CN102057048B - 微生物生物质和微生物油的直接化学修饰 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了可以通过将甘油脂质和脂肪酸酯碱水解成脂肪酸盐，由含油微生物生物质制备皂和化妆品。皂化油可以与多种添加剂组合以产生用作化妆品的组合物，所述组合物还可包含生物质的其它成分，包括未皂化的油、甘油和类胡萝卜素等。

Description

微生物生物质和微生物油的直接化学修饰
相关申请的交叉参考
本申请是非临时申请，且要求于2008年4月9日提交的61/043,620和于2008年6月20日提交的61/074610的权益，所述专利申请为了所有目的以其全文并入作为参考。
对序列表的引用
本申请包括所附的1-12页所示的序列表。
发明领域
本发明涉及基因工程、水产业领域，以及涉及含脂质微生物生物质(microbial biomass)的化学修饰。
发明背景
全球经济对能量需求的增加已经对化石燃料的成本施加越来越多的压力。这与日益增加的减少空气污染意义一道，已经刺激了家庭能源供应的开发并且触发了用于内燃引擎的非石油燃料的开发。对于压缩点火(柴油)引擎来说，已经显示脂肪酸的简单醇酯(生物柴油)可以接受为替代性柴油燃料。生物柴油比源自化石燃料的柴油具有更高的氧含量，因此减少颗粒物质、烃类和一氧化碳的排放，同时由于低硫含量还减少硫排放(Sheehan J等人，用于城市公共汽车的生物柴油和石油柴油的寿命周期清单(Life Cycle Inventory of Biodiesel and Petroleum Diesel forUse in an Urban Bus)，National Renewable Energy Laboratory，ReportNREL/SR-580-24089，Golden，Colo.(1998)，Graboski，M.S.和R.L.McCormick，Prog Energy Combust.Sci，24：125-164(1998))。
在生物柴油的生产、试验和使用方面的初期努力是采用精制的可食用植物油(通过油籽的溶剂提取被排出或回收)和动物脂肪(例如牛脂)作为原料进行燃料合成的(例如，参见Krawczyk，T.，INFORM，7：800-815(1996)；和Peterson，C.L.等人，Applied Engineering inAgriculture，13：71-79(1997)。该方法的进一步改进已经使得能够从更便宜的、未经高度精制的脂质原料例如废弃的餐馆油脂和大豆皂脚中生产脂肪酸甲酯(FAME)(例如，参见Mittelbach，M.和P.Tritthart，J AmOil Chem.Soc.，65(7)：1185-1187(1988)，Graboski，M.S.等人，生物柴油组合物对DDC系列60柴油机的引擎排放的影响(The Effect ofBiodiesel Composition on Engine Emissions from a DDC Series 60Diesel Engine)，Final Report to USDOE/National Renewable EnergyLaboratory，合约号ACG-8-17106-02(2000)。
几十年来，已经提出藻类的光能自养生长是自藻类制造生物柴油的一种有吸引力的方法，参见<回顾美国能源部的水生生物种计划：来自藻类的生物柴油>A Look Back at the U S Department of Energy′sAquatic Species Program：Biodiesel from Algae，NREL/TP 580-24190，John Sheehan，Tern Dunahay，John Benemann和Paul Roessler(1998)。很多研究人员认为，由于阳光是“免费的”资源，所以藻类的光能自养生长是培养微藻(microalgae)作为生物燃料生产原料的最理想方法(例如，参见Chisti，Biotechnol Adv.2007年5-6月，25(3)：294-306：“异养生产不如使用光合性微藻更有效，......因为异养微生物生长所需的可再生有机碳源最终由通常在农作物中发生的光合作用产生”)。其它研究不仅认为光能自养生长是生长微藻用于生物燃料的最好方法，而且认为没必要在引入到柴油引擎中之前对来自微藻生物质的任何物质都进行转酯(参见Screagg等人，Enzyme and Microbial Technology，Vol.33：7，2003，第884-889页)。
在最近几十年间光合生长方法一直是大量研究的焦点，部分地受到美国能源部燃料开发办公室的鼓励，其在1978～1996年期间资助了从藻类中开发可再生运输燃料的计划。该主要生产设计的中心是一系列户外阳光驱动的浅池塘，被设计成“跑道(raceway)”，其中藻类、水和营养物环绕着临近废CO2源(例如以化石物燃料为动力的发电厂)的圆形池塘循环。
常规通过在催化剂(例如强酸或强碱)的存在下将三酰基甘油(“TAG”)与低级烷基醇(例如甲醇)反应以产生脂肪酸烷基酯(例如，脂肪酸甲酯或“FAME”)和甘油来进行提取的/精制的植物油的转酯。
如上文所述，传统的生物柴油生产依赖于提取的和/或精制的油(通过溶剂提取油籽而被排出或回收的油)作为原料用于转酯过程。油来源，包括大豆、棕榈、椰子和芸苔(canola)，是通常使用的，提取通过干燥植物材料和预处理该材料(例如，通过薄片化)以促进溶剂(如己烷)渗透植物结构而进行。对用作起始材料的这些油的提取是传统生物柴油生产成本的显著影响因素。
类似于用于从干植物材料中提取油的溶剂提取工艺，在有机溶剂的存在下从微生物生物质进行油的溶剂提取。在此处，溶剂提取需要使用与水基本上不混溶的溶剂(例如己烷)以产生溶剂相(油在其中是可溶的)，以及需要水相(保留生物质的大量非脂质部分)。不幸的是，在工业规模生产中，为了有效提取而必须使用的挥发性(可能是致癌的)易燃有机溶剂的体积造成了危险的操作条件(同时在环境安全和工人安全性两方面)。而且，溶剂提取工艺产生大量的溶剂废流，它们需要正确的处置，因而增加了总体的生产成本。
作为备选方案，已报导了“无溶剂”提取工艺，这些工艺采用包含不超过约5％有机溶剂的水性溶剂从微生物提取脂质作为原料用在转酯工艺中生产生物柴油。简而言之，“无溶剂”提取工艺包括将裂解的细胞混合物与含有不超过约5％有机溶剂(例如己烷)的水性溶剂接触以产生相分离的混合物。该混合物包含较重的水层和含有乳化的脂质的较轻层。对较轻的脂质层重复进行提取工艺，直至获得非乳化的脂质层。不幸的是，脂质层的重复分离和洗涤使得“无溶剂”工艺特别费工。
仍然需要更廉价、更有效的方法用于从微生物产生的脂质提取有价值的生物分子。本发明满足了这种需求。
发明概述
在第一方面，本发明涉及如下发现：对含脂质的微生物生物质进行直接化学修饰可以急剧增加自那些脂质获得有价值物质的效率和降低成本。因此，在第一实施方案中，本发明提供了化学修饰含脂质微生物生物质的方法，其包括下述步骤：培养微生物群体，收获含有按干细胞重量计(DCW)至少5％脂质的微生物生物质，和使生物质进行化学反应，该化学反应导致共价修饰至少1％的脂质。在一些实施方案中，该方法还包括从所述生物质的其它组分中分离共价修饰的脂质。
在各种实施方案中，共价修饰的脂质与和其分离的生物质的比率按干重计为10％脂质对90％生物质至90％生物质对10％脂质。某些实施方案中，从生物质的其它组分中分离脂质的步骤包括相分离步骤，其中共价修饰的脂质形成较轻的非水相，而生物质的组分形成一个或多个较重相。在一些实施方案中，不经使脂质与非脂质物质的比率增加按重量计50％以上的预先富集步骤，使生物质进行化学反应。在其它实施方案中，使生物质进行化学反应，并进行使脂质与微生物干重的比率增加的预先富集步骤。在一些实施方案中，在化学反应前，收获的生物质不进行除了去除水和/或裂解细胞之外的任何处理。在一些实施方案中，进行化学反应的生物质以与细胞培养物相同的相对比例包含除水之外的组分。在一些实施方案中，生物质的脂质含量少于进行化学反应的生物质的90％。
在一个实施方案中，化学修饰含脂质微生物生物质包括：对生物质进行转酯以产生含有脂肪酸烷基酯的亲脂相和含有细胞物质与甘油的亲水相。在一些实施方案中，该方法还包括在使生物质进行转酯化学反应之前从所述生物质中去除水。在其它实施方案中，该方法还包括在从生物质中去除水之前破碎生物质。在一些实施方案中，使用选自下组的方法从生物质中去除水：对生物质进行冷冻干燥、转鼓干燥和烘箱干燥。
在其中化学修饰含脂质微生物生物质包括对生物质进行转酯的一些实施方案中，该方法还包括在对生物质实行转酯之前破碎生物质。在一些实施方案中，在破碎生物质之前从生物质中去除水。在一些实施方案中，破碎生物质包括加热生物质以产生裂解物。在其它实施方案中，破碎生物质包括将生物质与足以产生裂解物的酸或碱接触。在另外其它的实施方案中，破碎生物质包括将生物质与一种或多种酶接触以产生裂解物。在一些实施方案中，将生物质与至少一种蛋白酶和至少一种多糖降解酶接触。在一些实施方案中，破碎生物质包括机械裂解微生物群体以产生裂解物。在其它实施方案中，破碎生物质包括对生物质进行渗压震扰(osmotic shock)以产生裂解物。在另外其它的实施方案中，破碎生物质包括用裂解性病毒感染微生物群体以产生裂解物。在其它实施方案中，破碎生物质包括诱导裂解基因在微生物群体内表达以促进自裂解和裂解物的产生。
在其中化学反应包括转酯的化学修饰方法的一些实施方案中，脂肪酸烷基酯为脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。在一些实施方案中，将生物质转酯包括将生物质与醇和碱接触。在一些实施方案中，醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇及其混合物。在一些实施方案中，碱选自NaOH、KOH及其混合物。在一个实施方案中，醇为甲醇，且碱为NaOH。在一些实施方案中，将生物质转酯包括将生物质与醇和脂肪酶接触。在一些实施方案中，脂肪酶在微生物群体中由外源性脂肪酶基因表达。在一些实施方案中，通过将生物质与刺激物接触以激活控制外源性脂肪酶基因表达的诱导型启动子，从而诱导外源性脂肪酶基因表达。
在各种实施方案中，亲脂相中钙和镁的组合量按重量计不大于5ppm(parts per million，百万分比)。在一些实施方案中，亲脂相中磷的量按质量计不大于0.001％。在一些实施方案中，亲脂相中硫的量不大于15ppm。在一些实施方案中，亲脂相中钾和钠的组合量按重量计不大于5ppm。在一些实施方案中，亲脂相的总类胡萝卜素含量不大于100微克类胡萝卜素每克。在一些实施方案中，亲脂相中的总叶绿素含量不大于0.1mg/kg。
在一些实施方案中，使生物质进行化学反应包括将生物质与酶接触以催化该化学反应。在一些实施方案中，所述酶为脂肪酶。在一个实施方案中，该方法还包括将含有共价修饰的脂质的亲脂相与亲水的生物质细胞物质分离。
在本发明的各种实施方案中，微生物和所得的微生物生物质选自下组：细菌、蓝细菌、真核微藻、产油酵母和真菌。在一些实施方案中，微生物选自表1中所列出的真核微藻。在一些实施方案中，微生物为小球藻属(Chlorella)的物种，且在各种实施方案中，该物种选自下组：Chlorella fusca、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、Chlorella kessleri、小球藻(Chlorella vulgaris)、Chlorella saccharophila、Chlorella sorokiniana和椭圆小球藻(Chlorellaelhpsoidea)。在一个实施方案中，该物种为原壳小球藻。在一些实施方案中，微生物为无绿藻属(Prototheca)的物种，或该物种选自下组：威氏无绿藻(Prototheca wickerhamii)、Prototheca stagnora、Protothecaportoricensis、Prototheca moriformis和左氏无绿藻(Prototheca zopfii)。在一些实施方案中，微生物选自表2中所列出的产油酵母，且在其它实施方案中，该微生物选自表3中所列出的真菌。在一些实施方案中，微生物生物质包括来自单独进行培养的两种不同微生物株系或物种的生物质的混合物。在一个实施方案中，该不同的微生物株系或物种中的至少两种具有不同的甘油脂质谱。在一些实施方案中，该物种与小球藻属或无绿藻属的成员具有高程度的分类学相似性，例如在23S rRNA水平具有至少95％核苷酸同一性，如实施例中所公开。
在本发明的各种实施方案中，收获的生物质包含按DCW计至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的脂质含量。在一些实施方案中，至少20％脂质为C18。在一些实施方案中，至少30％脂质为C18。在一些实施方案中，至少40％脂质为C18。在一些实施方案中，至少50％脂质为C18。在一些实施方案中，至少50％脂质为C16或更长的链长度。在一些实施方案中，至少10％脂质为C14或更短的链长度。在一些实施方案中，至少20％脂质为C14或更短的链长度。
在本发明的一些实施方案中，微生物群体表达外源性蔗糖利用基因。在一些实施方案中，该基因是蔗糖转化酶。在一些实施方案中，微生物群体表达外源性脂质途径酶。在一些实施方案中，该脂质途径酶包含酰基-ACP硫酯酶。在一些实施方案中，微生物群体还表达与酰基-ACP硫酯酶共表达的外源性“天然共表达的”酰基载体蛋白。在一些实施方案中，该脂质途径酶具有作用于链中具有特定碳原子数目的底物的专一性。
在一些实施方案中，化学修饰含脂质微生物生物质包括将生物质氢化以饱和脂质中至少一个子集的不饱和键。在一些实施方案中，化学修饰含脂质微生物生物质包括将生物质进行酯交换反应以产生甘油脂质的混合物，其相对于所收获的生物质中的甘油脂质具有改变的脂肪酸组分配置。在一些实施方案中，化学修饰含脂质微生物生物质包括将生物质羟基化以产生羟基化的脂质。在一些实施方案中，将至少一部分羟基化脂质进行酯化以产生交内酯(estolides)。在一些实施方案中，化学修饰含脂质微生物生物质包括将生物质水解以自脂质产生游离脂肪酸。在一些实施方案中，将游离脂肪酸进行进一步的化学修饰。在一个实施方案中，化学修饰含脂质微生物生物质包括在氢与催化剂的存在下在升高的温度进行脱氧、在氢和催化剂的存在下进行异构化和去除气体和石脑油化合物。
在另一个实施方案中，化学修饰含脂质微生物生物质包括皂化生物质以从脂质中产生脂肪酸盐。在一个实施方案中，该生物质源自无绿藻属的微藻。在一些实施方案中，皂化生物质包括将生物质与足以使脂质中的至少一部分的甘油脂质和/或脂肪酸酯组分转化成脂肪酸盐的碱接触。在一些实施方案中，该碱为碱金属氢氧化物，例如NaOH或KOH。在一些实施方案中，该方法还包括将生物质与盐接触以使脂肪酸盐从溶液中沉淀。在一些实施方案中，该盐包含水溶性碱金属卤化物，例如NaCl或KCl。
在一些实施方案中，将两种不同的微生物株系或物种分开培养，将来自两种培养物的生物质混合，之后对生物质进行化学反应以修饰至少1％的脂质。在一些实施方案中，该不同微生物株系中的至少两种具有不同的甘油脂质谱。
在一方面，本发明涉及用于制备皂的皂化方法。在一些实施方案中，该方法包括培养微生物群体，收获含有按DCW计至少5％脂质(包括甘油脂质或脂肪酸酯)的微生物生物质，和使生物质进行碱水解反应以通过将至少一部分的甘油脂质或脂肪酸酯化学转化成脂肪酸盐而产生皂。在一些实施方案中，该碱水解反应包括将生物质与碱接触并任选地加热生物质。在一些实施方案中，该碱为碱金属氢氧化物，例如NaOH或KOH。在一些实施方案中，生物质中少于100％的甘油脂质和脂肪酸酯被转化成脂肪酸盐。在一些实施方案中，生物质中少于1％的甘油脂质和脂肪酸酯被转化成脂肪酸盐。
在皂化方法的一些实施方案中，该方法还包括将脂肪酸盐从生物质的其它组分中实质性地分离。本发明的一些方法还包括在水中煮沸分离的脂肪酸盐并且通过将盐引入到水溶液中使脂肪酸盐再沉淀以产生纯化的皂。在一些实施方案中，该盐为水溶性碱金属卤化物，例如NaCl或KCl。
本发明的一些皂化方法还包括将经纯化的皂或皂化的油组合物与一种或多种选自下组的添加剂组合：精油、香精油、香味油(flavor oil)、植物性药材、香精(extracts)、CO2提取物(CO2 extracts)、黏土(clay)、着色剂、二氧化钛、云母、着色草本植物(tinting herb)、珠光剂(glitter)、皮肤角质层剥离剂(exfoliant)、果实种子、纤维、籽粒粉末(grainpowder)、坚果粉(nut meal)、种子粉(seed meal)、油珠(oil bead)、蜡球(wax bead)、草药、水溶胶、维生素、奶粉、防腐剂、抗氧化剂、生育酚、盐、糖、植物油、蜡、甘油、海洋蔬菜(sea vegetable)、营养油、保湿油、植物油制奶油(vegetable butter)、丙二醇、对羟基苯甲酸类、蜂蜜、蜂蜡、芦荟、聚山梨酸酯、玉米淀粉、可可粉、珊瑚粉、湿润剂、树胶、乳化剂和增稠剂。在一个实施方案中，将混合物包装成化妆品。在另一个实施方案中，该化妆品包括洁面剂。
在皂化方法的一些实施方案中，脂肪酸盐与和其分离的生物质的比率按干重计为10％脂肪酸盐∶90％生物质至90％脂肪酸盐∶10％生物质。在一些方法中，使生物质进行碱水解反应，不进行使生物质中脂质与非脂质物质的比率按重量计增加50％以上的预先富集步骤。在一些方法中，在碱水解反应之前，收获的生物质不接受除裂解之外的处理。在其它方法中，使生物质进行碱水解反应，并进行使生物质中脂质与非脂质物质的比率与收获时的比率相比增加的预先富集步骤。在一些实施方案中，进行碱水解反应的生物质与收获时的生物质以相同的相对比例包含除水之外的组分。在一些实施方案中，脂质包含不超过进行碱水解反应的生物质的90％。
在皂化方法的一些实施方案中，收获的生物质包含按DCW计至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的脂质含量。在一些实施方案中，脂质包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的饱和脂肪酸成分。
在一些实施方案中，皂化方法还包括在使生物质进行碱水解反应之前破碎生物质。在一些实施方案中，破碎生物质包括机械裂解微生物群体以产生裂解物。在一些实施方案中，在皂化之前从生物质中提取油。在一些实施方案中，提取的油基本上不含颜色或色素。
在另一方面，本发明涉及包含含脂肪酸烷基酯的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物。
在组合物的各种实施方案中，至少20％脂肪酸烷基酯为C18。在一些实施方案中，至少30％脂肪酸烷基酯为C18。在一些实施方案中，至少40％脂肪酸烷基酯为C18。在一些实施方案中，至少50％脂肪酸烷基酯为C18。在一些实施方案中，至少50％脂肪酸烷基酯为C16或更长的链长度。在一些实施方案中，至少10％脂肪酸烷基酯为C14或更短的链长度。在一些实施方案中，至少20％脂肪酸烷基酯为C14或更短的链长度。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含含有完全饱和的脂质的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相。在另一方面，本发明涉及组合物，其包含含有脂质的较轻相和至少一个含有来自1种以上物种或株系的微生物生物质的较重相。在另一方面，本发明涉及包含含有羟基化的脂质的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物。在另一方面，本发明涉及包含含有游离脂肪酸的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物。
在另一方面，本发明涉及包含皂化油的组合物，所述皂化油源自培养微生物群体产生的生物质的碱水解。在一些实施方案中，该组合物还包含选自下组的至少一种和任选地一种以上的油：大豆油、油菜籽油、芸苔油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、玉米油、废植物油、乌桕油、橄榄油、向日葵油、棉籽油、鸡脂肪油、牛脂油、猪脂油、微藻油、大型藻(macroalgae)油、萼距花(Cuphea)油、亚麻油、花生油、精选白脂膏(choice white grease)、猪油(lard)、荠蓝籽油(Camelina sativa)、芥末籽油、腰果油、燕麦油、羽扇豆(lupine)油、洋麻(kenaf)油、金盏花(calendula)油、大麻(hemp)油、咖啡油、亚麻籽(亚麻)油、榛果(hazelnut)油、大戟属植物(euphorbia)油、南瓜籽油、芫荽油、茶油、芝麻油、红花油、稻米油、油桐(tung oil tree)油、可可油、椰子干(copra)油、罌粟花(piumpoppy)油、蓖麻子油、山核桃油、霍霍巴油(jojoba)、麻风树(jatropha)油、澳洲坚果(macadamia)油、巴西坚果(Brazil nut)油、鳄梨(avocado)油、化石油(fossil oil)或其馏分。
在各种实施方案中，皂化油组合物可以是固体(包括粉末)或液体。在一些实施方案中，该组合物还包含源自生物质的类胡萝卜素和/或源自生物质的未皂化甘油脂质和/或源自生物质的多糖。在一些实施方案中，皂化油包含至少50％的组合物总质量。在一些实施方案中，皂化油包含至少75％的组合物总质量。在其它实施方案中，皂化油包含少于50％的组合物总质量。在其它实施方案中，皂化油包含少于25％的组合物总质量。在一些实施方案中，源自生物质的组分构成至少50％的组合物总质量。在一些实施方案中，源自生物质的组分构成不超过50％的组合物总质量。
在另一方面，本发明涉及包含如本文所述的皂化油组合物和口服补充剂的试剂盒。在一些实施方案中，该口服补充剂包含维生素或草药(herb)。
附图简述
图1显示在存在各种类型的甘油以及有和无另外的葡萄糖的情况下培养时多个小球藻属物种和株系的DCW/L。
图2显示在存在各种类型的甘油以及另外的葡萄糖的情况下培养时多个小球藻属物种和株系的DCW/L。
图3显示在存在各种类型的甘油以及另外的葡萄糖的情况下培养时多个小球藻属物种和株系的培养物的相对脂质浓度。
图4显示在存在各种类型的甘油以及有和无另外的葡萄糖的情况下多个小球藻属物种和株系的培养物的脂质浓度。
图5显示在存在各种类型的甘油以及另外的葡萄糖的情况下培养时两个小球藻属物种和株系的脂质(以DCW的百分比表示)，其中在葡萄糖之后相继加入甘油。
图6显示在存在各种类型的甘油以及另外的葡萄糖的情况下培养时两个小球藻属物种和株系的脂质(以DCW的百分比表示)。
图7显示在2％葡萄糖和1％葡萄糖+1％试剂级甘油的存在下培养时多个小球藻属物种和株系的培养物的相对脂质浓度。
图8显示在存在葡萄糖以及有和无试剂级甘油的情况下培养时多个小球藻属物种和株系的脂质(以DCW的百分比表示)，其中相继或组合地加入甘油和葡萄糖。
图9显示在存在各种类型的甘油以及另外的葡萄糖的情况下培养时多个小球藻属物种和株系的培养物的相对脂质浓度，其中相继或组合地加入甘油和葡萄糖。
图10显示在存在各种类型的甘油以及另外的葡萄糖的情况下培养时多个小球藻属物种和株系的DCW/L，其中相继或组合地加入甘油和葡萄糖。
图11(a)显示在存在葡萄糖、试剂级甘油、未经酸化的生物柴油副产品甘油、及甘油与葡萄糖的组合的情况下培养时钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)的脂质(以DCW的百分比表示)。
图11(b)显示在各种类型甘油的存在下以及在甘油和葡萄糖的组合的存在下培养时Navicula pelliculosa的脂质(以DCW的百分比表示)。
图12(a)显示在各种类型甘油的存在下以及在甘油和葡萄糖的组合的存在下培养时被甲栅藻(Scenedesmus armatus)的脂质(以DCW的百分比表示)。
图12(b)显示在各种类型甘油的存在下以及在生物柴油副产品甘油和葡萄糖的组合的存在下培养时被甲栅藻的DCW/L。
图13显示在各种类型甘油的存在下以及在未经酸化的生物柴油副产品甘油和葡萄糖的组合的存在下培养时Navicula pelliculosa的DCW/L。
图14(a)和(b)显示在经酸化和未经酸化的生物柴油副产品甘油以及另外的葡萄糖的存在下培养时被甲栅藻和Navicula pelliculosa的DCW/L，其中相继或组合地加入甘油与葡萄糖。
图15显示与单独木糖或葡萄糖相比，木糖和葡萄糖的组合对小球藻的生长的协同效应。
图16显示在葡萄糖和果糖上原壳小球藻的生长。
图17显示在存在或缺少蔗糖转化酶下，在葡萄糖、蔗糖或数种糖蜜样品(命名为BS1、BS2和HTM)中的一种的存在下培养时原壳小球藻的DCW/L。
图18显示在存在或缺少蔗糖转化酶下，在葡萄糖、蔗糖或数种糖蜜样品(命名为BS1、BS2和HTM)中的一种的存在下培养时原壳小球藻的生长，通过相对细胞密度测量。
图19显示与从UTEX 250中提取的油相比从株系UTEX 1435中用己烷提取的油的视觉对比。
图20显示埋在皂中的高油藻细胞。
图21a-c显示比较来自原壳小球藻的8种不同株系的23s rRNA的基因组DNA序列的分支图。
图22-27显示在3种不同浓度的作为唯一碳源的纯高粱上生长的微藻不同株系的生长曲线。
图28显示对微藻物种中脂质链的多样性的总结。
图29a-i显示比较来自微藻的23种株系的23S rRNA的基因组DNA序列的分支图。
发明详述
I.定义
为了读者方便起见，下面提供了本文所用的某些术语的定义。
关于核酸的“在微藻中具有活性的”是指，在微藻中具有功能性的核酸。例如，已用于驱动抗生素抗性基因以将抗生素抗性赋予转基因微藻的启动子在微藻中是具有活性的。在微藻中具有活性的启动子的实例包括某些藻类物种的内源性启动子和发现于植物病毒中的启动子。
“酰基载体蛋白”或“ACP”是在脂肪酸合成中在4′-磷酸泛酰巯基乙胺部分的远端巯基上以硫羟酸酯形式结合成长的酰基链并且包含脂肪酸合酶复合物的组分的蛋白质。就酰基载体蛋白以及脂酰-ACP硫酯酶而言，短语“天然共表达”是指ACP和该硫酯酶在其所来源自的组织或生物体中天然地(在自然界中)被共表达，例如，由于编码这两种酶的基因处于共同的调控序列的控制下或由于它们可以响应于相同的刺激物而被表达。
“酰基-CoA分子”或“酰基-CoA”是包含与辅酶A共价连接的酰基部分的分子，其中在辅酶A的4′-磷酸泛酰巯基乙胺部分的远端巯基处通过硫羟酸酯键发生该共价连接。
“纯性(Axenic)”意指未被其它活生物体污染的生物体培养物。
“生物柴油”是指由脂质的转酯反应产生的脂肪酸酯。该酯可以是甲酯、乙酯或其它酯，取决于转酯反应的组分。
“生物质(Biomass)”是指由细胞的生长和/或繁殖而产生的物质。生物质可以含有细胞和/或细胞内内含物以及细胞外物质。胞外物质包括但不限于由细胞分泌的化合物。
“生物反应器(Bioreactor)”意指在其中培养(任选地在悬液中)细胞例如微生物的围隔物(enclosure)或部分围隔物(partial enclosure)。
“催化剂”是指能够促进或帮助反应物化学反应为产物但不成为产物的一部分的物质，例如分子或大分子复合物。因此，催化剂增加反应速率，之后催化剂可以作用于另一个反应物以形成产物。催化剂通常降低反应所需的总活化能，由此使得反应进行得更快速或使得反应可以在更低的温度进行和/或可以更快速地达到反应平衡。催化剂的实例包括酶(其为生物催化剂)和热(其为非生物催化剂)。
“纤维素物质”(cellulosic material)意指消化纤维素的产物，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、二糖、寡糖、木质素、糠醛和其它分子。
“共培养”(co-culture)及其变体例如“共培养(co-cultivate)”是指在同一生物反应器中存在两种或多种类型的细胞。该两种或多种类型的细胞可以均为微生物，例如微藻，或可以是与不同细胞类型一起培养的微藻细胞。培养条件可以是鼓励该两种或多种类型细胞的生长和/或繁殖的条件、或是促进该两种或多种类型细胞中的一种细胞类型或一个子集的细胞类型生长和/或繁殖同时维持剩余细胞类型的细胞生长的条件。
本文使用的“辅因子”是指酶为实现其酶促活性所需的任何非底物分子。
“互补DNA”(“cDNA”)是可以例如通过信使RNA(mRNA)的逆转录或扩增(例如，通过聚合酶链反应(“PCR”))而获得的mRNA的DNA拷贝。
“培养”及其变体是指，通过使用适宜的培养条件有意地促进一种或多种细胞的生长(增加细胞尺寸、细胞内容物、和/或细胞的活性)和/或繁殖(通过有丝分裂增加细胞数目)。生长和繁殖两者的组合可以被称为增殖。该一种或多种细胞可以是微生物例如微藻的细胞。适宜条件的实例包括：在生物反应器中使用确定成分培养基(具有已知特征，例如pH、离子强度和碳源)、规定温度、氧压和二氧化碳水平。该术语不指天然的或者无直接人为干预的微生物的生长或繁殖，例如最终变成化石以产生地质原油的生物体的天然生长。
“外源基因”是指转化(引入)到细胞中的核酸。转化的细胞可以被称为重组细胞，在其中可以引入另外的外源基因。相对于所转化的细胞，外源基因可以来自不同的物种(并由此是异源的)或来自相同物种(并由此是同源的)。在同源基因的情况下，所引入的基因在细胞的基因组中占据的位置不同于该基因的内源拷贝，或其处于与它所取代的内源基因不同的调节控制下，或者两者兼而有之。外源基因可以于细胞中存在一个以上的拷贝。外源基因可以在细胞中以插入基因组中的形式或以附加型分子的形式保持。
“外源提供的”描述向细胞培养物的培养基提供的分子。
“提取”是指，在使用或未使用溶剂的情况下，将油或脂质与水性生物质分离。
“脂酰-ACP硫酯酶”是在脂质合成中自酰基载体蛋白(ACP)催化切割脂肪酸的酶。
“固定碳源”意指在环境温度和压力下以固体或液体形式存在的含碳分子，典型地有机分子。
本文所用的“真菌”意指来自真菌界的特征在于几丁质细胞壁的异养生物。
“杂原子”意指非碳和氢的原子。杂原子的实例为镁、钙、钾、钠、硫、磷、铁和铜。
“匀浆物(Homogenate)”意指已被物理破坏的生物质。
“疏水级分”是指，在疏水相中比在水相中更易溶的物质的部分或级分。疏水级分与水基本上不混溶且通常为非极性的。
“脂质产量增加”是指微生物培养物的脂质生产力增加，其可以通过例如增加每升培养物的细胞干重、增加脂质所占的细胞百分比、或增加每升培养物体积每单位时间的脂质总量来实现。
“诱导型启动子”是响应于特定刺激物而介导可操作连接的基因转录的启动子。
“可操作连接”是指两个核酸序列例如控制序列(典型地启动子)和所连接的序列之间的功能性连接。如果启动子可以介导外源基因的转录，则它与该基因可操作连接。
“原位”意指“原地”或“在其最初位置”。例如培养物可以含有分泌催化剂的第一微生物例如微藻和分泌底物的第二微生物，其中第一微生物和第二微生物产生在共培养物中原位发生特定化学反应所需的组分而不需要物质的进一步分离或处理。
“脂肪酶”是催化脂质底物中的酯键水解的酶。脂肪酶催化脂质水解成甘油和脂肪酸，并可具有催化TAG转酯为脂肪酸烷基酯的作用。
“脂质”是可以得自微生物的亲脂分子。脂质的主要生物功能包括贮存能量，充当细胞膜的结构组分，和用作信号分子，但它们也行使其它功能。脂质在非极性溶剂(例如乙醚和氯仿)中可溶且在水中相对不溶。脂质主要由长的疏水烃“尾”组成。脂质的实例包括脂肪酸(饱和与不饱和的)；甘油酯或甘油脂质(例如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯(包括TAG)或中性脂肪、和磷酸甘油酯或甘油磷酸脂)；非甘油酯(鞘脂、甾醇脂质(包括胆固醇和类固醇激素)、异戊烯醇脂质(包括萜类化合物)、蜡和聚酮化合物)；和复杂脂质衍生物(连接糖的脂质或糖脂，和连接蛋白质的脂质)。脂质的其它实例包括游离脂肪酸；脂肪酸酯；甾醇；色素(例如类胡萝卜素和氧化类胡萝卜素(oxycarotenoids))、黄叶素、植物甾醇、麦角硫因(ergothionine)、硫辛酸、抗氧化剂(包括β-胡萝卜素和生育酚)。还包括多不饱和脂肪酸例如花生四烯酸、十八碳四烯酸、胆固醇、24-去氢胆固醇、虾青素、角黄素和n-6和n-3高不饱和脂肪酸，例如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸(DHA)。
“脂质途径酶(lipid pathway enzyme)”是参与脂质代谢(即脂质合成、修饰或降解)的酶，包括但不限于脂肪酶、脂酰-ACP硫酯酶和酰基载体蛋白。
“限制性浓度的营养物”是培养物中营养物的浓度限制所培养的生物繁殖。“非限制性浓度的营养物”是在给定的培养期内可以支持最大繁殖的营养物浓度。因此，在存在限制性浓度的营养物时比在营养物为非限制性时，在给定的培养期内产生较低的细胞数量。当营养物的存在浓度大于支持最大繁殖的浓度时，该营养物被称作在培养物中是“过量的”。
“甘油脂质谱(Glycerolipid profile)”是指在特定的生物质样品中不同碳链长度与饱和水平的甘油脂质的分布。例如，样品可以包含甘油脂质，其中约60％甘油脂质为C18:1，20％为C18:0，15％为C16:0，且5％为C14:0。当提及碳长度而不考虑饱和情况时(如“C18”)，这种提及可以包括任何饱和量；例如含有20％的C18形式的脂质的微生物生物质可以包括等量或不同量的C18:0、C18:1、C18:2等，其总和构成该微生物生物质的20％。
“裂解物”是指含有裂解的细胞的内容物的溶液。“裂解(lysing)”是指破坏细胞的细胞膜和任选地细胞壁，以足以释放至少一些胞内内容物。“裂解(Lysis)”是指足以导致至少一些胞内内容物释放的生物体质膜和任选地细胞壁的破坏，通常通过危害其完整性的机械、病毒或渗透压机制来实现。
“微藻”意指微生物生物体，其为(a)真核生物且含有叶绿体或叶绿体残迹；或(b)蓝细菌。微藻包括专性光能自养生物(其不能将固定碳源代谢成能量、和异养生物(其可脱离固定碳源而独自生活)。微藻不仅可以指在细胞分裂后不久与姐妹细胞分离的单细胞生物例如衣藻(Chlamydomonas)，而且可以指微生物，例如团藻(Volvox)，其是具有两种不同类型细胞的简单多细胞光合微生物。“微藻”还包括显示细胞-细胞粘着的其它微生物光合生物，例如阿格曼藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属(Anabaena)和桑椹藻属(Pyrobotrys)，和含有不再能进行光合作用的叶绿体样结构的生物，例如无绿藻属和某些沟鞭藻类(dinoflagellates)的微藻。
在本文可互换使用的“微生物生物体(microorganism)”和“微生物(microbe)”是指微观单细胞生物。
“油”指疏水、亲脂的非极性含碳物质，包括但不限于地质源原油，地质源原油的馏分、植物油、藻油和微生物脂质。
本文使用的“产油酵母”意指可以蓄积10％以上DCW的脂质的酵母。产油酵母包括酵母例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，和酵母例如酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的工程化菌株——其已进行工程化从而蓄积10％以上DCW的脂质。
“渗压震扰(Osmotic shock)”是指在渗透压突然降低之后溶液中细菌、藻类或其它细胞的破裂。有时诱导渗压震扰以将细胞组分释放到溶液中。
“光生物反应器”是指在其中培养一种或多种微藻细胞的容器，其至少一部分是至少部分地透明的或部分地敞开的，由此允许光通过。光生物反应器可以是密闭的，例如聚乙烯袋或埃伦迈厄烧瓶，或可以向环境敞开，例如户外池塘。
“多糖降解酶”是指能够催化任何多糖水解或解聚的酶，例如纤维素酶是催化纤维素水解的多糖降解酶。
“多糖”(或“聚糖”)是由通过糖苷键连接在一起的单糖组成的碳水化合物。纤维素是组成某些植物细胞壁的多糖的例子。纤维素可以被酶解聚以产生单糖例如木糖和葡萄糖、以及较大的二糖和寡糖。
在生物反应器的上下文中，“进出口(Port)”是指生物反应器中允许物质(例如气体、液体和细胞)流入或流出的开口。进出口通常与从光生物反应器引出的管道连接。
提及例如细胞、或核酸、蛋白或载体时所使用的“重组”是指，该细胞、核酸、蛋白或载体已通过引入异源性核酸或蛋白或通过改变天然的(天然存在的)核酸或蛋白而是修饰的，或该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞可以表达非天然基因、不存在于天然(非重组)形式的细胞中的基因，或者与非重组细胞差异地表达天然基因，即相对于非重组细胞中的基因表达，该天然基因被过表达、低表达或根本未被表达。“重组核酸”是指不存在于自然界中的核酸形式(可以包括天然存在的核酸的纯化制品)，典型地通过操作核酸，例如使用聚合酶和内切核酸酶，而体外形成。因此，通过将正常不发生连接的DNA分子连结在一起(例如将两种不同的核酸以彼此可操作连接的方式放置)而体外形成的表达载体、或线性形式的分离核酸，是重组的。一旦重组核酸被引入到宿主细胞或生物中，那么它可以非重组地，即，使用宿主细胞的体内细胞机器，进行复制；但是，重组产生的且随后非重组复制的此类核酸仍被认为是重组的。类似地，“重组蛋白”是使用重组技术(即通过表达重组核酸)而制得的蛋白。
“皂化油”是指在皂化来自微生物来源的脂肪酸酯的过程中产生的羧酸盐和相关化合物。脂肪酸酯可以源自微生物产生的三酰基甘油(TAG)。与来自微生物来源的油相关的化合物包括类胡萝卜素、生育酚、生育三烯醇(tocotrienols)和生物来源的其它化合物。
“超声”是指通过使用声波能量破碎生物学物质例如细胞的过程。
“茎叶(Stover)”是指收获籽粒后剩余的经干燥的农作物的茎和叶。
“蔗糖利用基因(sucrose utilization gene)”是表达后有助于细胞利用蔗糖作为能源的能力的基因。蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶和己糖激酶例如葡糖激酶和果糖激酶是蔗糖利用基因的实例。
II.概要
可以使用某些微生物大量产生脂质，以用于运输燃料和石油化学工业等应用。本发明提供了显著减少从微生物获得脂质和有价值的脂质衍生化合物的成本和增加其效率的方法。适用于本发明方法的微生物包括微藻、产油酵母、真菌、细菌和蓝细菌。用于本发明的微藻属可以是产脂质的微藻，小球藻属。本发明还提供了用于将三酰基甘油(TAG)原位转酯为脂肪酸烷基酯的方法，所述脂肪酸烷基酯可以用作生物柴油燃料和/或用于其它应用，本发明还提供了用于化学修饰微生物生物质中的脂质的其它方法。
本发明还提供了通过培养微生物群体来制备脂肪酸烷基酯(例如脂肪酸甲酯(FAME))的方法，其中所述微生物产生至少5％其DCW的脂质(例如甘油三酯)。在此方法中，从培养物收获微生物生物质，任选地将其干燥以去除水。然后通过加入低级烷基醇和催化剂(例如NaOH)进行转酯，以产生含有脂肪酸烷基酯的亲脂相和含有亲水性细胞物质的亲水相。亲脂相可以容易地与亲水相分离。
生物质的直接转酯，在转酯之前不介入从生物质中提取亲脂组分的分离操作步骤，与转酯前采用传统提取和精制步骤的方法相比，允许以大幅降低的成本生产生物柴油。
本发明的方法提供了其它优点——可以通过将甘油脂质原位转酯为脂肪酸烷基酯而生产生物柴油。特别地，可以在允许调节细胞的甘油脂质含量的条件下培养本发明的微生物。令人惊讶的是，已发现，在含有逐渐更高的油∶非油比率(作为DCW的函数)的细胞中总甘油脂质的更大比例可以被转化成脂肪酸烷基酯。而且，这些较高的油∶非油比率还导致另一个意想不到的优点：由具有逐渐更高油∶非油比率的细胞产生的脂肪酸烷基酯，比由具有较低油∶非油比率的细胞产生的脂肪酸烷基酯，具有更低浓度的杂原子。该本发明方法显著地不同于本领域的现有教义，即，微藻的光能自养生长是用于生物燃料生产的最好微藻培养方法(例如，参见Rodolfi等人，Biotechnology & Bioengineering102(1)：100-112(2008)中，有关依据微藻株系的生物质生产力和脂质含量筛选微藻株系以用于在户外光生物反应器中生长的讨论)。还发现，生物质中的油含量越高，直接化学修饰后所得产物的质量越高。本发明提供了培养微生物(例如微藻)以实现更高油含量用于直接化学修饰以生产更高质量的化学产品的异养方法。
本发明还提供了化学修饰含脂质微生物生物质的其它方法，包括但不限于，氢化、酯交换、羟基化、水解和皂化。这些方法可使用本文所述的各种微生物和培养条件进行以产生广泛多样的化学产品用于多种应用。
本发明还提供了有用的组合物，包括：包含含有脂肪酸烷基酯的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物；包含含有完全饱和的脂质的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物；包含含有脂质的较轻相和至少一个含有来自一种以上物种或株系的微生物生物质的较重相的组合物；包含含有羟基化的脂质的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物；和包含含有游离脂肪酸的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物。本发明还提供了包含通过培养微生物群体所产生的生物质的碱水解而产生的皂化油的组合物。
III.微生物
用于本发明的微生物产生适于化学修饰用于生产生物柴油和生产用于其它目的(例如工业化学原料和可食用油)的脂肪酸酯、以及生产其它化学实体的脂质。适用于生物柴油和化学品生产的脂质包括含有脂肪酸分子的TAG。在一些实施方案中，合适的脂肪酸含有至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个、至少26个、至少28个、至少30个、至少32个、或至少34个碳原子或更多。优选的用于生物柴油的脂肪酸通常含有16个和18个碳原子。在某些实施方案中，上述脂肪酸是饱和的(不含碳-碳双键和三键)；单不饱和的(单个双键)；多不饱和的(两个或更多个双键)；是线性的(非环状)；和/或在其结构中几乎没有分枝或完全没有分枝。
在一些实施方案中，用于本发明的原位转酯和修饰方法的微生物培养导致产生这样的生物质，所述生物质当干燥时包含至少5％、至少10％、至少15％、至少20％或至少25％的油含量。在其它实施方案中，经干燥的生物质包含至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的油含量。上下文所使用的“干”或“经干燥的”是指失去基本上所有的水。生物质也可不经干燥而进行化学修饰；例如生物质包括离心的细胞糊。
在一些实施方案中，用于本发明的原位转酯和其它化学修饰方法的微生物培养导致产生这样的生物质，在所述生物质中至少10％脂质为C18，至少15％脂质为C18，至少20％脂质为C18，或至少25％脂质为C18。在其它实施方案中，该生物质包含至少30％C18、至少35％C18、至少40％C18、至少45％C18或至少50％C18的脂质组分。在另外其它的实施方案中，该生物质可以包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％C14和/或C16或更长链长度的脂质组分。或者，该生物质可以包含至少10％或至少20％C14或更短链长度的脂质组分。
用于本发明方法的微生物可以天然存在或被基因工程化来增加脂质产量，以便产生包含更高比例的期望碳链长度(例如C18)脂肪酸的TAG，或者以便使用特定原料(例如糖蜜)作为能源和碳源。此类基因工程修饰在下文中于标题“脂质途径工程化”下描述。
生产合适脂质的任何微生物物种都可用于本发明的方法，尽管通常优选天然生产高水平的合适脂质的微生物。此外，可以在处于特定发酵条件时生产高水平脂质(按DCW的百分比)的微生物也是优选的。微藻可用于本发明的方法，并且可用于本发明方法的微藻(包括属和种)的非限制性实例在表1中列出。
表1微藻的实例
可用于本发明方法的产油酵母的非限制性实例在表2中列出。
表2产油酵母的实例
可用于本发明方法的真菌的非限制性实例在表3中列出。
表3真菌的实例
影响选择用于本发明的微生物的考虑因素，除了产生合适用于生物柴油生产的脂质之外，还包括：(1)以细胞重量百分比计的高脂质含量，(2)生长容易性，和(3)加工的容易性。优选的微生物异养(在没有光的情况下在糖上)生长或者已经使用例如在美国专利申请号60/941,581(于2007年6月1日提交的)、60/959,174(于2007年7月10日提交的)，60/968,291(于2007年8月27日提交的)和61/024,069(于2008年1月28日提交的)中公开的方法进行过工程化从而异养生长。
加工的考虑因素可以包括，例如用于裂解细胞的有效方式的可得性。细菌也可用于本发明的方法，特别是产油细菌例如红球菌属(Rhodococcus)物种，例如混浊红球菌(Rhodococcus opacus)和红球菌属物种。
可以用于本发明方法的微藻的物种可以通过对受试微藻的基因组的某些靶区进行扩增来鉴定，例如可以通过使用引物和使用任何基因组区域的方法学对细胞核和/或叶绿体DNA进行扩增和测序，以鉴定特定的微藻物种或株系(例如，参见Wu等人，Bot Bull Acad Sin(2001)42：115-121“使用核糖体DNA序列鉴定小球藻属物种分离物(Identification of Chlorella spp Isolates using ribosomal DNAsequences)”)。已确立的系统发生分析方法，例如核糖体内转录间隔区(ITS1和ITS2 rDNA)、23S rRNA、18s rRNA和其它保守基因组区域的扩增和测序，可用于鉴定微藻物种以及可用于本文所公开方法的其它生产烃和脂质的生物。对于藻类的鉴定和分类方法的实例，还可以参见例如Genetics，2005年8月，170(4)：1601-10和RNA，2005年4月，11(4)：361-4。
基因组DNA比较也可用于鉴定用于本发明方法的合适微藻物种。可以由微藻物种扩增保守DNA的区域(包括但不限于编码23S rRNA的DNA)，并与共有序列比较以筛选和用于本发明方法的微藻分类学相关的微藻物种。对于小球藻属和无绿藻属的物种，此类DNA序列比较的实例在下文实施例中示出。
在一些实施方案中，用于本发明方法的微藻具有编码23S rRNA的基因组DNA序列，该序列与SEQ ID NOs 3-6所列出的序列中的至少一个具有至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少89％、至少88％、至少87％或至少86％核苷酸同一性。在其它实施方案中，用于本发明方法的微藻具有编码23S rRNA的基因组DNA序列，其与SEQ ID NOs 3-29所列出的序列中的至少一个具有至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％或至少60％核苷酸同一性。
小球藻属是单细胞绿藻的一个属，属于绿藻门(chlorophyta)，可用于本发明的方法。小球藻的形状为球形，直径为约2～10μm，无鞭毛。小球藻属的一些物种是天然异养的。小球藻，特别是原壳小球藻，是用于本发明的优选微生物，因为其具有高组成的脂质，特别是适用于生物柴油和化学修饰成其它分子的长链脂质。此外，此微藻异养生长。
无绿藻属是单细胞微藻的一个属，被认为是可以用于本发明方法的小球藻的非光合突变体。尽管小球藻可以通过光合作用获得其能量，但是无绿藻属物种是专性异养生物。无绿藻的形状为球形，直径为约2～15微米，且无鞭毛。无绿藻，特别是Prototheca moriformis，是用于本发明的优选微生物，这是因为其脂质组成、特别是适用于皂化的饱和脂质。此外，从此微藻中提取的脂质具有非常低的着色剂污染物，进一步使其适用于皂化。
正如植物和动物一样，藻类和其它微生物以脂质形式贮存过量能量以便在其它能量来源(例如阳光)无法取得时使用。而且，油含量的调节允许生活在水性环境中的藻类漂浮，从而优化对阳光的接近性以进行光合过程。通过调节油含量而改变漂浮性能的能力已导致与高等植物相比可以产生高细胞油浓度的微藻细胞。高油含量的特性有利于原位化学修饰含油生物质，因为如本文所证实，高油生物质与低油生物质(特别是光合来源的低油生物质)相比产生更高纯度的TAG衍生物。因此，可用于产生高油生物质的微生物优选用于本发明的方法。
A.生长方法
为了实施任选的基因操作和为了生产脂质的目的，可以对微生物进行培养。前一种形式的培养小规模地且，至少最初地，在起始微生物可以生长的条件下进行。例如，如果起始微生物是光能自养生物，那么在光的存在下进行最初的培养。如果微生物经进化或工程化而不依赖于光进行生长，那么可以改变培养条件。为了脂质生产目的的培养通常大规模地进行。
1.光合生长方法
光合微生物例如微藻可以在光的存在下在液体培养基中生长，所述液体培养基可以例如容纳在光生物反应器中。可以操作到达微藻细胞培养物的光子数目，以及其它参数，如波长光谱和每天暗∶光小时的比率。微藻还可以在自然光中培养以及在自然光和人造光的同时和/或交替组合中培养。例如，可以在日间在自然光下培养而在夜间在人造光下培养小球藻属的微藻。
可以操纵光生物反应器的气体含量以使微生物(例如微藻)生长。光生物反应器的部分体积可以容纳气体而不是液体。气体入口可用于将气体泵到光生物反应器中。可以将任何气体泵到光生物反应器中，包括空气、空气/CO2混合物，稀有气体例如氩气和其它气体。还可以操纵气体进入光生物反应器的速率。增加气流进入光生物反应器将增加微藻培养物的浊度。在给定的气流速率下，传送气体进入光生物反应器的进口的布置也可以影响培养物的浊度。可以调节空气/CO2混合物以产生用于特定生物的最大生长的最佳CO2量。在光中，微藻在例如3％CO2/97％空气下比在100％空气中生长得明显更快。3％CO2/97％空气具有比空气多约100倍的CO2。例如，根据本方法，可以将约99.75％空气∶0.25％CO2、约99.5％空气∶0.5％CO2、约99.0％空气∶1.00％CO2、约98.0％空气∶2.0％CO2、约97.0％空气∶3.0％CO2、约96.0％空气∶4.0％CO2和约95.00％空气∶5.0％CO2的空气∶CO2混合物，输注到生物反应器或光生物反应器中。在J Agric Food Chem 2006年6月28日；54(13)：4593-9，J Biosci Bioeng 1999；87(6)：811-5和J NatProd 2003年6月；66(6)：772-8)中报导了5％CO2∶95％空气混合物输注到含有丛粒藻细胞的光生物反应器中。
可以在由多种不同类型的透明或半透明材料中的任何一种制成的密闭光生物反应器中生长并维持微藻。此类材料包括室(enclosure)、玻璃室、由材料例如聚乙烯制成的袋、透明或半透明管、和其它材料。也可以在敞开式光生物反应器例如跑道池、沉淀池和其它非密封容器中生长和维持微藻。
“藻类遮蔽(Algal shading)”是指光源不能穿透并到达光合培养物的所有细胞。离光源最近的细胞将“遮蔽”(由于其物理存在和叶绿体中光子的吸收)离光源较远的那些细胞，因而限制那些其它细胞接触到将碳原料转化成脂质或其它对于细胞生长和复制所必需的物质所需的能量。通过混合培养物，可以提供一种使所有细胞暴露于光源的机制，但是“遮蔽”仍然影响总的暴露持续时间，导致生长较慢和按DCW的百分比计的油含量较低。结果，可能需要更长的生长期来实现高细胞密度和/或高油含量。甚至在生长期延长后，以光作为唯一能源进行生长的细胞也很少含有按DCW的百分比计15％以上的油。此外，微藻的光合生长在生物质中导致高水平的叶绿素，从而在直接转酯的生物质中产生更高的镁量，因为镁是叶绿素的一种组分，并且叶绿素是积累于亲脂相中的高度疏水化合物。此外，在光合生长的藻类中比在异养生长的藻类中蓄积更高水平的类胡萝卜素。
2.用于脂质生产的异养生长方法
与光合生长方法不同，可以在液体培养基中进行微藻培养，其中培养物容纳在不允许光进入的生物反应器中。异养培养方法例如这些方法依赖于使用固定碳源(例如葡萄糖、甘油、纤维素物质等)来提供能量用于生长和脂质生产。可以操纵培养条件参数以优化总脂质生产。
微藻培养基通常含有组分例如固定氮源，痕量元素，任选地用于维持pH的缓冲剂、和磷酸盐。其它组分可以包括固定碳源例如乙酸盐或葡萄糖，和盐例如氯化钠，特别是对于海水微藻。痕量元素的实例包括锌、硼、钴、铜、锰和钼，例如各种以ZnCl2、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O和(NH4)6Mo7O24·4H2O的相应形式。也可以在本发明方法中操纵这些和其它培养参数，例如培养基的pH、痕量元素和其它培养基成分的身份和浓度，以实现所需生产结果。
对于能够在固定碳源上生长的生物而言，固定碳源可以是，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、甘油、纤维素物质来源和/或弗罗里多苷。该一种或多种碳源可以以至少约50μM、至少约100μM、至少约500μM、至少约5mM、至少约50mM和至少约500mM浓度的一种或多种外源提供的固定碳源来供应。对于多种小球藻属物种，例如，异养生长导致生物质的高产量和细胞中高脂质含量的蓄积。
对于脂质生产而言，通常大量地培养或发酵细胞(包括重组细胞)。培养可以在较大的液体体积中(例如在悬浮培养物中)发生。其它实例包括用小量细胞培养物开始，通过细胞的生长和繁殖，扩大成大量生物质，并同时发生脂质生产。生物反应器或钢制发酵罐可以用于容纳大的培养物体积。与用于生产啤酒和/或酒的那些发酵罐类似的发酵罐是合适的，用于生产乙醇的非常大的发酵罐也是合适的。
提供适用于发酵罐培养的营养物来源。这些包括原料例如下述中的一种或多种：固定碳源，例如葡萄糖、玉米淀粉、解聚的纤维素、蔗糖、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清或糖蜜；脂肪源，例如脂肪或植物油；氮源，例如蛋白质、大豆粉、玉米浆、氨(纯的或以盐的形式)、硝酸或硝酸盐、或分子氮；和磷源，例如磷酸盐。此外，发酵罐可以允许控制培养条件，例如温度、pH、氧压和二氧化碳水平。气体组分(如氧或氮)可以鼓泡通入液体培养物中。
可以使用发酵罐以允许细胞经历其生长周期的各个时期。举例来说，可以将产脂质细胞的接种物引入到培养基中，然后在细胞开始生长前经历延迟期(滞后阶段)。延迟期后，生长速率稳步地增加，接着进入log期或指数期。指数期之后通常是细胞分裂的减慢或完全停止，这归因于营养物(特别是氮)的减少。减慢后，生长停止，细胞进入将固定碳原料转化成所需产物例如TAG的稳态。在本文所述的微生物的情况下，维持稳态的时间越长，导致所需产物例如脂质的DCW的百分比越高。在某些情况下，期望将微生物细胞长时间地维持在稳态，其中细胞将碳水化合物例如葡萄糖转化成脂质而不经历细胞分裂，以产生具有超过30％、超过40％、超过50％或超过60％按细胞干重百分比计的脂质的微生物生物质。氮限制通常足以防止细胞经历细胞分裂。
使用本文所述和本领域已知的条件生长的微生物可以包含至少20％重量的脂质、优选至少40％重量、更优选至少50％重量的脂质、更优选至少60％重量的脂质、更优选至少70％重量的脂质、最优选至少80％重量的脂质。在一些实施方案中，使用本文所述的条件培养微生物以在不超过1周的培养时间内获得至少20％重量的脂质组分。在一些实施方案中，该培养期为不超过14天、不超过13天、不超过12天、不超过11天、不超过10天、不超过9天、不超过8天、不超过6天、不超过5天、不超过4天或不超过3天。在任何一种前述培养期中，微生物可以产生按DCW计至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％脂质。在一些实施方案中，使用本文所述的条件培养微生物以在至少2天的培养期内获得至少20％重量的脂质组分。在一些实施方案中，该培养期为至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或至少8天。在任何一种前述培养期中，微生物可以产生按DCW计至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％脂质。
可以调节加工条件以增加适于用作生物柴油或其它靶分子的脂质的产量，和/或以减少生产成本。例如，在某些实施方案中，在存在限制性浓度的一种或多种营养物(例如氮)的情况下培养微生物(例如微藻)。与在提供过量氮的培养物中的微生物脂质产量相比，该条件趋于使微生物脂质产量增加。在特定的实施方案中，脂质产量的增加为至少约10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％。可以在限制量的营养物的存在下培养微生物，时间为总培养期的一部分或整个培养期。在特定的实施方案中，在总培养期期间，营养物浓度在限制浓度与非限制浓度之间循环至少两次。此外，如附图中所示，与可比量的其它固定碳原料相比，可以使用某些固定碳原料例如甘油来增加占细胞重量的脂质百分比。
为了增加脂质产量，可以在用于产脂质微生物(例如微藻)的原料(给料，feedstock)中采用乙酸。乙酸直接输送到启动脂肪酸合成(即乙酰基-CoA)的代谢点，因此，在培养物中提供乙酸可以增加脂肪酸产量。一般而言，在此实施方案中，在足够量的乙酸存在下培养微生物以增加微生物脂质产量和/或微生物脂肪酸产量，尤其是超过在缺少乙酸时的微生物脂质(例如脂肪酸)产量。
在另一个实施方案中，通过在脂质途径酶(例如脂肪酸合成酶)的一种或多种辅因子的存在下培养产脂质微生物(例如微藻)而增加脂质产量。一般而言，在此实施方案中，辅因子的浓度足以使微生物脂质(例如脂肪酸)产量增加超过在缺少辅因子时的微生物脂质产量。在特定的实施方案中，通过在培养物中包括含有编码辅因子的外源基因的微生物(例如微藻)，向培养物提供辅因子。或者，可以通过包括含有编码参与合成辅因子的蛋白质的外源基因的微生物(例如微藻)，向培养物提供辅因子。在某些实施方案中，适宜的辅因子包括脂质途径酶所需的任何维生素，例如生物素或泛酸。编码适用于本发明的辅因子的基因或参与此类辅因子合成的基因是众所周知的，并且可以使用本领域技术人员已知的构建体和技术将其引入到微生物(例如微藻)中。
使用本领域已知的多种不同的培养方法，已经产生具有按干重计高百分比的油/脂质蓄积物的微藻生物质。根据本发明，具有较高百分比的蓄积油/脂质的微藻生物质是有用的。Li等人描述了使用高铁浓度在自养条件(即光合生长条件)下生长的小球藻培养物，在稳定期培养物中具有按DCW计至多56.6％的脂质(Li等人，Bioresource Technology99(11)：4717-22(2008))。Rodolfi等人描述了在氮饥饿条件下在光生物反应器中生长的、分别具有60％DCW的脂质和39.8％DCW的脂质的Nanochloropsis物种和钙质角刺藻(Chaetoceros calcitrans)培养物(Rodolfi等人，Biotechnology & Bioengineering 102(1)：100-112(2008))。Solovchenko等人描述了当在低氮浓度下光养生长时具有约30％脂质蓄积物(DCW)的Panetochloris incise培养物(Solovchenko等人，Journalof Applied Phcology 20：245-251(2008))。在具有氮饥饿的某些异养条件下生长的原壳小球藻可以生产至多55％脂质(DCW)(Miao和Wu，Bioresource Technology 97：841-846(2006))。其它小球藻属物种，包括Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana和Chlorella minutissima，已被描述当在低氮培养基条件下在搅拌的釜式生物反应器中生长时蓄积至多63％油(DCW)(Illman等人，Enzyme and Microbial Technology27：631-635(2000))。已报导了甚至更高百分比的脂质蓄积(按DCW计)，包括在增加的NaCl条件下生长的杜氏藻(Dumaliella tertiolecta)培养物中70％的脂质(DCW)蓄积(Takagi等人，Journal of Bioscience andBioengineering 101(3)：223-226(2006))，在丛粒藻培养物中75％的脂质蓄积物(Banerjee等人，Critical Reviews in Biotechnology22(3)：245-279(2002))。这些和类似方法可以用于微藻的光合和异养生长以产生油。
通过本文所述的培养方法产生且根据本发明是有用的微藻生物质包含按干重计至少10％微藻油。在一些实施方案中，微藻生物质包含按干重计至少15％、至少25％、至少35％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％微藻油。在一些实施方案中，微藻生物质含有按干重计10-90％微藻油、25-75％微藻油、40-75％微藻油或50-70％微藻油。
在各种实施方案中，微藻生物质包含按干重计至少25％至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％或至少50％微藻油。在其它实施方案中，微藻生物质包含按干重计至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％或至少90％微藻油。
a.非传统碳源的使用
微生物可以天然生长在或经工程化后生长在非传统碳源例如蔗糖、木糖、纤维素物质、高粱饴和废弃物质上。合适的纤维素物质包括来自草本和木本能量作物以及农业作物的残余物，即，非是主要的食物或纤维产品的植物部分(主要是茎秆和叶)。实例包括农业废弃物，例如甘蔗渣、稻壳、玉米纤维(包括秸秆、叶、壳和穗轴(cob))，麦秸、稻秸、甜菜渣、柑桔渣、柑桔皮；林业废弃物例如硬木和软木疏伐材、以及来自木材加工的硬木和软木残余物；废木料例如制材厂废料(木片、锯屑)和制浆厂废料；城市垃圾例如城市固体废弃物的纸部分、城市废木料和城市绿化废弃物例如城市绿化修剪废料；和木材建筑废料。另外的纤维素物质包括专门的纤维素作物例如柳枝稷、杂种白杨木和芒属、纤维甘蔗(fiber cane)和纤维高粱。由此类物质产生的五碳糖包括木糖。
在另外的异养生长方法中，微藻物种可以利用混合碳源，例如高粱饴或纯高粱。高粱饴由甜高粱秆的汁液产生。其糖谱主要包括葡萄糖(右旋糖)、果糖和蔗糖。可以筛选微藻株系利用高粱作为唯一碳源的能力。作为非限制性实例，来自原壳小球藻、Chlorella luteovirdis、Prototheca moriformis、Chlorella kessleri、Parachlorella kessleri和Prototheca stagnora的数种株系的微藻可以在异养条件中利用高粱饴，如下面实施例中所述。
一些微生物天然生长在或可以经工程化后生长在为非均一来源的化合物的固定碳源(例如城市废弃物、二级处理的污水、废水)和其它固定碳源来源及其它营养物(例如硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐)上。污水组分用作脂质生产中的营养来源，该培养为原位转酯和生产生物柴油或根据本发明方法的其它化学修饰提供了廉价来源的脂质。
为了减少生产生物柴油或其它化学修饰的脂质的成本，作为脂质转酯反应的副产品所产生的、粗的、部分纯化的、或纯化的甘油可以用作发酵例如产脂质微生物培养物的原料(给料)。因此，本发明提供了包括以下步骤的方法：在第一微生物培养物中培养微生物(例如微藻)；如下所述，使微生物生物质进行转酯以产生脂肪酸酯和甘油；和将甘油作为原料加至第二微生物培养物。第一和第二微生物培养物可以(但非必须)是相同微生物的培养物。如有需要，可以根据本发明实行连续系统，其中可以将由回收自培养物的脂质所产生的甘油返给相同培养物作为原料。
本文描述了包括使用甘油用于发酵多个属的真核和原核微生物的改良培养参数，所述微生物包括小球藻属、舟形藻属、栅藻属和螺旋藻属的微生物。如实施例所证实，具有极其趋异的进化谱系的微生物，包括小球藻属、舟形藻属、栅藻属和螺旋藻属，以及多种不同的小球藻属物种的培养物，不仅可以在纯化的试剂级甘油上生长得非常好，而且可以在来自生物柴油转酯的、经酸化的和未经酸化的甘油副产品上生长得非常好。在某些情况下，微藻，例如小球藻属株，在甘油的存在下比在葡萄糖的存在下经历更快的细胞分裂。
本发明方法可以利用微生物，例如通过两阶段生长法培养的微生物，其中首先向细胞投喂甘油以快速增加细胞密度，然后向细胞投喂葡萄糖以蓄积脂质。这可以提供显著的经济效益，因为转酯过程的甘油副产品被投回生产过程中。本发明还提供了其它给料方法，例如其中投喂甘油和葡萄糖的混合物的方法，和其中在生长阶段投喂葡萄糖、而在脂质生产阶段投喂甘油的方法。投喂此类混合物可以提供经济效益。此外，本发明的方法包括其中向微生物投喂替代糖(例如蔗糖)与甘油的各种组合的方法。这些替代方案已经用来自具有极其趋异的进化谱系的微生物(包括原核生物和真核生物)证明，表明了根据本发明方法这些替代性培养条件用于微生物发酵的可行性。
与在等量的试剂级甘油中相比，多个小球藻属物种，和属于一个小球藻属物种的多个株系，在来自转酯的甘油副产品的存在下表现更好。来自转酯的甘油副产品除甘油之外通常含有残留甲醇和其它污染物。例如，图1-6表明，原壳小球藻和Chlorella kessleri的株系在来自生物柴油转酯的经酸化的和未经酸化的甘油副产品上比在纯试剂级甘油上生长时显示出更好的生产力。与在等量的试剂级甘油中相比，其它微生物(例如栅藻属和舟形藻属微藻)也可以在来自转酯的甘油副产品的存在下表现更好。
图1表明干细胞重量/升(DCW/L)在生物柴油甘油副产品上比在纯甘油上高，当细胞生长在单独的或与葡萄糖组合的甘油中时这种趋势都存在。图2用小球藻属的另外株系显示了相同的趋势。图12(b)表明，被甲栅藻的DCW/L在经酸化的和未经酸化的生物柴油副产品甘油上比在纯试剂级甘油上高。图13表明，Navicula pelliculosa的DCW/L在未经酸化的生物柴油副产品甘油上比在纯试剂级甘油上高。
使用多个小球藻属物种以及使用属于一个小球藻属物种的多个株系，图3和4表明，细胞在生物柴油甘油副产品的存在下培养时比在等浓度的纯试剂级甘油的存在下培养时，每升的脂质水平(或脂质含量)更高。
图5和6表明，与在等浓度的纯试剂级甘油的存在下培养时相比，在生物柴油甘油副产品的存在下培养时多个小球藻属物种和属于一个小球藻属物种的多个株系蓄积更高DCW百分比的脂质(以细胞重量的百分比计的脂质)。图11表明，与在等浓度的纯试剂级甘油的存在下培养时相比，在生物柴油甘油副产品的存在下培养时钝顶螺旋藻和Navicula pelliculosa可以蓄积更高DCW百分比的脂质。图12(a)表明，与在等浓度的纯试剂级甘油的存在下培养时相比，在生物柴油甘油副产品的存在下培养时被甲栅藻可以蓄积更高DCW百分比的脂质。
而且，与存在仅葡萄糖时相比，在甘油和葡萄糖的混合物的存在下多个微生物物种(包括微藻，例如小球藻属、栅藻属、舟形藻属和螺旋藻属)作为生物柴油生产者显示更好的特征。因此，图7表明，与在2％葡萄糖的存在下相比，在1％甘油/1％葡萄糖的存在下小球藻属可以每升培养物蓄积更高的脂质水平(含量)。图12(b)表明，与在2％葡萄糖的存在下相比，在1％生物柴油副产品甘油/1％葡萄糖的存在下培养时被甲栅藻的DCW/L更高。图13表明，与在2％葡萄糖的存在下相比，在1％生物柴油副产品甘油/1％葡萄糖的存在下培养时Naviculapelliculosa的DCW/L更高。
图8表明，与在仅有葡萄糖的存在下培养时相比，在甘油和葡萄糖的等浓度(重量百分比)混合物的存在下培养时小球藻属可以蓄积更高DCW百分比的脂质。图11(a)表明，与在仅有葡萄糖的存在下培养时相比，在生物柴油副产品甘油和葡萄糖的等浓度(重量百分比)混合物的存在下培养时钝顶螺旋藻可以蓄积更高DCW百分比的脂质。图11(b)表明，与在仅有葡萄糖的存在下培养时相比，在试剂级甘油和葡萄糖的等浓度(重量百分比)混合物、以及生物柴油副产品甘油和葡萄糖的等浓度(重量百分比)混合物的存在下培养时Navicula pelliculosa可以蓄积更高DCW百分比的脂质。图12(b)表明，与在仅有葡萄糖的存在下培养时相比，在生物柴油副产品甘油和葡萄糖的等浓度(重量百分比)混合物的存在下培养时被甲栅藻可以蓄积更高DCW百分比的脂质。增加以DCW的百分比计的脂质的此类方法可以用于产生生物质，其中，与较低脂质百分比的生物质相比，当将生物质进行直接转酯时该生物质在生物柴油中产生更低的杂原子量。
还已发现，通过将甘油和葡萄糖相继地加至微生物(包括微藻，例如小球藻属、栅藻属和舟形藻属)而不是以单批的甘油和葡萄糖的混合物的形式加入，可以造成另外的产量增加。在生物柴油甘油副产品和试剂级甘油的存在下测试了多个小球藻属物种和属于一个小球藻属物种的多个株系的该属性。
因此，图8表明，当在第一时段将甘油加至培养物中、然后在第二时段加入葡萄糖并继续培养时，与在实验开始时将相同量的甘油和葡萄糖一起加入相比，小球藻属可以蓄积更高DCW百分比的脂质。增加以DCW的百分比计的脂质的此类方法可以用于产生生物质，其中，与较低脂质百分比的生物质相比，当将生物质进行直接转酯和其它化学修饰方法时，该生物质在生物柴油或其它产品中产生更低的杂原子量。图9显示，当相继加入甘油和葡萄糖时，与在培养开始时将相同量的甘油和葡萄糖一起加入相比，小球藻属显示每升培养物更高的脂质水平(含量)。当使用经酸化的生物柴油副产品甘油、未经酸化的生物柴油副产品甘油或试剂级甘油时，观察到这种趋势。
图10表明，与在培养开始时将相同量的甘油和葡萄糖一起加入相比，当相继加入甘油和葡萄糖时，两种不同的小球藻属物种的4种不同株系蓄积更高的DCW/L培养物。当使用经酸化的生物柴油副产品甘油、未经酸化的生物柴油副产品甘油或试剂级甘油时，观察到了这种趋势。图14(a)和(b)表明，与在发酵开始时加入等量的甘油和葡萄糖相比，当第一时段向培养物仅加入生物柴油副产品甘油、之后加入葡萄糖时，被甲栅藻和Navicula pelliculosa可以显示DCW/L增加。
因此，通过使用生物柴油副产品和在时间上分开碳源，可以提高微生物脂质生产中的3种不同生产力标志(DCW/L、克/L脂质和脂质的DCW百分比)。
还可以通过使用纤维素生物质作为原料，来降低生产生物柴油或其它化学修饰脂质的成本。纤维素生物质(例如茎叶，例如玉米茎叶)是廉价的且容易可得的，但是，使用这种物质作为酵母的给料的尝试一直是失败的。特别是，已发现此类原料对酵母生长有抑制作用，且酵母不能使用由纤维素物质产生的五碳糖(例如，来自半纤维素的木糖)。相比之下，微藻可以在经加工的纤维素物质上生长。因此，本发明提供了在纤维素物质和/或五碳糖的存在下培养微藻以生产可以根据本文所述的方法进行转酯的脂质的方法。纤维素物质通常包括纤维素(40-60％干重)，半纤维素(20-40％干重)，和木质素(10-30％干重)。
令人惊讶的是，与在单独的葡萄糖或木糖上培养时相比，在葡萄糖和木糖的组合上培养时原壳小球藻可以显示较高的生产力水平。这种协同效应提供了显著的优势，因为其允许在木糖和葡萄糖的组合(例如纤维素物质)上培养小球藻属，如图15所示。
增加适用作生物柴油的脂质的产量和/或降低生产成本的工艺条件的这些具体实例可以单独地(如上述)或组合地使用。此外，本发明包括选择和/或基因工程化微生物(例如微藻)，以产生甚至更适用于上述方法的微生物。例如，在本发明方法的范围内涵盖应用在利用任何上述原料上具有更大能力的微生物来获得增加的增殖和/或脂质生产。
还可以通过使用蔗糖(包括，例如自甘蔗，生产的蔗糖)作为原料，来降低生产生物柴油或其它化学修饰脂质的成本。本发明的方法包括使用可以利用蔗糖作为碳源的小球藻属工程化物种。例如，蔗糖转运蛋白和蔗糖转化酶的表达允许小球藻属将蔗糖从培养基转运到细胞中并水解蔗糖以产生葡萄糖和果糖。任选地，在内源性己糖激酶活性不足以将果糖最大磷酸化的情况下，也可以表达果糖激酶。合适的蔗糖转运蛋白的实例包括在Genbank登录号CAD91334、CAB92307和CAA53390下描述的那些。合适的蔗糖转化酶的实例包括在Genbank登录号CAB95010、NP_12104和CAA06839下描述的那些。合适的果糖激酶的实例包括在Genbank登录号P26984、P26420和CAA43322下描述的那些。可以例如按国际公开号WO2008/151149中所述，设计用于转化微藻(包括小球藻属)的、编码一种或多种此类基因的载体。
蔗糖转化酶的分泌可以消除表达转运蛋白(可以转运蔗糖到细胞中)的需要。这是因为，分泌的转化酶催化蔗糖分子转化成葡萄糖分子和果糖分子，这两者均可以被本文所公开的微生物转运和利用。表达带分泌信号的蔗糖转化酶，将在细胞外产生转化酶活性。参见Hawkins等人，Current Microbiology Vol.38(1999)，第335-341页，关于在小球藻属中具有活性的分泌信号的实例。此类蛋白的表达允许已经能够利用胞外葡萄糖作为能源的细胞利用蔗糖作为胞外能源。在如本文所示可以将胞外果糖和胞外葡萄糖用作能源的细胞例如原壳小球藻中，转化酶的分泌可以提供对于将蔗糖用作有效且廉价的能源而言所需的唯一催化活性。
通过将转化酶加至原壳小球藻的培养基，说明了表达外源性可分泌蔗糖转化酶的微生物的培养潜力。加入转化酶允许细胞在含有木质素的糖源(例如糖蜜)上发酵。可以将藻类或其它微生物如本文所述工程化，以便其可以在糖蜜上如其在纯葡萄糖上一样良好地生长，并且使用甘蔗加工的此低价值废品可以在烃类生产中造成显著的成本节省。图19-20显示，在存在或缺乏胞外蔗糖转化酶的情况下，与在葡萄糖或蔗糖上的生长相比，细胞在3种糖蜜来源(命名为BS1、BS2和HTM)上的生长。
也可以在表达蔗糖转运蛋白的细胞中和在表达任何允许蔗糖进入细胞的碳水化合物转运蛋白的细胞中，胞内表达蔗糖转化酶。
B.脂质途径工程化
如本文所述，可以用于本发明方法的微生物可以任选地进行工程化以表达特定基因，所述特定基因可在微生物培养(例如表达蔗糖转化酶基因以促进蔗糖原料的利用)中或在本发明的直接化学修饰方法(例如表达裂解基因以促进生物质破裂，和/或表达脂肪酶基因以催化转酯)的执行中是有益的。此外，任选的基因工程化可以有利地用于改造微生物的脂质途径。可以修饰该途径以改变所生产的脂质的性质和/或比例和/或以增加流入脂质的碳。
1.改变所生产的脂质的性质和/或比例
在微藻的情况下，一些野生型细胞已具有良好的生长特性，但不产生所需类型或量的脂质。实例包括桑椹藻属、席藻属(Phormidium)、阿格曼藻属、四鞭藻属、鳞孔藻属(lepocinclis)、桑椹藻属、菱形藻属、鳞孔藻属、鱼腥藻属、裸藻属、水绵属、绿球藻属、四角藻属、颤藻属、扁裸藻属(Phagus)和绿梭藻属，其具有在城市污水或废水中生长的期望生长特性。此类细胞可以进行工程化以具有改善的脂质生产特性。期望特性包括优化每单位体积和/或每单位时间的脂质产量、碳链长度(例如，对于生物柴油生产或对于需要烃原料的工业应用)，减少双键或三键的数目(任选地降为零)、除去或消除环和环状结构，和增加一种特定脂质类型的或一群不同脂质的氢∶碳比率。此外，生产期望脂质的微藻也可以进行工程化以具有甚至更有利的产出。此类微藻的实例括小球藻属物种。
在特定的实施方案中，可以上调或下调一种或多种控制脂肪酸合成的代谢分叉点的关键酶以提高脂质生产。上调可以例如通过用表达构建体转化细胞来实现，在所述表达构建体中例如使用增加转录的强启动子和/或增强子元件表达编码目的酶的基因。此类构建体可以包括可使转化体得以选择的选择标记，这可导致构建体的扩增和所编码酶的表达水平的增加。根据本发明方法适于上调的酶的实例包括在将丙酮酸转化为乙酰-CoA中起作用的丙酮酸脱氢酶(实例，来自微藻的一些，包括在Genbank登录号NP_415392；AAA53047；Q1XDM1；和CAF05587下描述的那些)。丙酮酸脱氢酶的上调可以增加乙酰-CoA的生产，因而增加脂肪酸合成。乙酰-CoA羧化酶催化脂肪酸合成中的初始步骤。因此，可以对该酶进行上调以增加脂肪酸的生产(实例，来自微藻的一些，包括在Genbank登录号BAA94752；AAA75528；AAA81471；YP_537052；YP_536879；NP_045833；和BAA57908下描述的那些)。通过上调在脂肪酸合成期间携带正在生长的酰基链的酰基载体蛋白(ACP)，也可以增加脂肪酸生产(实例，来自微藻的一些，包括在Genbank登录号A0T0F8；P51280；NP_849041；YP_874433下描述的那些)。甘油-3-磷酸酰基转移酶催化脂肪酸合成的限速步骤。对该酶进行上调可以增加脂肪酸生产(实例，来自微藻的一些，包括在Genbank登录号AAA74319；AAA33122；AAA37647；P44857；和ABO94442下描述的那些)。前述的蛋白质是可以用于在微藻(包括小球藻属物种)中表达的候选物。
目的酶的下调可以使用例如反义、催化性RNA/DNA、RNA干扰(RNAi)、“敲除”、“敲低(knock-down)”、或其它诱变技术来实现。还可以使用胞内抗体来抑制酶表达/功能。根据本发明方法适于下调的酶的实例包括柠檬酸合酶，作为三羧酸(TCA)循环的一部分，其消耗乙酰-CoA。下调柠檬酸合酶可以迫使更多的乙酰-CoA进入脂肪酸合成途径。
全局调控因子调节脂肪酸生物合成途径的基因的表达。因此，可以酌情上调或下调脂肪酸合成的一种或多种全局调控因子以分别抑制或增强多种脂肪酸合成基因的表达，最终以增加脂质生产。实例包括固醇调控元件结合蛋白(SREBP)，例如SREBP-1a和SREBP-1c(例如，参见在Genbank登录号NP_035610和Q9WTN3下描述的那些)。就控制点酶的调控而言，如上所述可以对全局调控因子进行上调或下调。
本发明的方法也可以使用已被基因工程化以表达一个或多个编码脂质途径酶(例如脂酰-ACP硫酯酶(参见表4中的实例及登录号)或酰基载体蛋白(ACP))的外源基因的微生物(例如微藻、产油酵母、细菌或真菌)来实施，其中所述脂质途径酶可以在脂质合成期间促进具有所需碳链长度的脂肪酸从酰基载体蛋白上断裂。可以基于其对具有特定碳链长度的脂肪酸的特异性来选择脂酰-ACP硫酯酶。在一些实施方案中，脂酰-ACP硫酯酶可以由与诱导型启动子可操作连接的基因表达，和/或可以在胞内区室中表达。在一些实施方案中，如上所述，可以将编码脂酰-ACP硫酯酶和天然共表达的ACP的基因转化到细胞中，任选地与一种或多种编码其它脂质途径酶的基因一起。在其它实施方案中，ACP和脂酰-ACP硫酯酶可以对彼此具有亲和力，当两者一起用于本发明的微生物和方法时，该亲和力将赋予优势，而不管它们在特定的组织或生物中是否是天然共表达的。因此，本发明的方法可以用表达天然共表达的该对酶的细胞和用具有彼此之间存在相互作用亲和力的酶对的细胞来实施，以促进特定长度的碳链从ACP断裂。
适用于本发明的其它修饰的实例记载于现已放弃的于2006年8月15日提交的美国临时申请号60/837,839和于2007年8月15日提交的美国专利申请号11/893,364中，每个专利申请并入本文作为参考。该申请公开了基因工程改造微藻株以表达两个或更多个外源基因，一个编码固定碳源(例如蔗糖)的转运蛋白，而第二个编码蔗糖转化酶。所得的可发酵生物以比通过之前已知的生产方法可以得到的生产成本更低的生产成本生产脂质。该共同待决专利申请还教导了，上述两个外源基因的插入可以与通过定向和/或随机诱变来破坏多糖生物合成相组合，其引导甚至更多的碳流入脂质生产中。单独地和组合地，营养转变、改变脂质生产的工程化和以外源酶进行的处理可以改变由微生物产生的脂质组成。这种改变可以是所生产的脂质的量、所生产的一种或多种脂质相对于其它脂质的量、和/或微生物生产的脂质的类型的变化。例如，可以对微藻进行工程化，以产生更高量和/或百分比的TAG，或具有较高比例的特定碳长度脂肪酸分子的TAG。
适用于本发明的微生物和方法的脂酰-ACP硫酯酶包括但不限于表4所列出的那些。
表4脂酰-ACP硫酯酶和GenBank登录号
其它适用于本发明的微生物和方法的酶包括与表4列出的蛋白质中的一种具有至少70％氨基酸同一性，并且显示相应的期望酶活性(即从酰基载体蛋白断裂脂肪酸)的那些酶。在另外的实施方案中，酶活性存在于与上述序列之一具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同一性的序列中，所有序列特此并入作为参考。
上述的脂质途径酶可以用于自微生物(例如微藻、产油酵母或真菌)或微生物群体生产各种脂质，其中脂酰-ACP硫酯酶在脂质合成期间从酰基载体蛋白(ACP)断裂脂肪酸。这些脂质途径酶可以专一地作用于包括特定碳原子数的底物。例如，脂酰-ACP硫酯酶可以对从ACP断裂16个碳原子的脂肪酸具有专一性。因此，在各种实施方案中，微生物可以含有编码蛋白质的外源基因，就包含于底物中的碳原子数目而言所述蛋白质在催化酶活性(例如从ACP断裂脂肪酸)方面具有专一性。在各种实施方案中，酶专一性可以针对具有8～34个碳原子、优选8～18个碳原子、更优选14～18个碳原子的底物。
通过选择期望的待表达外源基因的组合，可以调整由微生物产生的脂质组分。当微生物如上所述进行培养时，其合成与ACP连接的脂肪酸，脂酰-ACP硫酯酶催化脂肪酸自ACP断裂以通过进一步的酶加工而产生掺入该脂肪酸分子的TAG。
2.增加碳向脂质途径的流入
一些微藻产生显著量的非脂质代谢产物，例如多糖。因为多糖生物合成可以用掉细胞可得的总代谢能中的相当大部分，所以诱变产脂质细胞、然后筛选减少的或消除的多糖生产，可以导致能够生产较高脂质产量的株系。
在小球藻属中表达转基因的实例可以见于文献(例如，参见CurrentMicrobiology Vol.35(1997)，第356-362页，Sheng Wu Gong Cheng XueBao 2000年7月；16(4)：443-6；Current Microbiology Vol.38(1999)，第335-341页，Appl Microbiol Biotechnol(2006)72：197-205；MarineBiotechnology 4，63-73，2002；Current Genetics 39：5，365-370(2001)；Plant Cell Reports 18：9，778-780，(1999)；Biologia Plantarium42(2)：209-216，(1999)；Plant Pathol.J 21(1)：13-20，(2005))中。为了本发明的目的，可以采用用于引入转基因到小球藻属中的任何合适技术。
在产油酵母(例如解脂耶氏酵母)中表达转基因的实例可以见于文献(参见，例如，Bordes等人，J Microbiol Methods 6月27日(2007))中。在真菌(例如高山被孢霉、卷枝毛霉和赭曲霉)中表达转基因的实例也可以见于文献(例如，参见Microbiology，7月；153(Pt7)：2013-25(2007)；Mol Genet Genomics，6月；271(5)：595-602(2004)；Curr Genet，3月，21(3)：215-23(1992)；Current Microbiology，30(2)：83-86(1995)；Sakuradani，NISR Research Grant，“有用的产脂质微生物的代谢工程化的研究(Studies of Metabolic Engineering ofUseful Lipid-producing Microorganisms)”(2004)，和PCT/JP2004/012021)。在细菌例如大肠杆菌中表达外源基因的实例是众所周知的，例如，参见《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Sambrook等人(第3版)，2001，Cold SpringHarbor Press。
IV.原位转酯的方法
根据本发明方法可以在自上述微生物培养物产生的生物质上进行TAG向脂肪酸烷基酯的原位转酯。在一些实施方案中，生物质可以包含来自两种或更多种不同微生物株系或物种的培养物的组合生物质。在一些实施方案中，这些不同的株系或物种具有不同的甘油脂质谱，如在实施例22和24中举例说明的。
在本发明的一些方法中，首先从培养基收获微生物生物质并干燥，然后在转酯之前实施任选的生物质破碎步骤。在本发明的其它方法中，在干燥和转酯之前对微生物生物质实施生物质破碎步骤。在一些方法中，收获生物质包括将生物质的细胞组分与水和细胞培养基分离，例如通过例如使细胞培养生物反应器的内容物通过筛子或类似过滤装置。在一些实施方案中，收获生物质包括将细胞培养物的细胞组分加工成糊或低水分含量的组合物。
A.干燥方法
可以对由本文所述的经培养的微生物产生的生物质进行干燥，去除水，否则水可在转酯反应期间用作底物(在下文详细地描述)，导致游离脂肪酸而不是期望的脂肪酸烷基酯的形成。用于本发明的原位转酯方法的生物质必须干燥达到的程度取决于用于转酯过程的醇∶生物质比率、醇的成本、和进行转酯的反应容器的成本或对其大小的其它体积限制。应理解的是，这些因素，在相对于干燥生物质的成本进行平衡后，确定生物质的“可接受的干度”。
在一些实施方案中，可以使用鼓式干燥器对生物质进行干燥，其中生物质在鼓中旋转并利用空气干燥，可以对该空气进行加热以加快干燥过程。在其它实施方案中，可以使用烘箱或喷雾干燥器以促进生物质的干燥。或者，可以通过冻干工艺干燥生物质。冻干工艺可以被扼要地描述成“冷冻-干燥”工艺，其中生物质在冷冻干燥室中被冷冻。向冷冻干燥室施加真空，导致水从生物质中升华(一级干燥)和解吸(二级干燥)，从而产生适用于如下所述的进一步加工的产物。在其它实施方案中，根据本文所述的方法可以利用前述的组合来适当地干燥生物质以用于进一步的处理。
B.生物质破碎方法
在一些实施方案中，可能期望在原位转酯之前破碎生物质，以使微生物的胞内内容物更易接近于醇和催化剂转酯试剂。根据本发明的方法，这可以有助于促进将TAG转化为脂肪酸烷基酯或其它分子。
在本发明的一些方法中，在对生物质进行一个或多个上文所述的干燥工艺之前，可以进行生物质的破碎。在其它方法中，生物质的破碎可以在干燥工艺之后。在一些方法中，使或不使生物质进行干燥工艺，在破碎生物质之前或之后从生物质中去除水。在微生物生长之后，可以任选地通过离心培养基来分离微生物以产生浓缩的微生物生物质。可以通过裂解微生物细胞产生裂解物，从而实现生物质的破碎。可以通过任何合适的方式(包括热诱发的裂解、添加碱、添加酸、通过使用酶例如蛋白酶或多糖降解酶(例如淀粉酶)，通过使用超声、机械裂解，通过使用渗压震扰、用裂解性病毒感染和/或表达一个或多个裂解基因)，实现细胞裂解。进行裂解以释放已由微生物产生的胞内分子。用于裂解微生物的这些方法中的每一个都可以单独地或组合地应用。
细胞破碎的程度可以通过显微镜分析来观察。使用一种或多种本文所述的方法，通常观察到70％以上的细胞破碎。优选地，细胞破碎为80％以上，更优选地为90％以上，最优选为约100％。
在特定的实施方案中，在生长后裂解微生物，例如以增加细胞脂质对用于转酯的催化剂(例如如下述表达的脂肪酶或化学催化剂)的暴露。可以调节细胞裂解、脂肪酶表达(例如通过诱导型启动子)和调整转酯反应条件(例如水的去除，醇的添加等)的时间，以优化自脂肪酶介导的转酯反应产生的脂肪酸酯的产量。
在本发明的一个实施方案中，裂解微生物的工艺包括对含有微生物的细胞悬浮液进行加热。在此实施方案中，对含有微生物的培养基(或从培养基分离的微生物的悬浮液)进行加热，直至微生物，即微生物的细胞壁和细胞膜，降解或瓦解。通常地，所用温度为至少50℃。更高的温度，例如至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃、至少100℃、至少110℃、至少120℃、至少130℃或更高，可以用于更有效的细胞裂解。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的工艺包括将碱加至含有微生物的细胞悬浮液。所述碱应足够强以水解所用微生物的蛋白质性化合物的至少一部分。可以用于溶解蛋白质的碱在化学领域是已知的。用于这些方法的示例性碱包括但不限于锂、钠、钾、钙的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐，及其混合物。优选的碱为KOH。在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的工艺包括将酸加至含有微生物的细胞悬浮液。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的工艺包括用酶裂解微生物。用于裂解微生物的酶包括蛋白酶和多糖降解酶，例如半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶和崩溃酶。多糖降解酶(任选地来自小球藻属或小球藻属病毒)是优选的。优选的用于裂解含油生物质的酶对是alcalase和mannaway(Novozymes)。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的工艺使用超声，即超声处理，来进行。也可以用高频声波裂解细胞。可以电产生声波，通过金属尖头传送到适当浓缩的细胞悬浮液。基于在细胞悬浮液中产生空穴，这种超声处理(或超声破碎)破坏细胞的完整性。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的工艺通过机械方式进行。细胞可以被机械地裂解，且任选地被匀浆化以促进脂质转酯。例如，可以使用压力破碎器(pressure disrupter)，将含有细胞的浆液泵过限制口阀。施以高压(多达1500bar)，然后通过出口喷嘴产生瞬时膨胀。通过3种不同的机制实现细胞破碎：在阀门上的撞击、喷口中的高液体剪切、和释放时突然的压力降低，引起细胞的爆炸。该方法释放胞内分子。或者，可以使用球磨机。在球磨机中，在具有小研磨颗粒(例如小珠)的悬浮液中搅动细胞。细胞由于剪切力、在小珠之间的研磨，和与珠的撞击而破碎。小珠使细胞破碎，释放细胞内容物。也可以通过剪切力破碎细胞，例如使用搅拌(例如高速搅拌机或Waring搅拌机(blender))、弗氏压碎器或甚至离心(在脆弱细胞壁的情况下)。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的工艺通过应用渗压震扰来进行。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的工艺通过蒸汽处理、即通过添加加压蒸汽来进行。用于细胞破碎的微藻蒸汽处理例如在美国专利号6,750,048中描述。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的工艺包括用裂解性病毒感染微生物。已知多种病毒可裂解适用于本发明方法的微生物，并且用于特定微生物的特定裂解性病毒的选择和使用在本领域技术人员的能力范围之内。例如，绿草履虫-小球藻病毒(paramecium bursariachlorella virus，PBCV-1)是一组在某些单细胞的真核小球藻样绿藻中复制和裂解的、大的二十面体噬斑形成性双链DNA病毒(藻类DNA病毒科(Phycodnaviridae)、绿藻病毒属(Chlorovirus))的原型。因此，任何易感的微藻(例如原壳小球藻)均可以通过用合适的小球藻病毒感染培养物而裂解。用小球藻病毒感染小球藻属物种的方法是已知的。参见例如Adv Virus Res.2006；66：293-336；Virology，1999年4月25日；257(1)：15-23；Virology，2004年1月5日；318(1)：214-23；Necleic AcidsSymp Ser.2000；(44)：161-2；J.Virol.2006年3月；80(5)：2437-44；和Annu.Rev.Microbiol 1999，53：447-94。
在本发明的另一个实施方案中，裂解微生物的工艺包括自溶。在此实施方案中，用于本发明方法的微生物被基因工程化以产生可以裂解微生物的裂解基因。该裂解基因可以使用诱导型启动子来表达，以便首先可以在培养基中生长细胞至期望密度，然后收获，之后诱导启动子表达裂解基因从而裂解细胞。在一个实施方案中，裂解基因编码多糖降解酶。在某些其它实施方案中，裂解基因是来自裂解性病毒的基因。因此，例如，来自小球藻属病毒的裂解基因可以在小球藻例如原壳小球藻中表达。
优选使用诱导型启动子来进行裂解基因的表达，例如通过刺激物例如小分子、光、热和其它刺激物的存在而被诱导的、在微藻中具有活性的启动子。来自小球藻属病毒的裂解基因是已知的。例如，参见Virology 260，308-315(1999)；FEMS Microbiology Letters 180(1999)45-53；Virology 263，376-387(1999)；和Virology 230，361-368(1997)。
在特定的实施方案中，微生物在生长后被裂解，例如以增加细胞脂质对用于转酯的催化剂(例如下文讨论的脂肪酶，或化学催化剂)的暴露。可以对脂肪酶表达(例如通过诱导型启动子)、细胞裂解以及修饰转酯反应条件(例如水的去除，醇的添加等)的时间进行调整，以优化自脂肪酶介导的转酯产生的脂肪酸酯产量。
C.转酯
根据本发明的方法，对如上所述由微生物生产的脂质实行转酯步骤，以产生含有脂肪酸烷基酯的亲脂相和含有细胞物质和甘油的亲水相。在本发明的一些方法中，然后将亲脂相与亲水的细胞物质分离。
1.一般化学过程
动物油和植物油通常由三酰基甘油(TAG)构成，其为游离脂肪酸与三元醇甘油的酯。在转酯中，TAG中的甘油被低级烷基醇例如甲醇、乙醇或异丙醇取代。典型的反应方案如下：
在此方案中，用碱将醇脱质子化以使其成为更强的亲核试剂。通常地，以极度过量(最多50倍)使用乙醇或甲醇。正常地，此反应进行得极其缓慢或者一点也不进行。可以使用热、以及酸或碱来帮助加速反应。酸或碱不被转酯反应消耗，因此，它们不是反应物而是催化剂。在传统上几乎所有的生物柴油均使用碱催化的技术来生产，因为其仅需要低的温度和压力并产生98％以上的转化产率(条件是起始油具有低的水分和游离脂肪酸)。
转酯的一个特殊例子是甘油醇解或使用甘油(丙三醇)来断裂化学键。通常，通过添加酸或碱，催化甘油醇解反应。可以在简单的酯、脂肪、游离脂肪酸或TAG上进行甘油醇解，其中甲酯与过量甘油反应以形成甘油单酯和/或甘油二酯，产生甲醇作为副产物。甘油单酯和甘油二酯可以用作乳化剂，通常被添加至食品中。
2.使用重组脂肪酶用于转酯
也已经实验性地使用酶(例如脂肪酶)而不是碱进行转酯。可以进行脂肪酶催化的转酯，例如在室温至80℃之间的温度，以大于1∶1、优选约3∶1的TAG与低级醇的摩尔比率。适用于根据本发明方法的转酯的脂肪酶包括但不限于表5列出的那些。用于转酯的脂肪酶的其它实例可以参见例如美国专利号4,798,793、4,940,845、5,156,963、5,342,768、5,776,741和WO89/01032，所述出版物各自并入本文作为参考。
表5用于转酯的脂肪酶
使用脂肪酶生产适用于生物柴油的脂肪酸酯的一项挑战是脂肪酶的价格比强碱工艺所用的氢氧化钠(NaOH)的价格高得多。通过使用可以循环利用的固定化脂肪酶，这项挑战已得到解决。然而，固定化脂肪酶的活性必须在循环少数个循环之后仍得以保持，以便允许就生产成本而言基于脂肪酶的工艺可以与强碱工艺竞争。通常用于转酯的低级醇会使固定化脂肪酶中毒。美国专利号6,398,707(于2002年6月4日授予Wu等人)(其并入本文作为参考)描述了用于增强固定化脂肪酶的活性和再生具有降低的活性的固定化脂肪酶的方法。
在特定的实施方案中，重组脂肪酶在生产该脂肪酶所作用于的脂质的同一微生物中表达。合适的重组脂肪酶包括上文表5列出的那些和/或在上文表5列出的GenBank登录号下描述的那些，或与上文表5列出的脂肪酶中的一种具有至少70％氨基酸同一性且显示脂肪酶活性的多肽。在另外的实施方案中，酶活性存在于与上述序列之一具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同一性的序列中，所有序列特此并入本文作为参考。
设计用来在微生物(例如微藻)中表达脂肪酶基因的一种示例性载体，含有与在微藻中具有活性的启动子可操作连接的脂肪酶编码基因。或者，如果载体不含有与脂肪酶基因可操作连接的启动子，那么可以将脂肪酶基因转化到细胞中以使其在载体整合位点处与内源启动子可操作连接。已在微藻中展示了无启动子的转化方法(例如，参见PlantJournal 14：4，(1998)，第441-447页)。该载体还可以包含编码赋予抗生素或除草剂抗性的蛋白质的第二基因，即选择标记。任选地，该一个或两个基因可以尾随着含有多腺苷酸化信号的3′非翻译序列。编码此两个基因的表达盒可以物理地连接在该载体中或可以连接在分开的载体上。还可使用微藻的共转化，其中同时使用不同的载体分子来转化细胞(例如，参见Protist 2004年12月；155(4)：381-93)。任选地，可以根据在抗生素或其它选择标记的存在下、在缺乏抗性盒的细胞不能生长的条件下细胞的生长能力，选择转化了的细胞。
编码脂肪酶和选择标记的DNA可以是密码子优化的cDNA。重编码用于在微藻中表达的基因的方法在美国专利7,135,290中描述。另外的信息可在网址www.kazusa.or.jp/codon得到。
很多启动子在微藻中具有活性，包括所转化藻类的内源性启动子和对所转化藻类而言非内源性的启动子(即来自其它藻类的启动子、来自高等植物的启动子和来自植物病毒或藻类病毒的启动子)。在微藻中具有活性的外源性和/或内源性启动子、和在微藻中具有功能性的抗生素抗性基因是本领域已知的。用于表达外源基因的启动子可以是天然与该基因连接的启动子或可以是异源基因。一些启动子在一个以上的微藻物种中具有活性。其它启动子具有物种特异性。优选的启动子包括启动子例如来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的RBCS2，和病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)(CMV)和小球藻病毒的启动子(已证实其在多个微藻物种中具有活性)(例如，参见PlantCell Rep.2005年3月；23(10-11)：727-35；J Microbiol.2005年8月；43(4)：361-5；Mar Biotechnol(NY)2002年1月；4(1)：63-73)。
启动子、cDNA和3′UTR、以及载体的其它元件可以通过克隆技术使用从天然来源中分离的片段而产生(例如，参见《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Sambrook等人(第3版，2001，Cold Spring Harbor Press，和美国专利4,683,202)。或者，可以使用已知方法来合成产生元件(例如，参见Gene，1995年10月16日；164(1)：49-53)。
细胞可以通过任何适合的技术(包括例如生物弹道法、电穿孔、玻璃球转化和碳化硅晶须转化法(silicon carbide whisker transformation))转化。
在特定的实施方案中，脂肪酶以可诱导的和/或靶向的方式表达。使用诱导型启动子表达脂肪酶基因，可允许在微生物生长后、在对条件已经进行调整(必要时)后，例如在破碎细胞、减少反应混合物的水含量、和/或添加足够的醇以驱使TAG转化为脂肪酸酯之后，产生脂肪酶，以增强转酯。可以用于本发明的诱导型启动子包括响应于刺激物(例如外源提供的小分子、温度(热或冷)、光等)而介导可操作连接的基因转录的那些。合适的启动子可以激活基本上沉默的基因的转录，或者上调(优选显著上调)以低水平转录的可操作连接的基因的转录。在后者情况下，脂肪酶的转录水平优选不显著干扰在表达该脂肪酶的微生物的生长。
在特定的实施方案中，靶向表达脂肪酶至一个或多个细胞区室可以是有利的，其中，脂肪酶被隔离在所述细胞区室中与大多数细胞脂质分隔开，直至转酯反应开始。
3.具有较高的油∶非油比率的生物质的优势
美国专利申请公开号20030229237(公开于2003年12月11日)和20050020842(公开于2005年1月27日)中已报道了对农产品的直接转酯。这些工艺采用物质例如大豆、椰子、棕榈、玉米、棉花、亚麻、油菜籽/芸苔、红花、向日葵或其它籽油原料或动物脂肪作为底物用于转酯过程以产生脂肪酸烷基酯。
使用本文所述的微生物来产生用于本发明转酯方法的TAG的一个特别的优势是，可以调节该生物质中的油与非油的比率，已意外地发现这种能力赋予两个有利的特性。首先，如下面实施例所示，具有较高的油∶非油比率的生物质的转酯导致TAG向脂肪酸烷基酯转化的效率增加。其次，也如下面实施例所示，具有较高的油∶非油比率的生物质的转酯产生具有下降比例的非期望杂原子的生物柴油产品。在后一情况下，通过转酯产生的亲脂相所含的磷量按重量计不大于60ppm。在一些实施方案中，亲脂相中磷的量按重量计不大于25ppm。在一些实施方案中，亲脂相中磷的量按重量计不大于10ppm。在其它实施方案中，亲脂相中硫的量按重量计不大于80ppm，而在另外其它的实施方案中，亲脂相中硫的量按重量计不大于60ppm。在一些实施方案中，亲脂相中硫的量按重量计不大于15ppm。在一些实施方案中，亲脂相中铁的量按重量计不大于2ppm。在一些实施方案中，亲脂相中锌的量按重量计不大于40ppm。在一些实施方案中，亲脂相中锌的量按重量计不大于12ppm。在一些实施方案中，亲脂相中镁和钙的组合量按重量计不大于5ppm。在一些实施方案中，亲脂相中钠和钾的组合量按重量计不大于50ppm。在一些实施方案中，亲脂相中钠和钾的组合量按重量计不大于15ppm。本发明的一些方法产生产物，其中在转酯后的物质的亲脂相中下述杂原子或杂原子组合中的两种或更多种在浓度上被限制到下述浓度：硫少于15ppm，磷少于20.001％总质量，镁和钙的组合量不大于5ppm，钠和钾的组合量不大于15ppm。
异养生长的高油生物质(特别是微藻)的另一方面是，转酯后在亲脂相中得到的类胡萝卜素的量。在本发明的一些实施方案中，叶黄素(lutein)的量不大于400微克每克亲脂相。在一些实施方案中，叶黄素的量不大于200微克每克亲脂相。在一些实施方案中，叶黄素的量不大于100微克每克亲脂相。在一些实施方案中，叶黄素的量不大于40微克每克亲脂相。在一些实施方案中，叶黄素的量不少于5微克每克亲脂相。在一些实施方案中，叶黄素的量不少于10微克每克亲脂相。在一些实施方案中，叶黄素的量不少于30微克每克亲脂相。在一些实施方案中，亲脂相所含有的叶黄素的量在上述的最大水平与最小水平的任何组合之间，例如低于400微克且至少5微克每克亲脂相之间。在一些实施方案中，叶黄素的量为约35微克每克亲脂相。
在一些实施方案中，玉米黄质的量不大于275微克每克亲脂相。在一些实施方案中，玉米黄质的量不大于150微克每克亲脂相。在一些实施方案中，玉米黄质的量不大于75微克每克亲脂相。在一些实施方案中，玉米黄质的量不大于25微克每克亲脂相。在一些实施方案中，玉米黄质的量不少于0.5微克每克亲脂相。在一些实施方案中，玉米黄质的量不少于10微克每克亲脂相。在一些实施方案中，玉米黄质的量不少于20微克每克亲脂相。在一些实施方案中，亲脂相所含有的玉米黄质的量在上述的最大水平与最小水平的任何组合之间，例如低于275微克且至少0.5微克每克亲脂相之间。在一些实施方案中，玉米黄质的量为约23微克每克亲脂相。
在一些实施方案中，α-隐黄素的量不大于8微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-隐黄素的量不大于5微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-隐黄素的量不大于2微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-隐黄素的量不大于0.1微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-隐黄素的量不少于0.001微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-隐黄素的量不少于0.01微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-隐黄素的量不少于0.05微克每克亲脂相。在一些实施方案中，亲脂相所含有的α-隐黄素的量在上述的最大水平与最小水平的任何组合之间，例如低于8微克且至少0.01微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-隐黄素的量为约0.06微克每克亲脂相。
在一些实施方案中，β-隐黄素的量不大于18微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-隐黄素的量不大于8微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-隐黄素的量不大于4微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-隐黄素的量不大于2微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-隐黄素的量不少于0.1微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-隐黄素的量不少于1微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-隐黄素的量不少于1.5微克每克亲脂相。在一些实施方案中，亲脂相所含有的β-隐黄素的量在上述的最大水平与最小水平的任何组合之间，例如低于18微克且至少0.1微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-隐黄素的量为约1.8微克每克亲脂相。
在一些实施方案中，α-胡萝卜素的量不大于1.9微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-胡萝卜素的量不大于1微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-胡萝卜素的量不大于0.1微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-胡萝卜素的量不大于0.09微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-胡萝卜素的量不少于0.0005微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-胡萝卜素的量不少于0.01微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-胡萝卜素的量不少于0.05微克每克亲脂相。在一些实施方案中，亲脂相所含有的α-胡萝卜素的量在上述的最大水平与最小水平的任何组合之间，例如低于1.9微克且至少0.0005微克每克亲脂相。在一些实施方案中，α-胡萝卜素的量为约0.08微克每克亲脂相。
在一些实施方案中，β-胡萝卜素的量不大于14微克每克亲脂相。
在一些实施方案中，β-胡萝卜素的量不大于10微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-胡萝卜素的量不大于4微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-胡萝卜素的量不大于1.5微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-胡萝卜素的量不少于0.1微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-胡萝卜素的量不少于0.9微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-胡萝卜素的量不少于1微克每克亲脂相。在一些实施方案中，亲脂相所含有的β-胡萝卜素的量在上述的最大水平与最小水平的任何组合之间，例如低于14微克且至少0.1微克每克亲脂相。在一些实施方案中，β-胡萝卜素的量为约1.2微克每克亲脂相。
通过将本发明的方法应用于含有高油∶非油比率的生物质而使TAG转化为脂肪酸烷基酯的效率增加和引入到亲脂相中的杂原子的比例减少，是意想不到的优势。以下描述了实施例，显示油可以被转酯的效率的提高和转酯产物中杂原子的比例的减少。
在一些实施方案中，进行转酯或其它化学修饰方法的经干燥生物质的油∶非油比率为至少1∶20、至少1∶19、至少1∶18、至少1∶17、至少1∶16、至少1∶15、至少1∶14、至少1∶13、至少1∶12、至少1∶11、至少1∶10、至少1∶9、至少1∶8、至少1∶7、至少1∶6、至少1∶5、至少1∶4、至少1∶3、至少1∶2、或至少1∶1。在其它实施方案中，进行转酯的经干燥生物质的油∶非油比率为至少1.1∶1、至少1.2∶1、至少1.3∶1、至少1.4∶1、至少1.5∶1、至少1.6∶1、至少1.7∶1、至少1.8∶1、至少1.9∶1、至少2∶1、至少3∶1、至少4∶1、至少5∶1、至少6∶1、至少7∶1、至少8∶1、至少9∶1或至少10∶1。
V.含脂质生物质的其它化学修饰方法
本发明提供了可以产生用于多种工业应用和其它应用的产品的非转酯化学修饰方法，包括氢化、酯交换、羟基化和水解加衍生化。采用和上述就转酯所描述的方式类似的方式，也可以在由本文所述的微生物培养物产生的生物质上进行这些化学修饰。在一些实施方案中，生物质可以包含来自两种或更多种不同微生物株系或物种的培养物的组合生物质。在一些实施方案中，所述不同的株系或物种具有不同的甘油脂质谱，如在实施例22中所举例说明。在本发明的一些方法中，首先从培养基中收获微生物生物质，然后对其实施化学反应，该反应导致共价修饰至少1％的脂质。在一些实施方案中，通过所述化学工艺，修饰至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％脂质。
A.氢化：双键的饱和
氢化是向甘油脂质的脂肪酸成分或游离脂肪酸中的双键添加氢。氢化工艺允许将液体油转化成半固体或固体脂肪，其可能更适于特定应用。氢化是众所周知的化学方法，通常包括在氢的存在下在升高的温度(例如140-225℃)，将油混合物与细碎的过渡金属(例如镍、钯、铂或铑)催化剂接触。
通过本文所述方法产生的生物质的氢化可以与本文所提供的一种或多种方法和/或物质(包括具有至少20％DCW百分比的脂质的微生物生物质)相结合而实施，或者可以实施所述氢化以如下面文献中报道的生产产品：美国专利号7,288,278(食品添加剂或药品)、5,346,724(润滑产品)、5,475,160(脂肪醇)、5,091,116(可食用油)、6,808,737(用于人造黄油和涂抹物(spreads)的结构脂肪)、5,298,637(卡路里减少的脂肪代用品)、6,391,815(氢化催化剂和硫吸附剂)、5,233,099和5,233,100(脂肪醇)、4,584,139(氢化催化剂)、6,057,375(泡沫抑制剂)和7,118,773(可食用乳状液涂抹物)，所述文献各自并入本文作为参考。
B.酯交换：甘油脂质的脂肪酸组分的交换
天然产生的甘油脂质通常不具有一致的脂肪酸组分分布。在油的情况下，酯交换是指不同甘油脂质的两种酯之间的酰基残基的交换。酯交换法提供了一种可以重排甘油脂质混合物的脂肪酸组分以改变分布模式的机制。酯交换是众所周知的化学方法，通常包括在催化剂例如碱金属或碱金属烷基化物(例如甲醇钠)的存在下将油混合物加热(至约200℃)一段时间(例如30分钟)。该方法可以用于将油混合物的脂肪酸组分的分布模式随机化，或可以定向产生期望的分布模式。可以在本文提供的物质(例如具有至少20％DCW百分比的脂质的微生物生物质)上实施这种脂质化学修饰方法。
寻求特定的脂肪酸分布模式的定向酯交换，可以通过将油混合物保持在低于可能存在的一些TAG的熔点的温度来实施。这导致这些TAG的选择性结晶，随着它们的结晶，可以从反应混合物中有效地去除这些TAG。可以继续该方法直至油中的大部分脂肪酸已沉淀。可以使用定向酯交换法，以通过将较长链脂肪酸替代为较短链对应物而产生例如卡路里含量较低的产物。还可以使用定向酯交换产生具有脂肪混合物的产物，所述产物不需诉诸于氢化(其可产生不需要的反式异构体)而可以提供在食品添加剂或食品(例如人造黄油)中寻找的期望熔解特征和结构特性。
通过本文所述的方法产生的生物质的酯交换可以与一种或多种方法和/或物质结合起来实施，或可以实施以如下面文献报道地生产产品：美国专利号6,080,853(不易消化的脂肪代用品)、4,288,378(花生酱稳定剂)、5,391,383(可食用的喷雾油)、6,022,577(用于食品的可食用脂肪)、5,434,278(用于食品的可食用脂肪)、5,268,192(低卡路里坚果产品)、5,258,197(可食用的低卡路里组合物)、4,335,156(可食用的脂肪产品)、7,288,278(食品添加剂或药物)、7,115,760(分馏工艺)、6,808,737(结构脂肪)、5,888,947(引擎润滑剂)、5,686,131(可食用的油混合物)和4,603,188(可熟化聚氨酯组合物)，所述文献各自并入本文作为参考。
在本发明的一个实施方案中，如美国专利号6,465,642(其并入本文作为参考)中所报道的，在如上所述进行生物质转酯之后，使转酯的产物与多元醇反应，产生多元醇脂肪酸聚酯。还可以在具有短链脂肪酸酯的微生物生物质上进行转酯，如美国专利6,278,006中所述，其并入本文作为参考。
C.羟基化：通过将水加至双键进行饱和
羟基化涉及将水加至双键使其饱和和掺入羟基部分。羟基化提供了一种将甘油脂质的一种或多种脂肪酸组分转化为羟基脂肪酸的机制。例如可以通过记载在美国专利号5,576,027(其并入本文作为参考)中的方法，进行羟基化。羟基化的脂肪酸(包括蓖麻油及其衍生物)可以用作几种工业应用的成分，包括用作食品添加剂、表面活性剂、色素湿润剂、消泡剂、防水添加剂、增塑剂、美容乳化剂和/或除味剂，以及用于电学、药学、涂料、油墨、粘着剂和润滑剂中。
通过本文所述的方法产生的微生物生物质的羟基化可以与一种或多种方法和/或物质结合起来实施，或可以实施以如下面文献中所述生产产品：美国专利号6,590,113(油基涂料和油墨)、4,049,724(羟基化工艺)、6,113,971(橄榄油脂)、4,992,189(润滑剂和润滑添加剂)、5,576,027(羟化乳)和6,869,597(化妆品)，所述文献各自并入本文作为参考。
羟基化甘油脂质可以被转化为交内酯(estolides)。交内酯由其中的羟基化脂肪酸组分已被另一脂肪酸分子酯化的甘油脂质组成。可以如由Isbell等人，JAOCS 71(2)：169-174(1994)所述(其并入本文作为参考)，通过温热甘油脂质和脂肪酸的混合物并将该混合物与矿物酸接触，进行羟基化甘油脂质至交内酯的转化。交内酯可以用于多种应用，包括但不限于记载在下述文献中的应用：美国专利号7,196,124(弹性材料和地板覆盖物)、5,458,795(用于高温应用的稠化的油)、5,451,332(用于工业应用的流体)、5,427,704(燃料添加剂)和5,380,894(润滑剂、油脂、增塑剂和印刷油墨)，所述文献各自并入本文作为参考。
D.水解加衍生化：游离脂肪酸的断裂与修饰
对来自通过本发明方法产生的甘油脂质的脂肪酸组分进行水解，可以获得游离脂肪酸，其可被衍生化以生成其它有用的化学实体。水解在水和酸或碱催化剂的存在下发生。所释放的游离脂肪酸可以被衍生化以产生多种产物，如美国专利号5,304,664(高度硫酸化的脂肪酸)、7,262,158(清洗组合物)、7,115,173(织物柔顺剂组合物)、6,342,208(用于处理皮肤的乳剂)、7,264,886(斥水剂组合物)、6,924,333(涂料添加剂)、6,596,768(富含脂质的反刍动物原料)和6,380,410(用于洗涤剂和清洁剂的表面活性剂)中所报道的，所述这些文献各自并入本文作为参考。
E.修饰含脂质微生物生物质的其它化学反应
可在含脂质微生物生物质上进行的其它化学反应包括将三酰基甘油与环丙烷基化剂反应以增强流动性和/或氧化稳定性(如美国专利6,051,539中记载的)；由三酰基甘油制造蜡(如美国专利6,770,104中记载的)；和将三酰基甘油环氧化(如于“脂肪酸组成对环氧化的三酰基甘油的酰基化动力学的影响(The effect of fatty acid composition on theacrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols)”，Journal of theAmerican Oil Chemists′Society，79：1，59-63，(2001)和Free RadicalBiology and Medicine，37：1，104-114(2004)中记载的)，所述这些文献各自并入本文作为参考。
在一些方法中，修饰的第一步骤是加氢处理以使双键饱和，然后在氢和催化剂的存在下在升高的温度脱氧。在一些方法中，氢化和脱氧在同一反应中发生。在其它方法中，脱氧在氢化之前发生。然后任选地，也在氢和催化剂的存在下，异构化。最终，如有需要，可以去除气体和石脑油成分。例如，参见美国专利5,475,160(甘油三酯的氢化)、5,091,116(脱氧、氢化和气体去除)、6,391,815(氢化)和5,888,947(异构化)，所述文献均各自并入本文作为参考。
F.含油微生物生物质和提取的油的皂化
1.基本的皂化化学
动物油和植物油通常由三酰基甘油(TAG)构成，其为脂肪酸与三元醇甘油的酯。在碱水解反应中，TAG中的甘油被去除，留下三个羧酸阴离子，所述羧酸阴离子可以与碱金属阳离子例如钠或钾结合以产生脂肪酸盐。典型的反应方案如下：
在此方案中，羧酸组分从甘油部分上断裂，并被羟基取代。用于反应的碱(例如KOH)的量由所需的皂化程度来确定。如果目的是例如产生包含最初存在于TAG组合物中的一些油的肥皂产物，那么向反应混合物中引入不足以将所有TAG转化为脂肪酸盐的碱量。通常地，此反应在水溶液中进行，而且进行得很慢，但是可以通过加热来提速。可以通过将盐例如水溶性碱金属卤化物(例如NaCl或KCl)加至反应混合物中，促进脂肪酸盐的沉淀。优选地，所述碱为碱金属氢氧化物，例如NaOH或KOH。或者，可以在该反应方案中使用其它碱，例如链烷醇胺，包括例如三乙醇胺和氨基甲基丙醇。在一些实施方案中，为产生透明皂产品，这些替代物可能是优选的。
2.含油生物质的皂化
根据本发明的方法，对含油微生物生物质的皂化可以在完整的生物质上进行、或在于实施该碱水解反应之前已经破碎了的生物质上进行。在前一情况下，可以将通过如上所述培养微生物产生的完整微生物生物质与碱直接接触，以将生物质的含酯的脂质组分转化为脂肪酸盐。在一些实施方案中，将培养的微生物中的全部或一部分的水除去，并将生物质重新悬浮于水溶液中，所述水溶液含有足以将生物质中期望比例的甘油脂质和脂肪酸酯成分皂化的碱量。在一些实施方案中，生物质中少于100％的甘油脂质和脂肪酸酯被转化为脂肪酸盐。
在本发明的一些方法中，在进行该碱水解反应之前破坏生物质。可以通过任何一种或多种上述用于裂解细胞的方法(包括热诱导的裂解、机械裂解等)来完成生物质的破坏，以使微生物的胞内内容物更易接近于碱。这可有助于促进将TAG或脂肪酸酯转化为脂肪酸盐。尽管在皂化之前可以使用酸诱导的裂解来破坏生物质，但是可能更期望其它方法以降低在碱水解反应期间消耗额外的碱来中和任何残留酸的可能性，因为这种可能性可以影响转化为脂肪酸盐的效率。因为应用热可以加速该碱水解反应，所以在皂化反应之前或期间可以使用热诱导的裂解，以产生脂肪酸盐。
在本发明的一些实施方案中，在进行碱水解反应之前，对生物质不进行任何处理或除破坏之外的任何处理。在一些实施方案中，如本文所述进行生物质的预先富集，以使生物质中脂质与非脂质物质的比率增至按重量计50％以上(或增加50％以上)。在其它实施方案中，在无预先富集步骤的情况下，对生物质进行碱水解反应。在一些实施方案中，进行碱水解反应的生物质以与收获时的生物质相同的相对比例含有除水之外的组分。在已去除基本上所有的水的那些实施方案中，生物质包含细胞乳状液或基本上干燥的乳液浓缩物。
可以使用本文所述的任何微生物，产生用于生产皂化油的含脂质生物质。在一些实施方案中，微生物还可赋予通过本文所述的方法产生的皂化油组合物其它特征。例如，不同物种的微藻、以及在不同条件下生长的微藻、具有不同的颜色，包括绿色、黄色、橙色、红色等。可以有目的地少量地保留赋予微藻这些颜色的化合物，以便在所得的皂化油组合物中提供天然色素。在一些实施方案中，还可以在皂化油组合物中少量地保留生物质的其它成分(包括类胡萝卜素和叶黄素(xanth ophylls))。
在本发明方法中生物质的皂化程度可以变化。在一些实施方案中，可能期望产生还包括生物质的甘油脂质成分的皂化油组合物。可以基于对生物质中甘油脂质和脂肪酸酯含量的分析，确定用于该碱水解反应的碱(例如NaOH)的适宜量。在一些实施方案中，优选使用过量的碱直接皂化含脂质生物质，因为部分的碱可通过与生物质的其它成分反应而被消耗。在一些实施方案中，使用过量的碱皂化生物质的含酯脂质成分，导致具有不期望的碱性的皂化油组合物。在这些情况下，可以通过在水中煮沸该皂化油组合物并加入盐例如NaCl、KCl等来再沉淀脂肪酸盐，以纯化该组合物，从而降低组合物的碱性。然后可以对该纯化的皂组合物进行进一步加工处理，例如去除过量水、引入各种添加剂到皂组合物中、将皂模塑成条状或其它形状等。
在一些实施方案中，通过本文所述的方法产生的脂肪酸盐(也称为皂化油)可以与一种或多种选自下列的添加剂组合：精油、香精油、香味油(flavor oil)、植物性药材、香精(extracts)、CO2提取物(CO2extracts)、黏土(clay)、着色剂、二氧化钛、云母、着色草本植物(tintingherb)、珠光剂(glitter)、皮肤角质层剥离剂(exfoliant)、果实种子、纤维、籽粒粉末(grain powder)、坚果粉(nut meal)、种子粉(seed meal)、油珠(oil bead)、蜡球(wax bead)、草药、水溶胶、维生素、奶粉、防腐剂、抗氧化剂、生育酚、盐、糖、植物油、蜡、甘油、海洋蔬菜(sea vegetable)、营养油、保湿油、植物油制奶油(vegetable butter)、丙二醇、对羟基苯甲酸类、蜂蜜、蜂蜡、芦荟、聚山梨酸酯、玉米淀粉、可可粉、珊瑚粉、湿润剂、树胶、乳化剂和增稠剂，或本文所述的任何其它添加剂。
3.提取的油的皂化
因为碱通过与提取油中存在的非甘油脂质或脂肪酸酯的组分相互作用而被消耗掉的可能性降低，所以可以较为容易地控制对提取的生物质脂质成分进行皂化的程度。通过常规己烷提取操作或通过油提取或无溶剂提取操作，可以进行脂质成分的提取。
常规己烷提取(还可以利用其它合适的有机溶剂)通常包括将生物质或裂解物与己烷接触一段时间，其中己烷的量和接触时间将足以允许脂质形成己烷溶液。然后可以过滤混合物，并通过例如旋转蒸发去除己烷。己烷提取方法在本领域中是众所周知的。
油提取包括直接将油加至裂解物，而不进行裂解物组分的预先分离。加入油后，裂解物自动地或由于离心等而分离成不同的层。按密度递减的顺序，这些层可以包括：重固体沉淀物、水相、乳液相和油相。乳液相是脂质和水相的乳液。根据所加入油相对于裂解物的百分比(w/w或v/v)、离心力(如果有)、水性介质的体积和其它因素，可以存在乳液和油相之一或两者。用油孵育或处理细胞裂解物或乳液相一段时间，所述时间足以允许由微生物产生的脂质溶解在油中，从而形成非均相混合物。
在各种实施方案中，用于提取工艺的油选自下组：来自大豆、油菜籽、芸苔、棕榈、棕榈仁、椰子、玉米、废植物、乌桕、橄榄、向日葵、棉籽、鸡脂肪、牛脂、猪脂、微藻、大型藻(macroalgae)、萼距花(Cuphea)、亚麻、花生、精选白脂膏(猪油)、荠蓝籽(Camelina sativa)、芥末籽、腰果、燕麦、羽扇豆(lupine)、洋麻(kenaf)、金盏花(calendula)、大麻(hemp)、咖啡、亚麻籽、榛果(hazelnut)、大戟属植物(euphorbia)、南瓜籽、芫荽、茶、芝麻、红花、稻米、油桐(tung oil tree)、可可、椰子干(copra)、罌粟花(pium poppy)、蓖麻子、山核桃、霍霍巴(jojoba)、麻风树(jatropha)、澳洲坚果(macadamia)、巴西坚果(Brazil nut)、和鳄梨(avocado)的油。加至裂解物的油的量通常为与所述油混合的裂解物的5％以上(按v/v和/或w/w量度)。因此，优选的油与细胞裂解物的v/v或w/w为5％以上或至少6％、至少7％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少95％。
也可以通过冷却裂解物，经无溶剂提取操作(基本上不使用或决不使用有机溶剂或油)，从裂解物中提取脂质。在此类方法中，优选通过在高于室温下进行酸处理，生成裂解物。也可以使用超声处理，特别是如果温度介于室温与65℃之间时。可以经离心或沉降使此裂解物分层，其中一层是含水脂质层(“乳液”层)。其它层可包括固体沉淀物、水层和脂质层。可以通过冻融或以其它方式冷却乳液，从乳液层中提取脂质。在此类方法中，没必要加入任何有机溶剂或油。如果加入任何溶剂或油，那么其可以为低于裂解物的5％v/v或w/w。
然后，分离的或提取的脂质可以如上所述进行碱水解反应，其中加至反应混合物的碱的量可以适应性调整以皂化脂质组合物中期望量的甘油脂质和脂肪酸酯成分。可以通过对组合物中酯化的脂质的量进行近似估计或定量，适应性调整皂化规定的油部分所需的碱量，由此提供调节保留在所得组合物中的未皂化油的量的机会。在一些实施方案中，所得组合物中按重量计至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％的油保持未被皂化。在其它实施方案中，可能期望皂化所有或几乎所有的油，以使所得组合物含有按重量计不大于10％、不大于9％、不大于8％、不大于7％、不大于6％、不大于5％、不大于4％、不大于3％、不大于2％、不大于1％或不大于0.5％的未皂化油。
在本发明的各种实施方案中，微生物生物质或油可以包含具有不同碳链长度和不同饱和水平的脂质。脂质的特征可以起因于用于产生进行皂化反应的生物质或油的该一种或多种微生物群体的天然甘油脂质谱，或可以是如本文所述的脂质途径工程化的结果，其中生成可以产生更大比例的特定脂质的微生物转基因株系。
如本文所述进行转酯或其它化学修饰的微生物生物质可以任选地进行预先富集步骤，使脂质与微生物干重的比率增加。在一些实施方案中，生物质中脂质与非脂质物质的比率按重量计增加超过10％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％或超过100％。在本发明的一些方法中，对生物质进行化学反应，而不经预先富集步骤，或在一些实施方案中，不经使该比率增加50％以上的预先富集步骤。可以通过例如加入得自非该微生物生物质的来源(例如得自第二微生物生物质培养物、植物或种子油来源等)的脂质，增进脂质与非脂质物质的比率。不管是否进行任选的富集，在进行化学反应的生物质中脂质组分包含不超过50％、不超过60％、不超过70％、不超过80％、不超过90％或不超过95％，优选在该生物质中脂质组分包含不少于15％、不少于20％、不少于30％、不少于35％、不少于40％或不少于45％。在一些实施方案中，收获的生物质包含按DCW计至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的脂质含量。
在一些实施方案中，在使生物质进行皂化(或其它化学修饰)反应之前从生物质中去除水。在本发明的一些实施方案中，在使生物质进行皂化(或其它化学修饰)反应之前，不对微生物生物质进行除了去除水或裂解之外的任何处理。在一些实施方案中，进行化学反应的生物质与自发酵收获时的生物质以相同的相对比例含有除水之外的组分。在上下文中，“相同的相对比例”意指，在考虑与下述因素相关的变化后，组分的比例基本上保持相同：收获生物质后细胞的使用或一些组分的代谢转化、(未使用外源性试剂或催化剂的情况下)所收获的生物质内的一些组分的化学转化、气体从所收获生物质中的逸出、和/或不易控制的该相对比例的类似改变。短语“相同的相对比例”也意在说明某个水平的实验差异性，例如±5％。
在本发明的一些方法中，在化学修饰脂质后从生物质的其它组分中分离共价修饰的脂质。在一些实施方案中，分离脂质包括相分离，借此共价修饰的脂质形成较轻的非水相，而生物质的组分形成一个或多个较重相。然后可以移出该较轻的非水相以分离共价修饰的脂质组分。在一些实施方案中，可以通过离心或其它技术，促进含有共价修饰的脂质的亲脂相与亲水的生物质细胞物质的分离。共价修饰的脂质与和其分离的生物质的比率按干重计可以为10％脂质∶90％生物质至90％脂质∶10％生物质。
4.具有较高的饱和油含量和较少的有色杂质的生物质的优势
尽管用于本文所述的皂化方法的生物质和/或提取油可以源自许多具有不同甘油脂质谱和不同比率的其它成分(例如色素)的微生物中的任何一种，但是在优选的实施方案中，生物质和/或提取油在TAG中包含相对高比率的饱和脂肪酸并包含相对低比率的赋予油颜色的成分(例如色素)。在一个实施方案中，生物质和/或提取油源自无绿藻属的微藻。
皂化油中脂肪酸组分的饱和特征和有色成分的存在，影响含有皂化油的组合物的保存限期和其感官质量。饱和脂肪酸比其不饱和对应物更不易氧化。因此，在皂化油产品制备中使用具有相对较高比率的饱和∶不饱和脂肪酸组分的皂化油，可导致更长的总体保存限期，并使通常具有不受欢迎气味的氧化产物的生成最小化。类似地，相对缺少有色杂质(其在氧化后倾向于改变包含其的皂化油组合物的外观)可提升组合物的感官质量和消费者对此类产品的满意程度，特别是经过长的保存期后。所得皂的消费者将倾向于将特定颜色或无色与皂的品牌联系在一起，并每次期望产品具有相同的颜色。皂化油中颜色的缺乏将使得所得的皂化油具有更好的一致性。
较高比率的饱和脂肪酸在制备下述的皂化组合物中特别有利，在所述组合物中生物质(或提取油)中的一部分甘油脂质保持未被皂化。如前文讨论，可以通过调节用于皂化反应的碱的量，使一定百分比的甘油脂质保持未被修饰(未皂化)，由此生成保留某个比例的最初存在的甘油脂质的肥皂产品。皂化反应中存在过量的甘油脂质通常被称为“加脂(superfatting)”。皂化反应后剩余在产物中的额外油赋予组合物增湿的特性，但是像任何油一样，其会氧化，从而可导致难闻气味组合物的产生。将较高比率的饱和∶不饱和脂肪酸成分用作反应混合物的“加脂”组分，可导致保存期相对更长的产物，并使难闻性氧化产物的产生最小化。
在各种实施方案中，饱和脂肪酸成分占根据本发明方法进行碱水解反应的微生物生物质或提取油的含酯脂质组分的1-100％。在优选的实施方案中，饱和脂肪酸成分占碱水解反应中含酯脂质组分的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。
在一些实施方案中，产生颜色的杂质(例如类胡萝卜素)存在于微生物生物质或提取油中，浓度为不超过500ppm、不超过250ppm、不超过100ppm、不超过75ppm或不超过25ppm。产生颜色的杂质包括类胡萝卜素例如叶黄素、β胡萝卜素、玉米黄质、虾青素和叶绿素。在其它实施方案中，存在于微生物生物质或提取油中的叶绿素的量少于0.1mg/kg、少于0.05mg/kg或少于0.01mg/kg。
在一些实施方案中，在皂化之前或之后，微生物油或皂分别含有少于60微克、少于59微克、少于58微克、少于57微克、少于56微克、少于55微克、少于54微克、少于53微克、少于52微克、少于51微克、少于50微克、少于49微克、少于48微克、少于47微克、少于46微克、少于45微克、少于44微克、少于43微克、少于42微克、少于41微克、少于40微克、少于39微克、少于38微克、少于37微克、少于36微克、少于35微克、少于34微克、少于33微克、少于32微克、少于31微克、少于30微克、少于29微克、少于28微克、少于27微克、少于26微克、少于25微克、少于24微克、少于23微克、少于22微克、少于21微克、少于20微克、少于19微克、少于18微克、少于17微克、少于16微克、少于15微克、少于14微克、少于13微克、少于12微克、少于11微克、少于10微克、少于9微克、少于8微克、少于7微克、少于6微克、少于5微克或少于4微克类胡萝卜素每克皂化油。
无绿藻属的微藻，包括但不限于威氏无绿藻、Prototheca stagnora、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis和左氏无绿藻，天然产生较高比率的饱和脂质成分，如在实施例28举例说明。而且，从无绿藻属的微藻中提取的油通常包括较少的产生颜色的杂质，从而允许生产含有该皂化油的无色组合物。因此，将此类微生物用作生物质或油的来源来实施根据本发明的皂化方法是优选的。
VI.组合物
本发明还提供了可以通过本文所述的方法制备的组合物。在本发明的各种组合物的每一个中，微生物生物质选自：细菌、蓝细菌、真核微藻、产油酵母和真菌。在一些实施方案中，微生物生物质选自源自表1所列真核微藻微生物的生物质。在一些实施方案中，微生物生物质为小球藻属物种，在一些实施方案中，该物种选自下组：Chlorella fusca、原壳小球藻、蛋白核小球藻、Chlorella kessleri、小球藻(Chlorellavulgaris)、Chlorella saccharophila、Chlorella sorokiniana和椭圆小球藻。在一个实施方案中，该物种为原壳小球藻。在一些实施方案中，微生物生物质源自选自表2所列产油酵母的酵母，或源自选自表3所列真菌的真菌。
在一个实施方案中，本发明涉及包含含有脂肪酸烷基酯的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物。
在此组合物的各种实施方案中，至少20％的脂肪酸烷基酯为C18。在其它实施方案中，至少30％、至少40％或至少50％的脂肪酸烷基酯为C18。在一些实施方案中，至少50％的脂肪酸烷基酯为C16或更长的链长度。在一些实施方案中，至少10％的脂肪酸烷基酯为C14或更短的链长度。在一些实施方案中，至少20％的脂肪酸烷基酯为C14或更短的链长度。
在一些实施方案中，组合物包含变化量的杂原子。在一些实施方案中，较轻相中钙和镁的组合量按重量计不大于5ppm。在一些实施方案中，较轻相中磷的量按质量计不大于0.001％。在一些实施方案中，较轻相中硫的量不大于15ppm。在一些实施方案中，较轻相中钾和钠的组合量按重量计不大于5ppm。在一些实施方案中，较轻相的总类胡萝卜素含量不大于100微克类胡萝卜素每克。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含含有完全饱和的脂质的最轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物。
在又一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含含有脂质的较轻相和至少一个含有来自1种以上物种或株系的微生物生物质的较重相。在又一个实施方案中，本发明提供了包含含有羟基化的脂质的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了包含含有游离脂肪酸的较轻相和至少一个含有微生物生物质的较重相的组合物。
在又一个实施方案中，本发明提供了包含皂化油的组合物，所述皂化油源自按如上所述对培养微生物群体所产生的生物质的碱水解。在一些实施方案中，皂化油所源自的生物质包含来自单独进行培养的两种或更多种不同微生物株系或物种的生物质的混合物。在一个实施方案中，组合的生物质所源自的这些不同的微生物株系或物种中的至少两种，包含不同的甘油脂质谱。在不同的实施方案中，组合物可以是固体(包括粉末)或液体。
本发明的皂化油组合物可以包括源自如本文所述的一个或多个微生物物种的脂肪酸盐，且可以包括直接源自用于制备皂化油的生物质的类胡萝卜素或其它组分。在一些实施方案中，皂化油组合物包括但不限于β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、虾青素、α-隐黄素、β-隐黄素、叶黄素、番茄红素、八氢番茄红素、六氢番茄红素和/或玉米黄质。在一些实施方案中，皂化油组合物包括藻类多糖，例如在国际公开号WO/2007/084769中描述的那些，所述专利申请并入本文作为参考。
在一些实施方案中，皂化油组合物包含各种比例的源自生物质的未皂化甘油脂质。在各种实施方案中，源自生物质的未皂化甘油脂质占皂化油组合物的至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。在其它实施方案中，未皂化甘油脂质占皂化油组合物的至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％或至多1％。
在根据本发明的皂化油组合物的各种实施方案中，皂化油包含组合物总质量的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，皂化油包含组合物总质量的至多80％、至多75％、至多70％、至多65％、至多60％、至多55％、至多50％、至多45％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％或至多5％。在一些实施方案中，源自生物质的组分，包括但不限于皂化的油、未皂化的油、类胡萝卜素等，构成组合物总质量的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在其它实施方案中，源自生物质的组分构成组合物总质量的至多80％、至多75％、至多70％、至多65％、至多60％、至多55％、至多50％、至多45％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％或至多5％。
在皂化油组合物的一些实施方案中，组合物还包括至少一种选自下列的油：大豆油、油菜籽油、芸苔油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、玉米油、废植物油、乌桕油、橄榄油、向日葵油、棉籽油、鸡脂肪油、牛脂油、猪脂油、微藻油、大型藻油、萼距花油、亚麻油、花生油、精选白脂膏、猪油、荠蓝籽油、芥末籽油、腰果油、燕麦油、羽扇豆油、洋麻油、金盏花油、大麻油、咖啡油、亚麻籽(亚麻)油、榛果油、大戟属植物油、南瓜籽油、芫荽油、茶油、芝麻油、红花油、稻米油、油桐油、可可油、椰子干油、罌粟油、蓖麻子油、山核桃油、霍霍巴油、麻风树油、澳洲坚果油、巴西坚果油和鳄梨油。
在皂化油组合物的一些实施方案中，一种或多种添加剂与脂肪酸盐组合。在一些实施方案中，选择添加剂以优化组合物使用(例如用作皮肤清洁剂)时的清洁效率。在其它实施方案中，就添加剂赋予组合物的投合消费者兴趣的特征而言，对添加剂进行选择。在一些实施方案中，为优化清洁效率以及为吸引消费者力，选择添加剂。在各种实施方案中，添加剂选自：精油、香精油、香味油(flavor oil)、植物性药材、香精(extracts)、CO2提取物(CO2 extracts)、黏土(clay)、着色剂、二氧化钛、云母、着色草本植物(tinting herb)、珠光剂(glitter)、皮肤角质层剥离剂(exfoliant)、果实种子、纤维、籽粒粉末(grain powder)、坚果粉(nutmeal)、种子粉(seed meal)、油珠(oil bead)、蜡球(wax bead)、草药、水溶胶、维生素、奶粉、防腐剂、抗氧化剂、生育酚、盐、糖、植物油、蜡、甘油、海洋蔬菜(sea vegetable)、营养油、保湿油、植物油制奶油(vegetable butter)、丙二醇、对羟基苯甲酸类、蜂蜜、蜂蜡、芦荟、聚山梨酸酯、玉米淀粉、可可粉、珊瑚粉、湿润剂、树胶、乳化剂和增稠剂。这些添加剂可从许多皮肤护理成分和沐浴附属物供应商处商购。
精油包括多香果(allspice)精油、香树(amyris)精油、当归根(angelicaroot)精油、茴香子(anise seed)精油、罗勒(basil)精油、月桂(bay)精油、香柠檬(bergamot)精油、黑胡椒(black pepper)精油、白千层(cajeput)精油、樟脑(camphor)精油、依兰(cananga)精油、小豆蔻(cardamom)精油、胡萝卜籽(carrot seed)精油、肉桂(cassia)精油、荆芥(catnip)精油、雪松木(cedarwood)精油、春黄菊(chamomile)精油、肉桂树皮(cinnamonbark)精油、肉桂叶(cinnamon leaf)精油、爪哇香茅(citronella Java)精油、鼠尾草(clary sage)精油、丁子香芽(clovebud)精油、芫荽(coriander)精油、亚洲薄荷(cornmint)精油、柏木(cypress)精油、印蒿(davana)精油、莳萝子(dill seed)精油、榄香(elemi)精油、桉树(eucalyptus)精油、茴香(fennel)精油、冷杉(fir)精油、乳香(frankincense)精油、波旁天竺葵(geranium bourbon)精油、玫瑰天竺葵(geranium roast)精油、天竺葵(geranium)精油、姜(ginger)精油、粉红葡萄柚(grapefruit pink)精油、葡萄柚(grapefruit)精油、古芸香胶(gurjum balsam)精油、海索草(hyssop)精油、刺柏(juniper berry)精油、lavandin精油、lavandula精油、薰衣草(lavender)精油、柠檬香桃木(lemon myrtle)精油、柠檬茶树(lemon tea tree)精油、柠檬(lemon)精油、香茅(lemongrass)精油、白柠檬(lime)精油、山鸡椒(litsea cubeba)精油、橘子(mandarin)精油、马郁兰(marjoram)精油、毛蕊花(mullein)精油、没药(myrrh)精油、橙花(neroli)精油、nerolina精油、袅莉(niaouli)精油、肉豆蔻(nutmeg)精油、橘皮(orange)精油、玫瑰草(palmarosa)精油、广藿香(patchouli)精油、薄荷(peppermint)精油、苦橙叶(petitgrain)精油、松针(pine needle)精油、ravensara精油、ravintsara精油、rosalina精油、玫瑰(rose)精油、迷迭香(rosemary)精油、花梨木(rosewood)精油、鼠尾草(sage)精油、檀香木(sandalwood)精油、薄荷(spearmint)精油、甘松(spikenard)精油、八角茴香(star anise)精油、红柑(tangerine)精油、茶树(tea tree)精油、百里香(thyme)精油、tulsi精油、马鞭草(verbena)精油、岩兰(vetiver)精油、依兰(ylang ylang)精油和大根老鹳草(zdravetz)精油、或其组合。
香精油和香味油包括净郁金香(tulip)、杏仁(almond)、amaretto、琥珀(amber)、anais、苹果(apple)、苹果肉桂(apple cinnamon)、applespice、杏、apricot crème、阿拉伯麝香(arabian musk)、沙梨(asian pear)、asian plum blossom、autumn woods、香蕉、罗勒(basil)、basil nectarine、bay rum、月桂子(bayberry)、香柠檬(bergamot)、berries and cream、Birthday Cake、黑莓(blackberry)、红茶(black tea)、黑莓茶(blackberrytea)、黑加仑(blackcurrent)、蓝色尼罗河(blue nile)、蓝莓快乐(blueberrydelight)、brambleberry preserves、红糖(brown sugar)、泡泡糖(bubblegum)、奶油乳酪(buttercream)、奶油糖果(butterscotch)、海芋百合(callalily)、甜瓜(cantaloupe)、焦糖苹果(caramel apple)、康乃馨(carnation)、carrot cake、chai tea、甘菊(chamomile)、中国麝香(China musk)、中国雨(China rain)、中国牡丹(chinese peony)、菊花(chrysanthemum)、肉桂(cinnamon)、椰子(coconut)、椰子奶油(coconut cream)、棉花糖(cotton candy)、蔓越莓(cranberry)、黄瓜(cucumber)、黄瓜蜜瓜(cucumber melon)、水仙花(daffodil)、蒲公英(dandelion)、飞燕草(delphinium)、露莓(dewberry)、焦糖牛奶(dulce de leche)、格雷伯爵茶(earl grey tea)、easter cookie、蛋奶酒(egg nog)、埃及麝香(eqyptianmusk)、魔法森林(enchanted forest)、英国薰衣草(english lavender)、英国梨(english pear)、常绿树(evergreen)、无花果(fig)、赤素馨花(frangipani)、乳香(frankincense)、法国香草(french vanilla)、鲜苹果(fresh apple)、fresh brewed coffee、fruitpunch、栀子(gardenia)、天竺葵(geranium)、姜花(ginger lily)、gingerbread、葡萄(grape)、葡萄柚(grapefruit)、青苹果(green apple)、绿草(green grass)、绿茶(green tea)、番石榴(guava)、番石榴花(guava flower)、夏威夷白姜(hawaiian whiteginger)、天芥菜(heliotrope)、大麻(hemp)、药草(herbaceous)、holidayfruitcake、冬青浆果(hollyberry)、蜂蜜姜(honey ginger)、蜂蜜、忍冬(honeysuckle)、茉莉(jasmine)、茉莉花茶(jasmine tea)、杜松浆果(juniperberries)、猕猴桃(kiwi)、熏衣草(lavender)、leather、柠檬、柠檬欧芹(lemon parsley)、丁香花(lilac)、lime、罗甘莓(loganberry)、莲花(lotusblossom)、木兰(magnolia)、mandarin、芒果、芒果与猕猴桃(mango andkiwi)、枫(maple)、牛奶巧克力(milk chocolate)、含羞草(mimosa)、mintylime、桑椹(mulberry)、没药(myrrh)、橙花(neroli)、橡苔(oakmoss)、燕麦粉(oatmeal)、海洋雨(ocean rain)、橙花(orange blossom)、orangesherbet、橘子香草(orange vanilla)、木瓜(papaya)、西番莲(passionfruit)、广藿香(patchouli)、桃、peaches and cream、洋梨草莓(pearberry)、薄荷、pikaki、pina colada、菠萝(pineapple)、石榴(pomegranate)、pumpkin pie、葡萄干与杏仁(raisins and almonds)、覆盆子(raspberry)、烤坚果(roasted nuts)、花梨木(rosewood)、鼠尾草(sage)、檀香木(sandalwood)、黄樟(sassafras)、海苔(sea moss)、芝麻(sesame)、西伯利亚松树(siberian pine)、雪果(snowberry)、西班牙苔藓(spanish moss)、spice、草莓(strawberry)、sugar plum、晒黑油(suntan lotion)、甜丁香(sweet clove)、甜草(sweet grass)、甜豌豆(sweet pea)、红橘(tangerine)、泰国椰子(thai coconut)、timber、蕃茄叶(tomato leaf)、香草(vanilla)、西瓜(watermelon)、白巧克力(white chocolate)、野樱桃(wild cherry)、紫藤(wisteria)、witches brew、和依兰(ylang ylang)、或其组合。
皮肤角质层剥离剂包括可以用于去除死皮细胞、污垢或其它来自皮肤表面的物质的颗粒，包括但不限于水果种子和纤维、籽粒粉末、坚果和种子粉，以及油或蜡珠。果实纤维包括蓝莓、蔓越莓、葡萄、猕猴桃、覆盆子、黑莓、草莓等。籽粒粉末包括磨至不等粗度的燕麦粉和杏仁粉等。还可以使用聚合物珠例如由聚乙烯制成的那些等。死皮细胞和/或皮肤最外层的去除可以为生物活性剂(例如类胡萝卜素)更接近皮肤的较深层提供机会，所述生物活性剂也可以存在于本发明的组合物中。
香精和CO2提取物包括通过常规提取工艺或通过使用液化二氧化碳产生的草本植物提取物。草本植物包括芦荟叶(aloe vera leaf)、紫花苜蓿叶(alfalfa leaf)、朱草根(alkanet root)、胭脂树籽(annatto seed)、竹芋(arrowroot)、牛蒡根(burdock root)、金盏花瓣(calendula petals)、胡萝卜根(carrot root)、春黄菊花(chamomile flower)、紫草叶(comfreyleaf)、玉米穗丝(corn silk)、荷兰蓝罂粟(dutch blue poppies)、茴香子(fennel seed)、姜根(ginger root)、人参(ginseng)、绿茶叶(green tea leaf)、素馨花(jasmine flower)、杜松浆果(juniper berries)、熏衣草芽(lavenderbuds)、柠檬皮(lemon peel)、香茅(lemongrass)、药蜀葵根(marshmallowroot)、荨麻(nettles)、燕麦秆(oat straw)、橙皮(orange peel)、红辣椒(paprika)、欧芹(parsley)、薄荷叶(peppermint leaf)、玫瑰花芽(rosebuds)、玫瑰花瓣(rose petals)、玫瑰果(rosehip)、迷迭香叶(rosemaryleaf)、马尾草(shavegrass)、薄荷叶(spearmint leaf)和圣约翰草(St John′swort)及其组合。
色素和珠光剂包括绿#5、绿#8、橙#4、红#22、红#33、紫#2、蓝#1、绿#3、红#40、黄#5、黄#6、绿#6、红#17、以及珠光云母和着色草本植物例如散沫花叶(henna leaf)、檀香木(sandalwood)、姜黄根(turmeric)、蔓越莓(cranberry)、猕猴桃(kiwi)、覆盆子(raspberry)、朱草(alkanet)、胭脂树(annatto)、胡萝卜根(carrot root)、荨麻(nettles)、红辣椒(paprika)和欧芹(parsley)。
在各种实施方案中，对含有一种或多种如上文所述的添加剂的皂化油组合物进行配制以用作化妆品。在一些实施方案中，所述化妆品是个人卫生产品，例如用于个体身体或其部分(例如脸、腿等)的清洁组合物。
在一方面，本发明涉及包含如本文所述的皂化油组合物和口服补充剂的试剂盒。在一个实施方案中，该口服补充剂为维生素。在另一个实施方案中，该口服补充剂为草本植物。
在另一方面，本发明涉及将源自如本文所述生产的生物质的碱水解的皂化油用于与一种或多种如上文所述的添加剂混合、并将所述混合物包装成化妆品的方法。在一个实施方案中，该化妆品包含清洁组合物(例如洁面剂)。
可以使用常规DNA分析方法来检测源自本发明微生物生物质的组分的存在。
本文引用的所有参考文献(包括专利、专利申请和出版物)特此以其全部内容并入作为参考，而不管先前是否明确并入。为了描述和公开可以用于本发明的试剂、方法学和概念的目的，引用本文提及的出版物。本文的任何内容均不应解释为承认这些文献是本文所述的本发明的现有技术。特别地，为了所有目的，下述专利申请特此以其全部内容并入作为参考：于2008年4月9日提交的标题为“微生物生物质的直接化学修饰(Direct Chemical Modification of Microbial Biomass)”的美国临时申请号61/043,620、于2008年6月20日提交的标题为“由含油微生物生物质和油产生的肥皂和化妆品(Soaps and Cosmetic ProductsProduced from Oil-Bearing Microbial Biomass and Oils)”的美国临时申请号61/074,610、国际公开号WO 2008/151149和于2008年11月7日提交的标题为“包含微藻组分的化妆品组合物(CosmeticCompositions Comprising Microalgal Components)“的美国临时申请号61/112,464。
尽管已经结合本发明的特定实施方案对本发明进行了描述，但是应理解，能够对本发明作出进一步的修饰。以下权利要求的范围包括一般地遵循本发明的原则的本发明的变型、应用或改编，包括自本公开的偏离，只要该偏离属于本领域已知或常规的操作实践并可以应用于之前阐述的必要特征即可。提供以下实施例来举例说明而非限制本发明。
VII.实施例
实施例1
除非另有说明，否则所有在此和下述实施例中描述的株系均得自University of Texas Culture Collection of Algae(Austin，TX)。在本实施例中，对小球藻属株系在甘油和葡萄糖上的生长进行了测试。培养下述小球藻属物种和株系：Chlorella kessleri(株系263、397、398、2228)；Chlorella sorokiniana(株系1663、1665、1669、1671、1810)；Chlorellasaccharophila(2911、2469)；原壳小球藻(31、249、250、264)。将每种株系从固体培养基接种到25ml液体基础培养基(2g/L酵母提取物、2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.4mMK2HPO4、1.28mM KH2PO4、0.43mM NaCl)中，于27℃、75μEm-2S-1的光强度下振荡培养72小时。使用这些培养物将各株系以1×105个细胞/ml的最终密度接种到24孔板中，板含有2ml(a)单独的基础培养基，(b)基础培养基+0.1％葡萄糖，和(c)基础培养基+0.5％试剂级甘油(EMScience，目录号#GX0185-6)。将板放在暗处，在振摇下于27℃生长72小时。将在3种条件下生长的每种株系的样品在蒸馏水中1.9∶1稀释，在Molecular Devices SpectraMax 340PC中读取600nm吸光度。与仅含基础培养基相比，所有株系显示出在葡萄糖和甘油的存在下生长。
实施例2
株系和培养基：将原壳小球藻#1(株系250)、#2(株系264)和Chlorella kessleri#1(株系398)的贮存培养物维持在改良培养基上。每升改良培养基(g/L)包括0.25g NaNO3、0.09g K2HPO4、0.175gKH2PO4、0.025g、0.025g CaCl2·2H2O、0.075g MgSO4·7H2O和2g酵母提取物。来自生物柴油生产的甘油废弃物(经酸化的甘油(AG)和未经酸化的甘油(NAG))得自Imperial Western Products(Selma，CA，USA)。“纯”或“试剂级”甘油得自EM Science(Merck KGA分部)，目录号#GX0185-6。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.+1％纯甘油
2.+1％经酸化的甘油
3.+1％未经酸化的甘油
4.+1％纯甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
5.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
6.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至不同的培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅动。在72hr的最初生长后，将1％(w/v)葡萄糖加至样品#4、5和6中，然后将细胞培养另外24hr。为了测量DCW，通过在Eppendorf5415C离心机中以5,000rpm离心5分钟使1ml每种培养物沉淀。去除上清液后，将细胞沉淀物在-80℃冷冻，在实验室规模冷冻干燥机(Labconco，MO，USA)中进行冷冻干燥。结果示于图1。
实施例3
株系和培养基：将原壳小球藻#1(株系250)、#3(株系249)和Chlorella kessleri#2(株系397)的贮存培养物维持在改良培养基(参见实施例2)上。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖
2.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
3.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至不同的培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅动。96hr后，就DCW测量细胞生长(参见实施例2)。结果示于图2。
实施例4
株系和培养基：原壳小球藻#3(株系249)、#4(株系31)和Chlorellakessleri#2(株系397)的贮存培养物维持在改良培养基(参见实施例2)上。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖
2.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
3.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至含有不同的甘油(纯、经酸化的或未经酸化的)的培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅动。96hr后，测量脂质含量。为了测量细胞中的脂质含量，收集100μl培养物，用相同体积的培养基洗涤1次。向每个管中加入5μl经洗涤的细胞和200μl硫酸(18M)。将各管在水浴中于90℃孵育30分钟，将1ml磷酸-香草醛试剂加至各管中，在37℃孵育15分钟。为了制备磷酸-香草醛试剂，将0.12g香草醛加至20ml水中，用85％磷酸将体积调节至100ml。相对于作为样品的含有5μl水的参比管，于530nm读取玻璃比色杯中的光密度。结果示于图3。
实施例5
株系和培养基：原壳小球藻#2(株系264)和Chlorella kessleri#1(株系398)贮存培养物维持在改良培养基(参见实施例2)上。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.+1％纯甘油
2.+1％未经酸化的甘油
3.+1％纯甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
4.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至含有不同的甘油(纯或未经酸化)的培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅动。72hr的最初生长后，将1％葡萄糖加至样品#3和#4，将细胞培养另外的24hr。测量所有样品中的脂质含量(参见实施例4)。还在600nm下测量光密度以检查非特异性吸光度，并自OD 530nm中扣除以计算脂质的量。参比曲线由范围在1～10μg的溶解于氯仿的三油精组成。结果示于图4。
实施例6
株系和培养基：原壳小球藻#3(株系249)和Chlorella kessleri#2(株系397)贮存培养物维持在改良培养基(参见实施例2)上。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
2.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
3.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至含有不同的甘油(纯、经酸化的或未经酸化的)的培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。72hr的最迟生长后，加入1％葡萄糖，使细胞培养另外的24hr。测量所有样品中的DCW和脂质含量(参见实施例2和5)。由总脂质量除以DCW来计算脂质百分比。结果示于图5。
实施例7
株系和培养基：原壳小球藻#2(株系264)和Chlorella kessleri#1(株系398)贮存培养物维持在改良培养基(参见实施例2)上。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
2.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至含有1％纯甘油或1％未经酸化的甘油的培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。72hr的初期生长后，加入1％葡萄糖，使细胞培养另外的24hr。测量所有样品中的DCW和脂质含量(参见实施例1和4)。由总脂质量除以干细胞重量来计算脂质百分比。结果示于图6。
实施例8
株系和培养基：原壳小球藻#1(株系250)、#4(株系31)和Chlorellakessleri#2(株系397)贮存培养物维持在改良培养基(参见实施例2)上。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.+2％葡萄糖
2.+1％甘油+1％葡萄糖
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至不同培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。96hr的初期生长后，测量脂质含量(参见实施例5)。结果示于图7。
实施例9
株系和培养基：原壳小球藻#3(株系249)，#4(株系31)和Chlorellakessleri#1(株系398)贮存培养物维持在改良培养基(参见实施例2)上。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.+2％葡萄糖
2.+1％甘油+1％葡萄糖
3.+1％甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至不同培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。72hr的初期生长后，将1％(w/v)葡萄糖加至#3培养基，使细胞培养另外的24hr。测量所有样品中的DCW和脂质含量(参见实施例2和5)。由总脂质量除以干细胞重量来计算脂质百分比。结果示于图8。
实施例10
株系和培养基：原壳小球藻#1(株系250)、#3(株系249)和Chlorellakessleri#2(株系397)贮存培养物维持在改良培养基(参见实施例2)上。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖
2.+1％纯甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
3.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
4.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
5.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
6.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至不同培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。72hr的初期生长后，将1％(w/v)葡萄糖加至#2、#4和#6培养基，使细胞培养另外的24hr。测量所有样品中的脂质含量(参见实施例4)。结果示于图9。
实施例11
株系和培养基：原壳小球藻#1(株系250)、#3(株系249)、#4(株系31)和Chlorella kessleri#2(株系397)贮存培养物维持在改良培养基(参见实施例2)上。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖
2.+1％纯甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
3.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
4.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
5.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
6.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至不同培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。72hr的初期生长后，将1％(w/v)葡萄糖加至#2、#4和#6培养基，使细胞培养另外的24hr。测量所有样品中的DCW(参见实施例2)。结果示于图10。
实施例12
株系和培养基：(a)钝顶螺旋藻(UTEX 2340)和(b)Naviculapelliculosa(UTEX 667)。将螺旋藻的贮存培养物维持在螺旋藻培养基中，而将舟形藻维持在土壤浸出液培养基(soil extract medium，SEM)中。螺旋藻培养基包括162mM NaHCO3、38mM Na2CO3、1.9mMK2HPO4、29mM NaNO3、5.75mM K2SO4、17.1mM NaCl、0.8mMMgSO4·7H2O、0.25mM CaCl2·2H2O、2mM Na2EDTA、0.36mMFeCl3·6H2O、0.21mM MnCl2·4H2O、0.037mM ZnCl2、0.0085mMCoCl2·6H2O、0.017mM NaMoO4·2H2O、0.78μM CuSO4·5H2O、0.15μM ZnSO4·7H2O、10μM H3BO3和0.001mM维生素B12。土壤浸出液培养基包括2.94mM NaNO3、0.17mMCaCl2·2H2O、0.3mMMgSO4·7H2O、0.43mM K2HPO4、1.29mM KH2PO4、0.43mM NaCl和土壤浸出液。来自生物柴油生产的甘油废弃物(经酸化的甘油(AG)和未经酸化的甘油(NAG))得自Imperial Western Products(Selma，CA，USA)。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。(a)
7.螺旋藻培养基+2％葡萄糖
8.螺旋藻培养基+2％试剂级甘油
9.螺旋藻培养基+2％未经酸化的甘油
10.螺旋藻培养基+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(b)
1.SEM+2％葡萄糖
2.SEM+2％试剂级甘油
3.SEM+1％试剂级甘油+1％葡萄糖
4.SEM+2％经酸化的甘油
5.SEM+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
6.SEM+2％未经酸化的甘油
7.SEM+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至不同培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。96hr后，测量脂质含量。为了测量细胞中的脂质含量，收集100μl培养物，用相同体积的培养基洗涤1次。向每个管中加入5μl经洗涤的细胞和200μl硫酸(18M)。将各管在水浴中于90℃孵育30分钟，将1ml磷酸-香草醛试剂加至各管中，在37℃孵育15分钟。为了制备磷酸-香草醛试剂，将0.12g香草醛加至20ml水中，用85％磷酸将体积调节至100ml。相对于作为样品的含有5μl水的参比管，于530nm读取玻璃比色杯中的光密度。参比曲线由范围1～10μg的溶解于氯仿的三油精组成。
为了测量DCW，通过以5,000rpm离心5分钟使0.5ml每种培养物沉淀。去除上清液后，将细胞沉淀物在-80℃冷冻，并在Freeze Drysystem(Labconco，MO，USA)中干燥过夜。由总脂质量除以干细胞重量来计算脂质百分比。结果示于图11。
实施例13
株系和培养基：被甲栅藻(UTEX 2552)贮存培养物维持在改良培养基上。每升改良培养基(g/L)包括0.25g NaNO3、0.09g K2HPO4、0.175g KH2PO4、0.025g、0.025g CaCl2·2H2O、0.075g MgSO4·7H2O和2g酵母提取物。对于每种生长条件，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
(a)，(b)
1.+2％葡萄糖
2.+2％甘油
3.+2％经酸化的甘油
4.+2％未经酸化的甘油
5.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
将被甲栅藻(UTEX 2552)以5×105细胞/ml的浓度接种至不同培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。96hr后，通过DCW测量细胞生长，并通过磷-香草醛分析法测量脂质含量(参见实施例12)。由总脂质量除以干细胞重量来计算脂质百分比。结果示于图12。
实施例14
株系和培养基：Navicula pelliculosa(UTEX 667)贮存培养物维持在土壤浸出液培养基(参见实施例12)上。对于每种生长条件，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.SEM+2％葡萄糖
2.SEM+2％甘油
3.SEM+2％经酸化的甘油
4.SEM+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
5.SEM+2％未经酸化的甘油
6.SEM+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
将Navicula pelliculosa(UTEX 667)以5×105细胞/ml的浓度接种至含有葡萄糖或不同甘油(纯、经酸化的或未经酸化的)的培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。96hr后，按DCW测量细胞生长(参见实施例12)。结果示于图13。
实施例15
株系和培养基：被甲栅藻(UTEX 2552)和Naviculapelliculosa(UTEX 667)。对被甲栅藻而言，将贮存培养物保持在改良培养基上；而对Navicula pelliculosa而言，将贮存培养物保持在土壤浸出液培养基上(参见实施例1)。对于每种株系而言，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
被甲栅藻
5.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
6.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
Navicula pelliculosa
1.SEM+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
2.SEM+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(在72hr后加入)
将每种株系以5×105细胞/ml的浓度接种至培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。72hr的初期生长后，将1％葡萄糖加至样品#2，使细胞培养另外的24hr。按DCW测量细胞生长(参见实施例12)。结果示于图14(a)和(b)。
实施例16
株系和培养基：原壳小球藻(UTEX 31)贮存培养物维持在改良培
养基(参见实施例1)上。对于每种条件，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
4.
5.+0.5％葡萄糖
6.+0.5％木糖
7.+0.25％葡萄糖+0.25％木糖
将原壳小球藻#4(UTEX 31)以3×105细胞/ml的浓度接种至含有不同糖(葡萄糖或木糖)的培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。生长72hr后，通过对每种培养物的细胞数目进行计数来测量细胞生长。结果示于图15。
实施例17
原壳小球藻株系#1、#3和#4贮存培养物维持在改良培养基(参见实施例1)上。对于每种条件，在24孔板中制备1ml下述不同的培养基。
1.
2.+1％葡萄糖
3.+1％果糖
将每种株系以1×106细胞/ml的浓度接种至含有不同糖(葡萄糖或木糖)的培养基。将培养物放置在暗处，并用Labnet公司(Berkshire，UK)的定轨振摇器以430rpm搅拌。生长96hr后，通过对每种培养物的细胞数目进行计数来测量细胞密度。结果示于图16。
实施例18
小球藻在蔗糖上
将原壳小球藻(UTEX 249)以4×105个细胞/ml的终细胞密度接种到3个含有具有1％蔗糖的培养基(2.94mM NaNO3、0.428mMK2HPO4、1.28mM KH2PO4、0.427mM NaCl、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、蛋白胨1g/L)的50ml烧瓶中。将转化酶(Sigma#14504)以0.01U/ml和0.05U/ml加至这些培养物中的两个。在以150rpm振摇下将所有3个培养物于暗处生长～60hr。在振摇下于暗处～60hr后，对所有3个培养物进行最后的细胞计数。对照烧瓶达到4.4×105个细胞/ml，而0.01U/ml和0.05U/ml烧瓶分别达到1×108和3×108个细胞/ml的细胞密度。在实验结束时通过显微镜分析检查每个烧瓶的污染，所有烧瓶均干净。
实施例19
在糖蜜加蔗糖转化酶上原壳小球藻的生长
用于接种的小球藻细胞的制备：自固体板采集接种物，开始10ml小球藻液体培养。于26℃，使培养物在光照下生长约2天。使用光密度计(OD)在750nm读数且通过测定DCW来测量生长。
糖蜜和糖贮存溶液的制备：如下表6所示，用葡萄糖、蔗糖和三种不同的糖蜜样品(标记为BS1、BS2和HTM)制备5％贮存溶液，所述糖蜜样品是将甘蔗商业加工成糖时获得的。经检验，所有贮存液的pH均在6～6.6的范围内，然后将贮存液均进行高压灭菌。
表6糖蜜和糖溶液
  糖蜜   ％糖   稀释在100ml中的5％糖
  克或ml
  HTM   78.72   6.4
  BS1(FL)   44.25   11.3
  BS2(AU)   51.55   9.7
  蔗糖   100   5
  葡萄糖   100   5
转化酶溶液的制备：通过将1mg 400单位/mg转化酶(Sigma)在10ml蒸馏水中复水，制备40单位/ml转化酶贮存溶液。
实验条件和设置：制备10ml培养物，每个培养物由基础培养基中的1％终浓度糖蜜/糖、0.05单位/ml转化酶和1.0e6个细胞/ml原壳小球藻组成。培养物如下编号：
(1)仅有培养基(对照)；(2)1％HTM；(3)1％BS1；(4)1％BS2；(5)1％葡萄糖和(6)1％蔗糖。还制备了未加入转化酶的类似对照组。在28℃、暗处、以250rpm振摇下使培养物生长5天。
结果：在各自原料上于暗处孵育5天后，评价原壳小球藻细胞的生长。如示于图19-20，细胞可以在蔗糖转化酶的存在下在糖蜜上生长，其产量可与在纯葡萄糖上生长的产量相当。
实施例20
高油和低油生物质的产生
材料和方法：用于转酯的原壳小球藻#1(株系250)生物质在作为固定碳源的葡萄糖的存在下以补料分批发酵形式异养生长，基本上如Appl Microbiol Biotechnol 78：29-36(2008)中所述。在指数生长期间(在60小时时)采取样品“LO-1”，该样品含有与在光合生长下获得的油含量类似的油含量。在培养物中的所有氮均已被消耗且培养物已进入脂质蓄积的稳态阶段后，在115小时时采集样品“080020-1”。
脂质含量：油(转酯前)的总脂质含量通过HPLC分析来确定。将约10mg经干燥的生物质与1ml用KOH饱和的异丙醇混合，并在80℃孵育4小时。自细胞沉淀物提取脂质，并用加热至80℃的异丙醇氢氧化钾溶液进行水解达4小时。使用下述方法用Aglient 1100 HPLC分析提取物样品。用溴代苯甲酰基甲基溴(60mg/ml)将样品衍生化，并将其上样到Luna 5u C8(2)100A 150×2mm柱(Phenomenex)上。使用水到100％乙腈∶四氢呋喃(95∶5)的梯度从柱子中洗脱样品。用DAD阵列检测器在254nm的波长处检测信号。
样品“LO-1”含有8.6％油，而样品“080020-1”含有28％油。
实施例21
微生物生物质的直接转酯
样品制备：将分别包含低油含量和高油含量的生物质湿沉淀物(如上述制备)冷冻干燥。将来自样品的经干燥的生物质磨成粗粉，并在真空下于55℃再次干燥过夜。使用Mettler Toledo Moisture分析仪测定每一个样品的水分百分比，均为＜3％。
转酯：在4倍于生物质体积的螺旋盖玻璃瓶中将无水乙醇/1NNaOH以1∶5的比率加至经干燥的生物质(＜3％水分)。瓶中放入搅拌棒，然后将瓶紧紧密封。将混合物在55℃剧烈搅拌7小时。Whatmann滤纸过滤生物质，用甲醇洗涤直至滤液澄清。将所有洗涤水合并到含有初滤液的球形烧瓶中，使用旋转蒸发仪蒸馏出甲醇。加入氯仿(1份)，充分混合，然后倾到分液漏斗中。然后将甲醇(2份)加至烧瓶中，充分混合，并加至分液漏斗中。将去离子水(0.8体积)加至烧瓶，混合，并加至分液漏斗中。剧烈摇动分液漏斗的内容物(边排气)，使之分层。将下层(氯仿/油)收集到预先称重的烧瓶中，将新鲜氯仿加回到漏斗中进行二次萃取。然后使用旋转蒸发仪蒸馏出氯仿。将烧瓶重新称重，以确定产率。如上所述，通过HPLC再次测定脂质含量。如由Schmid等人，J ofApplied Phycology 7：487-494(1995)所述，使用HPLC方法进行经转酯的组合物的类胡萝卜素成分的分析性测量。通过电感耦合等离子体质谱法(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry)进行元素分析。
结果：表7显示来自低油(LO-1-8.6％脂质)和高油(080020-1-28％脂质)生物质的转酯产物的结果。所有类胡萝卜素均表示为mcg/g含有脂肪酸甲酯的亲脂相。
表7经转酯的低油和高油生物质的组成
实施例22
培养微藻以实现高油含量
培养微藻株系以实现按DCW计高百分比的油。将冷藏保存的细胞在室温解冻，将500μl细胞加至4.5ml培养基(4.2g/L K2HPO4、3.1g/LNaH2PO4、0.24g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L柠檬酸一水化物、0.025g/LCaCl2·2H2O、2g/L酵母提取物)+2％葡萄糖中，在6孔板中在搅拌下(200rpm)于28℃生长7天。通过将1ml培养物在预先称重的Eppendorf管中以14,000rpm离心5分钟，测定DCW。弃去培养物上清液，所得细胞沉淀物用1ml去离子水洗涤。将培养物再次离心，弃去上清液，将细胞沉淀置于-80℃直至冷冻。样品之后被冷冻干燥24hr，计算DCW。为确定培养物中的总脂质，取出3ml培养物，使用Ankom系统(Ankom公司，Macedon，NY)根据生产厂商的方案进行分析。用Amkom XT10提取器根据生产厂商的方案将样品进行溶剂提取。总脂质测定为酸水解的经干燥的样品与溶剂提取的经干燥的样品之间的质量差。油的DCW百分比测量值示于表8。
表8培养微藻以实现高油含量
实施例23
具有高油含量的微藻的基因分型
将来自上文表8所列的23种株系的微藻样品进行基因分型。如下将基因组DNA从藻类生物质中分离。将来自液体培养物的细胞(约200mg)以14,000×g离心5分钟。然后将细胞重悬浮于无菌蒸馏水中，以14,000×g离心5分钟，弃去上清液。将直径为～2mm的单个玻璃球加至生物质，将各管置于-80℃达至少15分钟。移出样品，加入150μl研磨缓冲液(1％肌氨酰、0.25M蔗糖、50mM NaCl、20mM EDTA、100mM Tris-HCl pH 8.0、RNase A 0.5μg/ul)。通过简短涡旋将沉淀重悬浮，然后加入40μl 5M NaCl。将样品简短涡旋，然后加入66μl 5％CTAB(溴化十六烷基三甲基铵)，最后简短涡旋。此后将样品在65℃孵育10分钟，然后以14,000×g离心10分钟。将上清液转移至新管中，用300μl苯酚∶氯仿∶异戊醇12∶12∶1萃取1次，然后以14,000×g离心5分钟。将所得水相转移至含有0.7体积的异丙醇(～190μl)的新管中，倒置混合，在室温孵育30分钟或在4℃过夜。通过以14,000×g离心10分钟回收DNA。然后所得沉淀用70％乙醇洗涤2次，然后用100％乙醇进行最后洗涤。将沉淀在室温空气干燥20-30分钟，然后重悬浮于50μl 10mM TrisCl、1mM EDTA(pH 8.0)中。
将5μl如上文所述制备的藻类总DNA在10mM Tris、pH 8.0中1∶50稀释。如下设置终体积为20μl的PCR反应。10μl 2×iProof HF master混合物(BIO-RAD)加入0.4μl引物SZ02613(5′-TGTTGAAGAATGAGCC GGCGAC-3′(SEQ ID NO：1)以10mM贮存浓度)。该引物序列对应于Gen Bank登录号L43357的位置567-588，其在高等植物和藻类质体基因组中高度保守。之后加入0.4μl引物SZ02615(5′-CAGTGAGCTATTA CGCACTC-3′(SEQ ID NO：2)以10mM贮存浓度)。此引物序列与Gen Bank登录号L43357的位置1112-1093互补，且在高等植物和藻类质体基因组中是高度保守的。接下来，加入5μl经稀释的总DNA和3.2μl dH2O。如下运行PCR反应：98℃、45″；98℃、8″；53℃、12″；72℃、20″进行35个循环，然后在72℃运行1分钟，保持在25℃。为了纯化PCR产物，将20μl 10mMTris pH 8.0加至每个反应，然后用40μl苯酚∶氯仿∶异戊醇12∶12∶1萃取，涡旋，以14,000×g离心5分钟。将PCR反应物加样于S-400柱(GEHealthcare)，以3,000×g离心2分钟。随后将纯化的PCR产物TOPO克隆到PCR8/GW/TOPO中，在LB/Spec板上对阳性克隆进行选择。使用M13正向和反向引物在2个方向对纯化的质粒DNA进行测序。使用Geneious DNA分析软件产生序列比对和无根树，如示于图29a-29i。株系1-23的序列(在实施例22中命名，表8)在后附序列表中列为SEQ ID Nos：7-29。
实施例24
藻类物种中脂质链的多样性
维持各种藻类物种的培养物，并在如上文实施例2中所述的改良培养基中进行所有实验。对于每种株系，在50ml烧瓶中如下建立10ml培养物。
1.没有添加碳的生长培养基
2.具有1％葡萄糖的生长培养基
将每种株系在上述的两种条件下生长，初始接种密度为1.0×106个细胞/ml。将培养物保持在暗处，以250rpm搅拌7天。在7天生长期后收获细胞，通过测量干细胞重量，相对于对照评价在暗处的生长。如下测定DCW：将1ml培养物离心，所得沉淀用水漂洗以去除任何盐或残留培养基，最后将经漂洗的沉淀在-80℃冷冻；在Freeze DrySystem(Labconco，MO，USA)中进行过夜冷冻干燥。下面表9中列出的所有物种于暗处在作为碳源的葡萄糖上生长。没有细胞在缺少葡萄糖(条件1)的情况下生长。如实施例20中所述，测定甘油脂质谱。
表9.各种藻类物种的甘油脂质谱
还使用HPLC分析了来自如实施例22中所述生长且示于表8的部分株系的脂质样品的脂质谱。结果示于图29。
实施例25
高油原壳小球藻生物质的皂化
根据实施例20中所述的方法，生成具有高油含量的生物质，并进行分析。生物质包含45％脂质、20％碳水化合物、10％蛋白质、10％其它细胞成分、10％水和5％盐。在一个实施方案中，所述生物质可以包含经干燥的藻类全细胞，其含有悬浮于部分脱水的细胞质中的脂质小球。
液体细胞皂的制备：将上文经鉴定的生物质分散于水中以形成水包油乳液浓缩物。然后，将足以将期望量的甘油脂质和脂肪酸酯转化为脂肪酸盐的过量KOH溶解于包含生物质的水溶液中。接着将混合物搅拌以促进碱水解反应完全，加热至80～90℃的温度达30分钟～12小时，以完成脂质至脂肪酸盐的转化。在整个反应过程中，如有必要补充因蒸发所损失的水。各种添加剂可以与皂化组合物组合以产生肥皂产品，所述添加剂包括甘油(用于透明和赋予润湿特性)、乙二胺(EDTA，在硬水条件下使用时增强性能的螯合剂)，椰油酰胺丙基甜菜碱(用于赋予清洁和漂洗特性的两性表面活性剂)和芳香剂。在一些实施方案中，所述肥皂产品包含具有如下表10所示的组分的细胞皂。
表10.直接由生物质制成的细胞皂的组分
  组分  量
  生物质(全细胞)  10-60％
  KOH  1-5％
  甘油  5-25％
  芳香剂  1-2％
  EDTA  1-5％
  水  至100％
此实施例中所述的细胞皂包括天然水化和皮肤软化的特性(这是由存在的来自藻类细胞的碳水化合物和蛋白质所赋予的)，和抗氧化性质(源自组合物中掺入的藻类类胡萝卜素和其它化合物)。
或者，有机碱例如三乙醇胺可以用于碱水解反应以产生更透明的产物。使用三乙醇胺或另一种有机碱通常也将生成更温和的产品，当其用作清洁剂时更不易刺激皮肤。
任选地，可通过加入NaCl或KCl盐使脂肪酸盐从混合物中沉淀，分离后与本文所述的各种添加剂组合用于组合物中。
图20显示用具有48％DCW的油的原壳小球藻生物质制得的皂的显微照片。该皂含有10％w/w藻类生物质。
实施例26
来自原壳小球藻生物质的己烷-提取油的皂化
根据实施例20中所述的方法产生生物质。进行脂质从生物质中的常规己烷提取。然后，通过将脂质与含有足以将期望量的脂质转化为脂肪酸盐的碱量的NaOH或KOH水溶液混合、任选地加热混合物以加速反应，以皂化己烷提取的脂质。然后通过加入NaCl或KCl，沉淀脂肪酸盐。源自己烷提取的生物质的皂化油的组合物包含更高比例的污染性类胡萝卜素，这是由于用己烷从微生物生物质中提取此类化合物的效率引起的。
实施例27
来自原壳小球藻生物质的无溶剂提取油的皂化
根据实施例20中所述的方法产生生物质。通过裂解并经由使用物理压力挤压生物质，从生物质中无溶剂提取脂质。然后，通过将脂质与含有足以将所需量的脂质转化为脂肪酸盐的碱量的NaOH或KOH水溶液混合、任选加热混合物以加速反应，从而皂化所提取的脂质。然后通过加入NaCl或KCl来沉淀脂肪酸盐。与己烷提取的脂质相比，源自无溶剂提取的生物质的皂化油的组合物包含相对较低比例的污染性类胡萝卜素，这是由于使用无溶剂操作从微生物生物质中提取此类化合物的效率降低引起的。
实施例28
无绿藻属株系的甘油脂质谱
在具有2％葡萄糖的培养基中培养5种无绿藻属株系，在6孔板中在搅拌下(200rpm)于28℃生长7天。使用标准HPLC方法，确定脂质谱。当在不同的培养基中生长时，特定株系的脂质谱不发生明显变化。结果示于下表11。
表11.无绿藻属株系的甘油脂质谱
对来自UTEX 1435的生物质进行己烷提取。提取的油含有极少的颜色。图19显示，与来自原壳小球藻UTEX 250的油相比，UTEX 1435油的样品。
实施例29
从Prototheca moriformis UTEX 1435中提取的油的类胡萝卜素和 叶绿素分析
来自Prototheca moriformis(UTEX 1435)生物质的己烷提取油，根据上文实施例26中所述的方法产生，并使用HPLC分析类胡萝卜素和叶绿素。总的来说，该类胡萝卜素水平比上表7中所示的油中类胡萝卜素水平低得多。此外，油的叶绿素含量少于0.01mg/kg。这结果与图19中所示的结果相一致，其中来自UTEX 1435生物质的提取油具有极少的颜色。从UTEX 1435生物质中提取的油的类胡萝卜素和叶绿素分析总结于下表12中。
表12.从Prototheca moriformis UTEX 1435中提取的油的类胡萝卜素分析
  叶黄素   0.382mcg/g
  玉米黄质   1.23mcg/g
  顺式-叶黄素/玉米黄质   0.446mcg/g
  α-隐黄素   未测出
  β-隐黄素   未测出
  番茄红素   未测出
  α-胡萝卜素   0.057mcg/g
  β-胡萝卜素   0.127mcg/g
  顺式-β-胡萝卜素   0.069mcg/g
  六氢番茄红素   0.696mcg/g
  八氢番茄红素   0.689mcg/g
  总的鉴定的类胡萝卜素   3.70mcg/g
  叶绿素   ＜0.01mg/g
实施例30
来自原壳小球藻的8种株系的23S rRNA的基因组DNA分析
根据上文实施例23中所述的方法，自原壳小球藻的8种株系(UTEX 25、UTEX 249、UTEX 250、UTEX 256、UTEX 264、UTEX 411、CCAP 211/17和CCAP 211/8d)分离基因组DNA，进行23S rRNA的基因组DNA分析。
除UTEX 25之外，所测试的所有原壳小球藻株系的序列具有同一性。结果总结于图21a-21c所示的分支图中。所有8种株系的序列在后附序列表中列为SEQ ID Nos：3-4。
还将Prototheca moriformis UTEX 1436(SEQ ID NO：5)的23srRNA基因组序列与其它无绿藻属物种和原壳小球藻进行了比较。这种比较显示，Prototheca moriformis UTEX 1436的23s rRNA基因组序列与其它无绿藻属基因型(SEQ ID NO：6)不同。
实施例31
高粱利用筛选
株系：下述株系用于筛选中以鉴定能够利用高粱作为唯一碳源的微藻株：10个株系是原壳小球藻(UTEX 25、UTEX 31、UTEX 411、CCAP221/8D、UTEX 249、UTEX 250、UTEX 256、UTEX 264、SAG 211-10D和CCAP 211/17)。6个株系是Prototheca moriformis(UTEX 1435、UTEX 1437、UTEX 288、UTEX 1439、UTEX 1441和UTEX 1434)。其它株系包括Chlorella luteoviridis(UTEX 22和SAG 2214)、Chlorellakessleri(UTEX 2229)、Parachlorella kessleri(SAG 12.80)和Protothecastagnora(UTEX 1442)。
培养条件：在24孔板中以1ml液体培养物开始微藻株(上文确定的)的种子培养物，在光照下以～350rpm搅拌自养生长48小时。纯高粱购自Maasdam Sorghum Mills(Lynnville，Iowa)，其具有下述糖谱：果糖21.0％w/w、葡萄糖28.0％w/w、蔗糖16.0％w/w和麦芽糖＜0.5％w/w。然后将培养物转移至含有2％、5％或7％(v/v)纯高粱(由纯贮存液稀释)作为唯一碳源的液体培养基，接着将培养物在以～350rpm搅拌下于暗处异养生长。在24、40、48、67和89小时时自培养物取样，使用分光光度计上的A750读数度量生长。观察了所测试的每一株系的生长，如图22-27所示。

Claims (38)

1.化学修饰含脂质的微生物生物质的方法，其包括： 
(a)培养微藻群体，其中所述微藻为无绿藻属微藻； 
(b)收获微藻生物质，其中所述生物质含有按干细胞重量计至少5％的微藻脂质以及不超过500ppm的产生颜色的杂质；和 
(c)对所述生物质进行化学反应，其中该反应导致共价修饰至少1％的微藻脂质，以产生修饰的脂质，其中所述化学反应选自转酯、酯交换、羟基化、环丙烷基化、环氧化、加氢处理、脱氧、异构化、皂化和水解中的一种或多种。 
2.权利要求1的方法，其中所述加氢处理为氢化。 
3.权利要求1的方法，其还包括将共价修饰的脂质与所述生物质的其它组分分离。 
4.权利要求1的方法，其中在化学反应前不对收获的生物质进行除了去除水或裂解之外的处理。 
5.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括将所述生物质转酯以产生含有脂肪酸烷基酯的亲脂相和含有细胞物质与甘油的亲水相。 
6.权利要求1的方法，其还包括在使所述生物质进行化学反应之前从所述生物质中去除水。 
7.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括将所述生物质与酶接触以催化化学反应。 
8.权利要求1的方法，其中微藻脂质或修饰的脂质为 
至少10％的C14或更短链长的脂质。 
9.权利要求1的方法，其中微藻脂质或修饰的脂质为 
至少10％的C16脂质。 
10.权利要求1的方法，其中微藻脂质或修饰的脂质为 
至少10％的C18脂质。 
11.权利要求1的方法，其中微藻脂质或修饰的脂质为 
至少50％的饱和脂肪酸成分。 
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中微藻选自威氏无绿藻(Prototheca wickerhamii)、Prototheca stagnora、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis和左氏无绿藻(Prototheca zopfii)。 
13.权利要求12的方法，其中微藻是Prototheca moriformis。 
14.权利要求5的方法，其还包括在进行生物质转酯之前破碎生物质。 
15.权利要求1的方法，其中步骤(c)选自以下步骤：将生物质氢化以至少部分地饱和脂质中的不饱和键；对生物质进行酯交换以产生相对于所收获的生物质中的脂质具有改变的脂肪酸成分配置的甘油脂质的混合物；将生物质羟基化以产生羟基化的脂质；将至少一部分羟基化的脂质酯化以产生交内酯；将生物质水解以从脂质产生游离脂肪酸。 
16.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括将生物质皂化以自脂质产生脂肪酸盐。 
17.制备皂的方法，其包括： 
(a)提供微藻生物质，其中所述生物质来自无绿藻属微藻，且含有按DCW计至少5％的微藻脂质，其中所述生物质包括甘油脂质或脂肪酸酯，和不超过500ppm的产生颜色的杂质；和 
(b)对所述生物质进行碱水解反应以将至少一部分的甘油脂质或脂肪酸酯化学转化为脂肪酸盐而产生皂。 
18.权利要求17的方法，其还包括将脂肪酸盐与生物质的其它组分基本上分离。 
19.权利要求17的方法，其中微藻脂质为 
至少10％的C14或更短链长的脂质。 
20.权利要求17的方法，其中微藻脂质为 
至少10％的C16脂质。 
21.权利要求17的方法，其中微藻脂质为 
至少10％的C18脂质。 
22.权利要求17的方法，其中微藻脂质为至少50％的饱和脂肪酸成分。 
23.权利要求17至22之任一项的方法，其中微藻选自：威氏无绿藻(Prototheca wickerhamii)、Prototheca stagnora、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis和左氏无绿藻(Prototheca zopfii)。 
24.权利要求23的方法，其中微藻是Prototheca moriformis。 
25.组合物，其包含皂化油，所述皂化油来自通过培养无绿藻属微藻群体所产生的微藻生物质的碱水解，其中所述生物质包含不超过500 ppm产生颜色的杂质。 
26.权利要求25的组合物，其中所述组合物还包括至少一种选自下列的油：大豆油、油菜籽油、芸苔油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、玉米油、废植物油、乌桕油、橄榄油、向日葵油、棉籽油、鸡脂肪油、牛脂油、猪脂油、微藻油、大型藻油、萼距花油、亚麻油、花生油、精选白脂膏、猪油、荠蓝籽油、芥末籽油、腰果油、燕麦油、羽扇豆油、洋麻油、金盏花油、大麻油、咖啡油、亚麻籽油、榛果油、大戟属植物油、南瓜籽油、芫荽油、茶油、芝麻油、红花油、稻米油、油桐油、可可油、椰子干油、椰子干油、罌粟油、蓖麻子油、山核桃油、霍霍巴油、麻风树油、澳洲坚果油、巴西坚果油、鳄梨油、化石油或其蒸馏级分。 
27.权利要求25的组合物，其中微藻选自：威氏无绿藻(Prototheca wickerhamii)、Prototheca stagnora、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis和左氏无绿藻(Prototheca zopfii)。 
28.权利要求27的组合物，其中微藻是Prototheca moriformis。 
29.权利要求25的组合物，其中源自生物质的组分构成组合物总质量的至少50％。 
30.权利要求25的组合物，其包含少于50微克类胡萝卜素每克皂化油。 
31.权利要求25的组合物，其中所述皂化油是自脂肪酸酯皂化的，所述脂肪酸酯包含至少10％的C16脂质。 
32.权利要求25的组合物，其中所述皂化油是自脂肪酸酯皂化的，所述脂肪酸酯包含至少10％的C14或更短链长的脂质。 
33.权利要求25的组合物，其中所述皂化油是自脂肪酸酯皂化的，所述脂肪酸酯包含至少10％的C18脂质。 
34.权利要求25的组合物，其中所述皂化油是自脂肪酸酯皂化的，所述脂肪酸酯包含至少50％的饱和脂肪酸成分。 
35.权利要求31-34之任一项的组合物，其中脂肪酸酯是三酰基甘油。 
36.权利要求25的组合物，其包含少于0.1mg/kg的叶绿素。 
37.权利要求25的组合物，其是皂。 
38.权利要求37的组合物，其中皂包含微藻生物质。 
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