CN110016448A - 一种快捷分离筛选抑菌性乳酸菌的方法 - Google Patents

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Abstract

一种快捷分离筛选抑菌性乳酸菌的方法，步骤如下：1）用平板计数琼脂制备平板和MRS琼脂制备平板；2）将样品用MRS肉汤培养基进行增菌；3）筛菌：增菌之后进行梯度稀释再涂布在MRS琼脂平板上；待菌落长出之后，将该平板在平板计数琼脂平板上按压进行接种；接种后将平板计数琼脂平板在30℃下培养，菌落长出后在该平板上倾注含有106cfu/g指示菌的PCA培养基，形成双层琼脂，进行培养；4）观察抑菌圈，标记出有抑菌性的菌落，并在MRS琼脂平板上找出对应位置的黄色菌落，5）挑取该单菌落、再通过平板划线法进一步纯化即得到具有抑菌性的乳酸菌菌株。本发明可快速从样品中筛选出具有抑菌性的乳酸菌，方便快捷，提高了筛菌效率。

Description

一种快捷分离筛选抑菌性乳酸菌的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种快捷分离筛选具有抑菌性乳酸菌的方法。
背景技术
近年来，食品安全问题在全球已经成为备受关注的问题，水产品由于其丰富的营养价值在全球范围内都很受欢迎，但同时也由于其营养成分有利于腐败微生物和常见的食源性疾病原体的生长和繁殖，海产品的安全和营养价值在贮藏和运输的过程比肉类等其它食品下降的更快。
目前，化学防腐剂是延长货架期的主要手段之一，但由于消费者对化学添加剂的担忧；开发并使用更多的天然防腐剂来提高食品安全性的生物保鲜技术越来越受到关注。微生物能够产生具有抑菌性代谢产物，可以作为生物防腐剂抑制腐败菌和致病菌的生长，从而达到延长食品货架期和提高食品安全性的目的。乳酸菌通常被认为是安全的微生物（GRAS），同时为了延长水产品的货架期，提高其品质，选用属于水产品及其加工环境中存在的乳酸菌微生物群是有利的方法，因为它们已经适应这些环境。因此利用方便快捷的方法分离具有抑菌性的乳酸菌具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、快捷分离筛选具有抑菌性乳酸菌的方法，减小工作量，快速筛选出具有抑菌性的乳酸菌。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种快捷分离筛选抑菌性乳酸菌的方法：
包括以下几个步骤：
(1) 从水产品市场购买水产品后，半小时内4℃低温保鲜盒运送至实验室；
(2)在无菌环境下取出水产品肠道，并用无菌手术剪刀将其充分剪碎混匀，加入含有25mL的无菌生理盐水中重复充分振荡摇匀，制成原液；
（3）吸取1 mL原液用MRS肉汤培养基进行增菌培养48-72h；将培养后的菌液用灭菌后的生理盐水稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8共6个稀释梯度；
（4）将灭菌后的平板计数琼脂培养基倾注在150mm的培养皿中，将添加溴甲酚紫的MRS琼脂倾注在90mm的培养皿中制备MRS琼脂平板；
（5）将（3）获得的稀释菌液涂布在MRS琼脂平板上，30℃下培养48-72h；
（6）待（3）中菌落长出之后，将该平板在平板计数琼脂平板上按压进行接种，30℃下培养48-72h；
（7）平板计数琼脂平板菌落形成后，在其表面倾注含有106cfu/ml指示菌的PCA培养基，形成双层琼脂，放置30℃培养18-24h,并观察菌落附近是否有抑菌圈；
（8）在添加溴甲酚紫MRS琼脂平板中找出和（7）中平板计数琼脂平板中具有抑菌圈的菌落对应位置且菌落颜色为黄色的菌落；
（9）将（8）中的菌落用平板划线法继续分离纯化，对每株菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验后，选择革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株保存；
（10）提取菌株的DNA，进行16S rDNA的PCR扩增与测序，并进行菌株的同源性分析。进一步，上述步骤（3）中的稀释涂布，使用灭菌后的生理盐水进行梯度稀释。
进一步，所述平板计数琼脂制备平板运用150mm的培养皿，MRS琼脂（添加溴甲酚紫）培养基制备平板运用90mm的培养皿。
进一步，所述MRS琼脂中溴甲酚紫添加量为0.01%。
进一步，所述的所有操作均在无菌操作台中进行，保持无菌环境。
本发明的有益效果：
利用本发明的方法可方便、快捷分离筛选具有抑菌性的乳酸菌的方法，具有操作简单可行，减小工作量、提高效率等优点。本方法在一般的生化实验室均可实现抑菌性乳酸菌的快速筛选。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不受实施例任何形式的限制。
从芦潮港水产品市场购买花鲈鱼后，低温运送至实验室。在无菌条件下取肠道剪碎后加入含有适量生理盐水均质袋中进行均质，摇匀之后吸取1ml至MRS肉汤培养基中在30℃下进行增菌48-72h；将培养后的菌液用灭菌后的生理盐水稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8共6个稀释梯度，涂布于MRS琼脂（含溴甲酚紫）的平板（90mm培养皿）中，30℃下培养48-72h;待菌落长出后将该平板在平板计数琼脂平板（150mm培养皿）上按压进行接种，30℃下培养48-72h；待菌落长出后在上述平板计数琼脂平板（150mm培养皿）上倾注含有106cfu/ml大肠杆菌的平板计数琼脂培养基，凝固后放置30℃下培养18-24h；之后观看抑菌圈，标记出有抑菌性的菌落，并在MRS琼脂（含溴甲酚紫）的平板（90mm培养皿）上找出对应位置的黄色菌落，再通过划线法即得到具有抑菌性的乳酸菌菌株。对每株菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验后，选择革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株保存；提取菌株的DNA，进行16SrDNA的PCR扩增与测序，并进行菌株的同源性分析。

Claims (4)

1.一种快捷分离筛选抑菌性乳酸菌的方法，其特征在于：
包括以下几个步骤：
(1) 从水产品市场购买水产品后，半小时内4℃低温保鲜盒运送至实验室；
(2)在无菌环境下取出水产品肠道，并用无菌手术剪刀将其充分剪碎混匀，加入含有25mL的无菌生理盐水中重复充分振荡摇匀，制成原液；
（3）吸取1 mL原液用MRS肉汤培养基进行增菌培养48-72h；将培养后的菌液用灭菌后的生理盐水稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8共6个稀释梯度；
（4）将灭菌后的平板计数琼脂培养基倾注在150mm的培养皿中，将添加溴甲酚紫的MRS琼脂倾注在90mm的培养皿中制备MRS琼脂平板；
（5）将（3）获得的稀释菌液涂布在MRS琼脂平板上，30℃下培养48-72h；
（6）待（3）中菌落长出之后，将该平板在平板计数琼脂平板上按压进行接种，30℃下培养48-72h；
（7）平板计数琼脂平板菌落形成后，在其表面倾注含有106cfu/ml指示菌的PCA培养基，形成双层琼脂，放置30℃培养18-24h,并观察菌落附近是否有抑菌圈；
（8）在添加溴甲酚紫MRS琼脂平板中找出和（7）中平板计数琼脂平板中具有抑菌圈的菌落对应位置且菌落颜色为黄色的菌落；
（9）将（8）中的菌落用平板划线法继续分离纯化，对每株菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验后，选择革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株保存；
（10）提取菌株的DNA，进行16S rDNA的PCR扩增与测序，并进行菌株的同源性分析。
2.根据权利要求书1所述一种快捷分离筛选抑菌性乳酸菌的方法，其特征在于所有的操作均在无菌操作台中进行，保持无菌环境。
3.根据权利要求书1所述一种快捷分离筛选抑菌性乳酸菌的方法，其特征在于MRS琼脂中溴甲酚紫添加量为0.01%。
4.根据权利要求书1所述一种快捷分离筛选抑菌性乳酸菌的方法，其特征在于可以快速从样品中筛选出具有抑菌性的乳酸菌，方便快捷、减小了工作量、提高了筛菌效率。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006119780A2 (en) * 2005-05-11 2006-11-16 Chr. Hansen A/S New antibiotic-sensitive lactic acid bacteria strains
WO2019027376A2 (en) * 2017-08-03 2019-02-07 Chiang Mai University METHOD FOR INDUCING MICROBIAL MUTAGENESIS TO PRODUCE LACTIC ACID
CN110527642A (zh) * 2019-04-24 2019-12-03 上海海洋大学 一种具有生物抗菌作用的粪肠球菌

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006119780A2 (en) * 2005-05-11 2006-11-16 Chr. Hansen A/S New antibiotic-sensitive lactic acid bacteria strains
WO2019027376A2 (en) * 2017-08-03 2019-02-07 Chiang Mai University METHOD FOR INDUCING MICROBIAL MUTAGENESIS TO PRODUCE LACTIC ACID
CN110527642A (zh) * 2019-04-24 2019-12-03 上海海洋大学 一种具有生物抗菌作用的粪肠球菌

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
曾志刚等: "细菌素产生菌的筛选及其细菌素的分离纯化", 《中国抗生素杂志》 *
沈勇等: "花鲈鱼肠道中产细菌素粪肠球菌的筛选和抑菌效果研究", 《食品与发酵工业》 *
王睿迪等: "咸干蓝点马鲛品质特征与优势菌群分析", 《渔业科学进展》 *
董韩博等: "带鱼肠道中抑菌性乳酸菌的筛选和抑菌效应分析", 《食品与发酵工业》 *
韩新锋等: "低温乳酸菌发酵泡白菜工艺与品质分析", 《食品与发酵工业》 *

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