BRPI0609093B1

BRPI0609093B1 - processo para preparar uma cepa de bifidobacterium sp. que contém um gene tetw mutante em seu cromossomo, cepa de bifidobacterium e uso da mesma

Info

Publication number: BRPI0609093B1
Application number: BRPI0609093A
Authority: BR
Inventors: Stroman Per
Original assignee: Chr Hansen As
Priority date: 2005-05-11
Filing date: 2006-05-11
Publication date: 2018-12-18
Also published as: US8021883B2; EP2264164A1; EP1882034A2; US20080171073A1; EP2194125A2; BRPI0609093A2; RU2394911C2; US20120045820A1; WO2006119780A3; EP2194125A3; WO2006119780A2; RU2007145713A; BRPI0609093A8; US8440450B2

Abstract

linhagens de bactérias de ácido láctico sensíveis a antibióticos. muitas bifidobacteriaceas probjóticas contêm um tetw ativo que torna as células resistentes à tetraciclina. isto pode apresentar um risco de transferência horizontal de genes antibióticos funcionais. a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de novas cepas sensíveis à tetraciclina do gênero de bifidobacteriacea (bifidobacterium sp.). em particular, a presente invenção refere-se a novas cepas sensíveis a antibióticos obtidas partindo de cepas resistentes a antibióticos e ao uso de tais novas cepas para a preparação de um alimento ou de um produto alimentício ou uma forma de dosagonde compreende organismcs viáveis.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA PREPARAR UMA CEPA DE BIFIDOBACTERIUM SP. QUE CONTÉM UM GENE TETW MUTANTE EM SEU CROMOSSOMO, CEPA DE BIFIDOBACTERIUM E USO DA MESMA.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método de obtenção de novas cepas sensíveis a antibióticos do gênero Bifidobacterium de Bifidobacteriacea resistente a antibióticos carregando um gene cromossômico de resistência a antibiótico codificado e às cepas que podem ser obtidas através do método. Em particular, a presente invenção refere-se a novas cepas sensíveis a antibióticos obtidas partindo de cepas probióticas resistentes a antibióticos e ao uso de tais novas cepas para a preparação de um alimento ou de um produto alimentício ou de uma forma de dosagem que compreende organismos viáveis. ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

As bactérias que fermentam açúcares com a produção de ácidos, em particular, o ácido láctico como um componente metabólico principal têm sido conhecidas durante um longo período de tempo. Tais bactérias podem ser encontradas no leite ou em produtos do leite, plantas vivas ou em decomposição, mas também nos intestinos de seres humanos e de animais. Tradicionalmente, estas bactérias têm sido referidas como “bactérias do ácido láctico”. As bactérias do ácido láctico especificam um grupo bastante heterólogo de bactérias microaerofílicas ou anaeróbicas imóveis Grampositivas que fermentam açúcar com a produção de ácidos incluindo o ácido láctico e compreende, por exemplo, os gêneros Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc e Pediococcus.

Durante séculos as bactérias do ácido láctico foram utilizadas na produção de alimentos e produtos alimentícios incluindo a maior parte dos produtos de laticínios e atualmente as bactérias do ácido láctico são essenciais na produção de todos os produtos de leite fermentado tais como iogurte, queijo e manteiga. Além disso, as bactérias do ácido láctico são amplamente utilizadas na indústria de processamento de carne, na indústria de produção de vinhos, na indústria de produção de sucos assim como em um número de outras indústrias.

Petição 870180046715, de 30/05/2018, pág. 9/20

As culturas de bactérias do ácido láctico também encontram usos importantes na biopreservação de matérias alimentícias.

A publicação de um grande número de relatos que documentam que várias bactérias lácticas afetam de forma benéfica o bem-estar de seres humanos e/ou de animais atraiu um interesse adicional a este grupo de bactérias. Em particular, foi descoberto que cepas específicas de Lactobacillus ou Bifidobacterium são capazes de colonizar a mucosa intestinal e de auxili ar a manter o bem-estar dos hospedeiros.

A EP 0 768 375 descreve cepas específicas de Bifidobacterium ssp, que são capazes de serem implantadas na flora intestinal e que são capazes de excluir competitivamente a adesão de bactérias patogênicas nas células intestinais. É relatado que estas Bifidobactérias auxiliam na imunomoduiação e assim na manutenção da saúde do indivíduo. O efeito de imunomodulação das Bifidobactérias pode ainda ser conferido sobre crianças em gestação. A WO 01/97822, por exemplo, descreve que a ingestão da cepa Bifidobacterium animalis Bb-12® pela mãe durante sua gravidez reduz a ocorrência de doenças atópicas nas crianças. Ainda a WO 03/099037 descreve que a cepa de Bifidobacterium animalis Bb-12® é capaz de modificar de forma benéfica a resposta imunológica. De acordo com Masco e outros (2004), a cepa de Bifidobacterium animalis Bb-12® deve ser corretamente . referida como a cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12®.

Os microorganismos probióticos foram definidos como “Microorganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas conferem um benefício à saúde no hospedeiro” (FAO/WHO 2002). Durante os últimos anos, a documentação sobre as propriedades probióticas das Bifidobactérias e outras bactérias lácticas tem se acumulado. Em geral, a ativida de probiótica está associada com cepas específicas. A cepa previamente mencionada de Bifidobacterium animalis Bb-12® assim como a cepa Bifidobacterium lactis HN019 foram relatadas como probióticas (WO 01/97822,

WO 03/099037, Zhou e outros (2005), US 6379663).

No mundo todo está bem espalhada a preocupação pública de que o número de bactérias patogênicas resistentes a antibióticos aumenta

drasticamente. Todos os dados disponíveis indicam que o aumento perturbador nas bactérias patogênicas resistentes a antibióticos é causado por um uso extensivo e muito liberal de antibióticos na população gerai assim como na criação de animais.

É um fato bem-estabelecido que muitas bactérias resistentes a antibióticos carregam determinantes genéticos, genes, que conferem resistência a um ou mais antibióticos. É, além disso, bem sabido que tais determinantes genéticos sob certas circunstâncias podem ser transferidos e podem conferir o fenótipo de resistência a antibióticos às bactérias receptoras.

A frequência da transferência é muito dependente do contexto genético particular em que os genes de resistência a antibióticos são encontrados. Isto é, genes resistentes a antibióticos que residem em plasmídeos ou em transposons demonstraram conferir o fenótipo de resistência a antibióticos às bactérias receptoras em frequências relativamente altas, enquanto que os deter15 minantes codificados nos cromossomos são muito menos sujeitos à transferência.

Por estas razões, pode ser uma preocupação ingerir até mesmo bactérias não patogênicas benéficas se contiverem um determinante de resistência a antibióticos. Esta preocupação é adicionalmente enfatizada no 20 relato do EUROPEAN COMMISSIOIXTS Scientific Committee on Animal Nutrition (SCAN) sobre Criteria for Assessing the Safety of Micro-Organisms

Resistant to Antibiotics of Human Clinicai and Veterinary de 3 de julho de

2001, revisado em 24 de janeiro de 2003, citando que a presença de um gene de resistência conhecido não é aceitável (página 21).

A resistência à tetraciclina é a resistência a antibiótico bacteriana mais comum encontrada na natureza e similarmente é o tipo mais amplamente distribuído de resistência entre bactérias isoladas de animais (Billington 2002). A tetraciclina inibe a síntese de proteínas através da ligação a um sítio isolado de alta afinidade na subunidade ribossomal 30S. Com a tetraci30 clina nesta posição, a ligação do aminoacil-tRNA no sítio A é prevenida e assim a síntese de proteínas é bloqueada.

A resistência à tetraciclina pode ser mediada através do efluxo

ativo da tetraciclina da célula, através da proteção ribissomal por uma ou mais proteínas solúveis, as assim chamadas proteínas de proteção ribossomal (RPPs) ou através da inativação enzimática da tetraciclina.

Recentemente, um novo gene de resistência à tetraciclina (Tet^r) do tipo proteção do ribossomo, tetW, foi identificado em isolados de rúmen de Butyrivibrio fibrisoívens e um número de outras bactérias do rúmen (Bar-

bosa, 1999).

Embora o determinante tetW esteja amplamente distribuído entre os isolados resistentes à tetraciclina de agentes patogênicos de animais 10 (Billington 2002), foi uma surpresa para os autores deste pedido de patente descobrir que todas as cepas probióticas conhecidas de Bifidobacterium animalis subs, lactis, incluindo as duas cepas bem-conhecidas de Bifidobacterium Bb-12® e DR10®, carregam um determinante tetW funcional e são resistentes à tetraciclina; em particular porque em um relato recente a cepa 15 DR10® assim como a cepa Bb-12® foram relatadas como sendo sensíveis à tetraciclina (Zhou e outros 2005).

Muito embora experimentos extensos tenham indicado que o determinante tetW da cepa Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-

12® não pode ser transferido sob situações reais, ainda permanece a preo20 cupação de determinantes de resistência a antibióticos em produtos alimen. tícios. Consequentemente, foram tentadas várias abordagens para realizar a inativação ou a remoção do gene tetW em Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12® através de mutagênese clássica, envolvendo vários agentes mutagênicos, assim como através de manipulação genética direta.

Entretanto, até agora todas as tentativas não foram bem-sucedidas. É considerado que uma razão importante para as muitas tentativas sem sucesso seja pelo fato de que o tetW fica localizado no cromossomo das cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subs, lactis.

Assim, seria altamente vantajoso estabelecer um método para a inativação do gene de resistência tetW em Bifidobacteriacea probiótica. Tal método poderia, além disso, ajudar a resolver o problema de fornecimento de variações sensíveis ao antibiótico de Bifidobacteriacea resistentes à te5 φ 20 traciclina probióticas com interesse comerciai, que podem satisfazer o requerimento de ausência de genes de resistência funcionais a antibióticos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O problema anterior foi resolvido através do fornecimento de um método de isolamento de uma cepa sensível à tetraciclina de Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriacea) partindo de uma cepa progenitora bactéria na resistente à tetraciclina em que o fenótipo de resistência ao antibiótico é causado pela expressão de um tetW funcional que está integrado de forma estável no seu cromossomo, o dito método compreendendo submeter as células tanto a um agente mutagênico químicos quanto a um agente mutagênico físico. Preferencialmente, o agente mutagênico químico compreende o brometo de etídio (EtBr) e o agente mutagênico físico é UV.

Este método parece poder ser geralmente aplicado a Bifidobacteríum sp. resistente à tetraciclina com um tetW funcional integrado de forma estável em seu cromossomo, uma vez que em cada um dos experimentos de mutação que foram realizados com este método era possível isolar variações sensíveis à tetraciclina das duas cepas de Bifidobacterium Bb-12® e HN019 (DR10®).

Assim, os aspectos importantes adicionais da invenção são o fornecimento de cepas de Bifidobacterium sp. contendo um tetW codificado cromossomicamente mutado que torna a cepa sensível às tetraciclinas, que podem ser obtidas através do método mencionado anteriormente e do uso de tais cepas de Bifidobacterium para a preparação de um material que pode ser ingerido ou de um medicamento.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de inativação de um gene tetW em uma célula de Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriaceaè), o dito método compreendendo submeter uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional a um agente mutagênico químico e a um agente mutagênico físico.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um método de preparação de uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW inativado, o dito método compreendendo as etapas de: a) inativação do gene tetW em uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetlV funcional submetendo a dita célula a um agente mutagênico químico e um agente mutagênico físico b) isolamento de um mutante da célula de Bifidobacterium sp. obtida na etapa a) que possui um gene tetW 5 inativado.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de preparação de uma célula de Bifidobacterium sp. sensível à tetraciclina, o dito método compreendendo as etapas de: a) submissão de uma célula de Bifidobacterium sp. a um agente mutagênico químico e a um agen10 te mutagênico físico, em que a célula de Bifidobacterium sp. possui uma Concentração tnibodora Mínima de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior

b) isolamento de um mutante da célula de Bifidobacterium sp.

obtida na etapa a), em que o dito mutante possui uma Concentração Inibido15 ra Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW inativado.

Em um quinto aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. que possui uma Concentração Inibidora Mínima 20 de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

Em um sexto aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. que contém um tetW codificado cromossomicamente mutado que torna a célula sensível a tetraciclinas que pode ser obtida através do método da presente invenção.

Em um sétimo aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium que é sensível a tetraciclinas por causa de uma mutação no tetW, a dita célula de Bifidobacterium sendo derivada de uma célula progenitora que é resistente a tetraciclinas por causa da presença de um gene tetW localizado no cromossomo.

Em um oitavo aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de uma célula de Bifidobacterium de acordo com a presente invenção para a preparação de um material que pode ser ingerido ou uma cultura bacteriana.

Em um nono aspecto, a presente invenção refere-se a um alimento ou a um produto alimentício que compreende a célula bacteriana da presente invenção.

Em um décimo aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. de acordo com a presente invenção para uso como um probiótico.

Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de um mamífero que compreende a administração de uma célula de Bifidobacterium sp. de acordo com presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em uma modalidade a presente invenção refere-se a um método de inativação de um gene tetW em uma célula de Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriaceae), o dito método compreendendo submeter uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional a um agente 15 mutagênico químico e a um agente mutagênico físico.

A presente invenção refere-se ainda a um método de preparação de uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW inativado, o dito método compreendendo as etapas de: a) inativação de um gene tetW em uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene 20 tetW funcional submetendo uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetWfuncional a um agente mutagênico químico e a um agente mutagênico físico.

b) isolamento de um mutante da célula de Bifidobacterium sp. obtida na etapa a) que possui um gene tetWinativado.

Em uma modalidade adicionai a presente invenção refere-se ainda a um método de preparação de uma célula de Bifidobacterium sp. sensível à tetraciclina, o dito método compreendendo as etapas de: a) submissão de uma célula de Bifidobacterium sp. a um agente mutagênico químico e a um agente mutagênico físico, em que a célula de Bifidobacterium 30 sp. possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior

b) isolamento de um mutante da célula de Bifidobacterium sp.

obtida na etapa a)_r em que o dito mutante possui uma Concentração Inibidora Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

A razão pela qual tem sido difícil mutar um gene tetW em uma célula de Bifidobacterium sp. pode ser que o gene fica localizado no cromos5 somo das células. Assim, em um método da presente invenção, o gene tetW funcional pode ser localizado no cromossomo da célula de Bifidobacterium sp.

Assim, em um método da presente invenção o gene tetW inatívado pode ser localizado no cromossomo da célula de Bifidobacterium sp.

O termo “gene tetW inativado refere-se no contexto da presente 10 invenção a um gene teíWque, se presente em uma célula, não é capaz de exercer sua função normal.

Em particular um gene teMZ inativado é um gene que comparado a um gene tetW funcional compreende uma mutação no quadro aberto de leitura (ORF) do gene, em que a dita mutação pode ser uma mutação de 15 alteração de quadro, introdução de um códon de término ou uma mutação que resulta em uma substituição de aminoácido não conservada. Uma substituição de aminoácido não conservada é definida como uma substituição de um resíduo de aminoácido por um outro resíduo de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, tamanho, carga ou polaridade), que 20 geralmente não altera as propriedades funcionais da proteína. Em particular, . um gene tetW inativado é um gene teM/que, quando presente em uma célula, torna a dita célula sensível à tetraciclina.

O termo “gene tetW funcional refere-se no contexto da presente invenção a um gene tetW que, se presente em uma célula, torna a célula 25 resistente à tetraciclina. Em particular um gene tetW funcional pode ser um gene que compreende um quadro aberto de leitura (ORF) que possui uma sequência que corresponde às posições 1318-3234 na SEQ ID NO: 22 ou uma sequência que possui 30%, tal como 40% ou 50% ou 60% ou 70% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 99% de homologia à sequência que corres30 ponde às posições 1318-3234 da SEQ ID NO: 22.

Para as finalidades da presente invenção, os alinhamentos de sequências e o cálculo dos escores de homologia podem ser feitos utilizando

um alinhamento completo de Smith-Waterman, útil para alinhamentos tanto de proteínas quanto de DNA. As matrizes de escore pré-estabelecidas BLOSUM50 e a matriz de identidade são utilizadas para alinhamentos de proteínas e de DNA, respectivamente. A penalidade para o primeiro resíduo em 5 um espaço é de 12 para proteínas e de 16 para DNA, enquanto que a penalidade para resíduos adicionais em um espaço é de 2 para proteínas e de 4 para DNA. O alinhamento pode ser feito com o pacote FASTA versão v20u6

(W. R. Pearson e D, J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysís”, PNAS 85: 2444-2448 e W. R. Pearson (1990) “Rapid and 10 Sensitive Sequence Comparison with FASTP e FASTA”, Methods in Enzymology, 183: 3’ or N-terminal -> C-terminal direction of the nucleic acid or amino acid sequence, respectivamente).

É um resultado da presente invenção que o inventor seja capaz de descrever um método geral útil para o isolamento de uma cepa de Bifido15 bacterium sp. (Bifidobacteriacea) que contém um tetW mutado em seu cromossomo que torna a cepa sensível a tetracictinas e que é isolado de uma cepa progenitora bacteriana resistente à tetraciclina em que o fenótipo de resistência a antibiótico é causado pela expressão de tetW integrado de forma estável em seu cromossomo.

A referência à “cepa progenitora” deve ser entendida na presente invenção como referência a uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetWfuncional, uma célula de Bifidobacterium sp. resistente à tetraciclina ou uma célula de Bifidobacterium sp. que possui um valor de

MIC de 4 microgramas de tetracíclina/mLou superior.

A referência à “cepa sensívei a antibiótico” deve ser entendida na presente invenção como referência a uma célula de Bifidobacterium sp.

que compreende um gene tetW inativado, uma célula de Bifidobacterium sp. sensível à tetraciclina ou uma célula de Bifidobacterium sp. que possui um valor de MIC de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

Em uma modalidade da presente invenção, a célula de Bifidobacterium pode ser uma cepa.

Em uma modalidade adicional os métodos da presente invenção podem após a etapa a) compreender ainda as etapas de:

i) transferência de um alíquota da cultura tratada com UV para um meio fresco contendo uma dose de um análogo da penicilina que é prejudicial para as células que crescem de forma exponencial, mas tolerável para as células que não estão crescendo e ii) cultivo das céiuias no meio que compreende o dito análogo de penicilina sob condições, que promoveríam o crescimento exponencial na ausência de penicilina ou de um análogo da penicilina tal como a ampicilina.

O termo “prejudicial a células que crescem de forma exponenci10 al” refere-se no contexto da presente invenção a compostos capazes de reduzir a taxa de crescimento exponencial das células.

O termo “tolerável” refere-se no contexto da presente invenção a

compostos que são bacteriocríticos.

Em uma modalidade, os métodos da presente invenção podem compreender as etapas de:

i) cultivo das células progenitoras ou da célula de Bifidobacteríum sp. compreendendo um gene tetW funcional ou que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior para a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencial, ii) transferência de uma alíquota das células obtidas na etapa i) para meio fresco contendo um agente mutagênico químico, iii) transferência da cultura obtida na etapa ii) para um ou mais recipientes para formar uma camada de 0,5-10 mm de espessura da cultura, iv) submissão da(s) cultura(s) da etapa iii) a um agente mutagê- nico físico,

v) cultivo das células mutadas da etapa iv) para a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencial, vi) transferência de uma alíquota das bactérias da etapa v) para uma ou mais placas de Petri contendo um meio de crescimento com ágar adequado, a alíquota das bactérias sendo selecionada para fornecer colônias isoladas vii) identificação das colônias da etapa vi) que adquiriram sensí bilidade ao antibiótico por plaqueamento de réplicas em placas de Petri com e sem antibiótico e

viii) isolamento e expansão das células obtidas na etapa vii).

O agente mutagênico químico e o físico podem ser como descri5 to no parágrafo que descreve agentes mutagênicos químicos e físicos que podem ser utilizados nos métodos da presente invenção.

Pode ser uma vantagem manter ou armazenar as colônias sensíveis a antibióticos obtidas na etapa viii).

Este procedimento também pode ser descrito como 1) a cultura das células progenitoras para a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencíal, 2) a transferência de uma alíquota das células para meio fresco contendo brometo de etídio (EtBr), 3) a transferência da cultura para um ou mais recipientes para formar uma camada de 0,5 - 10 mm de espessura de cultura, 4) a submissão da cultura para um tratamento com 15 UV, 5) a cultura das células mutadas para a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencial, 6) a transferência de uma alíquota de bactérias para uma ou mais placas de Petri para formar colônias isoladas, 7) a identificação das colônias que adquiriram sensibilidade a antibióticos por plaqueamento de réplicas em placas de Petri com e sem antibiótico e 8) o 20 isolamento, a expansão e a manutenção das colônias sensíveis a antibióticos identificadas como uma nova cepa sensível a antibióticos.

Em uma modalidade adicional, a cultura obtida na etapa iv) ou 4) pode ser submetida a uma etapa de enriquecimento em relação a mutações que compreende as etapas de:

iva) transferência de uma alíquota da cultura tratada com UV para um meio fresco contendo uma dose de um análogo de penicilina que é prejudicial para as células em crescimento exponencial, mas tolerável para as células que não estão em crescimento, e ivb) cultivo das células no meio contendo o dito análogo de peni30 cilina sob condições que promoveríam o crescimento exponencial na ausência de penicilina ou um análogo de penicilina tal como a ampicilina.

Na técnica, os testes de diluição são utilizados para determinar

as concentrações inibidoras mínimas (MICs) de agentes antimicrobianos e estes são os métodos de referência para o teste de susceptibilidade antimicrobiana. Nos testes de diluição, os microorganismos são testados em relação a sua capacidade de produzir crescimento visível em meios adequados 5 e a concentração mais baixa de um agente antimicrobiano que inibe o crescimento de um microorganismo é definida como a MIC. Os termos Concentração Mínima de Inibição, Concentração Inibidora Mínima e MIC podem ser utilizados de forma intercambiável no contexto da presente invenção, A MIC (Concentração Inibidora Mínima) pode ser considerada como a concentra10 ção mais baixa de um composto particular que resulta na inibição do crescimento visível ou como a concentração mínima do agente antibacteriano em um certo meio de cultura abaixo da qual o crescimento bacteriano não é inibido.

Há ensaios diferentes para a determinação do valor de MIC para 15 um composto particular. No contexto da presente invenção, o valor de MIC pode ser, em particular, determinado de acordo com o método de seleção de susceptibilidade com o teste E descrito por Danielsen e Wínd (2003), O método de seleção de susceptibilidade com o teste E compreende as etapas de:

a) mergulhamento de um swab de algodão esterilizado em uma cultura de uma cepa sensível à tetraciclina que será testada, que foi crescida . durante a noite,

b) esfriamento da superfície inteira de uma placa de ágar MRS (diâmetro: 8,5 cm) igualmente em três direções com o swab de algodão da etapa a)

c) quando o inóculo aplicado na etapa b) secar, aplicação da tira do teste E na superfície do ágar através do auxílio de um aplicador manual com a escala da MIC com a face para cima

d) inóculo da placa de ágar sob condições anaeróbicas ou microaerofílicas em uma posição invertida a 37°C durante a noite

e) determinação do valor de MIC através da leitura do valor em que o limite da elipse de inibição tem interseção com a tira.

Este método e a tira do teste E são também descritos na EP 157

071 que é incorporada aqui como referência.

Ainda um outro método para a determinação da Concentração Inibidora Mínima é descrito na FR-A-2 264 089, que é incorporada aqui como referência.

A expressão “resistente à tetraciclina” refere-se a uma bactéria que possui uma Concentração Inibidora Mínima (MIC) de tetraciclina pelo menos maior que 4 pg/mL (ÊFSA, 2005), por exemplo, pelo menos 5 microgramas/mL, tal como pelo menos 8 microgramas/mL, incluindo pelo menos 10 microgramas/mL ou ainda pelo menos 15 microgramas de tetraciclina/mL.

O valor de MIC pode, em particular, ser como determinado pelo método de seleção de susceptibilidade com o teste E como descrito por Danielsen e Wind (2003).

Consequentemente, a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional pode, em particular, ter uma Concentração 15 Inibidora Mínima como descrito anteriormente.

No presente contexto, a expressão “sensível às tetraciclinas” refere-se a uma bactéria que possui uma MIC de 1,5 micrograma/mL ou inferior, tal como 1 micrograma/mL ou até mesmo menos que 0,75 micrograma/mL de uma tetraciclina específica do grupo das tetraciclinas. O valor de 20 MIC pode, em particular, ser como determinado através do método de seleção de susceptibilidade com o teste E.

Especificamente, a expressão “sensível à tetraciclina” refere-se a uma bactéria que possui uma MIC de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior, tal como 1 micrograma/mL ou até mesmo menor que 0,75 micro25 grama de tetraciclina/mL. O valor de MIC pode, em particular, ser determinado através do método de seleção de susceptibilidade com o teste E. consequentemente, a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW inativado pode, em particular, ter uma Concentração Inibidora Mínima como descrito anteriormente.

Como demonstrado no exemplo 12, até agora todas as mutações que são caracterizadas por uma Concentração Inibidora Mínima (MIC) determinada pelo teste E, que é igual ou inferior a 1,5 pg de tet/mL, contiI

I

nham um tetW mutado. Isto abre para um procedimento de seleção, que resulta na seleção de cepas de Bifidobactérias sensíveis à tetraciclína, que com uma alta probabilidade, contêm um gene tetWinativado. Assim, os métodos da presente invenção podem compreender ainda uma seleção de mu5 tantes sensíveis à tetraciclína que provavelmente contêm particularmente um gene tetW mutado. Este método de seleção pode compreender as etapas a seguir, assim a etapa b) no método da presente invenção descrita anteriormente pode, em particular, compreender ainda as etapas de:

i) determinação da Concentração Inibidora Mínima (MIC) das bactérias através do método de seleção de susceptibilidade com o teste E, ii) divisão das bactérias em duas classes baseadas no resultado da seleção de susceptibilidade com o teste E:

Classe 1: bactérias com uma MIC de 1,5 pg/mL ou inferior de acordo com o teste E e

Classe 2: bactérias com uma MIC acima de 1,5 pg/mL de acordo com o teste E; e iii) identificação e expansão das bactérias sensíveis a antibióti, cos identificadas em ii) com uma MIC de 1,5 pg/mL ou inferior (Classe 1).

Pode ser uma vantagem adicional manter as bactérias sensíveis 20 a antibióticos obtidas na etapa iii).

“Tetraciclinas” ou “grupo de antibióticos da tetraciclína” refere-se ao grupo de antibióticos bacteriostáticos que são produzidos pelas espécies de Streptomyces e seus derivados semi-sintéticos relacionados. As tetraci clinas inibem tanto bactérias G ram-positivas e Gram-negativas quanto ric25 kettsiae. São caracterizadas por um modo de ação que implica que o antibiótico se liga de forma reversível ao ribossomo 30S e iniba a ligação do aminoacil-t-RNA ao sítio receptor no ribossomo 70S. Em adição à própria tetraciclina, também terramicina, demeclociclina, meclociclina, doxiciclina/doxiciclin, limeciclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, rolitetraci30 clina, aureomicina assim como outras clortetraciclinas são consideradas como membros do grupo das tetraciclinas. Consequentemente, também um método em que as tetraciclinas são um antibiótico selecionado do grupo que

consiste em, mas não limitado à tetraciclina, terramicina, demeclociclina, meclocicíina, doxiciclina/doxiciclin, limeciclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, aureomicina e outras clortetraciciinas é uma modalidade da presente invenção.

O tipo preferido de tetraciclinas é a tetraciclina.

Como mencionado, foram necessárias várias tentativas antes do presente método ser desenvolvido. É considerado que é a ação combinada tanto de um agente mutagênico químico quanto físico, por exemplo, brometo de etídio e luz ultravioleta, que aumenta a chance de uma mutação bem10 sucedida do gene tetW.

Para aumentar adicionalmente a probabilidade de sucesso, a cultura ou a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional ou que possui um valor de MIC de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior, pode subsequentemente à etapa de mutação, isto é, a 15 etapa de submissão da dita cultura ou células a um agente mutagênico químico e físico, ser submetida a uma etapa de enriquecimento em relação a mutações que compreende as etapas de:

a) transferência de uma alíquota da cultura tratada com UV para meio fresco contendo uma dose de um análogo de penicilina que é prejudi20 ciai para as células em crescimento exponencial, mas tolerável para as células que não estão em crescimento e

b) cultura das células no meio que compreende o dito análogo de penicilina sob condições que promoveríam o crescimento exponencial na ausência de um análogo de penicilina.

Considerando que tal “procedimento de seleção com ampicilina” é bem-estabelecido e foi frequentemente utilizado para bactérias gramnegativas desde 1972 (Miller 1972), é surpreendente que o procedimento de seleção com ampicilina” para o melhor do presente conhecimento não foi previamente utilizado em um protocolo de mutação direcionado contra Bifi30 dobacteriaceae gram-positivas. Embora algumas Bifidobacteriacea possam crescer sob condições aeróbicas, é considerado vantajoso quando a cultura é realizada a uma tensão de oxigênio reduzida, por exemplo, através da su

plementação do meio de cultura com cloridrato de cisteina como descrito no exemplo 1.

Em geral, a abordagem mutagênica dua! da presente invenção é considerada uma escala mais eficaz que quando os agentes mutagênicos 5 são utilizados individualmente.

O agente mutagênico químico pode, em princípio, ser qualquer composto químico capaz de mutagenizar ácidos nucléicos, em particular, o DNA. Em particular, o agente mutagênico químico pode ser um agente mutagênico intercalante que absorve UV, isto é, um composto químico capaz 10 de se intercalar tanto com os ácidos nucléicos, tal como o DNA, quanto de absorção da luz UV, Sem ficar ligado a qualquer teoria, o inventor da presente invenção acredita que através da combinação dos compostos intercalantes que absorvem UV como agentes mutagênicos químicos e irradiação de UV como o agente mutagênico físico, é possível a obtenção de um certo 15 grau de especificidade à sequência em relação à mutação de uma seqüência de ácido nucléico, tal como o DNA. Por exemplo, o brometo de etídio (EtBr) que é um composto intercalante de absorção de UV não se intercala geralmente aleatoriamente dentro do DNA. De forma geral, a quantidade de EtBr que se intercala dentro do DNA depende, por exemplo, do grau de su20 perenrolamento do DNA. Como o grau de DNA superenrolado, pelo menos . em eucariotos, se correlaciona com o nível de expressão de um gene particular, é considerado que este possa resultar em um certo grau de especificidade à sequência em relação a onde o EtBr se intercala com o DNA. A presença de EtBr intercalado em uma sequência de DNA resulta geralmente em mutação(ões) da sequência de DNA nos locais em que o EtBr é intercalado quando a dita seqüência é exposta à luz UV. Além disso, o EtBr deve geralmente se intercalar nos filamentos de sequências de DNA de trato polidApolidT ou pelo menos a taxa de intercalação do EtBr com tais sequências é baixa comparada com outras sequências.

Os exemplos de compostos intercalantes de absorção de UV incluem, mas não estão limitados a brometo de etídio (EtBr), etídio, proflavina, daunomicina, adriamicina, actinomicina, elipticina, tilorona, m-AMSA, mitramicina. netropsina, irehdiamina A. antramicina, esteptonigrina, bleomícina, ditercalínio, triostina e equinomicina. Outros exemplos de tais compostos são fornecidos na US 5.391.723, que é incorporada aqui como referência.

O agente mutagênico físico da presente invenção pode em uma modalidade particular ser uma radiação não ionizante com um comprimento de onda mais curto que 800 nm. Um exemplo de tal agente mutagênico físico é a radiação por UV.

Consequentemente, em uma modalidade da presente invenção,

o agente mutagênico químico é um composto intercalante de absorção de

UV, tal como qualquer um dos exemplos mencionados anteriormente e o agente mutagênico físico é uma radiação não ionizante com um comprimento de onda mais curto que 800 nm, tal como radiação por UV. Em uma modalidade adicional, o agente mutagênico químico é EtBr e o agente mutagênico físico é radiação por UV.

Como ilustrado no exemplo 1, a ação combinada de EtBr e a exposição à luz UV reduz consideravelmente a viabilidade das células imediatamente após os tratamentos com EtBr-UV. É considerado que tal abordagem dual eficaz pode ser a razão pela qual foi possível atingir uma inativação eficiente do gene tetW em Bifidobacteriacea. Assim, em uma modali20 dade importante da presente invenção, o tratamento por UV é ajustado para, resultar em uma redução do número de células vivas que é medido através das Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) até menos que 20%, tal como menos que 15% ou até mesmo menos que 10% em relação ao número das UFCs da cultura imediatamente antes do tratamento por UV. Este ajuste do tratamento por UV pode, ern uma modalidade, se realizado na etapa iv) do método.

Em uma modalidade preferida, a concentração de EtBr é ajustada para ficar entre 10 e 30 microgramas/mL. Em modalidades adicionais, o análogo de penicilina utilizado no “procedimento de enriquecimento com 30 ampicilina” é ampicilina que, em particular, pode ser utilizada em uma dose de 50-300 microgramas/mL no meio, em particular, esta dose de ampicilina pode ser utilizada junto com uma concentração de EtBr de 10-30 microgra-

mas/mL.

A resistência à tetraciclina e à oxitetraciclina foi observada em

cepas de Bifidobacterium caie nula tum. Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium asteroids, Bifidobacterium infantis,

Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis e subespécies das mesmas (Yazid (2000), Lim (1983), Scott (2000), este estudo). O te/W foi observado em cepas resistentes à tetraciclina de Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis (Scott e outros 2000, Moubareck e outros 2005). Entretanto, a resistência à tetraci10 clina não é característica de cepas probióticas de Bifidobacterium. Moubareck (2005) relata que Bifidobactérias probióticas em geral parecem ser mais susceptíveis a antibióticos e as duas Bifidobactérias probióticas bemconhecidas, Bifidobacterium animalis supsp. lactis strain Bb-12® e DR10® foram relatadas como sendo sensíveis à tetraciclina (Zhou e outros 2005).

Ainda, Moubareck (2005) não observou tetW em Bifidobacterium animalis. Surpreendentemente, entretanto; o presente estudo divulgou que também cepas probióticas de Bifidobacterium, incluindo cepas probióticas de Bifidobacterium animalis tais como Bifidobacterium animalis supsp. lactis cepas Bb-12® e DR10®, contêm um tetWfuncional que torna as bactérias resisten20 tes à tetraciclina.

Assim, nas modalidades atualmente preferidas, a espécie bacteriana é selecionada do grupo que consiste em Bifidobacteriacea que contém um tetW funcional que torna as bactérias resistentes à tetraciclina. Em uma modalidade preferida adicional, a cepa progenitora bacteriana resistente à 25 tetraciclina é uma cepa probiótica. Sírniiarmente, a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetWfuncional ou que possui um valor de MIC de 4 mícrogramas de tetraciclina/mL ou superior pode ser uma célula probiótica.

A célula de Bifidobacterium sp. mutante que compreende um gene tetW inativado ou que possui um valor de MIC de 1,5 micrograma de 30 tetraciclina/mL ou inferior também pode ser uma célula probiótica.

No contexto da presente invenção, o termo “probiótico” deve ser entendido como “microorganismos vivos que quando administrados em

quantidades adequadas conferem um benefício à saúde ao hospedeiro” (FAO/WHO 2002).

Em particular, as cepas probióticas podem ser cepas que são capazes de sobreviver à passagem do esôfago e do estômago e, além dis5 so, são capazes de sobreviver à exposição ao ácido biliar que ocorre na parte superior do intestino. Consequentemente, é esperado que uma bactéria probiótica potencial sobreviva à exposição ao suco gástrico no estômago (exemplo 9) e exibem ainda resistência aos sais biliares (exemplo 10). A cepa placebo para tais estudos pode ser, em particular, cepas que não possu10 em um efeito probiótico; mais particularmente cepas que não possuem adicionalmente um efeito patogênico.

Outro teste para a determinação do fato de uma cepa ser ou não considerada como sendo probiótica incluem...

Durante os últimos anos, se acumulou uma documentação de 15 propriedades probióticas de Bifidobacteria e outras bactérias lácticas. Em geral, a atividade probiótica está associada a cepas específicas. A cepa previamente mencionada de Bifidobacterium animalis Bb-12® assim como a cepa de Bifidobacterium lactis HN019 foram relatadas como probióticas (WO 01/97822, WO 03/099037, Zhou e outros (2005), US 6379663).

As espécies de Bifidobacterium que são úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitadas a Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium asteroids, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifi- dobacteríum infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum e Bifidobacterium pseudoca25 tenulatum e subespécies das mesmas.

A invenção, entretanto, não está limitada a estas Bifidobacteriacea particulares mencionadas anteriormente. O versado na técnica reconhecería tais Bifidobacteriacea que podem ser úteis no método de acordo com a invenção, assim como outras bactérias probióticas que contêm um tet W 30 funcional que as torna resistentes às tetraciclinas.

Nas modalidades preferidas, a cepa ou célula, a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene fetW funcionai ou a célula de Bi

fidobacterium sp. que possui uma MIC de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior, é uma cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis. Em particular, a dita célula ou cepa é uma célula ou cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC5445 (Bb-12®), depositada em 30 de

setembro de 2003 de acordo com o Tratado de Budapeste no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM 15954 ou cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis CHCC7158, depositada em 28 de abril de 2005 de a10 cordo com o Tratado de Budapeste no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM 17280.

É digno de nota enfatizar que a nomenclatura de Bifidobacterium 15 animalis subespécie lactis sofreu alterações ao longo dos anos.

Inicialmente, a cepa de Bifidobacterium Bb-12® foi descrita co-

mo uma Bifidobacterium bifidum. Seqüenciaimente, foi descoberto que Bifidobacterium animalis era mais correto, embora a cepa não fosse uma Bifidobacterium animalis típica. A cepa difere em vários aspectos de Bifidobac20 terium animalis como descrito por Meile e outros (1997), que sugeriram o . estabelecimento de uma nova espécie, Bifidobacterium lactis. O nome desta espécie foi posteriormente validado na lista N^s 62 em IJSB (1997). O status da espécie de Bifidobacterium lactis foi discutido desde a publicação de Meiles. Recentemente, Cai e outros (2000) publicaram resultados da hibridiza25 ção de D NA-D NA, que mostraram que Bifidobacterium lactis não diferia o suficiente de Bifidobacterium animalis para permitir o status da espécie. Com base nestes resultados, o International Committee on Systematic Bacteriology, o Subcomitê em taxonomia de Bifidobacterium, Lactobacillus e organismos relacionados decidiram que Bifidobacterium lactis não pode ser re30 conhecida como uma espécie válida (Minutes, USEM, 2001). Desde então, uma análise taxonômica polifásica foi feita e publicada levando à criação de duas subespécies dentro de Bifidobacterium animalis (Masco e outros,

Μ

2004) . Bb-12® pertence a uma das subespécies, B. animalis subsp. lactis. Com base em impressões digitais do DNA, parece para os presentes inventores que também a cepa bem-conhecida de Bifidobacterium DR10^P deveria ser corretamente denominada de B. animalis subsp. lactis. Na literatura, a cepa DR10\ é também referida como Bifidobacterium lactis HN019 (Zhou

2005) e HOWARU Bifido (www.danisco.com).

Como ilustrado no exemplo 2, o método da presente invenção pode resultar em duas classes de novos isolados sensíveis a antibiótico uma

classe que expressa um nível intermediário de sensibilidade à tetraciclina, 10 isto é, isolados com uma MIC variando entre 2 e 4 pg de tetraciclina/mL e isolados com uma MIC menor que 1,5 pg de tetracíclína/mL tal como 0,75 ou até mesmo 0,5 pg de tetraciclina/mL. Até agora, foram identificados somente isolados com um tetW inativado em isolados com uma MIC menor que 1,5 pg de tetraciclina/mL e em todos os casos foram utilizadas Bifidobacteríacea 15 possuindo um MIC maior que 10 microgramas de tetraciclina/mL como células progenitoras. Assim, uma modalidade preferida da presente invenção é um método de isolamento de uma cepa sensível à tetraciclina de Bifidobacterium sp. (Bifidobacteríacea) de uma cepa progenitora bacteriana resistente à tetraciclina em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) da tetraciclina 20 da cepa progenitora é de pelo menos 10 microgramas de tetraciclina/mL e a

MIC da cepa sensível ao antibiótico é de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior. A cepa progenitora pode ser uma célula de Bifidobacterium sp.

que compreende um gene funcional feWou que possui um valor de MIC de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior e a cepa sensível a antibiótico 25 pode ser uma célula de Bifidobacterium sp. mutante que compreende um gene tetW inativado ou que possui um valor de MIC de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

Uma vez que o grupo de antibióticos da tetraciclina compartilha o mesmo modo de ação, é considerado que a inativação de tetW, em geral, 30 resultará em uma modificação na sensibilidade a qualquer um do grupo de antibióticos da tetraciclina em uma magnitude similar à alteração observada com a tetraciclina. Consequentemente, uma modalidade da invenção é um

método de isolamento de uma cepa de Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriacea) que é sensível a uma ou mais das tetraciclinas de uma cepa progenitora bacteriana que é resistente a uma ou mais das tetraciclinas e em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) do dito antibiótico da cepa progenitora 5 é pelo menos 10 vezes maior que a MIC da cepa sensível a antibiótico. A cepa progenitora pode ser uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional ou que possui um valor de MIC de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior e a cepa sensível ao antibiótico pode ser uma célula de Bifidobacterium sp. mutante que compreende um gene tetW 10 inativado ou que possui um valor de MIC de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

Os exemplos dos antibióticos do grupo da tetraciclina são representados pelo grupo de antibióticos que compreende tetraciclina, terramicina, demeclociclina, meclociclina, doxiciclina/doxiciclina, limeciclina, metaci15 clina, minociclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, aureomicina e outras clortetraciclinas.

Para o bem do presente conhecimento, até agora todas as cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subs. lactis e um número substancial de outras Bifidobacteriacea carregam um determinante tetWfuncional 20 que as tornam resistentes à tetraciclina. O inventor da presente invenção . descobriu de forma surpreendente que era possível fornecer Bifidobacteriacea que carregam um determinante tet W inativado.

Como ilustrado nos exemplos, é na verdade possível obter variações de cepas probióticas conhecidas de Bifidobacterium sp. que contêm 25 um tetW codificado peío cromossomo mutado que torna a cepa sensível às tetraciclinas. O fornecimento de tais novas cepas é considerado a modalidade mais preferida da presente invenção.

Consequentemente, em uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um 30 gene tetW inativado. Esta célula pode, em particular, ter uma Concentração Inibidora Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina /mL.

Em uma modalidade adicional, na célula de Bifidobacterium sp.

o gene tetW ínativado pode estar localizado no cromossomo das ditas células.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se ainda a uma célula de Bifidobacterium sp. que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclína/mL.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. que contém um tet W codificado por cromossomo mutado que torna a célula sensível às tetraciclinas que pode ser obtida através de um método da presente invenção.

A presente invenção refere-se ainda a uma célula de Bifidobac10 terium que é sensível às tetraciclinas por causa de uma mutação em tetW, a dita célula de Bifidobacterium sendo derivada de uma célula progenitora que é resistente às tetraciclinas por causa da presença de um gene tetW localizado no cromossomo.

A nova cepa ou célula, em princípio, pode ser uma variação ou uma mutação de qualquer Bifidobacterium que carregue um tetW codificado peto cromossomo tornando a cepa resistente às tetraciclinas. As células adequadas podem ser selecionadas do grupo de Bifidobacteriacea que compreende Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis e sub20 espécies das mesmas. Em particular, são preferidas as células classificadas como Bifidobacterium animalis subespécie lactis.

As referências à tetraciclina em relação a uma célula de Bifidobacterium sp. da presente invenção incluem aquelas descritas em relação aos métodos da presente invenção. Similarmente, a célula progenitora pode ser qualquer das mencionadas anteriormente em relação a uma célula progenitora útil em um método da presente invenção.

Em geral, são preferidas novas cepas bacterianas que possuem uma Concentração Inibidora Mínima (MIC) de antibiótico que é pelo menos 10 vezes menor que a MIC da cepa progenitora resistente a antibiótico.

Consequentemente, a Concentração Inibidora Mínima de antibiótico (MIC) da célula progenitora pode ser pelo menos 10 vezes maior que a MIC da célula sensível a antibiótico.

Em particular, a Concentração Inibidora Mínima (MIC) de tetraci-

clina da célula progenitora pode ser de pelo menos 10 microgramas de tetraciclina/mL e a MIC de célula da cepa sensível a antibiótico pode ser de 1 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

As células de Bifidobacterium sp. preferidas da presente invenção podem ser aquelas que possuem uma que é de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior, tal como 1 micrograma/mL ou até mesmo menor que 0,75 micrograma de tetraciclina/mL. O valor de MIC pode, em particular, ser como determinado através do método de seleção de susceptibilidade 10 com o teste E.

Tais cepas que portam um fertVmutado são modalidades particularmente preferidas da invenção.

A mutação de inativação do gene fetWque torna as novas cepas sensíveis às tetraciclinas podem ser tipicamente descritas em relação à se15 qüência do gene tertVda célula progenitora relevante.

Como descrito nos exemplos, as cepas sensíveis à tetraciclína adequadas com um tetW inativado podem ser conseguidas através da introdução de mutações específicas no gene tetW.

Em uma modalidade preferida da invenção, um códon de térmi20 no “opal” foi introduzido no tetW através da alteração de uma parte do tetW codificado por cromossomo caracterizada pela sequência TCG CTG GGA

TAC TTG AAC CAG AGT [SEQ ID 1] por TCG CTG GGA TAC TGA ACC

AGA GTT [SEQ ID 2], a base deletada no tetW funcional é indicada pelo sublinhado. Assim, uma célula de Bifidobacterium que compreende a se25 qüência: GGA TAC TGA ACC [SEQ ID 3] ou [ATACTGAA] em seu gene tetW é uma modalidade preferida da presente invenção. Foi também observado que o gene tetW poderia ser inativado e resultar na sensibilidade à tetraciclina, através da alteração da parte do tetW codificado por cromossomo que compreende a sequência: CAG AGC GTG GTT ÇAG TCT GTT CGG [SEQ ID 4] por CAG AGC GTG GTT TAG TCT GTT CGG [SEQ ID 5]. Esta mutação introduz um códon de término âmbar no tetW e a base mutada no tefW funcional está sublinhada. Tal Bifidobacterium que compreende a se-

qüência: GTG GTT TAG TCT [SEQ ID 6] ou [GGTTTAGT] em seu gene tetW e uma outra modalidade preferida da presente invenção. Uma cepa bacteriana ou a célula de Bifidobacterium sp. da presente invenção em que o gene tetW inativado ou mutado compreende pelo menos uma sequência selecio5 nada do grupo que consiste em, mas não limitada à SEQ ID NO: 3 [GGA

TAC TGA ACC], [ATACTGAA], SEQ ID NO: 6 [GTG GTT TAG, TCT], [GGTTTAGT], SEQ ID N^s: 27 [AC CAG CGT TTT C] e [CAGCGTTT] é também uma modalidade da presente invenção.

A introdução dos códigos de término “opal” e “âmbar” na região que codifica a proteína do gene tetW representa dois eventos moleculares diferentes. No caso da mutação “opal”, foi deletada uma base, enquanto que no caso da âmbar, uma base foi mutada {in casu do par C para T, isto é, uma transição de base).

Deve ser enfatizado que o tetW de uma Bifidobacterium pode 15 ser inativado através de outros tipos de mutações nos outros sítios de tetW.

Isto é ilustrado pela cepa mutante de Bifidobacterium Bb-12Tet-S180 em que o gene tetW compreende a SEQ ID NO: 27 [AC CAG CGT TTT C] que representa uma única transversão de base de uma A para uma C na posição

N°2731 na SEQ ID 22; e a DR10Tet-S33 e a Bb-12Tet-S79 que compreen20 dem várias mutações em tetW. DR10Tet-S33 compreende duas mutações no tetW descritas pela SEQ ID NO: 28 [CG CCC TGC CAC A] (ou [CCCTGCCA]) e pela SEQ ID NO: 29 [AT ATT GTC ATC A] (ou [ATTGTCAT]) e Bb-12Tet-S79 compreende três mutações descritas por SEQ ID NO:

[TA GAC GAT GGA A] (ou [GACGATGG]), SEQ ID NO; 31 [CG GTC

CGG GTA A] (ou [GTCCGGGT]) e SEQ ID NO: 32 [CT GAT CCG GCC TT] (ou [GATCCGGC]). Assim, em uma modalidade, a célula de Bifidobacterium sp. da presente invenção pode ser uma célula em que o gene tetW inativado ou mutado compreende uma das combinações de sequências mencionadas anteriormente.

Assim, a célula de Bifidobacterium sp. de acordo com a presente invenção pode ser uma célula, em que o gene tetW inativado ou mutado compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo da SEQ ID 3 [GGATACTGAACC], SEQ ID NO: 6 [GTGGTTTAGTCT], SEQ ID 25 [ATACTGAA], SEQ ID NO: 27 [ACCAGCGT TTTC], SEQ ID 28 [CGCCCTGCCACA], SEQ ID 29 [ATATTGTCATCA], SEQ ID 30 [TAGACGATGGAA], SEQ ID 31 [CGGTCCGGGTAA], SEQ ID 32 [CTGATCCG G CCTT], 5 [CAGCGTTT], [GACGATGG], [GTCCGGGT], [ATCCGGCC], [CCTGCCAC], [TTGTCATC], [GGTTTAGT], [GTGGACCG], [CGCCCATT] e [TCCGGCCC],

Em particular, a célula de Bifidobacterium sp. de acordo com a presente invenção pode ser uma célula em que o gene tetW inativado ou

mutado compreende as sequências [CCTGCCAC] e [TTGTCATC],

Em uma outra modalidade, a célula de Bifidobacterium sp. de acordo com a presente invenção pode ser uma célula em que o gene tetW inativado ou mutado compreende as sequências [GACGATGG], [GTCCGGGT] e [ATCCGGCC],

Até onde a cepa de Bifidobacterium contiver um tetW codificado por cromossomo mutado tornando a cepa sensível às tetraciclinas e que pode ser obtida através do método da presente invenção, as cepas sensíveis à tetraciclína resultantes são modalidades da presente invenção.

Uma indicação muito importante do fato de que uma cepa sensí-

vel à tetraciclína mutada particularmente contenha provavelmente um gene tetW mutado, é a determinação da Concentração Inibidora Mínima (MIC) da bactéria através do método de seleção de susceptibilidade com o teste E.

Como demonstrado no exemplo 12, as cepas mutadas podem ser classificadas em duas classes: Classe 1: cepas com uma MIC de 1,5 pg/mL ou inferior; e Classe 2: cepas com uma MIC > 1,5 pg/mL. Isto é utilizado em uma 25 modalidade do método de isolamento ue cepas que compreende as etapas de:

a) determinação da Concentração Inibidora Mínima (MIC) das bactérias através do método de seleção de susceptibilidade com o teste E,

b) com base no resultado da seleção de susceptibilidade com o teste E, dividindo as bactérias em duas classes:

Classe 1: bactérias com uma MIC de 1,5 pg/mL ou inferior de acordo com o teste E, e

Classe 2: bactérias com uma MIC acima de 1,5 pg/mL de acordo com o teste E: e

c) identificação e expansão de tais bactérias sensíveis a antibióticos identificadas b) como pertencentes à classe 1.

Em uma modalidade adicional a etapa c) pode incluir manter as bactérias sensíveis a antibióticos. Em particular, a etapa c) pode ser a identificação, a expansão e a manutenção de tais bactérias sensíveis a antibióticos identificadas em b) como pertencentes à classe 1 como uma nova cepa sensível a antibiótico. A modalidade mais preferida da presente invenção é a cepa bacteriana ou a célula de Bifidobacterium sp. da presente invenção, 10 que é identificada como Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa

CHCC8902 (Bb-12Tet-S139) e depositada em 28 de abril de 2005 de acordo com o Tratado de Budapeste no International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeílkulturen sob o número de acesso 15 DSM 17281. Esta cepa sensível à tetraciclina contém a mutação “opal” em seu tetW. Esta cepa é particularmente preferida por que é uma mutação das cepas probióticas bem-conhecidas de Bifidobacterium Bb-12®. Além disso, CHCC8902 contém uma deleção de uma única base em tet W caracterizada em uma taxa de reversão relativamente baixa menor que 1,6 x 10'⁹ a tor20 nando particularmente adequada para ingestão em grandes números (ver o

Exemplo 4). Como ilustrado in exemplo 9 e 10, a cepa sensível à tetraciclina Bb-12Tet-S139 preservou as características de uma cepa probiótica. Assim, em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a cepa bactériasna sensível à tetraciclina ou a célula de Bifidobacterium sp. da pre25 sente invenção é uma cepa probiótica.

Uma outra modalidade preferida da presente invenção é uma cepa bactériasna ou a célula de Bifidobacterium sp. da presente invenção que é identificada como Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC9070 (DR10Tet-S9X) e depositada em 28 de abril de 2005 de acordo 30 com o Tratado de Budapeste no International Recognition of the Deposit of

Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure junto a Deutsche

Sammlung von Mikroorganismen und Zeílkulturen sob o número de acesso

DSM17282. Esta cepa sensível à tetraciclina contém a mutação “âmbar” em seu tetW. Esta cepa é também preferida porque é uma mutação da cepa probiótica bem-conhecida de Bifidobacterium DR10® (CHCC7158).

CHCC9070 (DR10Tet-S9X) contém uma transição de uma única base em tetW. Como antecipado pela literatura existente sobre transições de bases, a taxa de reversão é maior, por exemplo, que de mutantes de deleção. No caso de CHCC9070 que contém a taxa de retromutação de 1,8 x 10‘⁸. Embora CHCC9070 seja mais susceptível à reversão que CHCC8902, a cepa é ain-

da relativamente estável e consequentemente adequada para ingestão.

Como mencionado, algumas Bifidobactérias podem servir como probióticos, isto é, como organismos não patogênicos, que possuem benefícios para a saúde quando tomados oralmente em alimentos ou cápsulas. Os alvos comuns da ação probiótica são distúrbios intestinais (por exemplo, diarréia dos viajantes, diarréia associada a antibióticos) ou sintomas intestinais (inchaço, flatulência, desconforto). Ainda, uma faixa mais ampla de benefícios (por exemplo, propriedades anticolesterolêmicas, anticarcinogênicas e imunoestimuladoras) é também discutida na literatura de probióticos.

Assim, em uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se ao uso de uma célula de Bifidobacterium sp. da presente invenção pa20 ra a preparação de um material que pode ser ingerido ou de uma cultura . bacteriana.

Assim, em uma modalidade adicional, a célula de Bifidobacterium sp. da presente invenção pode ser para uso como um probiótico.

Em particular, a célula de Bifidobacterium sp. da presente inven25 ção para uso como um probiótico pode estar na forma de um material que pode ser ingerido.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se ainda a um método de tratamento de um mamífero através da administração de uma célula de Bifidobacterium sp. de acordo com a presente invenção.

Em particular a célula de Bifidobacterium sp. pode ser fornecida no método na forma de um material que pode ser ingerido.

Os termos “trato gastrointestinal” ou “intestinal” são, no presente

contexto, utilizados de forma intercambiável e refere-sem tanto ao trato gastrointestinal superior quanto ao inferior que incluem a boca, o esôfago, o estômago, o intestino delgado incluindo o duodeno, o jejuno e o íleo e o intestino grosso que compreende o cólon e o ceco.

A cultura bacteriana pode, em uma modalidade adicional, ser adicionalmente processada.

As bactérias, isto é, a célula de Bifidobacterium sp., desta invenção podem ser fornecidas na forma de um produto alimentício fermentado ou em formas de dosagem formuladas na forma de comprimido (incluindo com10 primidos mastígáveis), uma cápsula (do tipo duro ou mole), um pó, um granulado, uma preparação líquida, uma suspensão, um suplemento oral seco, um suplemento oral úmido, uma formulação para alimentação em tubo seco ou uma formulação para alimentação em tubo úmido.

Em uma modalidade, o material que pode ser ingerido é um ali15 mento ou um produto alimentício fermentado preparado através do uso das Bifidobactérias da presente invenção. Consequentemente, em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se ainda um alimento ou a um produto alimentício que compreende uma célula bacteriana ou uma cepa de acordo com a presente invenção, isto é, uma célula de Bifidobacterium sp.

de acordo com a presente invenção.

O alimento ou o produto alimentício fermentado pode ser adicionalmente processado. Em um número de situações, foi relatado que as bactérias produzem compostos que promovem a saúde durante a fermentação. Em tais casos, podería ser vantajoso fracionar e/ou concentrar frações do 25 produto alimentício fermentado, roae-se ainda imaginar que, em certas situações, seria valioso processar adicionalmente o produto alimentício através de pasteurização, muito embora as Bifidobactérias benéficas sejam inativadas através de tal procedimento.

Entretanto, em geral, é considerado benéfico que o material que 30 pode ser ingerido compreenda Bifidobactérias vivas em uma quantidade de aproximadamente 10⁵ UFC/g até aproximadamente 10¹² UFC/g de material que pode ser ingerido, uma vez que as células vivas são um pré-requisito

para a obtenção do efeito probiótico.

É considerado que as Bifidobactérias da presente invenção podem ser utilizadas para a preparação de uma faixa ampla de materiais que podem ser ingeridos tais como leite, coalhada, produtos fermentados à base 5 de leite, leite acidificado, iogurte, frozen iogurte, leite em pó, pós à base de leite, queijo, produtos de queijo para espalhar, molhos, bebidas, sorvetes, sorvetes individuais sem palito ou picolés, produtos à base de cereais fermentados, fórmulas para bebês e leite de soja.

Uma modalidade importante adicional da presente invenção é o uso das Bifidobactérias da presente invenção para preparar uma composição para o tratamento ou para a prevenção de uma doença, síndrome ou estado de saúde ou para melhorar a digestão de nutrientes ou para melhorar o estado de saúde geral de um ser humano ou de um animal vertebrado.

Uma vez que as Bifidobactérias em geral são consideradas co15 mo organismos probióticos (Yazid, 2000) o uso de uma Bifidobactéria da presente invenção como um probiótico é uma modalidade preferida. A composição probiótica da presente invenção pode ser qualquer material que possa ser ingerido selecionado do grupo que consiste em leite, coalhada,

produtos fermentados à base de leite, leite acidificado, iogurte, frozen iogur20 te, leite em pó, pós à base de leite, concentrado de leite, queijo, produtos de queijo para espalhar, molhos, bebidas, sorvetes, produtos à base de cereais fermentados, fórmulas para bebês, comprimidos suspensões bacterianas líquidas, suplemento oral seco, suplemento oral úmido, alimentação em tubo seco ou alimentação em tubo úmido que são produzidos através do uso das 25 Bifidobactérias desta invenção.

Em uma modalidade adicional, a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Como utilizado aqui, o termo “veículo farmaceuticamente aceitável” significa um ou mais diluentes de recheio sólidos ou líquidos ou uma ou mais substâncias de encapsulamento que são 30 adequadas para a administração a um ser humano ou um animal que é/são compatíveis com os organismos probioticamente ativos. O termo “compatível” refere-se a componentes da composição farmacêutica que são capazes

de ser mesclados com o probiótico de uma maneira que não possibilita interação porque reduziría substancialmente a eficiência dos organismos selecionados para a invenção sob condições de uso comuns. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis têm que ter uma pureza suficientemente alta e uma 5 toxicidade suficientemente baixa para torná-los adequados para a administração a seres humanos e animais tratados.

Em modalidades úteis, o material que pode ser ingerido de acordo com a invenção é adequado para a prevenção ou para o tratamento de uma doença, síndrome ou estado de saúde selecionado do grupo que con10 siste em distúrbios associados a antibióticos, gastroenterite, diarréia incluindo a diarréia do viajante e a diarréia infantil aguda, intolerância à lactose, infecções gastrointestinais e colonização do trato gastrointestinal por bactérias patogênicas incluindo Helicobacter pylori e Clostridium difficile, síndrome do intestino irritável (IBS), doença inflamatória dos intestinos (IBD) e outras 15 síndromes imunomuduladoras, câncer de cólon, infecções e tumores urogenitais, infecções vaginais, alergia (especialmente eczema atópico), vacinação, colesterolemia e hipertensão.

Em modalidades adicionalmente úteis, o material que pode ser ingerido de acordo com a invenção é adequado para a prevenção ou para o 20 tratamento de infecções com agentes patogênicos tais como, por exemplo, Heliobacter pylori, Campylobacter pylori, Staphylococcus aureus, Staphyiococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Hemophilus influenzae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marces25 cens, Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas maltophilia, Salmonella sp.

e fungos tais como Candida albicans e Aspergiilus fumigatus e combinações destas espécies.

Nos últimos anos, rotavírus e outros vírus entéricos foram identificados como uma causa principal de diarréia infecciosa. De forma interes30 sante, tanto Bifidobacterium Bb-12® quanto HN019 (DR10®) mostraram prevenir ou tratar eficientemente infecções também com estes agentes patogênicos. Assim, em modalidades úteis, o material que pode ser ingerido de a

cordo com a invenção é utilizado para a prevenção ou para o tratamento de infecções com rotavírus e outros vírus entéricos.

Pode ser útil combinar dois ou mais dos organismos ativos probioticamente assumidos anteriores, tais como, por exemplo, uma preparação 5 que compreende uma espécie de Lactobacillus e uma espécie de Bifidobacterium.

Desempenho das cepas mutantes e seus benefícios aos seres humanos

A Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12® (CHCC5445), é uma cepa extremamente importante para a saúde e o bem-estar de mamífe10 ros por causa de suas capacidades probióticas (por exemplo, efeito estabilizador do sistema imunológico em seres humanos, controle de uma microflora equilibrada no trato digestivo reduzindo ou atuando assim como inibidores de várias síndromes epidemiológicas etc.). Ainda a Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 (DR10®, CHCC7158), possui um registro impressionan15 te de atividade probiótica. Embora ambas estas cepas carreguem um gene ativo que codifica resistência à tetraciclina, a resistência bacteriana a antibióticos mais proeminente encontrada na natureza (Chopra e Roberts, 2001), ambas foram utilizadas durante muitos anos na produção de alimentos e para o presente conhecimento sem causar qualquer dano. Ao contrário, a20 penas efeitos positivos foram atribuídos ao uso destas cepas. Entretanto, o . fato de que ambas as cepas contêm o tetW ativo em seu genoma não possui a possibilidade teórica de transferência da resistência à tetraciclina a outras - e talvez bactérias prejudiciais no sistema digestivo humano. O risco disso aumenta se as bactérias doadoras ingeridas sobreviverem nos intestinos em 25 grandes números, como no caso com o uso típico de bactérias probióticas. A inativação do gene tetW nas duas variações, como foi demonstrado aqui, elimina o risco de uma transferência horizontal de genes funcionais resistentes a antibióticos. Além da lesão no tetW, as duas cepas sensíveis à tetraciclina são provavelmente isogênicas as suas cepas-mãe, como sugerido no

Exemplo 5 e no Exemplo 6. Assim, pode ser assumido que as duas cepas sensíveis à tetraciclina possuem a maior parte, se não todas, das características que tornam Bb-12® e HN019 (DR10®) probióticas.

Em adição, testes de laboratório que envolvem eletroforese em gel bidimensional para a caracterização adicional das cepas mutantes estão sendo realizados para verificar a estrutura básica isogênica com as cepas do tipo selvagem.

Conclusão

1) - a inativação do gene de resistência à tetraciclina, tetW, de Bifidibacterium animalis ssp lactis Bb-12® e Bifidibacterium animalis ssp lactis HN019 (DR10®) foi estabelecida através de uma combinação do agente mutagênico intercalante, brometo de etídio e irradiação sucessiva com ultra10 violeta.

2) - cinco dos isolados sensíveis à tetraciclina resultantes originados de Bb-12 ® e de HN019 (DR10®) eram incapazes de crescer em caldo MRS com tetraciclina em uma concentração acima de 1,5 pg/mL.

3) - a caracterização de um dos isolados mutantes, Bb12Tet-139 (um derivado de CHCC5445) demonstrou uma alteração de quadro na posição de nucleotídeo N°2722 no gene tetW resultando imediatamente em um códon de término opal de 170 aminoácidos próximo ao produto gênico. No outro mutante, DR10Tet-S9X (um derivado de CHCC7158) um códon de término âmbar foi introduzido (posição de nucleotídeo N° 1741), 498 amino20 ácidos próximo do produto gênico.

4) - a taxa de reversão para Bb12Tet-S139 é menor que 1,6 x 10'⁹ e a taxa de retromutação para DR10Tet-S9x é de 1,8 x 10'⁸.

5) - o cultivo, as taxas de acidificação, o perfil de DNA e o transcriptoma (Exemplo 6) dos mutantes de tet W não eram diferentes das res- pectivas cepas do tipo selvagem.

6) - as análise dos isolados mutantes não divulgaram quaisquer rearranjos ou modificações, mas para tetW, do DNA genômico como julgado partindo das análises de fingerprinting do DNA e dos transcriptomas.

7) - os experimentos mostram que Bb12Tet-139 preservou mui30 tas das características probióticas de Bb-12 ®.

As Bifidobactérias e outras bactérias do ácido láctico são comumente utilizadas como culturas de partida que têm uma finalidade tecnológi-

ca na produção de vários alimentos. A indústria mais bem-conhecida que utiliza culturas de partida é a indústria de laticínios, mas as culturas de partida também são utilizadas em outras indústrias, por exemplo, na indústria de processamento de carne. Assim, uma modalidade da presente invenção é o 5 uso de uma cepa de Bifidobacterium de acordo com a invenção para a preparação de uma cultura de partida. As culturas de partida podem ser fornecidas na forma de culturas de partida congeladas ou secas em adição às culturas de partida líquidas. Em uma modalidade adicional, a cultura de partida pode ser seca por congelamento, seca por spray ou seca em leito fluidizado.

Uma composição de cultura de partida de acordo com a invenção compreende tipicamente bactérias de uma concentração de células viáveis, que fica na faixa de 10⁴ até 10¹² UFC por grama da composição. Um método conveniente de produção de uma cultura de partida congelada compreende as etapas a seguir: 1. cultivo de uma cepa bacteriana de acordo 15 com presente invenção, 2. coleta das células propagadas para fornecer uma cultura bacteriana concentrada, 3. congelamento do material bacteriano para a obtenção de material congelado e 4. embalamento do material seco por congelamento em um recipiente adequado. Similarmente, um método con-

veniente de produção de uma cultura de partida seca por congelamento 20 compreende as etapas a seguir: 1. cultivo de uma cepa bacteriana de acordo . com as reivindicações presentes na invenção, 2. coleta das células propagadas para fornecer uma cultura bacteriana concentrada, 3. congelamento do material bacteriano para a obtenção de material congelado, 4. sublimação da água do material congelado e 5. embalamento do material seco por con25 gelamento em um recipiente adequado. Ainda, é considerada uma cultura de partida seca por spray/leito fluidizado. O congelamento do material bacteriano pode ser convenientemente realizado mergulhando a cultura concentrada em nitrogênio líquido e coletando o material congelado.

Como descrito na WO 2005/003327 A1, é benéfico adicionar certos agentes crioprotetores a uma cultura de partida. Assim, uma composição de cultura de partida de acordo com a presente invenção pode compreender um ou mais agentes crioprotetores selecionados do grupo que

consiste em inosina-5’-monofosfato (IMP), adenosina-5'-monofosfato (AMP), guanosina-5’-monofosfato (GMP), uranosina-5’-monofosfato (UMP), citidina5’-monofosfato (CMP), adenina, guanina, uracila, citosina, adenosina, guanosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina, hopoxantina, orotidina, timidi5 na, inosina e um derivado de qualquer um de tais compostos.

A invenção apresentada na forma de reivindicações

Os aspectos e as modalidades da invenção podem ser apresentados na forma das assim chamadas reivindicações. Isto é fornecido abaixo.

1. Processo de isolamento a cepa de Bifidobacterium sp. (Bifido- bacteriacea) contendo um feM/mutado em seu cromossomo, a dita mutação tornando a cepa sensível às tetraciclinas e a dita cepa é isolada de uma cepa bacteriana progenitora resistente à tetraciclina em que o fenótipo de resistência a antibiótico é causado pela expressão de tetW integrado de forma estável em seu cromossomo, o dito processo compreendendo submeter as 15 células a um agente mutagênico químico e a um agente mutagênico físico.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o agente mutagênico químico compreende brometo de etídio (EtBr) e o agente mutagênico físico é UV.

3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que a cepa progenitora bacteriana resistente à tetraciclina é selecionada do grupo de cepas que consiste em Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC5445 (Bb-12®), depositada em 30 de setembro de 2003 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM 15954 e, Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa 25 CHCC7158, depositada em 28 de abril de 2005 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM 17280.

4. Processo de acordo com as reivindicações 1 até 3, em que o processo compreende uma seleção de mutantes sensíveis às tetraciclinas que são particularmente prováveis de conterem um gene tefWmutado, o dito processo de seleção compreendendo as etapas de:

a) determinação da Concentração Inibidora Mínima (MIC) das bactérias através do processo de seleção de susceptibilidade com o teste E,

b) divisão das bactérias em duas classes com base no resultado da seleção de susceptibilidade com o teste E:

Classe 2: bactérias com uma MIC acima de 1,5 pg/mL de acordo com the teste E; e

c) identificação, expansão e manutenção de tais bactérias sensíveis a antibióticos identificadas em b) com uma MIC de 1,5 pg/mL ou inferior (Classe 1) como uma nova cepa sensível a antibiótico.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que as tetraciclinas é a tetraciclina.

6. Processo de acordo com as reivindicações 1 até 5, em que a cepa bacteriana progenitora resistente à tetraciclina é uma cepa probiótica.

7. Processo de acordo com as reivindicações 1 até 6, em que a 15 cepa bacteriana sensível à tetraciclina é uma cepa probiótica.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1 até 7, em que o

processo compreende as etapas de:

1) cultura das células progenitoras para a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencial,

2) transferência de uma alíquota das células para meio fresco . contendo brometo de etídio (EtBr),

3) transferência da cultura para um ou mais recipientes para formar uma camada de cultura de 0,5-10 mm de espessura,

4) submissão da cultura a um tratamento com UV,

5) cultura das células mutadas para a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencial,

6) transferência de uma alíquota de bactérias para uma ou mais placas de Petri contendo um meio de crescimento com ágar adequado, a alíquota de bactérias sendo selecionada para fornecer colônias isoladas

7) identificação de tais colônias que adquiriram sensibilidade a antibiótico através do plaqueamento de réplicas nas placas de Petri com e sem antibiótico e

8) isolamento, expansão e manutenção de tais colônias sensí-

veis a antibiótico identificadas como uma nova cepa sensível a antibiótico.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a cultura subseqüente à etapa 4) é submetida a uma etapa de enriquecimento em relação a mutações que comprende as etapas de:

4a) transferência de uma alíquota da cultura tratada com UV para meio fresco contendo uma dose de um análogo de penicilina que é prejudicial às células em crescimento exponencial, mas tolerável pelas células que não estão em crescimento e

4b) cultura das células no meio que compreende o dito análogo de penicilina sob condições, que promoveríam o crescimento exponencial na ausência de penicilina ou de um análogo de penicilina tal como a ampicilina.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a cultura é realizada a uma tensão de oxigênio reduzida.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tratamento com UV da etapa 4) reduz o número de células vivas medido através das Unidades Formadoras de Colônia (UFCs) até menos que 20% em relação ao número das UFCs da cultura imediatamente antes do tratamento com UV.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 10, em que o análogo de penicilina é a ampicilina que é utilizada a uma dose de 50-300 microgramas/mL de meio.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as tetraciclinas são um antibiótico selecionado do grupo 25 de tetraciclina, terramicina, demeciociciina, meciociciina, doxicicli- na/doxiciclina, limeciclina, metaciclina, minociclina, oxitetracidina, rolitetraciclina, aureomicina e outras clortetraciclinas.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a cepa progenitora é selecionada do grupo de Bifidobac30 teriaceas que compreende Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenuiatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis e subespécies das mesmas.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações

anteriores, em que a cepa progenitora é uma cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) do antibiótico da cepa progenitora é pelo menos 10 vezes maior que a MIC da cepa sensível a antibiótico.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) da tetraciclína da cepa progenitora é de pelo menos 10 microgramas/mL e a MIC da tetraciclina da cepa sensível a antibiótico é de 1 micrograma/mL ou inferior.

18. Cepa de Bifidobacterium sp. que contém um tetW codificado por cromossomo mutado que torna a cepa sensível às tetraciclinas que pode ser obtida através do processo de qualquer uma das reivindicações anteriores.

19. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 18, em que as tetraciclinas são um antibiótico selecionado do grupo de tetraciclina, terramicina, demeclociclina, meclociclina, doxiciclina/doxiciclina, limeciclina, metaciclína, minociclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, aureomicina e

outras clortetraciclinas.

20. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 ou 19, em que a cepa progenitora é selecionada do grupo de Bifidobacteriaceas que compreende Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis e subespécies das mesmas.

21. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 20, em que a cepa progenitora é uma cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis.

22. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 21, em que a cepa progenitora é Bifidobacterium ani30 malis subespécie lactis cepa CHCC5445 (Bb-12®), depositada em 30 de setembro de 2003 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM15954.

23. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 22, em que a cepa progenitora é Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC7158, depositada em 28 de abril de 2005 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o 5 número de acesso DSM 17280.

24, Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 23, em que a Concentração Inibidora Mínima de antibiótico (MIC) da cepa progenitora é pelo menos 10 vezes maior que a MIC da cepa sensível a antibiótico.

25. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 23, em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) da tetraciclina da cepa progenitora é de pelo menos 10 microgramas/mL e a MIC da cepa sensível a antibiótico é de 1 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

26. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 23, caracterizada pelo fato de que é susceptível a uma concentração de tetraciclinas que é 1,0 pg/mL ou inferior de acordo com o ensaio de seleção da susceptibilidade com o teste E.

27. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 25, em que o gene tetWcompreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo da SEQ ID 3 [GGA TAC TGA ACC], da SEQ ID NO: 6 [GTG GTT TAG TCT] e da SEQ ID NO: 27 [AC CAG CGT TTT C],

28. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 27, em que o gene tetWcompreende a SEQ ID 3 [GGA TAC TGA ACC].

29. Cepa de Bifidobacterium ue acordo com a reivindicação 27, em que o gene tetWcompreende a SEQ ID NO: 6 [GTG GTT TAG TCT].

30. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 27, em que o gene tetWcompreende a SEQ ID NO: 27 [AC CAG CGT TTT C].

31. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 25, em que o gene tefU/compreende as seqüências da SEQ ID NO: 28 [CG CCC TGC CAC A] e da SEQ ID NO; 29 [AT ATT GTC ATC A],

Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das

reivindicações 18 até 25, em que o gene fôtWcompreende as sequências da SEQ ID NO: 30 [TA GAC GAT GGA A], da SEQ ID NO: 31 [CG GTC CGG GTA A] e da SEQ ID NO: 32 [CT GAT CCG GCC TTJ.

33. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 18, que é identificada como Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC8902 (Bb-12Tet-S139) e depositada em 30 de abril de 2005 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeílkulturen sob o número de acesso DSM17281.

34. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 18, que é identificada como Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC9070 (DR10Tet-S9X) e depositada em 28 de abril de 2005 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeílkulturen sob o número de acesso DSM 17282.

35. Cepa de Bifidobacterium que é sensível às tetraciclinas por causa de uma mutação no tetW a dita cepa Bifidobacterium sendo derivada de uma cepa progenitora que é resistente às tetraciclinas por causa da presença de um tetWlocalizado no cromossomo.

36. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 35, em que as tetraciclinas são um antibiótico selecionado do grupo que consis. te em tetraciclina, terramicina, demeclociclina, meclociclina, doxiciclina/doxiciclina, limeciclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, aureomicina e outras clortetraciclinas.

37. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das 25 reivindicações 35 ou 36, em que a cepa progenitora é selecionada do grupo que consiste em Bifidobacteriacea compreendendo Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis e subespécies das mesmas.

38. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das 30 reivindicações 35 até 37, em que a cepa progenitora é uma cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis.

39. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das

reivindicações 35 até 38, em que a cepa progenitora é Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC5445 (Bb-12®), depositada em 30 de setembro de 2003 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuituren sob o número de acesso DSM15954.

40. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 39, em que a cepa progenitora é Bifidobacterium animaüs subespécie lactis cepa CHCC7158, depositada em 28 de abril de 2005 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuituren sob o número de acesso DSM 17280.

41. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 40, em que a Concentração Inibidora Mínima de antibiótico (MIC) da cepa progenitora é pelo menos 10 vezes maior que a MIC da cepa sensível a antibiótico.

42. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das 15 reivindicações 35 até 40, em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) da tetraciclina da cepa progenitora é de pelo menos 10 microgramas/mL e a MIC da cepa sensível a antibiótico é de 1 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

43. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das 20 reivindicações 35 até 42 ou das reivindicações 72 até 74, em que o gene tetWcompreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo da SEQ ID 3 [GGA TAC TGA ACC], da SEQ ID NO: 6 [GTG GTT TAG TCT] e da SEQ ID NO: 27 [AC CAG CGT TTT C].

44. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das 25 reivindicações 35 até 42 ou das reivindicações 72 até 74, em que o gene tetW compreende as seqüências da SEQ ID NO: 28 [CG CCC TGC CAC A] e da SEQ ID NO: 29 [AT ATT GTC ATC A],

45. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 42 ou das reivindicações 72 até 74, em que o gene tetWcompreende as seqüências da SEQ ID NO: 30 [TA GAC GAT GGA A], da SEQ ID NO: 31 [CG GTC CGG GTA A] e da SEQ ID NO: 32 [CT GAT CCG GCC TT].

Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 43,

em que o gene tetWcompreende a SEQ ID NO: 3 [GGA TAC TGA ACC).

47. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 43, em que o gene tetWcompreende a SEQ ID NO: 6 [GTG GTT TAG TCT],

48, Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 43, em que o gene tetWcompreende a SEQ ID NO: 27 [AC CAG CGT TTT Cj.

49. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 46 ou das reivindicações 72 até 74, que é identificada como Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC8902 (Bb-12Tet-

S139) e depositada em 28 de abril de 2005 junto a Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM 17281.

50. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 45, da reivindicação 47 ou das reivindicações 72 até 74, que é identificada como Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa

CHCC9070 (DR10Tet-S9X) e depositada em 28 de abril de 2005 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM 17282.

51. Uso de uma cepa de Bifidobacterium como definida em qualquer uma das reivindicações 18 até 50, para a preparação de um mate- rial que pode ser ingerido ou de uma cultura bacteriana.

52. Uso de acordo com a reivindicação 51, em que a cultura bacteriana é adicionalmente processada.

53. Uso de acordo com a reivindicação 51, em que o material que pode ser ingerido é um alimento ou um produto alimentício fermentado.

54. Uso de acordo com a reivindicação 53, em que o alimento ou o produto alimentício fermentado é adicionalmente processado.

55. Uso de acordo com a reivindicação 51, em que o material que pode ser ingerido compreende Bifidobactérias em uma quantidade de aproximadamente 10⁵ UFC/g até aproximadamente 10¹² UFC/g de material que pode ser ingerido.

56. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 até

55, em que o material que pode ser ingerido é uma composição selecionada

do grupo que consiste em leite, coalhada, produtos fermentados à base de leite, leite acidificado, iogurte, frozen iogurte, leite em pó, pós à base de leite, concentrado de leite, queijo, produtos de queijo para espalhar, molhos, bebidas, sorvetes, produtos à base de cereais fermentados, formulas para bebês 5 e leite de soja.

57. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 até

56, em que o material que pode ser ingerido é utilizado para a preparação de uma composição para o tratamento e/ou para a prevenção de uma doença, síndrome ou estado de saúde ou para melhorar a digestão de nutrientes ou 10 para melhorar o estado de saúde geral de um ser humano ou de um animal vertebrado.

58. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 até

57, em que o material que pode ser ingerido é utilizado como um probiótico.

59. Uso de acordo com as reivindicações 51 ou 58, em que o material que pode ser ingerido é uma composição selecionada do grupo que consiste em leite, coalhada, produtos fermentados à base de leite, leite acidificado, iogurte, frozen iogurte, leite em pó, pós à base de leite, concentrado de leite, queijo, produtos de queijo para espalhar, molhos, bebidas, sorvetes, produtos à base de cereais fermentados, fórmulas para bebês, comprimidos, 20 cápsulas, suspensões bacterianas líquidas, suplemento oral seco, suplemento oral úmido, alimentação em tubo seco ou alimentação em tubo úmido.

60. Uso de acordo com a reivindicação 51, em que a dita doença, síndrome ou estado de saúde é selecionada do grupo que consiste em distúrbios associados a antibióticos, gastroenterite, diarréia incluindo a diar- réia dos viajantes c a diarréia infantil aguda, intolerância à iactose, infecções gastrointestinais e colonização do trato gastrointestinal por bactérias patogênicas incluindo Helicobacter pylori e Clostridium difficile, síndrome do intestino irritável (IBS), doença inflamatória dos intestinos (IBD), câncer de cólon, infecções e tumores urogenitais, infecções vaginais, alergia (especialmente 30 eczema atópico), vacinação, colestrolemia e hipertensão.

61. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 até

60, em que o material que pode ser ingerido é adequado para a prevenção

ou para o tratamento de infecções por agentes patogênicos.

62. Alimento ou produto alimentício que compreende a cepa bacteriana como definida em qualquer uma das reivindicações 18 até 50.

63. Uso de uma cepa de Bifidobacterium como definida em qualquer uma das reivindicações 18 até 50, para a preparação de uma cultura de partida.

64. Uso de acordo com a reivindicação 63, em que a cultura de partida é congelada.

65. Uso de acordo com a reivindicação 63, em que a cultura de 10 partida é seca por congelamento.

66. Uso de acordo com a reivindicação 63, em que a cultura de partida é seca por spray/em leito fluidizado.

67. Composição de cultura de partida que compreende a bactéria de qualquer uma das reivindicações 18 até 50, preferencialmente em que a composição de cultura de partida possui uma concentração de células viáveis, que está na faixa de 10⁴ até 10¹² UFC por grama da composição.

68. Composição de cultura de partida de acordo com a reivindicação 67, que em adição compreende um ou mais agentes crioprotetores selecionados do grupo que consiste em inosina-5’-monofosfato (IMP), ade- nosina-5’-monofosfato (AMP), guanosina-5’-monofosfato (GMP), uranosina. 5’-monofosfato (UMP), citidina-5’-monofosfato (CMP), adenina, guanina, uracila, citosina, adenosina, guanosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina, hipoxantina, orotidina, timidina, inosina e um derivado de qualquer um de tais compostos.

69. Processo para a produção de urna cuitura de partida congelada que compreende as etapas a seguir:

1. cultura de uma cepa bacteriana como definida nas reivindicações 18 até 50

2. coleta das células propagadas para fornecer uma cultura bac- teriana concentrada,

3. congelamento do material bacteriano para a obtenção de material congelado e

4. embaiamento do material seco por congelamento em um reci- piente adequado.

70. Processo para a produção de uma cultura de partida seca por congelamento que compreende as etapas a seguir:

1. cultura de uma cepa bacteriana como definida nas reivindicações 18 até 50

2. coleta das células propagadas para fornecer uma cultura bacteriana concentrada,

3. congelamento do material bacteriano para a obtenção de ma- terial congelado,

4. sublímação da água do material congelado e

5. embaiamento do material seco por congelamento em um recipiente adequado.

71. Processo de acordo com as reivindicações 69 ou 70, em que etapa 3 é realizada mergulhando a cultura concentrada em nitrogênio líquido e coletando o material congelado.

72. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 42, em que o gene tetW compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo de [ATACTGAA], [GGTTTAGT] e [CAGCGTTT],

73. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 42, em que o gene tetW compreende as sequências [CCCTGCCA] e [ATTGTCAT],

74. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das 25 reivindicações 35 até 42, em que o gene tetW compreende as sequências [GACGATGG], [GTCCGGGT] e [GATCCGGC].

A invenção é ilustrada nos exemplos e nas tabelas não limitantes a seguir, em que a Tabela 1 é uma descrição dos oligonucleotídeos utilizados para as análises de PCR e para o seqüenciamento do DNA do gene 30 tetW que codifica resistência à tetraciclina de Bb-12® e HN019.

A Tabela 2 é a sequência de DNA de tetWe o gene da transposase a montante, tps, de Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12® (SEQ

ID 22). A sequência de nucleotídeos do gene TetWe as regiões flanqueadoras de Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12®.

A sequência foi obtida através do seqüenciamento em Chr. Hansen A/S. A montante fica o quadro aberto de leitura que codifica a transpo5 sase, nt N° 4-966, com o aminoácido representado sob a sequência de DNA (M. W. aprox. 35 kDa). A seqüência de nt. N° 1318-3234 é o gene que codifica resistência à tetraciclína, tetW, com o aminoácido sublinhado sob a se-

quência de DNA. (M. W. aprox. 70 kDa).

A mutação âmbar na posição de nucleotídeo (nt) N° 1741 (nt N°

424 em relação ao códon de início de tetW) para a cepa sensível à tetraciclina, DR10Tet-S9X (CHCC9070), é indicada acima da seqüência de DNA. A mutação de alteração de quadro na posição de nt N° 2722 (nt N°1405 em relação ao códon de início) para a cepa sensível à tetraciclína, Bb12TetS139 (CHCC8902), é indicada acima da seqüência de DNA.

*): indica um códon de término.

Tabela 8-1: Lista de cepas de referência utilizadas para verificar a detecção específica de Bb-12Tet-S139.

Tabela 9-1: Condições para o teste de estabilidade de culturas secas por congelamento.

Tabela 9-2: Sobrevivência de culturas secas por congelamento (%).

Tabela 10-1. Sobrevivência em juco gástrico artificial (%). Média de três experimentos.

Tabela 11-1. Tolerância aos ácidos biliares. Crescimento bacteriano em placas de ágar MRS-Cisteína HCI suplementadas com 2 % p/v de 25 sais biliares.

Tabela 12-1, Concentrações Inibidoras Mínimas (MICs) de tetraciclina de cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis e dois derivados das mesmas.

Tabela 13-1. Concentrações Inibidoras Mínimas (MICs) de tetra30 ciclina Bb-12 e 3 novos derivados das mesmas.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Inativação do gene feflVem duas cepas probióticas de Bifidobac47

teríum animalis subespécie lactis que expressam resistência à tetraciclina.

Uma abordagem mutagênica forte e dual foi utilizada para inativar a resistência intrínseca à tetraciclina do genoma de Bifídobacerium animalis ssp. lactis cepa Bb-12® e cepa HN019 (DR10®). Isto incluía o trata5 mento das células com o agente mutagênico, brometo de etídio (EtBr) seguido pela irradiação de ultravioleta em uma escala mais forçada que a normal quando os agentes mutagênicos são utilizados individualmente.

Cepas e condições de cultura.

As cepas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12® 10 e HN019 (DR10®) foram obtidas da coleção de culturas de Chr. Hansen A/S, Horsholm, Denmark. A cepa Bb-12® de B. animalis subsp. lactis tem o número de acesso CHCC5445 na coleção de culturas de Hansen e é depositada junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) sob o número de acesso DSM 15954, A cepa HN019 (DR10®) B.

animalis subsp. lactis foi isolada de um produto com fórmula para bebês disponível comercialmente rotulado Femleaf DR-10 bifidus e vendido na Tailândia durante 2000. Possui o número de acesso CHCC7158 na coleção de culturas de Hansen e é depositada junto a DSMZ sob o número de acesso DSM 17280.

As duas cepas que são resistentes à tetraciclina (pelo menos 15 pg/mL, como determinado pelo procedimento com o teste E, Danielsen e Wind, 2003), foram cultivadas rotineiramente sob condições anaeróbicas a 37°C em caldo Difco-MRS (deMan 1960), suplementado com 0,05% de cloridrato de Cisteína (Cisteína-HCI, Merck chemicals) assim como em ágar

MRS (1,5% de ágar) com a mesma concentração de Cisteína-HCI e 15 pg de tetraciclina por mL.

Tratamento mutagênico de Mutaqenic de Bb-12

Uma alíquota (2%) de uma Bb-12® cultivada durante a noite (on) em MRS foi transferida para caldo MRS fresco (10 mL sem tetraciclina) con30 tendo 20 pg/mL de brometo de etídio (EtBr) e incubada até a densidade óptica [DO] a 600 nm, de 0,35. As células em crescimento exponencial foram então submetidas à irradiação com UV (reticulador com UV, Stratagene) em

uma placa de Petri aberta durante 5 min (70 mJ/cm²). O tratamento com UV foi repetido uma vez após um intervalo de escuridão de 5 min à temperatura ambiente. O tratamento foi ajustado para a obtenção de uma letalidade de aproximadamente 90%. A letalidade foi avaliada como a seguir: A viabilidade 5 das células imediatamente após os tratamentos com EtBr-UV foi determinada através do plaqueamento das células em ágar MRS sem tetraciclina e a letalidade foi calculada partindo da UFC observada.

Um mL da cultura que sofreu mutagênese foi então transferido para 9 mL de MRS fresco sem a adição de EtBr e foi então permitido que 10 crescesse durante um período de 16 horas a 37°C em escuridão completa, em cujo ponto as alíquotas das células tratadas foram inoculadas novamente (1% [vol/vol]) em caldo MRS fresco e permitidas que crescessem durante mais 16 horas.

Exemplo 2: Seleção de variações sensíveis à tetraciclina de duas cepas pro15 bióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis.

Procedimento de seleção

A seleção em relação a isolados sensíveis à tetraciclina foi reali, zada após um procedimento de enriquecimento com ampicilina (Miller, 1972) adaptado para Bífidobacteriae ter sido realizado. Sucintamente, o procedi20 mento com ampicilina foi realizado através da transferência de uma alíquota . (1 %) da cultura que sofreu mutagênese com crescimento superado para meio MRS fresco (10 mL) e cultivando as células até uma DOeoo de 0,2 sem a adição de tetraciclina. 0,5 mL desta cultura foi utilizado para inocular 10 mL do caldo MRS contendo 10 microgramas de tetraciclina/mL e incubado du25 rar.te 2 h a 37°C à tensão de oxigênio reduzida, após o que a ampicilina foi adicionada a uma concentração final de 150 microgramas/mL e a cultura foi incubada continuamente durante 16 h a 37°C. Como a ampicilina mata apenas células em crescimento (isto é, células Tet^R) e não as células que não estão se dividindo (isto é, células Tet^s mutantes), a adição da ampicilina po30 de ser considerada uma etapa de enriquecimento para o isolamento subsequente de mutantes Tet^s. As células foram coletadas por centrifugação (4.000 x G durante 5 min a 4°C) e lavadas duas vezes com caldo MRS fresco.

Após o enriquecimento com ampicilina, a seleção em relação a isolados sensíveis à tetraciclina foi realizada através do plaqueamento das alíquotas das células lavadas sobre ágar MRS em uma diluição apropriada para fornecer aproximadamente 150 colônias por placa após a incubação a 5 37°C durante 20 horas.

As colônias sensíveis à tetraciclina foram identificadas por plaqueamento de réplicas em ágar MRS sem antibióticos e ágar MRS contendo 10 pg de tetraciclina por mL, sobre o qual os isolados sensíveis à tetraciclina eram incapazes de crescer. Finalmente, as colônias sensíveis à tetraciclina 10 foram cultivadas em caldo MRS. O DNA genômico total foi isolado tanto dos clones sensíveis à tetraciclina quanto da cepa resistente à tetraciclina para caracterização intensiva. A seleção das réplicas resultou em 155 isolados sensíveis à tetraciclina de CHCC5445 de um total de aproximadamente 4.000 colônias verificadas. De CHCC7158, foram isoladas 43 colônias sen15 síveis à tetraciclina de aproximadamente 1.000 células. Todas estas colônias foram adicionalmente testadas em caldo MRS líquido contendo tetraciclina (10 pg/mL). Uma fração substancial de falsos positivos (aprox. 85 %) conseguiu crescer sob estas condições. Os isolados sensíveis à tetraciclina restantes foram submetidos à seleção de susceptibilidade com o teste E para 20 determinar seu limite de sensibilidade à tetraciclina.

O teste E foi realizado de acordo com o método do fabricante (AB BIODISK, Suécia), ligeiramente modificado por M. Danielsen e A. Wind (2003). Sucintamente, a determinação do valor da Concentração Inibidora Mínima (MIC) para os isolados individuais foi realizada mergulhando um 25 swab de algodão esterilizado dentro de uma cultura crescida durante a noite da cepa sensível à tetraciclina que devia ser testada e esfriando a superfície inteira de uma placa de ágar MRS (diâmetro: 8,5 cm) igualmente em três direções. Após secar o inóculo aplicado, uma tira de teste E foi aplicada na superfície do ágar através do auxílio de um aplicador manual com a escala 30 de MIC voltada para cima. As placas foram inoculadas de forma anaeróbica durante a noite em uma posição invertida a 37 °C. O valor da MIC foi determinado através da leitura do valor em que o limite da elipse de inibição inter

secta a tira Na maior parte dos casos variava entre 2 e 4 pg/mL. Apenas dois isolados, um derivado de CHCC5445, chamado de Bb12Tet-S139 e um derivado de CHCC7158, chamado de DR10Tet-S9X, demonstraram uma

sensibilidade maior à tetraciclina com um valor de MIC de 0,5 pg/mL

Exemplo 3: Caracterização molecular dos derivados sensíveis à tetraciclina de duas cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis. Amplificação pela PCR e seqüenciamento do DNA do gene tetW

O DNA genômico foi preparado partindo de Bb-12® do tipo selvagem e dos dois isolados sensíveis à tetraciclina através do uso do proto10 colo Easy-DNA para o isolamento do DNA de bactérias gram-positivas de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen).

O gene tetW das variações sensíveis foi caracterizados através de análises da PCR de acordo com o protocolo de Innis e Gelfand (1990) e o DNA foi seqüenciado para testar em relação a mutações possíveis em tal 15 gene. O quadro aberto de leitura inteiro (ORF, aprox. 2,0 kb) de tetWfoi amplificado partindo de cada isolado em três fragmentos sobrepostos (A, B e C) com três conjuntos de iniciadores (tabela 1, tabela 2).

O Fragmento A (aprox. 785 pb) foi amplificado com o iniciador senso: tefWk.DI, derivado de uma seqüência de 296 pb a montante do có20 don de início do gene tetW e o iniciador anti-sentido: teM6cR2, derivado do . ORF de tetW. O Fragmento B (aprox. 935 pb) foi amplificado com o iniciador senso: tefWk.D4 e o iniciador anti-sentido; teMóc.R5 do ORF de tetW. O

Fragmento C (920 pb) foi amplificado com o iniciador senso: tert/lócD3 derivado do ORF e o iniciador anti-sentido: teM6cR4 262 pb a jusante do códon 25 de término do gene tetW.

Os fragmentos amplificados partindo das três reações de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose (0,7%) e à coloração em EtBr e foram identificados com iluminação com UV. As bandas correspondendo aos três fragmentos gênicos amplificados foram cortadas do gel e o 30 DNA foi extraído (kit de extração do gel QIAquick da Qiagen). Os produtos da PCR purificados foram clonados no vetor plasmideal, pCR2.1-TOPO (Invitrogen), para a determinação da sequência de nucleotídeos utilizando os

iniciadores para frente e para trás M13. O seqüenciamento do DNA dos genes tetW de cada um dos isolados sensíveis à tetraciclina individuais com valores do teste E de 2-4 pg/mL demonstrou que o gene de resistência à tetraciclina não tinha sido afetado ou mutado nestes isolados e era 100% ho-

mólogo ao gene tetWna Bb-12® do tipo selvagem representada na Tabela 2.

O seqüenciamento dos genes tetW dos dois isolados com valores do teste E para tetraciclina de 0,5 pg tetraciclina/mL mostrou que em ambos os casos o gene tetWfoi afetado. O Bb12Tet-S139 (um derivado de CHCC5445) demonstrou uma alteração de quadro na posição de nucleotí10 deo N°2722, em que um resíduo de timidina foi deletado como ilustrado abaixo na Tabela 2.

Seqüência de aminoácidos: - Ser Leu Gly Tyr Leu Asn Gin Ser

Bb-12® (CHCC5445) nt N° 2710: - TCG CTG GGA TAC TTG AAC CAG AGT Bb12Tet-S139 (CHCC8902) nt N° 2710: - TCG CTG GGA TAC

TGA ACC AGA GTT -

Seqüência de aminoácidos: - Ser Leu Gly Tyr opal (códon de término).

A ilustração acima mostra uma seqüência parcial do gene tetW em CHCC5445. O resíduo de timina sublinhado em Bb-12® (nt: 2722 na se20 qüência de tetW) é deletada no mutante de alteração de quadro, Bb12TetS139, resultando em um códon de término opal/sem sentido 170 aminoácidos próximo ao produto do gene tetWdo tipo selvagem, [nt N°2722 possui o número de posição de nt N° 1405 na seqüência de tetW na Tabela 2, SEQ ID 22],

O seqüenciamento do DNA do gene tetW do outro isolado sensível à tetraciclina DR1OTet-S9X, um derivado da cepa HN019 (CHCC7158), demonstrou uma transição de uma citidina para um resíduo de timidina na posição de nucleotídeo N° 174, gerando imediatamente assim um códon de término da tradução âmbar como apresentado na Tabela 2.

Seqüência de aminoácidos: - Gin Ser Vai Vai Gin Ser Vai Arg DR10® (HN019, CHCC7158) nt N° 2729: -CAG AGC GTG GTT ÇAG TCT GTT CGG-

DR10Tet-S9X (CHCC9070) nt N° 2729: CAG AGC GTG GTT

TAG TCT GTTCGG -

Sequência de aminoácidos: - Gin Ser Vai Vai âmbar (códon de término).

A ilustração anterior mostra uma seqüéncia parcial do gene tetW em CHCC7158, que é idêntica ao gene tetW em CHCC5445. O resíduo de citidina sublinhado em HN019 (nt: 1741) é substituído por um resíduo de timidina na cepa mutante, resultando em um códon de término âmbar/sem sentido 498 aminoácidos próximo ao produto gênico teWdo tipo selvagem, 10 [nt N° 1741 possui a posição de nt número N° 424 na sequência de DNA de tetW na Tabela 2, SEQ ID 22],

Exemplo 4: Estabilidade genética dos isolados sensíveis à tetraciclina Bb12Tet-S139 (CHCC8902), DR10Tet-S9X(CHCC9070) e Bb12Tet-S180.

Determinação das taxas de retromutacão através do plaqueamento das célu15 Ias em ágar MRS com tetraciclina

Um mL de uma cultura da cepa mutante Bb12Tet-S139 (1,6 x 10*⁹ células/mL) cultivado durante a noite foi espalhado com 50 μΙ_ cada sobre 20 placas de Petri (diâmetro: 13,8 cm) com ágar MRS suplementado com tetraciclina (15 pg/mL). Após 24 horas de incubação anaeróbica a 37°C, 20 nenhuma colônia podia ser detectada sobre as placas demonstrando que a . taxa de reversão é menor que 1,6x10'⁹.

O mesmo teste de estabilidade foi realizado para a cepa DR10Tet-S9X. Uma cultura crescida durante a noite desta cepa (1,1 x 10'⁹células/mL) foi similarmente espalhada com 50 pL cada sobre 20 placas de 25 Petri com ágar MRS suplementado com tetraciclina (15 pg/mL). Após o período de incubação, foram detectadas 19 colônias resistentes à tetraciclina. A taxa de reversão para a mutação âmbar foi calculada em 1,8 x 10'⁸.

A taxa de reversão para a cepa Bb12Tet-S180 foi calculada em 1,7 x 10'⁷.

Exemplo 5: Testes fisiológicos e fenotípicos das duas cepas sensíveis à tetraciclina, Bb12Tet-S139 (CHCC8902) e DR10Tet-S9X(CHCC9070). Condições de crescimento de cepas mutantes em caldo MRS.

O crescimento da Bb12Tet-S139 e da DR10Tet-S9X foi comparado (em triplicatas) com suas cepas-mãe, CHCC5445 e CHCC7158, respectivamente, cultivadas sob condições similares em caldo MRS (200 mL com Cisteína-HCI) ao longo de um período de 24 horas. As amostras para a 5 medida da densidade óptica a 600 nm foram todas monitoradas ao longo do período de incubação. As taxas de crescimento para ambos os mutantes

eram similares àquelas das cepas do tipo selvagem parentais indicando que o tratamento mutagênico dos isolados sensíveis à tetraciclina não parecia impedir os genes em suas vias fermentativas.

Taxas de acidificação dos dois mutantes de tetW.

A acidificação (caldo MRS), isto é, a conversão do piruvato em ácido láctico, foi monitorada (em duplicatas) ao longo de um período de 6 horas e comparada com a das cepas-mãe respectivas crescidas sob as mesmas condições. Não foi observada qualquer diferença óbvia na taxa de 15 acidificação entre os derivados mutantes de CHCC5445 e CHCC7158 e suas cepas-mãe.

Análise de impressão digital fingerprintinq do DNA.

A eletroforese em gel em campo pulsado do DNA genômico digerido com Spel e Xbal proveniente das duas cepas tetW mutantes foi reali20 zada de acordo com os métodos padronizados (Hung e Bandziulis, 1990) e não revelou qualquer rearranjo do padrão cromossômico digerido com Spel ou com Xbal quando comparado como o das respectivas cepas do tipo selvagem. Isto adiciona evidência a uma estrutura básica isogênica global dos mutantes e das cepas-mãe.

Exemplo 6: A análise da expressão gênica do genoma inteiro (transcriptòmica) mostra que a expressão gênica de Bb12Tet-S139 é indistinguível da de Bb-12®

Materiais & Métodos

Planejamento e produção de microarranjos de genoma inteiro para Bb12

Os presentes inventores seqüenciaram previamente e montaram microarranjos de genoma inteiro para Bb12® (Garrigues e outros 2005). Sucintamente, Bb-12® foi seqüenciado com pistola, resultando em 56 contí

guos Através da análise adicional das montagens, era evidente que apenas dois por cento das sequências estavam faltando. Dentro de quase 2,0 Mb da sequência do genoma, foram identificadas 1612 supostas CDSs (sequências codificadoras). Um oligo específico de 65-75mer foi planejado para cada ge5 ne com algumas exceções, tais como supostos genes muito pequenos. Para dois genes, foram planejados vários oligos. Em um todo, foram planejados 1569 oligos partindo da sequência. Em adição, foram planejados mais de 100 oligos de controle. Os oligos foram “impressos” sobre lâminas UltraGAPS (Corning B. V., Schiphol-Rijk, Holanda) em quatro cópias em réplica 10 como descrito anteriormente (Pedersen e outros 2005).

As amostras de RNA foram coletadas em RNAprotect (QIAGEN, Valencia, CA, USA) para estabilizar um perfil de expressão e o RNA total foi isolado (RNeasy, QIAGEN). 10 pg de RNA foram copiados em cDNA utilizando o CyScribe Post-Labelling Kit com 1,65 pg do nonâmero aleatório co15 mo iniciador (Amersham Biosciences, Hillerod, Dinamarca). A condição de teste foi marcada com Cy5 e a condição de referência com Cy3. As duas amostras foram agrupadas e metade delas foi hibridizada ao arranjo. Ao invés de 50% de formam ida recomendados no protocolo, foram utilizados 60%

(estas condições foram estabelecidas previamente utilizando oligos de con20 trole). Após aproximadamente 18h de hibridização, o arranjo foi lavado (Cor. ning B.V.), verificado por varredura e pré-analisado como descrito anteriormente (Pedersen e outros 2005). Os dados do arranjo foram importados para Acuity 4.0 (Axon Instruments Inc., Union City, CA, USA) onde foram normalizados com LOWESS. Foi criado um conjunto de dados com todos os 25 pontos identificados. Foram removidos os dados dos oiigos em que apenas

0, 1 ou 2 dos 4 pontos em réplica foram identificados. Similarmente, foram removidos os dados dos oligos em que o desvio padrão entre Iog2(proporção)ões normalizadas era >0,5.

Resultados

A expressão gênica de Bb12Tet-139S foi comparada com a de

Bb12 utilizando microarranjos do genoma inteiro. Culturas estacionárias de ambas as cepas foram inoculadas a 1% (DQ600=0,06) em MRS fresco +

0,05% de cisteína · HCI pré-aquecidos a 37°C. A DO600 foi então medida a cada 30 min. Na faixa de DO de 0,1-1,0 UA (unidades de absorção), o crescimento era exponencial. A taxa de crescimento específica, μ, era de 0,50 h‘¹(R2=0,9977) e 0,51 h‘¹ (R2=0,9953) para Bb-12® e Bb12Tet-S139, respecti5 vamente. Conseqüentemente, não há diferença significativa entre as taxas de crescimento das duas cepas. Partindo das amostras de RNA em DO=1,0 UA (após seis horas e meia de crescimento) foram produzidos microarranjos. Bb12Tet-S139 e Bb-12® eram as condições de teste e de referência, respectivamente. Dos 1569 genes representados no microarranjo, foram ob10 tidos dados reguladores significativos partindo de 1271 genes.

Como uma regra prática, um gene é freqüentemente considerado como sendo expresso de forma diferencial se for >2 vezes regulado para mais ou para menos entre as duas condições (ver, por exemplo, Pedersen e outros 2005). Nenhum dos 1271 genes no conjunto de dados era expresso 15 diferencialmente mais que >2 vezes. Em comparação, quando Bb12 foi exposto a 0,1% de sal biliar, 86 e 123 genes eram >2 vezes regulados para mais e para menos, respectivamente (Garrigues e outros 2005). Entre estes genes, 17 e 27 eram ainda >4 vezes regulados para mais e para menos, respectivamente. Isto mostra que se o metabolismo da célula for perturbado, 20 podem ocorrer alterações drásticas em relação à expressão gênica. Similarmente, quando 1% do fructooligossacarídeo (FOS) foi adicionado ao meio, apenas 2 genes foram >2 vezes expressos de forma diferencial. Estes 2 genes codificam proteínas envolvidas na utilização de FOS e eram regulados para mais 5 vezes (Garrigues e outros 2005). Este último experimento mos25 tra que as condições de crescimento podem ser reproduzidas e que perturbações que afetam partes particulares do metabolismo podem ser identificadas. Combinando os resultados acima, é evidente que em relação à expressão gênica e ao estado fisiológico geral não são observados efeitos adversos em Bb12Tet-S139 comparado com Bb-12®. Baseado nisso, pode ser 30 assumido que Bb12Tet-S139 se comporta como Bb-12® exceto pela sensibilidade à tetraciclina.

Exemplo 7: Detecção quantitativa específica ao mutante de Bb-12Tet-S139.

A fim de se obter um método para a detecção quantitativa de BB-12TET-S139, foi planejado um ensaio de PCR em tempo real com uma sonda dual marcada. O alvo para o ensaio é o gene tetW, mais especifica5 mente o sítio de deleção é alvo da sonda dual marcada.

Iniciadores e sonda

Os iniciadores foram planejados com o auxílio do programa disponível publicamente “Primer 3” (http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi). A sonda foi planejada manualmente. Deriva10 dos de LNA (ácido nucléico fechado, uma tecnologia de propriedade pertencente à Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) foram incorporados na sonda com a finalidade de possibilitar o encurtamento da sonda e assim obter maior especificidade. A temperatura de anelamento, a estrutura secundária e a hibridização de iniciador/sonda foram avaliadas com o auxílio de programas da 15 Exiqon (http://lnatools.com). Os iniciadores foram obtidos da TAGC, Copenhagen, Dinamarca, a sonda marcada dual foi obtida da Exiqon, Vedbaek, Dinamarca.

Reação da PCR em tempo real

A reação da PCR foi corrida no ABI 7500 (Applied Biosystems) 20 sob condições padronizadas: 15 s de desnaturação a 95°C, 1 min de anela. mento e alongamento a 60°C durante 40 ciclos. Foram utilizados os reagentes a seguir: TaqMan® Universal PCR Master Mix (concentrado 2x), 300 nM de iniciador para frente e de iniciador para trás, 200 nM de sonda. O volume de reação era de 25 pl_.

Resultados

Planejamento do ensaio

O planejamento do ensaio resultou nos iniciadores e na sonda a seguir: iniciador para frente 5’- CAA TAC AAG AGC CGG GTT TC, iniciador para trás 5’- GTG CTG ACC GGA CTG TAA TAA A -3’, sonda 5’-FAM30 AtActgaaccA-TAMRA-3’ (FAM = Carbóxi-Fluoresceína; TAMRA = CarbóxiTetrametil-rodamina). As letras minúsculas na sequência da sonda indicam derivados de LNA. O tamanho do produto de amplificação é de 160 pb.

Extração do DNA

O DNA foi extraído partindo de culturas puras com o auxílio do DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante para a extração de bactérias gram-positivas. O DNA foi extraído de amostras 5 fecais com o auxílio do QIAamp Stool DNA extraction Kit Qiagen, Alemanha) seguindo as instruções para a detecção de agentes patogênicos como descrito pelo fabricante.

Teste de especificidade

A especificidade do ensaio foi testada contra o tipo selvagem, 10 algumas cepas de referência de Bifidobacterium (ver a tabela 8-1) e o DNA fecal de camundongo e humano.

O ensaio era completamente específico para BB-12TET-S139 e não foi observada qualquer amplificação acima do limite para o tipo selvagem ou qualquer uma das outras amostras de Bifidobacterium.

CHCC	Cepa	Espécie
8918	LMG11596	Bifidobacterium gallicum
9084	ATCC25527	Bifidobacterium animalis ssp. animalis
9081	DSM20219	Bifidobacterium longum biovar. íongum
9078	DSM20213	Bifidobacterium breve
9076	ATCC29521	Bifidobacterium bifidum
9074	ATCC15703	Bifidobacterium adolescentis
9080	ATCC15697	Bifidobacterium longum biovar. infantis
4266	ATCC27535	Bifidobacterium angulatum
8912	LMG 10505	Bifidobacterium pseudocatenulatum
2182	Bb46	Bifidobacterium longum biovar. longum
8914	LMG 11045	Bifidobacterium dentium
8916	LMG21589	Bifidobacterium scardovii
5445	Bb-12®	Bifidobacterium animalis ssp. lactis

Conclusão

Assim, este ensaio pode ser utilizado para identificar identify Bi~ 20 fidobacterium animalis ssp. lactis cepa BB-12TET-S139.

Exemplo 8: Produção e estabilidade de culturas secas por congelamento

Foi realizada uma verificação da capacidade das cepas secas por congelamento formuladas de sobreviver a 30°C durante 3 semanas em 2 níveis diferentes de oxigênio e umidade.

Materiais:

Bb-12® (DSM 15954); 2 volumes secos por congelamento e uma mistura de Bb-12Tet-S139 (DSM 17281). 2 volumes secos por congelamento e uma mistura. No total 6 amostras são utilizadas para o estudo. Os 5 volumes secos por congelamento são produzidos de acordo com uma receita padronizada. As misturas são um volume seco por congelamento moído misturado com dextrose com uma atividade de água menor que 0,15. Métodos:

Cada amostra é dividida em 3 partes, que são tratadas como 10 indicado na tabela 9-1 durante 3 semanas.

	Referência	T ratamento 1	T ratamento 2
Temperatura	-50 ± 5°C	+30°C ± 2°C	+30°C ± 2°C
Condições durante o período de teste	Manter em “alubag” selada	Manter em “alubag” selada	Manter em um recipiente aberto em uma câmara aclimatada a aproximadamente 15% de umidade relativa

Após o período de teste, é realizada uma análise de UFC/g duas vezes em todas as amostras.

' UFC/g

Uma quantidade conhecida de amostra é homogeneizada com diluente e são preparadas diluições decimais. As diluições apropriadas são misturadas com Ágar MRS da OXOID adicionado de 0,05 % de cloridrato de 20 cisteína, então incubadas durante 3 dias a 37°C em uma câmara anaeróbica utilizando AnaerGen® da OXOID. São utilizadas pelo menos 4 placas de Petri com 30 até 300 colônias para censo.

Sobrevivência:

A sobrevivência é calculada como a seguir:

% de Sobrevivência: (Log de UFC/g na amostra após tratamento *100)/( Log de UFC/g na amostra de referência).

Resultados:

São mostrados na tabela 9-2 abaixo.

Tabela 9-2: Sobrevivência de culturas secas por congelamento (%)

	Tratamento 1	T ratamento 2
	Bb-12TetS139	Bb-12®	Bb-12Tet-S139	Bb-12®
Massa seca por congelamento
1		99%		-
2	100%		99%
3		100%		98%
4	99%		98%
Misturas
A		100%o		97%
B	99%		97%

Conclusão:

Não há diferença entre Bb-12® e Bb-12Tet-S139 em relação a sua sobrevivência durante 3 semanas a +30°C ou a sua sobrevivência em “alubags” seladas a +30°C e aprox. 15% de umidade relativa. Isto é verdadeiro tanto para culturas puras secas por congelamento assim como para culturas misturadas com excipientes (misturas).

Exemplo 9: Sobrevivência em suco gástrico artificial

A sobrevivência de uma bactéria probiótica ao longo do trato gastrointestinal humano é considerada como sendo um fator importante-.para, sua funcionalidade probiótica.

A cepa Bb-12® de Bifidobacterium animalis subsp. lactis possui uma excelente tolerância ao suco gástrico e ao sal biliar. O teste in vitro utilizado para a tolerância a ácidos se baseia na medida da sobrevivência após sua exposição a um suco gástrico artificial.

A Bb-12Tet-S139 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, cultivada sob condições anaeróbicas durante a noite em MRS (Difco) a 37 °C, foi testada em relação a sua tolerância ao suco gástrico artificial comparada à BB-12.

O suco gástrico foi produzido misturando 2,0 g de cloreto de sódio (Merck 1.06404.1000) e 3,2 g de pó de pepsina (Sigma P-7000) em água. Então 80 mL de ácido clorídrico a 1 M foram adicionados e a mistura foi

diluída até 1000 mL com H₂O. O ajuste final até pH-2 foi feito com NaOH 5 Μ. A cultura bacteriana crescida durante a noite foi lavada três vezes com 0,9 % de diluente de solução salina suplementado com 1,5% de triptona a pH=7 e então adicionada ao suco gástrico seguido pela amostragem em in5 tervalos de tempo diferentes.

A taxa de sobrevivência das células de cada amostra foi anali-

sada através do plaqueamento das células em ágar MRS suplementado com

0,05% de Cisteína HCI e da determinação do número de unidades formadoras de colônias (u.f.c.). As células foram expostas ao suco gástrico (pH=2) a 10 37°C até 90 min. O conjunto de dados (ver a tabela 10-1) foi analisado através do teste U de Mann-Whitney.

Tabela 10-1. Sobrevivência em suco gástrico artificial (%). Média de três experimentos

Amostra (1 min 100%)	%de Sobrevivência 30 min	Desvio Padrão	% de Sobrevivência 60 min	Desvio Padrão	% de Sobrevivência 90 min	Desvio Padrão
BB-12®	103,2	7,10	104,5	7,6	98,1	7,9
Bb12TetS139	107,4	3,2	102,5	9,4	103,5	12,6

Conclusão

Não foi observada qualquer diferença significativa entre BB-12® e Bb-12Tet-S139 em relação à tolerância aos ácidos gástricos.

Exemplo 10: Tolerância aos ácidos biliares.

A sobrevivência de qualquer bactéria probiótica potencial ao longo do trato gastrointestinal humano é considerada como sendo importante para sua funcionalidade probiótica. A cepa Bb-12® de Bifidobacterium animalis subsp. lactis possui uma excelente resistência ao sal biliar.

No presente experimento, a cepa Bb-12Tet-S 139 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis foi testada em relação a sua resistência aos extratos biliares bovinos e suínos comparada à de Bb-12®.

A tolerância para a bile foi analisada através do plaqueamento das células em placas de ágar suplementado com sal biliar de concentra-

ções variáveis essencialmente como descrito por Noriega L. e outros Int. J.

Food Microbioi 94, 79-86, 2004. As determinações da Concentração Inibidora Mínima (MIC) de ambas as cepas foram feitas em placas de ágar MRSCisteína HCi suplementado com diluições em série de duas vezes de extrato 5 biliar bovino (Sigma B3883) e biliar suíno (Sigma B8631) em concentrações de 2% até 0,062% p/v.

Resultados

Foi mostrado que ambas as cepas eram tolerantes a concentrações de sais biliares de até pelo menos 2%.

Os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados são mostrados na tabela 11-1.

Tabela 11-1. Tolerância aos ácidos biliares. Crescimento bacteriano em placas de ágar MRS-Cisteína HCI suplementado com 2 % p/v de sais biliares.

	Bile bovina	Extrato de bile suína
Bb-12® (A)	+	+
Bb-12® (B)	+	+
Bb-12® (C)	+	+
Bb-12Tet-S139 (A)	+	+
Bb-12Tet-S139 (B)	+	+
Bb-12Tet-S139 (C)	+	+

+ indica crescimento bacteriano evidente em todas as placas de ágar

Conclusão

Tanto Bb-12® quanto Bb-12Tet-S139 são tolerantes a pelo menos 2% de ácidos biliares, indicando uma Concentração Inibidora Mínima que é maior que 2% para ambas as cepas. A toierância aos sais biliares é 20 indicativa da adaptação às condições no trato gastrointestinal.

Exemplo 11: Três novos derivados sensíveis à tetraciclina de duas cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis - isolamento e caracterização molecular dos mesmos.

Os três novos derivados foram cultivados, mutados, selecionado 25 e caracterizados como descrito nos Exemplos 1,2 e 3.

Bb-12Tet-S79 e Bb-12Tet-S180 são derivados de Bifidobacteri

um animalis subespécie lactis Bb-12®. DR10Tet-S33 é um derivado de HN019 (DR10®).

Bb-12Tet-S180,

O seqüenciamento do DNA do gene tetW do isolado sensível à tetraciclina Bb-12Tet-S180, um derivado de Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12® (CHCC5445), demonstrou uma transversão de uma adenina para um resíduo de citidina na posição de nucleotídeo N° 2731 na Tab. 2 (SEQ ID 22) gerando uma substituição de aminoácído de uma Serina por uma Arginina como apresentado abaixo.

Sequência de aminoácidos: - Tyr Leu Asn Gin Ser Phe Gin Asn

Bb-12 (CHCC5445) nt N° 2719 - TAC TTG AAC CAG AGT TTT CAA AAC Bb-12Tet-S180 nt N°2719 - TAC TTG AAC CAG CGT TTT CAA

AAC Seqüência de aminoácidos: Tyr Leu Asn Gin Ara Phe Gin Asn

A seqüência anterior mostra uma seqüência de aminoácidos 15 parcial do gene tetWencontrada em CHCC5445. O resíduo de adenina sublinhado em CHCC5445 (nt: 2731) é substituído por um resíduo de citidina na cepa mutante, resultando em uma substituição de aminoácído de 168 aminoácidos antes do códon de término da tradução.

Vários DR10tet-S33 e Bb-12Tet-S79 mutantes,

O sectüenciamento do DNA dos genes tetW dos isolados sensí. veis à tetraciclina DR10Tet-S33 e Bb-12Tet-S79 demonstrou substituições de dois e três nucleotídeos, respectivamente, das quais cada uma deu origem a uma substituição de aminoácído no produto do gene tetWcomo descrito abaixo.

DR10tet-S33, nt N° 1546[G] para 1546[T] no tripleto GGC para TGC resultou em uma substituição de aminoácído de Glicina por Cisteína.

nt N° 1774[A] para 1774[G] no tripleto ATC para GTC resultou em uma substituição de aminoácído de Isoleucina por Valina. Ver a Tab. 2 30 (SEQ ID 22).

Bb-12Tet-S79, nt N° 1358[C] para 1358[A] no tripleto GCT para GAT resultou

em uma substituição de aminoácido de Alanina por Ácido aspártico.

nt N° 3023[A] para 3023[G] no tripleto CAG para CGG resultou em uma substituição de aminoácido de Glutamina por Arginina.

nt N° 3095[T] para 3095[C] no tripleto CTG para CÇG resultou 5 em uma substituição de aminoácido de Leucina por Prolina. Ver a Tab. 2 (SEQ ID 22).

Sensibilidade,

Os isolados sensíveis à tet foram submetidos à seleção de susceptibilidade com o teste E de acordo com os métodos descritos por M. Da10 nielsen e A. Wind (2003), para determinar seu limite de sensibilidade à tetraciclina. O resultado é resumido na tabela 12-1 abaixo:

Tabela 12-1. Concentrações Inibidoras Mínimas (MICs) de tetraciclina de cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis e dois derivados das mesmas.

Tipo	Cepa	Susceptibilidade à tet de acordo com o teste E (valor de MIC)
Cepa parental	Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12®	>16 pg/ml
Cepa mutante	Bb-12Tet-S79	< 1,0 pg/ml
Cepa mutante	Bb12Tet-S139	<1,0 pg/ml
Cepa mutante	Bb-12Tet-S180	< 1,0 pg/ml
parent strain	Bifidobacterium animalis subspecies /ací/sHN019 (DR10™),	>16 pg/ml
Cepa mutante	DR10Tet-S9X	1,0 pg/ml
Cepa mutante	DR10Tet-S33	< 1,0 pg/ml

Exemplo 12: Classificação de variações sensíveis à tetraciclina de duas cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis.

Como mencionado no Exemplo 2, aproximadamente 85 % dos supostos isolados “sensíveis à tetraciclina” conseguiram crescer em caldo 20 MRS líquido contendo tetraciclina (10 pg/mL) sob estas condições. Os 15% restantes dos isolados sensíveis à tetraciclina foram então submetidos à seleção de susceptibilidade com o teste E de acordo com os métodos descritos por M. Danielsen e A. Wind (2003), para determinar seu limite de sensibilidade à tetraciclina.

Em geral, o teste E revelou duas classes de mutantes sensíveis à tetraciclina:

Classe 1: Crescimento a uma concentração de tetraciclina de 1,5 pg/mL ou inferior de acordo com o teste E; e

Classe 2: Crescimento a concentrações de tetraciclina > 1,5 pg/mL;

O gene tetW foi analisado em um número representativo de mutantes sensíveis à tetraciclina da Classe 1 e da Classe 2.

O resultado sendo:

Classe 1: Crescimento a uma concentração de tetraciclina < 1,5 pg/mL; são mutantes sensíveis à tetraciclina que são caracterizados por possuírem deleções de nucleotídeos (nt) ou substituições de nt, das quais algumas resultam na introdução de códons de término no quadro aberto de leitura do gene tetWe

Classe 2: Crescimento a concentrações de tetraciclina > 1,5 pg/mL; nenhuma mutação em tetW. Esta classe de mutações é mais provavelmente causada por mutações nas paredes celulares ou nas proteínas de transporte.

Conclusão

Até agora, todas as mutações que são caracterizadas por um valor de teste E < 1,5 pg de tet/mL continham um tetW mutadQ. Isto abre para um procedimento de seleção, que resulta na seleção de Bifidobactérias sensíveis à tetraciclina que, com uma alta probabilidade, contêm um gene tetW inativado.

Exemplo 13: Três derivados sensíveis à tetraciclina adicionais de uma cepa probiótica de Bifidobacterium animalis subespécie iactis - isolamento e caracterização molecular dos mesmos.

Os três novos derivados foram cultivados, mutados, selecionados e caracterizados como descrito nos Exemplos 1,2 e 3.

Bb-12tefW-S73, Bb-12tertV-S14 e Bb- 12teM/-S4 são derivados de Bifidobacterium animalis subespécie Iactis Bb-12®.

Bb-12tefW-S73,

O seqüenciamento do DNA do gene tetW partindo do isolado /

sensível à tetraciclina Bb-12tetW-S73, um derivado de Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12® (CHCC5445), demonstrou uma alteração de uma timidina para um resíduo de guanina na posição de nucleotídeo N° 1573 na Tab. 2 (SEQ ID 22) (TAC > GAC) gerando uma substituição de a5 minoácido de uma Tirosina por um Ácido Aspártico.

Bb-12fetW-S14,

O seqüenciamento do DNA do gene tetW partindo do isolado sensível à tetraciclina Bb-12tetW-S14, um derivado de Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12® (CHCC5445), demonstrou uma alteração de 10 uma timina para um resíduo de citosina na posição de nucleotídeo N° 2869 na Tab. 2 (SEQ ID 22) (TCA > CCA) gerando uma substituição de aminoácido de uma Serina por uma Prolina.

Bb-12tetW-S4,

O seqüenciamento do DNA do gene tetW partindo do isolado 15 sensível à tetraciclina Bb-12tetW-S4, um derivado de Bifidobacterium anímalis subespécie lactis Bb-12® (CHCC5445), demonstrou uma alteração de uma adenina para um resíduo de guanina na posição de nucleotídeo N° 3176 na Tab. 2 (SEQ ID 22) (CAG > CGG) gerando uma substituição de uma Glutamina por uma Arginina.

Sensibilidade,

Os isolados sensíveis à tet foram submetidos à seleção de susceptibilidade com o teste E de acordo com os métodos descritos por M. Danielsen e A. Wind (2003), para determinar seu limite de sensibilidade à tetraciclina. O resultado é resumido na tabela 13-1 abaixo:

Tabela 13-1. Concentrações Inibidora» Mínimas (íviiCs) de tetraciclina Bb-12 e 3 novos derivados da mesma.

tipo	cepa	susceptibilidade à tet de acordo com o teste E (valor de MIC)
cepa parental	Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12®	£ 16 pg/ml
cepa mutante	Bb-12tetW-S73	< 1,0 pg/ml
cepa mutante	Bb-12tetW-S14	< 1,0 pg/ml
cepa mutante	Bb-12tetW-S4	1,0 pg/ml

LISTAGEM DE REFERÊNCIAS

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Em Relação aos Organismos Depositados

Para todos os organismos microbianos mencionados no presente pedido de patente, se aplica o que vem a seguir.

Em relação às designações às quais a Patente Européia está buscando, uma amostra de microorganismos depositados será tornada disponível até a publicação da menção da expedição da Patente Européia ou até a data em que o pedido de patente por recusado ou retirado ou for considerado como sendo retirado, apenas pelo envio de tal amostra a um perito nomeado pela pessoa que está requisitando a amostra e aprovado i) pelo Requerente e/ou ii) pelo escritório de patentes europeu (EPO), sempre que aplicável. (Rule 28 (4) e 30 28 (5) EPC).

INDICAÇÕES EM RELAÇÃO AO MICROORGANISMO OU A OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO DEPOSITADO

Tabela 1

Oligonucleotídeos utilizados para as análise da PCR e seqüenciamento do DNA do gene teftVque codifica resistência à tetraciclina de Bb12.

Iniciador	Seqüência (5' para 3')	Posições^ dos nucleotídeos
Stps.05	GAGCATCGCTTAATTCCTTCGAGGGG	-394	-369
StetW.D	CGAGGGGACTTTGGCCCACCGCTGGGTGG	-375	-347
StetW.Dl	GCAGGCAGGCACGTCCATCCGCCTC	-199	-175
Stps.R3	GGCTTCTGCCACCGTGGCCTCGTCAC	234	209
tpsW.RI	CCTGTCCTTGTCCACGCCGATATGCGC	554	526
tetWx.Dl	CGGCACCTGCTGTATAATGCGGATTGTGGC	1022	1051
tetW.Dup	GTGGGAACAAAGGATTATGATAGTCCC	1092	1118
tetWx.D4	GGCTGGCGTTGATTTGCAGAGCGTGG	1713	1738
tetW.DSOO	GCAGACGGTGTCGCTGTCCCCGG	1782	1804
tetWx.R2	CCGGGGACAGCGACACCGTCTGC	1804	1782
tetWx.D3	GGAGCGGCCGCTCAAAGCAGCCAGCC	2580	2625
tetWx.R3	GGCTGGCTGCTTTGAGCGGCCGCTCC	2625	2580
.R5	L> Lj U T TG G G C G G C AC C T C G	2645	2619
tetW.RSOO	CCAGCCCGTAACGGATACCATCCC	2773	2750
tetWx.R4	GATGGTCGCATGATCGGCGGGGTCACTCCC	+262	+ 233

* A numeração se baseia na sequência de DNA ilustrada na tabela 2. O prefixo “D” indica um iniciador direto derivado do filamento senso. O prefixo “R” indica um iniciador inverso complementar ao filamento senso.

Tabela 2

A sequência de DNA de teHVflanqueada pelo gene da transposase a montante, tps, de Bifidobacterium animalis Bb-12 (SEQ ID 22).

ORF que codifica uma Transposase cagatgacgatttccgcattcagcgacgaactggcacaggtgcggacgaagaaaaaagca ------------------------------------------------------------- 60 GTCTACTGCTAAAGGCGTAAGTCGCTGCTTGACCGTGTCCACGCCTGCTTCTTTTTTCGT

MTILAFS DELAQVRTKKKA

TTTCTCGACCAGATTGAACGGATCGTCCCGTGGAAGGAATGGCTTGCCATGATTCAGCCG ------------------------------------------------------------ ₁₂₀

AAAGAGCTGGTCTAACTTGCCTAGCAGGGCACCTTCCTTACCGAACGGTACTAAGTCGGC

FLDQIERI VPWKEWLAMI QP

TGCTATTACAAAGGAGAGCGCGGCAACAAACCCTATCCGCTGGAGATCATGCTCCGACTG

------------------------------------------------------------- ₁₈₀

ACGATAATGTTTCCTCTCGCGCCGTTGTTTGGGATAGGCGACCTCTAGTACGAGGCTGAC

CYYKGERGNKPYPLEIMLRL

TATCTGCTGCAAAACCTCTATGACCTGAGTGACGAGGCCACGGTGGCAGAAGCCATCGAC —----------------------------------------------------------- 240

ATAGACGACGTTTTGGAGATACTGGACTCACTGCTCCGGTGCCACCGTCTTCGGTAGCTG

YLLQNLYDLSDEATVAEAID

AGCCGCGCATTTTCGGAGTTCTGCGGCGTCGATTCCAGCAACCAGGTTCCGAACGGGGAT

------------------------------------_:------------------------ ₃₀₀

TCGGCGCGTAAAAGCCTCAAGACGCCGCAGCTAAGGTCGTTGGTCCAAGGCTTGCCCCTA

SRAFSEFCGVDSSNQVPNGD

ACTCTTGGCCGGTTCCGGAACTTGCTGATCAAGAACGGACTGCAGGAGAAGCTGTTCGCT ------------------------------------------------------------ ₃₆₀TGAGAACCGGCCAAGGCCTTGAACGACTAGTTCTTGCCTGACGTCCTCTTCGACAAGCGA

TLGRFRNLLIKNGLQEKLFA

CAGGTGGTAGCAGCGCTCATGGAACGTGGCCTCATTCTGAAAAAGGGCACCATTGTAGAT ------------------------------------------------------------ ₄₂₀GTCCACCATCGTCGCGAGTACCTTGCACCGGAGTAAGACTTTTTCCCGTGGTAACATCTA

QVVAALMERGLILKKGTIVD

TCCACCATCATTTCCGCCCCCTCTTCTACCAAGAATAAGGAAAAGAAACGGGATCCGGAT ------------------------------------------------------------ _4g0AGGTGGTAGTAAAGGCGGGGGAGAAGATGGTTCTTATTCCTTTTCTTTGCCCTAGGCCTA

STIISAPSSTKNKEKKRDPD

GCCCACCAAGTCAAGAAGGGCAACACCTGGCACTTTGGGTACAAAGCGCATATCGGCGTG

CGGGTGGTTCAGTTCTTCCCGTTGTGGACCGTGAAACCCATGTTTCGCGTATAGCCGCAC

A H Q V K K G N T w n F U Y K A Η I G V

540

GACAAGGACAGCGGACTGGTTCA.CACAGTGGAAGCTACACCGGCAAATGTCCACGACGTT ------------------------------------------------------------- 600

CTGTTCCTGTCGCCTGACCAAGTGTGTCACCTTCGATGTGGCCGTTTACAGGTGCTGCAA

DKDSGLVHTVEATPANVHDV

GCGGAAGTGCCGAAATTATTGACGGGAGAGGAAGAAACAGTCTATGGAGACAGCGGTTAT ------------------------------------------------------------ 660

CGCCTTCACGGCTTTAATAACTGCCCTCTCCTTCTTTGTCAGATACCTCTGTCGCCAATA

AEVPKLLTGEEETVYGDSGY

CTCGGCGCAGGTAAGCGCGAAGATGCCGTAGTCCGAAACAAAGCTGGCCGGAAAATCAAG

------------------------------------------------------------ 720

GAGCCGCGTCCATTCGCGCTTCTACGGCATCAGGCTTTGTTTCGACCGGCCTTTTAGTTC

LGAGKREDAVVRNKAGRKIK

TACAAGATCAATCGTCGTCCATCGCAGATGAAGAAACTGAGCAAAAGCGGGCAGTACGCA ------------------------------------------------------------- 760 ATGTTCTAGTTAGCAGCAGGTAGCGTCTACTTCTTTGACTCGTTTTCGCCCGTCATGCGT

YKINRRPSQMKKLSKSGQYA

GCAAAGAAAGCGGAACGGGCGAAATCCTCAGTGCGAGCAAAAGTAGAGCATGTATTCGGT ------------------------------------------------------------ 840 CGTTTCTTTCGCCTTGCCCGCTTTAGGAGTCACGCTCGTTTTCATCTCGTACATAAGCCA

AKKAERAKSSVRAKVEHVFG

GTCGTTAAGAAGCAGCTGCGCTTCCGAAAAACGCGATACCGAGGGCTTGAAAAGCAACAA ------------------------------------------------------------ 990

CAGCAATTCTTCGTCGACGCGAAGGCTTTTTGCGCTATGGCTCCCGAACTTTTCGTTGTT

VVKKQLRFRKTRYRGLEKQQ

GCCAAATTCAATATCATGTTTGCGTTGGCAAATCTGATTCTGGCTGACAGACCCTGTCTG ------------------------------------------------------------ 960 CGGTTTAAGTTATAGTACAAACGCAACCGTTTAGACrAAGACCGACTGTCTGGGACAGAC

AKFNIMFALANLILADRPCL

Término da Transposase

GCAGCTTGAGTCAGTGCGCCTTTGCGGACAAAAAATTCGGAGGTTATCCACAGTTTTTAT

------------------------------------------------------------ ₁₀₂₀

CGTCGAACTCAGTCACGCGGAAACGCCTGTTTTTTAAGCCTCCAATAGGTGTCAAAAATA

A A *

TCGGCACCTGCTGTATAATGCGGATTGTGGCATTTGTGCGGTGTTGCCTTAAATAAAACT

------------------------------------------------------------ _loeo

AGCCGTGGACGACATATTACGCCTAACACCGTAAACACGCCACAACGGAATTTATTTTGA

ATAATCAAATAGTGGGAACAAAGGATTATGATAGTCCCTTTTGTAGGGGCTTAGTTTTTT

------------------------------------------------------------ ₁₁₄₀

TATTAGTTTATCACCCTTGTTTCCTAATACTATCAGGGAAAACATCCCCGAATCAAAAAA gtacccaatttaagaatacttttgccttatcaattttgacatatccccaaaaacagcact

------------------------------------------------------------ 2200 catgggttaaattcttatgaaaacggaatagttaaaactgtataggggtttttgtcgtga

CACAAACAGGTGTATGCTGTATATGTGTATGTCCGCAAATTATCATCCCCAGTGGTAAAA — ~ ----------------------------------------------------------- 1260

GTGTTTGTCCACATACGACATATACACATACAGGCGTTTAATAGTAGGGGTCACCATTTT

Início da Tetraciclina

GTATTTTACTGCTGGGGATTTTTATGCCCTTCGGGGCAGTAAAGGGAGGACAATCACATG ------------------------------------------------------------ ₁₃20

CATAAAATGACGACCCCTAAAAATACGGGAAGCCCCGTCATTTCCCTCCTGTTAGTGTAC

M

AAAATAATCAATATTGGAATTCTTGCCCATGTAGACGCTGGAAAGACGACCTTGACGGAG

------------------------------------------------------------- ₁₃₈₀

TTTTATTAGTTATAACCTTAAGAACGGGTACATCTGCGACCTTTCTGCTGGAACTGCCTC

KIINIGILAHVDAGKTTLTE

AGCCTGCTATATGCCAGCGGAGCCATTTCAGAACCGGGGAGCGTCGAAAAAGGGACAACG

------------------------------------------------------------ _144O

TCGGACGATATACGGTCGCCTCGGTAAAGTCTTGGCCCCTCGCAGCTTTTTCCCTGTTGC

SLLYASGAISEPGSVEKGTT

AGGACGGACACCATGCTTTTGGAGCGGCAGCGTGGGATTACCATTCAAGCGGCAGTCACT ---------------_:--------------------------------------------- ₁₅₀₀

TCCTGCCTGTGGTACGAAAACCTCGCCGTCGCACCCTAATGGTAAGTTCGCCGTCAGTGA

RTDTMLLERQRGITIQAAVT

TCCTTCCAGTGGCACAGATGTAAAGTCAACATTGTGGATACGCCCGGCCACATGGATTTT -----------------'------------------------------------------- 1560

AGGAAGGTCACCGTGTCTACATTTCAGTTGTAACACCTATGCGGGCCGGTGTACCTAAAA sfqwhrckvnivdtpghmdf

TTGGCGGAGGTGTACCGCTCTTTGGCTGTTTTAGATGGGGCCATCTTGGTGATCTCCGCT

------------------------------------------------------------ ₁₆₂0 aaccgcctccacatggcgagaaaccgacaaaatctaccccggtagaaccactagaggcga LAEVYRSLAVLDGAILVISA aaagatggcgtgcaggcccagacccgtattctgttccatgccctgcggaaaatgaacatt ------------------------------------------------------------ ₁₆₈₀TTTCTACCGCACGTCCGGGTCTGGGCATAAGACAAGGTACGGGACGCCTTTTACTTGTAA KDGVQAQTRILFHALPKMNI

CCCACCGTTATCTTTATCAACAAGATCGACCAGGCTGGCGTTGATTTGCAGAGCGTGGTT ------------------------------------------------------------ _1?40

GGGTGGCAATAGAAATAGTTGTTCTAGCTGGTCCGACCGCAACTAAACGTCTCGCACCAA

PTV1FINKIDQAGVDLQSVV nt N° 1741-C substituído porT em DR10Tet-S9X

CAGTCTGTTCGGGATAAGCTCTCCGCCGATATTATCATCAAGCAGACGGTGTCGCTGTCC ------------------------------------------------------------ _lg00

GTCAGACAAGCCCTATTCGAGAGGCGGCTATAATAGTAGTTCGTCTGCCACAGCGACAGG

QSVRDKLSADI IIKQTVSLS * (âmbar)

CCGGAAATAGTCCTGGAGGAAAATACCGACATAGAAGCATGGGATGCGGTCATCGAAAAT

1860

GGCCTTTATCAGGACCTCCTTTTATGGCTGTATCTTCGTACCCTACGCCAGTAGCTTTTA

PEIVLEENT.DIEAWDAVIEN

AACGATAAATTATTGGAAAAGTATATCGCAGGAGAACCAATCAGCCGGGAAAAACTTGTG

1920

TTGCTATTTAATAACCTTTTCATATAGCGTCCTCTTGGTTAGTCGGCCCTTTTTGAACAC

NDKLLEKY1AGEPISREKLV

CGGGAGGAACAGCGGCGGGTTCAAGACGCCTCCCTGTTCCCGGTCTATTATGGCAGCGCC

1980

GCCCTCCTTGTCGCCGCCCAAGTTCTGCGGAGGGACAAGGGCCAGATAATACCGTCGCGG

REEQRRVQDASLFPVYYGSA

AAAAAGGGCCTTGGCATTCAACCGTTGATGGATGCGGTGACAGGGCTGTTCCAACCGATT

2040

TTTTTCCCGGAACCGTAAGTTGGCAACTACCTACGCCACTGTCCCGACAAGGTTGGCTAA

KKGLGIQPLMDAVTGLFQPI

GGGGAACAGGGGAGCGCCGCCCTATGCGGCAGCGTTTTCAAGGTGGAGTATACAGATTGC

2100

CCCCTTGTCCCCTCGCGGCGGGATACGCCGTCGCAAAAGTTCCACCTCATATGTCTAACG

GEQGSAALCGSVFKVEYTDC

GGCCAGCGGCGTGTCTATCTACGGCTATACAGCGGAACGCTGCGCCTGCGGGATACGGTG

2160

CCGGTCGCCGCACAGATAGATGCCGATATGTCGCCTTGCGACGCGGACGCCCTATGCCAC

GQRRVYLRLYSGTLRLRDTV

GCCCTGGCCGGGAGAGAAAAGCTGAAAATCACAGAGATGCGTATTCCATCCAAAGGGGAA

2220

CGGGACCGGCCCTCTCTTTTCGACTTTTAGTGTCTCTACGCATAAGGTAGGTTTCCCCTT ALAGREKLKITEMRIPSKGE

ATTGTTCGGACAGACACCGCTTATCCGGGTGAAATTGTTATCCTTCCCAGCGACAGCGTG

TAACAAGCCTGTCTG T G G C GAATAGG CC CACT T TAAC AATAGGAAGGGTCGC TGTCG CAC IVRTDTAYPGEIVILPSDSV ‘ AGGTTAAACGATGTATTAGGGGACCCAACCCGGCTCCCTCGTAAAAGGTGGCGTGAGGAC

TCCAATTTGCTACATAATCCCCTGGGTTGGGCCGAGGGAGCATTTTCCACCGCACTCCTG RLNDVLGDPTRLPRKRWRED

2280

2340

cccctccccatgctgcggacgtcgattgcrccgaaaacggcagcgcaaagagaacggctg

CC

GGGGAGGGGTACGACGCCTGCAGCTAACGCGGCTTTTGCCGTCGCGTTTCTCTTGCCGAC

PLPMLRTSIAPKTAAQRERL

CTGGACGCTCTTACGCAACTTGCGGATACTGACCCGCTTTTGCGCTGCGAGGTGGATTCC

GACCTGCGAGAATGCGTTGAACGCCTATGACTGGGCGAAAACGCGACGCTCCACCTAAGG

LDALTQLADT J PLLRCEVDS

ATCACCCATGAGATCATTCTTTCTTTTTTGGGCCGGGTGCAGTTGGAGGTTGTTTCCGCT

2520

TAGTGGGTACTCTAGTAAGAAAGAAAAAACCCGGCCCACGTCAACCTCCAACAAAGGCGA

ΣΤΗΕΙ ILSFLGRVQLEVVSA

TTGCTGTCGGAAAAATACAAGCTTGAAACAGTGGTAAAGGAACCCACCGTCATTTATATG

2580

AACGACAGCCTTTTTATGTTCGAACTTTGTCACCATTTCCTTGGGTGGCAGTAAATATAC

LLSEKYKLETVVKEPTVIYM

GAGCGGCCGCTCAAAGCAGCCÀGCCACACCATCCATATCGAGGTGCCGCCCAACCCGTTT

2640

CTCGCCGGCGAGTTTCGTCGGTCGGTGTGGTAGGTATAGCTCCACGGCGGGTTGGGCAAA

ERPLKAASHTIHIEVPPNPF

TGGGCATCCATCGGACTGTCTGTTACACCACTCCCGCTTGGCTCCGGTGTACAATACAAG

2700

ACCCGTAGGTAGCCTGACAGACAATGTGGTGAGGGCGAACCGAGGCCACATGTTATGTTC

WAS IGLSVTPLPLGSGVQYK nt 2722-T deletado em Bb12Tet-S139

AGCCGGGTTTCGCTGGGATACTTGAACCAGAGTTTTCAAAACGCTGTCAGGGATGGTATC

2760

TCGGCCCAAAGCGACCCTATGAACTTGGTCTCAAAAGTTTTGCGACAGTCCCTACCATAG SRVSLGYLNQSFQNAVRDGI

G Y * (opa.l }

CGTTACGGGCTGGAGCAGGGCTTGTTCGGCTGGAACGTAACGGACTGTAAGATTTGCTTT

GCAATGCCCGACCTCGTCCCGAACAAGCCGACCTTGCATTGCCTGACATTCTAAACGAAA

RYGLEQGLFGWNVTDCKICF

GAATACGGGCTTTATTACAGTCCGGTCAGCACGCCGGCGGACTTCCGCTCATTGGCCCCG

CTTATGCCCGAAATAATGTCAGGCCAGTCGTGCGGCCGCCTGAAGGCGAGTAACCGGGGC

EYGLYY-SPVSTPADFR SLAP

2820

2880

ATTGTATTGGAACAGGCATTGAAGGAATCAGGGACGCAACTGCTGGAACCTTATCTCTCC ----------------------------------------------------------- 2940

TAACATAACCTTGTCCGTAACTTCCTTAGTCCCTGCGTTGACGACCTTGGAATAGAGAGG

IVLEQALKESGTQLLEPYLS

TTCACCCTCTATGCGCCCCGGGAATATCTTTCCAGGGCTTATCATGATGCACCGAAATAC ------------------------------------------------------------ ₃₀₀₀

AAGTGGGAGATACGCGGGGCCCTTATAGAAAGGTCCCGAATAGTACTACGTGGCTTTATG

FTLYAPREYl_SRAvhdAPKY

TGTGCCACCATCGAAACGGTCCAGGTAAAAAAGGATGAAGTTGTCTTTACTGGCGAGATT

------------------------------------------------------------ ₃₀₆₀ACACGGTGGTAGCTTTGCCAGGTCCATTTTTTCCTACTTCAACAGAAATGACCGCTCTAA

C A T I ETVQVKKDEVVFTGEI

CCCGCCCGCTGTATACAGGCATACCGTACTGATCTGGCCTTTTACACCAACGGGCAGAGC

------------------------------------------------------------ ₃₁₂ο

GGGCGGGCGACATATGTCCGTATGGCATGACTAGACCGGAAAATGTGGTTGCCCGTCTCG

PARCIQAYRTDLAFYTNGQS

GTATGCCTTACAGAACTGAAAGGGTATCAGGCCGCTGTCGGCAAGCCAGTCATCCAGCCC ------------------------------------------------------------ ₃₁₈₀

CATACGGAATGTCTTGACTTTCCCATAGTCCGGCGACAGCCGTTCGGTCAGTAGGTCGGG

VCLTELKGYQAAVGKPVIQP

Término da Tetraciclina

CGCCGTCCAAACAGCCGCCTGGACAAGGTGCGCCATATGTTCAGTAAGATCACTTGATAC

------------------------------------------------------------ ₃₂4₀

GCGGCAGGTTTGTCGGCGGACCTGTTCCACGCGGTATACAAGTCATTCTAGTGAACTATG

RRPNSRLDKVRHMFSKIT*

Seqüência de nucleotídeos do transposon TetW inativo de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis Bb-12®. A sequência foi obtida através do seqüenciamento em Chr. Hansen A/S. A montante está o quadro aberto 5 de leitura que codifica a transposase, nt. N° 4-966, com o aminoácido representado sob a seqüência de DNA (M.W. de aproximadamente 35 kDa). A seqüência de nt. N° 1318-3234 é o gene que codifica resistência à tetraciclina, tetW, com o aminoácido representado sob a seqüência de DNA (M.W. de aproximadamente 70 kDa).

A mutação âmbar na posição de nt N° 1741 (ntN° 424 em relação ao códon de início de tetW) para a cepa sensível à tetraciclina, DR10Tet-S9X (CHCC9070), é indicada acima da seqüência de DNA.

A mutação de alteração de quadro na posição de nt N° 2722 (nt N° 1405 em relação ao códon de início) para a cepa sensível à tetraciclina, Bb12Tet-S139 (CHCC8902), é indicada acima da seqüência de DNA.

*): indica um códon de término.

<110> Chr. Hansen A/S

Chr. Hansen A/S

Listagem de Seqüência <120> LINHAGENS DE BACTÉRIAS DE ÁCIDO LÁCTICO SENSÍVEIS A ANTIBIÓTICOS <130> P2195DK00

<160> 32

<170>	Patentln versão	3.3
<210>	1
<211>	24
<212>	DNA
<213>	Bifidobacterium	animalis subsp. lactis
<400>	1
tcgctgggat acttgaacca <	gagt

25	<210>	2
	<211>	24
	<212>	DNA
	<213>	Bifidobacterium animalis subsp. lactis.
30	<400>	2
	tcgctgggat actgaaccag agtt	24

35	<210> <211> <212> <213>	3 12 DNA Bifidobacterium animalis subsp. lactis
	<400>	3

ggatactgaa cc <210>4 <211>24 <212> DNA <213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis <4 0 0 >4 cagagcgtgg ttcagtctgt tcgg <210>5 <211>24 <212> DNA <213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis <400>5 cagagcgtgg tttagtctgt tcgg <210> 6 <211> 12

<212> DNA <213> Bif idobacteri nm an i ma 1 i s snbsp. lactis <400> 6 gtggtttagt ct

10	<210> <211> <212> <-213>	7 26 DNA Artificial
15	<220> <223>	Oligonucleotídeo usado para análise em	PCR	e	sequencíalmente de
	DNA da resistência à tetracilina-codificando	o	gene tetW de Bb-12
		- para detalhes, ver tabela 1,
	<400>	7
20	gagcatcgct taattccttc gagggg <210> 8			26
	<211>	29
	<212>	DNA
	<213>	artificial
25	<220> <223>	Oligonucleotídeo usado para análise em	PCR	e	sequencialmente de
		DNA da resistência à tetracilina-codificando	o	gene tetW de Bb-12
		- para detalhes, ver tabela 1.
30	<400>	8
	cgaggggact ttggcccacc gctgggtgg			29

35	<210> <211> <212> <213>	9 25 DNA Artificial
40	<220> <223>	Oligonucleotídeo usado para analise em PCR e sequencialmente de
		DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 9 gcaggcaggc acgtccatcc gcctc

50	<210> <211> <212> <213>	10 26 DNA Artificial
55	<220> <223>	Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e sequencialmente de
	DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12
		- para detalhes, ver tabela 1.

<400> 10 ggcttctgcc accgtggcct cgtcac 26 <210> 11

	<211>	27
	<212> <213>	DNA Artificial
5	<220> <223>	Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e DNA da resistência à tetracilina-codificando o - para detalhes, ver tabela 1.	sequencialmente de gene tetW de Bb-12
10	<400> cctgtc	11 cttg tccacgccga tatgcgc	27

	<210>	12
15	<211>	30
	<212>	DNA
	<213>	Artificial
	<220>
20	<223>	Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e	sequencialmente de
		DNA da resistência à tetracilina-codificando o	gene tetW de Bb-12
		- para detalhes, ver tabela 1.

<400> 12 cggcacctgc tgtataatgc ggattgtggc

	<210>	13
	<211>	27
30	<212>	DNA
	<213>	Artificial
	<220>
	<223>	Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e	sequencialmente de
35		DNA da resistência à tetracilina-codificando o	gene tetW de Bb-12
		- para detalhes, ver tabela 1.
	<400>	13
	gtgggaacaa aggattatga tagtccc	27
40

<210>	14
<211>	26
<212>	DNA
45 <213>	Artificial

η η n _% <223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e sequencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 14 ggctggcgtt gatttgcaga gcgtgg

<210>	15
<211>	23
<212>	DNA
<213>	Artificial

<220>

<·223> Oligonucleotideo usado para análise em PCR e sequencialmente de ONA da resistência à tetracilina codificando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 15 gcagacggtg tcgctgtccc cgg <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Oligonucleotideo usado para análise em PCR e sequencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 16 ccggggacag cgacaccgtc tgc

	<210> <2 11>	17 26
25	<212>	DNA
	<213>	Artificial

<220>

<223> Oligonucleotideo usado para análise em PCR e sequencialmente de

DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12

- para detalhes, ver tabela 1.

<400> 17 ggagcggccg ctcaaagcag ccagcc

<210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220>

^4 0 0 > j_ 8 ggcrggctgc tttgagcggc cgctcc 26 <210>

<211>

<212>

<213>

DNA

Artificial <220>

<400> 19

κ>

gcccaaaacg ggttgggcgg cacctcg <220>

<223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e sequencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codíficando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 20

15	ccagcccgta acggatacca tccc	24
	<210>	21
	<211>	30
	<212>	DNA
20	<213>	Artificial
	<220
	<223>	Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e	sequencialmente	de
		DNA da resistência à	tetracilina-codificando o	gene tetW de Bb-	12
25		- para detalhes, ver	tabela 1.
	<400>	21

gatggtcgca tgatcggcgg ggtcactccc <210> 22 <211> 3240 <212> DNA <213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis.

35	<400> 22
	cagatgacga	tttccgcatt	cagcgacgaa	ctggcacagg	tgcggacgaa	gaaaaaagca	60
	tttctcgacc	agattgaacg	gatcgtcccg	tggaaggaat	ggcttgccat	gattcagccg	120
40	tgctattaca	aaggagagcg	cggcaacaaa	ccctatccgc	tggagatcat	gctccgactg	180
	tatctgctgc	aaaacctcta	tgacctgagt	gacgaggcca	cggtggcaga	agccatcgac	240
45	agccgcgcat	tttcggagtt	ctgcggcgtc	gattccagca	accaggttcc	gaacggggat	300
	actcttggcc	ggttccggaa	cttgctgatc	aagaacggac	tgcaggagaa	gctgttcgct	360
	a rrz-r 4- π π t- z-* » '-'ti ΐί	ccigcgc	yyããCytyyC	(jLcattctga	aaaagggcac	cattgtagat	420
50	tccaccatca	tttccgcccc	ctcttctacc	aagaataagg	aaaagaaacg	ggatccggat	480
	gcccaccaag	tcaagaaggg	caacacctgg	cactttgggt	acaaagcgca	tatcggcgtg	540
	gacaaggaca	gcggactggt	tcacacagtg	gaagctacac	cggcaaatgt	ccacgacgtt	600
55
	gcggaagtgc	cgaaattatt	gacgggagag	gaagaaacag	tctatggaga	cagcggttat	660
	ctcggcgcag	gtaagcgcga	agatgccgta	gtccgaaaca	aagctggccg	gaaaatcaag	720
60	tacaagatca	atcgtcgtcc	atcgcagatg	aagaaactga	gcaaaagcgg	gcagtacgca	780
	gcaaagaaag	cggaacgggc	gaaatcctca	gtgcgagcaa	aagtagagca	tgtattcggt	840

	gtcgttaaga	agcaactgcg	ct.trcgaaaa	a^gcga a	gagggcttga	aaagcaacaa	9 3 3
5	gccaaattca	atat.catgtt	tgcgttggca	aatctgattc	tggctgacag	accctgtctg	960
	gcagcttgag	tcagtgcgcc	tttgcggaca	aaaaattcgg	aggttatcca	cagtttttat	1020
	tcggcacctg	ctgtataatg	cggattgtgg	catttgtgcg	gtgttgcctt	aaataaaact	1080
10	ataatcaaat	agtgggaaca	aaggattatg	atagtccctt	ttgtaggggc	ttagtttttt	1140
	gtacccaatl	taagaatact	tttgcctLat	caattttgac	atatccccaa	aaacagcact	1200
15	cacaaacagg	tgtatgctgt.	atatgtgtat	gtccgcaaat	tatcatcccc	agtggtaaaa	12 6 0
gtattttact	gctggggatt	11tatgccc t	tcggggcagt	aaagggagga	caatcacatg	1320
	aaaataatca	atattggaat	tcttgcccat	gtagacgctg	gaaagacgac	cttgacggag	1380
20	agcctgctat	atgccagcgg	agccatttca	gaaccgggga	gcgtcgaaaa	agggacaacg	1440
	aggacggaca	ccatgctttt	ggagcggcag	cgtgggatta	ccattcaagc	ggcagtcact	1500
25	tccttccagt	ggcacagatg	taaagtcaac	attgtggata	cgcccggcca	catggatttt	1560
	ttggcggagg	tgtaccgctc	tttggctgtt	ttagatgggg	ccatcttggt	gatctccgct	1620
	aaagatggcg	tgcaggccca	gacccgtatt	ctgttccatg	ccctgcggaa	aatgaacatt	1680
30	cccaccgtta	tctttatcaa	caagatcgac	caggctggcg	ttgatttgca	gagcgtggtt	1740
	cagtctgttc	gggataagct	ctccgccgat	attatcatca	agcagacggt	gtcgctgtcc	1800
35	ccggaaatag	tcctggagga	aaataccgac	atagaagcat	gggatgcggt	catcgaaaat	1860
	aacgataaat	tattggaaaa	gtatatcgca	ggagaaccaa	tcagccggga	aaaacttgtg	1920
	cgggaggaac	agcggcgggt	tcaagacgcc	tccctgttcc	cggtctatta	tggcagcgcc	1980
40	aaaaagggcc	ttggcattca	accgttgatg	gatgcggtga	cagggctgtt	ccaaccgatt	2040
	ggggaacagg	ggagcgccgc	cctatgcggc	agcgttttca	aggtggagta	tacagattgc	2100
45	ggccagcggc	gtgtctatct	acggctatac	agcggaacgc	tgcgcctgcg	ggatacggtg	2160
	gccctggccg	ggagagaaaa	gctgaaaatc	acagagatgc	gtattccatc	caaaggggaa	2220
	attgttcgga	cagacaccgc	ttatccgggt	gaaattgtta	tccttcccag	cgacagcgtg	2280
50	aggttaaacg	atgtattagg	ggacccaacc	cggctccctc	gtaaaaggtg	gcgtgaggac	2340
	cccctcccca	tgctgcggac	gtcgattgcg	ccgaaaacgg	cagcgcaaag	agaacggctg	2400
55	ctggacgctc	ttacgcaact	tgcggatact	gacccgcttt	tgcgctgcga	ggtggattcc	2460
	atcacccatg	agatcattct	ttcttttttg	ggccgggtgc	agttggaggt	tgtttccgct	2520
	ttgctgtcgg	aaaaatacaa	gcttgaaaca	gtggtaaagg	aacccaccgt	catttatatg	2580
60	gagcggccgc	tcaaagcagc	cagccacacc	atccatatcg	aggtgccgcc	caacccgttt	2640
	tgggcatcca	tcggactgtc	tgttacacca	ctcccgcttg	gctccggtgt	acaatacaag	2700

	agccgggttt	cgctgggata	cttgaaccag	agttttcaaa	acgctgtcag	ggatggtatc	2760
	cgttacgggc	tggagcaggg	cttgttcggc	tggaacgtaa	cggactgtaa	gatttgcttt	2820
5	gaatacgggc	tttattacag	tccggtcagc	acgccggcgg	acttccgctc	attggccccg	2880
	attgtattgg	aacaggcatt	gaaggaatca	gggacgcaac	tgctggaacc	ttatctctcc	2940
10	ttcaccctct	atgcgccccg	ggaatatctt	tccagggctt	atcatgatgc	accgaaatac	3000
	tgtgccacca	tcgaaacggt	ccaggtaaaa	aaggatgaag	ttgtctt tac	tggcgagatt	3 060
	cccgcccgct	gtatacaggc	ataccgtact	gatctggcct	tttacaccaa	cgggcagagc	-' n J, «L
15	gtatgcctta	cagaactgaa	agggtatcag	gccgctgtcg	gcaagccagt	catccagccc	3180
	cgccgtccaa	acagccgcct	ggacaaggtg	cgccatatgt	tcagtaagat	cacttgatac	3240

<210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> iniciador a jusante usado para a detecção de Bb-12Tet-S139 <400> 23 caatacaaga gccgggtttc <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> iniciador reverso usado para a detecção de Bb-12Tet-S139

gtgctgaccg gactgtaata aa

45	<210> <211> <212> <213>	25 11 DNA Artificial
50	<220> <223>	Sonda de detecção que	compreende ácidos nucléicos Locked (LNA)
55	<220> <221> <222> <223>	misc_feature ¢1)..() A = A ligado à carbóxi	-Fluoresceína

	<220>
	<221>	base modificada
60	<222>	(2)..(2)
<223>	T = T LNA

<220>

<2 21> modi f ied_bas^ <222> (4)..(10) <223> LNA C, T, G, A, A, C and C <220>

<221> misc_feature <222> (11)..() <223> A = A ligado a carbóxi-tetrametil-rodamina <400> 25 atactgaacc a

15	<210>	26
	<211>	24
	<212>	DNA
	<213>	Bifidobacterium animalis susp. lactis
20	<400>	26

tacttgaacc agcgttttca aaac

25	<210> <211> <212> <213>	27 12 DNA Bifidobacterium animalis subsp. lactis
30	<400>	27
accagcgttt tc

<210> 28 <211> 12 <212> DNA <213> Bifidobacterium animalis subspecies lactis

<400> 28 cgccctgcca ca <210> 29 <211> 12 <212> DNA <213> Bifidobacterium animalis subspecies lactis <400> 29 <210> 30 <211> 12 <212> DNA <213> Bifidobacterium animalis subspecies lactis <400> 30 tagacgatgg aa

<210>	31
<211>	12
<212>	DNA

<213>	Bifidobacterium	animalis	subspecies lactis
<400>	31
cggtcc	gggt aa			12
<210>	32
<211>	13
<212>	DNA
<213>	Bifidobacterium	animalis	subspecies lactis
<400>	32
ctgatc	cggc ctt			13

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para preparar uma cepa de Bifidobacterium sp. que contém um gene tetW mutante em seu cromossomo, em que a dita mutação torna a cepa sensível a tetraciclinas e a dita cepa é isolada a partir de uma cepa progenitora bacteriana resistente a tetraciclina, em que o fenótipo de ressitência a antibiótico é causado pela expressão do gene tetW integrado de forma estável em seu cromossomo, o processo caracterizado pelo fato de que compreende submeter as células a um agente mutagênico químico e a um agente mutagênico físico, e que o processo compreende as etapas de:

i) cultivo das células protegenitoras para a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencial, ii) transferência de uma alíquota das células para meio fresco contendo brometo de etídio (EtBr), iii) transferência da cultura para um ou mais recipientes para formar uma camada de cultura de 0,5-10 mm de espessura, iv) submissão da cultura a um tratamento com UV,

v) cultivo das células mutadas para a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencial, vi) transferência de uma alíquota de bactérias para uma ou mais placas de Petri contendo um meio de crescimento adequado com ágar, a alíquota das bactérias é selecionada para fornecer colônias isoladas, vii) identificação dessas colônias que adquiriram sensibilidade ao antibiótico por plaqueamento de réplicas em placas de Petri com e sem o antibiótico, e viii) isolamento, expansão e manutenção dessas colônias sensíveis ao antibiótico identificadas como uma nova cepa sensível ao antibiótico tetraciclina;

em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) de tetraciclina da cepa progenitora é de pelo menos 10 pg de tetraciclina/mL e a MIC de tetraciclina da cepa sensível ao antibiótico é de 1,5 pg de tetraciclina/mL ou menos; e em que a célula progenitora é selecionada do grupo que consiste na cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC5445 (Bb-12®),

Petição 870180046715, de 30/05/2018, pág. 10/20 depositada em 30 de setembro de 2003 junto à Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuituren sob o número de acesso DSM15954, e na cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC7158, depositada em 28 de abril de 2005 junto à Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuituren sob o número de acesso DSM 17280.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura obtida na etapa iv) é submetida a uma etapa de enriquecimento em relação às mutações que compreende as etapas de:

iva) transferência de uma alíquota da cultura tratada com UV para meio fresco contendo uma dose de um análogo de penicilina que é prejudicial para as células em crescimento exponencial, mas tolerável pelas células que não estão em crescimento, e ivb) cultivo das células em um meio que compreende o dito análogo de penicilina sob condições que promoveríam o crescimento exponencial na ausência de penicilina ou de um análogo de penicilina tal como a ampicilina.
3. Cepa de Bifidobacterium, caracterizada pelo fato de que é sensível a tetraciclinas devido a uma mutação de inativação no gene tetW localizado no cromossomo, em que o gene tetW compreende pelo menos uma sequência selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 3 [GGA TAC TGA ACC] e SEQ ID NO: 6 [GTG GTT TAG TCT];

em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) de tetraciclina da cepa sensível é de 1,5 pg de tetraciclina/mL ou menos; e em que a cepa é selecionada dentre o grupo consistindo de Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC8902 (Bb-12Tet-S139) e depositada em 28 de abril de 2005 junto à Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuituren sob o número de acesso DSM17281, e Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC9070 (DR10Tet-S9X) e depositada em 28 de abril de 2005 junto à Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuituren sob o número de acesso DSM 17282.
4. Uso de uma cepa de Bifidobacterium como definida na

Petição 870180046715, de 30/05/2018, pág. 11/20 reivindicação3, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um material que pode ser ingerido ou de uma cultura bacteriana, em que o material que pode ser ingerido é um alimento ou um produto alimentício fermentado.