CN103282473A - 具有降低倾点的微生物油、从其中产生的介电流体、以及相关方法 - Google Patents

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Abstract

在此提供了用于从微生物(包括含油微生物)产生的脂质中生产介电流体的方法和组合物、以及低成本培养这样的微生物的方法。含有外源基因的微藻细胞在制造介电流体中是有用的，其中外源基因例如编码蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶、多糖降解酶、脂质途径修饰酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、去饱和酶、脂肪酰基辅酶A/醛还原酶、和/或酰基载体蛋白。

Description

具有降低倾点的微生物油、从其中产生的介电流体、以及相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年10月13日提交的在先美国临时申请号61/546.932；2011年8月10日提交的在先美国临时申请号61/522,231；2011年2月2日提交的在先美国临时申请号61/438,966；2010年11月3日提交的在先美国临时申请号61/409,902的权益，所述文献特此通过引用以其全文结合。
序列表的引用
本申请包括随其所附的如在第1-44页中所显示的序列表。
发明领域
本发明涉及从微生物中产生油和用于加工这些油以改善其倾点的方法，以及源自它们的产品，包括食用油和包含这类油的食品以及工业产品如润滑剂和介电流体。本发明的实施方案因此涉及以下领域：化学尤其是油脂化学、食用油及其生产和用途、润滑剂及其生产、介电流体、原料及其生产、微生物学和分子生物学。
背景
化石燃料是用于有机物质的埋藏的可燃地质沉积物的一般术语，其从腐败的植物和动物形成，这些有机物质已经通过在地壳中暴露于热和压力经过数百万年而转化成原油、煤炭、天然气或重油。化石燃料是有限的不可再生资源。
许多工业，包括塑料和化学品制造商，严重依赖于作为其生产工艺原料的烃的可获得性。
PCT公开号2008/151149描述了用于培养生产油的微藻、提取微生物油以及从产油微生物所产生的油来生产食品、食用油、燃料、及其他油脂化学品的方法和材料。
一种重要的油脂化学应用是生产工业介电流体，用于变压器和其他电气装置中的电绝缘和冷却或散热。这些电气装置包括电力变压器和配电变压器、电路断路器、电容器、开关设备、X光机和绝缘电缆。
自二十世纪九十年代以来，已经使用生物基油，尤其高油酸大豆油，作为密封变压器中的介电流体(参见Srivastava(2009)Int’l J Computer Electrical Eng，v.1(2)第212-216页)。目前生物基介电流体是纯化的高油酸三酰甘油(TAG)，具有掺入的添加剂(参见美国专利号6,274,067和美国专利申请号20100243969和20080283803)。例如，高油酸大豆油介电流体相对于矿物油基介电流体的主要益处是(i)燃点增加(2x)、(ii)变压器寿命增加(4-8x)、和(iii)因生物基油的生物可降解性高而致修复泄漏的成本较低(＞3x)及毒性较低(参见Schneider(2006)J Sci Food Agric，v.86第1769-1780页)。
生物基油相对于矿物基油的主要缺点是，生物基油的氧化不稳定性、获得生物基油以及从矿物基油到生物基油的转换设备的成本增加(参见Schneider(2006)，上文)。虽然生物基介电流体占据介电流体市场的重要部分，矿物油基介电流体目前在市场上占优势。另一个重大缺点是生产这些大豆基油以及将它们从重要食物来源转换成非食品应用的成本。
概述
在某些实施方案中，本发明提供了具有改进倾点的微生物油、用于制造这种油的方法、以及源自它们的产品。倾点是甘油三酯油的饱和脂肪酸对不饱和脂肪酸的相对浓度和脂肪酸的链长的函数。在本发明方法的实施方案中，通过减少饱和馏分(包括称作硬脂馏分的棕榈酸甘油三酯和硬脂酸甘油三酯)的相对比例降低微生物油的初始倾点。根据这些方法，将油分提以降低油的饱和甘油三酯浓度。这可以根据本发明的实施方案通过干法分提(一种用于进行“冬化”的说明性方法)来完成。在这种方法的一个实施方案中，将微生物油(例如，藻油)任选地首先精炼、漂白、脱臭或脱胶以产生以初始倾点为特征的“RBD油”。然后以控制方式降低RBD油的温度直到晶核形成，并且然后保持在这个第一结晶温度(即，持续几小时)以产生晶体。然后通过过滤移除晶体，以产生两个部分：含有一些或大部分硬脂馏分的固相和主要含有油精馏分的液相。这种液相以低于初始倾点的第二倾点为特征，例如，第二倾点可以在大约-10℃与大约-40℃之间，并且脂肪酸组成可以是至少50％C18：1和少于10％C18：2。可以使液相针对较低的第二结晶温度再次经历分提以实现硬脂的进一步去除。在说明性实施方案中，第一结晶温度在高于15℃至大约50℃之间，并且第二结晶温度在大约-15℃与大约15℃之间。
在任何情况下，所生成的纯化液体馏分等同于或基本上类似于如植物油工业中共知的超级油精油(super olein oil)，具有比天然藻油更好的热特性。在一些实施方案中，如特定应用可能所希望的，通过添加甚至进一步降低倾点的化学倾点抑制剂进一步改进这些特性。通过这种方法提供的微生物油可以不仅用于食品应用中，而且用于工业应用中，如生产润滑剂、液压流体、工业用油和介电流体。对于工业应用(例如，介电流体)，可以添加至微生物油的一种或多种添加剂(除倾点抑制剂之外或取而代之)包括：抗氧化剂、金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、破乳剂、抗磨损添加剂或抗水解化合物。
在各种实施方案中，微生物油源自具有不同脂质谱(即，不同脂肪酸谱)的产油微生物，如微藻细胞，包括表达外源基因的重组细胞，这些外源基因编码如一种或多种脂肪酰基-ACP硫酯酶的蛋白质。在说明性实施方案中，微生物油源自经工程化以表达一个或多个外源基因的基因工程微生物，并且这种方法另外地包括培养这种微生物直到微生物具有按干重计至少10％的油，并且从这种微生物分离油以产生微生物油，然后可以将微生物油如上文所述进行精炼、漂白、脱臭和任选地脱胶。也可以使用具有相似或不同脂质谱的其他产油微生物，包括酵母、真菌、和细菌。在某些实施方案中，本发明因此提供了从这样的微藻和/或产油微生物(包括酵母、真菌和细菌)制造脂质和油基产品(包括介电流体)的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了包含微生物油的产品，其中该微生物油具有大约10℃与大约-40℃之间的倾点，并且其中该微生物油的脂肪酸组成是至少大约50％C18：1和少于大约10％C18：2。在这样的实施方案的变型中，产品具有在-10℃与大约-40℃之间的倾点。产品中的微生物油可以包括例如至少大约60％、至少大约70％、或至少大约80％C18：1。在一些情况下，微生物油可以包括少于大约5％C18：2(例如，至少大约80％C18：1和少于大约5％C18：2)。在特定的实施方案中，产品中的微生物油具有在大约25与大约200之间的碘值。在某些实施方案中，微生物油可以由经工程化以表达一个或多个外源基因的基因工程微生物产生。用于此目的的说明性微生物包括来自无绿藻属(Prototheca)或小球藻属(Chlorella)的种类(例如，Prototheca moriformis)。这样的微生物可以经过工程化以表达例如编码蔗糖转化酶和/或脂肪酰基-ACP硫酯酶的一个或多个外源基因。在说明性实施方案中，微生物经过工程化以表达编码两种或更多种脂肪酰基-ACP硫酯酶或蔗糖转化酶和一种或多种脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因。
在各种实施方案中，产品包括一种或多种添加剂，如抗氧化剂、金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、破乳剂、抗磨损添加剂、倾点抑制剂、或抗水解化合物。说明性产品包括润滑剂、液压流体、工业用油、或介电流体。尤其是介电流体可以具有一种或多种以上讨论的添加剂。
在一些情况下，微生物油基产品是介电流体。在一些实施方案中，用于介电流体中的微生物油具有一种或多种以下属性：(i)少于0.4微克/ml的总类胡萝卜素；(ii)少于0.001微克/ml的番茄红素；(iii)少于0.02微克/ml的β胡萝卜素；(iv)每千克油少于0.02毫克的叶绿素；(v)每100克油0.40-0.60毫克γ生育酚；(vi)每100克油3-9mg菜油甾醇；或(vii)每克油少于0.5毫克总生育三烯酚。在一些情况下，介电流体具有以下一种或多种特性：在40℃时小于大约110cSt(例如，在20-30cSt范围内)的粘度；(b)在100℃时在大约2至大约15cSt(例如4-8cSt)范围内的粘度；(c)在40℃时至少35的粘度指数(VI，无量纲数)，包括但不限于35至80的VI、80至110的VI、110至125的VIT、125至160的VI并且在一些实施方案中大于160的VI；(d)-8℃至10℃或更低的倾点(液体将流动的最低温度)，包括但不限于-20℃至-25℃或更低的倾点和在一些实施方案中-30℃或-40℃或更低的倾点；(e)等同于ASTM D2882的润滑性；(f)低挥发性；(g)高闪点，包括150℃或更高的闪点，包括300℃或更高的闪点；(h)150℃或更高(例如，高于300℃)的燃点，包括300℃或更高的闪点；(i)低反应性，包括在酸和碱存在下的抗分解性、良好的热稳定性、与氧反应的低易感性和低中和值(0.06或更低，例如0.03或更低)；(j)良好的可混合性，包括高破乳化性；(k)在25℃时1％或更低(包括但不限于0.5％或更低、0.15％或更低、0.1％或更低和在一些实施方案中0.05％或更低)的功率因数；(l)在100℃时1.5％或更低(包括但不限于1％或更低、0.3％或更低和在一些实施方案中0.1％或更低)的功率因数；(m)高介电强度；(n)低耗散因数；(o)低电导率；(p)高比热，包括但不限于至少0.39cal/gm/℃的比热和在一些实施方案中至少0.45cal/gm/℃或更高的比热；和(q)是生物可降解的，即，在微生物存在下分解成二氧化碳和水，使得至少15％或更多的介电流体在标准试验条件下在28天内生物降解，并且在一些实施方案中，30％或更多、70％或更多、或100％介电流体在这些条件下生物降解。
本发明还提供了包含上述介电流体的电气部件。在某些实施方案中，电气部件是变压器。
本发明进一步提供了生产包含微生物油的产品的方法。在某些实施方案中，这种产品具有大约-10℃与大约-40℃之间的倾点，并且其中微生物油的脂肪酸组成是至少50％C18：1和少于10％C18：2。在这样的实施方案中，该方法需要培养经工程化以表达一个或多个外源基因的基因工程微生物直到微生物具有按干重计至少10％的油，并且然后从微生物中分离油。然后使微生物油经历精炼、漂白、脱臭和任选地脱胶以产生RBD油。该方法可以任选地进一步需要向RBD油添加抗氧化剂、金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、破乳剂、抗磨损添加剂、倾点抑制剂或抗水解化合物。说明性的工程化微生物可以包括来自无绿藻属(Prototheca)或小球藻属(Chlorella)的种类(例如，Prototheca moriformis)。这样的微生物可以经过工程化以表达例如编码蔗糖转化酶和/或脂肪酰基-ACP硫酯酶的一个或多个外源基因。在说明性实施方案中，微生物经过工程化以表达编码两种或更多种脂肪酰基-ACP硫酯酶或蔗糖转化酶和一种或多种脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制造介电流体的方法，该方法包括以下步骤：(a)培养产油微生物以提供含有按干重计至少10％脂质的产油微生物，(b)从产油微生物分离脂质，和(c)使脂质经历至少一个选自下组的加工步骤，该组由以下各项组成：精炼、漂白、脱臭、脱胶和通过结晶或干法分提或通过冬化分提。
在这种方法的一些具体实施方案中，产油微生物选自下组，该组由以下各项组成：微藻、产油酵母、产油真菌和产油细菌。在一些情况下，产油微生物为混浊红球菌(Rhodococcus opacus)的产油细菌。在一些情况下，产油微生物是产油真菌。在一些情况下，产油真菌是在表3中列出的种类。在一些情况下，产油微生物是产油酵母。在一些情况下，产油酵母是在表2中列出的种类。在一些情况下，产油微生物是微藻。在一些情况下，微藻是在表1中列出的种类。在一些情况下，微藻是属于无绿藻属。
在一些实施方案中，通过这种方法产生的介电流体具有以下一种或多种属性：(i)0.05-0.244mcg/g总类胡萝卜素；(ii)少于0.003mcg/g番茄红素；(iii)少于0.003mcg/gβ胡萝卜素；(iv)0.045-0.268mcg/g叶绿素A；(v)38.3-164mcg/gγ生育酚；(vi)少于0.25％菜子甾醇、菜油甾醇、豆甾醇(stignasterol)、或β-谷甾醇；(vii)249.6-325.3mcg/g总生育三烯酚；(viii)0.003-0.039mcg/g叶黄素；和(ix)60.8-261.7mcg/g生育酚。在一些实施方案中，通过这种方法产生的介电流体具有选自以下的特性：(a)在40℃时小于大约110cSt(例如，在20-30cSt范围内)的粘度；(b)在100℃时在大约2至大约15cSt(例如，4-8cSt)范围内的粘度；(c)在40℃时至少35的粘度指数；(d)-8℃至-10℃或更低(包括-15℃至-25℃或更低)的倾点；(e)等同于ASTM D2882的润滑性；(f)150℃或更高的闪点；(g)0.06或更低的中和值；(h)在25℃时1％或更低的功率因数；(i)至少0.39cal/gm/℃的比热；和(j)生物可降解性，使得至少15％或更多的介电流体在标准试验条件下在28天内降解。
在一些情况下，介电流体与以下一种或多种添加剂混合：(a)抗氧化剂；(b)金属离子钝化剂；(c)腐蚀抑制剂；(d)破乳剂；(e)抗磨损添加剂；(f)马来酸酐苯乙烯共聚物(malan styrene copolymer)；(g)倾点抑制剂，包括但不限于
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10-310或1-133(Rohmax-Evonik Additives GmbH)，或其他聚(烷基)丙烯酸酯和聚(甲基)丙烯酸酯如V-351(Infineum UK limitied)、PMA-D110和PMA D；或(h)碳二亚胺；或(i)合成酯或(j)聚α烯烃(PAO)或(k)交内酯的酯(ester of estolides)。
在另一个实施方案中，本发明提供一种包含产油微生物油的介电流体，其中所述介电流体包含少于大约10％的C18：2。在一些情况下，介电流体包含少于大约5％的C18：2。在一些情况下，介电流体包含少于大约2％的C18：2。在一些情况下，介电流体进一步包含至少65％的C18：1。在一些情况下，介电流体进一步包含少于30％的C16：0。
在一些实施方案中，微生物油与另一种油共混以产生根据本发明实施方案的介电流体。在一些情况下，其他油不是微生物油。在一些情况下，其他油选自下组，该组由以下各项组成：大豆油、菜籽油、卡诺拉油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、玉米油、废弃植物油、乌桕油、橄榄油、向日葵油、棉籽油、鸡脂肪、牛脂、猪脂、微藻油、巨藻油、微生物油、正萼距花(Cuphea)油、亚麻油、花生油、精选白脂膏、猪油、荠蓝(Camellina sativa)油、芥子油、腰果油、燕麦油、羽扇豆油、洋麻油、金盏花油、海草(help)油、咖啡油、亚麻(flax)油、榛果油、大戟油、南瓜子油、芫荽油、茶油、芝麻油、红花油、米糠油、油桐树油、可可油、干椰子肉油、鸦片罂粟油、蓖麻油、胡桃油、霍霍巴油、澳洲坚果油、巴西坚果油、鳄梨油、产油酵母油、产油细菌油、石油或前述油任一种的馏分。
在一些实施方案中，其他油在介电流体中的含量少于30％。在一些情况下，其他油在介电流体中的含量少于20％。在一些情况下，其他油在介电流体中的含量少于10％。在一些实施方案中，微生物油在介电流体中的含量少于50％。在一些情况下，微生物油在介电流体中的含量少于25％。在一些情况下，微生物油在介电流体中的含量少于10％。
在另一个实施方案中，本发明提供一种包含以下一种或多种添加剂的介电流体：(a)抗氧化剂，包括但不限于BHT和其他苯酚；(b)金属离子(如Cu、Zn，等等)钝化剂，包括但不限于苯并三唑；(c)腐蚀抑制剂，包括但不限于磺酸酯和琥珀酸酯；(d)破乳剂；(e)抗磨损添加剂，包括但不限于二硫代磷酸锌；(f)降低倾点的添加剂，包括但不限于马来酸酐苯乙烯共聚物和聚(烷基)丙烯酸酯，包括但不限于聚甲基丙烯酸酯；以及(g)保护其免受水解的化合物，包括但不限于碳二亚胺。
本发明的这些和其他实施方案描述于下文的详细说明中并且在下文的实例中举例说明。上文讨论和贯穿本申请的任何或所有特征可以在本发明的多种实施方案中组合。
附图简要说明
可以通过参考以下说明结合附图来理解本发明，这些附图展示了本发明的某些具体实施方案。
图1.针对RBD油分提的典型冷却曲线(Tf＝过滤温度)。
图2.针对藻油精分提的典型冷却曲线(Tf＝过滤温度)。
图3.VPL10-310对藻油和分提油的倾点的影向“脱臭油”是RBD油；“油精”是油精#1；“超级油精”是超级油精#1”。
详细说明
本发明部分地起因于以下发现：无绿藻属和其他产油微生物在某些实施方案中出乎意料地具有有利于生产介电流体的特性，除了其他应用之外，这些介电流体例如生物可降解润滑剂，尤其是发动机油和液压流体(先前主要基于矿物油)。微生物油基润滑剂可以用来替代链锯杆中的石油润滑剂、钻井泥浆和油、油基金属加工液、食品工业润滑剂、开式齿轮油、可生物降解润滑脂、液压流体、船用油和舷外发动机润滑剂、水泵和地下泵用油、钢轨翼缘润滑剂、减震器润滑剂、拖拉机油、农用装备润滑剂、电梯油、脱模油、二冲程发动机润滑剂和其他润滑剂。
本发明还部分地起因于发现用于改性微生物油以降低减少其倾点的方法。脂质的酯交换产生长链脂肪酸酯。可以调节其他酶促和化学过程以产生脂肪酸、醛、醇、链烷、和烯。在一些应用中，产生了用于介电流体中的烃化合物。
为了方便读者，将本详细说明分成多个部分。第I部分提供了在此所使用的术语的定义。第II部分提供了在本发明方法的实施方案中有用的培养条件的说明。第III部分提供了基因工程方法和材料的说明。第IV部分提供了微生物的基因工程使其能够利用蔗糖的说明，具体提到微藻，如通过无绿藻举例说明的。第V部分提供了改变脂质生物合成的基因工程的说明。第VI部分描述了用于制造本发明实施方案的微生物油和源自其中的产品(如介电流体)的方法。第VII部分披露了展示本发明的各种实施方案的实例。
i.定义
除非另有定义，在此所使用的所有技术与科学术语具有如本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了在本发明中所使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，《微生物学与分子生物学词典》(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)(第2版，1994)；《剑桥科学与术语词典》(The Cambridge Dictionary of Science and Technology)(Walker编著，1988)；《遗传学词汇》(The Glossary of Genetics)，第5版，R.Rieger等人(编著)，Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham，《哈珀科林生物学词典》(The Harper Collins Dictionary of Biology)(1991)。如在此所使用的，除非另外指明，以下术语具有归属于它们的含义。
“在微藻中有活性”指在微藻中有功能的核酸。例如，已经用来驱动抗生素抗性基因以便对转基因微藻赋予抗生素抗性的启动子在微藻中有活性。
“酰基载体蛋白”或“ACP”是一种蛋白质，它在脂肪酸合成过程中结合在4′-磷酸泛酰巯基乙胺部分的远端巯基处作为硫羟酸酯的正在增长的酰基链并且构成脂肪酸合成酶复合体的组分。
“酰基辅酶A分子”或“酰基辅酶A”是包含酰基部分的分子，其中酰基部分在辅酶A的4′-磷酸泛酰巯基乙胺部分的远端巯基处经由硫羟酸酯键与辅酶A共价连接。
“抗氧化剂”是能够抑制其他分子氧化的分子。抗氧化剂时常被添加至工业产品中。常见用途是作为稳定剂在燃料和润滑剂中防止氧化和在汽油中防止导致发动机脏污残余物形成的聚合作用。它们也广泛地用来防止聚合物如橡胶、塑料和胶粘剂的氧化降解，这种氧化降解引起这些材料中强度和柔性的丧失。
“抗水解化合物”是通过与水反应抑制化学化合物分解的分子。例如，可以采用碳二亚胺作为抗水解化合物。抗水解化合物是可商业获得的，例如，从SpecialChem等供应商获得。
“抗磨损添加剂”是对于流体(例如，润滑油)的添加剂，它导致较长的机器寿命，这是由于组件的耐磨性和耐刮性(score resistance)更高。抗磨损添加剂在油膜破裂时防止机器零件之间的直接金属与金属接触。典型地，添加剂与零件表面上的金属反应并且形成薄膜，所述薄膜可以在摩擦表面上滑动。抗磨损添加剂典型地含有锌化合物和磷化合物。抗磨损添加剂的实例包括二硫代磷酸锌(ZDP)、二烷基二硫代磷酸锌(ZDDP，还充当腐蚀抑制剂和抗氧化剂)、磷酸三甲苯酯(TCP，用于高温操作)、卤代烃(氯化石蜡，用于极端压力操作)、甘油单油酸酯、硬脂酸(其在150℃下经由可逆吸附过程附着于表面，用于温和触条件)。
“面积百分比”是指使用其中样品内每种脂肪酸在检测之前转化成脂肪酸甲酯(FAME)的FAME GC/FID检测方法观察到的峰面积。例如，与任何其他脂肪酸如C14：1相比，观察到没有不饱和的14碳原子脂肪酸(C14：0)的独立峰。每种种类FAME的峰面积与其在混合物中的组成百分比组成成正比并且基于样品中存在的所有峰的总和而被计算(即[特定峰下的面积/所有测量峰的总面积]X100)。当提到在此所述的油和细胞的脂质(脂肪酸)谱时，“至少4％C8-C14”表示细胞中或提取的甘油脂组合物中至少4％的总脂肪酸具有包括8、10、12或14个碳原子的链长。
“无菌的”是指没有被其他活生物污染的生物培养物。
“生物柴油”是适合用作柴油发动机中的燃料的以生物方式产生的脂肪酸烷基酯。
“生物质”是通过细胞的生长和/或增殖产生的物质。生物质可以含有细胞和/或胞内内容物以及细胞外物质，包括但不限于由细胞分泌的化合物。
“生物反应器”是其中培养(任选地以悬浮方式培养)细胞的密闭罩或部分密闭罩。
介电流体的“击穿电压”是介电流体丧失其绝缘特性的电压。
“催化剂”是能够推进或促进反应物至产物的化学反应，而不变成产物的一部分的试剂，如分子或大分子络合物。催化剂增加了反应的速率，此后，催化剂可以作用于另一种反应物以形成产物。催化剂通常降低反应所需要的总活化能，使得反应进行更快或在较低温度推进。因此，反应平衡可以更快达到。催化剂的实例包括作为生物催化剂的酶、作为非生物催化剂的热、以及用于化石油精炼过程中的金属。
“纤维素物质”是消化纤维素的产物，包括葡萄糖与木糖，以及任选地另外的化合物如二糖、寡糖、木质素、糠醛和其他化合物。纤维素材料的来源的非限制性实例包括甘蔗渣、甜菜浆、玉米秸秆、木屑、锯屑和柳枝稷。
“共培养”及其变体如“共培养”和“共发酵”是指在同一个生物反应器中存在两种或更多种类型的细胞。两种或更多种类型的细胞可以两者都是微生物，如微藻，或可以是与一种不同的细胞类型一起培养的微藻细胞。培养条件可以是促进两种或更多种细胞类型的生长和/或增殖的那些条件或促进两种或更多种细胞之一或其亚组生长和/或增殖同时维持其余细胞的细胞生长的那些条件。
“辅因子”是除了底物之外的一种酶进行其酶活性所需要的任何分子。
“互补DNA”或“cDNA”是mRNA的DNA拷贝，通常通过逆转录信使RNA(mRNA)或扩增(例如，通过聚合酶链反应(“PCR”))获得。
“腐蚀抑制剂”是添加至流体时降低与这种流体接触的金属或合金的腐蚀速率的分子。
“培养”及其变体如“培养”和“发酵”是指通过使用选择和/或受控的条件有意地促进一个或多个细胞生长(在细胞大小、细胞内容物、和/或细胞活性方面增加)和/或增殖(经由有丝分裂增加细胞数)。生长和增殖的组合可以称作繁殖。选择和/或受控的条件的实例包括使用确定成分培养基(具有已知特征如pH、离子强度、和碳源)、指定的温度、氧张力、二氧化碳水平、以及在生物反应器中的生长。培养不是指微生物在自然界中或以别的方式在没有人类干预下的生长或增殖；例如，最终变成化石以产生地质原油的生物的自然生长不是培养。
“细胞溶解”是细胞在低渗环境中的溶解。细胞溶解由过度的渗透作用或水向细胞内部移动(水分过多)引起的。细胞不能经受住内部的水的渗透压，因此它爆裂。
“脱脂粕(Delipidated meal)”和“脱脂微生物生物质”是通过使用机械提取(即，通过螺旋榨机进行)或溶剂提取或二者，已经从其中提取或分离油(包括脂质)之后的微生物生物质。与从微生物生物质中提取或分离油/脂质之前相比，脱脂粕具有降低量的油/脂质，但是的确含有一些残余油/脂质。
“破乳剂”是破坏乳液(通常为液-液乳液)或防止它们形成的分子。破乳剂典型地基于以下化学品：酸催化酚醛树脂、碱催化酚醛树脂、聚胺、二环氧化物、多元醇。这些分子通常经乙氧基化(和/或丙氧基化)以提供所需的水溶性/油溶性。添加环氧乙烷增加水溶性，而环氧丙烷降低水溶性。可商业获得的破乳剂制品典型地是二种至四种不同的化学品在一种或多种载体溶剂如二甲苯、重芳烃石脑油(HAN)、异丙醇、甲醇、2-乙基己醇或柴油中的混合物。
“介电质”或“介电流体”是在正常情况下(或在其预期使用的情况下)不传导电流或具有非常低水平的电流传导性的流体。介电流体用于例如变压器和其他电气装置中的电绝缘、冷却和润滑。利用介电流体的电气装置包括电力变压器和配电变压器、电路断路器、电容器、开关设备、X光机、和绝缘电缆。
材料(例如，绝缘体)的“介电强度”是产生介电击穿(即，其绝缘性能失效)所需要的最大电压，表示为伏特/每单位厚度。材料的介电强度可以根据标准方法(例如ASTM测试方法D1816、D877、D3300、D117、D2413、D6180、D6181、或D1310)测定。
“表达载体”或“表达构建体”或“质粒”或“重组DNA构建体”是指已经通过人类干预(包括通过重组手段或直接化学合成)产生的核酸，其带有允许特定核酸在宿主细胞中转录和/或翻译的一系列指定核酸元件。表达载体可以是质粒的一部分、病毒、或核酸片段。典型地，表达载体包含与启动子可操作地连接的待转录核酸。
“外源基因”是指令已经导入(“转化”)到细胞中的RNA和/或蛋白质的表达的核酸，并且还被称为“转基因”。转化的细胞可以被称为重组细胞，可以向其中导入另外的外源基因。相对于正在转化的细胞，外源基因可以来自不同的种类(因此是异源的)，或来自相同的种类(因此是同源的)。因此，外源基因可以包括相对于该基因的内源拷贝占据细胞基因组中不同位置或在不同控制之下的同源基因。外源基因可以在细胞中以一个拷贝以上存在。外源基因可以在细胞中作为基因组(核或质粒)中的插入片段或作为游离型分子而维持。
“外源提供的”是指提供到细胞培养物的培养基的分子。
“螺旋压榨”是用于从原料如大豆和油菜籽中提取油的机械方法。螺旋榨机是螺杆型机器，其通过笼形桶样腔(caged barrel-like cavity)挤压物料。原料进入压机的一侧，并且压榨后的饼从另一侧退出，同时油在笼中的杆之间渗出并且被收集。这种机器使用来自螺杆驱动器的摩擦力和连续压力来移动和压榨原料。油从不允许固体通过的小开口渗出。当挤压原料时，摩擦力典型地引起原料加热。
“脂肪酸”是带有脂族长尾(链)的羧酸。脂肪酸的脂族部分可以是充分饱和的(无双键)或可以在分子的一个或多个不同部分是不饱和的。大部分天然存在的脂肪酸具有偶数(从4至28)个碳原子的链。脂肪酸可以是甘油三酯或其他脂质(例如，磷脂、鞘脂)的组分。脂肪酸可以由“脂质数”表征。脂质数采取C∶D形式，其中C是脂肪酸中的碳原子的数目并且D是脂肪酸中的双键的数目。因此，“C18：1”是指具有18个碳和1个双键的脂肪酸，而“C18：2”是指具有18个碳和2个双键的脂肪酸。
“脂肪酰基-ACP硫酯酶”是在脂质合成过程中催化从酰基载体蛋白(ACP)切下脂肪酸的酶。
“脂肪酰基辅酶A/醛还原酶”是催化酰基辅酶A分子还原成伯醇的酶。
“脂脂肪酰基辅酶A还原酶”是催化酰基辅酶A分子还原成醛的酶。
“脂肪醛脱羧酶”是催化脂肪醛转化成链烷的酶。
“脂肪醛还原酶”是催化醛还原成伯醇的酶。
材料的燃点是该材料被明火点燃后将继续燃烧至少5秒的温度。可以根据标准方法(例如ASTM测试方法D92或D1310)测定燃点。
“闪点”是材料可以在空气中蒸发以形成可着火混合物的最低温度。在闪点上，材料可以点燃，但是点燃时产生的蒸汽可以不以足以维持燃烧的速率产生。可以根据标准方法(例如ASTM测试方法D3278、D3828、D56、或D93)测定燃点。
“固定碳源”是在环境温度和压力以固体或液体形式在培养基中存在的含碳分子，典型地是有机分子，它可以由其中所培养的微生物利用。
如涉及培养条件时，“异养的”是在基本上不存在光下，同时利用或代谢固定碳源的培养。
“匀浆”是已经被物理破坏的生物质。
“液压流体”是在液压系统中充当功率传输介质的流体。
“烃”是仅含有氢原子和碳原子的分子，其中碳原子共价连接以形成氢原子连接到其上的直链、支链、环状、或部分环状的主链。烃化合物的分子结构从最简单(处于作为天然气组分的甲烷形式(CH4))变动至非常重质和非常复杂，如某些分子，如发现于原油、石油和沥青中的沥青质。烃可以处于气体、液体、或固体形式，或这些形式的任何组合，并且可以具有在主链中的相邻碳原子之间的一个或多个双键或叁键。因而，本术语包括直链、支链、环状、或部分环状的链烷、烯、脂质、和石蜡。实例包括丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛烷、和鲨烯。
“氢∶碳比”是分子中基于原子对原子的氢原子对碳原子的比率。这个比率可以用来指代烃分子中碳原子和氢原子的数目。例如，具有最高比率的烃是甲烷CH4(4∶1)。
材料的“疏水性部分”是与水相相比更可溶于疏水相中的部分或级分。疏水性部分基本上不溶于水中；并且通常是非极性的。
“增加脂质产量”是指通过例如增加每升培养物的细胞的干重、增加构成脂质的细胞的百分比、或增加每升培养物体积每单位时间脂质总量来增加微生物培养的脂质生产率。
“诱导型启动子”是响应于特定刺激介导可操作地连接的基因的转录的启动子。
“工业用油”是用于工业中的油。常见的工业用油包括链锯杆润滑剂、金属加工液、食品级润滑剂、齿轮油、船用油、发动机润滑剂、拖拉机油、农用设备润滑剂、电梯油、脱模油，等等。“链锯杆润滑剂”用于链锯的杆和链的外部润滑。“金属加工液”是用来冷却和/或润滑金属片成型为有用物体的过程的流体。“食品级润滑剂”是可接受用于肉、家禽和其他食品加工设备、应用和工厂中的润滑剂。“齿轮油”是用于润滑齿轮的油，例如，在汽车、卡车、和其他机械中的变速器、变速箱、和差速器内。“船用油”是用于润滑船舶设备的运动部件的油。“发动机润滑剂”用于各种内燃发动机的润滑。虽然主要功能是润滑运动部件，发动机润滑剂也可以清洁、抑制腐蚀、改善密封、和通过从运动部件中带走热而冷却发动机。“拖拉机油”是用于拖拉机上的运动部件的油。“农用设备润滑剂”是用于润滑农用设备运动部件的润滑剂。“电梯油”是用作液压电梯中的液压流体的油。“脱模油”是在使用模具生产成型制品中有用的油。脱模油促进成型制品从模具释放并且可以具有提供所希望的表面整饰的表面调理特征。
“处于可操作连接”是在两个核酸序列(如控制序列(典型地是启动子)和连接的序列(典型地是编码蛋白质的序列，也称作编码序列))之间的功能性连接。如果一种启动子可以介导外源基因的转录，则该启动子与该基因处于可操作连接。
“原位”表示“在适当的位置”或“在其初始位置内”。
“碘值”(Iodine value)(或“碘值”(iodine number))是油的不饱度的量度。它是由油中的不饱和键消耗的碘的质量。例如，具有碘值50的油是其中100克油将消耗50克碘的油。在本领域中常规地测定碘值。测定碘值的标准方法包括ASTM D5768-02(2006)和DIN53241。
“营养素的限制性浓度”是培养物中限制培养的生物的增殖的化合物的浓度。“营养素的非限制性浓度”是在给定培养时间期间支持最大增殖的浓度。
因此，在给定培养时间期间产生的细胞数目在限制性浓度的营养素存在下比当营养素为非限制性时低。当营养素以高于支持最大增殖的浓度存在时，将这种营养素称作在培养物中“过量”。
“脂肪酶”是催化水不溶性脂质底物中的酯键水解的水溶性酶。脂肪酶催化脂质水解成甘油和脂肪酸。
“脂质修饰酶”指改变脂质的共价结构的酶。脂质修饰酶的实例包括脂肪酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、去饱和酶，包括硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)和脂肪酰基去饱和酶(FAD)、以及脂肪醛脱羧酶。
“脂质途径酶”是在脂质代谢(即，脂质合成、修饰或降解)中发挥作用的任何酶和以化学方式修饰脂质的任何蛋白质以及载体蛋白。
“脂质”或“脂类”是可溶于非极性溶剂(如醚和氯仿)中并且相对或完全不溶于水中的一类分子。脂质分子具有这些特性，因为它们主要由本质上疏水的长烃尾组成。脂质的实例包括脂肪酸(饱和与不饱和)；甘油酯或甘油脂(如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯或中性脂肪和磷酸甘油酯或甘油磷脂)；非甘油酯(鞘脂、固醇脂质包括胆固醇和类固醇激素，孕烯醇酮脂类包括萜类、脂肪醇、蜡、以及聚酮化合物)；和复合脂质衍生物(连接糖的脂质、或糖脂、和连接蛋白质的脂质)。“脂肪”是称作“三酰甘油脂”的脂质亚类。
“润滑剂”是当在固体表面之间导入作为薄膜时能够减少摩擦力、热和/或磨损的物质。
“溶解产物”是含有溶解细胞内容物的溶液。
“溶解”(Lysing)或“溶解”(lysis)是破坏生物有机体或细胞的细胞膜和任选地细胞壁，足以释放至少一些细胞内内容物。
“金属离子钝化剂”，也称作“金属钝化剂”或“金属钝化物质(MDA)”是用来通过钝化(通常通过掩蔽)金属离子而稳定流体的燃料和/或油添加剂。金属离子可以因燃料中天然存在的酸和润滑剂中因氧化过程产生的酸与系统的金属部件的作用而产生。
“微藻”是真核微生物生物，其含有叶绿体或质体并且任选地能够进行光合作用，或能够进行光合作用的原核微生物生物。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物，以及能够仅仅以固定碳源为生的异养生物。微藻包括在细胞分裂之后不久与姐妹细胞分开的单细胞生物，如衣藻(Chlamydomonas)，以及微生物，例如像，团藻(Volvox)，它是两种不同细胞类型的简单多细胞光合生物。微藻包括细胞，如小球藻、杜氏藻(Dunaliella少和无绿藻属。微藻还包括展现出细胞-细胞粘附的其他微生物光合生物，如阿格门氏藻(Agmenellum)、鱼腥藻(Anabaena)和桑葚藻(Pyrobotry)。“微藻”也指专性异养微生物，它们已经丧失进行光合作用的能力，如某些甲藻藻类和无绿藻种类。
“微生物”(Microorganism)和“微生物”(microbe)是微观的单细胞生物。
关于两种蛋白质或基因的“天然共表达”表示这些蛋白质或它们的基因在它们从其衍生的组织或生物中天然地共表达，例如，由于编码这两种蛋白质的基因处于共同调节序列的控制之下或它们向应于相同的刺激而表达。
“油”是指由生物(包括产油酵母、植物、和/或动物)产生的任何三酰甘油酯油。除非另外说明，与脂肪区分时，“油”是指在普通室温和压力通常为液体，但不总是为液体的脂质。例如，“油”包括源自植物的植物油或种子油，包括而不限于源自鳄梨、巴西坚果、金盏花、荠蓝属植物、荠蓝、卡诺拉油菜、腰果、蓖麻、可可脂(也称作可可，它是源自可可豆的三酰甘油酯油，在典型室温和压力为固体)、椰子、咖啡、干椰子肉、芫荽、玉米、棉籽、正萼距花、大戟、榛果、大麻、麻风树、霍霍巴、洋麻、亚麻、羽扇豆、澳洲坚果、芥子、燕麦、橄榄、鸦片罂粟、棕榈、棕榈仁、花生、山核桃、南瓜子、油菜籽、水稻、红花、芝麻、大豆、向日葵、和油桐树的油以及其组合。“微生物油”是指源自微生物的油。“产油酵母”表示可以天然积累超过其20％干细胞重量作为脂质并且属于双核亚界真菌的酵母。产油酵母包括但不限于，生物如解脂耶罗威亚酵母(Yarrowialipolytica)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、变曲隐球酵母(Cryptococcuscurvatus)、如斯达氏由脂酵母(Lipomyces starkeyi)。
“渗透压休克”是渗透压急剧下降后细胞在溶液中破裂。有时诱导渗透压休克以便使这样的细胞的细胞组分释放到溶液中。
“多糖降解酶”是能够催化任何多糖水解或糖化的任何酶。例如，纤维素酶催化纤维素的水解。
“多糖”或“聚糖”是由糖苷键连接在一起的单糖构成的糖。纤维素是构成某些植物细胞壁的多糖。纤维素可以通过酶解聚以产生单糖如木糖和葡萄糖，以及较大的二糖和寡糖。
“倾点”是液体在特定条件集合下将倾出或流动的最低温度。示例性倾点标准包括ASTM D97-11、D5853-11和D5949-10，但是可以在进行与在此所述的方法相关的倾点测定中使用本领域技术人员已知或由其制定的其他标准。
“倾点抑制剂”或“PPD”是控制油或润滑剂中的蜡晶体形成、导致较低的倾点和改进的低温流性能的聚合物。
“启动子”是指导核酸转录的核酸控制序列。如在此所使用的，启动子包括转录起始位点附近必需的核酸序列，如，在聚合酶II型启动子的情况下的TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻抑元件，它们可以距转录起始位点多达几千碱基对而定位。
“重组”是指因导入外源核酸或改变天然核酸而已经被修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体。因而，例如，重组细胞表达了没有发现于天然(非重组)形式的细胞内部的基因，或以与非重组细胞表达这些基因不同的方式表达天然基因。“重组核酸”是最初在体外形成(通常，通过操作核酸，例如，使用聚合酶和核酸内切酶)的核酸或另外地处于通常未发现于自然界中的形式。可以产生重组核酸，例如，以便将两个或更多个核酸安排为可操作连接。因此，分离核酸或通过连接通常在自然界中不接合的DNA分子在体外形成的表达载体均被认为是重组的。一旦产生重组核酸并将其导入宿主细胞或生物中，这种核酸可以利用宿主细胞的体内细胞机器(cellular machinery)进行复制；然而一旦以重组的方式产生，虽然这样的核酸随后在细胞内复制，其仍将被认为是重组的。同样，“重组蛋白”是使用重组技术，即，通过表达重组核酸产生的蛋白质。
“RBD油”是已经经历精炼、漂白或脱臭的油。
“可再生柴油”是通过脂质的氢化和脱氧所产生的链烷(如C10：0、C12：0、C14：0、C16：0和C18：0)的混合物。
“糖化”是将生物质(通常为纤维素生物质或木质纤维素生物质)转化成单体糖(如葡萄糖和木糖)的过程。“糖化”或“解聚”的纤维素材料或生物质是指已经通过糖化作用转化成单体糖的纤维素材料或生物质。
“超声波处理”是通过使用声波能量破坏生物材料(如细胞)的过程。
“糠醛种类”是2-呋喃甲醛或保留相同基本结构特征的衍生物。
“秸秆”是在已经收获籽粒之后剩余的作物的干燥茎和叶。
“蔗糖利用基因”是在表达时辅助细胞利用蔗糖作为能源的能力的基因。由蔗糖利用基因编码的蛋白质在此称为“蔗糖利用酶”并且包括蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、和己糖激酶如葡萄糖激酶和果糖激酶。
“变压器”是将电能从一条回路通过感应耦合导体(典型地是变压器线圈)转移至另一条回路的装置。
术语“冬化”油或“油的冬化”是指一种过程，它包括从油中去除较高熔点组分和/或添加一种或多种倾点抑制剂。
II.培育和培养条件
在某些实施方案中，本发明总体上涉及培养产油微生物，如野生型和重组微藻，包括小球藻属和无绿藻种类和株系，以及酵母、真菌和细菌种类与菌株，用于生产微生物油(脂质)。为了方便读者，将这个部分细分成多个小节。小节1描述了无绿藻种类和株系以及怎样通过基因组DNA比较来鉴定无绿藻种类和株系和相关微藻，以及用于在此所述方法中的其他微藻、酵母、真菌、和细菌。小节2描述了用于培养的生物反应器。小节3描述了用于培养的培养基。小节4描述了根据在此所述的说明性培养方法的油(脂质)的生产。小节5描述了适用于在此所述方法中的产油酵母类型、用于产生酵母生物质的培养条件和根据在此所述的说明性方法制备的生物质的脂质谱和化学组成。
1.无绿藻种类和株系以及其他的产油微生物
无绿藻是一种值得注意的用于生产脂质的微生物，因为它可以产生高水平脂质，尤其适合于生产介电流体和其他润滑剂的脂质。由无绿藻产生的脂质比其他微藻产生的脂质具有更高的饱和度。而且，无绿藻脂质是通常不含色素(低至不可检出水平的叶绿素和某些类胡萝卜素)并且在任何情况下含有比来自其他微藻的脂质少得多的色素。而且，相对于从其他微生物中生产脂质，可以使用在在此所述方法中所提供的重组无绿藻细胞，以更高的产量和效率并且以降低的成本产生脂质。用于在在此所述方法中的说明性无绿藻属种类和株系包括魏氏无绿藻(Prototheca wickerhamii)、雍滞无绿藻(Prototheca stagnora)(包括UTEX327)、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis(包括UTEX株1441、1435)和祖菲无绿藻(Prototheca zopfii)。无绿藻种类是专性异养生物。
可以通过扩增基因组的某些靶区域来鉴定用于在此所述方法中的无绿藻属种类。例如，可以使用引物和使用任何基因组区域的方法学，例如使用Wu等人，Bot.Bull.Acad.Sin.(2001)42：115-121Identification of Chlorella spp.isolates usingribosomal DNA sequences(使用核糖体DNA序列鉴定小球藻属种类分离株)中描述的方法，通过将核和/或叶绿体DNA的扩增和测序，实现特定无绿藻种类或株系的鉴定。良好建立的系统进化分析法，如核糖体内部转录间隔区(ITS1和ITS2rDNA)、23S rRNA、18S rRNA和其他保守基因组区域的扩增和测序，可以由本领域技术人员用来不仅鉴定无绿藻种类，还鉴定具有相似脂质谱和生产能力的其他产生烃和脂质的生物。对于藻类的鉴定和分类方法的实例，还参见例如Genetics，2005Aug；170(4)：1601-10和RNA，2005Apr；11(4)：361-4。
因此，基因组DNA比较可以用来鉴定有待用于在此所述方法中的适合的微藻种类。保守基因组DNA区域，例如但不限于编码23S rRNA的DNA，可以从微藻种类中扩增并且与共有序列比较，以便筛选分类学上与用于在此所述方法中的优选微藻相关的微藻种类。下文显示了针对无绿藻属内的种类的这种DNA序列比较的实例。基因组DNA比较还可以用来鉴定在菌种保藏中心已经被错误鉴定的微藻种类。菌种保藏中心将经常基于表型特征和形态学特征鉴定微藻种类。这些特征的使用可能导致微藻的种类或属的错误分类。使用基因组DNA比较可能是一种较好的基于微藻种类的系统发生关系而将它们分类的方法。
用于在此所述方法中的说明性微藻典型地具有编码23S rRNA的基因组DNA序列，所述DNA序列与SEQ ID NO：11-19中所列出的序列中的至少一个序列具有至少99％、至少95％、至少90％、或至少85％的核苷酸一致性。
对于确定核苷酸或氨基酸一致性百分比的序列比较，一个序列典型地充当参考序列，将测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。基于指定的程序参数，序列比较算法然后计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
可以例如通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)或通过目视检查(通常参见Ausubel等人，上文)来进行用于比较的最佳序列比对。
适合于确定序列一致性和序列相似性百分比的算法的另一个实例是BLAST算法，描述于Altschul等人J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的(在网址www.ncbi.nlm.nih.gov)。该算法涉及首先通过查询序列中的长度W的短字鉴定高评分序列对(HSP)，其中当所述短字与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配或满足某一正值阈评分(positive-valued threshold score)T。T被称为相邻字评分阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul等人，上文)。这些初始相邻字命中(initial neighborhood word hit)充当种子，这些种子用于启动检索以找到含有这些种子的更长HSP。这些字命中然后在两个方向沿着每个序列尽可能远地延伸，只要可以提高累积比对评分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积分。对于氨基酸序列，使用打分矩阵来计算累积分。字命中在每个方向上的延伸在以下情况时停止：累积比对评分从其最大实现值以量X跌落；累积分因积累一个或更多负评分残基比对而达到或低于零；或到达两个序列的任一序列的末端。对于鉴定一种核酸或多肽是否处于本发明的范围内，BLAST程序的默认参数是适合的。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3和期望值(E)10、以及BLOSUM62打分矩阵作为默认。TBLATN程序(使用核苷酸序列的蛋白质序列)使用字长(W)3、期望值(E)10、以及BLOSUM62打分矩阵作为默认(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))。
除了计算序列一致性百分比之外，BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小总和概率(P(N))，其提供在两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配藉此偶然发生的概率指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于大约0.1、更优选小于大约0.01、并且最优选小于大约0.001，则将认为核酸与参考序列相似。
除了无绿藻之外，多种产油微生物也可以用于在此所述的方法中。例如，小球藻属，包括但不限于小球藻属原始小球藻种类的株系，是用于在此所述方法中的优良微藻。除了产生适合的脂质或烃用于生产油、燃料和油脂化学品之外，影向选择用于在此所述方法中的微生物的考虑事项可以包括以下一项或多项：(1)作为细胞重量百分比的高脂质含量；(2)易于生长；(3)易于进行基因工程；和(4)易于进行生物质加工。在特定的实施方案中，野生型或基因修饰的微生物产生了含有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％或更多微生物油(即，脂质和脂肪酸)的细胞。优选的生物以异养方式(在不存在光时依赖糖)生长(和培养)。微藻通常是用于在此所述方法中的优良微生物。可以用来实施这些方法的微藻的实例包括，但不限于在表1中列出的以下藻类。
表1产油微藻的实例
Figure BDA00003138838400251
Figure BDA00003138838400271
除微藻之外，产油酵母可以积累超过其20％干细胞重量作为脂质并且因此用于在此所述的方法中。在本发明的一个实施方案中，产生脂质的微生物或可以从中提取、回收或获得油的微生物是产油酵母。可以在在此所述的方法中使用的产油酵母的实例包括但不限于在表2中列出的产油酵母。下文实例中提供了用于培养产油酵母(解脂耶罗威亚酵母(Tarrowia lipolytica)和禾本红酵母(Rhodotorula graminis)以实现高油含量的说明性方法。
表2.产油酵母的实例
Figure BDA00003138838400281
在本发明的一个实施方案中，产生脂质的微生物或可以从中提取、回收或获得脂质的微生物是真菌。可以在在此所述的方法中使用的真菌的实例包括但不限于在表3中列出的真菌。
表3.产油真菌的实例
Figure BDA00003138838400282
Figure BDA00003138838400291
因此，在本发明的一个实施方案中，用于产生用于在此所述的方法中的微生物生物质的微生物是真菌。适合的真菌的实例(例如，高山被孢霉、卷枝毛霉、和赭曲霉)包括已经显示易于接受基因操作的那些真菌，如在文献中所述(参见，例如，Microbiology，Jul；153(Pt.7)：2013-25(2007)；Mol Genet Genomics，Jun；271(5)：595-602(2004)；Curr Genet，Mar；21(3)：215-23(1992)；CurrentMicrobiology，30(2)：83-86(1995)；Sakuradani，NISR NISR Research Grant，″Studiesof Metabolic Engineering of Useful Lipid-producing Microorganisms(有用的产生脂质的微生物的代谢工程研究)″(2004)；和PCT/JP2004/012021)。
在本发明的其他实施方案中，产生脂质的微生物或可以从中提取、回收、或获得油的微生物是产油细菌。产油细菌是可以积累超过其20％干细胞重量作为脂质的细菌。用于在此所述的方法中的产油细菌种类，包括红球菌属种类，如混浊红球菌和红球菌种类(Rhodococcus sp.)。培养产油细菌(如混浊红球菌)的方法是本领域已知的(参见Waltermann等人，(2000)Microbiology，146：1143-1149)。下文实例中提供了用于培养混浊红球菌以实现高油含量的说明性方法。
2.生物反应器
出于实施基因操作和生产微生物油(例如，烃如脂质、脂肪酸、醛、醇和链烷)两者的目的而培养微生物。前一类型的培养按小规模实施并且至少起初在起始微生物可以生长的条件下进行。出于烃生产目的的培养通常按大规模(例如，10,000L、40,000L、100,000L或更大的生物反应器)在生物反应器中实施。微藻(包括无绿藻种类)以及在此所述的其他产油微生物典型地按在此所述的方法在生物反应器内的液体培养基中培养。典型地，生物反应器不允许大量光或任何量的光进入。在一些实施方案中，产油微生物(包括微藻)的整个培养步骤在基本上不存在光的情况下进行。
生物反应器或发酵罐用来培养微藻细胞经过其生理周期的多个阶段。生物反应器为用于异养生长和增殖方法提供许多优点。在此所述的微藻和其他产油微生物典型地在液体(例如在作为实例的悬浮培养物中)中大量发酵。生物反应器(如钢发酵罐)可以容纳十分大的培养体积(本发明的各种实施方案中使用40,000升和更大容量的生物反应器)。生物反应器典型地也允许控制培养条件如温度、pH、氧张力、和二氧化碳水平。例如，生物反应器典型地是可配置的，例如，使用与管路连接的端口以允许气体组分(如氧或氮)鼓泡穿过液体培养物。也可以使用生物反应器更轻易地操纵其他培养参数，如培养基的pH、微量元素的一致性和浓度、以及其他培养基组分。
生物反应器可以配置成使培养基在微藻繁殖和数目增加的时间段期间流遍生物反应器。在一些实施方案中，例如，可以将培养基在接种之后但在细胞达到所希望的密度之前输注到生物反应器中。在其他情况下，在培养开始时，将生物反应器以培养基充盈，并且在培养物接种之后不再输注培养基。换言之，将微藻(或其他微生物)生物质在含水培养基中培养一段时间，在此期间，微藻繁殖并且数目增加；然而，含水培养基的量在贯穿这段时间期间并不流遍生物反应器。因此在一些实施方案中，在接种之后，含水培养基不流遍生物反应器。
配备多种装置(如旋转叶片和叶轮、摆动机构、搅拌棒、加压气体输注装置)的生物反应器可以用来混合微藻培养物。混合可以是连续或间歇的。例如，在一些实施方案中，为繁殖微藻，不维持气体进入和培养基进入的湍流态直到已经实现所希望的所述微藻数目增加。
生物反应器端口可以用来将气体、固体、半固体、和液体导入或提取到含有微藻的生物反应器腔室中。虽然许多生物反应器具有一个以上的端口(例如，一个用于培养基进入，并且另一个用于采样)，仅一种物质进入或离开端口是不必要的。例如，一个端口可以用来使培养基流入生物反应器并且稍后用于采样、气体进入、气体离开或其他目的。优选地，采样端口可以反复使用，而不改变或损害培养物的无菌性质。采样端口可以配置有允许样品流停止和开始或提供连续采样手段的阀门或其他装置。生物反应器典型地具有允许接种培养物的至少一个端口，并且这种端口也可以用于其他目的，如培养基或气体进入。
生物反应器端口允许操纵微藻培养物的气体含量。为了举例说明，生物反应器的部分体积可以是气体，而不是液体，并且生物反应器的气体入口允许将气体泵送入生物反应器。可以被有益地泵送入生物反应器的气体包括空气、空气/CO2混合物、稀有气体(如氩气)、和其他气体。生物反应器典型地被配备为使得用户能够控制气体进入生物反应器的速率。如上文指出，增加进入生物反应器的气体流量可以用来增进培养物的混合。
增加的气体流量也影响培养物的浊度。可以通过安置气体进口低于含水培养基的液位实现紊流，从而进入生物反应器的气体鼓泡至培养物表面。一个或多个气体出口允许气体逃逸，从而防止生物反应器中的压力累积。优选地，气体出口通向防止污染微生物进入生物反应器的“单向”阀门。
3.培养基
微藻以及其他微生物培养基典型地含有多种组分，如固定氮源、固定碳源、微量元素、任选地用于pH维持的缓冲剂、和磷酸盐(典型地作为磷酸盐提供)。其他组分可以包括盐，如氯化钠，尤其对于海水微藻而言。氮源包括有机和无机氮源，例如包括而不限于分子氮、硝酸盐、硝酸盐、氨(纯氨或盐形式，如(NH4)2SO4和NH4OH)、蛋白质、大豆粕、玉米浆、以及酵母提取物。微量元素的实例包括锌、硼、钴、铜、锰、和钼，例如处于对应的形式：ZnCl2、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O和(NH4)6Mo7O24·4H2O。
根据本发明的方法使用的微生物发现于世界各处的各个地点和环境。由于它们与其他种类的隔离和因此产生的进化趋异，可能难以预测用于最佳生长和产生脂质和/或烃组分的特定生长培养基。在一些情况下，微生物的某些菌株可能在特定生长培养上不能生长，原因在于存在某种抑制性组分或不存在特定微生物菌株需要的某种必要营养需求。
固体和液体生长培养基通常可从广泛来源获得，并且可以找到制备适合于多种微生物株系的特定培养基的说明书，例如在www.utex.org/在线获得，该站点由奥斯汀的德克萨斯大学(1University Station A6700，奥斯汀，德克萨斯，78712-0183)，为其藻类培养物保藏中心(UTEX)维护。例如，多种淡水和咸水培养基包括在通过引用结合在此的PCT公开号2008/151149中描述的那些。
在一个具体的实例中，月示培养基(Proteose Medium)适于无菌培养，并且可以通过添加1g月示蛋白胨至1升Bristol培养基来制备1L体积的培养基(pH约6.8)。Bristol培养基包含在水溶液中的2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.43mM、1.29mM KH2PO4、和1.43mM NaCl。对于1.5％琼脂培养基，可以将15g琼脂添加至1L这种溶液。将溶液盖好并高压灭菌，并且然后在使用之前贮存在冷藏温度。另一个实例是无绿藻分离培养基(PIM)，其包含10g/L邻苯二甲酸氢钾(KHP)、0.9g/L氢氧化钠、0.1g/L硫酸镁、0.2g/L磷酸二氢钾、0.3g/L氯化铵、10g/L葡萄糖、0.001g/L盐酸硫胺素、20g/L琼脂、0.25g/L5-氟胞嘧啶，pH在5.0至5.2的范围内(参见Pore，1973，App.Microbiology，26：648-649)。可以通过咨询以上鉴定的URL或通过咨询维持微生物培养物的其他机构(如SAG、CCAP、或CCALA)而容易地确定供在此所述方法中使用的其他适合的培养基。SAG是指在哥廷根大学的藻类培养物保藏中心(哥廷根，德国)，CCAP是指苏格兰海洋科学协会管理的藻类和原虫培养物保藏中心(苏格兰，英国)，并且CCALA是指在植物研究所(Institute of Botany)的藻类实验室培养物保藏中心(
Figure BDA00003138838400331
，捷克共和国)。另外，美国专利号5,900,370描述了适合于无绿藻种类异养发酵的培养基制品和条件。
为了有成本效益的生产，固定碳源的选择是重要的，因为固定碳源的成本必须充分低从使油生产是经济的。适合的碳源例如包括乙酸盐、弗罗里多苷、果糖、半乳糖、葡糖醛酸、葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、鼠李糖、棉子糖、水苏糖、蔗糖和/或木糖。根据在此所述的方法有用的适合的原料例如包括黑液、玉米淀粉、解聚的纤维素材料、乳清、转化糖(葡萄糖/果糖)、糖蜜、马铃薯、高粱、蔗糖、甜菜、甘蔗、稠甘蔗汁、水稻和小麦。碳源也可以作为混合物如蔗糖和解聚甜菜浆的混合物而被提供。
一种或多种碳源可以按一种或多种外源提供的固定碳源的至少大约50μM、至少大约100μM、至少大约500μM、至少大约5mM、至少大约50mM、以及至少大约500mM的浓度而供应。优选高度浓缩的碳源作为发酵原料，并且在各种实施方案中，在原料中以接近其最大溶解度的浓度(即，以超过90％溶解度的浓度，如95％或更高即99％溶解度的浓度)提供碳源。
例如，在一些实施方案中，在补料分批培养时原料中使用至少300g/L、至少400g/L、至少500g/L或至少600g/L或更高的葡萄糖水平，其中当细胞生长并且积累微生物油(脂质)时，高度浓缩的固定碳源随时间推移而被供应给细胞。在其他实施方案中，在补料分批培养中，在原料中使用至少500g/L、至少600g/L、至少700g/L、至少800g/L或更高的蔗糖水平。高度浓缩的蔗糖碳源的非限制性实例包括稠甘蔗汁、甘蔗汁、甜菜汁和糖蜜。为了在此所述方法的目的，特别感兴趣的碳源包括纤维素(处于解聚形式)、甘油、蔗糖、和高粱，下文更详细地讨论每种碳源。
根据在此所述的方法，可以使用解聚的纤维素生物质作为原料培养微生物。纤维素生物质(例如，秸秆，如玉米秸秆)是便宜并且可以容易地获得的；然而，使用这种材料作为酵母用原料的尝试已经失败。具体而言，已经发现这种原料抑制酵母生长，并且酵母不能利用从纤维素材料中产生的5-碳糖(例如，来自半纤维素的木糖)。相反，微藻可以在加工的纤维素材料上生长。纤维素材料通常包括大约40％-60％的纤维素、大约20％-40％的半纤维素、以及10％-30％的木质素。
适合的纤维素材料包括来自草本和木质能源作物以及农业作物的残余物，即，植物部分，主要是茎和叶，它们不随主要食物或纤维产物一起从田间去除。实例包括农业废弃物如甘蔗渣、稻壳、玉米纤维(包括茎、叶、玉米皮、和玉米芯)、大豆粕、麦秸、稻草、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮；林业废弃物如硬木和软木间伐材(thinnings)、和来自木材操作的硬木和软木残余物；木材废弃物如锯木厂废弃物(木屑、锯屑)和纸浆厂废弃物；城市废弃物如市政固体废弃物的纸部分、城市木质废弃物和城市绿色废弃如市政碎草(grass clipping)；和木结构废弃物。另外的纤维素材料包括专用的纤维素作物如柳枝稷、杂交杨木、和芒草、纤维甘蔗、和纤维高粱。从这些材料产生的五碳糖包括木糖。
处理纤维素材料以增加微生物能够藉此利用包含在这些材料内的糖的效率。可以实施在此所述的方法以利用在酸爆炸之后处理纤维素材料的新方法，从而这些材料适合用于微生物(例如，微藻和产油酵母)的异养培养。如上文讨论，木质纤维素生物质由多种部分组成，这些部分包括纤维素(β-1，4连接的葡萄糖(六碳糖)的结晶聚合物)、半纤维素(更松散结合的聚合物，主要地由木糖(五碳糖)并且较少程度地由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖组成)、木质素(芥子醇及其衍生物组成的复杂芳香族聚合物)、以及果胶(是α-1，4连接的多聚半乳糖醛酸的直链)。因为纤维素和半纤维素的聚合结构，在它们中的糖(例如，单体葡萄糖和木糖)不是呈可以被许多微生物有效利用(代谢)的形式。对于这些微生物，进一步加工纤维素生物质以产生构成聚合物的单体糖对于确保有效利用纤维素材料作为原料(碳源)可能是十分有益的。
细胞或纤维素生物质经历一个称作“爆炸”的过程，其中所述生物质用稀硫酸(或其他酸)在升高的温度和压力下处理。这个过程将生物质调理，使得生物质可以有效地经受纤维素部分和半纤维素部分的酶促水解，变成葡萄糖和木糖单体。所生成的单体糖被称作纤维素糖。纤维素糖可以随后被微生物利用以产生多种代谢物(例如，脂质)。酸爆炸步骤导致半纤维素部分部分水解为组成单糖。这些糖可以随进一步处理从生物质完全释放。在一些实施方案中，进一步处理是包括用热水洗涤爆裂材料的水热处理(去除污染物，例如盐)。这个步骤对纤维素乙醇发酵不是必要的，原因在于在这类工艺中使用更加稀释的糖浓度。在其他实施方案中，进一步处理是另外的酸处理。在再另外的实施方案中，进一步处理是爆裂材料的酶促水解。这些处理也可以按任何组合方式使用。处理的类型可以影向释放的糖的类型(例如，五碳糖与六碳糖)和它们在这种过程中释放的阶段。因此，可以产生不同的糖流，无论它们是主要为五碳还是六碳。因此可以将这些富集的五碳流或六碳流导向到具有不同碳利用能力的特定微生物。
在此所述的这些方法典型地涉及发酵至在乙醇发酵中所实现的更高的细胞密度。由于用于异养脂质生产的培养物的密度更高，固定碳源(例如，源自纤维素材料的糖流)优选地处于浓缩形式。解聚纤维素材料的葡萄糖水平在培养步骤之前优选地是至少300g/升、至少400g/升、至少500g/升或至少600g/升，所述培养步骤任选地是在细胞生长并且积累脂质时将这种材料随时间推移而被供应给细胞的补料分批培养。在生产纤维素乙醇时，纤维素糖流不以这个浓度范围或接近这个浓度范围而被使用。因此，为了在生产木质纤维素油期间产生和维持很高的细胞密度，必须将碳原料以高度浓缩的形式输送至异养培养物中。然而，在进料流中不是产油微生物的底物并且不被其代谢的任何组分将在生物反应器中积累，如果这种组分有毒或抑制所希望的终产物的产生，这可能导致问题。虽然木质素和木质素衍生的副产物、碳水化合物衍生的副产物如糠醛与羟甲基糠醛、以及源自纤维素材料的产生的盐(在爆炸过程和后续中和过程中均存在)、甚至未代谢的戊糖/己糖可能在乙醇发酵中带来问题，在这些物质的浓度在初始原料中高的过程中，这些影响被显著放大。为了实现来自纤维素材料的六碳糖(它们可以在本发明的大规模生产应用中使用)的300g/L、400g/L、500g/L或更高的糖浓度，这些有毒材料的浓度可以比典型地存在于纤维素生物质的乙醇发酵中的浓度高20倍。
纤维素材料的爆炸加工处理利用显著量的硫酸、热和压力，从而释放碳水化合物副产物，即糠醛和羟甲基糠醛。在半纤维素水解期间通过木糖脱水成糠醛和水，产生糠醛和羟甲基糠醛。在本发明的一些实施方案中，将这些副产物(例如，糠醛和羟甲基糠醛)在导入生物反应器之前从糖化的木质纤维素材料中去除。在本发明的某些实施方案中，用于去除碳水化合物的副产物的方法是爆裂纤维素材料的水热处理。另外，在特定的实施方案中，本发明提供了其中能够耐受化合物如糠醛或羟甲基糠醛的株系被用于生产的方法。在另一个实施方案中，本发明也提供了用于使用微生物的方法，这些微生物不仅能够耐受发酵培养基中的糠醛，而且实际上能够在发酵期间代谢这些副产物。
爆炸过程还产生显著水平的盐。例如，当爆裂的纤维素生物质以以10∶1的水∶固形物(干重)比率再悬浮时，用于爆炸的典型条件可以导致超过5mS/cm的电导率。在本发明的某些实施方案中，稀释的爆裂的生物质经历酶促糖化，并且将所生成的上清液浓缩直至25倍以便用于生物反应器中。浓缩糖流中的盐水平(如由电导率量度的)可以不可接受地高(高达1.5M Na+当量)。当中和用于后续酶促糖化过程的爆裂的材料时，也产生另外的盐。根据在此所述的方法，可以去除这些盐，从而可以将生成的浓缩纤维素糖流用于产生脂质的异养过程中。在一些实施方案中，去除这些盐的方法为用树脂(例如，但不限于，DOWEXMarathon MR3)去离子化。在某些实施方案中，用树脂去离子化的步骤在糖浓缩之前或在糖化之前的生物质的pH调节和水热处理或前述步骤的任何组合之前进行；在其他实施方案中，在这些加工过程中的一个或多个之后实施该步骤。在其他实施方案中，爆炸过程本身被改变，从而避免以不可接受高的水平产生盐。例如，纤维素生物质的硫酸(或其他酸)爆炸过程的适合替代方案是机械制浆以使纤维素生物质易于接受酶促水解(糖化)。在再另外的实施方案中，使用抵抗高水平盐的天然微生物菌株或抵抗高水平盐的基因工程菌株。
如下实施制备爆裂纤维素生物质的方法的优选实施方案，其中爆裂纤维素生物质用于利用产油微生物生产异养微生物油。第一个步骤包括将再悬浮的爆裂纤维素生物质的pH调节至5.0-5.3范围，随后将纤维素生物质洗涤3次。可以通过多种手段完成这个洗涤步骤，包括使用脱盐和离子交换树脂、反渗透、水热处理(如上文所述)、或仅在去离子水中反复再悬浮和离心。这个洗涤步骤产生其电导率在100-300μS/cm之间的纤维素流以及显著量的糠醛和羟甲基糠醛的去除。可以保存来自这个洗涤步骤的滗析液以浓缩从半纤维素部分释放的五碳糖。第二个步骤包括酶促糖化洗涤的纤维素生物质。在一个实施方案中，使用Accellerase(Genencor)。第三个步骤包括通过离心或滗析和漂洗糖化的生物质回收糖。所生成的生物质(固体)是一种能量密集、富含木质素的组分，它可以用作燃料或送到废弃点。收集在离心/滗析和淋洗过程中回收的糖流。第四个步骤包括微过滤以去除染固形物，同时回收渗透物。第五个步骤包括可以使用真空蒸发器完成的浓缩步骤。这个步骤可以任选地包括添加消泡剂如P’2000(Sigma/Fluka)，由于所生成的糖原料的蛋白质含量，有时它是必要的。
在本发明方法的另一个实施方案中，碳源是甘油，包括来自生物柴油酯交换的酸化和未酸化的甘油副产物。在一个实施方案中，碳源包括甘油和至少一种其他碳源。在一些情况下，将所有甘油和至少一种其他固定碳源在发酵开始时提供给微生物。在一些情况下，将甘油和至少一种其他固定碳源以预定比率同时提供给微生物。在一些情况下，将甘油和至少一种其他固定碳源在发酵过程期间以预定的速率供应给微生物。
一些微藻在甘油存在下经历比葡萄糖存在下更快的细胞分裂(参见PCT公开号2008/151149)。在这些情况下，其中首先将甘油供应给细胞以快速增加细胞密度并且然后供应葡萄糖以积累微生物油(脂质)的两阶段生长过程可以提高产生油的效率。当返回微生物油生产工艺时，酯交换法的甘油副产物的使用提供了显著的经济优势。还提供了其他进料方法，如采用甘油和葡萄糖的混合物作为固定碳源的那些方法。供应这类混合物还获得相似的经济益处。另外，在某些实施方案中，本发明提供了向微藻供应替代性糖(如与甘油不同地组合的蔗糖)的方法。
在本发明方法的另一个实施方案中，碳源是转化糖。通过将蔗糖分解成其单糖组分(果糖和葡萄糖)而产生转化糖。可以通过本领域已知的几种方法实现转化糖的产生。一种这样的方法是加热蔗糖的水溶液。经常，使用催化剂来加速蔗糖转化成转化糖。这些催化剂可以是生物的；例如，可以将酶如转化酶和蔗糖酶添加至蔗糖以加速产生转化糖的水解反应。酸是与热配合时可以加速水解反应的非生物催化剂的实例。一旦产生转化糖，它与蔗糖相比较不易结晶并且因此为储存和补料分批发酵提供了优点，其中在异养培养微生物(包括微藻)的情况下，对于浓缩碳源存在着需要。在一个实施方案中，碳源是转化糖，优选地处于浓缩形式(在如上文描述那样使用的条件下其最大溶解度的至少90％)，即，至少800g/升、至少900g/升、至少1000g/升或至少1100g/升。当细胞生长并且积累脂质时，优选地处于浓缩形式的转化糖随时间推移被供应给细胞。
在本发明方法的另一个实施方案中，碳源是蔗糖，包括含有蔗糖的复杂原料，如来自甘蔗加工的稠甘蔗汁。如上文指出，由于用于异养油生产的培养物的密度更高，固定碳源(例如，蔗糖、葡萄糖，等等)在培养步骤之前处于浓缩形式，即，至少500g/升、至少600g/升、至少700g/升或至少800g/升的固定碳源，所述培养步骤任选地是在细胞生长并且积累脂质时将这种材料随时间推移供应给细胞的补料分批培养。在一些情况下，碳源是在培养步骤之前处于稠甘蔗汁形式的蔗糖，典型地处于浓缩形式，即，至少60％固形物或大约770g/升糖、至少70％固形物或大约925g/升糖或至少80％固形物或大约1125g/升糖，所述培养步骤任选地是补料分批培养。当细胞生长并且积累脂质时，浓缩的稠甘蔗汁随时间推移被供应给细胞。
在一个实施方案中，培养基进一步包括至少一种蔗糖利用酶。在一些情况下，培养基包含蔗糖转化酶。在一个实施方案中，蔗糖转化酶酶是由外源蔗糖转化酶基因编码的可分泌性蔗糖转化酶，所述外源蔗糖转化酶基因由微生物群体表达。因此，在一些情况下，如下文第IV部分中更详细地描述，用于在此所述的方法中的微生物已经被基因工程化以表达蔗糖利用酶，如蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、己糖激酶、葡萄糖激酶、或果糖激酶。
含有蔗糖的复杂原料包括来自甘蔗加工的废弃糖蜜；这种低价值的甘蔗加工废弃产物的使用在生产烃和其他油中能够提供显著的成本节约。用于在此所述的方法中的另一种含有蔗糖的复杂原料是高粱，包括高粱饴和纯高粱。高粱饴是从甜高粱秆的汁中产生的。其糖谱主要由葡萄糖(右旋糖)、果糖和蔗糖组成。
4.油生产
为了根据在此所述的方法生产油(脂质)，优选的是在黑暗下培养细胞，例如，当使用不允许光冲击培养物的极大(40,000升和更大)发酵罐时，情况就是如此。例如，可以在含有固定碳源的培养基中并且在没有光的情况下使无绿藻和其他微藻种类生长和增殖用于产生油；这种生长称作异养生长。
作为实例，将产生脂质的微藻细胞的接种物导入培养基中；在细胞开始增殖之前存在一个延迟期(延滞期)。在延迟期后，增殖速率稳定增加并且进入对数期或指数期。指数期之后转而增殖减慢，这是由于营养素(如氮)减少、有毒物质增加、以及群体感应机制(quorum sensing mechanism)的缘故。在这种减慢之后，增殖停止，并且细胞进入静止期或稳定生长状态，这取决于提供给细胞的特定环境。为了获得富含脂质的生物质，典型地正好在指数期结束之后收获培养物，可以通过允许氮或另一种关键营养素(除了碳之外)变得耗尽，从而迫使细胞将过量存在的碳源转化成脂质而提前终止该阶段。可以操纵培养条件参数来优化总油生产量、在油中所产生的脂肪酸的组合、和/或特定脂肪酸和相应脂质的产生。
优选地，使用在此所述和其他本领域已知的条件所培养的微生物包含按重量计至少大约20％、优选地按重量计至少大约40％、更优选地按重量计至少大约50％、以及最优选地按重量计至少大约60％的脂质。可以调节工艺条件以增加适于特定用途的脂质的产量和/或降低生产成本。例如，在某些实施方案中，在限制性浓度的一种或多种营养素(例如像，氮、磷、或硫)存在同时提供过量的固定碳能量如葡萄糖的情况下培养微藻或其他产油微生物。氮限制倾向于增加微生物脂质产量，其超过其中过量提供氮的培养物中的微生物脂质产量。在特定的实施方案中，脂质产量的增加是至少大约：10％、50％、100％、200％、或500％。可以将微生物在限制量的营养素存在的情况下培养持续总培养期的一部分或持续整个时期。在特定的实施方案中，在总培养期期间，营养素浓度在限制性浓度与非限制性浓度之间循环至少2次。可以通过继续培养持续增加的时间段同时提供过量的碳但是限制或不限制氮而增加细胞的脂质含量。
在另一个实施方案中，通过在脂质途径酶(例如，脂肪酸合成酶)的一种或多种辅因子存在的情况下培养产生脂质的微生物(例如，微藻)而增加脂质产量。通常，辅因子的浓度足以增加微生物油(例如，脂质和脂肪酸)产量，其超过在辅因子不存在情况下的微生物油产量。在一个特定的实施方案中，通过在培养物中包含微生物(例如，微藻)将辅因子提供给培养物，其中该微生物含有编码这种辅因子的外源基因。可替代地，可以通过包括含有外源基因的微生物(例如，微藻)将辅因子提供给培养物，其中该外源基因编码参与这种辅因子的合成的蛋白质。在某些实施方案中，适合的辅因子包括脂质途径酶所需要的维生素(例如像，生物素和泛酸盐)。适合用于在此所述的方法中或参与这类辅因子的合成的编码辅因子的基因是熟知的，并且可以使用构建体和如上文描述的那些技术，将这些基因导入微生物中(例如，在此所述的微藻或其他产油微生物)。
在此所述的生物反应器、培养条件和异养生长与增殖方法的具体实例可以按任何适合的方式组合以提高微生物生长和脂质和/或蛋白质产生的效率。
已经产生了具有按干重计高百分比油/脂质积累的微藻生物质(参见PCT公开号2008/151149)。通过在此所述的培养方法产生的并且根据在此所述的方法使用的微藻生物质包含按干重计至少10％的微藻油。在一些实施方案中，微藻生物质包含按干重计至少25％、至少50％、至少55％、或至少60％的微藻油。在一些实施方案中，微藻生物质含有按干重计10％-90％的微藻油、25％-75％的微藻油、40％-75％的微藻油、或50％-70％的微藻油。
在此所述的或从用于在此所述的方法和组合物中的生物质中提取的生物质微藻油可以包含具有一条或多条不同的脂肪酸酯侧链的甘油脂。甘油脂由与一个、二个或三个脂肪酸分子酯化的甘油分子组成，所述脂肪酸分子可以具有不同的长度并且具有不同的饱和度。如下文第V部分中更详细地描述的，可以通过培养条件或通过脂质途径工程操纵脂肪酸分子(和含有它们的微藻油)的长度特征和饱和特征来改变在在此所述的微藻油中的脂肪酸分子的特性或比例。因此，可以在单一藻种类中或通过将源自两个或更多个微藻种类的生物质或藻油混合或通过将在此所述的藻油与源自其他来源的油(如大豆油、菜籽油、卡诺拉油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、玉米油、废弃植物油、乌桕油、橄榄油、向日葵油、棉籽油、鸡脂肪、牛脂、猪脂、微藻油、巨藻油、微生物油、正萼距花油、亚麻油、花生油、精选白脂膏、猪油、荠蓝油、芥子油、腰果油、燕麦油、羽扇豆油、洋麻油、金盏花油、海草(help)油、咖啡油、亚麻油、榛果油、大戟油、南瓜子油、芫荽油、茶油、芝麻油、红花油、米糠油、油桐树油、可可油、干椰子肉油、鸦片罂粟油、蓖麻油、山核桃油、霍霍巴油、澳洲坚果油、巴西坚果油、鳄梨油、石油)或前述油的任一种馏分混合而制备藻油(或其他微生物油)的特定共混物。
如上文指出，也可以通过组合来自至少两个不同微藻种类的生物质或油而操纵油的组成，即，甘油脂的脂肪酸组分的特性和比例。在一些实施方案中，至少两个不同的微藻种类具有不同的甘油脂谱。不同的微藻种类可以如在此所述那样一起或分开培养，优选地在异养条件下培养，以便产生对应的油。不同的微藻种类可以在细胞的甘油脂中含有不同百分比的不同脂肪酸组分。
通常，无绿藻株具有C16和C18脂肪酸作为优势种类的脂质谱。通常优选这种链长较长的脂肪酸，尤其是单饱和的C16和C18脂肪酸(即，C16：1和C18：1)用于生产介电流体(参见，例如，美国专利号6,274,067)。例如，Protothecamoriformis(UTEX1435)、雍滞无绿藻(UTEX327)、和Prototheca moriformis(UTEX1441)含有在12％与30％之间的C16脂肪酸以及在50％与58％之间的C18：1脂肪酸。原始小球藻(Chlorella protothecoides)(UTEX250)含有大约73％的C18：1脂肪酸、并且其他原始小球藻株(包括但不限于UTEX25、UTEX249、UTEX256、UTEX264、UTEX411、CCAP211/17、CCAP221/8D和SAG22110d)可以含有在7％与18％之间的C16脂肪酸以及在55％与75％之间的C18：1脂肪酸。在各种实施方案中，用于在此所述的产品(如介电流体)中的微生物油(脂质)是至少大约50％的C18：1，例如，至少大约55％、至少大约60％、至少大约65％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、以及至少大约90％的C18：1。在这些或其他实施方案中，微生物油(脂质)是少于大约10％的C18：2，例如，少于大约7.5％、少于大约5％，少于大约2.5％、以及少于大约1％的C18：2。微生物油可以具有总计100％或更少的C18：1和C18：2的任何百分比组合。例如，微生物油可以具有至少50％的C18：1和少于10％C18：2或至少80％的C18：1和少于5％的C18：2。
微藻(或其他微生物)油(脂质)还可以包含由微藻产生或从培养基中掺入微藻油中的其他组分。这些其他组分可以按不同的量存在，这取决于培养条件、种类、用来从生物质回收油的提取方法和可能影响油组成的其他因素。这类组分的非限制性实例包括以少于0.4微克/ml存在的类胡萝卜素；以少于0.001微克/ml存在的番茄红素；以少于0.02微克/ml存在的β胡萝卜素；以每千克油少于0.02毫克存在的叶绿素；每100克油从0.40毫克至0.60毫克存在的γ生育酚；每100克油从3毫克至9毫克存在的菜油甾醇；以及以每克油少于0.5毫克存在的生育三烯酚。
其他组分可以包括而不限于磷脂、生育酚、生育三烯酚、类胡萝卜素(例如，α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素，等等)、叶黄素(xanthophyll)(例如，叶黄素(lutein)、玉米黄质、α-隐黄质和β-隐黄质)、以及各种有机或无机化合物。在一些情况下，从无绿藻种类提取的油包含每克油0.003至0.039微克之间的叶黄素、每克油少于0.003微克的番茄红素；以及每克油少于0.003微克的β胡萝卜素。
5.产油酵母菌株和培养条件
本发明提供了用于从产油酵母生物质产生油/脂质的方法。本发明部分地源自以下发现：可以制备具有高油含量的酵母生物质并且提取的油可以转化成多种有用产品，包括介电流体和其他润滑剂。酵母油，其可能包含饱和及中等至较长链的脂肪酸(例如，C16和C18脂肪酸)的混合物，提供了用于制备化学品(包括介电流体)的优良起始原料。
可以根据在此所述的方法使用产生适合的油和/或脂质的多个酵母种类，不过天然产生高水平的适合的油或脂质的酵母是优选的。
在特定的实施方案中，产油酵母包括含有按干重计至少20％或更多甘油三酯油的细胞。在其他实施方案中，产油酵母含有按干重计至少25％-35％或更多的甘油三酯油。通常，在这些实施方案中，产油酵母中所含的油越多，可以从生物质提取的油就越多，因此典型地优选的是可以培养产油酵母以便含有按干重计至少40％、至少50％、或至少60％或更多的甘油三酯油。并非所有类型的脂质均令人希望地用于化学品(如介电流体)中，因为它们可能具有不希望的链长、饱和水平、或与不希望的污染物结合。这些考虑事项也影响用于在此所述的方法中的产油酵母(或任何其他微生物)的选择。
用于在此所述的方法中的产油酵母的适合种类包括但不限于丘陵假丝酵母、假丝酵母种类、变曲隐球酵母、Cryptococcus terricolus、汉逊德巴利酵母、产脂拟内孢霉、Geotrichum carabidarum、Geotrichum cucujoidarum、Geotrichumhisteridarum、林生地霉、Geotrichum vulgare、隐伯顿毕赤酵母、产油油脂酵母、Lypomyces orentalis、斯达氏油脂酵母、Lipomyces tetrasporous、墨西哥毕赤酵母、球红冬孢酵母、圆红冬孢酵母、橙黄红酵母、Rhodotorula dairenensis、Rhodotoruladiffluens、粘红酵母、粘红酵母胶粘变种、瘦弱红酵母、禾本红酵母、小红酵母、粘质红酵母、粘质红酵母粘质变种、Rhodotorula terpenoidalis、Rhodotorulatoruloides、Sporobolomyces alborubescens、Starmerella bombicola、德尔布有孢圆酵母、普地有孢圆酵母、丝孢酵母、芸苔丝孢酵母、Trichosporon domesticum、赖巴克丝孢酵母、Trichosporon loubieri、Trichosporon loubieri var.loubieri、圆形丝孢酵母、茁芽丝孢酵母、毛孢子菌种类、Wickerhamomyces Canadensis、解脂耶罗威亚酵母、和Zygoascus meyerae。
用于在此所述的方法中的产油酵母种类可以通过将它们基因组的某些靶区域与在此所鉴定的种类的那些相同区域比较而进行鉴定；优选的种类是这些种类，它们展现出与在此所鉴定的种类的一致性或至少很高水平的同源性并且产生与在此具体所述的菌株相似量和相似类型的脂质。例如，可以使用引物和使用适当基因组区域的方法学，例如使用Kurtzman和Robnett，Antonie van Leeuwenhoek73(4)：331-371(1998)，Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts fromanalysis of nuclear large subunit(26S)ribosomal DNA partial sequences(从细胞核大亚基(26S)核糖体DNA部分序列的分析中鉴定子囊菌酵母及其系统发生)中描述的方法，通过将基因组DNA扩增和测序，实现特定产油酵母种类或菌株的鉴定。可以由本领域技术人员使用良好建立的系统进化分析法，如核糖体RNA基因的核18S和26S和内部转录间隔区(ITS)区和其他保守区的扩增和测序来鉴定适合用于在此披露的方法中的产油酵母种类。
因此，基因组DNA比较可以用来鉴定待用于在此所述方法中的适合的产油酵母种类。保守基因组DNA区域，例如但不限于在真菌18S的3′区域与真菌26SrRNA基因的5′区域之间的保守基因组序列，可以例如从分类学上与用于在此所述的方法中的优选产油酵母相关的酵母种类中扩增并且与这些优选种类的相应区域比较。然后选择展现出高水平相似性的种类用于在此所述的方法中。实例6描述了48株产油酵母菌株的真菌18S保守3′区域和真菌26S rRNA的5′区域的基因组测序。可以使用上文针对微藻/微生物所披露的相同方法进行序列比较以便确定核苷酸或氨基酸一致性百分比。
将产油酵母在液体培养基中培养以便根据在此所述的方法增殖生物质。在在此所述的方法中，使产油酵母种类在含有固定碳源和/或固定氮源的培养基中在没有光的情况下生长(异养生长)。产油酵母的异养生长通常在有氧环境下发生。例如，在有限氮条件下异养生长持续延长的时间段如10日至15日或更多天数可以导致轻脂质/油内容物在细胞中积累。
产油酵母培养基典型地含有多种组分，如固定碳源(下文讨论)、固定氮源(如蛋白质、大豆粕、酵母提取物、玉米浆、氨(纯氨或盐形成)、硝酸、或硝酸盐)、微量元素，任选地用于维持pH的缓冲剂和磷酸盐(磷源；可以使用其他磷酸盐)。
在一个特定的实例中，适合于培养产油酵母菌株的培养基是YPD培养基。这种培养基适合于无菌培养，并且可以通过添加10g细菌培养用酵母、20g细菌培养用蛋白胨和40g葡萄糖至蒸馏水中制备1L体积的培养基(pH约6.8)。对于1.5％琼脂培养基，可以将15g琼脂添加至1L的这种溶液。将溶液盖好并高压灭菌，并且然后在使用之前贮存在冷藏温度。已经描述了用于培养和增殖产油酵母菌株以产生高脂质水平作为干重百分比的其他方法(参见例如Li等人，Enzyme and Microbial Technology(2007)41：312-317(显示了使用补料分批发酵将圆红冬孢酵母培养至含有67.5％w/w脂质))。典型地可以通过增加发酵时间长度同时在氮限制情况下提供过量碳源而在产油酵母中产生高脂质/油含量。
固体和液体生长培养基通常可以从多种来源获得，并且可以找到制备适合于多种产油酵母菌株的特定培养基的说明书，例如在www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ_Medium186.pdf在线获得。
[0176]可以通过咨询上文鉴定的URL或通过咨询保持产油酵母培养物的其他机构而容易的确定用于在此所述的方法中的其他适合的培养基，这些结构例如是奥地利生物资源和应用真菌学中心世界真菌培养物保藏中心(Fungal CultureCollections of The World Austrian Center of Biological Resources and AppliedMycology)(www.biotec.boku.ac.at/acbr.html)；生物医学真菌和酵母保藏中心(The Biomedical Fungi and Yeasts Collection)(bccm.belspo.be/about/ihem.php)；捷克微生物保藏中心(Czech Collection of Microorganisms)(sci.muni.cz/ccm/index.html)；巴斯德研究所(Institut Pasteur)(www.pasteur.fr/ip/easysite/go/03b-000011-08h/)；德国微生物和细胞培养物保藏中心(www.dsmz.de/)；Mychoteca Univesitatis Taurinenesis(web086.unito.it/cgi-bin/bioveg/documenti.pl/Show？_id＝b522)；日本物理化学研究所(Riken)日本生物资源微生物保藏中心(Riken Bioresource Center JapanCollection of Microorganisms)(www.jcm.riken.jp/JCM/announce.shtml)；国家酵母培养物保藏中心(he National Collection of Yeast Cultures)(www.ncyc.co.uk/)；ATCC(www.atcc.org/)；Phaff酵母培养物保藏中心(PhaffYeast Culture Collection)(www.phaffcollection.org/)。
根据在此所述的方法使用的产油酵母发现于世界各处的各个地点和环境。由于它们与其他种类隔离和因此产生的它们的进化趋异，可能难以或不可能预测用于最佳培养和从任何特定的微生物种类中产生油和/或脂质和/或蛋白质的特定生长培养基，但是就在此的披露内容而言，本领域技术人员可以通过常规测试而容易地找到适当的培养基。在一些情况下，微生物的某些菌株可能在特定生长培养上不能生长，原因在于存在某种抑制性组分或不存在特定微生物菌株需要的某种必需营养需求。以下实例提供了培养多个产油酵母种类以积累作为干细胞重量百分比的高水平脂质的示例性方法。
固定碳源是培养基的关键组分。用于在此所述的方法的适合固定碳源例如包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、N-乙酰葡糖胺、甘油、葡糖醛酸、棉子糖、水苏糖、和/或乙酸盐。上文的小节3(培养基)含有关于适合的碳源的更详细讨论。
可以调节工艺条件来增加作为脂质(油)的细胞重量百分比。例如，在某些实施方案中，在一种或多种营养素(例如像，氮、磷酸盐、和某些金属离子)的限制性浓度存在同时提供过量的固定碳源(如葡萄糖)的情况下培养产油酵母。氮限制倾向于增加微生物脂质产量，超过其中过量提供氮的培养物中的微生物脂质产量。在特定的实施方案中，脂质产量的增加是至少大约10％、50％、100％、200％、或500％。可以将微生物在限制量的营养素存在的情况下培养持续总培养期的一部分或持续整个时期。在一些实施方案中，在总培养期期间，营养素浓度在限制性浓度与非限制性浓度之间循环至少2次。
在稳定生长状态下，细胞积累油(脂质)但是不经历细胞分裂。在本发明的一个实施方案中，通过继续向细胞提供初始生长培养基的所有组分(除了固定氮源之外)来维持生长状态。通过供应最初提供给细胞的所有营养素(除了固定氮源之外)培养产油酵母，如通过供养细胞持续延长的时间段，导致按干细胞重量计更高百分比的脂质。
在其他实施方案中，在所有固定氮已经消耗之后，通过向细胞供应固定碳源持续延长的时间段(如至少1周或2周)而产生高脂质生物质。在一些实施方案中，允许细胞在存在固定碳源和没有固定氮源的情况下积累油超过10天、超过15天、或超过20天。使用在此所述或另外地本领域已知的条件所培养的产油酵母可以包含按干重计至少大约20％脂质，并且经常包含按干重计35％、45％、55％、65％、和甚至75％或更多的脂质。因此，可以通过维持细胞处于其中它们消耗碳并积累油但是不经历细胞分裂的生长状态而提高在微生物脂质生产中作为脂质的干细胞重量的百分比。
其中氮过量存在的条件倾向于增加微生物蛋白质产量，超过其中不过量提供氮的培养物中的微生物油产量。用于产油酵母的适合的氮源可以来自有机氮源和/或无机氮源。
有机氮源的非限制性实例是酵母提取物、蛋白胨、玉米浆、和玉米浆粉。优选的无机氮源的非限制性实例例如包括并且不限于(NH4)2SO4和NH4。在一个实施方案中，用于实施本发明的培养基仅含有无机氮源。在另一个实施方案中，用于实施本发明的培养基仅含有有机氮源。在又另一个实施方案中，用于实施本发明的培养基含有有机氮氮和无机氮源的混合物。
一个用来培养产油酵母的培养基制品的实例包含：7g/L KH2PO4；2g/LNa2HPO4；1.5g/L MgSO4·7H2O；1.5g/L酵母提取物；0.2g/L CaCl2·6H2O；0.1g/LFeCl3·6H2O；0.001g/L生物素和0.001g/L ZnSO4·7H2O，用HCL调节至5.5的pH水平、和12g/L葡萄糖及作为氮源的30g/L NH4Cl。用来培养产油酵母的另一种培养基包含：20g/L葡萄糖；0.5g/L酵母提取物；5g/L(NH4)2SO4；和1g/LKH2PO4；0.5g/L MgSO4·7H2O。一种用于发酵罐中培养产油酵母的培养基制品由30g/L葡萄糖；20g/L木糖；2g/L(NH4)2SO4；1g/L KH2PO4和0.5g/L MgSO4·7H2O组成。
在在此所述的方法中，生物反应器或发酵罐用来培养产油酵母细胞经过其生理周期的多个阶段。作为实例，将产生脂质的产油酵母细胞的接种物导入培养基中；在细胞开始增殖之前存在延迟期(延滞期)。在延迟期后，增殖速率稳定增加并且进入对数期或指数期。指数期之后转而是增殖减慢，这是由于营养素(如氮)减少、有毒物质增加、以及群体感应机制的缘故。在这种减慢之后，增殖停止，并且细胞进入静止阶段或稳定生长状态，这取决于提供给细胞的特定环境。为了获得富含脂质的生物质，典型地正好在指数期结束之后收获培养物，可以通过允许氮或另一种关键营养素(除了碳之外)变得耗尽，从而迫使细胞将过量存在的碳源转化成脂质而提前终止该阶段。可以操纵培养条件参数来优化总油生产量、所产生的脂肪酸种类的组合、和/或特定油的产生。
为了产生高脂质产油酵母，细胞优选地在液体(如在作为实例的悬浮培养物中)中大量发酵。生物反应器(如钢发酵罐)可以容纳十分大的培养体积(在本发明的多种实施方案中使用5000升、10,000升、80,000升和更大体积的生物反应器)。生物反应器典型地也允许控制培养条件如温度、pH、氧张力、和二氧化碳水平。例如，生物反应器典型地是可配置的，例如，使用与管路连接的端口以允许气体组分(如氧或氮)鼓泡穿过液体培养物。
生物反应器可以配置成使培养基在产油酵母繁殖和数目增加的时间段期间流遍生物反应器。在一些实施方案中，例如，可以将培养基在接种之后但在细胞达到所希望的密度之前输注到生物反应器中。在其他情况下，在培养开始时，将生物反应器以培养基充盈，并且在培养物接种之后不再输注培养基。换言之，将产油酵母生物质在含水培养基中培养一段时间，在此期间，酵母繁殖并且数目增加；然而，含水培养基的量在贯穿这段时间期间并不流遍生物反应器。因此在一些实施方案中，在接种之后，含水培养基不流遍生物反应器。
配备多种装置(如旋转叶片和叶轮、摆动机构、搅拌棒、加压气体输注装置)的生物反应器可以用来混合产油酵母培养物。混合可以是连续或间歇的。如上文简要提到的，生物反应器经常配备各种端口，这些端口例如允许操纵培养物的气体含量。为了举例说明，生物反应器的部分体积可以是气体，而不是液体，并且生物反应器的气体入口允许将气体泵送入生物反应器。可以被有益地泵送入生物反应器的气体包括空气、空气/CO2混合物、稀有气体(如氩气)、和其他气体。生物反应器典型地被配备为使得用户能够控制气体进入生物反应器的速率。如上文指出，增加进入生物反应器的气体流量可以用来增进培养物的混合。
增加的气体流量也影响培养物的浊度。可以通过安置气体进口低于含水培养基液位实现紊流，从而进入生物反应器的气体鼓泡至培养物表面。一个或多个气体出口允许气体逃逸，从而防止生物反应器中的压力累积。优选地，气体出口通向防止污染微生物进入生物反应器的“单向”阀门。
在此所述的生物反应器、培养条件和异养生长与增殖方法的具体实例可以按任何适合的方式组合以改善微生物生长和脂质和/或蛋白质产生的效率。
根据上文所述的方法产生的产油酵母培养物在发酵培养基中产生产油酵母生物质。为了制备这种生物质以及为了制备微藻或其他微生物生物质以便提取油，典型地将生物质浓缩或从发酵培养基中收获。在从发酵培养基中收获产油酵母生物质时，生物质主要包含悬浮于含水培养基中的完整细胞。为了浓缩生物质，可以进行脱水步骤。脱水或浓缩指将生物质与发酵液或其他液体培养基分离并且因此固-液分离。因此，在脱水过程中，将培养基从生物质移除(例如，通过保留生物质的过滤器排出发酵液)，或以别的方式将生物质从培养基移除。用于脱水的常见工艺包括离心、过滤和使用机械压力。这些工艺可以单独地或以任何组合使用。
离心涉及使用离心力来分离混合物。在离心过程中，混合物的更致密组分迁移离开离心机的轴，而混合物的较不致密组分向轴迁移。通过增加有效重力(即，通过增加离心速度)，更致密的物质(如固体)与较不致密的物质(如液体)分离，并且因此根据密度分离出来。对生物质和液体培养基或其他水溶液的离心形成包含产油酵母细胞的浓缩膏。离心并不去除显著量的细胞内水。事实上，在离心之后，在生物质中可以仍然存在大量的表面水分或自由水分(例如，高达70％)，因此离心不视为干燥步骤。
过滤也可以用于脱水。适合于在此所述的方法的一个过滤实例是切向流过滤(TFF)，也称作错流过滤。切向流过滤是使用膜系统和流动力从液体分离固体的分离技术。对于说明性的适合的过滤方法，参见Geresh，Carb.Polym.50；183-189(2002)，其描述MaxCell A/G Technologies0.45uM中空纤维滤器的用途。还参见例如，
Figure BDA00003138838400511
装置，与100kD膜、300kD膜、1000kD膜(目录号P2C01MC01)、0.1μM膜(目录号P2VVPPV01)、0.22μM膜(目录号P2GVPPV01)、以及0.45μM膜(目录号P2HVMPV01)一起使用。渗余物优选地不以显著的水平通过过滤器，并且在渗余物中的产物优选地不粘附于过滤材料。也可以使用中空纤维过滤系统进行TFF。具有至少大约0.1微米例如大约0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.45或至少大约0.65微米孔径的过滤器是适合的。TFF的优选孔径允许发酵液中的溶质和碎片流过，但是不允许微生物细胞流过。
也可以用直接施加至生物质以将液体发酵液从微生物生物质分离的机械压力实现脱水，其中所述机械压力足以使生物质脱水，但不足以造成大量细胞溶解。可以使用例如带式压滤机施加使微生物生物质脱水的机械压力。带式压滤机是一种施加机械压力至浆料(例如，从发酵罐或生物反应器取得的微生物生物质)的脱水装置，其中所述浆料在通过盘旋的直径渐减的滚筒的两条张紧带之间穿过。带式压滤机实际上可以分成3个区带：重力区带，其中通过重力经多孔滤带排出引流的自由水/液体；楔形区带，其中准备好固形物用于施加压力；和压力区带，其中将可调节的压力施加于重力排出的固形物。
在浓缩之后，如在下文所述那样加工产油酵母生物质，以便将它准备用于油提取。
已经使用不同的培养方法(包括本领域已知的方法)产生按干重计具有高百分比油/脂质积累的产油酵母生物质。具有更高百分比的积累油/脂质的产油酵母用于在此所述的方法中。显示假丝酵母107能够在限氮条件下积累高达40％的脂质wt/wt(Gill等人，Appl and Environ Microbiology(1977)第231-239页)。Li等人证明了以补料分批培养产生脂质含量为48％w/w的圆红冬孢酵母44(Li等人，Enzyme and Microbial Technology(2007)41：312-317)。已经显示使用动物脂肪(硬脂)作为碳源时，解脂耶罗威亚酵母能够产生每克生物质0.44-0.54g之间的脂质(Panpanikolaou等人，A4ppl Microbiol Biotechnol(2002)58：308-312)。
通过在此所述的培养方法产生和根据在此所述的方法使用的生物质包含按干重计至少10％的油。在一些实施方案中，这种生物质包含按干重计至少25％、至少50％、至少55％或至少60％的油。在一些实施方案中，这种生物质含有按干重计10％-90％的油、25％-75％的油、40％-75％的油、或50-70％的油。
在此所述的或从用于在此所述的方法和组合物中的生物质中提取的生物质油可以包含具有一条或多条不同脂肪酸酯侧链的甘油。甘油脂是由与一个、二个或三个脂肪酸分子酯化的甘油分子组成，所述脂肪酸分子可以具有不同的长度并且具有不同的饱和度。如上文指出，也可以通过组合来自至少两个不同产油酵母种类(或产油酵母菌株和另一种产油微生物)的生物质或油而操纵油的组成，即，甘油脂的脂肪酸组分的特性和比例。在一些实施方案中，至少两个不同的微生物种类具有不同的甘油脂谱。不同的微生物种类可以如在此所述那样一起或分开培养，优选地在异养条件下培养，以便产生对应的油。不同的微生物种类可以在细胞的甘油脂中含有不同百分比的不同脂肪酸组分。
已经对解脂耶罗威亚酵母进行基因工程化。本发明的一个实施方案使用含有脂质修饰酶的解脂耶罗威亚酵母工程化菌株来制造适合用作润滑剂和介电流体的油。工程化耶罗维亚酵母(Yarrowia)的实例描述于美国专利号7,465,565和7,273,746以及美国专利申请系列号10/840579、11/613420、11/714377和11/264737中。
III.基因工程方法和材料
可以使用重组微藻或其他重组产油微生物实施在此所述的方法。这个部分描述了用于基因修饰产油微生物(如微藻，特别地举例说明无绿藻细胞)的方法和材料，以便产生用于在此所述的方法中的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包括但不限于重组Prototheca moriformis、祖菲无绿藻(Prototheca zopfii)、Protothecakrugani、和雍滞无绿藻宿主细胞。为了方便读者，将这些方法和材料的描述内容分成多个小节。在小节1中，描述了转化方法。在小节2中，描述了使用同源重组的基因工程方法。在小节3中，描述了表达载体和组件。
1.工程化方法-转化
可以通过任何适合的技术转化细胞，所述技术例如包括生物射弹(biolistics)、电穿孔(参见Maruyama等人(2004)，Biotechnology Techniques8：821-826)、玻璃珠转化(glass bead transformation)和碳化硅晶须转化(siliconcarbide whisker transformation)。另一种可以使用的方法涉及形成原生质体和使用CaCl2和聚乙二醇(PEG)以将重组DNA导入微藻或其他微生物细胞中(参见Kim等人(2002)，Mar.Biotechnol.4：63-73，其报道了这种椭圆小球藻(Chorellaellipsoidea)转化方法的用途)。微藻的共转化可以用来将两种不同的载体分子同时导入细胞中(参见例如Protist2004Dec；155(4)：381-93)。
生物射弹法(参见例如，Sanford，Trends In Biotech.(1988)6：299302，美国专利号4,945,050)；电穿孔(Fromm等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)(1985)82：58245828)、使用激光束、显微注射或能够将DNA导入微藻中的任何其他方法也可以用于转化产油微生物，如无绿藻细胞。
2.工程化方法-同源重组
同源重组涉及互补DNA序列对齐和交换同源区的能力。在同源重组方法中，将含有与被靶向的基因组序列(“模板”)同源的序列的转基因DNA(“供体”)导入生物中并且然后在相应的基因组同源序列的位点处经历重组到基因组中。在大多数情况下，这种方法的机械步骤(mechanistic steps)包括：(1)同源DNA片段配对；(2)将双链断裂导入供体DNA分子中；(3)模板DNA分子通过游离供体DNA末端侵入，接着是DNA合成；和(4)解析产生最终重组产物的双链断裂修复事件。
对于在分子遗传水平可以完成的事项而言，在宿主生物中实施同源重组的能力具有许多实际意义，并且在生成能够产生定制油(脂质)的产油微生物中是有用的。就其本质而言，同源重组是一个精确的基因打靶事件；因此，用相同的导向序列产生的大部分转基因系就表型而言将是基本上相同的，从而迫使筛选少得多的转化事件。同源重组还将基因插入事件靶向到宿主染色体中，从而产生优良的遗传稳定性，甚至在没有遗传选择的情况下也是如此。由于不同的染色体基因座可以影响基因表达，甚至从异源启动子/UTR，同源重组可以是一种在陌生基因组环境中查找基因座并评定特定基因组环境对基因表达影响的方法。
特别有用的基因工程应用利用同源重组co-opt特异性宿主调节元件如启动子/UTR以高度特异性方式驱动异源基因表达。例如，用编码选择性标记的异源基因消融或敲除去饱和酶基因/基因家族可以用来增加宿主细胞中产生的饱和脂肪酸的总百分比。实例4描述了同源重组靶向构建体和在Prototheca moriformis中产生的这类去饱和酶基因消融(敲除)的工作实例。减少内源基因表达的另一种方法是使用RNA诱导的基因表达下调或沉默方法，包括但不限于RNAi或反义方法、以及dsRNA方法。反义法、RNAi法、dsRNA法、和发夹RNA法是本领域熟知的并且包括导入当表达为mRNA时导致发夹RNA形成的表达构建体或含有靶基因的一部分的表达构建体，其中所述部分以反义方向转录。这些方法均导致减少的靶基因表达。实例4还描述了通过发夹RNA方法下调内源性Prototheca morriformisΔ12去饱和酶基因(FADc)的表达构建体和工作实例。
由于同源重组是一个精确的基因打靶事件，它可以用来精确地修饰在感兴趣的基因或区域内的任何核苷酸，只要已经鉴定足够的侧翼区即可。因此，可以使用同源重组作为修饰影响RNA和/或蛋白质的基因表达的调节序列的手段。它还可以用来修饰蛋白质编码区以调节酶活性如底物特异性、亲和力、和Km，从而实现所希望的宿主细胞代谢变化。同源重组提供了强有力的操纵宿主基因组的手段，导致基因打靶、基因转换、基因缺失、基因重复、和基因倒位并且导致基因表达调节元件如启动子、增强子和3′UTR的交换。
可以使用靶向构建体实现同源重组，所述靶向构建体含有“靶向”宿主细胞内源基因组内的感兴趣的基因或区域的内源序列片段。这样的靶向序列可以位于感兴趣的基因或区域5′、感兴趣的基因/区域3′或甚至位于感兴趣的基因/区域的侧翼。可以将这样的靶向构建体作为具有另外的载体骨架的超螺旋质粒DNA、不具有载体骨架的PCR产物或作为线性化分子转化到宿主细胞中。在一些情况下，可能有利的是，首先用限制性酶暴露转基因DNA(供体DNA)内部的同源序列。这个步骤可以增加重组效率并且减少不希望的事件的发生。增加重组效率的其他方法包括使用PCR产生转化用转基因DNA，其含有与正在被靶向的基因组序列同源的线性末端。
出于非限制性说明的目的，用于同源重组的供体DNA序列的区域包括在Prototheca moriformis中的DNA的KE858区域。KE858是一个1.3kb的基因组片段，它包含蛋白质的编码区的一部分，其中所述蛋白质与转移RNA(tRNA)蛋白质家族共享同源性。Southem印迹已经显示KE858序列在Protothecamoriformis(UTEX1435)基因组中以单拷贝存在。已经在PCT申请号PCT/US2009/66142中描述了这个区域和使用这个区域进行同源重组打靶的实例。另一种有用的供体DNA区域是6S基因组序列。
3.载体和载体组件
就在此的披露内容而言，可以通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备用于转化微生物的载体。载体典型地含有一个或多个基因，其中每种基因指令所希望的产物(基因产物)的表达并与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列调节基因表达或将该基因产物靶向到重组细胞中的特定位置。为了方便读者，将这个小节分成多个小节。小节A描述了可以包含在载体上的控制序列。小节B描述了典型地包含在载体中的基因以及密码子优化方法和使用它们所制备的基因。
A.控制序列
控制序列是调节编码序列表达或指导基因产物至细胞内或细胞外特定位置的核酸。调节表达的控制序列例如包括调节编码序列转录的启动子和终止编码序列转录的终止子。另一个控制序列是位于编码序列末端的编码多聚腺苷化信号的3′非翻译序列。将基因产物导向至特定位置的控制序列包括编码信号肽的那些，这些信号肽将它们连接到其上的蛋白质导向至细胞内或细胞外的特定位置。
因此，用于在微藻或其他产油微生物中表达外源基因的示例性载体设计含有所希望的基因产物(例如，选择标记、脂质途径修饰酶、或蔗糖利用酶)的编码序列，该编码序列与微藻或其他产油微生物中有活性的启动子可操作地连接。可替代地，如果这种载体不合与感兴趣的编码序列可操作地连接的启动子，则可以将该编码序列转化到细胞中，使得它在载体整合时变成与内源启动子可操作地连接。已经证明无启动子的转化方法在微藻(参见例如Plant Journal14：4，(1998)，第441-447页)和其他微生物中有效。
许多启动子在微藻中有活性，包括相对于正在转化的藻类为内源的启动子，以及相对于正在转化的藻类不是内源的启动子(即，来自其他藻类的启动子、来自高等植物的启动子、以及来自植物病毒或藻类病毒的启动子)。PCT公开号2008/151149和其中引用的参考文献中描述了在微藻中有活性的说明性外源和/或内源启动子(以及在微藻中有功能的抗生素抗性基因)。
用来表达外源基因的启动子可以是与这个基因天然连接的启动子或可以是异源基因启动子。一些启动子在一个以上的微藻种类中是有活性的。其他启动子是种类特异性的。说明性的启动子包括在下文实例中使用的启动子，如来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhard)β-微管蛋白的启动子，和已经显示在多个微藻种类中有活性的病毒启动子，如源自花椰菜花叶病毒(CMV)和小球藻病毒的启动子(参见例如Plant Cell Rep.2005Mar；23(10-11)：727-35；J Microbiol.2005Aug；43(4)：361-5；Mar Biotechnol(NY).2002Jan；4(1)：63-73)。适用于在无绿藻中表达外源基因的另一种启动子是异养小球藻(Chlorella sorokiniana)谷氨酸脱氢酶启动子/5′UTR。典型地，使用含有启动子的这些序列的至少10、20、30、40、50、或60个或更多个核苷酸。在本中请的序列表中列出了用于无绿藻中表达外源基因的说明性启动子，如小球藻HUP1基因的启动子(SEQ ID NO：1)和椭圆小球藻硝酸盐还原酶启动子(SEQ ID NO：2)。小球藻病毒启动子也可以用来在无绿藻中表达基因，如美国专利6,395,965的SEQ ID NOs：1-7。另外的在无绿藻中有活性的启动子可以例如在Biochem Biophys Res Commun.1994Oct14；204(1)：187-94；Plant Mol Biol.1994Oct；26(1)：85-93；Virology.2004Aug15；326(1)：150-9；和Virology.2004Jan5；318(1)：214-23中找到。
启动子通常可以表征为组成型或诱导型。组成型启动子通常具有在所有时间(或在细胞生活周期中的某些时间)以相同水平驱动表达的活性或功能。相反，诱导型启动子仅仅在响应于刺激时有活性(或变得无活性)或显著上调或下调。两种类型的启动子均用于在此所述的方法中。用于在此所述的方法中的诱导型启动子包括这些启动子，它们介导可操作地连接的基因向应于刺激(如外源提供的小分子(例如，葡萄糖，如在SEQ ID NO：1中)、温度(热或冷)、培养基中氮的缺乏，等等)的转录。适合的启动子可以激活基本上沉默的基因的转录或上调、优选地显著上调以低水平转录的可操作地连接的基因的转录。
包含终止区控制序列是任选的，并且如果使用，则选择主要在于方便，因为终止区是相对可互换的。终止区可以相对于转录起始区(启动子)是天然的，可以相对于感兴趣的DNA序列是天然的，或可以是从另一个来源可获得的。参见例如，Chen和Orozco，Nucleic Acids Res.(1988)16：8411。
在此所述的方法也可以利用载体，这些载体含有提供感兴趣的基因的区室化表达的控制序列和重组基因。靶向的细胞器是叶绿体、质体、线粒体、和内质网。另外，在此所述的方法还可以利用在此所述的控制序列和重组基因以及含有它们的载体，它们被提供为蛋白质在细胞外部分泌。
可以使用质体靶向信号，将无绿藻的核基因组中表达的蛋白质靶向到质体。相对于小球藻为内源的质体靶向序列是已知的，如在小球藻核基因组中编码被靶向至质体的蛋白质的基因；参见例如GenBank登录号AY646197和AF499684，并且在一个实施方案中，含有这样的控制序列的载体在在此所述的方法中用来将蛋白质表达靶向到无绿藻质体。
以下实例描述藻质体靶向序列将异源蛋白质靶向到宿主细胞中的正确区室的用途。使用Prototheca moriformis和原始小球藻细胞产生cDNA文库，并且在PCT申请号PCT/US2009/066142中描述了这些文库。
在另一个实施方案中，将在无绿藻或另一种产油微生物中的多肽的表达靶向到内质网。在表达载体中包含适当的滞留或分选信号确保蛋白质留在内质网(ER)中并且不顺流进入高尔基体。例如，来自Wageningen UR-Plant ResearchInternational的IMPACTVECTOR1.3载体包含熟知的KDEL滞留或分选信号。用这种载体，ER滞留具有实用优点，在于已经报道它提高表达水平5倍或更多。这种现象的主要原因似乎是相比于在细胞质中存在的负责表达的蛋白质的翻译后降解的蛋白酶，ER含有较低浓度和/或不同的蛋白酶。在绿色微藻中有功能的ER滞留信号是已知的。例如，参见Proc Natl Acad Sci U S A.2005Apr26；102(17)：6225-30。
在本发明的另一个实施方案中，将在细胞外部分泌的多肽靶向到培养基中。对于在小球藻中有活性的也可以在其他微藻(如无绿藻)中使用的分泌信号的实例参见Hawkins等人，Current Microbiology第38卷(1999)，第335-341页。
B.基因和密码子优化
典型地，基因包括启动子、编码序列、和终止控制序列。当通过重组DNA技术装配时，基因可以称作表达盒并且可以在侧翼具有方便插入载体中的限制性位点，所述载体被用来将重组基因导入宿主细胞中。这个表达盒可以在侧翼具有来自基因组或其他核酸靶的DNA序列，以便促进表达盒通过同源重组稳定整合到基因组中。可替代地，载体及其表达盒可以保持未整合，在这种情况下，载体典型地包含能够提供异源载体DNA复制的复制起点。
在载体上存在的常见基因是编码蛋白质的基因，所述蛋白质的表达允许含有这种蛋白质的重组细胞区别于不表达这种蛋白质的细胞。这种基因或其相应的基因产物称作选择标记。可以在用于转化在此所述的方法中有用的无绿藻或任何其他产油微生物的转基因构建体中使用多种选择标记的任一种。适合的选择标记的实例包括G418抗性基因、硝酸盐还原酶基因(参见Dawson等人(1997)，CurrentMicrobiology35：356-362)、潮霉素磷酸转移酶基因(HPT；参见Kim等人(2002)，Mar.Biotechnol.4：63-73)、新霉素磷酸转移酶基因和赋予腐草霉素抗性的ble基因(Huang等人(2007)，Appl.Microbiol.Biotechnol.72：197-205)。确定微藻和其他产油微生物对抗生素敏感性的方法是熟知的。例如，参见Mol Gen Genet.1996Oct16；252(5)：572-9。
不是基于抗生素的其他选择标记也可以在用于转化微藻(通常，包括无绿藻种类)的转基因构建体中使用。也可以使用赋予利用某些碳源的能力的基因作为选择标记，所述碳源以前是不能由该微藻利用的。以实例说明，Protothecamoriformis株典型地在蔗糖上不良地生长(如果生长的话)。使用含有蔗糖转化酶基因的构建体可以赋予阳性转化子在作为底物的蔗糖上生长的能力。
为了在此所述的方法的某些实施方案的目的，用来制备重组宿主细胞的表达载体将包括至少2个和经常3个基因，如果这些基因之一是选择标记的话。例如，可以通过用载体转化产生基因工程无绿藻，其中除了选择标记之外，所述载体还包一个或多个外源基因，例如像，蔗糖转化酶基因或酰基ACP-硫酯酶基因。一个或两个基因可以使用诱导型启动子表达，这允许控制这些基因表达的相对定时以增强脂质生产和转化成脂肪酸酯。两个或更多个外源基因的表达可以在相同的诱导型启动子控制之下或者在不同的诱导型(或组成型)启动子控制之下。在后一种情况下，可以诱导第一外源基因表达持续第一时间段(在此期间，可以诱导或可以不诱导第二外源基因的表达)，并且可以诱导第二外源基因表达持续第二时间段(在此期间，可以诱导或可以不诱导第一外源基因的表达)。
在其他实施方案中，两个或更多个外源基因(除了任何选择标记之外)是脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基辅酶A/醛还原酶，它们的组合作用产生醇产物。进一步提供的是外源基因的其他组合，包括而不限于，脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂脂肪酰基辅酶A还原酶，以产生醛。在一个实施方案中，载体提供脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂脂肪酰基辅酶A还原酶和脂肪醛脱羧酶的组合以产生链烷。在这些实施方案的每一个中，可以使用诱导型启动子表达一个或多个外源基因。
表达两个或更多个外源基因的其他说明性载体包含编码蔗糖转运蛋白和蔗糖转化酶两者的那些载体以及编码选择标记和分泌型蔗糖转化酶的那些载体。由于使用甘蔗(和甘蔗衍生糖)作为碳源的工程化能力，用任一类型载体转化的重组无绿藻或其他微藻或微生物细胞以较低的制造成本产生脂质。上文描述的两种外源基因的插入可以与通过定向和/或随机诱变破坏多糖生物合成相组合，这甚至使更多的碳流转向进入脂质生产。单独和组合地，营养型转换、改变脂质产生的工程化、以及用外源酶处理改变了由微生物产生的脂质组成。这种改变可以是以下方面的变化：所产生脂质的量、所产生的一种或多种脂质(脂肪酸)种类相对于其他脂质种类的量、和/或在微生物中产生的脂质种类的类型。例如，可以将微藻工程化以产生更高量和/或百分比的TAG。
为了最佳表达重组蛋白，采用这样的编码序列是有益的：这些编码序列用优选被有待转化的宿主细胞使用的密码子产生mRNA。因此，转基因的正确表达可能需要转基因的密码子使用匹配于其中正在表达这种转基因的生物的特定密码子偏倚。作为这种作用基础的精确机制是多样的，但是包括将可获得的氨基酰tRNA池与细胞中正在合成的蛋白质正确平衡，当满足这种需要时，这伴随转基因信使RNA(mRNA)的更高效翻译。当转基因中的密码子使用时未优化时，可获得的tRNA池并不足以允许异源mRNA的高效翻译，从而导致核糖体失速和终止以及转基因mRNA可能不稳定。
在此描述了用于在无绿藻中成功表达重组蛋白的密码子优化的核酸。通过研究从Prototheca moriformis分离的cDNA序列分析了无绿藻种类中的密码子使用。这项分析代表对超过24,000个密码子的查询，并且在下表4中显示结果。
表4.在无绿藻株中优选的密码子使用
Figure BDA00003138838400621
Figure BDA00003138838400631
在其他实施方案中，参考除了无绿藻株或另一个微生物株之外的微藻株，已经将重组载体中的基因进行密码子优化。例如，在美国专利号7,135,290中描述了再编码用于在微藻中表达的基因的方法。另外的用于密码子优化的信息是可获得的，例如，在GenBank的密码子使用数据库处获得。
虽然在此所述的方法和材料允许将任何外源基因导入无绿藻或其他微藻或其他产油微生物中，对于不能天然利用蔗糖的微生物或低效率利用蔗糖的微生物，涉及蔗糖利用和脂质途径修饰的基因是特别感兴趣的，如以下部分中所讨论的。
IV.蔗糖利用
在实施方案中，重组无绿藻或其他微藻或其他微生物细胞含有一个或多个外源蔗糖利用基因。在各种实施方案中，一个或多个基因编码选自下组的一种或多种蛋白质，该组由以下各项组成：果糖激酶、葡萄糖激酶、己糖激酶、蔗糖转化酶、蔗糖转运蛋白。例如，蔗糖转运蛋白和蔗糖转化酶的表达允许无绿藻或任何其他微藻或其他微生物细胞将蔗糖从培养基转运至细胞中并且水解蔗糖以产生葡萄糖和果糖。任选地，在内源性己糖激酶活性不足以导致果糖最大磷酸化的情况下，也可以表达果糖激酶。适合的蔗糖转运蛋白的实例是Genbank登录号CAD91334、CAB92307、和CAA53390。适合的果糖激酶的实例是Genbank登录号P26984、P26420和CAA43322。
在一个实施方案中，用分泌蔗糖转化酶的无绿藻宿主细胞实施在此所述的方法。蔗糖转化酶的分泌避免需要表达可以将蔗糖转运至细胞中的转运蛋白。这是因为分泌型转化酶催化一分子蔗糖转化成一分子葡萄糖和一分子果糖，二者均可以被用于在此所述的方法中的微生物转运和利用。例如，带有分泌信号(如SEQ ID NO：4的分泌信号(来自酵母)、SEQ ID NO：5(来自高等植物)、SEQ IDNO：6(真核共有分泌信号)和SEQ ID NO：7(来自高等植物和真核共有信号序列的组合)的蔗糖转化酶(如SEQ ID NO：3)的表达在细胞外产生转化酶活性。这种蛋白质的表达(如通过在此披露的基因工程方法学能够实现)允许已经能够利用细胞外葡萄糖作为能源的细胞利用蔗糖作为细胞外能源。
表达转化酶的无绿藻种类是用于生产用作介电流体或其他润滑剂的微生物油的优选微藻种类(对于生产食用油，一些消费者可能偏好使用非重组微生物产生的油)，其中所述转化酶被分泌至含有蔗糖的培养基中。这种充分有活性的蛋白质的表达及其细胞外靶向允许所得到的宿主细胞在蔗糖上生长，而它们未转化的对应物则不能。因此，在此所述的方法的实施可以利用具有密码子优化的转化酶基因(包括但不限于酵母转化酶基因)整合于其基因组中的无绿藻重组细胞，使得这种转化酶基因被表达为通过转化酶活性和蔗糖水解进行评定。将转化酶基因用作无绿藻和其他微藻重组细胞中的选择标记，因为这类细胞能够在蔗糖上生长，而它们未转化的对应物则不能；并且使用转化酶选择重组宿主细胞的方法是藻类分子遗传学的强有力选择标记。
蔗糖转化酶在无绿藻中的成功表达也表明，异源(重组)蛋白可以在藻细胞中表达并且成功地以完全活性和功能性形式运送至细胞外并且进入培养基。因此，在微藻中表达广泛和多样类型的异源蛋白质并且将它们分泌于宿主细胞外部的方法和试剂是可获得的。这种蛋白质例如包括工业用酶，例如像，脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶、乳糖酶、异构酶、以及转化酶。
适合的蔗糖转化酶的实例包括Genbank登录号CAB95010、NP_012104和CAA06839鉴定的那些。下文表5中列出了适合的转化酶的非限制性实例。下文序列表中包括每种列出的转化酶的氨基酸序列。在一些情况下，适合用于在此所述的方法和载体中的外源蔗糖利用基因编码与选自表5的蔗糖转化酶具有至少40％、50％、60％、75％、或90％或更高的氨基酸一致性的蔗糖转化酶。
表5.蔗糖转化酶
Figure BDA00003138838400661
转化酶由无绿藻分泌至培养基也能够使细胞在来自甘蔗加工的废弃糖蜜上生长，如同它们在纯试剂级的葡萄糖上生长那样；这种低价值的甘蔗加工废弃产物的使用可以在脂质和其他油的生产中提供显著的成本节省。因此，在此所述的方法可以涉及使用含有无绿藻或其他微藻微生物群体的微生物培养物，以及包含(i)蔗糖和(ii)蔗糖转化酶的培养基。在各种实施方案中，培养物中的蔗糖来自高粱、甜菜、甘蔗、糖蜜、或解聚的纤维素材料(它可以任选地含有木质素)。虽然此处例举的微生物被改变使得它们可以利用蔗糖，可以应用在此所述的方法和试剂，使得原料如纤维素材料是可以被具有分泌纤维素酶、果胶酶、异构酶等等的能力的工程化宿主微生物利用的，从而酶促反应的分解产物不再是仅仅简单地被耐受，而是被宿主用作碳源。
V.脂质途径工程化
除了改变无绿藻(或其他微藻或其他微生物细胞)利用原料如含蔗糖原料的能力之外，已经被修饰以改变所产生脂质的特性和/或比例的重组无绿藻(或其他微藻或其他微生物细胞)用于在此所述的方法中。可以进一步或可替代地修饰这个途径以改变通过酶促加工脂肪酸途径中的脂质和中间体所产生的各种脂质分子的特性和/或比例。在各种实施方案中，相对于其未转化的对应物，重组细胞具有增加或优化的每单位体积和/或每单位时间脂质产量、碳链长(例如，用于工业化学品(包括但不限于介电流体)和需要脂质原料的其他应用)、减少的双键或叁键数(任选地至零)和增加的特定脂质(脂肪酸)种类或不同脂质群体的氢∶碳比。
在特定的实施方案中，已经上调或下调控制针对脂肪酸合成的在代谢中的分支点的一种或多种关键酶来改进脂质产生。可以例如，通过用表达构建体转化细胞实现上调，其中编码感兴趣的酶的基因被表达，例如，使用增加转录的强启动子和/或增强子元件。这样的构建体可以包含选择标记，使得转化子可以经历选择，也可以用于扩增构建体并同时增加所编码的酶的表达水平。适合于根据在此所述的方法上调酶的实例包括在将丙酮酸转化成乙酰-CoA中发挥作用的丙酮酸脱氢酶(例如，一些来自微藻，包括Genbank登录号NP_415392；AAA53047；Q1XDM1和CAF05587)。丙酮酸脱氢酶的上调可以增加乙酰-CoA的产生，并且从而增加脂肪酸合成。乙酰-CoA羧化酶催化脂肪酸合成中的初始步骤。因此，可以上调这种酶以增加脂肪酸的产生(例如，一些来自微藻，包括Genbank登录号BAA94752；AAA75528；AAA81471；YP_537052；YP_536879；NP_045833和BAA57908)。也可以通过上调酰基载体蛋白(ACP)来增加脂肪酸产生，酰基载体蛋白在脂肪酸合成过程中携带正在增长的酰基链(例如，一些自微藻，包括Genbank登录号A0T0F8；P51280；NP_849041；YP_874433)。甘油-3-磷酸酰基转移酶催化脂肪酸合成的限速步骤。这种酶的上调可以增加脂肪酸产生(例如，一些来自微藻，包括Genbank登录号AAA74319；AAA33122；AAA37647；P44857；和ABO94442)。
基因的上调和/或下调可以适用于控制脂肪酸生物合成途径的基因表达的全面调节子(global regulator)。因此，在适当的情况下，可以上调或下调脂肪酸合成的一种或多种全面调节子以分别抑制或增强多个脂肪酸合成基因的表达并且最终增加脂质产生。实例包括固醇调节元件结合蛋白(SREBP)，如SREBP-1a和SREBP-1c(例如，参见Genbank登录号NP_035610和Q9WTN3)。
也可以用已经被修饰以含有一个或多个外源基因的重组无绿藻(或其他微藻或其他微生物)细胞实施在此所述的方法，其中所述外源基因编码脂质修饰酶如，例如像，脂肪酰基-ACP硫酯酶(参见表6)、脂肪酰基辅酶A/醛还原酶(参见表8)、脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪醛脱羧酶、脂肪醛还原酶、去饱和酶(如硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酰基去饱和酶)和鲨烯合酶(参见GenBank登录号AF205791)。在一些实施方案中，将编码脂肪酰基-ACP硫酯酶和天然共表达的酰基载体蛋白的基因转化到无绿藻(或其他微藻或其他微生物)细胞中，任选地连同编码其他脂质修饰酶的一个或多个基因一起转化。在其他实施方案中，ACP和脂肪酰基-ACP硫酯酶可以具有当这两种酶在在此所述的微生物和方法中一起使用时赋予优势的相互亲和力，无论它们是否在特定组织或生物中天然地共表达。因此，在某些实施方案中，本发明考虑了这些酶的天然共表达对以及共享彼此相互作用的亲和力以促进从ACP切下特定长度碳链的那些酶。
在再另外的实施方案中，将编码去饱和酶的外源基因连同编码其他脂质修饰酶的一个或多个基因一起转化到无绿藻(或其他微藻或其他微生物)细胞中，以便提供关于脂质饱和的修饰。在另一个实施方案中，内源性去饱和酶基因在无绿藻(或其他微藻或其他微生物)细胞中过表达(例如，通过导入另外的基因拷贝)。硬脂酰-ACP去饱和酶(参见，例如，GenBank登录号AAF15308；ABM45911；和AAY86086)例如催化硬脂酰-ACP转化成油酰-ACP。上调这种基因可以增加由细胞产生的单不饱和脂肪酸比例；而下调可以降低单不饱和物的比例。出于说明性目的，硬脂酰-ACP去饱和酶(SAD)负责从C18：0前体合成C18：1脂肪酸。另一个去饱和酶家族是脂肪酰基去饱和酶(FAD)，包括Δ12脂肪酸去饱和酶。这些去饱和酶也提供关于脂质饱和的修饰。出于说明性目的，Δ12脂肪酸去饱和酶负责从C18：1前体合成C18：2脂肪酸。同样，可以控制一种或多种甘油脂去饱和酶(如ω-6脂肪酸去饱和酶、ω-3脂肪酸去饱和酶或ω-6-油酸酯去饱和酶)的表达以改变不饱和脂肪酸对饱和脂肪酸的比率。在一些实施方案中，可以参考所希望的碳链长来选择去饱和酶，使得去饱和酶能够在指定碳长度的底物或具有指定范围内碳长度的底物内产生位置特异性修饰。在另一个实施方案中，如果所希望的脂肪酸谱是单不饱和物(如C16：1和/或C18：1)增加，则SAD的过表达或异源性SAD的表达可以与脂肪酰基去饱和酶(FAD)的沉默或失活(例如，通过突变、RNAi、发夹RNA、敲除内源性去饱和酶基因，等等)偶联。下文实例4描述了靶向消融或敲除硬脂酰-ACP去饱和酶和Δ12脂肪酸去饱和酶并且还描述了使用发夹RNA反义构建体来减少内源性去饱和酶基因的表达。
因此，在特定的实施方案中，本发明的微生物经基因工程化以表达选自以下的一个或多个外源基因：酰基-ACP硫酯酶、酰基辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、去饱和酶、脂肪醛脱羧酶或天然共表达的酰基载体蛋白。上文描述了适合的用于表达脂肪酶基因的表达方法，除了其他方法之外，包括诱导型表达和区室化表达。脂肪酰基-ACP硫酯酶在脂质合成过程中从酰基载体蛋白(ACP)切下脂肪酸。通过进一步酶促加工，切下的脂肪酸然后与辅酶组合以产生酰基辅酶A分子。这种酰基辅酶A是产生醛的脂肪酰基辅酶A还原酶以及产生醇的脂肪酰基辅酶A/醛还原酶的酶活性的底物。如上文通过脂肪酰基辅酶A还原酶的作用所产生的醛是产生醇的脂肪醛还原酶或产生链烷或烯的脂肪醛脱羧酶的进一步酶活性的底物。
在一些实施方案中，通过在此所述的方法产生的脂肪酸、甘油酯或相应的伯醇、醛、链烷或烯含有16或18个碳原子。用于生产介电流体的优选脂肪酸或相应的醇、醛、链烷和烯含有16-18个碳原子。在某些实施方案中，以上脂肪酸是饱和的(没有碳-碳双键或叁键)；单不饱和的(单个双键)；多不饱和的(两个或更多个双键；并且可以是直链(不是环状)或支链的或这两种类型的混合物。对于介电流体，优选单不饱和脂肪酸，尤其是油酸(C18：1)。为了增加具有所希望的链长和/或饱和度的脂质的产生，人们可以将微藻细胞工程化以便过表达具有所希望的链长特异性的硫酯酶、敲除具有较短链长特异性的硫酯酶的产生或减少这样的基因的表达、和/或敲除负责在所希望的脂质中的饱和度的去饱和酶基因。
上文所述的各种酶典型地具有用于水解含有特定碳原子数的底物的优先特异性。例如，脂肪酰基-ACP硫酯酶可以优先从ACP切下具有12个碳原子的脂肪酸。在一些实施方案中，ACP和长度特异性硫酯酶可以彼此具有亲和力，从而使它们作为组合特别有用(例如，外源ACP和硫酯酶基因可以在它们自其衍生的特定组织或生物中天然地共表达)。因此，在各种实施方案中，本发明的重组无绿藻(或其他微藻或其他微生物)细胞可以含有编码蛋白质的外源基因，所述蛋白质就底物中所含碳原子的数目而言具有用于催化酶活性(例如，从ACP切下脂肪酸、将酰基辅酶A还原成醛或醇、或将醛转化成链烷)的特异性。在各种实施方案中，酶特异性可以针对具有从8个至34个碳原子并且优选地从16个至18个碳原子的底物。
适合供在此所述的微生物和方法使用的其他脂肪酰基-ACP硫酯酶包括而不限于表6中列出的那些。
表6.脂肪酰基-ACP硫酯酶和GenBank登录号
Figure BDA00003138838400721
Figure BDA00003138838400731
基于生物油的化学品如介电流体具有源自天然酯(即，种子油)如来自向日葵油和卡诺拉油的高油酸(C18：1)的脂肪酸组成。表7显示了常见商业种子油的脂肪酸谱。下文的所有商业种子油数据均从美国药典食品和化学品代码，第7版(2010-2011)编纂。
表7.商业种子油的脂质谱
Figure BDA00003138838400732
Figure BDA00003138838400741
Figure BDA00003138838400751
适合于供在此所述的微生物和方法使用的脂肪酰基辅酶A/醛还原酶包括而不限于在表8中列出的那些。
表8.通过GenBank登录号列出的脂肪酰基辅酶A/醛还原酶
Figure BDA00003138838400761
酰基-ACP硫酯酶是高等植物(和一些微藻种类)脂肪酸生物合成的终止物，并且在大部分植物种类中，这是由FatA基因家族成员实施的，其中所述FatA基因家族成员的作用是在C16：0至C18：0阶段终止延伸。在合成较短链脂肪酸的种类(如萼距花、油棕、肉豆蔻或月桂)中，由FatB基因编码的不同组的酰基-ACP硫酯酶实施这个终止步骤。
用于在此所述的方法中的其他适合的酶包括与表6和表8中列出的蛋白质之一具有至少70％氨基酸一致性并且展现出相应的所希望的酶活性(例如，从ACP切下脂肪酸、将酰基辅酶A还原成醛或醇、或将醛转化成链烷)的那些酶。在另外的实施方案中，酶活性存在于与上述序列之一具有至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、或至少大约99％一致性的序列内，特此将所有序列通过引用进行结合。
通过选择有待表达的外源基因(或有待失活的内源基因或两者)的所希望的组合，人们可以定制由微生物产生的油，然后可以从含水生物质提取这种油。例如，微生物可以含有：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因；(ii)任选地，天然共表达的酰基载体蛋白或对脂肪酸酰基-ACP硫酯酶具有亲和力的酰基载体蛋白；(iii)突变的内源去饱和酶基因，其中所述突变使得去饱和酶基因或去饱和酶蛋白质无活性，如去饱和酶敲除；(iv)内源硬脂酰酰基载体蛋白去饱和酶过表达或异源SAD表达；和(v)前述情况的任何组合。
编码这类酶(如脂肪酰基ACP硫酯酶)的基因可以从已经已知展现出显著脂质生产的细胞如原始小球藻获得。可以将已经已知在脂质产生中发挥作用的基因，例如，编码使双键饱和的酶的基因，单独地转化到受体细胞中。在PCT公开号2008/151149中描述了用于鉴定可以改变(改进)微藻中的脂质生产的基因的方法，所述专利通过引用结合在此。
因此，在某些实施方案中，本发明的实施可以利用已经被基因工程化从而与相同种类的野生型细胞相比以改变的水平表达脂质途径酶的无绿藻或其他微藻或其他微生物细胞。在一些情况下，当两种细胞均在相同条件下生长时，与野生型细胞相比，这种细胞产生更多的脂质。在一些情况下，细胞已经被基因工程化和/或被选择为与野生型细胞相比以更高的水平表达脂质途径酶。在一些情况下，脂质途径酶选自下组，该组由以下各项组成：丙酮酸脱氢酶、乙酰-CoA羧化酶、酰基载体蛋白、以及甘油-3磷酸酰基转移酶。在一些情况下，细胞已经被基因工程化和/或被选择为与野生型细胞相比以更低的水平表达脂质途径酶。在细胞以较低水平表达脂质途径酶的一个实施方案中，脂质途径酶包括柠檬酸合酶。
在一些实施方案中，细胞已经被基因工程化和/或被选择为与野生型细胞相比以改变的水平表达脂肪酸合成的全面调节子，由此与野生型细胞相比，多个脂肪酸合成基因的表达水平被改变。在一些情况下，脂质途径酶包括修饰脂肪酸的酶。在一些情况下，脂质途径酶选自硬脂酰-ACP去饱和酶以及甘油脂去饱和酶。在一些情况下，细胞已经被基因工程化和/或被选择为表达较低水平的脂质途径酶或根本不表达特定的脂质途径酶(即，其中脂质途径酶已经被敲除或替换为外源基因)。
在其他实施方案中，本发明的实施利用含有一个或多个外源基因和/或一个或多个失活的内源基因的产油微生物，其中所述外源或内源基因编码选自下组的蛋白质，该组由以下各项组成：脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪醛脱羧酶、去饱和酶、以及酰基载体蛋白。在另一个实施方案中，内源去饱和酶基因在含有一个或多个以上外源基因的微生物中过表达。在一个实施方案中，外源基因与一个启动子可操作地连接，所述启动子是响应于刺激可诱导或可抑制的。在一些情况下，这种刺激选自下组，该组由以下各项组成：外源提供的小分子、热、冷、以及在培养基中限制氮或无氮。在一些情况下，外源基因在细胞区室表达或以别的方式被靶向到细胞区室。在一些实施方案中，细胞区室选自叶绿体、质体和线粒体。在一些实施方案中，微生物是Prototheca moriformis、Prototheca krugani、雍滞无绿藻或祖菲无绿藻。
在一个实施方案中，外源基因或失活的内源基因编码脂肪酸酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，由外源或失活的内源基因编码的硫酯酶催化从酰基载体蛋白(ACP)切下8至18碳脂肪酸。在一些情况下，由外源基因或失活的内源基因编码的硫酯酶催化从ACP切下10至14碳脂肪酸。在一个实施方案中，由外源基因或失活的内源基因编码的硫酯酶催化从ACP切下12碳脂肪酸。在一些实施方案中，由外源内源基因编码的硫酯酶催化从ACP切下16-18碳脂肪酸。
在一个实施方案中，外源基因编码脂肪酰基辅酶A/醛还原酶。在一些情况下，由外源基因编码的还原酶催化8至18碳脂肪酰基辅酶A还原成相应的伯醇。在一些情况下，由外源基因或失活的基因编码的还原酶催化10至14碳脂肪酰基辅酶A还原成相应的伯醇。在一个实施方案中，由外源基因或失活的基因编码的还原酶催化12碳脂肪酰基辅酶A还原成相应的十二醇。
在此所述的方法的实施可以利用含有两个外源基因(或两个失活的内源基因)的重组无绿藻(或其他微藻或微生物)细胞，其中第一外源基因或失活的内源基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶并且第二外源基因或失活的内源基因编码选自下组的蛋白质，该组由以下各项组成：脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪酰基辅酶A/醛还原酶、以及酰基载体蛋白。在一个实施方案中，这两个外源基因各自与一个启动子可操作地连接，所述启动子是响应于刺激可诱导的。在一些情况下，每个启动子是响应于相同刺激(如在培养基中限制氮或无氮)可诱导的。培养基中限制氮或完全缺乏氮在一些微生物如无绿藻和其他微藻和其他微生物种类中刺激油产生，并且可以用作诱导油(脂质)产生至高水平的触发物。当与在此披露的基因工程方法组合使用时，可以将作为干细胞重量百分比的脂质推至高水平，如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％和至少75％。
在此披露的新颖的油(脂质)和源自它们的介电流体不同于具有高C16和C18脂肪酸的其他天然存在的油，如向日葵油和卡诺拉油。
在一个实施方案中，由第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP切下8至18碳脂肪酸。另外，在具有较长链长的油是所希望的那些实施方案中，减少(通过改变其表达)或消除了(例如，通过敲除)一种或多种较短链长(即，低于C14，如C12、C10和/或C8)TE和/或相应ACP基因的表达。
在上文所述的各种实施方案中，无绿藻(或其他微藻或其他微生物)细胞可以含有编码脂质途径酶的至少一个外源基因或至少一个失活(或经工程化以减少表达)的内源基因。在一些情况下，脂质途径酶选自下组，该组由以下各项组成：硬脂酰-ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶、甘油脂去饱和酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰-CoA羧化酶、酰基载体蛋白、以及甘油-3磷酸酰基转移酶。在其他情况下，无绿藻或其他细胞含有选自下组的脂质修饰酶，该组由以下各项组成：脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基辅酶A/醛还原酶、脂肪酰基辅酶A还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羧酶、和/或酰基载体蛋白。
VI.微生物油的产生和源自其中的产品
1.微生物油的产生
为了根据在此所述的方法产生微生物油，通过任何方便的手段收获或以别的方式收集由微生物细胞产生的原始、未加工的油(脂质)。例如，可以通过全细胞提取分离油。在这种方法中，首先破坏细胞，并且然后可以例如通过使用如上文所述的离心从细胞团中分离胞内及细胞膜/细胞壁结合的脂质和脂肪酸以及胞外烃。在许多实施方案中，在溶解微生物细胞的过程之后或在其期间提取产生在微生物中的细胞内脂质。
更具体地，在完成培养之后，一般从发酵液中分离微生物。经常地，通过离心实现分离以产生浓缩的微生物生物质膏。。这种生物质可以然后任选地用洗涤液(例如，蒸馏水)洗涤以除去发酵液和碎片。任选地，也可以在破坏细胞之前干燥(烘干、冻干，等等)洗涤的微生物生物质。可替代地，当发酵结束时，可以在不与一些或所有发酵液分开的情况下溶解细胞。例如，当溶解细胞时，细胞可以处于小于1∶1v∶v细胞对胞外液体的比率。
可以溶解含有脂质的微生物以产生溶解产物。如在此详述，可以通过任何方便的手段实现溶解微生物(也称为细胞溶解)的步骤，所述手段包括热诱导的溶解、添加碱、添加酸、使用酶如蛋白酶和多糖降解酶(如淀粉酶)、使用超声波、机械溶解、使用渗透压休克、用溶解病毒感染和/或表达一个或多个溶解基因。进行溶解以释放已经由微生物产生的细胞内分子。这些用于溶解微生物的方法的每一种可以作为单一方法或以组合方式同时或依次地使用。可以通过显微镜分析来观察细胞破坏的程度。使用一种或多种在此所述的方法，典型地观察到超过70％的细胞破碎。优选地，细胞破裂超过80％、更优选超过90％并且最优选大约100％。
在特定的实施方案中，在生长之后溶解微生物，例如以便增加用于提取或进一步加工的微生物油的暴露。如果使用外源脂肪酶基因，可以调节脂肪酶表达(例如，通过诱导型启动子)或细胞溶解的定时，以便优化脂质和/或烃的产生。下文描述众多溶解技术。这些技术可以单独或组合地使用。
在本发明的一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括加热含有微生物的细胞悬液。在这个实施方案中，加热含有微生物的发酵液(或从发酵液中分离的微生物悬液)直到微生物(即微生物的细胞壁和细胞膜)降解或分解。典型地，应用的温度是至少50℃。更高的温度，如至少30℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃、至少100℃、至少110℃、至少120℃、或至少130℃或更高用于更高效的细胞溶解。可以通过煮沸微生物通过热处理来溶解细胞。可替代地，可以在高压釜中进行热处理(不沸腾)。可以将热处理的溶解产物冷却，用于进一步处理。也可以通过蒸汽处理，即，通过添加加压蒸汽进行细胞破碎。例如在美国专利号6,750,048中描述了用于细胞破碎的微藻蒸汽处理。在一些实施方案中，可以通过将蒸汽鼓泡到发酵罐中并且将培养液维持在所希望的温度持续小于大约90分钟、优选小于大约60分钟、并且更优选小于大约30分钟而实现蒸汽处理。
在本发明的另一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括将碱添加至含有微生物的细胞悬液。该碱应当强到足以水解所使用的微生物的蛋白质化合物的至少一部分。用于增溶蛋白质的碱是化学领域已知的。用于本发明方法的实施方案中的示例性碱包括但不限于锂、钠、钾、钙的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐及其混合物。优选的碱是KOH。例如在美国专利号6,750,048中描述了用于破碎细胞的微藻碱处理。
在本发明的另一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括将酸添加至含有微生物的细胞悬液。可以使用浓度为10mN-500mN或优选40nM-160nM的酸实现酸溶解。优选在室温以上(例如，在40°-160°，即，50°-130°的温度)进行酸溶解。对于中等温度(例如，室温至100℃，并且尤其是室温至65°)，酸处理可以有用地与超声处理或其他细胞破碎方法结合。
在本发明的另一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括通过使用酶溶解微生物。用于溶解微生物的优选酶是蛋白酶和多糖降解酶，如半纤维素酶(例如，来自黑曲霉(Aspergillusniger)的半纤维素酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；#H2125)、果胶酶(例如，来自根霉种类(Rhizopus sp.)的果胶酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；#P2401)、Mannaway4.0L(Novozymes)、纤维素酶(例如，绿色木霉(Trichoderma viride)的纤维素酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；#C9422)、以及崩溃酶(例如，来自担子菌纲种类(Basidiomycetes sp.)的崩溃酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；#D9515)。
在本发明的其他实施方案中，使用酶完成溶解，所述酶例如是纤维素酶如多糖降解酶，其任选地来自小球藻或小球藻病毒，和/或蛋白酶，如灰色链霉菌(Streptomyces griseus)蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、在Degradation ofPolylactide by Commercial Proteases(通过商业蛋白酶降解聚乳酸)，Oda Y等人，Journal of Polymers and the Environment，第8卷，第1期，2000年1月，第29-32页(4)中所列出的蛋白酶、Alcalase2.4FG(Novozymes)和Flavourzyme100L(Novozymes)。也可以使用蛋白酶和多糖降解酶的任何组合，包括前述蛋白酶和多糖降解酶的任何组合。
在另一个实施方案中，可以使用螺旋榨机进行溶解。在这个过程中，以高压迫使生物质穿过螺杆型装置，溶解细胞并引起细胞内脂质释放并且与细胞中的蛋白质和纤维(和其他组分)分开。
在本发明的另一个实施方案中，通过使用超声波(即，超声处理)进行溶解微生物的步骤。因此，也可以用高频声波溶解细胞。可以电子地产生声波并且将其通过金属尖端传输至适当浓缩的细胞悬液。这种超声处理(或超声波处理)基于在细胞悬液中产生空腔而破坏细胞完整性。
在本发明的另一个实施方案中，通过使用机械溶解进行溶解微生物的步骤。可以将细胞机械地溶解并且任选地均质化以促进烃(例如，脂质)收集。例如，压力破碎仪可以用来泵送含有细胞的浆料穿过限流孔阀(restricted orifice valve)。施加高压(高达1500巴)，随后穿过出口喷嘴瞬间膨胀。通过三种不同的机制完成细胞破碎：冲击在阀门上、在孔口中的高液体剪切和释放时压力骤降，从而引起细胞爆裂。这种方法释放细胞内分子。可替代地，可以使用球磨机。在球磨机中，在悬浮液中将细胞与小磨粒(例如珠子)一起搅动。细胞因剪切力、在珠子之间的碾磨以及与珠子碰撞而破裂。珠子破坏细胞以释放细胞内容物。也可以通过剪切力破坏细胞，如使用共混(例如用高速或瓦林混碎机(Waring blender)作为实例)、弗氏压碎器、或在薄弱细胞壁的情况下甚至离心来破坏细胞。
在本发明的另一个实施方案中，通过应用渗透压休克(即，将微生物细胞悬浮在低渗溶液中)进行溶解微生物的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括用溶解病毒感染微生物。已知多种病毒溶解适合用于在此所述的方法中的微生物，并且针对特定的微生物选择和使用特定的溶解病毒是在本领域的技术水平范围之内的。例如，草履虫小球藻病毒(PBCV-1)是一组巨大的形成蚀斑的二十面体双链DNA病毒的原型(藻DNA病毒科(Phycodnaviridae)，绿藻病毒属(Chlorovirus))，这些病毒在某些单细胞真核小球藻样绿藻中复制并将其溶解。因此，可以通过用适合的小球藻病毒感染培养物溶解任何易感性微藻。用小球藻病毒感染小球藻种类的方法是已知的。参见例如Adv.VirusRes.2006；66：293-336；Virology，1999Apr25；257(1)：15-23；Virology，2004Jan5；318(1)：214-23；Nucleic Acids Symp.Ser.2000；(44)：161-2；J.Virol.2006Mar；80(5)：2437-44；以及Annu.Rev.Microbiol.1999；53：447-94。
在本发明的另一个实施方案中，溶解微生物的步骤包括自溶。在这个实施方案中，一种微生物经基因工程化以产生溶解蛋白，这种蛋白将溶解这种微生物。这种溶解基因可以使用诱导型启动子表达，使得可以首先使细胞在发酵罐中生长至所希望的密度，随后诱导启动子以表达溶解基因来溶解细胞。在一个实施方案中，溶解基因编码多糖降解酶。在某些其他实施方案中，溶解基因是来自溶解病毒的基因。因此，例如，来自小球藻属病毒的溶解基因可以在藻细胞中表达；参见Virology260，308-315(1999)；FEMS Microbiology Letters180(1999)45-53；Virology263，376-387(1999)；和Virology230，361-368(1997)。优选地使用由刺激(如存在小分子、光、热和其他刺激)诱导的诱导型启动子，如微藻中有活性的启动子完成溶解基因的表达。
多种方法可用于从通过以上方法产生的细胞溶解物中分离脂质。例如，脂质和脂质衍生物如脂肪醛、脂肪醇和烃(如链烷)可以用疏水性溶剂如己烷提取(参见Frenz等人1989，Enzyme Microb.Technol.，11：717)。脂质和脂质衍生物也可以使用液化(参见例如Sawayama等人1999，Biomass and Bioenergy17：33-39和Inoue等人1993，Biomass Bioenergy6(4)：269-274)；油液化(参见例如Minowa等人1995，Fuel74(12)：1735-1738)；和超临界CO2提取(参见例如Mendes等人2003，Inorganica Chimica Acta356：328-334)提取。Miao和Wu描述了从原始小球藻培养物回收微藻脂质的方案，其中将细胞通过离心收获、用蒸馏水洗涤并且通过冷冻干燥法干燥。在研钵中粉碎所得到的细胞粉末并且然后将其用正己烷提取。Miao和Wu，Biosource Technology(2006)97：841-846。
因此，可以用有机溶剂提取回收由在此所述的微生物产生的脂质、脂质衍生物和烃。在一些情况下，优选的有机溶剂是己烷。典型地，将有机溶剂直接添加至溶解产物，而不事先分离溶解产物组分。在一个实施方案中，将通过上文所述的一种或多种方法产生的溶解产物与有机溶剂接触足以允许脂质和/或烃组分与有机溶剂形成溶液的一段时间。在一些情况下，可以然后进一步精炼溶液以回收特定的所希望的脂质或烃组分。己烷提取法是本领域熟知的。
PCT申请号US10/031108中描述了用于从微生物中提取脂质的其他方法，所述专利通过引用结合在此。
可以通过使用一种或多种酶(包括脂肪酶)修饰如在此所述的细胞产生的脂质和脂质衍生物，如脂肪醛、脂肪醇、以及烃(如链烷)。当烃处于细胞的细胞外环境中时，可以将一种或多种酶在酶修饰烃或从烃前体中完成其合成的条件下添加至这个环境。可替代地，在添加一种或多种催化剂(例如酶)之前，可以从细胞物质中部分或完全地分离烃。这样的催化剂是外源添加的，并且它们的活性在细胞外部或在体外发生。
2.微生物油的进一步加工
因此，如在此所述的在体内由细胞产生或在体外酶促修饰的脂质和烃可以任选地通过常规手段进一步加工。加工可以包括“裂解”以减少尺寸，并且因此增加烃分子的氢∶碳比。催化裂解和热裂解方法常规地用于烃和甘油三酯油加工中。催化方法涉及使用催化剂，如固体酸催化剂。这种催化剂可以是二氧化硅-氧化铝或沸石，这引起碳-碳键的异裂断裂或非对称断裂，产生碳正离子和氢负离子(hydride anion)。这些活性中间体然后经历重排或与另一种烃发生氢负离子转移。反应可以因此再生这些中间体以导致自增殖链机制(self-propagating chainmechanism)。也可以加工烃以减少其中的碳-碳双键或三键的数目，任选地减少至零。也可以加工烃以除去或消除其中的环或环状结构。也可以加工烃以增加氢∶碳比。这可以包括加氢(“氢化”)和/或烃“裂解”成更小的烃。
一旦提取脂质，可以根据在此所述的方法，使脂质经受一个或多个加工步骤。这些加工步骤不同于生产燃料时对原油(例如，石油和其他来源)进行的精炼步骤。这些加工步骤在一些方面与在用于人类消费的种子油的生产过程中的那些加工步骤是可比较的。在一些实施方案中，将提取的脂质脱胶以提取卵磷脂和其他磷脂。在其他实施方案中，将提取的脂质使用碱或碱金属精炼。在再另外的实施方案中，使提取的脂质通过漂白粘土，通常是酸性粘土。在其他实施方案中，将提取的脂质脱臭以消除或减少挥发性杂质，如醛和酮。在再另外的实施方案中，将提取的脂质冬化以消除或减少蜡或饱和脂肪。取决于所希望的产品的特征，对提取的脂质可以按任何和所有组合的方式进行前述加工步骤。已经被精炼(例如，用碱或碱金属)、漂白(例如，用漂白粘土)和/或脱臭的提取脂质通常被称为RBD油。从来自在此所述的微藻和/或产油酵母提取的脂质中产生的RBD油用于多种工业应用中，包括生产介电流体。
在一些实施方案中，进行脱胶以从油中去除污染物如磷脂。在本发明的一些实施方案中，所提取的油的脱胶是精炼、漂白和脱臭(或RBD)的一部分。RBD过程消除或减少所提取的油的气味、颜色和/或味道。在一些实施方案中，精炼过程通常由两个步骤组成：脱胶和通过用氢氧化钠苛性剥离去除油中的游离脂肪酸(FFA)的中和步骤。漂白步骤可以涉及将油与各种漂白粘土混合以吸附颜料、痕量金属和硫化合物。脱臭步骤可以是在低压和高温下发生的蒸馏过程。在说明性蒸馏过程中，将油置于真空下并且用蒸汽加热以去除任何剩余的味道或气味和FFA。也可以通过用活性炭处理实现脱臭。
上述步骤可以起到降低倾点的作用。在各种实施方案中，可以将微生物油(脂质)的倾点降低至大约-10℃、大约-15℃、大约-20℃、大约-25℃、大约30℃、大约-35℃、或大约-40℃。另外，微生物油的倾点可以落入由任何这些值所限制的任何范围内，例如，大约-10℃至-40℃或大约-15℃至大约-35℃，等等。倾点的降低可以因这些步骤降低饱和馏分的相对比例而发生，所述饱和馏分主要由称作硬脂馏分的棕榈酸甘油三酯和硬脂酸甘油三酯组成。油的分提降低了油的饱和甘油三酯浓度。分提可以通过干法分提，如在植物油工业中已知的冬化法来完成。在这种方法中，首先将微生物油(例如，藻油)通过与在植物油工业中所使用的那些相似的方法精炼、漂白和脱臭。这产生倾点在-5℃至-10℃范围内例如-8℃的油。
然后可以以受控方式降低RBD油的温度直到晶核形成。然后可以将油在这个结晶温度保持几小时以促进晶体生长。然后通过过滤移除晶体，以产生两个部分：含有一些或大部分硬脂馏分的固相、以及主要含有油精馏分的液相。这产生倾点在-8℃至-15℃例如-11℃的油。液相可以在较低的结晶温度再次经历分提以实现硬脂的进一步去除。所得到的纯化的液体馏分等同于如植物油工业中共知的超级油精，具有比天然微生物油更好的热特性。例如，第二次分提可以产生具有在-15℃至-25℃范围内(例如-20℃)的倾点的油。所得到的油预期用于多种应用中，主要包括食品应用，其中可以完全或部分地使用微生物油作为动物油和植物油的更便宜并且通常更健康的替换品。
3.源自微生物油的产品
在此所述的微生物油也可以用来生产产品，如润滑剂、液压流体、工业用油或介电流体。常见的工业用油包括链锯杆润滑剂、金属加工液、食品级润滑剂、齿轮油、船用油、发动机润滑剂、拖拉机油、农用设备润滑剂、电梯油、脱模油，等等。介电流体典型地用来冷却和/或电绝缘电气部件(尤其是在高压配电设备中)，例如像，自动重合器、电容器、电路断路器、高电压充液输电缆、配电组件、开关设备(例如，高电压负载断路开关，如在USPN6,797,909中描述的那些)、变压器、传输组件和电压调节器。
传统的介电流体包括矿物油基润滑剂。这些润滑剂包括I、II和II+类基础油，它们是已经常规地精炼或轻度加氢处理并且具有小于120粘度指数(VI)的石油基础油。这些润滑剂也包括作为高度精炼的常规油品的III类基础油(在US包括“合成机油”)。III类基础油可以通过加氢处理(加氢裂解和/或加氢异构化)1类或II/II+类基础油而产生并且含有比I、II和II+类基础油更少的饱和物、硫和氮，并具有大于120的VI。根据众多因素的任一种，如沸点、十六烷值、浊点、闪点、粘度、苯胺点、含硫量、含水量、灰分含量、铜片腐蚀、和残碳，美国试验与材料协会美洲(American Society  of Testing and Materials)(ASTM)建立了介电流体和其他烃组合物(如柴油燃料(ASTM D975)、喷气燃料(ASTM D1655)和生物柴油(ASTM D6751))的规范。
可以通过多种方法制备生物基介电流体。例如，一种始于粗制植物油的方法涉及以下步骤：脱胶、碱精制、漂白、脱臭、氢化、冬化(以产生RBD植物油)、用粘土处理以去除痕量极性化合物和酸性物质(参见美国专利号6,274,067)，并且与添加剂合并以产生生物基介电流体。
介电流体的关键特性包括粘度、可燃性、反应性、可混合性、电绝缘能力、生物可降解性、以及制造成本。虽然综述了这些和其他特性，通过理解传统生物基介电流体相对于矿物油基介电流体的一些优点和缺点，读者可以更好地领会本发明某些实施方案的一些优点。对于粘度，生物基介电流体相对于矿物油基介电流体通常具有更高的粘度和倾点，并且因此具有较差的低温性能。然而，后者的粘度可以因在各种矿物油来源中的化合物之间的不一致性和化合物的复杂性而在批次间变动。生物基介电流体相对于矿物油基介电流体通常具有更高的闪点和燃点(以至少2倍)。生物基介电流体通常相对于矿物油基介电流体具有较差的水解、热稳定性及氧化稳定性和更高的酸值(至少大约2倍)。生物基介电流体相对于矿物油基介电流体通常是更易生物可降解的并具有更低的毒性并且是由可再生(与不可再生相反)资源制成的。相对于矿物油基介电流体，生物基介电流体通常生产成本更高并且需要更多的添加剂。
本发明的方法提供了新的介电流体，在某些实施方案中，所述介电流体具有传统生物基介电流体的所有优点，具有较少(并且在一些实施方案中没有)缺点。在考虑以下对介电流体的一般特性的讨论后，可以更好地领会本发明方法的这些和其他优点。
理想地，介电流体的粘度应当尽可能小地随温度变动。粘度是流体抵抗流动或剪切的量度(“稠度”)并且被量度为运动粘度(kv)和绝对粘度(动力)(cSt或mm2/s40℃和100℃)为单位。(ASTM D2270-04；ASTM D445；ASTM D88)。通常，充分迫使两个运动表面分开的最低粘度润滑剂是所希望的。有时将粘度视为液压流体的最重要特征。如果粘度太高，则摩擦力、压降、功率消耗和热生成增加。如果粘度太低，则可能在更高的运行温度下产生增加的内部泄漏。油膜可能不足以防止过度磨损或可能的运动部件咬死(seizure)。源自各种来源的介电流体的说明性粘度(以cSt为单位)是：矿物油衍生的介电流体：在40℃，20和在100℃，4；大豆油衍生的介电流体：在40℃，30和在100℃，7.6；向日葵油衍生的介电流体：在40℃，40和在100℃，8.7；和油菜籽(卡诺拉)油衍生的介电流体：在40℃，33(Siniawski等人；J.SyntheticLubrication；24，101-110(2007)；Schneider；J.Sci.Food Agric.，86，1769-1780(2006))。在特定的实施方案中，本发明的方法可以提供介电流体，其具有与源自前述来源的介电流体的那些粘度相似的粘度。在说明性实施方案中，介电流体具有在40℃小于大约110cSt(例如，在20cSt-30cSt的范围内)的粘度和/或在100℃在大约2cSt至大约15cSt(例如4cSt-8cSt)范围内的粘度。
粘度指数(VI，无量纲数)是随着温度而变动的粘度变动的量度。对于VI，将油在40℃的kv与两种参比油(VI’为0和100)比较，其中所有的油在100℃具有相同的kv(ASTM D2270)。VI值通常应当尽可能地高。高VI值表示油的粘度随温度变化小。通常：低VI是低于35；中等VI是35至80；高VI是80至110；很高VI是110至125；超级VI是125至160；并且超高VI等于或大于160。源自各种起始原料的介电流体的VI包括：矿物油衍生的介电流体：103；大豆油衍生的介电流体：246；和向日葵油衍生的介电流体：206。(Siniawski等人；J.Synthetic Lubrication；24，101-110(2007))。在特定的实施方案中，本发明的方法可以提供介电流体，其具有与源自前述来源的介电流体的那些VI相似的VI。
倾点是液体将倾出或流动的最低温度(℃)(ASTM D97)。倾点应当比使用介电流体的最低预测环境温度低至少10℃。源自各种起始原料的介电流体的倾点包括：矿物油衍生的介电流体：-50℃；大豆油衍生的介电流体：-9℃；向日葵油衍生的介电流体：-12℃；和油菜籽(卡诺拉)油衍生的介电流体：-21℃。(Siniawski等人；J.Synthetic Lubrication；24，101-110(2007))。在特定的实施方案中，本发明的方法可以提供介电流体，其具有与源自前述来源的介电流体的那些倾点相似的倾点。在各种实施方案中，微生物油基介电流体的倾点可以是大约-10℃、大约-15℃、大约-20℃、大约-25℃、大约30℃、大约-35℃或大约-40℃。另外，微生物油基介电流体的倾点可以落入由任何这些值所限制的任何范围内，例如，大约-10℃至-40℃或大约-15℃至大约-35℃，等等。
例如，并且如上文所述，可以容易地产生根据在此所述的方法产生的RBD油，其具有大约-8℃或更低的倾点。可以通过将RBD油与倾点抑制剂混合进一步降低这个倾点，以便基于添加至油的倾点抑制剂的量而实现具有在-15℃至-20℃范围内或更低的倾点的油。来自单次分提的油精馏分容易地产生具有大约-11℃的倾点的油，其中可以通过将油精馏分与倾点抑制剂混合进一步降低所述倾点，以便基于添加至油的倾点抑制剂的量而实现具有在-16℃至-20℃范围内或更低的倾点的油。来自第二次分提的油精馏分(“超级油精”)容易地产生具有大约-20℃倾点的油，其中可以通过将超级油精馏分与倾点抑制剂混合进一步降低所述倾点，以便基于添加至油的倾点抑制剂的量而实现具有低于-20℃(即-26℃)的倾点或更低的油。多种倾点抑制剂是从Chevron、Oronite、Infineum、General Electric、RohmMax Evonik和其他供应商可商业获得的。与在此所述的微生物油(脂质)一起使用的说明性倾点抑制剂包括
Figure BDA00003138838400911
10-310或1-133(Rohmax-Evonik Additives GmbH)或其他聚(烷基)丙烯酸酯和聚(甲基)丙烯酸酯如
Figure BDA00003138838400912
V-351(Infineum UK limitied)、PMA-D110和PMA D。
介电流体的润滑性(抗磨性)是重要的，因为当流体粘度不足并且流体膜未阻止表面接触时会发生过早磨损(ASTM D2882)。在一些实施方案中，本发明的方法提供了具有良好润滑性(等同于或好于ASTM D2882)的介电流体。
对于介电流体，对于油而言的挥发性或蒸发的倾向(atm蒸气vs.℃)也是重要的。通常，优选较低的挥发性。在一些实施方案中，本发明的方法可以提供介电流体，其具有尽可能低并且甚至比矿物油基和传统生物基介电流体更低的挥发性。
介电流体的可燃性是重要的。通常，优选较低的可燃性(参见“Bio-BasedLubricants：A Market Opportunity Study Update(生物基润滑剂：市场机会研究更新)”联合大豆委员会(United Soybean Board)，2008年11月，Omni TechIntemational，Ltd.，www.soynewuses.org/downloads/reports/BioBasedLubricantsMarketStudy.pdf)。在特定的实施方案中，本发明的方法可以提供介电流体，其具有尽可能低并且甚至比矿物油基和传统生物基介电流体更低的可燃性。
闪点是油蒸发以形成在空气中的可燃混合物的最低温度(℃)。ASTMD3278、D3828、D56和D93描述了适用于介电流体的闪点规范。为防止油点燃，闪点通常应当尽可能地高。源自各种来源的介电流体的闪点包括：矿物油衍生的介电流体：147℃；和TAG衍生的介电流体(典型的)：324℃。用于配电变压器和电力变压器的新的安全介电冷却剂(New Safety Dielectric Coolants forDistribution and Power Transformers)，www.cooperpower.com/Library/pdf/00048.pdf)。在一些实施方案中，本发明的方法可以提供介电流体，其具有与源自前述来源的介电流体的那些闪点相似和等于或高于ASTM D1310和ASTM D92规范的闪点。
燃点是油被明火点燃之后将继续燃烧至少5秒的最低温度(℃)。ASTMD1310和ASTM D92描述了适合用于介电流体的燃点规范。为了防止油点燃，燃点应当尽可能地高。源自各种来源的介电流体的燃点包括：矿物油衍生的介电流体：165℃；和TAG衍生的介电流体(常见)：360℃。在一些实施方案中，本发明的方法可以提供介电流体，其具有与源自前述来源的介电流体的那些燃点相似和等于或高于ASTM D1310和ASTM D92规范的燃点。在一些实施方案中，燃点高于300℃，例如，300℃至450℃。
介电流体的反应性是重要的；介电流体不应当与酸/碱、热和空气反应(或应当具有低反应性)。
水解反应性是指在酸或碱存在下流体对分解的敏感性。ASTM D2619和ASTM D943描述了适用于介电流体的水解反应性。在TAG中，易分解官能团是酯和酸/碱敏感性官能团。在特定的实施方案中，本发明的方法可以提供具有低水解反应性(等同于或好于ASTM D2619和/或ASTM D943)的介电流体。
热稳定性是指介电流体对热分解性的敏感性。在生物油衍生的介电流体中，热不稳定性典型地归因于甘油上的β-氢，最终导致消除产物。在特定的实施方案中，本发明的方法可以提供具有高热稳定性(等于或大于生物油衍生的传统介电流体的热稳定性)的介电流体。
氧化易感性是指介电流体对与氧反应以形成氧化产物的敏感性。ASTMD943和ASTM D2272描述了适用于介电流体的氧化稳定性。低氧化易感性是所希望的；较高的值表示更易氧化的润滑剂。在某些实施方案中，本发明的方法可以在特定的实施方案中提供具有低氧化易感性(例如，ASTM D943或ASTMD2272)的介电流体。
中和值(酸值(acid value)/酸值(acid number))是油或介电流体中的酸量的量度。当油(或介电流体)随着老化和使用而氧化时形成酸。在生物基润滑剂中，酸源自氧化、酯的热分解或酸/碱水解。ASTM D947、ASTM D3487、和ASTM D68711描述了适用于介电流体的中和值。通常，酸值应当尽可能地低。标准矿物油的酸值是0.03并且生物基油的酸值是0.06。在特定的实施方案中，本发明的方法可以提供了具有低酸值(例如，ASTM D947、ASTM D3487、或ASTM D6871)的介电流体。
可混合性指流体与其他流体混合的能力。理想地，介电流体应当与其他润滑剂、流体、和添加剂但不与水充分混合。破乳化性是指液压流体如何良好地抵抗与水混合。破乳化性在介电流体中是最佳的。与所希望的润滑剂和添加剂的可混合性在介电流体中是最佳的。在某些实施方案中，本发明的方法可以在特定的实施方案中提供具有良好可混合性和破乳化性的介电流体。
介电流体应当具有良好的电绝缘特性，即，它们应当防止电流耗散。对变压器进行绝缘功率因数试验来测量介电损耗(以％量度)。这个值报告变压器的状况-湿度、干度、绝缘劣化、绕组状况(condition of the windings)、绝缘套(barrier)、调压开关、套管和油。与介电流体相关的功率因数值应当尽可能地低，典型地是0.5％或更小。例如，从精炼厂运出的新油的功率因数应当在25℃不超过0.05％和在100℃不超过0.3％。对于在69kV或低于69kV运行的新设备中的新油，功率因数应当在25℃不超过0.15％并且在100℃不超过1.5％；在69kV至在288kV或低于288kV运行时，功率因数应当在25℃不超过0.10％并且在100℃不超过1.0％；在345kV或高于345kV运行时，功率因数应当在25℃不超过0.05％并且在100℃不超过0.3％。用于电路断路器的新油应当具有在25℃不超过0.05％和在100℃不超过0.3％的功率因数。用于电路断路器中的油不应当具有在25℃高于1.0％的功率因数。本发明方法的某些实施方案提供了具有有利功率因数需求的介电流体。
介电强度是指在击穿之前介电流体(电绝缘体)可以抵抗的最大电场强度。介电强度以单位MV/m量度(相对电容率)，并且ASTM D877提供了适用于介电流体的规范。为了作为电绝缘体使用，润滑剂的介电强度应当尽可能地高。在特定的实施方案中，本发明的方法可以提供介电流体，它们的介电强度等于或优于由ASTM D877规定的那些介电强度。
耗散因数是由于当使用介电流体作为电绝缘体时所致的电损耗的量度并且被度量为在25℃的单位％。ASTM D924提供了适用于介电流体的规范。作为电绝缘体，耗散因数值应当尽可能地低。在特定的实施方案中，本发明的方法可以提供介电流体，它们的耗散因数等于或优于由ASTM D924规定的那些耗散因数。
电导率是当用作电绝缘体时介电流体传导电流的能力的量度并且被度量为单位S·m-1。ASTM D2624提供了适用于介电流体的规范。作为绝缘体，介电流体的电导率值应当尽可能地低。本发明方法的实施方案提供了介电流体，其具有与由ASTM D2624规定的那些电导率相比有利的电导率。
为了在电变压器和其他应用中使用，介电流体的热性能应当是使得将热量被有效地转移。比热是指物质的热容量并且被度量为单位cal/gm/℃。ASTMD-2766提供了适用于介电流体的规范。较高的比热值使传热和冷却能够更有效。矿物油基介电流体的比热值通常是大约0.39并且TAG衍生的介电流体的比热值大约为0.45。根据本发明实施方案的方法可以提供介电流体，其具有等于或高于0.39和/或符合ASTM D2624规范的比热值。
介电流体的环境特性是重要的。通常，应当采用如此选择从而缓和泄漏或其他事故的环境效应的介电流体。生物可降解性是指介电流体在环境中分解成二氧化碳和水的特性并且通常被量度为每28天％的单位。OECD301B和ASTMD-6046提供了适用于介电流体的生物可降解性规范。容易地可生物降解的生物可降解性值通常是约100％；本质可生物降解的生物可降解性值通常是20％-70％；并且不可生物降解的生物可降解性值通常是可忽略至0％。矿物油基介电流体通常具有15％-35％范围内的生物可降解性值，并且生物油衍生的介电流体通常具有70％-100％范围内的生物可降解性值。本发明方法的某些实施方案可以提供具有70％-100％范围内生物可降解性值的介电流体(参见Renewable Lubricants Manual：Biobased Oils，Fluids，&Greases www.renewablelubricants.com/RenewableLubricantsManual_ Biodegradable.html#Introduction)。
碘值(iodine value)(或碘值(iodine number))是关于油的不饱度的量度。更具体地说，碘值是由油中不饱和键所消耗的碘的质量。干性油具有相对高的大约175的或更高的碘值。大豆油具有大约130的碘值，并且橄榄油具有大约80的碘值。在本领域中常规地测定碘值。测定碘值的标准方法包括ASTMD5768-02(2006)和DIN53241。在各种实施方案中，微生物油基产品(例如介电流体)中的微生物油可以具有在大约25与大约200之间的碘值，例如大约50、大约75、大约100、大约125、大约150、或大约175。此外，碘值可以在由任何这些值所限制的任何范围内，例如大约25至大约175、大约50至大约200、大约50至大约175，等等。
也可以改变脂肪酸不饱和。增加不饱和可以降低凝固点/倾点。单不饱和，如在高油酸生物润滑剂中所见的情况，是目前最佳的并且代表倾点和氧化反应性之间的平衡。单不饱和油与空气反应，但是比多不饱和FA或PUFA慢得多。PUFA的实例包括花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。双不饱和与多不饱和FA对氧化高度敏感并且不适合用于电气应用。伴随源自植物油的介电流体的一个问题是存在多不饱和FA(例如，亚油酸和亚麻酸)。本发明的一些实施方案的介电流体的一个优点是，它们包含或(自其衍生)的微生物油比源自其他生物油的介电流体含有更少的双不饱和与多不饱和FA，并且在一些实施方案中不含双不饱和与多不饱和FA。
这种介电流体的脂质谱通常与原料油的脂质谱高度相似。对于作为介电流体使用，优选高量的较长链(C16-C18)单不饱和脂肪酸。由于氧化和氧化产物的产生，多不饱和脂肪酸(如C18：2、C18：3、ARA、EPA和DHA)不是优选的。饱和脂肪酸倾向于成为固体或具有高凝固点的液体，因此在介电流体中的大量饱和脂肪酸是不希望的。在各种实施方案中，用于介电流体中的微生物油(脂质)是至少大约50％C18：1，例如，至少大约55％、至少大约60％、至少大约65％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、以及至少大约90％C18：1。在这些或其他实施方案中，微生物油(脂质)少于大约10％C18：2，例如，少于大约7.5％、少于大约5％，少于大约2.5％、以及少于大约1％C18：2。微生物油可以具有总计100％或更少的C18：1和C18：2百分比的任何组合。例如，微生物油可以具有至少50％C18：1和少于10％C18：2，或至少80％C18：1和少于5％C18：2。
出于说明的目的，在此提供了来自产油微生物的TAG油，与向日葵油中的20％-75％和大豆油中的48％-65％相比，它们含有少于2％C18：2(参见实例4)。还提供了与大豆油中的5％-10％C18：3相比，具有少于0.5％C18：3的TAG油。
可以根据在此所述的方法实现、操纵和/或变动介电流体的这些特性和其他特性，从而提供适合于任何应用的产品，如润滑剂、液压流体、工业用油、或介电流体。例如，可以如上文所述那样进行产油微生物的遗传操作，以便改变脂质中的各种脂肪酸的链长、饱和度、和/或组成。在某些实施方案中，如在此所述使用的微生物油由已经被工程化以表达一个或多个外源基因的基因工程微生物产生。例如，基因工程微生物可以是无绿藻(例如，Prototheca moriformis)或小球藻。说明性的外源基因包括编码蔗糖转化酶和/或脂肪酰基-ACP硫酯酶的那些。
另外，从微藻或产油酵母提取的脂质可以经历各种化学修饰以在介电流体中实现所希望的特性。常见的改变包括改变脂肪酸(FA)链长。较短链的FA具有降低的倾点。也可以根据本发明方法的实施方案使用化学修饰来减少不饱和，并且化学修饰包括烷基化、自由基加成(radical addition)、酰化、烯反应(ene-reaction)、氢甲酰化、选择性氢化、寡聚化、氢氨甲基化、酰氧基化、以及环氧化。另外或作为替代，添加剂(如倾点抑制剂)可以与加工的微生物油混合以实现所希望的特性，例如，倾点。下文更详细地讨论了说明性的添加剂。
如上文讨论，在特定的实施方案中，从产油微生物提取的未加工的微生物油在掺入到本发明的产品中之前典型地进行“富集”。例如，在微生物脂质中可能存在可以作为沉积物从溶液中结晶和/或沉淀和沉降的污染物。当在较低温度使用介电流体时，沉积物形成尤其是个问题。沉积物或沉淀物可以引起问题，如降低流量、阻塞，等等。具体地涉及去除这些杂质和沉积物以产生更高质量的产品的方法是本领域熟知的。这样的方法的实例包括但不限于，预处理油以去除污染物如磷脂和游离脂肪酸(例如，脱胶、碱炼和二氧化硅吸附剂过滤)。
可以根据本发明方法的实施方案使用冬化来富集微生物油。存在着几种冬化根据本发明实施方案的介电流体的方法。一种方法是将流体与其他介电流体掺合。另一个方法是使用可以降低凝固点的添加剂。干法分提也可以用来降低饱和馏分(硬脂馏分)的相对比例。通过将油冷却，可以使饱和物结晶并且然后滤出晶体。分馏选择性地将流体分离成单独的组分或馏分，从而允许移除或包括特定馏分。其他分提方法包括尿素分提、溶剂分提和热蒸馏。
然后可以将硅藻土或其他过滤材料如漂白粘土添加至冷却的液体以形成浆料，然后可以将这种浆料通过压力叶(pressure leaf)滤机或其他类型滤器过滤以去除微粒。然后可以将过滤的液体通过增泽过滤器(polish filter)以去除任何剩余的沉积物和硅藻土，从而产生终产物。可替代地或另外地，在任何前述的方法步骤结束时产生的这种产物或微生物油可以与倾点抑制剂混合以产生本发明的产品，如介电流体。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于产生润滑油或介电流体的方法，该方法包括以下步骤：(a)使用在此披露的方法培养含脂质的微生物，(b)溶解含有脂质的微生物以产生溶解产物，(c)从溶解的微生物分离脂质组合物，和(d)富集分离的脂质组合物，由此产生润滑油或介电流体。典型地，步骤(d)将包括一个或多个精炼、漂白和/或脱臭步骤和一个或多个分提步骤，从而通过去除棕榈酸甘油三酯和/或硬脂酸甘油三酯降低饱和馏分的相对比例。在一个另外的实施方案中，从步骤(d)产生的润滑油或介电流体与倾点抑制剂混合。
任选地，用于增加分离脂质的氧化稳定性的其他添加剂可以与通过这些方法产生的微生物油、润滑剂或介电流体混合。这样的添加剂的实例包括抗氧化剂如生育酚(维生素E，例如，α-、β-生育酚和/或δ-生育酚)、抗坏血酸(维生素C)。适合的抗氧化剂是可商业获得的。BASF公司以商品名
Figure BDA00003138838400981
销售一系列适合的基于苯酚和基于胺的抗氧化剂。IRGANOX L109、IRGANOX L64、IRGANOXL57、其他IRGANOX抗氧化剂、和其他基于苯酚和基于胺的化合物适合作为油和产品(包括介电流体)的抗氧化添加剂。抗氧化剂的其他非限制性实例包括丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、单叔丁基对苯二酚(TBHQ)、丁基氢基茴香醚(butylated hydroanisole)、四氢苯丁酮(tetrahydrobutrophenone)、抗坏血酸棕榈酸酯、以及没食子酸丙酯。在某些实施方案中，微生物油基产品，例如，介电流体，另外地包含一种按重量计在0.1％至5％并且优选地在0.5％至2％的抗氧化剂。
可以任选地向作为产品(如介电流体)使用的分离脂质添加的其他添加剂是金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、抗磨损添加剂、和/或水解保护剂。一些在介电流体中广泛使用的添加剂描述于Schneider，J Science Food and Agriculture；86：1769-1780)中。金属离子钝化剂具有两种主要功能。它们抑制金属表面上的化学侵蚀并且它们还钝化金属表面以抑制可以充当用于自由基(不成对电子)形成的催化剂的任何残留物。金属钝化剂是可商业获得的。例如，BASF公司提供了一系列金属钝化剂，包括
Figure BDA00003138838400991
系列金属钝化剂。RTVANDERBILT公司出售系列金属钝化剂。金属钝化剂的其他实例包括衍生化三唑(derivatized triazole)，包括1-(二-异辛基氨基甲基)-1，2，4-三唑、1-(2-甲氧基丙-2-基)甲苯基三唑、1-(1-环己氧基丙基)甲苯基三唑、1-(1-环己氧基庚基)甲苯基三唑、1-(1-环己氧基丁基)甲苯基三唑、1-[双(2-乙基己基)氨基甲基-4-甲基苯并三唑；衍生化硼(derivatized boron)，包括硼酸三乙酯、硼酸三丙酯、硼酸三异丙酯、硼酸三丁酯、硼酸三戊酯、硼酸三己酯、硼酸三环己酯、硼酸三辛酯、硼酸三异辛酯，以及其他衍生化肼金属钝化剂，例如，2′，3-双[[3-[3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基]丙酰基]丙酰肼，等等。)。在某些实施方案中，微生物油基产品，例如，介电流体，另外地包含一种或多种按重量计在0.1％至5％并且优选在0.5％至2％的金属钝化剂。
因此，根据在此所述方法制备的介电流体可以含有许多添加剂，包括但不限于以下一种或多种添加剂：(a)抗氧化剂，包括但不限于BHT和其他苯酚；(b)金属离子(如Cu、Zn，等等)的钝化剂，包括但不限于苯并三唑；(c)腐蚀抑制剂，包括但不限于磺酸酯和琥珀酸酯；(d)破乳剂；(e)抗磨损添加剂，包括但不限于二硫代磷酸锌；(f)降低倾点的添加剂，包括但不限于马来酸酐苯乙烯共聚物、聚(烷基)丙烯酸酯，包括但不限于聚甲基丙烯酸酯；和(g)保护其免受水解的化合物，包括但不限于碳二亚胺。
在某些实施方案中，本发明的方法产生包含微生物油的产品，其中所述微生物油具有在大约-10℃与大约-40℃之间的倾点，并且其中所述微生物油的脂肪酸组成是至少50％C18：1和少于10％C18：2。这种方法需要培养经工程化以表达一个或多个外源基因的基因工程微生物直到所述微生物具有按干重计至少10％的油。说明性的基因工程微生物包括无绿藻(例如，Prototheca moriformis)或小球藻。说明性的外源基因包括编码蔗糖转化酶和/或脂肪酰基-ACP硫酯酶的那些。在一些实施方案中，基因工程微生物表达至少两个外源基因，所述基因例如编码蔗糖转化酶和脂肪酰基-ACP硫酯酶、编码两种不同的脂肪酰基-ACP硫酯酶，或编码蔗糖转化酶和两种不同的脂肪酰基-ACP硫酯酶。一旦微生物具有按干重计至少10％的油，将油从微生物中分离并且经历精炼、漂白、脱臭或脱胶以产生RBD油。任选地，可以将抗氧化剂、金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、破乳剂、抗磨损添加剂、倾点抑制剂、和/或抗水解化合物添加至RBD油，以产生所希望的产品。
在特定的实施方案中，本发明的分提方法产生适合于掺入产品(例如，介电流体)中的微生物油，其中所述微生物油具有在大约-10℃与大约-40℃之间的倾点，并且其中所述微生物油的脂肪酸组成是至少50％C18：1和少于10％C18：2。这种方法需要使初始(即“第一”)微生物油经历精炼、漂白、脱臭或脱胶以产生RBD油(其中RBD油以初始倾点和第一温度为特征)，将RBD油的温度降低至第二温度，并且在第二温度过滤RBD油以提供以低于初始倾点的第二倾点为特征的第二微生物油，其中所述第二倾点在大约-10℃与大约-40℃之间，并且其中第二微生物油的脂肪酸组成是至少50％C18：1和少于10％C18：2。说明性的第一温度在高于15℃至大约50℃之间，并且说明性的第二温度在大约-15℃与约15℃之间。任选地，可以将抗氧化剂、金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、破乳剂、抗磨损添加剂、倾点抑制剂、和/或抗水解化合物添加至第二微生物油，以产生所希望的产品。在这些实施方案的变型中，通过以下方式产生第一微生物油：培养经工程化以表达一个或多个外源基因的基因工程微生物直到微生物具有按干重计至少10％的油；然后从微生物中分离油以产生第一微生物油。可以采用这种方法比便例如产生润滑剂、液压流体、工业用油、或介电流体。在产品是介电流体的某些实施方案中，该流体包含抗氧化剂、金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、破乳剂、抗磨损添加剂、倾点抑制剂、或抗水解化合物中的一种或多种。
在本发明的一个实施方案中，通过将源自产油微生物的油和/或介电流体与现有的油或介电流体掺合而产生介电流体。现有的油和介电流体可以是植物或动物来源的(或这两者，即，石油)。
因此，本发明包括多种方法，其中从产油微生物中取得脂质以产生介电流体和用于多种工业和其他应用中的其他产品。用于修饰由在此披露的方法产生的油的方法实例包括但不限于，油的水解、油的加氢处理、以及油的酯化。微藻脂质的其他化学修饰包括而不限于环氧化、氧化、水解、硫酸化、磺化、乙氧基化、丙氧基化、酰胺化、以及皂化。微藻油的改性产生基础油脂化学品，针对所希望的功能这些化学品可以进一步被改性成所选择的衍生的油脂化学品。参考燃料生产方法，以与上文描述相似的方式，也可以对从在此所述的微生物培养物中产生的油进行这些化学修饰。
在某些实施方案中，在此所述的介电流体在电气系统(如变压器，包括容纳变压器铁芯/线圈组的箱体)中使用，其中该介电流体围绕铁芯/线圈组。在这样的实施方案的变型中，箱体也包含与箱体中气体接触但与介电绝缘流体隔离的氧吸收材料。适合的氧吸收材料是能够降低箱体内部围绕介电流体的气氛中的游离氧的浓度并且进而减少在该流体本身中存在的溶解氧的那些材料。这样的化合物可以被称为氧清除化合物。有用的氧清除化合物包括在食品包装工业中常用的那些。用于实施本发明的氧清除化合物的代表物包括以下：亚硫酸钠；硫酸铜五水合物；碳和活化铁粉的组合；亚硫酸氢盐、氢氧化钙、碳酸氢钠和活性碳的混合物；包覆在金属粉末表面上的金属卤化物粉末；以及碱性化合物如氢氧化钙与碳酸钠或碳酸氢钠的组合。也认为一种或多种以上组合物的混合物和组合考虑是有用的。同样用作氧清除化合物的是根据通过引用方式结合的美国专利号2,825,651所提供的那些组合物，包括除氧组合物，其包含亚硫酸盐和加速剂如水合硫酸铜、氯化亚锡、或氧化钴的混合物。另一类有用的氧清除化合物包括包含锰盐、铁盐、钴盐或镍盐、碱性化合物和亚硫酸盐或易潮解化合物的那些组合物，如由美国专利号4,384,972所披露的，该专利也通过引用进行结合。优选的氧清除化合物包含(或作为其基础组分包含)至少一种碱性氧化铁，如氧化亚铁，或由氧化铁材料的混合物制成。有用的含有氧化铁的组合物是商业可获得的，例如，以“Ageless”商品名从南卡罗来纳州邓肯市Mitsubishi Gas Chemical Company和以商品名“Freshmax”从纽约州布法罗Multisorb Technologies公司可商业获得。还有用的是包含亚铁盐和氧化调节物和/或金属亚硫酸盐或硫酸盐化合物的混合物的氧吸收剂。
已经如上详述的本发明在下实例中进行了举例说明，这些实例被提供为旨在说明而不是限制要求保护的发明。
VII.实例
实例1：用于培养无绿藻的方法
培养无绿藻株以实现按干细胞重量计高百分比的油。将冷冻的细胞在室温融化，并且将500μl细胞添加至加有2％葡萄糖的4.5ml的培养基(4.2g/LK2HPO4、3.1g/L NaH2PO4、0.24g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L柠檬酸一水合物、0.025g/L CaCl22H2O、2g/L酵母提取物)，并且在28℃在6孔平板中在搅拌(200转/分钟)下培养7天。通过以14,000转/分钟在预称重的Eppendorf管中将1ml的培养物离心5分钟，确定干细胞重量。弃去培养上清液并且将所得到的细胞沉淀用1ml的去离子水洗涤。将培养物再次离心，弃去上清液，并且将细胞沉淀置于-80℃直到冷冻。然后将样品冻干24小时并且计算干细胞重量。为了确定培养物中的总脂质，移出3ml培养物并且使用Ankom系统(Ankom公司，马其顿，纽约)根据制造商的方案进行分析。将样品用Amkom XT10提取器，根据制造商的操作方案进行溶剂提取。将总脂质确定为在酸水解的干燥样品与溶剂提取的干燥样品之间的质量差。在表9中显示了干细胞重量的油百分比测量值。
表9.按干细胞重量计的油百分比
种类 株 ％油
雍滞无绿藻 UTEX327 13.14
Prototheca moriformis UTEX1441 18.02
Prototheca moriformis UTEX1435 27.17
将来自无绿藻属多个株的微藻样品进行基因分型。如下从藻生物质分离基因组DNA。以14,000xg持续5分钟将细胞(大约200mg)从液体培养物中离心出来。然后将细胞再悬浮于无菌蒸馏水中，以14,000xg离心5分钟，并且弃去上清液。将直径约2mm的单个玻璃珠添加至生物质，并且将管置于-80℃持续至少15分钟。移出样品并添加150μl研磨缓冲液(1％Sarkosyl，0.25M蔗糖，50mM NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0，RNA酶A0.5μg/μl)。通过短暂涡旋将沉淀再悬浮，随后添加40μl的5M NaCl。将样品短暂涡旋，随后添加66μl的5％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)并且进行最终短暂涡旋。接下来，将样品在65℃孵育10分钟，此后将它们以14,000xg离心10分钟。将上清液转移至一支新管并且用300μl的酚∶氯仿∶异戊醇(12∶12∶1)提取一次，随后以14,000xg离心5分钟。将所得到的水相转移至一支含有0.7体积异丙醇(约190μl)的新管，通过倒置进行混合并且在室温孵育30分钟或在4℃孵育过夜。通过以14,000xg离心10分钟回收DNA。然后将所得到的沉淀用70％乙醇洗涤2次，随后用100％乙醇最终洗涤。将沉淀在室温晾干20分钟-30分钟，随后再悬浮于50μl的10mM TrisCl、1mM EDTA(pH8.0)中。
将如上文所述那样制备的5μl总藻DNA按1∶50稀释于10mM Tris(pH8.0)中。如下设置PCR反应，终体积20μl。将10μl2x iProof HF主混合物(BIO-RAD)以10mM储存浓度添加至0.4μl引物SZ02613(5’-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3’(SEQ ID NO：9))。这个引物序列范围在Gen Bank登录号L43357中的位置567-588并且在高等植物和藻类质体基因组中是高度保守的。随后添加至处于10mM储存浓度的0.4μl引物SZ02615(5’-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3’(SEQ ID NO：10))。这个引物序列与Gen Bank登录号L43357中的位置1112-1093互补并且在高等植物和藻质体基因组中是高度保守的。接下来，添加5μl稀释的总DNA和3.2μl dH2O。PCR反应如下运行：98℃，45”；98℃，8”；53℃，12”；72℃，20”，持续35个循环，随后72℃持续1分钟，并且保持在25℃。为了纯化PCR产物，将20μl的10mMTris(pH8.0)添加至每个反应，随后用40μl酚∶氯仿∶异戊醇(12∶12∶1)提取，涡旋并且以14,000xg离心5分钟。将PCR反应物施加至S-400柱(GE Healthcare)并且以3,000xg离心2分钟。随后将纯化的PCR产物TOPO克隆到PCR8/GW/TOPO中，并且在LB/Spec平板上选择阳性克隆。使用M13正向和反向引物，将纯化的质粒DNA按两个方向测序。总共选择十二个无绿藻株对其23SrRNA DNA测序，并且在序列表中列出这些序列。下文包括株的编号和序列表编号的简述。针对来自UTEX1435(SEQ ID NO：15)序列的总趋异(overalldivergence)进行序列分析。出现了作为最趋异的两对(UTEX329/UTEX1533和UTEX329/UTEX1440)。在两种情况下，成对比对导致75.0％的成对序列一致性。下文还包括针对UTEX1435的序列一致性百分比：
Figure BDA00003138838401041
使用HPLC分析来自上文列出的株的亚组中的脂质样品的脂质谱。结果显示于表10中。
表10.无绿藻种类中脂质链的多样性
Figure BDA00003138838401052
分析从Prototheca moriformis UTEX1435(通过溶剂提取或使用螺旋榨机)提取的油的类胡萝卜素、叶绿素、育酚、其他固醇和生育三烯酚。下表11中汇总结果。
表11.从Prototheca moriformis(UTEX1435)提取的油中的类胡萝卜素、叶绿素、生育酚/固醇和生育三烯酚分析
Figure BDA00003138838401053
Figure BDA00003138838401061
Figure BDA00003138838401071
使用标准植物油加工方法精炼和漂白来自4个独立批次的从Protothecamoriformis提取的油。简而言之，在水平滗析器(horizontal decanter)中澄清从Prototheca moriformis提取的粗制油，其中将固形物与油分离。然后将澄清的油转移至含有柠檬酸和水的罐并且让其沉降大约24小时。在24小时之后，罐中的混合物形成2个分离层。底层由水和胶组成，然后通过滗析移除所述胶，之后将脱胶油转移至漂白罐中。然后将油与另一个剂量的柠檬酸一起加热。然后添加漂白粘土至漂白罐，并且将混合物在真空下进一步加热，以便蒸发掉存在的任何水。然后将混合物泵送通过叶滤机以移除漂白粘土。然后使过滤的油通过最终5μm增泽过滤器(polishing filter)并且然后收集储存直至使用。然后分析精炼和漂白的(RB)油的类胡萝卜素、叶绿素、固醇、生育三烯酚、和生育酚。在以下表12中汇总了这些分析的结果。“Nd”表示未检测到，并且下文列出检测灵敏度：
检测灵敏度
类胡萝卜素(mcg/g)nd＝＜0.003mcg/g
叶绿素(mcg/g)nd＝＜0.03mcg/g
固醇(％)nd＝0.25％
生育酚(mcg/g)；nd＝3mcg/g
表12.来自精炼和漂白的Prototheca moriformis油的类胡萝卜素、叶绿素、固醇、生育三烯酚和生育酚分析
Figure BDA00003138838401091
还分析了相同4个批次Prototheca moriformis油的微量元素，并且将结果汇总在以下表13中。
表13.精炼和漂白的Prototheca moriformis油的元素分析
Figure BDA00003138838401101
Figure BDA00003138838401111
实例2：用于生物射弹转化无绿藻的一般方法
根据来自制造商的方案制备Seashell金微载体550纳米。质粒(20μg)与50μl的结合缓冲液和60μl(30mg)的S550d金载体混合并且在冰中孵育1分钟。添加沉淀缓冲液(100μl)，并且将混合物在冰中孵育另外1分钟。在涡旋之后，通过在Eppendorf5415C微量离心机中以10,000转/分钟旋转10秒，使DNA包被的颗粒沉淀。将金沉淀物用500μl冷100％乙醇洗涤一次，通过在离心管中短暂旋转沉淀，并且用50μl冰冷的乙醇再悬浮。在短暂(1-2秒)超声处理之后，将10μl DNA包被的颗粒立即转移至载体膜。
将无绿藻株在转动摇床上含有2％葡萄糖的月示培养基(2g/L酵母提取物，2.94mM NaNO3，0.17mM CaCl2·2H2O，0.3mM MgSO4·7H2O，0.4mM K2HPO4，1.28mM KH2PO4，0.43mM NaCl)中培养直到它达到2x106个细胞的细胞密度。收获细胞，用无菌蒸馏水洗涤一次并且再悬浮于50μl的培养基中。将1x107个细胞铺展在非选择性月示培养基平板的中心三分之一(center third)。用PDS-1000/He生物射弹粒子递送体系(Bio-Rad)轰击细胞。使用裂碟片(1350psi)，并且将平板置于筛选/巨载体组件下方6em。允许细胞在25℃恢复12-24小时。回收时，将细胞用橡胶抹刀从板上刮下，与100μl培养基混合并且铺展在含有适当抗生素选择的平板上。在25℃孵育7-10天之后，在平板上可见代表转化细胞的集落。将集落挑出并点在选择性(抗生素或碳源)琼脂平板上用于第二轮选择。
实例3：异源脂肪酰基acp硫酯酶基因在微藻细胞中的表达
先前已经在PCT申请号PCT/US2009/66412中描述了用于微藻细胞(包括无绿藻种类)中表达异源硫酯酶基因的方法和结果，特此将该专利通过引用进行结合。这个实例描述了使用来自高等植物种类的其他硫酯酶基因/基因产物的结果。
将来自蓖麻的脂肪酰基-ACP硫酯酶导入Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中，并且在序列表中列出密码子优化的cDNA序列(SEQ ID NO：87)和氨基酸序列(来自GenBank登录号ABS30422.1)(SEQ ID NO：88)。表达构建体含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’(SEQ ID NO：100)和3’(SEQ ID NO：101)同源重组靶向序列(分布于构建体侧翼)和在莱茵衣藻(C.reinhardtii)β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻(Chlorella vulgaris)硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO：78列出并且用作选择标记。蓖麻编码区在Protothecamoriformis Amt03启动子/5’UTR(SEQ ID NO：84)和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR(SEQ ID NO：85)的控制下。还将蓖麻天然转运肽替换为来自原始小球藻硬脂酰去饱和酶(SEQ ID NO：86)的转运肽，并且将带有替换的转运肽的硫酯酶的cDNA序列作为SEQ ID NO：87列出。将整个蓖麻表达盒称作pSZ1375并且转化到Prototheca moriformis遗传背景中。在具有蔗糖作为唯一碳源的平板上筛选阳性克隆。选择阳性克隆的亚组并且将其在脂质产生条件下培养，并且使用如上文所述的直接酯交换法确定脂质(脂肪酸)谱。将所选择的克隆的脂肪酸谱汇总在以下表14中。
表14.蓖麻ACP-硫酯酶转基因无绿藻细胞的脂肪酸谱
Figure BDA00003138838401131
结果显示，相对于野生型株，含有蓖麻硫酯酶转基因的转化子具有改变水平的C16：0脂肪酸和在较小程度上具有C18：0脂肪酸。同样，当与野生型水平相比时，存在着C18：1脂肪酸水平的同时增加。
实例4：改变微藻Prototheca moriformis中饱和脂肪酸的水平
A.通过基因敲除方法减少硬脂酰ACP去饱和酶和Δ12脂肪酸去饱和酶 表达
作为使用基于生物信息学的方法基于cDNA的基因组筛选(来自Protothecamoriformis(UTEX1435)的基因组DNA的Illumia转录组和Roche454测序)的部分，鉴定到涉及脂肪酸去饱和的特定两组基因：硬脂酰ACP去饱和酶(SAD)和Δ12脂肪酸去饱和酶(Δ12FAD)。硬脂酰ACP去饱和酶酶是脂质合成途径的部分，并且它们发挥作用以将双键导入脂肪酰基链中，例如，从C18：0脂肪酸合成C18：1脂肪酸。Δ12脂肪酸去饱和酶也是脂质合成途径的部分，并且它们发挥作用以将双键导入已经不饱和的脂肪酸中，例如，从C18：1脂肪酸合成C18：2脂肪酸。使用基于在生物信息学工作期间已经鉴定的两类脂肪酸去饱和酶基因的探针，Southern印迹分析表明每一类去饱和酶基因可能由多个家族成员组成。另外地，编码硬脂酰ACP去饱和酶的基因落入两个不同的家族。基于这些结果，设计了三个基因破坏构建体以通过靶向每个去饱和酶酶家族内的更高度保守的编码区破坏多个基因家族成员。
使用以下序列，设计3个同源重组靶向构建体：(1)Δ12脂肪酸去饱和酶(d12FAD)家族成员的编码序列的高度保守部分和(2)靶向两个不同SAD家族的每个成员的两个构建体，每个构建体具有来自每个家族的编码序列保守区域。将这种策略设计成将选择标记基因(赋予水解蔗糖的能力的来自酿酒酵母的suc2蔗糖转化酶盒)嵌入这些高度保守的编码区(靶向多个家族成员)内，而不是经典的基因替换策略，其中同源重组将靶向靶向基因的侧翼区。
通过生物射弹转化，使用上文描述的方法，将所有构建体导入细胞中，并且将构建体在射击到细胞中之前线性化。在含有蔗糖的平板/培养基上选择转化子，并且使用上述方法测定脂肪酸谱的变化。下文列出了来自三个靶向构建体中的每一个的相关序列。
Figure BDA00003138838401151
挑出来自用每种构建体转化的代表性阳性克隆，然后确定这些克隆的脂肪酸谱(以面积％表示)并且将其汇总在以下表15中。
表15.去饱和酶敲除的脂肪酸谱。
Figure BDA00003138838401161
每种构建体对所需类别的脂肪酸产生可度量的影响，并且在全部3种情况下，C18：0水平明显增加，尤其随着两个SAD敲除的情况下。进一步比较来自SAD敲除的多个克隆表明，SAD2B敲除系在C18：1脂肪酸方面比随SAD2A敲除系所观察到的C18：1脂肪酸水平具有明显更大的减少。
使用上文描述的方法在Prototheca moriformis(UTEX1435)背景下产生另外的Δ12脂肪酸去饱和酶(FAD)敲除。为了鉴定Δ12FAD的潜在同源物，使用以下引物来扩增编码假定FAD的基因组区域：
引物15’-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3’    SEQ ID NO：74
引物25’-GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3’    SEQ ID NO：75
从使用以上引物对Prototheca moriformis基因组DNA进行基因组扩增产生的序列是高度相似的，但是表明多个基因或Δ12FAD等位基因存在于Protothecamoriformis中。
基于这种结果，设计两个基因破坏构建体来消融一个或多个Δ12FAD基因。该策略将蔗糖转化酶(来自酿酒酵母的suc2)盒(因此赋予水解蔗糖能力作为选择标记)嵌入高度保守的编码区中，而不是使用经典的基因替换策略。第一构建体，称作pSZ1124，含有分布于莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR(酿酒酵母suc2盒)侧翼的5’和3’基因组靶向序列，其中所述的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子驱动醇酒酵母suc2基因的表达。第二构建体，称作pSZ1125，含有分布于在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR侧翼的5’和3’基因组靶向序列，其中所述的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子驱动酿酒酵母suc2基因的表达。构建体的相关序列列出在序列表中：
pSZ1124(FAD2B)5’基因组靶向序列    SEQ ID NO：76
pSZ1124(FAD2B)3’基因组靶向序列    SEQ ID NO：77
酿酒酵母suc2盒                     SEQ ID NO：78
pSZ1125(FAD2C)5’基因组靶向序列    SEQ ID NO：79
pSZ1125(FAD2C)3’基因组靶向序列    SEQ ID NO：80
将pSZ1124和pSZ1125分别导入Prototheca moriformis背景，并且基于水解蔗糖的能力选择阳性克隆。表16汇总了在使用pSZ1124和pSZ1125打靶载体的两个转基因系中所获得的脂肪酸谱(以面积％表示，使用上文描述的方法产生)。
表16.Δ12FAD敲除的脂肪酸谱
C10：0 C12：0 C14：0 C16：0 C16：1 C18：0 C18：1 C18：2 C18：3α
亲本 0.01 0.03 1.15 26.13 1.32 4.39 57.20 8.13 0.61
FAD2B 0.02 0.03 0.80 12.84 1.92 0.86 74.74 7.08 0.33
FAD2C 0.02 0.04 1.42 25.85 1.65 2.44 66.11 1.39 0.22
含有FAD2B(pSZ1124)的转基因构建体在脂质谱方面产生十分有趣和出乎意料的结果，在于预期下降的C18：2水平仅下降大约一个面积％。然而，C18：1脂肪酸水平显著地增加，几乎完全以显著下降的C16：0水平为代价。含有FAD2C(pSZ1125)的转基因构建体也产生脂质谱变化：C18：2的水平显著降低，同时C18：1水平相应增加。
B.下调无绿藻细胞中Δ12去饱和酶(FADc)的RNA发夹方法
将通过发夹RNA下调FADc(Δ12去饱和酶基因)基因表达的载体导入Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中。使用酿酒酵母suc2蔗糖转化酶基因作为选择标记，从而向阳性克隆赋予在作为唯一碳源的蔗糖上生长的能力，并且使用两个类型的构建体。第一个类型的构建体利用FADc编码区第一外显子的一部分，这个部分以順式方式连接于其第一内含子，后接处于反方向的第一外显子重复单元。将这种类型的构建体设计成当表达为mRNA时形成发夹。产生了这种第一类型的两个构建体，一个构建体受Prototheca moriformis Amt03启动子(SEQ ID NO：84)驱动，称作pSZ1468，并且第二构建体受茵衣藻β-微管蛋白启动子(SEQ ID NO：89)驱动，称作pSZ1469。第二个类型的构建体利用处于反义方向的大FADc外显子2，受Prototheca moriformis Amt03启动子(SEQ ID NO：84)驱动，称作pSZ1470，或者受茵衣藻β-微管蛋白启动子(SEQ ID NO：89)驱动，称作pSZ1471。所有4个构建体具有酿酒酵母suc2蔗糖转化酶盒(SEQ ID NO：78)和针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’(SEQ ID NO：100)和3’(SEQID NO：101)同源重组靶向序列(分布于构建体的侧翼)。每种发夹RNA构建体的FADc部分的序列连同每种构建体的相关部分在序列表中列出如下：
Figure BDA00003138838401181
将这4个构建体的每一个转化到Prototheca moriformis背景中，并且使用含有蔗糖作为唯一碳源的平板筛选阳性克隆。从每个转化中挑取阳性克隆，并且选择亚组以确定pSZ1468、pSZ1469、pSZ1470和pSZ1471中所含的发夹和反义盒对脂肪酸谱的影响。在产生脂质的条件下使从每个转化中选择的克隆生长，并且使用如上文所述的直接酯交换法确定脂肪酸谱。来自每个转化的代表性脂肪酸谱汇总在以下表17中。野生型1和2细胞是未转化的Prototheca moriforrmis细胞，它们作为阴性对照与每个转化子进行操作。
表17.含有发夹RNA构建体以下调Δ12去饱和酶基因(FADc)表达的Prrotothecamoriformis细胞的脂肪酸谱
Figure BDA00003138838401191
Figure BDA00003138838401201
以上结果显示，发夹构建体pSZ1468和pSZ1469显示预期的表型：分别与野生型1和野生型2相比，C18：2脂肪酸水平降低和C18：1脂肪酸水平增加。反义构建体pSZ1470和pSZ1471不导致C18：2脂肪酸水平下降，但是当分别与野生型1和野生型2相比时，反而显示略微增加，和C16：0脂肪酸水平略微下降。
C.外源硬脂酰-ACP去饱和酶的表达
将油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶(GenBank登录号AAB67840.1)导入Prototheca moriformis UTEX1435遗传背景中。表达构建体含有针对用于整合至核基因组中的6S基因组区域的5’(SEQ ID NO：100)和3’(SEQ ID NO：101)同源重组靶向序列(分布于构建体侧翼)和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO：78列出并且用作选择标记。油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶编码区处于Prototheca moriformis Amt03启动子/5’UTR(SEQID NO：84)和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下，并且将天然转运肽替换为原始小球藻硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽(SEQ ID NO：86)。密码子优化的cDNA序列和氨基酸序列(具有替换的转运肽)在序列表中分别作为SEQ IDN0：98和SEQ ID NO：99列出。将整个油橄榄SAD表达盒称作pSZ1377并且转化到Prototheca moriformis遗传背景中。在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上筛选阳性克隆。选择阳性克隆的亚组并且使其在脂质产生条件下生长，并且使用如上文所述的直接酯交换法确定脂肪酸谱。所选择的克隆的脂肪酸谱汇总在以下表18中。
表18.油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶转基因Prototheca moriformis细胞的脂肪酸谱
Figure BDA00003138838401211
以上结果表明，导入异源去饱和酶(在这种情况下来自油橄榄的硬脂酰-ACP去饱和酶)可以导致更高水平的C18：1脂肪酸和C18：0和C16：0脂肪酸水平的同时下降。
实例5：产油酵母的培养
在这个实例和后续实例中所使用的产油酵母菌株从位于德国Braunschweig，Inhoffenstrabe，7B，38124的德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen un Zellkulturen GmbH)(DSMZ)或位于荷兰乌得勒支P.O Box85167，3508的Centraalbureau voor Schimmelscultures(CBS)Fungal BiodiversityCentre获得。筛选了一百八十五个产油酵母菌株的生长速率和脂质产生。
通过在YPD琼脂平板(如下文描述的YPD培养基，添加2％琼脂)上划线成单菌落使所有菌株无菌。挑取来自每个菌株的YPD平板中的单菌落并且在回转摇床上的YPD培养基中以200转/分钟在30℃生长至晚对数期(10g细菌培养用酵母提取物，20g细菌培养用蛋白胨和20g葡萄糖/1L终体积蒸馏水)。
为了评定脂质生产率，将2mLYPD培养基添加至50mL去了皮重的Bioreactor管(MidSci，Inc.)并且用每种菌株的冷冻贮存物接种。随后将这些管置于30℃培养箱中并且以200转/分钟振摇，培养24小时以产生种子培养物。在24小时之后，添加含有0.1M邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.0)的8mL Y1培养基(没有氨基酸的酵母氮源，Difco)并且通过轻轻吸液充分混合。将所得到的培养物均等地分入第二个去了皮重的的生物反应器管中。然后将所得到的各自5mL的一式二份培养物置于30℃培养箱中，于200转/分钟搅拌持续5天。然后收获细胞用于确定脂质生产率和脂质谱。将3mL的培养物用于确定干细胞重量和总脂质含量(脂质生产率)并且1mL用于脂肪酸谱确定。在任何一种情况下，将培养物置于管中并且以3500转/分钟离心10分钟以便沉淀细胞。在滗析上清液之后，将2mL去离子水添加至每个管并且用来洗涤所得到的细胞沉淀。再次以3500转/分钟旋转这些管持续10分钟以沉淀洗涤的细胞，然后滗析上清液，并且将细胞沉淀置于-70℃的冰箱中持续30分钟。然后将管转移至冷冻干燥机中过夜以便干燥。第二天，记录锥形管加上从3mL培养物产生的干燥生物质的重量，并且使用AnkomAcid Hydrolysis系统(根据制造商的说明书)对所得到的细胞沉淀进行总脂质提取以确定总脂质含量。
基于生长速率和脂质生产率，在筛选的185个菌株中选出30个菌株。这30个菌株的脂质生产率(表示为干细胞重量的脂质百分比)汇总在以下表19中。
表19.产油酵母菌株的脂质生产率
Figure BDA00003138838401221
Figure BDA00003138838401231
使从1mL培养物产生的细胞沉淀经历直接酯交换和GC分析，用于脂肪酸谱确定。以上酵母菌株的17个菌株的脂肪酸谱汇总在以下表20中。
表20.产油酵母菌株的脂肪酸谱
Figure BDA00003138838401251
nd表示未检测到。
对另外的产油酵母菌株进行脂肪酸谱分析，并且发现几个菌株产生高百分比的C16：1脂肪酸，包括德尔布有孢圆酵母CBS2924。这种产油酵母菌株具有作为DCW百分比的大约40％脂质的脂质生产率和以下脂肪酸谱：C12：0(0.36％)；C14：0(1.36％)；C15：0(0.16％)；C16：0(10.82％)；C16：1(42.9％)；C17：0(0.11％)；C18：0(2.1％)；C18：1(35.81％)；C18：2(4.62％)。发现这种菌株具有特别高百分比的C16：1(棕榈油酸)作为其脂肪酸谱的部分。将4个另外的菌株鉴定为产生高百分比的16∶1：解脂耶罗威亚酵母CBS6012(10.10％)；解脂耶罗威亚酵母CBS6331(14.80％)、解脂耶罗威亚酵母CBS10144(12.90％)和解脂耶罗威亚酵母CBS5589(14.20％)。
实例6：对产油酵母菌株进行基因分型
对48个不同的产油酵母菌株进行基因分型。如下从48个不同的产油酵母生物质菌株分离基因组DNA。以14,000xg持续5分钟将细胞(大约200mg)从液体培养物中离心出来。然后将细胞再悬浮于无菌蒸馏水中，以14,000xg离心5分钟，并且弃去上清液。将直径约2mm的单个玻璃珠添加至生物质，并且将管置于-80℃持续至少15分钟。移出样品并添加150μl研磨缓冲液(1％Sarkosyl，0.25M蔗糖，50mM NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0，RNA酶A0.5μg/μl)。通过短暂涡旋将沉淀再悬浮，随后添加40μl的5M NaCl。将样品短暂涡旋，随后添加66μl的5％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)并且进行最终短暂涡旋。接下来，将样品在65℃孵育10分钟，此后将它们以14,000xg离心10分钟。将上清液转移至一支新管并且用300μl酚∶氯仿∶异戊醇(12∶12∶1)提取一次，随后以14,000xg离心5分钟。将所得到的水相转移至一支含有0.7体积异丙醇(约190μl)的新管，通过倒置进行混合并且在室温孵育30分钟或在4℃孵育过夜。通过以14,000xg离心10分钟回收DNA。然后将所得到的沉淀用70％乙醇洗涤2次，随后用100％乙醇最终洗涤。将沉淀在室温晾干20-30分钟，随后再悬浮于50μl的10mM TrisCl、1mM EDTA(pH8.0)中。
将如上文所述那样制备的5μl总藻DNA按1∶50稀释于10mM Tris(pH8.0)中。如下设置PCR反应，终体积20μl。将10μl2x iProof HF主混合物(BIO-RAD)添加至处于10mM储存浓度的0.4μl引物SZ5434正向引物(5’-GTCCCTGCCCTTTGTACACAC-3’(SEQ ID NO：39))和处于10mM储存浓度的0.4μl引物SZ5435反向引物(5’-ttgatatgcttaagttcagcggg-3’(SEQ IDNO：40))。基于在真菌18S rRNA基因的三个引发区域(prime region)和真菌26S rRNA基因的五个引发区域之间的序列保守性而选择引物。正向引物与Genbank登录号#AY550243的核苷酸1632-1652一致，而反向引物与Genbank登录号#NC_001144的核苷酸464271-464293一致。接下来，添加5μl稀释的总DNA和3.2μl dH2O。如下运行PCR反应：98℃，45”；98℃，8”；53℃，12”；72℃，20”，持续35个循环，随后72℃持续1分钟，并且保持在25℃。为了纯化PCR产物，将20μl的10mM Tris(pH8.0)添加至每个反应，随后用40μl酚∶氯仿∶异戊醇(12∶12∶1)提取，涡旋并且以14,000xg离心5分钟。将PCR反应物施加至S-400柱(GE Healthcare)并且以3,000xg离心2分钟。使用ZeroBluntPCR4Blunt-TOPO载体试剂盒(Invitrogen)根据制造商的说明书，将所得到的纯化PCR产物克隆并且转化到大肠杆菌中。对氨苄青霉素抗性菌落直接进行测序反应。使用M13正向和反向引物，将纯化的质粒DNA在两个方向测序。将纯化的PCR产物随后TOPO克隆到PCR8/GW/TOPO中，并且在LB/Spec平板上选择阳性克隆。使用M13正向和反向引物，将纯化的质粒DNA按两个方向测序。
基因分型的48个产油酵母菌株连同相应的SEQ ID NO的清单显示在表21中。
表21.基因分型的产油酵母菌株
Figure BDA00003138838401271
Figure BDA00003138838401281
Figure BDA00003138838401291
实例7：培养混浊红球菌以实现高油含量
使用2ml冷冻的贮存物，产生混浊红球菌PD630(DSM44193，DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkuttwen GmbH)的种子培养物并且将其接种至250ml三角振荡培养瓶(baffle flask)中含有4％蔗糖的50ml MSM培养基内(参见Schlegel等人，(1961)Arch Mikrobiol38，209-22)。使种子培养物在30℃生长，伴以200转/分钟搅拌直到它达到在600nm处1.16的光密度。10ml种子烧瓶培养物用来接种用于在两种不同的氮条件下产生脂质的培养物：10mMNH4Cl和18.7mM NH4Cl(各自一式二份)。使生长培养物在30℃生长，伴以200转/分钟搅拌6天。在培养6天之后，在10mM NH4Cl条件下生长的细胞达到按DCW计最大57.2％(平均)的脂质。在培养5天之后，在18.7mM NH4Cl条件下生长的细胞达到按DCW计最大51.8％(平均)的脂质。
将混浊红球菌生物质样品进行直接酯交换并通过GC/FID分析脂肪酸谱。结果是：C14：0(2.33)；C15：0(9.08)；C16：0(24.56)；C16：1(11.07)；C17：0(10.50)；2个双键等效(2DBE)C17种类(19.90)；C18：0(2.49)；C18：1(17.41)；C18：2(0.05)；C19：0(0.75)和2DBE C19种类(1.87)。
实例8：从微生物提取油
A.使用螺旋榨机和压榨辅料(press aid)从微藻提取油
使用鼓式干燥器干燥按DCW计含有38％油的微藻生物质，导致获得5％-5.5％的水分含量。将这种生物质传送至L250弗氏压碎器中。将30.4kg(671bs.)生物质馈送通过榨机，并且没有回收油。将相同的干燥微生物生物质馈送通过榨机，所述干燥微生物生物质与不同百分比的作为压榨辅料的柳枝稷组合。干燥微生物生物质和20％w/w柳枝稷的组合产生最好的总油回收百分比。然后榨饼经历己烷提取并且20％柳枝稷条件下的最终产率是61.6％的总可获得油(以重量计算)。具有超过50％油干细胞重量的生物质不需要在提取油时使用压榨辅料如柳枝稷。在PCT申请号PCT/US2010/31108中描述了使用螺旋榨机从微藻中提取油的其他方法，所述专利通过引用结合在此。
B.使用螺旋榨机从产油酵母提取油
从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心，Inhoffenstraβe7B，38124，不伦瑞克，德国)获得酵母菌株粘红酵母(DSMZ-DSM70398)。将冷冻的细胞融化并且添加至含有1x DAS维生素溶液(1000x：9g/L三(羟甲基)甲基甘氨酸；0.67g/L硫胺素-HCl；0.01g/L d-生物素；0.008氰钴胺；0.02泛酸钙；和0.04g/L p-氨基苯甲酸)的50mL YPD培养基(上文描述)，并且使其在30℃在以200转/分钟搅拌下生长18-24小时直到OD读数超过5OD(A600)。然后将培养物转移至7-L发酵罐并转换至含有1x DAS维生素溶液的YPl培养基(没有氨基酸和硫酸铵的8.5g/L Difco酵母氮源，3g/L硫酸铵，4g/L酵母提取物)。对培养物每日采样2次并且在OD(A600)测定干细胞重量(DCW)和脂质浓度。当培养物达到高于50g/L DCW时，收获培养物。基于干细胞重量，酵母生物质含有大约50％油。将两份酵母生物质样品进行直接酯交换并通过GC/FID分析脂肪酸谱。结果以面积百分比表示，并且显示在以下表22中。
表22.酯交换的酵母生物质样品的脂肪酸谱
使用三种不同的方法将收获的酵母培养液干燥用于比较：(1)在强力烘箱中在75℃盘式干燥过夜；(2)在鼓式干燥器上在没有浓缩的情况下干燥；和(3)将酵母培养液浓缩至22％固形物并且然后在鼓式干燥器上干燥浆料。将来自三种不同的干燥条件中的每种条件的材料进行热调节并且将其馈送通过螺旋压机用于提取油。压榨温度是150°F并且将调节的干燥酵母生物质保持在大约190°F直到它被预备馈送到压机中。
盘式干燥的酵母的水分含量是1.45％，并且然后将干燥的酵母在烘箱中在90℃调节10分钟。调节后的水分含量是0.9％。然后将调节的盘式干燥材料馈送到用于油提取的台式Taby螺旋压机(70型Taby Pressen榨油机，带有2.2Hp马达和70mm螺杆直径)中。这种材料没有产生任何显著量的油，并且在压机中观察到重质废料(heavy footing)。
在没有浓缩的情况下鼓式干燥的酵母培养液的水分含量是5.4％，并且然后将鼓式干燥的酵母在烘箱中在90℃调节20分钟。调节之后的水分含量是1.4％。然后将调节的鼓式干燥酵母馈送到用于油提取的台式Taby螺旋压机中。这种材料出油良好，废料最少。
鼓式干燥的浓缩酵母培养液的水分含量是2.1％，并且然后将鼓式干燥的浓缩酵母在烘箱中在90℃调节20分钟。在调节之后的水分含量是1.0％。然后将调节的鼓式干燥的浓缩酵母馈送到用于油提取的台式Taby螺旋压机中。这种材料出油良好，废料最少。
C.干燥产油细菌和从中提取油
根据在此提供的方法培养产油细菌菌株混浊红球菌PD630(DSMZ-DSM44193)，以产生按DCW计具有大约32％脂质的产油细菌生物质。
使用离心将收获的混浊红球菌培养液浓缩并且然后用去离子水洗涤并且再悬浮于1.8L去离子水中。将50克纯化的纤维素(PB20-Pre-co-Floc，EP Minerals，Nevada)添加至再悬浮的生物质，并且用去离子水将总固形物调节至20％。然后在鼓式干燥器上干燥红球菌生物质，并且在鼓式干燥之后的红球菌的水分含量是大约3％。
然后将鼓式干燥的材料在烘箱中在130℃热调节30分钟，所得到的水分含量是大约1.2％。然后使调节的鼓式干燥的浓缩酵母馈送穿过用于油提取的台式Taby压机(螺旋压机)。压榨温度是209F并且将调节的干燥酵母生物质保持在大约240°F直到它被预备馈送到压机中。油回收伴随有重质废料。
实例9：提取的油的加工；倾点的降低
概述
可以根据在此所述的方法加工根据前述实例制备的微生物油以改善其特性以便用于食品和润滑剂中。除以上实例中描述的微生物之外，微藻原始小球藻是优良的微生物油生产者。对于培养小球藻种类和株以便获得高油含量并且从中提取油的方法，参见PCT公开号2008/151149、2010/120939、和2010/138,620，所述专利通过引用结合在此。
可以通过减少饱和馏分的相对比例来降低从原始小球藻获得的油的倾点降低，其中饱和馏分主要由在行业中称为硬脂馏分的棕榈酸甘油三酯和硬脂酸甘油三酯组成。这是通过将油分提以降低油的饱和甘油三酯浓度而实现的。这是通过与植物油工业中已知的冬化法相似的结晶或干法分提而完成的。首先通过上述方法(也可以采用与植物油工业中所使用的那些相似的方法)将藻油精炼、漂白和脱臭以产生“RBD油”。
然后以受控制的方式降低RBD油的温度直到晶核形成。然后将油在这个结晶温度保持几个小时以促进晶体生长。然后通过过滤移除晶体，以产生两个部分：含有一些或大部分硬脂馏分的固相、以及主要含有油精馏分的液相。使液相在较低的结晶温度再次经历分提以实现硬脂的进一步去除。所得到的纯化的液体馏分等同于如植物油工业中共知的超级油精，具有比天然藻油更好的热特性。
材料与方法
材料
藻油(精炼、漂白和脱臭的)由太阳酵素(Solazyme)公司(南旧金山，加利福尼亚)生产。在本研究中所使用的油的特性汇总在表23中。
表23.在本研究中所使用的藻油的特性
Figure BDA00003138838401341
由RohmMax Evonik(霍舍姆(Horsham)，宾夕法尼亚州)供应基于聚甲基丙烯酸烷基酯共聚物的倾点抑制剂(PPD)，即含有约50％(w/w)的菜籽油载体的
Figure BDA00003138838401342
10-310和含有精炼矿物油载体的
Figure BDA00003138838401343
1-133。
方法
A.干法分提：结晶
将大约2.5kg藻油置于3-L夹套容器中，该夹套容器与用于加热和冷却产物的温控循环水浴(结晶与脱胶(Crystallization&Degumming)，沙勒罗瓦(Charleroi)，比利时)连接。反应器配有变速搅拌器。通过监测在反应器双层壁之间循环的油和水的温度来控制冷却。冷却结束时，用棒从反应器对晶体悬浮液滴采样并且将液滴沉积在盖玻片上以监测晶体形成。在晶体有机会熔化之前即刻在显微镜下分析样品。
在图1中显示了总的冷却曲线。搅拌器速度在第一阶段期间是30转/分钟并且直到冷却程序结束是15转/分钟。
B.干法分提：过滤
在结晶结束时，使用1-L隔膜式压滤机(Choquenet SA，Chauny，France)过滤晶体悬液。在保持于最终冷却温度上的腔室中实施过滤。过滤时间是20分钟并且滤器供给压力是4barg。
在分离步骤结束时，将硬脂馏分和油精馏分称重，计算馏分产率，并且留出每种馏分的样品用于进一步分析。在图2中显示了在冷却程序后，通过加工来自第一次分提的油精和重复上文描述的结晶和过滤过程而产生藻超级油精#l。通过首先分提脱臭的油并且使用与图2中所示相似的冷却程序重复结晶和过滤过程，产生藻超级油精#2和#3。
C.倾点(PP)
将倾点抑制剂(0.5克和1.0克)称量到烧瓶中。将藻油、油精和超级油精馏分(100克)添加至每个烧瓶。将混合物彻底混合。根据D97ASTM(美国检测与材料学会(American Society for Testing and Materials))标准方法测试每份样品。将样品倒入试管中并且在没有搅拌的情况下在温度设定在48.0℃的水浴中加热。加热样品直到它达到46.0℃。在加热之后，将样品(在水浴中)冷却至25.0℃。然后将样品置于甲醇浴中的金属圆柱体内。甲醇浴的温度设定在-1.0℃至-2.0℃直到样品的温度达到10.0℃。然后，将甲醇浴的温度降低至-17.0℃直到样品的温度达到-7.0℃。当样品的温度大约比预期倾点高11.0℃时，每降低3.0℃从甲醇浴中取出样品，以检验可倾倒性(pour ability)。样品的倾点被确定为当从甲醇浴取出时试管中的样品停止倾泻的温度。对于记录的温度，增加3.0℃以产生样品的实际倾点值。
可以根据在此所述的方法，通过添加甚至进一步降低倾点的化学倾点抑制剂进一步改进在每个步骤产生的油的特性。用于这个实例的倾点抑制剂是
Figure BDA00003138838401361
10-310和1-133，二者均由Evonik生产，但是可以使用任何标准倾点抑制剂获得相似的结果。结果显示在以下表24中、以及图3中。
表24.分馏和倾点(1)抑制剂对藻油(℃)的影响
Figure BDA00003138838401362
(1)倾点ASTM D97
(2)聚(烷基)丙烯酸酯和菜籽油的50∶50混合物。生物可降解等级
(3)聚(烷基)丙烯酸酯和精炼矿物油的混合物。
NT＝未测试
实例10：从工程化微藻中产生的油的倾点
使用实例2的方法，用表25中的以下质粒构建体之一转化Prothecamoriformis(UTEX1435)。
表25.用来转化Protheca moriformis(UTEX1435)的质粒构建体
Figure BDA00003138838401371
每种构建体含有用于整合至核基因组中的区域和在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO：78列出并且用作选择标记。下文显示用于核基因组整合的靶向区域的相关序列。
Figure BDA00003138838401372
Figure BDA00003138838401381
除了蔗糖选择标记之外，这4个构建体中的3个还含有表达蛋白质或RNA的不同的另外的序列。表26列出了由所指示的构建体中的DNA序列编码的重要酶或发夹RNA盒。所有蛋白质编码区经过密码子优化以反映Protothecamoriformis UTEX1435(见表2)核基因中固有的密码子偏倚。在序列表中列出了所使用的构建体的氨基酸序列和cDNA序列两者。
表26.用来转化Protheca moriformis(UTEX1435)的用于硫酯酶或发夹RNA表达的质粒构建体。
Figure BDA00003138838401382
红花ACP硫酯酶编码区(构建体3中的CtOTE)和Cuphea wrightii FatB2硫酯酶编码区(构建体4中的CwTE2)均处于Prototheca moriformis Amt03启动子/5’UTR(SEQ ID NO：84)和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR(SEQ ID NO：85)的控制下。将红花ACP硫酯酶的天然转运肽替换为原始小球藻硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽(SEQ ID NO：86)。密码子优化的红花ACP硫酯酶cDNA序列和氨基酸序列(具有替换的转运肽)在序列表中分别作为SEQ ID NO：106和SEQ IDNO：104列出。密码子优化的Cuphea wrightii FatB2硫酯酶cDNA序列和氨基酸序列在序列表中分别作为SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：105列出。在实例4中描述了含有FADc发夹RNA的构建体1。
将每个构建体转化到Prototheca moriformis遗传背景中。在含有蔗糖作为唯一碳源的平板上筛选阳性克隆。选择阳性克隆的亚组并且使其在脂质产生条件下生长。使用葡萄糖使野生型UTEX1435生长，同时在蔗糖中培养所有其他转基因系。对于每个构建体，使转化子生长并且将油分离。如在此所述分析分离的油的脂肪酸谱并且确定倾点。使用用于倾点评价的ASTM D97标准测试方法确定倾点。转基因菌株的油的脂肪酸谱和倾点显示在以下表27中。表27披露了用于成功操纵油的倾点的数据，这些油是由基因工程化微藻产生的。用构建体3转化的油的倾点从-10.5℃下降到-19.5℃。
表27.含有不同构建体的Prototheca moriformis细胞的脂肪酸谱和倾点温度。
野生型 构建体1 构建体2 构建体3 构建体4
C6：0 0 0 0 0 0
C8：0 0 0 0 0 0
C10：0 0 0 0.01 0.03 0.01
C12：0 0.03 0.02 0.03 0.11 0.03
C14：0 1.12 0.68 0.75 0.90 1.08
C16：0 14.02 15.55 13.26 7.75 26.09
C18：0 3.24 3.79 5.26 1.78 12.37
C18：1 67.76 76.84 71.75 86.40 53.42
C18：2 11.49 0.91 6.44 0.12 4.38
C18：3α 0.62 0.09 0.07 0.02 0.2
倾点 -10.5℃ -7.6℃ -7.6℃ -19.5℃ 10.4℃
实例11：具有改变的脂肪酸谱的工程化微藻
如上文所述，整合异源基因以敲除或敲低无绿藻种类中的特定内源性脂质途径酶可以改变脂肪酸谱。由于内源性脂肪酰基-ACP硫酯酶催化脂质合成期间从酰基载体蛋白切下脂肪酸，它们是建立宿主生物脂质谱的重要脂质途径酶。产生质粒构建体以评定宿主细胞的脂质谱是否可以因敲除或敲减内源性脂肪酰基-ACP硫酯酶基因FATA1而受影响。
A.通过敲除内源性Prototheca moriformis硫酯酶基因而改变脂肪酸谱
使用实例2的方法，用表28中的以下质粒构建体之一转化UTEX1435的以经典方式诱变的衍生物S1920。每种构建体含有用于整合到核基因组中以中断内源性FATA1基因的区域以及在莱菌衣藻β-微管蛋白启动子/5’UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR的控制下的酿酒酵母sue2蔗糖转化酶编码区。这种酿酒酵母suc2表达盒作为SEQ ID NO：78列出并且用作选择标记。所有蛋白质编码区经过密码子优化以反映Prototheca moriformis UTEX1435(参见表2)核基因中固有的密码子偏倚。下文显示用于核基因组整合的FATA1基因的靶向区域的相关序列。
Figure BDA00003138838401401
表28.用来转化Protheca moriformis(UTEX1435)S1920的质粒构建体
质粒构建体 序列元件
pSZ1883 FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1
pSZ1925 FATA1-CrbTub_yInv_nr：：amt03_CwTE2_nr-FATA1
在构建体FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1中的相关限制性位点在以下序列中以小写体、粗体和加下划线显示并且分别是：5’-3’BspQ1、Kpn I、Asc I、MfeI、Sac I、BspQ I。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’末端。粗体、小写体序列代表来自S1920的允许通过同源重组在FATA1基因座处靶向整合的基因组DNA。在5’至3’方向继续向前，通过加框文本指示驱动酵母蔗糖转化酶基因(赋予S1920代谢蔗糖的能力)表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。转化酶的起始子ATG和终止子TGA由大写、粗斜体指示，同时编码区以小写斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR由小写体加下划线文本指示，后接由小写粗体文本指示的S190FATA1基因组区域。
Figure BDA00003138838401411
Figure BDA00003138838401421
为了将Cuphea wrightii ACP-硫酯酶2(CwFatB2)基因(登录号：U56104)在FATA1基因座处导入S1920，产生了一种构建体，它在Prototheca moriformisAmt03启动子/5’UTR(SEQ ID NO：84)和普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR(SEQID NO：85)的控制下表达CwFatB2基因的蛋白质编码区。已经在S1920中表达的构建体可以书写为FATA1-CrbTub_yInv_nr：：amt03_CwTE2_nr-FATA1。
在构建体FATA1-CrbTub_yInv_nr：：amt03_CwTE2_nr-FATA1中的相关限制性位点在以下序列中以小写体、粗体和加下划线显示并且分别是：5’-3’BspQ1、Kpn I、Asc I、Mfe I、BamH I、EcoR I、Spe I、Asc I、Pac I、Sac I、BspQ I。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’末端。粗体、小写体序列代表来自S1920的允许通过同源重组在FATA1基因座处靶向整合的基因组DNA。在5’至3’方向继续向前，通过加框文本指示驱动酵母蔗糖转化酶基因(赋予S1920代谢蔗糖的能力)表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。转化酶的起始子ATG和终止子TGA由大写、粗斜体指示，同时编码区以小写斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR由小写体加下划线文本指示，后接由加框斜体文本指示的Prototheca moriformis的内源性amt03启动子。C.wrightii ACP-硫酯酶的起始子ATG和终止子TGA密码子由大写、粗斜体指示，同时ACP-硫酯酶编码区的其余部分以粗斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR同样由小写体加下划线文本显示，后接由小写粗体文本显示的S1920FATA1基因组区域。密码子优化的Cuphea wrightii FatB2硫酯酶cDNA序列和氨基酸序列在序列表中分别作为SEQ ID NO：107和SEQ IDNO：105列出。
Figure BDA00003138838401431
Figure BDA00003138838401441
Figure BDA00003138838401451
Figure BDA00003138838401461
在FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1转化到S1920中之后，将原代转化子以克隆方式纯化并且在标准脂质产生条件下在pH5.0生长，与如在实例1中披露的条件相似。使用标准脂肪酸甲酯气相色谱火焰电离(FAME GC/FID)检测方法分析脂肪酸谱。下表29提供了几种转化子的脂肪酸谱。
表29.含有破坏内源性FATA1等位基因的选择标记的Prototheca moriformis细胞的脂肪酸谱。
Figure BDA00003138838401471
这些结果显示，消融宿主的内源性FATA1等位基因改变了工程化微藻的脂质谱。将选择标记靶向到内源性FATA1等位基因的影响是C16：0脂肪酸产生的明显减少，同时C18：1脂肪酸产生的增加。
在FATA1-CrbTub_yInv_nr：：amt03_CwTE2_nr-FATA1转化到S1920中之后，将原代转化子以克隆方式纯化并且在标准脂质产生条件下在pH7.0生长，同时提供不同的碳源至总浓度40g/L。蔗糖浓度是40g/L。在仅使用葡萄糖作为碳源的情况下，以40g/L提供葡萄糖。在使用葡萄糖和果糖作为碳源的情况下，以20g/L提供葡萄糖并且以20g/L提供果糖。通过GC-FID评定脂肪酸谱。所得到的脂肪酸谱列出在表30中。
表30.含有破坏内源性FATA1等位基因的选择标记和外源硫酯酶的Protothecamoriformis细胞的脂肪酸谱。
Figure BDA00003138838401481
Figure BDA00003138838401491
与将选择标记单独靶向到宿主的FATA1等位基因相一致，选择标记与外源硫酯酶的整合改变了工程化微藻的脂质谱。如同上文，将外源基因靶向到FATA1等位基因导致C16：0脂肪酸产生的明显减少。CwTE2硫酯酶在FATA1基因座处的另外表达还影响中链脂肪酸和C18：1脂肪酸产生至这样的程度，这种程度取决于所分析的转化子中存在的外源硫酯酶活性水平。在整合到宿主基因组中之后，可以扩增由构建体如FATA1-CrbTub_yInv_nr：：amt03_CwTE2_nr-FATA1中的重复单元如普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR界定的基因。在扩增的转基因在靶整合位点处的拷贝数与硫酯酶水平之间存在良好的一致性，正如对脂肪酸谱或重组蛋白积累(通过蛋白质印迹法评估)的影响所揭示的。
其中CwTE2基因已经经历扩增的转基因系显示中链(C10：0-C14：0)脂肪酸的明显增加和C18：1脂肪酸的同时减少。相反，其中CwTE2经历或不经历扩增(如1-2个拷贝)的那些转化子一致显示较低的外源硫酯酶表达，导致中链脂肪酸略微增加和对C18：1脂肪酸增加的大得多的影响。
总之，这些数据显示，消融宿主的内源性FATA1等位基因改变了工程化微藻的脂质谱。
B.通过敲低内源性Prototheca moriformis硫酯酶基因改变脂质谱
将构建体pSZ1773导入Prototheca moriformis UTEX1435S1920遗传背景，该构建体通过发夹RNA下调Prototheca moriformis FATA1基因表达。使用酿酒酵母suc2蔗糖转化酶基因作为选择标记，从而赋予在作为唯一碳源的蔗糖上生长的能力。编码发夹RNA的构建体部分使用FatA1编码区的第一外显子，其后接内源内含子，和处于反方向的第一外显子的重复单元。包括针对6S基因组区域的5’和3’同源重组靶向序列(分布于构建体侧翼)，分别作为SEQ ID NO：100和101列出，用于将发夹构建体整合至核基因组中。这种构建体命名为6S：：β-Tub：suc2：nr：：β-tub：发夹FatA：nr：：6S。
在6S：：β-Tub：suc2：nr：：β-tub：发夹FatA：nr：：6S中的相关限制性位点在以下序列中以小写体、粗体和加下划线显示并且分别是：5’-3’BspQ1、Kpn I、Mfe I、BamH I、EcoR I、Spe I、Xho I、Sac I、BspQ I。BspQI位点界定转化DNA的5’和3’末端。粗体、小写体序列代表来自S1920的允许通过同源重组在6s基因座处靶向整合的基因组DNA。在5’至3’方向继续向前，通过加框文本指示驱动酵母蔗糖转化酶基因(赋予S1920代谢蔗糖的能力)表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。转化酶的起始子ATG和终止子TGA由大写、粗斜体指示，同时编码区以小写斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR由小写体加下划线文本指示，后接由加框斜体文本指示的驱动发夹FatA1表达的第二莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。FatA1的起始ATG密码子由大写、粗斜体指示，同时FatA1编码区的第一外显子的其余部分以大写体指示。FatA基因的内含子由加下划线的大写体指示，并且连接区域以加下划线的大写体指示，在FatA1内含子/反向第一外显子交界处产生粗斜体，以便有助于这些载体中的RNA剪接。FatA1的倒位的第一外显子由大写体显示指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR同样由小写体加下划线文本指示，后接由小写粗体文本指示的S19206S基因组区域。这种RNAi构建体的FATA部分的序列作为SEQ ID NO：110列出。
Figure BDA00003138838401511
Figure BDA00003138838401521
Figure BDA00003138838401531
6S：：β-Tub：suc2：nr：：β-tub：发夹FatA：nr：：6S的表达导致沉默靶FatA基因的发夹RNA形成。在将它转化到S1920中之后，将原代转化子以克隆方式纯化并且在标准脂质产生条件下在pH5.0生长。来自代表性转化子克隆的脂肪酸谱列出在表31中。
表31.含有发夹RNA构建体以下调FATA表达的Prototheca moriformis细胞的脂肪酸谱。
Figure BDA00003138838401532
Figure BDA00003138838401541
以上结果显示，发夹FATA构建体产生了预期的表型：与野生型未转化的对照相比，C16脂肪酸水平降低和C18：1脂肪酸水平增加。
虽然已经结合具体实施方案描述了本发明，应当理解能够进一步修改。本申请旨在涵盖通常遵循本发明原理的本发明的任何变型、用途或适应性改变，并且包括这样的本披露的偏离，如落入本发明所属领域内已知或惯常的实践范围内或和如可能适用于在上文中所述的本质特征的偏离。
在此引证的所有参考文献，包括专利、专利申请、以及出版物，包括Genbank登录号，特此通过引用以其全文进行结合，无论先前是否具体地结合。出于描述和公开可以结合本发明使用的试剂、方法学和构思的目的，引证了在此提到的出版物。在此决不是解释为承认这些参考文献相对在此所述的发明是现有技术。具体而言，出于所有目的，特此将以下专利申请通过引用以其全文进行结合：PCT申请号PCT/US2009/066142，2009年11月30日提交，名称为“在异养微生物中产生定制的油”(Production of Tailored Oils in Heterotrophic Microorganisms)；PCT申请号PCT/US2009/066141，2009年11月30日提交，名称为“在异养微生物中产生定制的油”(Production of Tailored Oils in HeterotrophicMicroorganisms)；和PCT申请号PCT/US2010/31108，2010年4月14日提交，名称为“提取和分离微生物油的方法”(Methods of Microbial Oil Extraction andSeparation)。
序列表
SEQ ID NO：1
来自小球藻的HUP启动子(GenBank登录号X55349的子序列)
gatcagacgggcctgacctgcgagataatcaagtgctcgtaggcaaccaactcagcagctgcttggtgttgggtctgcaggatagtgttgcagggccccaaggacagcaggggaacttacaccttgtccccgacccagttttatggagtgcattgcctcaagagcctagccggagcgctaggctacatacttgccgcaccggtatgaggggatatagtactcgcactgcgctgtctagtgagatgggcagtgctgcccataaacaactggctgctcagccatttgttggcggaccattctgggggggccagcaatgcctgactttcgggtagggtgaaaactgaacaaagactaccaaaacagaatttcttcctccttggaggtaagcgcaggccggcccgcctgcgcccacatggcgctccgaacacctccatagctgtaagggcgcaaacatggccggactgttgtcagcactctttcatggccatacaaggtcatgtcgagattagtgctgagtaagacactatcaccccatgttcgattgaagccgtgacttcatgccaacctgcccctgggcgtagcagacgtatgccatcatgaccactagccgacatgcgctgtcttttgccaccaaaacaactggtacaccgctcgaagtcgtgccgcacacctccgggagtgagtccggcgactcctccccggcgggccgcggccctacctgggtagggtcgccatacgcccacgaccaaacgacgcaggaggggattggggtagggaatcccaaccagcctaaccaagacggcacctataataataggtggggggactaacagccctatatcgcaagctttgggtgcctatcttgagaagcacgagttggagtggctgtgtacggtcgaccctaaggtgggtgtgccgcagcctgaaacaaagcgtctagcagctgcttctataatgtgtcagccgttgtgtttcagttatattgtatgctattgtttgttcgtgctagggtggcgcaggcccacctactgtggcgggccattggttggtgcttgaattgcctcaccatctaaggtctgaacgctcactcaaacgcctttgtacaactgcagaactttccttggcgctgcaactacagtgtgcaaaccagcacatagcactcccttacatcacccagcagtacaaca
SEQ ID NO：2
来自AY307383的椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸盐还原酶启动子
cgctgcgcaccagggccgccagctcgctgatgtcgctccaaatgcggtcccccgattttttgttcttcatcttctccaccttggtggccttcttggccagggccttcagctgcatgcgcacagaccgttgagctcctgatcagcatcctcaggaggccctttgacaagcaagcccctgtgcaagcccattcacggggtaccagtggtgctgaggtagatgggtttgaaaaggattgctcggtcgattgctgctcatggaattggcatgtgcatgcatgttcacaatatgccaccaggctttggagcaagagagcatgaatgccttcaggcaggttgaaagttcctgggggtgaagaggcagggccgaggattggaggaggaaagcatcaagtcgtcgctcatgctcatgttttcagtcagagtttgccaagctcacaggagcagagacaagactggctgctcaggtgttgcatcgtgtgtgtggtgggggggggggggttaatacggtacgaaatgcacttggaattcccacctcatgccagcggacccacatgcttgaattcgaggcctgtggggtgagaaatgctcactctgccctcgttgctgaggtacttcaggccgctgagctcaaagtcgatgccctgctcgtctatcagggcctgcacctctgggctgaccggctcagcctccttcgcgggcatggagtaggcgccggcagcgttcatgtccgggcccagggcagcggtggtgccataaatgtcggtgatggtggggaggggggccgtcgccacaccattgccgttgctggctgacgcatgcacatgtggcctggctggcaccggcagcactggtctccagccagccagcaagtggctgttcaggaaagcggccatgttgttggtccctgcgcatgtaattccccagatcaaaggagggaacagcttggatttgatgtagtgcccaaccggactgaatgtgcgatggcaggtccctttgagtctcccgaattactagcagggcactgtgacctaacgcagcatgccaaccgcaaaaaaatgattgacagaaaatgaagcggtgtgtcaatatttgctgtatttattcgttttaatcagcaaccaagttcgaaacgcaactatcgtggtgatcaagtgaacctcatcagacttacctcgttcggcaaggaaacggaggcaccaaattccaatttgatattatcgcttgccaagctagagctgatctttgggaaaccaactgccagacagtggactgtgatggagtgccccgagtggtggagcctcttcgattcggttagtcattactaacgtgaaccctcagtgaagggaccatcagaccagaaagaccagatctcctcctcgacaccgagagagtgttgcggcagtaggacgacaag
SEQ ID NO：3
酵母蔗糖转化酶
MTNETSDRPLVHFTPNKGWMNDPNGLWYDEKDAKWHLYFQYNPNDTVWGTPLFWGHATSDDLTNWEDQPIAIAPKRNDSGAFSGSMVVDYNNTSGFFNDTIDPRQRCVAIWTYNTPESEEQYISYSLDGGYTFTEYQKNPVLAANSTQFRDPKVFWYEPSQKWIMTAAKSQDYKIEIYSSDDLKSWKLESAFANEGFLGYQYECPGLIEVPTEQDPSKSYWVMFISINPGAPAGGSFNQYFVGSFNGTHFEAFDNQSRVVDFGKDYYALQTFFNTDPTYGSALGIAWASNWEYSAFVPTNPWRSSMSLVRKFSLNTEYQANPETELINLKAEPILNISNAGPWSRFATNTTLTKANSYNVDLSNSTGTLEFELVYAVNTTQTISKSVFADLSLWFKGLEDPEEYLRMGFEVSASSFFLDRGNSKVKFVKENPYFTNRMSVNNQPFKSENDLSYYKVYGLLDQNILELYFNDGDVVSTNTYFMTTGNALGSVNMTTGVDNLFYIDKFQVREVK
SEQ ID NO：4
酵母分泌信号
MLLQAFLFLLAGFAAKISAS
SEQ ID NO：5
高等植物分泌信号
MANKSLLLLLLLGSLASG
SEQ ID NO：6
共有真核分泌信号
MARLPLAALG
SEQ ID NO：7
组合高等植物/真核分泌信号
MANKLLLLLLLLLLPLAASG
SEQ ID NO：8
酿酒酵母蔗糖转化酶NP_012104
GAATTCCCCAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTGGCGCGCCATATCAATGCTTCTTCAGGCCTTTCTTTTTCTTCTTGCTGGTTTTGCTGCCAAGATCAGCGCCTCTATGACGAACGAAACCTCGGATAGACCACTTGTGCACTTTACACCAAACAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACGAAAAAGATGCCAAGTGGCATCTGTACTTTCAATACAACCCGAACGATACTGTCTGGGGGACGCCATTGTTTTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAATTGGGAGGACCAACCAATAGCTATCGCTCCGAAGAGGAACGACTCCGGAGCATTCTCGGGTTCCATGGTGGTTGACTACAACAATACTTCCGGCTTTTTCAACGATACCATTGACCCGAGACAACGCTGCGTGGCCATATGGACTTACAACACACCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCGTATAGCCTGGACGGTGGATACACTTTTACAGAGTATCAGAAGAACCCTGTGCTTGCTGCAAATTCGACTCAGTTCCGAGATCCGAAGGTCTTTTGGTACGAGCCCTCGCAGAAGTGGATCATGACAGCGGCAAAGTCACAGGACTACAAGATCGAAATTTACTCGTCTGACGACCTTAAATCCTGGAAGCTCGAATCCGCGTTCGCAAACGAGGGCTTTCTCGGCTACCAATACGAATGCCCAGGCCTGATAGAGGTCCCAACAGAGCAAGATCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTTATTTCCATTAATCCAGGAGCACCGGCAGGAGGTTCTTTTAATCAGTACTTCGTCGGAAGCTTTAACGGAACTCATTTCGAGGCATTTGATAACCAATCAAGAGTAGTTGATTTTGGAAAGGACTACTATGCCCTGCAGACTTTCTTCAATACTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGCATTGCGTGGGCTTCTAACTGGGAGTATTCCGCATTCGTTCCTACAAACCCTTGGAGGTCCTCCATGTCGCTCGTGAGGAAATTCTCTCTCAACACTGAGTACCAGGCCAACCCGGAAACCGAACTCATAAACCTGAAAGCCGAACCGATCCTGAACATTAGCAACGCTGGCCCCTGGAGCCGGTTTGCAACCAACACCACGTTGACGAAAGCCAACAGCTACAACGTCGATCTTTCGAATAGCACCGGTACACTTGAATTTGAACTGGTGTATGCCGTCAATACCACCCAAACGATCTCGAAGTCGGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTTAAAGGCCTGGAAGACCCCGAGGAGTACCTCAGAATGGGTTTCGAGGTTTCTGCGTCCTCCTTCTTCCTTGATCGCGGGAACAGCAAAGTAAAATTTGTTAAGGAGAACCCATATTTTACCAACAGGATGAGCGTTAACAACCAACCATTCAAGAGCGAAAACGACCTGTCGTACTACAAAGTGTATGGTTTGCTTGATCAAAATATCCTGGAACTCTACTTCAACGATGGTGATGTCGTGTCCACCAACACATACTTCATGACAACCGGGAACGCACTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGTGTGGATAACCTGTTCTACATCGACAAATTCCAGGTGAGGGAAGTCAAGTGAGATCTGTCGATCGACAAGCTCGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAATTAA
SEQ ID NO：9
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC
SEQ ID NO：10
CAGTGAGCTATTACGCACTC
SEQ ID NO：11
UTEX329Prototheca kruegani
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAGTTAAAAAGAGTGGCATGGTTAAAGAAAATACTCTGGAGCCATAGCGAAAGCAAGTTTAGTAAGCTTAGGTCATTCTTTTTAGACCCGAAACCGAGTGATCTACCCATGATCAGGGTGAAGTGTTAGTAAAATAACATGGAGGCCCGAACCGACTAATGTTGAAAAATTAGCGGATGAATTGTGGGTAGGGGCGAAAAACCAATCGAACTCGGAGTTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTTAGGCGCAGCAGTAGCAGTACAAATAGAGGGGTAAAGCACTGTTTCTTTTGTGGGCTTCGAAAGTTGTACCTCAAAGTGGCAAACTCTGAATACTCTATTTAGATATCTACTAGTGAGACCTTGGGGGATAAGCTCCTTGGTCAAAAGGGAAACAGCCCAGATCACCAGTTAAGGCCCCAAAATGAAAATGATAGTGACTAAGGATGTGGGTATGTCAAAACCTCCAGCAGGTTAGCTTAGAAGCAGCAATCCTTTCAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO：12
UTEX1440魏氏无绿藻(Prototheca wickerhamii)
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTTAAAATAAATGGCAGGCTAAGAGATTTAATAACTCGAAACCTAAGCGAAAGCAAGTCTTAATAGGGCGTCAATTTAACAAAACTTTAAATAAATTATAAAGTCATTTATTTTAGACCCGAACCTGAGTGATCTAACCATGGTCAGGATGAAACTTGGGTGACACCAAGTGGAAGTCCGAACCGACCGATGTTGAAAAATCGGCGGATGAACTGTGGTTAGTGGTGAAATACCAGTCGAACTCAGAGCTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTGAGGCGCAGCAATATATCTCGTCTATCTAGGGGTAAAGCACTGTTTCGGTGCGGGCTATGAAAATGGTACCAAATCGTGGCAAACTCTGAATACTAGAAATGACGATATATTAGTGAGACTATGGGGGATAAGCTCCATAGTCGAGAGGGAAACAGCCCAGACCACCAGTTAAGGCCCCAAAATGATAATGAAGTGGTAAAGGAGGTGAAAATGCAAATACAACCAGGAGGTTGGCTTAGAAGCAGCCATCCTTTAAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO：13
UTEX1442雍滞无绿藻(Prototheca stagnora)
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAGTTAAAAAAAATGGCATGGTTAAAGATATTTCTCTGAAGCCATAGCGAAAGCAAGTTTTACAAGCTATAGTCATTTTTTTTAGACCCGAAACCGAGTGATCTACCCATGATCAGGGTGAAGTGTTGGTCAAATAACATGGAGGCCCGAACCGACTAATGGTGAAAAATTAGCGGATGAATTGTGGGTAGGGGCGAAAAACCAATCGAACTCGGAGTTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTTAGGCGCAGCAGTAGCAACACAAATAGAGGGGTAAAGCACTGTTTCTTTTGTGGGCTTCGAAAGTTGTACCTCAAAGTGGCAAACTCTGAATACTCTATTTAGATATCTACTAGTGAGACCTTGGGGGATAAGCTCCTTGGTCAAAAGGGAAACAGCCCAGATCACCAGTTAAGGCCCCAAAATGAAAATGATAGTGACTAAGGACGTGAGTATGTCAAAACCTCCAGCAGGTTAGCTTAGAAGCAGCAATCCTTTCAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO：14
UTEX288Prototheca moriformis
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAGTTAAAAAGAGTGGCATGGTTAAAGATAATTCTCTGGAGCCATAGCGAAAGCAAGTTTAACAAGCTAAAGTCACCCTTTTTAGACCCGAAACCGAGTGATCTACCCATGATCAGGGTGAAGTGTTGGTAAAATAACATGGAGGCCCGAACCGACTAATGGTGAAAAATTAGCGGATGAATTGTGGGTAGGGGCGAAAAACCAATCGAACTCGGAGTTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTTAGGCGCAGCAGTAGCAACACAAATAGAGGGGTAAAGCACTGTTTCTTTTGTGGGCTTCGAAAGTTGTACCTCAAAGTGGCAAACTCTGAATACTCTATTTAGATATCTACTAGTGAGACCTTGGGGGATAAGCTCCTTGGTCAAAAGGGAAACAGCCCAGATCACCAGTTAAGGCCCCAAAATGAAAATGATAGTGACTAAGGATGTGGGTATGTTAAAACCTCCAGCAGGTTAGCTTAGAAGCAGCAATCCTTTCAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO：15
UTEX1439，UTEX1441，UTEX1435，UTEX1437Prototheca moriformis
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTTAAAATAAATGGCAGGCTAAGAGAATTAATAACTCGAAACCTAAGCGAAAGCAAGTCTTAATAGGGCGCTAATTTAACAAAACATTAAATAAAATCTAAAGTCATTTATTTTAGACCCGAACCTGAGTGATCTAACCATGGTCAGGATGAAACTTGGGTGACACCAAGTGGAAGTCCGAACCGACCGATGTTGAAAAATCGGCGGATGAACTGTGGTTAGTGGTGAAATACCAGTCGAACTCAGAGCTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTGAGGCGCAGCAATATATCTCGTCTATCTAGGGGTAAAGCACTGTTTCGGTGCGGGCTATGAAAATGGTACCAAATCGTGGCAAACTCTGAATACTAGAAATGACGATATATTAGTGAGACTATGGGGGATAAGCTCCATAGTCGAGAGGGAAACAGCCCAGACCACCAGTTAAGGCCCCAAAATGATAATGAAGTGGTAAAGGAGGTGAAAATGCAAATACAACCAGGAGGTTGGCTTAGAAGCAGCCATCCTTTAAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO：16
UTEX1533魏氏无绿藻(Prototheca wickerhamii)
TGTTGAAGAATGAGCCGTCGACTTAAAATAAATGGCAGGCTAAGAGAATTAATAACTCGAAACCTAAGCGAAAGCAAGTCTTAATAGGGCGCTAATTTAACAAAACATTAAATAAAATCTAAAGTCATTTATTTTAGACCCGAACCTGAGTGATCTAACCATGGTCAGGATGAAACTTGGGTGACACCAAGTGGAAGTCCGAACCGACCGATGTTGAAAAATCGGCGGATGAACTGTGGTTAGTGGTGAAATACCAGTCGAACTCAGAGCTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTGAGGCGCAGCAATATATCTCGTCTATCTAGGGGTAAAGCACTGTTTCGGTGCGGGCTATGAAAATGGTACCAAATCGTGGCAAACTCTGAATACTAGAAATGACGATATATTAGTGAGACTATGGGGGATAAGCTCCATAGTCGAGAGGGAAACAGCCCAGACCACCAGTTAAGGCCCCAAAATGATAATGAAGTGGTAAAGGAGGTGAAAATGCAAATACAACCAGGAGGTTGGCTTAGAAGCAGCCATCCTTTAAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO：17
UTEX1434Prototheca moriformis
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAGTTAAAAAGAGTGGCGTGGTTAAAGAAAATTCTCTGGAACCATAGCGAAAGCAAGTTTAACAAGCTTAAGTCACTTTTTTTAGACCCGAAACCGAGTGATCTACCCATGATCAGGGTGAAGTGTTGGTAAAATAACATGGAGGCCCGAACCGACTAATGGTGAAAAATTAGCGGATGAATTGTGGGTAGGGGCGAAAAACCAATCGAACTCGGAGTTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTTAGGCGCAGCAGTAGCAACACAAATAGAGGGGTAAAGCACTGTTTCTTTTGTGGGCTCCGAAAGTTGTACCTCAAAGTGGCAAACTCTGAATACTCTATTTAGATATCTACTAGTGAGACCTTGGGGGATAAGCTCCTTGGTCGAAAGGGAAACAGCCCAGATCACCAGTTAAGGCCCCAAAATGAAAATGATAGTGACTAAGGATGTGAGTATGTCAAAACCTCCAGCAGGTTAGCTTAGAAGCAGCAATCCTTTCAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO：18
UTEX1438祖菲无绿藻(Prototheca zopfii)
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAGTTAAAAAGAGTGGCATGGTTAAAGAAAATTCTCTGGAGCCATAGCGAAAGCAAGTTTAACAAGCTTAAGTCACTTTTTTTAGACCCGAAACCGAGTGATCTACCCATGATCAGGGTGAAGTGTTGGTAAAATAACATGGAGGCCCGAACCGACTAATGGTGAAAAATTAGCGGATGAATTGTGGGTAGGGGCGAAAAACCAATCGAACTCGGAGTTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTTAGGCGCAGCAGTAGCAACACAAATAGAGGGGTAAAGCACTGTTTCTTTCGTGGGCTTCGAAAGTTGTACCTCAAAGTGGCAAACTCTGAATACTCTATTTAGATATCTACTAGTGAGACCTTGGGGGATAAGCTCCTTGGTCAAAAGGGAAACAGCCCAGATCACCAGTTAAGGCCCCAAAATGAAAATGATAGTGACTAAGGATGTGAGTATGTCAAAACCTCCAGCAGGTTAGCTTAGAAGCAGCAATCCTTTCAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO：19
UTEX1436Prototheca nmoriformnis
TGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTTAGAAAAGGTGGCATGGTTAAGGAAATATTCCGAAGCCGTAGCAAAAGCGAGTCTGAATAGGGCGATAAAATATATTAATATTTAGAATCTAGTCATTTTTTCTAGACCCGAACCCGGGTGATCTAACCATGACCAGGATGAAGCTTGGGTGATACCAAGTGAAGGTCCGAACCGACCGATGTTGAAAAATCGGCGGATGAGTTGTGGTTAGCGGTGAAATACCAGTCGAACCCGGAGCTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTGAGGCGCAGCAGTACATCTAGTCTATCTAGGGGTAAAGCACTGTTTCGGTGCGGGCTGTGAGAACGGTACCAAATCGTGGCAAACTCTGAATACTAGAAATGACGATGTAGTAGTGAGACTGTGGGGGATAAGCTCCATTGTCAAGAGGGAAACAGCCCAGACCACCAGCTAAGGCCCCAAAATGGTAATGTAGTGACAAAGGAGGTGAAAATGCAAATACAACCAGGAGGTTGGCTTAGAAGCAGCCATCCTTTAAAGAGTGCGTAATAGCTCACTG
SEQ ID NO：20
菊苣(Chicorium intybus)：GenBank登录号Y11124
MSNSSNASESLFPATSEQPYRTAFHFQPPQNWMNDPNGPMCYNGVYHLFYQYNPFGPLWNLRMYWAHSVSHDLINWIHLDLAFAPTEPFDINGCLSGSATVLPGNKPIMLYTGIDTENRQVQNLAVPKDLSDPYLREWVKHTGNPIISLPEEIQPDDFRDPTTTWLEEDGTWRLLVGSQKDKTGIAFLYHSGDFVNWTKSDSPLHKVSGTGMWECVDFFPVWVDSTNGVDTSIINPSNRVKHVLKLGIQDHGKDCYLIGKYSADKENYVPEDELTLSTLRLDYGMYYASKSFFDPVKNRRIMTAWVNESDSEADVIARGWSGVQSFPRSLWLDKNQKQLLQWPIEEIEMLHQNEVSFHNKKLDGGSSLEVLGITASQADVKISFKLANLEEAEELDPSWVDPQLICSENDASKKGKFGPFGLLALASSDLREQTAIFFRVFRKNGRYVVLMCSDQSRSSMKNGIEKRTYGAFVDIDPQQDEISLRTLIDHSIVESFGGRGKTCITTRVYPTLAIGEQARLFAFNHGTESVEISELSAWSMKKAQMKVEEP
SEQ ID NO：21
粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)转化酶：GenBank登录号AB011433MFLKYILASGICLVSLLSSTNAAPRHLYVKRYPVIYNASNITEVSNSTTVPPPPFVNTTAPNGTCLGNYNEYLPSGYYNATDRPKIHFTPSSGFMNDPNGLVYTGGVYHMFFQYSPKTLTAGEVHWGHTVSKDLIHWENYPIAIYPDEHENGVLSLPFSGSAVVDVHNSSGLFSNDTIPEERIVLIYTDHWTGVAERQAIAYTTDGGYTFKKYSGNPVLDINSLQFRDPKVIWDFDANRWVMIVAMSQNYGIAFYSSYDLIHWTELSVFSTSGYLGLQYECPGMARVPVEGTDEYKWVLFISINPGAPLGGSVVQYFVGDWNGTNFVPDDGQTRFVDLGKDFYASALYHSSSANADVIGVGWASNWQYTNQAPTQVFRSAMTVARKFTLRDVPQNPMTNLTSLIQTPLNVSLLRDETLFTAPVINSSSSLSGSPITLPSNTAFEFNVTLSINYTEGCTTGYCLGRIIIDSDDPYRLQSISVDVDFAASTLVINRAKAQMGWFNSLFTPSFANDIYIYGNVTLYGIVDNGLLELYVNNGEKTYTNDFFFLQGATPGQISFAAFQGVSFNNVTVTPLKTIWNC
SEQ ID NO：22
异常毕赤酵母(Pichia anomala)β-呋喃果糖苷酶(转化酶)：GenBank登录号X80640
MIQLSPLLLLPLFSVFNSIADASTEYLRPQIHLTPDQGWMNDPNGMFYDRKDKLWHVYFQHNPDKKSIWATPVTWGHSTSKDLLTWDYHGNALEPENDDEGIFSGSVVVDRNNTSGFFNDSTDPEQRIVAIYTNNAQLQTQEIAYSLDKGYSFIKYDQNPVINVNSSQQRDPKVLWHDESNQWIMVVAKTQEFKVQIYGSPDLKKWDLKSNFTSNGYLGFQYECPGLFKLPIENPLNDTVTSKWVLLLAINPGSPLGGSINEYFIGDFDGTTFHPDDGATRFMDIGKDFYAFQSFDNTEPEDGALGLAWASNWQYANTVPTENWRSSMSLVRNYTLKYVDVNPENYGLTLIQKPVYDTKETRLNETLKTLETINEYEVNDLKLDKSSFVATDFNTERNATGVFEFDLKFTQTDLKMGYSNMTTQFGLYIHSQTVKGSQETLQLVFDTLSTTWYIDRTTQHSFQRNSPVFTERISTYVEKIDTTDQGNVYTLYGVVDRNILELYFNDGSIAMTNTFFFREGKIPTSFEVVCDSEKSFITIDELSVRELARK
SEQ ID NO：23
西洋德巴利酵母(Debaryomyces occidentalis)转化酶：GenBank登录号XI7604
MVQVLSVLVIPLLTLFFGYVASSSIDLSVDTSEYNRPLIHFTPEKGWMNDPNGLFYDKTAKLWHLYFQYNPNATAWGQPLYWGHATSNDLVHWDEHEIAIGPEHDNEGIFSGSIVVDHNNTSGFFNSSIDPNQRIVAIYTNNIPDLQTQDIAFSLDGGYTFTKYENNPVIDVSSNQFRDPKVFWHERFKSMDHGCSEIARVKIQIFGSANLKNWVLNSNFSSGYYGNQYGMSRLIEVPIENSDKSKWVMFLAINPGSPLGGSINQYFVGDFDGFQFVPDDSQTRFVDIGKDFYAFQTFSEVEHGVLGLAWASNWQYADQVPTNPWRSSTSLARNYTLRYVIQMLKLTANIDKSVLPDSINVVDKLKKKNVKLTNKKPIKTNFKGSTGLFDFNITFKVLNLNVSPGKTHFDILINSQELNSSVDSIKIGFDSSQSLFYIDRHIPNVEFPRKQFFTDKLAAYLEPLDYDQDLRVFSLYGIVDKNIIELYFNDGTVAMTNTFFMGEGKYPHDIQIVTDTEEPLFELESVIIRELNK
SEQ ID NO：24
水稻(Oryza sativa)转化酶：GenBank登录号AF019113
MATSRLTPAYDLKNAAAAVYTPLPEQPHSAEVEIRDRKPFKIISAIILSSLLLLALILVAVNYQAPPSHSSGDNSQPAAVMPPSRGVSQGVSEKAFRGASGAGNGVSFAWSNLMLSWQRTSYHFQPVKNWMNDPNGPLYYKGWYHLFYQYNPDSAVWGNITWGHAVSTDLINWLHLPFAMVPDQWYDVNGVWTGSATILPDGRIVMLYTGDTDDYVQDQNLAFPANLSDPLLVDWVKYPNNPVIYPPPGIGVKDFRDPTTAGTAGMQNGQRLVTIGSKVGKTGISLVYETTNFTTFKLLYGVLHAVPGTGMWECVDLYPVSTTGENGLDTSVNGLGVKHVLKTSLDDDKHDYYALGTYDPVKNKWTPDNPDLDVGIGLRLDYGKYYAARTFYDQNKQRRILWGWIGETDLEAVDLMKGWASLQAIPRTIVFDKKTGTNVLQRPEEEVESWSSGDPITQRRIFEPGSVVPIHVSGATQLDITASFEVDETLLETTSESHDAGYDCSNSGGAGTRGSLGPFGLLVVADEKLSELTPVYLYVAKGGDGKAKAHLCAYQTRSSMASGVEKEVYGSAVPVLDGENYSARILIDHSIVESFAQAGRTCVRSRDYPTKDIYGAARCFFFNNATEASVRASLKAWQMKSFIRPYPFIPDQKS
SEQ ID NO：25
洋葱(Allium cepa)转化酶：GenBank登录号AJ006067
MSSDDLESPPSSYLPIPPSDEFHDQPPPLRSWLRLLSIPLALMFLLFLATFLSNLESPPSDSGLVSDPVTFDVNPAVVRRGKDAGVSDKTSGVDSGFVLDPVAVDANSVVVHRGKDAGVSDKTSGVDSGLLKDSPLGPYPWTNQMLSWQRTGFHFQPVKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPEGAVWGNIAWGHAVSRDLVHWTHLPLAMVPDQWYDINGVWTGSATILPDGQIVMLYTGATNESVQVQNLAVPADQSDTLLLRWKKSEANPILVPPPGIGDKDFRDPTTAWYEPSDDTWRIVIGSKDSSHSGIAIVYSTKDFINYKLIPGILHAVERVGMWECVDFYPVATADSSHANHGLDPSARPSPAVKHVLKASMDDDRHDYYAIGTYDPAQNTWVPDDASVDVGIGLRYDWGKFYASKTFYDHAKKRRILWSWIGETDSETADIAKGWASLQGVPRTVLLDVKTGSNLITWPVVEIESLRTRPRDFSGITVDAGSTFKLDVGGAAQLDIEAEFKISSEELEAVKEADVSYNCSSSGGAAERGVLGPFGLLVLANQDLTE
QTATYFYVSRGMDGGLNTHFCQDEKRSSKASDIVKRIVGHSVPVLDGESFALRILVDHSIVESFAQGGRASATSRVYPTEAIYNNARVFVFNNATGAKVTAQSLKVWHMSTAINEIYDPATSVM
SEQ ID NO：26
栽培甜菜(Beta vulgaris subsp.vulgaris)转化酶：GenBank登录号AJ278531
LFYQYNPNGVIWGPPVWGHSTSKDLVNWVPQPLTMEPEMAANINGSWSGSATILPGNKPAILFTGLDPKYEQVQVLAYPKDTSDPNLKEWFLAPQNPVMFPTPQNQINATSFRDPTTAWRLPDGVWRLLIGSKRGQRGLSLLFRSRDFVHWVQAKHPLYSDKLSGMWECPDFFPVYANGDQMGVDTSIIGSHVKHVLKNSLDITKHDIYTIGDYNIKKDAYTPDIGYMNDSSLRYDYGKYYASKTFFDDAKKERILLGWANESSSVEDDIKKGWSGIHTIPRKIWLDKLGKQLIQWPIANIEKLRQKPVNIYRKVLKGGSQIEVSGITAAQADVEISFKIKDLKNVEKFDASWTSPQLLCSKKGASVKGGLGPFGLLTLASXGLEEYTAVFFRIFKAYDNKFVVLMCSDQSRSSLNPTNDKTTYGTFVDVNPIREGLSLRVLIDHSVVESFGAKGKNVITARVYPTLAINEKAHLYVFNRGTSNVEITGLTAWSMKKANIA
SEQ ID NO：27
短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)UCC2003β-呋喃果糖苷酶(转化酶)：GenBank登录号AAT28190
MTDFTPETPVLTPIRDHAAELAKAEAGVAEMAAKRNNRWYPKYHIASNGGWINDPNGLCFYKGRWHVFYQLHPYGTQWGPMHWGHVSSTDMLNWKREPIMFAPSLEQEKDGVFSGSAVIDDNGDLRFYYTGHRWANGHDNTGGDWQVQMTALPDNDELTSATKQGMIIDCPTDKVDHHYRDPKVWKTGDTWYMTFGVSSEDKRGQMWLFSSKDMVRWEYERVLFQHPDPDVFMLECPDFFPIKDKDGNEKWVIGFSAMGSKPSGFMNRNVNNAGYMIGTWEPGGEFKPETEFRLWDCGHNYYAPQSFNVDGRQIVYGWMSPFVQPIPMEDDGWCGQLTLPREITLDDDGDVVTAPVAEMEGLREDTLDHGSITLDMDGEQVIADDAEAVEIEMTIDLAASTADRAGLKIHATEDGAYTYVAYDDQIGRVVVDRQAMANGDHGYRAAPLTDAELASGKLDLRVFVDRGSVEVYVNGGHQVLSSYSYASEGPRAIKLVAEFGNLKVESLKLHHMKSIGLE
SEQ ID NO：28
酿酒酵母转化酶：GenBank登录号NP_012104
MLLQAFLFLLAGFAAKISASMTNETSDRPLVHFTPNKGWMNDPNGLWYDEKDAKWHLYFQYNPNDTVWGTPLFWGHATSDDLTNWEDQPIAIAPKRNDSGAFSGSMVVDYNNTSGFFNDTIDPRQRCVAIWTYNTPESEEQYISYSLDGGYTFTEYQKNPVLAANSTQFRDPKVFWYEPSQKWIMTAAKSQDYKIEIYSSDDLKSWKLESAFANEGFLGYQYECPGLIEVPTEQDPSKSYWVMFISINPGAPAGGSFNQYFVGSFNGTHFEAFDNQSRVVDFGKDYYALQTFFNTDPTYGSALGIAWASNWEYSAFVPTNPWRSSMSLVRKFSLNTEYQANPETELINLKAEPILNISNAGPWSRFATNTTLTKANSYNVDLSNSTGTLEFELVYAVNTTQTISKSVFADLSLWFKGLEDPEEYLRMGFEVSASSFFLDRGNSKVKFVKENPYFTNRMSVNNQPFKSENDLSYYKVYGLLDQNILELYFNDGDVVSTNTYFMTTGNALGSVNMTTGVDNLFYIDKFQVREVK
SEQ ID NO：29
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)转化酶A：GenBank登录号AY171597
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SEQ ID NO：30
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SEQ ID NO：31
Prototheca moriformisΔ12FAD敲除同源重组靶向构建体的3′供体DNA序列
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SEQ ID NO：32
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SEQ ID NO：33
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SEQ ID NO：34
Prototheca moriformis SAD2A敲除同源重组靶向构建体的3′供体DNA序列
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SEQ ID NO：36
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SEQ ID NO：38
Prototheca moriformis SAD2B敲除同源重组靶向构建体
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SEQ ID NQ：39
正向引物SZ5434
GTCCCTGCCCTTTGTACACAC
SEQ ID NO：40
反向引物SZ5435
TTGATATGCTTAAGTTCAGCGGG
SEQ ID NO：41
粘红酵母DSMZ-DSM70398和子囊菌油脂酵母(Lipomyces tetrasporus)CBS5911
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGCTATTGGGAGCTCGCGAGAGCACCTGACTGCCGAGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATTAGGGTGTCCAACTTAACTTGGAGCCCGACCCTCACTTTCTAACCCTGTGCATTTGTCTTGGGTAGTAGCTTGCGTCAGCGAGCGAATCCCATTTCACTTACAAACACAAAGTCTATGAATGTAACAAATTTATAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATTCTTCAACCCACCTCTTTCTTAGTGAATCAGGCGGTGTTTGGATTCTGAGCGCTGCTGGCTTCGCGGCCTAGCTCGCTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTCGGCGTAATAGACTATTCGTTGAGGATTCTGGTCTCTGACTGGAGCCGGGTAAGGTTAAAGGGAGCTACTAATCCTCATGTCTATCTTGAGATTAGACCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：42
粘红酵母胶粘变种(Rhodotorula glutinis var.glutinis)CBS3044和子囊菌油脂酵母CBS8664
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGCTATTGGGAGCTCGCGAGAGCACCCGACTGCCGAGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATTAGGGCGTCCAACTTAACTTGGAGCCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCATCTGTTTCTGGTCAGTAGCTCTCTCGGGAGTGAACGCCATTCACTTAAAACACAAAGTCTATGAATGTATAAAATTTATAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCCTCTCTTTTCTTAATGAATCGAGAGGTGCTTGGATCCTGAGCGCTGCTGGCTTCGGCCTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGATTCTGGTCTCGTACCAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCCTAAAAGTCTAACTTTTGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：43
子囊菌油脂酵母CBS1808和子囊菌油脂酵母CBS1810
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTTCGGACTGGCTCCAGAAAATGGGAAACCATTATCAGGAGCTGGAAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGTATTTGTCTTTTAAAGACATCTCTCTATCCATAAACTCTTTTTTCTAAAAAGACATGATTTACACAATTAGTCTGAATGATTATATAAAAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTATTGTGAATTGCAGGATTTTGTGAATCATCGAATTTTTGAACGCACATTGCACCTTCTGGTATTCCGGAGGGTATACCTGTTTGAGCGTCATTTATATACTCAAAACTTTGTTTTGGTGATGGGCACATATCTGGTGAGAGCTAGATTTGCCTGAAATATAGTGGTAGAGATTGCTACGAGTTATGCAAGTTAGCCAATGCTATTAAGTTAATTCGTTGGTGAAGCATGCGGAGCTTTAGCGGTCGCCTTCCTTAACTATTGGAATTTTTCTAATTTTGACCTCAAATCAGGCAGGAGTA
SEQ ID NQ：44
斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)CBS1809和圆形丝孢酵母(Trichosporonmontevideense)CBS8261
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGACCCTCGGATTGGCGTTAGGAAGCCGGCAACGGCATCCTTTGGCCGAGAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGATTGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACTGTTCTATTACTTGACGCAAGTCGAGTATTTTTACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAGCTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTCCTAATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATCTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTTTGACATTAATGTCTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGACTCTGGCCTGAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：45
解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)CBS6331
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGTGAGACCTTGGGAGGGCGAGATGAGGGGGGCAACCCCTTTTGAACATCCAAACTTGGTCAAACTTGATTATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGATTTTATCTATTTCTGTGGATTTCTGGTATATTACAGCGTCATTTTATCTCAATTATAACTATCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCACATCGATGAAGAACGCAGCGAACCGCGATATTTTTTGTGACTTGCAGATGTGAATCATCAATCTTTGAACGCACATTGCGCGGTATGGCATTCCGTACCGCACGGATGGAGGAGCGTGTTCCCTCTGGGATCGCATTGCTTTCTTGAAATGGATTTTTTAAACTCTCAATTATTACGTCATTTCACCTCCTTCATCCGAGATTA
SEQ ID NO：46
弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)CBS5324、粘质红酵母粘质变种(Rhodotorulamucilaginosa var.mucilaginosa)CBS316、弯曲隐球酵母CBS570、弯曲隐球酵母CBS2176、弯曲隐球酵母CBS2744、弯曲隐球酵母CBS2754、弯曲隐球酵母CBS2829、弯曲隐球酵母CBS5163和弯曲隐球酵母CBS5358
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGATTTCTGGATTGGCGTTAGGAAGCCGGCAACGGCATCCTTTGGCTGAGAAGTTACTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGATTTGCCTTCGGGCTAAACTATATCCATAACACCTGTGAACTGTTGATTGACTTCGGTCAATATTTTTACAAACATTGTGTAATGAACGTCATGTTATAATAACAAATATAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTCAACCATTAGGGTTTCTTAATGGCTTGGATTTGGACGTTTGCCAGTCAAATGGCTCGTCTTAAAAGAGTTAGTGAATTTAACATTTGTCTTCTGGCGTAATAAGTTTCGCTGGGCTGATAGTGTGAAGTTTGCTTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTCTTGAACTCTGGCCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：47
毛孢子菌种类(Trichosporon sp.)CBS7617
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGACCCTCGGATTGGCGTTAAGAAGCCGGCAACGGCATCTTTTGGCCGAGAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATTGCTCTTTGAGCGTTAAACTATATCCATCTACACCTGTGAACTGTTGATTGACTTCGGTCAATTACTTTTACAAACATTGTGTAATGAACGTCATGTTATTATAACAAAAATAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATCTCAACCATTAGGGTTTCTTAATGGCTTGGATTTGGGCGCTGCCACTTGCCTGGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCGTATTAACTTGTCGATCTGGCGTAATAAGTTTCGCTGGTGTAGACTTGAGAAGTGCGCTTCTAATCGTCCTCGGACAATTCTTGAACTCTGGTCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：48
Sporobolomyces alborubescens CBS482
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGCTATTGGGAGCTCGCGAGAGCACCCGACTGCCGAGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGCGAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCTTAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAATTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGAATTCTAGTCTTCGGATTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAATGTCTACATTTTAAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：49
粘红酵母胶粘变种CBS324
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGCTATTGGGAGCTCGCGAGAGCACCCGACTGCCGAGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATCTAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCATCTGTTTTAAAATTGGCTAGTAGCTCTTCGGAGCGAACCACCATTTTTCACTTATACAAACACAAAGTCTATGAATGTAAACAAATTTATAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCCACCTCTTTCTTAGTGAATCTGGTGGTGCTTGGTTTCTGAGCGCTGCTCTGCTTCGGCTTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAACCGAAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGATTCCAGACTTGTTCTGGAGCCGAGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCCTAAAGTCTATTTTTTGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：50
粘红酵母胶粘变种CBS4476
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGGCTCCGGATTGGCTTCTGGGAGCCGGCAACGGCACCTAGTCGCTGAGAAGTTGGACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAAATGCAAGGACGCTCTTTTTAGAGGTCCGACCCAATTCATTTTCTCACACTGTGCACACACTACTTTTTACACCATTTTTAACACTTGAAGTCTAAGAATGTAAACAGTCTCTTAATTGAGCATAAAATTTAAACAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCACTCTTTGGTATTCCGAAGAGTATGTCTGTTTGAGTGTCATGAAACTCTCAACCCCCCTGTTTTGTAATGAACCAGGCGTGGGCTTGGATTATGGCTGCTGCCGGCGTAATTGTCGACTCGGCTGAAATACACGAGCTACCCATTTCATAAGAAATAGACGGTTTGACTCGGCGTAATAACATATTTCGCTGAGGACGTCACATTCTTTACCTAGTGGTGCTTCTAATGCGACATCTAAACTTTAAGCTTTAGACCTCAAATCAGTCAGGACTA
SEQ ID NQ：51
丝孢酵母(Trichosporon behrend)CBS5581
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGACCCTCGGATTGGCGTTAGGAAGCCGGCAACGGCATCCTTTGGCCGAGAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGATTGCCTTCATAGGCTTAAACTATATCCACATACACCTGTGAACTGTTCCACCACTTGACGCAAGTCGAGTGTTTTTACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAGCTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTCCTAATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATCTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTTTGACATTAATGTCTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGACTCTGGCCTGAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：52
Geotrichum histeridarum CBS9892
CGCCCGTCGCTACTACCGATCGAATGGCTTAGTGAGGCTTCCGGATTGATTTGGGAGAGAGGGCGACTTTTTTCCTGGAACGAGAAGCTAGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGAAAAATGCGATATTAGTGGTTTATTTTGCTCGCCGAAAGGCAAACTTTTAACATACCTACCTTTTTTTAACTATAAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTTTTGTGAATTGCAGAAGTGAATCATCAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTGGTGGTATTCCGCCAGGCATACCTGTTTGAGCGTTGTTCTCTCTGGGATTGTCTACTTTCCTCAAAGAAATTAAACAAACAAGTTTGACACAACACCTCAACCTCAGATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：53
橙黄红酵母(Rhodotorula aurantiaca)CBS8411和弯曲隐球酵母CBS8126
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATG GCTTAGTGAGGCCTTCGGATTGGCTTCTGGGAGCCGGCAACGGCACCTAGTCGCTGAGAAGTTTGACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTTTAGGACGTTCTTTTTAGAAGTCCGACCCTTTCATTTTCTTACACTGTGCACACACTTCTTTTTTACACACACTTTTAACACCTTAGTATAAGAATGTAATAGTCTCTTAATTGAGCATAAATAAAAACAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCACTCTTTGGTATTCCGAAGAGTATGTCTGTTTGAGTGTCATGAAACTCTCAACCCCCCTATTTTGTAATGAGATGGGTGTGGGCTTGGATTATGGTTGTCTGTCGGCGTAATTGCCGGCTCAACTGAAATACACGAGCAACCCTATTGAAATAAACGGTTTGACTTGGCGTAATAATTATTTCGCTAAGGACGCTTTCTTCAAATATAAGAGGTGCTTCTAATTCGCTTCTAATAGCATTTAAGCTTTAGACCTCAAATCAGTCAGGACTA
SEQ ID NO：54
Trichosporon domesticum CBS8111
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGACCTCCGGATTGGCGTTGAGAAGCCGGCAACGGCATCTCTTGGCTGAGAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGATTGCCTTAATTGGCTTAAACTATATCCATCTACACCTGTGAACTGTTTGATTGAATCTTCGGATTCGATTTTATACAAACATTGTGTAATGAACGTCATTATATTATAACAAAAAAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTCAACCATTAGGGTTTCTTAATGGCTTGGATTTGGAGGTTTGCCAGTCTGACTGGCTCCTCTTAAAAGAGTTAGCAAGTTGAACTATTGCTATCTGGCGTAATAAGTTTCGCTGGAATGGTATTGTGAAGCGTGCTTCTAATCGTCTTCGGACAATTTTTTGACTCTGGCCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：55
Rhodotorula toruloides CBS8761
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGCTATCGGGAGCTCGCGAGAGCACCTGACTGCCGAGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATTAGGGTGTCCAACTTAACTTGGAGCCCGACCCTCACTTTCTAACCCTGTGCATTTGTCTTGGGTAGTAGCTCGTGTCAGCGAGCGAATCCCATTTCACTTACAAACACAAAGTCTATGAATGTAACAAATTTATAACAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATTCTTCAACCCACCTCTTTCTTAGTGAATCAGGCGGTGTTTGGATTCTGAGCGTTGCTGGCTTCGCGGCCTAGCTCGCTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTCGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGATTCTGGTCTCTGACTGGAGCCGGGTAAGATTAAAGGAAGCTACTAATCCTCATGTCTATCTTTTGAGATTAGACCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：56
Rhodotourula terpendoidalis CBS8445
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGACTGGCTATTGGGATCTCGCGAGAGAACCTGACTGCTGGGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATATTAGGGTGCTCTTTTCATCAAAGAGGCCTGACCTTCATTCTTCTACCCTGTGCACTATTCAAACATTCGGCAGTTGGTAATTTGGCTTGTAAAAGAGCCAGACGACTCTGCTGAATTCACTCTTAAACTCTAAAGTATAAGAATGTTACAAATAAAACAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCGCTGGTATTCCGGCGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAAACCTCAACCCTTCAATTCCTTGTTGAATTGTAAGGTGTTTGGATTCTGAATGTTTGCTGGCTTGAAGGGCCCTTGGCTACTTCAAAAGCGAAGCTCATTCGTAATACATTAGCATCTCAATTTCGAATATTCGGATTGACTCGGCGTAATAGACTTTATTCGCTGAGGACACCTTCACAAGGTGGCCGAATTTCGAGGTAGAAGCTTCCAATTCGATCAAAAGTCACTCTTAGTTTAGACCTCAGATCAGGCAGGACTA
SEQ ID NO：57
解脂耶罗威亚酵母CBS10144
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGTGAGACCTTGGGAGGGCGAGATGAGGGGGGCAACCCCTTTTGAACATCCAAACTTGGTCAAACTTGATTATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGATTTTATCTATTTCTGTGGATTTCTGGTATATTACAGCGTCATTTTATCTCAATTATAACTATCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCACATCGATGAAGAACGCAGCGAACCGCGATATTTTTTGTGACTTGCAGATGTGAATCATCAATCTTTGAACGCACATTGCGCGGTATGGTATTCCGTACCGCACGGATGGAGGAGCGTGTTCCCTCTGGGATCGCATTGCTTTCTTGAAATGGATTTTTTAAACTCTCAATTATTACGTCATTTCA CCTCCTTCATCCGAGATTA
SEQ ID NO：58
粘红酵母胶粘变种CBS5805
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGCTATTGGGAGCTCGCGAGAGCACCTGACTGCCGAGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATTAGGGTGTCCAACTTAACTTGGAACCCGACCCTCACTTTCTAACCCTGTGCATTTGTCTTGGGTAGTAGCTTGCGTCGGCGAGCGAATCCCATTTCACTTACAAACACAAAGTCTATGAATGTAACAAATTTATAACAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATTCTTCAACCCACCTATTTCTTAGTGAATCAGGCGGTGTTTGGATTCTGAGCGCTGCTGGCCTCACGGCCTAGCTCGCTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTCGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGATTCTGGTCTCTGACTGGAGCCGGGTGAGATTAAAGGAAGCTACTAATCCTCATGTCTATCTTGAGATTAGACCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：59
解脂耶罗威亚酵母CBS10143
GTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGTGAGACCTTGGGAGGGCGAGATGAGGGGGGCAACCCCTTCTGAACATCCAAACTTGGTCAAACTTGATTATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGATTTTATCTATTTCTGTGGATTTCTATTCTATTACAGCGTCATTTTATCTCAATTATAACTATCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCACATCGATGAAGAACGCAGCGAACCGCGATATTTTTTGTGACTTGCAGATGTGAATCATCAATCTTTGAACGCACATTGCGCGGTATGGCATTCCGTACCGCACGGATGGAGGAGCGTGTTCCCTCTGGGATCGCATTGCTTTCTTGAAATGGATTTTTTAAACTCTCAATTATTACGTCATTTCACCTCCTTCATCCGAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA
SEQ ID NO：60
子囊菌油脂酵母CBS5607
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGCTATTGGGAGCTCGCGAGAGCACCTGACTGCTGAGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATCTAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAAATCTCACTTTCTAACCCTGTGCATCTGTTAATTGGAATAGTAGCTCTTCGGAGTGAACCACCATTCACTTATAAAACACAAAGTCTATGAATGTATACAAATTTATAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCCACCTCTTTCTTAGTGAATCTGGTGGTGCTTGGTTTCTGAGCGCTGCTCTGCTTCGGCTTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAACCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGATTCTAGTTTACTAGAGCCGAGTTGGGTTAAAGGAAGCTCCTAATCCTAAAGTCTATTTTTTGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：61
解脂耶罗威亚酵母CBS5589
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGTGAGACCTTGGGAGGGCGAGATGAGGGGGGCAACCCCTTCTGAACATCCAAACTTGGTCAAACTTGATTATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGATTTTATCTATTTCTGTGGATTTCTATTCTATTACAGCGTCATTTTATCTCAATTATAACTATCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCACATCGATGAAGAACGCAGCGAACCGCGATATTTTTTGTGACTTGCAGATGTGAATCATCAATCTTTGAACGCACATTGCGCGGTATGGCATTCCGTACCGCACGGATGGAGGAGCGTGTTCCCTCTGGGATCGCATTGCTTTCTTGAAATGGATTTTTTTAAACTCTCAATTATTACGTCATTTCACCTCCTTCATCCGAGATTA
SEQ ID NO：62
子囊菌油脂酵母CBS8724
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTTCGGACTGGCTCCAGAAAATGGGAAACCATTATCAGGAGCTGGAAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCTTCCGTAGCACTTACTGAAGCTTTAGCAGCCCGAAAAGGCGAATGCTAGCGACTATAAATAAATATGGCGTTCTTAAATGCTAGTCTCTGATTAGAGGCGACATTGCCAAATTGCGGGGACATCCTAAAGATCTTGATACCAAGCTGGTAGTCGAAAGACGCCAGTGGCCGAGCTAACAGCCCTGGGTATGGTAATAATTCAAGATATGGAACAATGGGTAATCCGCAGCCAAGTCCTAAACTACGCAAGTAGCATGGATGCAGTTCACAGGCCAAATGGTGATGGGTAGATTACTAAATCTGCTTAAGATATGGTCGGTCCCGCTGTGAGAGCAGATGGGAAGCTACAAAGCAGACTCGTGAGTTTGCGCAAACGTAACTAAAAACGTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGTATTTGTCTTTTAAAGACATCTCTCTATCCATAAACTCTTTTTTCTAAAAAGACATGATTTACACAATTAGTCTGAATGATTATATAAAAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTATTGTGAATTGCAGGATTTTGTGAATCATCGAATTTTTGAACGCACATTGCACCTTCTGGTATTCCGGAGGGTATACCTGTTTGAGCGTCATTTATATACTCAAAACTTCGTTTTGGTGATGGGCACATATCTGGTGAGAGCTAGATTTGCCTGAAATATAGTGGTAGAGATTGCTACGAGTTATGCAAGTTAGCCAATGCTATTAAGTTAATTCGTTGGTGAAGCATGCGGAGCTTTAGTGATCGCCTTCCTTAACTATTGGAATTTTTCTAATTTTGACCTCAAATCAGGCAGGAGTA
SEQ ID NO：63
球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaerocarpum)CBS2371
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGACCGGCTATTGGGAGCTCGCGAGAGCACCCGACTGCTGGGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCATTTGTTTGGGATAGTAGCCTCTCGGGGTGAACTCCTATTCACTCATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTTAATTTATAACAAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTTCTAGTGAAAGAGAAGGTGCTTGGTTTCTGAGCGTTTTGCTGGCCTCACGGTCGAGCTCGCTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGAATTCTAATCTTCGGATTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCCTAATGTCTATATTTTTAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：64
芸苔丝孢酵母(Trichosporon brassicae)CBS6382
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGACCTCCGGATTGGCGTTGAGAAGCCGGCAACGGCATCTCTTGGCCGAGAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGATTGCCTTAATTGGCTTAAACTATATCCAACTACACCTGTGAACTGTTCGATTGAATCTTCGATTCAATTTTACAAACATTGTGTAAAGAACGTCATTAGATCATAACAAAAAAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTCACACATCAAGGTTTCTTGATGAAGTGGATTTGGAGGTTGCCAGTCTAACTGGCTCCTCTTAAAGGAGTTAGCATATTTGATTATTGCTGTCTGGCGTAATAAGTTTCGCTAGTTTGGCATTTTGAAGTGTGCTTCTAATCGTCTTCGGACAATTTTTTGACTCTGGCCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：65
弯曲隐球酵母CBS2755和子囊菌油脂酵母CBS7656
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGATTTCCGGATTGGCGTTAGGAAGCCGGCAACGGCATCCTTTGGCTGAGAAGCTACTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGATTTGCCTTCGGGCTAACTATATCCATAACACCTGTGAACTGTTGATTGACTTCGGTCAATATTTTTACAAACATTGTGTAATGAACGTCATGTTATAATAACAAATATAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTCAACCATTAGGGTTTCTTAATGGCTTGGATTTGGACGTTTGCCAGTCAAATGGCTCGTCTTAAAAGAGTTAGTGAATTTAACATTTGTCTTCTGGCGTAATAAGTTTCGCTGGGCTGATAGTGTGAAGTTTGCTTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTCTTGAACTCTGGCCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：66
斯达氏油脂酵母CBS7786
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTTCGGACTGGCTCCAGAAAATGGGAAACCATTATCAGGAGCTGGAAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGA AGTA AAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGTATTTGTCTTTTCAAGACATCTCTCTATCCATAAACTCTTTTTTTTAAAAAGACATGATTTATAACAATTAGTCTGAATGATTATTTTTAAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCAAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGGATTTTGTGAATCATCGAATTTTTGAACGCACATTGCACCTTCTGGTATTCCGGAGGGTATACCTGTTTGAGCGTCATTTATATACTCAAAACTTACGTTTTGGTGATGGGCACGTATCTGGCTTCTAAGTTAGATTTGCCTGAAATATAGCGGTAGAGGTCGCTAGAAGCGATGCAAGTTAGCCAATGCTATTAAAGTTAATTCGTTGGTGACGCATGTTGAGCTTTTGGTGAAGTCTTCCTTAATTATTGGAATTTTTTTCTAATTTTGACCTCAAATCAGGCAGGAGTA
SEQ ID NO：67
解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica lipoyltica)CBS6012
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTTAGTGAGACCTTGGGAGGGCGAGATGAGGGGGGCAACCCCTTTTGAACATCCAAACTTGGTCAAACTTGATTATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGATTTTATCTATTTCTGTGGATTTCTATTCTATTACAGCGTCATTTTATCTCAATTATAACTATCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCACATCGATGAAGAACGCAGCGAACCGCGATATTTTTTGTGACTTGCAGATGTGAATCATCAATCTTTGAACGCACATTGCGCGGTATGGCATTCCGTACCGCACGGATGGAGGAGCGTGTTCCCTCTGGGATCGCATTGCTTTCTTGAAATGGATTTTTTTAAACTCTCAATTATTACGTCATTTCACCTCCTTCATCCGAGATTA
SEQ ID NO：68
Trichosporon loubieri var.loubieriCBS8265
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGACCTCCGGATTGGCGTTGAGAAGCCGGCAACGGCATCTCTTGGCCGAGAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGATTGCCATCTTGGCTTAAACTATATCCATCTACACCTGTGAACCGTTTGATTGAATCTTCTGATTCAATTTTACAAACATTGTGTAATGAACGTCATTAGATCATAATAAGAAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTCAACCATTAGGGTTTCTTAATGGCTTGGATTTGGAGGTTGCCATTCTAAATGGCTCCTCTTAAAAGAGTTAGCGAGTTTAACTATTGCTATCTGGCGTAATAAGTTTCGCTGGAATGGTATTGTGAAGCGCGCTTCTAATCGTCTTCGGACAATTTTTTGACTCTGGCCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：69
Geotrichum vulgare CBS10073
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCTTCCGGATTGATTAGTTGGAGAGGGAGACTTTTCTGACTGAACGAGAAGCTAGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAAGATTTAATATTAATTGTGAAATTAAAACGATATTAACAAAAAATCATACAATCAATTATAAAAAAAATCAAAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGTATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTTCTTGTGAATTGCAGAAGTGAATCATCAGTTTTTGAACGCACATTGCACTTTGGGGTATCCCCCAAAGTATACTTGTTTGAGCGTTGTTTCTCTCTTGGAATTGCATTGCTTTTCTAAAAAATCGAATCAAATTCGTTTGAAACATCCATTCTTCAACCTCAGATCAAGTAGGATTA
SEQ ID NO：70
圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)CBS14
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGCTATTGGGAGCTCGCGAGAGCACCTGACTGCCGAGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATTAGGGTGTCCAACTTAACTTGGAGCCCGACCCTCACTTTCTAACCCTGTGCATTTGTCTTGGGTAGTAGCTTGCGTCAGCGAGCGAATCCCATTTCACTTACAAACACAAAGTCTATGAATGTAACAAATTTATAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATTCTTCAACCCACCTCTTTCTTAGTGAATCAGGCGGTGTTTGGATTCTGAGCGCTGCTGGCTTCGCGGCCTAGCTCGCTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTCGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGATTCTGGTCTCTGACTGGAGCCGGGTAAGGTTAAAGGGAGCTACTAATCCTCATGTCTATCTTGAGATTAGACCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：71
粘红酵母胶粘变种CBS6020和Lipomyces orientalis CBS10300
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGCTATTGGGAGCTCGCGAGAGCACCTGACTGCTGAGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATCTAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCATCTGTTAATTGGAATAGTAGCTCTTCGGAGTGAACCACCATTCACTTATAAAACACAAAGTCTATGAATGTATACAAATTTATAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCCACCTCTTTCTTAGTGAATCTGGTGGTGCTTGGTTTCTGAGCGCTGCTCTGCTTCGGCTTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAACCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGATTCTAGTTTACTAGAGCCGAGTTGGGTTAAAGGAAGCTCCTAATCCTAAAGTCTATTTTTTGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：72
橙黄红酵母CBS317
CGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGATTTCCGGATTGGCGTTAGGAAGCCGGCAACGGCATCCTTTGGCTGAGAAGCTACTCAAACTTGGTCATTTAAAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGATTTGCCTTCGGGCTAACTATATCCATAACACCTGTGAACTGTTGATTGACTTCGGTCAATATTTTTACAAACATTGTGTAATGAACGTCATGTTATAATAACAAATATAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAACTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTCAACCATTAGGGTTTCTTAATGGCTTGGATTTGGACGTTTGCCAGTCAAATGGCTCGTCTTAAAAGAGTTAGTGAATTTAACATTTGTCTTCTGGCGTAATAAGTTTCGCTGGGCTGATAGTGTGAAGTTTGCTTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTCTTGAACTCTGGCCTCAAATCAGGTAGGACTA
SEQ ID NO：73
德布尔有孢酵母(Torulaspora delbrueckii)CBS2924
CGCCCGTCGCTAGTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCAGGATCTGCTTAGAGAAGGGGGCAACTCCATCTCAGAGCGGAGAATCTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAACTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGAGAAATCTATATGAATGAAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCAGGTTCAAGACCAGCGCTTAATTGCGCGGTTGCGGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAACATGTCTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAGTTTTCTACACAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATTATTATAAACCAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACAATCATGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTGTCAAGGGTTAACTTGAAATTGCTAGCCTGTTATTTGGTTGTGATTTTGCTGGCTTGGATGACTTTGTCCAGTCTAGCTAATACCGAATTGTCGTATTAGGTTTTACCAACTTCGGCAGACTGTGTGTTGGCTCGGGCGCTTTAAAGACTTTGTCGTAAACGATTTATCGTTTGTTTGAGCTTTTCGCATACGCAATCCGGGCGAACAATACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATA
SEQ ID NO：74
用于从Prototheca moriformis(UTEX1435)扩增Δ12FAD基因组的5′引物
5’-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3’
SEQ ID NO：75
用于从Prototheca moriformis(UTEX1435)扩增Δ12FAD基因组的3′引物
5’-GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3’
SEQ ID NO：76
pSZ11245′基因靶向序列(FAD2B)
gctcttcgagacgtggtctgaatcctccaggcgggtttccccgagaaagaaagggtgccgatttcaaagcagagccatgtgccgggccctgtggcctgtgttggcgcctatgtagtcaccccccctcacccaattgtcgccagtttgcgcaatccataaactcaaaactgcagcttctgagctgcgctgttcaagaacacctctggggtttgctcacccgcgaggtcgacgcccagcatggctatcaagacgaacaggcagcctgtggagaagcctccgttcacgatcgggacgctgcgcaaggccatccccgcgcactgtttcgagcgctcggcgcttcgtagcagcatgtacctggcctttgacatcgcggtcatgtccctgctctacgtcgcgtcgacgtacatcgaccctgcgccggtgcctacgtgggtcaagtatggcgtcatgtggccgctctactggttcttccaggtgtgtgtgagggttgtggttgcccgtatcgaggtcctggtggcgcgcatgggggagaaggcgcctgtcccgctgacccccccggctaccctcccggcaccttccagggcgccttcggcacgggtgtctgggtgtgcgcgcacgagtgcggccaccaggccttttcctccagccaggccatcaacgacggcgtgggcctggtgttccacagcctgctgctggtgccctactactcctggaagcactcgcaccgggtacc
SEQ ID NO：77
pSZ11243′基因靶向序列(FAD2B)
ccgccaccactccaacacggggtgcctggacaaggacgaggtgtttgtgccgccgcaccgcgcagtggcgcacgagggcctggagtgggaggagtggctgcccatccgcatgggcaaggtgctggtcaccctgaccctgggctggccgctgtacctcatgttcaacgtcgcctcgcggccgtacccgcgcttcgccaaccactttgacccgtggtcgcccatcttcagcaagcgcgagcgcatcgaggtggtcatctccgacctggcgctggtggcggtgctcagcgggctcagcgtgctgggccgcaccatgggctgggcctggctggtcaagacctacgtggtgccctacctgatcgtgaacatgtggctcgtgctcatcacgctgctccagcacacgcacccggcgctgccgcactacttcgagaaggactgggactggctgcgcggcgccatggccaccgtggaccgctccatgggcccgcccttcatggacaacatcctgcaccacatctccgacacccacgtgctgcaccacctcttcagcaccatcccgcactaccacgccgaggaggcctccgccgccatcaggcccatcctgggcaagtactaccagtccgacagccgctgggtcggccgcgccctgtgggaggactggcgcgactgccgctacgtcgtcccggacgcgcccgaggacgactccgcgctctggttccacaagtgagtgagtgagaagagc
SEQ ID NO：78
酿酒酵母suc2盒
ctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacggcgcgccATGctgctgcaggccttcctgttcctgctggccggcttcgccgccaagatcagcgcctccatgacgaacgagacgtccgaccgccccctggtgcacttcacccccaacaagggctggatgaacgaccccaacggcctgtggtacgacgagaaggacgccaagtggcacctgtacttccagtacaacccgaacgacaccgtctgggggacgcccttgttctggggccacgccacgtccgacgacctgaccaactgggaggaccagcccatcgccatcgccccgaagcgcaacgactccggcgccttctccggctccatggtggtggactacaacaacacctccggcttcttcaacgacaccatcgacccgcgccagcgctgcgtggccatctggacctacaacaccccggagtccgaggagcagtacatctcctacagcctggacggcggctacaccttcaccgagtaccagaagaaccccgtgctggccgccaactccacccagttccgcgacccgaaggtcttctggtacgagccctcccagaagtggatcatgaccgcggccaagtcccaggactacaagatcgagatctactcctccgacgacctgaagtcctggaagctggagtccgcgttcgccaacgagggcttcctcggctaccagtacgagtgccccggcctgatcgaggtccccaccgagcaggaccccagcaagtcctactgggtgatgttcatctccatcaaccccggcgccccggccggcggctccttcaaccagtacttcgtcggcagcttcaacggcacccacttcgaggccttcgacaaccagtcccgcgtggtggacttcggcaaggactactacgccctgcagaccttcttcaacaccgacccgacctacgggagcgccctgggcatcgcgtgggcctccaactgggagtactccgccttcgtgcccaccaacccctggcgctcctccatgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccgagtaccaggccaacccggagacggagctgatcaacctgaaggccgagccgatcctgaacatcagcaacgccggcccctggagccggttcgccaccaacaccacgttgacgaaggccaacagctacaacgtcgacctgtccaacagcaccggcaccctggagttcgagctggtgtacgccgtcaacaccacccagacgatctccaagtccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggaggaccccgaggagtacctccgcatgggcttcgaggtgtccgcgtcctccttcttcctggaccgcgggaacagcaaggtgaagttcgtgaaggagaacccctacttcaccaaccgcatgagcgtgaacaaccagcccttcaagagcgagaacgacctgtcctactacaaggtgtacggcttgctggaccagaacatcctggagctgtacttcaacgacggcgacgtcgtgtccaccaacacctacttcatgaccaccgggaacgccctgggctccgtgaacatgacgacgggggtggacaacctgttctacatcgacaagttccaggtgcgcgaggtcaagTGAcaattggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatgga
SEQ ID NO：79
pSZ11255′基因靶向序列(FAD2C)
gctcttcgaggggctggtctgaatccttcaggcgggtgttacccgagaaagaaagggtgccgatttcaaagcagacccatgtgccgggccctgtggcctgtgttggcgcctatgtagtcaccccccctcacccaattgtcgccagtttgcgcactccataaactcaaaacagcagcttctgagctgcgctgttcaagaacacctctggggtttgctcacccgcgaggtcgacgcccagcatggctatcaagacgaacaggcagcctgtggagaagcctccgttcacgatcgggacgctgcgcaaggccatccccgcgcactgtttcgagcgctcggcgcttcgtagcagcatgtacctggcctttgacatcgcggtcatgtccctgctctacgtcgcgtcgacgtacatcgaccctgcaccggtgcctacgtgggtcaagtacggcatcatgtggccgctctactggttcttccaggtgtgtttgagggttttggttgcccgtattgaggtcctggtggcgcgcatggaggagaaggcgcctgtcccgctgacccccccggctaccctcccggcaccttccagggcgccttcggcacgggtgtctgggtgtgcgcgcacgagtgcggccaccaggccttttcctccagccaggccatcaacgacggcgtgggcctggtgttccacagcctgctgctggtgccctactactcctggaagcactcgcaccgggtacc
SEQ ID NO：80
pSZ11253′基因靶向序列(FAD2C)
ccgccaccactccaacacggggtgcctggacaaggacgaggtgtttgtgccgccgcaccgcgcagtggcgcacgagggcctggagtgggaggagtggctgcccatccgcatgggcaaggtgctggtcaccctgaccctgggctggccgctgtacctcatgttcaacgtcgcctcgcggccgtacccgcgcttcgccaaccactttgacccgtggtcgcccatcttcagcaagcgcgagcgcatcgaggtggtcatctccgacctggcgctggtggcggtgctcagcgggctcagcgtgctgggccgcaccatgggctgggcctggctggtcaagacctacgtggtgccctacctgatcgtgaacatgtggctcgtgctcatcacgctgctccagcacacgcacccggcgctgccgcactacttcgagaaggactgggactggctgcgcggcgccatggccaccgtggaccgctccatgggcccgcccttcatggacaacatcctgcaccacatctccgacacccacgtgctgcaccacctcttcagcaccatcccgcactaccacgccgaggaggcctccgccgccatcaggcccatcctgggcaagtactaccagtccgacagccgctgggtcggccgcgccctgtgggaggactggcgcgactgccgctacgtcgtcccggacgcgcccgaggacgactccgcgctctggttccacaagtgagtgagtgagaagagc
SEQ ID NO：81
5′6S基因组供体序列
GCTCTTCGCCGCCGCCACTCCTGCTCGAGCGCGCCCGCGCGTGCGCCGCCAGCGCCTTGGCCTTTTCGCCGCGCTCGTGCGCGTCGCTGATGTCCATCACCAGGTCCATGAGGTCTGCCTTGCGCCGGCTGAGCCACTGCTTCGTCCGGGCGGCCAAGAGGAGCATGAGGGAGGACTCCTGGTCCAGGGTCCTGACGTGGTCGCGGCTCTGGGAGCGGGCCAGCATCATCTGGCTCTGCCGCACCGAGGCCGCCTCCAACTGGTCCTCCAGCAGCCGCAGTCGCCGCCGACCCTGGCAGAGGAAGACAGGTGAGGGGGGTATGAATTGTACAGAACAACCACGAGCCTTGTCTAGGCAGAATCCCTACCAGTCATGGCTTTACCTGGATGACGGCCTGCGAACAGCTGTCCAGCGACCCTCGCTGCCGCCGCTTCTCCCGCACGCTTCTTTCCAGCACCGTGATGGCGCGAGCCAGCGCCGCACGCTGGCGCTGCGCTTCGCCGATCTGAGGACAGTCGGGGAACTCTGATCAGTCTAAACCCCCTTGCGCGTTAGTGTTGCCATCCTTTGCAGACCGGTGAGAGCCGACTTGTTGTGCGCCACCCCCCACACCACCTCCTCCCAGACCAATTCTGTCACCTTTTTGGCGAAGGCATCGGCCTCGGCCTGCAGAGAGGACAGCAGTGCCCAGCCGCTGGGGGTTGGCGGATGCACGCTCAGGTACC
SEQ ID NO：82
用于樟树(Cinnamomum camphora)硫酯酶的相关表达构建体(Ptub：：neo：：nitred：：ptub：：C.camphora TE：：nitred)
CTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCCTGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGACTGGATCCTGGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATCGAGTACCGCCGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID NO：83
Prototheca moriformis SugT糖转运蛋白启动子/5″UTR
CCAGGCAGGCGGTAGGGTTGCCGATTGCTTGAGCGAATTGGAAGATATAATTTTTTGTGGTGTCCCTGGACGCTGTTTGTGGCGCTCCTTTTTGGAGAAGATTGCGTGGGGGAGCTTTCCATGTACCACGCTTCCTTCTGAAAGGATTCTGGCCGAGTCCTGATGAGCCCAAAGAAAACACCTGCCTTTCAGTGCTGGCACTCTGAAAACGTCAACAGATGATTATACATGTCACAAAAGGCAGCCGATTAGGAACGGGAGCTCTGGCCGTTCGTTTGGCTGCCTGGGCTGATTGAAGTGATCCACCCTGTTCGAATGAAGGCGGTCGAGTCGAATTATCGACCGGAGCTGTCGGGAAGGCGTCCGGGGCAGAGTGAGGTGCTGCGGCCTGGTTGTCGTTCAAAAAGACCCCGGTAGCCCAACAATCACGAACGAAAGGAATATAATTGCTTGCATACTATACATTCAGTTTCTATGTGGCGGGTAGACAAGTCTCATGGGCTTCTAAAGGCTGTCCCTTGAAGGCTACTTATAAAAACTTGCTGCGCCATGGCACGGATCGCGCTTGCGCAGGCTGCAACCCTGCGCGCAAGGTCAAATACACAGCAAAAGATACTAACAGAATTTCTAAAAACATTTAAATATTTGTTTCGACCAGCCAATTGTGGTCGTAGGCACGCAAAAGACTTTGTTTTGCGCCCACCGAGCATCCACGCTGGCAGTCAAGCCAGTCCGATGTGCATTGCGTGGCAGCATCGAGGAGCATCAAAAACCTCGTGCACGCTTTTCTGTCAATCATCATCAACCACTCCACCATGTATACCCGATGCATCGCGGTGCGCAGCGCGCCACGCGTCCCAGACCCGCCCAAAAACCCAGCAGCGGCGAAAGCAAATCTTCACTTGCCCGAAACCCCGAGCAGCGGCATTCACACGTGGGCGAAAACCCCACTTGCCCTAACAGGCGTATGTCTGCTGTCACGATGCCTGACAACGGTATTATAGATATACACTGATTAATGTTTGAGTGTGTGCGAGTCGCGAATCAGGAATGAATTGCTAGTAGGCACTCCGACCGGGCGGGGGCCGAGGGACCA
SEQ ID NO：84
amt03启动子/UTR序列
GGCCGACAGGACGCGCGTCAAAGGTGCTGGTCGTGTATGCCCTGGCCGGCAGGTCGTTGCTGCTGCTGGTTAGTGATTCCGCAACCCTGATTTTGGCGTCTTATTTTGGCGTGGCAAACGCTGGCGCCCGCGAGCCGGGCCGGCGGCGATGCGGTGCCCCACGGCTGCCGGAATCCAAGGGAGGCAAGAGCGCCCGGGTCAGTTGAAGGGCTTTACGCGCAAGGTACAGCCGCTCCTGCAAGGCTGCGTGGTGGAATTGGACGTGCAGGTCCTGCTGAAGTTCCTCCACCGCCTCACCAGCGGACAAAGCACCGGTGTATCAGGTCCGTGTCATCCACTCTAAAGAGCTCGACTACGACCTACTGATGGCCCTAGATTCTTCATCAAAAACGCCTGAGACACTTGCCCAGGATTGAAACTCCCTGAAGGGACCACCAGGGGCCCTGAGTTGTTCCTTCCCCCCGTGGCGAGCTGCCAGCCAGGCTGTACCTGTGATCGAGGCTGGCGGGAAAATAGGCTTCGTGTGCTCAGGTCATGGGAGGTGCAGGACAGCTCATGAAACGCCAACAATCGCACAATTCATGTCAAGCTAATCAGCTATTTCCTCTTCACGAGCTGTAATTGTCCCAAAATTCTGGTCTACCGGGGGTGATCCTTCGTGTACGGGCCCTTCCCTCAACCCTAGGTATGCGCGCATGCGGTCGCCGCGCAACTCGCGCGAGGGCCGAGGGTTTGGGACGGGCCGTCCCGAAATGCAGTTGCACCCGGATGCGTGGCACCTTTTTTGCGATAATTTATGCAATGGACTGCTCTGCAAAATTCTGGCTCTGTCGCCAACCCTAGGATCAGCGGCGTAGGATTTCGTAATCATTCGTCCTGATGGGGAGCTACCGACTACCCTAATATCAGCCCGACTGCCTGACGCCAGCGTCCACTTTTGTGCACACATTCCATTCGTGCCCAAGACATTTCATTGTGGTGCGAAGCGTCCCCAGTTACGCTCACCTGTTTCCCGACCTCCTTACTGTTCTGTCGACAGAGCGGGCCCACAGGCCGGTCGCAGCC
SEQ ID NO：85
普通小球藻(Chlorella vulgaris)硝酸盐还原酶3′UTR
GCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCC
SEQ ID NO：86
密码子优化的原始小球藻(Chlorella protothecoides)(UTEX250)硬脂酰ACP去饱和酶转运肽cDNA序列
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCC
SEQ ID NO：87
具有来自pSZ1375的原始小球藻UTEX250硬脂酰-ACP去饱和酶转运肽的蓖麻ACP-硫酯酶的密码子优化的编码序列
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCGCTCCTACGAGGTGGGCATCAACAAGACCGCCACCGTGGAGACCATCGCCAACCTGCTGCAGGAGGTGGGCTGCAACCACGCCCAGTCCGTGGGCTTCTCCACCGACGGCTTCGCCACCACCACCTCCATGCGCAAGATGCACCTGATCTGGGTGACCGCCCGCATGCACATCGAGATCTACAAGTACCCCGCCTGGTCCGACGTGGTGGAGGTGGAGACCTGGTGCCAGTCCGAGGGCCGCATCGGCACCCGCCGCGACTGGATCCTGACCGACTACGCCACCGGCCAGATCATCGGCCGCGCCACCTCCAAGTGGGTGATGATGAACCAGGACACCCGCCGCCTGCAGAAGGTGACCGACGACGTGCGCGAGGAGTACCTGGTGTTCTGCCCCCGCGAGCTGCGCCTGGCCTTCCCCGAGGAGAACAACCGCTCCTCCAAGAAGATCTCCAAGCTGGAGGACCCCGCCCAGTACTCCAAGCTGGGCCTGGTGCCCCGCCGCGCCGACCTGGACATGAACCAGCACGTGAACAACGTGACCTACATCGGCTGGGTGCTGGAGTCCATCCCCCAGGAGATCATCGACACCCACGAGCTGCAGACCATCACCCTGGACTACCGCCGCGAGTGCCAGCACGACGACATCGTGGACTCCCTGACCTCCGTGGAGCCCTCCGAGAACCTGGAGGCCGTGTCCGAGCTGCGCGGCACCAACGGCTCCGCCACCACCACCGCCGGCGACGAGGACTGCCGCAACTTCCTGCACCTGCTGCGCCTGTCCGGCGACGGCCTGGAGATCAACCGCGGCCGCACCGAGTGGCGCAAGAAGTCCGCCCGCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGAATCGAT
SEQ ID NO：88
蓖麻ACP-硫酯酶的氨基酸序列(登录号ABS30422.1)
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SEQ ID NO：89
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhard)TUB2启动子/5′UTR
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SEQ ID NO：90
来自pSZ1468的发夹RNA表达盒的FADc部分
ACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTAGCAGCATGTACCTGGCCTTTGACATCGCGGTCATGTCCCTGCTCTACGTCGCGTCGACGTACATCGACCCTGCACCGGTGCCTACGTGGGTCAAGTACGGCATCATGTGGCCGCTCTACTGGTTCTTCCAGGTGTGTTTGAGGGTTTTGGTTGCCCGTATTGAGGTCCTGGTGGCGCGCATGGAGGAGAAGGCGCCTGTCCCGCTGACCCCCCCGGCTACCCTCCCGGCACCTTCCAGGGCGCGTACGGGAAGAACCAGTAGAGCGGCCACATGATGCCGTACTTGACCCACGTAGGCACCGGTGCAGGGTCGATGTACGTCGACGCGACGTAGAGCAGGGACATGACCGCGATGTCAAAGGCCAGGTACATGCTGCTACGAAGCGCCGAGCGCTCGAAACAGTGCGCGGGGATGGCCTTGCGCAGCGTCCCGATCGTGAACGGAGGCTTCTCCACAGGCTGCCTGTTCGTCTTGATAGCCAT
SEQ ID NO：91
来自pSZ1468的FADc发夹RNA表达盒的相关部分
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SEQ ID NO：92
来自pSZ1469的发夹RNA表达盒的FADc部分
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SEQ ID NO：93
来自pSZ1469的FADc发夹RNA表达盒的相关部分
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SEQ ID NO：94
来自pSZ1470的发夹RNA表达盒的FADc部分
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SEQ ID NO：95
来自pSZ1470的FADc发夹RNA表达盒的相关部分
GCTCTTCGCCGCCGCCACTCCTGCTCGAGCGCGCCCGCGCGTGCGCCGCCAGCGCCTTGGCCTTTTCGCCGCGCTCGTGCGCGTCGCTGATGTCCATCACCAGGTCCATGAGGTCTGCCTTGCGCCGGCTGAGCCACTGCTTCGTCCGGGCGGCCAAGAGGAGCATGAGGGAGGACTCCTGGTCCAGGGTCCTGACGTGGTCGCGGCTCTGGGAGCGGGCCAGCATCATCTGGCTCTGCCGCACCGAGGCCGCCTCCAACTGGTCCTCCAGCAGCCGCAGTCGCCGCCGACCCTGGCAGAGGAAGACAGGTGAGGGGGGTATGAATTGTACAGAACAACCACGAGCCTTGTCTAGGCAGAATCCCTACCAGTCATGGCTTTACCTGGATGACGGCCTGCGAACAGCTGTCCAGCGACCCTCGCTGCCGCCGCTTCTCCCGCACGCTTCTTTCCAGCACCGTGATGGCGCGAGCCAGCGCCGCACGCTGGCGCTGCGCTTCGCCGATCTGAGGACAGTCGGGGAACTCTGATCAGTCTAAACCCCCTTGCGCGTTAGTGTTGCCATCCTTTGCAGACCGGTGAGAGCCGACTTGTTGTGCGCCACCCCCCACACCACCTCCTCCCAGACCAATTCTGTCACCTTTTTGGCGAAGGCATCGGCCTCGGCCTGCAGAGAGGACAGCAGTGCCCAGCCGCTGGGGGTTGGCGGATGCACGCTCAGGTACCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTG CTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCGGCCGACAGGACGCGCGTCAAAGGTGCTGGTCGTGTATGCCCTGGCCGGCAGGTCGTTGCTGCTGCTGGTTAGTGATTCCGCAACCCTGATTTTGGCGTCTTATTTTGGCGTGGCAAACGCTGGCGCCCGCGAGCCGGGCCGGCGGCGATGCGGTGCCCCACGGCTGCCGGAATCCAAGGGAGGCAAGAGCGCCCGGGTCAGTTGAAGGGCTTTACGCGCAAGGTACAGCCGCTCCTGCAAGGCTGCGTGGTGGAATTGGACGTGCAGGTCCTGCTGAAGTTCCTCCACCGCCTCACCAGCGGACAAAGCACCGGTGTATCAGGTCCGTGTCATCCACTCTAAAGAGCTCGACTACGACCTACTGATGGCCCTAGATTCTTCATCAAAAACGCCTGAGACACTTGCCCAGGATTGAAACTCCCTGAAGGGACCACCAGGGGCCCTGAGTTGTTCCTTCCCCCCGTGGCGAGCTGCCAGCCAGGCTGTACCTGTGATCGAGGCTGGCGGGAAAATAGGCTTCGTGTGCTCAGGTCATGGGAGGTGCAGGACAGCTCATGAAACGCCAACAATCGCACAATTCATGTCAAGCTAATCAGCTATTTCCTCTTCACGAGCTGTAATTGTCCCAAAATTCTGGTCTACCGGGGGTGATCCTTCGTGTACGGGCCCTTCCCTCAACCCTAGGTATGCGCGCATGCGGTCGCCGCGCAACTCGCGCGAGGGCCGAGGGTTTGGGACGGGCCGTCCCGAAATGCAGTTGCACCCGGATGCGTGGCACCTTTTTTGCGATAATTTATGCAATGGACTGCTCTGCAAAATTCTGGCTCTGTCGCCAACCCTAGGATCAGCGGCGTAGGATTTCGTAATCATTCGTCCTGATGGGGAGCTACCGACTACCCTAATATCAGCCCGACTGCCTGACGCCAGCGTCCACTTTTGTGCACACATTCCATTCGTGCCCAAGACATTTCATTGTGGTGCGAAGCGTCCCCAGTTACGCTCACCTGTTTCCCGACCTCCTTACTGTTCTGTCGACAGAGCGGGCCCACAGGCCGGTCGCAGCCACTAGTTCACTTGTGGAACCAGAGCGCGGAGTCGTCCTCGGGCGCGTCCGGGACGACGTAGCGGCAGTCGCGCCAGTCCTCCCACAGGGCGCGGCCGACCCAGCGGCTGTCGGACTGGTAGTACTTGCCCAGGATGGGCCTGATGGCGGCGGAGGCCTCCTCGGCGTGGTAGTGCGGGATGGTGCTGAAGAGGTGGTGCAGCACGTGGGTGTCGGAGATGTGGTGCAGGATGTTGTCCATGAAGGGCGGGCCCATGGAGCGGTCCACGGTGGCCATGGCGCCGCGCAGCCAGTCCCAGTCCTTCTCGAAGTAGTGCGGCAGCGCCGGGTGCGTGTGCTGGAGCAGCGTGATGAGCACGAGCCACATGTTCACGATCAGGTAGGGCACCACGTAGGTCTTGACCAGCCAGGCCCAGCCCATGGTGCGGCCCAGCACGCTGAGCCCGCTGAGCACCGCCACCAGCGCCAGGTCGGAGATGACCACCTCGATGCGCTCGCGCTTGCTGAAGATGGGCGACCACGGGTCAAAGTGGTTGGCGAAGCGCGGGTACGGCCGCGAGGCGACGTTGAACATGAGGTACAGCGGCCAGCCCAGGGTCAGGGTGACCAGCACCTTGCCCATGCGGATGGGCAGCCACTCCTCCCACTCCAGGCCCTCGTGCGCCACTGCGCGGTGCGGCGGCACAAACACCTCGTCCTTGTCCAGGCACCCCGTGTTGGAGTGGTGGCGGCGGTGCGAGTGCTTCCAGGAGTAGTAGGGCACCAGCAGCAGGCTGTGGAACACCAGGCCCACGCCGTCGTTGATGGCCTGGCTGGAGGAAAAGGCCTGGTGGCCGCACTCGTGCGCGCACACCCAGACACCCGTGCCGAAGGCGCCCTGGAAGGTGCCGGGAGGGTAGCCGGGGGGGTCAGCGGGACAGGCGCCTTCTCCTCCATGCGCGCCACCAGGACCTCAATACGGGCAACCAAAACCCTCAAACACACCTGGAAGAACCAGTAGAGCGGCCACATGATGCCGTACTTGACCCACGTAGGCACCGGTGCAGGGTCGATGTACGTCGACGCGACGTAGAGCAGGGACATGACCGCGATGTCAAAGGCCAGGTACATGCTGCTACGAAGCGCCGAGCGCTCGAAACAGTGCGCGGGGATGGCCTTGCGCAGCGTCCCGATCGTGAACGGAGGCTTCTCCACAGGCTGCCTGTTCGTCTTGATAGCCATCTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTGTAGAGCTCTTGTTTTCCAGAAGGAGTTGCTCCTTGAGCCTTTCATTCTCAGCCTCGATAACCTCCAAAGCCGCTCTAATTGTGGAGGGGGTTCGAATTTAAAAGCTTGGAATGTTGGTTCGTGCGTCTGGAACAAGCCCAGACTTGTTGCTCACTGGGAAAAGGACCATCAGCTCCAAAAAACTTGCCGCTCAAACCGCGTACCTCTGCTTTCGCGCAATCTGCCCTGTTGAAATCGCCACCACATTCATATTGTGACGCTTGAGCAGTCTGTAATTGCCTCAGAATGTGGAATCATCTGCCCCCTGTGCGAGCCCATGCCAGGCATGTCGCGGGCGAGGACACCCGCCACTCGTACAGCAGACCATTATGCTACCTCACAATAGTTCATAACAGTGACCATATTTCTCGAAGCTCCCCAACGAGCACCTCCATGCTCTGAGTGGCCACCCCCCGGCCCTGGTGCTTGCGGAGGGCAGGTCAACCGGCATGGGGCTACCGAAATCCCCGACCGGATCCCACCACCCCCGCGATGGGAAGAATCTCTCCCCGGGATGTGGGCCCACCACCAGCACAACCTGCTGGCCCAGGCGAGCGTCAAACCATACCACACAAATATCCTTGGCATCGGCCCTGAATTCCTTCTGCCGCTCTGCTACCCGGTGCTTCTGTCCGAAGCAGGGGTTGCTAGGGATCGCTCCGAGTCCGCAAACCCTTGTCGCGTGGCGGGGCTTGTTCGAGCTTGAAGAGC
SEQ ID NO：96
来自pSZ1471的发夹RNA表达盒的FADc部分
ACTAGTTCACTTGTGGAACCAGAGCGCGGAGTCGTCCTCGGGCGCGTCCGGGACGACGTAGCGGCAGTCGCGCCAGTCCTCCCACAGGGCGCGGCCGACCCAGCGGCTGTCGGACTGGTAGTACTTGCCCAGGATGGGCCTGATGGCGGCGGAGGCCTCCTCGGCGTGGTAGTGCGGGATGGTGCTGAAGAGGTGGTGCAGCACGTGGGTGTCGGAGATGTGGTGCAGGATGTTGTCCATGAAGGGCGGGCCCATGGAGCGGTCCACGGTGGCCATGGCGCCGCGCAGCCAGTCCCAGTCCTTCTCGAAGTAGTGCGGCAGCGCCGGGTGCGTGTGCTGGAGCAGCGTGATGAGCACGAGCCACATGTTCACGATCAGGTAGGGCACCACGTAGGTCTTGACCAGCCAGGCCCAGCCCATGGTGCGGCCCAGCACGCTGAGCCCGCTGAGCACCGCCACCAGCGCCAGGTCGGAGATGACCACCTCGATGCGCTCGCGCTTGCTGAAGATGGGCGACCACGGGTCAAAGTGGTTGGCGAAGCGCGGGTACGGCCGCGAGGCGACGTTGAACATGAGGTACAGCGGCCAGCCCAGGGTCAGGGTGACCAGCACCTTGCCCATGCGGATGGGCAGCCACTCCTCCCACTCCAGGCCCTCGTGCGCCACTGCGCGGTGCGGCGGCACAAACACCTCGTCCTTGTCCAGGCACCCCGTGTTGGAGTGGTGGCGGCGGTGCGAGTGCTTCCAGGAGTAGTAGGGCACCAGCAGCAGGCTGTGGAACACCAGGCCCACGCCGTCGTTGATGGCCTGGCTGGAGGAAAAGGCCTGGTGGCCGCACTCGTGCGCGCACACCCAGACACCCGTGCCGAAGGCGCCCTGGAAGGTGCCGGGAGGGTAGCCGGGGGGGTCAGCGGGACAGGCGCCTTCTCCTCCATGCGCGCCACCAGGACCTCAATACGGGCAACCAAAACCCTCAAACACACCTGGAAGAACCAGTAGAGCGGCCACATGATGCCGTACTTGACCCACGTAGGCACCGGTGCAGGGTCGATGTACGTCGACGCGACGTAGAGCAGGGACATGACCGCGATGTCAAAGGCCAGGTACATGCTGCTACGAAGCGCCGAGCGCTCGAAACAGTGCGCGGGGATGGCCTTGCGCAGCGTCCCGATCGTGAACGGAGGCTTCTCCACAGGCTGCCTGTTCGTCTTGATAGCCAT
SEQ ID NO：97
来自pSZ1471的FADc发夹RNA表达盒的相关部分
GCTCTTCGCCGCCGCCACTCCTGCTCGAGCGCGCCCGCGCGTGCGCCGCCAGCGCCTTGGCCTTTTCGCCGCGCTCGTGCGCGTCGCTGATGTCCATCACCAGGTCCATGAGGTCTGCCTTGCGCCGGCTGAGCCACTGCTTCGTCCGGGCGGCCAAGAGGAGCATGAGGGAGGACTCCTGGTCCAGGGTCCTGACGTGGTCGCGGCTCTGGGAGCGGGCCAGCATCATCTGGCTCTGCCGCACCGAGGCCGCCTCCAACTGGTCCTCCAGCAGCCGCAGTCGCCGCCGACCCTGGCAGAGGAAGACAGGTGAGGGGGGTATGAATTGTACAGAACAACCACGAGCCTTGTCTAGGCAGAATCCCTACCAGTCATGGCTTTACCTGGATGACGGCCTGCGAACAGCTGTCCAGCGACCCTCGCTGCCGCCGCTTCTCCCGCACGCTTCTTTCCAGCACCGTGATGGCGCGAGCCAGCGCCGCACGCTGGCGCTGCGCTTCGCCGATCTGAGGACAGTCGGGGAACTCTGATCAGTCTAAACCCCCTTGCGCGTTAGTGTTGCCATCCTTTGCAGACCGGTGAGAGCCGACTTGTTGTGCGCCACCCCCCACACCACCTCCTCCCAGACCAATTCTGTCACCTTTTTGGCGAAGGCATCGGCCTCGGCCTGCAGAGAGGACAGCAGTGCCCAGCCGCTGGGGGTTGGCGGATGCACGCTCAGGTACCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTTCACTTGTGGAACCAGAGCGCGGAGTCGTCCTCGGGCGCGTCCGGGACGACGTAGCGGCAGTCGCGCCAGTCCTCCCACAGGGCGCGGCCGACCCAGCGGCTGTCGGACTGGTAGTACTTGCCCAGGATGGGCCTGATGGCGGCGGAGGCCTCCTCGGCGTGGTAGTGCGGGATGGTGCTGAAGAGGTGGTGCAGCACGTGGGTGTCGGAGATGTGGTGCAGGATGTTGTCCATGAAGGGCGGGCCCATGGAGCGGTCCACGGTGGCCATGGCGCCGCGCAGCCAGTCCCAGTCCTTCTCGAAGTAGTGCGGCAGCGCCGGGTGCGTGTGCTGGAGCAGCGTGATGAGCACGAGCCACATGTTCACGATCAGGTAGGGCACCACGTAGGTCTTGACCAGCCAGGCCCAGCCCATGGTGCGGCCCAGCACGCTGAGCCCGCTGAGCACCGCCACCAGCGCCAGGTCGGAGATGACCACCTCGATGCGCTCGCGCTTGCTGAAGATGGGCGACCACGGGTCAAAGTGGTTGGCGAAGCGCGGGTACGGCCGCGAGGCGACGTTGAACATGAGGTACAGCGGCCAGCCCAGGGTCAGGGTGACCAGCACCTTGCCCATGCGGATGGGCAGCCACTCCTCCCACTCCAGGCCCTCGTGCGCCACTGCGCGGTGCGGCGGCACAAACACCTCGTCCTTGTCCAGGCACCCCGTGTTGGAGTGGTGGCGGCGGTGCGAGTGCTTCCAGGAGTAGTAGGGCACCAGCAGCAGGCTGTGGAACACCAGGCCCACGCCGTCGTTGATGGCCTGGCTGGAGGAAAAGGCCTGGTGGCCGCACTCGTGCGCGCACACCCAGACACCCGTGCCGAAGGCGCCCTGGAAGGTGCCGGGAGGGTAGCCGGGGGGGTCAGCGGGACAGGCGCCTTCTCCTCCATGCGCGCCACCAGGACCTCAATACGGGCAACCAAAACCCTCAAACACACCTGGAAGAACCAGTAGAGCGGCCACATGATGCCGTACTTGACCCACGTAGGCACCGGTGCAGGGTCGATGTACGTCGACGCGACGTAGAGCAGGGACATGACCGCGATGTCAAAGGCCAGGTACATGCTGCTACGAAGCGCCGAGCGCTCGAAACAGTGCGCGGGGATGGCCTTGCGCAGCGTCCCGATCGTGAACGGAGGCTTCTCCACAGGCTGCCTGTTCGTCTTGATAGCCATCTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTGTAGAGCTCTTGTTTTCCAGAAGGAGTTGCTCCTTGAGCCTTTCATTCTCAGCCTCGATAACCTCCAAAGCCGCTCTAATTGTGGAGGGGGTTCGAATTTAAAAGCTTGGAATGTTGGTTCGTGCGTCTGGAACAAGCCCAGACTTGTTGCTCACTGGGAAAAGGACCATCAGCTCCAAAAAACTTGCCGCTCAAACCGCGTACCTCTGCTTTCGCGCAATCTGCCCTGTTGAAATCGCCACCACATTCATATTGTGACGCTTGAGCAGTCTGTAATTGCCTCAGAATGTGGAATCATCTGCCCCCTGTGCGAGCCCATGCCAGGCATGTCGCGGGCGAGGACACCCGCCACTCGTACAGCAGACCATTATGCTACCTCACAATAGTTCATAACAGTGACCATATTTCTCGAAGCTCCCCAACGAGCACCTCCATGCTCTGAGTGGCCACCCCCCGGCCCTGGTGCTTGCGGAGGGCAGGTCAACCGGCATGGGGCTACCGAAATCCCCGACCGGATCCCACCACCCCCGCGATGGGAAGAATCTCTCCCCGGGATGTGGGCCCACCACCAGCACAACCTGCTGGCCCAGGCGAGCGTCAAACCATACCACACAAATATCCTTGGCATCGGCCCTGAATTCCTTCTGCCGCTCTGCTACCCGGTGCTTCTGTCCGAAGCAGGGGTTGCTAGGGATCGCTCCGAGTCCGCAAACCCTTGTCGCGTGGCGGGGCTTGTTCGAGCTTGAAGAGC
SEQ ID NO：98
具有来自pSZ1377的原始小球藻UTEX250硬脂酰-ACP转运肽的油橄榄(Oleaeuropaea)硬脂酰-ACP去饱和酶的密码子优化的编码序列
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCGAGGTGCACGTGCAGGTGACCCACTCCCTGGCCCCCGAGAAGCGCGAGATCTTCAACTCCCTGAACAACTGGGCCCAGGAGAACATCCTGGTGCTGCTGAAGGACGTGGACAAGTGCTGGCAGCCCTCCGACTTCCTGCCCGACTCCGCCTCCGAGGGCTTCGACGAGCAGGTGATGGAGCTGCGCAAGCGCTGCAAGGAGATCCCCGACGACTACTTCATCGTGCTGGTGGGCGACATGATCACCGAGGAGGCCCTGCCCACCTACCAGACCATGCTGAACACCCTGGACGGCGTGCGCGACGAGACCGGCGCCTCCCTGACCCCCTGGGCCATCTGGACCCGCGCCTGGACCGCCGAGGAGAACCGCCACGGCGACCTGCTGAACAAGTACCTGTACCTGTCCGGCCGCGTGGACATGAAGCAGATCGAGAAGACCATCCAGTACCTGATCGGCTCCGGCATGGACCCCCGCACCGAGAACAACCCCTACCTGGGCTTCATCTACACCTCCTTCCAGGAGCGCGCCACCTTCATCTCCCACGGCAACACCGCCCGCCTGGCCAAGGAGCACGGCGACCTGAAGCTGGCCCAGATCTGCGGCATCATCGCCGCCGACGAGAAGCGCCACGAGACCGCCTACACCAAGATCGTGGAGAAGCTGTTCGAGATCGACCCCGACGGCACCGTGCTGGCCCTGGCCGACATGATGCGCAAGAAGGTGTCCATGCCCGCCCACCTGATGTACGACGGCCAGGACGACAACCTGTTCGAGAACTTCTCCTCCGTGGCCCAGCGCCTGGGCGTGTACACCGCCAAGGACTACGCCGACATCCTGGAGTTCCTGGTGGGCCGCTGGGACATCGAGAAGCTGACCGGCCTGTCCGGCGAGGGCCGCAAGGCCCAGGACTACGTGTGCACCCTGCCCCCCCGCATCCGCCGCCTGGAGGAGCGCGCCCAGTCCCGCGTGAAGAAGGCCTCCGCCACCCCCTTCTCCTGGATCTTCGGCCGCGAGATCAACCTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGAATCGAT
SEQ ID NO：99
油橄榄硬脂酰-ACP去饱和酶的氨基酸序列(登录号AAB67840.1)
MALKLCFPPHKMPSFPDARIRSHRVFMASTIHSPSMEVGKVKKPFTPPREVHVQVTHSLAPEKREIFNSLNNWAQENILVLLKDVDKCWQPSDFLPDSASEGFDEQVMELRKRCKEIPDDYFIVLVGDMITEEALPTYQTMLNTLDGVRDETGASLTPWAIWTRAWTAEENRHGDLLNKYLYLSGRVDMKQIEKTIQYLIGSGMDPRTENNPYLGFIYTSFQERATFISHGNTARLAKEHGDLKLAQICGIIAADEKRHETAYTKIVEKLFEIDPDGTVLALADMMRKKVSMPAHLMYDGQDDNLFENFSSVAQRLGVYTAKDYADILEFLVGRWDIEKLTGLSGEGRKAQDYVCTLPPRIRRLEERAQSRVKKASATPFSWIFGREINL
SEQ ID NO：100
Prototheca moriformis的5′6S基因组供体序列
GCTCTTCGCCGCCGCCACTCCTGCTCGAGCGCGCCCGCGCGTGCGCCGCCAGCGCCTTGGCCTTTTCGCCGCGCTCGTGCGCGTCGCTGATGTCCATCACCAGGTCCATGAGGTCTGCCTTGCGCCGGCTGAGCCACTGCTTCGTCCGGGCGGCCAAGAGGAGCATGAGGGAGGACTCCTGGTCCAGGGTCCTGACGTGGTCGCGGCTCTGGGAGCGGGCCAGCATCATCTGGCTCTGCCGCACCGAGGCCGCCTCCAACTGGTCCTCCAGCAGCCGCAGTCGCCGCCGACCCTGGCAGAGGAAGACAGGTGAGGGGGGTATGAATTGTACAGAACAACCACGAGCCTTGTCTAGGCAGAATCCCTACCAGTCATGGCTTTACCTGGATGACGGCCTGCGAACAGCTGTCCAGCGACCCTCGCTGCCGCCGCTTCTCCCGCACGCTTCTTTCCAGCACCGTGATGGCGCGAGCCAGCGCCGCACGCTGGCGCTGCGCTTCGCCGATCTGAGGACAGTCGGGGAACTCTGATCAGTCTAAACCCCCTTGCGCGTTAGTGTTGCCATCCTTTGCAGACCGGTGAGAGCCGACTTGTTGTGCGCCACCCCCCACACCACCTCCTCCCAGACCAATTCTGTCACCTTTTTGGCGAAGGCATCGGCCTCGGCCTGCAGAGAGGACAGCAGTGCCCAGCCGCTGGGGGTTGGCGGATGCACGCTCAGGTACC
SEQ ID NO：101
Prototheca moriformis的3′6S基因组供体序列
GAGCTCCTTGTTTTCCAGAAGGAGTTGCTCCTTGAGCCTTTCATTCTCAGCCTCGATAACCTCCAAAGCCGCTCTAATTGTGGAGGGGGTTCGAATTTAAAAGCTTGGAATGTTGGTTCGTGCGTCTGGAACAAGCCCAGACTTGTTGCTCACTGGGAAAAGGACCATCAGCTCCAAAAAACTTGCCGCTCAAACCGCGTACCTCTGCTTTCGCGCAATCTGCCCTGTTGAAATCGCCACCACATTCATATTGTGACGCTTGAGCAGTCTGTAATTGCCTCAGAATGTGGAATCATCTGCCCCCTGTGCGAGCCCATGCCAGGCATGTCGCGGGCGAGGACACCCGCCACTCGTACAGCAGACCATTATGCTACCTCACAATAGTTCATAACAGTGACCATATTTCTCGAAGCTCCCCAACGAGCACCTCCATGCTCTGAGTGGCCACCCCCCGGCCCTGGTGCTTGCGGAGGGCAGGTCAACCGGCATGGGGCTACCGAAATCCCCGACCGGATCCCACCACCCCCGCGATGGGAAGAATCTCTCCCCGGGATGTGGGCCCACCACCAGCACAACCTGCTGGCCCAGGCGAGCGTCAAACCATACCACACAAATATCCTTGGCATCGGCCCTGAATTCCTTCTGCCGCTCTGCTACCCGGTGCTTCTGTCCGAAGCAGGGGTTGCTAGGGATCGCTCCGAGTCCGCAAACCCTTGTCGCGTGGCGGGGCTTGTTCGAGCTTGAAGAGC
SEQ ID NO：102
Prototheca morif6rmis FADc敲除同源重组靶向构建体的5′供体DNA序列
GGGCTGGTCTGAATCCTTCAGGCGGGTGTTACCCGAGAAAGAAAGGGTGCCGATTTCAAAGCAGACCCATGTGCCGGGCCCTGTGGCCTGTGTTGGCGCCTATGTAGTCACCCCCCCTCACCCAATTGTCGCCAGTTTGCGCACTCCATAAACTCAAAACAGCAGCTTCTGAGCTGCGCTGTTCAAGAACACCTCTGGGGTTTGCTCACCCGCGAGGTCGACGCCCAGCATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTAGCAGCATGTACCTGGCCTTTGACATCGCGGTCATGTCCCTGCTCTACGTCGCGTCGACGTACATCGACCCTGCACCGGTGCCTACGTGGGTCAAGTACGGCATCATGTGGCCGCTCTACTGGTTCTTCCAGGTGTGTTTGAGGGTTTTGGTTGCCCGTATTGAGGTCCTGGTGGCGCGCATGGAGGAGAAGGCGCCTGTCCCGCTGACCCCCCCGGCTACCCTCCCGGCACCTTCCAGGGCGCCTTCGGCACGGGTGTCTGGGTGTGCGCGCACGAGTGCGGCCACCAGGCCTTTTCCTCCAGCCAGGCCATCAACGACGGCGTGGGCCTGGTGTTCCACAGCCTGCTGCTGGTGCCCTACTACTCCTGGAAGCACTCGCACCG
SEQ ID NO：103
Prototheca moriformis FADc敲除同源重组靶向构建体的3′供体DNA序列
CCGCCACCACTCCAACACGGGGTGCCTGGACAAGGACGAGGTGTTTGTGCCGCCGCACCGCGCAGTGGCGCACGAGGGCCTGGAGTGGGAGGAGTGGCTGCCCATCCGCATGGGCAAGGTGCTGGTCACCCTGACCCTGGGCTGGCCGCTGTACCTCATGTTCAACGTCGCCTCGCGGCCGTACCCGCGCTTCGCCAACCACTTTGACCCGTGGTCGCCCATCTTCAGCAAGCGCGAGCGCATCGAGGTGGTCATCTCCGACCTGGCGCTGGTGGCGGTGCTCAGCGGGCTCAGCGTGCTGGGCCGCACCATGGGCTGGGCCTGGCTGGTCAAGACCTACGTGGTGCCCTACCTGATCGTGAACATGTGGCTCGTGCTCATCACGCTGCTCCAGCACACGCACCCGGCGCTGCCGCACTACTTCGAGAAGGACTGGGACTGGCTGCGCGGCGCCATGGCCACCGTGGACCGCTCCATGGGCCCGCCCTTCATGGACAACATCCTGCACCACATCTCCGACACCCACGTGCTGCACCACCTCTTCAGCACCATCCCGCACTACCACGCCGAGGAGGCCTCCGCCGCCATCAGGCCCATCCTGGGCAAGTACTACCAGTCCGACAGCCGCTGGGTCGGCCGCGCCCTGTGGGAGGACTGGCGCGACTGCCGCTACGTCGTCCCGGACGCGCCCGAGGACGACTCCGCGCTCTGGTTCCACAAGTGAGTGAGTGA
SEQ ID NO：104
具有原始小球藻(UTEX250)硬脂酰ACP去饱和酶转运肽(39个残基，加下划线)和3xFLAG(粗体)的红花(Carthamus tinctorius)油酰-酰基载体蛋白(CtOTE)硫酯酶
MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRAATGEQPSGVASLREADKEKSLGNRLRLGSLTEDGLSYKEKFVIRCYEVGINKTATIETIANLLQEVGGNHAQGVGFSTDGFATTTTMRKLHLIWVTARMHIEIYRYPAWSDVIEIETWVQGEGKVGTRRDWILKDYANGEVIGRATSKWVMMNEDTRRLQKVSDDVREEYLVFCPRTLRLAFPEENNNSMKKIPKLEDPAEYSRLGLVPRRSDLDMNKHVNNVTYIGWALESIPPEIIDTHELQAITLDYRRECQRDDⅣDSLTSREPLGNAAGVKFKEING SVSPKKDEQDLSRFMHLLRSAGSGLEINRCRTEWRKKPAKRMDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
SEQ ID NO：105
Cuphea wrightii FatB2(CwTE2)硫酯酶的蛋白质序列；GenBank登录号U56104
MVVAAAASSAFFPVPAPRPTPKPGKFGNWPSSLSQPFKPKSNPNGRFQVKANVSPHPKANGSAVSLKSGSLNTLEDPPSSPPPRTFLNQLPDWSRLRTAITTVFVAAEKQFTRLDRKSKRPDMLVDWFGSETⅣQDGLVFRERFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQDTSLNHCKSVGLLNDGFGRTPEMCTRDLIWVLTKMQⅣVNRYPTWGDTVEINSWFSQSGKIGMGREWLISDCNTGEILVRATSAWAMMNQKTRRFSKLPCEVRQEIAPHFVDAPPVIEDNDRKLHKFDVKTGDSICKGLTPGWNDFDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLTLEYRRECGRESVVESVTSMNPSKVGDRSQYQHLLRLEDGADIMKGRTEWRPKNAGTNRAIST
SEQ ID NO：106
具有原始小球藻(UTEX250)硬脂酰ACP去饱和酶转运肽和3xFLAG标签的红花油酰-酰基载体蛋白(CtOTE)硫酯酶的密码子优化序列
ATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCGCCACCGGCGAGCAGCCCTCCGGCGTGGCCTCCCTGCGCGAGGCCGACAAGGAGAAGTCCCTGGGCAACCGCCTGCGCCTGGGCTCCCTGACCGAGGACGGCCTGTCCTACAAGGAGAAGTTCGTGATCCGCTGCTACGAGGTGGGCATCAACAAGACCGCCACCATCGAGACCATCGCCAACCTGCTGCAGGAGGTGGGCGGCAACCACGCCCAGGGCGTGGGCTTCTCCACCGACGGCTTCGCCACCACCACCACCATGCGCAAGCTGCACCTGATCTGGGTGACCGCCCGCATGCACATCGAGATCTACCGCTACCCCGCCTGGTCCGACGTGATCGAGATCGAGACCTGGGTGCAGGGCGAGGGCAAGGTGGGCACCCGCCGCGACTGGATCCTGAAGGACTACGCCAACGGCGAGGTGATCGGCCGCGCCACCTCCAAGTGGGTGATGATGAACGAGGACACCCGCCGCCTGCAGAAGGTGTCCGACGACGTGCGCGAGGAGTACCTGGTGTTCTGCCCCCGCACCCTGCGCCTGGCCTTCCCCGAGGAGAACAACAACTCCATGAAGAAGATCCCCAAGCTGGAGGACCCCGCCGAGTACTCCCGCCTGGGCCTGGTGCCCCGCCGCTCCGACCTGGACATGAACAAGCACGTGAACAACGTGACCTACATCGGCTGGGCCCTGGAGTCCATCCCCCCCGAGATCATCGACACCCACGAGCTGCAGGCCATCACCCTGGACTACCGCCGCGAGTGCCAGCGCGACGACATCGTGGACTCCCTGACCTCCCGCGAGCCCCTGGGCAACGCCGCCGGCGTGAAGTTCAAGGAGATCAACGGCTCCGTGTCCCCCAAGAAGGACGAGCAGGACCTGTCCCGCTTCATGCACCTGCTGCGCTCCGCCGGCTCCGGCCTGGAGATCAACCGCTGCCGCACCGAGTGGCGCAAGAAGCCCGCCAAGCGCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGA
SEQ ID NO：107
Cuphea wrightii FatB2(CwTE2)硫酯酶的密码子优化序列
ATGGTGGTGGCCGCCGCCGCCAGCAGCGCCTTCTTCCCCGTGCCCGCCCCCCGCCCCACCCCCAAGCCCGGCAAGTTCGGCAACTGGCCCAGCAGCCTGAGCCAGCCCTTCAAGCCCAAGAGCAACCCCAACGGCCGCTTCCAGGTGAAGGCCAACGTGAGCCCCCACGGGCGCGCCCCCAAGGCCAACGGCAGCGCCGTGAGCCTGAAGTCCGGCAGCCTGAACACCCTGGAGGACCCCCCCAGCAGCCCCCCCCCCCGCACCTTCCTGAACCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCGCACCGCCATCACCACCGTGTTCGTGGCCGCCGAGAAGCAGTTCACCCGCCTGGACCGCAAGAGCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACTGGTTCGGCAGCGAGACCATCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCGAGCGCTTCAGCATCCGCAGCTACGAGATCGGCGCCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGACACCAGCCTGAACCACTGCAAGAGCGTGGGCCTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACCCCCGAGATGTGCACCCGCGACCTGATCTGGGTGCTGACCAAGATGCAGATCGTGGTGAACCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAACAGCTGGTTCAGCCAGAGCGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGAGTGGCTGATCAGCGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTGGGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCTTCAGCAAGCTGCCCTGCGAGGTGCGCCAGGAGATCGCCCCCCACTTCGTGGACGCCCCCCCCGTGATCGAGGACAACGACCGCAAGCTGCACAAGTTCGACGTGAAGACCGGCGACAGCATCTGCAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGAACGACTTCGACGTGAACCAGCACGTGAGCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATTCTGGAGAGCATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCAGCCTGACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGAGAGCGTGGTGGAGAGCGTGACCAGCATGAACCCCAGCAAGGTGGGCGACCGCAGCCAGTACCAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCGCCGACATCATGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCACCAACCGCGCCATCAGCACCTGA
SEQ ID NO：108
Prototheca moriformis FATA1敲除同源重组靶向构建体的5′供体DNA序列
GCTCTTCGGAGTCACTGTGCCACTGAGTTCGACTGGTAGCTGAATGGAGTCGCTGCTCCACTAAACGAATTGTCAGCACCGCCAGCCGGCCGAGGACCCGAGTCATAGCGAGGGTAGTAGCGCGCCATGGCACCGACCAGCCTGCTTGCCAGTACTGGCGTCTCTTCCGCTTCTCTGTGGTCCTCTGCGCGCTCCAGCGCGTGCGCTTTTCCGGTGGATCATGCGGTCCGTGGCGCACCGCAGCGGCCGCTGCCCATGCAGCGCCGCTGCTTCCGAACAGTGGCGGTCAGGGCCGCACCCGCGGTAGCCGTCCGTCCGGAACCCGCCCAAGAGTTTTGGGAGCAGCTTGAGCCCTGCAAGATGGCGGAGGACAAGCGCATCTTCCTGGAGGAGCACCGGTGCGTGGAGGTCCGGGGCTGACCGGCCGTCGCATTCAACGTAATCAATCGCATGATGATCAGAGGACACGAAGTCTTGGTGGCGGTGGCCAGAAACACTGTCCATTGCAAGGGCATAGGGATGCGTTCCTTCACCTCTCATTTCTCATTTCTGAATCCCTCCCTGCTCACTCTTTCTCCTCCTCCTTCCCGTTCACGCAGCATTCGGGGTACC
SEQ ID NO：109
Prototheca moriformis FATA1敲除同源重组靶向构建体的3′供体DNA序列
GACAGGGTGGTTGGCTGGATGGGGAAACGCTGGTCGCGGGATTCGATCCTGCTGCTTATATCCTCCCTGGAAGCACACCCACGACTCTGAAGAAGAAAACGTGCACACACACAACCCAACCGGCCGAATATTTGCTTCCTTATCCCGGGTCCAAGAGAGACTGCGATGCCCCCCTCAATCAGCATCCTCCTCCCTGCCGCTTCAATCTTCCCTGCTTGCCTGCGCCCGCGGTGCGCCGTCTGCCCGCCCAGTCAGTCACTCCTGCACAGGCCCCTTGTGCGCAGTGCTCCTGTACCCTTTACCGCTCCTTCCATTCTGCGAGGCCCCCTATTGAATGTATTCGTTGCCTGTGTGGCCAAGCGGGCTGCTGGGCGCGCCGCCGTCGGGCAGTGCTCGGCGACTTTGGCGGAAGCCGATTGTTCTTCTGTAAGCCACGCGCTTGCTGCTTTGGGAAGAGAAGGGGGGGGGTACTGAATGGATGAGGAGGAGAAGGAGGGGTATTGGTATTATCTGAGTTGGGTGAAGAGC
SEQ ID NO：110
发夹RNA表达盒的FATA部分
ATGGCACCGACCAGCCTGCTTGCCAGTACTGGCGTCTCTTCCGCTTCTCTGTGGTCCTCTGCGCGCTCCAGCGCGTGCGCTTTTCCGGTGGATCATGCGGTCCGTGGCGCACCGCAGCGGCCGCTGCCCATGCAGCGCCGCTGCTTCCGAACAGTGGCGGTCAGGGCCGCACCCGCGGTAGCCGTCCGTCCGGAACCCGCCCAAGAGTTTTGGGAGCAGCTTGAGCCCTGCAAGATGGCGGAGGACAAGCGCATCTTCCTGGAGGAGCACCGGTGCGTGGAGGTCCGGGGCTGACCGGCCGTCGCATTCAACGTAATCAATCGCATGATGATCAGAGGACACGAAGTCTTGGTGGCGGTGGCCAGAAACACTGTCCATTGCAAGGGCATAGGGATGCGTTCCTTCACCTCTCATTTCTCATTTCTGAATCCCTCCCTGCTCACTCTTTCTCCTCCTCCTTCCCGTTCACGCAGCATTCGGGGCAACGAGGTGGGCCCGTGCTCCTCCAGGAAGATGCGCTTGTCCTCCGCCATCTTGCAGGGCTCAAGCTGCTCCCAAAACTCTTGGGCGGGTTCCGGACGGACGGCTACCGCGGGTGCGGCCCTGACCGCCACTGTTCGGAAGCAGCGGCGCTGCATGGGCAGCGGCCGCTGCGGTGCGCCACGGACCGCATGATCCACCGGAAAAGCGCACGCGCTGGAGCGCGCAGAGGACCACAGAGAAGCGGAAGAGACGCCAGTACTGGCAAGCAGGCTGGTCGGTGCCAT
SEQ ID NO：111
构建体FATA1-CrbTub yInv nr-FATA1的部分，其含有用于整合到核基因组以中断内源性FATA1基因的区域以及在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5′UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区
Figure BDA00003138838402061
Figure BDA00003138838402071
SEQ ID NO：112
构建体FATA1-CrbTub_yInv_nr：：amt03_CwTE2_nr-FATA1的部分，其含有用于整合到核基因组中以中断内源性FATA1基因的区域以及在莱茵衣藻β-微管蛋白启动子/5′UTR和普通小球藻硝酸盐还原酶3′UTR的控制下的酿酒酵母suc2蔗糖转化酶编码区
Figure BDA00003138838402081
Figure BDA00003138838402091
SEQ ID NO：113
构建体6S：：β-Tub：suc2：nr：：β-tub：发夹FatA：nr：：6S的部分，其含有FatA1编码区的第一外显子，其后接内源内含子和处于反方向的第一外显子的重复单元
Figure BDA00003138838402092
Figure BDA00003138838402101

Claims (44)

1.一种包含微生物油的产品，其中所述油具有低于大约-5℃的倾点，并且其中所述微生物油的脂肪酸组成是至少50％C18:1和少于10％C18:2。
2.如权利要求1所述的产品，其中该产品具有在大约-10℃与大约-40℃之间的倾点。
3.如任何以上权利要求所述的产品，其中该微生物油的脂肪酸组成是至少60％C18:1。
4.如任何以上权利要求所述的产品，其中该微生物油的脂肪酸组成是至少70％C18:1。
5.如任何以上权利要求所述的产品，其中该微生物油的脂肪酸组成是少于5％C18:2。
6.如任何以上权利要求所述的产品，其中该微生物油的脂肪酸组成是至少80％C18:1和少于5％C18:2。
7.如任何以上权利要求所述的产品，其中该产品具有250℃至375℃的闪点或300℃至450℃的燃点。
8.如任何以上权利要求所述的产品，其中该微生物油的碘值在25与200之间。
9.如任何以上权利要求所述的产品，进一步包含倾点抑制剂。
10.如任何以上权利要求所述的产品，其中该产品是润滑剂、液压流体、工业用油、或介电流体。
11.如任何以上权利要求所述的产品，其中该产品是介电流体。
12.如权利要求11所述的介电流体，其中该介电流体具有20kV至75kV的击穿电压。
13.如权利要求11或权利要求12所述的介电流体，其中该介电流体具有20MV/m(RMS)至75MV/m(RMS)的介电强度。
14.如权利要求11-13中任一项所述的介电流体，其中该介电流体进一步包含抗氧化剂、金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、破乳剂、抗磨损添加剂、倾点抑制剂、或抗水解化合物。
15.如任何以上权利要求所述的产品，其中该微生物油由经工程化以表达一个或多个外源基因的基因工程微生物产生。
16.如权利要求15所述的产品，其中该基因工程微生物是无绿藻(Prototheca)或小球藻(Chlorella)。
17.如权利要求16所述的产品，其中该基因工程微生物是Protothecamoriformis。
18.如权利要求15-17中任一项所述的产品，其中一个或多个外源基因编码蔗糖转化酶或脂肪酰基-ACP硫酯酶。
19.如权利要求18所述的产品，其中一个或多个外源基因编码两种或更多种脂肪酰基-ACP硫酯酶。
20.如权利要求18所述的产品，其中一个或多个外源基因编码蔗糖转化酶和一种或多种脂肪酰基-ACP硫酯酶。
21.一种包含由基因工程微生物产生的微生物油的介电流体，其中该介电流体具有在大约-10℃与大约-40℃之间的倾点。
22.如权利要求21所述的介电流体，其中该微生物油的脂肪酸组成是至少50％C18:1和少于10％C18:2。
23.如权利要求21或权利要求22所述的介电流体，其中该微生物油的脂肪酸组成是至少70％C18:1。
24.如权利要求21-23中任一项所述的介电流体，其中该微生物油的脂肪酸组成是至少70％C18:1和少于5％C18:2。
25.如权利要求21-24中任一项所述的介电流体，其中该基因工程微生物是无绿藻或小球藻。
26.如权利要求25所述的介电流体，其中该微生物是Prototheca moriformis。0
27.一种电气部件，其包含如权利要求21-26中任一项所述的介电流体。
28.如权利要求27所述的电气部件，它是一种变压器。
29.一种产生RBD微生物油的方法，其中该微生物油具有低于大约-5℃的倾点，并且其中概微生物油的脂肪酸组成是至少50％C18:1和少于10％C18:2，该方法包括：
a.培养经工程化以表达一个或多个外源基因的基因工程微生物直到该微生物具有按干重计至少10％的油；
b.从该微生物中分离油；并且
c.使该油经历精炼、漂白、脱臭或脱胶以产生RBD微生物油。
30.如权利要求29所述的方法，其中该微生物油具有在大约-10℃与大约-40℃之间的倾点。
31.如权利要求29或权利要求30所述的方法，其中该方法另外地包括向RBD油添加抗氧化剂、金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、破乳剂、抗磨损添加剂、倾点抑制剂、或抗水解化合物。
32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中该基因工程微生物是无绿藻或小球藻。
33.如权利要求30所述的方法，其中该基因工程微生物是Protothecamoriformis。
34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中一个或多个外源基因编码蔗糖转化酶或脂肪酰基-ACP硫酯酶。
35.如权利要求34所述的方法，其中一个或多个外源基因编码两种或更多种脂肪酰基-ACP硫酯酶。
36.如权利要求34所述的方法，其中一个或多个外源基因编码蔗糖转化酶和一种或多种脂肪酰基-ACP硫酯酶。
37.一种产生包含微生物油的产品的方法，其中该产品具有低于大约-5℃的倾点，并且其中该微生物油的脂肪酸组成是至少50％C18:1和少于10％C18:2，该方法包括：
a.使该第一微生物油经历精炼、漂白、脱臭或脱胶以产生RBD油，其中该RBD油以初始倾点和第一温度为特征；
b.将该RBD油的温度降低至第二温度，其低于第一温度；
c.将该RBD油保持在该第二温度；并且
d.在该第二温度过滤概RBD油以提供以低于初始倾点的第二倾点为特征的第二微生物油，其中该第二倾点低于大约-5℃。
38.如权利要求37所述的方法，其中该微生物油具有在大约-10℃与大约-40℃之间的倾点。
39.如权利要求37或权利要求38所述的方法，其中该方法另外地包括向第二微生物油添加抗氧化剂、金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、破乳剂、抗磨损添加剂、倾点抑制剂、或抗水解化合物。
40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中该方法另外地包括通过以下步骤产生第一微生物油：
a.培养经工程化以表达一个或多个外源基因的基因工程微生物直到该微生物具有按干重计至少10％的油；并且
b.从该微生物中分离油以产生第一微生物油；
41.如权利要求37-40中任一项所述的方法，其中该第一温度在高于15℃至大约50℃之间，并且该第二温度在大约-15℃与大约15℃之间。
42.如权利要求37-41中任一项所述的方法，其中该产品是润滑剂、液压流体、工业用油、或介电流体。
43.如权利要求42所述的方法，其中该产品是介电流体。
44.如权利要求43所述的介电流体，其中该介电流体进一步包含抗氧化剂、金属离子钝化剂、腐蚀抑制剂、破乳剂、抗磨损添加剂、倾点抑制剂、或抗水解化合物。
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