente. En comparación, cuando se expuso Bb12 a 0.1% de
sales biliares, 86 y 123 genes fueron regulados >2 veces por
exceso y por defecto, respectivamente (presentado por Garrigues
et al.). Entre estos genes, 17 y 27 fueron regulados incluso
>4 veces por exceso y por defecto, respectivamente. Esto muestra
que si el metabolismo celular está perturbado, puede ocurrir
cambios espectaculares con respecto a la expresión genética. De
manera similar, cuando el 1% de fructooligosacarido (FOS) fue
añadido al medio, sólo 2 genes fueron expresados de manera
diferente >2 veces. Estos 2 genes codifican las proteínas
implicadas en la utilización de FOS y fueron regulados 5 por exceso
(presentado por Garrigues et al.). Este último experimento
muestra que las condiciones de crecimiento pueden ser reproducidas
y que las perturbaciones que influyen partes particulares de
metabolismo pueden ser identificadas. Para combinar los resultados
anteriores es evidente que con respecto a la expresión génica y al
estado fisiológico general ningún efecto adverso ha sido observado
en Bb12Tet-S139 comparado con
BB-12®. En base a esto, se puede suponer que
Bbl2Tet-S139 se comporta como BB-12®
excepto para la sensibilidad a la tetraciclina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha mostrado anteriormente en ratones que la
Bifidobacterium BB-12® (CHCC5445) tiene
efectos antagonísticos contra la Salmonella enteritidis de
subespecie typhimurium y en consecuencia ha sido indicada
para reducir las consecuencias patológicas en el ratón
(supervivencia significativamente más alta en grupos probióticos en
comparación con el placebo). La intención consiste en repetir los
estudios con ambas Bifidobacterium BB-12®
(CHCC5445) y Bb-12Tet-S139
(CHCC8902) para mostrar que CHCC8902 es probiótica y presenta
efectos antagonísticos contra la Salmonella enteritidis de
subespecie typhimurium al mismo nivel que CHCC5445.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones convencionales de 21 días de edad son
divididos en 3 grupos experimentales de 10 ratones cada uno. Los
ratones serán tratados diariamente por alimentación forzada con 0.1
ml de leche desnatada reconstituida conteniendo 1 billón de CFU de
Bb-12Tet-S139 (CHCC 8902),
BB-12® (CHCC 5445) o placebo durante 5 días. El día
5, se administró a los ratones una dosis individual de 100 CFU de
Salmonella enteritidis de subespecie typhimurium
(crecida en un medio (Difco) de infusión líquida cerebro corazón
(BHI) a 37ºC). Los ratones fueron inoculados por vía orogástrica
con 0.1 ml de suspensión bacteriana conteniendo aproximadamente 100
células viables. El tratamiento probiótico es continuo durante 28
días con registro de bienestar, síntomas clínicos y muertes cada
día y un examen patológico es realizado en los animales muertos. Con
el fin de realizar experimentos, todos los ratones restantes serán
sacrificados por inhalación de éter y se realizará una patología
macroscópica. Se recogieron las heces de todos los animales antes
de la prueba y los días 1, 7, 14 y 28 de la prueba. Las bacterias
probióticas fueron recuperadas de las heces usando una disposición
en placas selectivas seguida de una identificación específica de
colonias usando un técnica de PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizarán las diferencias de
supervivencia/enfermedad/muerte y cambios patológicos entre los
grupos para mostrar una capacidad protectora de las bacterias
probióticas hacia la infección de Salmonella. La evaluación
estadística se realizará por nivel de importancia a P<0.05.
\vskip1.000000\baselineskip
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\newpage
En referencia a Organismos Microbianos
depositados [EXPERT SOLUTION]
Para todos los organismos microbianos
depositados mencionados en la solicitud de patente presente, se
aplica lo siguiente.
Con respecto a aquellas designaciones con las
que se busca una patente europea se pondrá a disposición una
muestra del microorganismo depositado hasta la publicación de la
decisión de concesión de la patente europea o hasta la fecha en la
que la solicitud haya sido rechazada o retirada o corra el riesgo de
ser retirada, sólo mediante la publicación de tal muestra para un
experto designado por la persona que solicita la muestra, y sea
aprobada i) por el solicitante y/o ii) por la Oficina de Patentes
Europeas, sea cual sea el que la solicita. (Norma 28 (4) y 28 (5)
EPC).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La secuencia de ADN tetW flanqueada por
el gen transposasa superior, tps, de Bifidobacterium anima/is
Bb-12 (SEC ID 22)
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de nucleótidos del transposón TetW
inactivo de Bifidobacterium animalis de subespecie
lactis Bp-12®. La secuencia fue obtenida por
secuenciación en Chr. Hansen A/S y verificada por comparación a una
similar obtenida por Danone.
En la parte superior se sitúa la transposasa
codificante de marco de lectura abierto, nt. # 4 -966, con el
aminoácido representado debajo de la secuencia de ADN (M.W. de
aprox. 35kDa). la secuencia nt. # 1318-2334 es el
gen codificante resistente a la tetraciclina, tetW, con el
aminoácido subrayado debajo de la secuencia de ADN (M.W. de aprox.
70kDa).
La mutación ámbar en posición nt # 1741 (nt #
424 relativa al codón de inicio de tetW) para la cepa
sensible a la tetraciclina, DR90Tet-S9X
(CHCC9070), está indicada encima de la secuencia de ADN.
La mutación de desplazamiento del marco en
posición nt # 2722 (nt # 1405 relativa al codón de inicio) para la
cepa sensible a la tetraciclina, Bp12Tet-S139
(CHCC8902), está indicada encima de la secuencia de ADN.
*): indica el codón de parada
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad por eventuales errores u
omisiones.
\bullet EP 0768375 A [0006]
\bullet WO 0197822 A [0006] [0007]
\bullet WO 03099037 A [0006] [0007]
\bullet WO 2005 A, Zhou [0007]
\bullet US 6379663 B [0007]
\bullet WO 9716198 A [0104]
\vskip1.000000\baselineskip
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Mot. Biol. Rev., 2001, vol. 65, 232-260
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<110> Chr. Hansen A/S
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVAS CEPAS BACTERIANAS DE ÁCIDO
LÁCTICO SENSIBLES A ANTIBIÓTICOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P2195EP00
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium animalis
subespecie lactis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgctgggat acttgaacca gagt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Bifidobacterium animalis
subespecie lactis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgctgggat actgaaccag agtt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211>12
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<212> ADN
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<213> Bifidobacterium animalis
subespecie lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatactgaa cc
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium animalis
subespecie lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagagcgtgg ttcagtctgt tcgg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Bifidobacterium animalis
subespecie lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<212> ADN
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<213> Bifidobacterium animalis
subespecie lactis
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtttagt ct
\hfill12
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<210> 7
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<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcatcgct taattccttc gagggg
\hfill26
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipcgaggggact ttggcccacc gctgggtgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaggcaggc acgtccatcc gcctc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipggcttctgcc accgtggcct cgtcac
\hfill26
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<210>11
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400>11
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\hfill27
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipcggcacctgc tgtataatgc ggattgtggc
\hfill30
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 13
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\hfill27
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 14
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\hfill26
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 23
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<212> ADN
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipccggggacag cgacaccgtc tgc
\hfill23
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<210> 17
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> artificial
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<400> 17
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\hskip-.1em\dddseqskipggagcggccg ctcaaagcag ccagcc
\hfill26
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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<400> 18
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\hskip-.1em\dddseqskipggctggctgc tttgagcggc cgctcc
\hfill26
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<210> 19
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskipgcccaaaacg ggttgggcgg cacctcg
\hfill27
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggatacca de ccagcccgta tccc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatggtcgca tgatcggcgg ggtcactccc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium animalis
subespecie lactis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Método de aislamiento de una cepa de
Bifidobacterium sp conteniendo un tetW mutado en su
cromosoma, dicha mutación haciendo a la cepa sensible a la
tetraciclina y dicha cepa siendo aislada de una cepa progenitora
bacteriana resistente a la tetraciclina donde el fenotipo
resistente a antibióticos es causado por la expresión de tetW
integrado de manera estable en su cromosoma, dicho método
comprendiendo la exposición de las células a un mutágeno químico y
un mutágeno físico, y donde el método comprende las fases de:
- 1)
- cultivar las células progenitoras para obtener un cultivo de células de crecimiento exponencial,
- 2)
- transferir una alícuota de las células a un medio fresco conteniendo bromuro de etidio (EtBr),
- 3)
- transferir el cultivo a uno o más recipientes para formar una capa de cultivo de 0.5 - 10 mm de espesor;
- 4)
- exponer el cultivo a un tratamiento UV,
- 5)
- cultivar las células mutadas para obtener un cultivo de células de crecimiento exponencial,
- 6)
- transferir una alícuota de bacterias a una o más placas de Petri conteniendo un medio de crecimiento agar adecuado, la alícuota de bacterias es seleccionada para proporcionar colonias individuales,
- 7)
- identificar estas colonias que han adquirido una sensibilidad a los antibióticos por réplica en placas de Petri con y sin antibiótico tetraciclina, y
- 8)
- aislar, expandir y mantener estas colonias sensibles al antibiótico tetraciclina identificadas como una nueva cepa sensible al antibiótico tetraciclina; y
donde la concentración inhibitoria
mínima (MIC) de tetraciclina de la cepa progenitora es de al menos
10 microgramos/ml de tetraciclina y la MIC de tetraciclina de la
cepa sensible a antibióticos es de 1.5 \mug/ml de tetraciclina o
menos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, donde el
cultivo después de la fase 4) es sometido a una fase de
enriquecimiento para mutaciones compendiendo las fases de:
- 4a)
- transferir una alícuota del cultivo tratado por UV a un medio fresco conteniendo una dosis de un análogo de penicilina que es perjudicial para las células de crecimiento exponencial, pero tolerable para células sin crecimiento, y
- 4b)
- cultivar las células en dicho análogo de penicilina comprendiendo un medio en unas condiciones que facilitarían el crecimiento exponencial en la ausencia de penicilina o de un análogo de penicilina tal como la ampicilina.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Cepa de Bifidobacterium sensible a las
tetraciclinas debido a una mutación de inactivación en tetW
situado sobre el cromosoma, donde el gen tetW comprende al
menos una secuencia seleccionada del grupo de SEC ID 3 [GGA TAC TGA
ACC] y SEC ID NO: 6 [GTG GTT TAG TCT]; y donde la concentración
inhibitoria mínima (MIC) de tetraciclina de la cepa sensible es de
1.5 \mug/ml de tetraciclina o menos.
4. Cepa de Bifidobacterium según la
reivindicación 3, que está identificada como cepa
Bifidobacterium animalis subspecie lactis CHCC8902
(Bb-12Tet-S139) y que fue
depositada el 28 de abril de 2005 en la Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen bajo el número de registro
DSM17281.
5. Cepa de Bifidobacterium según la
reivindicación 3, que está identificada como cepa
Bifidobacterium animalis subspecie lactis CHCC9070
(DR10Tet-S9X) y que fue depositada el 28 de abril
de 2005 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen bajo el número de registro DSM 17282.
6. Cepa de Bifidobacterium animalis
subespecie lactis, que es sensible a la tetraciclina debido
a una mutación de inactivación en tetW situado sobre el
cromosoma, y donde la concentración inhibitoria mínima (MIC) de
tetraciclina de la cepa sensible es de 1.5 \mug /ml de
tetraciclina o menos.
7. Cepa de Bifidobacterium animalis
subespecie lactis según la reivindicación 6, donde la cepa
progenitora es Bb-12 o HN019 (DR10).
8. Uso de una cepa de Bifidobacterium
según cualquiera de la reivindicaciones 3 a 7 para la preparación
de un material ingerible o de un cultivo bacteriano.
\newpage
9. Uso de un material ingerible o de un cultivo
bacteriano según la reivindicación 8 que comprende una cepa de
Bifidobacterium de cualquiera de las reivindicaciones
3-7, donde el material ingerible o un cultivo
bacteriano es usado para la preparación de una composición para el
tratamiento o la prevención de una enfermedad, síndrome o condición,
o para la preparación de una composición para mejorar la digestión
de nutrientes, o para la preparación de una composición para
mejorar el estado de salud general de un ser humano o de un animal
vertebrado.
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