ES2746074T3 - Aceites microbianos con puntos de fluidez reducidos, fluidos dieléctricos producidos a partir de estos y métodos relacionados - Google Patents

Abstract

Un fluido dieléctrico que comprende aceite microbiano, en donde el aceite microbiano tiene un punto de fluidez de menos de -5 ° C, y en donde la composición de ácidos grasos del aceite microbiano es al menos 50% C18: 1 y menos de 10% C18: 2; en donde el fluido dieléctrico comprende menos del 2% de C18: 2; y si el fluido dieléctrico comprende el aceite microbiano mezclado con otro aceite que no es un aceite microbiano, el contenido del otro aceite en el fluido dieléctrico es inferior al 30%.

Description

DESCRIPCIÓN

Aceites microbianos con puntos de fluidez reducidos, fluidos dieléctricos producidos a partir de estos y métodos relacionados

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a un fluido dieléctrico que comprende aceite microbiano y a un componente eléctrico que comprende el fluido dieléctrico.

Antecedentes

[0002] "Combustible fósil" es una expresión general para referirse a yacimientos geológicos de materiales orgánicos combustibles enterrados, formados a partir de animales y plantas en estado de descomposición que se han convertido en petróleo bruto, carbón, gas natural o aceites densos por exposición a calor y presión en la corteza terrestre durante cientos de millones de años. Los combustibles fósiles son una fuente no renovable finita

[0003] Muchas industrias, incluidos los fabricantes de plásticos y productos químicos, dependen en gran medida de la disponibilidad de hidrocarburos como materia prima para sus procesos de fabricación.

[0004] La publicación de PCT n.o 2008/151149 describe métodos y materiales para cultivar microalgas con el fin de producir de aceite, extraer aceite microbiano y producir alimentos, aceite alimentario, combustibles y otros productos oleoquímicos a partir de aceite producido por microbios oleaginosos.

[0005] Una aplicación oleoquímica importante es la producción de fluidos dieléctricos industriales, que se emplean para el aislamiento eléctrico y el enfriamiento o la disipación de calor en transformadores y otros dispositivos eléctricos. Estos dispositivos eléctricos incluyen transformadores de potencia y distribución, disyuntores, condensadores, conmutadores, máquinas de rayos X y cables aislantes.

[0006] Desde la década de 1990 se han empleado los aceites de origen biológico, particularmente el aceite de soja con un alto contenido de ácido oleico, en transformadores sellados (remítase a Srivastava (2009) Int'l J Computer Electrical Eng, v. 1(2) pp. 212-216). Los fluidos dieléctricos de origen biológico actuales son triacilgliceroles (TAG) con un alto contenido de ácido oleico purificados y con aditivos incorporados (remítase a la patente de EE. UU. N.o 6.274.067 y las solicitudes de patente de EE. UU. con N.os 20100243969 y 20080283803). Por ejemplo, las principales ventajas del fluido dieléctrico derivado de aceite de soja con un alto contenido de ácido oleico frente al fluido dieléctrico derivado de aceite mineral son (i) un punto de combustión mayor (2x), (ii) una vida útil del transformador mayor (4-8x), y (iii) unos costos menores asociados con el saneamiento de fugas debido a la elevada biodegradabilidad de los aceites de origen biológico (>3x) y a su menor toxicidad (remítase a Schneider (2006) J Sci Food Agric, v. 86 págs.

1769-1780).

[0007] Los principales inconvenientes de los aceites de origen biológico frente a los aceites de origen mineral son la inestabilidad oxidativa de los aceites de origen biológico, unos costos mayores asociados con la adquisición de aceites de origen biológico y la transición del equipo de aceites de origen mineral a aceites de origen biológico, remítase a Schneider (2006), supra). Aunque los fluidos dieléctricos de origen biológico ocupen una porción significativa del mercado de fluidos dieléctricos, en la actualidad los fluidos dieléctricos derivados de aceite mineral dominan el mercado. Otros inconvenientes importantes son los costos de producción de estos aceites derivados de la soja y su desvío de una fuente importante de alimentos a aplicaciones no alimentarias.

RESUMEN

[0008] En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona aceites microbianos con un punto de fluidez mejorado, métodos para preparar tales aceites y productos derivados de estos. El punto de fluidez es una función de las concentraciones relativas de ácidos grasos saturados respecto a insaturados del aceite triglicérido y la longitud de la cadena de los ácidos grasos. En realizaciones de los métodos de la invención, el punto de fluidez inicial del aceite microbiano se reduce reduciendo la proporción relativa de la fracción saturada, incluidos los triglicéridos palmíticos y esteáricos conocidos como la fracción estearínica. De acuerdo con estos métodos, el aceite se fracciona para reducir la concentración de triglicéridos saturados del aceite. Esto se puede conseguir de acuerdo con realizaciones de la invención mediante el fraccionamiento en seco, un proceso ilustrativo para llevar a cabo la “winterización”. En una realización de este método, el aceite microbiano (p. ej., algáceo) primero se refina, se decolora, se desodoriza o desgoma opcionalmente para producir "aceite RBD" que se caracteriza por un punto de fluidez inicial. Posteriormente se reduce la temperatura del aceite RBD de una forma controlada hasta que se forman núcleos cristalinos y a continuación se mantiene a dicha primera temperatura de cristalización (es decir, durante varias horas) para producir cristales. Los cristales se retiran posteriormente mediante filtración para producir dos fracciones: una fase sólida que contiene parte o gran parte de la fracción estearínica y una fase líquida que contiene la mayor parte de la fracción oleínica. Esta fase líquida se caracteriza por un segundo punto de fluidez que es menor que el punto de fluidez inicial, p. ej., el segundo punto de fluidez puede estar comprendido entre aproximadamente -10 °C y aproximadamente -40 °C, y la composición de ácidos grasos de la fase líquida puede ser de al menos un 50% de C18:1 y menos de un 10% de C18:2. La fase líquida se puede someter nuevamente a fraccionamiento hasta una segunda temperatura de cristalización menor para conseguir eliminar más estearina. En realizaciones ilustrativas, la primera temperatura de cristalización está comprendida entre más de 15 °C y aproximadamente 50 °C, y la segunda temperatura de cristalización está comprendida entre aproximadamente -15 °C y aproximadamente 15 °C.

[0009] En cualquier caso, la fracción líquida purificada resultante, que es equivalente o muy similar a un aceite conocido habitualmente en la industria del aceite vegetal como superoleína, tiene unas propiedades térmicas mejores que las del aceite algáceo natural. En algunas realizaciones, las propiedades se mejoran además añadiendo un depresor del punto de fluidez químico que reduce el punto de fluidez aún más, como puede que se desee para aplicaciones específicas. El aceite microbiano proporcionado mediante este método no se puede emplear únicamente en aplicaciones alimentarias, sino también en aplicaciones industriales, tales como la producción de lubricantes, fluidos hidráulicos, aceites industriales y fluidos dieléctricos. Para las aplicaciones industriales (p. ej., fluidos dieléctricos), uno o más aditivos que se pueden añadir al aceite microbiano (además de un depresor del punto de fluidez o en vez de este) incluyen: un antioxidante, desactivador de iones metálicos, desemulsionante, aditivo antidesgaste o compuesto antihidrólisis.

[0010] En varias realizaciones, el aceite microbiano se deriva de microbios oleaginosos, tales como células microalgáceas, con perfiles lipídicos característicos (es decir, perfiles de ácidos grasos característicos), que incluyen células recombinantes que expresan genes exógenos los cuales codifican proteínas tales como una o más acil graso-ACP-tioesterasas. En realizaciones ilustrativas, el aceite microbiano se deriva de un microbio transgénico modificado genéticamente para que exprese uno o más genes exógenos, y el método incluye además cultivar el microbio hasta que este tenga al menos un 10% de aceite en peso seco y separar el aceite del microbio para producir un aceite microbiano que posteriormente se puede refinar, decolorar, desodorizar y opcionalmente desgomar, tal como se ha descrito anteriormente. También se pueden emplear otros microbios oleaginosos, incluidos levaduras, hongos y bacterias, con perfiles lipídicos similares o diferentes. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona métodos para la síntesis de lípidos y productos a base de aceite, incluidos fluidos dieléctricos, a partir de tales microbios microalgáceos y/o oleaginosos, incluidos levaduras, hongos y bacterias.

[0011] En ciertas realizaciones, la invención proporciona un producto que incluye un aceite microbiano, donde el aceite microbiano tiene un punto de fluidez comprendido entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente -40 °C, y donde la composición de ácidos grasos del aceite microbiano es de al menos aproximadamente un 50% de C18:1 y menos de aproximadamente un 10% de C18:2. En variaciones de estas realizaciones, el producto tiene un punto de fluidez comprendido entre -10 °C y aproximadamente -40 °C. El aceite microbiano en el producto puede incluir, por ejemplo, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70% o al menos aproximadamente un 80% de C18:1. En algunos casos, el aceite microbiano puede incluir menos de aproximadamente un 5% de C18:2 (p. ej., tiene al menos aproximadamente un 80% de C18:1 y menos de aproximadamente un 5% de C18:2). En realizaciones particulares, el aceite microbiano en el producto tiene un índice de yodo comprendido entre aproximadamente 25 y aproximadamente 200. En ciertas realizaciones, el aceite microbiano puede ser producido por un microbio transgénico modificado genéticamente para que exprese uno o más genes exógenos. Los microbios ilustrativos a estos efectos incluyen especies del género Prototheca o Chlorella (p. ej., Prototheca moriformis). Tales microbios se pueden modificar genéticamente para que expresen, por ejemplo, uno o más genes exógenos que codifican sacarosainvertasa y/o acil graso-ACP-tioesterasa. En realizaciones ilustrativas, se modifica genéticamente un microbio para que exprese genes exógenos que codifican dos o más acil graso-ACP-tioesterasas, o sacarosa-invertasa y una o más acil graso-ACP-tioesterasa.

[0012] En varias realizaciones, el producto incluye uno o más aditivos, tales como un antioxidante, un desactivador de iones metálicos, un inhibidor de la corrosión, un desemulsionante, un aditivo antidesgaste, un depresor del punto de fluidez o un compuesto antihidrólisis. Los productos ilustrativos incluyen un lubricante, un fluido hidráulico, un aceite industrial o un fluido dieléctrico. Los fluidos dieléctricos, en particular, pueden contener uno o más de los aditivos indicados anteriormente.

[0013] En algunos casos, el producto a base de aceite microbiano es un fluido dieléctrico. En algunas realizaciones, el aceite microbiano empleado en el fluido dieléctrico tiene uno o más de los siguientes atributos: (i) menos de 0.4 microgramos/mL de contenido total de carotenoides; (ii) menos de 0.001 microgramos/mL de licopeno; (iii) menos de 0.02 microgramos/mL de beta-caroteno; (iv) menos de 0.02 miligramos de clorofila por kilogramo de aceite; (v) 0.40­ 0.60 miligramos de gamma-tocoferol por 100 gramos de aceite; (vi) 3-9 mg de campesterol por 100 gramos de aceite; o (vii) menos de 0.5 miligramos de contenido total de tocotrienoles por gramo de aceite. En algunos casos, el fluido dieléctrico tiene una o más de una de las siguientes propiedades: viscosidad a 40 °C menor de aproximadamente 110 cSt, p. ej., en el rango de 20 a 30 cSt; (b) viscosidad a 100 °C en el rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 cSt, p. ej., 4-8 cSt; (c) un índice de viscosidad (IV, un número sin unidades) a 40 °C de al menos 35, incluidos, sin carácter limitante, un IV comprendido entre 35 y 80, un IV comprendido entre 80 y 110, un IV comprendido entre 110 y 125, un IV comprendido entre 125 y 160, y, en algunas realizaciones, un IV superior a 160; (d) un punto de fluidez (la temperatura más baja a la que fluye el líquido) comprendida entre -8 y 10 °C o inferior, incluidos, sin carácter limitante, un punto de fluidez comprendido entre -20 y -25 °C o inferior, y, en algunas realizaciones, un punto de fluidez de -30 °C o -40 °C, o inferior; (e) lubricidad equivalente a D2882 de la ASTM; (f) volatilidad baja; (g) un punto de inflamación elevado, incluido un punto de inflamación mayor o igual a 150 °C, incluido un punto de inflamación mayor o igual a 300 °C; (h) un punto de combustión mayor o igual a 150 °C (p. ej., superior a 300 °C), incluido un punto de inflamación mayor o igual a 300 °C; (i) reactividad baja, incluida la resistencia a la descomposición en presencia de ácidos y bases, buena estabilidad térmica, susceptibilidad a reaccionar con oxígeno baja y un índice de neutralización bajo (menor o igual a 0.06, por ejemplo, menor o igual a 0.03); (j) buena miscibilidad, incluida una desemulsionabilidad baja; (k) un factor de potencia a 25 °C mayor o igual a un 1%, incluidos, sin carácter limitante, menor o igual a un 0.5%, menor o igual a un 0.15%, menor o igual a un 0.1%, y, en algunas realizaciones, menor o igual a un 0.05%; (l) un factor de potencia a 100 °C menor o igual a un 1.5%, incluidos, sin carácter limitante, menor o igual a un 1%, menor o igual a un 0.3%, y, en algunas realizaciones, menor o igual a un 0.1%; (m) una rigidez dieléctrica alta; (n) un factor de disipación bajo; (o) una conductividad eléctrica baja; (p) calor específico elevado, incluidos, sin carácter limitante, un calor específico de al menos 0.39 cal/gm/°C, y, en algunas realizaciones, un calor específico de al menos 0.45 cal/gm/°C o superior; y (q) es biodegradable, es decir, se descompone en dióxido de carbono y agua en presencia de microbios, de modo que se degrade al menos un 15% o más del fluido dieléctrico en condiciones de prueba estándar en 28 días, y en algunas realizaciones, un 30% o más, o un 70% o más, o un 100% en estas condiciones.

[0014] La invención también proporciona un componente eléctrico que incluye el fluido dieléctrico descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, el componente eléctrico es un transformador.

[0015] La invención proporciona además un método para producir un producto que incluye un aceite microbiano. En ciertas realizaciones, el producto tiene un punto de fluidez comprendido entre aproximadamente -10 °C y aproximadamente -40 °C, y en este la composición de ácidos grasos del aceite microbiano es de al menos un 50% de C18:1 y menos de un 10% de C18:2. En tales realizaciones, el método incluye cultivar un microbio transgénico modificado genéticamente para que exprese uno o más genes exógenos hasta que el microbio contenga al menos un 10% de aceite en peso seco y a continuación separar el aceite del microbio. El aceite microbiano se somete posteriormente a refinación, decoloración, desodorización y opcionalmente desgomación para producir aceite RBD. El método puede incluir, opcionalmente, añadir un antioxidante, un desactivador de iones metálicos, un inhibidor de la corrosión, desemulsionante, aditivo antidesgaste, depresor del punto de fluidez o compuesto antihidrólisis al aceite RBD. Los microbios ilustrativos modificados genéticamente pueden incluir especies del género Prototheca o Chlorella (p. ej., Prototheca moriformis). Tales microbios se pueden modificar genéticamente para que expresen, por ejemplo, uno o más genes exógenos que codifican sacarosa-invertasa y/o acil graso-ACP-tioesterasa. En realizaciones ilustrativas, se modifica genéticamente un microbio para que exprese genes exógenos que codifican dos o más acil graso-ACP-tioesterasas, o sacarosa-invertasa y una o más acil graso-ACP-tioesterasa.

[0016] En una realización, la presente invención proporciona un método para preparar un fluido dieléctrico, comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) cultivar un microbio oleaginoso para proporcionar un microbio oleaginoso que contenga al menos un 10% de lípido en peso seco, (b) separar el lípido del microbio oleaginoso, y (c) someter el lípido a al menos un paso de procesamiento seleccionado entre el grupo constituido por refinación, decoloración, desodorización, desgomación y fraccionamiento mediante cristalización o fraccionamiento en seco o por winterización.

[0017] En realizaciones específicas del método, el microbio oleaginoso se selecciona del grupo constituido por microalgas, levaduras oleaginosas, hongos oleaginosos y bacterias oleaginosas. En algunos casos, el microbio oleaginoso es una bacteria oleaginosa que es Rhodococcus opacus. En algunos casos, el microbio oleaginoso es un hongo oleaginoso. En algunos casos, el hongo oleaginoso es una especie enumerada en la Tabla 3. En algunos casos, el microbio oleaginoso es una levadura oleaginosa. En algunos casos, la levadura oleaginosa es una especie enumerada en la Tabla 2. En algunos casos, el microbio oleaginoso es una microalga. En algunos casos, la microalga es una especie enumerada en la Tabla 1. En algunos casos, la microalga es del género Prototheca.

[0018] En algunas realizaciones, el fluido dieléctrico producido mediante el método tiene uno o más de los siguientes atributos: (i) 0.05-0.244 mcg/g de contenido total de carotenoides; (ii) menos de 0.003 mcg/g de licopeno; (iii) menos de 0.003 mcg/g de beta-caroteno; (iv) 0.045-0.268 mcg/g de clorofila A; (v) 38.3-164 mcg/g de gamma-tocoferol; (vi) menos de un 0.25% de brasicasterol, campesterol, estignasterol o beta-sitosterol; (vii) 249.6-325.3 mcg/g de contenido total de tocotrienoles; (viii) 0.003-0.039 mcg/g de luteína; y (ix) 60.8-261.7 mcg/g de tocoferoles. En algunas realizaciones, el fluido dieléctrico producido mediante el método tiene una propiedad seleccionada del grupo constituido por: (a) viscosidad a 40 °C menor de aproximadamente 110 cSt, p. ej., en el rango de 20 a 30 cSt; (b) viscosidad a 100 °C en el rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 cSt, p. ej., 4-8 cSt; (c) un índice de viscosidad a 40 °C de al menos 35; (d) un punto de fluidez comprendido entre -8 y -10 °C o inferior, incluido entre -15 y -25 °C o inferior; (e) lubricidad equivalente a D2882 de la ASTM; (f) un punto de inflamación mayor o igual a 150 °C; (g) un índice de neutralización menor o igual a 0.06; (h) un factor de potencia a 25 °C menor o igual a un 1%; (i) un calor específico de al menos 0.39 cal/gm/°C; y (j) biodegradabilidad, de modo que al menos un 15% o más del fluido dieléctrico se degrade en condiciones de prueba estándar en 28 días.

[0019] En algunos casos, el fluido dieléctrico se mezcla con uno o más de los siguientes aditivos: (a) un antioxidante; (b) un desactivador de iones metálicos; (c) un inhibidor de la corrosión; (d) un desemulsificante; (e) un aditivo antidesgaste; (f) un copolímero de malan-estireno; (g) un depresor del punto de fluidez, incluidos, sin carácter limitante, VISCOPLEX® 10-310 o 1-133 (Rohmax-Evonik Additives GmbH), u otros poli(acrilatos de alquilo) y poli(metilacrilatos) tales como INFINEUM® V-351 (Infineum UK limited), PMA-D110 y PMA D; o (h) una carbodiimida; o (i) ésteres sintéticos o (j) poli(alfa-olefinas) (PAO) o (k) éster de estólidos.

[0020] En algunos casos, el fluido dieléctrico comprende además al menos un 65% de C18:1. En algunos casos, el fluido dieléctrico comprende además menos de un 30% de C16:0.

[0021] En algunas realizaciones, el aceite microbiano se mezcla con otro aceite para producir el fluido dieléctrico de acuerdo con las realizaciones de la invención. En algunos casos, el otro aceite no es un aceite microbiano. En algunos casos, el otro aceite se selecciona del grupo constituido por aceite de soja, colza, canola, palma, palmiste, coco, maíz, hortalizas de desecho, árbol del sebo, oliva, girasol, semilla del algodón, grasa de pollo, sebo bovino, sebo porcino, microalgas, macroalgas, microbios, Cuphea, lino, maní, grasa blanca de calidad, manteca, Camellina sativa, grano de mostaza, anacardo, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza (lino), avellana, Euphorbia, pepita de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, tung, cacao, copra, adormidera, semillas de ricino, pecana, jojoba, nuez de macadamia, nuez de brasil, palta, levadura oleaginosa, bacterias oleaginosa, petróleo o una fracción destilada de cualquiera de los aceites precedentes.

[0022] En algunas realizaciones, el contenido del otro aceite en el fluido dieléctrico es menor de un 30%. En algunos casos, el contenido del otro aceite en el fluido dieléctrico es menor de un 20%. En algunos casos, el contenido del otro aceite en el fluido dieléctrico es menor de un 10%. En algunas realizaciones, el contenido del aceite microbiano en el fluido dieléctrico es menor de un 50%. En algunos casos, el contenido del aceite microbiano en el fluido dieléctrico es menor de un 25%. En algunos casos, el contenido del aceite microbiano en el fluido dieléctrico es menor de un 10%.

[0023] En otra realización, la presente invención proporciona un fluido dieléctrico que comprende uno o más de los siguientes aditivos: (a) un antioxidante, incluidos, sin carácter limitante, BHT y otros fenoles; (b) un desactivador de iones metálicos tales como Cu, Zn y similares, incluido, sin carácter limitante, el benzotriazol; (c) inhibidores de la corrosión, incluidos, sin carácter limitante, los ésteres de tipo sulfonato y ésteres del ácido succínico; (d) desemulsionantes; (e) aditivos antidesgaste, incluido, sin carácter limitante, el ditiofosfato de zinc; (f) aditivos para reducir el punto de fluidez, incluidos, sin carácter limitante, los copolímeros de malan-estireno y poli(alquilacrilatos), incluidos, sin carácter limitante, los polimetacrilatos; y (g) compuestos que protegen contra la hidrólisis, incluidas, sin carácter limitante, las carbodiimidas.

[0024] Estas y otras realizaciones de la invención se describen en la siguiente descripción detallada y se ejemplifican en los siguientes ejemplos. Todas o algunas de las características descritas anteriormente y en toda esta solicitud se pueden combinar en diversas realizaciones de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0025] La invención se puede comprender haciendo referencia a la siguiente descripción junto con los dibujos adjuntos que ilustran ciertas realizaciones específicas de la presente invención.

Figura 1. Perfil de enfriamiento típico para el fraccionamiento de aceite RBD (Tf = temperatura de filtración).

Figura 2. Perfil de enfriamiento típico para el fraccionamiento de oleína algácea (Tf = temperatura de filtración). Figura 3. Efecto de VPL 10-310 sobre el punto de fluidez de aceite algáceo y aceites fraccionados. “Aceite desodorizado” es aceite RBD; “oleína” es oleína # 1; “superoleína” es superoleína #1.”

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0026] La presente invención surge, en parte, del descubrimiento de que Prototheca y otros microorganismos oleaginosos tienen, en ciertas realizaciones, propiedades inesperadamente ventajosas para la producción de fluidos dieléctricos que anteriormente se basaban principalmente en aceites minerales.

[0027] La presente invención también tiene origen, en parte, en el descubrimiento de procesos de modificación de aceites microbianos para reducir su punto de fluidez. La transesterificación de lípidos proporciona ésteres de ácidos grasos de cadena larga. Otros procesos enzimáticos y químicos se pueden adaptar para obtener ácidos grasos, aldehídos, alcoholes, alcanos y alquenos. En algunas aplicaciones, se producen compuestos hidrocarbonados útiles en fluidos dieléctricos.

[0028] Esta descripción detallada de la invención se divide en secciones para mayor comodidad del lector. La sección I proporciona definiciones de las expresiones y los términos utilizados en la presente. La Sección II proporciona una descripción de condiciones de cultivo útiles en realizaciones de los métodos de la invención. La Sección III proporciona una descripción de materiales y métodos de ingeniería genética. La Sección IV proporciona una descripción de la ingeniería genética de microbios para permitir la utilización de sacarosa, con referencia específica a microalgas, tal como ejemplifica Prototheca. La Sección V proporciona una descripción de la ingeniería genética para modificar la biosíntesis de lípidos. La Sección VI describe métodos para preparar aceites microbianos de realizaciones de la invención y productos derivados de estos, tales como fluidos dieléctricos. La Sección VII describe ejemplos que ilustran las diversas realizaciones de la invención.

I. DEFINICIONES

[0029] Todas las expresiones y los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el significado que habitualmente sobreentenderá un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención, a menos que se definan de otro modo. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos y expresiones empleados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2.a ed.

1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5.a Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Los siguientes términos y expresiones, tal como se utilizan en la presente, tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique lo contrario.

[0030] La expresión "activo en microalgas" se refiere a un ácido nucleico que es funcional en microalgas. Por ejemplo, un promotor que se ha utilizado para hacer que un gen de resistencia a antibióticos confiera resistencia a antibióticos a una microalga transgénica es activo en microalgas.

[0031] La expresión "proteína portadora de acilo" o "ACP" se refiere a una proteína que se une a una cadena de acilo en crecimiento durante la síntesis de un ácido graso como un éster tiólico en el tiol distal del resto 4'-fosfopanteteína y comprende un componente del complejo de la ácido graso-sintasa.

[0032] La expresión "molécula acil-CoA" o "acil-CoA" se refiere a una molécula que comprende un resto acilo unido covalentemente a coenzima A mediante un enlace de tipo éster tiólico en el tiol distal del resto 4'-fosfopanteteína de la coenzima A.

[0033] El término "antioxidante” se refiere a una molécula que es capaz de inhibir la oxidación de otras moléculas. Es habitual añadir antioxidantes a los productos industriales. Un uso común es como estabilizantes en combustibles y lubricantes para prevenir la oxidación, y en gasolinas para prevenir la polimerización que conduce a la formación de residuos que ensucian el motor. También se usan habitualmente para prevenir la degradación oxidativa de polímeros, tales como cauchos, plásticos y adhesivos, que provoca una pérdida de resistencia y flexibilidad en estos materiales.

[0033] La expresión "compuesto antihidrólisis" se refiere a una molécula que inhibe la descomposición de un compuesto químico por reacción con agua. Las carbodiimidas, por ejemplo, se pueden emplear como compuestos antihidrólisis. Los compuestos antihidrólisis se pueden adquirir de proveedores comerciales, p. ej., SpecialChem, entre otros.

[0034] El "compuesto anti-hidrólisis" es una molécula que inhibe la descomposición de un compuesto químico por reacción con agua. Las carbodiimidas, por ejemplo, pueden emplearse como compuestos anti-hidrólisis. Los compuestos anti-hidrólisis están disponibles comercialmente, p. de SpecialChem, entre otros.

[0035] El "aditivo antidesgaste" es un aditivo para un fluido (por ejemplo, un aceite lubricante) que da como resultado una vida útil más larga de la máquina debido a una mayor resistencia al desgaste y a las marcas de los componentes. Los aditivos antidesgaste evitan el contacto directo de metal a metal entre las partes de la máquina cuando la película de aceite se descompone. Típicamente, el aditivo reacciona con el metal en la superficie de la pieza y forma una película, que puede deslizarse sobre la superficie de fricción. Los aditivos antidesgaste suelen contener compuestos de zinc y fósforo. Los ejemplos de aditivos antidesgaste incluyen ditiofosfato de zinc (ZDP), dialquil ditio fosfato de zinc (ZDDP, también actúa como inhibidor de la corrosión y antioxidante), fosfato de tricresilo (TCP, utilizado para operaciones a altas temperaturas), halocarbonos (parafinas cloradas, para operaciones de presión extrema), monooleato de glicerol, ácido esteárico (que se adhiere a las superficies mediante un proceso de adsorción reversible bajo 150 ° C, útil para condiciones de contacto leves.

[0036] La expresión “porcentaje de área” se refiere al área de picos observados utilizando métodos de detección por FAME GC/FID en los que cada ácido graso en la muestra se convierte en un éster metílico de ácido graso (FAME) antes de la detección. Por ejemplo, se observa un pico separado para un ácido graso de 14 átomos de carbono sin insaturación (C14:0) en comparación con cualquier otro ácido graso tal como C14:1. El área de pico para cada clase de FAME es directamente proporcional a su composición porcentual en la mezcla y se calcula en función de la suma de todos los picos presentes en la muestra (es decir, [área bajo un pico específico/área total de todos los picos medidos] X 100). Cuando se hace referencia a perfiles lipídicos (de ácidos grasos) de aceites y células descritos en la presente, la expresión "al menos un 4% de C8-C14" quiere decir que al menos un 4% de los ácidos grasos totales en la célula o en la composición glicerolípidica extraída tiene una longitud de cadena que incluye 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono.

[0037] El término "axénico" se refiere a un cultivo de un organismo que no está contaminado por otros organismos vivos.

[0038] El término "biodiésel" se refiere a un éster alquílico de ácido graso producido biológicamente adecuado para emplear como combustible en un motor diésel.

[0039] El término "biomasa" se refiere al material producido por el crecimiento y/o la propagación de células. La biomasa puede contener células y/o componentes intracelulares, así como también material extracelular, que incluye, sin carácter limitante, los compuestos secretados por una célula.

[0040] El término "biorreactor" se refiere a un espacio cerrado o parcialmente cerrado en el que se cultivan las células, opcionalmente en suspensión.

[0041] La expresión "voltaje de ruptura" de un fluido dieléctrico es el voltaje en el que el fluido dieléctrico pierde sus propiedades aislantes.

[0042] El término "catalizador" se refiere a un agente, tal como una molécula o complejo macromolecular, capaz de facilitar o fomentar una reacción química de un reactivo para obtener un producto sin que llegue a formar parte del producto. Un catalizador incrementa la velocidad de una reacción, después de lo cual, el catalizador puede actuar sobre otro reactivo para formar el producto. Un catalizador generalmente reduce la energía de activación global requerida para la reacción, de modo que esta se produce más rápido o a una temperatura inferior. Por lo tanto, se puede alcanzar un equilibrio de reacción más rápidamente. Los ejemplos de catalizadores incluyen enzimas, que son catalizadores biológicos; calor, que es un catalizador no biológico; y metales utilizados en procesos de refinación del petróleo fósil.

[0043] La expresión "material celulósico" es el producto de la digestión de celulosa, incluidas la glucosa y xilosa, y opcionalmente compuestos adicionales tales como disacáridos, oligosacáridos, lignina, furfurales y otros compuestos. Los ejemplos no limitantes de fuentes de material celulósico incluyen bagazos de la caña de azúcar, pulpa de la remolacha azucarera, forraje del maíz, virutas de madera, serrín y pasto varilla.

[0044] El término "cocultivo" y sus variantes, tales como "cocultivar" y "cofermentar", se refieren a la presencia de dos o más tipos de células en el mismo biorreactor. Los dos o más tipos de células pueden ser microorganismos, tales como microalgas, o pueden ser una célula microalgácea cultivada con un tipo de célula diferente. Las condiciones de cultivo pueden ser aquellas que estimulan el crecimiento y/o la propagación de tales tipos de células, o aquellas que facilitan el crecimiento y/o la proliferación de una de tales células o de un subconjunto de estas, manteniendo el crecimiento celular para el resto.

[0045] El término "cofactor" define a cualquier molécula, que no sea el sustrato, necesaria para que una enzima ejerza su actividad enzimática.

[0046] La expresión "ADN complementario" o "ADNc" se refiere a una copia de ADN de ARNm, que normalmente se obtiene mediante la transcripción inversa de ARN mensajero (ARNm) o amplificación (p. ej., mediante reacción en cadena de la polimerasa ("PCR")).

[0047] La expresión "inhibidor de la corrosión" se refiere a una molécula que, cuando se añade a un fluido, reduce la tasa de corrosión de un metal o una aleación que está en contacto con el fluido.

[0048] El término "cultivado" y sus variantes, tales como "fermentado", se refieren a la estimulación intencionada del crecimiento (aumentos del tamaño celular, contenido celular y/o actividad celular) y/o la propagación (aumentos de los números de células por mitosis) de una o más células mediante el uso de condiciones seleccionadas y/o controladas. La combinación de crecimiento y propagación se puede denominar "proliferación". Los ejemplos de condiciones seleccionadas y/o controladas incluyen el uso de un medio definido (con características conocidas tales como pH, fuerza iónica y fuente de carbono), temperatura específica, tensión de oxígeno, niveles de dióxido de carbono y crecimiento en un biorreactor. El término "cultivar" no se refiere al crecimiento ni a la propagación de microorganismos en la naturaleza o sin intervención humana; por ejemplo, el crecimiento natural de un organismo que al final se convierte en un fósil para producir petróleo bruto geológico no es un cultivo.

[0049] El término "citólisis" se refiere a la lisis de células en un entorno hipotónico. La citólisis se debe a una ósmosis excesiva o movimiento de agua hacia el interior de una célula (hiperhidratación). La célula no puede soportar la presión osmótica del agua en su interior y, por lo tanto, revienta.

[0050] Las expresiones "harina deslipidada" y "biomasa microbiana deslipidada” se refieren a una biomasa microbiana después de que se haya extraído o aislado el aceite (incluidos los lípidos) de esta, ya sea mediante una extracción mecánica (es decir, ejercida por una prensa de tornillo) o con un disolvente, o ambas. La harina deslipidada tiene una cantidad reducida de aceite/lípidos en comparación con antes de la extracción o el aislamiento de aceite/lípidos de la biomasa microbiana pero contiene algo de aceite/lípidos residuales.

[0051] El término "desmulsionante" se refiere a una molécula que descompone emulsiones (normalmente emulsiones de líquido-líquido) o evita que estas se formen. Los desemulsionantes normalmente se basan en los siguientes compuestos químicos: resinas de fenol-formaldehído catalizadas con ácido, resinas de fenol-formaldehído catalizadas con base, poliaminas, diepóxidos, polioles. Estas moléculas se suelen etoxilar (y/o propoxilar) para proporcionar el grado deseado de solubilidad en agua/aceite. La adición de óxido de etileno incrementa la solubilidad en agua, mientras que el óxido de propileno la reduce. Las formulaciones desemulsionantes comercializadas suelen ser una mezcla de dos a cuatro compuestos químicos diferentes, en uno o más disolventes portadores tales como xileno, nafta aromática pesada (HAN), isopropanol, metanol, 2-etilhexanol o diésel.

[0052] Las expresiones "dieléctrico" o "fluido dieléctrico" se refieren a un fluido que no conduce una corriente eléctrica o que tiene un nivel de conductividad muy bajo para dicha corriente en condiciones normales (o en las condiciones en las que se pretende utilizar). Los fluidos dieléctricos se emplean para el aislamiento, el enfriamiento y la lubricación eléctricos, por ejemplo, en transformadores y otros dispositivos eléctricos. Los dispositivos eléctricos que emplean fluidos dieléctricos incluyen transformadores de potencia y distribución, disyuntores, condensadores, conmutadores, máquinas de rayos X y cables aislantes.

[0053] La "rigidez dieléctrica" de un material (p. ej., aislante) es el máximo voltaje requerido para producir una ruptura dieléctrica, es decir, la falla de sus propiedades aislantes, expresada como voltios por unidad de espesor. La rigidez dieléctrica de un material se puede determinar de acuerdo con los métodos estándar, por ejemplo, los métodos de prueba D1816, D877, D3300, D117, D2413, D6180, D6181 o D1310 de la ASTM.

[0054] Las expresiones "vector de expresión" o "constructo de expresión" o "plásmido" o "constructo de ADN recombinante" se refieren a un ácido nucleico que se ha generado mediante la intervención humana, que incluye mediante métodos recombinantes o síntesis química directa, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permitan la transcripción y/o traducción de un ácido nucleico particular en una célula huésped. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o un fragmento de ácido nucleico. Habitualmente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico que se ha de transcribir unido operablemente a un promotor.

[0055] La expresión "gen exógeno" se refiere a un ácido nucleico que codifica la expresión de un ARN y/o una proteína que se ha introducido ("transformado") en una célula, y también se denomina "transgén". Una célula transformada se puede denominar célula recombinante, en la cual se pueden introducir uno o más genes exógenos adicionales. El gen exógeno puede ser de una especie diferente (y, por lo tanto, heterólogo) o de la misma especie (y, por lo tanto, homólogo) respecto a la célula que se está transformando. Por lo tanto, un gen exógeno puede incluir un gen homólogo que ocupa una posición diferente en el genoma de la célula o que está sometido a un control diferente, respecto a la copia endógena del gen. Un gen exógeno puede estar presente en más de una copia en la célula. Un gen exógeno se puede mantener en una célula como una inserción en el genoma (nuclear o plasmídico) o como una molécula episomal.

[0056] La expresión "proporcionado/a de forma exógena" se refiere a una molécula proporcionada al medio de cultivo de un cultivo celular.

[0057] La expresión "prensado con una prensa de tornillo" se refiere a un método mecánico para extraer aceite de materias primas tales como soja y colza. Una prensa de tornillo es una máquina de tornillo que prensa material a través de una cavidad cilíndrica cerrada. Las materias primas entran por un lado de la prensa y la masa prensada sale por el otro lado, mientras que el aceite se filtra entre las barras de la rejilla y se recoge. La máquina emplea fricción y presión continua por accionamiento del tornillo para mover y comprimir la materia prima. El aceite se filtra a través de aberturas pequeñas que no permiten el paso de sólidos a su través. Al prensar la materia prima, la fricción suele provocar su calentamiento.

[0058] La expresión "ácido graso" es un ácido carboxílico con una cola (cadena) alifática larga. La porción alifática del ácido graso puede estar completamente saturada (sin ningún doble enlace) o puede estar insaturada en una o más porciones diferentes de la molécula. La mayoría de los ácidos grasos de origen natural tienen una cadena con un número par de átomos de carbono, comprendido entre 4 y 28. Los ácidos grasos pueden ser componentes de triglicéridos u otros lípidos, p. ej., fosfolípidos, esfingolípidos. Los ácidos grasos se pueden caracterizar por los "números lipídicos". Los números lipídicos se expresan como C:D, donde C es el número de átomos de carbono en el ácido graso y D es el número de dobles enlaces en el ácido graso. Por consiguiente, "C18:1" se refiere a un ácido graso con 18 carbonos y 1 doble enlace, mientras que "C18:2" se refiere a un ácido graso con 18 carbonos y 2 dobles enlaces.

[0059] La expresión "acil graso-ACP-tioesterasa" se refiere a una enzima que cataliza la escisión de un ácido graso de una proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis de lípidos.

[0060] La expresión "acil graso-CoA/aldehído-reductasa" se refiere a una enzima que cataliza la reducción de una molécula acil-CoA para obtener un alcohol primario.

[0061] La expresión "acil graso-CoA-reductasa" se refiere a una enzima que cataliza la reducción de una molécula acil-CoA para obtener un aldehído.

[0062] La expresión "aldehído graso-descarbonilasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de un aldehído graso en un alcano.

[0063] La expresión "aldehído graso-reductasa" se refiere a una enzima que cataliza la reducción de un aldehído para obtener un alcohol primario.

[0064] El punto de combustión de un material es la temperatura a la que continuará quemándose durante al menos 5 segundos tras la ignición con una llama abierta. El punto de combustión se puede determinar de acuerdo con métodos estándar, por ejemplo, los métodos de prueba D92 o D1310 de la ASTM.

[0065] La expresión "punto de combustión" se refiere a la temperatura más baja a la que un material se puede vaporizar para formar una mezcla inflamable en el aire. En el punto de combustión, el material se puede inflamar pero los vapores producidos durante la ignición puede que no se produzcan a una velocidad suficiente para mantener la combustión. El punto de inflamación se puede determinar de acuerdo con métodos estándar, por ejemplo, los métodos de prueba D3278, D3828, D56 o D93 de la ASTM.

[0066] La expresión "fuente fija de carbono" se refiere a una o más moléculas que contienen carbono, habitualmente una molécula orgánica, que están presentes a temperatura y presión ambiente en forma sólida o líquida en un medio de cultivo las cuales pueden ser utilizadas por un microorganismo cultivado en él.

[0067] El término "heterotrófico", en lo que respecta a condiciones de cultivo, se refiere a cultivar en ausencia sustancial de luz, a la vez que se utiliza o metaboliza una fuente fija de carbono.

[0068] El término "homogeneizado" se refiere a biomasa que ha sido alterada físicamente.

[0069] La expresión "fluido hidráulico" se refiere al fluido que sirve como medio de transmisión de potencia en un sistema hidráulico.

[0070] La expresión "hidrocarburo" se refiere a una molécula que contiene solamente átomos de hidrógeno y carbono, donde los átomos de carbono se enlazan covalentemente para formar una estructura principal lineal, ramificada, cíclica o parcialmente cíclica a la que se unen los átomos de hidrógeno. La estructura molecular de compuestos hidrocarbonados varía de la más simple, en forma de metano (CH4), que es un constituyente del gas natural, a las muy pesadas y muy complicadas, tales como algunas moléculas, como por ejemplo, asfaltenos que se encuentran en el crudo, petróleo y asfaltos. Los hidrocarburos pueden estar en forma gaseosa, líquida o sólida, o cualquier combinación de estas formas, y pueden tener uno o más dobles o triples enlaces entre átomos de carbono adyacentes en la estructura principal. Por consiguiente, el término incluye parafina, lípidos, alquenos y alcanos lineales, ramificados, cíclicos o parcialmente cíclicos. Los ejemplos incluyen propano, butano, pentano, hexano, octano y escualeno.

[0071] La expresión "proporción de hidrógeno:carbono" se refiere a la proporción de átomos de hidrógeno frente a átomos de carbono en una molécula, basada en átomo por átomo. La proporción se puede utilizar para referirse al número de átomos de carbono e hidrógeno en una molécula hidrocarbonada. Por ejemplo, el hidrocarburo con la mayor proporción es el metano CH4 (4:1).

[0072] La expresión "fracción hidrofóbica" se refiere a la porción o fracción de un material que es más soluble en una fase hidrofóbica en comparación con una fase acuosa. Una fracción hidrofóbica es sustancialmente insoluble en agua y normalmente es apolar.

[0073] La expresión "aumento del rendimiento lipídico" se refiere a un aumento de la productividad de lípidos de un cultivo microbiano, por ejemplo, aumentando el peso seco de células por litro de cultivo, aumentando el porcentaje de células que constituyen lípidos y/o aumentando la cantidad total de lípidos por litro de volumen de cultivo por unidad de tiempo.

[0074] La expresión "promotor inducible" se refiere a un promotor que media la transcripción de un gen unido operablemente como respuesta a un estímulo particular.

[0075] La expresión "unido(s)/a(s) operablemente" se refiere a una unión funcional entre dos secuencias de ácidos nucleicos, tales como una secuencia de control (habitualmente un promotor) y la secuencia unida (habitualmente una secuencia que codifica una proteína, denominada también secuencia codificante). Un promotor está unido operablemente a un gen exógeno si puede mediar la transcripción del gen.

[0076] La expresión "in situ" se refiere a "en el lugar" o "en su posición original".

[0077] La expresión "índice de yodo" (o "número de yodo") se refiere a una medida del grado de insaturación de un aceite. Es la masa de yodo que consumen los enlaces insaturados en un aceite. Por ejemplo, un aceite con un índice de yodo de 50 es un aceite en el que 100 g de aceite consumirían 50 g de yodo. Los índices de yodo se determinan de forma rutinaria en la técnica. Los métodos estándar para determinar los índices de yodo incluyen D5768-02(2006) de la ASTM y 53241 del DIN.

[0078] La expresión "concentración limitante de un nutriente" se refiere a una concentración de un compuesto en un cultivo que limita la propagación de un organismo cultivado. La expresión "una concentración no limitante de un nutriente" se refiere a una concentración que estimula la propagación máxima durante un periodo de cultivo dado. Por lo tanto, el número de células producidas durante un periodo de cultivo dado es menor en presencia de una concentración limitante de un nutriente que cuando el nutriente no es limitante. Se dice que un nutriente está "en exceso" en un cultivo, cuando el nutriente está presente en una concentración superior a la que estimula la propagación máxima.

[0079] El término "lipasa" se refiere a una enzima hidrosoluble que cataliza la hidrólisis de enlaces de tipo éster en sustratos lipídicos insolubles en agua. Las lipasas catalizan la hidrólisis de lípidos para obtener gliceroles y ácidos grasos.

[0080] La expresión "enzima para la modificación de lípidos" se refiere a una enzima que altera la estructura covalente de un lípido. Los ejemplos de enzimas para la modificación de lípidos incluyen una lipasa, una acil graso-ACP-tioesterasa, una desaturasa, incluida una estearoil-proteína portadora de acil-desaturasa (SAD) y una acil grasodesaturasa (FAD), y una aldehído graso-descarbonilasa.

[0081] La expresión "enzima de la vía lipídica" se refiere a cualquier enzima que desempeña una función en el metabolismo de lípidos, es decir, ya sea en la síntesis, la modificación o la degradación de lípidos, y cualesquiera proteínas que modifican lípidos químicamente, así como también proteínas portadoras.

[0082] Los términos "lípido" o "lípidos" se refieren a una clase de moléculas que son solubles en disolventes apolares (tales como éter y cloroformo) y son relativa o completamente insolubles en agua. Las moléculas lipídicas tienen estas propiedades, ya que están compuestas en gran parte por largas colas hidrocarbonadas que son de naturaleza hidrófoba. Los ejemplos de lípidos incluyen ácidos grasos (saturados e insaturados); glicéridos o glicerolípidos (tales como monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos o grasas neutras, y fosfoglicéridos o glicerofosfolípidos); no glicéridos (esfingolípidos, lípidos esterólicos incluidos el colesterol y las hormonas esteroides, lípidos prenólicos incluidos los terpenoides, alcoholes grasos, ceras y policétidos); y derivados de lípidos complejos (lípidos unidos a azúcares o glucolípidos, lípidos unidos a proteínas). La expresión "grasas" se refiere a un subgrupo de lípidos denominados "triacilglicéridos".

[0083] La expresión "lubricante" se refiere a una sustancia capaz de reducir la fricción, el calor y/o el desgaste cuando se coloca como una película entre superficies sólidas.

[0084] La expresión "lisado" se refiere a una solución que contiene el contenido de células lisadas.

[0085] La expresión "lisar" o "lisis" se refiere a una disrupción de la membrana celular y opcionalmente de la pared celular de un organismo biológico o célula que es suficiente para liberar al menos parte del contenido intracelular.

[0086] La expresión "desactivador de iones metálicos", denominado también "desactivador de metales" o "agente desactivador de metales (ADM)" se refiere a un combustible y/o aditivo oleoso utilizado para estabilizar fluidos mediante la desactivación (normalmente por captura) de iones metálicos. Los iones metálicos pueden ser producidos por acción de ácidos de origen natural en el combustible y ácidos generados en lubricantes mediante procesos oxidativos con las partes metálicas de los sistemas.

[0087] El término "microalgas" se refiere a un organismo microbiano eucariota que contiene un cloroplasto o plástido y que opcionalmente es capaz de realizar la fotosíntesis, o a un organismo microbiano procariota capaz de realizar la fotosíntesis. Las microalgas incluyen fotoautótrofos obligados, que no pueden metabolizar una fuente fija de carbono como energía, así como también heterótrofos, los cuales pueden vivir únicamente a costa de una fuente fija de carbono. Las microalgas incluyen organismos unicelulares que se separan de células hermanas poco después de la división celular, tales como Chlamydomonas, así como también microbios tales como, por ejemplo, Volvox, que es un microbio fotosintético multicelular simple de dos tipos diferentes de células. Las microalgas incluyen células tales como Chlorella, Dunaliella y Prototheca. Las microalgas también incluyen otros organismos fotosintéticos microbianos que exhiben adhesión de célula-célula tales como Agmenellum, Anabaena y Pyrobotrys. El término "microalgas" también se refiere a microorganismos heterotróficos obligados que han perdido la capacidad de realizar la fotosíntesis, tales como ciertas especies de algas dinoflageladas y especies del género Prototheca.

[0088] Los términos "microorganismo" y "microbio" se refieren a organismos unicelulares microscópicos.

[0089] La expresión "coexpresado(s)/a(s) de forma natural", con respecto a dos proteínas o genes, se refiere a que las proteínas o sus genes se coexpresan de forma natural en un tejido u organismo del cual se derivan, p. ej., porque los genes que codifican las dos proteínas están controlados por una secuencia reguladora común o porque se expresan como respuesta al mismo estímulo.

[0090] El término "aceite" se refiere a cualquier aceite triacilglicérido, producido por organismos, que incluyen levaduras oleaginosas, plantas y/o animales. El término "aceite", a diferencia del término "grasa", se refiere, a menos que se indique lo contrario, a lípidos que son generalmente, pero no siempre, líquidos en condiciones normales de presión y temperatura ambiente. Por ejemplo, el término "aceite" incluye aceites vegetales o seminales derivados de plantas, incluidos sin carácter limitante un aceite derivado del aguacate, nueces de Brasil, caléndula, camelina, Camelina Sativa, canola, anacardo, ricino, manteca de cacao (conocida también como cacao, que es un aceite triacilglicérido derivado de granos de cacao que es sólido en las condiciones habituales de temperatura y presión ambiente), coco, café, copra, cilantro, maíz, semilla de algodón, Cuphea, Euphorbia,avellana, cáñamo, Jatropha, jojoba, kenaf, linaza, altramuz, nueces de macadamia, semillas de mostaza, avena, Oliva, adormidera, palma, palmiste, maní, pacana, pepitas de calabaza, colza, arroz, cártamo, sésamo, soja, girasol y árbol de Tung, así como también combinaciones de estos. La expresión "aceite microbiano" se refiere a un aceite derivado de microbio.

[0091] La expresión "levaduras oleaginosas" se refiere a levaduras que pueden acumular de forma natural más de un 20% de su peso celular seco como lípido y pertenecen al subreino Dikarya de hongos. Las levaduras oleaginosas incluyen, sin carácter limitante, organismos tales como Yarrowia lipolytica, Rhodotorula glutinis, Cryptococcus curvatus y Lipomyces starkeyi.

[0092] La expresión "choque osmótico" se refiere a la ruptura de las células en una solución tras una reducción repentina de la presión osmótica. En algunas ocasiones se induce el choque osmótico para liberar componentes celulares de dichas células en una solución.

[0093] La expresión "enzima que degrada polisacáridos" se refiere a cualquier enzima capaz de catalizar la hidrólisis o sacarificación de cualquier polisacárido. Por ejemplo, las celulasas catalizan la hidrólisis de la celulosa.

[0094] Los "polisacáridos" o "glicanos" son carbohidratos constituidos por monosacáridos unidos entre sí por enlaces glicosídicos. La celulosa es un polisacárido que forma parte de ciertas paredes celulares de plantas. La celulosa puede ser despolimerizada por enzimas para obtener monosacáridos tales como xilosa y glucosa, así como también disacáridos más grandes y oligosacáridos.

[0095] La expresión "punto de fluidez" es la temperatura más baja a la que un líquido se verterá o fluirá en un conjunto específico de condiciones. Los estándares ilustrativos del punto de fluidez incluyen D97-11, D5853-11 y D5949-10 de la ASTM, pero también se pueden emplear otros, con los que estén familiarizados los expertos en la técnica o que estos desarrollen, para determinar el punto de fluidez en relación con los métodos descritos en la presente.

[0096] Las expresiones "depresores del punto de fluidez" o "DPF" se refieren a polímeros que controlan la formación de cristales cerosos en aceites o lubricantes, lo cual hace que se reduzca el punto de fluidez y mejoren las cualidades de fluidez a temperatura baja.

[0097] El término "promotor" se refiere a una secuencia de control de un ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Un promotor, tal como se utiliza en la presente, incluye las secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción, tales como, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos represores o potenciadores distales, que pueden estar situados incluso a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción.

[0098] El término "recombinante" se refiere a una célula, ácido nucleico, proteína o vector que ha sido modificado debido a la introducción de un ácido nucleico exógeno o la alteración de un ácido nucleico nativo. De este modo, p. ej., las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresar genes nativos de forma diferente a la que esos genes son expresados por una célula no recombinante. Un "ácido nucleico recombinante" es un ácido nucleico formado originariamente in vitro, en general, mediante la manipulación de un ácido nucleico, p. ej., utilizando polimerasas y endonucleasas, o que está en una forma en la que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Los ácidos nucleicos recombinantes se pueden producir, por ejemplo, para colocar dos o más ácidos nucleicos en unión operable. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado o un vector de expresión formado in vitro, ligando moléculas de ADN que normalmente no están unidas en la naturaleza, se considerarán ambos recombinantes. Una vez se ha obtenido un ácido nucleico recombinante y se ha introducido en una célula u organismo huésped, este se puede replicar utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped; sin embargo, estos ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque se repliquen posteriormente de forma intracelular, se seguirán considerando recombinantes. De forma similar, una "proteína recombinante" es una proteína obtenida utilizando técnicas recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante.

[0099] La expresión "aceite RBD" se refiere a un aceite que ha sido sometido a refinación, decoloración o desodorización.

[0100] La expresión "diésel renovable" se refiere a una mezcla de alcanos (tal como C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 y C18:0) producidos mediante la hidrogenación y desoxigenación de lípidos.

[0101] El término "sacarificación" se refiere a un proceso de conversión de biomasa, normalmente biomasa celulósica o lignocelulósica, en azúcares monoméricos tales como glucosa y xilosa. La biomasa o material celulósico "sacarificado" o "despolimerizado" se refiere a la biomasa o material celulósico que se ha convertido en azúcares monoméricos mediante sacarificación.

[0102] El término "sonicación" se refiere a un proceso de disrupción de materiales biológicos, tales como una célula, utilizando energía de ondas sonoras.

[0103] La expresión "especies de furfural" se refiere a 2-furancarboxaldehído o a un derivado que conserva las mismas características estructurales básicas.

[0104] El término "forraje" define a las hojas y los tallos secos de un cultivo remanentes después de que el grano se ha recolectado.

[0105] La expresión "gen de utilización de sacarosa" se refiere a un gen que, cuando se expresa, aumenta la capacidad de una célula para utilizar sacarosa como fuente de energía. Las proteínas codificadas por un gen de utilización de sacarosa se denominan en la presente "enzimas de utilización de sacarosa" e incluyen transportadores de sacarosa, sacarosa-invertasas y hexocinasas tales como glucocinasas y fructocinasas.

[0106] El término "transformador" se refiere a un dispositivo que transfiere energía eléctrica de un circuito a otro a través de conductores acoplados inductivamente, normalmente las bobinas del transformador.

[0107] Las expresiones "winterizar" aceite o "winterización de aceite" se refieren a un proceso que incluye eliminar los componentes con un punto de fusión mayor de un aceite y/o añadir uno o más depresores del punto de fluidez.

II. Cultivo y condiciones de cultivo

[0108] En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere en general al cultivo de microbios oleaginosos tales como microalgas naturales y recombinantes, incluidas especies y cepas de Chlorella y Prototheca, y especies y cepas de levaduras, hongos y bacterias, para la producción de aceite microbiano (lípidos). Para mayor comodidad del lector, esta sección se subdivide en subsecciones. La subsección 1 describe especies y cepas de Prototheca, y cómo identificar nuevas especies y cepas de Prototheca y microalgas relacionadas mediante comparación de ADN genómico, así como también otras microalgas, levaduras, hongos y bacterias útiles en los métodos descritos en la presente. La subsección 2 describe biorreactores útiles para el cultivo. La subsección 3 describe medios de cultivo. La subsección 4 describe la producción de aceite (lípido) de acuerdo con métodos de cultivo descritos en la presente. La subsección 5 describe tipos de levaduras oleaginosas adecuadas para utilizar en los métodos descritos en la presente, condiciones de cultivo para generar biomasa de levadura y los perfiles lipídicos y la composición química de la biomasa preparada de acuerdo con los métodos ilustrativos descritos en la presente.

1. Especies y cepas de Prototheca y otros microbios oleaginosos

[0109] Prototheca es un microorganismo destacado para utilizar en la producción de lípidos, ya que puede producir niveles elevados de lípidos, particularmente lípidos adecuados para la producción de fluidos dieléctricos y otros lubricantes. El lípido producido por Prototheca tiene un grado de saturación mayor que los producidos por otras microalgas. Además, el lípido de Prototheca generalmente está exento de pigmento (niveles entre bajos e indetectables de clorofila y ciertos carotenoides) y, en todo caso, contiene mucho menos pigmento que los lípidos de otras microalgas. Además, las células de Prototheca recombinantes proporcionadas para utilizar en los métodos descritos en la presente se pueden emplear para producir lípido con un rendimiento y una eficacia mayores, y con costos reducidos, en comparación con la producción de lípido a partir de otros microorganismos. Las cepas y especies de Prototheca ilustrativas para utilizar en los métodos descritos en la presente incluyen Prototheca wickerhamii, Prototheca stagnora (que incluye UTEX 327), Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis (que incluye las cepas UTEX 1441, 1435) y Prototheca zopfii. Las especies del género Prototheca son heterótrofos obligados.

[0110] Las especies de Prototheca para utilizar en los métodos descritos en la presente se pueden identificar mediante la amplificación de ciertas regiones diana del genoma. Por ejemplo, la identificación de una especie o cepa específica de Prototheca se puede conseguir mediante la amplificación y secuenciación de ADN nuclear y/o cloroplástico utilizando cebadores y metodología que emplee cualquier región del genoma, por ejemplo, mediante los métodos descritos en Wu et al., Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42:115-121 Identification of Chlorella spp. isolates using ribosomal DNA sequences. Los expertos en la técnica pueden utilizar métodos muy establecidos de análisis filogenético, tales como la amplificación y secuenciación del espaciador transcrito interno ribosómico (ADNr ITS1 y ITS2), ARNr 23S, ARNr 18S y otras regiones genómicas conservadas para identificar especies, no solamente de Prototheca, sino también de otros organismos productores de hidrocarburos y lípidos con perfiles lipídicos y una capacidad de producción similares. Para consultar ejemplos de métodos de identificación y clasificación de algas remítase también a, por ejemplo, Genetics, agosto de 2005;170(4):1601-10 y RNA, abril de 2005;11(4):361-4.

[0111] Por lo tanto, se puede usar la comparación de ADN genómico para identificar las especies adecuadas de microalgas que se pueden utilizar en los métodos descritos en la presente. Se pueden amplificar regiones de ADN genómico conservado, tal como, sin carácter limitante, ADN que codifica ARNr 23S, procedentes de especies de microalgas y se pueden comparar con secuencias consenso para seleccionar especies de microalgas que estén relacionadas taxonómicamente con las microalgas preferidas utilizadas en los métodos descritos en la presente. A continuación, se muestran ejemplos de de dicha comparación de secuencias de ADN para especies del género Prototheca. La comparación de ADN genómico también puede ser útil para identificar especies de microalgas que hayan sido identificadas erróneamente en una colección de cepas. A menudo, una colección de cepas identificará especies de microalgas en función de características fenotípicas y morfológicas. El uso de estas características puede conducir a la clasificación errónea de las especies o el género de una microalga. El uso de la comparación de ADN genómico puede ser un método mejor para clasificar especies de microalgas en función de su relación filogenética.

[0112] Las microalgas ilustrativas para utilizar en los métodos descritos en la presente normalmente tienen secuencias de ADN genómico que codifican ARNr 23S con una identidad nucleotídica de al menos un 99%, al menos 95%, al menos 90% o al menos un 85% con respecto a al menos una de las secuencias enumeradas en las SEQ ID NOs: 11­ 19.

[0113] Para comparar secuencias con el fin de determinar el porcentaje de identidad nucleotídica o aminoacídica, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de prueba. Al aplicar un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se introducen en una computadora, se designan las coordenadas posteriores, si es necesario, y se designan los parámetros del programa para el algoritmo de las secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula a continuación el porcentaje de identidad secuencial para la(s) secuencia(s) de prueba en relación con la secuencia de referencia, en función de los parámetros de programa designados.

[0114] Se puede realizar un alineamiento óptimo de secuencias para compararlas, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección visual (remítase en general a Ausubel et al., supra).

[0115] Otro ejemplo de un algoritmo adecuado para determinar el porcentaje de identidad secuencial y similitud secuencial es el algoritmo de BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa para realizar análisis de BLAST es de acceso público a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (en el sitio web www.ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencias con puntaje alto (HSP, por sus siglas en inglés) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que coinciden o satisfacen un puntaje umbral de valor positivo T determinado cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina el umbral de puntaje de palabras vecinas(Altschul et al., supra.). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas con el fin de encontrar HPS más largas que las contengan. A continuación, los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la medida en que el puntaje de alineamiento acumulativo puede incrementar. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos coincidente; siempre > 0) y N (puntaje de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se emplea una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los aciertos de las palabras en cada dirección se detiene cuando: el puntaje de alineamiento acumulativo se reduce una cantidad X respecto a su máximo valor conseguido; el puntaje acumulativo se reduce hasta un valor menor o igual a cero debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos con puntaje negativo; o se llega al final de una de las secuencias. Para identificar si un ácido nucleico o polipéptido está comprendido por el alcance de la invención, los parámetros predeterminados de los programas BLAs T son adecuados. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M=5, N=-4 de una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10 y la matriz de puntaje BLOSUM62. El programa TBLATN (que emplea secuencias de proteínas para secuencias de nucleótidos) utiliza como parámetros predeterminados una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10 y una matriz de puntaje BLOSUM 62. (remítase a Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

[0116] Además de calcular el porcentaje de identidad secuencial, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias ( remítase a, p. ej., Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medición de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.1, más preferentemente menor de aproximadamente 0.01 y aún más preferentemente menor de aproximadamente 0.001.

[0117] Se pueden utilizar una amplia variedad de microbios oleaginosos además de Prototheca en los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, Chlorella, incluidas sin carácter limitante cepas de las especies prototecoides de Chlorella, es una microalga excelente para utilizar en los métodos descritos en la presente. Las consideraciones que afectan a la selección de microorganismos para utilizar en los métodos descritos en la presente, además de la producción de lípidos o hidrocarburos adecuados para producir aceites, combustibles y compuestos oleoquímicos, pueden incluir una o más de las siguientes: (1) contenido elevado de lípidos como porcentaje de peso celular; (2) crecimiento fácil; (3) modificación genética fácil; y (4) procesamiento de la biomasa fácil. En realizaciones particulares, el microorganismo natural o modificado genéticamente proporciona células con un contenido de aceite microbiano (es decir, lípidos y ácidos grasos) de al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65% o al menos un 70% o superior. Los organismos preferidos crecen (y se cultivan) de forma heterotrófica (sobre azúcares en ausencia sustancial de luz). En general, las microalgas son excelentes microbios para utilizar en los métodos descritos en la presente. Los ejemplos de microalgas que se pueden utilizar para llevar a la práctica los métodos incluyen, sin carácter limitante, las siguientes algas que se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. Ejemplos de microalgas oleaginosas.

[0118] Además de microalgas, las levaduras oleaginosas pueden acumular más de un 20% de su peso celular seco como lípidos y, por lo tanto, son útiles en los métodos descritos en la presente. En una realización de la presente invención, un microorganismo que produce un lípido o un microorganismo a partir del cual se puede extraer, recuperar u obtener aceite, es una levadura oleaginosa. Los ejemplos de levaduras oleaginosas que se pueden emplear en los métodos descritos en la presente incluyen, sin carácter limitante, las levaduras oleaginosas que se enumeran en la Tabla 2. En los siguientes ejemplos se proporcionan métodos ilustrativos para el cultivo de levaduras oleaginosas (Yarrowia lipolytica y Rhodotorula graminis) con el fin de conseguir un alto contenido de aceite.

Tabla 2. Ejemplos de levaduras oleaginosas.

[0119] En una realización de la presente invención, un microorganismo que produce un lípido o un microorganismo a partir del cual se puede extraer, recuperar u obtener un lípido, es un hongo. Los ejemplos de hongos que se pueden emplear en los métodos descritos en la presente incluyen, sin carácter limitante, los hongos que se enumeran en la Tabla 3.

Tabla 3. Ejemplos de hongos oleaginosos.

[0120] Por lo tanto, en una realización de la presente invención, el microorganismo utilizado en la producción de biomasa microbiana para utilizar en los métodos descritos en la presente es un hongo. Los ejemplos de hongos adecuados (p. ej., Mortierella alpine, Mucor circinelloides y Aspergillus ochraceus) incluyen aquellos que se ha demostrado que se pueden modificar genéticamente, tal como se describe en la bibliografía (remítase, por ejemplo, a Microbiology, julio; 153(Pt.7): 2013-25 (2007); Mol Genet Genomics, junio; 271(5): 595-602 (2004); Curr Genet, marzo; 21(3):215-23 (1992); Current Microbiology, 30(2):83-86 (1995); Sakuradani, NISR Research Grant, "Studies of Metabolic Engineering of Useful Lipid-producing Microorganisms" (2004); y PCT/JP2004/012021).

[0121] En otras realizaciones de la presente invención, un microorganismo que produce un lípido o un microorganismo a partir del cual se puede extraer, recuperar u obtener aceite, es una bacteria oleaginosa. Las bacterias oleaginosas son bacterias que pueden acumular más de un 20% de su peso celular seco como lípidos. Las especies de bacterias oleaginosas para utilizar en los métodos descritos en la presente incluyen especies del género Rhodococcus, tales como Rhodococcus opacus y Rhodococcus sp. En la técnica se conocen métodos para cultivar bacterias oleaginosas, tales como Rhodococcus opacus, (remítase a Waltermann, et al., (2000) Microbiology, 146: 1143-1149). En los siguientes ejemplos se proporcionan métodos ilustrativos para cultivar Rhodococcus opacus con el fin de conseguir un contenido elevado de aceite.

2. Biorreactor

[0122] Los microorganismos se cultivan tanto con el fin de realizar manipulaciones genéticas como para la producción de aceite microbiano (p. ej., hidrocarburos tales como lípidos, ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos). El primer tipo de cultivo se realiza a pequeña escala y al menos inicialmente en condiciones en las que el microorganismo de partida pueda crecer. El cultivo cuyo fin es la producción de hidrocarburos se realiza normalmente a gran escala (p. ej., en biorreactores de 10000 L, 40000 L, 100000 L o más grandes) en un biorreactor. Las microalgas, incluidas las especies de Prototheca, así como también el resto de microbios oleaginosos descritos en la presente, normalmente se cultivan en los métodos descritos en la presente en medios líquidos dentro de un biorreactor. Normalmente, el biorreactor no permite la entrada de cantidades sustanciales de luz o no permite que entre nada de luz. En algunas realizaciones, el paso o los pasos de cultivo completos del microbio oleaginoso, incluidas las microalgas, se realizan en ausencia sustancial de luz.

[0123] El biorreactor o termentador se utiliza para cultivar las células de microalgas durante las diferentes fases de su ciclo fisiológico. Los biorreactores ofrecen muchas ventajas para su uso en el crecimiento heterotrófico y métodos de propagación. Las microalgas y otros microbios oleaginosos descritos en la presente normalmente se fermentan en grandes cantidades en líquido tal como, por ejemplo, en cultivos en suspensión. Los biorreactores, tales como los fermentadores de acero, pueden dar cabida a volúmenes de cultivo muy grandes (en varias realizaciones de la invención se utilizan biorreactores de 40000 litros y de mayor capacidad). Los biorreactores suelen permitir también el control de las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, tensión de oxígeno y niveles de dióxido de carbono. Por ejemplo, habitualmente los biorreactores se pueden configurar, por ejemplo, utilizando puertos conectados a tubos, para permitir que los componentes gaseosos, como oxígeno o nitrógeno, sean burbujeados a través de un cultivo líquido. Otros parámetros de cultivo, tales como el pH del medio de cultivo, la identidad y la concentración de elementos traza y otros constituyentes del medio, también se pueden manipular más fácilmente utilizando un biorreactor.

[0124] Los biorreactores se pueden configurar para que los medios de cultivo fluyan a través del biorreactor durante todo el periodo de tiempo en el que las microalgas se reproducen y aumentan en número. En algunas realizaciones, por ejemplo, los medios se pueden infundir en el biorreactor después de la inoculación pero antes de que las células alcancen una densidad deseada. En otros ejemplos, un biorreactor se llena con los medios de cultivo al principio de un cultivo, y no se infunde más medio de cultivo después que el cultivo se haya inoculado. Es decir, la biomasa de microalgas (u otros microbios) se cultiva en un medio acuoso durante un período de tiempo en el que las microalgas se reproducen y aumentan en número; sin embargo, no fluye ninguna cantidad de medio de cultivo acuoso a través del biorreactor durante todo este período de tiempo. De este modo, en algunas realizaciones, el medio de cultivo acuoso no fluye a través del biorreactor después de la inoculación.

[0125] Se pueden emplear biorreactores equipados con dispositivos tales como aspas giratorias e impulsores, mecanismos de oscilación, barras de agitación, medios para la infusión de gas a presión para hacer que los cultivos de microalgas se mezclen. La mezcla puede ser continua o intermitente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, no se mantiene un régimen de flujo turbulento de entrada de gas ni la entrada de medios durante la reproducción de las microalgas, hasta que se haya conseguido un incremento deseado en el número de dichas microalgas.

[0126] Los puertos del biorreactor se pueden utilizar para introducir o extraer gases, sólidos, semisólidos y líquidos en la cámara del biorreactor que contiene las microalgas. Aunque muchos biorreactores tienen más de un puerto (por ejemplo, uno para la entrada de medios y otro para el muestreo), no es necesario que solamente una sustancia entre o salga de un puerto. Por ejemplo, un puerto se puede utilizar para hacer fluir medios de cultivo al interior del biorreactor y posteriormente se puede utilizar para el muestreo, la entrada de gases, la salida de gases u otros fines. Preferentemente, un puerto de muestreo se puede utilizar repetidamente sin alterar ni comprometer la naturaleza axénica del cultivo. Un puerto de muestreo se puede configurar con un valor u otro dispositivo que permita detener y reanudar el flujo de muestra o para proporcionar un modo de muestreo continuo. Los biorreactores normalmente tienen al menos un puerto que permite la inoculación de un cultivo, y dicho puerto también se puede utilizar con otros fines tales como la entrada de medios o gases.

[0127] Los puertos de los biorreactores permiten manipular el contenido de gas del cultivo de microalgas. A modo ilustrativo, parte del volumen de un biorreactor puede ser gas en lugar de líquido y las entradas de gas del biorreactor pueden permitir el bombeo de gases al interior del biorreactor. Los gases que se pueden bombear beneficiosamente al interior de un biorreactor incluyen aire, mezclas de aire/CO2, gases nobles, tales como el argón, y otros gases. Los biorreactores normalmente están diseñados para que el usuario pueda controlar la velocidad de entrada de un gas en el biorreactor. Como se indicó anteriormente, el aumento del flujo de gas en un biorreactor se puede usar para aumentar la mezcla del cultivo.

[0128] El aumento del flujo de gas afecta también a la turbidez del cultivo. Se puede producir turbulencia colocando un puerto de entrada de gas por debajo del nivel de los medios de cultivo acuosos para que de este modo la entrada de gas en el biorreactor produzca burbujas en la superficie del cultivo. Uno o más puertos de salida de gas permiten que el gas se escape, de este modo se evita que la presión aumente en el biorreactor. Preferentemente, un puerto de salida de gas conduce a una válvula "unidireccional" que evita la entrada de microorganismos contaminantes en el biorreactor.

3. Medios

[0129] Los medios de cultivo microalgáceos, así como también otros medios de cultivo microbianos, normalmente contienen componentes tales como una fuente de nitrógeno fijo, una fuente de carbono fijo, elementos traza, opcionalmente un tampón regulador del pH y fosfato (normalmente proporcionado como una sal de fosfato). Otros componentes pueden incluir sales tales como cloruro de sodio, en particular para las microalgas de agua de mar. Las fuentes de nitrógeno incluyen fuentes de nitrógeno orgánicas e inorgánicas, entre ellas, por ejemplo, sin carácter limitante, nitrógeno molecular, nitrato, sales de nitrato, amoníaco (puro o en forma salina, tal como (NH4)2SO4 y NH4OH), proteína, harina de soja, licor de maceración del maíz y extracto de levadura. Los ejemplos de elementos traza incluyen zinc, boro, cobalto, cobre, manganeso y molibdeno en, por ejemplo, las formas respectivas de ZnCl2, H3BO3, CoCl2'6H2O, CuCl22H2O, MnCl24H2O y (NH4)6Mo7O244H2O.

[0130] Los microorganismos útiles de acuerdo con los métodos de la presente invención se encuentran en diversos lugares y entornos en todo el mundo. Como consecuencia de su aislamiento de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, puede ser difícil predecir el medio de cultivo particular para el cultivo y la generación óptimos de constituyentes lipídicos y/o hidrocarbonados. En algunos casos, puede que no sea posible cultivar ciertas cepas de microorganismos en un medio de cultivo particular debido a la presencia de algún componente inhibitorio o a la ausencia de algún nutriente esencial requerido por la cepa particular del microorganismo.

[0131] Normalmente los medios de cultivo sólidos y líquidos se pueden adquirir de una amplia variedad de fuentes, y las instrucciones para la preparación de medios particulares que son adecuados para una amplia variedad de cepas de microorganismos se pueden encontrar en internet, por ejemplo, en www.utex.org/, un sitio mantenido por la Universidad de Texas en Austin, 1 University Station A6700, Austin, Texas, 78712-0183, para su colección de cultivos de algas (UTEX). Por ejemplo, diversos medios de agua dulce y agua salada incluyen los descritos en la publicación del PCT N.o 2008/151149, incorporada a la presente por referencia.

[0132] En un ejemplo particular, el medio Proteosa es adecuado para cultivos axénicos, y se puede preparar un volumen de 1 L del medio (pH ~ 6.8) mediante la adición de 1 g de proteosa peptona a 1 L de medio Bristol. El medio Bristol comprende NaNO3 2.94 mM, CaCl2 2H2O 0.17 mM, MgSO47H2O 0.3 mM, 0.43 mM, KH2PO4 1.29 mM y NaCl 1.43 mM en una solución acuosa. Para medio agar al 1.5%, se pueden añadir 15 g de agar a 1 L de la solución. La solución se cubre y esteriliza en autoclave, y se conserva después a una temperatura refrigerada antes de usarla. Otro ejemplo es el medio de aislamiento de Prototheca (PIM, por sus siglas en inglés), que comprende 10 g/L de hidrogenoftalato de potasio (KHP), 0.9 g/L de hidróxido sódico, 0.1 g/L de sulfato de magnesio, 0.2 g/L de hidrogenofosfato de potasio, 0.3 g/L de cloruro de amonio, 10 g/L de glucosa, 0.001 g/L de clorhidrato de tiamina, 20 g/L de agar, 0.25 g/L de 5-fluorocitosina, a un pH comprendido en el rango de 5.0 a 5.2 (remítase a Pore, 1973, App. Microbiology, 26: 648-649). Otros medios adecuados para utilizar con los métodos descritos en la presente se pueden identificar fácilmente consultando la URL identificada anteriormente, o consultando otras organizaciones que mantienen los cultivos de microorganismos, tales como SAG, CCAP o CCALA. SAG se refiere a la colección de cultivos de algas en la Universidad de Gottingen (Gottingen, Alemania), CCAP se refiere a la colección de cultivos de algas y protozoos dirigida por la Asociación Escocesa de Ciencias Marinas (Escocia, Reino Unido) y CCALA se refiere a la colección de cultivos de algas en laboratorio en el Instituto de Botánica (Treboñ, República Checa). Además, la patente de EE. UU. N.o 5.900.370 describe formulaciones espacio de medios y condiciones adecuadas para la fermentación heterotrófica de especies de Prototheca.

[0133] Para que la producción sea rentable, la selección de una fuente de carbono fijo es importante, ya que el costo de la fuente de carbono fijo debe ser lo suficientemente bajo como para que la producción de aceite sea económica. Las fuentes de carbono adecuadas incluyen, por ejemplo, acetato, floridósida, fructosa, galactosa, ácido glucurónico, glucosa, glicerol, lactosa, manosa, N-acetilglucosamina, ramnosa, rafinosa, estaquiosa, sacarosa y/o xilosa. Las materias primas adecuadas útiles de acuerdo con los métodos descritos en la presente incluyen, por ejemplo, licor negro, almidón de maíz, material celulósico despolimerizado, suero lácteo, azúcar invertido (glucosa/fructosa), molasas, papa, sorgo, sacarosa, remolacha azucarera, caña de azúcar, jugo de caña espeso, arroz y trigo. Las fuentes de carbono también se pueden proporcionar como una mezcla, tal como una mezcla de sacarosa y pulpa de remolacha azucarera despolimerizada.

[0134] La fuente o las fuentes de carbono se pueden suministrar en una concentración de al menos aproximadamente 50 |jM, al menos aproximadamente 100 jiM, al menos aproximadamente 500 jiM, al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 50 mM y al menos aproximadamente 500 mM de una o más fuentes de carbono fijo proporcionadas de forma exógena. Se prefieren las fuentes de carbono muy concentradas como materia prima para la fermentación y, en varias realizaciones, la fuente de carbono se proporciona en una materia prima con una concentración que es próxima a su solubilidad máxima (es decir, en una concentración que excede un 90% de solubilidad, tal como una concentración mayor o igual a un 95%, es decir, un 99% de solubilidad).

[0135] Por ejemplo, en algunas realizaciones, se utilizan niveles de glucosa de al menos 300 g/L, al menos 400 g/L, al menos 500 g/L o al menos 600 g/L o superiores en la materia prima en un cultivo discontinuo, en el que la fuente de carbono fijo muy concentrada se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan aceite microbiano (lípido). En otras realizaciones, se utilizan niveles de sacarosa de al menos 500 g/L, al menos 600 g/L, al menos 700 g/L, al menos 800 g/L o superiores en la materia prima en un cultivo discontinuo. Los ejemplos no limitantes de fuentes de carbono de tipo sacarosa muy concentradas incluyen jugo de caña espeso, jugo de caña de azúcar, jugo de remolacha azucarera y molasas. Las fuentes de carbono de particular interés a efectos de los métodos descritos en la presente incluyen celulosa (en una forma despolimerizada), glicerol, sacarosa y sorgo, cada uno de los cuales se describe más detalladamente a continuación.

[0136] De acuerdo con los métodos descritos en la presente, los microorganismos se pueden cultivar utilizando biomasa celulósica despolimerizada como materia prima. La biomasa celulósica (p. ej., forraje, tal como el forraje del maíz) no es costosa y se puede adquirir fácilmente; sin embargo, los intentos de utilizar este material como materia prima para levaduras han fallado. En particular, se ha descubierto que tales materias primas inhiben el crecimiento de levaduras, y las levaduras no pueden utilizar los azúcares de cinco carbonos producidos a partir de materiales celulósicos (p. ej., xilosa a partir de hemicelulosa). Por el contrario, las microalgas pueden crecer en material celulósico procesado. Los materiales celulósicos generalmente incluyen aproximadamente un 40-60% de celulosa; aproximadamente un 20-40% de hemicelulosa; y un 10-30% de lignina.

[0137] Los materiales celulósicos adecuados incluyen residuos de cultivos energéticos herbáceos y leñosos, así como también cultivos agrícolas, es decir, las partes de la planta, principalmente tallos y hojas, que no se eliminaron de los campos con el alimento principal o el producto fibroso. Los ejemplos incluyen desperdicios agrícolas tales como el bagazo de la caña de azúcar, cáscaras de arroz, fibra de maíz (incluidos los tallos, hojas, cortezas y mazorcas), harina de soja, paja de trigo, paja de arroz, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, pieles de cítricos; desperdicios forestales tales como diluyentes de madera dura y blanda, y residuos de madera dura y blanda de operaciones madereras; desperdicios de madera tales como desperdicios de aserraderos (virutas de madera, aserrín) y desperdicios del molino de pulpa; desperdicios urbanos tales como fracciones de papel de los desperdicios sólidos municipales, desperdicios urbanos de madera y desperdicios urbanos verdes tales como segados de hierba municipales; y desperdicios de la construcción con madera. Los materiales celulósicos adicionales incluyen cultivos celulósicos dedicados tales como el pasto varilla, madera híbrida de álamo y Miscanthseus, caña fibrosa y sorgo fibroso. Los azúcares de cinco carbonos que se producen a partir de este tipo de materiales incluyen la xilosa.

[0138] Los materiales celulósicos se tratan para incrementar la eficiencia con la que los microbios pueden utilizar el azúcar o los azúcares contenidos en los materiales. Los métodos descritos en la presente se pueden llevar a la práctica para aprovechar nuevos métodos para el tratamiento de materiales celulósicos después de la explosión ácida de modo que los materiales sean adecuados para utilizar en un cultivo heterotrófico de microbios (p. ej., microalgas y levaduras oleaginosas). Tal como se indicó anteriormente, la biomasa lignocelulósica está compuesta por varias fracciones que incluyen celulosa, un polímero cristalino de glucosa con enlaces beta-1,4 (un azúcar de seis carbonos), hemicelulosa, un polímero asociado ligeramente compuesto principalmente por xilosa (un azúcar de cinco carbonos) y en menor medida por manosa, galactosa, arabinosa, lignina, un polímero aromático complejo compuesto por alcohol sinapílico y sus derivados, y pectinas, que son cadenas lineales de un ácido poligalacturónico con enlaces alfa-1,4. Debido a que la estructura polimérica de la celulosa y la hemicelulosa, los azúcares (p. ej., xilosa y glucosa monomérica) contenidos en estas no se encuentran en una forma que los microbios puedan utilizar de forma eficiente (metabolizados). Para tales microbios, puede ser muy útil procesar adicionalmente la biomasa celulósica para generar los azúcares monoméricos que constituyen los polímeros con el fin de garantizar que los materiales celulósicos se utilizan de forma eficiente como materia prima (fuente de carbono).

[0139] La celulosa o la biomasa celulósica se somete a un proceso, denominado "explosión", en el que la biomasa se trata con ácido sulfúrico diluido ( u otro ácido) a una temperatura y presión elevadas. Este proceso acondiciona la biomasa de modo que se pueda someter de forma eficiente a la hidrólisis enzimática de las fracciones celulósicas y hemicelulósicas para obtener monómeros de glucosa y xilosa. Los azúcares monoméricos resultantes se denominan azúcares celulósicos. Los azúcares celulósicos pueden ser utilizados posteriormente por microorganismos para producir varios metabolitos (p. ej., lípido). El paso de la explosión ácida da como resultado una hidrólisis parcial de la fracción hemicelulósica para obtener los monosacáridos constituyentes. Estos azúcares se pueden liberar completamente de la biomasa con un tratamiento posterior. En algunas realizaciones, el tratamiento posterior es un tratamiento hidrotérmico que incluye lavar el material sometido a explosión con agua caliente, la cual elimina contaminantes tales como sales. Este paso no es necesario para fermentaciones de etanol celulósico debido a las concentraciones de azúcares más diluidas utilizadas en tales procesos. En otras realizaciones, el tratamiento posterior es un tratamiento ácido adicional. En otras realizaciones más, el tratamiento posterior es la hidrólisis enzimática del material sometido a explosión. Estos tratamientos también se pueden utilizar en cualquier combinación. El tipo de tratamiento puede afectar al tipo de azúcares liberados (p. ej., azúcares de cinco carbonos frente a azúcares de seis carbonos) y a la etapa en la que se liberen en el proceso. Como consecuencia de esto, se pueden crear corrientes diferentes de azúcares, ya sean principalmente de cinco carbonos o de seis carbonos. Estas corrientes enriquecidas de cinco carbonos o de seis carbonos se pueden dirigir, por lo tanto, a microorganismos específicos con diferentes capacidades de utilización de carbono.

[0140] Los métodos descritos en la presente normalmente implican la fermentación hasta densidades celulares superiores a las que se consigan en la fermentación etanólica. Debido a las elevadas densidades de los cultivos para la producción de lípidos heterotróficos, la fuente de carbono fijo (p. ej., la corriente o las corrientes de azúcares derivados celulósicos) se encuentra preferentemente en una forma concentrada. El nivel de glucosa del material celulósico despolimerizado es preferentemente de al menos 300 g/L, al menos 400 g/L, al menos 500 g/L o al menos 600 g/l antes del paso de cultivo, que es opcionalmente un cultivo discontinuo en el que el material se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan lípido. Las corrientes de azúcares celulósicos no se utilizan en un rango próximo o igual a este rango de concentración en la producción de etanol celulósico. Por lo tanto, para generar y mantener las sumamente elevadas densidades celulares durante la producción de aceite lignocelulósico, la materia o materias primas de carbono se deben suministrar a los cultivos heterotróficos en una forma muy concentrada. Sin embargo, cualquier componente en la corriente de alimentación que no sea un sustrato para el microorganismo oleaginoso y que no sea metabolizado por este se acumulará en el biorreactor, lo cual puede dar lugar a problemas si el componente es tóxico o inhibe la producción del producto final deseado. Debido a que los subproductos de tipo lignina y derivados de la lignina, los subproductos derivados de carbohidratos, tales como furfurales e hidroximetilfurfurales, y las sales derivadas de la generación de los materiales celulósicos (tanto en el proceso de explosión como en el proceso de neutralización posterior) e incluso azúcares de pentosa/hexosa no metabolizados pueden plantear problemas en las fermentaciones etanólicas, estos efectos se amplifican significativamente en un proceso en el que su concentración en la materia prima inicial es elevada. Para conseguir concentraciones de azúcares a partir de materiales celulósicos de 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L o superiores para azúcares de seis carbonos que se puedan utilizar en la producción a gran escala de la presente invención, la concentración de estos materiales tóxicos puede ser 20 veces superior a las concentraciones que suelen estar presentes en las fermentaciones etanólicas de biomasa celulósica.

[0141] Este tratamiento del proceso de explosión del material celulósico utiliza cantidades significativas de ácido sulfúrico, calor y presión, de este modo se libera subproductos de carbohidratos, a saber furfurales e hidroximetilfurfurales. Los furfurales e hidroximetilfurfurales se producen durante la hidrólisis de hemicelulosa por deshidratación de xilosa para obtener furfural y agua. En algunas realizaciones de la presente invención, estos subproductos (p. ej., furfurales hidroximetilfurfurales) se eliminan del material lignocelulósico sacarificado antes de introducirlo en el biorreactor. En ciertas realizaciones de la presente invención, el proceso para la eliminación de los subproductos de carbohidratos es un tratamiento hidrotérmico de los materiales celulósicos sometidos a explosión. Además, en realizaciones particulares, la presente invención proporciona métodos en los que se utilizan cepas que pueden tolerar compuestos tales como furfurales o hidroximetilfurfurales para la producción. En otra realización, la presente invención también proporciona métodos para utilizar microorganismos que no solamente pueden tolerar furfurales en los medios de fermentación, sino que también pueden metabolizar estos subproductos durante la fermentación.

[0142] El proceso de explosión también genera niveles significativos de sales. Por ejemplo, las condiciones típicas para la explosión pueden dar como resultado conductividades en exceso de 5 mS/cm cuando la biomasa celulósica sometida a explosión se resuspende en una proporción 10:1 de agua:sólidos (peso seco). En ciertas realizaciones de la presente invención, la biomasa sometida a explosión diluida se somete a sacarificación enzimática, y el sobrenadante resultante se concentra con un factor de 25 para utilizarlo en el biorreactor. El nivel salino (según se mida por conductividad) en la corriente o las corrientes de azúcares concentrados puede que sea inaceptablemente elevado (de hasta 1.5 M equivalentes de Na+). Se generan a su vez sales adicionales durante la neutralización de los materiales sometidos a explosión para el proceso de sacarificación enzimática posterior. De acuerdo con los métodos descritos en la presente, estas sales se pueden eliminar de modo que la corriente o las corrientes de azúcares celulósicos concentrados resultantes se puedan utilizar en procesos heterotróficos para producir lípido. En algunas realizaciones, el método de eliminación de estas sales es desionización con resinas tales como, sin carácter limitante, DOWEX Marathon MR3. En ciertas realizaciones, el paso de desionización con resinas se lleva a cabo antes de ajustar el pH o la concentración de los azúcares y el tratamiento hidrotérmico de la biomasa antes de la sacarificación, o cualquier combinación de lo anterior; en otras realizaciones, el paso tiene lugar después de uno o más de estos procesos. En otras realizaciones, el proceso de explosión en sí se modifica para evitar de este modo que se generen sales hasta niveles inaceptablemente elevados. Por ejemplo, una alternativa adecuada a la explosión con ácido sulfúrico (u otro ácido) de la biomasa celulósica es la pulpación mecánica para que la biomasa celulósica se vuelva receptiva a la hidrólisis enzimática (sacarificación). En otras realizaciones más, se utilizan cepas nativas de microorganismos resistentes a niveles elevados de sales o cepas modificadas genéticamente con resistencia a niveles elevados de sales.

[0143] Una realización preferida para el proceso de preparación de biomasa celulósica sometida a explosión para utilizar en la producción de aceites microbianos heterotróficos utilizando microbios oleaginosos se lleva a cabo como se indica a continuación. Un primer paso comprende ajustar el pH de la biomasa celulósica sometida a explosión resuspendida al rango comprendido entre 5.0-5.3 y a continuación se lava la biomasa celulósica tres veces. Este paso de lavado se puede llevar a cabo de varias formas, incluidos el uso de resinas de intercambio iónico y desalinización, ósmosis inversa, tratamiento hidrotérmico (como el descrito anteriormente) o la resuspensión y centrifugación repetida en agua desionización. Este paso de lavado da como resultado una corriente celulósica cuya conductividad está comprendida entre 100 y 300 pS/cm y la eliminación de cantidades significativas de furfurales e hidroximetilfurfurales. El líquido decantado en este paso de lavado se puede guardar para concentrar azúcares de cinco carbonos liberados de la fracción hemicelulósica. Un segundo paso comprende la sacarificación enzimática de la biomasa celulósica lavada. En una realización, se utiliza acelerasa (Genencor). Un tercer paso comprende la recuperación de azúcares mediante centrifugación o decantación y el enjuague de la biomasa sacarificada. La biomasa resultante (sólidos) es un componente energético denso con un alto contenido de lignina que se puede utilizar como combustible o se puede enviar a desechos. Se recoge la corriente de azúcares recuperados en el proceso de centrifugación/decantación y enjuague. Un cuarto paso comprende la microfiltración para eliminar sólidos contaminantes con recuperación del permeado. Un quinto paso comprende un paso de concentración que se puede llevar a cabo utilizando un evaporador de vacío. Este paso puede incluir opcionalmente la adición de agentes antiespumantes, tales como P'2000 (Sigma/Fluka), que en ocasiones es necesaria debido al contenido proteico de la materia prima de azúcar resultante.

[0144] En otra realización de los métodos de la invención, la fuente de carbono es glicerol, incluido el subproducto de glicerol acidulado y no acidulado procedente de la transesterificación de biodiésel. En una realización, la fuente de carbono incluye glicerol y al menos una fuente de carbono diferente. En algunos casos, todo el glicerol y la fuente o las fuentes de carbono fijo diferentes se proporcionan al microorganismo al principio de la fermentación. En algunos casos, el glicerol y la fuente o las fuentes de carbono fijo diferentes se proporcionan al microorganismo simultáneamente en una proporción predeterminada. En algunos casos, el glicerol y la fuente o las fuentes de carbono fijo diferentes se proporcionan a los microbios en una tasa predeterminada durante el curso de la fermentación.

[0145] Algunas algas experimentan la división celular más rápido en presencia de glicerol que en presencia de glucosa (remítase a la publicación de PCT N.o 2008/151149). En estos casos, los procesos de cultivo en dos etapas, en los que primero se añade glicerol a las células para incrementar la densidad de células rápidamente y a continuación se añade glucosa para acumular aceite microbiano (lípidos), puede mejorar la eficacia con la que se produce el aceite. El uso del subproducto de glicerol del proceso de transesterificación proporciona ventajas económicas significativas cuando se recicla en un proceso de producción de aceite microbiano. Además se proporcionan otros métodos de alimentación, tales como los que emplea mezclas de glicerol y glucosa como fuente de carbono fijo. El uso de tales mezclas como alimentación también proporciona beneficios económicos similares. Además, en ciertas realizaciones, la inversión proporciona métodos de alimentación de microalgas con azúcares alternativos tales como sacarosa en diferentes combinaciones con glicerol.

[0146] En otra realización de los métodos de la invención, la fuente de carbono es azúcar invertido. El azúcar invertido se produce dividiendo la sacarosa en sus componentes monosacáridos: fructosa y glucosa. La producción de azúcar invertido se puede conseguir mediante varios métodos conocidos en la técnica. Uno de estos métodos consiste en calentar una solución acuosa de sacarosa. Habitualmente se emplean catalizadores para acelerar la conversión de sacarosa en azúcar invertido. Estos catalizadores pueden ser biológicos; por ejemplo, se pueden añadir enzimas tales como invertasas y sucrasas a la sacarosa para acelerar la reacción de hidrólisis con el fin de producir azúcar invertido. Un ácido es un ejemplo de un catalizador no biológico que, cuando se combina con calor, puede acelerar la reacción de hidrólisis. Una vez que se forma el azúcar invertido, este tiene una menor tendencia a cristalizar en comparación con la sacarosa y, por lo tanto, proporciona ventajas para el almacenamiento y las fermentaciones discontinuas, en las que, en el caso del cultivo heterotrófico de microbios, incluidas microalgas, se necesita una fuente de carbón concentrada. En una realización, la fuente de carbono es azúcar invertido, preferentemente en una forma concentrada (al menos 90% de su solubilidad máxima en las condiciones utilizadas, tal como se describió anteriormente), es decir, al menos 800 g/L, al menos 900 g/L, al menos 1000 g/L o al menos 1100 g/L. El azúcar invertido, preferentemente en una forma concentrada, se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan lípido.

[0147] En otra realización de los métodos de la invención, la fuente de carbono es sacarosa, incluida una materia prima compleja que contiene sacarosa, tal como el jugo de caña espeso obtenido tras procesar la caña de azúcar. Como se indicó anteriormente, debido a las elevadas densidades de los cultivos para la producción de aceites heterotróficos, la fuente de carbono fijo (p. ej., sacarosa, glucosa, etc.) está en una forma concentrada, es decir, al menos 500 g/L, al menos 600 g/L, al menos 700 g/L o al menos 800 g/L de la fuente de carbono fijo antes del paso de cultivo, que es opcionalmente un cultivo discontinuo en el que el material se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan lípidos. En algunos casos, la fuente de carbono es sacarosa en forma de jugo de caña espeso, normalmente en una forma concentrada, es decir, al menos un 60% de sólidos o aproximadamente 770 g/L de azúcar, al menos un 70% de sólidos o aproximadamente 925 g/L de azúcar, o al menos un 80% de sólidos o aproximadamente 1125 g/L de azúcar antes del paso de cultivo, que opcionalmente es un cultivo discontinuo. El jugo de caña espeso concentrado se añade a las células con el tiempo mientras las células crecen y acumulan lípido.

[0148] En una realización, el medio de cultivo incluye además al menos una enzima de utilización de sacarosa. En algunos casos, el medio de cultivo incluye una sacarosa-invertasa. En una realización, la enzima sacarosa-invertasa es una enzima sacarosa-invertasa secretable codificada por un gen de sacarosa-invertasa exógeno expresado por la población de microorganismos. Por lo tanto, en algunos casos, como se describe más detalladamente en la Sección IV, más adelante, el microbio utilizado en los métodos descritos en la presente ha sido modificado genéticamente para expresar una enzima de utilización de sacarosa, tal como un transportador de sacarosa, una sacarosa-invertasa, una hexocinasa, una glucocinasa o una frutocinasa.

[0149] Las materias primas complejas que contienen sacarosa incluyen molasas de desecho obtenidas durante el procesamiento de la caña de azúcar; el uso de este producto de desecho de escaso valor obtenido durante el procesamiento de la caña de azúcar puede proporcionar un ahorro de costos importante en la producción de hidrocarburos y otros aceites. Otra materia prima compleja que contiene sacarosa y que es útil en los métodos descritos en la presente es el sorgo, incluidos el jarabe de sorgo y el sorgo puro. El jarabe de sorgo se produce a partir del jugo de caña de sorgo dulce. Su perfil de azúcares consiste principalmente en glucosa (dextrosa), fructosa y sacarosa.

4. Producción de aceite

[0150] Para la producción de aceite (lípido) de acuerdo con los métodos descritos en la presente, es preferible cultivar las células en la oscuridad, como en el caso, por ejemplo, en el que se utilicen fermentadores de capacidad muy elevada (mayor o igual a 40000 litros) los cuales no permiten que la luz llega al cultivo. Por ejemplo, Prototheca y otras especies de microalgas se pueden cultivar y propagar para producir aceite en un medio que contenga una fuente de carbono fijo y en ausencia de luz; dicho cultivo se conoce como crecimiento heterotrófico.

[0151] A modo de ejemplo, se introduce un inóculo de células de microalgas que producen lípido en el medio; hay un período de latencia (fase de latencia) antes de que las células comiencen a propagarse. Tras el período de latencia, la velocidad de propagación aumenta constantemente y entra en la fase logarítmica o exponencial. La fase exponencial va seguida a su vez de una ralentización de la propagación debido a la disminución de nutrientes, tales como nitrógeno, el aumento de sustancias tóxicas y los mecanismos de detección de cuórum. Después de esta ralentización, la propagación se detiene y las células entran en una fase estacionaria o estado de crecimiento constante, en función del entorno particular que se proporcione a las células. Para obtener la biomasa con un contenido lipídico elevado, el cultivo se cosecha normalmente mucho después del final de la fase exponencial, la cual puede finalizar temprano al permitir que el nitrógeno u otro nutriente fundamental (que no sea carbono) se agote, lo cual obliga a las células a convertir las fuentes de carbono, presentes en exceso, en lípido. Los parámetros de las condiciones de cultivo se pueden manipular para optimizar la producción total de aceite, la combinación de ácidos grasos en el aceite producido, y/o la producción de un ácido graso específico y el lípido o los lípidos correspondientes.

[0152] Preferentemente, los microorganismos cultivados utilizando las condiciones que se describen en la presente y otras conocidas en la técnica comprenden al menos aproximadamente un 20% en peso de lípido, preferentemente al menos aproximadamente un 40% en peso, más preferentemente al menos aproximadamente un 50% en peso y aún más preferentemente al menos aproximadamente un 60% en peso. Las condiciones del proceso se pueden ajustar para incrementar el rendimiento lipídico de modo que sea adecuado para un uso particular y/o para reducir los costos de producción. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se cultiva una microalga u otro microbio oleaginoso en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes, tales como, por ejemplo, nitrógeno, fósforo o azufre, y a la vez se proporciona un exceso de una fuente de carbono fijo tal como glucosa. La limitación de nitrógeno tiende a aumentar el rendimiento lipídico microbiano en comparación con el rendimiento lipídico microbiano en un cultivo en el que se proporciona nitrógeno en exceso. En realizaciones particulares, el aumento en el rendimiento lipídico es de al menos aproximadamente: un 10%, un 50%, un 100%, un 200% o un 500%. El microbio se puede cultivar en presencia de una cantidad limitante de un nutriente durante parte del período de cultivo total o durante el período completo. En realizaciones particulares, la concentración de nutriente se alterna entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el período de cultivo total. El contenido lipídico de las células se puede incrementar continuando el cultivo durante periodos de tiempo mayores mientras se proporciona un exceso de carbono, pero limitando el nitrógeno o en ausencia de este.

[0153] En otra realización, el rendimiento lipídico se incrementa cultivando un microbio que produce lípido (p. ej., una microalga) en presencia de uno o más cofactores para una enzima de la vía lipídica (por ejemplo, una enzima sintética de ácido graso). Generalmente, la concentración del cofactor o de los cofactores es suficiente para que el rendimiento del aceite microbiano (p. ej., lípidos y ácidos grasos) sea superior al rendimiento del aceite microbiano en ausencia del cofactor o los cofactores. En una realización particular, el cofactor o los cofactores se proporcionan al cultivo mediante la inclusión en el cultivo de un microbio (p. ej., microalga) que contiene un gen exógeno que codifica el cofactor o los cofactores. Como alternativa, el cofactor o los cofactores se pueden proporcionar al cultivo mediante la inclusión de un microbio (p. ej., microalga) que contiene un gen exógeno que codifica una proteína que participa en la síntesis del cofactor. En ciertas realizaciones, los cofactores adecuados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de la vía lipídica, tal como, por ejemplo: biotina y pantotenato. Los genes que codifican cofactores adecuados para utilizar en los métodos descritos en la presente o que participan en la síntesis de tales cofactores son muy conocidos y se pueden introducir en microbios (p. ej., microalgas u otro microbio oleaginoso descrito en la presente) utilizando constructos y técnicas como los que se describen anteriormente.

[0154] Los ejemplos específicos de biorreactores, condiciones de cultivo, y métodos de propagación y crecimiento heterotrófico descritos en la presente se pueden combinar de cualquier manera que sea adecuada para mejorar los rendimientos del crecimiento microbiano y la producción de lípido y/o proteína.

[0155] Se ha generado biomasa de microalgas con un porcentaje elevado de acumulación de aceite/lípido en peso seco (remítase a la publicación de PCT N.o 2008/151149). La biomasa de microalgas generada mediante los métodos de cultivo descritos en la presente y útil de acuerdo con los métodos descritos en la presente comprende al menos un 10% de aceite microalgáceo en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al menos un 25%, al menos un 50%, al menos un 55% o al menos un 60% de aceite microalgáceo en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas contiene entre un 10 y un 90% en peso de aceite microalgáceo, entre un 25 y un 75% de aceite microalgáceo, entre un 40 y un 75% de aceite microalgáceo o entre un 50 y un 70% de aceite microalgáceo en peso seco.

[0156] El aceite microalgáceo de la biomasa descrita en la presente o extraído de la biomasa para utilizar en los métodos y las composiciones descritos en la presente puede comprender glicerolípidos con una o más cadenas laterales de éster de ácido graso diferentes. Los glicerolípidos están compuestos por una molécula de glicerol esterificada a una, dos, o tres moléculas de ácidos grasos, que pueden tener longitudes variables y grados de saturación variables. Las características referentes a la saturación y a la longitud de las moléculas de ácidos grasos (y los aceites microalgáceas que las contienen) se pueden manipular para modificar las propiedades o las proporciones de las moléculas de ácidos grasos en los aceites microalgáceos descritos en la presente diseñando las condiciones de cultivo o la vía lipídica, tal como se describe más detalladamente en la Sección V, más adelante. Por lo tanto, se pueden preparar mezclas específicas de aceite de algas (u otros microbios) ya sea dentro de una única especie de algas o mezclando la biomasa o aceite algáceo de dos o más especies de microalgas, o mezclando aceite algáceo descrito en la presente con aceites procedentes de otras fuentes tales como la soja, colza, canola, palma, palmiste, coco, maíz, hortalizas de desecho, árbol del sebo, oliva, girasol, semilla del algodón, grasa de pollo, sebo bovino, sebo porcino, microalgas, macroalgas, microbios, Cuphea, lino, maní, grasa blanca de calidad, manteca, Camellina sativa, semilla de mostaza, anacardo, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza (lino), avellana, Euphorbia, pepita de calabaza, cilantro, camelia, sésamo, cártamo, arroz, tung, cacao, copra, adormidera, semillas de ricino, pecana, jojoba, nuez de macadamia, nuez de brasil, palta, petróleo o una fracción destilada de cualquiera de los aceites precedentes.

[0157] Tal como se indicó anteriormente, la composición del aceite, es decir, las propiedades y proporciones de los constituyentes correspondientes a los ácidos grasos de los glicerolípidos, se pueden manipular también combinando biomasa o aceite de al menos dos especies de microalgas distintas. En algunas realizaciones, al menos dos de las distintas especies de microalgas tienen diferentes perfiles glicerolipídicos. Las distintas especies de microalgas se pueden cultivar juntas o por separado, tal como se describe en la presente, preferentemente en condiciones heterotróficas, para generar los respectivos aceites. Las diferentes especies de microalgas pueden contener diferentes porcentajes de distintos constituyentes correspondientes a los ácidos grasos en los glicerolípidos de la célula.

[0158] Generalmente, las cepas de Prototheca tienen perfiles lipídicos con ácidos grasos C16 y C18 como las especies predominantes. Por lo general, para la producción de fluidos dieléctricos se prefieren los ácidos grasos de cadena más larga, especialmente los ácidos grasos C16 y C18 monosaturados (es decir, C16:1 y C18:1) (remítase, por ejemplo, a la patente de EE. UU. N.o 6.274.067). Por ejemplo, Prototheca moriformis (UTEX 1435), Prototheca stagnora (Ut EX 327) y Prototheca moriformis (UTEX 1441) contienen entre un 12% y un 30% de ácidos grasos C16 y entre un 50% y un 58% de ácidos grasos C18:1. Chlorella protothecoides (UTEX 250) contiene aproximadamente un 73% de ácidos grasos C18:1 y otras cepas de Chlorella protothecoides, incluidas, sin carácter limitante, UTEX 25, UTEX 249, UTEX 256, UTEX 264, UTEX 411, CCAP 211/17, CCAP 221/8D y SAG 221 10d, pueden contener entre un 7% y un 18% de ácidos grasos C16 y entre un 55% y un 75% de ácidos grasos C18:1. En varias realizaciones, el aceite microbiano (lípido) útil en los productos descritos en la presente (tales como fluidos dieléctricos) contiene al menos aproximadamente un 50% de C18:1, p. ej., al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85% y al menos aproximadamente un 90% de C18:1. En estas u otras realizaciones, el aceite microbiano (lípido) contiene menos de aproximadamente un 10% de C18:2, p. ej., menos de aproximadamente un 7.5%, menos de aproximadamente un 5%, menos de aproximadamente un 2.5% y menos de aproximadamente un 1% de C18:2. El aceite microbiano puede contener cualquier combinación de porcentajes de C18:1 y C18:2 que ascienda a un 100% o menos. Por ejemplo, el aceite microbiano puede contener al menos un 50% de C18:1 y menos de un 10% de C18:2 o al menos un 80% de C18:1 y menos de un 5% de C18:2.

[0159] El aceite (lipido) de microalgas (u otros microbios) también puede incluir otros constituyentes producidos por las microalgas o incorporados en el aceite de microalgas a partir del medio de cultivo. Éstos otros constituyentes pueden estar presentes en diferentes cantidades dependiendo de las condiciones de cultivo, la especie, el método de extracción utilizado para recuperar el aceite de la biomasa y otros factores que puedan afectar a la composición del aceite. Los ejemplos no limitantes de tales constituyentes incluyen carotenoides, presentes en una cantidad inferior a 0.4 microgramos/mL; licopeno, presente en una cantidad inferior a 0.001 microgramos/mL; beta-caroteno, presente en una cantidad inferior a 0.02 microgramos/mL; clorofila, presente en una cantidad inferior a 0.02 miligramos por kilogramo de aceite; gamma-tocoferol, presente en una cantidad comprendida entre 0.40 y 0.60 miligramos por 100 gramos de aceite; campesterol, presente en una cantidad comprendida entre 3 y 9 miligramos por 100 gramos de aceite; y tocotrienoles, presentes en una cantidad inferior a 0.5 miligramos por gramo de aceite.

[0160] Los otros constituyentes pueden incluir, sin carácter limitante, fosfolípidos, tocoferoles, tocotrienoles, carotenoides (p. ej., alfa-caroteno, beta-caroteno, licopeno, etc.), xantófilas (p. ej., luteína, zeaxantina, alfacriptoxantina y beta-criptoxantina) y varios compuestos orgánicos o inorgánicos. En algunos casos, el aceite extraído de especies de Prototheca comprende entre 0.003 y 0.039 microgramos de luteína/gramos de aceite, menos de 0.003 microgramos de licopeno/gramos de aceite; y menos de 0.003 microgramos de beta-caroteno/gramo de aceite

5. Cepas y condiciones de cultivo de levaduras oleaginosas

[0161] La presente invención proporciona métodos para producir aceites/lípidos a partir de biomasa de levaduras oleaginosas. La invención tiene origen, en parte, en descubrimientos de que la biomasa de levadura se puede preparar con un alto contenido de aceite y el aceite extraído se puede convertir en varios productos útiles, incluidos fluidos dieléctricos y otros lubricantes. El aceite de levadura, que puede comprender una mezcla de ácidos grasos saturados de cadena entre media y larga (p. ej., ácidos grasos C16 y C18), proporciona un material de partida excelente para la preparación de productos químicos incluidos fluidos dieléctricos.

[0162] Se pueden utilizar diversas especies de levadura que produce aceites y/o lípidos adecuados de acuerdo con los métodos descritos en la presente, aunque se prefieren la levadura que produce niveles altos de aceites o lípidos adecuados de forma natural.

[0163] En realizaciones particulares, la levadura oleaginosa comprende células que contienen al menos un 20% o más de aceite triglicérido en peso seco. En otras realizaciones, la levadura oleaginosa contiene al menos un 25-35% o más de aceite triglicérido en peso seco. Generalmente, en estas realizaciones, cuanto más aceite contenga la levadura oleaginosa, más aceite se podrá extraer de la biomasa, de modo que normalmente se prefiere que la levadura oleaginosa se pueda cultivar hasta que contenga al menos un 40%, al menos un 50% o al menos un 60% o más de aceite triglicérido en peso seco. No todos los tipos de lípidos son convenientes para utilizar en productos químicos, tales como fluidos dieléctricos, ya que pueden tener una longitud de cadena o unos niveles de saturación no deseados, o estar asociados con contaminantes no deseados. Estas consideraciones también afectan a la selección de la levadura oleaginosa (o cualquier otro microbio) que se vaya a utilizar en los métodos descritos en la presente.

[0164] Las especies adecuadas de levadura oleaginosa para utilizar en los métodos descritos en la presente incluyen, sin carácter limitante, Candida apicola, Candida sp., Cryptococcus curvatus, Cryptococcus terricolus, Debaromyces hansenii, Endomycopsis vernalis, Geotrichum carabidarum, Geotrichum cucujoidarum, Geotrichum histeridarum, Geotrichum silvicola, Geotrichum vulgare, Hyphopichia burtonii, Lipomyces lipofer, Lypomyces orentalis, Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporous, Pichia mexicana, Rodosporidium sphaerocarpum, Rhodosporidium toruloides Rhodotorula aurantiaca, Rhodotorula dairenensis, Rhodotorula diffluens, Rhodotorula glutinus, Rhodotorula glutinis var. glutinis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis Rhodotorula minuta, Rhodotorula mucilaginosa,Rhodotorula mucilaginosa var. mucilaginosa, Rhodotorula terpenoidalis, Rhodotorula toruloides, Sporobolomyces alborubescens, Starmerella bombicola, Torulaspora delbruekii, Torulaspora pretoriensis, Trichosporon behrend, Trichosporon brassicae, Trichosporon domesticum, Trichosporon laibachii, Trichosporon loubieri, Trichosporon loubieri var. loubieri, Trichosporon montevideense, Trichosporon pullulans, Trichosporon sp., Wickerhamomyces Canadensis, Yarrowia lipolytica y Zygoascus meyerae.

[0165] Las especies de levadura oleaginosa para utilizar en los métodos descritos en la presente se pueden identificar por comparación de ciertas regiones diana de su genoma con esas mismas regiones de especies identificadas en la presente; las especies preferidas son aquellas que exhiben identidad o al menos un nivel muy alto de homología con las especies identificadas en la presente, y que producen cantidades similares y tipos similares de lípido en comparación con las cepas descritas específicamente en la presente. Por ejemplo, se puede conseguir identificar una especie o cepa de levadura oleaginosa específica mediante la amplificación y secuenciación de ADN genómico utilizando cebadores y metodología que emplea regiones adecuadas del genoma, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en Kurtzman y Robnett, Antonie van Leeuwenhoek 73(4): 331-371 (1998), Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Los expertos en la técnica pueden emplear métodos de análisis filogenético bien establecidos, tales como la amplificación y secuenciación de 18S y 26S nucleares, y regiones de espaciadores transcritos internos (ITS, por sus siglas en inglés) de genes de ARN ribosómico y otras regiones conservadas, para identificar las especies de levaduras oleaginosas adecuadas para utilizar en los métodos descritos en la presente.

[0166] Por lo tanto, se puede usar la comparación de ADN genómico para identificar las especies adecuadas de levaduras oleaginosas que se pueden utilizar en los métodos descritos en la presente. Se pueden amplificar regiones de ADN genómico conservadas, tales como, sin carácter limitante, secuencias genómicas conservadas entre regiones 3' de 18S fúngico y regiones 5' de genes de ARNr 26S fúngico, de especies de levaduras que pueden, por ejemplo, estar relacionadas taxonómicamente con las levaduras oleaginosas preferidas utilizadas en los métodos descritos en la presente, y se pueden comparar con las regiones correspondientes de tales especies preferidas. Las especies que presentan un nivel alto de similitud se seleccionan posteriormente para utilizarlas en los métodos descritos en la presente. El Ejemplo 6 describe la secuenciación genómica de regiones 3' de 18S fúngico y regiones 5' de ARNr 26S fúngico conservadas para 48 cepas de levaduras oleaginosas. La comparación de las secuencias para determinar el porcentaje de identidad nucleotídica o aminoacídica se puede realizar utilizando los mismos métodos se describen anteriormente para las microalgas/microorganismos.

[0167] Las levaduras oleaginosas se cultivan en medios líquidos para propagar la biomasa de acuerdo con los métodos descritos en la presente. En los métodos descritos en la presente, las especies de levaduras oleaginosas se cultivan en un medio que contiene una fuente de carbono fijo y/o una fuente de nitrógeno fijo en ausencia de luz (crecimiento heterotrófico). El crecimiento heterotrófico de levaduras oleaginosas normalmente tiene lugar en un entorno aeróbico. Por ejemplo, el crecimiento heterotrófico durante periodos de tiempo prolongados, tales como de entre 10 y 15 días o más, en condiciones de nitrógeno limitado puede dar como resultado la acumulación de un contenido bajo de lípido/aceite en las células.

[0168] Los medios de cultivo de levaduras oleaginosas normalmente contienen componentes tales como una fuente de carbono fijo (descrita anteriormente), una fuente de nitrógeno fijo (tal como proteína, harina de soja, extracto de levadura, licor de maceración del maíz, amoníaco (puro o en forma salina), nitrato o sal de nitrato), elementos traza, opcionalmente un tampón regulador del pH y fosfato (una fuente de fósforo; se pueden utilizar otras sales de fosfato).

[0169] En un ejemplo particular, un medio adecuado para el cultivo de cepas de levadura oleaginosa es el medio YPD. Este medio es adecuado para cultivos axénicos, y se puede preparar un volumen de 1 L del medio (pH ~ 6.8) mediante la adición de 10 g de bacto-levadura, 20 g de bacto-peptona y 40 g de glucosa en agua destilada. Para medio agar al 1.5%, se puede añadir 15 g de agar a 1 L de solución. La solución se cubre y esteriliza en autoclave, y se conserva después a una temperatura refrigerada antes de usarla. Se han descrito otros métodos para el crecimiento y la propagación de cepas de levaduras oleaginosas con el fin de generar altos niveles de lípidos como un porcentaje del peso seco (remítase, por ejemplo, a Li et al., Enzyme and Microbial Technology (2007) 41:312-317 (que describe el cultivo de Rhodosporidium toruloides hasta un 67.5% p/p de lípido utilizando fermentación discontinua). Las levaduras oleaginosas con un contenido de aceite/lípido elevado se pueden generar normalmente incrementando la duración de la fermentación mientras que se proporciona un exceso de fuente de carbono con limitación de nitrógeno.

[0170] Normalmente los medios de cultivo sólidos y líquidos se pueden adquirir de una amplia variedad de fuentes, y las instrucciones para la preparación de medios particulares que son adecuados para una amplia variedad de cepas de levaduras oleaginosas se pueden encontrar en internet, por ejemplo, en www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ_Medium186.pdf.

[0171] Otros medios adecuados para utilizar con los métodos descritos en la presente se pueden identificar fácilmente consultando la URL identificada anteriormente o consultando otras organizaciones que mantienen cultivos de levaduras oleaginosas tales como las colecciones de cultivos fúngicos del Centro Austriaco Mundial de Recursos Biológicos y Micología Aplicada (www.biotec.boku.ac.at/acbr.html); la colección biomédica de hongos y levaduras (bccm.belspo.be/about/ihem.php); la colección checa de microorganismos (sci.muni.cz/ccm/index.html); el Instituto Pasteur (www.pasteur.fr/ip/easysite/go/03b-000011-08h/); la colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (www.dsmz.de/); la micoteca Univesitatis Taurinenesis (web086.unito.it/cgibin/bioveg/documenti.pl/Show?_id=b522); la colección japonesa de microorganismos del Centro de Biorrecursos Riken (www.jcm.riken.jp/JCM/announce.shtml); la colección nacional de cultivos de levaduras (www.ncyc.co.uk/); ATCC (www.atcc.org/); y la colección de cultivos de levaduras Phaff (www.phaffcollection.org/).

[0172] Las levaduras oleaginosas útiles de acuerdo con los métodos descritos en la presente se encuentran en diversos lugares y entornos en todo el mundo. Como consecuencia de su aislamiento de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, puede ser difícil o imposible predecir el medio de cultivo particular para el crecimiento y la generación óptimos de aceite y/o lípido y/o proteína a partir de una especie particular de microbio cualquiera, pero los expertos en la técnica podrán encontrar fácilmente medios que sean adecuados mediante pruebas rutinarias, considerando la descripción de la presente. En algunos casos, puede que no sea posible cultivar ciertas cepas de microorganismos en un medio de cultivo particular debido a la presencia de algún componente inhibitorio o a la ausencia de algún nutriente esencial requerido por la cepa particular del microorganismo. Los siguientes ejemplos proporcionan los métodos ilustrativos para cultivar diferentes especies de levaduras oleaginosas con el fin de acumular altos niveles de lípido como un porcentaje del peso celular seco.

[0173] La fuente de carbono fijo es un componente fundamental del medio. Las fuentes de carbono fijo adecuadas para los propósitos de los métodos descritos en la presente incluyen, por ejemplo, glucosa, fructosa, sacarosa, lactosa, galactosa, xilosa, manosa, ramnosa, arabinosa, N-acetilglucosamina, glicerol, ácido glucurónico, rafinosa, estaquiosa y/o acetato. La Subsección 3 (Medios) anterior contiene una discusión más detallada sobre las fuentes de carbono adecuadas.

[0174] Las condiciones del proceso se pueden ajustar para aumentar el porcentaje en peso de células correspondiente a lípido (aceite). Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se cultiva una levadura oleaginosa en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes, tales como, por ejemplo, nitrógeno, fosfato y ciertos iones metálicos, y a la vez se proporciona un exceso de una fuente de carbono fijo tal como glucosa. La limitación de nitrógeno tiende a aumentar el rendimiento lipídico microbiano en comparación con el rendimiento lipídico microbiano en un cultivo en el que se proporciona nitrógeno en exceso. En realizaciones particulares, el aumento en el rendimiento lipídico es de al menos aproximadamente un 10%, 50%, 100%, 200% ó 500%. El microbio se puede cultivar en presencia de una cantidad limitante de un nutriente durante parte del período de cultivo total o durante el período completo. En algunas realizaciones, la concentración de nutriente se alterna entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el período de cultivo total.

[0175] En un estado de crecimiento estacionario, las células acumulan aceite (lípido) pero no experimentan división celular. En una realización de la invención, el estado de crecimiento se mantiene al continuar proporcionando todos los componentes de los medios de cultivo originales a las células, excepto una fuente de nitrógeno fijo. El cultivo de levaduras oleaginosas mediante el suministro de todos los nutrientes proporcionados inicialmente a las células, excepto una fuente de nitrógeno fijo, tal como alimentando las células durante un período de tiempo prolongado, da como resultado un porcentaje superior de lípido en peso celular seco.

[0176] En otras realizaciones, la biomasa con un alto contenido lipídico se genera suministrando una fuente de carbono fijo a las células, después que todo el nitrógeno fijo se haya consumido, durante períodos de tiempo prolongados, tales como de al menos una o dos semanas. En algunas realizaciones, se deja que las células acumulen aceite en presencia de una fuente de carbono fijo y en ausencia de una fuente de nitrógeno fijo durante más de 10 días, más de 15 días o más de 20 días. Las levaduras oleaginosas cultivadas utilizando las condiciones descritas en la presente u otras conocidas en la técnica pueden comprender al menos aproximadamente un 20% de lípido en peso seco y con frecuencia comprenden un 35%, un 45%, un 55%, un 65%, e incluso un 75% o más de lípido en peso seco. Por lo tanto, el porcentaje del peso celular seco correspondiente a lípido en la producción de lípido a partir de microbios se puede entonces mejorar manteniendo las células en un estado de crecimiento en el que consumen carbono y acumulan aceite, pero no experimentan división celular.

[0177] Las condiciones en las que el nitrógeno está en exceso tienden a aumentar el rendimiento proteico microbiano en comparación con el rendimiento de aceite microbiano en un cultivo en el que no se proporciona nitrógeno en exceso. Las fuentes de nitrógeno adecuadas para las levaduras oleaginosas pueden provenir de fuentes de nitrógeno orgánico y/o fuentes de nitrógeno inorgánico.

[0178] Los ejemplos no limitantes de fuentes de nitrógeno orgánico son extracto de levadura, peptona, licor de maceración del maíz y maíz macerado en polvo. Los ejemplos no limitantes de fuentes de nitrógeno inorgánico preferidas incluyen, por ejemplo, y sin carácter limitante, (NH4)2SO4 y NH4OH. En una realización, los medios de cultivo para llevar a la práctica la invención contienen únicamente fuentes de nitrógeno inorgánico. En otra realización, los medios de cultivo para llevar a la práctica la invención contienen únicamente fuentes de nitrógeno orgánico. En otra realización más, los medios de cultivo para llevar a la práctica la invención contienen una mezcla de fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico.

[0179] Un ejemplo de una formulación de un medio utilizada para cultivar levaduras oleaginosas incluye: 7 g/L de KH2PO4; 2 g/L de Na2HPO4; 1.5 g/L de MgSO47H2O; 1.5 g/L de extracto de levadura; 0.2 g/L de CaCl26H2O; 0.1 g/L de FeCl36H2O; 0.001 g/L de biotina y 0.001 g/L de ZnSO47H2O con un nivel de pH ajustado a 5.5 con HCL y con 12 g/L de glucosa y 30 g/L de NH4Cl como fuente de nitrógeno. Otro medio que se utiliza para cultivar levaduras oleaginosas incluye: 20 g/L de glucosa; 0.5 g/L de extracto de levadura; 5 g/L de (NH4)2SO4; y 1 g/L de KH2PO4; 0.5 g/L de MgSO47H2O. Otra formulación de un medio para el cultivo de levaduras oleaginosas en un fermentador consiste en: 30 g/L de glucosa; 20 g/L de xilosa; 2 g/L de (NH4)2SO4; 1 g/L de KH2PO4; y 0.5 g/L de MgSO47H2O.

[0180] En los métodos descritos en la presente, se emplea un biorreactor o fermentador para cultivar células de levaduras oleaginosas durante las diferentes fases de su ciclo fisiológico. A modo de ejemplo, se introduce un inóculo de células de levaduras oleaginosas que producen lípido en el medio; hay un período de latencia (fase de latencia) antes de que las células comiencen a propagarse. Tras el período de latencia, la velocidad de propagación aumenta constantemente y entra en la fase logarítmica o exponencial. La fase exponencial va seguida a su vez de una ralentización de la propagación debido a la disminución de nutrientes, tales como nitrógeno, el aumento de sustancias tóxicas y los mecanismos de detección de cuórum. Después de esta ralentización, la propagación se detiene y las células entran en una fase estacionaria o estado de crecimiento constante, en función del entorno particular que se proporcione a las células. Para obtener la biomasa con un contenido lipídico elevado, el cultivo se cosecha normalmente mucho después del final de la fase exponencial, la cual puede finalizar temprano al permitir que el nitrógeno u otro nutriente fundamental (que no sea carbono) se agote, lo cual obliga a las células a convertir las fuentes de carbono, presentes en exceso, en lípido. Los parámetros de las condiciones de cultivo se pueden manipular para optimizar la producción total de aceite, la combinación de las especies de ácidos grasos producidas y/o la producción de un aceite específico.

[0181] Para producir levaduras oleaginosas con un alto contenido lipídico, las células se fermentan preferentemente en grandes cantidades en líquido tal como, por ejemplo, en cultivos en suspensión. Los biorreactores, tales como fermentadores de acero (en varias realizaciones de la invención se utilizan volúmenes de 5000 litros, 10000 litros, 80 000 litros y volúmenes superiores), pueden dar cabida a volúmenes de cultivo muy grandes. Los biorreactores normalmente también permiten controlar las condiciones de cultivo tales como la temperatura, el pH, la tensión de oxígeno y los niveles de dióxido de carbono. Por ejemplo, habitualmente los biorreactores se pueden configurar, por ejemplo, utilizando puertos conectados a tubos, para permitir que los componentes gaseosos, como oxígeno o nitrógeno, sean burbujeados en un cultivo líquido.

[0182] Los biorreactores se pueden configurar para que los medios de cultivo fluyan a través del biorreactor durante todo el periodo de tiempo en el que las levaduras oleaginosas se reproducen y aumentan en número. En algunas realizaciones, por ejemplo, los medios se pueden infundir en el biorreactor después de la inoculación pero antes de que las células alcancen una densidad deseada. En otros ejemplos, un biorreactor se llena con los medios de cultivo al principio de un cultivo, y no se infunde más medio de cultivo después que el cultivo se haya inoculado. Es decir, la biomasa de levaduras oleaginosas se cultiva en un medio acuoso durante un período de tiempo en el que las levaduras se reproducen y aumentan en número; sin embargo, no fluye ninguna cantidad de medio de cultivo acuoso a través del biorreactor durante todo este período de tiempo. De este modo, en algunas realizaciones, el medio de cultivo acuoso no fluye a través del biorreactor después de la inoculación.

[0183] Se pueden emplear biorreactores equipados con dispositivos tales como aspas giratorias e impulsores, mecanismos de oscilación, barras de agitación, medios para la infusión de gas a presión para hacer que los cultivos de levaduras oleaginosas se mezclen. La mezcla puede ser continua o intermitente. En resumen, tal como se mencionó anteriormente, los biorreactores suelen estar equipados con diferentes puertos que permiten, por ejemplo, manipular el contenido de gas del cultivo. A modo ilustrativo, parte del volumen de un biorreactor puede ser gas en lugar de líquido y las entradas de gas del biorreactor pueden permitir el bombeo de gases al interior del biorreactor. Los gases que se pueden bombear beneficiosamente al interior de un biorreactor incluyen aire, mezclas de aire/CO2, gases nobles, tales como el argón, y otros gases. Los biorreactores normalmente están diseñados para que el usuario pueda controlar la velocidad de entrada de un gas en el biorreactor. Como se indicó anteriormente, el aumento del flujo de gas en un biorreactor se puede usar para aumentar la mezcla del cultivo.

[0184] El aumento del flujo de gas afecta también a la turbidez del cultivo. Se puede producir turbulencia colocando un puerto de entrada de gas por debajo del nivel de los medios de cultivo acuosos para que de este modo la entrada de gas en el biorreactor produzca burbujas en la superficie del cultivo. Uno o más puertos de salida de gas permiten que el gas se escape, de este modo se evita que la presión aumente en el biorreactor. Preferentemente, un puerto de salida de gas conduce a una válvula "unidireccional" que evita la entrada de microorganismos contaminantes en el biorreactor.

[0185] Los ejemplos específicos de biorreactores, condiciones de cultivo, y métodos de propagación y crecimiento heterotrófico descritos en la presente se pueden combinar de cualquier manera que sea adecuada para mejorar los rendimientos del crecimiento microbiano y la producción de lípido y/o proteína.

[0186] Los cultivos de levaduras oleaginosas generados de acuerdo con los métodos descritos anteriormente producen biomasa de levaduras oleaginosas en los medios de fermentación. Para preparar esta biomasa, así como también para preparar biomasa de microalgas o de otros microbios, con el fin de extraer aceite, la biomasa se concentra o cosecha habitualmente del medio de fermentación. En el momento de la cosecha de la biomasa de levadura oleaginosa del medio de fermentación, la biomasa comprende principalmente células intactas suspendidas en un medio de cultivo acuoso. Para concentrar la biomasa, se puede llevar a cabo un paso de deshidratación. La deshidratación o concentración se refiere a la separación de la biomasa del caldo de fermentación u otro medio líquido y, por lo tanto, se trata de una separación sólido-líquido. De este modo, durante la deshidratación, el medio de cultivo se elimina de la biomasa (por ejemplo, drenando el caldo de fermentación a través de un filtro que retiene la biomasa) o la biomasa se elimina del medio de cultivo. Los procesos comunes para la deshidratación incluyen centrifugación, filtración y el uso de presión mecánica. Estos procesos se pueden usar individualmente o en cualquier combinación.

[0187] La centrifugación implica el uso de fuerza centrífuga para separar mezclas. Durante la centrifugación, los componentes más densos de la mezcla migran lejos del eje de la centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. Al aumentar la fuerza de la gravedad efectiva (es decir, aumentando la velocidad de centrifugación), el material más denso, tal como sólidos, se separa del material menos denso, tal como líquidos, y así se separan de acuerdo con su densidad. La centrifugación de biomasa y caldo u otra solución acuosa forma una pasta concentrada que comprende las células de levadura oleaginosa. La centrifugación no elimina cantidades significativas de agua intracelular. De hecho, después de la centrifugación, podría haber todavía una cantidad considerable de humedad superficial o libre en la biomasa (por ejemplo, superior al 70%), por lo que la centrifugación no se considera un paso de secado.

[0188] También se puede utilizar filtración para la deshidratación. Un ejemplo de filtración que es adecuada para los métodos descritos en la presente es la filtración de flujo tangencial (FFT), conocida también como filtración de flujo cruzado. La filtración de flujo tangencial es una técnica de separación que emplea sistemas de membrana y fuerza de flujo para separar sólidos de líquidos. Para consultar un método de filtración adecuado ilustrativo, remítase a Geresh, Carb. Polym. 50; 183-189 (2002), que describe el uso de un filtro de fibra hueca de 0.45 uM de MaxCell A/G Technologies. Consulte además, por ejemplo, los dispositivos Pellicon® de Millipore, utilizados con membranas de 100 kD, 300 kD, 1000 kD (número de catálogo P2C01MC01), 0.1 uM (número de catálogo P2VVPPV01), 0.22 uM (número de catálogo P2GVPPV01) y 0.45 uM (número de catálogo P2HVMPV01). Preferentemente, el volumen retenido no pasa por el filtro en un nivel significativo y, preferentemente, el producto en el volumen retenido no se adhiere al material de filtro. La FFT también se puede realizar utilizando sistemas de filtración de fibra hueca. Los filtros con un tamaño de poro de al menos aproximadamente 0.1 micrómetros, por ejemplo, aproximadamente de 0.12, 0.14, 0.16, 0.18, 0.2, 0.22, 0.45 micrómetros o al menos aproximadamente 0.65 micrómetros son adecuados. Los tamaños de poro preferidos de FFT permiten que los solutos y restos celulares del caldo de fermentación atraviesen el filtro, pero no las células microbianas.

[0189] La deshidratación se puede efectuar también aplicando una presión mecánica directamente sobre la biomasa para separar el caldo de fermentación líquido de la biomasa microbiana que sea suficiente para deshidratar la biomasa, sin provocar la lisis de las células predominantes. La presión mecánica para deshidratar la biomasa microbiana se puede aplicar usando, por ejemplo, una prensa filtradora de bandas. Una prensa filtradora de bandas es un dispositivo de deshidratación que aplica presión mecánica sobre una suspensión (p. ej., la biomasa microbiana extraída directamente del fermentador o biorreactor) la cual se hace pasar entre las dos bandas tensionadas a través de un serpentín de rodillos de diámetro decreciente. De hecho, la prensa filtradora de bandas puede dividirse en tres zonas: la zona de gravedad, en la que el agua/líquido de drenaje libre se drena por acción de la gravedad a través de una banda porosa; una zona de cuña, en la que los sólidos se preparan para aplicar presión; y una zona de presión, en la que se aplica presión regulable a los sólidos drenados por gravedad.

[0190] Tras concentrar, la biomasa de levadura oleaginosa se procesa, como se describe más adelante en la presente, para prepararla con el fin de extraer el aceite.

[0191] Se ha generado biomasa de levadura oleaginosa con un porcentaje más elevado de acumulación de aceite/lípido en peso seco utilizando métodos de cultivo diferentes, incluidos los métodos conocidos en la técnica. Las levaduras oleaginosas con un porcentaje más alto de aceite/lípido acumulado son útiles en los métodos descritos en la presente. Se ha comprobado que Candida 107 es capaz de acumular hasta un 40% p/p de lípido en condiciones de nitrógeno limitante (Gill et al., Appl and Environ Microbiology (1977) págs. 231-239). Li et al. han demostrado la producción a partir de Rhodosporidium toruloids 44 de hasta un contenido lipídico de un 48% p/p en cultivos discontinuos (Li et al., Enzyme and Microbial Technology (2007) 41:312-317. Se ha demostrado que Yarrowia lipolytica es capaz de producir 0.44-0.54 g de lípido por gramo de biomasa cuando se utiliza grasa animal (estearina) como fuente de carbono (Panpanikolaou et al., Appl Microbiol Biotechnol (2002) 58:308-312.

[0192] La biomasa generada mediante los métodos de cultivo descritos en la presente y útil de acuerdo con los métodos descritos en la presente comprende al menos un 10% de aceite en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa comprende al menos un 25%, al menos un 50%, al menos un 55% o al menos un 60% de aceite en peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa contiene entre un 10 y un 90% de aceite, entre un 25 y 75% de aceite, entre un 40 y un 75% de aceite o entre un 50 y un 70% de aceite en peso seco.

[0193] El aceite de la biomasa descrita en la presente o extraído de la biomasa para utilizar en los métodos y las composiciones descritos en la presente puede comprender glicerolípidos con una o más cadenas laterales de éster de ácido graso diferentes. Los glicerolípidos están compuestos por una molécula de glicerol esterificada a una, dos, o tres moléculas de ácidos grasos, que pueden tener longitudes variables y grados de saturación variables. La composición del aceite, es decir, las propiedades y proporciones de los constituyentes correspondientes a los ácidos grasos de los glicerolípidos, se pueden manipular combinando la biomasa o aceite de al menos dos especies de levadura oleaginosa distintas (o una cepa de levadura oleaginosa y otro microbio productor de aceite). En algunas realizaciones, al menos dos de las distintas especies microbianas tienen diferentes perfiles glicerolipídicos. Las distintas especies microbianas se pueden cultivar juntas o por separado, tal como se describe en la presente, preferentemente en condiciones heterotróficas, para generar los respectivos aceites. Las diferentes especies microbianas pueden contener diferentes porcentajes de distintos constituyentes correspondientes a los ácidos grasos en los glicerolípidos de la célula.

[0194] Yarrowia lipolytica se ha modificado genéticamente. Una realización de la invención utiliza cepas modificadas de Yarrowia lipolytica que contienen enzimas de modificación de lípidos para preparar aceites adecuados para usar como lubricantes y fluidos dieléctricos. En las patentes de EE. UU. N.os 7.465.565 y 7.273.746 y las solicitudes de patente de EE. u U. con número de serie 10/840579, 11/613420, 11/714377 y 11/264737 se describen ejemplos de Yarrowia modificada.

III. MÉTODOS Y MATERIALES PARA LA MOFICIACIÓN GENÉTICA

[0195] Los métodos descritos en la presente se pueden llevar a la práctica utilizando microalgas recombinantes u otros microbios oleaginosos recombinantes. Esta sección describe métodos y materiales para modificar genéticamente microbios oleaginosos, tales como microalgas, específicamente células de Prototheca ilustrativas, con el fin de conseguir que las células huésped recombinantes sean útiles en los métodos descritos en la presente, incluidas, sin carácter limitante, células huésped de Prototheca moriformis, Prototheca zopfii, Prototheca krugani, y Prototheca stagnora recombinantes. La descripción de estos métodos y materiales se divide en subsecciones para mayor comodidad del lector. En la subsección 1, se describen métodos de transformación. En la subsección 2, se describen métodos de modificación por ingeniería genética que emplean recombinación homóloga. En la subsección 3, se describen componentes y vectores de expresión.

1. Métodos de modificación - transformación

[0196] Las células se pueden transformar mediante cualquier técnica adecuada incluidas, p. ej., biolística, electroporación (remítase a Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8:821-826), transformación con microesferas de vidrio y transformación con whiskers de carburo de silicio. Otro método que se puede utilizar implica la formación de protoplastos y el uso de CaCl2 y polietilenglicol (PEG) para introducir ADN recombinante en células de microalgas u otros microbios (remítase a Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73, que describe el uso de este método para la transformación de Chorella ellipsoidea). La cotransformación de microalgas se puede utilizar para introducir dos moléculas vectoriales distintas en una célula simultáneamente (remítase, por ejemplo, a Protist, diciembre de 2004;155(4):381-93).

[0197] También se pueden utilizar métodos biolísticos (remítase, por ejemplo, a Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302, la patente de EE. UU. N.o 4.945.050); electroporación (Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (EE. UU.) (1985) 82:5824 5828), el uso de un haz de láser, microinyección o cualquier otro método capaz de introducir ADN en una microalga para transformar microbios oleaginosos, tales como una célula de Prototheca.

2. Métodos de modificación - recombinación homologa

[0198] La recombinación homologa se refiere a la capacidad de secuencias de ADN complementarias para alinearse e intercambiar regiones de homología. En el proceso de recombinación homóloga, se introduce ADN transgénico ("donante") que contiene secuencias homólogas a las secuencias genómicas diana ("molde") en el organismo y posteriormente se somete a recombinación en el genoma en el sitio de las secuencias homólogas genómicas correspondientes. Los pasos mecanísticos de este proceso, en la mayoría de los casos, incluyen: (1) apareamiento de los segmentos de ADN homólogos; (2) introducción de rupturas bicatenarias en la molécula de ADN donante; (3) invasión de la molécula de ADN molde por parte de los extremos de ADN donante libres seguida de la síntesis de ADN; y (4) resolución de eventos de reparación de rupturas bicatenarias que dan como resultado productos finales de recombinación.

[0199] La capacidad para realizar una recombinación homóloga en un organismo huésped tiene muchas implicaciones prácticas sobre lo que se puede conseguir a nivel genético molecular y es útil en la generación de un microbio oleaginoso que pueda producir aceites diseñados (lípidos). Por su propia naturaleza, la recombinación homóloga es un evento de modificación dirigida a genes preciso; por lo tanto, la mayoría de las líneas transgénicas generadas con la misma secuencia de modificación dirigida serán esencialmente idénticas en términos del fenotipo, lo cual reduce el número de eventos de transformación que se deben evaluar. La recombinación homóloga también dirige eventos de inserción génica al cromosoma huésped, lo cual da como resultado una estabilidad genética excelente, incluso en ausencia de selección genética. Debido a que locus cromosómicos diferentes pueden afectar a la expresión génica, incluso de promotores/UTR heterólogos, la recombinación homóloga puede ser un método de búsqueda de locus en un entorno genómico poco familiar y de evaluación del impacto de un entorno genómico particular sobre la expresión génica.

[0200] Las aplicaciones de modificación por ingeniería genética particularmente útiles que emplean recombinación homóloga incorporan elementos regulatorios huésped específicos tales como promotores/UTR para dirigir la expresión génica heteróloga de un modo sumamente específico. Por ejemplo, la ablación o desactivación de genes de desaturasa/familias génicas con un gen heterólogo que codifica un marcador selectivo se puede utilizar para incrementar el porcentaje global de ácidos grasos saturados producidos en la célula huésped. El Ejemplo 4 describe los constructos de modificación dirigida por recombinación homóloga y un ejemplo práctico de ablaciones de genes de desaturasa (desactivaciones) generados en Prototheca moriformis. Otra estrategia para reducir la expresión de un gen endógeno es emplear un método inducido por ARN de reducción o silenciamiento de la expresión génica que incluye, sin carácter limitante, una estrategia de ARNi o antisentido, así como también una estrategia de ARNbc. Las estrategias de ARN horquillado, ARNi, ARNbc y antisentido son muy conocidas en la técnica e incluyen la introducción de un constructo de expresión que, cuando se expresa como ARNm, conduce a la formación de un ARN horquillado o un constructo de expresión que contiene una porción del gen diana que se transcribe en la orientación antisentido. Todas estas estrategias dan como resultado la reducción de la expresión del gen diana. El Ejemplo 4 también describe constructos de expresión y un ejemplo práctico de la reducción de la expresión de un gen de desaturasa delta 12 de Prototheca moriformis endógeno (FADc) mediante un enfoque de ARN horquillado.

[0201] Debido a que la recombinación homóloga es un evento de modificación dirigida a genes preciso, se puede utilizar para modificar cualquier nucleótido o nucleótidos en un gen o región de interés de forma precisa, siempre que se hayan identificado suficientes secuencias flanqueantes. Por lo tanto, la recombinación homóloga se puede utilizar como una forma de modificación de secuencias regulatorias que afectan a la expresión génica de ARN y/o proteínas. También se puede emplear para modificar regiones que codifican proteínas con el fin de modificar actividades enzimáticas tales como la Km, la especificidad y la afinidad del sustrato, de este modo se consigue el cambio deseado en el metabolismo de la célula huésped. La recombinación homóloga proporciona un medio potente para manipular el genoma huésped que da como resultado la modificación dirigida a genes, conversión génica, deleción génica, duplicación génica, inversión génica y el intercambio de elementos regulatorios de la expresión génica tales como promotores, potenciadores y 3'UTR.

[0202] La recombinación homóloga se puede conseguir utilizando constructos de modificación dirigida que contienen trozos de secuencias endógenas cuya "diana" es el gen o región de interés en el genoma de la célula huésped endógena. Tales secuencias de direccionamiento pueden estar situadas en 5' respecto al gen o la región de interés, 3' respecto al gen/región de interés o incluso flanquear el gen/región de interés. Tales constructos de modificación dirigida se pueden transformar en la célula huésped ya sea como un ADN plasmídico superhelicoidal con una estructura principal vectorial adicional, un producto de PCR sin estructura principal vectorial o como una molécula linealizada. En algunos casos, puede ser conveniente exponer primero las secuencias homólogas del ADN transgénico (ADN donante) a una enzima de restricción. Este paso puede incrementar la eficacia de la recombinación y reducir la aparición de eventos no deseados. Otros métodos para incrementar la eficacia de la recombinación incluyen utilizar PCR para generar ADN transgénico transformante que contiene extremos lineales homólogos a las secuencias genómicas diana.

[0203] A efectos ilustrativos no limitantes, las regiones de secuencias de ADN donante que son útiles para la recombinación homóloga incluyen la región KE858 de ADN en Prototheca moriformis. KE858 es un fragmento genómico de 1.3 kb que engloba la parte de la región codificante de una proteína que comparte homología con la familia de proteínas de ARN transferente (ARNt). Los ensayos de inmunotransferencia de Southern han demostrado que la secuencia de KE858 está presente en una única copia en el genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435).

Esta región y los ejemplos de uso de esta región para la modificación dirigida por recombinación homologa se han descrito en la solicitud de PCT N.o PCT/US2009/66142. Otra región útil de ADN donante es la secuencia genómica 6S.

3. Vectores y componentes vectoriales

[0204] Los vectores para la transformación de microorganismos se pueden preparar mediante técnicas con las que estarán familiarizados los expertos en la técnica en vista de la descripción de la presente. Un vector contiene normalmente uno o más genes, donde cada gen codifica la expresión de un producto deseado (el producto génico) y está unido operablemente a una o más secuencias de control que regulan la expresión génica o dirigen el producto génico a una posición particular en la célula recombinante. Para mayor comodidad del lector, esta subsección está dividida en subsecciones. La subsección A describe secuencias de control que pueden estar contenidas en vectores. La subsección B describe genes contenidos normalmente en vectores así como también métodos de optimización de codones y genes preparados utilizándolos.

A. Secuencias de control

[0205] Las secuencias de control son ácidos nucleicos que regulan la expresión de una secuencia codificante o dirigen un producto génico a una posición particular en el interior o exterior de una célula. Las secuencias de control que regulan la expresión incluyen, por ejemplo, promotores que regulan la transcripción de una secuencia codificante y terminadores que detienen la transcripción de una secuencia codificante. Otra secuencia de control es una secuencia 3' no traducida situada en el extremo de una secuencia codificante que codifica una señal de poliadenilación. Las secuencias de control que dirigen productos génicos a posiciones particulares incluyen aquellas que codifican péptidos señal, que dirigen la proteína a la que están unidos a una posición particular en el interior o exterior de la célula.

[0206] Por lo tanto, un diseño de un vector ilustrativo para la expresión de un gen exógeno en una microalga u otro microbio oleaginoso contiene una secuencia que codifica un producto génico deseado (por ejemplo, un marcador seleccionable, una enzima de modificación de la vía lipídica o una enzima de utilización de sacarosa) en unión operable con un promotor activo en la microalga u otro microbio oleaginoso. Como alternativa, si el vector no contiene un promotor en unión operable con la secuencia codificante de interés, la secuencia codificante se puede transformar en las células de modo que se una operablemente a un promotor endógeno en el punto de integración del vector. Se ha demostrado que el método de transformación sin promotor funciona en microalgas (remítase, por ejemplo, a Plant Journal 14:4, (1998), págs. 441-447) y otros microbios.

[0207] Muchos promotores son activos en microalgas, incluidos promotores que son endógenos a las algas que se están transformando, así como también promotores que no son endógenos a las algas que se están transformando (es decir, promotores de otras algas, promotores de plantas superiores y promotores de virus vegetales o virus algáceos). En la publicación de PCT N.o 2008/151149 y las referencias citadas en dicho documento se describen promotores endógenos y/o exógenos ilustrativos que son activos en microalgas (así como también genes de resistencia a antibióticos funcionales en microalgas).

[0208] El promotor utilizado para expresar un gen exógeno puede ser el promotor unido de forma natural a ese gen o puede ser un promotor de un gen heterólogo. Algunos promotores son activos en más de una especie de microalgas. Otros promotores son específicos para una especie. Los promotores ilustrativos incluyen promotores tales como ptubulina de Chlamydomonas reinhardtii, utilizados más adelante en los Ejemplos, y promotores víricos, tales como promotores derivados del virus del mosaico de la coliflor (VMC) y el virus de Chlorella, que se ha demostrado que son activos en múltiples especies de microalgas (remítase, por ejemplo, a Plant Cell Rep. marzo de 2005;23(10-11):727-35; J Microbiol. agosto de 2005;43(4):361-5; Mar Biotechnol (n Y). enero de 2002;4(1):63-73). Otro promotor que es adecuado para utilizar para la expresión de genes exógenos en Prototheca es el promotor/5'UTR de la glutamatodeshidrogenasa de Chlorella sorokiniana. Normalmente, se utilizan al menos 10, 20, 30, 40, 50 o 60 nucleótidos o más de estas secuencias que contienen un promotor. En el listado de secuencias de esta solicitud se enumeran los promotores ilustrativos útiles para la expresión de genes exógenos en Prototheca, tales como el promotor del gen HUP1 de Chlorella (SEQ ID NO:1) y el promotor de la nitrato-reductasa de Chlorella ellipsoidea (s Eq ID NO:2). Los promotores del virus de Chlorella también se pueden utilizar para expresar genes en Prototheca, tales como las SEQ ID NOs: 1-7 de la patente de EE. UU. 6.395.965. Se pueden encontrar otros promotores activos en Prototheca, por ejemplo, en Biochem Biophys Res Commun. 14 de octubre de 1994;204(1):187-94; Plant Mol Biol. octubre de 1994;26(1):85-93; Virology. 15 de agosto de 2004;326(1):150-9; y Virology. 5 de enero de 2004;318(1):214-23.

[0209] Un promotor se puede caracterizar generalmente como constitutivo o inducible. Los promotores constitutivos son generalmente activos o funcionan para dirigir la expresión en todo momento (o en ciertos momentos durante el ciclo de la vida celular) al mismo nivel. Los promotores inducibles, por el contrario, son activos (o se modifican para inactivarlos), o se inducen o reprimen de forma significativa únicamente en respuesta a estímulos. Ambos tipos de promotores encuentran aplicación en los métodos descritos en la presente. Los promotores inducibles útiles en los métodos descritos en la presente incluyen aquellos que median la transcripción de un gen unido operablemente en respuesta a un estímulo, tal como una pequeña molécula proporcionada exógenamente (p. ej., glucosa, como en la SEQ ID NO:1), temperatura (calor o frío), carencia de nitrógeno en medios de cultivo, etc. Los promotores adecuados pueden activar la transcripción de un gen esencialmente silencioso o incrementar, preferentemente de forma sustancial, la transcripción de un gen unido operablemente que se transcribe en un nivel bajo.

[0210] La inclusión de una secuencia de control correspondiente a la región de terminación es opcional y si se emplea, entonces la elección es principalmente una de conveniencia, ya que las regiones de terminación son relativamente intercambiables. La región de terminación puede ser nativa de la región de inicio de la transcripción (el promotor), puede ser nativa de la secuencia de ADN de interés o se puede obtener de otra fuente. Remítase, por ejemplo, a Chen and Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411.

[0211] Los métodos descritos en la presente también pueden emplear vectores que contienen secuencias de control y genes recombinantes que proporcionan la expresión compartimentada de un gen de interés. Los orgánulos que se emplean como dianas son cloroplastos, plástidos, mitocondrias y el retículo endoplasmático. Además, los métodos descritos en la presente también emplean secuencias de control y genes recombinantes, y vectores que los contienen descritos en la presente que proporcionan la secreción de una proteína fuera de la célula.

[0212] Las proteínas que se expresan en el genoma nuclear de Prototheca se pueden dirigir al plástido utilizando señales de direccionamiento plastídico. Se conocen secuencias de direccionamiento plastídico endógenas de Chlorella, tales como genes en el genoma nuclear de Chlorella que codifican proteínas que se dirigen al plástido; consulte, por ejemplo, los números de acceso a GenBank AY646197 y AF499684, y, en una realización, se utilizan vectores que contienen tales secuencias de control en los métodos descritos en la presente para dirigir la expresión de una proteína a un plástido de Prototheca.

[0213] Los ejemplos describen más adelante el uso de secuencias de direccionamiento plastídico de algas para dirigir proteínas heterólogas al compartimento correcto en la célula huésped. Se prepararon genotecas de ADNc utilizando células de Prototheca moriformis y Chlorella protothecodies, y se describen en la solicitud de PCT N.o PCT/US2009/066142.

[0214] En otra realización, la expresión de un polipéptido en Prototheca u otro microbio oleaginoso se dirige al retículo endoplasmático. La inclusión de una señal de selección o retención adecuada en un vector de expresión garantiza que las proteínas se retengan en el retículo endoplasmático (RE) y no se pasen posteriormente a Golgi. Por ejemplo, el vector IMPACTVECTOR1.3, de Wageningen UR- Plant Research International, incluye la señal de selección o retención muy conocida KDEL. Con este vector, la retención en el RE tiene la ventaja práctica de que se ha detectado que mejora los niveles de expresión en un quíntuple o más. La principal razón por la que esto ocurre parece ser que el RE contiene concentraciones menores y/o diferentes proteasas responsables de la degradación postraslacional de proteínas expresadas que están presentes en el citoplasma. Se conocen señales de retención en el RE funcionales en microalgas verdes. Por ejemplo, remítase a Proc Natl Acad Sci U S A. 26 de abril de 2005; 102(17):6225-30.

[0215] En otra realización de la presente invención, un polipéptido se dirige para que se secrete fuera de la célula en los medios de cultivo. Remítase a Hawkins et al., Current Microbiology Vol. 38 (1999), págs. 335-341 para consultar ejemplos de señales de secreción activas en Chlorella que se pueden utilizar además en otras microalgas, tales como Prototheca.

B. Optimización de codones y genes

[0216] Normalmente, un gen incluye un promotor, una secuencia codificante y secuencias de control de terminación. Cuando se prepara mediante tecnología de ADN recombinante, un gen se puede denominar casete de expresión y puede estar flanqueado por sitios de restricción para ser insertado de forma conveniente en un vector que se utiliza para introducir el gen recombinante en una célula huésped. El casete de expresión puede estar flanqueado por secuencias de ADN del genoma u otro ácido nucleico diana para facilitar la integración estable del casete de expresión en el genoma mediante recombinación homóloga. Como alternativa, el vector y su casete de expresión pueden permanecer no integrados, en cuyo caso, el vector normalmente incluye un origen de replicación, que es capaz de proporcionar replicación del ADN del vector heterólogo.

[0217] Un gen común presente en un vector es un gen que codifica una proteína, cuya expresión permite que la célula recombinante que contiene la proteína se diferencie de células que no expresan la proteína. Dicho gen, o su producto génico correspondiente, se denomina marcador seleccionable. Se puede emplear cualquiera de una gran variedad de marcadores seleccionables en un constructo transgénico útil para transformar Prototheca o cualquier otro microbio oleaginoso útil en los métodos descritos en la presente. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de resistencia G418, el gen de nitrato-reductasa (remítase a Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35:356-362), el gen de higromicina-fosfotransferasa (HPT; remítase a Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73), el gen de neomicina-fosfotransferasa y el gen ble, que confiere resistencia a la fleomicina (Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:197-205). Los métodos para determinar la sensibilidad de microalgas y otros microbios oleaginosos a antibióticos son muy conocidos. Por ejemplo, remítase a Mol Gen Genet. 16 de octubre de 1996;252(5):572-9.

[0218] También se pueden emplear otros marcadores seleccionables que no están basados en antibióticos en un constructo transgénico útil para transformar microalgas en general, incluidas las especies de Prototheca. También se pueden utilizar genes que confieren la capacidad de utilización de ciertas fuentes de carbono que previamente no podían ser utilizadas por las microalgas como marcadores seleccionables. A modo ilustrativo, las cepas de Prototheca moriformis normalmente crecen poco o nada en sacarosa. Utilizando un constructo que contiene un gen de sacarosainvertasa se puede conferir la capacidad a transformantes positivos de crecer en sacarosa como sustrato de carbono.

[0219] A efectos de ciertas realizaciones de los métodos descritos en la presente, el vector de expresión utilizado para preparar una célula huésped recombinante incluirá al menos dos y a menudo tres genes, si uno de los genes es un marcador seleccionable. Por ejemplo, una Prototheca modificada genéticamente se puede preparar mediante la transformación con vectores que comprenden, además de un marcador seleccionable, uno o más genes exógenos, tales como, por ejemplo, un gen de sacarosa-invertasa o un gen de acil ACP-tioesterasa. Uno o ambos genes se pueden expresar utilizando un promotor inducible, que permite controlar el momento relativo en el que se expresen estos genes para incrementar el rendimiento lipídico y la conversión en ésteres de ácidos grasos. La expresión de dos o más genes exógenos puede estar controlada por el mismo promotor inducible o controlada por promotores inducibles (o constitutivos) diferentes. En la última situación, la expresión de un primer gen exógeno se puede inducir durante un primer periodo de tiempo (durante el cual se puede inducir o no un segundo gen exógeno) y la expresión de un segundo gen exógeno se puede inducir durante un segundo periodo de tiempo (durante el cual se puede inducir o no la expresión de un primer gen exógeno).

[0220] En otras realizaciones, los dos o más genes exógenos (además de cualquier marcador seleccionable) son: una acil graso-ACP-tioesterasa y una acil graso-CoA/aldehído-reductasa, cuya acción combinada proporciona un producto alcohólico. Se proporcionan además otras combinaciones de genes exógenos que incluyen, sin carácter limitante, una acil graso-ACP-tioesterasa y una acil graso-CoA-reductasa para generar aldehídos. En una realización, el vector proporciona la combinación de una acil graso-ACP-tioesterasa, una acil graso-CoA-reductasa y una aldehído grasodescarbonilasa para generar alcanos. En cada una de estas realizaciones, se pueden expresar uno o más genes exógenos utilizando un promotor inducible.

[0221] Otros vectores ilustrativos que expresan dos o más genes exógenos incluyen aquellos que codifican tanto un transportador de sacarosa como una enzima sacarosa-invertasa y aquellos que codifican tanto un marcador seleccionable como una sacarosa-invertasa secretada. La Prototheca recombinante u otra célula microalgácea o microbiana transformada con uno de los tipos de vectores produce lípidos con costos de fabricación menores debido a la capacidad adquirida de utilización de la caña de azúcar (y azúcares derivados de la caña de azúcar) como fuente de carbono. La inserción de los dos genes exógenos descritos anteriormente se puede combinar con la disrupción de la biosíntesis de polisacáridos mediante mutagénesis dirigida y/o aleatoria, que dirige un flujo de carbono incluso mayor a la producción de lípido. De modo individual y combinados, la conversión trófica, la modificación para alterar la producción de lípido y el tratamiento con enzimas exógenas alteran la composición lipídica producida por un microorganismo. La alteración puede ser un cambio en la cantidad de lípidos producidos, la cantidad de una o más especies lipídicas (ácidos grasos) producidas con relación a otras especies lipídicas y/o los tipos de especies lipídicas producidas en el microorganismo. Por ejemplo, las microalgas se pueden modificar para que produzcan una cantidad y/o un porcentaje mayor de TAG.

[0222] Para la expresión óptima de una proteína recombinante, es beneficioso emplear secuencias codificantes que produzcan ARNm con codones utilizados preferentemente por la célula huésped que se haya de transformar. Por lo tanto, la expresión adecuada de transgenes puede requerir que el uso de codones del transgén coincida con la preferencia codónica específica del organismo en el que el transgén se esté expresando. Los mecanismos precisos en los que se basa este efecto son muchos pero incluyen el balance adecuado de agrupaciones de ARNt aminoacilado disponibles, siendo las proteínas sintetizadas en la célula, acoplado con una traducción más eficiente del ARN mensajero transgénico (ARNm) cuando se satisface esta necesidad. Cuando el uso de codones en el transgén no se optimiza, las agrupaciones de ARNt disponibles no son suficientes para permitir una traducción eficiente del ARNm heterólogo, lo cual produce detención y terminación ribosómicas y posible inestabilidad del ARNm transgénico.

[0223] En la presente se describen ácidos nucleicos con codones optimizados útiles para la expresión exitosa de proteínas recombinantes en Prototheca. El uso de codones en especies de Prototheca se analizó estudiando secuencias de ADNc aisladas de Prototheca moriformis. Este análisis representa la interrogación sobre 24 000 codones y dio como resultado la siguiente Tabla 4.

Tabla 4. Uso de codones preferido en cepas de Prototheca.

[0224] En otras realizaciones, el gen en el vector recombinante ha sido sometido a optimización de codones con referencia a una cepa de microalga que no sea una cepa de Prototheca u otra cepa microbiana. En la patente de EE. UU. N.o 7.135.290 se describen, por ejemplo, métodos de recodificación de genes para la expresión en microalgas. Se dispone de información adicional sobre la optimización de codones, p. ej., en la base de datos de uso de codones de GenBank.

[0225] Aunque los métodos y materiales que se describen en la presente permiten introducir cualquier gen exógeno en Prototheca u otras microalgas u otros microbios oleaginosos, los genes relacionados con la modificación de vía lipídica y la utilización de sacarosa son de particular interés para microbios incapaces de utilizarlos de forma natural o para microbios que los utilizan de forma ineficiente, tal como se discute en las siguientes secciones.

IV. UTILIZACIÓN DE SACAROSA

[0226] En una realización, la Prototheca recombinante u otra célula microalgácea u otra célula microbiana contiene uno o más genes de utilización de sacarosa exógenos. En varias realizaciones, el gen o genes codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo constituido por una fructocinasa, una glucocinasa, una hexocinasa, una sacarosainvertasa y un transportador de sacarosa. Por ejemplo, la expresión de un transportador de sacarosa y una sacarosainvertasa permite a Prototheca o a cualquier otra célula microbiana o microalgácea transportar sacarosa al interior de la célula desde los medios de cultivo e hidrolizar sacarosa para proporcionar glucosa y fructosa. Opcionalmente, se puede expresar además una fructocinasa en casos en los que la actividad hexocinasa endógena es insuficiente para que la fosforilización de fructosa sea máxima. Algunos ejemplos de transportadores de sacarosa adecuados son los números de acceso a Genbank CAD91334, CAB92307 y CAA53390. Algunos ejemplos de fructocinasas adecuadas son los números de acceso a Genbank P26984, P26420 y CAA43322.

[0227] En una realización, los métodos descritos en la presente se llevan a la práctica con una célula huésped de Prototheca que secreta una sacarosa-invertasa. La secreción de una sacarosa-invertasa obvia la necesidad de expresar un transportador que pueda transportar sacarosa a la célula. Esto se debe a que una invertasa secretada cataliza la conversión de una molécula de sacarosa en una molécula de glucosa y una molécula de fructosa, ambas de las cuales pueden ser transportadas y utilizadas por microbios útiles en los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, la expresión de una sacarosa-invertasa (tal como SEQ ID NO:3) con una señal de secreción (tal como la de SEQ ID NO:4 (de levadura), SEQ ID NO:5 (de plantas superiores), SEQ ID NO:6 (señal de secreción consenso eucariota) y SEQ ID NO:7 (combinación de secuencia señal de plantas superiores y consenso eucariota) genera actividad invertasa fuera de la célula. La expresión de esta proteína, tal como permite la metodología de ingeniería genética descrita en la presente, permite a células que ya son capaces de utilizar glucosa extracelular como fuente de energía utilizar sacarosa como fuente de energía extracelular.

[0228] Las especies de Prototheca que expresan una invertasa que es secretada en un medio que contiene sacarosa son las especies de microalgas preferidas para la producción de aceite microbiano con el fin de utilizarlo como un fluido dieléctrico u otro lubricante (para la producción de aceites alimentarios, algunos consumidores puede que prefieran aceite producido utilizando microbios no recombinantes). La expresión y el direccionamiento extracelular de esta proteína completamente activa permite a las células huésped resultantes crecer en sacarosa, mientras que sus homólogas no transformadas no pueden. Por lo tanto, la práctica de los métodos descritos en la presente puede emplear células de Prototheca recombinantes con un gen de invertasa con codones optimizados, incluido, sin carácter limitante, el gen de invertasa de levadura, integrado en su genoma de modo que el gen de invertasa se expresa tal y como se evalúa por la actividad de invertasa y la hidrólisis de sacarosa. Los genes de invertasa son útiles como marcadores seleccionables en Prototheca y otras células recombinantes de microalgas, tales como células que pueden crecer en sacarosa, mientras que sus homólogos no transformados no pueden; y los métodos para seleccionar células huésped recombinantes que emplean una invertasa como marcador seleccionable son muy valiosos para la genética molecular de algas.

[0229] La expresión exitosa de una sacarosa-invertasa en Prototheca también demuestra que se pueden expresar proteínas (recombinantes) heterólogas en una célula algácea, y transportarlas con éxito fuera de la célula y al medio de cultivo en una forma funcional y completamente activa. Por lo tanto, se dispone de métodos y reactivos para expresar una amplia y diversa gama de proteínas heterólogas en microalgas y secretarlas fuera de la célula huésped. Tales proteínas incluyen, por ejemplo, enzimas industriales tales como, por ejemplo, lipasas, proteasas, celulasas, pectinasas, amilasas, esterasas, oxidoreductasas, transferasas, lactasas, isomerasas e invertasas.

[0230] Algunos ejemplos de sacarosa-invertasas adecuadas incluyen las identificadas con los números de acceso a Genbank CAB95010, NP_012104 y CAA06839. A continuación, se enumeran ejemplos no limitantes de invertasas adecuadas en la Tabla 5. Las secuencias de aminoácidos para cada invertasa enumerada se incluyen en el siguiente Listado de Secuencias. En algunos casos, el gen de utilización de sacarosa exógeno adecuado para utilizar en los métodos y vectores descritos en la presente codifica una sacarosa-invertasa con un porcentaje de identidad aminoacídica de al menos un 40, 50, 60, 75 o 90% o superior respecto a una sacarosa-invertasa seleccionada de la Tabla 5.

Tabla 5. Sacarosa-invertasas.

[0231] La secreción de una invertasa al medio de cultivo por parte de Prototheca permite a las células crecer además en molasas de desecho obtenidas durante el procesamiento de la caña de azúcar al igual que en glucosa de calidad de reactivo puro; el uso de este producto de desecho de escaso valor obtenido durante el procesamiento de la caña de azúcar puede proporcionar un ahorro significativo de costos en la producción de lípidos y otros aceites. Por lo tanto, los métodos descritos en la presente pueden implicar el uso de un cultivo microbiano que contiene una población de Prototheca u otros microorganismos microalgáceos y un medio de cultivo que comprende (i) sacarosa y (ii) una enzima de sacarosa-invertasa. En varias realizaciones, la sacarosa del cultivo proviene de sorgo, remolacha azucarera, caña de azúcar, molasas o material celulósico despolimerizado (que puede contener opcionalmente lignina). Aunque los microbios ejemplificados en la presente se alteren de modo que puedan utilizar sacarosa, los métodos y reactivos descritos en la presente se pueden aplicar de modo que las materias primas, tales como materiales celulósicos, puedan ser utilizadas por un microbio huésped modificado con la capacidad de secretar celulasas, pectinasas, isomerasas o similares, de tal forma que los productos de ruptura de las reacciones enzimáticas ya no sean simplemente tolerados sino que sean utilizados como fuente de carbono por el huésped.

V. MODIFICACIÓN DE LA VÍA LIPÍDICA

[0232] Además de alterar la capacidad de Prototheca (u otras células microalgáceas u otras microbianas) para utilizar materias primas, tales como materias primas que contienen sacarosa, las Prototheca recombinantes (u otras células microalgáceas u otras microbianas) que han sido modificadas para alterar las propiedades y/o proporciones de lípidos producidos son útiles en los métodos descritos en la presente. La vía además, o como alternativa, se puede modificar para alterar las propiedades y/o proporciones de varias moléculas de lípidos producidas mediante el procesamiento enzimático de lípidos e intermedios en la vía de ácidos grasos. En varias realizaciones, las células recombinantes tienen, en comparación con sus homólogos no transformados, un rendimiento lipídico optimizado o mayor por unidad de volumen y/o por unidad de tiempo, longitud de la cadena carbonada (p. ej., para productos químicos industriales incluidos, sin carácter limitante, fluidos dieléctricos y otras aplicaciones que requieren materia prima lipídica), número reducido de dobles o triples enlaces, opcionalmente de hasta cero, y una mayor proporción de hidrógeno:carbono de una especie particular de lípido (ácido graso) o de una población lipídica diferente.

[0233] En realizaciones particulares, la expresión de una o más enzimas fundamentales que controlan los puntos de ramificación en el metabolismo de síntesis de ácidos grasos se ha incrementado o reducido para mejorar la producción de lípido. El incremento se puede conseguir, por ejemplo, transformando células con constructos de expresión en los que se expresa un gen que codifica la enzima de interés, p. ej., utilizando un promotor fuerte y/o elementos potenciadores que incrementan la transcripción. Estos constructos pueden incluir un marcador seleccionable de modo que los transformantes se puedan someter a selección, el cual también se puede utilizar para amplificar el constructo y para obtener un incremento concomitante en el nivel de expresión de la enzima codificada. Los ejemplos de enzimas adecuadas para dicho incremento de acuerdo con los métodos descritos en la presente incluyen la piruvatodeshidrogenasa, que desempeña una función en la conversión de piruvato en acetil-CoA (los ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso a Genbank NP_415392; AAA53047; Q1XDM1; y CAF05587). El incremento de la piruvato-deshidrogenasa puede incrementar la producción de acetil-CoA y de este modo incrementar la síntesis de ácidos grasos. La acetil-CoA-carboxilasa cataliza el paso inicial de la síntesis de ácidos grasos. Por consiguiente, esta enzima se puede incrementar para aumentar la producción de ácidos grasos (los ejemplos, de algunas microalgas, incluyen los números de acceso a Genbank BAA94752; AAA75528; AAA81471; Yp_537052; YP_536879; NP_045833; y BAA57908). La producción de ácidos grasos también se puede aumentar incrementando la proteína portadora de acilo (ACP), que porta las cadenas de acilo en fase de crecimiento durante la síntesis de ácidos grasos (los ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso a Genbank A0T0F8; P51280; NP_849041; YP_874433). La glicerol-3-fosfato-aciltransferasa cataliza el paso limitante de la velocidad de síntesis de ácidos grasos. El incremento de esta enzima puede hacer que la producción de ácidos grasos aumente (los ejemplos, algunos de microalgas, incluyen los números de acceso a Genbank AAA74319; AAA33122; AAA37647; p44857; y ABO94442).

[0234] El aumento y la reducción de la expresión de genes se puede aplicar a reguladores globales que controlan la expresión de los genes de las vías biosintéticas de ácidos grasos. Por consiguiente, se pueden incrementar o reducir uno o más reguladores globales de la síntesis de ácidos grasos, según proceda, para inhibir o aumentar, respectivamente, la expresión de una pluralidad de genes sintéticos de ácidos grasos y, por último, para incrementar la producción de lípidos. Los ejemplos incluyen proteínas de unión a elementos reguladores de esterol (SREBP), tales como SREBP-1a y SREBP-1c (por ejemplo, consulte los números de acceso a Genbank NP_035610 y Q9WTN3).

[0235] Los métodos descritos en la presente también se pueden llevar a la práctica con células de Prototheca recombinante (o de otras microalgas u otros microbios) que han sido modificadas para contener uno o más genes exógenos que codifican enzimas de modificación de lípidos tales como, por ejemplo, acil graso-ACP-tioesterasas (remítase a la Tabla 6), acil graso-CoA/aldehído-reductasas (remítase a la Tabla 8), acil graso-CoA-reductasas, aldehído graso-decarbonilasa, aldehído graso-reductasas, desaturasas (tales como desaturasas de estearoil-ACP-desaturasas y acil graso-desaturasas) y escualeno-sintasas (consulte el número de acceso a GenBank AF205791). En algunas realizaciones, los genes que codifican una acil graso-ACP-tioesterasa y una proteína portadora de acilo coexpresada de forma natural se transforman en una célula de Prototheca (o de otra microalga o de otro microbio), opcionalmente con uno o más genes que codifican otras enzimas de modificación de lípidos. En otras realizaciones, la ACP y la acil graso-ACP-tioesterasa pueden presentar afinidad la una por la otra lo cual supone una ventaja cuando se utilizan las dos juntas en los microbios y los métodos descritos en la presente, independientemente de si se coexpresan o no de forma natural en un tejido u organismo particular. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la presente invención contempla tanto pares coexpresados de forma natural de estas enzimas así como también aquellas que comparten afinidad por interaccionar entre sí para facilitar la escisión de una cadena carbonada de una longitud específica de la ACP.

[0236] En otras realizaciones más, un gen exógeno que codifica una desaturasa se transforma en la célula de Prototheca (o de otra microalga u otro microbio) en conjunción con uno o más genes que codifican otras enzimas de modificación de lípidos para proporcionar modificaciones con respecto a la saturación de los lípidos. En otra realización, se sobreexpresa un gen de desaturasa endógeno (p. ej., mediante la introducción de copias adicionales del gen) en una célula de Prototheca (o de otra microalga u otro microbio). La estearoil-ACP-desaturasa (consulte, p. ej., los números de acceso a GenBank AAF15308; ABM45911; y AAY86086), por ejemplo, cataliza la conversión de estearoil-ACP en oleoil-ACP. El incremento de la expresión de este gen puede aumentar la proporción de ácidos grasos monosaturados producidos por una célula; mientras que la reducción puede disminuir la proporción de monoinsaturados. A efectos ilustrativos, la estearoil-ACP-desaturasas (SAD) son responsables de la síntesis de ácidos grasos C18:1 a partir de precursores C18:0. Otra familia de desaturasas son las acil graso-desaturasas (FAD), incluidas ácido graso-desaturasas delta 12. Estas desaturasas también proporcionan modificaciones con respecto a la saturación de los lípidos. A efectos ilustrativos, las delta 12 ácido graso-desaturasas son responsables de la síntesis de ácidos grasos C18:2 a partir de precursores C18:1. De forma análoga, la expresión de uno o más glicerolípidodesaturasas se puede controlar para alterar la proporción de ácidos grasos insaturados respecto a saturados tales como u>-6-ác¡do graso-desaturasa, u>-3-ác¡do graso-desaturasa o w-6-oleato-desaturasa. En algunas realizaciones, la desaturasa se puede seleccionar con referencia a una longitud de la cadena carbonada deseada, de modo que la desaturasa sea capaz de realizar modificaciones en sitios específicos dentro de un sustrato con una longitud de carbonos específica o sustratos con una longitud de carbonos comprendida dentro de un rango específico. En otra realización, si el perfil de ácidos grasos deseados es un incremento de monoinsaturados (tales como C16:1 y/o C18:1), la sobreexpresión de una SAD o la expresión de una SAD heteróloga se puede acoplar con el silenciamiento o inactivación (p. ej., mediante mutación, ARNi, ARN horquillado, desactivación de un gen de desaturasa endógeno, etc.) de una acil graso-desaturasa (FAD). El Ejemplo 4 siguiente describe la ablación dirigida o desactivación de estearoil-ACP-desaturasas y delta 12-ácido graso-desaturasas y también describe el uso de constructos antisentido de ARN horquillado para reducir la expresión de un gen de desaturasa endógeno.

[0237] Por lo tanto, en realizaciones particulares, los microbios de la presente invención están modificados genéticamente para expresar uno o más genes exógenos seleccionados entre una acil-ACP-tioesterasa, una acil-CoA/aldehído-reductasa, una acil graso-CoA-reductasa, una aldehído graso-reductasa, una desaturasa, un aldehído graso-descarbonilasa o una proteína portadora de acilo coexpresada de forma natural. A continuación se describen métodos de expresión adecuados para la expresión de un gen de lipasa, incluidas, entre otras, la expresión inducible y la expresión compartimentada. Una acil graso-ACP-tioesterasa escinde un ácido graso de una proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis de lípidos. Mediante procesamiento enzimático adicional, el ácido graso escindido se combina a continuación con una coenzima para obtener una molécula de acil-CoA. Esta acil-CoA es el sustrato de la actividad enzimática de una acil graso-CoA-reductasa para obtener un aldehído, así como también para una acil graso-CoA/aldehído-reductasa para obtener un alcohol. El aldehído producido por acción de la acil graso-CoA-reductasa identificada anteriormente es el sustrato de la actividad enzimática adicional ya sea por una aldehído grasoreductasa para obtener un alcohol o una aldehído graso-descarbonilasa para obtener un alcano o alqueno.

[0238] En algunas realizaciones, los ácidos grasos, glicerolípidos o los alcoholes primarios, aldehídos, alcanos o alquenos correspondientes generados por los métodos descritos en la presente contienen 16 o 18 átomos de carbono. Los ácidos grasos preferidos para la producción de fluidos dieléctricos o los alcoholes, aldehídos, alcanos y alquenos correspondientes contienen 16-18 átomos de carbono. En ciertas realizaciones, los ácidos grasos anteriores están saturados (sin ningún enlace carbono-carbono doble o triple); monoinsaturados (un único doble enlace); poliinsaturados (dos o más dobles enlaces; y pueden ser lineales (no cíclicos) o ramificados o una mezcla de los dos tipos. Para fluidos dieléctricos, se prefieren los ácidos grasos monoinsaturados, especialmente el ácido oleico (C18:1). Para incrementar la producción de lípidos con la longitud de cadena y/o el grado de saturación deseado, se puede modificar la célula microalgácea para sobreexpresar una tioesterasa con especificidad respecto a una longitud de cadena deseada, para desactivar la producción de tioesterasas con una especificidad respecto a una longitud de cadena más corta o para reducir la expresión de tales genes, y/o para desactivar genes de desaturasa responsables del grado de saturación en los lípidos deseados.

[0239] Varias enzimas descritas anteriormente tienen normalmente una especificidad preferencial por la hidrólisis de un sustrato que contiene un número específico de átomos de carbono. Por ejemplo, una acil graso-ACP-tioesterasa puede tener preferencia por escindir un ácido graso con 12 átomos de carbono de la ACP. En algunas realizaciones, la ACP y la tioesterasa de longitud específica pueden tener afinidad una por la otra, lo que hace que sean particularmente útiles como una combinación (p. ej., los genes exógenos de tioesterasa y ACP se pueden coexpresar de forma natural en un tejido u organismo particular del que se derivan). Por lo tanto, en varias realizaciones, la célula de Prototheca recombinante (o de otra microalga u otro microbio) de la invención puede contener un gen exógeno que codifica una proteína con especificidad para la catálisis de una actividad enzimática (p. ej., escisión de un ácido graso de una ACP, reducción de una acil-CoA para obtener un aldehído o un alcohol, o conversión de un aldehído en un alcano) con respecto al número de átomos de carbono contenidos en el sustrato. La especificidad enzimática puede ser, en varias realizaciones, respecto a un sustrato con 8-34 átomos de carbono y preferentemente 16-18 átomos de carbono.

[0240] Otras acil graso-ACP-tioesterasas adecuadas para utilizar con los microbios y métodos descritos en la presente incluyen, sin carácter limitante, las enumeradas en la Tabla 6.

Tabla 6. Acil graso-ACP-tioesterasas y números de acceso a GenBank

Acil graso-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica (# de GenBank AAC49001)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Cinnamomum camphora (# de GenBank Q39473) Acil graso-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica (# de GenBank Q41635 Acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (# de GenBank AAB71729) Acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (# de GenBank AAB71730) Acil graso-ACP-tioesterasa de Elaeis guineensis (# de GenBank ABD83939) Acil graso-ACP-tioesterasa de Elaeis guineensis (# de GenBank AAD42220) Acil graso-ACP-tioesterasa de Populus tomentosa (# de GenBank ABC47311) Acil graso-ACP-tioesterasa de Arabidopsis thaliana (# de GenBank NP 172327) Acil graso-ACP-tioesterasa de Arabidopsis thaliana (# de GenBank CAA85387) Acil graso-ACP-tioesterasa de Arabidopsis thaliana (# de GenBank CAA85388) Acil graso-ACP-tioesterasa de Gossypium hirsutum (# de GenBank Q9SQI3) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea lanceolata (# de GenBank CAA54060) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (# de GenBank AAC72882) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea calophylla subsp. mesostemon (# de GenBank ABB71581)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea lanceolata (# de GenBank CAC19933) Acil graso-ACP-tioesterasa de Elaeis guineensis (# de GenBank AAL15645) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (# de GenBank Q39513)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Gossypium hirsutum (# de GenBank AAD01982) Acil graso-ACP-tioesterasa de Vitis vinifera (# de GenBank CAN81819)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Garcinia mangostana (# de GenBank AAB51525) Acil graso-ACP-tioesterasa de Brassica juncea (# de GenBank ABI18986)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Madhuca longifolia (# de GenBank AAX51637) Acil graso-ACP-tioesterasa de Brassica napus (# de GenBank ABH11710)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo-cultivar indica) (# de GenBank EAY86877)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo-cultivar japonica) (# de GenBank NP 001068400)

(Continuado)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo-cultivar indica) (# de GenBank EAY99617)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (# de GenBank AAC49269) Acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo-cultivar japónica) (# de GenBank NP 001068400)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Oryza sativa (grupo-cultivar indica) (# de GenBank EAY99617)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (# de GenBank AAC49269) Acil graso-ACP-tioesterasa de Ulmus Americana (# de GenBank AAB71731) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea lanceolata (# de GenBank CAB60830) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea palustris (# de GenBank AAC49180) Acil graso-ACP-tioesterasa de Iris germanica (# de GenBank AAG43858) Acil graso-ACP-tioesterasa de Iris germanica (# de GenBank AAG43858.1) Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea palustris (# de GenBank AAC49179) Acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (# de GenBank AAB71729) Acil graso-ACP-tioesterasa de Myristica fragrans (# de GenBank AAB717291.1)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Cuphea hookeriana (# de GenBank U39834) Acil graso-ACP-tioesterasa de Umbelluaria californica (# de GenBank M94159)

Acil graso-ACP-tioesterasa de Cinnamomum camphora (# de GenBank U31813) Acil graso-ACP-tioesterasa de Ricinus communis (# de GenBank ABS30422.1)

[0241] Los productos químicos a base de bioaceite, tales como fluidos dieléctricos, tienen composiciones de ácidos grasos con un alto contenido en ácido oleico (C18:1) que se originan a partir de ésteres naturales (es decir, aceites seminales) tal como aceite de girasol y aceite de canola. La Tabla 7 muestra los perfiles de ácidos grasos de aceites seminales comerciales comunes. Todos los datos de aceites seminales comerciales que se muestran a continuación se compilaron de los Códigos de las Farmacopeas de Productos Químicos y Alimentos, de EE. UU. 7.a Ed. 2010­ 2011.

Tabla 7. Perfiles lipídicos de aceites seminales comerciales

(Continuado)

[0242] Las acil graso-CoA/aldehído-reductasas adecuadas para utilizar con los microbios y métodos descritos en la presente incluyen, sin carácter limitante, las enumerados en la Tabla 8.

Tabla 8. Acil graso-CoA/aldehído-reductasas enumeradas en los números de acceso a GenBank

[0243] Las acil-ACP-tioesterasas son los terminadores de la biosíntesis de ácidos grasos de plantas superiores (y algunas especies de microalgas) y, en la mayoría de las especies vegetales, esto es realizado por miembros de la familia de genes FatA, cuya función es detener la elongación en la etapa de C16:0 a C18:0. En especies que sintetizan ácidos grasos de cadena más corta (tales como Cuphea, Elaeis, Myristica o Umbellularia), un grupo diferente de acil-ACP-tioesterasas codificadas por genes FatB lleva a cabo este paso de terminación.

[0244] ej., escisión de un ácido graso de una proteína portadora de acilo, reducción de una acil-CoA a un aldehído o un alcohol, o conversión de un aldehído en un alcano). En realizaciones adicionales, la actividad enzimática está presente en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 99% de identidad respecto a una de las secuencias descritas anteriormente, todas las cuales se incorporan a la presente por referencia.

[0245] Seleccionando la combinación deseada de genes exógenos que se han de expresar (o genes endógenos que se han de inactivar o ambas), se puede modificar el aceite generado por el microbio, el cual se puede extraer posteriormente de la biomasa acuosa. Por ejemplo, el microbio puede contener: (i) un gen exógeno que codifica una acil graso-ACP-tioesterasa; (ii) opcionalmente, una proteína portadora de acilo coexpresada de forma natural o una proteína portadora de acilo con afinidad por la acil graso-ACP-tioesterasa; (iii) un gen de desaturasa endógeno mutado, donde la mutación desactiva el gen de desaturasa o proteína desaturasa, tal como una desactivación de desaturasa; (iv) sobreexpresión de una estearoil-proteína portadora de acilo-desaturasa endógena o la expresión de una SAD heteróloga; y (v) cualquier combinación de lo anterior.

[0246] Los genes que codifican estas enzimas, tales como acil graso-ACP-tioesterasas, se pueden obtener a partir de células de las que ya hay constancia de que exhiben una producción de lípidos significativa tal como Chlorella protothecoides. Los genes de los que hay constancia de que desempeñan una función en la producción de lípidos, p. ej., un gen que codifica a una enzima que satura dobles enlaces, se pueden transformar de forma individual en células receptoras. Los métodos para identificar genes que pueden alterar (mejorar) la producción de lípidos en microalgas se describen en la publicación de PCT N.o 2008/151149, incorporada a la presente por referencia.

[0247] Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la práctica de la presente invención puede utilizar una célula de Prototheca o de otra microalga u otro microbio que ha sido modificada genéticamente para expresar una enzima de la vía lipídica en un nivel alterado en comparación con una célula natural de la misma especie. En algunos casos, la célula produce más lípido en comparación con la célula natural cuando ambas células se cultivan en las mismas condiciones. En algunos casos, la célula ha sido modificada genéticamente y/o seleccionada para expresar una enzima de la vía lipídica en un nivel superior que la célula natural. En algunos casos, la enzima de la vía lipídica se selecciona del grupo constituido por piruvato-deshidrogenasa, acetil-CoA-carboxilasa, proteína portadora de acilo y glicerol-3-fosfatoaciltransferasa. En algunos casos, la célula ha sido modificada genéticamente y/o seleccionada para expresar una enzima de la vía lipídica en un nivel inferior que la célula natural. En una realización en la que la célula expresa la enzima de la vía lipídica en un nivel inferior, la enzima de la vía lipídica comprende citrato-sintasa.

[0248] En algunas realizaciones, la célula ha sido modificada genéticamente y/o seleccionada para expresar un regulador global de la síntesis de ácidos grasos en un nivel alterado en comparación con la célula natural, de modo que los niveles de expresión de una pluralidad de genes sintéticos de ácidos grasos se alteran en comparación con la célula natural. En algunos casos, la enzima de la vía lipídica comprende una enzima que modifica un ácido graso. En algunos casos, la enzima de la vía lipídica se selecciona entre una estearoil-ACP-desaturasa y una glicerolípidodesaturasa. En algunos casos, la célula ha sido modificada genéticamente y/o seleccionada para expresar un nivel inferior de una enzima de la vía lipídica o para no expresar en absoluto una enzima de la vía lipídica específica (es decir, donde una enzima de la vía lipídica que ha sido desactivada o reemplazada con un gen exógeno).

[0249] En otras realizaciones, la práctica de la presente invención utiliza un microbio que produce aceite el cual contiene uno o más genes exógenos y/o uno o más genes endógenos inactivados, donde los genes exógenos o endógenos codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo constituido por una acil graso-ACP-tioesterasa, una acil graso-CoA-reductasa, una aldehído graso-reductasa, una acil graso-CoA/aldehído-reductasa, un aldehído graso-descarbonilasa, una desaturasa y una proteína portadora de acilo. En otra realización, un gen de desaturasa endógeno se sobreexpresa en un microbio que contiene uno o más de los genes exógenos anteriores. En una realización, el gen exógeno está en unión operable con un promotor, que se puede inducir o reprimir en respuesta a un estímulo. En algunos casos, el estímulo se selecciona del grupo constituido por una molécula pequeña proporcionada de forma exógena, calor, frío y una cantidad limitada de nitrógeno o en ausencia de este en los medios de cultivo. En algunos casos, el gen exógeno se expresa o se dirige a un compartimento celular. En algunas realizaciones, el compartimento celular se selecciona del grupo constituido por un cloroplasto, un plástido y una mitocondria. En algunas realizaciones, el microbio es Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora o Prototheca zopfii.

[0250] En una realización, el gen exógeno o gen endógeno inactivado codifica una acil graso-ACP-tioesterasa. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno o endógeno inactivado cataliza la escisión de un ácido graso de 8-18 carbonos de una proteína portadora de acilo (ACP). En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno o endógeno inactivado cataliza la escisión de un ácido graso de 10-14 carbonos de una ACP. En una realización, la tioesterasa codificada por el gen exógeno o endógeno inactivado cataliza la escisión de un ácido graso de 12 carbonos de una ACP. En algunas realizaciones, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 16-18 carbonos de una ACP.

[0251] En una realización, el gen exógeno codifica una acil graso CoA/aldehído-reductasa. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 8-18 carbonos para obtener el alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la reductasa codificada por el gen exógeno o gen endógeno inactivado cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 10-14 carbonos para obtener el alcohol primario correspondiente. En una realización, la reductasa codificada por el gen exógeno o endógeno inactivado cataliza la reducción de una acil graso-CoA de 12 carbonos para obtener dodecanol.

[0252] La práctica de los métodos descritos en la presente puede utilizar una célula de Prototheca recombinante (o de otra microalga o microbio) que contiene dos genes exógenos (o dos genes endógenos inactivados), donde un primer gen exógeno o endógeno inactivado codifica una acil graso-ACP-tioesterasa y un segundo gen exógeno o endógeno inactivado codifica una proteína seleccionada del grupo constituido por una acil graso-CoA-reductasa, una acil graso-CoA/aldehído-reductasa y una proteína portadora de acilo. En algunos casos, los dos genes exógenos están cada uno en unión operable con un promotor, que se puede inducir en respuesta a un estímulo. En algunos casos, cada promotor se puede inducir en respuesta a un estímulo idéntico, tal como una cantidad limitada de nitrógeno o en ausencia de este en los medios de cultivo. La limitación o la ausencia total de nitrógeno en los medios de cultivo estimula la producción de aceite en algunos microorganismos, tales como Prototheca y otras especies de microalgas y microbios, y se puede utilizar como desencadenante para inducir la producción de aceite (lípido) hasta niveles altos. Cuando se utiliza combinado con los métodos de ingeniería genética descritos en la presente, la cantidad de lípido en porcentaje de peso celular seco se puede incrementar hasta niveles altos tales como al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70% y al menos un 75%.

[0253] Los aceites (lípidos) novedosos y fluidos dieléctricos derivados de estos descritos en la presente son diferentes de otros aceites naturales con un alto contenido de ácidos grasos C16 y C18, tales como aceite de girasol y canola.

[0254] Además, en las realizaciones en las que se desean aceites con una longitud de cadena más larga, la expresión de uno o más genes TE con una longitud de cadena más corta (es decir, menor de C14, tal como C12, C10 y/o C8) y/o ACP correspondientes se reduce (alterando su expresión) o se elimina (mediante una desactivación, por ejemplo).

[0255] En las diferentes realizaciones descritas anteriormente, la célula de Prototheca (o de otra microalga u otro microbio) puede contener al menos un gen exógeno o al menos un gen endógeno inactivado (o modificado para reducir la expresión) que codifica una enzima de la vía lipídica. En algunos casos, la enzima de la vía lipídica se selecciona del grupo constituido por una estearoil-ACP-desaturasa, una ácido graso-desaturasa, una glicerolípido-desaturasa, una piruvato-deshidrogenasa, una acetil-CoA-carboxilasa, una proteína portadora de acilo y una glicerol-3-fosfatoaciltransferasa. En otros casos, la célula de Prototheca u otra célula contiene una enzima de modificación de lípidos seleccionada del grupo constituido por una acil graso-ACP-tioesterasa, una acil graso-CoA/aldehído-reductasa, un acil graso-CoA-reductasa, un aldehído graso-reductasa, un aldehído graso-descarbonilasa y/o una proteína portadora de acilo.

VI. PRODUCCIÓN DE ACEITE MICROBIANO Y PRODUCTOS DERIVADOS DE ESTE

1. Producción de aceite microbiano

[0256] Para producir aceite microbiano de acuerdo con los métodos descritos en la presente, el aceite bruto no procesado (lípidos) producido por células microbianas se cosecha o se recoge mediante cualquier método conveniente. El aceite se puede aislar mediante extracción celular total, por ejemplo. En este método, las células se someten primero a disrupción y después se pueden separar los lípidos asociados con la pared celular/membrana celular e intracelular y ácidos grasos así como también hidrocarburos extracelulares de la masa celular, tal como mediante el uso de centrifugación descrito anteriormente. Los lípidos intracelulares producidos en microorganismos, en muchas realizaciones, se extraen después o durante el proceso de lisis de las células microbianas.

[0257] Más específicamente, una vez finalizado el cultivo, los microorganismos se separan normalmente del caldo de fermentación. Habitualmente, la separación se efectúa mediante centrifugación para generar una pasta concentrada de biomasa microbiana. A continuación, la biomasa se puede lavar opcionalmente con una solución de lavado (p. ej., agua DI) para eliminar el caldo de fermentación y los desechos. Opcionalmente, la biomasa microbiana lavada se podría secar también (secado en el horno, liofilizado, etc.) antes de la disrupción celular. Por otra parte, las células se pueden lisar sin separarlas de parte o todo el caldo de fermentación cuando la fermentación haya finalizado. Por ejemplo, las células pueden estar en una proporción inferior a 1:1 (V:V) de células respecto al líquido extracelular cuando las células se lisan.

[0258] Los microorganismos que contienen un lípido se pueden lisar para producir un lisado. Tal como se indica en la presente, el paso de lisis de un microorganismo (denominado también lisis celular) se puede conseguir mediante cualquier método conveniente, incluidas la lisis termoinducida, adición de una base, adición de un ácido, utilizando enzimas tales como proteasas y enzimas de degradación de polisacáridos, tales como amilasas, utilizando ultrasonidos, lisis mecánica, utilizando choque osmótico, infección con un virus lítico y/o expresión de uno o más genes líticos. La lisis se lleva a cabo para liberar moléculas intracelulares que han sido producidas por el microorganismo. Cada uno de estos métodos para la lisis de un microorganismo se puede usar como método único o en combinación simultánea o secuencial. El alcance de la disrupción celular se puede observar por análisis microscópico. Mediante uno o más de los métodos descritos anteriormente, se observa normalmente más de un 70% de ruptura celular. Preferentemente, la ruptura celular es superior a un 80%, más preferentemente superior a un 90% y aún más preferentemente aproximadamente un 100%.

[0259] En realizaciones particulares, el microorganismo se lisa después del cultivo, por ejemplo, para incrementar la exposición del aceite microbiano para la extracción o procesamiento posterior. Si se utiliza un gen de lipasa exógeno, el momento de la expresión de la lipasa (p. ej., a través de un promotor inducible) o lisis celular se puede ajustar para optimizar el rendimiento de lípidos y/o hidrocarburos. A continuación, se describen varias técnicas de lisis. Estas técnicas se pueden usar individualmente o en cualquier combinación.

[0260] En una realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende calentar una suspensión celular que contiene el microorganismo. En esta realización, el caldo de fermentación que contiene los microorganismos (o una suspensión de microorganismos aislada del caldo de fermentación) se calienta hasta que los microorganismos, es decir, las paredes y membranas celulares de microorganismos, se degradan o rompen. Normalmente, las temperaturas aplicadas son de al menos 50 oC. Se utilizan temperaturas superiores, tales como de al menos 30 oC, al menos 60 oC, al menos 70 oC, al menos 80 oC, al menos 90 oC, al menos 100 oC, al menos 110 oC, al menos 120 oC o al menos 130 oC o superiores, para una lisis celular más eficiente. La lisis celular por tratamiento térmico se puede realizar hirviendo el microorganismo. Como alternativa, el tratamiento término (sin hervir) se puede realizar en un autoclave. El lisado termotratado se puede enfriar para el tratamiento posterior. La disrupción celular también se puede realizar mediante un tratamiento con vapor, es decir, medinate la adición de vapor presurizado. Por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.o 6.750.048 se describe el tratamiento con vapor de microalgas para la disrupción celular. En algunas realizaciones, el tratamiento con vapor se puede conseguir inyectando vapor en el fermentador y manteniendo el caldo a una temperatura deseada durante menos de aproximadamente 90 minutos, preferentemente menos de aproximadamente 60 minutos y más preferentemente menos de aproximadamente 30 minutos.

[0261] En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende añadir una base a una suspensión celular que contiene el microorganismo. La base debe ser suficientemente fuerte para hidrolizar al menos una porción de los compuestos proteicos de los microorganismos utilizados. Las bases que son útiles para solubilizar proteínas se conocen en la técnica de la química. Las bases ilustrativas que son útiles en realizaciones de los métodos de la presente invención incluyen, sin carácter limitante, hidróxidos, carbonatos y bicarbonatos de litio, sodio, potasio, calcio y mezclas de estos. Una base preferida es KOH. Por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.o 6.750.048 se describe el tratamiento con base de microalgas para la disrupción celular.

[0262] En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende añadir un ácido a una suspensión celular que contiene el microorganismo. La lisis ácida se puede conseguir utilizando un ácido en una concentración de 10-500 mN o preferentemente 40-160 nM. La lisis ácida se realiza preferentemente a una temperatura superior a la temperatura ambiente (p. ej., a 40-160 °C, es decir, una temperatura de 50-130 °C). Para temperaturas moderadas (p. ej., de temperatura ambiente a 100 °C y particularmente de temperatura ambiente a 65 °C), el tratamiento ácido se puede combinar de forma útil con sonicación u otros métodos de disrupción celular.

[0263] En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende lisar el microorganismo utilizando una enzima. Las enzimas preferidas para lisar un microorganismo son proteasas y enzimas que degradan polisacáridos tales como hemicelulasa (p. ej., hemicelulasa de Aspergillus niger; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #H2125), pectinasa (p. ej., pectinasa de Rhizopus sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #P2401), Mannaway 4.0 L (Novozymes), celulasa (p. ej., celulasa de Trichoderma viride; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #C9422) y driselasa (p. ej., driselasa de Basidiomycetes sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #D9515).

[0264] En otras realizaciones de la presente invención, la lisis se consigue utilizando una enzima tal como, por ejemplo, una celulasa tal como una enzima que degrada polisacáridos, opcionalmente de Chlorella o un virus de Chlorella, y/o una proteasa, tal como proteasa de Streptomyces griseus, quimotripsina, proteinasa K, proteasas enumeradas en Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Y et al., Journal of Polymers and the Environment, Volumen 8, Número 1, enero de 2000, págs. 29-32(4), Alcalase 2.4 FG (Novozymes) y Flavourzyme 100 L (Novozymes). También se puede utilizar cualquier combinación de una proteasa y una enzima que degrada polisacáridos, incluida cualquier combinación de las proteasas precedentes y enzimas que degradan polisacáridos.

[0265] En otra realización, la lisis se puede realizar utilizando una prensa de tornillo. En este proceso, la biomasa se impulsa a través de un dispositivo de tipo tornillo a una presión elevada, lisando las células, y haciendo que el lípido intracelular se libere y se separe de la proteína y fibra (y el resto de los componentes) de la célula.

[0266] En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo se realiza utilizando ultrasonidos, es decir, sonicación. Por lo tanto, las células también se pueden lisar con sonidos de alta frecuencia. Los sonidos se pueden producir electrónicamente y transportar a través de un ápice metálico hasta una suspensión celular concentrada de forma apropiada. Esta sonicación (o ultrasonicación) provoca la disrupción de la integridad celular debido a la creación de cavidades en la suspensión celular.

[0267] En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo se realiza mediante lisis mecánica. Las células se pueden lisar mecánicamente y opcionalmente homogeneizar para facilitar la separación de los hidrocarburos (p. ej., lípido). Por ejemplo, se puede emplear un desestabilizador de la presión para bombear una célula que contiene la suspensión a través de una válvula con un orificio restringido. Se aplica alta presión (de hasta 1500 bares), seguida por una expansión instantánea a través de una boquilla de salida. La disrupción celular se consigue mediante tres mecanismos diferentes: el impacto sobre la válvula, la alta tensión de cizalla del líquido en el orificio y la reducción repentina de la presión durante la descarga, lo cual hace que la célula reviente. El método libera moléculas intracelulares. Como alternativa, se puede usar un molino de bolas. En un molino de bolas, las células se agitan en suspensión con partículas abrasivas pequeñas, tales como microesferas. Las células se rompen debido a fuerzas de cizalla, molienda entre las microesferas y colisiones con las microesferas. Las microesferas rompen las células para que se libere el contenido celular. Las células también se pueden romper por acción de fuerzas de cizalla, tal como empleando un mezclador (tal como, por ejemplo, una licuadora Waring o de alta velocidad), una prensa francesa o incluso con centrifugación, cuando las paredes celulares sean débiles, para romper las células.

[0268] En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo se realiza aplicando un choque osmótico (es decir, suspendiendo las células del microorganismo en una solución hipotónica).

[0269] En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende infectar el microorganismo con un virus lítico. Se conocen una amplia gama de virus que lisan microorganismos adecuados para utilizar los métodos descritos en la presente, y la selección y el uso de un virus lítico particular para un microorganismo particular entra dentro de las competencias de la técnica. Por ejemplo, el virus de paramecium bursaria chlorella (PBCV-1) es el prototipo de un grupo (familia Phycodnaviridae, género Chlorovirus) de virus con ADN bicatenario, formadores de placas, icosahédricos y grandes que lisan y se replican en ciertas algas verdes similares a Chlorella eucariotas e unicelulares. Por consiguiente, cualquier microalga sensible se puede lisar infectando el cultivo con un virus de Chlorella adecuado. Se conocen métodos para infectar especies de Chlorella con un virus de Chlorella . Remítase, por ejemplo, a Adv. Virus Res. 2006;66:293-336; Virology, 25 de abril de 1999;257(1):15-23; Virology, 5 de enero de 2004;318(1):214-23; Nucleic Acids Symp. Ser. 2000;(44):161-2; J. Virol. marzo de 2006;80(5):2437-44; y Annu. Rev. Microbio!. 1999;53:447-94.

[0270] En otra realización de la presente invención, el paso de lisis de un microorganismo comprende la autólisis. En esta realización, un microorganismo se modifica genéticamente para que produzca una proteína lítica que lisará el microorganismo. Este gen lítico se puede expresar utilizando un promotor inducible, de modo que las células se pueden cultivar primero hasta una densidad deseada en un fermentador y a continuación se induce el promotor para expresar el gen lítico que lisará las células. En una realización, el gen lítico codifica una enzima que degrada polisacáridos. En ciertas realizaciones diferentes, el gen lítico es un gen que proviene de un virus lítico. Así pues, por ejemplo, un gen lítico de un virus de Chlorella se puede expresar en una célula algácea; remítase a Virology 260, 308­ 315 (1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387 (1999); y Virology 230, 361-368 (1997). La expresión de genes líticos se realiza preferentemente utilizando un promotor inducible, tal como un promotor activo en microalgas el cual se induce mediante un estímulo tal como la presencia de una pequeña molécula, luz, calor y otros estímulos.

[0271] Se dispone de varios métodos para separar lípidos de lisados celulares producidos mediante los métodos anteriores. Por ejemplo, se pueden extraer lípidos y derivados de lípidos, tales como aldehídos grasos, alcoholes grasos e hidrocarburos, tales como alcanos, con un disolvente hidrófobo tal como hexano (remítase a Frenz et al.

1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717). También se pueden extraer lípidos y derivados de lípidos utilizando licuación (remítase, por ejemplo, a Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 e Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4):269-274); licuación de aceite (remítase, por ejemplo, a Minowa et al. 1995, Fuel 74(12):1735-1738); y extracción de CO2 supercrítico (remítase, por ejemplo, a Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334). Miao y Wu describen un protocolo para la recuperación de lípidos microalgáceos a partir de un cultivo de Chlorella prototheocoides, en el que las células se cosecharon por centrifugación, se lavaron con agua destilada y se secaron por liofilización. El polvo celular resultante se pulverizó en un mortero y después se extrajo con n-hexano. Miao y Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846.

[0272] Por lo tanto, se pueden recuperar lípidos, derivados de lípidos e hidrocarburos generados por los microorganismos descritos en la presente extrayendo con un disolvente orgánico. En algunos casos, el disolvente orgánico preferido es hexano. Normalmente, el disolvente orgánico se añade directamente al lisado sin separar previamente los componentes del lisado. En una realización, el lisado generado mediante uno o más de los métodos descritos anteriormente se pone en contacto con un disolvente orgánico durante un período de tiempo suficiente para permitir que los componentes lipídicos y/o hidrocarbonados formen una solución con el disolvente orgánico. En algunos casos, además la solución se puede refinar posteriormente para recuperar de manera específica los componentes lipídicos o hidrocarbonados deseados. Los métodos de extracción con hexano son muy conocidos en la técnica.

[0273] Otros métodos para extraer lípidos de microorganismos se describen en la solicitud de patente N.o US10/031108, incorporada a la presente por referencia.

[0274] Los lípidos y derivados de lípidos, tales como aldehídos grasos, alcoholes grasos e hidrocarburos, tales como alcanos, producidos por las células tal como se describe en la presente se pueden modificar utilizando una o más enzimas, incluida una lipasa. Cuando los hidrocarburos están en el entorno extracelular de las células, la enzima o las encimas se pueden añadir al entorno en condiciones en las que la enzima modifique el hidrocarburo o complete su síntesis a partir de un precursor de hidrocarburos. Como alternativa, los hidrocarburos se pueden aislar parcial o completamente del material celular antes de añadir uno o más catalizadores tales como enzimas. Tales catalizadores se añaden exógenamente y su actividad ejerce en el exterior de la célula o in vitro.

2. Procesamiento posterior del aceite microbiano

[0275] Así pues, los lípidos o hidrocarburos producidos por las células in vivo o modificados enzimáticamente in vitro, tal como se describe en la presente, opcionalmente se pueden procesar posteriormente de un modo convencional. El procesamiento puede incluir "craqueo" para reducir el tamaño e incrementar de este modo la proporción de hidrógeno:carbono de las moléculas hidrocarbonados. Los métodos de craqueo catalítico y térmico se utilizan habitualmente en el procesamiento de aceites triglicéridos e hidrocarbonados. Los métodos catalíticos implican el uso de un catalizador, tal como un catalizador ácido sólido. El catalizador puede ser sílice-alúmina o una zeolita, que produce la ruptura asimétrica o heterolítica de un enlace carbono-carbono para dar como resultado un carbocatión y un anión hidruro. Estos intermedios reactivos experimentan posteriormente una transposición o transferencia de hidruro con otro hidrocarburo. Las reacciones pueden regenerar de este modo los intermedios para dar como resultado un mecanismo de cadena autopropagante. Los hidrocarburos también se pueden procesar para reducir, opcionalmente hasta cero, el número de dobles o triples enlaces carbono-carbono que estos contengan. Los hidrocarburos también se pueden procesar para eliminar o retirar un anillo o estructura cíclica que estos contengan. Los hidrocarburos también se pueden procesar para incrementar la proporción de hidrógeno:carbono. Esto puede incluir la de la adición de hidrógeno ("hidrogenación") y/o el "craqueo" de hidrocarburos para obtener hidrocarburos más pequeños.

[0276] Una vez que se han extraído los lípidos, estos se pueden someter, de acuerdo con los métodos descritos en la presente, a uno o más pasos de procesamiento. Estos pasos de procesamiento son diferentes de los pasos de refinación que se realizan sobre el crudo (p. ej., petróleo y otras fuentes) en la producción de combustibles. Estos pasos de procesamiento en algunos aspectos son comparables con los que se realizan sobre los aceites seminales durante la producción de aceite apto para el consumo humano. En algunas realizaciones, los lípidos extraídos se desgoman para extraer lecitina y otros fosfolípidos. En otras realizaciones, los lípidos extraídos se refinan utilizando una base o un metal alcalino. En otras realizaciones más, los lípidos extraídos se hacen pasar a través de arcilla decolorante, normalmente una arcilla ácida. En otras realizaciones, los lípidos extraídos se desodorizan para eliminar o reducir las impurezas volátiles tales como aldehídos y cetonas. En otras realizaciones más, los lípidos extraídos se winterizan para eliminar o reducir las ceras o grasas saturadas. Los pasos de procesamiento anteriores se pueden realizar combinados de cualquier forma sobre los lípidos extraídos, dependiendo de las características del producto deseado. Los lípidos extraídos que han sido refinados (p. ej., con una base o un metal alcalino), decolorados (p. ej., con una arcilla decolorante) y/o desodorizados se suelen denominar aceite RBD. El aceite RBD producido a partir de lípidos extraídos de microalgas y/o levaduras oleaginosas descritas en la presente es útil en diversas aplicaciones industriales, incluida la producción de fluidos dieléctricos.

[0277] En algunas realizaciones, la desgomación se realiza para eliminar contaminantes, tales como fosfolípidos, del aceite. En algunas realizaciones de la invención, la desgomáción del aceite extraído forma parte de la refinación, decoloración y desodoración (o RBD). El proceso RBD elimina o reduce el olor, color y/o sabor del aceite extraído. En algunas realizaciones, el proceso de refinación normalmente consiste en dos etapas: desgomación y un paso de neutralización que elimina los ácidos grasos libres (FFA, por sus siglas en inglés) del aceite mediante separación cáustica con hidróxido de sodio. El paso de decoloración puede implicar mezclar el aceite con varias arcillas decolorantes para que absorban color, metales traza y compuestos de azufre. El paso de desodorización puede ser un proceso de destilación que tiene lugar a baja presión y temperatura elevada. En un proceso de destilación ilustrativo, el aceite se somete a vacío y se calienta con una corriente para eliminar cualquier sabor u olor residual y FFA. La desodorización también se puede conseguir por tratamiento con carbón activo.

[0278] Los pasos enumerados anteriormente pueden servir para reducir el punto de fluidez. En varias realizaciones, el punto de fluidez del aceite microbiano (lípido) se puede reducir hasta aproximadamente -10 oC, aproximadamente -15 oC, aproximadamente -20 oC, aproximadamente -25 oC, aproximadamente 30 oC, aproximadamente -35 oC o aproximadamente -40 oC. Además, el punto de fluidez del aceite microbiano puede estar comprendido dentro de cualquier rango limitado por cualquiera de estos valores, p. ej., de aproximadamente -10 oC a -40 oC o de aproximadamente -15 oC a aproximadamente -35 oC, etc. La reducción del punto de fluidez se puede producir porque estos pasos reducen la proporción relativa de la fracción saturada, que consiste fundamentalmente en triglicéridos palmíticos y esteáricos, conocidos como la fracción estearínica. El fraccionamiento del aceite reduce la concentración de triglicéridos saturados del aceite. El fraccionamiento se puede realizar mediante fraccionamiento en seco, como en el proceso de winterización conocido en la industria del aceite vegetal. En este proceso, el aceite microbiano (p. ej., algáceo) primero se refina, decolora y desodoriza mediante métodos similares a los utilizados en la industria del aceite vegetal. De este modo se obtiene aceite con un punto de fluidez comprendido en el rango de -5 a -10 oC, por ejemplo, -8 oC.

[0279] Posteriormente se puede reducir la temperatura del aceite RBD de una forma controlada hasta que se forman núcleos cristalinos. A continuación, el aceite se mantiene a esta temperatura de cristalización durante varias horas para fomentar el crecimiento de cristales. Los cristales se retiran posteriormente mediante filtración para obtener dos fracciones: una fase sólida que contiene parte o gran parte de la fracción estearínica y una fase líquida que contiene la mayor parte de la fracción oleínica. De este modo se obtiene aceite con un punto de fluidez comprendido en el rango de -8 a -15 oC, por ejemplo, -11 oC. La fase líquida se puede someter de nuevo a fraccionamiento hasta una temperatura de cristalización menor para obtener una eliminación adicional de estearina. La fracción líquida purificada resultante, equivalente a una superoleína, nombre con el que se le conoce habitualmente en la industria del aceite vegetal, tiene unas propiedades térmicas mejores que las del aceite microbiano nativo. Por ejemplo, un segundo fraccionamiento puede dar como resultado un aceite con un punto de fluidez comprendido en el rango de -15 oC a -25 oC, por ejemplo, -20 oC. El aceite resultante es excepcionalmente útil en varias aplicaciones.

3. Productos derivados de aceites microbianos

[0280] Los aceites microbianos descritos en la presente también se pueden utilizar para producir productos, tales como lubricantes, fluidos hidráulicos, aceites industriales o fluidos dieléctricos. Los aceites industriales comunes incluyen lubricantes para barras de motosierras, fluidos de metalistería, lubricantes aptos para el uso alimentario, aceites para engranajes, aceites marinos, lubricantes para motores, aceites para tractores, lubricantes para maquinaria agrícola, aceites para elevadores, aceites desmoldantes y similares. Los fluidos dieléctricos se utilizan habitualmente para enfriar y/o aislar eléctricamente componentes eléctricos (especialmente en equipo de distribución de energía eléctrica de alto voltaje), tales como, por ejemplo, autorreconectadores, condensadores, disyuntores, cables de transmisión rellenos de fluido de alto voltaje, componentes de distribución de potencia, conmutador (p. ej., un disyuntor automático de alto voltaje, tal como los descritos en USPN 6.797.909), transformadores, componentes de transmisión y reguladores del voltaje.

[0281] Los fluidos dieléctricos tradicionales incluyen los lubricantes a base de aceite mineral. Estos incluyen aceites base del Grupo 1, II y II+, que son aceites base de petróleo que han sido refinados de forma convencional o hidrotratados ligeramente y tienen un índice de viscosidad (IV) inferior a 120. Estos también incluyen aceites base del Grupo III (incluido el "aceite de motor sintético" en los EE. UU.) que son productos oleosos convencionales muy refinados. Los aceites base del Grupo III se pueden preparar mediante hidroprocesamiento (hidrocraqueo y/o hidroisomerización) de aceites base del Grupo 1 o Grupo II/II+, y contienen menos saturados, azufre, y nitrógeno que los aceites base del Grupo I, II o II+, y tienen un IV superior a 120. La Sociedad Estadounidense para Pruebas de Materiales (ASTM, por sus siglas en inglés) establece especificaciones para fluidos dieléctricos y otras composiciones hidrocarbonadas (tales como combustible diésel (D975 de la ASTM), turbosina (D1655 de la ASTM) y biodiésel (D6751 de la ASTM)) de acuerdo con cualquiera de varios factores, tales como el punto de ebullición, índice de cetano, punto de enturbiamiento, punto de inflamación, viscosidad, punto de anilina, contenido de azufre, contenido de agua, contenido de cenizas, corrosión en lámina de cobre y residuo carbonoso.

[0282] Los fluidos dieléctricos de origen biológico se pueden preparar mediante diversos procesos. Por ejemplo, un proceso, que parte de aceite vegetal crudo implica el paso de desgomación, refinación alcalina, decoloración, desodorización, hidrogenación, winterización (para obtener aceite vegetal RBD), tratamiento con una arcilla para eliminar compuestos polares traza y materiales ácidos (remítase a la patente de EE. UU. N.o 6.274.067) y combinación con aditivos para producir fluidos dieléctricos de origen biológico.

[0283] Las propiedades fundamentales de los fluidos dieléctricos incluyen: viscosidad, inflamabilidad, reactividad, miscibilidad, capacidad de aislamiento eléctrico, biodegradabilidad y costos de fabricación. Aunque estas y otras propiedades se revisen a continuación, el lector podrá apreciar mejor algunas de las ventajas de ciertas realizaciones de la presente invención comprendiendo algunas de las ventajas y desventajas de fluidos dieléctricos de origen biológico tradicionales frente a fluidos dieléctricos a base de aceite mineral. Para la viscosidad, los fluidos dieléctricos de origen biológico generalmente tienen una viscosidad y un punto de fluidez superiores y, por lo tanto, peores propiedades a temperaturas bajas en comparación con los fluidos dieléctricos a base de aceite mineral. Sin embargo, la viscosidad de estos últimos puede variar de lote a lote debido a la incoherencia entre los compuestos en diferentes fuentes de aceite mineral y debido a su complejidad. Los fluidos dieléctricos de origen biológico por lo general tienen puntos de inflamación y combustión superiores (de al menos el doble) en comparación con los fluidos dieléctricos a base de aceite mineral. Los fluidos dieléctricos de origen biológico por lo general tienen una estabilidad hidrolítica, térmica y oxidativa inferior, y un índice de acidez superior (de al menos el doble) en comparación con los fluidos dieléctricos a base de aceite mineral. Los fluidos dieléctricos de origen biológico son por lo general más biodegradables y tienen una toxicidad inferior en comparación con los fluidos dieléctricos a base de aceite mineral, y están hechos de una fuente renovable, en vez de perecedera. La producción de fluidos dieléctricos de origen biológico generalmente es más costosa y requiere más aditivos en comparación con los fluidos dieléctricos a base de aceite mineral.

[0284] Los métodos de la presente invención proporcionan nuevos fluidos dieléctricos que, en ciertas realizaciones, tienen todas las ventajas de los fluidos dieléctricos de origen biológico tradicionales con menos, y en algunas realizaciones con ninguno, de los inconvenientes. Estas y otras ventajas de los presentes métodos se podrán apreciar mejor teniendo en cuenta la siguiente discusión de las propiedades generales de los fluidos dieléctricos.

[0285] Idealmente, la viscosidad de un fluido dieléctrico debería variar lo menos posible con la temperatura. La viscosidad es una medida de la resistencia de un fluido a fluir o a esfuerzos de cizalla ("espesor") y se mide como viscosidad cinemática (kv) y absoluta (dinámica) (cSt o mm2/s a 40 y 100 °C). (D2270-04 de la ASTM; D445 de la ASTM; D88 de la ASTM). En general, se prefiere el lubricante menos viscoso que separe de forma adecuada dos superficies en movimiento. La viscosidad se considera a veces la característica más importante de un fluido hidráulico. Si la viscosidad es demasiado elevada, entonces la fricción, la caída de presión, el consumo de energía y la generación de calor aumentan. Si la viscosidad es demasiado baja, entonces puede que como resultado de esto las fugas internas aumenten a temperaturas operacionales superiores. La película oleosa puede ser insuficiente para prevenir el desgaste excesivo o el posible agarrotamiento de las partes móviles. Las viscosidades ilustrativas (en unidades cSt) de fluidos dieléctricos derivados de diversas fuentes son: derivados de aceite mineral: 20 a 40 °C y 4 a 100 °C; derivados de aceite de soja: 30 a 40 °C y 7.6 a 100 °C; derivados de aceite de girasol: 40 a 40 °C y 8.7 a 100 °C; y derivados de aceite de colza (canola): 33 a 40 °C. (Siniawski et al.; J. Synthetic Lubrication; 24, 101-110 (2007); Schneider; J. Sci. Food Agric., 86, 1769-1780 (2006)). Los métodos de la presente invención pueden, en realizaciones particulares, proporcionar fluidos dieléctricos con viscosidades similares a las de los fluidos dieléctricos derivados de las fuentes precedentes. En realizaciones ilustrativas, el fluido dieléctrico tiene una viscosidad a 40 °C menor de aproximadamente 110 cSt, p. ej., comprendida en el rango de 20 a 30 cSt, y/o una viscosidad a 100 °C comprendida en el rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 cSt, p. ej., 4-8 cSt.

[0286] El índice de viscosidad (IV, un número sin unidades) es una medida de la variación de la viscosidad con la variación de temperatura. Para IV, se compara la kv del aceite a 40°C con dos aceites de referencia (con IV de 0 y 100), donde todos los aceites tienen la misma kv a 100 °C (D2270 de la ASTM). El valor de IV generalmente debe ser lo mayor posible. Unos valores de IV altos indican que la viscosidad del aceite cambia poco con la temperatura. En general: un IV bajo es inferior a 35; un IV medio está comprendido entre 35 y 80; un IV alto está comprendido entre 80 y 110; un IV muy alto está comprendido entre 110 y 125; un IV super está comprendido entre 125 y 160; y un IV superalto es mayor o igual a 160. Los IV de fluidos dieléctricos derivados de diversos materiales de partida incluyen: derivados de aceite mineral: 103; derivados de aceite de soja: 246 y derivados de aceite de girasol: 206. (Siniawski et al.; J. Synthetic Lubrication; 24, 101-110 (2007)). Los métodos de la presente invención pueden, en realizaciones particulares, proporcionar fluidos dieléctricos con IV similares a los de los fluidos dieléctricos derivados de las fuentes precedentes.

[0287] El punto de fluidez es la temperatura más baja a la que un líquido fluirá o se podrá verter (°C) (D97 de la ASTM). El punto de fluidez debe ser al menos 10 °C inferior a la temperatura ambiente menor anticipada a la que se utilizará el fluido dieléctrico. Los puntos de fluidez de fluidos dieléctricos derivados de diversos materiales de partida incluyen: derivados de aceite mineral: -50 °C; derivados de aceite de soja: -9 °C; derivados de aceite de girasol: -12 °C y derivados de aceite de colza (canola): -21 °C. (Siniawski et al.; J. Synthetic Lubrication; 24, 101-110 (2007)). Los métodos de la presente invención pueden, en realizaciones particulares, proporcionar fluidos dieléctricos con puntos de fluidez similares a los de los fluidos dieléctricos derivados de las fuentes precedentes. En varias realizaciones, el punto de fluidez de un fluido dieléctrico a base de aceite microbiano puede ser de aproximadamente -10 oC, aproximadamente -15 oC, aproximadamente -20 oC, aproximadamente -25 oC, aproximadamente 30 oC, aproximadamente -35 oC o aproximadamente -40 oC. Además, el punto de fluidez del fluido dieléctrico a base de aceite microbiano puede estar comprendido dentro de cualquier rango limitado por cualquiera de estos valores, p. ej., de aproximadamente -10 oC a -40 oC o de aproximadamente -15 oC a aproximadamente -35 oC, etc.

[0288] Por ejemplo y tal como se describió anteriormente, el aceite RBD producido de acuerdo con los métodos descritos en la presente se puede producir fácilmente con puntos de fluidez menores o iguales a aproximadamente -8 oC. Este punto de fluidez se puede reducir aún más mezclando el aceite RBD con un depresor del punto de fluidez para obtener aceites con puntos de fluidez comprendidos en el rango de -15 a -20 oC o inferiores en función de la cantidad de depresor del punto de fluidez que se añada al aceite. La fracción oleínica obtenida de un único fraccionamiento produce fácilmente aceite con un punto de fluidez de aproximadamente -11 °C, que se puede reducir mezclando la fracción oleínica con un depresor del punto de fluidez para obtener aceites con puntos de fluidez comprendidos en el rango de -16 a -20 oC o inferiores en función de la cantidad de depresor del punto de fluidez añadido al aceite. La fracción oleínica obtenida de un segundo fraccionamiento ("superoleína") produce fácilmente aceite con un punto de fluidez de aproximadamente -20°C, que se puede reducir mezclando la fracción superoleínica con un depresor del punto de fluidez para obtener aceites con puntos de fluidez inferiores a -20 oC, es decir, de -26 °C o inferiores, en función de la cantidad de depresor del punto de fluidez añadido al aceite. Se dispone de una amplia gama de depresores del punto de fluidez comercializados por Chevron, Oronite, Infineum, General Electric, RohmMax Evonik y otras empresas. Los depresores del punto de fluidez ilustrativos para utilizar con los aceites microbianos (lípidos) descritos en la presente incluyen VIs Co PLEX® 10-310 o 1-133 (Rohmax-Evonik Additives GmbH), u otros poli(alquil)acrilatos y poli(metil)acrilatos tales como INFINEUM® V-351 (Infineum UK limitied), PMA-D110 y PmA D.

[0289] La lubricidad (propiedades antidesgaste) de un fluido dieléctrico es importante, ya que se produce un desgaste prematuro cuando la viscosidad del fluido es insuficiente y la película del fluido no evita el contacto con la superficie (D2882 de la ASTM). En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención proporcionan fluidos dieléctricos con una lubricidad buena (equivalente o mejor a D2882 de la ASTM).

[0290] La volatilidad o la tendencia de un aceite a vaporizarse (atm de vapor frente a oC) también es importante para un fluido dieléctrico. En general, se prefiere una volatilidad baja. En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención pueden proporcionar fluidos dieléctricos con una volatilidad tan baja como la de los fluidos dieléctricos a base de aceite mineral y de origen biológico tradicionales o incluso inferior.

[0291] La inflamabilidad del fluido dieléctrico es importante. En general, se prefiere una inflamabilidad baja (remítase a “Bio-Based Lubricants: A Market Opportunity Study Update” United Soybean Board, noviembre de 2008, Omni Tech International, Ltd., www.soynewuses.org/downloads/reports/BioBasedLubricantsMarketStudy.pdf). Los métodos de la presente invención pueden, en realizaciones particulares, proporcionar fluidos dieléctricos con una inflamabilidad tan baja como la de los fluidos dieléctricos a base de aceite mineral y de origen biológico tradicionales o incluso inferior.

[0292] El punto de inflamación es la temperatura más baja (°C) a la que un aceite se vaporiza para formar una mezcla inflamable en el aire. D3278, D3828, D56 y D93 de la ASTM describen las especificaciones del punto de inflamación adecuadas para los fluidos dieléctricos. Para prevenir la ignición del aceite, el punto de inflamación generalmente debe ser lo mayor posible. Los puntos de inflamación de fluidos dieléctricos derivados de diversas fuentes incluyen: derivados de aceite mineral: 147 °C; y derivados de TAG (típicos): 324 °C. (New Safety Dielectric Coolants for Distribution and Power Transformers, www.cooperpower.com/Library/pdf/00048.pdf). En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención pueden proporcionar fluidos dieléctricos con puntos de inflamación similares a los de fluidos dieléctricos derivados de las fuentes anteriores, y mayores o iguales a los de las especificaciones de D1310 de la ASTM y D92 de la ASTM.

[0293] El punto de combustión es la menor temperatura (°C) a la que un aceite continuará quemándose durante al menos cinco segundos tras la ignición con una llama abierta. D1310 de la ASTM y D92 de la ASTM describen las especificaciones del punto de combustión adecuadas para los fluidos dieléctricos. Para prevenir la ignición del aceite, el punto de combustión debe ser lo mayor posible. Los puntos de combustión de fluidos dieléctricos derivados de diversas fuentes incluyen: derivados de aceite mineral: 165 °C; y derivados de TAG (típicos): 360 °C. (New Safety Dielectric Coolants for Distribution and Power Transformers, www.cooperpower.com/Library/pdf/00048.pdf). En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención pueden proporcionar fluidos dieléctricos con puntos de combustión similares a los de fluidos dieléctricos derivados de las fuentes anteriores, y mayores o iguales a los de las especificaciones de D1310 de la ASTM y D92 de la ASTM. En algunas realizaciones, dicho punto de combustión es superior a 300 °C, p. ej., entre 300 °C y 450 °C.

[0294] La reactividad de un fluido dieléctrico es importante; el fluido dieléctrico no debe reaccionar (o debe tener una reactividad baja) con ácidos/bases, calor y aire.

[0295] La reactividad hidrolítica se refiere a la tendencia de un fluido a descomponerse en presencia de ácidos o bases. D2619 de la ASTM y D943 de la ASTM describen las especificaciones de la reactividad hidrolítica adecuadas para los fluidos dieléctricos. En TAG, los grupos funcionales sensibles son los ésteres y grupos funcionales sensibles a ácidos/bases. Los métodos de la presente invención pueden, en realizaciones particulares, proporcionar fluidos dieléctricos con una reactividad hidrolítica baja (equivalente o mejor a D2619 de la ASTM y/o D943 de la ASTM).

[0296] Estabilidad térmica se refiere a la tendencia de un fluido dieléctrico a la descomposición térmica. En fluidos dieléctricos derivados de aceite de origen biológico, la inestabilidad térmica habitualmente se debe a los hidrógenos p del glicerol, que al final da como resultado productos de eliminación. Los métodos de la presente invención pueden, en realizaciones particulares, proporcionar fluidos dieléctricos con una estabilidad térmica alta (mayor o igual a la de los fluidos dieléctricos derivados de aceite de origen biológico tradicionales).

[0297] La sensibilidad oxidativa se refiere a la tendencia de un fluido dieléctrico a reaccionar con oxígeno para formar productos de oxidación. D943 de la ASTM y D2272 de la ASTM describen la estabilidad oxidativa adecuada para los fluidos dieléctricos. Se prefiere una sensibilidad oxidativa baja; los valores superiores indican más lubricantes oxidativos. En ciertas realizaciones, los métodos de la presente invención pueden, en realizaciones particulares, proporcionar fluidos dieléctricos con una sensibilidad oxidativa baja (p. ej., D943 de la ASTM o D2272 de la ASTM).

[0298] El índice de neutralización (índice de acidez/número de ácido) es una medida de la cantidad de ácido contenida en un aceite o fluido dieléctrico. Los ácidos se forman como aceites (o fluidos dieléctricos) oxidados con el paso del tiempo y el uso. Los ácidos se originan en lubricantes de origen biológico a partir de la oxidación, termólisis de ésteres o hidrólisis ácida/básica. D947 de la ASTM, D3487 de la ASTM y D6871 de la ASTM describen los índices de neutralización adecuados para fluidos dieléctricos. En general, el índice de acidez debe ser lo menor posible. El número de ácido para aceite mineral estándar es de 0.03 y para aceite de origen biológico es de 0.06. (Ester Transformer Fluids, IEEE/PES Transformer Committee Meeting, 7 de octubre de 2003, www.transformerscommittee.org/info/F03/F03-EsterFluids.pdf). Los métodos de la presente invención pueden, en realizaciones particulares, proporcionar fluidos dieléctricos con números de ácido bajos (p. ej., D947 de la ASTM, D3487 de la ASTM o D6871 de la ASTM).

[0299] El término "miscibilidad" se refiere a la capacidad de un fluido para mezclarse con otros fluidos. Idealmente, un fluido dieléctrico se debería mezclar bien con otros lubricantes, fluidos y aditivos pero no con agua. El término "demulsibilidad" se refiere a lo bien que un fluido hidráulico resiste a mezclarse con agua. La demulsibilidad es óptima en un fluido dieléctrico. La miscibilidad con lubricantes y aditivos deseados es óptima en un fluido dieléctrico. En ciertas realizaciones, los métodos de la presente invención pueden, en realizaciones particulares, proporcionar fluidos dieléctricos con una miscibilidad y una demulsibilidad buenas.

[0300] Los fluidos dieléctricos deben tener buenas propiedades de aislamiento eléctrico, es decir, deben evitar que la corriente eléctrica se disipe. Se realizan pruebas de determinación del factor de potencia de aislamiento en transformadores para medir las pérdidas dieléctricas (medidas en %). Este valor indica el estado del transformador -humedad, sequedad, deterioro del aislamiento, el estado de los devanados, barreras, conmutadores de tomas, bujes y aceite. Los valores del factor de potencia asociados con un fluido dieléctrico deben ser lo menor posible, normalmente menores o iguales a un 0.5%. Por ejemplo, el factor de potencia de un aceite nuevo enviado desde una refinería no debe ser superior a un 0.05% a 25 °C y no debe ser superior a un 0.3% a 100 °C. (Directriz C57 del IEEE , 106-1991 tal como se cita en www.nttworldwide.com/tech2209.htm). Para el nuevo aceite en un equipo nuevo que opera a 69 kV o menos, el factor de potencia no debe ser superior a un 0.15% a 25 °C y no debe ser superior a un 1.5% a 100 °C; que opera a 69 kV o a 288 kV o menos, el factor de potencia no debe ser superior a un 0.10% a 25 °C y no debe ser superior a un 1.0% a 100 °C; que opera a 345 kV o más, el factor de potencia no debe ser superior a un 0.05% a 25 °C y no debe ser superior a un 0.3% a 100 °C. El nuevo aceite para disyuntores debe tener un factor de potencia que no sea superior a un 0.05% a 25 °C y que no sea superior a un 0.3% a 100 °C. El aceite utilizado en los disyuntores no debe tener un factor de potencia superior a un 1.0% a 25 °C. Ciertas realizaciones de los métodos de la presente invención proporcionan fluidos dieléctricos con propiedades referentes al factor de potencia favorables.

[0301] La resistencia dieléctrica se refiere a la intensidad de campo eléctrico máxima que el fluido dieléctrico (aislante eléctrico) puede resistir antes de descomponerse. La resistencia dieléctrica se mide en unidades de MV/m (relativas a la permitividad) y D877 de la ASTM proporciona especificaciones adecuadas para fluidos dieléctricos. Para utilizar un aislante eléctrico, la resistencia dieléctrica del lubricante debe ser tan elevada como sea posible. Los métodos de la presente invención pueden, en realizaciones particulares, proporcionar fluidos dieléctricos con resistencias dieléctricas mayores o iguales a las especificadas por D877 de la ASTM.

[0302] El factor de disipación es una medida de la pérdida eléctrica debida al fluido dieléctrico cuando se utiliza como aislante dieléctrico, y se mide en unidades porcentuales a 25 oC. D924 de la ASTM proporciona especificaciones adecuadas para fluidos dieléctricos. Como aislante eléctrico, el valor del factor de disipación debe ser lo menor posible. En ciertas realizaciones, los métodos de la presente invención proporcionan fluidos dieléctricos con factores de disipación mayores o iguales a los especificados por D924 de la ASTM.

[0303] La conductividad eléctrica es una medida de la capacidad de un fluido dieléctrico, cuando se utiliza como aislante eléctrico, para conducir corriente eléctrica y se mide en unidades de Sm-1. D2624 de la ASTM proporciona especificaciones adecuadas para fluidos dieléctricos. Como aislante, el valor de la conductividad eléctrica del fluido dieléctrico debe ser lo menor posible. Las realizaciones de los métodos de la presente invención proporcionan fluidos dieléctricos con una conductividad eléctrica favorable en comparación con la especificada por D2624 de la ASTM.

[0304] Para el uso en transformadores eléctricos y otras aplicaciones, las propiedades térmicas del fluido dieléctrico deben ser tales que se transfiera calor de forma eficiente. La expresión "calor específico" se refiere a la capacidad térmica de una sustancia y se mide en unidades de cal/g/oC. D2766 de la ASTM proporciona especificaciones adecuadas para fluidos dieléctricos. Unos valores de calor específico superiores permiten una transferencia de calor y un enfriamiento más eficientes. Los valores del calor específico para fluidos dieléctricos derivados de aceite mineral son generalmente de aproximadamente 0.39 y para fluidos dieléctricos derivados de TAG de aproximadamente 0.45. (Safety Dielectric Coolants for Distribution and Power Transformers, www.cooperpower.com/Library/pdf/00048.pdf). Los métodos de acuerdo con realizaciones de la presente invención pueden proporcionar fluidos dieléctricos con unos valores de calor específico mayores o iguales a 0.39 y/o que se ajustan a las especificaciones de D2624 de la ASTM.

[0305] Las propiedades medioambientales de un fluido dieléctrico son importantes. En general, se deberían emplear fluidos dieléctricos seleccionados para mitigar así los efectos medioambientales de un derrame u otro accidente. El término "biodegradabilidad" se refiere a la capacidad de un fluido dieléctrico para descomponerse en forma de dióxido de carbono y agua en el medioambiente y generalmente se mide en unidades porcentuales cada 28 días. 301B de la OECD y D-6046 de la ASTM proporcionan especificaciones de la biodegradabilidad adecuadas para fluidos dieléctricos. Los valores de biodegradabilidad para los fácilmente biodegradables son generalmente de aproximadamente un 100%; los valores de biodegradabilidad para los inherentemente biodegradables generalmente están comprendidos entre un 20 y un 70%; y los valores de biodegradabilidad para los no biodegradables generalmente están comprendidos entre un valor despreciable y un 0%. Los fluidos dieléctricos derivados de aceite mineral generalmente tienen unos valores de biodegradabilidad comprendidos en el rango de un 15 a un 35%, y los fluidos dieléctricos derivados de aceite de origen biológico generalmente tienen valores de biodegradabilidad comprendidos en el rango de un 70 a un 100%. Ciertas realizaciones de los métodos de la presente invención pueden proporcionar fluidos dieléctricos con valores de biodegradabilidad comprendidos en el rango de un 70 a un 100% (remítase a Renewable Lubricants Manual: Biobased Oils, Fluids, & Greases www.renewablelubricants.com/ RenewableLubricantsManual_Biodegradable.html#Introduction).

[0306] El índice de yodo (o el número de yodo) es una medida del grado de insaturación de un aceite. Más específicamente, el índice de yodo es la masa de yodo que consumen los enlaces insaturados en un aceite. Los aceites de secado tienen índices de yodo relativamente altos mayores o iguales a aproximadamente 175. Los aceites de soja tienen índices de yodo de aproximadamente 130 y los aceites de oliva de aproximadamente 80. Los índices de yodo se determinan de forma rutinaria en la técnica. Los métodos estándar para determinar los índices de yodo incluyen D5768-02(2006) de la ASTM y 53241 del DIN. En varias realizaciones, un aceite microbiano es un producto a base de aceite microbiano, p. ej., un fluido dieléctrico, puede tener un índice de yodo comprendido entre aproximadamente 25 y aproximadamente 200, por ejemplo, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 125, aproximadamente 150 o aproximadamente 175. Además, el índice de yodo puede estar comprendido en cualquier rango limitado por cualquiera de estos valores, por ejemplo, entre aproximadamente 25 y aproximadamente 175, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 175, etc.

[0307] También se puede alterar la insaturación de los ácidos grasos. Al aumentar la insaturación se reducen los puntos de fluidez/congelación. En la actualidad la monoinsaturación, tal como en el caso de los biolubricantes con un alto contenido de ácido oleico, es óptima y representa un equilibrio entre el punto de fluidez y la reactividad oxidativa. Los aceites monoinsaturados reaccionan con el aire pero mucho más despacio que los FA o PUFA poliinsaturados. Los ejemplos de PUFA incluyen el ácido araquidónico (ARA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA). Los fA di- y poliinsaturados son muy sensibles a la oxidación y no son adecuados para las aplicaciones eléctricas. Un problema con los fluidos dieléctricos derivados de aceites vegetales es la presencia de FA poliinsaturados (p. ej., ácido linoleico y ácido linolénico). Una ventaja de los fluidos dieléctricos de algunas de las realizaciones de la presente invención es que el aceite microbiano que comprenden (o del que se derivan) contiene menos FDA di- y poliinsaturados que los fluidos dieléctricos derivados de otros bioaceites, y en algunas realizaciones ninguno.

[0308] El perfil lipídico del fluido dieléctrico normalmente es muy similar al perfil lipídico del aceite utilizado como materia prima. Para el uso como fluidos dieléctricos se prefieren cantidades altas de ácidos grasos monoinsaturados de cadena más larga (C16-C18). Los ácidos grasos poliinsaturados (tales como C18:2, C18:3, ARA, EPA y DHA) no se prefieren debido a la oxidación de la producción de productos de oxidación. Los ácidos grasos saturados tienden a ser sólidos o líquidos con un punto de congelación alto, lo cual hace que los ácidos grasos saturados no sean deseables en grandes cantidades en fluidos dieléctricos. En varias realizaciones, el aceite microbiano (lípido) útil en fluidos dieléctricos contiene al menos aproximadamente un 50% de C18:1, p. ej., al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85% y al menos aproximadamente un 90% de C18:1. En estas u otras realizaciones, el aceite microbiano (lípido) contiene menos de aproximadamente un 10% de C18:2, p. ej., menos de aproximadamente un 7.5%, menos de aproximadamente un 5%, menos de aproximadamente un 2.5% y menos de aproximadamente un 1% de C18:2. El aceite microbiano puede contener cualquier combinación de porcentajes de C18:1 y C18:2 que ascienda a un 100% o menos. Por ejemplo, el aceite microbiano puede contener al menos un 50% de C18:1 y menos de un 10% de C18:2 o al menos un 80% de C18:1 y menos de un 5% de C18:2.

[0309] A efectos ilustrativos, se proporcionan en la presente aceites TAG de microbios oleaginosos que contienen menos de un 2% de C18:2 (remítase al Ejemplo 4), en comparación con un 20-75% en el aceite de girasol y un 48-65% en el aceite de soja. También se proporcionan aceites TAG con menos de un 0.5% de C18:3, en comparación con un 5-10% en el aceite de soja.

[0310] Estas y otras propiedades de un fluido dieléctrico se pueden conseguir, manipular y/o variar de acuerdo con los métodos descritos en la presente para obtener así un producto, tal como un lubricante, un fluido hidráulico, un aceite industrial o un fluido dieléctrico, adecuado para cualquier aplicación. Por ejemplo, se puede realizar una manipulación genética de microbios oleaginosos, tal como se describe anteriormente, para alterar la longitud de la cadena, la saturación y/o la composición de los diferentes ácidos grasos en el lípido. En ciertas realizaciones, un aceite microbiano útil como el descrito en la presente es producido por un microbio modificado genéticamente que ha sido modificado para expresar uno o más genes exógenos. Por ejemplo, el microbio modificado genéticamente puede ser Prototheca (p. ej, Prototheca moriformis) o Chlorella. Los genes exógenos ilustrativos incluyen los que codifican sacarosa-invertasa y/o acil graso-ACP-tioesterasa.

[0311] Además, el lípido extraído de una levadura oleaginosa o microalgácea se puede someter a varias modificaciones químicas para conseguir una propiedad deseada en un fluido dieléctrico. Las alteraciones típicas incluyen alterar la longitud de la cadena de ácidos grasos (FA). Los FA de cadena más corta tienen puntos de fluidez menores. Las modificaciones químicas también se pueden utilizar de acuerdo con realizaciones de los métodos de la invención para reducir la insaturación e incluyen alquilación, adición radicalaria, acilación, reacciones eno, hidroformilación, hidrogenación selectiva, oligomerización, hidroaminometilación, aciloxilación y epoxidación. Además, o como alternativa, un aditivo, tal como un depresor del punto de fluidez, se puede mezclar con el aceite microbiano procesado para conseguir una propiedad deseada, p. ej., punto de fluidez. Los aditivos ilustrativos se discuten más detalladamente a continuación.

[0312] Tal como se discutió anteriormente, en realizaciones particulares, el aceite microbiano crudo extraído de un microbio oleaginoso normalmente está "enriquecido" antes de incorporarlo en un producto de la invención. Por ejemplo, pueden existir contaminantes en los lípidos microbianos que pueden cristalizar y/o precipitar, y separarse de la solución como un sedimento. La formación de sedimentos supone un problema especialmente cuando se utiliza un fluido dieléctrico a temperaturas bajas. El sedimento o los precipitados pueden provocar problemas tales como reducción del flujo, obstrucciones, etc. En la técnica se dispone de procesos específicos para la eliminación de estos contaminantes y sedimentos con el fin de producir un producto de mayor calidad. Los ejemplos de tales procesos incluyen, sin carácter limitante, el pretratamiento del aceite para eliminar los contaminantes tales como fosfolípidos y ácidos grasos libres (p. ej., desgomación, refinación cáustica y filtración por adsorción sobre sílice).

[0313] De acuerdo con realizaciones de los métodos de la invención se puede emplear la winterización para enriquecer el aceite microbiano. Existen varias estrategias para winterizar un fluido dieléctrico de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Una estrategia consiste en mezclar el fluido con otros fluidos dieléctricos. Otra estrategia consiste en utilizar aditivos que pueden reducir el punto de congelación. También se puede emplear el fraccionamiento en seco para reducir la proporción relativa de la fracción saturada (la fracción estearínica). Al enfriar el aceite, se puede inducir la cristalización de los compuestos saturados y a continuación se filtran los cristales. El fraccionamiento separa selectivamente un fluido en sus componentes o fracciones individuales para poder eliminar o incluir fracciones específicas. Otros métodos de fraccionamiento incluyen el fraccionamiento con urea, fraccionamiento con disolventes y destilación térmica.

[0314] A continuación, se puede añadir diatomita u otro material filtrante, tal como arcilla decolorante, al líquido enfriado para formar una suspensión, que posteriormente se puede filtrar a través de un filtro de hojas a presión u otro tipo de filtro para eliminar las partículas. A continuación, el líquido filtrado se puede hacer pasar por un filtro de fieltro para eliminar cualesquiera sedimentos y diatomita remanentes y producir de este modo un producto final. Como alternativa, o además, este producto, o el aceite microbiano producido al final de cualquiera de los pasos de proceso anteriores, se puede mezclar con un depresor del punto de fluidez para producir un producto de la invención, tal como un fluido dieléctrico.

[0315] En una realización de la presente invención, se proporciona un método para producir un aceite lubricante o un fluido dieléctrico que comprende los pasos de (a) cultivar un microorganismo que contiene lípido utilizando métodos descritos en la presente, (b) lisar un microorganismo que contiene lípido para producir un lisado, (c) aislar la composición lipídica del microorganismo lisado y (d) enriquecer la composición lipídica aislada, mediante el cual se produce un aceite lubricante o un fluido dieléctrico. Normalmente, el paso (d) incluirá uno o más pasos de refinamiento, decoloración y/o desodorización, y uno o más pasos de fraccionamiento para reducir la proporción relativa de la fracción saturada mediante la eliminación de triglicéridos palmíticos y/o esteáricos. En otra realización, el aceite lubricante o fluido dieléctrico resultante del paso (d) se mezcla con un depresor del punto de fluidez.

[0316] Opcionalmente, otros aditivos para incrementar la estabilidad oxidativa de los lípidos aislados se pueden mezclar con el aceite microbiano, lubricante o fluido dieléctrico producido mediante estos métodos. Los ejemplos de tales aditivos incluyen antioxidantes tales como tocoferoles (vitamina E, p. ej., alfa-, beta- y/o delta-tocoferol) y ácido ascórbico (vitamina C). Los antioxidantes adecuados se pueden adquirir de proveedores comerciales. La empresa BASF comercializa una gama de antioxidantes a base de fenoles y a base de aminas adecuados con el nombre comercial IRGANOX®. IRGANOX L109, IRGANOX L64, IRGANOX L57, otros antioxidantes de tipo IRGANOX y otros compuestos a base de fenoles y a base de aminas son adecuados como aditivos antioxidantes para los aceites y productos, incluidos los fluidos dieléctricos. Otros ejemplos no limitantes de antioxidantes incluyen hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), mono-tert-butilhidro quinona (TBHQ), hidroanisol butilado, tetrahidrobutrofenona, palmitato de ascorbilo y galato de propilo. En ciertas realizaciones, un producto a base de aceite microbiano, p. ej., un fluido dieléctrico, incluye además un antioxidante en una concentración comprendida entre un 0.1% y un 5% en peso, y preferentemente entre un 0.5% y un 2%.

[0317] Otros aditivos que se pueden añadir opcionalmente a los lípidos aislados para utilizar como productos, tales como fluidos dieléctricos, son desactivadores de iones metálicos, inhibidores de la corrosión, aditivos antidesgaste y/o protectores contra la hidrólisis. Algunos aditivos de uso común en fluidos dieléctricos se describen en Schneider, 2006, J Science Food and Agriculture; 86: 1769-1780). Los desactivadores de iones metálicos tienen dos funciones principales. Suprimen el ataque químico sobre la superficie del metal y también pasivan la superficie metálica para suprimir cualesquiera residuos que puedan actuar como catalizadores para la formación de radicales (electrón desapareado). Los desactivadores de metales se pueden adquirir de proveedores comerciales. Por ejemplo, la empresa BASF proporciona una gama de desactivadores de metales que incluye la gama IRGAMET® de desactivadores de metales. La empresa RTVANDERBILT vende la gama CUVAN® de desactivadores de metales. Otros ejemplos de desactivadores de metales incluyen triazoles derivatizados incluidos 1-(diisooctilaminometil)-1,2,4-triazol, 1 -(2-metoxi prop-2-il )to liltri az o l, 1-(1-ciclohexiloxipropil)toliltriazol, 1-(1-ciclohexiloxiheptil)toliltriazol, 1-(1-ciclohexiloxibutil)toliltriazol, 1-[bis(2-etilhexil)aminometil-4-metilbenzotriazol, borones derivatizados incluidos borato de trietilo, borato de tripropilo, borato de triisopropilo, borato de tributilo, borato de tripentilo, borato de trihexilo, borato de triciclohexilo, borato de trioctilo, borato de triisooctilo y otros desactivadores de metales hidrazínicos derivatizados, p. ej., 2',3-bis[[3-[3,5-di-tert-butil-4-hidroxifenil]propionil]]proponiohidrazina y similares. ). En ciertas realizaciones, un producto a base de aceite microbiano, p. ej., un fluido dieléctrico, incluye además uno o más desactivadores de metales en una concentración comprendida entre un 0.1% y un 5% en peso, y preferentemente entre un 0.5% y un 2%.

[0318] Por lo tanto, los fluidos dieléctricos preparados de acuerdo con los métodos descritos en la presente pueden contener varios aditivos incluidos, sin carácter limitante, uno o más de los siguientes aditivos: (a) un antioxidante, incluidos, sin carácter limitante, BHT y otros fenoles; (b) un desactivador de iones metálicos tales como Cu, Zn y similares, incluido, sin carácter limitante, el benzotriazol; (c) inhibidores de la corrosión, incluidos, sin carácter limitante, los ésteres de tipo sulfonato y ésteres del ácido succínico; (d) desemulsionantes; (e) aditivos antidesgaste, incluido, sin carácter limitante, el ditiofosfato de zinc; (f) aditivos para reducir el punto de fluidez, incluidos, sin carácter limitante, los copolímeros de malan-estireno y poli(alquilacrilatos), incluidos, sin carácter limitante, los polimetacrilatos; y (g) compuestos que protegen contra la hidrólisis, incluidas, sin carácter limitante, las carbodiimidas.

[0319] En ciertas realizaciones, un método de la invención produce un producto, incluido un aceite microbiano, con un punto de fluidez comprendido entre aproximadamente -10 °C y aproximadamente -40 °C, y en este la composición de ácidos grasos del aceite microbiano es de al menos un 50% de C18:1 y menos de un 10% de C18:2. El método incluye cultivar un microbio transgénico modificado genéticamente para que exprese uno o más genes exógenos hasta que el microbio contenga al menos un 10% de aceite en peso seco. Los microbios modificados genéticamente ilustrativos incluyen Prototheca (p. ej, Prototheca moriformis) o Chlorella. Los genes exógenos ilustrativos incluyen los que codifican sacarosa-invertasa y/o acil graso-ACP-tioesterasa. En algunas realizaciones, el microbio modificado genéticamente expresa al menos dos genes exógenos, p. ej., que codifican sacarosa-invertasa y acil graso-ACP-tioesterasa, que codifican dos acil graso-ACP-tioesterasas diferentes o que codifican sacarosa-invertasa y dos acil graso-ACP-tioesterasas diferentes. Una vez que el microbio contenga al menos un 10% de aceite en peso seco, el aceite se separa del microbio y se somete a refinamiento, decoloración, desodorización o desgomación para producir aceite RBD. Opcionalmente, se puede añadir un antioxidante, un desactivador de iones metálicos, un inhibidor de la corrosión, desemulsionante, aditivo antidesgaste, depresor del punto de fluidez y/o compuesto antihidrólisis al aceite RBD para producir un producto deseado.

[0320] En realizaciones particulares, un método de fraccionamiento de la invención produce un aceite microbiano adecuado para ser incorporado en productos (por ejemplo, un fluido dieléctrico) con un punto de fluidez comprendido entre aproximadamente -10 °C y aproximadamente -40 °C, y en este la composición de ácidos grasos del aceite microbiano es de al menos un 50% de C18:1 y menos de un 10% de C18:2. El método incluye someter un aceite microbiano de partida (es decir, "primer aceite") a refinamiento, decoloración, desodorización o desgomación para producir aceite RBD, donde el aceite RBD se caracteriza por un punto de fluidez inicial y una primera temperatura; reducir la temperatura del aceite RBD hasta una segunda temperatura; y filtrar el aceite RBD a la segunda temperatura para proporcionar un segundo aceite microbiano caracterizado por un segundo punto de fluidez que es menor que el punto de fluidez inicial, donde el segundo punto de fluidez está comprendido entre aproximadamente -10 °C y aproximadamente -40 °C, y donde la composición de ácidos grasos del segundo aceite microbiano es de al menos un 50% de C18:1 y menos de un 10% de C18:2. Una primera temperatura ilustrativa está comprendida entre más de 15 °C y aproximadamente 50 °C, y una segunda temperatura ilustrativa está comprendida entre aproximadamente -15 °C y aproximadamente 15 °C. Opcionalmente, se puede añadir un antioxidante, un desactivador de iones metálicos, un inhibidor de la corrosión, desemulsionante, aditivo antidesgaste, depresor del punto de fluidez y/o compuesto antihidrólisis al segundo aceite microbiano para producir un producto deseado. En variaciones de estas realizaciones, el primer aceite microbiano se produce cultivando un microbio transgénico modificado genéticamente para que exprese uno o más genes exógenos hasta que el microbio contenga al menos un 10% de aceite en peso seco y a continuación separar el aceite del microbio para producir el primer aceite microbiano. Este método se puede emplear para producir, p. ej., un lubricante, un fluido hidráulico, un aceite industrial o un fluido dieléctrico. En ciertas realizaciones, en las que el producto es un fluido dieléctrico, el fluido incluye uno o más de los siguientes: un antioxidante, un desactivador de iones metálicos, un inhibidor de la corrosión, un desemulsionante, un aditivo antidesgaste, un depresor del punto de fluidez o un compuesto antihidrólisis.

[0321] En una realización de la invención, se produce un fluido dieléctrico mezclando aceites y/o fluidos dieléctricos derivados de microbios oleaginosos con aceites o fluidos dieléctricos existentes. Los aceites y fluidos dieléctricos existentes pueden ser de origen vegetal o animal (o ambos, es decir, petróleo).

[0322] Por lo tanto, la presente invención incluye una diversidad de métodos en los que el lípido procedente de microbios oleaginosos se procesa con el fin de obtener fluidos dieléctricos y otros productos útiles en diversas aplicaciones industriales y de otros tipos. Los ejemplos de procesos para modificar aceite producido mediante los métodos descritos en la presente incluyen, sin carácter limitante, la hidrólisis del aceite, el hidroprocesamiento del aceite y la esterificación del aceite. Otras modificaciones químicas de lípidos microalgáceos incluyen, sin carácter limitante, epoxidación, oxidación, hidrólisis, sulfataciones, sulfonación, etoxilación, propoxilación, amidación y saponificación. La modificación del aceite de microalgas produce compuestos oleoquímicos básicos que se pueden modificar posteriormente para obtener compuestos oleoquímicos derivados seleccionados para una función deseada. De una forma similar a la descrita anteriormente con respecto a los procesos de producción de combustible, estas modificaciones químicas también se pueden llevar a cabo sobre aceites generados a partir de los cultivos microbianos descritos en la presente.

[0323] En ciertas realizaciones, se emplea un fluido dieléctrico descrito en la presente en un sistema eléctrico, tal como un transformador, incluido un tanque en el que está contenido un montaje de núcleo/bobinas del transformador, donde el fluido dieléctrico rodea el montaje de núcleo/bobinas. En variaciones de estas realizaciones, el tanque también incluye un material que absorbe oxígeno que está en contacto con gases dentro del tanque, pero asilado sin contacto con el fluido aislante dieléctrico. Los materiales que absorben oxígenos adecuados son aquellos que son capaces de reducir la concentración de oxígeno libre en la atmósfera que rodea al fluido dieléctrico dentro del tanque y que a su vez reducen la presencia de oxígeno disuelto en el propio fluido. Tales compuestos se pueden denominar compuestos captadores de oxígeno. Los compuestos captadores de oxígeno útiles incluyen aquellos que se emplean habitualmente en la industria del embalaje de alimentos. Los compuestos captadores de oxígeno representativos útiles en la práctica de la invención incluyen los siguientes: sulfito de sodio; sulfato de cobre pentahidratado; una combinación de carbón y hierro activo en polvo; mezclas de hidrosulfito, hidróxido de calcio, bicarbonato de sodio y carbón activo; un haluro metálico en polvo aplicado como recubrimiento sobre la superficie de un polvo metálico; y combinaciones de compuestos alcalinos, tales como hidróxido de calcio, con carbonato de sodio o bicarbonato de sodio. Las mezclas y combinaciones de una o más de las composiciones anteriores también se consideran útiles. También son útiles como compuestos captadores de oxígeno las composiciones proporcionadas de acuerdo con la patente de EE. UU. N.o 2.825.651, que se incorpora por referencia, incluida una composición depuradora de oxígenos que comprende una intermezcla de una sal de sulfito y un acelerador tal como sulfato de cobre hidratado, cloruro estannoso u óxido cobaltoso. Otra clase útil de compuestos captadores de oxígeno incluye aquellas composiciones que comprenden una sal de manganeso, hierro, cobalto o níquel, un compuesto alcalino y un sulfito o compuesto delicuescente, tal como se describe en la patente de EE. UU. N.o 4.384.972, que también se incorpora por referencia. Los compuestos captadores de oxígeno preferidos incluyen (o incluyen como componte principal) al menos un óxido de hierro básico, tal como óxido de hierro ferroso, o están compuestos por mezclas de materiales de óxido de hierro. Las composiciones que contienen óxido de hierro útiles se pueden adquirir de proveedores comerciales, por ejemplo, con el nombre comercial "Ageless" de la empresa Mitsubishi Gas Chemical Company de Duncan, Carolina del Sur, y con el nombre comercial "Freshmax" de Multisorb Technologies, Inc. of Buffalo, N.Y. También son útiles los agentes que absorben oxígeno que comprenden una mezcla de sales ferrosas y un modificador de la oxidación y/o un compuesto de tipo sulfito o sulfato metálico.

[0324] La invención, habiéndose descrito detalladamente anteriormente, se ejemplifica en los siguientes ejemplos, que se presentan para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada

VII. EJEMPLOS

EJEMPLO 1: Métodos para cultivar Prototheca

[0325] Se cultivaron cepas de Prototheca para obtener un porcentaje elevado de aceite en peso seco celular. Las células conservadas criológicamente se descongelaron a temperatura ambiente y se añadieron 500 uL de células a 4.5 mL de medio (4.2 g/L de K2HPO4, 3.1 g/L de NaH2PO4, 0.24 g/L de MgSO47H2O, 0.25 g/L de ácido cítrico monohidratado, 0.025 g/L de CaCl22H2O, 2 g/L de extracto de levadura) junto con un 2% de glucosa y se cultivaron durante 7 días a 28 °C con agitación (200 rpm) en una placa de 6 pocillos. Los pesos secos celulares se determinaron por centrifugación de 1 mL de cultivo a 14 000 rpm durante 5 minutos en un tubo eppendorf prepesado. El sobrenadante de cultivo se descartó y el sedimento celular resultante se lavó con 1 mL de agua desionizada. El cultivo se centrifugó de nuevo, el sobrenadante se descartó y los sedimentos celulares se mantuvieron a -80 °C hasta su congelación. A continuación, las muestras se liofilizaron durante 24 horas y se calcularon los pesos secos celulares. Para la determinación del contenido lipídico total en los cultivos, se extrajeron 3 mL del cultivo y se sometieron a un análisis mediante un sistema de Ankom (Ankom Inc., Macedonia, Nueva York), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras se sometieron a extracción con disolvente en un extractor Amkom XT10 de acuerdo con el protocolo del fabricante. El contenido lipídico total se determinó como la diferencia másica entre las muestras secas hidrolizadas con ácido y las extraídas con disolvente. Las mediciones del porcentaje del aceite en peso seco celular se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9. Porcentaje de aceite en peso seco celular

[0326] Se determinó el genotipo de muestras de microalgas para múltiples cepas del género Prototheca. Se aisló ADN genómico de la biomasa algácea como se indica a continuación. Se centrifugaron células (aproximadamente 200 mg) de cultivos líquidos 5 minutos a 14 000 x g. Las células se resuspendieron después en agua destilada estéril, se centrifugaron 5 minutos a 14000 x g y se desechó el sobrenadante. Se añadió una única microesfera de cristal con un diámetro de ~ 2 mm a la biomasa y los tubos se trataron a -80 °C durante al menos 15 minutos. Se retiraron las muestras y se añadieron 150 pL de tampón de trituración (1% de Sarkosil, sacarosa 0.25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, T ris-HCl 100 mM, pH de 8.0, 0.5 pg/pL de ARNasa A). Se volvieron a suspender los pellets agitando brevemente con un vórtex y a continuación se añadieron 40 pL de NaCl 5 M. Las muestras se agitaron brevemente con un vórtex, a continuación se añadieron 66 pL de CTAB al 5% (bromuro de cetiltrimetilamonio) y se agitó brevemente por última vez con un vórtex. Posteriormente, las muestras se incubaron a 65 °C durante 10 minutos y después se centrifugaron a 14000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo una vez con 300 pL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 12:12:1, a continuación se centrifugó durante 5 minutos a 14 000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo nuevo que contenía 0.7 volúmenes de isopropanol (~ 190 pL), se mezcló por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante toda la noche a 4 °C. El ADN se obtuvo por centrifugación a 14000 x g durante 10 minutos. A continuación, el pellet resultante se lavó dos veces con etanol al 70% y después se realizó un lavado final con etanol al 100%. Los pellets se secaron al aire durante 20-30 minutos a temperatura ambiente, y después se volvieron a suspender en 50 pL de TrisCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH de 8.0).

[0327] Se diluyeron cinco pL de ADN total de algas, preparado como se ha descrito anteriormente, con un factor de 1:50 en Tris 10 mM , pH de 8.0. Las reacciones de PCR, con un volumen final de 20 pL, se llevaron a cabo como se indica a continuación. Se añadieron diez pL de mezcla patrón 2 x iProof HF (Bio-Rad) a 0.4 pL del cebador SZ02613 (5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3' (SEQ ID NO:9) con una concentración estándar de 10 mM). Esta secuencia de cebador comprende desde la posición 567 a 588 en el número de acceso a GenBank L43357 y está altamente conservada en genomas plastídicos de algas y plantas superiores. A continuación, se añadieron 0.4 pL del cebador SZ02615 (5'-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3' (SEQ ID NO:10) con una concentración estándar de 10 mM). Esta secuencia de cebador es complementaria con la posición 1112-1093 en el número de acceso a GenBank L43357 y está altamente conservada en genomas plastídicos de algas y plantas superiores. A continuación, se añadieron 5 pL de ADN total diluido y 3.2 pL de dH2O. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo como se indica a continuación: 98 °C, 45''; 98 °C, 8''; 53 °C, 12''; 72 °C, 20'' durante 35 ciclos seguidos de 72 °C durante 1 minuto y manteniéndose a 25 °C. Para la purificación de los productos de PCR, se añadieron 20 pL de Tris 10 mM, pH de 8.0, a cada reacción, a continuación se extrajo con 40 pL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 12:12:1, se agitó con vórtex y se centrifugó a 14 000 x g durante 5 minutos. Las reacciones de PCR se trataron en columnas S-400 (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3000 x g. Posteriormente, los productos purificados de PCR se sometieron a clonación TOPO en PCR8/GW/TOPO y se seleccionaron los clones positivos para placas de LB/Spec. El ADN del plásmido purificado se secuenció en ambas direcciones utilizando cebadores M13 directos e inversos. En total, se seleccionaron doce cepas de Prototheca para secuenciar el ADN de ARNr 23S y las secuencias se enumeran en el Listado de Secuencias. A continuación se incluye un resumen de las cepas y los números del Listado de Secuencias. Se analizaron las secuencias para determinar la divergencia total respecto a la secuencia UTEX 1435 (SEQ ID NO:15). Se detectaron dos pares (u TeX 329/UTEX 1533 y UTEX 329/UTEX 1440) como las más divergentes. En ambos casos, el alineamiento de pares de bases dio como resultado un 75.0% de identidad secuencial de pares de bases. A continuación, también se incluye el porcentaje de identidad secuencial respecto a UTEX 1435:

[0328] Las muestras lipídicas de un subconjunto de las cepas enumeradas anteriormente se analizaron para determinar el perfil lipídico mediante HPLC. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 10.

Tabla 10. Diversidad de las cadenas lipídicas en especies de Prototheca

[0329] El aceite extraído de UTEX 1435 de Prototheca moriformis (mediante extracción con disolvente o utilizando una prensa de tornillo) se analizó para determinar el contenido de carotenoides, clorofila, tocoferoles, otros esteroles y tocotrienoles. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 11.

Tabla 11. Análisis de carotenoides, clorofila, tocoferol/esteroles y tocotrienol en aceite extraído de Prototheca moriformis (UTEX 1435).

[0330] El aceite extraído de Prototheca moriformis, de cuatro lotes diferentes, se refinó y decoloró utilizando métodos de procesamiento de aceites vegetales estándares. Resumiendo, el aceite crudo extraído de Prototheca moriformis se clarificó en un decantador horizontal, donde se separaron los sólidos del aceite. A continuación, el aceite clarificado se transfirió a un tanque con ácido cítrico y agua, y se dejó que sedimentara durante aproximadamente 24 horas. Después de 24 horas, la mezcla del tanque formó dos fases diferentes. La fase inferior estaba compuesta por agua y productos gomosos, que posteriormente se eliminaron por decantación antes de transferir el aceite desgomado a un tanque de decoloración. A continuación, el aceite se calentó junto con otra dosis de ácido cítrico. Después se añadió arcilla decolorante al tanque de decoloración y la mezcla se calentó adicionalmente al vacío para evaporar cualquier resto de agua que estuviera presente. A continuación, la mezcla se bombeó a través de un filtro de hojas para eliminar la arcilla decolorante. Después el aceite filtrado se hizo pasar a través de un filtro pulidor final de 5 pm y a continuación se recolectó para almacenarlo hasta su uso. Después el aceite refinado y decolorado (RB) se analizó para determinar el contenido de carotenoides, clorofila, esteroles, tocotrienoles y tocoferoles. Los resultados de estos análisis se resumen en la Tabla 12 a continuación. “Nd” significa no detectado y la sensibilidad de la detección se especifica a continuación:

Sensibilidad de la detección

[0331] Carotenoides (mcg/g); nd = < 0.003 mcg/g

Clorofila (mcg/g); nd = < 0.03 mcg/g

Esteroles (%); nd = 0.25%

Tocoferoles (mcg/g); nd = 3 mcg/g

Tabla 12. Análisis de carotenoides, clorofila, esteróles, tocotrienoles y tocoferol de aceite refinado y decolorado de Prototheca moriformis.

[0332] Los mismos cuatro lotes de aceite de Prototheca moriformis también se analizaron para determinar los elementos traza y los resultados se resumen a continuación en la Tabla 13.

Tabla 13. Análisis elemental de aceite refinado y decolorado de Prototheca moriformis.

EJEMPLO 2: Métodos generales para la transformación biolística de Prototheca

[0333] Se prepararon microportadores de oro de Seashell de 550 nanómetros de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se mezcló plásmido (20 pg) con 50 pL de tampón aglutinante y 60 pL (30 mg) de portadores de oro S550d y se incubó en hielo durante 1 min. Se añadió tampón de precipitación (100 pL) y la mezcla se incubó en hielo durante 1 min más. Después de agitar con vórtex, se formaron pellets de las partículas recubiertas con ADN centrifugándolas a 10000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5415C durante 10 segundos. El pellet de oro se lavó una vez con 500 |j|_ de etanol al 100% frío, se formaron pellets por centrifugación breve en la microcentrífuga y se volvieron a suspender con 50 pL de etanol enfriado con hielo. Después de una breve sonicación (1-2 s), se transfirieron inmediatamente 10 jL de partículas recubiertas con ADN a la membrana portadora.

[0334] Se cultivaron cepas de Prototheca en medio Proteosa (2g/L de extracto de levadura, NaNO3 2.94 mM, CaCl22H2O 0.17 mM, MgSO4 7H2O 0.3 mM, K2HPO4 0.4 mM, KH2PO4 1.28 mM, NaCl 0.43 mM) con un 2% de glucosa en un agitador giratorio hasta que se obtuvo una densidad celular de 2 x 106 células/mL. Las células se recolectaron, se lavaron una vez con agua destilada estéril y se volvieron a suspender en 50 jL de medio. Se esparcieron 1 x 107 células en el tercer centro de una placa de medio Proteosa no selectivo. Las células se bombardearon con el sistema biolístico de suministro de partículas PDS-1000/He (Bio-Rad). Se utilizaron discos de ruptura (1350 psi) y las placas se colocaron 6 cm por debajo del montaje de macroportador/pantalla. Se dejó que las células se recuperasen a 25 °C durante 12-24 h. Tras la recuperación, se rasparon las células de las placas con una espátula de goma, se mezclaron con 100 jL de medio y se esparcieron en placas que contenían la selección adecuada de antibióticos. Después de 7-10 días de incubación a 25 °C, se pudieron observar colonias que representaban células transformadas en las placas. Las colonias se seleccionaron y se colocaron en placas de agar (con fuente de antibiótico o de carbón) para una segunda ronda de selección.

EJEMPLO 3: Expresión de genes heterólogos de acil graso-ACP-tioesterasas en células de microalgas

[0335] Los métodos para la expresión de genes heterólogos de tioesterasas en células de microalgas, incluida la especie Prototheca, y sus resultados se han descrito previamente en la Solicitud de PCT N.o PCT/US2009/66412, que se incorpora a la presente por referencia. Este ejemplo describe los resultados obtenidos utilizando otros productos génicos/genes de tioesterasas de especies de plantas superiores.

[0336] Se introdujo una acil graso-ACP-tioesterasa de Ricinus communis en un entorno genético UTEX 1435 de Prototheca moriformis; la secuencia de ADNc con codones optimizados (SEQ ID NO:87) y las secuencias de aminoácidos (con N.o de acceso a GenBank ABS30422.1)(SEQ ID NO:88) se enumeran en la Lista de secuencias. El constructo de expresión contenía secuencias de modificación dirigida por recombinación homóloga 5' (SEQ ID NO:100) y 3' (SEQ ID NO:101) (flanqueando el constructo) para la región genómica 6S para la integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa de S. cerevisiae suc2 bajo el control del promotor/5'UTR de p-tubulina de C. reinhardtii y 3' UTR de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris. Este casete de expresión de S. cerevisiae suc2 se enumera como la SEQ ID NO:78 y actuó como un marcador de selección. La región codificante de R. communis estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO:84) y 3'UTR de la nitrato-reductasa de C. vulgaris (SEQ ID NO:85). El péptido de tránsito nativo de Ricinus communis también se reemplazó por el péptido de tránsito de la estearoil-desaturasa de C.protothecoides (SEQ ID NO:86) y la secuencia de ADNc de la tioesterasa con el péptido de tránsito reemplazado se enumera como la SEQ ID NO:87. El casete de expresión entero de Ricinus communis se denominó pSZ1375 y se transformó en un entorno genético de Prototheca moriformis. Los clones positivos se evaluaron en placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos, se cultivaron en condiciones de producción de lípidos y se determinaron los perfiles lipídicos (ácidos grasos) utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito anteriormente. Los perfiles de ácidos grasos de los clones seleccionados se resumen en la Tabla 14 a continuación.

Tabla 14. Perfiles de ácidos grasos de células de Prototheca transgénicas con ACP-tioesterasa de Ricinus communis.

[0337] Los resultados indican que los transformantes con el transgén de tioesterasa de Ricinus communis presentan niveles modificados de ácidos grasos C16:0 y, en menor grado, de ácidos grasos C18:0, en comparación con la cepa natural. Además, se observó un aumento concomitante del nivel de ácidos grasos C18:1 en comparación con el nivel natural.

EJEMPLO 4: Modificación de los niveles de ácidos grasos saturados en las microalgas Prototheca moriform is

A.Reducción de la expresión de la estearoil-ACP-desaturasa y la delta 12-ácido graso-desaturasa mediante una estrategia de desactivación génica

[0338] Como parte de un análisis genómico utilizando una estrategia bioinformática basada en ADNc, el transcriptoma de Illumia y la secuenciación de Roche 454 del ADN genómico de Prototheca moriformis (UTEX 1435), se identificaron dos grupos específicos de genes implicados en la desaturación de ácidos grasos: estearoil-ACP-desaturasas (SAD) y delta 12-ácido graso-desaturasas (A12 FAD). Las enzimas estearoil-ACP-desaturasas son parte de la vía de síntesis de lípidos y actúan introduciendo dobles enlaces en las cadenas de los ácidos grasos, por ejemplo, la síntesis de ácidos grasos C18:1 a partir de ácidos grasos C18:0. Las delta 12-ácido graso-desaturasas también son parte de la vía de síntesis de lípidos y actúan introduciendo dobles enlaces en los ácidos grasos ya insaturados, por ejemplo, la síntesis de ácidos grasos C18:2 a partir de ácidos grasos C18:1. Los análisis de inmunotransferencia de Southern utilizando sondas basadas en las dos clases de genes de desaturasas de ácidos grasos identificadas durante los estudios bioinformáticos indicaron que cada clase de genes de desaturasas comprendía probablemente múltiples miembros de la familia. Además, los genes que codificaban estearoil-ACP-desaturasas pertenecían a dos familias distintas. Basándose en estos resultados, se diseñaron tres constructos de alteración génica para alterar múltiples miembros de la familia de genes mediante la modificación dirigida de regiones codificantes más altamente conservadas en cada familia de enzimas desaturasas.

[0339] Se diseñaron tres constructos de modificación dirigida recombinantes homólogos utilizando: (1) porciones altamente conservadas de la secuencia codificante de los miembros de la familia de delta 12-ácido graso-desaturasas (d12FAD) y (2) dos constructos que tenían como diana cada una de las dos familias diferentes de SAD, cada uno de ellos con regiones conservadas de las secuencias codificantes de cada familia. Esta estrategia está diseñada para embeber un gen marcador seleccionable (el casete de la sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae que confiere la capacidad para hidrolizar sacarosa) en estas regiones codificantes altamente conservadas (que tienen múltiples miembros de la familia como diana), en lugar de una estrategia clásica de reemplazo de genes en la que la recombinación homóloga tendría como diana regiones flanqueantes del gen diana.

[0340] Todos los constructos se introdujeron en las células mediante una transformación biolística utilizando los métodos descritos anteriormente y los constructos se linealizaron antes de ser bombardeados en las células. Los transformantes se seleccionaron en medios/placas que contenían sacarosa y los cambios en el perfil de ácidos grasos se analizaron utilizando el método descrito anteriormente. A continuación se enumeran las secuencias relevantes de cada uno de los tres constructos de modificación dirigida.

[0341] Se seleccionaron los clones positivos representativos de las transformaciones con cada uno de los constructos y se determinaron los perfiles de ácidos grasos para estos clones (expresados en % de área), los cuales se resumen en la Tabla 15 a continuación.

T ab la 15. P e rfiles de ác ido s g ra sos para las d e sa c tiva c io n e s de de sa tu ra sas .

[0342] Cada uno de los constructos presentó un efecto considerable sobre la clase deseada de ácido graso y en los tres casos los niveles de C18:0 aumentaron de forma significativa, particularmente con las desactivaciones de las dos SAD. Una comparación adicional de múltiples clones de las desactivaciones de SAD indicó que las líneas de desactivación de SAD2B presentaban unas reducciones significativamente mayores de los niveles de ácidos grasos C18:1 que de los ácidos grasos C18:1 observados con las líneas de desactivación de SAD2A.

[0343] Se generaron desactivaciones adicionales de A12-ácido graso-desaturasa (FAD) en un entorno de Prototheca moriformis (UTEX 1435) utilizando los métodos descritos anteriormente. Para identificar homólogos potenciales de A12FAD, se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar una región genómica codificante de un FAD putativo:

Cebador 1: 5'-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3' SEQ ID NO:74 Cebador 2: 5'- GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3' SEQ ID NO:75

[0344] Las secuencias resultantes de la amplificación genómica del ADN genómico de Prototheca moriformis utilizando los cebadores anteriores fueron muy similares, pero indicaron que existen múltiples genes o alelos de A12FADs en Prototheca moriformis.

[0345] Basándose en este resultado, se diseñaron dos constructos de alteración de genes para suprimir uno o más genes de A12FAD. La estrategia consistía en embeber un casete de sacarosa-invertasa (suc2 de S. cerevisiae), de este modo se conferiría la capacidad para hidrolizar sacarosa como un marcador seleccionable en regiones codificantes altamente conservadas en lugar de utilizar una estrategia clásica de reemplazamiento de genes. El primer constructo, denominado pSZ1124, contenía secuencias de modificación dirigida genómica 5’ y 3’ flanqueando un promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen suc2 de S. cerevisiae y una 3'UTR de la nitratoreductasa de Chlorella vulgaris (casete suc2 de S. cerevisiae). El segundo constructo, denominado pSZ1125, contenía secuencias de modificación dirigida genómica 5' y 3' flanqueando un promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen suc2 de S. cerevisiae y una 3’UTR de nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris. Las secuencias relevantes de los constructos se enumeran en el Listado de Secuencias:

[0346] pSZ1124 y pSZ1125 se introdujeron, cada uno de ellos, en un entorno de Prototheca moriformis y se seleccionaron los clones positivos basándose en la capacidad para hidrolizar sacarosa. La Tabla 16 resume los perfiles de ácidos grasos (en % de área, que se generó utilizando los métodos descritos anteriormente) obtenidos en dos líneas transgénicas en las que se utilizaron los vectores de modificación dirigida pSZ1124 y pSZ1125.

T ab la 16. P e rfiles de ác ido s g ra sos para las d e sa c tiva c io n e s de A 12 -FA D .

[0347] Las líneas transgénicas que contenían el constructo de FAD2B (pSZ1124) presentaron un resultado inesperado y muy interesante en el perfil lipídico, ya que los niveles de C18:2, que cabría esperar que se hubieran reducido, solo disminuyeron aproximadamente un 1% de área. Sin embargo, los niveles de ácidos grasos C18:1 aumentaron significativamente, casi exclusivamente a costa de los niveles de C16:0, que se redujeron significativamente. Las líneas transgénicas que contenían el constructo de FAD2C (pSZ1125) también presentaron un cambio en el perfil de ácidos grasos: los niveles de C18:2 se redujeron significativamente, junto con un aumento correspondiente de los niveles de C18:1.

B.Estrategia de ARN horquillado para reducir la expresión de delta 12-desaturasa (FADc) en células de Prototheca

[0348] Se introdujeron vectores que reducen la expresión génica de FADc (gen de delta 12-desaturasa) mediante ARN horquillados en un entorno genético UTEX 1435 de Prototheca moriformis. El gen de la sacarosa-invertasa suc2 de Saccharomyces cerevisiae se utilizó como un marcador seleccionable, que confiere capacidad para crecer en sacarosa como única fuente de carbono para obtener clones positivos, y se utilizaron dos tipos de constructos. El primer tipo de constructo utilizó una porción del primer exón de la región codificante de FADc unida en cis a su primer intrón, seguida de una unidad de repetición del primer exón en orientación inversa. Este tipo de constructo se diseñó para que forme una horquilla cuando se exprese como ARNm. Se crearon dos constructos de este primer tipo, uno dirigido por el promotor Amt03 de Prototheca moriformis (SEQ ID NO:84), denominado pSZ1468, y un segundo dirigido por el promotor de p-tubulina de Chlamydomomas reinhardtii (SEQ ID NO:89), denominado pSZ1469. El segundo tipo de constructo utilizó el exón 2 grande de FADc en la orientación antisentido dirigido por el promotor Amt03 de Prototheca moriformis (SEQ ID NO:84), denominado pSZ1470, o dirigido por el promotor de p-tubulina de Chlamydomomas reinhardtii (SEQ ID NO:89), denominado pSZ1471. Los cuatro constructos tenían un casete de sacarosa-invertasa suc2 de S. cerevisiae (SEQ ID NO:78) y secuencias de modificación dirigida por recombinación homóloga 5' (SEQ ID NO:100) y 3' (SEQ iD NO:101) (flanqueando el constructo) para la región genómica 6S para la integración en el genoma nuclear. Las secuencias de las porciones de FADc de cada constructo de ARN horquillado, junto con las porciones relevantes de cada constructo, se enumeran en el Listado de Secuencias como se indica a continuación:

[0349] Cada uno de los cuatro constructos se transformó en un entorno de Prototheca moriformis y los clones positivos se evaluaron utilizando placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionaron los clones positivos de cada transformación y se seleccionó un subconjunto para determinar el efecto de los casetes de tipo antisentido y horquillado contenidos en pSZ1468, pSZ1469, pSZ1470 y pSZ1471 sobre los perfiles de ácidos grasos. Los clones seleccionados de cada transformación se cultivaron en condiciones de producción de lípidos y se determinaron los perfiles de ácidos grasos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito anteriormente. Los perfiles de ácidos grasos representativos de cada una de las transformaciones se resumen a continuación en la Tabla 17. Las células de origen natural 1 y 2 eran células de Prototheca moriformis no transformadas que se analizaron con cada uno de los transformantes como control negativo

Tabla 17. Perfiles de ácidos grasos de células de Prototheca moriformis que contenían constructos de ARN horquillado para reducir la expresión del gen de delta 12-desaturasa (FADc).

[0350] Los resultados anteriores indican que los constructos de horquilla pSZ1468 y pSZ1469 presentaron los fenotipos esperados: una reducción de los niveles de ácidos grasos C18:2 y un aumento de los niveles de ácidos grasos C18:1, en comparación con los de origen natural 1 y origen natural 2, respectivamente. Los constructos antisentido, pSZ1470 y pSZ1471, no dieron como resultado ninguna reducción de los niveles de ácidos grasos C18:2, pero en su lugar presentaron un ligero aumento en comparación con los de origen natural 1 y origen natural 2, respectivamente, y una ligera reducción de los niveles de ácidos grasos C16:0.

C. Expresión de una estearoil-ACP-desaturasa exógena

[0351] Se introdujo estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea (N.o de acceso a GenBank AAB67840.1) en un entorno genético UTEX1435 de Prototheca moriformis. El constructo de expresión contenía secuencias de modificación dirigida por recombinación homóloga 5' (SEQ ID NO:100) y 3' (SEQ ID NO:101) (flanqueando el constructo) para la región genómica 6S para la integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa de S. cerevisiae suc2 bajo el control del promotor de p-tubulina/5'UTR de C. reinhardtii y 3' UTR de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris. Este casete de expresión de S. cerevisiae suc2 se enumera como la SEQ ID NO:78 y actuó como un marcador de selección. La región codificante de la estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea estaba bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO:84) y 3'UTR de la nitrato-reductasa de C. vulgaris, y el péptido de tránsito nativo se reemplazó por el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides (SEQ ID NO:86). Las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos (con el péptido de tránsito reemplazado) se enumeran en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO:98 y SEQ ID NO:99, respectivamente. El casete de expresión entero de SAD de O. europaea se denominó pSZ1377 y se transformó en un entorno genético de Prototheca moriformis. Los clones positivos se evaluaron en placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos, se cultivaron en condiciones de producción de lípidos y se determinaron los perfiles de ácidos grasos utilizando métodos de transesterificación directa según se ha descrito anteriormente. Los perfiles de ácidos grasos de los clones seleccionados se resumen en la Tabla 18 a continuación.

Tabla 18. Perfil de ácidos grasos de células de Prototheca moriformis transgénicas con estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea.

[0352] Los resultados anteriores demuestran que la introducción de una desaturasa heteróloga, en este caso una estearoil-ACP-desaturasa de Olea europaea, puede dar como resultado unos niveles más elevados de ácidos grasos C18:1 y una reducción concomitante de los niveles de ácidos grasos C18:0 y C16:0.

EJEMPLO 5: Cultivo de levadura oleaginosa

[0353] Las cepas de levadura oleaginosa utilizadas en este ejemplo y en los ejemplos posteriores se obtuvieron de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un Zellkulturen GmbH (DSMZ), situado en Inhoffenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, o de Centraalbureau voor Schimmelscultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre situado en P.O. Box 85167, 3508 Utrecht, Holanda. Se analizaron ciento ochenta y cinco cepas de levadura oleaginosa para determinar su tasa de crecimiento y producción de lípidos.

[0354] Todas las cepas se volvieron axénicas mediante siembra en estrías para obtener colonias únicas en placas de agar YPD (medio YPD según se describe a continuación con un 2% de agar añadido). Se seleccionaron colonias únicas de las placas de YPD de cada cepa y se cultivaron hasta la fase logarítmica tardía en medio YPD (10 g de extracto de bacto-levadura, 20 g de bacto-peptona y 20 g de glucosa/1 L de volumen final en agua destilada) en un agitador rotatorio a 200 rpm y 30 °C.

[0355] Para evaluar la productividad de lípidos, se añadieron 2 mL de medio YPD a un tubo de biorreactor tarado de 50 mL (MidSci, Inc.) y se inoculó un estándar congelado de cada cepa. A continuación, los tubos se introdujeron en una incubadora a 30 °C y se cultivaron durante 24 horas, agitando a 200 rpm para generar un cultivo de siembra. Después de 24 horas, se añadieron 8 mL de medio Y1 (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos, Difco) que contenía tampón de ftalato 0.1 M, pH de 5.0, y se mezcló debidamente pipeteando cuidadosamente. El cultivo resultante se dividió por igual en un segundo tubo de biorreactor tarado. A continuación, los cultivos duplicados resultantes de 5 mL cada uno se introdujeron en una incubadora a 30 °C con agitación de 200 rpm durante 5 días. A continuación, se recolectaron las células para determinar la productividad de lípidos y el perfil lipídico. Se utilizaron 3 mL del cultivo para determinar el peso seco de las células y el contenido lipídico total (productividad de lípidos) y se utilizó 1 mL para determinar el perfil de ácidos grasos. En cada caso, los cultivos se introdujeron en tubos y se centrifugaron a 3500 rpm durante 10 minutos para formar pellets a partir de las células. Después de decantar el sobrenadante, se añadieron 2 mL de agua desionizada a cada tubo y se utilizaron para lavar el pellet celular resultante. Los tubos se volvieron a centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos para formar pellets a partir de las células lavadas, a continuación se decantó el sobrenadante y los pellets celulares se guardaron en un congelador a -70 °C durante 30 minutos. A continuación, los tubos se transfirieron a un liofilizador durante toda la noche para secarlos. Al día siguiente, se registró el peso del tubo cónico más la biomasa seca resultante de los 3 mL de cultivo y el pellet celular resultante se sometió a una extracción lipídica total utilizando un sistema de hidrólisis ácida de Ankom (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) para determinar el contenido lipídico total.

[0356] De las 185 cepas analizadas, se seleccionaron 30 cepas basándose en la tasa de crecimiento y la productividad de lípidos. La productividad de lípidos (expresada como el porcentaje de lípidos respecto el peso seco de las células) de estas 30 cepas se resume a continuación en la Tabla 19.

T a b la 19. P rod uc tiv idad de líp idos de las cep as de le vad u ra o lea g in osa .

[0357] Los pellets celulares resultantes de 1 mL de cultivo se sometieron a transesterificación directa y análisis de GC para determinar el perfil de ácidos grasos. En la Tabla 20 a continuación se indica un resumen de los perfiles de ácidos grasos para 17 de las cepas de levadura anteriores.

Tabla 20. Perfiles de ácidos grasos para las cepas de levadura oleaginosa.

[0358] El análisis del perfil de ácidos grasos se realizó en cepas adicionales de levadura oleaginosa y se observó que varias cepas producían un porcentaje elevado de ácidos grasos C16:1, incluida la cepa CBS 2924 de Torulaspora delbruekii. Esta cepa de levadura oleaginosa presentó una productividad de lípidos de aproximadamente un 40% de lípidos como porcentaje respecto al PSC y un perfil de ácidos grasos de: C12:0 (0.36%); c 14:0 (1.36%); C15:0 (0.16%); C16:0 (10.82%); C 16:1 (42.9%); C17:0 (0.11%); C18:0 (2.1%); C18:1 (35.81%); C18:2 (4.62%). Se observó que esta cepa presentaba un porcentaje particularmente elevado de C16:1 (ácido palmitoleico) como parte de su perfil de ácidos grasos. Se identificaron cuatro cepas más que producían un porcentaje elevado de 16:1: CBS 6012 de Yarrowia lipolytica (10.10%); CBS 6331 de Yarrowia lipolytica (14.80%), CBS 10144 de Yarrowia lipolytica (12.90%) y CBS 5589 de Yarrowia lipolytica (14.20%).

EJEMPLO 6: Genotipado de las cepas de levadura oleaginosa

[0359] Se realizó el genotipado de 48 cepas diferentes de levadura oleaginosa. El ADN genómico se aisló a partir de cada una de las 48 cepas diferentes de biomasa de levadura oleaginosa como se indica a continuación. Se centrifugaron células (aproximadamente 200 mg) de cultivos líquidos 5 minutos a 14 000 x g. Las células se resuspendieron después en agua destilada estéril, se centrifugaron 5 minutos a 14 000 x g y se desechó el sobrenadante. Se añadió una única microesfera de cristal con un diámetro de ~ 2 mm a la biomasa y los tubos se trataron a -80 °C durante al menos 15 minutos. Se retiraron las muestras y se añadieron 150 pL de tampón de trituración (1% de Sarkosil, sacarosa 0.25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, pH de 8.0, 0.5 pg/pL de ARNasa A). Se volvieron a suspender los pellets agitando brevemente con un vórtex y a continuación se añadieron 40 pL de NaCl 5 M. Las muestras se agitaron brevemente con un vórtex, a continuación se añadieron 66 pL de CTAB al 5% (bromuro de cetiltrimetilamonio) y se agitó brevemente por última vez con un vórtex. Posteriormente, las muestras se incubaron a 65 °C durante 10 minutos y después se centrifugaron a 14000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo una vez con 300 pL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 12:12:1, a continuación se centrifugó durante 5 minutos a 14000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo nuevo que contenía 0.7 volúmenes de isopropanol (~ 190 pL), se mezcló por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante toda la noche a 4 °C. El ADN se obtuvo por centrifugación a 14000 x g durante 10 minutos. A continuación, el pellet resultante se lavó dos veces con etanol al 70% y después se realizó un lavado final con etanol al 100%. Los pellets se secaron al aire durante 20-30 minutos a temperatura ambiente, y después se volvieron a suspender en 50 pL de TrisCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH de 8.0).

[0360] Se diluyeron cinco pL de ADN total de algas, preparado como se ha descrito anteriormente, con un factor de 1:50 en Tris 10 mM , pH de 8.0. Las reacciones de PCR, con un volumen final de 20 pL, se llevaron a cabo como se indica a continuación. Se añadieron diez pL de mezcla patrón 2 x iProof HF (Bio-Rad) a 0.4 pL del cebador directo SZ5434 (5' GTCCCTGCCCTTTGTACACAC -3' (SEQ ID NO:39) con una concentración estándar de 10 mM) y 0.4 pL del cebador inverso SZ5435 (5'- ttgatatgcttaagttcagcggg -3' (SEQ ID NO:40) con una concentración estándar de 10 mM). Los cebadores se seleccionaron basándose en la conservación de la secuencia entre tres regiones principales de 18S y cinco regiones principales de genes de ARNr 26S fúngicos. El cebador directo es idéntico a los nucleótidos 1632-1652 del N.o de acceso a Genbank AY550243 y el cebador inverso es idéntico a los nucleótidos 464271-464293 del N.o de acceso a Genbank NC_001144. A continuación, se añadieron 5 pL de ADN total diluido y 3.2 pL de dH2O. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo como se indica a continuación: 98 °C, 45''; 98 °C, 8''; 53 °C, 12''; 72 °C, 20'' durante 35 ciclos seguidos de 72 °C durante 1 minuto y manteniéndose a 25 °C. Para la purificación de los productos de PCR, se añadieron 20 pL de Tris 10 mM, pH de 8.0, a cada reacción, a continuación se extrajo con 40 pL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 12:12:1, se agitó con vórtex y se centrifugó a 14000 x g durante 5 minutos. Las reacciones de PCR se trataron en columnas S-400 (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3000 x g. Los productos purificados de PCR resultantes se clonaron y transformaron en E. coli utilizando el kit del vector ZeroBlunt PCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo directamente en colonias resistentes a ampicilina. El ADN del plásmido purificado se secuenció en ambas direcciones utilizando cebadores M13 directos e inversos. Posteriormente, los productos purificados de PCR se sometieron a clonación TOPO en PCR8/GW/TOPO y se seleccionaron los clones positivos para placas de LB/Spec. El ADN del plásmido purificado se secuenció en ambas direcciones utilizando cebadores M13 directos e inversos.

[0361] En la Tabla 21 se indica una lista de las 48 cepas de levadura oleaginosa que fueron genotipadas, junto con las SEQ ID NO correspondientes

Tabla 21. Cepas de levadura oleaginosa genotipadas

Nombre de la cepa Número de la cepa

Rhodotorula glutinis DSMZ-DSM 7098

Lipomyces tetrasporus CBS 5911

Rhodotorula glutinis var. glutinis CBS 3044

Lipomyces tetrasporus CBS 8664

Lipomyces tetrasporus CBS 1808

Lipomyces tetrasporus CBS 1810

Lipomyces starkeyi CBS 1809

Trichosporon montevideense CBS 8261

Yarrowia lipolytica CBS 6331

Cryptococcus curvatus CBS 5324

Rhodotorula mucilaginosa var. CBS 316

mucilaginosa

Cryptococcus curvatus CBS 570

Cryptococcus curvatus CBS 2176

Cryptococcus curvatus CBS 2744

Cryptococcus curvatus CBS 2754

Cryptococcus curvatus CBS 2829

Cryptococcus curvatus CBS 5163

Cryptococcus curvatus CBS 5358

Trichosporon sp. CBS 7617

Sporororbolomyces alborubescens CBS 482

Rhodotorula glutinis var. glutinis CBS 324

Rhodotorula glutinis var. glutinis CBS 4476

Trichosporon behrend CBS 5581

Geotrichum histeridarum CBS 9892

Rhodotorula aurantiaca CBS 8411

Cryptococcus curvatus CBS 8126

Trichosporon domesticum CBS 8111

Rhodotorula toruloides CBS 8761

Rhodotorula terpendoidalis CBS 8445

Yarrowia lipolytica CBS 10144

Rhodotorula glutinis var. glutinis CBS 5805

Yarrowia lipolytica CBS 10143

Lipomyces tetrasporus CBS 5607

Yarrowia lipolytica CBS 5589

Lipomyces tetrasporus CBS 8724

Rhodosporidium sphaerocarpum CBS 2371

Trichosporon brassicae CBS 6382

Cryptococcus curvatus CBS 2755

(Continuado)

Lipomyces tetrasporus CBS 7656 SEQ ID NO:65 Lipomyces starkeyi CBS 7786 SEQ ID NO:66 Yarrowia lipolytica CBS 6012 SEQ ID NO:67 Trichosporon loubieri var. loubieri CBS 8265 SEQ ID NO:68 Geotrichum vulgare CBS 10073 SEQ ID NO:69 Rhodosporidium toruloides CBS 14 SEQ ID NO:70 Rhodotorula glutinis var. glutinis CBS 6020 SEQ ID NO:71 Lipomyces orientalis CBS 10300 SEQ ID NO:71 Rhodotorula aurantiaca CBS 317 SEQ ID NO:72 Torulaspora delbrueckii CBS 2924 SEQ ID NO:73

EJEMPLO 7: Cultivo de Rhodococcus opacus para obtener un contenido elevado de aceite

[0362] Se generó un cultivo de siembra de Rhodococcus opacus PD630 (DSM 44193, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuttwen GmbH) utilizando 2 mL de un estándar conservado criológicamente inoculado en 50 mL de medio MSM con un 4% de sacarosa (remítase a Schlegel et al., (1961) Arch Mikrobiol 38, 209-22) en un matraz deflectado de 250 mL. El cultivo de siembra se cultivó a 30 °C con agitación de 200 rpm hasta que alcanzó una densidad óptica de 1.16 a 600 nm. Se utilizaron 100 mL del cultivo del matraz de siembra para inocular cultivos con el fin de producir lípidos en dos condiciones diferentes de nitrógeno: NH4Cl 10 mM y NH4Cl 18.7 mM (cada uno por duplicado). Los cultivos en crecimiento se cultivaron a 30 °C con agitación de 200 rpm durante 6 días. Las células cultivadas utilizando NH4Cl 10 mM alcanzaron un contenido lipídico máximo de un 57.2% (promedio) en PSC después de 6 días de cultivo. Las células cultivadas utilizando NH4Cl 18.7 mM alcanzaron un contenido lipídico máximo de un 51.8% (promedio) en PSC después de 5 días de cultivo.

[0363] Una muestra de la biomasa de Rhodococcus opacus se sometió a transesterificación directa y se analizó mediante GC/FID para determinar el perfil de ácidos grasos. Los resultados fueron los siguientes: C14:0 (2.33); C15:0 (9.08); C16:0 (24.56); C16:1 (11.07); C17:0 (10.50); especies C17 equivalentes con 2 dobles enlaces (E2DE) (19.90); C18:0 (2.49); C18:1 (17.41); C18:2 (0.05); C19:0 (0.75) y especies C19 E2DE (1.87).

EJEMPLO 8: Extracción de aceite a partir de microorganismos

A. Extracción de aceite a partir de microalgas utilizando una prensa de tornillo y un adyuvante de prensado

[0364] Se secó biomasa de microalgas que contenía un 38% de aceite en PSC utilizando una secadora de tambor, lo cual dio como resultado un contenido de humedad resultante de un 5-5.5%. La biomasa se introdujo en una prensa francesa L250. Se introdujeron 30.4 kg (67 lb) de biomasa en la prensa y no se obtuvo nada de aceite. Se introdujo en la prensa la misma biomasa microbiana seca combinada con varios porcentajes de pasto varilla como adyuvante de prensado. La combinación de biomasa microbiana seca y un 20% p/p de pasto varilla proporcionó el mejor porcentaje global de recuperación de aceite. A continuación, la masa prensada se sometió a una extracción con hexano y el rendimiento final para el uso de un 20% de pasto varilla fue de un 61.6% del aceite disponible total (calculado en peso). La biomasa con más de un 50% de aceite en peso seco de las células no requirió el uso de un adyuvante de prensado, tal como el pasto varilla, para extraer el aceite. Otros métodos para extraer aceite de microalgas utilizando una prensa de tornillo se describen en la Solicitud de PCT N.o PCT/US2010/31108, incorporada a la presente por referencia.

B. Extracción de aceite a partir de levadura oleaginosa utilizando una prensa de tornillo

[0365] Se obtuvo una cepa de levadura de Rhodotorula glutinis (DSMZ-DSM 70398) de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, InhoffenstraUe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania). Las células conservadas criológicamente se descongelaron, se añadieron a 50 mL de medio YPD (descrito anteriormente) con 1x solución de vitaminas DAS (1000x: 9 g/L de tricina; 0.67 g/L de tiamina-HCl; 0.01 g/L de d-biotina; 0.008 de cianocobalamina; 0.02 de pantotenato de calcio; y 0.04 g/L de ácido p-aminobenzoico) y se cultivaron a 30 °C con agitación de 200 rpm durante 18-24 horas hasta que la lectura de la DO fue superior a una DO de 5 (A600). A continuación, el cultivo se transfirió a fermentadores de 7 L y el medio se cambió por YP1 (8.5 g/L de base de nitrógeno para levaduras Difco sin aminoácidos ni sulfato de amonio, 3 g/L de sulfato de amonio, 4 g/L de extracto de levadura) con 1x solución de vitaminas DAS. Se tomaron muestras de los cultivos dos veces al día y se analizaron para determinar la DO (A600), el peso seco de las células (PSC) y la concentración de lípidos. Cuando los cultivos llegaron a un PSC de 50 g/L, estos se recolectaron. Basándose en el peso seco de las células, la biomasa de levadura contenía aproximadamente un 50% de aceite. Dos muestras de la biomasa de levadura se sometieron a transesterificación directa y se analizaron mediante GC/FID para determinar el perfil de ácidos grasos. Los resultados se expresan en porcentaje de área y se muestran en la Tabla 12 a continuación.

Tabla 22. Perfil de ácidos grasos de las muestras de biomasa de levadura transesterificadas

[0366] El caldo de levadura obtenido se secó utilizando tres métodos diferentes para establecer una comparación: (1) secado en una bandeja en un horno de aire forzado a 75 °C durante toda la noche; (2) secado en una secadora de tambor sin concentración; y (3) se concentró el caldo de levadura hasta un 22% de sólidos y a continuación la suspensión se secó en una secadora de tambor. El material de cada una de las tres condiciones de secado diferentes se acondicionó por calentamiento y se introdujo en una prensa de tornillo para la extracción del aceite. La temperatura de la prensa era de 150 °F y la biomasa de levadura seca acondicionada se mantuvo a aproximadamente 190 °F hasta que estuvo a punto para ser introducida en la prensa.

[0367] El contenido de humedad de la levadura secada en bandeja fue de un 1.45% y a continuación la levadura seca se acondicionó en un horno a 90 °C durante 10 minutos. El contenido de humedad después del acondicionamiento fue de un 0.9%. A continuación, el material secado en bandeja y acondicionado se introdujo en una prensa de tornillo Taby de laboratorio (prensa de aceite Taby Pressen de tipo 70 con un motor de 2.2 Hp y un diámetro de tornillo de 70 mm) para extraer el aceite. Este material no proporcionó ninguna cantidad significativa de aceite y se observó bastante sedimentación en la prensa.

[0368] El contenido de humedad del caldo de levadura secado en un tambor sin concentración fue de un 5.4% y a continuación la levadura secada en el tambor se acondicionó en un horno a 90 °C durante 20 minutos. El contenido de humedad después del acondicionamiento fue de un 1.4%. A continuación, la levadura secada en el tambor y acondicionada se introdujo en una prensa de tornillo Taby de laboratorio para la extracción del aceite. Este material presentó una buena producción de aceite, con sedimentación mínima.

[0369] El contenido de humedad del caldo de levadura concentrado y secado en un tambor fue de un 2.1% y a continuación la levadura concentrada y secada en el tambor se acondicionó en un horno a 90 °C durante 20 minutos. El contenido de humedad después del acondicionamiento fue de un 1.0%. A continuación, la levadura concentrada, secada en el tambor y acondicionada se introdujo en una prensa de tornillo Taby de laboratorio para la extracción del aceite. Este material presentó una buena producción de aceite, con sedimentación mínima.

C. Secado y extracción de aceite a partir de bacterias oleaginosas

[0370] La cepa de bacterias oleaginosas PD630 de Rhodococcus opacus (DSMZ-DSM 44193) se cultivó de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente para producir biomasa de bacterias oleaginosas con aproximadamente un 32% de contenido lipídico en PDC.

[0371] El caldo de Rhodococcus opacus obtenido se concentró utilizando centrifugación y a continuación se lavó con agua desionizada y se volvió a suspender en 1.8 L de agua desionizada. Se añadieron 50 gramos de celulosa purificada (PB20-Pre-co-Floc, EP Minerals, Nevada) a la biomasa resuspendida y se ajustó el contenido de sólidos totales con agua desionizada hasta un 20%. A continuación, la biomasa de Rhodococcus se secó en una secadora de tambor y el contenido de humedad de Rhodococcus después del secado en el tambor fue de aproximadamente un 3%.

[0372] A continuación, el material secado en el tambor se acondicionó por calentamiento en un horno a 130 °C durante 30 minutos con un contenido de humedad resultante de aproximadamente un 1.2%. A continuación, la biomasa acondicionada por calentamiento se introdujo en una prensa Taby de laboratorio (prensa de tornillo) para la extracción del aceite. La temperatura de la prensa era de 209°F y la biomasa de levadura seca acondicionada se mantuvo a aproximadamente 240°F hasta que estuvo a punto para ser introducida en la prensa. La obtención de aceite vino acompañada de bastante sedimentación.

EJEMPLO 9: Procesamiento del aceite extraído; reducción del punto de fluidez

Resumen

[0373] El aceite microbiano preparado de acuerdo con los ejemplos anteriores se puede procesar de acuerdo con los métodos descritos en la presente con el fin de mejorar sus propiedades para utilizarlo en alimentos y lubricantes. Además de los microbios descritos en los ejemplos anteriores, la microalga Chlorella protothecoides es una productora excelente de aceite microbiano. Para consultar métodos de cultivo de cepas y especies de Chlorella con el fin de obtener un contenido elevado de aceite y para extraer aceite de estas, remítase a las Publicaciones de PCT N.os 2008/151149, 2010/120939 y 2010/138.620, incorporadas a la presente por referencia.

[0374] Se redujo el punto de fluidez en el aceite obtenido de Chlorella protothecoides reduciendo la proporción relativa de la fracción saturada, constituida principalmente por triglicéridos esteáricos y palmíticos conocidos en la técnica como la fracción estearínica. Esto se consiguió fraccionando el aceite para reducir la concentración de triglicéridos saturados del aceite. Esto se puede llevar a cabo por cristalización o fraccionamiento en seco, de forma similar al proceso de winterización conocido en la industria del aceite vegetal. En primer lugar, el aceite de algas se refinó, decoloró y desodorizó mediante los métodos descritos anteriormente (también se podrían utilizar métodos similares a los utilizados en la industria del aceite vegetal) para producir "aceite RBD".

[0375] La temperatura del aceite RBD se redujo de una forma controlada hasta que se formaron núcleos cristalinos. A continuación, el aceite se mantuvo a esta temperatura de cristalización durante varias horas para fomentar el crecimiento de los cristales. Los cristales se retiraron posteriormente mediante filtración para obtener dos fracciones: una fase sólida que contenía parte o gran parte de la fracción estearínica y una fase líquida que contenía principalmente la fracción oleínica. La fase líquida se sometió nuevamente a fraccionamiento hasta una temperatura de cristalización menor para conseguir eliminar más estearina. La fracción líquida purificada resultante, equivalente a una superoleína, nombre con el que se le conoce habitualmente en la industria del aceite vegetal, tiene unas propiedades térmicas mejores que las del aceite de algas original.

Materiales y métodos

Materiales

[0376] El aceite algáceo (refinado, decolorado y desodorizado) fue producido por Solazyme, Inc (South San Francisco, CA). La Tabla 23 resume las propiedades del aceite utilizado en el estudio.

Tabla 23. Propiedades del aceite algáceo utilizado en el estudio.

[0377] El depresor del punto de fluidez basado en un copolímero de polialquilmetacrilato (PPD) VISCOPLEX® 10-310 que contenía ~50% (p/p) de portador de aceite de ricino y VISCOPLEX® 1-133 que contenía portador de aceite mineral refinado fueron suministrados por RohmMax Evonik (Horsham, PA).

Métodos

A. Fraccionamiento en seco: cristalización

[0378] Se introdujeron aproximadamente 2.5 kg de aceite de algas en un recipiente de 3 L con camisa conectado a un baño con agua circulante de temperatura controlada, que se utilizó para calentar y enfriar el producto (Crystallization & Degumming, Charleroi, Bélgica). El reactor estaba provisto de un agitador de velocidad variable. El enfriamiento se controló monitorizando las temperaturas del aceite y del agua que circulaba entre las paredes dobles del reactor. Se tomó una muestra del reactor con una varilla constituida por una microgota de la suspensión de cristales y se depositó sobre un portaobjetos para monitorizar la formación de cristales al final del enfriamiento. La muestra se analizó inmediatamente con un microscopio antes de que los cristales tuvieran la oportunidad de fundirse.

[0379] En la Fig. 1 se muestra el patrón de enfriamiento global. La velocidad del agitador era de 30 rpm durante la primera fase y de 15 rpm al final del programa de enfriamiento.

B. Fraccionamiento en seco: filtración

[0380] Al final de la cristalización, la suspensión de cristales se filtró utilizando un filtro prensa de membrana de 1 L (Choquenet SA, Chauny, Francia). La filtración se llevó a cabo en una cámara que se mantuvo a la temperatura de enfriamiento final. El tiempo de filtración fue de 20 min y la presión suministrada al filtro fue de 4 barg.

[0381] Al final del paso de separación, se pesaron las fracciones estearínica y oleínica, se calcularon los rendimientos de las fracciones y se guardó una muestra de cada fracción para realizar más análisis. La superoleína de algas #1 se produjo procesando la oleína del primer fraccionamiento y repitiendo los procesos de cristalización y filtración descritos anteriormente siguiendo el programa de enfriamiento mostrado en la Fig. 2. Las superoleínas de algas #2 y #3 se produjeron fraccionando en primer lugar el aceite desodorizado y repitiendo los procesos de cristalización y filtración utilizando un programa de enfriamiento similar al que se muestra en la Fig. 2.

C. Punto de Vertido (PP)

[0382] Se pesaron los depresores del punto de fluidez (0.5 y 1.0 gramos) en matraces. Se añadieron el aceite de algas y las fracciones oleínica y superoleínica (100 gramos) a cada matraz. Las mezclas se mezclaron completamente. Se evaluó cada muestra de acuerdo con el método estándar D 97 de la ASTM (Sociedad Americana para Ensayos y Materiales). La muestra se vertió en un tubo de ensayo y se calentó sin agitación en un baño de agua, en el que se fijó la temperatura a 48.00C. La muestra se calentó hasta que alcanzó 46.00C. Después de calentarla, la muestra se enfrió hasta 25.0 oc (en un baño de agua). A continuación, la muestra se introdujo en un cilindro metálico en un baño de metanol. La temperatura del baño de metanol se fijó entre -1.0 oc y -2.0 oc hasta que la temperatura de la muestra alcanzó 10.0 oc. A continuación, la temperatura del baño de metanol se redujo hasta -17.0 oc hasta que la temperatura de la muestra alcanzó -7.00C. Cuando la temperatura de la muestra estaba aproximadamente 11.00C por encima del punto de fluidez esperado, la muestra se retiró del baño de metanol a cada reducción de 3.0 oc, con el fin de comprobar su capacidad para fluir. El punto de fluidez de la muestra se determinó como la temperatura a la cual la muestra en el tubo de ensayo dejó de fluir cuando se retiró del baño de metanol. Para dar el valor real del punto de fluidez de la muestra, se añadieron 3.0 oc a la temperatura registrada.

[0383] Las propiedades del aceite producido en cada paso se podrían mejorar adicionalmente de acuerdo con los métodos descritos en la presente añadiendo un depresor químico del punto de fluidez que redujera aún más el punto de fluidez. Los depresores del punto de fluidez utilizados en este ejemplo fueron VISCOPLEX® 10-310 y 1-133, ambos producidos por Evonik, pero se podrían obtener resultados similares utilizando cualquier depresor del punto de fluidez estándar. Los resultados se muestran en la Tabla 24 a continuación y en la Fig. 3.

Tabla 24. Efecto del fraccionamiento y los depresores del punto de fluidez(1) sobre el aceite de algas (oC)

(1) Punto de fluidez según D97 de la ASTM

(2) Mezcla 50:50 de poli(alquil)acrilato y aceite de ricino. Clasificado como biodegradable.

(3) Mezcla de poli(alquil)acrilato y aceite mineral refinado.

NE = no evaluado.

EJEMPLO 10: Puntos de fluidez de aceite producido a partir de microalgas modificadas

[0384] Se transformó Protheca moriformis (UTEX 1435) con uno de los siguientes constructos plasmídicos de la Tabla 25 utilizando los métodos del Ejemplo 2.

Tabla 25. Constructos plasmídicos utilizados para transformar Protheca moriformis (UTEX 1435).

[0385] Cada uno de los constructos contenía una región para la integración en el genoma nuclear y una región codificante de la sacarosa-invertasa de S. cerevisiae suc2 bajo el control del promotor de p-tubulina/5'UTR de C. reinhardtii y 3' UTR de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris. Este casete de expresión de S. cerevisiae suc2 se enumera como la SEQ ID NO:78 y actuó como un marcador de selección. A continuación se muestran las secuencias relevantes para las regiones de modificación dirigida utilizadas para la integración en el genoma nuclear.

[0386] Además del marcador seleccionable de sacarosa, tres de los cuatro constructos también contenían secuencias adicionales diferentes para la expresión de proteínas o ARN. La Tabla 26 enumera casetes de ARN horquillado o enzimas importantes codificados por la secuencia de ADN en el constructo indicado. Todas las regiones codificantes de proteínas tenían los codones optimizados para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Prototheca moriformis UTEX 1435 (remítase a la Tabla 2). En el Listado de Secuencias se enumeran tanto las secuencias de aminoácidos como las secuencias de ADNc para el constructo utilizado.

Tabla 26. Constructos plasmídicos para la expresión de tioesterasas o ARN horquillado utilizados para transformar Protheca moriformis (UTEX 1435).

[0387] Las regiones codificantes tanto de la ACP-tioesterasa de Carthamus tinctorius (CtOTE en el Constructo 3) como de la tioesterasa FatB2 de Cuphea wrightii (CwTE2 en el Constructo 4) estaban bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO:84) y 3'UTR de la nitrato-reductasa de C. vulgaris (SEQ ID NO:85). El péptido de tránsito nativo de la ACP-tioesterasa de C. tinctorius se reemplazó por el péptido de tránsito de la estearoil-ACP-desaturasa de Chlorella protothecoides (SEQ ID NO:86). Las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos (con el péptido de tránsito reemplazado) de la ACP-tioesterasa de C. tinctorius se enumeran en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO:106 y SEQ ID NO:104, respectivamente. Las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos de la tioesterasa FatB2 de Cuphea wrightii se enumeran en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO:107 y SEQ ID NO:105, respectivamente. El Constructo 1 que contiene el ARN horquillado para FADc se describe en el Ejemplo 4.

[0388] Cada constructo se transformó en un entorno genético de Prototheca moriformis. Los clones positivos se evaluaron en placas con sacarosa como única fuente de carbono. Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos y se cultivó en condiciones de producción de lípidos. Se cultivó UTEX 1435 de tipo natural utilizando glucosa, mientras que las demás líneas transgénicas se cultivaron en sacarosa. Para cada constructo, se cultivaron los transformantes y se aisló el aceite. Los aceites aislados se analizaron para establecer los perfiles de ácidos grasos y se determinaron los puntos de fluidez según se describe en la presente. Los puntos de fluidez se determinaron utilizando el método de prueba estándar D97 de ASTM para la evaluación de puntos de fluidez. Los perfiles de ácidos grasos y los puntos de fluidez de los aceites para cepas transgénicas se muestran en la Tabla 27 a continuación. La Tabla 27 muestra los datos para la manipulación eficaz de los puntos de fluidez de los aceites producidos por microalgas modificadas genéticamente. El punto de fluidez del aceite transformado con el Constructo 3 se redujo desde -10.5 °C hasta 19.5 °C.

Tabla 27. Perfiles de ácidos grasos y temperaturas de los puntos de fluidez para células de Prototheca moriformis que contienen diferentes constructos.

EJEMPLO 11: Microalgas modificadas con perfiles de ácidos grasos alterados

[0389] Según se ha descrito anteriormente, la integración de genes heterólogos para desactivar o reducir la expresión de enzimas de la vía lipídica endógenas específicas en especies de Prototheca puede alterar los perfiles de ácidos grasos. Debido a que las acilo graso-ACP-tioesterasas catalizan la escisión de un ácido graso a partir de una proteína portadora de acilo durante la síntesis de lípidos, estas son enzimas importantes de la vía lipídica a la hora de establecer el perfil lipídico del organismo huésped. Se crearon constructos plasmídicos para evaluar si el perfil lipídico de una célula huésped puede verse afectado como resultado de una desactivación o reducción de la expresión de un gen endógeno de acilo graso-ACP-tioesterasa, FATA1.

A. Alteración de los perfiles de ácidos grasos mediante la desactivación de un gen endógeno de tioesterasa de Prototheca moriform is

[00390] Un derivado mutado de forma clásica de Protheca moriformis UTEX 1435, S1920, se transformó con uno de los siguientes constructos plasmídicos de la Tabla 28 utilizando los métodos del Ejemplo 2. Cada constructo contenía una región para la integración en el genoma nuclear para interrumpir el gen endógeno FATA1 y una región codificante de la sacarosa-invertasa de S. cerevisiae suc2 bajo el control del promotor de p-tubulma/5'UTR de C. reinhardtii y 3' UTR de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris. Este casete de expresión de S. cerevisiae suc2 se enumera como la SEQ ID NO:78 y actuó como un marcador de selección. Todas las regiones codificantes de proteínas tenían los codones optimizados para reflejar los codones preferenciales inherentes en genes nucleares de Prototheca moriformis UTEX 1435 (remítase a la Tabla 2). A continuación se muestran las secuencias relevantes para las regiones de modificación dirigida para el gen FATA1 que se utilizaron para la integración en el genoma nuclear.

Descripción SEQ ID NO:

secuencia 5' para la integración en el locus FATA1 SEQ ID NO:108 secuencia 3' para la integración en el locus FATA1 SEQ ID NO:109 Tabla 28. Constructos plasmídicos utilizados para transformar S1920 de Protheca moriformis (UTEX 1435).

[0391] Los sitios de restricción relevantes en el constructo FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1 se indican en minúscula en la secuencia a continuación, en negrita y subrayados y son 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Asc I, Mfe I, Sac I, BspQ I, respectivamente. Los sitios de BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en negrita y minúscula representan ADN genómico de S1920 que permite la integración dirigida en el locus FATA1 mediante recombinación homóloga. Siguiendo en la dirección de 5' a 3', el promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen de sacarosa-invertasa de la levadura (que confiere la capacidad a S1920 para metabolizar sacarosa) se indica con el texto encuadrado. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA para la invertasa se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La 3' UTR de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris se indica con texto en minúscula y subrayado y viene seguida por la región genómica FATA1 de S190, que se indica con texto en negrita y minúscula gctcttcggagtcactgtgccactgagttcgactggtagctgaatggagtcgctgctccactaa acgaattgtcagcaccgccagccggccgaggacccgagtcatagcgagggtagtagcgcgccat ggcaccgaccagcctgcttgccagtactggcgtctcttccgcttctctgtggtcctctgcgcgc tccagcgcgtgcgcttttccggtggatcatgcggtccgtggcgcaccgcagcggccgctgccca tgcagcgccgctgcttccgaacagtggcggtcagggccgcacccgcggtagccgtccgtccgga acccgcccaagagttttgggagcagcttgagccctgcaagatggcggaggacaagcgcatcttc ctggaggagcaccggtgcgtggaggtccggggctgaccggccgtcgcattcaacgtaatcaatc gcatgatgatcagaggacacgaagtcttggtggcggtggccagaaacactgtccattgcaaggg catagggatgcgttccttcacctctcatttctcatttctgaatccctccctgctcactctttct cctcctccttcccgttcacgcagcattcggggtaccctttcttgcgctatgacacttccagcaa aaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccc cccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaat 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g c g c c c t g g g c a t c g c g t g g g c c t c c a a c t g g g a g t a c t c c g c c t t c g t g c c c a c c a a c c c c t g g c g c t c c t c c a t g t c c c t c g t g c g c a a g t t c t c c c t c a a c a c c g a g t a c c a g g c c a a c c c g g a g a c g g a g c t g a t c a a c c t g a a g g c c g a g c c g a t c c t g a a c a t c a g c a a c g c c g g c c c c t g g a g c c g g t t c g c c a c c a a c a c c a c g t t g a c g a a g g c c a a c a g c t a c a a c g t c g a c c t g t c c a a c a g c a c c g g c a c c c t g g a g t t c g a g c t g g t g t a c g c c g t c a a c a c c a c c c a g a c g a t c t c c a a g t c c g t g t t c g c g g a c c t c t c c c t c t g g t t c a a g g g c c t g g a g g a c c c c g a g g a g t a c c t c c g c a t g g g c t t c g a g g t g t c c g c g t c c t c c t t c t t c c t g g a c c g c g g g a a c a g c a a g g t g a a g t t c g t g a a g g a g a a c c c c t a c t t c a c c a a c c g c a t g a g c g t g a a c a a c c a g c c c t t c a a g a g c 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[0392] Para introducir el gen de la ACP-tioesterasa 2 de Cuphea wrightii (CwFatB2) (N.o de acceso: U56104) en S1920 en el locus FATA1, se generó un constructo para expresar la región codificante de la proteína del gen CwFatB2 bajo el control del promotor Amt03/5'UTR de Prototheca moriformis (SEQ ID NO:84) y 3'u Tr de la nitrato-reductasa de C. vulgaris (s Eq ID NO:85). El constructo que se ha expresado en S1920 se puede escribir como FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1.

[0393] Los sitios de restricción relevantes en el constructo FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1 se indican en minúscula, en negrita y subrayados en la secuencia a continuación y son 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Asc I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Asc I, Pac I, Sac I, BspQ I, respectivamente. Los sitios de BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en negrita y minúscula representan ADN genómico de S1920 que permite la integración dirigida en el locus FATA1 mediante recombinación homóloga. Siguiendo en la dirección de 5' a 3', el promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen de sacarosa-invertasa de la levadura (que confiere la capacidad a S1920 para metabolizar sacarosa) se indica con el texto encuadrado. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA para la invertasa se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La 3' UTR de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris se indica con texto en minúscula y subrayado, y viene seguida por un promotor amt03 endógeno de Prototheca moriformis, que se indica con texto en cursiva encuadrado. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA de la ACP-tioesterasa de C. wrightii se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que el resto de la región codificante de la ACP-tioesterasa se indica en negrita y cursiva. La 3' UTR de la nitrato-reductasa de C. vulgaris se indica de nuevo con texto en minúscula y subrayado y viene seguida por la región genómica FATA1 de S1920, que se indica con texto en negrita y minúscula. Las secuencias de ADNc con codones optimizados y las secuencias de aminoácidos de la tioesterasa FatB2 de Cuphea wrightii se enumeran en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO:107 y SEQ ID NO:105, respectivamente.

g c t c t t c g g a g t c a c t g t g c c a c t g a g t t c g a c t g g t a g c t g a a t g g a g t c g c t g c t c c a c t a a a c g a a t t g t c a g c a c c g c c a g c c g g c c g a g g a c c c g a g t c a t a g c g a g g g t a g t a g c g c g c c a t g g c a c c g a c c a g c c t g c t t g c c a g t a c t g g c g t c t c t t c c g c t t c t c t g t g g t c c t c t g c g c g c t c c a g c g c g t g c g c t t t t c c g g t g g a t c a t g c g g t c c g t g g c g c a c c g c a g c g g c c g c t g c c c a t g c a g c g c c g c t g c t t c c g a a c a g t g g c g g t c a g g g c c g c a c c c g c g g t a g c c g t c c g t c c g g a a c c c g c c c a a g a g t t t t g g g a g c a g c t t g a g c c c t g c a a g a t g g c g g a g g a c a a g c g c a t c t t c c t g g a g g a g c a c c g g t g c g t g g a g g t c c g g g g c t g a c c g g c c g t c g c a t t c a a c g t a a t c a a t c g c a t g a t g a t c a g a g g a c a c g a a g t c t t g g t g g c g g t g g c c a g a a a c a c t g t c c a t t g c a a g g g c a t a g g g a t g c g t t c c t t c a c c t c t c a t t t c t c a t t t c t g a a t c c c t c c c t g c t c a c t c t t t c t ^{c c t c c t c c t t c c c g t t c a c g c a g c a t t c g g g g t a - c c} ctttcttgcgctatgacacttccagcaa aaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccc cccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaat agccaggcccccgattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagat cactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttc ^{c t c t t c g t t t c a g t c a c a a c c c g c a a a c} ggcgcgccATG ^{c t g c t g c a g g c c t t c c t g t t c c t g c} t g g c c g g c t t c g c c g c c a a g a t c a g c g c c t c c a t g a c g a a c g a g a c g t c c g a c c g c c c c c t g g t g c a c t t c a c c c c c a a c a a g g g c t g g a t g a a c g a c c c c a a c g g c c t g t g g t a c g a c g a g a a g g a c g c c a a g t g g c a c c t g t a c t t c c a g t a c a a c c c g a a c g a c a c c g t c t g g g g g a c g c c c t t g t t c t g g g g c c a c g c c a c g t c c g a c g a c c t g a c c a a c t g g g a g g a c c a g c c c a t c g c c a t c g c c c c g a a g c g c a a c g a c t c c g g c g c c t t c t c c g g c t c c a t g g t g g t g g a c t a c a a c a a c a c c t c c g g c t t c t t c a a c g a c a c c a t c g a c c c g c g c c a g c g c t g c g t g g c c a t c t g g a c c t a c a a c a c c c c g g a g t c c g a g g a g c a g t a c a t c t c c t a c a g c c t g g a c g g c g g c t a c a c c t t c a c c g a g t a c c a g a a g a a c c c c g t g c t g g c c g c c a a c t c c a c c c a g t t c c g c g a c c c g a a g g t c t t c t g g t a c g a g c c c t c c c a g a a g t g g a t c a t g a c c g c g g c c a a g t c c c a g g a c t a c a a g a t c g a g a t c t a c t c c t c c g a c g a c c t g a a g t c c t g g a a g c t g g a g t c c g c g t t c g c c a a c g a g g g c t t c c t c g g c t a c c a g t a c g a g t g c c c c g g c c t g a t c g a g g t c c c c a c c g a g c a g g a c c c c a g c a a g t c c t a c t g g g t g a t g t t c a t c t c c a t c a a c c c c g g c g c c c c g g c c g g c g g c t c c t t c a a c c a g t a c t t c g t c g g c a g c t t c a a c g g c a c c c a c t t c g a g g c c t t c g a c a a c c a g t c c c g c g t g g t g g a c t t c g g c a a g g a c t a c t a c g c c c t g c a g a c c t t c t t c a a c a c c g a c c c g a c c t a c g g g a g c g c c c t g g g c a t c g c g t g g g c c t c c a a c t g g g a g t a c t c c g c c t t c g t g c c c a c c a a c c c c t g g c g c t c c t c c a t g t c c c t c g t g c g c a a g t t c t c c c t c a a c a c c g a g t a c c a g g c c a a c c c g g a g a c g g a g c t g a t c a a c c t g a a g g c c g a g c c g a t c c t g a a c a t c a g c a a c g c c g g c c c c t g g a g c c g g t t c g c c a c c a a c a c c a c g t t g a c g a a g g c c a a c a g c t a c a a c g t c g a c c t g t c c a a c a g c a c c g g c a c c c t g g a g t t c g a g c t g g t g t a c g c c g t c a a c a c c a c c c a g a c g a t c t c c a a g t c c g t g t t c g c g g a c c t c t c c c t c t g g t t c a a g g g c c t g g a g g a c c c c g a g g a g t a c c t c c g c a t g g g c t t c g a g g t g t c c g c g t c c t c c t t c t t c c t g g a c c g c g g g a a c a g c a a g g t g a a g t t c g t g a a g g a g a a c c c c t a c t t c a c c a a c c g c a t g a g c g t g a a c a a c c a g c c c t t c a a g a g c g a g a a c g a c c t g t c c t a c t a c a a g g t g t a c g g c t t g c t g g a c c a g a a c a t c c t g g a g c t g t a c t t c a a c g a c g g c g a c g t c g t g t c c a c c a a c a c c t a c t t c a t g a c c a c c g g g a a c g c c c t g g g c t c c g t g a a c a t g a c g a c g g g g g t g g a c a a c c t g t t c t ^{a c a t c g a c a a g t t c c a g g t g c g c g a g g t c a a g} TGAcaattg ^{g c a g c a g c a g c t c g g a t a g t a t c} gacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtg aatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgc gagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcata tcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctc ctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacc tgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaggatc ccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcctctgtcgcacctcagcgcg gcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccgg ttcacacacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaa cgttcacagcctagggatatcgaattcggccgacaggacgcgcgtcaaaggtgctggtcgtgta t g c c c t g g c c g g c a g g t c g t t g c t g c t g c t g g t t a g t g a t t c c g c a a c c c t g a t t t t g g c g t c t t a t t t t g g c g t g g c a a a c g c t g g c g c c c g c g a g c c g g g c c g g c g g c g a t g c g g t g c c c c a c g g c t g c c g g a a t c c a a g g g a g g c a a g a g c g c c c g g g t c a g t t g a a g g g c t t t a c g c g c a a g g t a c a g c c g c t c c t g c a a g g c t g c g t g g t g g a a t t g g a c g t g c a g g t c c t g c t g a a g t t c c t c c a c c g c c t c a c c a g c g g a c a a a g c a c c g g t g t a t c a g g t c c g t g t c a t c c a c t c t a a a g a g c t c g a c t a c g a c c t a c t g a t g g c c c t a g a t t c t t c a t c a a a a a c g c c t g a g a c a c t t g c c c a g g a t t g a a a c t c c c t g a a g g g a c c a c c a g g g g c c c t g a g t t g t t c c t t c c c c c c g t g g c g a g c t g c c a g c c a g g c t g t a c c t g t g a t c g a g g c t g g c g g g a a a a t a g g c t t c g t g t g c t c a g g t c a t g g g a g g t g c a g g a c a g c t c a t g a a a c g c c a a c a a t c g c a c a a t t c a t g t c a a g c t a a t c a g c t a t t t c c t c t t c a c g a g c t g t a a t t g t c c c a a a a t t c t g g t c t a c c g g g g g t g a t c c t t c g t g t a c g g g c c c t t c c c t c a a c c c t a g g t a t g c g c g c a t g c g g t c g c c g c g c a a c t c g c g c g a g g g c c g a g g g t t t g g g a c g g g c c g t c c c g a a a t g c a g t t g c a c c c g g a t g c g t g g c a c c t t t t t t g c g a t a a t t t a t g c a a t g g a c t g c t c t g c a a a a t t c t g g c t c t g t c g c c a a c c c t a g g a t c a g c g g c g t a g g a t t t c g t a a t c a t t c g t c c t g a t g g g g a g c t a c c g a c t a c c c t a a t a t c a g c c c g a c t g c c t g a c g c c a g c g t c c a c t t t t g t g c a c a c a t t c c a t t c g t g c c c a a g a c a t t t c a t t g t g g t g c g a a g c g t c c c c a g t t a c g c t c a c c t g t t t c c c g a c c t c c t t a c t g t t c t g t c g a c a g a g c g g g c c c a c a g g c c g g t c g c agccactagtatggtggtggccgccgccgccagcagcgccttcttccccgtgcccgccccccgc cccacccccaagcccggcaagttcggcaactggcccagcagcctgagccagcccttcaagccca agagcaaccccaacggccgcttccaggtgaaggccaacgtgagcccccacgggcgcgcccccaa ggccaacggcagcgccgtgagcctgaagtccggcagcctgaacaccctggaggacccccccagc agcccccccccccgcaccttcctgaaccagctgcccgactggagccgcctgcgcaccgccatca ccaccgtgttcgtggccgccgagaagcagttcacccgcctggaccgcaagagcaagcgccccga catgctggtggactggttcggcagcgagaccatcgtgcaggacggcctggtgttccgcgagcgc ttcagcatccgcagctacgagatcggcgccgaccgcaccgccagcatcgagaccctgatgaacc acctgcaggacaccagcctgaaccactgcaagagcgtgggcctgctgaacgacggcttcggccg cacccccgagatgtgcacccgcgacctgatctgggtgctgaccaagatgcagatcgtggtgaac cgctaccccacctggggcgacaccgtggagatcaacagctggttcagccagagcggcaagatcg gcatgggccgcgagtggctgatcagcgactgcaacaccggcgagatcctggtgcgcgccaccag cgcctgggccatgatgaaccagaagacccgccgcttcagcaagctgccctgcgaggtgcgccag gagatcgccccccacttcgtggacgccccccccgtgatcgaggacaacgaccgcaagctgcaca agttcgacgtgaagaccggcgacagcatctgcaagggcctgacccccggctggaacgacttcga cgtgaaccagcacgtgagcaacgtgaagtacatcggctggattctggagagcatgcccaccgag gtgctggagacccaggagctgtgcagcctgaccctggagtaccgccgcgagtgcggccgcgaga gcgtggtggagagcgtgaccagcatgaaccccagcaaggtgggcgaccgcagccagtaccagca cctgctgcgcctggaggacggcgccgacatcatgaagggccgcaccgagtggcgccccaagaac gccggcaccaaccgcgccatcagcaccTGAttaattaactcgaggcagcagcagctcggatagt atcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacct gtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttt tgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttc atatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctg ctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgca acctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaaa gcttgagctcttgttttccagaaggagttgctccttgagcctttcattctcagcctcgataacc tccaaagccgctctaattgtggagggggttcgaagacagggtggttggctggatggggaaacgc tggtcgcgggattcgatcctgctgcttatatcctccctggaagcacacccacgactctgaagaa gaaaacgtgcacacacacaacccaaccggccgaatatttgcttccttatcccgggtccaagaga gactgcgatgcccccctcaatcagcatcctcctccctgccgcttcaatcttccctgcttgcctg cgcccgcggtgcgccgtctgcccgcccagtcagtcactcctgcacaggccccttgtgcgcagtg ctcctgtaccctttaccgctccttccattctgcgaggccccctattgaatgtattcgttgcctg tgtggccaagcgggctgctgggcgcgccgccgtcgggcagtgctcggcgactttggcggaagcc gattgttcttctgtaagccacgcgcttgctgctttgggaagagaagggggggggtactgaatgg atgaggaggagaaggaggggtattggtattatctgagttgggtgaagagc (SEQ ID NO:112)

[0394] Durante la transformación de FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1 en S1920, se purificaron clones de transformantes primarios y se cultivaron en condiciones de producción de lípidos estándar a pH 5.0 similares a las condiciones descritas en el Ejemplo 1. Los perfiles de ácidos grasos se analizaron utilizando métodos de detección por cromatografía de gases de éster metílico de ácido graso en ionización de llama (FAME GC/FID). La siguiente Tabla 29 muestra los perfiles de ácidos grasos de varios transformantes.

Tabla 29. Perfiles de ácidos grasos de células de Prototheca moriformis que contenían un marcador seleccionable para suprimir un alelo de FATA1 endógeno.

[0395] Estos resultados muestran que la ablación del alelo de FATA1 endógeno del huésped altera el perfil lipídico de las microalgas modificadas. El impacto de dirigir un marcador seleccionable al alelo de FATA1 endógeno es una disminución clara de la producción de ácidos grasos C16:0 con un incremento en la producción de ácidos grasso C18:1.

[0396] Durante la transformación de FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FA en S1920, se purificaron clones de transformantes primarios y se cultivaron en condiciones de producción de lípidos estándar a pH 7.0 y proporcionando fuentes de carbono diferentes hasta una concentración total de 40 g/L. La concentración de sacarosa era de 40 g/L. Cuando se utilizó únicamente glucosa como fuente de carbono, la glucosa se proporcionó en una concentración de 40 g/L. Cuando se utilizaron glucosa y fructosa como fuentes de carbono, la glucosa se proporcionó en una concentración de 20 g/L y la fructosa en una concentración de 20 g/L. Los perfiles de ácidos grasos se evaluaron mediante GC-FID. Los perfiles de ácidos grasos resultantes se enumeran en la Tabla 30.

Tabla 30. Perfiles de ácidos grasos de células de Prototheca moriformis que contenían un marcador seleccionable y una tioesterasa exógena para suprimir un alelo de FATA1 endógeno.

(Continuado)

[0397] En concordancia con el direccionamiento de un marcador seleccionable solo al alelo de FATA1 del huésped, la integración de un marcador seleccionable concomitante con una tioesterasa exógena altera el perfil lipídico de las microalgas modificadas. Al igual que se indicó anteriormente, el direccionamiento de un gen exógeno al alelo de FATA1 produce una disminución clara de la producción de ácidos grasos C16:0. La expresión adicional de la tioesterasa CwTE2 en el locus FATA1 también afecta a los ácidos grasos de cadena media y a la producción de ácidos grasos C18:1 en una medida que depende del nivel de actividad de la tioesterasa exógena presente en los transformantes analizados. Los genes flanqueados por unidades repetitivas, tales como la 3' UTR de la nitrato-reductasa de C. vulgaris en constructos tales como FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1, se pueden amplificar al integrarlos en el genoma huésped. Existe una buena concordancia entre el número de copias del transgén amplificado en el sitio de integración diana y los niveles de tioesterasa, tal como indica el impacto que ejercen sobre los perfiles de ácidos grasos o la acumulación de proteínas recombinantes tal como se evalúa mediante imunotransferencia de Western.

[0398] Las líneas transgénicas en las que el gen CwTE2 ha sido sometido a amplificación muestran un aumento marcado en los ácidos grasos de cadena media (C10:0-C14:0) y una reducción concurrente de los ácido grasos C18:1. En contraste con esto, aquellos transformantes en los que CwTE2 no fue ampliado o fue ampliado poco (probablemente 1-2 copias) concuerdan con una expresión inferior de la tioesterasa exógena, lo cual produce un ligero incremento en los ácidos grasos de cadena media y un impacto mucho mayor sobre el incremento de ácidos grasos C18:1.

[0399] En conjunto, estos datos muestran que la ablación del alelo de FATA1 endógeno del huésped altera el perfil lipídico de las microalgas modificadas.

B. Alteración de los perfiles lipídicos mediante la desactivación de un gen endógeno de tioesterasa de Prototheca moriform is

[0400] Se introdujo un constructo, pSZ1773, para reducir la expresión del gen FATA1 de Prototheca moriformis mediante un ARN horquillado en un entorno genético UTEX 1435 de S1920 de Prototheca moriformis. El gen de la sacarosa-invertasa suc2 de Saccharomyces cerevisiae se utilizó como marcador seleccionable, que confiere capacidad para crecer en sacarosa como única fuente de carbono. La porción del constructo que codifica el ARN horquillado empleó el primer exón de la región codificante de FATA1, seguido del intrón endógeno y una unidad repetitiva del primer exón en la orientación inversa. Se incluyeron secuencias de modificación dirigida por recombinación homóloga 5' y 3' (que flanqueaban el constructo) en la región genómica 6S, enumeradas como SEQ ID NO:100 y 101 respectivamente, para la integración del constructo horquillado en el genoma nuclear. Este constructo se denomina 6S::p-Tub:suc2:nr:: p-tub:hairpinFatA:nr::6S.

[0401] Los sitios de restricción relevantes en el constructo 6S::p-Tub:suc2:nr:: p-tub:hairpin FatA:nr::6S se indican en minúscula, en negrita y subrayados en la secuencia a continuación y son 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Xho I, Sac I, BspQ I, respectivamente. Los sitios de BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en negrita y minúscula representan ADN genómico de S1920 que permite la integración dirigida en el locus 6S mediante recombinación homóloga. Siguiendo en la dirección de 5' a 3', el promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen de sacarosa-invertasa de la levadura (que confiere la capacidad a S1920 para metabolizar sacarosa) se indica con el texto encuadrado. El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA para la invertasa se indican en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que la región codificante se indica en minúscula y cursiva. La 3' UTR de la nitrato-reductasa de Chlorella vulgaris se indica con texto en minúscula y subrayado, y viene seguida por el segundo promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión de la horquilla para FATA1, que se indica con texto en cursiva encuadrado. El codón de iniciación ATG de FATA1 se indica en mayúscula, negrita y cursiva, mientras que el resto del primer exón de la región codificante de FATA1 se indica en mayúscula. El intrón del gen FATA se indica en mayúscula y subrayado, y se creó una región conectora, mostrada en mayúscula, negrita, cursiva y subrayada, en el punto de unión del intrón/primer exón inverso de FATA1 para facilitar el corte y empalme del ARN en estos vectores. El primer exón inverso de FATA1 se indica en mayúscula. La 3' UTR de la nitrato-reductasa de C. vulgaris se indica de nuevo con texto en minúscula y subrayado y viene seguida por la región genómica 6S de S1920, que se indica con texto en negrita y minúscula. Las secuencias de las porciones de FATA de este constructo de ARNi se enumeran como SEQ ID NO:110.

gctcttcgccgccgccactcctgctcgagcgcgcccgcgcgtgcgccgccagcgccttggcctt ttcgccgcgctcgtgcgcgtcgctgatgtccatcaccaggtccatgaggtctgccttgcgccgg ctgagccactgcttcgtccgggcggccaagaggagcatgagggaggactcctggtccagggtcc tgacgtggtcgcggctctgggagcgggccagcatcatctggctctgccgcaccgaggccgcctc caactggtcctccagcagccgcagtcgccgccgaccctggcagaggaagacaggtgaggggggt atgaattgtacagaacaaccacgagccttgtctaggcagaatccctaccagtcatggctttacc tggatgacggcctgcgaacagctgtccagcgaccctcgctgccgccgcttctcccgcacgcttc tttccagcaccgtgatggcgcgagccagcgccgcacgctggcgctgcgcttcgccgatctgagg acagtcggggaactctgatcagtctaaacccccttgcgcgttagtgttgccatcctttgcagac cggtgagagccgacttgttgtgcgccaccccccacaccacctcctcccagaccaattctgtcac ctttttggcgaaggcatcggcctcggcctgcagagaggacagcagtgcccagccgctgggggtt ggcggatgcacgctcaggtaccctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggc tgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttc ggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccga ttgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttcta 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caagcccagacttgttgctcactgggaaaaggaccatcagctccaaaaaacttgccgctcaaac cgcgtacctctgctttcgcgcaatctgccctgttgaaatcgccaccacattcatattgtgacgc ttgagcagtctgtaattgcctcagaatgtggaatcatctgccccctgtgcgagcccatgccagg catgtcgcgggcgaggacacccgccactcgtacagcagaccattatgctacctcacaatagttc ataacagtgaccatatttctcgaagctccccaacgagcacctccatgctctgagtggccacccc ccggccctggtgcttgcggagggcaggtcaaccggcatggggctaccgaaatccccgaccggat cccaccacccccgcgatgggaagaatctctccccgggatgtgggcccaccaccagcacaacctg ctggcccaggcgagcgtcaaaccataccacacaaatatccttggcatcggccctgaattccttc tgccgctctgctacccggtgcttctgtccgaagcaggggttgctagggatcgctccgagtccgc aaacccttgtcgcgtggcggggcttgttcgagcttgaagagc (SEQ ID NO:113)

[0402] La expresión de 6S::p-Tub:suc2:nr:: p-tub:hairpin FatA:nr::6S conduce a la formación de un ARN horquillado para silenciar los genes FATA diana. Durante su transformación en S1920, se purificaron clones de transformantes primarios y se cultivaron en condiciones de producción de lípidos estándar a pH 5.0. Los perfiles resultantes de los clones de transformantes representativos se enumeran en la Tabla 31

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un fluido dieléctrico que comprende aceite microbiano, en donde el aceite microbiano tiene un punto de fluidez de menos de -5 ° C, y en donde la composición de ácidos grasos del aceite microbiano es al menos 50% C18: 1 y menos de 10% C18: 2; en donde el fluido dieléctrico comprende menos del 2% de C18: 2; y si el fluido dieléctrico comprende el aceite microbiano mezclado con otro aceite que no es un aceite microbiano, el contenido del otro aceite en el fluido dieléctrico es inferior al 30%.

2. El fluido dieléctrico de la reivindicación 1, en el que el fluido dieléctrico tiene un punto de fluidez de entre -10°C y -40°C.

3. El fluido dieléctrico de cualquier reivindicación precedente, en el que la composición de ácidos grasos del aceite microbiano es:

(i) al menos 60% de C18: 1; o

(ii) al menos 70% C18: 1.

4. El fluido dieléctrico de cualquier reivindicación precedente, en el que el fluido dieléctrico tiene un punto de inflamación de 250°C a 375°C, o un punto de incendio de 300°C a 450°C.

5. El fluido dieléctrico de cualquier reivindicación precedente, en el que el valor de yodo del aceite microbiano está entre 25 y 200

6. El fluido dieléctrico de cualquier reivindicación precedente, que comprende además un depresor del punto de vertido.

7. El fluido dieléctrico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fluido dieléctrico tiene un voltaje de ruptura de 20 kV a 75 kV, y / o una resistencia dieléctrica de 20 MV / m (RMS) a 75MV / m (RMS).

8. El fluido dieléctrico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el fluido dieléctrico comprende además un antioxidante, un desactivador de iones metálicos, un inhibidor de la corrosión, un demulsificador, un aditivo antidesgaste, un depresor del punto de vertido o un compuesto antihidrólisis .

9. El fluido dieléctrico de cualquier reivindicación precedente, en el que el aceite microbiano es producido por un microbio diseñado genéticamente para expresar uno o más genes exógenos.

10. El fluido dieléctrico de la reivindicación 9, en el que el microbio genéticamente modificado es Prototheca o Chlorella, opcionalmente Prototheca moriformis.

11. El fluido dieléctrico de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que el uno o más genes exógenos codificado (s):

(i) una invertasa de sacarosa;

(ii) una acil-ACP tioesterasa grasa;

(iii) dos o más tioesterasas acil-ACP grasas; o

(iv) invertasa de sacarosa y una o más tioesterasas acil-ACP grasas.

12. El fluido dieléctrico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el aceite microbiano es producido por un microbio diseñado genéticamente, y en el que el fluido dieléctrico tiene un punto de fluidez de entre -10 ° C y -40 ° C.

13. El fluido dieléctrico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el fluido dieléctrico comprende al menos el 65% de C18: 1.

14. El fluido dieléctrico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el fluido dieléctrico comprende menos del 30% de C16: 0.

15. Un componente eléctrico que comprende el fluido dieléctrico de cualquier reivindicación anterior, opcionalmente en el que el componente eléctrico es un transformador.