MX2014011979A - Microorganismos bajos en polisacaridos para la produccion de biocombustibles y otros materiales renovables. - Google Patents

Microorganismos bajos en polisacaridos para la produccion de biocombustibles y otros materiales renovables.

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Paul W Behrens
Joseph W Pfeifer
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Abstract

La presente invención se refiere a fermentaciones de densidad celular elevada de organismos del tipo silvestre que pueden conducir a una viscosidad incrementada debido a la producción de polisacáridos exocelulares. Los microorganismos mutantes con una morfología seca, que resulta de una formación reducida del polisacárido exocelular, fueron aislados y caracterizados. La composición del polisacárido exocelular para estos microorganismos modificados se muestra que va a ser diferente que la composición del polisacárido del microorganismo del tipo silvestre. Además de la formación reducida del polisacárido exocelular, los mutantes de morfología seca de las cepas múltiples muestran una viscosidad reducida, una transferencia de masa del oxígeno mejorada, y un rendimiento mejorado de la fermentación del ácido graso sobre el carbón.

Description

MICROORGANISMOS BAJOS EN POLISACARIDOS PARA LA PRODUCCION DE BIOCOMBUSTIBLES Y OTROS MATERIALES RENOVABLES Campo de la Invención Esta invención está dirigida a microorganismos, medios, aceites biológicos, biocombustibles, y/u otros métodos adecuados para su uso en la producción de lípidos.
Antecedentes de la Invención Los problemas de los niveles de los gases de invernadero y el cambio del clima han conducido al desarrollo de tecnologías que buscan utilizar ciclos naturales entre el carbón fijo y el dióxido de carbono liberado. Debido al avance de estas tecnologías, se han desarrollado varias técnicas para convertir las materias primas en biocombustibles. Sin embargo, aún con los avances anteriores en la tecnología, subsiste una necesidad y un deseo de mejorar la viabilidad económica para la conversión de las fuentes de carbono renovables a los combustibles.
El combustible biodiesel tiene beneficios claros de que son renovables, biodegradables , no tóxicos, y no contienen ni azufre ni substancias aromáticas. Pero una de sus desventajas es su costo elevado, la mayoría de las cuales se debe al costo del aceite vegetal. Por lo tanto, el aspecto económico de la producción del combustible biodiesel ha sido restringido por el costo de las materias primas aceitosas, Ref. 251394 tales como los lípidos.
Los lípidos para su uso en biocombustibles y otros materiales renovables pueden ser producidos en microorganismos, tales como la levadura, las algas, los hongos, o las bacterias. La fabricación de un lípido en un microorganismo involucra hacer crecer microorganismos que son capaces de producir un lípido deseado en un termentador o biorreactor, aislar la biomasa microbiana, secarla, y extraer los lípidos intracelulares . Sin embargo, el biocombustible y otras aplicaciones de materiales renovables requieren fermentaciones de alta densidad, y muchos microorganismos no pueden alcanzar niveles elevados de la fermentación de la densidad celular debido a la viscosidad incrementada del medio, y por consiguiente no es adecuada para aplicaciones de densidad elevada de las células, tales como los biocombustibles y otros materiales renovables.
Existe una necesidad de microorganismos para la producción de biocombustibles y otros materiales renovables que producen el caldo de fermentación con viscosidad baja y un coeficiente elevado de transferencia de masa para soportar niveles elevados de densidad celular.
Breve Descripción de las Figuras Las figuras que se anexan, las cuales son incorporadas en, y constituyen una parte de esta descripción, ilustran las modalidades de la descripción y, junto con la descripción, sirven para explicar las características, ventajas, y principios de la descripción. En las figuras: la figura 1 es una gráfica que muestra la reducción en la potencia por volumen (P/V) desde 2000 cuando la viscosidad de la solución se incrementa. La figura 1 muestra las condiciones de transferencia de oxígeno tanto elevadas como bajas.
La figura 2 es una gráfica de P/V necesaria para suministrar el oxígeno a la solución de acuerdo con la viscosidad de la solución. La figura 2 muestra condiciones de transferencia de oxígeno tanto elevadas como bajas.
La figura 3 es una gráfica de la viscosidad de la solución como una función de la concentración del polisacárido en gramos por litro La figura 4 muestra el resultado representativo de la cromatografía de intercambio iónico (IEC, por sus siglas en inglés) del polisacárido hidrolizado ácido de la cepa MK29404 del tipo silvestre (abreviado "WT" ) .
La figura 5 muestra el resultado representativo del análisis de la cromatografía de intercambio iónico (IEC) del polisacárido hidrolizado ácido de la cepa MK29404 Seco-1 mutante .
La figura 6 muestra el resultado representativo de la cromatografía por exclusión de tamaño de los polisacáridos aislados.
Descripción Detallada de la Invención La producción de aceites a partir de microorganismos tiene muchas ventajas sobre la producción de aceites de las plantas, tales como un ciclo de vida breve, un requerimiento de trabajo menor, la independencia de la temporada y el clima, y el escalamiento hacia arriba facilitado. El cultivo de microorganismos tampoco requiere superficies grandes y no existe competencia con la producción de alimentos.
Las fermentaciones de densidad elevada de las células de los organismos del tipo silvestre (abreviado "WT" ) pueden conducir a una viscosidad incrementada debido a la producción de polisacáridos exocelulares activada por las mismas condiciones limitantes del nitrógeno que facilitan la producción de lípidos. Los mutantes con una morfología y/o un fenotipo "seco" , que indican una formación reducida de polisacáridos, fueron aislados y caracterizados. Además de la formación reducida del polisacárido, los mutantes del fenotipo seco de las cepas múltiples también pueden exhibir una viscosidad reducida, una transferencia de masa del oxígeno mejorada, un rendimiento mejorado de la fermentación sobre el carbón, y la capacidad de extracción mejorada de los lípidos .
La descripción se refiere a microorganismos productores de aceite y a los métodos de cultivo de tales microorganismos para la producción de los compuestos útiles, incluyendo los lípidos, los ésteres de ácidos grasos, los ácidos grasos, los aldehidos, los alcoholes, los alcanos, los combustibles, el combustible y los precursores, para su uso en la industria y los combustibles, o como fuentes de energía y alimentos. Los microorganismos como se describieron en la solicitud pueden ser seleccionados o diseñados genéticamente para su uso en los métodos u otros aspectos de acuerdo con la descripción mencionada aquí . 1. Definiciones A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el significado entendido comúnmente por una persona experta en el arte al cual pertenece esta descripción. Las siguientes referencias proveen a una persona experta con una definición general de muchos de los términos utilizados en esta descripción: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2/a. ed. 1994) ; The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988) ; The Glossary of Genetics, 5/a. Ed. , R. Rieger et al., eds . , Springer Verlag (1991) ; Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991) ; Sambrook et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3/a. edición, 2001, Cold Spring Harbor Press) .
Cuando se utilicen aquí, los siguientes términos tienen los significados asignados a ellos a menos que se especifique de otra manera.
Cuando se utilicen aquí, los términos "tiene", "que tiene", "que comprende", "con", "que contiene", y "que incluye" son expresiones abiertas e inclusivas. Alternativamente, el término "que consiste" es una expresión cerrada y exclusiva. En el caso de que exista ambigüedad en la construcción de cualquier término en las reivindicaciones o la descripción, el intento del redactor es hacia las expresiones abiertas e inclusivas.
Cuando se utilice aquí, el término "y/o semejantes" provee soporte para cualquiera y la totalidad de los artículos y/o elementos individuales y combinados, en una lista, así como soporte para los equivalentes de los artículos y/o elementos individuales y combinados.
Con respecto al orden, el número, la secuencia, la omisión, y/o el límite de la repetición para las etapas en un método o proceso, el redactor intenta que no estén implicados el orden, el número, la secuencia, la omisión, y/o el límite de la repetición para las etapas con respecto al alcance de la invención, a menos que se provea explícitamente.
Con respecto a los intervalos, los intervalos van ser interpretados como inclusivos de todos los puntos entre los valores superiores y los valores inferiores, tal como para proveer soporte para todos los intervalos posibles contenidos entre los valores superiores y los valores inferiores que incluyen los intervalos sin un límite superior y/o el límite inferior.
Las bases para las operaciones, porcentajes, y procedimientos pueden ser sobre cualquier base adecuada, tal como una base en masa, una base en volumen, una base molar, y/o semejantes. Si no está especificada una base, una base en masa y otra base apropiada debe ser utilizada.
El término "substancialmente" , como se utiliza aquí, se refiere a que es ampliamente aquel que está especificado y/o identificado.
El término "semejante", como se utiliza aquí, se refiere a que tiene características en común, tales como unas que no sean dramáticamente diferentes.
Será evidente para aquellos expertos en el arte que se pueden hacer varias modificaciones y variaciones en la estructuras y métodos descritos sin apartarse del alcance o espíritu de la invención. Particularmente, las descripciones de cualquiera de las modalidades pueden ser combinadas libremente con las descripciones de otras modalidades para conducir a combinaciones y/o variaciones de dos o más elementos y/o limitaciones. Otras modalidades de la invención serán evidentes para aquellos expertos en el arte a partir de la consideración de la descripción y la práctica de la invención descrita aquí . Está propuesto que la descripción y los ejemplos sean considerados solamente ejemplares, con el alcance y espíritu verdadero de la invención que está indicado por las siguientes reivindicaciones .
Los términos "que producen" y la "producción", cuando se utilicen aquí, se refieren a la fabricación, conformación, creación, configuración, el modo para llevarlo a cabo", el modo para la consideración en existencias, la manufacturación, el crecimiento, la sintetización, y/o semejantes. De acuerdo con algunas modalidades, la producción incluye la fermentación, el cultivo de las células, y/o semejantes. La producción puede incluir organismos nuevos o adicionales así como la maduración de los organismos existentes .
El término "crecimiento", como se utiliza aquí, se refiere al incremento en el tamaño, tal como por la asimilación del material en el organismo viviente y/o semej antes .
El término "biológico", como se utiliza aquí, se refiere a sistemas vivos, procesos que utilizan organismos vivos, organismos que están vivos, y/o semejantes. Biológico se puede referir a los organismos de las arqueas, bacterias, y/o eucariotas. Biológico también puede referirse a los compuestos y/o materiales derivados y/o modificados de los organismos biológicos. De acuerdo con algunas modalidades, biológico excluye los materiales antiguos y/o fosilizados, tales como aquellos cuya vida terminó al menos hace 1,000 años .
El término "aceite", como se utilizó aquí, se refiere a substancias y/o materiales de hidrocarburos que son al menos algo hidrofílicos y/o repelentes del agua. El aceite puede incluir un aceite mineral, un aceite sintético, un aceite esencial, y/o semejantes. El aceite mineral se refiere al petróleo y/o las substancias relacionadas derivadas al menos en parte de la tierra y/o el subsuelo, tales como los combustibles fósiles. "Aceite orgánico" se refiere a materiales y/o substancias derivadas al menos en parte de las plantas, animales, otros organismos, y/o semejantes. "Aceite sintético" se refiere a materiales y/o substancias derivadas al menos en parte de las reacciones y/o procesos químicos, tales como los que pueden ser utilizados en el aceite lubricante. El aceite puede ser al menos generalmente soluble en los solventes no polares y otros hidrocarburos, pero al menos generalmente insoluble en el agua y/o en soluciones acuosas. El aceite puede ser al menos aproximadamente 50 por ciento soluble en los solventes no polares, al menos aproximadamente 75 por ciento soluble en los solventes no polares, al menos aproximadamente 90 por ciento soluble en los solventes no polares, completamente solubles en solventes no polares, aproximadamente 50 por ciento soluble en solventes no polares hasta aproximadamente 100 por ciento solubles en solventes no polares y/o semejantes, todos con base en la masa.
El término "aceites biológicos" como se utiliza aquí, se refiere a materiales y/o substancias de hidrocarburos derivados al menos en parte de organismos vivientes, tales como animales, plantas, hongos, algas, microalgas, bacterias, y/o semejantes. De acuerdo con algunas modalidades, los aceites biológicos pueden ser adecuados para su uso como, y/o en la conversión en, biocombustibles y/o materiales renovables . Estos materiales renovables pueden ser utilizados en la manufactura de una composición de alimentos, de suplemento de la dieta, cosmética, o farmacéutica para un ser humano o un animal no humano.
El término "lípido", cuando se utilice aquí, se refiere a aceites, mantecas, ceras, grasas, colesterol, glicéridos, esteroides, fosfátidos, cerebrosidas , aceites grasos, compuestos relacionados con los ácidos grasos, compuestos derivados, otras substancias aceitosas, y/o semejantes. Los lípidos se pueden hacer en células vivientes y pueden tener un contenido de carbono relativamente elevado y un contenido de hidrógeno relativamente elevado con un contenido de oxígeno relativamente inferior. Los lípidos incluyen típicamente un contenido de energía relativamente elevado tal como en una base en masa.
El término "materiales renovables", como se utiliza aquí, se refiere a substancias y/o artículos que han sido derivados al menos parcialmente de una fuente y/o un proceso capaz de ser reemplazado por ciclos y/o recursos ecológicos naturales. Los materiales renovables pueden incluir substancias químicas, substancias químicas intermedias, solventes, monómeros, oligómeros, polímeros, biocombustibles, compuestos intermedios de biocombustibles, biogasolina, materias primas combinadas de biogasolina, biodiesel, diesel ecológico, diesel renovable, materias primas combinadas de biodiesel, biodestilados , aceites biológicos, y/o semejantes. En algunas modalidades, el material renovable puede ser derivado de un organismo viviente, tal como de las plantas, algas, bacterias, hongos, y/o semejantes.
El término "biocombustible" como se utiliza aquí, se refiere a componentes y/o corrientes adecuadas para su uso como un combustible y/o a una fuente de combustión derivada al menos en parte de fuentes renovables. El biocombustible puede ser producido sosteniblemente y/o tiene emisiones de carburos reducidas o ninguna emisión neta a la atmósfera, tal como cuando se compara con los combustibles fósiles. De acuerdo con algunas modalidades, las fuentes renovables pueden excluir los materiales obtenidos de las minas o obtenidos por perforación, tal como desde el subsuelo. En algunas modalidades, las fuentes renovables pueden incluir los organismos unicelulares, organismos multicelulares, plantas, hongos, bacterias, algas, cosechas cultivadas, cosechas no cultivadas, madera, y/o semejantes. Los biocombustibles puede ser adecuados para su uso como combustibles de transporte, tal como para el uso en vehículos terrestres, vehículos marinos, vehículos de aviación, y/o semejantes. Los biocombustibles pueden ser adecuados para su uso en la generación de energía, tal como la energía de intercambio de un vapor en elevación con un medio de transferencia de calor adecuado, la generación de un gas sintético, la generación de hidrógeno, la fabricación de electricidad, y/o semejantes.
El término "biodiesel", como se utiliza aquí, se refiere a componentes o corrientes adecuadas para uso y/o combinación directa en un charco de diesel y/o un suministro de cetano derivado de fuentes renovables. Las moléculas de biodiesel adecuadas pueden incluir los ásteres de ácidos grasos, monoglicéridos , diglicéridos , lípidos, alcoholes grasos, alcanos, naftas, materiales del intervalo del destilado, materiales parafínicos, materiales aromáticos, compuestos alifáticos (rectos, ramificados, y/o cíclicos), y/o semejantes. El biodiesel puede ser utilizado en motores de encendido por compresión, tales como los motores de combustión interna de diesel automotriz, los motores de diesel para trabajo pesado de los camiones, y/o semejantes. En la alternativa, el biodiesel también puede ser utilizado en turbinas de gas, calentadores, hervidores, y/o semejantes. De acuerdo con algunas modalidades, el biodiesel y/o las mezclas de biodiesel satisfacen o cumplen con los estándares de combustible aceptados industrialmente , tales como B20, B40, B60, B80, B99.9, B100, y/o semejantes.
El término "biodestilado" cuando se utiliza aquí, se refiere a componentes o corrientes adecuadas para el uso directo y/o el mezclado en los combustibles de aviación (para propulsión a chorro) , materias primas base para los lubricantes, combustibles de queroseno, aceites combustibles, y/o semejantes. El biodestilado puede ser derivado de las fuentes renovables, y tienen cualquier intervalo del punto de ebullición adecuado, tal como un intervalo de punto de ebullición de aproximadamente 100 grados Celsius hasta aproximadamente 700 grados Celsius, aproximadamente 150 grados Celsius hasta aproximadamente 350 grados Celsius, y/o semejantes. En ciertas modalidades, el biodestilado es producido a partir de materiales de animales o de plantas recientemente vivos por una variedad de tecnologías de procesamiento. De acuerdo con una modalidad, los biodestilados pueden ser utilizados para un combustible o para producir energía en un motor de incendido por compresión de carga homogénea (HCCI, por sus siglas en inglés) . Los motores de HCCI pueden incluir una forma de combustión interna con un combustible que se mezcla bien y un oxidante (típicamente el aire) comprimido hasta el punto del auto-encendido .
El término "consumo", como se utiliza aquí, se refiere al uso, la utilización, la alimentación, el consumo, la transformación, y/o semejantes. De acuerdo con algunas modalidades, el consumo puede incluir los procesos durante y/o una parte del metabolismo celular (catabolismo y/o anabolismo) , la respiración celular (anaeróbica y/o anaeróbica) , la reproducción celular, el crecimiento celular, la fermentación, el cultivo celular, y/o semejantes.
El término "materia prima", como se utiliza aquí, se refiere a materiales y/o substancias utilizadas para el suministro, la alimentación, la provisión a, y/o semejantes, tales como a un organismo, una máquina, un proceso, una planta de producción, y/o semejantes. Las materias primas pueden incluir los materiales de entrada utilizados para la conversión, la síntesis, y/o semejantes. De acuerdo con algunas modalidades, las materias primas pueden incluir cualquier material, compuesto, substancia, y/o semejantes, adecuado para el consumo por un organismo, tales como los azúcares, hexosas, pentosas, monosacáridos , disacáridos, trisacáridos , polioles (alcoholes de azúcar) , ácidos orgánicos, almidones, carbohidratos, y/o semejantes. De acuerdo con algunas modalidades, la materia prima puede incluir la sucrosa, glucosa, fructosa, xilosa, glicerol, mañosa, arabinosa, lactosa, galactosa, maltosa, otros azúcares de cinco carbonos, otros azúcares de seis carbonos, otros azúcares de doce carbonos, extractos de plantas que contienen azúcares, otros azúcares sin refinar, y/o semejantes. Las materias primas pueden referirse a uno o más de los compuestos orgánicos listados anteriormente cuando están presentes en las materias primas.
De acuerdo con algunas modalidades, las materias primas pueden ser alimentadas en la fermentación utilizando una o más alimentaciones. En algunas modalidades, las materias primas pueden estar presentes en un medio cargado a un recipiente previo a la inoculación. En algunas modalidades, las materias primas pueden ser agregadas por medio de una o más corrientes de alimentación además del medio cargado al recipiente.
De acuerdo con algunas modalidades, las materias primas puede incluir un material derivado lignocelulósico, tal como un material derivado al menos en parte de la biomasa y/o de las fuentes lignocelulósicas .
De acuerdo con algunas modalidades, el método y/o el proceso pueden incluir la adición de otros materiales y/o substancias para auxiliar y/o ayudar al organismo, tales como los nutrientes, vitaminas, minerales, metales, agua, y/o semejantes. El uso de otros aditivos también está dentro del alcance de esta descripción, tales como un antiespumante, floculantes, emulsionadores, desemulsionantes, aumentadores de la viscosidad, reductores de la viscosidad, agentes tensioactivos , sales, otros materiales modificadores de los fluidos, y/o semejantes.
El término "orgánico", como se utiliza aquí, se refiere a compuestos que contienen carbón, tales como los carbohidratos, azúcares, cetonas, aldehidos, alcoholes, lignina, celulosa, hemicelulosa, pectina, otras substancias que contienen carbón, y/o semejantes.
El término "biomasa" , cuando se utilice aquí, se refiere a materiales de animales y/o plantas y/o a substancias derivadas al menos en parte de organismos vivientes y/o a organismos recientemente vivos, tales como de las plantas y/o de las fuentes lignocelulósicas . Los ejemplos no limitativos de los materiales que comprenden la biomasa incluyen las proteínas, los lípidos, y los polisacáridos .
El término "cultivo de la célula" , cuando se utilice aquí, se refiere al metabolismo de los carbohidratos por lo cual un donador de electrones final es el oxígeno, tal como aeróbicamente . Los procesos de cultivo de las células pueden utilizar cualquiera de los organismos adecuados, tales como las bacterias, hongos (incluyendo la levadura) , las algas, y/o semejantes. Los procesos de cultivo de las células adecuados pueden incluir los organismos que están presentes naturalmente y/o los organismos modificados genéticamente.
El término "fermentación", cuando se utilice aquí, se refiere tanto al cultivo de las células como al metabolismo de los carbohidratos en donde un donador de electrones final no es el oxígeno, tal como anaeróbicamente . La fermentación puede incluir una ruptura anaeróbica controlada por enzimas de un componente rico en energía, tal como un carbohidrato a dióxido de carbono y un alcohol, un ácido orgánico, un lípido, y/o semejantes. En una alternativa, la fermentación se refiere a una transformación controlada biológicamente de un compuesto orgánico o inorgánico. Los procesos de fermentación pueden utilizar cualesquiera organismos adecuados, tales como las bacterias, hongos (incluyendo la levadura), las algas, y/o semejantes. Los procesos de fermentación adecuados pueden incluir los organismos que están presentes naturalmente y/o los organismos modificados genéticamente.
Los procesos biológicos pueden incluir cualquier sistema viviente adecuado y/o artículo derivado de un proceso y/o un sistema viviente. Los procesos biológicos pueden incluir la fermentación, el cultivo celular, la respiración aeróbica, la respiración anaeróbica, las reacciones catabólicas, las reacciones anabólicas, la biotransformación, la sacarificación, la licuefacción, la hidrólisis, la despolimerización, la polimerización, y/o semejantes.
El término "organismo", como se utiliza aquí, se refiere al menos a una estructura relativamente compleja de elementos independientes y subordinados cuyas relaciones y/o proporciones pueden ser determinadas ampliamente por su función en el todo. El organismo puede incluir un individuo diseñado para llevar a cabo las actividades de la vida con órganos separados en su función pero mutuamente dependientes. Los organismos pueden incluir un ser viviente, tal como uno capaz de crecimiento, reproducción, y/o semejantes.
Los organismos pueden incluir cualquier ser de una sola (mono) célula, un ser de (multi) células complejas, y/o semejantes. Los organismos pueden incluir las algas, hongos (incluyendo las levaduras, las bacterias, y/o semejantes. El organismo puede incluir los microorganismos, tales como las bacterias o protozoarios . El organismo puede incluir uno o más organismos que están presentes naturalmente, uno o más organismos modificados genéticamente, combinaciones de los organismos que están presentes de manera natural y organismos modificados genéticamente, y/o semejantes. Las modalidades con las combinaciones de organismos múltiples diferentes están dentro del alcance de la descripción. Cualquier organismo o combinación adecuada puede ser utilizada, tales como uno o más organismos, al menos aproximadamente dos organismos, al menos aproximadamente cinco organismos, aproximadamente dos organismos hasta aproximadamente veinte organismos, y/o semejantes.
En una modalidad, el organismo puede ser un miembro de una sola célula del reino fungoso, tal como una levadura, por ejemplo. Los ejemplos de la levadura oleaginosa que pueden ser utilizados incluyen, pero no están limitados a las siguientes levaduras oleaginosas: Candida apícola, Candida sp. , Cryptococcus curvatus, Cryptococcus terricolus, Debaromyces hansenii , Endomycopsis vemalis, Geotrichum carabidaru , Geotrichum cucujoidaru , Geotrichum histendarum, Geotrichum silvícola, Geotrichum vulgare, Hyphopichia burtonii , Lipomyces lipofer, Lypomyces orentalis, Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporous, Pichia mexicana, Rodosporidium sphaerocarpum, Rhodosporidium toruloides Rhodotorula aurantiaca, Rhodotorula dairenensis, Rhodotorula diffluens, Rhodotorula glutinus, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis, Rhodotorula minuta, Rhodotorula ucilaginosa, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula terpenoidalis, Rhodotorula toruloides, Sporobolomyces alborubescens, Starmerella bombicola, Torulaspora delbruekii, Torulaspora pretoriensis, Trichosporon behrend, Trichosporon brassicae, Trichosporon domesticum, Trichosporon laibachii , Trichosporon loubieri , Trichosporon loubieri , Trichosporon montevideense, Trichosporon pullulans, Trichosporon sp., Wickerhamomyces canadensis, Yarrowia lipolytica, y Zygoascus meyerae.
El organismo puede operar, funcionar, y/o vivir bajo cualesquiera condiciones adecuadas, tales como anaeróbicamente , aeróbicamente, fotosintéticamente, heterotróficamente , y/o semejantes.
El término "oleginoso" cuando se utilice aquí, se refiere a substancias que llevan aceite, que contienen aceite y/o que producen aceites, lípidos, grasas, y/u otras substancias semejantes a aceites. El aceite, lípido, grasa, y/u otras substancias semejantes a aceites pueden ser producidos dentro o fuera de la célula. Oleaginoso puede incluir organismos que producen al menos aproximadamente 20 por ciento en peso de aceites, al menos aproximadamente 30 por ciento en peso de aceites, al menos aproximadamente 40 por ciento en peso de aceites, al menos aproximadamente 50 por ciento en peso de aceites, al menos aproximadamente 60 por ciento en peso de aceites, al menos aproximadamente 70 por ciento en peso de aceites, al menos aproximadamente 80 por ciento en peso de aceites, y/o semejantes. Oleaginoso puede referirse a un microorganismo durante el cultivo, la acumulación de lípidos, a las condiciones de la recolección, y/o semejantes.
El término "ingeniería genética", como se utiliza aquí, se refiere a la manipulación y/o modificación intencional de al menos una porción de un código genético y/o expresión de un código genético de un organismos.
El término "modificación genética", como se utiliza aquí, se refiere a cualquier método de introducción de un cambio genético a un organismo. Los ejemplos no limitativos incluyen la mutagénesis, adición y/o remoción genómica de uno o más genes, porciones de proteínas, regiones promotoras, regiones no codificantes, cromosomas, y/o semejantes. La modificación genética puede ser aleatoria o no aleatoria. La modificación genética puede comprender, por ejemplo, las mutaciones, y pueden ser inserciones, deleciones, mutaciones puntuales, substituciones, y cualquier otra mutación. La modificación genética también puede ser utilizada para referirse a una diferencia genética de un organismo del tipo no silvestre y un organismo del tipo silvestre.
Los términos "organismo no modificado" o "microorganismo no modificado" como se utilizan aquí, se refieren a los organismos, cultivos, células individuales, biota, y/o semejantes, al menos generalmente sin acciones de intervención por las fuerzas exteriores, tales como de la clase humana, de las máquinas, y/o semejantes. Cuando se utilice aquí, un microorganismo no modificado es típicamente el microorganismo particular como existe el mismo previo a la introducción de una modificación genética de acuerdo con la solicitud. En la mayoría de las modalidades, un microorganismo no modificado es la cepa del tipo silvestre del microorganismo. Sin embargo, el microorganismo no modificado como se definió aquí puede ser un organismo que fue alterado genéticamente previo a la introducción de la modificación genética de acuerdo con esta descripción. Por ejemplo, una cepa de levadura disponible del ATCC que comprende una mutación desactivada de un cierto gen podría ser considerada un microorganismo no modificado de acuerdo con esta definición. El término microorganismo no modificado también abarca los organismos que no tienen una modificación genética asociada con la producción de polisacáridos o la viscosidad del caldo de fermentación.
En algunas modalidades, la producción de un organismo incluye en donde el organismo incluye ácidos grasos y/o conducen a un organismo que contiene ácidos grasos, tales como dentro o en una o más vesículas y/o cavidades . En la alternativa, el ácido graso puede estar relativamente no contenido dentro de la célula y/o fuera de la célula, tal como relativamente libre de las membranas de restricción. La producción del organismo puede incluir la reproducción celular (más células) así como el crecimiento celular (el incremento de un tamaño y/o los contenidos de la célula, tal como por el incremento de un contenido de ácido graso) . La reproducción y el crecimiento pueden ocurrir al menos substancialmente de manera simultánea entre sí, al menos substancialmente de manera exclusiva entre sí, al menos parcialmente de manera simultánea y al menos parcialmente de manera exclusiva, y/o semejantes.
Los polisacáridos (también llamados "glicanos") son carbohidratos compuestos de monosacáridos unidos conjuntamente por enlaces glucosídicos . Los polisacáridos son moléculas definidas ampliamente, y la definición incluye los polisacáridos intracelulares , los polisacáridos secretados, los polisacáridos exocelulares, los polisacáridos de la pared celular, y semejantes. La celulosa es un ejemplo de un polisacárido que compone ciertas paredes de las células de las plantas. La celulosa puede ser despolimerizada por las enzimas para producir los monosacáridos tales como la xilosa y la glucosa, así como los disacáridos y oligosacáridos más grandes. La cantidad de cada componente de los monosacáridos después de la despolimerización de los polisacáridos está definida aquí como un perfil del monosacárido . Ciertos polisacáridos comprenden substituyentes diferentes de los carbohidratos, tales como el acetato, piruvato, succinato, y fosfato .
El término "ácidos grasos", cuando se utilice aquí, se refiere a ácidos monocarboxílieos saturados y/o insaturados, tal como en la forma de glicéridos en las grasas o aceites grasos. Los glicéridos pueden incluir los acilglicéridos , monoglicéridos , diglicéridos , triglicéridos, y/o semejantes. El ácido graso también se refiere a los ácidos carboxílicos que tienen grupos de hidrocarburos rectos o ramificados que tienen desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 átomos de carbono. Los grupos de hidrocarburos que incluyen desde 1 hasta aproximadamente 4 sitios de insaturación, generalmente dobles enlace o enlaces pi . Los ejemplos de tales ácidos grasos son el ácido laurico, cido estérico, ácido palmítico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido araquidónico, ácido elaidico, ácido linoelaidico, ácido eicosenoico, ácido fitánico, ácido behénico, y ácido adrénico.
Los dobles enlaces se refieren a dos pares de electrones compartidos por dos átomos en una molécula.
El término "unidad", cuando se utilice aquí, se refiere a una sola cantidad considerada como un todo, una pieza y/o complejo de aparatos que sirven para efectuar una o más funciones y/o resultados particulares, y/o semejantes.
El término "corriente", como se utiliza aquí, se refiere a un flujo y/o suministro de una substancia y/o un material, tal como una sucesión gradual. El flujo de las corrientes puede ser continuo, discreto, intermitente, por lotes, por semi-lotes, semi-continuo, y/o semejantes.
El término "recipiente", como se utiliza aquí, se refiere a un receptáculo y/o elemento de contención de una substancia, tal como un líquido, un gas, un caldo de fermentación, y/o semejante. Los recipientes pueden incluir cualquier tamaño y/o forma adecuados, tal como al menos aproximadamente 1 litro, al menos aproximadamente 1,000 litros, al menos aproximadamente 100,000 litros, al menos aproximadamente 1,000,000 litros, al menos aproximadamente 1,000,000,000 litros, menos de aproximadamente 1,000,000 litros, aproximadamente 1 litro hasta aproximadamente 1,000,000,000 litros, y/o semejantes. Los recipientes pueden incluir tanques, reactores, columnas, cubas, barriles, vasijas, y/o semejantes. Los recipientes pueden incluir cualquier equipo auxiliar adecuado, tales como bombas, agitadores, equipo de aireación, intercambiadores de calor, serpentines, camisas, sistemas de presurización (de presión positiva y/o al vacío), sistemas de control, y/o semejantes.
El término "colocar", cuando se utilice aquí, se refiere a colocar en su lugar, colocar en un sitio, ajustar para que esté listo, y/o semejantes. El organismo puede ser incorporado libremente en un caldo de fermentación (suspendido) , y/o fijado sobre un medio y/o superficie adecuado dentro de al menos una porción del recipiente. El organismo puede ser generalmente más denso que el caldo (receptor) , generalmente más claro que el caldo (material flotante) , generalmente flotando neutralmente con respecto al caldo, y/o semejantes.
El término "adaptado", cuando se utilice aquí, se refiere a hacerlo para que se ajuste para un uso, propósito, y/o semejantes, específicos.
El término "satisfacer", cuando se utilice aquí, se refiere a alcanzar, obtener, satisfacer, igualar, y/o semejantes .
El término "que excede", cuando se utilice aquí, se refiere a que se extiende más allá, que sobrepasa, y/o semejantes. De acuerdo con algunas modalidades, el exceso incluye al menos 2 por ciento arriba de la cantidad y/o valor de umbral .
La densidad celular (del organismo) medida en gramos de peso seco por litro (del medio o caldo de fermentación) , mide y/o indica la productividad del organismo, la utilización del medio de fermentación (caldo) , y/o la utilización del volumen del recipiente de fermentación. La densidad celular incrementada puede conducir a una producción incrementada de un producto particular y a la utilización incrementada del equipo (costos de capital inferiores). En general, la densidad celular incrementada es benéfica, pero una densidad celular demasiado elevada puede conducir a costos de bombeo y mezclado más elevados (viscosidad incrementada) y/o las dificultades en la remoción del calor (coeficiente de transferencia de calor inferior) , y/o semejantes.
El término "viscosidad", cuando se utilice aquí, se refiere a la propiedad física de los fluidos que determina la resistencia interna a las fuerzas de cizallamiento . La viscosidad puede ser medida por varios métodos, incluyendo por ejemplo un viscosímetro, con las unidades típicas de centipoises (cP) . La viscosidad también puede ser medida utilizando otros dispositivos conocidos, tales como un reómetro .
El término "transferencia de masa" , cuando se utilice aquí, se refiere al movimiento neto de la masa desde una localización hasta otra. Frecuentemente, las especies químicas se transfieren entre dos fases a través de una interfaz o difusión a través de una fase. La fuerza impulsora para la transferencia de la masa es una diferencia en la concentración; el movimiento aleatorio de las moléculas provoca una transferencia neta desde un área de concentración elevada hasta un área de concentración baja. Para los procesos de separación, las características termodinámicas determinan la extensión de la separación, aunque la transferencia de la masa determina la velocidad a la cual ocurrirá la separación. Una transferencia de masa importante es aquella del oxígeno y otros nutrientes en el caldo de fermentación .
La cantidad de la velocidad de transferencia de la masa puede ser cuantificada a través del cálculo y la aplicación de los coeficientes de transferencia de la masa, (m/s) , la cual es una velocidad de difusión constante que relaciona la velocidad de transferencia de la masa, el área de transferencia de la masa, y el gradiente de concentración como la fuerza impulsora. Esta puede ser utilizada para cuantificar la transferencia de la masa entre las fases, las mezclas de los fluidos inmiscibles y parcialmente miscibles (o entre un fluido y un sólido poroso) . La cuantificación de la transferencia de la masa permite el diseño y la fabricación del equipo de proceso de la fermentación que puede satisfacer los requerimientos especificados, estimando lo que sucederá en las situaciones de vida reales.
El término "densidad", cuando se utilice aquí, se refiere a una masa por unidad de volumen de un material y/o una substancia. La densidad celular se refiere a una masa de las células por volumen unitario, tal como el peso de las células vivientes por volumen unitario. La misma es expresada comúnmente como gramos de las célula secas por litro. La densidad celular puede ser medida en cualquier punto adecuado en el método, tal como durante el comienzo de la fermentación, durante la fermentación, durante el complemento de la fermentación, sobre el lote completo, y/o semejantes.
El término "FAME", cuando se utilice aquí, se refiere a un éster metílico de ácido graso. El término FAME también puede ser utilizado para describir el ensayo utilizado para determinar la cantidad o porcentaje del éster metílico del ácido graso en un microorganismo.
El término "equivalente del ácido graso libre", cuando se utilice aquí, significa el FAME determinado utilizando el método de prueba Celb - 89 de la American Oil Chemists Society, y multiplicado por un factor de 0.953.
El término "rendimiento", cuando se utilice aquí, se refiere a una cantidad y/o un valor producido y/o regresado cuando se compara con una cantidad consumida. Como ejemplos no limitativos, la cantidad consumida pueden ser los azúcares, el carbón, el oxígeno, o cualquier otro nutriente. El "rendimiento" también se puede referir a una cantidad y/o un valor producido y/o regresado cuando se compara con un período de tiempo transcurrido.
Los términos "rendimiento de la ermentación", "rendimiento del ácido graso", o "rendimiento del azúcar", cuando se utilicen aquí, significan el equivalente del ácido graso libre estimado total producido (en peso) dividido entre el azúcar total consumido durante el proceso de fermentación (en peso) .
El rendimiento del ácido graso puede ser medido en cualquier punto adecuado en el método, tal como durante el comienzo de la fermentación, durante la fermentación, durante el complemento de la fermentación, sobre el lote completo, y/o semejantes.
En general, un contenido de ácido graso más elevado es deseado y puede proveer una extracción y/o remoción más facilitada de los ácidos grasos desde un material restante y/o residuo del material celular, así como la utilización y/o productividad incrementada para la materia prima y/o el equipo .
En general, una productividad del ácido graso más elevada conduce a un proceso más económico puesto que es deseable una fabricación del producto más rápidamente (es decir, tiempos reducidos del ciclo) .
Un rendimiento más elevado del ácido graso es preferido generalmente porque el mismo indica la conversión del carbón desde el azúcar hacia el ácido graso y nada de subproductos y/o masa de las células.
El rendimiento del ácido graso sobre el oxígeno expresado como gramos de los ácidos grasos producidos por gramo de la base consumida por el oxígeno, mide y/o indica una cantidad y/o velocidad de oxígeno utilizada para producir los ácidos grasos. Una demanda del oxígeno más elevada puede incrementar los gastos del capital y/o los gastos operativos.
El término "contenido", cuando se utilice aquí, se refiere a una cantidad del material especificado contenido. La base de la masa seca se refiere a que está al menos substancialmente libre del agua. El contenido del ácido graso puede ser medido en cualquier punto adecuado en el método, tal como durante el comienzo de la fermentación, durante la fermentación, durante el complemento de la fermentación, sobre el lote completo, y/o semejantes.
El término "productividad", cuando se utilice aquí, se refiere a la calidad y/o el estado de producción y/o fabricación, tal como una velocidad por unidad de volumen. La productividad del ácido graso puede ser medida en cualquier punto adecuado en el método, tal como durante el comienzo de la fermentación, durante la fermentación, durante el complemento de la fermentación, sobre el lote completo, y/o semejantes. La productividad puede ser medida durante un período de tiempo fijo, tal como mediodía a mediodía diariamente. En una alternativa, la productividad puede ser medida sobre una base recurrente adecuada, tal como durante cualquier período de 24 horas. Otras bases para medir la productividad están dentro del alcance de la descripción. 2. Microorganismos En un aspecto, se describe un microorganismo oleaginoso adecuado para la producción de materiales renovables .
Algunos microorganismos producen cantidades significativas de metabolitos diferentes de los lípidos, tales como por ejemplo, polisacáridos . La biosíntesis de los polisacáridos ya se sabe que utiliza una proporción significativa de la energía metabólica total disponible para las células. Como se describe aquí, la mutagénesis de las células productoras de lípidos seguido por la selección para una producción de polisacáridos reducida o eliminada, genera cepas novedosas que son capaces de producir rendimientos más elevados de los lípidos. Estas mejoras significativas e inesperadas pueden resultar de una característica de transferencia de la masa mejorada del cultivo, un flujo más elevado de carbono a ácidos grasos, o ambos de estos mecanismos. Para algunos microorganismos, el incremento del rendimiento de los lípidos puede ser por medio de un mecanismo que todavía no está caracterizado.
En ciertas modalidades, los microorganismos descritos comprenden una modificación. En algunas modalidades, la modificación es una modificación genética no presente en un microorganismo no modificado.
La modificación genética puede ser introducida por muchos métodos. En ciertas modalidades, la modificación genética es introducida por ingeniería genética. En otras modalidades, la modificación genética es introducida por mutagénesis aleatoria.
En las modalidades particulares, la modificación afecta la síntesis de polisacáridos . En otras modalidades, la modificación afecta uno o más genes que codifican una proteína que contribuye a la síntesis de polisacáridos. En otras modalidades, la modificación afecta uno o más genes reguladores que codifican las proteínas que controlan la síntesis de polisacáridos. En todavía otras modalidades, la modificación afecta una o más de las regiones reguladoras no codificantes. En otras modalidades, uno o más genes son regulados ascendentemente o regulados descendentemente de tal modo que la producción de polisacáridos sea reducida.
En todavía otras modalidades, la modificación afecta el transporte y/o la secreción del polisacárido . En algunas modalidades, la modificación afecta uno o más genes que codifican una proteína que contribuye al transporte y/o la secreción del polisacárido. En otras modalidades, la modificación afecta uno o más genes reguladores que codifican las proteínas que controlan el transporte y/o la secreción del polisacárido. En todavía otras modalidades, la modificación afecta una o más regiones reguladoras no codificantes. En otras modalidades, uno o más genes son regulados ascendentemente o regulados descendentemente de tal modo que el transporte y/o la secreción del polisacárido sea reducido .
En otras modalidades, la modificación genética afecta uno o más genes que controlan la síntesis de los ácidos grasos. Estos genes incluyen puntos de ramificación en la ruta metabólica de los ácidos grasos. En otras modalidades, el gen es regulado ascendentemente o regulado descendentemente de tal modo que la producción de los lípidos sea incrementada. Los ejemplos de las enzimas adecuadas para la regulación ascendente de acuerdo con los métodos descritos incluyen la piruvato deshidrogenasa, la cual desempeña un papel en la conversión del piruvato a la acetil-CoA. La regulación ascendente de la piruvato deshidrogenasa puede incrementar la producción de la acetil-CoA, y por esto incrementa la síntesis de los ácidos grasos. La acetil-CoA carboxilasa cataliza la etapa inicial en la síntesis de los ácidos grasos. En consecuencia, esta enzima puede ser regulada ascendentemente para incrementar la producción de los ácidos grasos. La producción de los ácidos grasos también puede ser incrementada por la regulación ascendente de la proteína portadora de acilo (ACP) , la cual lleva las cadenas de acilo crecientes durante la síntesis de los ácidos grasos. La glicerol-3-fosfato aciltransferasa cataliza la etapa limitante de la velocidad de la síntesis de los ácidos grasos. La regulación ascendente de esta enzima puede incrementar la producción de ácidos grasos.
Los ejemplos de las enzimas potencialmente adecuadas para la regulación descendente de acuerdo con los métodos descritos incluyen la citrato sintasa, la cual consume la acetil-CoA como parte del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) . La regulación descendente de la citrato sintasa puede forzar más acetil-CoA hacia la ruta sintética de los ácidos grasos.
Cualesquiera especies de organismos que produzcan lípidos o hidrocarburos adecuados pueden ser utilizadas, aunque los microorganismos que producen naturalmente niveles elevados de los lípidos o hidrocarburos adecuados, son preferidos. La producción de hidrocarburos por los microorganismos es revisada por Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496 y A Look Back at the U.S. Department of Energy' s Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190 , John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann y Paul Roessler (1998) .
En algunas modalidades, un microorganismo que produce un lípido o un microorganismo del cual un lípido puede ser extraído, recuperado, u obtenido, es un hongo. Los ejemplos de los hongos que pueden ser utilizados incluyen, pero no están limitados a los siguientes géneros y especies de hongos: Mortierella, Mortierria vinacea, Mortierella alpine, Pythium debaryanum, Mucor circinelloides, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus , Pennicillium iilacinum, Hensenulo, Chaetomium, Cladosporium, Malbranchea, Rhizopus, y Pythium.
En cierta modalidad, el microorganismo modificado oleaginoso descrito es una levadura. Los ejemplos de la mutación del gen en la levadura oleaginosa pueden ser encontrados en la literatura (véase Bordes et al, J. Microbiol Methods, 27 junio (2007)). En ciertas modalidades, la levadura pertenece al género Rhodotorula, Pseudozyma, o Sporidiobolus. Los ejemplos de la levadura oleaginosa que pueden ser utilizados incluyen, pero no están limitados a las siguientes levaduras oleaginosas: Candida apícola, Candida sp., Cryptococcus curvatus, Cryptococcus terricolus, Debaromyces hansenii , Endomycopsis vemalis, Geotrichum carabidarum, Geotrichum cucujoidarum, Geotrichum histendarum, Geotrichum silvícola, Geotrichum vulgare, Hyphopichia burtonii, Lipomyces lipofer, Lypomyces orentalis, Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporous, Pichia mexicana, Rodosporidium sphaerocarpum, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula aurantiaca, Rhodotorula dairenensis, Rhodotorula diffluens, Rhodotorula glutinus, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis, Rhodotorula minuta, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula terpenoidalis, Rhodotorula toruloides, Sporobolomyces alborubescens, Starmerella bombicola, Torulaspora delbruekii , Torulaspora pretoriensis, Trichosporon behrend, Trichosporon brassicae, Trichosporon domesticum, Trichosporon laibachii, Trichosporon loubieri , Trichosporon loubieri, Trichosporon montevideense, Trichosporon pullulans, Trichosporon sp., Wickerhamomyces canadensis, Yarrowia lipolytica, y Zyqoascus meyerae .
En otras modalidades, la levadura pertenece al género Sporidiobolus pararoseus . En una modalidad específica, el microorganismo descrito es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12508 (Cepa MK29404 (Secol-13J) ) . En otra modalidad específica, el microorganismo es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12509 (Cepa MK29404 (Secol-182J) ) . En otra modalidad específica, el microorganismo es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12510 (Cepa K29404 (Secol-173N) ) . En otra modalidad específica, el microorganismo es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12511 (Cepa MK29404 (Seco55) ) . En otra modalidad específica, el microorganismo es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12512 (Cepa MK29404 (Seco41)). En otra modalidad específica, el microorganismo es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12513 (Cepa MK29404 (Secol) ) . En otra modalidad específica, el microorganismo es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12515 (Cepa MK29404 (Secol-147D) ) . En otra modalidad específica, el microorganismo es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12516 (Cepa MK29404 (Secol-72D) ) .
En otras modalidades, la levadura pertenece al género Rhodotorula ingeniosa . En una modalidad específica, el microorganismo descrito es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12506 (Cepa MK29794 (KSecol6-1) ) . En otra modalidad específica, el microorganismo es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12507 (Cepa MK29794 (KSeco7) ) . En otra modalidad específica, el microorganismo es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12514 (Cepa MK29794 ( 200 Secol) ) . En otra modalidad específica, el microorganismo es el microorganismo que corresponde al No. de Depósito del ATCC PTA-12517 (Cepa MK29794 (33 Secol)).
En ciertas modalidades, la levadura modificada comprende una morfología seca, mientras que la levadura no modificada no comprende una morfología seca. En otras modalidades, la levadura no modificada comprende la morfología de la cepa de levadura del tipo silvestre. 3. Condiciones de Cultivo De acuerdo con ciertas modalidades, el microorganismo oleaginoso se hace crecer en el cultivo, tal como por ejemplo durante la manufactura en algunas modalidades, el cultivo del microorganismo modificado comprende condiciones substancialmente semejantes a aquellas del cultivo del microorganismo no modificado.
Los microorganismos pueden ser cultivados tanto para los propósitos de llevar a cabo manipulaciones genéticas como para la producción subsiguiente de hidrocarburos (por ejemplo, los lípidos, los ácidos grasos, los aldehidos, los alcoholes, y los alcanos) . El primer tipo del cultivo es llevado a cabo a una escala pequeña e inicialmente , al menos, bajo condiciones en las cuales se puede hacer crecer al microorganismo de partida. Por ejemplo, si el microorganismo de partida es un fotoautótrofo, el cultivo inicial es llevado a cabo en la presencia de la luz. Las condiciones del cultivo pueden ser cambiadas si el microorganismo es desarrollado o diseñado para crecer independientemente de la luz. El cultivo para los propósitos de la producción de hidrocarburos se lleva a cabo usualmente a una escala grande. En ciertas modalidades, durante las condiciones del cultivo está presente una fuente de carbón fijo. El cultivo también puede ser expuesto a la luz en varios tiempos durante el cultivo, incluyendo por ejemplo ninguno, algunos, o la totalidad del tiempo.
Para organismos capaces de crecer sobre una fuente de carbón fijo, la fuente de carbón fijo puede ser, por ejemplo, la glucosa, fructosa, sucrosa, galactosa, xilosa, mañosa, rhamnosa, N-acetilglucosamina, glicerol, floridosida, y/o el ácido glucurónico. Una o más fuente (s) de carbón pueden ser suministradas a una concentración de al menos aproximadamente 50 µ?, al menos aproximadamente 100 µ?, al menos aproximadamente 500 µ?, al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 50 mM, y al menos aproximadamente 500 mM, de una o más de la(s) fuente (s) de carbón fijo provista (s) exógenamente . Algunos microorganismos pueden crecer utilizando una fuente de carbón fijo tal como la glucosa o el acetato en la ausencia de la luz. Tal crecimiento es conocido como un crecimiento heterotrofico .
Otros parámetros del cultivo también pueden ser manipulados. Los ejemplos no limitativos incluyen la manipulación del pH del medio de cultivo, la identidad y la concentración de los elementos de trazas, y otros constituyentes del medio. El medio de cultivo puede ser acuoso tal como uno que contiene una porción substancial de agua .
La modificación de las condiciones de la fermentación es una manera de intentar el aumento del rendimiento del lípido deseado u otro producto biológico. Sin embargo, esta estrategia tiene un valor limitado, para las condiciones que promueven la producción de los lípidos (relaciones elevadas del carbón con respecto al nitrógeno) también promueve la producción de polisacáridos .
Las condiciones del proceso pueden ser ajustadas para reducir el rendimiento de los polisacáridos para reducir el costo de producción. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un microorganismo es cultivado en la presencia de una concentración limitativa de uno o más nutrientes, tal como, por ejemplo, el carbón y/o el nitrógeno, el fósforo, o el azufre, mientras que se provee un exceso de energía del carbón fijo tal como la glucosa. La limitación del nitrógeno tiende a incrementar el rendimiento de los lípidos microbianos en un cultivo en el cual el nitrógeno es provisto en exceso. El microorganismo puede ser cultivado en la presencia de una cantidad limitativa de un nutriente para una porción del período de cultivo total o para el período completo. En las modalidades particulares, la concentración de los nutrientes es reciclada entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el período de cultivo total.
Para incrementar el rendimiento de los lípidos, el ácido acético puede ser empleado en las materias primas para un microorganismo oleaginoso. El ácido acético se alimenta directamente en el punto del metabolismo que inicia la síntesis de ácidos grasos (es decir, el acetil-CoA) ; por consiguiente, la provisión del ácido acético en el cultivo puede incrementar la producción de ácidos grasos. Generalmente, el microorganismo es cultivado en la presencia de una cantidad suficiente del ácido acético para incrementar el rendimiento de los lípidos microbianos, y/o el rendimiento de los ácidos grasos microbianos, específicamente, arriba del rendimiento de los lípidos microbianos (por ejemplo, el ácido graso) en la ausencia del ácido graso.
En otra modalidad, el rendimiento de los lípidos es incrementado por el cultivo por el cultivo de un microorganismo en la presencia de uno o más cofactor (es) para una enzima de la ruta de los lípidos (por ejemplo, una enzima sintética de ácidos grasos) . En general, La concentración del (de los) cofactor (es) es suficiente para incrementar el rendimiento de los lípidos (por ejemplo, los ácidos grasos) sobre el rendimiento de los lípidos microbianos en la ausencia del (de los) cofactor (es) . En una modalidad particular, el (los) cofactor(es) es (son) provisto (s) al cultivo por la inclusión en el cultivo de un microorganismo que contiene un gen exógeno que codifica el (los) cofactor (es) . Alternativamente, el(los) cofactor (es) pueden ser provistos a un cultivo por la inclusión de un microorganismo que contiene un gen exógeno que codifica una proteína que participa en la síntesis del cofactor. En ciertas modalidades, los cofactores adecuados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de la ruta de los lípidos, tal como, por ejemplo: la biotina, pantotenato. En otras modalidades, los cofactores que codifican los genes o que participan en la síntesis de tales cofactores pueden ser introducidos en los microorganismos (por ejemplo, las microalgas, la levadura, y otros) . 4. Polisacáridos En otro aspecto, los microorganismos oleaginosos descritos en la solicitud producen un polisacárido . En algunas modalidades, el microorganismo modificado produce un polisacárido. En otras modalidades, el microorganismo no modificado produce un polisacárido. En todavía otras modalidades, tanto el microorganismo modificado como el microorganismo no modificado producen un polisacárido.
Los polisacáridos, cuando son sintetizados, pueden ser retenidos dentro de la célula (intracelular) , colocados dentro de la pared celular, y/o secretados fuera de la célula (exocelular) . Los microorganismos que tienen niveles bajos del polisacárido exocelular pueden ser identificados con base en la observación visual de la morfología de la colonia sobre placas de agar. Las colonias que producen niveles más elevados del polisacárido exocelular son de apariencia húmeda y muy suave. Si la placa es invertida (volteada de arriba hacia abajo) la colonia goteará sobre el otro lado de la placa. Esta morfología es característica de las células que producen grandes cantidades del polisacárido exocelular. Los mutantes de los polisacáridos exocelulares de nivel bajo pueden ser identificados por una morfología de la colonia que está presente y que no es visiblemente húmeda, expresada aquí como una morfología "seca". Estas colonias bajas en polisacáridos no son suaves sino rígidas y pulvurentas .
En una modalidad, el microorganismo modificado comprende una morfología seca. En algunas modalidades, el microorganismo modificado comprende una morfología seca, mientras que el microorganismo no modificado no comprende una morfología seca. En ciertas modalidades, el microorganismo no modificado comprende la morfología del microorganismo del tipo silvestre.
Un polisacárido exocelular bien caracterizado es el polisacárido de xantano. (Shu y Yang, Biotechnol Bioeng. 5 marzo; 35 (5) : 458-68 (1990)). En la ruta del xantano, la mayoría de los esfuerzos de búsqueda han buscado incrementar la producción del polisacárido de xantano para aplicaciones industriales. Sin embargo, varios problemas con la fermentación son observados cuando se elevan los niveles de los polisacáridos secretados, y la fermentación llega a ser más costosa .
Se describen aquí nuevos microorganismos que producen un polisacárido a niveles reducidos. La producción del polisacárido de los microorganismos descritos puede ser reducida a cualquier nivel, incluyendo el gen, la proteína, el plegado o la modificación de la proteína, la ruta de síntesis, o el nivel celular/extracelular . La invención no está limitada a ningún mecanismo específico de la reducción de polisacáridos.
En ciertas modalidades en donde el microorganismo tanto modificado como no modificado produce un polisacárido exocelular, el microorganismo modificado produce menos polisacárido exocelular que el microorganismo no modificado. En ciertas modalidades, el microorganismo no modificado típicamente comprende la cepa del tipo silvestre del microorganismo. En ciertas modalidades, el microorganismo produce al menos 4 veces menos polisacáridos que el microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo produce al menos 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10, 15, 20, 30, 40 o 50 veces menos polisacárido exocelular que el microorganismo no modificado. En algunas modalidades, la producción del polisacárido es inferior en el microorganismo modificado a causa de una mutación en un gen asociado con los polisacáridos .
Los polisacáridos exocelulares pueden ser encontrados en el caldo de fermentación producido o resultante de los microorganismos descritos. El caldo de fermentación puede incluir, entre otros, una fuente de carbón, nutrientes, cuerpos de organismos, secreciones de organismos, agua, subproductos, productos de desecho, y/o semejantes. Los polisacáridos exocelulares son encontrados típicamente fuera de la célula debido a la exportación celular (por ejemplo, la secreción) o por la alteración de la membrana celular, tal como durante la muerte celular. El polisacárido también es conocido o referido generalmente como un "exopolisacárido" si es encontrado fuera de la célula. El microorganismo modificado, el microorganismo no modificado, o ambos, pueden producir un caldo de fermentación que comprende un polisacárido. También se describe aquí un microorganismo no modificado que produce un polisacárido, pero el microorganismo modificado no produce un polisacárido.
Los polisacáridos exocelulares pueden ser cuantificados utilizando varias características métricas diferentes que pueden ser calculadas por una persona con experiencia ordinaria en el arte. En una modalidad, el polisacárido exocelular es cuantificado como la masa del polisacárido por volumen unitario del caldo de fermentación producido por el microorganismo. La masa del polisacárido por volumen unitario del caldo de fermentación producido por los microorganismos de acuerdo con la descripción puede ser calculada fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en el arte. Otras características métricas no limitativas que pueden ser utilizadas para cuantificar el polisacárido exocelular incluyen: el nivel absoluto (gramos/volumen) del polisacárido soluble total: el nivel absoluto de los azúcares individuales (gramos/volumen) del polisacárido soluble hidrolizado total; las relaciones del polisacárido soluble con respecto a la biomasa total; la relación de la biomasa soluble con respecto a la biomasa magra; la relación del polisacárido soluble con respecto a los lípidos; la relación del polisacárido con respecto a los lípidos extraíbles; la cantidad del polisacárido por célula; el nivel absoluto de la viscosidad; y/o la relación de la viscosidad con respecto al polisacárido soluble utilizando cualquiera de los valores anteriores . La determinación de estas características métricas está muy adentro de la experiencia ordinaria en el arte.
En ciertas modalidades, el microorganismo modificado produce menos de aproximadamente 22.8 gramos de polisacárido exocelular por litro del caldo de fermentación. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce menos de aproximadamente 6 gramos por litro del caldo de fermentación. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce menos de aproximadamente 3 gramos de polisacárido exocelular por litro del caldo de fermentación. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce menos de aproximadamente 1 gramo por litro del caldo de fermentación. En otras modalidades, el microorganismo produce menos de aproximadamente 0.5, 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, o menos del polisacárido exocelular por litro del caldo de fermentación .
En ciertas modalidades en donde los microorganismos tanto modificados como no modificados producen un caldo de fermentación que comprende un polisacárido exocelular, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende menos polisacárido que un volumen igual del caldo de fermentación del microorganismo no modificado. En una modalidad, el microorganismo modificado produce al menos aproximadamente 2 veces menos polisacárido exocelular por litro del caldo de fermentación que el microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce al menos aproximadamente 4 veces menos polisacárido por litro del caldo de fermentación que el organismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, o 1000 veces menos polisacárido exocelular por litro del caldo de fermentación que el microorganismo no modificado. En otras modalidades, el mic oorganismo modificado produce al menos 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 90, o 99 por ciento menos polisacárido exocelular por litro del caldo de fermentación que el microorganismo no modificado .
Los polisacáridos exocelulares también pueden ser cuantificados por el cálculo de la relación del lípido con respecto al polisacárido en el caldo de fermentación producido por los microorganismos descritos. Este cálculo puede ser obtenido fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en el arte.
En ciertas modalidades, los microorganismos modificados de acuerdo con la invención producen un caldo de fermentación que comprende una relación del lípido con respecto al polisacárido exocelular mayor que aproximadamente 2. En otras modalidades, los microorganismos modificados producen un caldo de fermentación que comprende una relación del lípido con respecto al polisacárido exocelular de aproximadamente 10. En todavía otras modalidades, los microorganismos modificados producen un caldo de fermentación que comprende una relación del lípido con respecto al polisacárido exocelular mayor que aproximadamente 10. En las modalidades adicionales, los microorganismos modificados producen un caldo de fermentación que comprende una relación del lípido con respecto al polisacárido exocelular de aproximadamente 50. En las modalidades adicionales, los microorganismos modificados producen un caldo de fermentación que comprende una relación del lípido con respecto al polisacárido exocelular de aproximadamente 70. En las modalidades adicionales, los microorganismos modificados producen un caldo de fermentación que comprende una relación del lípido con respecto al polisacárido exocelular de aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, o 1000 o mayor.
Los polisacáridos exocelulares pueden ser cuantificados por el cálculo de la masa del polisacárido por biomasa total del caldo de fermentación producido por los microorganismos descritos. Este cálculo puede ser obtenido fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en el arte .
En ciertas modalidades, los microorganismos modificados producen un caldo de fermentación que comprende aproximadamente 0.20 gramos del polisacárido exocelular por gramo de la biomasa del caldo total (véase la Tabla 4) . En otras modalidades, los microorganismos modificados producen un caldo de fermentación que comprende al menos aproximadamente 0.04 gramos del polisacárido por gramo de la biomasa del caldo total. En las modalidades adicionales, los microorganismos modificados producen un caldo de fermentación que comprende aproximadamente 0.1, 0.5, 1.0, o 10.0 gramos del polisacárido exocelular por 100 gramos de la biomasa del caldo total .
En ciertas modalidades en donde los microorganismos tanto modificados como no modificados producen un caldo de fermentación que comprende un polisacárido exocelular, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende menos gramos del polisacárido exocelular por gramo de la biomasa del caldo total que el caldo de fermentación del microorganismo no modificado (véase la Tabla 4) . En otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende aproximadamente 2 veces menos gramos del polisacárido exocelular por gramo de la biomasa del caldo total que el caldo de fermentación del microorganismo no modificado. En todavía otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende aproximadamente 5 veces menos gramos del polisacárido exocelular por gramo de la biomasa del caldo total que el caldo de fermentación del microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, o 1000 veces menos polisacárido exocelular por gramo de la biomasa del caldo total que el caldo de fermentación del microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce al menos 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 90, o 99 por ciento menos polisacárido exocelular por gramo de la biomasa del caldo total que el caldo de fermentación del microorganismo no modificado.
Los microorganismos modificados novedosos descritos aquí producen un caldo de fermentación específico. Este caldo de fermentación comprende ciertos componentes biológicos en relaciones específicas. En una cierta modalidad, el caldo de fermentación producido por el microorganismo modificado comprende una relación del lípido con respecto al polisacárido exocelular mayor que aproximadamente 2. En otra modalidad, el caldo de fermentación producido por el microorganismo modificado comprende una relación del lípido co respecto al polisacárido exocelular de aproximadamente 10. En otra modalidad, el caldo de fermentación producido por el microorganismo modificado comprende una relación del lípido con respecto al polisacárido exocelular mayor que aproximadamente 10. En las modalidades adicionales, el caldo de fermentación producido por el microorganismo modificado comprende una relación del lípido con respecto al polisacárido exocelular de aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, o 1000 o más grande.
La estructura del polisacárido comprende generalmente monosacáridos unidos conjuntamente por enlaces glucosídicos . Los microorganismos tanto modificados como no modificados producen un polisacárido en muchas de las modalidades descritas. Como se describió aquí, son microorganismos modificados novedosos que producen un polisacárido a niveles reducidos que los microorganismos no modificados. En estas modalidades en donde el microorganismo tanto modificado como no modificado produce un polisacárido exocelular, el polisacárido puede tener la misma estructura para ambos microorganismos, y el microorganismo modificado puede producir una cantidad menor de la misma estructura del polisacárido que el microorganismo no modificado. Sin embargo, también están contemplados microorganismos modificados que producen una estructura del polisacárido exocelular que el microorganismo no modificado. En estas modalidades, los microorganismos modificados novedosos producen un polisacárido exocelular a niveles reducidos a causa de que la estructura del polisacárido es diferente que el microorganismo no modificado. Por ejemplo, un microorganismo modificado puede producir un polisacárido exocelular con un peso molecular inferior que el microorganismo no modificado, conduciendo a una masa del polisacárido reducida por volumen del caldo de fermentación .
Los microorganismos modificados como son descritos en ciertas modalidades producen un polisacárido exocelular diferente que el microorganismo no modificado. La estructura del polisacárido exocelular producido por el microorganismo modificado es alterada cuando se compara con el organismo no modificado. En muchas de estas modalidades particulares, el polisacárido exocelular producido por el microorganismo modificado tiene un peso molecular diferente que el polisacárido producido por el microorganismo no modificado. En una modalidad, el microorganismo modificado produce un polisacárido exocelular con un peso molecular inferior que el polisacárido exocelular producido por el microorganismo no modificado (véase la Figura 6) .
La estructura del polisacárido puede ser analizada por medio de varios métodos, incluyendo por ejemplo: HPLC, la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) , la cromatografía de intercambio iónico (IEC) , el análisis de sedimentación, la centrifugación por gradientes, y ultra-filtración (véase por ejemplo Prosky L, et al., J. Assoc. Off. Analytical Chem. 71:1017-1023 (1988); Deniaud, et al., Int. J. Biol . Macromol . , 33:9-18 (2003). Estos métodos pueden involucrar el fraccionamiento por tamaño de los extractos de microorganismos. Las técnicas de SEC y los métodos de ultrafiltración son empleados frecuentemente. Los principios básicos de SEC son descritos adicionalmente por ejemplo, en Hoagland, et al., J. Agricultural Food Chem., 41(8):1274- 1281(1993). Las columnas apropiadas para los intervalos particulares del fraccionamiento pueden ser seleccionadas fácilmente y utilizadas de manera efectiva para resolver las fracciones, por ejemplo Sephacryl S 100 HR, Sephacryl S 200 HR, Sephacryl S 300 HR, Sephacryl S 400 HR y Sephacryl S 500 HR o sus equivalentes. De un modo análogo, el medio de Sepharose o sus equivalentes, por ejemplo Sepharose 6B, 4B, 2B, pueden ser utilizados.
La purificación de los polisacáridos o los complejos de polisacáridos con las proteínas puede ser lograda en combinación con otras técnicas de cromatografía, incluyendo la cromatografía de afinidad, IEC, cromatografía por interacción hidrofóbica, u otras.
La ultrafiltración de las muestras podría ser efectuada utilizando las membranas moleculares con los cortes de la masa molecular apropiados . Las membranas y procedimientos específicos utilizados para efectuar el fraccionamiento están disponibles ampliamente para aquellos expertos en el arte.
Los polisacáridos también pueden ser detectados utilizando la electrofóresis en un gel (véase por ejemplo Goubet, et al., Anal Biochem. 321:174-82 (2003); Goubet, et al., Anal Biochem. 300:53-68 (2002). Otros ensayos pueden ser utilizados para detectar los polisacáridos particulares cuando sea necesario, tales como el fenol: el ensayo del ácido sulfúrico para detectar los carbohidratos (véase Cuesta G., et al., J Microbiol Methods . enero del 2003; 52 (1) : 6973) ; y Braz et al, J. Med. Biol. Res. 32(5):545-50 (1999); Panin et al., Clin. Chem. noviembre; 32:2073-6 (1986)).
Las diferentes composiciones de exopolisacáridos, las estructuras y/o las productividades pueden ser un resultado directo o indirecto de la modificación genética del microorganismo modificado. El cambio puede ser debido a cualquier proceso biológico, y no está limitado a cualquier mecanismo o ruta biológica. El cambio puede afectar las características genéticas del microorganismo, o transcripción, traducción, modificación post-traduccional , el plegado de la proteína, el ensamblaje del monosacárido, o cualquier otro proceso biológico involucrado en la síntesis del polisacárido . En algunas modalidades, el mecanismo para la producción del polisacárido puede ser desconocido. En otras modalidades, el mecanismo para producir el polisacárido puede ser desconocido. En otras modalidades, el polisacárido producido por el microorganismo modificado puede ser un polisacárido no caracterizado previamente.
En otro aspecto, los microorganismos modificados como se describieron, producen un polisacárido exocelular que comprende diferentes componentes de monosacáridos que los componentes de los monosacáridos del polisacárido producido por el microorganismo no modificado (compárense la Figura 4 y la Figura 5) . De acuerdo con algunas modalidades, el microorganismo modificado produce un polisacárido exocelular que comprende un perfil del monosacárido diferente que el polisacárido producido por el microorganismo no modificado (compárense las Tablas 5 y 6) .
La caracterización de los componentes de los monosacáridos de un polisacárido por despolimerización puede ser por los métodos y técnicas descritos en Finlayson y Du Bois, Clin Chem Acta. 1 marzo; 84 (1-2 ): 203 -6 (1978), por ejemplo. En algunas modalidades, los polisacáridos producidos por el microorganismo modificado comprenden un número más elevado de monosacáridos particulares que los polisacáridos producidos por el microorganismo no modificado. En una modalidad, el monosacárido particular es la fucosa. En otra modalidad, el monosacárido particular es la arabinosa. En todavía otra modalidad, el monosacárido particular es la galactosa. Otras modalidades describen un polisacárido producido por un microorganismo modificado que comprende monosacáridos particulares múltiples que están presentes en un número más elevado que el polisacárido producido por el microorganismo no modificado.
En algunas modalidades, los polisacáridos exocelulares producidos por el microorganismo modificado comprenden un número inferior de un monosacárido particular que los polisacáridos producidos por el microorganismo no modificado. En una modalidad, el monosacárido particular es la glucosa. En otra modalidad, el monosacárido particular es la xilosa. En todavía otra modalidad, el monosacárido particular es la fructosa. Otras modalidades describen un polisacárido exocelular producido por un microorganismo modificado que comprende monosacáridos particulares múltiples que están presentes en un número inferior que el polisacárido exocelular producido por el microorganismo no modificado.
En algunas modalidades, los polisacáridos producidos por los microorganismos de acuerdo con la descripción son los polisacáridos de peso molecular elevado. En una modalidad, los polisacáridos de peso molecular elevado comprenden un peso molecular de al menos aproximadamente 300 kilodaltons (kDa) , como es mostrado en la Figura 6. En otras modalidades, los polisacáridos de peso molecular elevado comprenden un peso molecular de al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más kDa. Si un polisacárido es considerado un polisacárido de peso molecular elevado, dependerá de las especies del microorganismo oleaginoso y el caldo de fermentación.
En ciertas modalidades en donde los microorganismos tanto modificados como no modificados producen polisacáridos exocelulares de peso molecular elevado, la producción de los polisacáridos de peso molecular elevado por el microorganismo modificado es inferior que la producción de los polisacáridos de peso molecular elevado por el microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una abundancia relativa inferior de los polisacáridos exocelulares de peso molecular elevado que el caldo de fermentación del microorganismo no modificado. 5. Viscosidad del Caldo de Fermentación El efecto de los polisacáridos exocelulares sobre la viscosidad ha sido caracterizado previamente en la fermentación de las bacterias y las algas (de Swaff, et al., Appl Microbiol Biotechnol . octubre ; 57 (3 ) : 395-400 (2001); Becker, et al., Appl Microbiol Biotechnol. agosto; 50 (2) : 145-52.(1998)). La producción de los polisacáridos exocelulares por los microbios conduce a un incremento en la biomasa de la viscosidad del caldo de fermentación. La viscosidad elevada debida a la producción del polisacárido complica el desarrollo de las fermentaciones de densidad celular elevada, tales como aquellas requeridas para aplicaciones de biocombustibles . Para lograr estos niveles de densidad celular elevada, se requieren viscosidades bajas y coeficientes de transferencia de masa elevada resultantes. Muchos microorganismos no pueden producir estas viscosidades bajas requeridas y coeficientes de transferencia de masa elevados debido a la producción del polisacárido exocelular, y por consiguiente no son adecuadas para aplicaciones de biocombustibles .
Se describen microorganismos modificados que producen el caldo de la fermentación con mediciones de la viscosidad baja durante las fermentaciones con alto contenido de nutrientes, permitiendo que estos microorganismos logren niveles de biomasa más elevados para aplicaciones de densidad elevada. En un aspecto, los microorganismos oleaginosos como se describieron producen un caldo de fermentación. En algunas modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que tiene una viscosidad inferior que un caldo de fermentación producido por el microorganismo no modificado cuando ha crecido en el cultivo (Tabla 1) .
La viscosidad puede ser medida por cualquier número de maneras. Los viscosímetros son utilizados típicamente, por ejemplo, tales como un viscosímetro de Brookfield estándar o un viscosímetro de rutina de Cannon-Fenske capilar (Schott, Mainz, Alemania), o un viscosímetro Vismetron (fabricado por Shibaura System Co. , Ldt . ) . Se puede utilizar cualquier método o dispositivo para la medición de la viscosidad de un caldo de fermentación.
En ciertas modalidades, el caldo de fermentación que contiene el microorganismo oleaginoso tiene una densidad celular substancialmente semejante a la densidad celular del caldo de fermentación producido por el microorganismo no modificado.
El caldo de fermentación debe comprender una cantidad mínima de biomasa para producir suficientes ácidos grasos. En algunas modalidades, el caldo de fermentación de cada uno de los microorganismos modificados y no modificados comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro. En otras modalidades, la biomasa del caldo de fermentación de cada microorganismo es de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, o 45 gramos por litro. En otras modalidades, la biomasa del caldo de fermentación de cada microorganismo es de al menos aproximadamente 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 174, 200, 300, 400, o 500 o más gramos por litro del peso seco celular.
En un aspecto, un microorganismo de acuerdo con esta descripción produce un caldo de fermentación que comprende tanto una biomasa mínima como una viscosidad máxima. En ciertas modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de menos de aproximadamente 1,100 centipoises (cP) (véase la Tabla 1) . En otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de menos de aproximadamente 700 cP. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de menos de aproximadamente 100 cP. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de menos de aproximadamente 30 cP. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de menos de aproximadamente 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o 25 cP. En todavía otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de menos de aproximadamente 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 Cp, ó mas.
En otro aspecto, los microorganismos modificados como se describieron producen un caldo de fermentación que tiene una viscosidad inferior que la viscosidad del caldo de fermentación producido por los microorganismos no modificados. En algunas modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad al menos aproximadamente 10 veces inferior que la viscosidad de un caldo de fermentación substancialmente semejante producido por el microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de al menos aproximadamente 100 veces inferior que la viscosidad del caldo de fermentación producido por el microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de al menos aproximadamente 500 veces inferior que la viscosidad del caldo de fermentación producido por el microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 150, 200, 300, 400, 600, o 1000 o más veces inferior que la viscosidad del caldo de fermentación producido por el microorganismo no modificado. 6. Potencia de Agitación y Disponibilidad del Nutriente La viscosidad es un contribuyente importante para el diseño de ingeniería de los sistemas de fermentación aeróbicos a escala industrial . Un factor principal en el diseño de los fermentadores a escala industrial es la provisión de una transferencia de masa adecuada del oxígeno en solución y el mantenimiento de al menos una concentración del oxígeno disuelto mínima. Algunos microorganismos en el caldo de fermentación requieren un suplemento de oxígeno para sostener niveles de oxígeno disuelto adecuados para la propagación y supervivencia de la célula.
En algunas modalidades, el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que puede mantener un nivel de oxígeno disuelto mínimo (abreviado "DO") sin suplemento de oxígeno. El nivel de oxígeno disuelto puede ser medido por cualquiera de varios métodos. Un método de medición del grado de saturación del oxígeno en el caldo de fermentación es la utilización de una sonda de oxígeno. La sonda enviará una señal que indica la cantidad de oxígeno en el caldo de fermentación como un porcentaje relativo con respecto a la señal de oxígeno máxima calibrada. En ciertas modalidades, el nivel de oxígeno disuelto mínimo comprende aproximadamente 20 por ciento. Véase la Tabla 1, columna 6, etiquetado "% DO") . En otras modalidades, el nivel de oxígeno disuelto mínimo comprende aproximadamente 10, 15, 25, 30 por ciento o más elevado. Diferentes especies de microorganismos pueden requerir varios niveles de oxígeno disuelto para la viabilidad y propagación celular.
Una viscosidad elevada del caldo de cultivo incrementa la entrada de energía requerida para el mezclado y también puede reducir la velocidad máxima de la transferencia del oxígeno. Por ejemplo, esto ha sido demostrado en los cultivos de Xanthomonas campestris productores de xantano. (Shu y Yang, Biotechnol Bioeng. 5 marzo; 35 (5) : 454-68 (1990) . El caldo de fermentación de alta viscosidad limita la transferencia de la masa, conduciendo a la necesidad de una agitación y entradas de potencia de aireación más grandes para proveer oxígeno suficiente y otros nutrientes a las células en el caldo de fermentación (Figuras 1 y 2) . Para mantener la misma transferencia de masa del oxígeno cuando se incrementa la viscosidad, se requiere una potencia suministrada incrementada (tal como la potencia por volumen) , usualmente por una combinación de la agitación y el trabajo del compresor neumático. El requerimiento de una potencia incrementada para la agitación, aumenta el costo de la fermentación considerablemente.
El coeficiente de transferencia de masa del oxígeno es una manera en que se calcula la disponibilidad del oxígeno en el caldo de fermentación. El coeficiente de transferencia de masa del oxígeno puede ser calculado por una persona con experiencia ordinaria en el arte, y es calculado típicamente de las gráficas de la tensión del oxígeno disuelto contra el tiempo (de Swaff, et al., Appl Microbiol Biotechnol. octubre;57 (3) :395-400 (2001)) . También están disponibles correlaciones empíricas que describen la relación entre la viscosidad de la solución (µ) , la velocidad de transferencia de la masa del oxígeno (kLa) , la velocidad superficial del aire (Us) , y la Potencia suministrada (P/V) . Por ejemplo, la correlación empírica más común es como sigue: kLa = A*(P/V)AB * (Us)AC * (µ) AD Los valores apropiados para las constantes A, B, C, y D que representan la correlación empírica entre cada parámetro y el coeficiente de transferencia de masa del oxígeno (kLa) pueden ser seleccionados y/o calculados fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en el arte .
En ciertas modalidades, el microorganismo modificado tiene un coeficiente de transferencia de masa del oxígeno que es más elevado que el coeficiente de transferencia de masa del oxígeno del microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado no requiere suplemento del oxígeno cuando crece en el cultivo, pero el microorganismo no modificado requiere el suplemento del oxígeno cuando crece en el cultivo. Por lo tanto, la reducción de la viscosidad de la solución también podría reducir la potencia por volumen requerida para suministrar el oxígeno y otros nutrientes.
La concentración del polisacárido es probablemente un contribuyente importante para la viscosidad de una solución. Se pueden hacer correlaciones empíricas entre las concentraciones del polisacárido en solución con la viscosidad de la solución observada.
En un aspecto, los microorganismos como se describieron requieren una cantidad reducida de potencia para agitar un volumen unitario del caldo de fermentación. La cantidad de potencia requerida para agitar un volumen (medida típicamente en caballos de potencia por 3785 litros (1000 galones) o kilowatt por metro cúbico) de un caldo de fermentación, puede ser calculada por una persona con experiencia en el arte. En algunas modalidades, el volumen unitario es de 3785 litros (1000 galones) . Este requerimiento de potencia reducida provee un proceso de fermentación menos costoso .
En una modalidad, el microorganismo modificado puede ser cultivado en el caldo de fermentación que requiere menos de 5.96 kilovatios (8.0 caballos de potencia) por 3785 litros (1000 galones) para la agitación (figura 2) . En otra modalidad, el microorganismo modificado puede ser cultivado en el caldo de fermentación que requiere menos de 3.728 kilovatios (5.0 caballos) de potencia por 3785 litros (1000 galones) para la agitación. En todavía otras modalidades, el microorganismo modificado puede ser cultivado en el caldo de fermentación que requiere menos de 2.98, 2.24, 1.49, 0.74 kilovatios (4.0, 3.0, 2.0, 1.0 caballos de potencia) o menos, por 3785 litros (1000 galones) para la agitación.
En otra modalidad, el microorganismo modificado requiere menos caballos de potencia de agitación por volumen unitario que el microorganismo no modificado. En ciertas modalidades, el microorganismo modificado requiere al menos aproximadamente 9 veces menos caballos de potencia de agitación por 3785 litros (1000 galones) que el microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado requiere al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 1000 o un número mayor de veces, de menos caballos de potencia de agitación por volumen unitario que el microorganismo no modificado. 7. Rendimiento del Ácido Graso La totalidad de los microorganismos descritos aquí, tanto modificados como no modificados, pueden producir un ácido graso durante la fermentación. La síntesis de ácidos grasos es impactada negativamente por la producción de polisacáridos en muchos microorganismos. Las condiciones que promueven la producción de los lípidos (relaciones elevadas del carbón con respecto al nitrógeno) también promueven la producción de polisacáridos. Pueden ocurrir reducciones del rendimiento de la fermentación del ácido graso en estos microorganismos a causa de que una parte de la fuente de carbonos es utilizada para la producción de polisacáridos en lugar del ácido graso o lípido deseado. Cuando la viscosidad del caldo de fermentación se incremente con cantidades crecientes del polisacárido, también existe una reducción en la transferencia de la masa, lo cual puede reducir la eficiencia de la síntesis de los ácidos grasos. Los procesos de extracción de los ácidos grasos también son afectados negativamente por la producción de polisacáridos. La recolección de las células es difícil por medio de filtración o centrifugación en la presencia de los polisacáridos. La ruptura de la célula es ineficiente en la presencia de los polisacáridos. Los polisacáridos pueden contribuir a la formación de emulsiones estables. Los niveles elevados de los polisacáridos también pueden prevenir la extracción y recuperación del aceite en sistemas acuosos.
Una medida de la productividad del microorganismo es el rendimiento de la fermentación del ácido grasos. Por la introducción de las modificaciones genéticas en los microorganismos no modificados de acuerdo con esta descripción, los microorganismos modificados novedosos fueron creados, los cuales generalmente mejoraron el rendimiento de la fermentación de los ácidos grasos sobre el azúcar (substrato de carbón) en aproximadamente 20-25 % en peso. El rendimiento del ácido graso de los microorganismos descritos puede ser calculado fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en el arte. Típicamente, el éster metílico del ácido graso, o FAME, es evaluado.
Un éster metílico del ácido graso (FAME, por sus siglas en inglés) puede ser creado por una reacción catalizada con un álcali entre las grasas o los ácidos grasos y el metanol, para producir un combustible o ensayo del perfil del ácido graso producido por un microorganismo. Los tipos y proporciones de los ácidos grasos presentes en los lípidos de las células, o el perfil del ácido graso, son los rasgos fenotípicos principales y pueden ser utilizados para identificar los microorganismos. Por ejemplo, el análisis utilizando cromatografía gaseosa ( "GC" ) puede determinar las longitudes, enlaces, anillos y ramificaciones del FAME. Las razones primarias para analizar los ácidos grasos como los esteres metílicos del ácido graso incluyen: en su forma no derivada, libre, los ácidos grasos pueden ser difíciles de analizar a causa de que estos compuestos altamente polares tienden a formar enlaces de hidrógeno, conduciendo a problemas de adsorción. La reducción de su polaridad puede hacerlos más adecuados para el análisis. Para distinguir entre las diferencias muy ligeras exhibidas por los ácidos grasos no saturados, los grupos funcionales de carboxilo polares pueden ser neutralizados primero. Esto permite entonces que la química en una columna efectúe las separaciones por la elución en el punto de ebullición, y también por el grado de insaturación, y aún la configuración cis contra trans de la instauración.
La esterificación de los ácidos grasos a ésteres metílicos de ácidos grasos puede ser efectuada utilizando un reactivo de derivación de la alquilación. Los ésteres metílicos ofrecen una estabilidad excelente, y proveen muestras rápidas y cuantitativas para el análisis por GC. La reacción de esterificación involucra la condensación del grupo carboxilo de un ácido y el grupo hidróxilo de un alcohol. La transesterificación puede incluir el uso de cualquier alcohol adecuado, tal como el metanol, etanol, ropanol, butanol, y/o semejantes. La esterificación se puede hacer en la presencia de un catalizador (tal como el tricloruro de boro) . El catalizador protona un átomo de oxígeno del grupo carboxilo, haciendo al ácido mucho más reactivo. Un alcohol se combina entonces con el ácido protonado para producir un éster con la pérdida del agua. El catalizador es removido con el agua. El alcohol que es utilizado determina la longitud de la cadena de alquilo de los ésteres resultantes (el uso del metanol conducirá a la formación de los ésteres metílicos mientras que el uso del etanol conducirá a ésteres de etilo) .
En la mayoría de las modalidades, los microorganismos modificados descritos comprenden un rendimiento de la fermentación del ácido graso que es mayor que el rendimiento de la fermentación del ácido graso del microorganismo no modificado. En ciertas modalidades, los microorganismos modificados exhiben un rendimiento de la fermentación del ácido graso de al menos aproximadamente 14 por ciento. En otras modalidades, el microorganismo modificado tiene un rendimiento de la fermentación del ácido graso de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 por ciento o más elevado (Tabla 1) .
En algunas modalidades, el microorganismo modificado produce un rendimiento de la fermentación del ácido graso de al menos aproximadamente 10 por ciento mayor que el rendimiento de la fermentación del ácido graso producido por el microorganismo no modificado. En otras modalidades, el microorganismo modificado produce un rendimiento del ácido graso al menos aproximadamente 20 por ciento mayor que el rendimiento del ácido graso producido por el microorganismo no modificado. En todavía otras modalidades, el microorganismo modificado produce un rendimiento del ácido graso de aproximadamente 10 por ciento hasta aproximadamente 30 por ciento mayor que el rendimiento del rendimiento del ácido graso producido por el microorganismo no modificado. En las modalidades adicionales, el microorganismo modificado produce un rendimiento del ácido graso de al menos aproximadamente 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 o un número más elevado, en porcentaje, que el rendimiento del ácido graso producido por el microorganismo no modificado. 8. Producción de Biocombustible Esta descripción también incluye la producción de lípidos microbianos y la producción de biocombustible y/o precursores de biocombustible utilizando los ácidos grados contenidos en estos lípidos. Esta descripción provee microorganismos que producen lípidos adecuados para la producción del biodiesel y/o para aplicaciones nutritivas a un costo muy bajo.
De acuerdo con algunas modalidades, la descripción puede incluir un método de producción de aceites biológicos. El método puede incluir la producción o el crecimiento de un microorganismo como se describió aquí. El microorganismo puede incluir y/o tener dentro, ácidos grasos que contienen un lípido y/o una cantidad de ácidos grasos que contienen lípidos. En la alternativa, el organismo puede excretar y/o descargar el aceite biológico.
El método puede incluir además cualesquiera acciones adicionales adecuadas, tales como la extracción y/o la remoción de los ácidos grasos que contienen lípidos por lisado de las células, aplicando una presión, extracción de solventes, destilación, centrifugación, otro procesamiento mecánico, otro procesamiento térmico, otro procesamiento químico, y/o semejantes. En la alternativa, el microorganismo productor puede excretar y/o descargar los ácidos grasos que contienen lípidos desde el microorganismo sin procesamiento adicional .
Los ácidos grasos pueden tener cualquier perfil y/o características adecuadas, tales como las adecuadas generalmente para la producción de un biocombustible . De acuerdo con algunas modalidades, los ácidos grasos pueden incluir una cantidad y/o porcentaje adecuado de los ácidos grasos con cuatro o más dobles enlaces sobre una base de la masa. En la alternativa, los ácidos grasos pueden incluir una cantidad y/o porcentaje adecuado de los ácidos grasos con tres o más dobles enlaces, con dos o más dobles enlaces, con uno o más dobles enlaces, y/o semejantes.
En otro aspecto, se describen métodos de producción de un precursor de un biocombustible. En ciertas modalidades, los métodos comprenden el cultivo de los microorganismos como se describieron y la recolección del caldo de la fermentación producido por el microorganismo. El precursor del biocombustible puede ser producido utilizando cualquiera de los microorganismos descritos aquí. En algunas modalidades, el precursor del biocombustible es un aceite biológico. El precursor del biocombustible puede ser extraído como se describió aquí o por cualquier otra técnica adecuada. Si es necesario, se puede efectuar un procesamiento químico adicional de los lípidos y/o aceites biológicos extraídos en los precursores del biocombustible . En algunas modalidades, el método comprende además la extracción de los ácidos grasos desde el microorganismo y hacer reaccionar los ácidos grasos para producir un biocombustible.
También se describen métodos para producir un biocombustible. En ciertas modalidades, el método comprende suministrar una fuente de carbón y convertir la fuente de carbono a los ácidos grasos dentro de los microorganismos como es descrito. Ciertos microorganismos descritos deben ser cultivados a una densidad celular específica previo a la extracción de los lípidos, aceites, biocombustibles , o precursores de biocombustibles. En ciertas modalidades, el método descrito comprende el cultivo del microorganismo hasta una densidad celular de al menos aproximadamente 50 gramos del peso seco celular por litro en un caldo de fermentación que tiene una viscosidad de menos de aproximadamente 1100 cP. En una modalidad, los biocombustibles o los precursores de biocombustibles del método, son producidos con cualquiera de los microorganismos modificados como se describió aquí. En una modalidad, el microorganismo es una levadura que produce un polisacárido exocelular. En otras modalidades, el método descrito comprende el cultivo del microorganismo a una densidad celular de al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 o más gramos por litro en un caldo de fermentación que tiene una viscosidad de menos de aproximadamente 1500, 1000, 750, 500, 100, 50, 30, 10, 5 o un valor más bajo de cP.
Un biocombustible producido por los métodos descritos también es mencionado. El biocombustible puede ser derivado de cualquiera de los precursores del biocombustible o los aceites biológicos o lípidos como se produjeron por los métodos o microorganismo descritos. El precursor del biocombustible o el aceite biológico pueden ser procesados adicionalmente en el biocombustible con cualquier método adecuado, tal como la esterificación, transesterificación, hidrogenación, termofraccionamiento, y/o semejantes. En la alternativa, el aceite biológico puede ser adecuado para el uso directo como un biocombustible. La esterificación se refiere a la fabricación y/o la conformación de un éster, tal como por la reacción de un ácido con un alcohol para formar un éster. La transesterificación se refiere a la carga de un éster en uno o más ésteres diferentes, tal como por la reacción de un alcohol con un triglicérido para formar ésteres de ácidos grasos y glicerol, por ejemplo. La hidrogenación y/o el hidrotratamiento se refieren a las reacciones para agregar hidrógeno a las moléculas, tal como para saturar y/o reducir los materiales.
En otro aspecto, se describen métodos para suministrar energía a un vehículo por el quemado de un biocombustible en un motor de combustión interna. El biocombustible puede ser producido por cualquiera de los métodos descritos o por cualquiera de los microorganismos descritos .
En otro aspecto, se describe un biocombustible adecuado para su uso en los motores de compresión. El biocombustible puede ser producido por cualquiera de los métodos descritos o por cualquiera de los microorganismos descritos .
Un interés creciente es dirigido al uso de los componentes de hidrocarburos de origen biológico en los combustibles, tales como el biodiesel, diesel renovable, y combustibles para aviones de propulsión a chorro, puesto que las materias primas biológicas renovables que pueden reemplazar las materias primas derivadas de los combustibles ya están disponibles, y el uso de las mismas es deseable. Existe una necesidad urgente de métodos para producir componentes de hidrocarburos a partir de materiales biológicos. La presente descripción satisface esta necesidad por la provisión de los métodos y microorganismos adecuados para la producción del biodiesel, diesel renovable, y combustible para aviones de propulsión a chorro utilizando los lípidos generados por los métodos descritos aquí como un material biológico para producir biodiesel, diesel renovable, y un combustible para aviones de propulsión a chorro.
Después de la extracción, los componentes de los lípidos y/o los hidrocarburos recuperados de la biomasa microbiana descrita aquí, pueden ser sometidos a tratamiento químico para la manufactura de un combustible para su uso en vehículos que queman diesel y en motores de aviones de propulsión a chorro. Un ejemplo es que el biodiesel puede ser producido por transesterificación de los triglicéridos contenidos en la biomasa rica en aceite. Las composiciones de los lípidos pueden ser sometidas a transesterificación para producir ésteres de ácidos grasos de cadena larga útiles como biodiesel. Así, en otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para producir un biodiesel. En una cierta modalidad, el método para la producción del biodiesel comprende las etapas de (a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos utilizando los métodos descritos aquí, (b) lisar un microorganismo que contiene lípidos para producir un lisado, (c) aislar los lípidos del microorganismo lisado, y (d) transesterificar la composición de los lípidos, por medio del cual se produce un biodiesel. La transesterificación puede incluir el uso de cualquier alcohol adecuado, tal como el metanol , etanol, propanol, butanol, y/o semejantes.
Los métodos para el crecimiento de un microorganismo, el lisado de un microorganismo para producir un lisado, el tratamiento del lisado en un medio que comprende un solvente orgánico para formar una mezcla heterogénea y la separación del lisado tratado en una composición de lipidos, ya han sido descritos anteriormente y también pueden ser utilizados en el método de producción del biodiesel .
El estándar internacional común para el biodiesel es EN 14214 (noviembre del 2008) . Alemania utiliza el DIN EN 14214 y el UK requiere el cumplimiento de BS EN 14214. ASTM D6751 (noviembre del 2008) es el estándar de biodiesel más común referido en los Estados Unidos de América y Canadá. Las pruebas industriales básicas para determinar si los productos se conforman con estos estándares incluyen típicamente la cromatografía en fase gaseosa, la HPLC, y otras. El biodiesel que satisface los estándares de calidad es muy poco tóxico, con una calificación de la toxicidad mayor que 50 ml/kg. El combustible resultante puede satisfacer y/o exceder los estándares internacionales EN 14214:2008 (Combustibles automotrices, ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) para motores diesel) y/o ASTM D6751-09 (Descripción Estándar para una Mezcla de Combustible Biodiesel (B100) para Combustibles de Destilados Intermedios). Los contenidos completos de EN 14214:2008 y ASTM D6751-09 son incorporados ambos por el presente para referencia en su totalidad como una parte de esta descripción. 9. Producción del Material Renovable La producción de materiales renovables, incluyendo los aceites biológicos, de fuentes tales como las plantas (incluyendo las semillas que contienen aceite), microorganismos, y los animales necesarios para varios propósitos. Por ejemplo, es deseable incrementar la admisión en la dieta de muchos nutrientes benéficos encontrados en los aceites biológicos. Los nutrientes particularmente benéficos incluyen los ácidos grados tales como los ácidos grasos omega 3 y omega 6 y los ásteres de los mismos. A causa de que los seres humanos y muchos otros animales no pueden sintetizar directamente los ácidos grasos esenciales de omega 3 y omega 6, los mismos deben ser obtenidos de la dieta. Las fuentes de la dieta tradicionales de los ácidos grasos esenciales incluyen los aceites vegetales, los aceites de mamíferos marinos, los aceites de pescado y las semillas que contienen aceite. Además, los aceites producidos por ciertos microorganismos se ha encontrado que van a ser ricos en ácidos grasos esenciales. Para reducir los costos asociados con la producción de los ácidos grasos benéficos para usos en la dieta, farmacéuticos, y cosméticos, existe una necesidad de un método eficiente y de costo bajo de producción de aceites biológicos que contienen estos ácidos grasos.
En ciertas modalidades, el microorganismo oleaginoso produce un material renovable. Los materiales renovables como se describieron aquí pueden ser utilizados para la manufactura de una composición alimenticia, de suplemento alimenticio, cosmética, o farmacéutica, para un animal no humano o un ser humano. Los materiales renovables pueden ser fabricados en los siguientes ejemplos no limitativos: productos alimenticios, composiciones farmacéuticas, cosméticos, y composiciones industriales. En ciertas modalidades, el material renovable es un biocombustible o un precursor de biocombustible .
Un producto alimenticio es cualquier alimento para consumo animal o humano, e incluye composiciones tanto líquidas como sólidas. Un producto alimenticio puede ser un aditivo para alimentos de animales o de seres humanos, e incluye alimentos medicinales. Los alimentos incluyen, pero no están limitados a, alimentos comunes; productos líquidos, incluyendo leches, bebidas, bebidas terapéuticas, y bebidas nutritivas; alimentos funcionales; suplementos; alimentos neutracéuticos ; leches de fórmula, incluyendo las fórmulas para infantes prematuros; alimentos para mujeres embarazadas o lactantes; alimentos para adultos; alimentos geriátricos; y alimentos para animales. En algunas modalidades, el microorganismo, el material renovable, u otro producto biológico descrito aquí puede ser utilizado directamente como, o incluido como un aditivo dentro de uno o más de: un aceite, manteca vegetal, un material que se puede untar, otro ingrediente graso, bebida, salsa, alimento a base de un lácteo o a base de soya (tal como la leche, el yogur, el queso y el helado) , un artículo horneado, un producto nutritivo, por ejemplo, como un suplemento nutritivo (en la forma de una cápsula o tableta) , un suplemento de vitamina, un suplemento de la dieta, una bebida pulverizada, un producto alimenticio pulverizado terminado o semi - terminado , y combinaciones de los mismos .
En ciertas modalidades, el material renovable es un aceite biológico. En ciertas modalidades, el material renovable es un aceite graso saturado. Los ejemplos de los ácidos grasos saturados no limitativos incluyen el ácido oleico, el ácido linoleico, o el ácido palmítico.
Los microorganismos oleaginosos modificados descritos aquí pueden ser altamente productivos en la generación de materiales renovables cuando se compara con los microorganismos de la contraparte, no modificados. El material renovable del microorganismo es descrito en la Solicitud de Patente U.S. 13/046,065 pendiente (No. de Pub. 20120034190, presentada el 11 de marzo del 2011), la cual es incorporada aquí para referencia en su totalidad. En otras modalidades, la solicitud describe los métodos de producción de materiales renovables. Los métodos de producción de materiales renovables se describen en la Sol. de Patente U.S. pendiente 13/046,065 (No. Pub . 20120034190, presentada el 11 de marzo del 2011), la cual es incorporada aquí para referencia en su totalidad. Cada referencia citada en esta descripción es incorporada por el presente para referencia como si fuera descrita en su total idad .
Ej emplos Los siguientes ejemplos son presentados para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada .
Ejemplo 1: Mutagénesis de la Cepa Las cepas seleccionadas para el trabajo de la mutagénesis fueron MK29404, una cepa de las especies de levadura Sporidiobolus pararoseus, y MK29794, una cepa de las especies de levadura Rhodotorula ingeniosa. MK29404 y MK9794 producen un caldo de viscosidad elevada después de la fermentación durante aproximadamente 70-100 horas, como es mostrado en la Tabla 1. MK28428 tiene una viscosidad inferior después de tiempos de fermentación comparables (Tabla 1).
Las modificaciones genéticas fueron introducidas en estas cepas por medio de luz UV estándar, la irradiación con rayos X y la mutagénesis química. Para determinar el nivel apropiado de exposición a los diferentes mutágenos, las curvas de exterminio fueron llevadas a cabo sobre cada cepa y cada mutágeno. La luz UV, la irradiación con rayos X y un mutágeno químico (nitrosoguanidina) fueron utilizados para cada cepa.
Brevemente, las células fueron colocadas en placas, sobre placas del medio de agar y se expusieron a un intervalo de irradiación con luz UV de 350-475 La mutagénesis de los rayos X fue llevada a cabo colocando en placas las células sobre las placas del medio de agar y exponiéndolas a la irradiación con rayos X durante 30 minutos o 1 hora. La mutagésis química fue llevada a cabo mezclando las células de MK29404 con niveles variables de nitrosoguanidina durante 1 hora. Los niveles de 20 y 40 µg/ml fueron utilizados para la generación subsiguiente de mutantes.
Las células mutagenizadas se hicieron crecer sobre placas de agar con una concentración del Medio de Crecimiento de Biocombustibles (BFGM) estándar de 1/16 del medio de la concentración total . Si se decide utilizar una concentración de BFGM de 1/16 del medio de la concentración total. Esta concentración permitió la acumulación significativa de la grasa pero evitó que las colonias se hicieran crecer abundantemente y se fusionen conjuntamente .
Ejemplo 2: Selección de la Morfología de la Cepa Seca La primera selección de las cepas mutantes de K29404 y MK29794 fue por inspección visual. Las colonias mutantes que tuvieron niveles bajos del polisacárido fueron identificadas con base en la observación visual de las colonias sobre las placas de agar . Las colonias del tipo silvestre son de apariencia "húmeda" y "fangosa" . Si la placa de agar es volteada de arriba hacia abajo, la colonia "goteará" sobre el otro lado de la placa. Esta morfología es características de las células que producen grandes cantidades del polisacárido extracelular . Los mutantes bajos en polisacáridos fueron identificados por una morfología de la colonia que fue "seca" . Estas colonias no fueron visiblemente húmedas o fangosas, sino rígidas y pulvurentas. Las colonias que estuvieron "secas" fueron seleccionadas para estudio adicional.
Ejemplo 3: Fermentación de las Cepas Seleccionadas Las colonias con la morfología "seca" fueron guardadas para un análisis más detallado y referidas comúnmente como mutantes "secos" . Las cepas múltiples del mutante y las cepas MK29404, MK28428, y MK29794 del tipo silvestre (WT) fueron fermentadas, con las cepas de WT que representan microorganismos no modificados ejemplares. A menos que se especifique de otra manera dentro de esta descripción, el protocolo de fermentación fue seguido generalmente de manera directa o conducido de acuerdo con los procedimientos de la Patente U.S. No. 6,607,900, incorporada por el presente para referencia.
Cada cepa fue cultivada en un termentador BioFlo 6000 de 100 litros de New Brunswick Scientific (Edison, New Jersey, E.U.A.) con un proceso por lotes de alimentación de carbón (glucosa) y nitrógeno (hidróxido de amonio) . La fermentación fue inoculada con 6 litros del cultivo. Para la propagación del inoculo se utilizó un termentador VirTis de 14 litros (SP Scientific Gardiner, New York, E.U.A.) . El medio del inoculo incluyó 10 litros del medio preparado en cuatro grupos separados. El grupo A incluyó 98 gramos de MSG*1H20, 202 gramos de Na2S04, 5 gramos de KCl, 22.5 gramos de MgS04*7H20, 23.1 gramos de (NH4)2S04, 14.7 gramos de KH2P04, 0.9 gramos de CaCl2*2H20, 17.7 gramos de MnCl2*4H20, 18.1 miligramos de ZnS04*7H20, 0.2 miligramos de CoCl2*6H20, 0.2 miligramos de Na2Mo04*2H20, 11.8 miligramos de CuS04*5H20, 11.8 miligramos de NiS04*6H20, y 2 mililitros de 1520US ( ant iespumante ) de Dow (Midland, Michigan, E.U.A.) . El grupo A fue tratado en autoclave a 121 grados Celsius en el termentador del inoculo a un volumen de aproximadamente 9.5 litros. El grupo B incluyó 20 mililitros de un litro de una solución en almacenamiento que contiene 2.94 gramos de FeS04* H20 y 1 gramo de ácido cítrico. La solución en almacenamiento del grupo B fue tratada en autoclave a 121 grados Celsius. El grupo C incluyó 37.6 miligramos de tiamina-HCl, 1.9 miligramos de vitamina B12, y 1.9 miligramos de la sal de hemi-calcio del ácido pantoténico disueltos en 10 mililitros y se esterilización en un filtro. El grupo D incluyó 1,000 mililitros de agua destilada que contiene 400 gramos de polvo de glucosa. Después que el termentador fue enfriado a 29.5 grados Celsius, se agregaron los grupos B, C, y D al fermentador. Utilizando hidróxido de sodio y ácido sulfúrico, el fermentador fue ajustado en el pH a 5.5 y el oxígeno disuelto fue abarcado hasta el 100 % previo a la inoculación.
El fermentador del inoculo fue inoculado con 18 mililitros de un cultivo en un recipiente de agitación estándar y se cultiva a 29.5 grados Celsius, pH 5.5, 350 revoluciones por minuto de agitación, y 8 litros por minuto de aire durante un período de 27 horas, tiempo en el cual se transfirieron 6 litros del caldo del inoculo al fermentador de 100 litros. El fermentador de 100 litros incluyó 80 litros del medio de fermentación. El medio de fermentación fue preparado de un modo semejante al fermentador del inoculo.
El medio de la fermentación incluyó 7 grupos del medio aplicado por lotes. El grupo A incluyó 1,089.6 gramos de a2S04/ 57.6 gramos de K2SO4, 44.8 gramos de KC1, 181.6 gramos de MgS04*7H20 y 90.4 gramos de KH2P04-El grupo A fue esterilizado con vapor a 122 grados Celsius durante 60 minutos en el fermentador de 100 litros a un volumen de aproximadamente 35 litros. El grupo B incluyó 90.4 gramos de (NH4)2S04, y 10.4 gramos de MSG*1H20 en un volumen de aproximadamente 500 mililitros. El grupo C incluyó 15.2 gramos de CaCl2*2H20 en un volumen de aproximadamente 200 mililitros. El grupo D incluyó 1,200 gramos de la glucosa pulverizada en aproximadamente 2 litros de agua destilada. El grupo E incluyó 248 miligramos de MnCl2*4H20, 248 miligramos de ZnS04*7H20, 3.2 miligramos de CoCl2*6H20, 3.2 miligramos de Na4Mo04*2H20, 165.6 miligramos de CuS04*5H20, y 165.6 miligramos de NiS04*6H20 en un volumen de aproximadamente 1 litro. El grupo F incluyó 824 miligramos de FeS04*7H20 y 280.3 miligramos de ácido cítrico en un volumen de aproximadamente 280 mililitros. El grupo G incluyó 780 miligramos de tiamina-HCl, 12.8 miligramos de vitamina B12 , y 266.4 miligramos de sal de hemi-calcio de ácido pantoténico filtrados en condiciones estériles en un volumen de aproximadamente 67.4 mililitros de agua destilada. Los Grupos B, C, D, E, F, y G fueron combinados y agregados al termentador después que el termentador alcanzó una temperatura operativa de 29.5 grados Celsius. El volumen del termentador previo a la inoculación fue de aproximadamente 38 litros.
El termentador fue inoculado con 6 litros del caldo de la fermentación descrito anteriormente. La fermentación fue a pH controlado utilizando una solución de 5.4 litros de hidróxido de amonio 4N a un pH de 5.5. El oxígeno disuelto fue controlado entre 5 por ciento y 20 por ciento por medio de la fermentación utilizando agitación desde 180 revoluciones por minuto hasta 480 revoluciones por minuto y un flujo de aire desde 60 litros por minuto hasta 100 litros por minuto. De principio a fin de la fermentación, se alimentaron 34.8 litros de una solución de 850 gramos de peso seco celular por litro de la solución de dextrosa al 95 por ciento para mantener una concentración de menos de 50 gramos de peso seco celular por litro.
Ejemplo 4: Mediciones de la Viscosidad La viscosidad de cada cepa fue ensayada después de un período de tiempo de fermentación fijo, generalmente de 50-100 horas. La viscosidad del cultivo fue determinada con un viscosímetro de Brookfield estándar (Middleboro, MA) . Los componentes del medio no influyeron significativamente en la viscosidad a las concentraciones utilizadas.
Las cepas secas mostraron mediciones de la viscosidad mejoradas notablemente y un uso mejorado del carbón. Los datos que resumen las mediciones de la viscosidad de las cepas Secas silvestres (WT) y Secas, no modificadas, de K 29404, MK28428, y K 29794 están en la Tabla 1. Los cálculos de la masa fueron efectuados en volúmenes no reciclado ( "RV" ) . La viscosidad promedio para el tipo silvestre de MK29404 fue de 1701 cP, mientras que la viscosidad promedio para el mutante MK29404 Secol fue de 8.5 cP, lo cual es una reducción de 200 veces en la viscosidad. Otros mutantes MK 29404 Secos tuvieron reducciones semejantes en la viscosidad. La cepa del tipo silvestre MK 29794 tuvo una viscosidad de aproximadamente 700 cP, mientras que los mutantes Secos fueron en su mayoría < 50 cP. Por consiguiente, los mutantes Secos de las cepas MK 29404 y 29794 mostraron una reducción substancial en la viscosidad cuando se compara con sus contrapartes de WT (del Tipo Silvestre o no modificado) . Las cepas de MK28428 mostraron una viscosidad baja, pero puesto que los mutantes de MK 29404 y 29794 secos exhibieron mejores mediciones de productividad tales como el rendimiento de ácidos grasos sobre el azúcar, las cepas de MK 28428 no fueron seleccionadas para los experimentos de seguimiento.
Tabla 1: Viscosidad, suplemento de oxígeno, y rendimiento del azúcar de las cepas de levadura generadas 5 15 5 10 15 Ejemplo 5: Mediciones de FAME de Masa Seca El análisis de FAME es descrito aquí, pero no está limitado a esta descripción. Brevemente, los lípidos producidos son medidos por muestreo del caldo de fermentación al final de la fermentación, y el aislamiento por centrifugación de las células de levadura que contienen los lípidos. El agua es removida y los lípidos dentro de las células son convertidos a los ésteres utilizando un protocolo de esterificación catalizado por un ácido, analítico. Una vez que los lípidos internos son esterificados hasta FAME, los mismos son analizados por cromatografía en fase gaseosa con un estándar de referencia interna para cuantificar la cantidad de los lípidos convertidos. El análisis de FAME en esta etapa fue efectuado sobre la totalidad de las cepas probadas, como es mostrado en la Tabla 1. En general, los mutantes MK29404 y MK29974 Secos en promedio mostraron un porcentaje de FAMA más elevado que sus contrapartes del tipo silvestre (WT) no modificadas.
Como una medida de la producción de FAME normalizada a través de las diferentes cepas, el rendimiento del azúcar de las cepas mutantes de WT y secas, no modificadas, fueron evaluadas. El rendimiento del azúcar fue medido por el cálculo de la cantidad total del azúcar consumido por el organismo con relación a la cantidad del lípido producido por el organismo. Así, el rendimiento del azúcar es calculado por la suma de la masa del FAME producido, dividido entre la suma de la masa del azúcar consumido. El azúcar consumido por el organismo es medido por el análisis de HPLC de todas las soluciones libres de azúcar y totalizando el volumen de las soluciones de azúcar alimentadas durante la fermentación. Las muestras de HPLC también son tomadas entonces justo previo al inicio de la fermentación y justo después del complemento de la fermentación para verificar la cantidad de azúcar en el inoculo de inicio y la cantidad del azúcar no consumido restante después de la fermentación.
Los resultados del rendimiento del azúcar del ácido graso para todas las cepas son presentados en la Tabla 1, columna 7. En general, los mutantes secos tuvieron un rendimiento mejorado del azúcar que las cepas de WT, mejorando en aproximadamente 20-25 %. Por ejemplo, el 29404 del tipo silvestre tuvo un rendimiento de conversión del azúcar promedio del 16.1 % comparado con la Cepa 29404-Secol la cual tuvo un promedio de 19.2 %, lo cual es una mejora de aproximadamente 20 %. La cepa del tipo silvestre de 29794 tuvo un rendimiento del azúcar de 15.1 %, mientras que 33Secol y Kseco7 tuvieron porcentajes del rendimiento de 18.0 y 18.9, por lo cual se obtuvo una mejora de hasta 25 %.
Ejemplo 6: Medición del Suplemento de Oxígeno El requerimiento de suplemento del oxígeno de la totalidad de las cepas fue probado. Los niveles del oxígeno en el caldo de la fermentación se midieron utilizando un Sensor de Oxígeno DT222A (Fourier, Mokena, IL) en varios instantes del tiempo durante la fermentación. Si los niveles del oxígeno cayeron abajo del umbral del 20 %, la cepa se determinó que requiere un suplemento de oxígeno para soportar el crecimiento celular.
Previo a la fermentación, se calibró la sonda de oxígeno. Al inicio de la fermentación, existe una sonda de oxígeno en el tanque y el aire es soplado en el recipiente a una aireación y agitación máximas, simulando la saturación máxima del oxígeno ("100 % de oxígeno") . Para el resto de la fermentación, la sonda continuará enviando una señal de 4-20 mA que indica la cantidad del oxígeno en el tanque con relación al 100 % de la señal.
El controlador de la fermentación ajustará tanto la velocidad de la aireación (el aire de la instalación) como la velocidad de agitación para mantener el oxígeno disuelto al 20 % ("DO") (20 % de la señal al 100 %) . Cuando se requiere un suplemento de oxígeno, lo que indica que para lograr 20 % del oxígeno disuelto, el oxígeno puro tuvo que ser utilizado en lugar del aire de la instalación, el cual contiene 21 % de oxígeno .
Si una cepa requiere un suplemento de oxígeno, esto indica que la transferencia de la masa es pobre debido a la viscosidad elevada en las cepas. Como evidencia de las mejoras en las características de transferencia de la masa en las cepas de viscosidad baja, la Tabla 1 muestra que las cepas de viscosidad elevada requirieron consistentemente un suplemento de oxígeno para mantener el nivel del oxígeno disuelto deseado del 20 %. Los mutantes de viscosidad baja de MK29404 no requirieron consistentemente un suplemento de oxígeno. Aunque muchos de los mutantes de viscosidad baja de MK29794 todavía requirieron un suplemento de oxígeno, existieron mutantes encontrados que no lo hicieron, tales como el imitante MK29794 KSeco.
Ejemplo 7: Requerimientos de Energía de Agitación Las cepas con viscosidad elevada requieren entradas de potencia más elevada para el motor del agitador y las bombas de aireación. La potencia por volumen (P/V) se calcula como sigue: Para las condiciones de transferencia de oxígeno bajas, el P/V fue medido para lograr una kla de 0.041 seg-1 (y un promedio asociado OUR de 45 mmol/l/h) . Para las condiciones de transferencia del oxígeno elevadas, el P/V fue medido para lograr una kla de 0.100 seg-1 (y un promedio asociado OUR de 100 mmol/l/h) . El requerimiento de potencia por volumen fue medido y correlacionado con las viscosidades del caldo, como se muestra en la Tabla 2. Esos valores fueron utilizados para generar las gráficas como se muestran en las figuras 1 y 2, las cuales ilustran el efecto dramático de la viscosidad sobre los requerimientos de agitación del caldo de la fermentación.
Tabla 2 : Requerimientos incrementados de potencia por volumen (P/V) cuando se incrementa la viscosidad Ejemplo 8: Aislamiento y Cuantificación del Polisacárido Exocelular Para investigar la fuente de la viscosidad reducida, el polisacárido exocelular producido por 29404 Seco-1 fue aislado y analizado. El polisacárido producido por la cepa del tipo silvestre (WT) de MK29404 también fue analizado para determinar las diferencias, si existe alguna. El polisacárido fue aislado después de que estas cepas se hicieron crecer bajo condiciones de fermentación de volumen elevado (10 1) convencional, así como el crecimiento en recipientes agitadores de volumen bajo (250 mi) .
Para el experimento de fermentación a volumen elevado, las cepas se hicieron crecer en un termentador de 10 1 como se describió aquí. La cepa WT de MK29404 se hizo crecer utilizando un medio estándar en un recipiente de NBS11, de acuerdo con las siguientes condiciones: T154 1.0, pH 7.0, temperatura 27 °C, alimentación de NH4OH 11.8 ml/1, y alimentación del carbono de sucrosa. La cepa mutante MK29404 Seco-1 se hizo crecer en un recipiente NBS33 utilizando el Medio Definido por Raceland, que comprende 1.25 x N&P, tastona delecionada (aux. por N, P, biotina, metales, vitaminas), tiamina delecionada y vitamina B12 y la totalidad de los metales (excepto Fe, ácido cítrico, Zn) [biotina/pantotenato doble, 2.5x] , 1.2465 g/1 de ácido cítrico. Bajo las condiciones de volumen elevado, en la recolección, la viscosidad del MK29404 WT fue de 1700 cP. La viscosidad del K29404 Seco-1 fue de 8.0 cP (Tabla 1).
Para cuantificar el polisacárido , el polisacárido crudo fue sometido a aislamiento y purificación desde el sobrenadante del cultivo, de un cultivo por lotes del microorganismo. Para un protocolo más detallado, véase De Swaff et al; Miyazaki & Yamada, J" . Gen. Microbio. 95, 31-38(1976). Para aislar el polisacárido de la fermentación de volumen elevado, 15 g del caldo total fueron pesados. El caldo total fue diluido con 25 g de agua y 10 g de cloroformo, se agita giratoriamente, y se centrífuga a 4500g durante 15 min. Una alícuota de 10 mi del sobrenadante acuoso es transferida por pipeta. Se agregan 40 mi de etanol a esta alícuota para precipitar el polisacárido. El polisacárido precipitado es centrifugado a 4500 g durante 5 min. El sobrenadante es decantado, y el polisacárido permanece como pelotillas. El polisacárido es resuspendido en agua, y se repite la precipitación con etanol, seguido por las etapas de centrifugación y decantación. El polisacárido es secado gradualmente utilizando un corriente de nitrógeno. La masa neta del polisacárido crudo es medida entonces y puede ser extrapolada como es mostrado en la Tabla 3. Por ejemplo, la concentración aproximada del polisacárido total en la alícuota inicial puede ser calculada entonces por la multiplicación del factor de pureza por la masa neta del polisacárido obtenida del procedimiento de aislamiento. Los otros cálculos son entendidos fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en el arte.
En el experimento del frasco agitador de volumen bajo, las cepas imitantes tanto de MK29404 WT como del MK29404 Seco-1 se hicieron crecer con tres cuartas partes de BFGM con nitrógeno y fósforo enriquecidos. La alimentación del carbono para ambas cepas fue la sucrosa. Bajo las condiciones de crecimiento de volumen bajo, en la recolección, la viscosiad de la MK29404 WT fue de 4.11 cP, la viscosidad de la MK29404 Seco-1 fue de 1.68 cP (Tabla 3).
Tabla 3: Experimentos de cuantificación del polisacárido bajo diferentes condiciones de fermentación y de volumen La viscosidad observada de las soluciones fue graficada como una función de la concentración del polisacárido en solución. La gráfica de esta correlación es mostrada en la Figura 3. La correlación es como sigue : Viscosidad = 1.5 * e° -3C)*concentración del polisacárido Esta correlación empírica muestra que la viscosidad se incrementa exponencialmente con una concentración creciente del polisacárido. Este resultado indica que la reducción de la concentración del polisacárido reducirá exponencialmente la viscosidad de la solución, y a su vez reducirá dramáticamente la potencia por volumen requerida para suministrar oxígeno.
Para las fermentaciones a volúmenes elevados y bajos, la cepa K29404 WT produce aproximadamente al menos 4 veces la cantidad del polisacárido que la cepa mutante MK29404 Seco (volumen elevado de 10 1: 4.23 veces, volumen bajo del recipiente agitador: 4.13 veces) . (Tabla 3) . Esto sugiere que los experimentos en el frasco agitador de volumen bajo son representativos de cada producción del polisacárido de la cepa en la fermentación a volumen elevado. Por consiguiente, los frascos agitadores a volumen bajo pueden ser utilizados como un modelo exacto y eficiente para estudiar los efectos de los pol isacáridos y la viscosidad en los mutantes Secos.
Tabla 4: Resumen a % Lípidos Máx, cálculos de las relaciones Ejemplo 9: Determinación de la Composición del Polisacárido Exocelular La composición del monosacárido del polisacárido exocelular producido por MK29404 Seco-1 fue analizada. El polisacárido del tipo silvestre de MK29404 también fue evaluado para determinar si existieron algunas diferencias estructurales entre las cepas Secas y de WT.
Las cepas se hicieron crecer bajo condiciones de fermentación de volumen elevado de 10 1 y en las condiciones del recipiente agitador de volumen bajo, como se describieron anteriormente. Los polisaeáridos fueron aislados como se describió de las cepas mutantes tanto de WR como Secas bajo ambas condiciones de fermentación. Los polisaeáridos aislados fueron despolimerizados para determinar la cantidad de los componentes de monosacáridos . Esto se hizo utilizando la hidrólisis ácida del polisacárido, descrito con detalle en la Pat. U.S. No. 6,664,717; Hoebler, et al. J. Agrie. Food Chem. , 37:360-367 (1989), la cual es incorporada para referencia.
Brevemente, una muestra pequeña del polisacárido crudo es colocada en un tubo para máquina centrífuga. 5 mi del HC1 2 N son distribuidos en el tubo con la muestra y se colocan en un baño de agua a 60 grados Celsius, debido a que la muestra no se disuelve a temperatura ambiente. La muestra se agita giratoriamente de manera frecuente en el baño de agua caliente hasta que la muestra se ha disuelto completamente. Una vez disuelta, la solución de la muestra es incubada a 60 grados Celsius durante al menos 2 horas. Después de 2 horas, la muestra es removida del baño de agua y se dejó enfriar a temperatura ambiente, y se diluye cuando sea necesario. La cromatografía de intercambio iónico (IEC) es utilizada entonces para analizar la muestra utilizando una columna Carbopac SA10. Los cromatogramas de IEC para el polisacárido de MK29404 WT despolimerizado son mostrados en la figura 4. Los cromatogramas de IEC para el polisacárido mutante MK29404 Seco-1 despolimerizado son mostrados en la Figura 5. Como se puede observar, los cromatogramas de IEC tienen diferentes tipos de retención, sugiriendo una diferencia en la composición del monosacárido de los polisacáridos producidos por cada cepa.
La composición estequiométrica de cada muestra de polisacárido despolimerizada puede ser cuantificada entonces utilizando los estándares apropiados. Véase por ejemplo Dubois, M . , et al., Anal. Chem. 28:350-356 (1956), y la Pat . U.S. No. 5,512,488. Brevemente, el polisacárido crudo es pesado y diluido con agua desionizada hasta que se complementa la disolución. Se transfieren 0.5 mi del polisacárido crudo a un tubo que contiene 0.5 mi de una solución de fenol al 0.4 % (p/v) y se agita giratoriamente. Luego se agregan 2.5 mi de la solución del ácido sulfúrico concentrado y se agita giratoriamente. Luego se deja que se enfríe la solución a temperatura ambiente, y se mide la absorbancia a 490 nm. Esta absorbancia se correlaciona con el color del polisacárido. La muestra es diluida entonces cuando sea necesaria, y se prepara un estándar de la solución en almacenamiento utilizando las mismas proporciones estequiométricas de los monosacáridos como se encontraron en la muestra. La concentración del polisacárido total aproximada en la alícuota inicial puede ser calculada multiplicando el factor de la pureza por la masa neta del polisacárido obtenida del procedimiento de aislamiento.
Los resultados para la fermentación de 10 1 son mostrados en la Tabla 5. La composición del monosacárido de los polisacáridos para las fermentaciones en un frasco agitador de volumen bajo son mostradas en la Tabla 6. La identificación de los polisacáridos específicos no es posible de los datos.
Tabla 5: Composición del monosacárido después de la hidrólisis ácida de las cepas que crecieron en los fermentadores de 10 1 Tabla 6 : Composición del monosacárido después de la hidról ácida de las cepas que crecieron en los frascos agitadores Tabla 6 (Cont . ) Ejemplo 10: Cromatografía por Exclusión de Tamaño de Polisacáridos Aislados Los polisacáridos aislados producidos por MK29404 Seco-1 y MK29404 WT fueron analizados por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) . La SEC de los polisacáridos es descrita con detalle en Hoagland, et al, J. Agricultural and Food Chem. 41(8) : 1274-1281 (1993). Brevemente, los diversos polisacáridos producidos por cada una de las cepas se separarán de acuerdo con el peso molecular, exponiendo cualesquiera diferencias entre los polisacáridos producidos por el mutante WT contra el Seco-1.
La SEC fue corrida utilizando una columna con un límite de exclusión de 300 kD. Una lectura de SEC representativa con la superposición de los polisacáridos de MK29404 Seco-1 y WT es mostrada en la Figura 6. Las lecturas muestran que MK29404 WT contiene polisacáridos de PM más elevado (> 300 kD) en una abundancia relativamente más grande que MK29404 Seco-1.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un microorganismo oleaginoso adecuado para la producción de materiales renovables, caracterizado porque comprende una modificación genética no presente en un microorganismo no modificado, y en donde el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que tiene una viscosidad inferior que un caldo de fermentación producido por el microorganismo no modificado cuando crece en un cultivo.
2. El microorganismo oleaginoso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de menos de aproximadamente 1,100 centipoises (cP) .
3. El microorganismo oleaginoso de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de menos de aproximadamente 30 cP.
4. El microorganismo oleaginoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el microorganismo modificado comprende una morfología seca, mientras que el microorganismo no modificado no comprende una morfología seca.
5. El microorganismo oleaginoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque es un microorganismo que corresponde a uno o más del No. de Depósito del ATCC PTA-12508 (Cepa MK29404 (Secol-13J) ) , el No. de Depósito del ATCC PTA-12509 (Cepa MK29404 (Secol-182J) ) , el No. de Depósito del ATCC PTA-12510 (Cepa MK29404 (Secol-173N) ) , el No. de Depósito del ATCC PTA-12511 (Cepa MK29404 (Seco55)), el No. de Depósito del ATCC PTA-12512 (Cepa MK29404 (Seco41) ) , el No. de Depósito del ATCC PTA-12513 (Cepa MK29404 (Secol) ) , el No. de Depósito del ATCC PTA-12515 (Cepa MK29404 (Secol-147D) ) o el No. de Depósito del ATCC PTA-12516 (Cepa MK29404 (Secol-72D) ) .
6. El microorganismo oleaginoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque es el microorganismo que corresponde a uno o más del No. de Depósito del ATCC PTA-12506 (Cepa MK29794 (KSecol6-1)), el No. de Depósito del ATCC PTA-12507 (Cepa MK29794 (KSeco7)), el No. de Depósito del ATCC PTA-12514 (Cepa MK29794 (K200Secol) ) , o el No. de Depósito del ATCC PTA-12517 (Cepa MK29794 (33 Secol)).
7. El microorganismo oleaginoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el microorganismo modificado produce un caldo de fermentación que comprende una biomasa de al menos aproximadamente 50 gramos de peso seco celular por litro y una viscosidad de al menos aproximadamente 10 veces inferior que la viscosidad de un caldo de fermentación substancialmente semejante producido por el microorganismo no modificado.
8. El microorganismo oleaginoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el microorganismo modificado y el microorganismo no modificado producen un caldo de fermentación que comprende un polisacárido exocelular.
9. El microorganismo oleaginoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el microorganismo modificado produce al menos aproximadamente 2 veces menos polisacárido exocelular por litro del caldo de fermentación que el microorganismo no modificado .
10. El microorganismo oleaginoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el microorganismo modificado tiene un peso seco como ácidos grasos de al menos aproximadamente 25 por ciento.
11. El microorganismo oleaginoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el microorganismo modificado puede ser cultivado en un caldo de fermentación que requiere menos de aproximadamente 5.96 Vatios (8.0 caballos de potencia) por 3785 1 (1000 galones) para la agitación.
12. Un caldo de fermentación, caracterizado porque es producido por el microorganismo modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
13. El caldo de fermentación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende una relación del lípido con respecto al polisacárido exocelular mayor que aproximadamente 2.
14. Un método de producción de un precursor de biodiesel, caracterizado porque comprende cultivar el microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y recolectar el caldo de fermentación producido por el microorganismo.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063532B (zh) * 2020-08-11 2022-05-24 浙江工业大学 林生地霉及其制备(s)-1-(2-三氟甲基苯基)乙醇的应用
CN114409824B (zh) * 2022-02-23 2022-11-15 皖南医学院 毛霉胞外多糖及其制备方法和应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4664717A (en) 1982-11-26 1987-05-12 Union Oil Company Of California Methods for hydrolyzing polysaccharides and compositions useful therein
US5512488A (en) 1994-05-05 1996-04-30 Carrington Laboratories, Inc. Colorimetric assay for bioactive polysaccharide
DE60130737T3 (de) 2000-01-28 2016-01-14 Dsm Ip Assets B.V. Verstärkte Produktion von Lipiden enthaltend mehrfachungesättigte Fettsäuren durch hochdichte Kulturen von eukariotischen Mikroben in Gärvorrichtungen
EP2505651A3 (en) * 2006-12-10 2013-01-09 Dyadic International, Inc. Isolated fungus with reduced protease activity
US20090061493A1 (en) * 2007-06-01 2009-03-05 Solazyme, Inc. Lipid Pathway Modification in Oil-Bearing Microorganisms
WO2009059254A2 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Gevo, Inc Methods for the economical production of biofuel precursor that is also a biofuel from biomass
EP2358864B8 (en) * 2008-10-23 2017-09-13 Lumen Bioscience, Inc. Modified photosynthetic microorganisms for producing triglycerides
AU2010242915A1 (en) * 2009-04-29 2011-12-15 Eudes De Crecy Adapting microorganisms for agricultural products
US8597923B2 (en) * 2009-05-06 2013-12-03 SyntheZyme, LLC Oxidation of compounds using genetically modified Candida
GB2473755B (en) * 2009-09-27 2011-09-07 Opx Biotechnologies Inc Method for producing 3-hydroxypropionic acid and other products
WO2011109548A2 (en) * 2010-03-02 2011-09-09 Massachusetts Institute Of Technology Microbial engineering for the production of fatty acids and fatty acid derivatives
CA2792494C (en) 2010-03-11 2020-09-01 Kirk E. Apt Yeast strains and their uses in the production of lipids
KR101668097B1 (ko) * 2010-03-12 2016-10-24 삼성전자주식회사 전계 효과 트랜지스터를 포함하는 반도체 소자 및 그 형성 방법
BR112012026242A2 (pt) * 2010-04-14 2019-09-24 Solazyme Inc método para produção de óleo e óleo isolado de levedura oleaginosa
US9023636B2 (en) * 2010-04-30 2015-05-05 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of propylene
BR112013003003A2 (pt) * 2010-08-06 2016-06-14 Mascoma Corp produção de produtos malonil-coa derivados através de rotas anaeróbicas
JP2013544516A (ja) * 2010-11-03 2013-12-19 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア タンパク質性バイオマスの発酵を介した組換え微生物によるバイオ燃料および化学物質の生成
US9594869B2 (en) * 2011-03-01 2017-03-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Genetically engineered microbes and uses thereof
US20140080188A1 (en) * 2011-03-09 2014-03-20 Gevo, Inc. Yeast microorganisms with reduced 2,3-butanediol accumulation for improved production of fuels, chemicals, and amino acids
AU2012229063A1 (en) * 2011-03-15 2013-09-19 The Regents Of The University Of California Mutant cells for protein secretion and lignocellulose degradation
CN109468241A (zh) * 2011-10-19 2019-03-15 麻省理工学院 工程改造的微生物及用于微生物油生产的方法
CN109266706A (zh) * 2011-12-22 2019-01-25 希乐克公司 生物质加工
EP2809790A4 (en) * 2012-02-03 2015-11-18 Matrix Genetics Llc MODIFIED PHOTOSYNTHETIC MICROORGANISMS FOR THE CONTINUOUS PRODUCTION OF CARBON-CONTAINING COMPOUNDS

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