CN101849015A - 通过碱土金属皂沉淀步骤的由得自包含醇、皂和/或脂肪酸的起始原料的脂质进行发酵的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于由起始原料形成脂质或脂质的混合物的方法，所述起始原料包含至少一种醇和皂或皂前体，所述方法包括：将金属离子形成剂加入起始原料中，由此形成含有不溶相和液相的混合物；将不溶相由液相分离；使产脂微生物在培养基上与所述液相接触，由此开始产生脂质；以及收集脂质。本发明还涉及用于由含醇液相形成脂质或脂质的混合物的方法，所述液相包含至少一种醇。

Description

通过碱土金属皂沉淀步骤的由得自包含醇、皂和/或脂肪酸的起始原料的脂质进行发酵的方法
本发明涉及用于由起始原料形成脂质或脂质的混合物的方法，所述起始原料包含至少一种醇和皂或皂的前体。本发明还涉及用于由含醇液相形成脂质或脂质的混合物的方法，所述液相包含至少一种醇。
发明背景
生物柴油主要是脂肪酸甲酯，通过将长链脂肪酸与醇(甲醇)进行酯交换产生。天然脂肪的脂肪酸酯主要由甘油三酯组成，因此，在酯交换时，不适宜作为生物柴油的水溶性甘油从中释放出来。从理论上讲，由甘油三酯产生10％重量的甘油。根据工艺条件，皂的比例可大幅变化，并且可上升至甘油三酯初始总量的百分之几十。由于皂化合物分散于且部分溶于形成中的甘油水溶液中，因此难以将其从水溶液中分离出来。皂破坏脂溶性脂肪酸酯与水溶性甘油之间的相，并趋于形成不同程度的乳状液，就分离技术而论，在大规模处理时造成极富挑战性的困难。醇(例如甲醇)的去除，也将需要昂贵的真空蒸馏。因此，可以断定，在现代技术中采用前述方法进行生物柴油的生产是一种原料的浪费。仅就甘油所需的纯化步骤而论，提高在该方法中所产生的甘油的值就已非常不合算。
一些微生物在其细胞中积累脂肪。已知甘油可用作微生物(即使是对于积累脂肪的微生物)的碳源(例如Microbial Lipids(微生物的脂质)，主编C.Ratledge和S.G.Wilkinson，第1卷，Academic Press，1988；Papanikolaou，S.和Aggelis，G.，Lipid production by Yarrowia lipolyticagrowing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture(在一级连续培养中通过生长在工业用甘油中的亚罗解脂酵母进行脂质生产)，Bioresource Technol.82(2002)43-49)。另一方面，对于积累脂肪的微生物以及由其产生的脂肪，在十年间都未取得突破，除大多用于一些特殊脂肪的小规模生产以外。在来源于生物柴油工艺的甘油的利用中，尤其是在通过微生物形成的脂肪中，这种甘油的普遍不良质量，例如就脂肪酸的碱金属盐(下文亦称皂)和它含有的醇而论，已成为问题。皂和醇阻止大多数生物的生长，因此，除去皂和醇对于微生物利用甘油是必要的。
大多数天然脂肪含有包含烃链的脂肪酸，所述烃链与醇基结合形成脂肪最富含能量的部分。脂肪的这个最富含能量的部分可通过由其形成醇酯而释放。在这个过程中，释放出甘油水溶液，其与醇和由脂肪的脂肪酸形成的皂化合物(下文亦称皂)混合在一起。含有甘油、醇和皂的这个部分是水溶性的，并且仍具有高的能量含量，尤其相对于皂而言。仅就甘油而言，在生产脂肪酸醇酯时，主要含有甘油的这一水溶性部分从理论上讲就已形成10％以上的次要废液流(minor wasteflow)。甘油本身就已经不贵，而且其市场也已饱和。因此，就在产生脂肪酸醇酯时形成的含杂质的甘油而言，没有内在的能量高效用途，并且鉴于现有技术，如果形成产生成本问题的次要液流(minor flow)，对此没有能量高效(energy efficient)，因此也没有产生附加值的有益技术能量高效。
对通过化学技术从中获得的甘油或产品在商业上有价值的可能用途进行了广泛研究。尽管如此，目前仍没有可能较之前利用甘油的程度明显较高且经济上耐用的解决办法。在Sarantila的研究中，总结了有关甘油作为化学工业原料的适宜性以及与其用途有关的挑战的多个方面(Sarantila，Maiju：Glyserolin
Figure GPA00001137463200021
Teknillinen korkeakoulu，10.11.2006。[Sarantila，Maiju：Utilization ofGlycerol(甘油的利用)，毕业论文，Helsinki University of Technology，2006年11月10日])。下面，根据该论文，描述了目前已知的最实际可能的用于提高利用率和附加值的甘油用途。
甘油分子的氧含量相对较高，而碳含量较低，因此导致热量值较差。此外，甘油火焰的温度比传统化石燃料的低。在实践中，已知甘油的燃烧还需要特别安排，因为必需使它达到非常小的液滴大小才能达到与氧气充分混合。此外，在生产生物燃料时所释放的甘油含有水。
甘油可按照多种不同的方法以化学方式衍生化。例如，甘油的酯化、醚化、乙酸甘油酯和二醇的生产与油的聚合和氧化同样为人所熟知。主要是对于这些方法的产物没有大规模应用，尤其是考虑到其生产需要程度高的甘油纯度以及昂贵耗能的催化剂和反应器技术(reactor technology)。
重整，即由甘油形成氢气，是一项能够处理甚至大量甘油的技术。然而，重整需要专门的仪器、大量的能源投资，且该方法本身需要昂贵的催化剂。
甘油在农业上也有一些应用。甘油可像动物饲料的组分一样用作能源。然而，它不含有蛋白质、脂肪或糖。即使就痕量元素而言，工业用甘油也不足，因此只能构成饲料混合物中的次要亚组分。此外，在生产有机燃料时形成的甘油含有甲醇和皂，这就需要与相对于饲料总成本结构不相称的纯化操作，例如用于除去醇或单独除去脂肪的真空蒸馏。
因此，显而易见的是，对于将甘油、尤其是含有甘油的不均匀混合物作为成分转化为商用产品而言，不存在可显著增加其需求的经济上有利的解决方法。尤其当在化石原料增长的同时兴趣转向可再生能源原料来源时，这项技术的缺点更突出。
发明简述
本发明涉及用于由起始原料形成脂质或脂质的混合物的方法，所述起始原料包含至少一种醇和皂或皂的前体。
本发明还涉及用于由含醇液相形成脂质或脂质的混合物的方法，所述液相包含至少一种醇，按照该方法，将产脂微生物接种到含有所述含醇液相的培养基中，使微生物产生脂质，并回收细胞团块(cellmass)或由细胞产生的脂质。
更具体地讲，本发明方法的特征在于权利要求1和4的特征部分的内容。
同样，本发明用途的特征在于权利要求23和24所述的内容。
本发明提供与一种方法有关的问题的新的解决方法，其中，按照已确立的方法，通过用碱金属醇盐处理脂质(例如甘油脂质(glycerolipids))，由脂质产生脂肪酸的酯类。甘油是在该方法中产生的，并且在一个副反应中，释放出醇以及碱金属盐、含有烃链的水溶性脂肪酸的皂。该方法的主要问题在于对不纯的甘油的利用以及将甘油形成为所述利用所需的安全有益的化合物的纯化。
本发明的综合优势是它可通过简单的方法步骤，以能量高效和环境友好的方式，由生物来源的含有较少能量的化合物(例如多元醇和一元醇)来产生富含能量的化合物脂质，优选避免使用大量的水。
含有醇的化合物和脂肪酸的未酯化盐的次要液流，就能源经济学而言难以利用，并且是从有机脂质中包含的脂肪酸酯的酯交换中释放出来的，它们可被转化成适用于产生由脂肪酸构成的甘油脂质的部分，所述甘油脂质可直接利用，或者可循环成为生物来源的含有甘油脂质的其它材料。将在微生物中形成的脂质形成所需要的酯类的处理可发生在不需要之前的微生物细胞的分解和随后的脂肪分离的步骤。
本发明的优势还包括该方法所需要的仪器简单，所涉及的有关制备和使用的技术是已知的。本发明的方法不受生产规模的限制，却可容易地逐步增加入将要处理的多元醇部分所需要的量。实施该方法不需要耗能的加热、加压单元操作或化学催化剂，对于操作，它只需要使用这类化学物质或加工这类可加入本发明方法的内部循环的生物材料。该方法不需要增加成本的对多元醇部分的预纯化，也不需要除去水份。由于除内部循环以外，在该方法中所形成的无脂质生物量(biomass)可用于许多不同的目的，例如用于产生单一组分或作为用于微生物生产的补充培养基，因此该方法的总成本效率得到提高。
本发明还可消除因表面活性化合物的存在而引起的普遍已知的问题。众所周知，表面活性化合物，例如脂肪酸的皂类，抑制微生物的生长并只作为少数微生物的碳源。在微生物的生产过程中，皂的存在降低了培养基的表面活性，产生泡沫，并且使将细胞与液体以基于其比重的方法的分离变得复杂起来。在含有水和水不溶性油的混合物中，皂的存在还抑制水相和油相的彼此分离。因此，含有皂样化合物的多元醇不适于用微生物的方法生产，同时抑制或削弱包含在生物柴油工艺中产生的皂的醇类次要液流的总体利用。通过本发明，例如，在生产脂肪酸酯时形成富含甘油的副产物部分(side fraction)所含的有机化合物可采用某种方法转化回脂质，这种方法结合化学处理实现了微生物的脂质生产。
通过本发明的方法，实现了通过微生物生产脂质的特殊的灵活性。含有多元醇而无生长抑制性有害组分的部分是大多数微生物的天然碳源。因此，该方法的一个优势还在于可以在大范围内选择微生物，例如根据脂质生产的能力、生物量的产量、培养方法或培养条件。还可按照许多不同的方式，以能量高效的方式使用脂质以外的其它微生物组分，因此，提高了本发明方法的总成本效率。
因此，与现有技术相比，本发明通过降低对来自其它来源的脂肪原料的需求，实现了持续发展的原则，并具备了将生产成本与用户可接受的水平相适应的先决条件。
下面，参照附图和发明详述，对本发明进行更详细的描述。
附图简述
图1表示本发明方法的主要实施步骤。
图2是酵母在本发明的起始原料或含醇液相中生长的曲线图，其中存在的皂已按照本发明的方法除去。
图3是酵母在纯甘油(生产商J.T.Baker，USA)中生长的曲线图。
图4是酵母在含有甘油和甲醇这两者的培养基(substrate)中生长的曲线图。图4a表示亚罗解脂酵母(Yarrowia liolytica)在培养基上的生长，所述培养基含有5％/10％的甘油，加入或不加入甲醇(占甘油量的2％重量)，图4b表示粘红酵母(Rhodotorula glutinis)在相应培养基中的生长。
图5是酵母在不含皂的甘油部分上生长的曲线图，不含皂的甘油部分5％、12.5％或25％的量在YNB(酵母氮源(Yeast Nitrogen Base))培养基使用。
图6柱状图是当培养基(YNB)含有5％或12.5％的不含皂的生物柴油-甘油部分时，酵母在不同时间点上的脂肪含量。粘红酵母和亚罗解脂酵母的脂肪含量分别见图6a和图6b。
图7是在使用葡萄糖(A)、纯甘油(B)或不含皂的甘油部分(C)作为碳源的培养基上大地半乳糖霉(Galactomyces geotrichum)的生长图。图7a表示霉菌的生长曲线，图7b表示霉菌细胞的脂肪含量。
发明详述
本发明涉及用于由起始原料形成脂质或脂质的混合物的方法，所述起始原料包含至少一种醇和皂或皂的前体，所述方法还包括
-将金属离子形成剂(metal ion forming agent)加入起始原料中，由此形成含有不溶相(insoluble phase)和液相的混合物，
-将不溶相由液相分离，
-使产脂质微生物在培养基上与所述液相接触，由此所述微生物细胞开始产生脂质，和
-收集脂质。
优选起始原料包含多元醇或一元醇或者这两者以及皂或皂的前体。
本发明还涉及用于由含醇液相形成脂质或脂质的混合物的方法，所述液相包含至少一种醇，所述方法还包括
-使产脂微生物在培养基上与含醇液相接触，由此所述微生物细胞开始产生脂质，和
-收集脂质。
优选液相包含多元醇或一元醇或者这两者。
具体地讲，本发明涉及用于从上述起始原料形成脂质或脂质的混合物的方法，其中醇的量至少为起始原料的一半，优选70％重量～99％重量，或者涉及用于从上述含醇液相形成脂质或脂质的混合物的方法，其中醇的量为所述液相的36％重量～100％重量，优选70％重量～100％重量。
根据本发明的一个优选实施方案，将含醇部分在该方法中用作起始原料以形成脂质或脂质的混合物，所述含醇部分由甘油脂质组成的脂质使用甲醇钠进行酯交换所形成。
术语“脂质”是指脂肪物质，其分子的一部分通常为溶于有机溶剂但是难溶于水的脂族烃链。
在本发明中，微生物中形成的脂质主要是三酰甘油，即由甘油和脂肪酸形成的三酯(甘油三酯)或甾醇的酯，但是在细胞中也可形成其它脂质，例如磷脂、甾醇、多萜醇、鞘脂、糖脂和双磷脂酰甘油。
根据本发明的一个优选实施方案，由含醇液相形成甘油三酯或含有甘油三酯的混合物，其中甚至还存在大量的例如甾醇和游离氧的组分。
术语“皂”是指脂肪酸的盐。
本发明主要包括一种基于天然平台(natural substage)的方法，通过该方法由甘油、其它醇(例如一元醇)和有机皂的混合物产生含有长链脂肪酸的脂肪(脂质)。因此，本发明可用于将高度氧化的有机化合物转化成具有高能量含量的还原性脂质，其通过进一步提炼可适于应用不同的产能形式。
下面，为了简单起见，本发明及其实施方案将甘油称为多元醇，但是可用适于本发明的其它多元醇代替甘油。
甘油和一元醇适宜作为微生物的碳源，尤其是因为已知证实，它们作为混合物增强两种碳源的使用，并且通过选择合适的微生物，这些化合物可通过生物合成而转化成微生物来源的由脂肪酸构成的脂质和转化成可加以利用的其它生物材料，例如作为所述方法内的营养物，用于分离可用于其它普通应用的有商业价值的化合物或生物量，例如作为饲料和营养物。
在酸催化制备的脂肪酸酯中形成的皂给基于微生物的脂质的产生带来了问题。皂减缓或甚至完全抑制微生物的生长，并因此降低或甚至完全抑制脂质的生物合成。皂还会使将细胞由培养基的分离复杂化。
按照本发明的方法，可通过将化学方法和微生物学方法结合，由含有甘油次要液流的不纯的皂通过微生物学的产生含有脂肪酸的脂质，其中含有甘油和其它化合物的部分用于合成脂质的微生物的产生，并且所述微生物因此形成的脂质可以再次使用，例如用于制备脂肪酸的醇酯。
在本发明中，将适于工业用途的化学反应和生物学反应以新的方式结合到实际方法中，通过该方法，可将在酸催化制备的脂肪酸酯中形成的甘油溶液中所包含的甘油、醇(优选为一元醇)和其它有机化合物以能量高效的方式转化成含脂肪酸的脂质。
本发明优选包括以下步骤，其中经过滤从甘油部分中除去可能的固体物质组分，之后用所需量的酸调节甘油部分的酸度，优选用形成可用作微生物的碳源的盐的酸，更优选用乙酸、甲酸或乳酸。过滤可通过例如使用意欲用于过滤的织物进行。
按照一个优选的实施方案，用于形成脂质或脂质的混合物的方法包括以下步骤：
-任选将酸加入起始原料中，优选有机酸，更优选乙酸、甲酸或乳酸，以调节pH值为3-8，优选值为6-8，
-将作为固体或作为液体(例如水溶液)的金属离子形成剂，例如碱土金属的无机盐，优选形成Ca2+或Mg2+的形成剂，更优选氯化钙或氯化镁，最优选氯化钙，以沉淀至少40％皂的量，优选以形成相对于皂的量为化学计算量的金属离子的量，最优选以超过化学计算量(stoichiometric excess)10％重量的量，加入混合物中，由此形成不溶相和液相，其中不溶相包含皂，液相包含含有多元醇或一元醇的含醇溶液，即前述液相，
-分离出不溶相，其中可能存在的皂前体已反应成为皂，优选经过滤或经倾析或通过一般用于回收沉淀物的其它方法从液相中分离出来，
-向培养基上提供液相和产脂质微生物，向培养基补充产生脂质所需要的营养物或者补充含有所述营养物的裂解的微生物团块，
-使微生物细胞产生脂质，从而脂质在微生物细胞内部或外部积累，
-任选裂解微生物细胞，
-任选通过相分离或抽提来分离脂质，
-优选经过滤或通过基于比重差异的方法(例如离心法)并随后通过分离所形成的部分(例如通过分离脂质、含脂质的部分或得自所回收的细胞团块的细胞中的脂质混合物)来回收细胞团块或由所述细胞产生的脂质，和
-优选使用细胞团块或其部分作为脂质。
特别优选将存在于任选过滤的甘油部分中的水溶性皂通过以下方法转化为水不溶性皂：向所述混合物中加入二价碱土金属的无机盐，优选Ca2+，最优选CaCl2。所加入的盐最适宜为固体，从而可以避免使用大量的水。控制混合时间，直到基本上停止形成沉淀。经过滤或经倾析或通过一般用于回收沉淀的其它方法，将所形成的不溶解部分(沉淀)与液体部分(液相)分离开来。如下使用液体甘油部分与它可能含有的其它化合物：通过以适于微生物脂质生产的浓度，混合到微生物培养基中。在分离皂沉淀之后，其所含的C4以上的烃部分可用若干种不同的方法处理，优选用于产生游离脂肪酸，最优选用于产生脂肪酸酯。
在该方法不同阶段加入的化合物，例如乙酸或CaCl2等二价碱土金属盐或这些化合物形成的副产物部分，除NaCl和二氧化碳以外，都不全部从整个方法中除去，而是优选在该方法中再循环，或形成独立的在经济上可利用的部分，因此，提高该方法的整体成本效用。
通过从在酯交换中形成的含醇副产物部分中除去表面活性化合物，建立使用这一部分用于培养微生物并用于产生单细胞(one-cell)脂质的先决条件。
然而，令人惊讶地发现，试剂纯甘油不是一种非常高效的碳源。另一方面，甲醇强化甘油的使用，即不需要除去甲醇，它可用来产生微生物来源的脂肪。
上文表明：基本上所有已处于相对氧化阶段的有机碳化合物可以上述效率加以利用以使得微生物能够利用这种混合物形成脂质，所述有机碳化合物来自含有大量未经利用的烃链的不纯的甘油部分。
用于本发明中的多元醇选自含有至少3个碳的多羟基脂族烷基醇。优选多元醇为甘油、由磷脂形成的醇、或甾醇。最适宜地，所述多元醇为甘油。另一方面，一元醇选自含有1-4碳的烷基醇，优选甲醇、乙醇或1-丙醇。最适宜一元醇为甲醇。
微生物选自天然或经改造的积累脂肪的微生物，优选选自酵母、霉菌、细菌和藻类，更优选选自酵母和霉菌，最适宜选自酵母。重要的是所述微生物能够产生脂质。
适用于本发明的积累脂肪的酵母属包括：
·假丝酵母属(Candida)(尤其是弯假丝酵母(C.curvata))
·西洋蓍霉属(Yarrowia)(尤其是亚罗解脂酵母)
·油脂酵母属(Lipomyces)(尤其是油脂酵母)
·红酵母属(Rhodotorula)(尤其是粘红酵母)
相应的适用于本发明的积累脂肪的霉菌属包括：
·被孢霉属(Mortierella)
·毛霉属(Muco)
·半乳糖霉属(Galactomyces)
相应的积累脂肪的细菌属包括：
·红球菌属(Rhodococcus)
·颤藻属(Oscillatoria)
同样，积累脂肪的微藻类属包括：
·隐甲藻属(Crypthecodiniumi)
·吾肯氏壶菌属(Ulkenia)
·裂殖壶菌属(Schizochytrium)
根据本发明的一个优选实施方案，使用在其细胞中以如下量合成含有脂肪酸的脂质的微生物进行脂质的合成，所述量优选为细胞干重的12％重量-60％重量。
按照本发明另一个优选的实施方案，使用能够利用甘油和短链醇作为碳源的微生物进行脂质的合成。
按照本发明一个特别优选的实施方案，使用适用于微生物的方式处理过的在本发明中形成的无脂质生物量作为培养基的营养物。除这些组分以外，可以向培养基补充有利于所使用的微生物的组分。为了产生脂质，微生物一般尤其需要碳源，在本发明中它获自起始原料；氮源，例如无机铵盐(例如硫酸铵)或有机氮源(例如氨基氮、酵母提取物或水解的细胞团块)；以及痕量元素源，例如磷酸盐、硫酸盐、氯化物、维生素或阳离子源(例如Mg、K、Na、Ca、Fe或Cu离子源)，必要时将这些组分加入培养基中。当应用本发明的方法时，培养基的醇含量优选为2％重量-36％重量。
为了从微生物中回收脂质，首先收集细胞，然后使细胞裂解，或者细胞例如因自溶而裂解，从而将作为油相的脂质与水相分离开来，又或者，将微生物团块本身或通过不同的已知方法由微生物团块获得的部分用作脂质。微生物中包含的含有脂肪酸的脂质或者由微生物产生的含有脂肪酸的脂质无需预先进行下述处理便可进行酯交换：将脂质从细胞中分离出来，或者将细胞裂解并用有机溶剂从破碎细胞中提取脂质。适用于本发明的脂质回收方法参见例如由Z.Jacob出版的：Yeast Lipids：Extraction，Quality Analysis，and Acceptability(酵母脂质：提取、质量分析与可接受性)，Critical Reviews in Biotechnology，12(5/6)；463-491(1992)。
当采用本发明的方法时，在细胞中形成的脂质的量可增加至高达细胞干物质的60％。
按照本发明方法产生的脂质或脂质的混合物可用于许多不同的应用当中。优选对脂质、脂质混合物、含有脂质的细胞或其部分进行酯化(例如酯交换)或加氢处理。
按照本发明一个特别优选的实施方案，所产生的脂质用于生产脂肪酸的醇酯。更适宜将这些脂肪酸的醇酯进一步用于制造生物燃料，例如生物柴油。甚至更优选将这些脂肪酸酯进一步用于制造生物柴油(甲酯或乙酯)或可再生柴油(renewable diesel)(动物、植物或微生物的经氢化处理的脂质，其中微生物脂质可得自细菌、酵母、霉菌、藻类或其它微生物)。相应地，优选从在制造例如生物柴油中所形成的含甲醇的甘油部分中获得用于本发明方法的起始原料，所述部分一般含有约2％-10％的皂。在反应中使水(以及一元醇，例如甲醇)的量降到最低，因为水会引起皂化作用。将不超过20％、优选2％-10％的水释放到所述含甲醇的甘油部分中。在用于本发明方法的起始原料中，优选这一水分含量。
包含脂肪酸的甘油三酯的植物油和动物脂肪一般用作柴油机燃料的原料。将这些原料转化成燃料包括例如以下方法：酯交换、催化加氢处理、氢化裂解、催化裂解和热裂解。通常不使用甘油三酯本身，而是可在酯交换反应中，将其可转化成相应的脂肪酸酯。
例如，本发明的产物适于作为在上文中最近所提到的反应的原料，优选在脂肪酸的酯化反应中或者对植物或动物来源的脂质进行氢化处理的方法中作为原料(feed)，最优选在制造所谓的HVO(“氢化植物油”)的方法中作为原料。
为了实现最终产物(即燃料)的有利的冷流性特性，有待用于酯交换中的本发明的产物优选具有双键。
在本发明中形成的脂质可含有0％重量-40％重量的游离脂肪酸，这是在例如甘油三酯的酶促水解中形成的，或者与脂肪的纯化有关。这些脂肪酸还可用于制造生物燃料，或者所述脂肪酸或者所述酸和甘油三酯可以酯化成甲酯，而所述甲酯又可用于生物柴油。
根据EU标准2003/30/EY(EU-directive 2003/30/EY)，“生物柴油”是指“一种具有用作生物燃料的柴油品质的从植物油或动物油中产生的甲酯”。
在分离脂质之后剩下的从微生物中形成的生物量是可处理的，并且可以许多不同的方式加以利用，例如将其再一次在微生物生长所需的培养基中使用、直接使用或者在酶、化学或物理(包括机械)加工之后使用。或者，将无脂质细胞团块分成不同的组成部分。优选的另选的方法是直接在细胞团块上进行酸催化水解，之后可通过例如相分离，将脂质与其它水解的细胞团块分离开来，其余的生物量可用于培养微生物。另一个任选的方法是使用无脂质细胞团块以分离出有商业重要性的组分。这些包括蛋白质、蛋白质水解产物、从蛋白质得到的肽，尤其是当使用酵母时，除上述的以外，还有β-葡聚糖、黄原胶、维生素、维生素前体和甾醇。优选的脂质应用是含有脂质的微生物团块直接用作例如脂质原料以产生脂肪酸酯。
下面的实施例是旨在说明本发明，不应以任何方式将其视作对本发明的限制。本发明也绝不限于所使用的微生物的菌株。除所采用菌株以外，也可借助于相同种或属的其它菌株来实施本发明。产脂质微生物(藻类同样)是普遍可获得的，保存在几个菌株保藏中心，例如ATCC、DSM等。产脂质微生物和使用微生物(也可用藻类)的脂质生产方法可参见文献资料的有关研究，例如Single Cell Oils(单细胞油类)，Z.Cohen和C.Ratledge编辑，AOCS Press，2005；以及Microbial Lipids(微生物脂质)，编辑C.Ratledge和S.G.Wilkinson，第1卷和第2卷，Academic Press，1988。
实施例
实施例1.酵母在本发明的起始原料上的生长
将亚罗解脂酵母ATCC 20373和粘红酵母TKK 3031的酵母在YNB培养基上培养，培养基补充了5％(重量/体积)含有皂的生物柴油甘油部分(即本发明的起始原料)或其中的皂已按照本发明除去的生物柴油甘油部分，使之在250rpm、30℃下振荡，用Klett-Summerson比色计通过不透明度的增加来监测生长。生长曲线见图2。从图中可发现，酵母在含有皂的甘油部分上生长得非常差。值得注意的是，在不含皂的甘油部分上培养的酵母的生长相对于培养时间几乎呈线性，这对于这种培养方式是不常见的，而且不透明度的增加可能是皂与混合物的其它组分产生的乳状液的结果。即使通过离心法都不可能回收细胞，这表明细胞的残余量与皂有关，这些组合在一起抵抗通过相分离产生的离心引力的影响。因此，也不能测定细胞的脂肪含量。
上述实验表明，在脂肪酸酯的酸催化制备中形成的甘油部分(含有皂的生物柴油-甘油部分)不适用于微生物的甘油脂质生产。
实施例2.酵母在纯甘油上的生长
将实施例1的酵母在YNB培养基上培养，培养基具有5％或10％(重量/体积)的纯(达99％以上)甘油(生产商J.T.Baker，USA)作为碳源。在室温、250rpm振荡下进行培养。酵母的生长曲线见图3。酵母生长非常缓慢，或仅达中等细胞含量。特别是粘红酵母的生长不良，在10％甘油上根本不生长。
因此，可以断定，相对于按照本发明已除去皂的甘油的部分，不含甲醇的纯甘油不是产生微生物团块的有效碳源，因此，也不是产生甘油脂质的有效碳源。
实施例3.甲醇对生长的作用
当将甘油量的2％重量的甲醇加入实施例2的培养基中并监测酵母的生长时，观察到甲醇的存在促进酵母的生长或根本不影响生长(图4)。
因此，这些实验表明，在甘油部分中醇的存在对于甘油部分的完全利用而言是有利的。
实施例4.在按照本发明已除去皂的甘油部分上酵母的生长和脂肪的产生
使亚罗解脂酵母和粘红酵母的酵母在YNB培养基上生长，培养基补充了5％、12.5％或25％(重量/体积)的甘油部分(已从中除去皂)。在室温、250rpm振荡下进行培养。生长曲线见图5。由图可知，酵母生长迅速，在含有5％和12.5％甘油部分的培养基上几乎一样好，但是25％甘油部分明显减缓生长。在该实验中，粘红酵母同样在含有12.5％甘油部分的培养基上生长。然而，应当注意的是，在含有5％甘油部分的培养基的情况下，使用了2％的置换物(displacement)，而具有较高甘油浓度的置换物的大小为1％。然而，不认为这对所获得的细胞浓度或脂肪的量有影响。
通过气相层析法，在不同时间点上对在不含皂的生物柴油-甘油(5％/12.5％甘油部分)上培养的细胞进行了脂肪含量的测定。结果见图6a-b。由图可知，使用较低甘油浓度的酵母细胞的脂肪含量较高。在该研究条件下，粘红酵母比亚罗解脂酵母含有多得多的脂肪。
实施例5.不含皂的甘油上霉菌的培养
使大地半乳糖霉(Geotrichum candidum)DSM 1240霉菌在50ml培养基(酵母提取物3g/l、KH2PO4 3g/l、MgSO4 5g/l)中培养，所述培养基中含有已按照本发明从中除去皂的生物柴油甘油部分或纯甘油(J.T.Baker)25g/l。在对比实验中，将葡萄糖(20g/l)用作碳源。将细胞在20℃温度、200rpm振荡下培养48小时。用Klett-Summerson比色计监测生长。在不同碳源上培养的细胞的生长曲线见图7a。由图可知，已按照本发明从中除去皂的生物柴油-甘油作为霉菌的优良碳源，与培养在葡萄糖上的细胞的生长速度相比，未观察到细胞生长速度有显著差异。未观察到包含在生物柴油甘油部分中的甲醇对霉菌生长有任何抑制作用，但也为观察到任何促进作用。
在24小时和48小时的时间点上测定了霉菌细胞的脂肪含量。从图7b中清楚可见，与使用用其它所研究的碳源相比，生物柴油甘油部分作为碳源使得在细胞中产生的脂肪含量更高(在48小时时间点，差异有统计显著性P＜0.005)。此外，必须注意的是，通过延长培养时间，霉菌细胞的脂肪含量可能上升得甚至更高。
实施例6.在甘油上培养的藻类
使用已按照本发明从中除去皂的生物柴油-甘油部分作为碳源部分，对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)这种硅藻进行混合营养型培养。纯甘油(生产商J.T.Baker)用作对照碳源。培养基(无菌海水)中甘油的浓度为8g/l。在1升锥形烧瓶进行培养，使通过无菌过滤器吹入的空气搅拌培养物，并用荧光灯连续照明。将细胞培养250小时后，生物柴油-甘油部分的细胞产量为2.0g干细胞团块/1，对于纯甘油为1.8g/l。所得到的细胞脂肪含量，对于生物柴油-甘油部分为121mg/g干物质，对于纯甘油为128mg/g干物质。

Claims (24)

1.一种用于由起始原料形成脂质或脂质的混合物的方法，所述起始原料包含至少一种醇和皂或皂前体，所述方法的特征在于：
-将金属离子形成剂加入所述起始原料中，由此形成含有不溶相和液相的混合物，
-将所述不溶相由所述液相分离，
-使产脂微生物在培养基上与所述液相接触，由此所述微生物细胞开始产生脂质，和
-收集脂质。
2.权利要求1的方法，其特征在于：所述起始原料包含多元醇或一元醇或者这两者以及皂或皂的前体，优选所述起始原料是由于脂质的酯交换而产生的部分。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于：所述醇的量是所述起始原料的至少一半，优选70％重量-99％重量。
4.一种用于由含醇液相形成脂质或脂质的混合物的方法，所述液相包含至少一种醇，所述方法包括
-使产脂微生物在培养基上与所述含醇液相接触，由此所述微生物细胞开始产生脂质，和
-收集脂质，
所述方法的特征在于：所述醇的量是所述液相的36％重量-100％重量。
5.权利要求4的方法，其特征在于：所述液相包含多元醇或一元醇或者这两者。
6.权利要求4或5的方法，其特征在于：所述醇的量是所述液相的70％重量-100％重量。
7.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：所述多元醇是甘油、由磷脂形成的醇、或甾醇。
8.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：所述一元醇是甲醇、乙醇或1-丙醇，优选甲醇。
9.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：所述不溶相包含皂。
10.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：所述液相包含权利要求4的含醇液相。
11.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：在加入所述金属离子形成剂之前将酸加入混合物中以调节pH值为3-8，优选值为6-8。
12.权利要求11的方法，其特征在于：所述酸是有机酸，优选乙酸、甲酸或乳酸。
13.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于；所述金属离子形成剂是氯化钙或氯化镁，优选氯化钙。
14.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：所述金属离子形成剂作为固体或作为液体加入，优选作为固体加入。
15.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：所述金属离子形成剂以沉淀至少40％的皂的量加入，优选所述形成剂以形成相对于皂的量为化学计算量的金属离子的量加入，最优选以化学计算量过量10％的量加入。
16.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：在所述培养基中的醇含量为2％重量-36％重量。
17.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：所述微生物是酵母、霉菌、细菌或藻类，优选酵母或霉菌，最优选酵母。
18.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：收集微生物的细胞团块或由细胞产生的脂质后，优选从所收集的细胞团块的细胞中分离出脂质、含脂质部分或脂质混合物。
19.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：对脂质、脂质混合物、含有脂质的细胞或其部分进行酯化或加氢处理。
20.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：在培养基中再次利用所收集的细胞团块或已从中分离出脂质的细胞团块。
21.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：在使用所述细胞团块之前对其进行酶加工、化学加工或物理加工。
22.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于：从含有脂质的细胞中分离出组分，例如蛋白质、蛋白质水解产物、来源于蛋白质的肽、β-葡聚糖、黄原胶、维生素、维生素前体或甾醇或者它们中的几种。
23.按照权利要求1-22中任一项的方法产生的脂质或脂质的混合物在作为脂肪酸酯化的原料或将脂质氢化的方法的原料中的用途。
24.生物柴油制备中形成的醇混合物在用于使用权利要求1-22中任一项的方法产生脂质或脂质的混合物中的用途。
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