KR20160101990A - 바이오연료의 생산에 사용하기 위한 지질 추출 방법 - Google Patents

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Abstract

발효 브로스로부터 바이오연료를 생산하는데 적합한 지질 추출을 위해 사용되는 방법 및 시스템은 브로스에서 유지성 미생물로부터 생성물을 더욱 쉽게 추출하기 위해 발효 브로스를 전처리하도록 열을 사용함을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 그 대신에, 아밀라아제, 1-4 만노시다아제, 및 1-3 만노시다아제를 포함하는 효소의 조합물이 유지성 미생물의 세포 벽을 파쇄하기 위해 사용될 수 있다. 잔여 브로스 워터는 재순환되어 당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수로서 사용될 수 있다.

Description

바이오연료의 생산에 사용하기 위한 지질 추출 방법{PROCESS FOR EXTRACTING LIPIDS FOR USE IN PRODUCTION OF BIOFUELS}
본원은 2013년 12월 20일자로 출원된 미국 가특허 출원 임시 번호 제61/918,850호를 우선권 주장한다.
선행 기술 결정을 위해, 공동 연구 계약이 바이오연료 분야에서 2008년 12월 18일자로 BP 바이오연료 UK 리미티드(BP Biofuel UK Limited) 및 마르테크 바이오사이언시즈 코포레이션(Martek Biosciences Corporation) 사이에서 이행되었다. 또한 선행 기술 결정을 위해, 공동 연구 계약이 바이오연료 분야에서 2009년 8월 7일자로 BP 바이오연료 UK 리미티드 및 마르테크 바이오사이언시즈 코포레이션 사이에서 이행되었다. 또한 선행 기술 결정을 위해, 공동 연구 계약이 바이오연료 분야에서 2012년 9월 1일자로 BP 바이오연료 UK 리미티드 및 DSM 바이오베이스드 프로덕츠 앤 서비시즈 비브이(DSM Biobased Products and Services B.V.) 사이에서 이행되었다.
본 발명은 바이오연료 생산을 위한 물질을 추출하는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 양태는 유지성(oleaginous) 미생물로부터 물질을 추출함에 관한 것이다.
공급원료를 바이오연료로 전환시키기 위한 다수의 기술들이 개발되어 왔다. 그러나, 기술이 이와 같이 진보하였음에도, 재생가능한 탄소 공급원을 연료로 전환시키기 위한 경제적 실행가능성을 개선시킬 필요 및 바람이 남아 있다.
식물성 오일-유래된 바이오연료는, 예컨대 재생가능하고, 생분해성이며, 무독성이고, 특정 경우에 황 또는 방향족 화합물을 함유하지 않는다는 이점을 가진다. 그러나, 식물성-오일-유래된 바이오연료의 하나의 잠재적인 단점은 높은 비용이고, 이의 대부분은 식물성 오일 공급원료의 가격에 기인한다. 따라서, 바이오연료 생산의 경제적 양태는 식물성 오일 원료 물질의 가격 뿐만 아니라 식물성 오일 원료 물질의 제한된 공급에 의해 적어도 어느 정도 제한되었다.
영양 제품에 사용하기 위한 지질은 미생물에서 생산될 수 있다. 예를 들면, 조류에서의 지질의 제조는 조류를 성장시키고, 이를 건조시키고, 이로부터 세포내 지질을 추출함을 포함한다. 미생물 내에서부터의 물질의 추출은 어려울 수 있다.
유사하게는, 유지성 효모를 비롯한 효모는 환경적 스트레스, 예컨대 전단력, 삼투압 불균형, 건조, 포식자 등으로부터 이들을 보호하기 위한 다당류 세포 벽을 갖는다. 보호용 세포 벽은 바이오연료로 전환될 수 있는 유지성 효모중의 세포내 대사산물, 예컨대 지질을 수집하는 것을 어렵게 만들 수 있다.
종속영양 유기체를 사용하여 당분을 바이오연료로 전환시키는 것은 수성 또는 용매 추출 분야에 의해 가능하고, 여기서 유기체 부분은 물 또는 또 다른 용매에 용해되어, 생성물인 지질이 발효 브로스(broth)로부터 직접적으로 제거되고 회수될 수 있다. 생성물은 기계적, 열적, 삼투압적, 효소적 힘의 조합에 의해 유지성 유기체의 내부 구획으로부터 회수되어, 가벼운 지질, 지질제거된 바이오매스(biomass), 및 수성 잔여물 및 다른 세포 잔여물로 구성된 다중-상 생성물 스트림을 생성한다. 관류(once-through) 가공은 종종 상당한 폐기물 및/또는 공동-생성물 스트림(들)을 생성한다.
비-용매/수성 추출 기법을 사용하여 추출된 물질을 높은 수율로 생성하는 유지성 미생물로부터 물질을 추출하기 위한 방법 및 시스템이 요구되고 요망된다. 관류 가공에 의존하기 보다는 잔여 공정 스트림을 재순환시키는, 유지성 미생물로부터 물질을 추출하기 위한 방법 및 시스템이 추가로 요구되고 요망된다.
본 발명은 유지성 미생물로부터 물질을 추출하기 위한 방법 및 시스템, 뿐만 아니라 추출된 물질로부터 바이오연료를 생산하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
특정 실시태양에 따라서, 유지성 유기체로부터의 생성물의 추출 수율을 개선시키기 위해 전처리 단계로서 온도가 사용될 수 있다. 더욱 특히, 전체 발효 브로스로부터 바이오연료를 생산하는데 적합한 지질 추출 방법은 약 90℃ 초과의 온도, 예컨대 약 90℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃, 또는 약 110℃ 내지 약 150℃, 또는 약 120℃ 내지 약 150℃, 또는 약 130℃ 내지 약 150℃로 브로스를 가열함으로써 전체 발효 브로스를 전처리하는 단계(여기서 브로스는 유지성 미생물을 함유함), 및 후속적으로 유지성 미생물로부터 생성물을 추출하는 단계를 포함한다. 전체 발효 브로스는 약 3 시간 초과 동안 가열될 수 있다. 특정 실시태양에서, 유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스가 45℃ 내지 80℃에서 보내는 시간은, 유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스를 45℃ 내지 80℃에서 60 분 미만으로 가열함으로써 최소화될 수 있다. 추가적으로 또는 그 대신에, 전체 발효 브로스는 1 분 당 약 0.1 내지 약 80℃의 평균 속도로 가열될 수 있다. 이러한 공정에서, 전체 발효 브로스의 pH는 산 또는 염기를 첨가하여 조정될 수 있다.
추가의 실시태양에서, 전체 발효 브로스는 약 60℃ 초과, 또는 약 70℃ 초과, 또는 약 80℃ 초과, 또는 약 85℃ 초과, 또는 약 90℃ 초과로 냉각되어, 예컨대 기계적 파열을 적용함으로써 추가의 등온(일정한 온도) 가공을 허용한다. 전체 발효 브로스는 1 분 당 약 1 내지 약 80℃의 평균 속도로 냉각될 수 있다. 전체 발효 브로스는 1 초 당 약 10 cm 내지 1 초 당 약 240 cm의 임펠러 팁(impeller tip) 속도로 교반될 수 있다. 가열 후, 전체 발효 브로스는 건조될 수 있다.
특정 실시태양에서, 전처리 동안, 약 10 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 20 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 30 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 50 psi 내지 약 150 psi의 압력은 전체 발효 브로스가 함유된 시스템에서 유지될 수 있다.
전처리 동안, 염은 전체 발효 브로스가 함유된 시스템에 존재하여, 시스템중 약 0.01 M 내지 약 2.0 M로 추정되는 이온 강도를 생성할 수 있다. 전체 발효 브로스는 0.05 g/ℓ 초과의 농도로 염 및 이온과 회합된 물 공급원 및/또는 조질의 당분 공급원을 포함할 수 있다. 염 및 이온은 Na, K, Ca, Mg, Zn, Mo, Cu, Mn, 염화물, 황산염, 인산염, 질산염, 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 이들 염 및 이온은 0.5 내지 40 g/ℓ의 농도로 증강될 수 있다. 추가적으로, 이미 존재하는 염 및 이온은 기계적 및/또는 정전기적 코어레서(coalescer) 중의 유지성 미생물로부터 생성물이 방출될 경우 형성되는 유화액의 융합(coalescence), 엉김, 밀도 변화, 및/또는 안정화를 촉진시킴으로써 오일 상의 회수를 도울 수 있다.
본원에서 방법은 유지성 미생물을 용균화시켜, 방출된 생성물인 오일 바디(oil body) 및 세포 잔사(debris) 부피의 적어도 80%, 또는 적어도 95%가 0.1 ㎛를 초과하는 직경의 크기를 갖는 오일 바디 및 세포 잔사 입자 크기 분포를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가적으로, 오일 및 세포 잔사 소적 또는 바디는 120 cm/s를 초과하는 임펠러 팁 속도로 혼합함으로써 연속 상으로서 회수될 수 있다.
유지성 세포 벽을 파쇄한 후, 예를 들면 지질을 비롯한 세포내 대사산물은 유지성 세포 벽으로부터 수집될 수 있다. 세포내 대사산물은 바이오연료, 예컨대 생물유도 디젤로 전환될 수 있다. 세포내 대사산물을 수집한 후 남는 수성 추출 유출물은 재순환될 수 있다. 재순환되는 추출수는 당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수(imbibition water)로서 사용될 수 있다.
전처리 후, 발효 브로스는 감압되고 냉각되어 추가의 가공 이전에 브로스에서 고형분을 농축시킨다. 추가적으로 또는 그 대신에, 전처리 후, 농축된 습윤 브로스 또는 세포와의 건조 혼합물을 생성하기 위해 증발기 또는 건조기가 포함될 수 있다. 용매가 건조 세포 또는 용균화되고 농축된 발효 브로스에 첨가되어 혼합물을 형성할 수 있다. 용매로는 헥산, 도데칸, 데칸, 디젤, 1종 이상의 알코올, 또는 이들의 조합물이 포함될 수 있다. 용균화된 발효 브로스 및 용매의 혼합물은 교반되어 유지성 미생물로부터의 오일과 접촉하여 이를 추출할 수 있다. 용매 및 오일은 용균화된 발효 브로스로부터, 예컨대 원심분리기를 사용하여 분리될 수 있다. 용매 및 오일은 반응되어 오일의 적어도 일부를 연료 성분으로 전환시킬 수 있다. 더욱이, 용매 및 오일의 나머지 부분은 바이오연료를 포함하는 연료로 전환될 수 있다. 사용후 브로스는 농작물용 비료, 동물 사료, 효모 추출물, 효모 가수분해물, 또는 탄소/영양소의 공급원으로서 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스는 당분 공급원료를 포함할 수 있다. 유지성 미생물 및 당분 공급원료가 함유된 전체 발효 브로스는 발효 브로스 1 ℓ 당 약 50 내지 약 250 g의 지질, 발효 브로스 1 ℓ 당 약 0 내지 약 50 g의 당분, 발효 브로스 1 ℓ 당 약 0 내지 약 40 g의 염, 발효 브로스 1 ℓ 당 약 10 내지 약 100 g의 무지질 건조 바이오매스를 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에 따라서, 전처리의 일부로서, 본 방법은 유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스를 약 40℃ 내지 약 80℃로 약 1 분 내지 약 3 시간 이하 동안 가열함으로써 전체 발효 브로스를 저온살균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대조적으로, 전처리 가열 동안, 전체 발효 브로스는 약 90℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃, 또는 약 110℃ 내지 약 150℃, 또는 약 120℃ 내지 약 150℃, 또는 약 130℃ 내지 약 150℃의 온도에서 약 30 분 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 8 시간 동안 유지될 수 있다. 전체 발효 브로스는 가열 기간 동안 스터링(stirring)될 수 있다. 산, 염기 또는 산과 염기 둘 다 전체 발효 브로스에 첨가될 수 있다.
전체 발효 브로스는 비드 밀(bead mill), 오리피스 판(orifice plate), 고 전단 혼합기, 또는 기타 전단 또는 기계적 파열 장치를 통해 1회, 2회 또는 그 이상 통과될 수 있다. 특정 실시태양에서, 전체 발효 브로스는 용기 중에서 약 70℃ 내지 약 100℃의 온도에서, 임의적으로 환류를 포함하여, 약 1 내지 약 60 시간 동안 스터링될 수 있다. 추가적으로, 염, 예컨대 NaCl, KCl, K2SO4, 또는 Na2S04는 용기 중의 전체 발효 브로스에 첨가되거나, 또는 그 대신에, 예를 들면 NaOH 또는 KOH + H2S04를 첨가함으로써 동일 반응계에서 생산될 수 있다. 예를 들면 약 2 중량% 이하의 염이 첨가될 수 있다. 산 또는 염기는 용기 중의 전체 발효 브로스의 pH를 약 3 내지 약 11로 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 상기 열거된 산 및 염기의 조합물로부터 생성된 열은 또한 브로스를 가열하기 위해 요구되는 에너지를 감소시키는데 기여할 수 있다. 지질은, 하나 이상의 단계, 예컨대 중력 분리, 하이드로사이클론(hydrocyclone), 필터, 및/또는 원심분리기를 포함할 수 있는 적절한 고체-액체-액체 분리 설계를 통해 수성 발효 브로스로부터 분리될 수 있다. 20% 미만의 유리 지방산인 오일은 원심분리를 통해 전체 발효 브로스로부터 분리될 수 있다. 미생물 오일의 생산에 적합한 이러한 지질 추출 방법은, 수성 추출 공정이 발효 브로스 중의 금속을 농축시키므로 오일에 비해 금속이 인공적으로 적어도 2의 비율로 더 낮은 오일을 생성할 수 있다. 이 방법은 바이오매스 고형분을 잔여 브로스 워터에 의해 재순환시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
유지성 미생물은 적어도 40 중량%의 지방을 포함할 수 있다. 예를 들면, 유지성 미생물은 유지성 효모 세포일 수 있다.
특정 실시태양에 따라서, 아밀라아제, 1-4 만노시다아제, 및 1-3 만노시다아제를 포함하는 효소의 조합물은 유지성 미생물의 유지성 세포 벽을 파쇄하기 위해 사용될 수 있다. 효소의 조합물은 추가로 적어도 하나의 보조 효소, 즉 설파타아제, 프로테아제, 키티나아제, 또는 이들 효소의 임의의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 아밀라아제는 알파 1-4 연결된 글루코오스에 대해 특이적일 수 있다. 효소의 조합물은 약 5 중량% 내지 약 30 중량%의 아밀라아제, 약 5 중량% 내지 약 45 중량%의 1-4 만노시다아제, 약 5 중량% 내지 약 45 중량%의 1-3 만노시다아제, 또는 이들 매개변수의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 효소 조합물은 적어도 하나의 보조 효소, 예컨대 설파타아제, 프로테아제, 키티나아제, 또는 이들 효소의 임의의 조합물을 또한 포함할 수 있다. 효소 조합물은 스포리디오볼루스 파라로세우스(Sporidiobolus pararoseus) MK29404와 함께 사용될 수 있다. 언급된 바와 같이, 유지성 세포 벽을 파쇄한 후, 예를 들면 지질을 포함하는 세포내 대사산물은 유지성 세포 벽으로부터 수집될 수 있다.
특정 실시태양에 따라서, 전체 발효 브로스로부터 바이오연료를 생산하는데 적합한 지질 추출 방법은 유지성 미생물의 세포 벽을 파쇄하기 위해 유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스에 효소의 조합물을 적용하는 단계(여기서 효소는 아밀라아제, 1-4 만노시다아제, 및 1-3 만노시다아제를 포함함), 및 후속적으로 유지성 미생물로부터 생성물을 추출하는 단계를 포함한다. 효소의 조합물은 적어도 하나의 보조 효소, 예컨대 설파타아제, 프로테아제, 키티나아제, 또는 이들 효소의 임의의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 아밀라아제는 알파 1-4 연결된 글루코오스에 대해 특이적일 수 있다. 효소의 조합물은 약 5 중량% 내지 약 30 중량%의 아밀라아제, 약 5 중량% 내지 약 45 중량%의 1-4 만노시다아제, 약 5 중량% 내지 약 45 중량%의 1-3 만노시다아제, 또는 이들 매개변수의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
이 방법은 세포 벽을 파쇄한 후 세포내 대사산물, 예컨대 지질을 유지성 미생물로부터 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포내 대사산물은 바이오연료, 예컨대 생물유래 디젤로 전환될 수 있다. 추가적으로, 세포내 대사산물을 수집한 후 남아 있는 수성 추출 유출물은 재순환될 수 있다. 재순환된 추출수는 당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수로서 사용될 수 있다.
특정 실시태양에 따라서, 수성 발효 브로스로부터 바이오연료를 생산하는데 적합한 지질 추출 방법은 수성 발효 브로스로부터 지질을 추출하여 바이오매스 고형분 및 잔여 브로스 워터를 남기는 단계(여기서 브로스는 유지성 미생물 또는 사탕수수, 또는 유지성 미생물 및 사탕수수 둘 다를 함유함); 및 당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수로서 잔여 브로스 워터를 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은, 예컨대 수성 발효 브로스를 약 40℃ 내지 약 80℃로 약 1 분 내지 약 3 시간 이하 동안 가열함으로써 수성 발효 브로스를 저온살균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 이 방법은 수성 발효 브로스를 약 90℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃, 또는 약 110℃ 내지 약 150℃, 또는 약 120℃ 내지 약 150℃, 또는 약 130℃ 내지 약 150℃의 온도로 가열하는 단계, 및 약 30 분 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 8 시간 동안의 선택된 범위내에서 브로스를 유지시키는 단계를 포함할 수 있다. 수성 발효 브로스는 가열 기간 동안 스터링될 수 있다. 산, 염기, 또는 산과 염기 둘 다는 수성 발효 브로스에 첨가될 수 있다. 수성 발효 브로스는 비드 밀 또는 다른 기계적 파열 장치를 통해 1회, 2회 또는 그 이상 통과될 수 있다.
본 명세서에 혼입되고 이의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명의 실시태양을 예시하고, 발명의 상세한 설명과 함께, 본 발명의 특징, 이점 및 원리를 설명한다. 도면에서:
도 1은 온도 전처리를 사용하고 효모 추출물의 생산을 포함하는 수성 추출 공정의 한 실시태양을 예시하는 공정 흐름도이다.
도 2는 재순환을 포함하는 통합된 당분에서-디젤로의 공정(sugar-to-diesel process)에 대한 하나의 실시태양을 예시하는 공정 흐름도이다.
도 3은 실시예 2에서 사용되는 수성 추출 공정을 예시하는 공정 흐름도이다.
도 4는 실시예 3에서 용균화 이후 방출된 오일 및 세포 잔사의 입자 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 3에서 오일 생성물 회수 이후 오일 및 세포 잔사의 입자 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 유지성 미생물로부터 물질을 추출하기 위한 방법 및 시스템, 뿐만 아니라 추출된 물질로부터 바이오연료를 생산하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 미생물로부터의 바이오연료의 생산은 식물(기름종자를 포함함)로부터의 바이오연료 생산에 비해 많은 이점, 예컨대 짧은 생명 주기, 더 적은 노동력의 필요성, 계절 및 기후에 대한 무관함, 및 더 쉬운 규모 확대(scale-up)를 갖는다.
아래에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 비교적 높은 온도로 브로스를 직접적으로 가열함으로써 오일을 추출하기 전에 발효 브로스를 전처리하면, 투과성이 증가되고 오일이 더욱 쉽게 확산되도록 세포 벽 구조가 열적으로 분해되어 유지성 미생물로부터 추출되는 오일의 양을 증가시킬 수 있다. 추가적으로 또는 그 대신에, 아밀라아제, 1-4 만노시다아제, 및 1-3 만노시다아제를 포함하는 효소의 조합물이 유지성 미생물의 유지성 세포 벽을 파쇄시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 지질 제거 이후 남아 있는 수성 추출 유출물은 전단부(front-end) 당분 회수 조작부로 재순환될 수 있다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "전처리하다" 및 "전처리"는 미생물내에서부터 임의의 물질을 물리적으로 분리하기 이전에 미생물에 실행되는 공정 단계를 지칭한다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "재생가능한 물질"은 바람직하게는 천연의 생태학적 주기 및/또는 자원에 의해 적어도 부분적으로 대체될 수 있는 공급원 및/또는 공정으로부터 적어도 부분적으로 유래되는 물질 및/또는 항목을 지칭한다. 재생가능한 물질로는, 광범위하게는, 예를 들면, 화학물질, 화학물질 중간체, 용매, 접착제, 윤활제, 단량체, 올리고머, 중합체, 바이오연료, 바이오연료 중간체, 바이오가솔린, 바이오가솔린 블렌드 스톡(blend stock), 바이오디젤, 그린 디젤, 재생가능한 디젤, 바이오디젤 블렌드 스톡, 바이오증류물, 바이오 숯, 바이오코크스(biocoke), 생물학적 오일, 재생가능한 구성 물질 등이 포함될 수 있다. 더욱 구체적인 예로서, 재생가능한 물질로는, 제한되지 않지만, 하나 이상의 임의의 다음과 같은 물질이 포함된다: 메탄, 에탄올, n-부탄올, 이소부탄올, 2-부탄올, 지방 알코올, 이소부텐, 이소프레노이드, 트리글리세라이드, 지질, 지방산, 락트산, 아세트산, 프로판디올, 부탄디올. 특정 실시태양에 따라서, 재생가능한 물질은 하나 이상의 바이오연료 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 재생가능한 물질로는 알코올, 예컨대 에탄올, 부탄올, 또는 이소부탄올, 또는 지질이 포함될 수 있다. 특정 실시태양에서, 재생가능한 물질은 살아있는 유기체, 예컨대 조류, 세균, 균류 등으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시태양에 따라서, 재생가능한 물질은 지질, 예컨대 유채씨유와 적어도 어느 정도 유사한 탄소 쇄 길이 프로필을 갖는 지방산이다.
용어 "바이오연료"는 바람직하게는 적어도 부분적으로 재생가능한 공급원으로부터 유래되는 연료 및/또는 연소 원료로서 사용하기에 적합한 성분 및/또는 스트림을 지칭한다. 바이오연료는, 예컨대 화석 연료와 비교될 경우, 대기로의 순 탄소 방출(총 탄소 주기)이 지속적으로 생산되고/되거나 감소되고/되거나 없을 수 있다. 특정 실시태양에 따라서, 재생가능한 공급원은, 예컨대 지하로부터 캐거나 파낸 물질을 배제할 수 있다. 특정 실시태양에서, 재생가능한 공급원으로는 단세포 유기체, 다세포 유기체, 식물, 균류, 세균, 조류, 경작된 농작물, 경작되지 않은 작물, 수목 등이 포함될 수 있다.
특정 실시태양에 따라서, 재생가능한 공급원은 미생물을 포함한다. 바이오연료는 수송 연료로서 사용하기에, 예컨대 육상 운송수단, 해양 운송 수단, 항공 운송수단 등에 사용하기에 적합할 수 있다. 더욱 특히, 바이오연료로는 가솔린, 디젤, 제트 연료, 케로센(kerosene) 등이 포함될 수 있다. 바이오연료는 전력 발생, 예컨대 증기 발생, 적합한 열 전달 매질에 의한 에너지 교환, 합성기체 발생, 수소 발생, 전기 생성 등에 사용하기에 적합할 수 있다. 특정 실시태양에 따라서, 바이오연료는 바이오디젤 및 석유 디젤의 블렌드이다.
용어 "바이오디젤" 및 "생물유도 디젤"은, 본원에서 사용될 경우, 상호교환적으로 사용되고, 직접 사용되고/되거나 디젤 푸울(pool)로 블렌딩되고/되거나 재생가능한 공급원으로부터 유래되는 세탄 공급에 적합한 성분 또는 스트림을 지칭한다. 적합한 바이오디젤 분자는 지방산 에스테르를 포함할 수 있다. 바이오디젤은 압축 점화 엔진, 예컨대 자동차 디젤 내부 연소 엔진, 트럭 중량급 디젤 엔진 등에 사용될 수 있다. 다르게는, 바이오디젤은 또한 기체 터어빈, 히터, 보일러 등에 사용될 수 있다. 특정 실시태양에 따라서, 바이오디젤 및/또는 바이오디젤 블렌드는 산업적으로 허용되는 연료 표준, 예컨대 B5, B7, B10, B15, B20, B40, B60, B80, B99.9, B 100 등을 충족시키거나 이에 순응한다.
용어 "지질"은, 본원에서 사용될 경우, 오일, 지방, 밀납, 그리스(grease),콜레스테롤, 글리세라이드, 스테로이드, 인지질, 세레브로시드(cerebroside), 지방산, 지방산 관련 화합물, 유도 화합물, 다른 오일성 물질 등을 지칭한다. 지질은 전형적으로, 예컨대 중량 기준으로 비교적 높은 에너지 함량을 포함한다.
용어, "미생물"은, 본원에서 사용될 경우, 현미경적 유기체를 지칭하고, 이는 단일 세포(단세포), 세포 클러스터(cluster), 또는 다세포성의 상대적 복합 유기체일 수 있다. 미생물은 조류, 균류(효모 포함), 세균, 청록색 세균, 원생동물 등을 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 미생물은 예를 들면 균류 계의 단일 세포 구성원, 예컨대 효모일 수 있다. 사용될 수 있는 유지성 균류의 예로는, 제한되지 않지만, 로도토룰라 인게니오사(Rhodotorula ingeniosa) 또는 스포리디오볼루스 파라로세우스, 뿐만 아니라 하기 속의 구성원이 포함될 수 있다: 아스페르길러스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 데바로마이세스(Debaromyces), 엔도마이콥시스(Endomycopsis), 푸사리움(Fusarium), 게오트리쿰(Geotrichum), 하이포피키아(Hyphopichia), 리포마이세스(Lipomyces), 무코(Mucor), 페니실리움(Penicillium), 피키아(Pichia), 슈도자이마(Pseudozyma), 리조푸스(Rhizopus), 로도토룰라, 로도스포리디움(Rodosporidium), 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces), 스타르메렐라(Starmerella), 토룰라스포라(Torulaspora), 트리코스포론(Trichosporon), 윅케르하모마이세스(Wickerhamomyces), 야로위아(Yarrowia), 자이고아스커스(Zygoascus), 및 자이고리포마이세스(Zygolipomyces). 더욱 특히, 유지성 균류는, 예를 들면, 다음중 임의의 균류를 포함할 수 있다: 아피오트리쿰 쿠르바툼(Apiotrichum curvatum), 칸디다 아피콜라(Candida apicola), 칸디다 봄비콜라(Candida bombicola), 칸디다 올레오필라(Candida oleophila), 칸디다 종, 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코쿠스 알비두스(Cryptococcus albidus), 크립토코쿠스 쿠르바투스(Cryptococcus curvatus), 크립토코쿠스 테리콜루스(Cryptococcus terricolus), 데바로마이세스 한세니(Debaromyces hansenii), 엔도마이콥시스 베르날리스(Endomycopsis vernalis), 게오트리쿰 카라비다룸(Geotrichum carabidarum), 게오트리쿰 쿠쿠조이다룸(Geotrichum cucujoidarum), 게오트리쿰 히스텐다룸(Geotrichum histendarum), 게오트리쿰 실비콜라(Geotrichum. silvicola), 게오트리쿰 불가레(Geotrichum vulgare), 하이포피키아 부르토니(Hyphopichia burtonii), 리포마이세스 리포페르(Lipomyces lipofer), 리포마이세스 오렌탈리스(Lipomyces orentalis), 리포마이세스 스타르케이(Lipomyces starkeyi), 리포마이세스 테트라스포로우스(Lipomyces tetrasporous), 피키아 멕시카나(Phichia mexicana), 로도스포리디움 스파에로카르품(Rhodosporidium sphaerocarpum), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 종, 로도토룰라 아우란티아카(Rhodotorula aurantiaca), 로도토룰라 다이레넨시스(Rhodotorula dairenensis), 로도토룰라 디풀루엔스(Rhodotorula diffluens), 로도토룰라 글루티너스(Rhodotorula glutinus), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis), 로도토룰라 그라미니스(Rhodotorula graminis), 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta), 로도토룰라 무실라기노사(Rhodotorula mucilaginosa), 로도토룰라 무실라기노사(Rhodotorula mucilaginosa), 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), 로도토룰라 테르페노이달리스(Rhodotorula terpenoidalis), 로도토룰라 토룰로이데스(Rhodotorula toruloides), 스포로볼로마이세스 알보루베센스(Sporobolomyces alborubescens), 스타르메렐라 봄비콜라(Starmerella bombicola), 토룰라스포라 델부루에키(Torulaspora delbruekii), 토룰라스포라 프레토리엔시스(Torulaspora pretoriensis), 토룰롭시스 리포페라(Torulopsis lipofera), 토루포시스(Toruposis) 종, 트리코스포론 베흐렌드(Trichosporon behrend), 트리코스포론 브라시카에(Trichosporon brassicae), 트리코스포론 카피타툼(Trichosporon capitatum), 트리코스포론 쿠타네움(Trichosporon cutaneum), 트리코스포론 도메스티쿰(Trichosporon domesticum), 트리코스포론 라이바키(Trichosporon laibachii), 트리코스포론 루비에리(Trichosporon loubieri), 트리코스포론 몬테비딘세(Trichosporon montevideense), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 트리코스포론 종, 윅케르하모마이세스 카나덴시스(Wickerhamomyces canadensis), 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica), 자이고아스커스 메예라에(Zygoascus meyerae), 및 자이고리포마이세스 락토수스(Zygolipomyces lactosus).
본원에 기재된 추출 방법은 본질적으로 임의의 유지성 미생물에 적용될 수 있다. 미생물은 임의의 적합한 조건하에, 예컨대 혐기적으로, 호기적으로, 광합성적으로, 종속영양적으로 작용, 기능, 및/또는 생활할 수 있다. 특정 실시태양에 따라서, 효모는 공기의 존재하에 종속영양적으로 배양될 수 있다.
용어 "유지성"은 본원에서 사용될 경우, 오일을 함유하고, 오일을 포함하고/하거나 오일, 지질, 지방 및/또는 다른 오일 유사 물질을 생산함을 지칭한다. 유지성은 유기체의 총 중량의 적어도 약 20 중량%의 오일, 적어도 약 30 중량%의 오일, 적어도 약 40 중량%의 오일, 적어도 약 50 중량%의 오일, 적어도 약 60 중량%의 오일, 적어도 약 70 중량%의 오일, 적어도 약 80 중량%의 오일 등을 생산하는 유기체를 포함할 수 있다. 유지성은 배양 동안, 지질 축적 동안, 수집 조건하에서 등의 미생물을 지칭한다.
바이오연료의 생산에 사용하기에 적합한 지질은 유지성 미생물의 오일-풍부 미생물 세포를 함유하는 전체 발효 브로스로부터 추출될 수 있다. 특정 실시태양에 따라서, 전체 발효 브로스는 당분 공급원료를 포함할 수 있다. 예를 들면, 전체 발효 브로스는 발효기 브로스 1 ℓ 당 약 50 내지 약 250 g의 지질, 발효기 브로스 1 ℓ 당 약 0 내지 약 50 g의 당분, 발효기 브로스 1 ℓ 당 약 0 내지 약 40 g의 염, 및 발효기 브로스 1 ℓ 당 약 10 내지 약 100 g의 무지질 건조 바이오매스를 포함할 수 있다. 유지성 미생물은 특정 실시태양에서 적어도 40 중량%의 지방, 또는 약 40 중량% 내지 약 80 중량%의 지방, 또는 약 50 중량% 내지 약 75 중량%의 지방을 포함할 수 있다.
열 전처리 이전에, 전체 발효 브로스는 세포 효소를 불활성화시키고 저장시 복제를 방지하기 위해 생산 유기체의 생존력을 제거하도록 저온살균될 수 있다. 저온살균은 또한 리파아제를 불활성화시킴으로써, 이 경우 관심있는 생성물의 손상을 최소화하기 위해 적절한 조절 측정을 제공한다. 저온살균은 전체 발효 브로스를 약 90℃ 미만, 예컨대 약 40℃ 내지 약 80℃로, 3 시간 미만, 예컨대 약 1 분 내지 3 시간 바로 아래의 시간 동안 가열함으로써 실행될 수 있다.
언급된 바와 같이, 추출된 오일의 양은 전체 발효 브로스를 열로 전처리함으로써 증가될 수 있다. 전체 발효 브로스의 전처리는 공정 pH의 동시적 변화와 함께의 열 처리를 포함하고, 이는 세포 벽 조성의 열-화학적 변화에 영향을 주고자 하는 것이다. 더욱 특히, 브로스를 90℃ 초과의 온도, 예컨대 약 90℃ 내지 약 150℃, 또는 약 91℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃, 또는 약 110℃ 내지 약 150℃, 또는 약 120℃ 내지 약 150℃, 또는 약 130℃ 내지 약 150℃로, 3 시간 초과 동안 직접적으로 가열함으로써, 세포 벽 구조는 열 분해를 겪고, 이는 세포 벽의 투과성을 증가시켜서, 유지성 미생물로부터 생성물을 후속적으로 추출하는 동안 오일이 더욱 쉽게 확산될 수 있도록 한다. 변화의 정확한 성질은 생산 균주의 세포 벽 화학에 의존한다. 유지성 효모의 경우, 세포 벽을 구성하는 탄수화물(단량체)의 방출이 전처리의 결과로서 관찰되었다. 예를 들면, 3 시간 바로 위 내지 약 8 시간 동안 임펠러를 사용하여 온화하게 스터링하면서 전체 발효 브로스를 121℃에서 유지시키면, 세포의 다공성을 증가시킴으로써 80 내지 85%의 추출률을 제공할 수 있다. 필수적이지 않지만, 증발을 통해 물 함량을 80%에서 70%로 낮추도록 발효 브로스의 농도를 조장하기 위해 시스템은 대기로 통기될 수 있다. 지질분해 활성을 최소화하기 위해, 유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스가 45℃ 내지 80℃에서 머무르는 시간을 최소화하는 것이 요망될 수 있다. 이러한 최소화는 유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스를 60 분 미만으로 45℃ 내지 80℃에서 가열함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시태양에서, 전체 발효 브로스는 1 분 당 약 0.1 내지 약 80℃의 평균 속도로 가열될 수 있다.
전처리 동안, 전체 발효 브로스의 pH는 또한 산 또는 염기를 첨가하여 조정될 수 있다. 예를 들면, 우선 산을 첨가한 다음 염기를 첨가함으로써, 이러한 처리는 오일의 초기 방출을 초래할 수 있다. 시약 및 다른 보조제의 사용을 통해, 산, 염기, 염 또는 산, 염기 또는 염의 임의의 조합물을 사용하여 pH는 약 0.5 내지 14의 범위내의 임의의 수준으로 조정될 수 있다. 예를 들면, 산은 pH를 약 3.0 내지 약 6.0으로 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 또 다른 예로서, 염기는 pH를 약 8.0 내지 약 10.5로 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 특정 실시태양에서, 전처리 동안 염은 전체 발효 브로스를 함유하는 시스템에 존재하여, 시스템 중에서 약 0.01 M 내지 약 2.0 M로 추정되는 이온 강도를 생성할 수 있다. 전처리 단계는 공정에서 가장 공격적인 연장된 열 처리 단계이고 대부분의 화학 반응이 이 기간 동안 일어난다. 후속적인 기계적 용균 단계는 오일을 비교적 불활성의 미반응성 환경으로 방출한다. 전처리를 통과한 발효 브로스는 8 시간 미만 이내에, 적절하게는 90℃를 넘는 온도에서 추가로 4 시간 가열하고 단독으로 혼합하여 융합될 수 있다. 비교로서, 단독으로 저온살균된 브로스는 오일 상의 분리를 허용하기 위해 고가의 추가의 혼합, 예컨대 90℃ 아래의 온도에서 8 시간이 넘는 추가의 혼합을 필요로 한다.
몇몇 실시태양에 따라서, 전체 발효 브로스는 염 및 이온과 회합된 조질의 당분 공급원을 약 0.05 g/ℓ 초과의 농도로 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 경우, 용어 "조질의 당분"은 복합 재생성 공급원료(자당, 당수수, 사탕무를 포함)로부터 유래된 하나 이상의 이당류 또는 단당류를 함유한 당분 추출물, 또는 당분 쥬스, 원액 쥬스, 농축 쥬스, 및 당밀을 비롯한 당분 추출물의 농축된 형태를 지칭한다. 조질의 당분은 15 중량% 초과 내지 95 중량%의 이당류 및 단당류와, 물, 염, 무기물, 공급원료 잔여물, 및 나머지를 형성하는 복합 바이오매스의 임의의 조합물을 함유할 수 있다. 조질의 당분은 그 대신에 건조 물질중 다른 고형분에 대해 당분 단량체의 비로서 60% 내지 99%를 함유하는 것으로 설명될 수 있다. 건조 물질의 다른 비-당분 성분들은 염, 무기물, 공급원료 잔여물, 및 복합 바이오매스를 포함할 수 있다.
조질의 당분 공급원과 회합된 이들 염 및 이온은 Na, K, Ca, Mg, Zn, Cu, Mn, Fe, Co, 및 염화물, 황산염, 인산염, 질산염, 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 이들 염 및 이온은 따라서 미생물의 발효 성장에 요구되는 것 이상의 농도로 도입된다. 염 및 이온은 예를 들면 0.5 내지 40 g/ℓ의 농도로 축적될 수 있다. 특별히 칼륨 및 칼슘이 특유적이고, 이는 대부분의 다른 요소에 비해 더 높은 농도로 축적되고 일반적 발효 브로스 매질과 상이하다. 이러한 독특한 특성은 지질 및 수 상의 분리를 조장할 수 있다. 더욱 특히, 칼륨의 농도는 적절하게는 나트륨의 농도에 비해 더 높다. 특정 실시태양에서, 칼슘의 농도는 1 g/ℓ를 초과할 수 있다. 특정 실시태양에서, 칼륨의 농도는 2.5 g/ℓ를 초과할 수 있다. 조립 농도에서, 도입된 염 및 이온은 생성물 오일이 미생물 세포로부터 방출될 때 융합에 의해 오일 상의 회수를 돕는다. 추가적으로, 조립 농도에서, 도입된 염 및 이온은 융합에 의한 오일 상의 회수를 돕기 위해 종종 요구되는 염 및 이온, 즉 유도자 또는 해유화제의 첨가에 대한 필요성을 제거한다. 이와 같이, 발효 브로스는 융합 단계 동안, 뿐만 아니라 다른 하류 단계 동안, 전처리 동안에서와 동일한 이온 비율 또는 농도를 유지할 수 있다. 예를 들면, 발효 브로스는 융합 동안 0.5 내지 40 g/ℓ의 염 및 이온 농도를 가질 수 있다.
추출을 개선시키기 위한 첨가제의 염은 발효 브로스에, 또는 당분 공급원을 위한 세척수에, 또는 발효 브로스 및 당분 공급원을 위한 세척수 둘 다에 첨가될 수 있다. 염 및 이온과 함께, 영양소 공급물, 조질의 또는 정제된 영양소 공급원, 질소 또는 탄소, 조질의 또는 부분 정련된 당분 공급원, 및/또는 상이한 물 공급원이 또한 발효 배지에 첨가될 수 있다.
조질의 당분을 포함하는 발효 브로스 상에서 추출 방법을 실행할 때, 원유를 회수하기 위해 전체 건조된 바이오매스 및/또는 용매를 이용하는 추출 기법과 비교하여, 금속 및 무기 원소, 예컨대 Na, K, P, Ca, Mg, Zn 등이 낮은 원유가 회수될 수 있다.
또한 전처리 동안, 약 10 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 20 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 30 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 50 psi 내지 약 150 psi의 압력이 전체 발효 브로스가 함유된 시스템에서 유지될 수 있다. 이러한 효과적인 온도 및 압력은, 시스템이 스팀 제트 이젝터(steam jet ejector)를 사용하여 진공하에 유지된다면 더 낮을 수 있다.
가열 후, 전체 발효 브로스는 냉각되거나 건조되거나, 또는 냉각 및 건조되어 추가의 등온(일정한 온도) 가공을 가능하게 한다. 더욱 특히, "등온 가공"은 본원에서 추가의 가열 또는 냉각을 필요로 하지 않는 가공을 지칭한다. 냉각 및/또는 건조에 관하여, 예를 들면, 전체 발효 브로스는 약 60℃ 초과, 또는 약 70℃ 초과, 또는 약 80℃ 초과, 또는 약 85℃ 초과, 또는 약 90℃ 초과의 온도로 냉각될 수 있다. 발효 브로스는 또한 냉각과 함께 감압되어 추가의 가공 이전에 브로스 중에서 고형분을 농축시킬 수 있다. 추가의 가공으로는, 비드 밀, 균질기, 오리피스 판, 고-전단 혼합기, 프레스, 압출기, 압력 파열, 습식 제분, 건식 제분, 또는 기타 전단 또는 기계적 파열 장치와 같은 장치를 1회 통과 또는 2회 통과 또는 그 이상을 위해 사용하는, 기계적 파열의 적용이 포함된다. 예를 들면, 비드 밀을 통한 2회 통과는 90% 초과의 추출률을 제공할 수 있다. 산의 추가의 첨가는 융합을 조장할 수 있다. 전체 발효 브로스는, 예를 들면 1 분 당 약 0.2 내지 약 80, 또는 약 0.2 내지 약 1℃의 평균 속도로 냉각될 수 있다. 추가적으로 또는 그 대신에, 순간 증발기가 브로스에서 고형분을 농축시키기 위해 사용될 수 있다.
추가적인 교반을 제공하기 위해, 전체 발효 브로스는 임의적으로 환류를 포함하여 약 70℃ 내지 약 100℃의 온도하에서 약 1 내지 약 60 시간 동안 용기 중에서 스터링되어, 예를 들면 60 내지 85%의 오일 회수율을 제공한다. 원할 경우, 전체 발효 브로스는 1 초 당 약 10 내지 약 300 cm, 또는 1 초 당 약 120 내지 약 240 cm의 임펠러 팁 속도에서 교반이 유지될 수 있다. 이러한 교반은 예컨대 방사형 및 축형 유동 임펠러(impeller), 예를 들면 러쉬톤(Rushton) 또는 마린(marine) 임펠러의 임의의 유리한 조합을 사용하여 실행될 수 있다. 임의적으로, 추가의 온도 조절, pH 조절, 염 첨가, 이들 작용의 임의의 조합은 교반 동안 이루어질 수 있다. 예를 들면, 약 2 중량% 이하의 염, 예컨대 NaCl, KCl, K2SO4, 또는 Na2S04는 용기 중의 전체 발효 브로스에 첨가되거나, 또는 그 대신에, 예를 들면, NaOH 또는 KOH + H2S04를 첨가함으로써 동일 반응계에서 생산될 수 있다. 또 다른 예로서, 산 또는 염기는 용기 중의 전체 발효 브로스의 pH를 약 3 내지 약 11로 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 상기 열거된 산 및 염기의 조합물로부터 생성된 열은 또한 브로스를 가열하기 위해 필요한 에너지를 감소시키는데 기여할 수 있다.
추가적인 전처리 단계로서, 유지성 미생물은 용균화되어, 방출된 생성물 오일 바디 및 세포 잔사 부피의 80% 이상, 또는 95% 이상이 0.1 ㎛를 초과하는 직경의 크기를 갖는 오일 바디 및 세포 잔사 입자 크기 분포를 생성할 수 있고, 여기서 직경은 소적, 입자, 또는 바디를 가로질러 가장 큰 거리이다. 직경은 맬버른 인스트루멘츠 리미티드(Malvern Instruments Ltd)(영국 우스터셔 소재)로부터 입수가능한 입자 크기 분석기(Particle Size Analyzer)를 사용하여 측정될 수 있다. 더욱 특히, 열 전처리는 용균화를 보조하고, 이는 바이오매스가 일단 소화되면 오일을 자유롭게 만든다. 이러한 입자 크기 분포에 기인하여, 오일 및 세포 잔사 소적은, 예를 들면 3-인치(7.62 cm) 러쉬톤 유형 임펠러 상에서, 1 초 당 120 cm 초과의 임펠러 팁 속도에서 단순 혼합 융합 단계를 통해 연속 상으로서 쉽게 회수될 수 있다. 융합된 지질은, 융합된 지질 부피의 80% 이상, 또는 95% 이상이 예를 들면 약 40 ㎛를 초과하는 직경의 크기를 갖는 융합된 지질 입자 분포를 생성할 수 있다.
용매는 가열 후 건조 세포 또는 용균화된 발효 브로스에 첨가되어 혼합물을 형성할 수 있다. 적합한 용매의 예로는 헥산, 도데칸, 데칸, 디젤, 알코올, 극성 용매, 비-극성 용매, 및 이들의 조합물이 포함될 수 있다. 이어서 혼합물은 교반되어 용매가 유지성 미생물의 전체 세포로부터의 오일과 접촉하여 이를 추출할 수 있도록 허용한다. 적합한 기간 후, 스트림은, 예컨대 원심분리기, 침강 탱크, 사이클론(cyclone), 또는 이들 기법의 임의의 조합에 의해 분리되어, 용매 및 오일을 발효 브로스로부터 분리할 수 있다. 이어서 용매 및 오일 스트림은 반응되어, 용매를 전환시키기 이전에 오일을 연료 성분으로 전환시키고 오일의 나머지 부분을 바이오연료를 포함하는 연료로 전환시킬 수 있다. 미생물 오일을 생산하는데 적합한 이러한 지질 추출 방법은, 수성 추출 공정이 발효 브로스 중의 금속을 오일에 비해 2 이상의 비율로 농축시키므로, 금속이 인공적으로 더 낮은 오일을 생성한다.
잔여 바이오밀(biomeal) 또는 본원에 기재된 열 전처리로부터 생성된 사용후 브로스는 수성 용액, 예컨대 배지 중의 가수분해된 세포 벽 다당류 및 단백질, 및 생성된 염, 뿐만 아니라 용균화되거나 되지 않은 탈-용매화된 세포 벽 잔사를 포함한다. 남은 지질제거된 바이오밀 또는 사용후 브로스는 예를 들면 농작물용 비료, 동물 사료, 효모 추출물, 또는 탄소/영양소의 공급원으로서 사용될 수 있다. 더욱 특히, 발효 브로스 중의 높은 수준의 칼륨에 기인하여, 사용후 브로스는 당분 분야 또는 다른 농작물을 위한 비료의 형태로 칼륨 공급원으로서 재순환될 수 있다. 수성 공정을 사용하여, 잔여 바이오밀은, 비-수성 공정으로부터 생성된 잔여 바이오밀에 비하여, 이들 다른 잠재적 사용을 위해 더 나은 형태로 존재할 수 있다.
도 1은 온도 전처리를 사용하고 효모 추출물의 생산을 포함하는 수성 추출 공정의 일예를 나타낸다. 공정은 발효 브로스(10)에 의해 시작되고, 여기에 염기(12)가 첨가될 수 있다(임의적으로). 발효 브로스(10)가 용기(14) 중에서 121℃로 가열되고 이 온도에서 대략 8 시간 동안 유지되는 동안, 산(16)이 첨가될 수 있다(임의적으로). 열 처리 이후, 전처리된 브로스(18)는 이어서 60℃로 냉각 장치(20) 및 공정에서 냉각되고(예컨대 순간-냉각에 의함), 수증기(22)가 방출된다. 이어서 농축된 브로스(24)는 원심분리기(26)로 옮겨지고, 이는 브로스(24)를 오일 스트림(28) 및 수성 추출 잔여 스트림(30)으로 분리한다. 다른 유형의 분리 기법, 예컨대 침강 탱크 또는 사이클론은 또한 단독으로 또는 서로 조합하여 사용될 수 있다. 수성 추출 잔여 스트림(30)은 가압기(32)(또는 증발기)를 향하고, 이로부터 물(34)은 압력에 의해 방출되고 효모 케이크(36)가 형성되어, 산(40)이 첨가되는 가수분해기(38)로 전진된다. 결과는 가수분해된 효모 케이크(42)이다.
본원에서 공정이 실행될 수 있는 미생물로는, 제한되지 않지만, 조류, 균류, 및 세균이 포함된다. 예를 들면, 적합한 균류는 유지성 효모, 예컨대 로도포룰라 속, 슈도자이마 속, 또는 스포리디오볼루스 속에 속하는 균류를 포함할 수 있다.
특정 실시태양에 따라서, 효모는 스포리디오볼루스 파라로세우스 속에 속한다. 구체적인 실시태양에서, 개시된 미생물은 ATCC 기탁 번호 PTA-12508(균주 MK29404(Dry1-13J))에 상응하는 미생물이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 미생물은 ATCC 기탁 번호 PTA-12509(균주 MK29404(Dry1-182J))에 상응하는 미생물이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 미생물은 ATCC 기탁 번호 PTA-12510(균주 MK29404(Dry1-173N))에 상응하는 미생물이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 미생물은 ATCC 기탁 번호 PTA-12511(균주 MK29404(Dry55))에 상응하는 미생물이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 미생물은 ATCC 기탁 번호 PTA-12512(균주 MK29404(Dry41))에 상응하는 미생물이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 미생물은 ATCC 기탁 번호 PTA-12513(균주 MK29404(Dry1))에 상응하는 미생물이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 미생물은 ATCC 기탁 번호 PTA-12515(균주 MK29404(Dry1-147D))에 상응하는 미생물이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 미생물은 ATCC 기탁 번호 PTA-12516(균주 MK29404(Dry1-72D))에 상응하는 미생물이다.
효모는 환경적 스트레스, 예컨대 전단력, 삼투압 불균형, 포식자 등으로부터 이들을 보호하기 위한 다당류 세포 벽을 갖는다. 보호용 세포 벽은 바이오연료로 전환될 수 있는 유지성 효모중의 세포내 대사산물, 예컨대 지질을 수집하는 것을 어렵게 만들 수 있다.
글리코시드계 효소는 다당류를 파쇄하는데 유용하고, 따라서 효모 세포 벽을 분해하는데 유용하다. 글리코시드계 효소는 종종 다당류내의 특이적 당분 단량체, 및 단량체 당분 사이의 특이적 결합기에 대해 활성적이다. 예를 들어, 글리코시드계 효소는 α-1-4 연결된 글루코오스(아밀로오스) 및 β-1-4 연결된 글루코오스(셀룰로오스)를 구별할 수 있다. 그러나, 효모는 모두가 동일한 다당류로 구성되지는 않고, 오히려 단당류 단량체의 유형 및 비율 및 단량체 사이의 결합기의 유형에 관하여 광범위하게 상이하다.
결과적으로, 세포 벽 분해에 최적인 글리코시드계 효소의 혼합물은 유기체에 의존적이다. 당분을 디젤로 전환시키는 하나의 특별한 유지성 효모인 스포리디오볼루스 파라로세우스 MK29404Dry1은 특별히 신규한 세포 벽 구조를 갖는다. 많은 효모에서 공통의 구조적 결합기는 β-1-3 글루칸이다. 그러나, MK29404Dry1은 단지 약간의 1-3 연결된 글루코오스를 나타내고, 그 대신 α-1-4 글루코오스가 주요 당분 결합기이다. 효모 세포 벽의 또 다른 공통의 성분은 만난이고, 이는 종종 1-6 연결된 만노오스 단량체로 구성된다. 대조적으로, MK29404Dry1은 매우 적은 1-6-만노오스를 함유하고, 오히려 1-3 및 1-4 연결된 만노오스를 함유한다.
MK29404Dry1 효모 세포 벽의 특별한 조성 때문에, 효소의 구체적인 조합이 미생물 세포 벽을 효과적으로 분해하기 위해 요구된다. 아밀라아제, 1-4 만노시다아제, 및 1-3 만노시다아제를 포함하는 효소의 조합물이 MK29404Dry1을 비롯한 유지성 미생물의 유지성 세포 벽을 파쇄하는데 특별히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 특별히, α-1-4 연결된 글루코오스에 특이적인 아밀라아제가 특히 효과적이다. 예를 들면, 효소의 조합물은 약 5% 내지 약 30%, 또는 약 6% 내지 약 25%, 또는 약 7% 내지 약 20%(중량)의 아밀라아제; 약 5% 내지 약 45%, 또는 약 10% 내지 약 35%, 또는 약 15% 내지 약 30%(중량)의 1-4 만노시다아제; 및 약 5% 내지 약 45%, 또는 약 10% 내지 약 35%, 또는 약 15% 내지 약 30%(중량)의 1-3 만노시다아제를 포함한다.
효소의 조합물은 또한 효소 성능 및 지질 회수를 개선시키기 위해 하나 이상의 보조 효소, 예컨대 프로테아제, 설파타아제, 키티나아제, 또는 이들 효소의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스 내에서 유지성 세포 벽을 파쇄하기 위해 효소의 조합물을 사용하기 이전에 또는 사용한 후, 전체 발효 브로스는 상기 기재된 바와 같이 열적으로 전처리될 수 있다. 더욱 특히, 브로스는 약 90℃ 내지 약 150℃의 온도로 3 시간 초과 동안 가열될 수 있다.
유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스 내의 유지성 세포 벽을 파쇄하기 위해 효소의 조합물을 사용한 후, 세포내 대사산물은 유지성 세포 벽으로부터 수집될 수 있다. 세포내 대사산물은 적합하게는 지질을 함유한다. 추출된 지질은 바이오연료, 예컨대 생물유도 디젤의 생산에서 사용될 수 있다.
더욱 특히, 위에서 보다 상세히 설명된 바와 같이, 용매, 예컨대 헥산, 도데칸, 데칸, 디젤, 알코올, 또는 이들 용매의 임의의 조합물은 건조 세포 또는 용균화된 발효 브로스에 첨가되어 혼합물을 형성한다. 브로스 및 용매의 혼합물은 교반되어 유지성 효모로부터의 오일에 접촉되어 이를 추출한다. 용매 및 오일은 후속적으로, 예컨대 원심분리기를 사용하여 브로스로부터 분리될 수 있다. 용매 및 오일은 반응되어 오일의 적어도 일부를 연료 성분으로 전환시킨다. 용매 및 오일의 나머지 부분은 연료, 즉 바이오연료로 전환될 수 있다. 사용후 브로스는 농작물용 비료, 동물 사료, 효모 추출물, 효모 가수분해물, 또는 탄소/영양소의 공급원으로서 사용될 수 있다.
아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 세포내 대사산물을 수집한 후 남는 임의의 수성 추출 유출물은 재순환될 수 있다. 예를 들면, 재순환된 추출수는 당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수로서 사용될 수 있다.
도 2는 지질 제거 후 남아 있는 수성 추출 유출물이 전단부 당분 회수 조작부로 어떻게 재순환되는지를 보여주는 통합된 당분에서-디젤로의 작업공정도이다. 더욱 특히, 재순환된 추출수는 당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수로서 사용된다. 공급 물질에 대한 더 큰 수율이 실현될 뿐만 아니라 폐기물 처리 자본 및 가공 비용이 감소되므로 이러한 통합은 유리하다.
폐 스트림의 재순환에 대해서는 항상 관심을 두지만, 핵심은 회수 값을 최대화시키는 작업공정도내의 적절한 재순환 지점을 식별하는 것인 한편, 또한 통합된 작업공정도의 동력학 및 최적 작동에 재순환이 어떻게 영향을 주는지를 설명한다.
상기 기재된 바와 같이, 당분은, 예를 들면 수성 추출 구간을 갖는 종속영양 유기체를 사용하여 디젤을 비롯한 바이오연료로 전환될 수 있고, 여기서 생성된 지질은 수성 발효 브로스로부터 직접적으로 제거되고 회수된다. 생성물은 열적, 기계적, 삼투압적, 효소적 힘의 조합에 의해 유지성 유기체의 내부 구획으로부터 회수되어, 덜 치밀한 지질, 잔여 브로스 워터, 및 지질 제거된 바이오매스를 함유하는 다중-상 생성물 스트림을 생성한다. 도 2에 예시된 바와 같이, 잔여 브로스 워터는 당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수로서 사용될 수 있다.
도 2에서 작업공정도는 밀(104)에 공급되는 사탕수수(100) 및 팽윤수(102)를 도시한다. 밀(104)로부터, 당분 용액(106)은 처리 장치(108)로 공급되고, 이 동안 바가스(bagasse)(110)는 분리된다. 처리 장치(108)로부터, MEV(다중-효과 증발기) 공급물(112)은 증발기(114)로 보내지고, 이 동안 머드(mud)(116)는 분리된다. 증발기(114)로부터, 증기/기체 스트림(118)은 종자 발효 장치(124)로 보내지고, 이 동안 농축된 당분 스트림(120)은 주요 발효 장치(126)로 공급되고, 물(122)은 분리된다. 농축된 당분 스트림(120)과 함께, 공기(128)는 또한 주요 발효 장치(126)에 첨가된다. 주요 발효 장치(126)로부터, 브로스(130)는 수성 추출 장치(134)에 공급되고, 이 동안 수증기 및 C02(132)는 방출된다. 수성 추출 장치(134)로부터, 생성된 오일(136)은 분리되고, 증발된 물(138)은 방출되고, 폐수(140)는 팽윤수 스트림(102)으로 재순환된다. 표 1은 도 2의 당분에서-디젤로의 작업공정도에서의 주요 스트림 및 성분에 대한 샘플 유동 규모를 도시한다. 표 1에서의 데이터에 기초하여, 40%의 팽윤수 감소가 계산되는데, 이러한 감소는 폐수의 재순환에 기인한다. 추가적으로, 5%의 바가스로의 고형분 보충이 계산되는데, 이는 또한 폐수의 재순환에 기인한다.
[표 1]
당분에서-디젤로의 작업공정도에서 주요 스트림 및 성분에 대한 유동 규모
Figure pct00001
팽윤수의 일부로서의 폐수의 재순환은 다음을 포함하는 예기치못한 다수의 이점을 생성한다:
1. 생성물로 추가로 전환될 수 있는 유기 탄소의 회수(이점 5 참조)
2. 비-지질 바이오매스로부터의 유기 및 무기 영양소의 적어도 부분적인 회수 및 감소된 제1의 의도적 영양소 공급물(예를 들어 암모니아)
3. 바가스와 혼합함으로써 용액으로부터의 회수되지 않은 비-지질의 분리
4. 바가스 및 회수되지 않은 비-지질 바이오매스를 혼합함에 의한 추가적인 보일러 공급 및 에너지 생성
5. 발효 조작에 대한 엄격성이 감소되어 더 큰 유기 탄소 저하 및 재생에 의한 회수의 허용(이점 1 참조)
6. 종자 및 주요 발효기에 대한 특이적인 공급 스트림으로서 사용하기 위한 당분 스트림(106 및 120)의 최적화
7. 팽윤을 위한 재순환수를 사용함으로써 신선한 물에 대한 요구의 감소
8. 폐기물 처리를 위한 자본 및 조작 비용의 감소
재순환 스트림은 핵심 구성성분의 회수 및 전환을 개선시키고 전체 효능을 개선시키기 위해 이전에 기재된 방법에서 이행될 수 있다. 예를 들면, 수성 발효 브로스로부터 바이오연료를 생산하는데 적합한 지질 추출 방법에서(여기서, 브로스는 유지성 미생물 또는 사탕수수, 또는 유지성 미생물 및 사탕수수 둘 다를 함유함), 수성 발효 브로스는, 예컨대 수성 발효 브로스를 약 40℃ 내지 약 80℃로 약 1 분 내지 거의 3 시간 이하 동안 가열함으로써 저온살균될 수 있다. 수성 발효 브로스는 브로스를 약 90℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃, 또는 약 110℃ 내지 약 150℃, 또는 약 120℃ 내지 약 150℃, 또는 약 130℃ 내지 약 150℃에서 약 30 분 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 8 시간 동안 가열함으로써 열적으로 전처리될 수 있다. 수성 발효 브로스는 가열 기간 동안 스터링될 수 있다. 산, 염기 또는 산 및 염기 둘 다는 수성 발효 브로스에 첨가될 수 있다. 수성 발효 브로스는 비드 밀 또는 다른 기계적 장치를 통해 적어도 1회 또는 적어도 2회 또는 그 이상 통과될 수 있다. 수성 발효 브로스는 약 70℃ 내지 약 100℃에서 또는 환류하에 약 1 내지 약 60 시간 동안 용기 중에서 스터링될 수 있다. 염, 예컨대 약 2 중량% 이하의 염, 예컨대 NaCl, KCl, K2SO4, 또는 Na2S04는 용기 중에서 수성 발효 브로스에 첨가되거나, 또는 그 대신에, 예를 들면, NaOH 또는 KOH + H2SO4를 첨가함으로써 동일 반응계에서 생산될 수 있다. 산 또는 염기는 용기 중에서 수성 발효 브로스의 pH를 약 3 내지 약 11로 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 지질은, 하나 이상의 단계, 예컨대 중력 분리, 하이드로사이클론, 필터, 및/또는 원심분리기를 포함하는 적절한 고체-액체-액체 분리 설계를 통해 수성 발효 브로스로부터 분리되어, 바이오매스 고형분 및 잔여 브로스 워터를 남긴다. 잔여 브로스 워터는 당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수로서 사용될 수 있다. 추가적으로, 바이오매스 고형분은 잔여 브로스 워터에 의해 재순환된다.
지질은, 예를 들면, 수소처리 또는 에스테르교환의 사용을 통해 바이오연료로 전환될 수 있다.
특정 실시태양에 따라서, 본 발명은 바이오연료를 생산하기 위한 제조 설비에 관한 것이다. 특정 실시태양에 따라서, 제조 설비는 지질 추출 유닛(unit)을 포함할 수 있다. 추가적으로, 제조 설비는 열 전처리 유닛을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 제조 설비는 잔여 브로스 워터의 재순환을 가능하게 하는 장비를 포함할 수 있다.
특정 실시태양에 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 제조된, 재생가능한 물질 또는 바이오연료, 또는 재생가능한 물질 및 바이오연료 둘 다에 관한 것이다.
특정 실시태양에 따라서, 본원에 기재된 방법은 미생물의 오일 추출 수율을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 이 방법은 미생물의 오일 추출 수율을 적어도 약 10 중량% 증가시킬 수 있다. 특정 실시태양에 따라서, 오일 추출 수율에서의 증가는 적어도 약 10 중량%, 적어도 약 15 중량%, 또는 적어도 약 20 중량%일 수 있다.
실시예
기재된 미생물의 성능을 특징짓기 위해 사용되는 미터법은 지방산 추출률, 또는 FAE이다. 본원에 따른 임의의 미생물의 FAE는 하기 식에 따라 계산될 수 있다:
ℓ/(b×C바이오매스) = 1 - {[c바이오밀×(100 - C바이오매스)]/[C바이오매스×(100 - c바이오밀)]}
상기 식에서,
b는 세포 파열 이후의 총 바이오매스이고, 전형적으로 g으로 측정되고;
C바이오매스는 세포 파열 이전의 FAME의 백분율이고, 여기서 C바이오매스는 바이오매스의 총 g수에 대한 FAME의 총 g수로서 계산되고; 용어 "FAME"는 본원에서 사용될 경우, 지방산 메틸 에스테르를 지칭하고;
c바이오밀은 세포 파열 이후의 FAME의 백분율이고, 여기서 c바이오밀은 바이오밀의 총 g수에 대한 FAME의 총 g수로서 계산되고;
ℓ는 세포 파열 이후이지만 오일 회수 단계 이전의 오일의 총 질량으로서, 전형적으로 g으로 측정된다. 미생물 또는 발효 브로스로부터 이들 값은 당분야의 숙련가에 의해 수득될 수 있다.
몇몇 실시태양에 따라서, 본원에 기재된 방법은 미생물의 오일 또는 지방산 추출률 지수를 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 이 방법은 미생물의 FAE 지수를 적어도 약 10 중량% 증가시킬 수 있다.
특정 실시태양에서, 헥산에 의한 오일 회수 후, 오일의 질량을 측정한다(L). 또한 헥산에 의한 오일 회수 후 FAME를 측정한다. 몇몇 실시태양에서, 당분야에 공지된 바와 같이, 진공 증발을 FAME 측정 이전에 샘플에 대해 수행한다.
본원에 따른 임의의 미생물의 추출 수율은 하기 식에 따라 계산될 수 있다:
100×[(L×C오일)/(B×C바이오매스)]
상기 식에서,
B는 세포 파열 이전의 총 바이오매스이고, 전형적으로 g으로 측정되고;
C바이오매스는 세포 파열 이전의 FAME의 백분율이고, 여기서 C바이오매스는 바이오매스의 총 g수에 대한 FAME의 총 g수로서 계산되고;
C오일은 세포 파열 및 오일 회수 이후의 FAME의 백분율이고, 여기서 C오일은 오일의 총 g수에 대한 FAME의 총 g수로서 계산되고;
L은 세포 파열 및 오일 회수 이후의 총 질량이고, 전형적으로 g으로 측정된다. 미생물 또는 발효 브로스로부터의 이들 측정값은 당분야의 숙련가에 의해 수득될 수 있다.
몇몇 실시태양에 따라서, 본원에 기재된 방법은 미생물의 오일 추출 수율을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 미생물의 오일 추출 수율을 적어도 약 10 중량% 증가시킬 수 있다.
실시예 1
당분 쥬스를 포함하는 복합 당분 공급원을 사용하여 유지성 효모 균주를 발효시켜 추가의 가공을 위한 저온살균되지 않은 전체 브로스를 수득하였다. 전체 브로스를 용기 중에서 27℃로부터 80℃로 30 분이내에 가열하여 저온살균하고 80℃에서 3 시간 동안 유지시켰다. 저온살균된 브로스는 16.8%의 지방산 추출률(FAE: fatty acid extractability)을 나타내었다. 저온살균된 비-용균화된 브로스를 벤치 원심분리기에서 4500 rpm(4000 g)하에 5 분 동안 원심분리시켰을 때 오일 상은 회수될 수 없었다.
분취량의 저온살균된 브로스를 8 시간 동안 106℃에서 2개의 러쉬톤 임펠러가 구비된 20 ℓ 들이 자케팅된(jacketed) 탱크 중에서 전처리하였다. 26℃에서 106℃로의 온도 증가는 약 45 분에 걸쳐서, 약 1.8℃/분의 속도로 발생하였다. 전처리된 브로스는 지방산 추출률의 증가를 나타내었다(80.75%). 저온살균된 비-용균화된 브로스를 벤치 원심분리기에서 4500 rpm하에 5 분 동안 원심분리시켰을 때 오일 상은 회수될 수 없었다. 결과는 표 2에 제시된다.
[표 2]
실시예 1의 수성 추출 조건 및 결과
Figure pct00002
저온살균되고 전처리된 브로스를, KDL 파일럿(Pilot) 비드-밀(0.5 mm 실리카-지르코니아 매질에 의해 85% 충전 부피로 충전된 1.4 ℓ의 용기)에 1 또는 2회 통과시키는 동안 각각 다양한 속도, 즉 80 ㎖/분 또는 380 ㎖/분으로 용균화시켰다. 전처리된 브로스는 밀에서 최소의 체류 시간을 갖는 저온살균된 브로스의 지방산 추출률(FAE)을 초과하였다. 최고 속도(380 ㎖/분)에서 1회 통과 동안 용균화된 전처리된 브로스의 추출률은 다수회 통과 동안 최저 속도(80 ㎖/분)에서 가공될 경우의 저온살균된 브로스의 추출률에 필적할만 하였다.
지방산 추출률이 약 95%인 저온살균되거나 전처리된 용균화된 브로스의 샘플(200 내지 300 g)을 3N 황산에 의해 pH 4로 조정하였다. 샘플을 회분식으로 환류[교반 막대를 갖는 500 ㎖의 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크]하에 융합시켰다. 벤치 원심분리기에서 15 내지 50 ㎖의 분취량을 4500 rpm(4000 g) 하에 5 분 동안 원심분리함으로써 융합을 모니터링하였다.
원심분리시 융합된 브로스는 사용후 브로스를 포함하는 더 아래의 층을 갖는 별개의 분리 오일 층을 나타내었다. 전처리된 용균화된 브로스의 융합은 16 시간 이내에 완료되었다. 저온살균된 용균화된 브로스는 융합을 위해 40 시간 이상이 필요하였다.
추출 수율을 추정하기 위해 원심분리된 관의 상부로부터 오일 층을 회수하였다. 전처리된 브로스에 대한 추출 수율은 84.1%였고, 저온살균된 브로스의 경우 69.9%였다.
일반적으로 적정을 통해 유리 지방산(FFA)의 수준에 의해 오일 품질을 결정하였다. 저온살균된 브로스 및 전처리된 브로스 둘 다로부터 회수된 원유에서 유리 지방산 수준은 유사하였다(1.2 내지 1.3%)
실시예 2
당분 쥬스를 포함하는 복합 당분 공급원을 사용함으로써 유지성 효모 균주를 발효시켜 추가의 가공을 위한 저온살균되지 않은 전체 브로스를 수득하였다. 본 실시예의 공정 흐름도는 도 3에 예시된다. 도 3에 도시된 바와 같이, 저온살균되지 않은 전체 브로스(210)를 브로스(210)의 저온살균을 포함한 프로토콜에 의해 교반된 자케팅된 용기(214) 중에서 80℃하에 3 시간 동안 추출하였다. 이어서 저온살균된 브로스(216)를 황산에 의해 pH 4로 조정하였고, 121℃ 에서 30 psi(15 psig)의 압력하에 8 시간 동안 전처리 상(218)이 되었다. 브로스 가열을 위해 1.8 ℃/분의 온도 상승을 사용하였고; 브로스를 0.23 ℃/분의 속도로 냉각시켰다. 이어서 전처리된 브로스(220)는 비드-밀에 의해 200 ㎖/분에서 2회 통과 동안 용균화 상(222)이 되었다. 이어서 용균화된 브로스(224)는 잘-교반되는 탱크에서 90℃, 70% 습도하에 융합 상(226)이 되었다. 이어서 융합된 브로스(228)는 고체-액체 분리 상(230)이 되었고, 여기서 융합된 브로스(228)를 2-상 및 3-상 원심분리기를 통해 원심분리하여 원유(232)를 회수하였다. 이 공정은 또한 사용후 브로스 상을 수득하였고, 이는 사용후 중질 상(234) 및 다수의 여러 가지 고체 스트림(236)으로 분리되었다.
저온살균되지 않은 전체 브로스의 샘플에서, 회수된 오일에서, 및 사용후 중질 상 및 고형분을 포함하는 출구 스트림 각각에서의 금속의 농도를 ICP 분석에 의해 분석하였다. 저온살균되지 않은 전체 브로스에서 및 회수된 원유에서의 금속 농도 비로부터, 출발 전체 브로스는 공정으로부터 회수된 오일에 비해 금속(Si 및 Cu 제외)의 농도가 적어도 2배였음을 알 수 있다. 공정으로부터 회수된 원유는 전체 발효 브로스와 비교하여 Na, Mg, P, K, Ca, Mn, Fe, 및 Zn이 상당히 고갈되었다.
추출 공정으로부터 회수된 원유는 또한 공정을 빠져나온 다른 스트림, 예컨대 사용후 중질 상 및 추출 후 고형분과 비교하여 Na, Mg, P, K, Ca, Mn, Fe, 및 Zn이 또한 상당히 고갈되었다.
[표 3]
수성 추출 공정으로부터 회수된 원유에 대한 전체 브로스에서의 금속의 농도 비교
Figure pct00003
실시예 3
유지성 효모 균주의 전체 발효 브로스를 4 시간 동안 교반된 용기 중에서 121℃로 가열하였다. 이후 브로스를 60℃로 냉각시키고 3가지 상이한 유동 속도(380 ㎖/분, 200 ㎖/분, 및 80 ㎖/분)에서 각각 수행되는 비드 밀[KDL 파일럿(Pilot), 뉴저지주 글렌 밀스 소재]을 통해 용균화시켜 세포내 오일 생성물을 방출시켰다. 밀에서 용균화 이후 방출된 오일 및 세포 잔사의 입자 크기 분포는 도 4에 제시된다. 용균화된 세포 및 오일 소적의 모든 측정가능한 부피는 0.1 미크론을 초과하였고, 이는 추가의 가공시 오일 및 고체 상을 분리하기 위한 공정, 예컨대 원심분리를 사용할 가능성을 지시한다.
오일 분별물중 오일 생성물은 80℃ 이상의 온도에서 혼합함으로써 회수될 수 있다. 380 ㎖/분에서 용균화된 각각의 5 ℓ의 브로스를 2개의 3-인치(7.62 cm) 러쉬톤 임펠러에 의해 혼합되는 용기에 넣었다. 용균화된 브로스를 150 rpm[팁 속도 = 60cm/s, 타워(Tower) NBS16]의 교반기 속도 또는 500 rpm(팁 속도 = 200 cm/s, 타워 NBS17)의 교반기 속도로 혼합하였다. 6 시간의 혼합이 종료되었을 때 오일 및 세포 잔사의 분포는 도 5에 제시된다. 500 rpm, 200 cm/s의 팁 속도에서 용기로부터의 생성물은 벤치 탑 원심분리기에서 4500 rpm(4000 g)하에 5 분 동안 원심분리할 경우 별개의 분리 오일 상을 나타내었다. 150 rpm, 60 cm/s의 팁 속도에서 용기로부터의 생성물은 원심분리시 자유 오일을 보이지 않았고 유화액 상임을 입증하였다.
본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고 개시된 구조 및 방법에 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있음은 당분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 특히, 임의의 하나의 실시태양에 대한 설명은 상세한 설명 또는 다른 실시태양과 자유롭게 조합되어 둘 이상의 요소 또는 제한의 조합 및/또는 변화를 생성할 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양은 본원에 개시된 본 발명의 구체적 사항 및 실행을 고려하여 당분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 고려되어야 하고, 본 발명의 진정한 범주 및 취지는 하기 특허청구범위에 의해 지시된다.

Claims (112)

  1. 유지성(oleaginous) 미생물이 함유된 전체 발효 브로스(broth)를 약 90℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃, 또는 약 110℃ 내지 약 150℃, 또는 약 120℃ 내지 약 150℃, 또는 약 130℃ 내지 약 150℃의 온도로 가열함으로써 전처리하는 단계; 및
    후속적으로 유지성 미생물로부터 생성물을 추출하는 단계
    를 포함하는, 전체 발효 브로스로부터 바이오연료를 생산하는데 적합한 지질 추출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    전체 발효 브로스를 약 30 분 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 8 시간 동안 가열하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스를 45℃ 내지 80℃에서 60 분 미만으로 가열함으로써, 유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스가 45℃ 내지 80℃에서 머무르는 시간을 최소화하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    전체 발효 브로스를 1분 당 약 0.1 내지 약 80℃의 평균 속도로 가열하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    산 또는 염기를 첨가함으로써 전체 발효 브로스의 pH를 조정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
    추가의 등온 가공(isothermal processing)을 허용하기 위해 전체 발효 브로스를 약 60℃ 초과, 또는 약 70℃ 초과, 또는 약 80℃ 초과, 또는 약 85℃ 초과, 또는 약 90℃ 초과의 온도로 냉각시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    추가의 등온 가공이 기계적 파열을 적용함을 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    전체 발효 브로스를 1 분 당 약 0.2 내지 약 80℃의 평균 속도로 냉각시키는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서,
    가열 후 전체 발효 브로스를 건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
    전체 발효 브로스를 1 초 당 약 10 cm 내지 1 초 당 약 240 cm의 임펠러 팁(impeller tip) 속도에서 교반하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서,
    전처리 동안 전체 발효 브로스가 함유된 시스템에서 압력을 약 10 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 20 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 30 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 50 psi 내지 약 150 psi로 유지시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    전처리 동안, 전체 발효 브로스가 함유된 시스템에 염이 존재하여, 시스템에 약 0.01 M 내지 약 2 M의 이온 강도를 생성하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서,
    유지성 미생물을 용균화시키는 단계를 추가로 포함하여, 방출된 생성물 오일 소적 및 잔사(debris) 부피의 80% 이상이 0.1 ㎛를 초과하는 직경의 크기를 갖는 소적 및 잔사 입자 크기 분포를 생성하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서,
    유지성 미생물을 용균화시키는 단계를 추가로 포함하여, 방출된 생성물 오일 소적 및 잔사 부피의 95% 이상이 0.1 ㎛를 초과하는 직경의 크기를 갖는 소적 및 잔사 입자 크기 분포를 생성하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    120 cm/s를 초과하는 임펠러 팁 속도에서 혼합함으로써 오일 및 세포 잔사 소적을 연속 상으로서 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서,
    발효 브로스를 추가의 30 분 내지 약 8 시간 동안 90℃ 이상에서 가열함으로써 전처리를 통과한 발효 브로스가 융합될 수 있는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서,
    추출 공정이 전체 발효 브로스 중의 금속을 오일에 비해 2 이상의 비율로 농축시키는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서,
    조질의 당분에 대해 방법을 실행하는 단계; 및 원유를 회수하기 위해 전체 건조된 바이오매스(biomass) 및/또는 용매를 이용하는 추출 기법과 비교하여 금속 및 무기 원소가 더 적은 원유를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항중 어느 한 항에 있어서,
    전체 발효 브로스가 0.05 g/ℓ를 초과하는 농도로 염 및 이온과 회합된 조질의 당분 공급원을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    염 및 이온이 Na, K, Ca, Mg, Zn, 및 염화물, 황산염, 인산염, 질산염, 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    염 및 이온이 칼륨, 칼슘, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  22. 제19항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서,
    염 및 이온이 0.5 내지 40 g/ℓ의 농도로 축적되는 방법.
  23. 제19항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서,
    염 및 이온이 나트륨에 비해 더 높은 농도의 칼륨을 포함하는 방법.
  24. 제19항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서,
    염 및 이온이 1 g/ℓ를 초과하는 농도로 칼슘을 포함하는 방법.
  25. 제19항 내지 제23항중 어느 한 항에 있어서,
    염 및 이온이 2.5 g/ℓ를 초과하는 농도로 칼륨을 포함하는 방법.
  26. 제19항 내지 제25항중 어느 한 항에 있어서,
    생성물이 유지성 미생물로부터 방출될 때 염 및 이온이 융합에 의한 오일 상의 회수를 돕는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    발효 브로스가 융합 동안 0.5 내지 40 g/ℓ 농도의 염 및 이온을 포함하는 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    융합이, 융합된 지질 부피의 80% 이상이 40 ㎛를 초과하는 직경의 크기를 갖는 융합된 지질 입자 크기 분포를 생성하는 방법.
  29. 제26항에 있어서,
    융합이, 융합된 지질 부피의 95% 이상이 40 ㎛를 초과하는 직경의 크기를 갖는 융합된 지질 입자 크기 분포를 생성하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항중 어느 한 항에 있어서,
    가열 후 발효 브로스를 감압시키는 단계; 및 전체 발효 브로스를 냉각시켜 추가의 가공 이전에 브로스 중의 고형분을 농축시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항중 어느 한 항에 있어서,
    가열 후 용매를 건조 세포 또는 용균화된 발효 브로스에 첨가하여 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    용매를 헥산, 도데칸, 데칸, 디젤, 알코올, 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    용균화된 발효 브로스 및 용매의 혼합물을 교반하여 유지성 미생물로부터의 오일과 접촉시켜 이를 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    용매 및 오일을 용균화된 발효 브로스로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    용매 및 오일을 용균화된 발효 브로스로부터 분리하기 위해 원심분리기를 사용하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    용매 및 오일을 반응시켜 오일의 일부 이상을 연료 성분으로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    용매 및 잔여 오일을, 바이오연료를 포함한 연료로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. 제34항 내지 제37항중 어느 한 항에 있어서,
    사용후 브로스를 농작물용 비료, 동물 사료, 효모 추출물, 효모 가수분해물, 또는 탄소/영양소의 공급원으로서 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 제1항 내지 제38항중 어느 한 항에 있어서,
    유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스가 당분 공급원료를 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    유지성 미생물 및 당분 공급원료가 함유된 전체 발효 브로스가, 발효 브로스 1 ℓ 당 약 50 내지 약 250 g의 지질, 발효 브로스 1 ℓ 당 약 0 내지 약 50 g의 당분, 발효 브로스 1 ℓ 당 약 0 내지 약 40 g의 염, 및 발효 브로스 1 ℓ 당 약 10 내지 약 100 g의 무지질(lipid-free) 건조 바이오매스를 포함하는 방법.
  41. 제1항 내지 제40항중 어느 한 항에 있어서,
    유지성 미생물이 40 중량% 이상의 지방을 포함하는 방법.
  42. 제1항 내지 제41항중 어느 한 항에 있어서,
    유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스를 저온살균하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    전체 발효 브로스를 약 40℃ 내지 약 80℃로 약 1 분 내지 약 3 시간 동안 가열함으로써 전체 발효 브로스를 저온살균하는 단계를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    전체 발효 브로스를 약 90℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃, 또는 약 110℃ 내지 약 150℃, 또는 약 120℃ 내지 약 150℃, 또는 약 130℃ 내지 약 150℃의 온도에서 약 30 분 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 8 시간 동안 유지시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    가열 기간 동안 전체 발효 브로스를 스터링(stirring)하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서,
    전체 발효 브로스에 산을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  47. 제44항 내지 제46항중 어느 한 항에 있어서,
    전체 발효 브로스에 염기를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  48. 제44항 내지 제47항중 어느 한 항에 있어서,
    비드 밀(bead mill), 균질기, 오리피스 판(orifice plate), 고-전단 혼합기, 프레스, 압출기, 압력 파열, 습식 제분, 건식 제분, 또는 기타 전단 또는 기계적 파열 장치를 통해 1회 이상 전체 발효 브로스를 통과시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    비드 밀, 균질기, 오리피스 판, 고-전단 혼합기, 프레스, 압출기, 압력 파열, 습식 제분, 건식 제분, 또는 기타 전단 또는 기계적 파열 장치를 통해 2회 이상 전체 발효 브로스를 통과시키는 단계를 포함하는 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서,
    용기 중의 용균화된 발효 브로스를 약 70℃ 내지 약 100℃에서 약 1 내지 약 60 시간 동안 스터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    용기 중의 용균화된 발효 브로스에 염을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    약 2 중량% 이하의 염을 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    염이 NaCl, KCl, K2SO4, Na2S04이거나, 또는 하나 이상의 NaOH 및 KOH + H2SO4의 조합물로부터 유래되는 방법.
  54. 제50항 내지 제53항중 어느 한 항에 있어서,
    용기 중의 용균화된 발효 브로스의 pH를 약 3 내지 약 11로 조정하기 위해 염기를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  55. 제51항 내지 제54항중 어느 한 항에 있어서,
    유리 지방산이 20% 미만인 오일을 전체 발효 브로스로부터 원심분리를 통해 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  56. 제1항 내지 제55항중 어느 한 항에 있어서,
    유지성 미생물이 유지성 효모 세포인 방법.
  57. 제1항 내지 제56항중 어느 한 항에 있어서,
    유지성 미생물의 유지성 세포 벽을 파쇄하기 위해 효소의 조합물을 사용하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 효소가 아밀라아제, 1-4 만노시다아제, 및 1-3 만노시다아제를 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    효소의 조합물이 설파타아제, 프로테아제, 및 키티나아제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 보조 효소를 추가로 포함하는 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서,
    아밀라아제가 알파 1-4 연결된 글루코오스에 대해 특이적인 방법.
  60. 제57항 내지 제59항중 어느 한 항에 있어서,
    효소의 조합물이 약 5 중량% 내지 약 30 중량%의 아밀라아제를 포함하는 방법.
  61. 제57항 내지 제60항중 어느 한 항에 있어서,
    효소의 조합물이 약 5 중량% 내지 약 45 중량%의 1-4 만노시다아제를 포함하는 방법.
  62. 제57항 내지 제61항중 어느 한 항에 있어서,
    효소의 조합물이 약 5 중량% 내지 약 45 중량%의 1-3 만노시다아제를 포함하는 방법.
  63. 제57항 내지 제62항중 어느 한 항에 있어서,
    유지성 세포 벽을 파쇄한 후 유지성 세포 벽으로부터의 세포내 대사산물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  64. 제63항에 있어서,
    세포내 대사산물이 지질을 포함하는 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서,
    세포내 대사산물을 바이오연료로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  66. 제63항 내지 제65항중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 대사산물을 수집한 후 남아있는 수성 추출 유출물을 재순환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수(imbibition water)로서 재순환된 추출수를 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  68. 아밀라아제, 1-4 만노시다아제, 및 1-3 만노시다아제를 포함하는, 미생물 세포 벽을 분해하기 위한 효소 조합물.
  69. 제68항에 있어서,
    아밀라아제가 알파 1-4 연결된 글루코오스에 대해 특이적인 효소 조합물.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서,
    설파타아제, 프로테아제, 및 키티나아제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 보조 효소를 추가로 포함하는 효소 조합물.
  71. 제68항 내지 제70항중 어느 한 항에 있어서,
    조합물이 스포리디오볼루스 파라로세우스(Sporidiobolus pararoseus) MK29404와 함께 사용되는 효소 조합물.
  72. 제68항 내지 제71항중 어느 한 항에 있어서,
    약 5 중량% 내지 약 30 중량%의 아밀라아제를 포함하는 효소 조합물.
  73. 제68항 내지 제72항중 어느 한 항에 있어서,
    약 5 중량% 내지 약 45 중량%의 1-4 만노시다아제를 포함하는 효소 조합물.
  74. 제68항 내지 제73항중 어느 한 항에 있어서,
    약 5 중량% 내지 약 45 중량%의 1-3 만노시다아제를 포함하는 효소 조합물.
  75. 유지성 미생물이 함유된 전체 발효 브로스에 아밀라아제, 1-4 만노시다아제, 및 1-3 만노시다아제를 포함하는 효소의 조합물을 적용하여 유지성 미생물의 세포 벽을 파쇄하는 단계; 및
    후속적으로 유지성 미생물로부터 생성물을 추출하는 단계
    를 포함하는, 전체 발효 브로스로부터 바이오연료를 생산하는데 적합한 지질 추출 방법.
  76. 제75항에 있어서,
    효소의 조합물이 설파타아제, 프로테아제, 및 키티나아제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 보조 효소를 추가로 포함하는 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서,
    아밀라아제가 알파 1-4 연결된 글루코오스에 대해 특이적인 방법.
  78. 제75항 내지 제77항중 어느 한 항에 있어서,
    효소의 조합물이 약 5 중량% 내지 약 30 중량%의 아밀라아제를 포함하는 방법.
  79. 제75항 내지 제78항중 어느 한 항에 있어서,
    효소의 조합물이 약 5 중량% 내지 약 45 중량%의 1-4 만노시다아제를 포함하는 방법.
  80. 제75항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서,
    효소의 조합물이 약 5 중량% 내지 약 45 중량%의 1-3 만노시다아제를 포함하는 방법.
  81. 제75항 내지 제80항중 어느 한 항에 있어서,
    세포 벽을 파쇄한 후 유지성 미생물로부터 세포내 대사산물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  82. 제81항에 있어서,
    세포내 대사산물이 지질을 포함하는 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서,
    세포내 대사산물을 바이오연료로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  84. 제81항 내지 제83항중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 대사산물을 수집한 후 남아있는 수성 추출 유출물을 재순환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  85. 제84항에 있어서,
    당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수로서 재순환된 추출수를 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  86. 제75항 내지 제85항중 어느 한 항에 있어서,
    전체 발효 브로스를 약 90℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃, 또는 약 110℃ 내지 약 150℃, 또는 약 120℃ 내지 약 150℃, 또는 약 130℃ 내지 약 150℃의 온도로 가열함으로써 전처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  87. 제75항 내지 제86항중 어느 한 항에 있어서,
    용매를 건조 세포 또는 용균화된 발효 브로스에 첨가하여 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  88. 제87항에 있어서,
    용매를 헥산, 도데칸, 데칸, 디젤, 알코올, 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택하는 방법.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서,
    브로스 및 용매의 혼합물을 교반하여 유지성 효모 세포로부터의 오일과 접촉시켜 이를 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  90. 제89항에 있어서,
    용매 및 오일을 브로스로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  91. 제90항에 있어서,
    용매 및 오일을 브로스로부터 분리하기 위해 원심분리기를 사용하는 단계를 포함하는 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서,
    용매 및 오일을 반응시켜 오일의 일부 이상을 연료 성분으로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  93. 제92항에 있어서,
    용매 및 잔여 오일을, 바이오연료를 포함한 연료로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  94. 제75항 내지 제93항중 어느 한 항에 있어서,
    사용후 브로스를 농작물용 비료, 동물 사료, 효모 추출물, 효모 가수분해물, 또는 탄소/영양소의 공급원으로서 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  95. 유지성 미생물이 함유된 수성 발효 브로스로부터 지질을 추출하여, 바이오매스 고형분 및 잔여 브로스 워터를 남기는 단계; 및
    당분을 추출하기 위해 공정 공급원료를 세척하는 팽윤수로서 상기 잔여 브로스 워터를 사용하는 단계
    를 포함하는, 수성 발효 브로스로부터 바이오연료를 생산하는데 적합한 지질 추출 방법.
  96. 제95항에 있어서,
    수성 발효 브로스를 저온살균하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  97. 제96항에 있어서,
    수성 발효 브로스를 약 40℃ 내지 약 80℃로 약 1 분 내지 약 3 시간 이하 동안 가열함으로써 수성 발효 브로스를 저온살균하는 단계를 포함하는 방법.
  98. 제95항 내지 제97항중 어느 한 항에 있어서,
    수성 발효 브로스를 약 30 분 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 8 시간 동안 가열하는 단계를 포함하는 방법.
  99. 제98항에 있어서,
    수성 발효 브로스를 약 90℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃, 또는 약 110℃ 내지 약 150℃, 또는 약 120℃ 내지 약 150℃, 또는 약 130℃ 내지 약 150℃의 온도에서 약 30 분 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 18 시간, 또는 3 시간 초과 내지 약 8 시간 동안 유지시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  100. 제99항에 있어서,
    가열 기간 동안 수성 발효 브로스를 스터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  101. 제95항 내지 제100항중 어느 한 항에 있어서,
    수성 발효 브로스에 산을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  102. 제95항 내지 제101항중 어느 한 항에 있어서,
    수성 발효 브로스에 염기를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  103. 제95항 내지 제102항중 어느 한 항에 있어서,
    비드 밀, 균질기, 오리피스 판, 고-전단 혼합기, 프레스, 압출기, 압력 파열, 습식 제분, 건식 제분, 또는 기타 전단 또는 기계적 파열 장치를 통해 1회 이상 수성 발효 브로스를 통과시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  104. 제103항에 있어서,
    비드 밀, 균질기, 오리피스 판, 고-전단 혼합기, 프레스, 압출기, 압력 파열, 습식 제분, 건식 제분, 또는 기타 전단 또는 기계적 파열 장치를 통해 2회 이상 수성 발효 브로스를 통과시키는 단계를 포함하는 방법.
  105. 제95항 내지 제104항중 어느 한 항에 있어서,
    용기 중의 용균화된 발효 브로스를 약 70℃ 내지 약 100℃에서 약 1 내지 약 60 시간 동안 스터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  106. 제105항에 있어서,
    용기 중의 용균화된 발효 브로스에 염을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  107. 제106항에 있어서,
    용기 중의 용균화된 발효 브로스에 약 2 중량% 이하의 염을 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  108. 제106항 또는 107항에 있어서,
    염이 NaCl 또는 Na2S04인 방법.
  109. 제105항 내지 제108항중 어느 한 항에 있어서,
    염기를 첨가하여 용기 중의 용균화된 발효 브로스의 pH를 약 3 내지 약 11로 조정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  110. 제95항 내지 제109항중 어느 한 항에 있어서,
    지질을 용균화된 발효 브로스로부터 원심분리를 통해 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  111. 제95항 내지 제110항중 어느 한 항에 있어서,
    수성 발효 브로스가 사탕수수 추출물을 포함하는 방법.
  112. 제95항 내지 제110항중 어느 한 항에 있어서,
    바이오매스 고형분을 잔류 브로스 워터에 의해 재순환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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