KR101840354B1 - 지방족 알데히드를 생산하기 위한 방법과 조성물들 - Google Patents

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Abstract

지방족 알데히드를 생산하기 위하여, 뉴클레오티드 서열들, 아미노산 서열들, 및 숙주 세포들을 포함하는, 방법들 및 조성물들이 설명된다.

Description

지방족 알데히드를 생산하기 위한 방법과 조성물들{METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING FATTY ALDEHYDES}
관련된 출원들에 대한 교차 참조
본 출원은 2008년 10월 7일 제출된 U.S. 가출원 No. 61/103,447의 우선권을 주장하고, 이의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
석유는 대지에서 액체, 가스, 또는 고체 형태로 발견되는 한정된 천연 자원이다. 석유는 주로 탄화수소들로 구성되고, 이들 탄화수소는 주로 탄소와 수소로 구성된다. 또한, 이는 상당한 양의 다른 원소, 예를 들면, 질소, 산소, 또는 황을 상이한 형태로 포함한다.
석유는 귀중한 자원이긴 하지만, 석유 제품들은 상당한 재정적 그리고 환경적 비용을 대가로 하여 개발된다. 먼저, 석유의 원천이 발견되어야 한다. 석유 탐사는 많은 비용이 소요되고 위험한 작업이다. 심해 유정(deep water well)을 탐사하는 비용은 1억 달러를 초과할 수 있다. 게다가, 이들 유정에 석유가 있을 것이라는 보장이 없다. 시추된 유정 중에서 단지 40 %가 상업적인 탄화수소들을 산출하는 생산 유정에 이르는 것으로 추정된다. 경제적 비용에 더하여, 석유 탐사는 환경적으로 고비용을 유발한다. 예를 들어, 근해 탐사는 주변 해양 환경을 파괴한다.
생산 유정이 발견된 이후, 석유는 많은 비용을 들여서, 대지로부터 추출되어야 한다. 1차 회수 동안, 지하의 자연 압력은 유정 내에서 석유의 대략 20 %를 추출할 만큼 충분하다. 이러한 자연 압력이 하락함에 따라서, 경제성이 있는 경우에 2차 회수 방법이 이용된다. 일반적으로, 2차 회수는 예를 들어, 물 주입(water injection), 천연 가스 주입(natural gas injection), 또는 가스 리프트(gas lift)에 의해 유정의 압력을 증가시키는 단계를 필요로 한다. 2차 회수 방법을 사용하여, 추가로 5 % 내지 15 %의 석유가 회수된다. 2차 회수 방법이 소진되면, 경제성이 있는 경우에 3차 회수 방법이 사용될 수 있다. 3차 방법은 석유가 더욱 용이하게 추출될 수 있도록 석유의 점성도(viscosity)를 감소시키는 단계를 포함한다. 3차 회수 방법을 사용하여, 추가로 5 % 내지 15 %의 석유가 회수된다. 따라서 최적 환경에서조차도, 유정 내에서 50 %의 석유만 추출될 수 있다. 또한, 석유 추출은 환경적 비용을 유발한다. 예를 들어, 석유 추출은 표면으로 부상하는 대량의 석유 삼출(seepage)을 유발할 수 있다. 게다가, 근해 시추는 주변 해양 환경을 교란하거나 파괴하는 해저(seabed)의 준설을 수반한다.
석유 매장물이 대지 전반에서 균일하게 발견되지 않기 때문에, 석유는 석유 생산 지역에서 석유 소비 지역으로 먼 거리에 걸쳐 수송되어야 한다. 수송 비용에 더하여, 파괴적인 기름 유출의 환경적 위험 또한 존재한다.
자연적인 형태에서, 대지로부터 추출된 원유는 상업적 용도가 극히 적다. 이는 다양한 길이 및 복잡성(complexity)의 탄화수소들[예를 들어, 파라핀 (또는 알칸), 올레핀 (또는 알켄), 알킨, 나프텐 (또는 시클로알칸), 지방족 화합물, 방향족 화합물 등]의 혼합물이다. 이에 더하여, 원유는 여타 유기 화합물들(예를 들어 질소, 산소, 황 등을 함유하는 유기 화합물들) 및 불순물(예를 들어 황, 염, 산, 금속 등)을 함유한다.
이런 이유로, 원유는 상업적으로 이용되기에 앞서, 정유되고 정제되어야 한다. 높은 에너지 밀도(energy density) 및 편의한 수송능력(transportability)으로 인하여, 대부분의 석유는 수송 연료(예를 들어, 가솔린, 디젤, 항공 연료 등), 난방유, 액화 석유 가스 등과 같은 연료로 정제된다.
원유는 또한, 석유화학제품을 생산하기 위한 원료의 일차 공급원이다. 석유로부터 유래된 원료의 2가지 주요 종류는 짧은 사슬 올레핀들(예를 들어, 에틸렌 및 프로필렌) 그리고 방향족들(예를 들어, 벤젠 및 크실렌 이성질체들)이다. 이들 원료는 접촉 분해(catalytic cracking), 증기 분해(steam cracking), 또는 접촉 개질공정(catalytic reforming)과 같은 다양한 방법들을 사용하여 상당한 비용을 들여 원유를 분해 (cracking)함으로써 원유 내에서 더욱 긴 사슬 탄화수소들로부터 유래된다. 이들 원료는 원유로부터 직접적으로 정제될 수 없는 석유화학제품들, 이를 테면 단량체, 용매, 세정제, 또는 접착제를 만드는데 사용된다.
원유로부터 유래된 원료의 한 가지 예시는 에틸렌이다. 에틸렌은 폴리에틸렌, 에탄올, 에틸렌 옥사이드, 에틸렌 글리콜, 폴리에스테르, 글리콜 에테르, 에톡실레이트, 비닐 아세테이트, 1,2-디클로로에탄, 트리클로로에틸렌, 테트라클로로에틸렌, 비닐 클로라이드, 및 폴리비닐 클로라이드와 같은 석유화학제품들을 생산하는데 사용된다. 원료의 추가적인 예시는 프로필렌이며, 이는 이소프로필 알코올, 아크릴로니트릴, 폴리프로필렌, 프로필렌 옥사이드, 프로필렌 글리콜, 글리콜 에테르, 부틸렌, 이소부틸렌, 1,3-부타디엔, 합성 탄성중합체, 폴리올레핀, 알파-올레핀, 지방 알코올, 아크릴산, 아크릴 중합체, 알릴 클로라이드, 에피클로로하이드린, 및 에폭시 수지를 생산하는데 사용된다.
이후에, 이들 석유화학제품은 플라스틱, 수지, 섬유, 탄성중합체, 약제, 윤활제, 또는 겔과 같은 특수 화학제품들을 만드는데 사용될 수 있다. 석유화학 원료로부터 생산될 수 있는 특정한 특수 화학제품들은 지방산, 탄화수소들(예를 들어 긴 사슬, 분지형 사슬, 포화, 불포화 등), 지방족 알코올, 에스테르, 지방족 알데히드(fatty aldehyde), 케톤, 윤활제 등이다.
알데히드는 많은 특수 화학제품들을 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 알데히드들은 중합체, 수지(예를 들어, Bakelite), 염료, 향료, 가소제, 향수, 약제, 및 기타 화학제품들을 생산하는데 사용된다. 일부는 용매, 보존제, 또는 붕해제로서 사용된다. 비타민과 호르몬과 같은 일부 천연 및 합성 화합물은 알데히드류이다. 이에 더하여, 많은 당은 알데히드 기들을 함유한다.
원유로부터 이들 특수 화학제품들을 수득하는 것은 대량의 에너지뿐만 아니라 상당한 재정적 투자가 요구된다. 또한, 이는 비효율적인 과정인데, 그 이유는 빈번하게 원유 내의 긴 사슬 탄화수소가 더욱 작은 단량체를 생산하기 위하여 분해(cracking)되기 때문이다. 이후에, 이들 단량체는 더욱 복합된 특수 화학제품들을 제조하기 위한 원료로서 사용된다.
석유를 탐사, 추출, 수송, 정제하는 것과 관련된 문제점들에 더하여, 석유는 점점 줄어들고 있는 한정된 자원이다. 세계 석유 소비의 예상치는 연간 300억 배럴(barrel)이다. 일부 예상에 따르면, 현재의 생산 수준에서, 세계 석유 매장량은 2050년 이전에 고갈될 것으로 추정된다.
최종적으로, 석유 기반 연료의 연소는 온실 가스(예를 들어, 이산화탄소) 및 다른 형태의 공기 오염(예를 들어, 일산화탄소, 이산화황 등)을 방출한다. 연료에 대한 세계 수요가 증가함에 따라서, 온실 가스 및 다른 형태의 공기 오염의 방출 또한 증가하고 있다. 대기 중에서 온실 가스의 축적은 증가된 지구 온난화(global warming)로 이어진다. 따라서 국지적인 환경 손상(예를 들어 기름 유출, 해양 환경의 준설 등)에 더하여, 석유 연소 또한 지구 환경을 손상시킨다.
석유에 의해 유발되는 본질적 과제로 인하여, 석유와 같이 탐사되거나, 추출되거나, 장거리에 걸쳐 수송되거나, 또는 실질적으로 정제될 필요가 없는 재생가능 석유 공급원이 요구된다. 또한, 석유 산업 및 석유 기반 연료의 연소에 의해 유발되는 환경 손상의 유형과 상관없이, 경제적으로 생산될 수 있는 재생가능 석유 공급원이 요구된다. 유사한 이유로, 석유로부터 전형적으로 유래되는 화학제품들의 재생가능 공급원이 또한 요구된다.
재생가능한 석유를 생산하는 일 방법은 재생가능한 석유 생성물을 생산하는 미생물을 공학처리(engineering)하는 것이다. 일부 미생물은 화학제품들을 생산하는 자연적인 능력을 갖는다. 예를 들어, 효모는 에탄올(예를 들어, 맥주, 와인 등)을 생산하는데 수 세기 동안 사용되어왔다. 최근 몇 년간, 고도의(advanced) 생명공학의 발달을 통하여, 이전에 전혀 생산할 수 없던 바이오생산물(bioproduct)을 생산하도록 유기체를 대사적으로(metabolically) 공학처리(metabolically engineered) 할 수 있다. 이러한 세포 활동들로부터 유도된 화학제품들과 같은 생산물들은 바이오생산물들로 알려져 있다. 이러한 세포 활동들로 생산된 연료는 바이오연료로 알려져 있다. 생물 연료는 석유 기반 연료에 대한 재생가능한 대체 연료이다. 바이오연료는 여하한 석유 기반 연료(예를 들어, 가솔린, 디젤, 항공 연료, 난방유 등)에 대하여 대체될 수 있다. 바이오연료는 식물체(plant matter), 동물체(animal matter), 또는 심지어 노폐물(waste product)과 같은, 재생가능한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 이러한 재생가능한 공급원은 집합적으로 바이오매스(biomass)로 알려져 있다. 석유 기반 연료보다 바이오연료의 한가지 이점은 비싸지 않고, 위험한 탐사 또는 추출이 요구되지 않는다는 점이다. 이에 더하여, 바이오연료는 국지적으로 생성될 수 있다. 따라서, 바이오연료는 장거리에 걸친 수송이 요구되지 않는다. 게다가, 바이오연료는 원유를 정제하는 것과 같이 에너지 집약적인 정제(energy intensive refining) 및 비용을 필요로 하지 않고 직접적으로 만들어질 수 있다. 다른 상황에서, 바이오연료는 제한적이고 비용 효율이 높은 정제의 단계(level)가 요구될 수 있다. 더욱이, 바이오연료의 사용은 연소되는 동안 방출되는 환경적으로 유해한 방출물(예를 들어, 온실가스, 대기 오염 등)의 양을 감소시킴으로써 환경을 개선한다. 예를 들어, 바이오연료는 바이오매스, 재생가능한 천연 자원으로부터 생산되므로, 바이오연료는 균형잡힌 탄소 순환을 유지한다. 바이오연료의 연소는(예를 들어, 이산화탄소와 같은) 탄소를 방출하는 동시에, 이러한 탄소는 바이오매스가 생산되는 동안 재순환될 것이므로(예를 들어, 작물의 경작), 석유 기반 연료와는 다른 탄소 순환의 균형을 유지한다.
유사한 이유로, 생물학적으로 유도된 화학제품들은 석유 기반 연료보다 바이오연료와 같은 이점들을 제공한다. 생물학적으로 유도된 화학제품들은 석유 화학제품들에 대한 재생가능한 대체품이다. 탄화수소들(예를 들어, 알칸, 알켄, 또는 알킨), 지방족 알코올, 에스테르, 지방산, 지방족 알데히드, 및 케톤과 같은 생물학적으로 유래된 화학제품들은 석유 화학제품보다 우수하며, 이는 부가적인 정제(extensive refining) 없이 직접적으로 생산되기 때문이다. 석유 화학제품들과 달리, 생물학적으로 유래된 화학제품들은, 이후에 좀 더 복합적인 석유 화학제품들을 만들기 위하여 더 가공되어야 하는 원료를 회수하기(recover) 위해 원유처럼 정제될 필요가 없다. 생물학적으로 유래되는 화학제품들은 직접적으로 바이오매스에서 원하는 화학적 생산물로 전환된다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드들을 인코딩하는 유전자의 확인에 기초된다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 114, 116, 118, 120, 또는 122의 아미노산 서열, 또는 이의 변이체(variant)를 포함하는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 발현하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 숙주 세포에서 지방족 알데히드를 분리하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경에서 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수동적으로 수송된다.
일부 실시예에서, 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 삽입, 또는 결실을 가지는 SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 114, 116, 118, 120, 또는 122의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 폴리펩티드는 카르복시산 환원효소 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드는 하기의 보존성 아미노산 치환체들 중에서 하나 이상을 포함한다: 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신과 같은 지방족 아미노산의 다른 지방족 아미노산으로의 대체물(replacement); 세린의 트레오닌으로의 대체물; 트레오닌의 세린으로의 대체물; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 잔기의 또 다른 산성 잔기로의 대체물; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드기를 보유하는 잔기의 아미드기를 보유하는 다른 잔기로의 대체물; 리신 및 아르기닌과 같은 염기성 잔기의 또 다른 염기성 잔기로의 교환물; 그리고 페닐알라닌 및 티로신과 같은 방향족 잔기의 또 다른 방향족 잔기로의 대체물. 일부 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가, 삽입, 또는 결실을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 카르복시산 환원효소 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작(modifying)하는 단계를 더 포함한다. 여하한 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 대안적인 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 감쇠(attenuating)시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 지방산 생성효소는 티오에스테라아제이다. 특정 실시예에서, 상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없이 tesA, 또는 tesA로 인코딩된다.
여타 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 지방산 분해 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리(genetically engineered)된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 특정 실시예에서, 상기 숙주 세포는 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857을 인코딩하는 유전자에 의해 인코딩되는 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 여하한 실시예에서, 유전공학처리된 숙주 세포는 상기 언급된 아실-CoA 생성효소 유전자들과 같은 지방산 분해 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자들의 결여(knockout)를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabb에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabb의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 레벨을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드는 박테리아, 식물, 곤충, 효모, 균류, 또는 포유동물로부터 파생된다.
여하한 실시예에서, 폴리펩티드는 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 균류 세포, 곰팡이 세포, 박테리아 세포, 또는 본 명세서에 설명된 여타 유기체로부터 파생된다. 일부 실시예에서, 박테리움은 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 마리움(Mycobacterium marinum), 및 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 마이코박테리움이다. 여타 실시예에서, 박테리움은 노카르디아 속(Nocardia sp.) NRRL 5646, 노카르디아 파르시니카(Nocardia farcinica), 스트렙토마이시스 그리세우스(Streptomyces griseus), 사리니스포라 아레니코라(Salinispora arenicola), 또는 크라비박테르 미치가네네시스(Clavibacter michiganenesis)이다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 114, 116, 118, 120, 또는 122의 아미노산 서열에 대하여 대략 70 %이상, 대략 75 %이상, 대략 80 %이상, 대략 85 % 이상, 대략 90 %이상, 대략 91 %이상, 대략 92 %이상, 대략 93 %이상, 대략 94 %이상, 대략 95 %이상, 대략 96 %이상, 대략 97 %이상, 대략 98 %이상, 또는 대략 99 %이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 114, 116, 118, 120, 또는 122의 아미노산 서열이다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포에서 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수동적으로 수송된다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계를 더 포함한다. 여하한 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 대안적인 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 감쇠시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 지방산 생성효소는 티오에스테라아제이다. 특정 실시예에서, 상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없이 tesA, 또는 tesA로 인코딩된다.
여타 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 지방산 분해 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전 공학처리된다. 특정 실시예에서, 상기 숙주 세포는 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857을 인코딩하는 유전자에 의해 인코딩되는 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 여하한 실시예에서, 유전공학처리된 숙주 세포는 상기 언급된 아실-CoA 생성효소 유전자들과 같은 지방산 분해 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자들의 결여를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 레벨을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드는 박테리아, 식물, 곤충, 효모, 균류, 또는 포유동물로부터 파생된다.
여하한 실시예에서, 폴리펩티드는 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 균류 세포, 곰팡이 세포, 박테리아 세포, 또는 본 명세서에 설명된 여타 유기체로부터 파생된다. 일부 실시예에서, 박테리움은 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 마리움(Mycobacterium marinum), 및 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 마이코박테리움이다. 여타 실시예에서, 박테리움은 노카르디아 속(Nocardia sp.) NRRL 5646, 노카르디아 파르시니카(Nocardia farcinica), 스트렙토마이시스 그리세우스(Streptomyces griseus), 사리니스포라 아레니코라(Salinispora arenicola), 또는 크라비박테르 미치가네네시스(Clavibacter michiganenesis)이다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121의 뉴클레오티드 서열의 보체(complement), 또는 이의 단편에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 카르복시산 환원효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포에서 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수동적으로 수송된다.
일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 덜 엄격한(low stringency), 엄격한(medium stringency), 매우 엄격한(high stringency), 또는 아주 매우 엄격한(very high stringency) 조건하에서, SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121의 뉴클레오티드 서열의 보체, 또는 이의 단편에 혼성화된다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계를 더 포함한다. 여하한 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 대안적인 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 감쇠시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예예서, 상기 지방산 생성효소는 티오에스테라아제이다. 특정 실시예에서, 상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없이 tesA, 또는 tesA로 인코딩된다.
여타 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 지방산 분해 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전 공학처리된다. 특정 실시예에서, 상기 숙주 세포는 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857을 인코딩하는 유전자에 의해 인코딩되는 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 여하한 실시예에서, 유전공학처리된 숙주 세포는 상기 언급된 아실-CoA 생성효소 유전자들과 같은 지방산 분해 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자들 중의 결여를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 식물, 곤충, 효모, 균류, 또는 포유동물로부터 파생된다.
여하한 실시예에서, 폴리펩티드는 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 균류 세포, 곰팡이 세포, 박테리아 세포, 또는 본 명세서에 설명된 여타 유기체로부터 파생된다. 일부 실시예에서, 박테리움은 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 마리움(Mycobacterium marinum), 및 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 마이코박테리움이다. 여타 실시예에서, 박테리움은 노카르디아 속(Nocardia sp.) NRRL 5646, 노카르디아 파르시니카(Nocardia farcinica), 스트렙토마이시스 그리세우스(Streptomyces griseus), 사리니스포라 아레니코라(Salinispora arenicola), 또는 크라비박테르 미치가네네시스(Clavibacter michiganenesis)이다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (i) 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 16의 아미노산, 또는 이의 변이체를 포함하는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계를 포함하며, 그리고 (ii) 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계가 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는 단계를 포함한다. 여하한 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 대안적인 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 감쇠시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예예서, 상기 지방산 생성효소는 티오에스테라아제이다. 특정 실시예에서, 상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없이 tesA, 또는 tesA로 인코딩된다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포에서 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수동적으로 수송된다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 삽입, 또는 결실을 가지는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 카르복시산 환원효소 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드는 하기의 보존성 아미노산 치환체들 중에서 하나 이상을 포함한다: 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신과 같은 지방족 아미노산의 또 다른 지방족 아미노산으로의 대체물(replacement); 세린의 트레오닌으로의 대체물; 트레오닌의 세린으로의 대체물; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 잔기의 또 다른 산성 잔기로의 대체물; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드기를 보유하는 잔기의 아미드기를 보유하는 다른 잔기로의 대체물; 리신 및 아르기닌과 같은 염기성 잔기의 또 다른 염기성 잔기로의 교환물; 그리고 페닐알라닌 및 티로신과 같은 방향족 잔기의 다른 방향족 잔기로의 대체물. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가, 삽입, 또는 결실을 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 카르복시산 환원효소 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (i) 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열에 대하여 대략 70 %이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 발현하는 단계를 포함하며, 그리고 (ii) 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계가 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는 유전자 발현을 조작하는 단계를 포함한다. 여하한 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 대안적인 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 감쇠시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 지방산 생성효소는 티오에스테라아제이다. 특정 실시예에서, 상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없이 tesA, 또는 tesA로 인코딩된다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포로부터 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 수동적으로 세포외 환경으로 수송된다.
일부 실시예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열에 대하여 대략 75 %이상, 대략 80 %이상, 대략 85 %이상, 대략 90 %이상, 대략 91 %이상, 대략 92 %이상, 대략 93 %이상, 대략 94 %이상, 대략 95 %이상, 대략 96 %이상, 대략 97 %이상, 대략 98 %이상, 또는 대략 99 %이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16이다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (i) 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열의 보체, 또는 이의 단편에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 카르복시산 환원효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하며; 그리고 (ii) 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계가 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는 유전자 발현을 조작하는 단계를 포함한다. 여하한 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 대안적인 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 감쇠시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 지방산 생성효소는 티오에스테라아제이다. 특정 실시예에서, 상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없이 tesA, 또는 tesA로 인코딩된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포로부터 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 수동적으로 세포외 환경으로 수송된다.
일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 덜 엄격한(low stringency), 엄격한(medium stringency), 매우 엄격한(high stringency), 또는 아주 매우 엄격한(very high stringency) 조건하에서, SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열의 보체 또는 이의 단편에 혼성화된다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 16의 아미노산, 또는 이의 변이체를 포함하는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 지방산 분해 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 특정 실시예에서, 숙주 세포는 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857을 인코딩하는 유전자에 의해 인코딩되는 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 여하한 실시예에서, 유전공학처리된 숙주 세포는 상기 언급된 아실-CoA 생성효소 유전자들과 같은, 지방산 분해 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자들 중의 결여를 포함한다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포로부터 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 수동적으로 세포외 환경으로 수송된다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 삽입, 또는 결실을 가지는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 카르복시산 환원효소 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드는 하기의 보존성 아미노산 치환체들 중에서 하나 이상을 포함한다: 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신과 같은 지방족 아미노산의 다른 지방족 아미노산으로의 대체물(replacement); 세린의 트레오닌으로의 대체물; 트레오닌의 세린으로의 대체물; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 잔기의 또 다른 산성 잔기로의 대체물; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드기를 보유하는 잔기의 아미드기를 보유하는 또 다른 잔기로의 대체물; 리신 및 아르기닌과 같은 염기성 잔기의 또 다른 염기성 잔기로의 교환물; 그리고 페닐알라닌과 티로신과 같은 방향족 잔기를 또 다른 방향족 잔기로의 대체물. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가, 삽입, 또는 결실을 갖는다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 16의 아미노산에 대하여 대략 70 %이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 지방산 분해 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 특정 실시예에서, 숙주 세포는 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857을 인코딩하는 유전자에 의해 인코딩되는 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 여하한 실시예에서, 유전공학처리된 숙주 세포는 상기 언급된 아실-CoA 생성효소 유전자들과 같은, 지방산 분해 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자들 중 결여를 포함한다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포로부터 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 수동적으로 세포외 환경으로 수송된다.
일부 실시예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16의 아미노산에 대하여 대략 75 %이상, 대략 80 %이상, 대략 85 %이상, 대략 90 %이상, 대략 91 %이상, 대략 92 %이상, 대략 93 %이상, 대략 94 %이상, 대략 95 %이상, 대략 96 %이상, 대략 97 %이상, 대략 98 %이상, 또는 대략 99 %이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16이다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열의 보체, 또는 이의 단편에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 카르복시산 환원효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하며, 여기서 상기 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 지방산 분해 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 특정 실시예에서, 숙주 세포는 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857을 인코딩하는 유전자에 의해 인코딩되는 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 여하한 실시예에서, 유전공학처리된 숙주 세포는 상기 언급된 아실-CoA 생성효소 유전자들과 같은, 지방산 분해 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자들 중의 결여를 포함한다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포로부터 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 수동적으로 세포외 환경으로 수송된다.
일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 덜 엄격한(low stringency), 엄격한(medium stringency), 매우 엄격한(high stringency), 또는 아주 매우 엄격한(very high stringency) 조건하에서, SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열의 보체 또는 이의 단편에 혼성화된다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121의 뉴클레오티드의 서열에 대하여 대략 70 %이상의 서열 동일성을 가지는 지방족 알데히드 생합성 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터(recombinant vector)를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121의 뉴클레오티드 서열에 대하여 대략 75 %이상, 대략 80 %이상, 대략 85 %이상, 대략 90 %이상, 대략 91 %이상, 대략 92 %이상, 대략 93 %이상, 대략 94 %이상, 대략 95 %이상, 대략 96 %이상, 대략 97 %이상, 대략 98 %이상, 또는 대략 99 %이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121의 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포로부터 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 수동적으로 세포외 환경으로 수송된다.
일부 실시예에서, 재조합 벡터는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함한다. 여하한 실시예에서, 프로모터는 발달-조절된(developmentally-regulated), 세포소기관(organelle)-특이적, 조직-특이적, 유도적, 구조적, 또는 세포-특이적 프로모터이다.
여타 실시예에서, 재조합 벡터는 (a) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열; (b) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커; (c) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 마커 서열; (d) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 정제 모이어티(purification moiety); (e) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 분비 서열; 및 (f) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 표적화 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 재조합 벡터는 플라스미드이다.
일부 실시예에서, 숙주 세포는 재조합 벡터에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합되고, 상기 뉴클레오티드 서열의 발현은 조절된 프로모터 영역에 의해 제어된다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계를 더 포함한다. 여하한 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 대안적인 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 감쇠시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 지방산 생성효소는 티오에스테라아제이다. 특정 실시예에서, 상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없이 tesA, 또는 tesA로 인코딩된다.
여타 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 지방산 분해 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 특정 실시예에서, 숙주 세포는 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857을 인코딩하는 유전자에 의해 인코딩되는 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 여하한 실시예에서, 유전공학처리된 숙주 세포는 상기 언급된 아실-CoA 생성효소 유전자들과 같은, 지방산 분해 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자들 중의 결여를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (i) 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열에 대하여 대략 70 %이상의 서열 동일성을 가지는 지방족 알데히드 생합성 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 발현시키는 단계, 및 (ii) 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계를 포함한다. 여하한 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 대안적인 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 감쇠시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 지방산 생성효소는 티오에스테라아제이다. 특정 실시예에서, 상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없이 tesA, 또는 tesA로 인코딩된다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포로부터 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 수동적으로 세포외 환경으로 수송된다.
일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열에 대하여 대략 75 %이상, 대략 80 %이상, 대략 85 %이상, 대략 90 %이상, 대략91 %이상, 대략 92 %이상, 대략 93 %이상, 대략 94 %이상, 대략 95 %이상, 대략96 %이상, 대략 97 %이상, 대략 98 %이상, 또는 대략 99 %이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시예에서, 재조합 벡터는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함한다. 여하한 실시예에서, 프로모터는 발달-조절된, 세포소기관-특이적, 조직-특이적, 유도적, 구조적, 또는 세포-특이적 프로모터이다.
여타 실시예에서, 재조합 벡터는 (a) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열; (b) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커; (c) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 마커 서열; (d) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 정제 모이어티(purification moiety); (e) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 분비 서열; 및 (f) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 표적화 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 재조합 벡터는 플라스미드이다.
일부 실시예에서, 숙주 세포는 재조합 벡터에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합되고, 상기 뉴클레오티드 서열의 발현은 조절된 프로모터 영역에 의해 제어된다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 레벨을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 숙주 세포에서 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열에 대하여 대략 70 %이상의 서열 동일성을 가지는 지방족 알데히드 생합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 지방산 분해 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 특정 실시예에서, 숙주 세포는 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857을 인코딩하는 유전자에 의해 인코딩되는 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 여하한 실시예에서, 유전학공학처리된 숙주 세포는 상기 언급된 아실-CoA 생성효소 유전자들과 같은, 지방산 분해 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자들 중의 결여를 포함한다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포로부터 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 수동적으로 세포외 환경으로 수송된다.
일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열에 대하여 대략 75 %이상, 대략 80 %이상, 대략 85 %이상, 대략 90 %이상, 대략91 %이상, 대략 92 %이상, 대략 93 %이상, 대략 94 %이상, 대략 95 %이상, 대략96 % 이상, 대략 97 %이상, 대략 98 %이상, 또는 대략 99 %이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시예에서, 재조합 벡터는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함한다. 여하한 실시예에서, 프로모터는 발달-조절된, 세포소기관-특이적, 조직-특이적, 유도적, 구조적, 또는 세포-특이적 프로모터이다.
여타 실시예에서, 재조합 벡터는 (a) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열; (b) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커; (c) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 마커 서열; (d) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 정제 모이어티(purification moiety); (e) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 분비 서열; 및 (f) 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 표적화 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 재조합 벡터는 플라스미드이다.
일부 실시예에서, 숙주 세포는 재조합 벡터에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합되고, 상기 뉴클레오티드 서열의 발현은 조절된 프로모터 영역에 의해 제어된다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생성 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 숙주 세포에서 (i) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10; (ii) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 또는 SEQ ID NO: 14; 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및 SEQ ID NO: 11을 포함하는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 카르복시산 환원효소 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포로부터 지방족 알데히드를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경에서 존재한다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 숙주 세포로부터 분비된다. 대안적인 실시예에서, 지방족 알데히드는 세포외 환경으로 수송된다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 수동적으로 세포외 환경으로 수송된다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드는 길이가 대략 1,000 아미노산 내지 대략 2,000 아미노산이다. 여하한 실시예에서, 폴리펩티드는 길이가 대략 1,000 아미노산, 길이가 대략 1,050 아미노산, 길이가 대략 1,100 아미노산, 길이가 1,150 아미노산, 길이가 대략 1,200 아미노산, 길이가 대략 1,250 아미노산, 길이가 대략 1,300 아미노산, 길이가 대략 1,400 아미노산, 길이가 대략 1,500 아미노산, 길이가 대략 1,600 아미노산, 길이가 대략 1,700 아미노산, 길이가 대략 1,800 아미노산, 길이가 대략 1,900 아미노산, 또는 길이가 대략 2,000 아미노산이다. 여타 실시예에서, 폴리펩티드는 길이가 대략 1,500까지의 아미노산, 길이가 대략 1,400까지의 아미노산, 길이가 대략 1,300까지의 아미노산, 길이가 대략 1,250까지의 아미노산, 길이가 대략 1,200까지의 아미노산, 길이가 대략 1,150까지의 아미노산, 길이가 대략 1,100까지의 아미노산, 길이가 대략 1,050까지의 아미노산, 또는 길이가 대략 1,000까지의 아미노산이다.
일부 실시예에서, 방법은 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계를 더 포함한다. 여하한 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 대안적인 실시예에서, 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 조작하는 단계는 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 감쇠시키는 단계 및/또는 숙주 세포에서 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 지방산 생성효소는 티오에스테라아제이다. 특정 실시예에서, 상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없이 tesA, 또는 tesA로 인코딩된다.
여타 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 지방산 분해 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 야생형 숙주 세포에 비하여 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 특정 실시예에서, 숙주 세포는 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857을 인코딩하는 유전자에 의해 인코딩되는 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 여하한 실시예에서, 유전공학처리된 숙주 세포는 상기 언급된 아실-CoA 생성효소 유전자들과 같은, 지방산 분해 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자들 중의 결여를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 방법은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 생물학적 기질의 존재하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
본 명세서에 설명되는 본 발명의 일 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 균류 세포, 곰팡이 세포, 및 박테리아 세포로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, 숙주 세포는 그람-양성 박테리아 세포(Gram-positive bacterial cell)이다. 여타 실시예에서, 숙주 세포는 그람-음성 박테리아 세포(Gram-negative bacterial cell)이다.
일부 실시예에서, 숙주 세포는 에스체리키아(Escherichia) 속, 바실루스(Bacillus) 속, 락토바실루스(Lactobacillus) 속, 로도코쿠스(Rhodococcus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 트리코더마(Trichoderma) 속, 뉴로스포라(Neurospora) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 후미콜라(Humicola) 속, 리조무코(Rhizomucor) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 무코(Mucor) 속, 미셀리오프토라(Myceliophtora) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 파네로차에테(Phanerochaete) 속, 느타리속(Pleurotus), 송편버섯속(Trametes), 크리소스포륨(Chrysosporium) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 스테노트로파모나스(Stenotrophamonas) 속, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속, 야로위아(Yarrowia) 속, 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로부터 선택된다.
여하한 실시예에서, 숙주 세포는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 세포, 바실루스 브레비스(Bacillus brevis) 세포, 바실루스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 세포, 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 세포, 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus) 세포, 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 세포, 바실루스 키르쿨란스(Bacillus circulans) 세포, 바실루스 푸밀리스(Bacillus pumilis) 세포, 바실루스 튜링기엔시스(Bacillus thuringiensis) 세포, 바실루스 클라우시(Bacillus clausii) 세포, 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) 세포, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 또는 바실루스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 세포이다.
여타 실시예에서, 숙주 세포는 트리코더마 코닌기(Trichoderma koningii) 세포, 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) 세포, 트리코더마 르에세이(Trichoderma reesei) 세포, 트리코더마 롱기브라키아텀(Trichoderma longibrachiatum) 세포, 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 세포, 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigates) 세포, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus) 세포, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 세포, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 세포, 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 세포, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 세포, 후미콜라 라누기노세(Humicola lanuginose) 세포, 로도코쿠스 오파쿠스(Rhodococcus opacus) 세포, 리조무코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 세포, 또는 무코 미에헤이(Mucor michei) 세포이다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포 또는 스트렙토마이세스 무리누스(Streptomyces murinus) 세포이다.
다른 구체예에서, 숙주 세포는 방선균(Actinomycetes) 세포이다.
일부 실시예에서, 숙주 세포는 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae) 세포이다. 특정 실시예에서, 숙주 세포는 진핵 식물(eukaryotic plant), 조류, 남조류, 녹색-황 세균, 녹색 비-황(green non-sulfur) 세균, 자색 황세균, 자색 비-황 세균, 극한성 생물, 효모, 균류, 이의 공학처리된 유기체, 또는 합성 유기체로부터 유래된 세포이다. 일부 실시예에서, 숙수 세포는 광 의존성이거나 탄소를 고정시킨다. 일부 실시예에서, 숙수 세포는 광 의존성이거나 탄소를 고정시킨다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 독립영양적 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 빛의 존재하에서와 같이, 광독립영양적 활성(photoautotrophic activity)을 갖는다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 빛의 부재하에서 종속영양적 또는 혼합영양적이다. 여하한 실시예에서, 숙주 세포는 아바비도프시스 타리아나(Avabidopsis thaliana), 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum), 미스캔더스 기간테우스(Miscanthus giganteus), 제아 메이즈(Zea mays), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcuse braunii), 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii), 두나리엘라 살리나(Dunaliela salina), 시네코코커스 속(Synechococcus Sp.) PCC 7002, 시네코코거스 속 PCC 7942, 시네초시스티스 속(Synechocystis Sp.) PCC 6803, 써모시네코코커스 이노그게이트(Thermosynechococcus elongates) BP-1, 클로로븀 테피듐(Chlorobium tepidum), 클로로프렉수스 아우란티쿠스(Chloroflexus auranticus), 크로마티움 비노슘(Chromatiumm vinosum), 로도스피리윰 루브륨(Rhodospirillum rubrum), 로도박터 캡술라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도슈도모나스 파루스리스(Rhodopseudomonas palusris), 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디우써모셀룸(Clostridiuthermocellum), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 포롬브(Schizosaccharomyces pombe), 슈도모나스 플루오르슨스(Pseudomonas fluorescens), 또는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)로부터 유래되는 세포이다.
여타 실시예에서, 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, VERO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Cv1 세포, MDCK 세포, 293 세포, 3T3 세포, 또는 PC12 세포이다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 대장균(E. coli) 세포이다. 여하한 실시예에서, 상기 대장균(E. coli) 세포는 균주 B, 균주 C, 균주 K, 또는 균주 W 대장균(E. coli) 세포이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생산 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 기질을 (i) SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 114, 116, 118, 120, 또는 122의 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO:17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 변이체에 대하여 대략 70 %이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드와 접촉하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 지방족 알데히드를 정제하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 삽입, 또는 결실을 가지는 SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 114, 116, 118, 120, 또는 122의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 카르복시산 환원효소 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드는 하기의 보존성 아미노산 치환체들 중에서 하나 이상을 포함한다: 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신과 같은 지방족 아미노산의 다른 지방족 아미노산으로의 대체물(replacemant); 세린의 트레오닌으로의 대체물; 트레오닌의 세린으로의 대체물; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 잔기의 또 다른 산성 잔기로의 대체물; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드기를 보유하는 잔기의 아미드기를 보유하는 또 다른 잔기로의 대체물; 리신 및 아르기닌과 같은 염기성 잔기의 또 다른 염기성 잔기로의 교환물; 그리고 페닐알라닌 및 티로신과 같은 방향족 잔기의 또 다른 방향족 잔기로의 대체물. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가, 삽입, 또는 결실을 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 카르복시산 환원효소 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 폴리펩티는 SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 114, 116, 118, 120, 또는 122의 아미노산 서열에 대하여 대략 75 % 이상, 대략 80 %이상, 대략 85 %이상, 대략 90 %이상, 대략 91 %이상, 대략 92 %이상, 대략 93 % 이상, 대략 94 %이상, 대략 95 %이상, 대략 96 %이상, 대략 97 %이상, 대략 98 %이상, 또는 대략 99 %이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 114, 116, 118, 120, 또는 122의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 뉴클레오티드는 EQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121의 뉴클레오티드 서열에 대하여 대략 75 %이상, 대략 80 %이상, 대략 85 %이상, 대략 90 %이상, 대략 91 %이상, 대략 92 %이상, 대략 93 %이상, 대략 94 %이상, 대략 95 %이상, 대략 96 %이상, 대략 97 %이상, 대략 98 %이상, 또는 대략 99 %이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 지방족 알데히드의 생성 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (i) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10; (ii) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 또는 SEQ ID NO: 14; 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및 SEQ ID NO: 11을 포함하는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 기질과 접촉하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 카르복시산 환원효소 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 지방산 환원효소 활성을 갖는다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드는 길이가 대략 1,000 아미노산 내지 대략 2,000 아미노산이다. 여하한 실시예에서, 폴리펩티드는 길이가 대략 1,000 아미노산, 대략 1,050 아미노산, 길이가 대략 1,100 아미노산, 길이가 1,150 아미노산, 길이가 대략 1,200 아미노산, 길이가 대략 1,250 아미노산, 길이가 대략 1,300 아미노산, 길이가 대략 1,400 아미노산, 길이가 대략 1,500 아미노산, 길이가 대략 1,600 아미노산, 길이가 대략 1,700 아미노산, 길이가 대략 1,800 아미노산, 길이가 대략 1,900 아미노산, 또는 길이가 대략 2,000 아미노산이다. 여타 실시예에서, 폴리펩티드는 길이가 대략 1,500까지의 아미노산, 길이가 대략 1,400까지의 아미노산, 길이가 대략 1,300까지의 아미노산, 길이가 대략 1,250까지의 아미노산, 길이가 대략 1,200까지의 아미노산, 길이가 대략 1,150까지의 아미노산, 길이가 대략 1,100까지의 아미노산, 길이가 대략 1,050까지의 아미노산, 또는 길이가 대략 1,000까지의 아미노산이다.
본 명세서에서 설명되는 본 발명의 일 실시형태에서, 방법은 C6-C26 지방족 알데히드를 포함하는 지방족 알데히드들을 생산할 수 있다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C2O, C21, C22, C23, C24, C25, 또는 C26 지방족 알데히드를 포함한다. 특정 실시예에서, 지방족 알데히드는 데카날, 도데카날, 미리스탈, 또는 헥사데칼이다.
여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 직쇄 지방족 알데히드를 포함한다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 분지쇄 지방족 알데히드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알데히드는 사이클릭 잔기(moiety)를 포함한다.
여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 불포화 지방족 알데히드이다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 단일불포화 지방족 알데히드이다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알데히드는 포화 지방족 알데히드이다.
본 명세서에서 설명되는 본 발명의 일 실시형태에서, 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 기질은 지방산이 될 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산은 C6-C26 지방산을 포함한다. 일부 실시예에서, 지방산은 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, 또는 C26 지방산을 포함한다. 특정 실시예에서, 지방산은 C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17, 또는 C18 지방산이다.
여타 실시예에서, 지방산은 직쇄 지방산을 포함한다. 여타 실시예에서, 지방산은 분지쇄 지방산을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 지방산은 사이클릭 잔기를 포함한다.
일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 불포화 지방족 알데히드이다. 여타 실시예에서, 지방족 알데히드는 단일불포화 지방족 알데히드이다. 여하한 실시예에서, 불포화 지방족 알데히드는 C6:1, C7:1, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1, C20:1, C21:1, C22:1, C23:1, C24:1, C25:1, 또는 C26:1 불포화 지방족 알데히드이다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알데히드는 오메가-7 위치에서 불포화된다. 여하한 실시예에서, 불포화 지방족 알데히드는 cis 이중 결합을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121의 뉴클레오티드 서열에 대하여 대략 70 %이상의 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 미생물 상류(microorganism upstream)의 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합되는 외인성 조절 서열을 포함하는 유전공학처리된 미생물을 특징으로 하고, 여기서 미생물은 야생-형 미생물에 비하여 지방족 알데히드의 증가된 수준을 생산한다.
일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121의 뉴클레오티드 서열에 대하여 대략 75 %이상, 대략 80 %이상, 대략 85 %이상, 대략 90 %이상, 대략 91 %이상, 대략 92 %이상, 대략 93 %이상, 대략 94 %이상, 대략 95 %이상, 대략 96 %이상, 대략 97 %이상, 대략 98 %이상, 또는 대략 99 %이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 113, 115, 117, 119, 또는 121이다.
일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 미생물에 대하여 내인성이다.
여타 실시예에서, 미생물은 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여하한 실시예에서, 미생물은 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자를 발현하거나 및/또는 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 증가시킨다. 대안적인 실시예에서, 미생물은 숙주 세포에서 지방산 생성효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 감쇠시키거나 및/또는 내인성 지방산 생성효소의 발현 또는 활성을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 상기 지방산 생성효소는 티오에스테라아제이다. 특정 실시예에서, 상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없이 tesA, 또는 tesA로 인코딩된다.
여타 실시예에서, 미생물은 야생형 미생물에 비하여 지방산 분해 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 미생물은 야생형 미생물에 비하여 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 특정 실시예에서, 미생물은 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857을 인코딩하는 유전자에 의해 인코딩되는 아실-CoA 생성효소의 감쇠된 수준을 발현한다. 여하한 실시예에서, 미생물은 상기 언급된 아실-CoA 생성효소 유전자들과 같은, 지방산 분해 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자들 중 결여를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 미생물은 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 탈수소화 효소/이성질화 효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 일부 실시예에서, 미생물은 도 6에 기록된 유전자 또는 fabA의 결여를 포함한다. 여타 실시예에서, 미생물은 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB에 의해 인코딩되는 효소와 같은, 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다. 여타 실시예에서, 미생물은 도 7에 기록된 유전자 또는 fabB의 결여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 미생물은 desA와 같은, 불포화 효소를 인코딩하는 유전자의 조작된 수준을 발현하도록 유전공학처리된다.
일부 실시예에서, 미생물은 박테리아이다. 여하한 실시예에서, 상기 박테리아는 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아이다.
일부 실시예에서, 미생물은 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 마리움(Mycobacterium marinum), 및 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans)로 구성된 군으로부터 선택되는 마이코박테리움이다.
여타 실시예에서, 미생물은 노카르디아 속(Nocardia sp.) NRRL 5646, 노카르디아 파르시니카(Nocardia farcinica), 스트렙토마이시스 그리세우스(Streptomyces griseus), 사리니스포라 아레니코라(Salinispora arenicola), 또는 크라비박테르 미치가네네시스(Clavibacter michiganenesis)이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 설명되는 여하한 미생물 또는 여하한 방법들에 의해 생산되는 지방족 알데히드를 특징으로 한다.
일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 대략 -15.4 이상의 δ13C를 갖는다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 대략 -15.4 내지 대략 -10.9의 δ13C, 또는 대략 -13.92 내지 대략 -13.84의 δ13C를 갖는다.
일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 대략 1.003 이상의 fM 14C를 갖는다. 여하한 실시예에서, 지방족 알데히드는 대략 1.01 이상 또는 대략 1.5 이상의 fM 14C를 갖는다. 일부 실시예에서, 지방족 알데히드는 대략 1.111 내지 대략 1.124의 fM 14C를 갖는다.
본 명세서에서 설명되는 일 실시형태에서, 지방족 알데히드는 대략 25 mg/L, 대략 50 mg/L, 대략 75 mg/L, 대략 100 mg/L, 대략 125 mg/L, 대략 150 mg/L, 대략 175 mg/L, 대략 200 mg/L, 대략 225 mg/L, 대략 250 mg/L, 대략 275 mg/L, 대략 300 mg/L, 대략 325 mg/L, 대략 350 mg/L, 대략 375 mg/L, 대략 400 mg/L, 대략 425 mg/L, 대략 450 mg/L, 대략 475 mg/L, 대략 500 mg/L, 대략 525 mg/L, 대략 550 mg/L, 대략 575 mg/L, 대략 600 mg/L, 대략 625 mg/L, 대략 650 mg/L, 대략 675 mg/L, 대략 700 mg/L, 대략 725 mg/L, 대략 750 mg/L, 대략 775 mg/L, 대략 800 mg/L, 대략 825 mg/L, 대략 850 mg/L, 대략 875 mg/L, 대략 900 mg/L, 대략 925 mg/L, 대략 950 mg/L, 대략 975 mg/L, 대략 1000 g/L, 대략 1050 mg/L, 대략 1075 mg/L, 대략 1100 mg/L, 대략 1125 mg/L, 대략 1150 mg/L, 대략 1175 mg/L, 대략 1200 mg/L, 대략 1225 mg/L, 대략 1250 mg/L, 대략 1275 mg/L, 대략 1300 mg/L, 대략 1325 mg/L, 대략 1350 mg/L, 대략 1375 mg/L, 대략 1400 mg/L, 대략 1425 mg/L, 대략 1450 mg/L, 대략 1475 mg/L, 대략 1500 mg/L, 대략 1525 mg/L, 대략 1550 mg/L, 대략 1575 mg/L, 대략 1600 mg/L, 대략 1625 mg/L, 대략 1650 mg/L, 대략 1675 mg/L, 대략 1700 mg/L, 대략 1725 mg/L, 대략 1750 mg/L, 대략 1775 mg/L, 대략 1800 mg/L, 대략 1825 mg/L, 대략 1850 mg/L, 대략 1875 mg/L, 대략 1900 mg/L, 대략 1925 mg/L, 대략 1950 mg/L, 대략 1975 mg/L, 대략 2000 mg/L, 또는 이 이상의 수율로 생산된다.
본 명세서에 설명된 일 실시형태에서, 지방족 알데히드 탄소 공급원으로부터 본 명세서에 설명된 미생물 또는 숙주 세포에서 생산된다.
다음의 도면들은 도시의 목적으로만 나타내며, 이로 제한하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명에 속하는 기술 분야에 전문가들에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 동일한 방법들 및 물질들이 본원 발명의 실시(practice) 또는 실험(testing)에 사용될 수 있으나, 적합한 방법들 및 물질들이 하기에 설명된다. GenBank 데이타베이스 서열들을 포함하는, 본 명세서에서 언급된 모든 출판물들, 특허 출원들, 특허들, 및 다른 참고문헌들은 이들의 전문이 참고문헌으로 참조병합된다. 불일치의 경우, 정의들을 포함하는, 본원 설명내용이 조절될 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 도시적일 뿐이며 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 다음의 상세한 설명 및 청구항으로부터 분명할 것이다.
정의들
설명내용 전반에서, 참고문헌은 약칭된 유전자 명칭 또는 폴리펩티드 명칭을 이 사용되지만, 이런 약칭된 유전자 또는 폴리펩티드 명칭은 유전자들 또는 폴리펩티드들의 종류를 대표하는 것으로 이해된다. 이런 유전자 명칭은 동일한 생리학적 기능을 갖는 동일한 폴리펩티드와 상동성(homologous) 폴리펩티드를 인코딩하는 모든 유전자들을 포함한다. 폴리펩티드 명칭은 동일한 활성을 갖는 (예를 들어, 동일한 기본 화학 반응을 촉매하는) 모든 폴리펩티드들을 포함한다.
달리 명시되지 않으면, 본 명세서에 언급된 수탁 번호는 National Institute of Health, U.S.A에 의해 관리되는 NCBI 데이터베이스(National Center for Biotechnology Information)로부터 유래된다. 달리 명시되지 않으면, 이들 수탁 번호는 2008년 10월까지의 데이터베이스에서 제공된다.
EC 번호는 Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(NC-IUBMB)에 의해 확증된다 (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). 본 명세서에 언급된 EC 번호는 University of Tokyo에 의해 부분적으로 후원된, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics에 의해 관리되는 KEGG 리간드 데이터베이스로부터 유래된다. 달리 명시되지 않으면, 이들 EC 번호는 2008년 10월까지의 데이터베이스에서 제공된다.
본 명세서에서, 단수 관사 "a" 및 "an"은 상기 관사의 문법적 목적어의 1개 또는 그 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는데 사용된다. 예로써, "요소"는 1개 또는 그 이상의 요소를 의미한다.
본 명세서에서, "대략"이라는 용어는 주어진 수치의 값 ±20 %를 의미하는데 사용된다. 따라서, "대략 60 %"는 60±(60의 20 %)[즉, 48 내지 70]의 값을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "감쇠"라는 용어는 약화, 감소 또는 축소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드가 이의 활성을 감소시키도록 폴리펩티드를 조작함으로써(예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 조작함으로써) 감쇠될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "바이오매스"라는 용어는 탄소 공급원으로부터 유래된 여하한 생물학적 물질을 지칭한다. 일부 예시에서, 바이오매스는 탄소 공급원으로 처리되고, 이는 생물전환에 적합하다. 다른 예시에서, 바이오매스는 탄소 공급원으로의 처리가 더 필요하지 않을 수 있다. 탄소 공급원은 바이오연료로 전환될 수 있다. 바이오매스의 한 가지 예시적인 공급원은 식물성 물질 또는 식물(vegetation)이다. 예를 들어, 옥수수, 사탕수수, 또는 스위치그래스 (switchgrass)가 바이오매스로서 사용될 수 있다. 바이오매스의 또 다른 비-제한적 예시는 동물성 물질, 예를 들면, 우분(cow manure)과 같은 신진대사 노폐물(metabolic waste)이다. 또한, 바이오매스는 조류 및 여타 수산 식물을 포함할 수 있다. 또한, 바이오매스는 공업, 농업, 임업, 그리고 가정으로부터의 폐기물(waste product)이 포함된다. 바이오매스로서 사용될 수 있는 이러한 폐기물의 예시들은 발효 찌꺼기, 목초(ensilage), 짚, 재목, 오수(sewage), 쓰레기, 및 셀룰로오스성 대도시 폐기물(cellulosic urban waste) 및 남은 음식들(food leftovers)이다. 또한, 바이오매스는 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류, 또는 다당류)과 같은, 탄소 공급원들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "탄소 공급원"이라는 구(phrase)는 원핵 또는 단순한 진핵 세포 성장을 위한 탄소 공급원으로서 사용하기 적합한 기질 또는 화합물을 지칭한다. 탄소 공급원들은 중합체, 탄수화물, 산, 알코올, 알데히드, 케톤, 아미노산, 펩티드, 및 가스(예를 들어, CO 및 CO2)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 형태일 수 있다. 이들에는 예를 들어, 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 및 갈락토오스와 같은 다양한 단당류; 프럭토-올리고당류 및 갈락토-올리고당류와 같은 올리고당류; 크실로오스 및 아라비노오스와 같은 다당류; 수크로오스, 말토오스, 및 투라노오스(turanose)와 같은 이당류; 메틸 셀룰로오스 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 물질; 숙시네이트, 락테이트, 및 아세테이트와 같은 포화된 또는 불포화 지방산 에스테르; 에탄올, 메탄올 및 글리세롤, 또는 이의 혼합물과 같은 알코올류가 포함된다. 또한, 탄소 공급원은 글루코오스가 포함되지만 이에 국한되지 않는 광합성(photosynthesis)의 산물일 수 있다. 바람직한 탄소 공급원은 바이오매스이다. 또 다른 바람직한 탄소 공급원은 글루코오스이다.
만약 각각의 두 개의 서열의 염기들이 조화되면[즉, 왓슨 크릭 염기쌍(Watson Crick base pair)을 형성할 수 있으면] 다른 뉴클레오티드 서열에 대하여 "상보적"이다. "상보적 가닥(complementary strand)"이라는 용어는 본 명세서에서 "보체"라는 용어와 동의어로서 사용된다. 핵산 가닥의 보체는 코딩 가닥의 보체 또는 비-코딩 가닥의 보체일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발현을 가능하게 할 만큼 충분한 조건"이라는 용어는 숙주 세포가 바람직한 산물, 이를 테면 본 명세서에 설명된 폴리펩티드 또는 지방족 알데히드를 생산할 수 있도록 하는 여하한 조건들을 의미한다. 예를 들어, 적합한 조건에는 발효 조건을 포함한다. 발효 조건은 온도 범위, 통기 수준, 및 배지 조성과 같은 많은 파라미터들을 포함할 수 있다. 각각의 이들 조건은 개별적으로, 그리고 조합적으로, 숙주 세포가 성장할 수 있도록 한다. 예시적인 배양 배지에는 액체 배지(broth) 또는 겔이 포함된다. 일반적으로, 배지는 숙주 세포에 의해 직접적으로 대사 작용될 수 있는 탄소 공급원, 이를 테면 글루코오스, 프럭토오스, 셀룰로오스 또는 이와 유사한 것들을 포함한다. 또한, 효소가 탄소 공급원의 기동(mobilization)[예를 들어, 전분 또는 셀룰로오스의 발효가능 당으로의 해중합반응(depolymerization)] 및 차후 신진 대사를 촉진하도록 배지에서 사용될 수 있다.
발현을 가능하게 할 만큼 조건이 충분한 지를 결정하기 위하여, 숙주 세포는 예를 들어, 대략 4, 8, 12, 24, 36, 또는 48시간 동안 배양될 수 있다. 배양 동안 및/또는 배양 이후, 샘플이 얻어지고 이들 조건이 발현을 가능하게 하는 지를 결정하기 위하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 샘플 또는 숙주 세포가 성장된 배지 내에서 이들 숙주 세포는 원하는 산물의 존재에 대하여 테스트될 수 있다. 산물의 존재에 대하여 테스트하는 경우, 이를 테면 TLC, HPLC, GC/FID, GC/MS, LC/MS, MS가 사용될 수 있지만 이들에 국한되지 않는 분석법이 사용될 수 있다.
본 명세서에 설명된 폴리펩티드들은 폴리펩티드 기능에 실질적인 영향을 주지 않는 추가의 보존성 또는 비-필수 아미노산 치환을 가질 수 있는 것으로 이해된다. 특정한 치환이 허용되는 (즉, 카르복시산 환원효소 활성과 같은 원하는 생물학적 특성에 부정적인 영향을 주지 않는) 지의 여부는 Bowie et al., Science (1990) 247:1306 1310에서 설명된 바와 같이 결정될 수 있다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 분지쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 분지쇄를 가지는 아미노산 잔기의 집단은 당해 분야에서 정의되었다. 이들 집단은 염기성 분지쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 분지쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은(uncharged) 극성 분지쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 분지쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 분지쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 분지쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "조절 요소(control element)"는 전사 조절 요소를 의미한다. 조절 요소에는 프로모터와 인핸서(enhancer)가 포함된다. "프로모터 요소", "프로모터", 또는 "프로모터 서열"이라는 용어는 유전자의 발현을 활성화시키는 스위치로서 기능하는 DNA 서열을 지칭한다. 유전자가 활성화되면, 상기 유전자는 전사되거나, 전사에 참여한다. 전사는 유전자로부터의 mRNA의 합성을 포함한다. 그러므로, 프로모터는 전사 조절 요소로서 기능하고, 또한 유전자의 mRNA로의 전사를 개시하기 위한 부위를 제공한다. 조절 요소는 전사에 관여하는 세포 단백질과 특이적으로 상호작용한다(Maniatis et al., Science 236:1237, 1987).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산"이라는 용어는 화학식 RCOOH를 갖는 카르복시산을 의미한다. R은 지방족 기, 바람직하게는 알킬기이다. R은 대략 4개 내지 대략 22개의 탄소 원자들을 포함할 수 있다. 지방산은 포화되거나, 단일불포화되거나, 또는 다중불포화될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 지방산은 지방산 생합성 경로로부터 만들어진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 생합성 경로"라는 용어는 지방산을 생산하는 생합성 경로를 의미한다. 지방산 생합성 경로는 지방산을 생산하기 위하여 본 명세서에 설명된 바와 같이 공학처리될 수 있고, 그리고 일부 구체예에서 원하는 탄소 사슬 특징을 갖는 지방산을 생산하기 위한 추가적인 효소들과 함께 발현될 수 있는 지방산 효소들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 분해 효소"라는 용어는 지방산 또는 지방산 유도체를 또 다른 산물로의 분해 또는 전환에 관여하는 효소를 의미한다. 지방산 분해 효소의 비제한적 예시는 아실-CoA 생성효소이다. 지방산 분해 효소의 추가적인 예시들은 본 명세서에서 설명된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 유도체"라는 용어는 생산 숙주 생물체의 지방산 생합성 경로로부터 부분적으로 만들어지는 산물을 의미한다. 또한, "지방산 유도체"는 아실-ACP 또는 아실-ACP 유도체로부터 부분적으로 만들어진 산물을 포함한다. 지방산 생합성 경로는 지방산 유도체를 생산하기 위하여 본 명세서에 설명된 바와 같이 공학처리될 수 있고, 일부 실시예에서 원하는 탄소 사슬 특징을 갖는 지방산 유도체를 생산하는 추가적인 효소와 함께 발현될 수 있는 지방산 생성 효소(synthase enzyme)를 포함한다. 예시적인 지방산 유도체에는 예를 들어 지방산, 아실-CoA, 지방 알데히드, 짧은 사슬과 긴 사슬 알코올, 탄화수소, 지방족 알코올, 및 에스테르(예를 들어, 왁스, 지방산 에스테르, 또는 지방산 에스테르)가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 유도체 효소"라는 용어는 지방산 유도체의 생산에서 발현되거나 과발현될 수 있는 여하한 효소를 의미한다. 이들 효소는 지방산 생합성 경로의 일부일 수 있다. 지방산 유도체 효소의 비-제한적 예시에는 지방산 생성효소, 티오에스테라아제, 아실-CoA 생성효소, 아실-CoA 환원효소, 알코올 탈수소효소, 알코올 아실전이효소, 지방 알코올-형성 아실-CoA 환원효소, 지방산 (카르복시산) 환원효소, 알데히드 환원효소, 아실-ACP 환원효소, 지방산 수산화효소, 아실-CoA 불포화효소, 아실-ACP 불포화효소, 아실-CoA 산화효소, 아실-CoA 탈수소화효소, 에스테르 생성효소, 및 알칸 생합성 폴리펩티드 등이 포함된다. 지방산 유도체 효소는 기질을 지방산 유도체로 전환시킬 수 있다. 일부 예시에서, 기질은 지방산 유도체 효소에 의해 상이한 지방산 유도체로 전환되는 지방산 유도체일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 효소"는 지방산 생합성에 관여하는 여하한 효소를 의미한다. 지방산 효소들은 지방산을 생산하기 위하여 숙주 세포에서 조작될 수 있다. 지방산 효소들의 비-제한적 예시는 지방산 생성효소 및 티오에스테라아제를 포함한다. 지방산 효소의 추가적인 예시들은 본 명세서에서 설명된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 생성효소"는 지방산 생합성에 관여하는 여하한 효소를 의미한다. 지방산 생성효소는 지방산을 생산하기 위하여 숙주 세포에서 발현되거나 과발현될 수 있다. 지방산 생성효소의 비-제한적 예시는 티오에스테라아제이다. 지방산 생성효소의 추가적인 예시들은 본 명세서에서 설명된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방족 알데히드"는 불포화 카르보닐기(C=O)에 의해 특징되는 화학식 RCHO를 갖는 알데히드를 의미한다. 바람직한 실시예에서, 지방족 알데히드는 지방산 또는 지방산 유도체로부터 만들어진 여하한 알데히드이다. 일 실시예에서, R기는 길이가 적어도 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 탄소이다.
R은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 분지쇄는 하나 이상의 분지 지점을 가질 수 있다. 또한, 분지쇄는 사이클릭형 분지를 포함할 수 있다.
더욱이, R은 포화되거나 불포화될 수 있다. 만약 불포화라면, 상기 R은 하나 이상의 불포화 지점을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 지방족 알데히드는 생합성으로 생산된다.
지방족 알데히드들은 많은 용도를 갖는다. 예를 들어, 지방족 알데히드는 많은 특수 화학물질들을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 지방족 알데히드는 중합체, 수지, 염료, 향미료(flavoring), 가소제, 향수, 의약품(pharmaceutical), 및 다른 화학물질들을 생산하는데 사용된다. 일부는 용매, 방부제, 또는 소독제로서 사용된다. 비타민 및 호르몬과 같은, 일부 천연 화합물들 및 합성 화합물들은 알데히드류이다.
"지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드", "카르복시산 환원효소", 및 "CAR"은 본 명세서에서 상호교환적으로(interchangeably) 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "현대 탄소(modern carbon)의 분율" 또는 "fM"은 각각, 옥살산 기준 HOxI 및 HOxII로 알려져 있는, 미국 국립표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology: NIST) 표준 참고 물질들(Standard Reference Materials: SRMs) 4990B 및 4990C에 의해 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다. 이러한 기본 정의는 14C /12C 동위원소 비율 HOxI (AD 1950에 기준됨)의 0.95 배에 부합한다. 이는 붕괴-보정된 산업 혁명전 목재에 거의 동등하다. 현재 생존 생물권(living biosphere)[식물 물질]의 경우에, fM은 대략 1.1이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전자 결여(Gene knockout)"는 원형 단백질(intact protein)의 기능을 감소시키거나 제거하기 위하여 표적 단백질을 인코딩하는 유전자를 조작하거나 불활성화시키는 절차를 지칭한다. 유전자의 불활성화는 UV 조사(irradiation) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 처리함으로써 돌연변이 유발(mutagenesis), 특정-부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis), 상동 재조합(homologous recombination), 삽입-결실 돌연변이 유발, 또는 "레드-유도 통합(Red-driven integration)"(Datsenko et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-45, 2000)과 같은 일반적인 방법들에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 숙주 세포에서 상동 재조합 발생(homologous recombination event)에 선택될 수 있도록, 구조체(construct)는 숙주 세포 내로 도입된다. 본 기술분야의 전문가는 구조체로 상동 재조합 발생을 수행(undergo)하는 효율적으로 형질주입된 세포(transfected cell)를 위하여 양성 선택 유전자들 및 음성 선택 유전자들 모두를 포함하는 결여된 구조체를 쉽게 구상할 수 있다. 숙주 세포에서의 변성(alteration)은 예를 들어, 단일 또는 이중 교차 재조합(crossover recombination)을 통하여 야생형 DNA 서열을 변성을 함유하는 DNA 서열로 교체함으로써 얻어질 수 있다. 형질전환체들(transformants)의 편리한 선발(convenient selection)을 위하여, 예를 들어, 변성은 항생제 내성 마커(antibiotic resistance marker)를 인코딩하는 DNA 서열, 또는 숙주 세포의 가능한 영양요구성을 보충하는 유전자일 수 있다. 돌연변이는 결실-삽입 돌연변이를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 이러한 변성의 예시는 유전자 파괴, 즉 유전자의 교란(perturbation)을 포함하여, 이런 유전자로부터 통상적으로 생산되는 산물은 기능적 형태로 생산되지 않는다. 이는 완전한 결실, 선택적 마커의 결실과 삽입, 선택적 마커의 삽입, 격자이동 돌연변이, 격자-내 결실(in-frame deletion), 또는 미성숙 종결을 야기하는 점 돌연변이(point mutation)에 기인할 수 있다. 일부 실시예에서, 유전자에 대한 전체 mRNA는 없다(absent). 다른 상황에서, 생산되는 mRNA의 양은 다양하다.
두 개의 서열 사이에 "상동성"의 계산은 하기와 같이 수행될 수 있다. 이들 서열은 최적의 비교 목적으로 정렬된다(예를 들어, 최적의 정렬을 위하여 첫 번째 및 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열 중에서 한쪽 또는 양쪽에 갭(gap)이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위하여 무시될 수 있다). 바람직한 실시예에서, 비교 목적으로 정렬된 참고 서열의 길이는 상기 참고 서열의 길이의 대략 30 %이상, 바람직하게는 대략 40 %이상, 더욱 바람직하게는 대략 50 %이상, 훨씬 더 바람직하게는 대략 60 %이상, 훨씬 더 바람직하게는 대략 70 %이상, 대략 80 %이상, 대략 90 %이상, 또는 대략 100 %이다. 이후에, 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드들이 비교된다. 첫 번째 서열에서의 위치가 두 번째 서열에서의 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 이들 분자는 상기 위치에서 동일하다(본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"에 동등하다). 두 개의 서열 사이에 동일성 비율은 이들 두 서열의 최적 배열을 위하여 도입되어야 하는 갭의 개수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 이들 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 개수의 함수이다.
서열들의 비교 및 두 개의 서열 사이에서 상동성 비율의 결정은 수학 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 두 개의 아미노산 서열 사이에서 상동성 비율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 그리고 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량(gap weight)과 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량(length weight)을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 내에 GAP 프로그램에 통합된 Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:444 453의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 두 개의 뉴클레오티드 서열 사이에서 상동성 비율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 그리고 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 중량과 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 내에 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다. 특히 바람직한 세트의 파라미터들 [그리고, 분자가 이들 클레임(claim)의 상동성 한계(homology limitation) 내에 있는 지를 결정하기 위하여 어떤 파라미터가 적용되어야 하는 지에 관하여 작업자가 확신하지 못하는 경우에 사용되어야 하는 파라미터]는 12의 갭 페널티(gap penalty), 4의 갭 연장 페널티(gap extend penalty), 그리고 5의 격자이동 갭 페널티(frameshift gap penalty)를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"는 본 명세서에 설명된 산물 (예를 들어, 본 명세서에 설명된 지방족 알데히드)을 생산하는데 사용되는 세포이다. 숙주 세포는 선택된 유전자를 발현하거나 과발현하도록, 또는 선택된 유전자의 발현이 감쇠되도록 조작될 수 있다. 숙주 세포의 비-제한적 예시들은 식물, 동물, 인간, 박테리아, 효모, 또는 곰팡이류 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "덜 엄격한(low stringency), 엄격한(medium stringency), 매우 엄격한(high stringency), 또는 아주 매우 엄격한(very high stringency) 조건 하에서 혼성화된다"라는 용어는 혼성화 (hybridization)와 세척에 대한 조건을 설명한다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 지침은 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 찾을 수 있다. 수성 및 비수성 방법은 상기 참고문헌에서 기술되고, 둘 중 하나가 사용될 수 있다. 본 명세서에서 언급되는 특이적인 혼성화 조건은 하기와 같다: 1) 대략 45 ℃에서 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC), 그 이후에 50 ℃이상에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS에서 2회 세척의 덜 엄격한 혼성화 조건 (상기 세척 온도는 덜 엄격한 조건의 경우에 55 ℃로 증가될 수 있다); 2) 대략 45 ℃이상에서 6X SSC, 그 이후에 60 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS에서 1회 이상의 세척의 엄격한 혼성화 조건; 3) 대략 45 ℃에서 6X SSC, 그 이후에 65 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS에서 1회 이상의 세척의 매우 엄격한 혼성화 조건; 그리고 바람직하게는, 4) 65 ℃에서 0.5M 인산나트륨, 7 % SDS, 그 이후에 65 ℃에서 0.2X SSC, 1 % SDS에서 1회 이상의 세척의 아주 매우 엄격한 혼성화 조건. 달리 명시되지 않으면, 아주 매우 엄격한 조건(4)가 바람직한 조건이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 관하여, "분리된"이라는 용어는 각각, 상기 핵산의 천연원(natural source) 내에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 지칭한다. 게다가, "분리된 핵산"은 단편으로서 자연적으로 발생되지 않으며 자연 상태에서 발견되지 않는, 핵산 단편을 포함하는 것으로 의미된다. 또한, "분리된"이라는 용어는 본 명세서에서 다른 세포 단백질로부터 분리되는 폴리펩티드를 지칭하는데 사용되고, 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 모두를 포함하는 것으로 의미된다. 또한, "분리된"이라는 용어는 본 명세서에서 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 경우에 배양 배지가 실질적으로 존재하지 않는 핵산 또는 펩티드를 지칭한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "분리된"이라는 용어는 화학적으로 합성되는 경우에 화학 전구물질 또는 기타 화학물질이 실질적으로 존재하지 않는 핵산 또는 펩티드를 지칭한다. 지방족 알데히드와 같은, 산물과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "분리된"이란 용어는 세포 구성요소, 세포 배양 배지, 또는 화학적 전구체 또는 합성 전구체로부터 분리된 산물들을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "세포 내에서 유전자의 발현 수준"은 세포 내에서 mRNA, mRNA전구체(pre-mRNA) 초기 전사체(들), 전사체 가공 중간물질, 성숙 mRNA(들), 및 상기 유전자에 의해 인코딩되는 분해 산물들의 수준을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "미생물"이라는 용어는 고세균(Archaea), 박테리아 및 진핵생물(Eucarya) 영역(domain)으로부터 원핵과 진핵 미생물 종을 의미하고, 후자에는 효모와 곰팡이류, 원생동물, 조류, 또는 고등 미생물(higher Protista)이 포함된다. "미생물 세포"(즉, 미생물로부터의 세포) 및 "미생물"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 현미경의 도움으로만 볼 수 있는 세포 또는 작은 유기체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "핵산"이라는 용어는 디옥시리보핵산(DNA)과 같은 폴리뉴클레오티드, 그리고 적절한 경우에 리보핵산(RNA)을 지칭한다. 또한, 상기 용어는 등가물(equivalent)로서, 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사체, 그리고 설명된 실시예에 적용가능하면, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, EST, 염색체, cDNA, mRNA, 그리고 rRNA를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 (예를 들어, 본 명세서에 설명된 폴리펩티드를 인코딩하는) 선택된 뉴클레오티드 서열이 프로모터와 가깝게 위치하고, 상기 프로모터가 선택된 DNA 서열의 발현을 조절할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 프로모터는 전사와 번역의 방향의 관점에서, 선택된 뉴클레오티드 서열의 상류에 위치된다. "작동가능하게 연결된"은 적절한 분자(예를 들어, 전사 활성화인자 단백질)가 조절 서열(들)에 결합되는 경우에, 뉴클레오티드 서열과 조절 서열(들)이 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된다는 것을 의미한다.
만약 분명하게 달리 명시되지 않는다면, "또는"이라는 용어는 본 명세서에서 "및/또는"이라는 용어를 의미하는데 사용되고, "및/또는"이라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "과발현"은 대응하는 야생-형 세포에서 정상적으로 발현되는 농도보다 높은 농도로 세포에서 핵산, 폴리펩티드, 또는 탄화수소를 발현하거나 발현되도록 유도한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드가 동일한 종의 비-재조합 숙주 세포에서의 농도와 비교하여 재조합 숙주 세포에서 더욱 높은 농도로 존재할 경우에, 상기 재조합 숙주 세포에서 "과발현"될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "분배 계수(partition coefficient)" 또는 "P"는 수성 상(예를 들어, 발효 배양액)에서 평형 농도로 나눈, 유기 상에서의 화합물의 평형 농도로서 정의된다. 본 명세서에 설명된 이중-상 시스템의 일 실시예에서, 유기 상은 생산 과정 동안 지방족 알데히드에 의해 형성된다. 하지만, 일부 예시에서, 유기 상은 예로써, 산물 분리를 용이하게 하는 옥탄 층을 제공함으로써 제공될 수 있다. 이중 상 시스템을 설명할 경우에, 화합물의 분배 특성은 logP로서 설명될 수 있다. 예를 들어, 1의 logP를 갖는 화합물은 유기 상에 10:1로 분배할 것이다. -1의 logP를 갖는 화합물은 유기 상에 1:10로 분배할 것이다. 적절한 발효 배양액과 유기 상을 선택함으로써, 높은 logP 값을 갖는 지방족 알데히드는 발효 용기 내에서 매우 낮은 농도에서도 유기 상으로 분리할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "정제한다", "정제된", 또는 "정제"라는 용어는 예를 들어, 분리(isolation) 또는 구분(separation)에 의해 주변 환경으로부터 분자의 이동(removal) 또는 분리를 의미한다. "실질적으로 정제된" 분자는 그들이 결합되는 다른 구성성분으로부터 대략 60 %이상, 바람직하게는 대략 75 %이상, 그리고 더욱 바람직하게는 대략 90 %이상 자유롭다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 또한 이들 용어는 샘플로부터 오염물질의 제거를 지칭한다. 예를 들어, 오염물질의 제거는 샘플 내에서 지방족 알데히드의 비율에 있어서의 증가를 유발할 수 있다. 예를 들어, 지방족 알데히드가 숙주 세포에서 생산되는 경우에, 상기 지방족 알데히드는 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제될 수 있다. 정제 후, 샘플 내에서 지방족 알데히드의 비율이 증가된다.
"정제한다", "정제된", 그리고 "정제"라는 용어는 절대 순도(absolute purity)를 요구하지 않는다. 이들은 상대적 용어이다. 따라서, 예를 들어 지방족 알데히드가 숙주 세포에서 생산되는 경우에, 정제된 지방족 알데히드는 다른 세포의 구성성분(예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 또는 기타 탄화수소)로부터 실질적으로 분리된 것이다. 또 다른 예시에서, 정제된 지방족 알데히드 제조물(preparation)은, 이들 지방족 알데히드가 발효 이후에 존재할 수도 있는 오염물질로부터 실질적으로 자유로운 것이다. 일부 실시예에서, 샘플의 중량으로 대략 50 %이상이 지방족 알데히드로 구성되는 경우에, 지방족 알데히드가 정제된다. 다른 실시예에서, 샘플의 중량으로 대략 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 또는 99 % 또는 그 이상이 지방족 알데히드로 구성되는 경우에, 지방족 알데히드는 정제된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "재조합 폴리펩티드"라는 용어는 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 폴리펩티드를 지칭하며, 여기서 일반적으로, 발현되는 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 DNA는 적합한 발현 벡터 내로 삽입되고, 상기 벡터는 교대로, 상기 폴리펩티드 또는 RNA를 생산하기 위하여 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 동일한" (또는 "실질적으로 상동인")이라는 용어는 첫 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 두 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 충분한 숫자의 동일한 또는 동등한 (예를 들어, 유사한 분지쇄, 예를 들면, 보존된 아미노산 치환을 갖는) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 포함하고, 따라서 첫 번째와 두 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 유사한 활성을 갖는 것을 지칭하는데 이용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생성효소"라는 용어는 합성 과정을 촉매하는 효소를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 생성효소라는 용어는 생성효소, 합성효소(synthetase), 및 연결효소(ligase)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "형질주입(transfection)"이라는 용어는 핵산-매개된 유전자 전달에 의하여 핵산을 (예를 들어, 발현 벡터를 통해) 수용자 세포 내로의 도입을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "형질전환(transformation)"은 외인성 DNA 또는 RNA의 세포 흡수의 결과로써 세포의 유전형이 변하는 과정을 지칭한다. 이는 RNA 또는 폴리펩티드의 재조합 형태를 발현하는 형질전환된 세포를 산출할 수 있다. 전달된 유전자로부터 안티센스 발현의 경우에, 자연-발생 형태의 폴리펩티드의 발현이 차단된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "수송 단백질"은 세포소기관 및/또는 세포의 내부 및/또는 외부로 하나 이상의 화합물의 이동을 용이하게 하는 폴리펩티드이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 X의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경된, 펩티드 X의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체는 보존성 변화 또는 비-보존성 변화를 가질 수 있다. 어떠한 아미노산 잔기가 생물학적 활성에 영향을 주지 않으면서, 치환, 삽입, 또는 결실(deleted)될 수 있는 지를 결정함에 대한 지침은 본 기술분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, LASERGENE 소프트웨어(DNASTAR)를 사용하여 알아낼 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열의 맥락에서 사용되는 경우에, "변이체"라는 용어는 유전자의 변이체 또는 이의 코딩 서열에 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 정의는 예를 들어, "대립유전자(allelic)", "절단접합(splice)", "종(species)", 또는 "다형성(polymorphic)" 변이체를 포함할 수 있다. 절단접합 변이체는 기준 폴리뉴클레오티드에 현저한 동일성을 갖지만, 일반적으로 mRNA 가공 동안 엑손(exon)의 대안적 절단접합(alternative splicing)으로 인하여 더욱 많은 또는 더욱 적은 숫자의 폴리뉴클레오티드를 가질 것이다. 대응하는 폴리펩티드는 추가적인 기능성 도메인 또는 도메인의 부재를 가질 수 있다. 종 변이체는 종 간에 상이한 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일반적으로, 결과물인 폴리펩티드는 서로에 대하여 현저한 아미노산 동일성을 가질 것이다. 다형성 변이체는 주어진 종의 개체 간에 특정 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서의 변이이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터"라는 용어는 상기 벡터와 연결되는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유용한 벡터의 한 가지 유형은 에피솜(episome)[즉, 염색체외 복제(extra-chromosomal replication)가 가능한 핵산]이다. 유용한 벡터는 이들 벡터와 연결되는 핵산의 자동 복제 및/또는 발현을 달성할 수 있는 것들이다. 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 "플라스미드" 형태인데, 이는 일반적으로 벡터 형태에서 염색체에 결합되지 않는 원형 이중 가닥 DNA 루프(loop)를 지칭한다. 본원 상세한 설명에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용되는데, 그 이유는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문이다. 그러나, 등가적인 기능을 수행하고 당해 기술분야에서 공지된 다른 형태의 발현 벡터 역시 포함된다.
본 발명은 적어도 일부분에서, 대장균(E. coli)에서 지방족 알데히드 생합성에 대한 새로운 경로의 발견, 및 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 확인을 기반으로 한다. 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 도 1에 도시된 생합성 경로에 관여한다. 이 경로에서, 지방산은 ATP에 의해 첫 번째로 활성화 되고, 이후에 지방족 알데히드를 발생하기 위하여 카르복시산 환원효소(CAR)-유사 효소(like enzyme)에 의해 환원된다. 따라서, 본 명세서에 설명된 지방족 알데히드 생합성 뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 지방족 알데히드를 생산하는데 이용될 수 있다.
지방족 알데히드 생합성 유전자들 및 변이체들
예를 들어, 본 명세서에 설명된 방법들 및 조성물들은 유전자의 폴리뉴클레오티드 변이체들뿐만 아니라, 지방족 알데히드 생합성 유전자들, 예를 들어 도 2 및 도 4에 기록된 뉴클레오티드 서열을 갖는 카르복시산 환원효소 유전자들(car 유전자들)을 포함한다. 일부 예시에서, 지방족 알데히드 생합성 유전자는 도 3에 도시된 하나 이상의 아미노산 모티프를 인코딩한다. 예를 들어, 상기 유전자는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; 및/또는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및 SEQ ID NO: 11을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. SEQ ID NO: 7은 환원효소 도메인을 포함하고; SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 14는 NADP 결합 도메인을 포함하며; SEQ ID NO: 9는 포스포판테테인 부착 부위를 포함하고; 그리고 SEQ ID NO: 10은 AMP 결합 도메인을 포함한다.
변이체들은 자연 발생되거나, 시험관 내에서 생성될 수 있다. 특히, 이러한 변이체들은 특정부위 돌연변이유발(site directed mutagenesis), 무작위 화학적 돌연변이유발(random chemical mutagenesis), 핵산말단가수분해효소(Exonuclease) III 결실 절차, 또는 표준 클로닝 기술과 같은 유전 공학 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 이러한 변이체들, 단편들, 유사체들, 또는 유도체들은 화학적 합성 또는 변형 절차를 사용하여 생성될 수 있다.
변이체들을 만드는 방법들은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들에는 산업적 또는 실험적 적용에 있어서 이들의 가치를 증대시키는 특성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들을 산출하기 위하여, 자연 분리물들(natural isolates)로부터 얻어진 핵산 서열이 조작되는 절차가 포함된다. 이러한 절차에서, 자연 분리물들로부터 얻어진 서열에 관하여 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 가지는 다수의 변이체 서열들이 산출되고 특성화된다. 전형적으로, 자연 분리물들로부터 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드들에 관하여 이들 뉴클레오티드 차이는 아미노산 변화를 야기한다.
예를 들어, 변이체들은 오류 빈발(error prone) PCR을 이용하여 생성될 수 있다(Leung et al., Technique 1:11-15, 1989; 및 Caldwell et al., PCR Methods Applic. 2:28-33, 1992 참조). 오류 빈발 PCR에서, PCR은 DNA 중합효소의 복사 정확도(copying fidelity)가 낮은 조건 하에 수행되고, 높은 비율의 점 돌연변이(point mutation)가 PCR 산물의 전장(entire length)을 따라서 획득된다. 간단히 말해, 이런 절차들에서, 돌연변이 유발되는 핵산들(예를 들어, 지방족 알데히드 생합성 폴리뉴클레오티드 서열)은 PCR 산물의 전장을 따라서 높은 비율의 점 돌연변이를 달성하기 위하여 PCR 프라이머, 반응 완충액, MgCl2, MnCl2, Taq 중합효소, 및 적절한 농도의 dNTP와 혼합된다. 예를 들어, 반응이 20 fmole의 돌연변이 유발되는 핵산(예를 들어, 지방족 알데히드 생합성 폴리뉴클레오티드 서열), 30 pmole의 각각의 PCR 프라이머, 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl(pH 8.3), 및 0.01 % 젤라틴을 포함하는 반응 완충액, 7 mM MgCl2, 0.5 mM MnCl2, 5 단위의 Taq 중합효소, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 1 mM dCTP, 그리고 1 mM dTTP를 사용하여 수행될 수 있다. PCR은 94 ℃에서 1분, 45 ℃에서 1분, 그리고 72 ℃에서 1분의 30회 주기 동안 수행될 수 있다. 그러나, 이들 파라미터는 적절하게 변할 수 있는 것으로 인지될 것이다. 이후에, 돌연변이 유발된 핵산은 적절한 벡터 내로 클로닝되고, 상기 돌연변이 유발된 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 활성이 평가된다.
또한, 변이체들은 임의의 클로닝된 목적 DNA 내에서 부위-특이적인 돌연변이를 발생시키는 올리고뉴클레오티드 지향된 돌연변이 유발을 사용하여 생성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 돌연변이 유발은 예를 들어, Reidhaar-Olson et al., Science 241:53-57, 1988에 설명된다. 간단히 말해서, 이러한 절차들에서 클로닝된 DNA 내로 도입되는 하나 이상의 돌연변이들을 보유하는 복수의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 합성되고, 돌연변이 유발되는 클로닝된 DNA(예를 들어, 지방족 알데히드 생합성 폴리뉴클레오티드 서열) 내로 삽입된다. 돌연변이유발된 DNA를 포함하는 클론은 회수(recovered)되고, 이들이 인코딩하는 폴리펩티드의 활성이 평가된다.
변이체들을 발생시키기 위한 또 다른 방법은 조립(assembly) PCR이다. 조립 PCR은 소형 DNA 단편의 혼합물로부터 PCR 산물의 조립을 수반한다. 다수의 상이한 PCR 반응이 동일한 바이알 내에서 병행으로 발생하는데, 한 반응의 산물이 또 다른 반응의 산물을 기폭한다. 예를 들어, 조립 PCR은 U.S. Pat. No. 5,965,408에 설명된다.
변이체들을 발생시키는 또 다른 방법은 유성(sexual) PCR 돌연변이 유발이다. 유성 PCR 돌연변이 유발에서, 서열 상동성을 기반으로 하는 DNA 분자의 무작위 단편화(random fragmentation)의 결과로써, 상이하지만 고도로 관련된 DNA 서열의 DNA 분자 간에 강제된 상동성 재조합(forced homologous recombination)이 시험관 내에서 발생한다. 그 이후에, PCR 반응에서 프라이머 신장에 의한 교차(crossover)의 고정이 수행된다. 유성 PCR 돌연변이 유발은 예를 들어, Stemmer, PNAS, USA 91:10747-10751, 1994에 설명된다.
또한, 변이체들은 생체 내에서 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시예에서, 핵산 서열 내에서 무작위 돌연변이는 하나 이상의 DNA 복원 경로(repair pathway)에서 돌연변이를 수송(carry)하는 박테리아 균주, 이를 테면 대장균(E. coli) 균주에서 상기 서열을 증식시킴으로써 발생된다. 이러한 "돌연변이 유발 유전자(mutator)" 균주들은 야생-형 균주에서보다 높은 무작위 돌연변이율을 갖는다. 궁극적으로, 이들 균주 중의 한 가지에서 DNA 서열(예를 들어, 지방족 알데히드 생합성 폴리뉴클레오티드 서열)의 증식은 DNA 내에서 무작위 돌연변이를 발생시킬 것이다. 생체 내에서의 돌연변이 유발에 이용하기 적합한 돌연변이 유발 유전자 균주들은, 예를 들어 PCT 공개(Publication) No. WO 91/16427에 설명된다.
또한, 변이체들은 카세트 돌연변이 유발(cassette mutagenesis)을 사용하여 발생될 수 있다. 카세트 돌연변이 유발에서, 이중 가닥 DNA 분자의 작은 영역이 고유 서열과 상이한 합성 올리고뉴클레오티드 "카세트"로 대체된다. 종종, 상기 올리고뉴클레오티드는 완전하게 및/또는 부분적으로 무작위화된 고유 서열을 포함한다.
순환 앙상블 돌연변이 유발(recursive ensemble mutagenesis) 역시 변이체들을 발생시키는데 사용될 수 있다. 순환 앙상블 돌연변이 유발은 아미노산 서열에서 상이하고 표현형적으로 관련된 돌연변이체의 다양한 개체군(population)을 생산하기 위하여 개발된, 단백질 공학(즉, 단백질 돌연변이 유발)을 위한 알고리즘이다. 이러한 방법은 조합 카세트 돌연변이 유발의 연속 라운드를 제어하기 위하여 피드백 기전을 사용한다. 순환 앙상블 돌연변이 유발은, 예를 들어 Arkin et al., PNAS, USA 89:7811-7815, 1992에 설명된다.
일부 실시예에서, 변이체들은 지수 앙상블(exponential ensemble) 돌연변이 유발을 사용하여 생성된다. 지수 앙상블 돌연변이 유발은 높은 비율의 독특한 기능성 돌연변이체로 조합 라이브러리를 발생시키기 위한 과정이며, 여기서 잔기의 작은 기들은 기능성 단백질을 야기하는 각각의 변경된 위치에서 아미노산을 확인하기 위하여 동시에 무작위화 된다. 지수 앙상블 돌연변이 유발은, 예를 들어 Delegrave et al., Biotech. Res. 11:1548-1552, 1993에 설명된다. 무작위와 특정부위 돌연변이 유발은, 예를 들어 Arnold, Curr. Opin. Biotech. 4:450-455, 1993에 설명된다.
일부 실시예에서, 변이체들은 재편성 절차(shuffling procedure)를 사용하여 생성되며, 여기서 별개의 폴리펩티드를 인코딩하는 복수의 핵산의 일부분이, 예를 들어 U.S. Pat. Nos. 5,965,408 및 5,939,250에 설명된 바와 같이 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 키메라 핵산 서열과 함께 융합된다.
또한, 폴리뉴클레오티드 변이체들은 핵산 유사체들을 포함한다. 핵산 유사체들은, 예를 들어 상기 핵산의 안정성, 혼성화, 또는 용해도를 향상시키기 위하여 염기 부분(base moiety), 당 부분(sugar moiety), 또는 인산염 주축(backbone)에서 조작될 수 있다. 염기 부분에서의 변형은 데옥시티미딘에 대한 데옥시우리딘 및 데옥시시티딘에 대한 5-메틸-2'-데옥시시티딘 또는 5-브로모-2'-독시시티딘(doxycytidine)을 포함한다. 당 부분의 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-O-알릴 당을 형성하도록 리보오스 당의 2' 하이드록실의 변형을 포함한다. 디옥시리보오스 인산염 주축은 모르폴리노 핵산을 생산하기 위하여 조작될 수 있고, 여기서 각각의 염기 부분은 6-원 모르폴리노 고리, 또는 펩티드 핵산에 연결되고, 여기서 상기 데옥시인산염 주축은 슈도펩티드 주축으로 대체되고 4개의 염기는 유지된다[Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:187-195; 및 Hyrup et al., Bioorgan. Med. Chem. (1996) 4:5-23.참조]. 또한, 데옥시인산염 주축은 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 주축, 포스포로아미디트, 또는 알킬 포스포트리에스테르 주축으로 대체될 수 있다.
도 2 및 도 4에 기록된 동족체, 또는 이의 변이체를 인코딩하는 여하한 폴리뉴클레오티드 서열은 본 명세서에 설명된 방법에서 지방족 알데히드 생합성 폴리뉴클레오티드로서 사용될 수 있다.
지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드들 및 변이체들
본 명세서에 설명된 방법들 및 조성물들은 폴리펩티드의 폴리펩티드 변이체들뿐만 아니라, 도 2 및 도 4에 기록된 아미노산 서열을 갖는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드들을 포함한다. 일부 예시에서, 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 도 3에 도시된 하나 이상의 아미노산 모티프들을 인코딩하는 것이다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 상황에서, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 및 SEQ ID NO: 14를 포함한다. 또 다른 상황에서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함한다. SEQ ID NO: 7은 환원효소 도메인을 포함하고; SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 14는 NADP 결합 도메인을 포함하며; SEQ ID NO: 9는 포스포판테테인 부착 부위를 포함하고; 그리고 SEQ ID NO: 10은 AMP 결합 도메인을 포함한다.
지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드 변이체들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존성 또는 비-보존성 아미노산 잔기(바람직하게는 보존성 아미노산 잔기)로 치환된 변이체일 수 있다. 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 인코딩되거나, 인코딩되지 않을 수 있다.
보존성 치환체들은 폴리펩티드 내에서 주어진 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산으로 대체하는 것이다. 전형적인 보존성 치환체들은 하기의 대체물들이다: 알라닌, 발린, 류신, 그리고 이소류신과 같은 지방족 아미노산의 다른 지방족 아미노산으로의 대체물(replacement); 세린의 트레오닌으로의 대체물, 또는 그 반대 경우의 대체물; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 잔기의 또 다른 산성 잔기로의 대체물; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드 기를 보유하는 잔기의 아미드 기를 보유하는 또 다른 잔기로의 대체물; 리신 및 아르기닌과 같은 염기성 잔기의 또 다른 염기성 잔기로의 교환물; 그리고 페닐알라닌 및 티로신과 같은 방향족 잔기의 또 다른 방향족 잔기로의 대체물.
다른 폴리펩티드 변이체들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것들이다. 또 다른 폴리펩티드 변이체들은 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물과 같은 다른 화합물(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)과 결합되는 것들이다.
부가적인 폴리펩티드 변이체들은 추가적인 아미노산이 선도 서열, 분비 서열, 전단백질(proprotein) 서열, 또는 폴리펩티드의 정제, 농축, 또는 안정화를 용이하게 하는 서열과 같은 폴리펩티드에 융합되는 것들이다.
일부 예시에서, 폴리펩티드 변이체들은 도 2 및 도 4에 기록된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서 동일한 생물학적 기능을 유지(예를 들어, 카르복시산 또는 지방산 환원효소 활성과 같은 지방족 알데히드 생합성 활성을 유지)하고, 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 예시에서, 폴리펩티드 변이체들은 도 2 및 도 4에 기록된 아미노산 서열에 대하여 대략 50 %이상, 대략 55 %이상, 대략 60 %이상, 대략 65 %이상, 대략 70 %이상, 대략 75 %이상, 대략 80 %이상, 대략 85 %이상, 대략 90 %이상, 대략 95 %이상, 또는 대략 95% 초과의 상동성을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 폴리펩티드 변이체들은 변이체의 대략 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 단편을 포함한다.
폴리펩티드 변이체들 또는 이들의 단편들은 본 명세서에 설명된 기술을 사용하여 이들을 인코딩하는 핵산을 분리함으로써, 또는 이들을 인코딩하는 합성 핵산을 발현함으로써 얻어질 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드 변이체들 또는 이들의 단편들은 생화학적 농축 또는 정제 절차를 통해 얻어질 수 있다. 폴리펩티드 변이체들 또는 단편들의 서열은 단백분해 절단(proteolytic digestion), 겔 전기영동(gel electrophoresis), 및/또는 미량서열결정(microsequencing)에 의해 결정될 수 있다. 이후에, 폴리펩티드 변이체들 또는 이들의 단편들의 서열은 본 명세서에 설명된 임의의 프로그램을 사용하여, 도 2 및 도 4에 기록된 아미노산 서열에 비교될 수 있다.
폴리펩티드 변이체들 및 이들의 단편들은 관례적인 방법을 사용하여 지방족 알데히드-생산 활성에 대하여 분석(assayed)될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 변이체들 또는 단편은 상기 폴리펩티드 변이체가 기능을 다하도록 하는 조건하에서 기질(예를 들어, 지방산, 지방산 유도체 기질, 또는 본 명세서에서 설명된 다른 기질)과 접촉될 수 있다. 기질 수준의 감소 또는 지방족 알데히드 수준의 증가는 지방족 알데히드-생산 활성을 결정하기 위하여 측정될 수 있다.
항-지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드 항체들
또한, 본 명세서에 설명된 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드에 대한 유도된 항체들을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체들은 본 기술분야에 공지된 방법들을 사용하여 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드의 발현을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 다중클론 항체; 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen binding fragment); 키메라 항체, 재형성 항체(reshaped antibody), 인간화 항체, 또는 이의 단편[예를 들어, Fab', Fab, F(ab')2]과 같은 조작된 항체; 또는 생합성 항체, 예를 들어, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체(DAB), Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 또는 이와 유사한 것일 수 있다.
다중클론과 단일클론 항체를 만들고 사용하는 방법들은, 예를 들어 Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory(December 1, 1998)에서 설명된다. 조작된 항체와 항체 단편[예를 들어, 키메라 항체, 재형성 항체, 인간화 항체, 또는 이의 단편, 예를 들면, Fab', Fab, F(ab')2 단편]; 또는 생합성 항체[예를 들어, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체(DAB), Fv, 단일 사슬 Fv (scFv), 및 이와 유사한 것]를 만드는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag(December 15, 2000; 1st edition)에서 찾아볼 수 있다.
기질들
본 명세서에 설명된 조성물들 및 방법들은 적절한 기질로부터 지방족 알데히드를 생산하는데 사용될 수 있다. 특정 이론에 구속되지 않지만, 본 명세서에 설명된 폴리펩티드는 환원 기전을 통해 기질로부터 지방족 알데히드를 생산하는 것으로 믿어진다. 일부 예시에서, 기질은 지방산 유도체(예를 들어, 지방산)이고, 특정한 분지화 패턴(branching pattern)과 탄소 사슬 길이를 갖는 지방족 알데히드는 원하는 지방족 알데히드를 생성하는 이러한 특징을 갖는 지방산 유도체로부터 생산될 수 있다.
따라서, 지방산 유도체 기질의 생산을 이끄는 생합성 경로 내에서 각각의 단계는 목적 기질을 생산하거나 과생산하기 위하여 조작될 수 있다. 예를 들어, 지방산 생합성 경로 또는 지방족 알데히드 경로에 관여하는 공지된 유전자는 원하는 기질을 생산하기 위하여, 숙주 세포 내에서 발현되거나, 과발현되거나, 또는 감쇠될 수 있다(예를 들어, PCT/US08/058788 참조). 예시적인 유전자들은 도 5에 제공된다.
기질들의 합성
지방산 생성효소(fatty acid synthase: FAS)는 아실 사슬들의 개시 및 신장(elongation)을 촉매하는 일군의 폴리펩티드이다(Marrakchi et al., Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002). FAS 경로에서 상기 효소와 함께 아실 운반 단백질(acyl carrier protein: ACP)은 생산되는 지방산 유도체의 길이, 포화도, 및 분지화(branching)를 제어한다. 상기 지방산 생합성 경로는 전구물질(precursor) 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA를 수반한다. 상기 경로에서 이 단계는 지방산 생합성(fab) 및 아세틸-CoA 탈탄산효소(acc) 유전자 집단의 효소에 의해 촉매된다[예를 들어, Heath et al., Prog. Lipid Res. 40(6):467-97 (2001)를 참조].
숙주 세포는 아세틸-CoA 및/또는 말로닐-CoA 생성효소 유전자와 같은 하나 이상의 지방산 생성효소 유전자를 재조합형으로 발현 또는 과발현시킴으로써 지방산 유도체 기질을 발현하도록 공학처리될 수 있다. 예를 들어, 아세틸-CoA 생산을 증가시키기 위하여, 하기의 유전자들 중에서 하나 이상이 숙주 세포에서 발현될 수 있다: pdh(E1p 탈수소효소 구성성분, 피루브산염 및 2-옥소글루타르산 탈수소효소 복합체의 E2p 디하이드로리포아미드 아실전이효소 구성성분, 및 lpd를 인코딩하는aceEF를 포함하는 다효소 복합체), panK, fabH, fabB, fabD, fabG, acpP, 및 fabF. 이들 유전자에 대한 예시적인 GenBank 수탁 번호는 하기와 같다: pdh(BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK(CoA, AAC76952로 알려짐), aceEF(AAC73227, AAC73226), fabH(AAC74175), fabB(P0A953), fabD(AAC74176), fabG(AAC74177), acpP(AAC74178), fabF(AAC74179). 부가적으로, fadE, gpsA, ldhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA, 및/또는 ackB의 발현 수준은 대응하는 유전자의 삭제 돌연변이(null mutation) 또는 결실 돌연변이를 함유하는 조건적으로 복제성 또는 비-복제성 플라스미드로 형질전환함으로써, 또는 프로모터 또는 인핸서 서열들을 치환함으로써, 공학처리된 숙주 세포 내에서 감쇠되거나 녹아웃(knock-out)될 수 있다. 이들 유전자에 대한 예시적인 GenBank 수탁 번호는 하기와 같다: fadE(AAC73325), gspA(AAC76632), ldhA(AAC74462), pflb(AAC73989), adhE(AAC74323), pta(AAC75357), poxB(AAC73958), ackA(AAC75356), 및 ackB(BAB81430). 결과물인 숙주 세포는 적절한 환경에서 성장될 때 증가된 아세틸-CoA 생산 수준을 가질 것이다.
말로닐-CoA 과발현은 숙주 세포 내로 accABCD(예를 들어, 수탁 번호AAC73296, EC 6.4.1.2)를 도입함으로써 작용될 수 있다. 지방산들은 리파아제를 인코딩하는 DNA 서열(예를 들어, 수탁 번호 CAA89087, CAA98876)을 숙주 세포 내로 도입함으로써 숙주 세포 내에서 더욱 과발현될 수 있다.
또한, PlsB 저해는 긴 사슬 아실-ACP의 수준에서 증가로 이끌 수 있고, 이는 상기 경로에서 초기 단계(예를 들어, accABCD, fabH, 및 fabI)를 저해할 것이다. plsB(예를 들어, 수탁 번호 AAC77011) D311E 돌연변이는 사용가능한 지방산의 양을 증가시키는데 사용될 수 있다.
또한, 숙주 세포는 단일불포화 지방산의 생산을 증가시키기 위하여, sfa 유전자(fabA의 억제자, 예를 들어, 수탁 번호 AAN79592)를 과발현하도록 공학처리될 수 있다(Rock et al., J. Bacteriology 178:5382-5387, 1996).
지방산 유도체 기질의 사슬 길이는 선택되는 티오에스테라아제의 발현을 조작함으로써 선택될 수 있다. 티오에스테라아제는 생산되는 지방산의 사슬 길이에 영향을 준다. 따라서, 숙주 세포는 바람직한 지방산 유도체 기질의 생산을 증가시키기 위하여 하나 이상의 선택된 티오에스테라아제를 발현하거나, 과발현하거나, 감쇠된 발현을 가지거나, 발현되지 않도록 공학처리될 수 있다. 예를 들어, C10 지방산들을 생산하는데 적합성(preference)을 갖는 티오에스테라아제를 발현시키고, C10 지방산들 이외의 지방산을 생산하는데 적합성을 갖는 티오에스테라아제(예를 들어, C14 지방산들을 생산하는데 적합한 티오에스테라아제)를 감쇠시킴으로써, C10 지방산들이 생산될 수 있다. 이는 10의 탄소 사슬 길이를 갖는 지방산의 상대적으로 균일한 집단을 산출한다. 다른 예시에서, 비-C14 지방산들을 생산하는 내인적 티오에스테라아제를 감쇠시키고, C14-ACP를 사용하는 티오에스테라아제를 발현시킴으로써 C14 지방산들이 생산될 수 있다. 일부 예시에서, C12-ACP를 사용하는 티오에스테라아제를 발현시키고, 비-C12 지방산들을 생산하는 티오에스테라아제를 감쇠시킴으로써, C12 지방산들이 생산될 수 있다. 아세틸-CoA, 말로닐-CoA, 및 지방산 과생산은, 예를 들어 세포 용해 후 방사성 전구물질, HPLC, 또는 GC-MS를 사용함으로써, 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 증명될 수 있다. 본 명세서에 설명된 방법에 사용될 수 있는 티오에스테라아제의 비-제한적 예시들은 표 1에 기록된다.
표 1: 티오에스테라아제들
Figure 112017024455945-pat00001
* Mayer et al., BMC Plant Biology 7:1-11, 2007
다른 예시에서, 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드, 이의 변이체, 또는 단편은 숙주 세포에서 증가된 수준의 지방산들을 야기하는 자연적으로 발생하는 돌연변이를 함유하는 상기 숙주 세포에서 발현된다. 일부 예시에서, 숙주 세포는 대응하는 야생-형 숙주 세포에 비해 상기 숙주 세포에서 지방산의 수준을 증가하도록 유전공학처리된다. 예를 들어, 숙주 세포는 대응하는 야생-형 숙주 세포에 비해 감소된 수준의 아실-CoA 생성효소를 발현하도록 유전공학 처리될 수 있다. 일 실시예에서, 하나 이상의 유전자(예를 들어, 아실-CoA 생성효소 유전자)의 수준은 "결여된" 숙주 세포를 유전공학처리함으로써 감소된다.
공지된 여하한의 아실-CoA 생성효소 유전자는 숙주 세포에서 감소되거나 결여될 수 있다. 아실-CoA 생성효소 유전자의 비-제한적 예시들은 fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadDl, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p 또는 단백질 ZP_O1644857를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 아실-CoA 생성효소 유전자의 특정 예시는 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv [NP_217021]로부터의 fadDD35, 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv [NP_217464]로부터의 fadDD22, 대장균(E. coli) [NP_416319]로부터의 fadD, 대장균(E. coli) [NP_416216]로부터의 fadK, 아시네토박터(Acinetobacter sp.) ADP1 [YP_045024]로부터의 fadD, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) RdkW20 [NP_438551]로부터의 fadD, 로도슈도모나스 파루스리스(Rhodopseudomonas palusris) Bis B18 [YP 533919]로부터의 fadD, 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) C-125 [NP_243969]로부터 BH3101, 슈도모나스 플루오르슨스(Pseudomonas fluorescens) Pfo-1 [YP 350082]로부터의 Pfl-4354, 코마모나스 테스토스테론(Comamonas testosterone) KF-1 [ZP_01520072]로부터의 EAV15023, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) [NP_388908]로부터의 yhfL, 슈도모나스 에어루기노사(P. aeruginosa) PAOl [NP_251989]로부터의 fadD1, 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) GM1 1000 [NP_520978]로부터 fadD1, 슈도모나스 에어루기노사(P. aeruginosa) PAO1 [NP_251990]로부터의 fadD2, 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) R551-3로부터 단백질 ZP_01644857을 인코딩하는 유전자, 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae) [NP_012257]으로부터의 faa3p, 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae) [NP_014962]로부터의 faalp, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) [CAA99571]로부터의 lcfA, 또는 Shockey et al., Plant. Physiol. 129:1710-1722, 2002; Caviglia et al, J. Biol. Chem. 279:1163-1169, 2004; Knoll et al., J. Biol. Chem. 269(23):16348-56, 1994; Johnson et al., J. Biol. Chem. 269:18037-18046, 1994; 및 Black et al., J. Biol Chem. 267:25513-25520, 1992에 설명된 것을 포함한다.
분지형 지방족 알데히드들의 형성
지방족 알데히드들은 기질들로서 분지형 지방산 유도체들을 사용함으로써 분지 지점(branch point)을 함유하도록 생산될 수 있다. 예를 들어, 대장균(E. coli)이 자연적으로 직쇄 지방산(sFA)들을 생산하나, 대장균(E. coli)은 상기 대장균(E. coli)에서 분지형 전구물질을 제공하는 유전자들(예를 들어, bkd, ilv, icm, 및 fab 유전자 일족)을 도입하고 발현 또는 과발현시킴으로써, 분지형 사슬 지방산(brFA)들을 생산하도록 공학처리될 수 있다. 부가적으로, 숙주 세포는 brFA의 신장을 위한 단백질들(예를 들어, ACP, FabF 등)을 인코딩하는 유전자를 발현 또는 과발현시키고 및/또는 정상적으로 sFA들을 발생시키는 대응하는 숙주 세포 유전자들을 결실 또는 감쇠시킴으로써 공학처리될 수 있다.
brFA들을 형성하는에서 첫 번째 단계는 분지형-사슬 아미노산 아미노전이효소(aminotransferase)에 의한 대응하는 α-케토산들의 생산이다. 숙주 세포들은 이러한 효소들을 인코딩하는 유전자들을 내인적으로 포함하거나, 이러한 유전자들이 재조합형으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 대장균(E. coli)은 이러한 효소, IlvE를 내인적으로 발현한다(EC 2.6.1.42; GenBank 수탁 YP_026247). 일부 숙주 세포에서, 이질성 분지형-사슬 아미노산 아미노기 전이효소가 발현되지 않을 수 있다. 하지만, 대장균(E. coli) IlvE, 또는 여하한의 다른 분지형 사슬 아미노산 아미노전이효소[예를 들어, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)(GenBank 수탁 AAF34406)로부터 IlvE, 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida)(GenBank 수탁 NP_745648)로부터 IlvE, 또는 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor)(GenBank 수탁 NP_629657)로부터 IlvE]가 내인적이지 않으면, 도입될 수 있다.
또 다른 실시예에서, α-케토산의 생산은 Atsumi et al, Nature 451:86-89, 2008에 설명된 방법을 사용함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어, 2-케토이소발레레이트는 IlvI, IlvH, IlvC, 또는 IlvD를 인코딩하는 유전자를 과발현시킴으로써 생산될 수 있다. 또 다른 예시에서, 2-케토-3-메틸-발레레이트는 IlvA 및 IlvI, IlvH [또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 AlsS], IlvC, IlvD, 또는 이들의 대응하는 동족체들을 인코딩하는 유전자들을 과발현시킴으로써 생산될 수 있다. 추가적인 실시예에서, 2-케토-4-메틸-펜타노에이트는 IlvI, IlvH, IlvC, IlvD 및 LeuA, LeuB, LeuC, LeuD, 또는 이들의 대응하는 동족체들을 인코딩하는 유전자를 과발현시킴으로써 생산될 수 있다.
두 번째 단계는 α-케토산들이 대응하는 분지형 사슬 아실-CoA로의 산화성 탈카르복실화(decarboxylation)이다. 이러한 반응은 분지형 사슬 α-케토산 탈수소효소 복합체(bkd; EC 1.2.4.4.)에 의해 촉매될 수 있으며(Denoya et al., J. Bacteriol. 177:3504, 1995), 상기 복합체는 E1α/β(탈탄소효소), E2(디하이드로리포일 트랜스아실라아제), 및 E3(디히드로리포일 탈수소효소) 서브유닛으로 구성된다. 이들 분지형-사슬 α-케토산 탈수소효소 복합체들은 피루브산염 및 α-케토글루타르산 탈수소효소 복합체들에 유사하다. brFA들을 보유하고 및/또는 분지형- 사슬 아미노산들에서 성장하는 여하한의 미생물은 숙주 세포, 예를 들면 대장균(E. coli)에서 발현을 위한 bkd 유전자들을 분리하기 위한 원료(source)로서 사용될 수 있다. 게다가, 대장균(E. coli)은 피루브산염 탈수소효소 복합체의 일부로서 E3 구성성분을 보유한다(lpd, EC 1.8.1.4, GenBank 수탁 NP_414658). 따라서, 이는 E1 α/β 및 E2 bkd 유전자들만을 발현하는데 충분할 수 있다. 표 2는 분지형-사슬 아실-CoA 전구물질들을 제공하기 위하여 숙주 세포에서 재조합형으로 도입되고 발현될 수 있는, 여러 미생물들로부터 bkd 유전자들의 비-제한적 예시들을 기록한다.
표 2: 선택된 미생물들로부터의 Bkd 유전자들
Figure 112017024455945-pat00002
또 다른 예시에서, 이소부티릴-CoA는 크로토닐-CoA 환원효소(Ccr, EC 1.6.5.5, 1.1.1.1) 및 이소부티릴-CoA 무타제(대형 서브유닛 IcmA, EC 5.4.99.2; 소형 서브유닛 IcmB, EC 5.4.99.2)의 공동발현을 통해 숙주 세포, 예를 들면 대장균(E. coli)에서 만들어질 수 있다(Han and Reynolds, J. Bacteriol. 179:5157, 1997). 크로토닐-CoA는 대장균(E. coli) 및 기타 미생물들에서 지방산 생합성에서의 중간체(intermediate)이다. 선택된 미생물로부터 ccr 및 icm 유전자들의 비-제한적 예시들은 표 3에 기록된다.
표 3: 선택된 미생물들로부터의 Ccr 및 icm 유전자들
Figure 112017024455945-pat00003
bkd 유전자들의 발현에 더하여, brFA 생합성의 개시는 분지형 사슬 아실-CoA에 대한 특이성(specificity)을 갖는 β-케토아실-아실-운반-단백질 생성효소 III(FabH, EC 2.3.1.41)을 이용한다(Li et al., J. Bacteriol. 187:3795-3799, 2005). 이러한 FabH 효소의 비-제한적 예시들은 표 4에 기록된다. 여하한의 brFA-함유 미생물의 지방산 생합성에 관여하는 fabH 유전자들은 숙주 세포에서 발현될 수 있다. brFA를 자연적으로 만들지 않는 숙주 세포들로부터 Bkd와 FabH 효소들은 brFA 생산을 지원하지 못할 수 있다. 그러므로, bkd 및 fabH는 재조합형으로 발현될 수 있다. bkd 및 fabH 유전자들을 함유하는 벡터들은 이러한 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 유사하게, Bkd 및 FabH 생산의 내인적 수준이 brFA를 생산하는데 충분하지 않을 수 있다. 이런 경우에, 이들은 과발현될 수 있다. 부가적으로, 아실 운반 단백질(ACP)들 및 β-케토아실-아실-운반-단백질 생성효소 II(fabF, EC 2.3.1.41)와 같은 지방산 생합성 경로의 다른 구성성분이 발현되거나 과발현될 수 있다(후보의 비-제한적 예시들은 표 4에 기록된다). 이들 유전자들을 발현시키는 것에 더하여, 내인적 지방산 생합성 경로에서 일부 유전자들이 숙주 세포에서 감쇠될 수 있다[예를 들어, 대장균(E. coli) 유전자들 fabH(GenBank 수탁 # NP_415609) 및/또는 fabF(GenBank 수탁 # NP_415613)].
표 4: brFA들을 갖는 선택된 미생물들로부터의 FabH, ACP 및 fabF 유전자들
Figure 112017024455945-pat00004
사이클릭 지방족 알데히드(Cyclic Fatty Aldehyde)들의 형성
사이클릭 지방족 알데히드는 기질들로서 사이클릭 지방산 유도체들을 사용함으로써 생산될 수 있다. 사이클릭 지방산 유도체 기질들을 생산하기 위하여, 사이클릭 전구물질들을 제공하는 유전자들(예를 들면, ans, chc, 및 plm 유전자 일족)가 사이클릭 전구물질들로부터 지방산 생합성을 개시하도록 숙주 세포 내로 도입되고 발현될 수 있다. 예를 들어, 대장균(E. coli)과 같은 숙주 세포를 ω-사이클릭 지방산(cyFA)들을 합성할 수 있는 세포로 전환시키기 위하여, 사이클릭 전구물질 시클로헥실카르보닐-CoA(CHC-CoA)를 제공하는 유전자(Cropp et al., Nature Biotech. 18:980-983, 2000)가 숙주 세포에서 도입되고 발현될 수 있다. 대장균(E. coli)에서 CHC-CoA를 제공하는 유전자들의 비-제한적 예시들은: 스트렙토마이세스 콜리누스(S. collinus), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(S. avermitilis), 또는 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor)로부터 chcB 유전자(Patton et al., Biochem. 39:7595-7604, 2000)와 함께, 스트렙토마이세스 콜리누스(Streptomyces collinus)의 안사트리에닌 유전자 클러스터(ansatrienin gene cluster)로부터의 ansJ, ansK, ansL, chcA, 및 ansM (Chen et al., Eur. J. Biochem. 261: 98-107, 1999), 또는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) HK803의 포스락토마이신(phoslactomycin) B 유전자 클러스터로부터의 plmJ, plmK, plmL, chcA, 및 plmM (Palaniappan et al., J. Biol. Chem. 278:35552-35557, 2003)를 포함한다[표 5 참조]. 이후에, 표 4에 기록된 유전자들은 ω-사이클릭 지방산들의 개시와 신장이 가능하도록 발현될 수 있다. 대안적으로, 이들 상동성 유전자들은 cyFA를 만드는 미생물들로부터 분리되고, 숙주 세포[예를 들어, 대장균(E. coli)]에서 발현될 수 있다.
표 5: CHC - CoA의 합성을 위한 유전자들
Figure 112017024455945-pat00005
*chcA만 GenBank 기입 U72144에서 주해되고, ansJKLM은 Chen et al. (Eur. J. Biochem. 261:98-107, 1999)에 따른다.
표 4에 기록된 유전자들(fabH, ACP, 및 fabF)는 ω-사이클릭 지방산 유도체의 개시와 신장을 가능하게 하는데, 그 이유는 이들이 폭 넓은 기질 특이성을 갖기 때문이다. 이들 유전자들 중에서 한 가지와 표 5에 기록된 유전자들의 공동발현이 cyFA를 산출하지 못하면, cyFA들을 만드는 미생물들(예를 들어, 표 6에 기록된 것들)로부터 fabH, acp, 및/또는 fabF 동족체들이 [예를 들어, 축퇴(degenerate) PCR 프라이머 또는 이질성 DNA 서열 프로브를 사용함으로써] 분리되고 공동발현될 수 있다.
표 6: ω-사이클릭 지방산들을 함유하는 미생물들의 비-제한적 예시들
Figure 112017024455945-pat00006
*cyFA 생합성을 위한 전구물질로서 사이클로헵틸카르보닐-CoA는 사용되지만 사이클로헥실카르보닐-CoA는 사용되지 않는다.
지방족 알데히드 포화 수준(Saturation Level)들
지방산들에서의 포화도(degree of saturation)는 지방산 중간체들의 포화도를 조절함으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, sfa, gns, 및 fab 유전자 일족은 지방산의 포화를 제어하기 위하여 발현되거나 과발현되거나, 또는 감소된 수준에서 발현될 수 있다. 도 5에는 본 명세서에 설명된 방법들 및 숙주 세포들에서 사용될 수 있는 유전자 일족들에서 유전자들의 비-제한적 예시들을 기록한다. 도 6은 추가적인 fabA 관련된 유전자들을 기록하고, 도 7은 추가적인 fabB 관련된 유전자들을 기록한다.
예를 들어, 숙주 세포는 fabB를 과발현하도록 숙주 세포(production host)를 공학처리함으로써, 또는 낮은 온도들(예를 들어, 37℃ 미만)에서 숙주 세포(production host)를 성장시킴으로써, 불포화 지방산들을 생산하도록 공학처리될 수 있다. FabB는 시스-δ3데세노일-ACP가 바람직하고 대장균(E. coli)에서 불포화 지방산 생산을 야기한다. fabB의 과발현은 현저한 비율의 불포화 지방산의 생산을 야기한다(de Mendoza et al., J. Biol. Chem. 258:2098-2101, 1983). 유전자 fabB는 상기 유전자를 자연적으로 가지고 있지 않은 숙주 세포 내로 삽입되고 발현될 수 있다. 이후에, 이들 불포화 지방산 유도체는 지방족 알데히드와 같은, 지방산 유도체를 생산하도록 공학처리된 숙주 세포에서 중간체로서 사용될 수 있다.
다른 예시에서, 지방산 생합성의 억제인자(repressor), 예를 들면 fabR(GenBank 수탁 NP_418398)이 결실될 수 있고, 이는 또한, 대장균(E. coli)에서 증가된 불포화 지방산 생산을 야기할 것이다(Zhang et al., J. Biol. Chem. 277:15558, 2002). 유사한 결실들이 다른 숙주 세포들에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 불포화 지방산에서의 추가적인 증가는 대장균(E. coli) fabI(트랜스-2-에노일-ACP 환원효소, GenBank 수탁 NP_415804)를 결실시키면서, fabM(트랜스-2, 시스-3-데세노일-ACP 이성질화효소, GenBank 수탁 DAA05501)의 과발현 및 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)으로부터 fabK(트랜스-2-에노일-ACP 환원효소 II, GenBank 수탁 NP_357969)의 제어된 발현에 의해 달성될 수 있다(Marrakchi et al., J. Biol. Chem. 277: 44809, 2002). 일부 예시에서, 내인적 fabF 유전자는 감쇠될 수 있으며, 따라서 생산되는 팔미톨리에이트의 비율(C16:1)이 증가한다.
또 다른 예시에서, 숙주 세포는 sfa, gns, 및/또는 fab 유전자의 발현을 감소시킴으로써 포화 지방산을 생산하도록 공학처리될 수 있다.
일부 예시에서, 숙주 세포는 탈수소효소/이성질화효소 및/또는 케토아실-ACP 생성효소의 감쇠된 수준을 발현하도록 공학처리될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 fabA, fabB, 도 6에 기록된 유전자, 및/또는 도 7에 기록된 유전자의 감소된 수준을 발현하도록 공학처리될 수 있다. 일부 예시에서, 숙주 세포는 불포화 지방산의 존재하에서 성장될 수 있다. 다른 예시에서, 숙주 세포는 불포화 효소(desaturase enzyme)를 인코딩하는 유전자를 발현하거나 과발현하도록 더 공학처리될 수 있다. 불포화효소의 일 비제한적 예시는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) DesA (AF037430)이다. 불포화 효소들을 인코딩하는 다른 유전자들은 본 기술분야에 알려져 있으며, 헥사데카노일-ACP 또는 옥타데카노일-ACP와 같은 아실-ACP를 사용하는 불포화효소와 같은, 숙주 세포들 및 본 명세서에 설명된 방법들에 사용될 수 있다. 포화 지방산들은 본 명세서에 설명되는 것처럼, 지방족 알데히드와 같은 지방산 유도체들을 생산하는데 사용될 수 있다.
지방족 알데히드들을 생산하기 위한 숙주 세포들의 유전공학(Genetic Engineering)
본 명세서에 설명된 바와 같이, 지방족 알데히드들을 생산하기 위하여 다양한 숙주 세포들이 사용될 수 있다. 숙주 세포는 여하한 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 설명된 폴리펩티드는 박테리아 세포[예를 들어, 대장균(E. coli)], 곤충 세포, 효모 또는 포유동물 세포[이를 테면, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, VERO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Cv1 세포, MDCK 세포, 293 세포, 3T3 세포, 또는 PC12 세포]에서 발현될 수 있다. 다른 예시적인 숙주 세포는 에스체리키아(Escherichia) 속, 바실루스(Bacillus) 속, 락토바실루스(Lactobacillus) 속, 로도코쿠스(Rhodococcus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 트리코더마(Trichoderma) 속, 뉴로스포라(Neurospora) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 후미콜라(Humicola) 속, 리조무코(Rhizomucor) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 무코(Mucor) 속, 미셀리오프토라(Myceliophtora) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 파네로차에테(Phanerochaete) 속, 느타리속(Pleurotus), 송편버섯속(Trametes), 크리소스포륨(Chrysosporium) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속, 야로위아(Yarrowia) 속, 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속의 구성원으로부터 세포를 포함한다. 또 다른 예시적인 숙주 세포는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 세포, 바실루스 브레비스(Bacillus brevis) 세포, 바실루스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 세포, 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 세포, 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus) 세포, 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 세포, 바실루스 키르쿨란스(Bacillus circulans) 세포, 바실루스 푸밀리스(Bacillus pumilis) 세포, 바실루스 튜링기엔시스(Bacillus thuringiensis) 세포, 바실루스 클라우시(Bacillus clausii) 세포, 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) 세포, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 세포, 트리코더마 코닌기(Trichoderma koningii) 세포, 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) 세포, 트리코더마 르에세이(Trichoderma reesei) 세포, 트리코더마 롱기브라키아텀(Trichoderma longibrachiatum) 세포, 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 세포, 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigates) 세포, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus) 세포, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 세포, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 세포, 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 세포, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 세포, 후미콜라 라누기노세(Humicola lanuginose) 세포, 리조무코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 세포, 무코 미에헤이(Mucor michei) 세포, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포, 스트렙토마이세스 무리누스(Streptomyces murinus) 세포, 또는 방선균(Actinomycetes) 세포일 수 있다. 다른 숙주 세포는 남세균(cyanobacterial) 숙주 세포이다.
바람직한 실시예에서, 숙주 세포는 대장균(E. coli) 세포, 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae) 세포, 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포이다. 더욱 바람직한 실시예에서, 숙주 세포는 대장균(E. coli) 균주 B, C, K, 또는 W이다. 다른 적합한 숙주 세포는 본 기술분야의 전문가에게 공지되어 있다.
본 명세서에 설명된 방법에 사용될 수 있는 추가적인 숙주 세포는 WO 2009/111513 및 WO 2009/111672에 설명된다.
본 기술분야에 잘 알려진 다양한 방법들이 지방족 알데히드들을 생산하도록 숙주 세포들을 유전공학처리 하는데 사용될 수 있다. 상기 방법들은 본 명세서에 설명된 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산을 함유하는 벡터들, 바람직하게는 발현 벡터들의 사용을 포함할 수 있다. 본 기술분야의 전문가들은 다양한 바이러스 벡터들(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터)을 인지할 것이며, 비-바이러스 벡터들은 본 명세서에 설명된 방법들에 사용될 수 있다.
본 명세서에 설명된 재조합 발현 벡터들은 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로, 본 명세서에 설명된 핵산을 포함한다. 재조합 발현 벡터들은 발현에 사용되는 숙주 세포에 기초하여 선택된 하나 이상의 조절 서열들을 포함할 수 있다. 조절 서열은 발현되는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 이러한 조절 서열들은 예를 들어, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 설명된다. 조절 서열들은 많은 유형의 숙주 세포들에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것들, 및 여하한 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것들(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것을 본 기술분야의 전문가들은 인지할 것이다. 본 명세서에 설명된 발현 벡터들은 본 명세서에 설명된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는, 융합 폴리펩티드들을 포함하는, 폴리펩티드들을 생산하기 위하여 숙주 세포들에 도입될 수 있다.
재조합 발현 벡터들은 원핵 또는 진핵 세포[예를 들어, 대장균(E. coli)와 같은 박테리아 세포, 곤충 세포(예를 들어, 배큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포, 또는 포유동물 세포]에서 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드 또는 변이체의 발현에 맞게 설계될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에서 더 논의된다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용함으로써, 시험관 내에서 전사되고 번역될 수 있다.
원핵생물, 예를 들어 대장균(E. coli)에서 폴리펩티드들의 발현은 대부분의 경우, 융합 또는 비-융합 폴리펩티드의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터들로 수행된다. 융합 벡터들은 그 속에 인코딩된 폴리펩티드에, 일반적으로, 재조합 폴리펩티드의 아미노 말단에 다수의 아미노산들을 첨가한다. 전형적으로, 이러한 융합 벡터들은 3가지 목적: (1) 재조합 폴리펩티드의 발현을 증가시키고; (2) 재조합 폴리펩티드의 용해도를 증가시키며; (3) 친화성 정제(affinity purification)에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 폴리펩티드의 정제를 돕는 것을 수행한다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 융합 모이어티와 재조합 폴리펩티드의 접합점에 단백분해 절단(proteolytic cleavage) 부위가 도입된다. 이는 융합 폴리펩티드의 정제 이후에 융합 모이어티로부터 재조합 폴리펩티드의 분리를 가능하게 한다. 이러한 효소들, 및 이들의 동족 인식 서열(cognate recognition sequence)들의 예시들은 인자 Xa, 트롬빈, 및 엔테로키나아제(enterokinase)를 포함한다. 예시적인 융합 발현 벡터들은 pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith et al., Gene (1988) 67:31-40), pMAL(New England Biolabs, Beverly, Mass.), 및 pRITS(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함하며, 이들은 표적 재조합 폴리펩티드에 각각, 글루타티온 S-전이효소(glutathione S-transferase, GST), 말토오스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 융합한다.
유도성, 비-융합 대장균(E. coli) 발현 벡터의 예시들은 pTrc(Amann et al., Gene (1988) 69:301-315) 및 pET 11d(Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)를 포함한다. pTrc 벡터로부터 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터 숙주 RNA 중합효소 전사에 의존한다. pET 11d 벡터로부터 표적 유전자 발현은 공동발현된 바이러스 RNA 중합효소(T7 gn1)에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터 전사에 의존한다. 이러한 바이러스 중합효소는 lacUV 5 프로모터의 전사 제어 하에, T7 gn1 유전자를 보유하는 내재성 λ 프로파지(resident λ prophage)로부터 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 공급된다.
재조합 폴리펩티드 발현을 극대화시키는 한 가지 전략은 재조합 폴리펩티드를 단백분해 절단하는 능력이 손상된 숙주 세포에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 것이다[Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128 참조]. 또 다른 전략은 발현 벡터 내로 삽입되는 핵산 서열을 변경하여 각각의 아미노산에 대한 개별 코돈이 숙주 세포에서 우선적으로(preferentially) 이용되는 것들이 되도록하는 것이다[Wada et al., Nucleic Acids Res. (1992) 20:2111-2118]. 핵산 서열들의 이런 변경은 표준 DNA 합성 기술들에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 이러한 실시예에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)에서 발현을 위한 벡터들의 예시들은 pYepSec1(Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229-234), pMFa(Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88(Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123), pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), 및 picZ(Invitrogen Corp, San Diego, Calif.)를 포함한다.
대안적으로, 본 명세서에 설명된 폴리펩티드는 배큘로바이러스 발현 벡터들을 사용하여 곤충 세포에서 발현될 수 있다. 배양된 곤충 세포들(예를 들어, Sf9 세포들)에서 단백질들의 발현에 사용가능한 배큘로바이러스 벡터들은, 예를 들어 pAc 시리즈(Smith et al., Mol. Cell Biol. (1983) 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈(Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39)를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 명세서에 설명된 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예시들은 pCDM8[Seed, Nature (1987) 329:840] 및 pMT2PC[Kaufman et al., EMBO J. (1987) 6:187-195]를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용되는 경우에, 발현 벡터의 제어 기능들은 바이러스 조절 요소들에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터들은 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된다. 원핵 세포들 및 진핵 세포들 모두에 적합한 다른 발현 시스템들은 Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989의 16장과 17장에 설명된다.
벡터들은 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 세포들 또는 진핵 세포들 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "형질전환" 및 "형질감염"이라는 용어는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침(co-precipitation), DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션(lipofection), 또는 전기천공(electroporation)을 포함하여, 외래 핵산(예를 들어, DNA)을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 본 기술분야에서 인정되는 다양한 기술을 지칭한다. 예를 들어, 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 적합한 방법은 Sambrook et al. (supra)에서 찾아볼 수 있다.
박테리아 세포들의 안정한 형질전환을 위하여, 사용된 발현 벡터 및 형질전환 기술에 따라, 단지 소량(small fraction)의 세포만 발현 벡터를 흡수하고 복제하는 것으로 알려져 있다. 이들 형질전환체들을 확인하고 선택하기 위하여, 선택가능한 마커(예를 들어, 항생제에 대한 내성)를 인코딩하는 유전자가 목적 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 선택가능한 마커들에는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라사이클린과 같은 약물에 내성을 제공하는 것들이 포함된다. 선택가능한 마커를 인코딩하는 핵산은 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터와 동일한 벡터에서 숙주 세포 내로 도입되거나, 별개의 벡터로 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포들은 약물 선택에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 선택가능한 마커 유전자가 통합된 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 사멸한다).
포유동물 세포들의 안정한 형질감염을 위하여, 사용된 발현 벡터 및 형질감염 기술에 따라, 단지 소량의 세포만 외래 DNA를 그들의 게놈 내로 통합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이들 통합체(integrant)들을 확인하고 선택하기 위하여, 선택가능한 마커(예를 들어, 항생제에 대한 내성)를 인코딩하는 유전자가 목적 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직한 선택가능한 마커들에는 G418, 히그로마이신, 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 내성을 제공하는 것들이 포함된다. 선택가능한 마커를 인코딩하는 핵산은 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터와 동일한 벡터에서 숙주 세포 내로 도입되거나, 별개의 벡터로 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선택에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 선택가능 마커 유전자가 통합된 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 사멸한다).
수송 단백질들
수송 단백질은 폴리펩티드들 및 유기 화합물들(예를 들어, 지방족 알데히드들)을 숙주 세포 외부로 내보낼 수 있다. 많은 수송 단백질 및 이출 단백질(efflux protein)은 다양한 화합물들을 방출하는 기능을 하고, 특정 유형의 탄화수소들에 선택적이도록 자연적으로 조작될 수 있다.
적합한 수송 단백질들의 비-제한적 예시들은 ATP-결합 카세트(ABC) 수송 단백질들, 이출 단백질들, 및 지방산 수송체 단백질(FATP)들이다. 적합한 수송 단백질들의 추가적인 비-제한적 예시들은 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans), 애기장대(Arabidopsis thalania), 알칼리제네스 유트로퍼스(Alkaligenes eutrophus), 및 로도코쿠스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)와 같은 생물체로부터의 ABC 수송 단백질을 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 ABC 수송 단백질들은 도 5에 기록된다(예를 들어, CER5, AtMRP5, AmiS2, 및 AtPGP1). 또한, 숙주 세포들은 유기 화합물들을 분비하는 내인적 능력에 대하여 선택될 수 있다. 숙주 세포 환경(예를 들어, 배양 배지, 발효 배양액) 내로 유기 화합물 생산 및 분비의 효율은 세포외 산물에 대한 세포내 산물의 비율로서 표시될 수 있다. 일부 예시에서, 상기 비율은 대략 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 또는 1:5일 수 있다.
발효
지방족 알데히드들의 생산과 분리는 유익한 발효 기술을 이용함으로써 강화될 수 있다. 비용을 줄이면서 생산을 극대화시키는 한 가지 방법은 탄화수소 산물들로 전환되는 탄소 공급원의 비율을 증가시키는 것이다.
정상적인 세포 수명 동안, 탄소는 지질, 당류, 단백질, 유기산, 및 핵산 생산과 같은 세포 기능에 사용된다. 성장-관련 활동에 필요한 탄소 양의 감소는 산물로의 탄소 공급원 전환의 효율을 증가시킬 수 있다. 이는 예를 들어, 먼저 숙주 세포를 원하는 밀도[예를 들어, 성장의 로그기(log phase)의 피크에서 달성되는 밀도]로 성장시킴으로써 달성될 수 있다. 이런 시점에서, 세포의 성장을 중단시키기 위하여 복제 체크포인트(replication checkpoint) 유전자가 동력화(harnessed)될 수 있다. 구체적으로, (Camilli et al., Science 311:1113, 2006; Venturi FEMS Microbio. Rev. 30:274-291, 2006; 및 Reading et al., FEMS Microbiol. Lett. 254:1-11, 2006에서 재조사된) 정족수 감지 기전(quorum sensing mechanism)이 p53, p21와 같은 체크포인트 유전자 또는 다른 체크포인트 유전자를 활성화시키는데 사용될 수 있다.
대장균(E. coli)에서 세포 복제 및 성장을 중단시키기 위하여 활성화될 수 있는 유전자들은 umuDC 유전자를 포함한다. umuDC 유전자들의 과발현은 정지기(stationary phase)에서 지수 성장(exponential growth)으로의 진행을 중단시킨다(Murli et al., J. of Bact. 182:1127, 2000). UmuC는 비-코딩 병소(non-coding lesion)들에서 장애관통 종합(translesion synthesis)- 대부분의 UV와 화학적 돌연변이유발의 기계적 기초를 수행할 수 있는 DNA 중합효소이다. umuDC 유전자 산물들은 장애관통 종합의 과정에 관여하고, 또한 DNA 서열 손상 체크포인트로서 기능한다. umuDC 유전자 산물들은 UmuC, UmuD, umuD', UmuD'2C, UmuD'2, 및 UmuD2를 포함한다. 지방족 알데히드가 만들어지는 동안, 산물-생산 유전자들이 동시에 활성화될 수 있으며, 따라서 복제 및 유지 경로들이 사용되는 필요성을 최소화시킨다. 또한, 숙주 세포들은 적절한 최종-산물 생산 유전자들로 상기 유전자의 de novo 합성을 통해 prpBCDE 프로모터 시스템 하에 pBAD24에서 대장균(E. coli)으로부터 umuC 및 umuD를 발현하도록 공학처리될 수 있다.
지방족 알데히드들로 전환되는 입력 탄소들의 비율은 원가 동인(cost driver)일 수 있다. 이러한 과정이 더욱 효율적일수록(즉, 지방족 알데히드들로 전환되는 입력 탄소의 비율이 높을수록), 상기 과정은 더욱 적은 비용이 소요될 것이다. 산소-함유 탄소 공급원들(예를 들어, 글루코오스 및 기타 탄수화물 기반 공급원)의 경우에, 산소는 이산화탄소의 형태로 방출될 것이다. 방출되는 2개의 산소 원자들마다, (지방산 유래된 산물의 경우) 탄소 원자 또한 방출되고 대략34 %(w/w)의 최대 이론적 물질대사 효율에 이른다. 그러나, 이러한 수치는 다른 유기 화합물들 및 탄소 공급원들의 경우에 변한다. 문헌에서 전형적인 효율은 대략 5 % 미만이다. 지방족 알데히드들을 생산하도록 공학처리된 숙주 세포들은 대략 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 및 30 % 초과의 효율을 가질 수 있다. 일 예시에서, 숙주 세포들은 대략 10 % 내지 대략 25 %의 효율을 나타낼 수 있다. 다른 예시에서, 이런 숙주 세포들은 대략 25 % 내지 대략 30 %의 효율을 나타낼 수 있다. 다른 예시에서, 숙주 세포들은 30 % 초과의 효율을 나타낼 수 있다.
숙주 세포는 PCT 출원 번호 PCT/US2007/003736에서 기술된 것들과 같이 재조합 셀룰로좀(cellulosomes)을 발현하도록 추가적으로 공학처리될 수 있다. 이들 셀룰로좀은 숙주 세포가 세포 물질을 탄소 공급원으로서 사용할 수 있도록 할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 전환효소(invertase)[EC 3.2.1.26]를 발현하도록 추가적으로 공학처리되어, 수크로오스가 탄소 공급원으로서 사용될 수 있도록 할 수 있다. 유사하게, 숙주 세포가 U.S. Patent No. 5,000,000; 5,028,539; 5,424,202; 5,482,846; 및 5,602,030에 설명된 교시를 사용하여 공학처리되어, 탄소를 효율적으로 동화시키고 세포 물질을 탄소원들로서 사용할 수 있도록 할 수 있다.
일 예시에서, 발효 챔버는 연속 환원을 겪는 발효액(fermentation)을 집어넣을 수 있다. 이러한 경우에, 안정한 환원 환경이 생성될 수 있다. 전자 균형(electron balance)은 이산화탄소의 (가스 형태로의) 방출에 의해 유지될 수 있다. 또한, NAD/H 및 NADP/H 균형을 증가시키는 노력은 전자 균형의 안정화를 촉진할 수 있다. 또한, 세포내 NADPH의 사용가능성은 NADH:NADPH 수소전달효소(transhydrogenase)를 발현하도록 숙주 세포를 공학처리함으로써 강화될 수 있다. 하나 이상의 NADH:NADPH 수소전달효소의 발현은 해당과정(glycolysis)에 의해 생산된 NADH를 NADPH로 전환시키며, 이는 지방족 알데히드의 생산을 강화시킬 수 있다.
소규모 생산의 경우에, 공학처리된 숙주 세포들은 예를 들어, 대략 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L, 5 L, 또는 10 L의 배치(batch)에서 성장될 수 있고; 발효될 수 있으며; 적절한 플라스미드에서 인코딩된 특정 유전자들을 기반으로 원하는 지방족 알데히드 생합성 유전자들을 발현하도록 유도될 수 있다. 대규모 생산의 경우에, 공학처리된 숙주 세포들은 10 L, 100 L, 1000 L, 10,000 L, 100,000 L, 1,000,000 L 또는 그 이상의 배치(batch)에서 성장될 수 있고; 발효될 수 있으며; 적절한 플라스미드들에서 인코딩된 특정 유전자들을 기반으로 하거나, 숙주 세포의 게놈 내로 도입되는 원하는 지방족 알데히드 생합성 유전자들을 발현하도록 유도될 수 있다.
예를 들어, 원하는 지방족 알데히드 생합성 유전자들을 함유하는 플라스미드들 또는 이의 염색체에 통합되는 지방족 알데히드 생합성 유전자들을 갖는 플라스미드들을 포함하는, 대장균(E. coli)과 같은 적합한 숙주 세포(production host)는 2 % 글루코오스, 카르베니실린, 및 클로람페니콜로 보충된 M9 배지 내에서 37 ℃에서 20시간 동안 적합한 반응기, 예를 들어 1 L 반응기에서 배양될 수 있다. 배양의 OD600이 0.9에 도달한 경우에, 숙주 세포는 지방족 알데히드 생산을 위하여 공학처리된 유전자 시스템을 활성화하도록 IPTG로 유도될 수 있다. 배양 후, 사용된 배지는 빼낼 수 있으며, 유기상(organic phase)은 GC-MS를 사용하여 지방족 알데히드에 대하여 검사될 수 있다.
일부 예시에서, 첫 1시간의 유도 후, 전체 세포 용적의 단지 대략 10%의 분액(aliquot)이 1시간마다 제거될 수 있고, 지방족 알데히드가 표면으로 상승하여 자발적 상 분리(spontaneous phase separation) 또는 침전이 진행되도록 교반 없이 방치(sit)될 수 있다. 이후에, 지방족 알데히드 구성성분은 수집될 수 있고, 수성 상은 반응 챔버로 환원(return)되었다. 반응 챔버는 연속적으로 가동될 수 있다. OD600이 0.6 미만으로 하락하는 경우에, 세포는 접종 배양액으로부터 성장된 새로운 배치로 교체될 수 있다.
무-세포 방법(Cell-free Method)들을 사용한 지방족 알데히드들의 생산
본 명세서에 설명된 일부 방법에서, 지방족 알데히드는 본 명세서에 설명되는 정제된 폴리펩티드 및 본 명세서에 설명된 기질을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 본 명세서에 설명된 바와 같은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드 또는 변이체를 발현하도록 공학처리될 수 있다. 숙주 세포는 폴리펩티드의 발현을 하는데 적합한 조건 하에 배양될 수 있다. 이후에, 무세포 추출액(cell free extract)들은 공지된 방법을 사용하여 산출될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포들은 세제를 사용하거나 초음파처리에 의해 용해될 수 있다. 발현되는 폴리펩티드들은 공지된 방법들을 사용하여 정제될 수 있다. 무세포 추출액들을 얻은 후, 본 명세서에 설명된 기질들은 상기 무세포 추출액들에 첨가되고, 기질들을 지방족 알데히드들로의 전환을 가능하게 하는 조건 하에 유지될 수 있다. 이후에, 지방족 알데히드들은 공지된 기술을 사용하여 분리되고 정제될 수 있다.
생산-후 처리
발효 동안 생산된 지방족 알데히드들은 발효 배지로부터 분리될 수 있다. 수성 배지로부터 지방족 알데히드들을 분리하기 위한 여하한 공지된 기술이 사용될 수 있다. 일 예시적인 분리 공정은 두 가지 상(이중-상) 분리 공정이다. 이러한 공정은 지방족 알데히드를 생산할 만큼 충분한 조건들 하에 유전공학처리된 숙주 세포를 발효시키는 단계, 상기 지방족 알데히드가 유기 상에 모이도록 하는 단계, 및 수성 발효 배양액으로부터 상기 유기 상을 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 배치(batch) 및 연속 발효 공정(continuous fermentation process)들 모두에서 실시될 수 있다.
이중-상 분리는 분리를 촉진하기 위하여 지방족 알데히드의 상대적 비혼화성(relative immiscibility)을 사용한다. 비혼화성(immiscible)은 물에서 용해되는 화합물의 상대적인 불능을 지칭하고, 상기 화합물의 분배 계수에 의해 정의된다. 생산되는 지방족 알데히드가 높은 logP 값을 갖도록 발효 배양액 및 유기상을 선택함으로써, 상기 지방족 알데히드가 발효 용기 내에서 매우 낮은 농도에서도 유기상 내로 분리할 수 있다는 것을 본 기술분야의 전문가는 인지할 것이다.
본 명세서에 설명된 방법에 의해 생산되는 지방족 알데히드는 세포질에서뿐만 아니라 발효 배양액에서 상대적으로 비혼화성일 수 있다. 그러므로, 지방족 알데히드는 세포내에서 또는 세포외에서 유기 상에 모아질 수 있다. 유기 상에서 산물의 수집은 세포 기능에 대한 지방족 알데히드의 영향을 감소시킬 수 있고, 숙주 세포가 더욱 많은 산물을 생산할 수 있도록 할 수 있다.
본 명세서에 설명된 방법들은 균질성 화합물들을 생산할 수 있고, 여기서 생산되는 지방족 알데히드의 대략 60 %, 70 %, 80%, 90 %, 또는 95 % 이상이 대략 6개 미만의 탄소, 대략 4개 미만의 탄소, 또는 대략 2개 미만의 탄소에 의해 변화하는 탄소 사슬 길이를 가질 것이다. 또한, 이들 화합물들은 상대적으로 균일한 포화도로 생산될 수 있다. 이들 화합물들은 다른 화학 화합물(예를 들어, 중합체, 계면활성제, 플라스틱, 직물, 용매, 첨가제 등)들의 생산을 위한 연료들, 연료 첨가제들, 출발 물질들, 또는 개인 관리 제품 첨가제들로서 직접적으로 사용될 수 있다. 또한, 이들 화합물들은 다른 산물들을 만들기 위한 후속 반응(subsequent reaction), 예를 들면 수소첨가, [예를 들어, 수소첨가, 열분해(pyrolisis), 또는 둘 모두를 통한] 촉매 분해(catatalytic cracking)를 위한 공급원료로서 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법들을 사용하여 생산되는 지방족 알데히드들은 대략 50 % 내지 대략 90 % 탄소; 또는 대략 5 % 내지 대략 25 % 수소를 함유할 수 있다. 다른 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법들을 사용하여 생산되는 지방족 알데히드들은 대략 65 % 내지 대략 85 % 탄소; 또는 대략 10 % 내지 대략 15 % 수소를 함유할 수 있다.
바이오생산물(Bioproduct)들
지방산 생합성 경로를 사용하여 생물학적으로 생산되는 유기 화합물들, 특히 생물학적으로 생산되는 지방족 알데히드들을 포함하는 바이오생산물들(예를 들어, 지방족 알데히드들)은 재생가능한 공급원으로부터 생산되지 않으며, 이로써, 물질의 새로운 조성물이다. 이러한 새로운 바이오생산물들은 이중 탄소-동위원소 지문기술(dual carbon-isotopic fingerprinting) 또는 14C 연대측정(dating)을 기초로 석유화학의 탄소로부터 유래된 유기 화합물로부터 구별될 수 있다. 부가적으로, 생물자원 탄소(biosourced carbon)의 특이적인 공급원(예를 들어, 글루코오스 대 글리세롤)은 이중 탄소-동위원소 지문기술에 의해 결정될 수 있다(본 명세서에서 참고문헌으로 병합된, U.S. Patent No. 7,169,588 참조).
유기 화합물들을 기반으로 하는 석유로부터 바이오생산물들을 구별하는 능력은 거래 중에(in commerce) 이들 물질을 추적하는데 유익하다. 예를 들어, 생물학적으로 기반된 탄소 동위원소 프로필들 및 석유로 기반된 탄소 동위원소 프로필들 모두를 포함하는 유기 화합물들 또는 화학제품들은 석유 기반된 물질들로만 만들어진 유기 화합물들 및 화학제품들로부터 구별될 수 있다. 따라서, 인스턴트 재료(instant material)들은 그들의 독특한 탄소 동위원소 프로필을 기반으로 하여 바이오연료로서 거래 중에 후속될 수 있다.
바이오생산물들은 각각의 연료에서 안정한 탄소 동위원소 비율(13C/12C)을 비교함으로써 유기 화합물을 기반으로 하는 석유로부터 구별될 수 있다. 주어진 바이오생산물에서 13C/12C 비율은 이산화탄소가 고정된 시간에서 대기 중의 이산화탄소에 대한 13C/12C 비율의 결과이다. 또한, 이는 정확한 대사작용 경로를 반영한다. 국부적인 변이들도 발생한다. 석유, C3 식물[활엽(the broadleaf)], C4 식물[목초(the grasses)], 및 해양의 탄산염(marine carbonate) 모두는 13C/12C 및 대응하는 δ13C 수치에서 상당한 차이를 나타낸다. 더욱이, C3 및 C4 식물의 지질 물질은 대사작용 경로의 결과로서 동일한 식물의 탄수화물 구성요소로부터 유래된 재료에 비하여 다르게 분석한다.
측정의 정확도 내에서, 13C은 동위원소 분별 효과로 인하여 큰 변화를 나타내며, 바이오생성물들에 대한 이의 가장 중요한 점은 광합성 기전이다. 식물들에서 탄소 동위원소 비율에 있어서 차이들의 주요한 원인은 식물에서 광합성 탄소 대사작용의 경로, 특히 1차 카르복실화(primary carboxylation)[즉, 대기 중 CO2의 초기 고정] 동안 발생하는 반응에 있어서의 차이와 밀접하게 관련된다. 식생(vegetation)의 많은 종류는 "C3"[또는 캘빈-벤슨(Calvin-Benson)] 생합성 회로를 병합하는 것들 및 "C4"[또는 해치-슬랙(Hatch-Slack)] 생합성 회로를 병합하는 것들이다.
C3 식물들에서, 1차 CO2 고정 또는 카르복실화 반응은 효소 리불로오스-1,5-디포스페이트 카르복실화효소를 포함하고, 첫 번째의 안정한 산물은 3-탄소 화합물이다. 경목(hardwood) 및 침엽수(conifer)와 같은 C3 식물은 온대 기후 지역에서 우세하다.
C4 식물들에서, 또 다른 효소인 포스포엔올-피루베이트 카르복실화효소를 포함하는 부가적인 카르복실화 반응은 1차 카르복실화 반응이다. 첫 번째의 안정한 탄소 화합물은 이후에 탈카르복실화되는 4-탄소산(carbon acid)이다. 따라서, 방출된 CO2는 C3 회로에 의해 재고정된다. C4 식물의 예시들은 열대형 목초(tropical grass), 옥수수, 및 사탕수수이다.
C4 식물 및 C3 식물 모두는 13C/12C 의 범위를 나타내나, 전형적인 수치는 C4 식물들에 대하여 mil 당 대략 -7 내지 대략 -13이며, C3 식물들에 대하여 mil 당 대략 -19 내지 대략 -27이다(예를 들어, Stuiver et al, Radiocarbon 19:355, 1977 참조). 석탄 및 석유는 일반적으로 이의 후자 범위에서 떨어져 있다. 13C 측정 전도는 본래 Pee Dee Belemnite(PDB) 석회암에 의해 제로 세트(zero set)로 정의되며, 여기서 수치는 이러한 재료로부터 천 분의 일 편차로 주어진다. "δ13C" 수치는 천 분의 일[퍼밀(per mil)], 약어로는 ‰로 표현되고, 하기와 같이 계산된다:
Figure 112017024455945-pat00007
PDB 표준 물질(RM)이 고갈되고 있으므로, 일련의 대안적인 RM이 IAEA, USGS, NIST, 및 여타의 선택된 국제 동위원소 실험실들과 협력하여 개발되고 있다. PDB로부터 퍼밀(per mil) 편차들에 대한 표기는 δ13C이다. 측정들은 질량 44, 45, 및 46의 분자 이온들에 대한 매우 정확한 신뢰성 있는 비율의 질량 분석기[high precision stable ratio mass spectrometry](IRMS)에 의해 CO2로 이뤄진다.
본 명세서에 설명된 조성물들은 본 명세서에 설명된 여하한 방법들에 의해 생산되는 바이오생성물들을 포함한다. 특히, 바이오생성물은 대략 -28 이상, 대략 -27 이상, -20 이상, -18 이상, -15 이상, -13 이상, -10 이상, 또는 -8 이상의 δ13C를 가질 수 있다. 예를 들어, 바이오생성물은 대략 -30 내지 대략 -15, 대략 -27 내지 대략 -19, 대략 -25 내지 대략 -21, 대략 -15 내지 대략 -5, 대략 -13 내지 대략 -7, 또는 대략 -13 내지 대략 -10의 δ13C를 가질 수 있다. 다른 예시에서, 바이오생성물은 대략 -10, -11, -12, 또는 -12.3의 δ13C를 가질 수 있다.
또한, 바이오생성물들은 각각의 화합물에서 14C의 양을 비교함으로써 유기 화합물을 기반으로 하는 석유로부터 구별될 수 있다. 14C는 핵의 반감기가 5730년이므로, "더 오래된(older)" 탄소를 함유하는 석유를 기반으로 하는 연료는 "최근의(newer)" 탄소를 함유하는 바이오생성물로부터 구별될 수 있다[예를 들어, "Source Apportionment of Atmospheric Particles", Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series(Lewis Publishers, Inc)(1992) 3-74 참조].
방사성 탄소 연대측정법(radiocarbon dating)에서 기본적인 가정은 대기 중에 14C 농도의 항상성(constancy)이 생물(living organism) 내에 14C 농도의 항상성에 이르게 한다는 것이다. 그러나, 1950년 이후부터의 대기권의 핵실험 및 1850년 이후부터의 화석 연료의 연소로 인하여, 14C는 제 2의, 지구화학적인 시간 특성을 얻었다. 대기 중 CO2, 및 그에 따른 생물권(living biosphere)에 있어서 이의 농도는 1960년대 중반의 핵실험의 정점(peak)에 대략 두 배였다. 이후에, 대략 7 내지 10년의 "반-감기" 이완(relaxation "half-life")을 갖는, 대략 1.2×10-12의 정상-상태의 우주기원(대기) 기준 동위원소 비율(14C/12C)로 서서히 되돌아 온다[이런 후자의 반감기는 문자 그대로 취해지는 것이 아니라; 오히려 핵무기 시대(nuclear age)의 시작 이후로 대기 및 생물권 중에 14C의 변화를 추적하는 자세한 대기권 핵 투입/붕괴의 기능(atmospheric nuclear input/decay function)을 사용해야 한다].
이는 최근의 생물권 탄소에 대한 매년의 연대측정(annual dating)의 전망을 제공하는 후자의 생물권 14C 시간 특성이다. 14C는 "현대 탄소의 분율"(fM)의 단위로 주어지는 결과를 갖는, 탄소 가속기 질량 분광 분석(accelerator mass spectrometry: AMS)에 의해 측정될 수 있다. fM은 미국표준기술연구소(NIST)의 표준 기준 물질들(SRMs) 4990B 및 4990C에 의해 정의된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "현대 탄소의 분율" 또는 "fM"은 각각 옥살산 기준 HOxI 및 HOxII로 알려진, 미국표준기술연구소(NIST)의 표준 기준 물질들(SRMs) 4990B 및 4990C에 의해 정의되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 기초적인 정의는 (AD 1950을 기준으로) 0.95배의 14C/12C 동위원소 비율 HOxI에 관한 것이다. 이는 감소-수정된(decay- corrected) 산업 혁명 이전의 목재와 거의 동등하다. 현재의 생물권(식물 재료)에 대한, fM은 대략 1.1이다.
본 발명은 대략 1 이상의 fM 14C를 가질 수 있는 바이오생성물을 제공한다. 예를 들어, 상기 바이오생성물은 대략 1.01 이상의 fM 14C, 대략 1 내지 1.5의 fM 14C, 대략 1.04 내지 대략 1.18의 fM 14C, 또는 대략 1.111 내지 대략 1.124의 fM 14C을 가질 수 있다.
14C의 또 다른 측정은 현대 탄소의 퍼센트, pMC로 알려져 있다. 14C 연대를 사용하는 고고학자 또는 지질학자에 경우, AD 1950년은 "측정의 기점 연도(zero years old)"와 같다. 또한, 이는 100 pMC로 나타낸다. 대기 중의 "핵무기 탄소(Bomb carbon)"는 열-핵무기의 정점인 1963년에 정상 수준에 거의 두 배에 달하였다. 대기권 내에서 이의 분포는, 핵무기 탄소의 등장 이후에, AD 1950년 이후로 살아 있는 식물 및 동물에 대한 100 pMC보다 더 큰 수치를 나타내는 것으로 추정되고 있다. 107.5 pMC에 가까운 오늘날의 수치는 시간이 지나면서 점차 감소하고 있다. 이는 옥수수와 같은 신선한 바이오매스 재료는 107.5 pMC에 가까운 14C 특징(signature)을 부여하는 것을 의미한다. 석유 기반 화합물은 0의 pMC 수치를 가질 것이다. 현대 탄소와 화석 탄소의 결합은 현대 pMC 함유량(content)의 희석을 야기할 것이다. 107.5 pMC가 현대 바이오매스 재료의 14C 함유량을 나타내며 0 pMC가 석유 기반 산물의 14C 함유량을 나타낸다고 가정함으로써, 재료에 대한 측정된 pMC 수치는 두 개의 구성성분 유형의 비율을 반영할 것이다. 예를 들어, 오늘날의 콩으로부터 100 % 유래된 재료는 107.5 pMC에 가까운 방사성 탄소 특징을 제공할 것이다. 만약 상기 재료가 석유 기반 산물로 50 % 희석된다면, 이는 대략 54 pMC의 방사성 탄소 특징을 제공할 것이다.
생물학적으로 기반한 탄소 함유량은 107.5 pMC와 같으면 "100 %"이고, 0 pMC와 같으면 "0 %"라고 지정함으로써 유래한다. 예를 들어, 99 pMC로 측정된 샘플은 93 %의 동등한 생물학적으로 기반한 탄소 함유량을 제공할 것이다. 이 수치는 생물학적으로 기반한 탄소 결과를 의미하며, 현대의 생물학적 재료 또는 석유 기반 재료로부터 유래되는 분석된 재료 내에서 모든 구성성분을 추측하는 것으로 해석된다.
본 명세서에서 설명된 바이오생성물은 대략 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 이상의 pMC를 가질 수 있다. 다른 예시에서, 본 명세서에서 설명된 바이오생성물은 대략 50 내지 대략 100; 대략 60 내지 대략 100; 대략 70 내지 대략 100; 대략 80 내지 대략 100; 대략 85 내지 대략 100; 대략 87 내지 대략 98; 또는 대략 90 내지 대략 95의 pMC를 가질 수 있다. 또 다른 예시에서, 본 명세서에서 설명된 바이오 생성물은 대략 90, 91, 92, 93, 94, 또는 94.2의 pMC를 가질 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예들로 더 설명된다. 실시예들은 도시의 목적으로만 제공된다. 이들은 임의의 방법으로 본 발명의 범위 또는 내용을 제한하려고 구성되는 것이 아니다.
도 1은 지방족 알데히드 생산에 대한 새로운 경로의 개략적인 도면이다.
도 2는 노카르디아 속(Nocardia sp.) NRRL 5646 car 유전자의 대응하는 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열의 목록이다.
도 3은 CAR 동족체들(homologs)에 대한 아미노산 서열 모티프들의 목록이다.
도 4는 car 동족체 유전자들의 아미노산 서열들 및 뉴클레오티드 서열들의 목록이다.
도 5는 특정 기질들의 생산을 증가시키도록 발현되거나, 과발현되거나, 또는 감쇠될 수 있는 예시적인 유전자들을 확인하는 표이다.
도 6은 fabA 관련된 유전자들에 대한 아미노산 서열들 및 뉴클레오티드 서열들의 표이다.
도 7은 fabB 관련된 유전자들에 대한 아미노산 서열들 및 뉴클레오티드 서열들의 표이다.
실시예들
실시예 1
카르복시산 환원효소(CAR) 동족체들의 확인
노카르디아 속(Nocardia sp.) 균주 NRRL 5646로부터 카르복시산 환원효소(CAR)은 카르복시산을 아실-CoA 생성효소와 같은 별개의 활성화 효소 없이 대응하는 알데히드로 환원할 수 있다(Li et al., J. Bacteriol. 179:3482-3487, 1997; He et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:1874-1881, 2004). 쿼리 서열(query sequence)로서 NRRL 5646 CAR 아미노산 서열(Genpept 수탁 AAR91681)[SEQ ID NO: 16]을 사용하는 BLAST 검색은 대략 20개의 상동성 서열을 확인하였다. 표 7에 기록된 세 개의 동족체들은 대장균(E. coli)에서 발현되는 경우에 생체 내에서 지방산을 지방족 알데히드로 전환하는 이들의 능력에 대해 평가된다. 뉴클레오티드 서열 수준에서, carA(SEQ ID NO: 19), carB(SEQ ID NO: 21), 및 fadD9(SEQ ID NO: 17)는 노카르디아 속(Nocardia sp.) NRRL 5646(SEQ ID NO: 15)의 car 유전자(AY495697)에 대하여 각각 62.6 %, 49.4 %, 및 60.5 %의 상동성을 증명하였다. 아미노산 수준에서, CARA(SEQ ID NO: 20), CARB(SEQ ID NO: 22), 및 FadD9(SEQ ID NO: 18)는 노카르디아 속(Nocardia sp.) NRRL 5646(SEQ ID NO: 16)에 대하여 각각 62.4 %, 59.1 % 및 60.7 %의 동일성을 증명하였다.
표 7: CAR-형 단백질 및 대응하는 코딩 서열(coding sequence)들.
Figure 112017024455945-pat00008
실시예 2
대장균( E. coli )에서 CAR 동족체들의 발현
A. 플라스미드 구성(Construction)
세 개의 대장균(E. coli) 발현 플라스미드들은 표 7에 기록된 CAR 동족체를 인코딩하는 유전자를 발현하도록 구성되었다. 첫 번째로, fadD9는 프라이머들 fadD9F 및 FadDR(표 8 참조)를 사용하여 (The University of British Columbia, 및 Vancouver, BC Canada로부터 얻어진) 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv의 게놈의 DNA로부터 증폭되었다. PCR 산물들은 먼저 PCR-블런트(blunt)[인비트로젠(Invitrogen)] 내에서 클로닝되었고, 이후에 NdeI-AvrII 단편으로 방출되었다. 상기 NdeI-AvrII 단편은 pACYCDuet-l-fadD9를 발생시키기 위하여 pACYCDuet-1[노보젠(Novogen)]의 NdeI 및 AvrII 부위 사이에서 클로닝되었다.
carA 및 carB 유전자는 각각의 프라이머들 CARMCaF 및 CARMCaR 또는 CARMCbF 및 CARMCbR(표 8 참조)을 사용하여 [ATCC (ATCC 23037D-5)로부터 얻어진] 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) MC2 155의 게놈의 DNA로부터 증폭되었다. 각각의 PCR 산물은 먼저 PCR-블런트(blunt) 내에서 클로닝되었고, 이후에 NdeI-AvrII 단편으로 방출되었다. 이후에, 각각의 두 개의 단편들은 pACYCDUET-carA 및 pACYCDUET-carB를 발생기키기 위하여 pACYCDuet-1[노보젠(Novogen)]의 NdeI 및 AvrII 부위 사이에서 클로닝되었다.
표 8. CAR 동족체들을 인코딩하는 유전자들을 증폭시키기 위하여 사용되는 프라이머들
Figure 112017024455945-pat00009
B. 지방족 알데히드 생산의 평가
CAR 동족체들(pACYCDUET-fadD9, pACYCDUET-carA, 및 pACYCDUET-carB)을 인코딩하는 플라스미드들은 (PCT/US08/058788에 설명된) pETDuet-l-'tesA와 함께 (PCT/US08/058788에 설명된) 대장균(E. coli) 균주 C41(DE3, ΔfadE) 내로 따로따로 동시-형질전환되었다.
대장균(E. coli) 형질전환체들은 37 ℃에서 카르베니실린(100 mg/L) 및 클로람페니콜(34 mg/L)로 보충된 3 mL의 LB 배지에서 성장되었다. 하룻밤 동안 성장한 후에, 15 ㎕의 배양물(culture)은 카르베니실린 및 클로람페니콜로 충전된 2 mL의 새로운 LB 배지로 옮겨졌다. 3.5시간 동안 성장한 후에, 2 mL의 배양물(culture)은 2 %의 글루코오스, 카르베니실린 및 클로람페니콜을 갖는 20 mL의 M9 배지를 함유하는 125 mL 플라스크 내로 옮겨졌다. 배양물(culture)의 OD600이 0.9에 도달하면, 1 mM의 IPTG가 각각의 플라스크에 첨가되었다. 37 ℃에서 20시간 동안 성장한 후에, 20 mL의 에틸 아세테이트(1 %의 아세트산을 포함, v/v)가 발효 동안 생산되는 유기 화합물들을 추출하기 위하여 각각의 플라스크에 첨가되었다. 미정제 에틸 아세테이트 추출물은 하기에 설명되는 바와 같이 즉시 GC/MS 분석되었다.
선도 서열이 없는(leaderless) 'tesA 및 대장균(E. coli)에 있어서 여하한 3 개의 car 유전자들의 동시-발현은 검출가능한 지방족 알데히드 생산을 야기하였다. 일 발효에서, LS9001/pACYCDUET carB+ pETDuet-1-'tesA는 평균 120 mg/L의 지방족 알데히드를 생산하였다. 머무름 시간(retention time)은 도데카날에 대하여 6.959분, 7-테트라데세날에 대하여 8.247분, 테트라데카날에 대하여 8.37, 9-헥사데세날에 대하여 9.433분, 헥사데카날에 대하여 9.545, 및 11-옥타데세날에 대하여 10.945분이었다. 많은 양의 지방족 알데히드의 존재는 알데히드를-발생하는 지방산 환원효소(AFAR)인 CAR과 일치한다. 이 기전은, 예를 들어 JjFAR과 같은 알코올을-발생하는 지방산 아실-CoA 환원효소(FAR : fatty acyl-CoA reductase) 및 Acr1와 같은 지방산 아실-CoA 환원효소와 상이하다.
C. CAR 동족체들의 지질 적합성(Substrate Preference)
별개의 기질 적합성들은 평가되는 세 개의 CAR 동족체들의 사이에서 관찰되었다. FadD9는 12보다 더 긴 탄소 사슬 길이를 갖는 다른 지방산에 비하여 C12 지방산들에 대한 강한 적합성을 나타내었다. CarA 및 CarB 모두는 FadD9 보다 더 넓은 기질 범위를 증명하였다.
D. 지방족 알데히드들의 정량화(quantification) 및 확인
GC-MS는 30 m×0.25 mm(0.1O㎛ 막) DB-5 컬럼을 갖춘 애질런트(Agilent) 5975B MSD 시스템을 사용하여 수행되었다. 컬럼 온도는 100 ℃에서 3분간 유지(isothermal) 되었다. 상기 컬럼은 20 ℃/분의 속도로 100 ℃ 내지 320 ℃까지 올라가도록 프로그램되었다. 최종 온도에 도달하게 되면, 상기 컬럼은 320 ℃에서 5분간 유지(isothermal)되었다. 주입 부피는 1 ㎕이었다. 운반 기체인 헬륨은 1.3 mL/분으로 방출되었다. 질량 분석기는 전자 충격 이온화 소스(electron impact ionization source)를 갖추었다. 이온화 소스 온도는 300 ℃로 설정되었다.
정량화 이전에, 다양한 알데히드들이 두 가지 방법을 사용하여 확인되었다. 첫 번째로, 각각의 화합물의 GC 머무름 시간이 라우릴알데히드 (도데카날)과 같은 알려진 기준물질(standard)의 머무름 시간과 비교되었다. 두 번째로, 각각의 화합물의 확인은 질량 스펙트럼 라이브러리에 기준물질의 질량 스펙트럼과 상기 화합물의 질량 스펙트럼을 비교함으로써 확인되었다.
다른 실시예들
본 발명은 이의 상세한 설명과 결합하여 설명되고, 상기의 설명은 본 발명의 범위를 제한하는 않으며, 도시하는 것으로 의도되고, 이는 첨부한 청구항의 범위에 의해 정의된다. 여타의 견해들, 이점들, 및 수정은 하기의 청구항들의 범위 내에 있다.

Claims (13)

  1. 유전공학처리(genetically engineered)된 미생물로써,
    (i) 카르복시산 환원 효소(reductase) 활성을 갖고, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 20, 및 SEQ ID NO: 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 그리고
    (ii) EC 3.1.2.14 또는 EC 3.1.1.5의 티오에스테라아제(thioesterase) 활성을 갖는 폴리펩티드
    가 과발현(overexpress)되도록 유전공학처리된 미생물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 미생물은 지방족 알데히드를 생성하는 미생물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 미생물은 감쇠된(attenuated) EC 1.3.99.3 또는 EC 1.3.99.-의 FadE 아실-CoA 탈수소 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 추가로 조작된 미생물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 미생물은 결실 또는 감소된 EC 1.3.99.-의 YdiO 아실-CoA 탈수소 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 추가로 조작된 미생물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 미생물은 결실 또는 감소된 EC 2.3.1.16의 FadA 3-케토아실-CoA 티올라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 추가로 조작된 미생물.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 미생물은 결실 또는 감소된 EC 4.2.1.17, EC 5.1.2.3, EC 5.3.3.8, 또는 EC 1.1.1.35의 FadB 케토아실-ACP 합성 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 추가로 조작된 미생물.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 미생물은 결실 또는 감소된 EC 2.3.1.16의 FadI 베타-케토아실-CoA 티올라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 추가로 조작된 미생물.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 미생물은 결실 또는 감소된 EC 5.1.2.3, EC 4.2.1.17 또는 EC 1.1.1.35의 FadJ 에피머라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 추가로 조작된 미생물.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 미생물은 곰팡이 세포, 효모 세포 및 박테리아 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)세포 인 미생물.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 카르복시산 환원 효소는 CarB, CarA 또는 FadD9 인 미생물.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 티오에스테라아제는 fatA1, fatA, fatB3, fatB2, fatB, tesB, 선도 서열 없는 tesA, 및 tesA로 구성된 군에서 선택되는 유전자로 인코딩되는 미생물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 티오에스테라아제 유전자는 선도 서열 없이 tesA로 인코딩되는 미생물.

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