KR101607235B1 - 미생물 바이오매스 및 미생물 오일의 직접적인 화학적 개질 - Google Patents

Abstract

오일-함유 미생물 바이오매스로부터 당지질 및 지방산 에스테르를 지방산 염으로 알칼리성 가수분해함으로서 비누 및 화장품을 제작할 수 있다. 비누화된 오일은 다양한 첨가제와 결합되어 화장품으로서 사용하기 위한 조성물을 생산할 수 있고 이는 또한 다른 것 중에서도 비-비누화된 오일, 글리세롤 및 카로테노이드를 포함하는, 또 다른 바이오매스 구성성분을 포함할 수 있다.

Description

미생물 바이오매스 및 미생물 오일의 직접적인 화학적 개질{DIRECT CHEMICAL MODIFICATION OF MICROBIAL BIOMASS AND MICROBIAL OILS}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 정규 출원(nonprovisional)이며, 모든 목적을 위해 전체로서 본원에 참조로서 포함된, 2008년 4월 9일 출원된, 제 61/043,620호 및 2008년 6월 20일에 출원된 제 61/074610호에 우선권을 주장한다.

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 본원에 첨부된, 1-12 페이지에서 도시된 바와 같은 서열 목록을 포함한다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 유전 공학, 양식업, 및 지질-함유 미생물 바이오매스의 화학적 개질에 귀속된다.

세계 경제에 의한 에너지에 대한 증가된 요구는 화석 연료의 소비에 증가된 압력을 가하였다. 공기 오염의 감소에 관심이 증가함에 따라, 국내 에너지 공급의 개발이 박차를 가하였고, 내부 연소 엔진을 위한 비-석유 연료의 개발이 시작되었다. 압축 점화 (디젤) 엔진의 경우, 지방산의 단순한 알코올 에스테르(바이오디젤)가 대체 디젤 연로로서 용인될 수 있음이 밝혀졌다. 바이오디젤은 화석연료에서 유래된 디젤보다 산소 함량이 더 높고, 따라서 미립자 물질, 탄화수소, 및 일산화탄소의 방출을 감소시키는 반면, 저 황 함량 때문에 황 방출도 감소시킨다(Sheehan, J, et al, Life Cycle Inventory of Biodiesel and Petroleum Diesel for Use in an Urban Bus, National Renewable Energy Laboratory, Report NREL/SR-580-24089, Golden, Colo (1998), Graboski, M S, and R L McCormick, Prog Energy Combust Sa, 24 125-164 (1998)).

바이오디젤의 생산, 테스팅, 및 용도에 초기에 노력은 연소 합성을 위한 원료로서, 정제된 식용 식물성 오일(오일종자의 용매 추출에 의해 배출됨 또는 회수됨) 및 동물성 지방(예를 들어, 우지)을 사용하였다(예를 들어, 문헌[Krawczyk, T, INFORM, 7 800-815(1996), 및 Peterson, C L, et al, Applied Engineering in Agriculture, 13 71-79(1997)] 참조). 상기 방법의 추가적 정제는 더 싸고, 덜 높게 정제된 지질 원료, 예컨대, 사용한 식당 기름 및 콩 솝스톡(soybean soapstock)으로부터 지방산 메틸 에스테르(FAME)의 생산을 가능케 하였다(예를 들어, 문헌[Mittelbach, M, and P Tritthart, J Am Oil Chem Soc, 65(7) 1185-1187 (1988), Graboski, M S, et al, The Effect of Biodiesel Composition on Engine Emissions from a DDC Series 60 Diesel Engine, Final Report to USDOE/National Renewable Energy Laboratory, Contract No ACG-8-17106-02 (2000)] 참조).

수십년 동안, 조류의 광독립영약적(photoautotrophic) 성장은 조류로부터 바이오디젤의 흥미로운 제조 방법으로서 제안되어 왔다(문헌[A Look Back at the U S Department of Energy's Aquatic Species Program Biodiesel from Algae, NREL/TP 580 24190, John Sheehan, Tern Dunahay, John Benemann and Paul Roessler(1998)] 참조). 많은 연구자들은, 햇빛은 "무료" 자원이므로, 바이오연료 생산을 위한 원료로서, 조류의 광독립영양적 성장이 미세조류의 배양의 가장 요망되는 방법으로 믿는다(예를 들어, 문헌[Chisti, Biotechnol Adv 2007 May-Jun,25(3) 294-306 "heterotrophic production is not as efficient as using photosynthetic microalgae because the renewable organic carbon sources required for growing heterotrophic microorganisms are produced ultimately by photosynthesis, usually in crop plants"] 참조). 다른 연구는 광독립영양적 성장이 미세조류를 바이오연료로 성장시키는 가장 최고의 방법으로 가정하였을 뿐만 아니라, 디젤 엔진으로 도입하기 전, 미세 조류 바이오매스로부터 임의의 물질을 트랜스에스테르화시킬 필요가 없음을 가정하였다(문헌[Screagg et al, Enzyme and Microbial Technology, Vol 33 7, 2003, Pages 884-889] 참조).

광합성적 성장 방법은 지난 수십년 동안 상당한 연구의 초점이었으며, 1978에서 1996년에 이르기까지의 기간 동안, 조류로부터 재생가능한 수송 연료를 개발하기 위한 프로그램에 기금을 제공한, 연료 개발 에너지 오피스 미국 부서[US Department of Energy's Office of Fuels Development]에 의해 일부 박차가 가해졌다. 주요 생산 설계는 폐 CO₂(예를 들어, 전기 발생 공장의 동력이 된 화석 연료)의 소스에 근접하여 조류, 물 및 영양분이 원형 연못 주변에서 순환되는, "레이스웨이(raceway)"로 지정된 연속의 얕은 야외 햇빛-중심 연못(shallow outdoor sunlight-driven ponds) 주변에서 중점적으로 이뤄졌다.

추출된/정제된 식물성 오일의 트랜스에스테르화는 종래에는 촉매(예를 들어, 강산 또는 강 염기)의 존재 하에 저-알킬 알코올(예를 들어, 메탄올)과 트리아실글리세롤("TAG")를 반응시켜 수행되어, 지방산 알킬 에스테르(예를 들어, 지방산 메틸 에스테르 또는 "FAME") 및 글리세롤을 산출시킨다.

상기 기술되었듯이, 전통적인 바이오디젤 생산은 트랜스에스테르화 과정을 위한 원료로서, 추출된 및/또는 정제된 오일(오일종자의 용매 추출에 의해 방출되거나 회수됨)에 의존해 왔다. 콩, 야자, 코코넛 및 카놀라를 포함하는 오일 소스가 일반적으로 사용되며, 추출은 식물성 물질을 건조시키고 상기 물질을 전처리(예를 들어, 플랭킹(flaking))하여, 용매, 예컨대 헥산에 의해 식물성 구조의 침투가 용이하게 함으로서 수행된다. 출발 물질로서 사용하기 위한 이러한 오일들의 추출은 전통적인 바이오디젤 생산 비용에 상당히 기여한다.

건조된 식물성 물질로부터 오일을 추출하는데 이용되는 용매 추출 과정과 유사하게, 미생물 바이오매스로부터 오일의 용매 추출이 유기 용매의 존재 하에 획득된다. 본문 중의 용매 추출은 본질적으로 물, 예컨대 헥산에 혼합되지 않아 용매 상(오일은 가용성이며, 수성 상은 주로 바이오매스의 비-지질 부분을 보유함)을 형성하는, 용매의 이용을 필요로 한다. 불행하게도, 산업적 규모 생산에서는, 효과적인 추출을 위해 사용되어야 하는 잠재적으로 발암성인 휘발성 물질, 가연성 유기 용매의 양은 환경적 측면 및 작업자의 안정성 측면 둘 모두를 지니는 위험한 작업 조건을 발생시킨다. 더욱이, 용매 추출 과정은 적절한 처분을 필요로 하는 상당한 용매 폐기물 스트림(waste stream)을 생성함으로서, 전반적인 생산 비용을 증가시킨다.

대안적으로, "무용매(solventless)" 추출 과정이 보고되었고; 이는 바이오디젤 생산을 위한 트랜스에스테르화 과정에서 원료로서 이용되기 위한 미생물로부터 지질을 추출하기 위해, 약 5% 이하의 유기 용매를 포함하는 수성 용매를 이용한다. 간략히, "무용매" 추출 과정은 용해된 세포 혼합물과 약 5% 이하의 유기 용매를 포함하는 수성 용매(예를 들어, 헥산)을 혼합하여, 상 분리 혼합물을 생성하는 것을 포함한다. 상기 혼합물은 더 무거운 수성 층과 유화된 지질을 포함하는 더 가벼운 층을 포함한다. 상기 추출 과정은 더 가벼운 지질 층에서 비-유화된 지질 층이 획득될 때까지 반복적으로 수행된다. 불행하게도, 지질 층의 세척 및 반복된 분리는 "무용매" 과정을 특히나 번거롭게 만든다.

미생물로부터 생산된 지질에서 유래된 가치있는 생체분자를 추출하기 위한 더욱 값싸고, 효과적인 방법에 대한 필요성이 여전히 남아있다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시킨다.

제 1 양태에서, 본 발명은 지질-함유 미생물 바이오매스의 직접적인 화학적 개질이 효율성을 급격히 증가시키고, 이러한 지질로부터 유래한 가치있는 물질을 획득하는 비용을 감소시킨다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 제 1 구체예에서, 본 발명은 화학적으로 지질-함유 미생물 바이오매스를 개질시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 미생물 집단을 배양하는 단계, 건조 세포 중량(DCW) 기준으로 적어도 5% 지질을 포함하는 미생물 바이오매스를 수확하는 단계, 상기 바이오매스에 1% 이상의 지질을 공유결합적으로(covalently) 개질시키는 화학적 반응을 적용하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 공유결합적으로 개질된 지질을 바이오매스의 다른 구성성분으로부터 분리하는 단계를 추가적으로 포함한다.

다양한 구체예에서, 공유결합적으로 개질된 지질 대 그것이 분리된 바이오매스의 비는 건조 중량 기준으로 10% 지질과 90% 바이오매스 및 90% 바이오매스와 10% 지질 사이이다. 일부 구체예에서, 바이오매스의 다른 구성성분에서 지질을 분리시키는 단계는, 공유결합적으로 개질된 지질이 더 가벼운 비-수성 층을 형성하고, 바이오매스의 구성성분이 하나 이상의 더 무거운 상을 형성하는 상 분리 단계를 포함한다. 일부 구체예에서는, 지질 대 비-지질 물질의 비를 50 중량 % 초과까지 증가시키는 사전 농축(prior enrichment)단계 없이, 바이오매스에 화학적 반응을 적용시킨다. 다른 구체예에서는, 지질 대 미생물의 건조 중량의 비를 증가시키는, 사전 농축 단계와 함께, 바이오매스에 화학적 반응을 적용시킨다. 일부 구체예에서, 수확된 바이오매스는 화학적 반응 전, 물을 제거시키고/시키거나 세포를 용해시키는 것 이외의 임의의 처리를 하지 않는다. 일부 구체예에서는, 화학적 반응이 적용된 바이오매스는 세포 배양과 같은 동일한 상대적 비율로 물 이외의 구성성분을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이오매스의 지질 함량은 화학적 반응이 적용된 바이오매스의 90% 미만이다.

제 1 구체예에서, 지질-함유 미생물 바이오매스의 화학적 개질은 바이오매스를 트랜스에스테르화하여, 지방산 알킬 에스테르를 함유하는 친유성 상 및 세포 물질 및 글리세롤을 함유하는 친수성 상을 생성시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 바이오매스에 트랜스에스테르화 화학적 반응을 적용하기 이전에, 바이오매스로부터 물을 제거하는 것을 추가적으로 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 바이오매스의 분해(disrupting) 후, 바이오매스로부터 물을 제거하는 것을 추가적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 바이오매스로부터 물을 제거하는 것은, 상기 바이오매스에 동결건조, 드럼 건조 및 오븐 건조로 이루어진 군에서 선택된 방법을 이용하여 수행된다.

지질-함유 미생물 바이오매스의 화학적 개질이 바이오매스를 트랜스에스테르화하는 것을 포함하는 일부 구체예에서, 상기 방법은 바이오매스를 트랜스에스테르화시키기 이전에, 바이오매스를 분해시키는 것을 추가적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 바이오매스를 분해하기 이전에, 바이오매스로부터 물이 제거된다. 일부 구체예에서, 바이오매스를 분해하는 것은, 바이오매스를 가열하여 용해물을 생성시키는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 바이오매스를 분해하는 것은, 바이오매스를 용해물을 생성하기에 충분한 산 또는 염기와 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 바이오매스를 분해하는 것은, 바이오매스와 하나 이상의 효소를 접촉시켜 용해물을 생성시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이오매스를 하나 이상의 프로테아제 및 하나 이상의 다당류-분해 효소와 접촉시킨다. 일부 구체예에서, 바이오매스를 분해하는 것은, 미생물 집단을 기계적으로 용해시켜, 용해물을 생성시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 바이오매스를 분해하는 것은, 바이오매스에 삼투압 충격을 가해 용해물을 생성시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 바이오매스를 분해하는 것은, 미생물 집단을 용해성 바이러스로 감염시켜 용해물을 생성시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 바이오매스를 분해하는 것은, 미생물 집단 내에 용해성 유전자의 발현을 유도하여, 자가용해 및 용해성 물질의 생성을 촉진시키는 것을 포함한다.

화학적 반응이 트랜스에스테르화를 포함하는, 화학적 개질 방법의 일부 구체예에서, 지방산 알킬 에스테르는 지방산 메틸 에스테르 또는 지방산 에틸 에스테르이다. 일부 구체예에서, 바이오매스를 트랜스에스테르화시키는 것은 바이오매스와 알코올 및 염기를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 염기는 NaOH, KOH, 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 알코올은 메탄올이고, 염기는 NaOH이다. 일부 구체예에서, 바이오매스를 트랜스에스테르화시키는 것은 바이오매스와 알코올 및 리파아제를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 리파아제는 미생물 집합 내에서 외인성 리파아제 유전자로부터 발현된다. 일부 구체예에서, 외인성 리파아제 유전자의 발현은 외인성 리파아제 유전자의 발현을 조절하는 유도성 프로모터를 활성화시키기 위해,바이오매스와 자극(stimulus)을 접촉시킴으로서 유도된다.

다양한 구체예에서, 친유성 상 내의 중량 기준으로, 취합된 칼슘 및 마그네슘의 양은 5 ppm(5 parts per million) 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상 중 인의 양은 질량 기준으로 0.001 % 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상 중 황의 양은 15 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상 내의 중량 기준으로, 취합된, 포타슘 및 소듐의 양은 5 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상 중 총 카로테노이드 함량은 그램 당 100 마이크로그램 이하의 카로테노이드이다. 일부 구체예에서, 친유성 상 중 총 엽록소 함량은 0.1 mg/kg 이하이다.

일부 구체예에서, 바이오매스에 화학적 반응을 적용시키는 것은, 바이오매스를 효소와 접촉시켜, 화학적 반응을 촉진시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 효소는 리파아제이다. 제 1 구체예에서, 상기 반응은 바이오매스의 친수성 세포 물질로부터 공유결합적으로 개질된 지질을 함유하는 친유성 상을 분리시키는 것을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 다양한 구체예에서, 미생물 및 결과물 미생물 바이오매스는 박테리아, 시아노박테리아, 진핵 미세조류, 유질성 효모, 및 진균으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 미생물은 표 1에 나열된 진행생물 미세 조류로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 미생물은 클로렐라(Chlorella) 속의 종이며, 다양한 구체예에서, 상기 종은 클로렐라 푸스카(Chlorella fusca), 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 케슬러리(Chlorella kessleri), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 사카로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 및 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)로 이루어진 군에서 선택된다. 제 1 구체예에서, 상기 종은 클로렐라 프로토테코이드이다. 일부 구체예에서, 상기 미생물은 프로토테카(Prototheca ) 속의 종이거나, 상기 종은 프로토테카 위커하미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리폴미스(Prototheca monformis) 및 프로토테카 좁피(Prototheca zopfii)로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 미생물은 표 2에 나열된 유질성 효모로 이루어진 군에서 선택되며, 또 다른 구체예에서, 미생물은 표 3에 나열된 진균으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 미생물 바이오매스는 별개로 배양되어진 두개의 구별되는 균주 또는 종에서 온 바이오 매스 혼합물을 포함한다. 제 1 구체예에서, 미생물의 두개 이상의 구별되는 균주 또는 종은 상이한 당지질(glycerolipid) 프로파일을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 종은 클로렐라 속 또는 프로토테카 속의 멤버와 높은 정도의 분류학적 유사성, 예컨대, 실시예에서 기재된 바와 같이, 23S rRNA 수준에서 95% 이상의 뉴클레오티드 상동성을 갖는다.

본 발명의 다양한 구체예에서, 수확된 바이오매스는 DCW로 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상의 지질 함량을 포함한다. 일부 구체예에서, 20% 이상의 지질은 C18이다. 일부 구체예에서, 30% 이상의 지질은 C18이다. 일부 구체예에서, 40% 이상의 지질은 C18이다. 일부 구체예에서, 50% 이상의 지질은 C18이다. 일부 구체예에서, 50% 이상의 지질은 C16이거나, 더 긴 쇄 길이이다. 일부 구체예에서, 10% 이상의 지질은 C14이거나, 더 짧은 쇄 길이이다. 일부 구체예에서, 20% 이상의 지질은 C14이거나, 더 짧은 쇄 길이이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 미생물 집단은 외인성 자당 이용 유전자를 발현한다. 일부 구체예에서, 미생물 집단은 외인성 지질 경로의 효소를 발현한다. 일부 구체예에서, 상기 지질 경로의 효소는 아실-ACP 티오에스테라제(thioesterase)를 포함한다. 일부 구체예에서, 미생물 집단은 아실-ACP 티오에스테라제를 이용해 공동-발현되는, 외인성 "자연적으로 공동-발현된" 아실 운반 단백질(Acyl carrier protein)을 추가적으로 발현시킨다. 일부 구체예에서, 상기 지질 경로의 효소는 쇄 안에 특정된 탄소 원자의 수를 지니는 기질에 작용하기 위한 특이성을 지닌다.

일부 구체예에서, 지질-함유 미생물 바이오매스의 화학적 개질은 바이오매스를 수소화하여, 지질 내에 불포화된 결합의 적어도 한부분을 포화시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 지질-함유 미생물 바이오매스의 화학적 개질은 바이오매스를 인터에스테르화(interesterifying)시켜, 수확된 바이오매스 중에 당지질에 대하여 지방산 구성의 개질된 정렬을 지니는 당지질 혼합물을 생성하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 지질-함유 미생물 바이오매스의 화학적 개질은 바이오매스를 수산화시켜 수산화된 지질을 생성시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 수산화된 지질의 적어도 한 부분은 에스테르화되어 에스토리드(estolide)를 생성한다. 일부 구체예에서, 지질-함유 미생물 바이오매스의 화학적 개질은 바이오매스를 가수분해하여, 지질로부터 유리 지방산을 생성시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 유리 지방산은 추가적으로 화학적 개질된다. 제 1 구체예에서, 지질-함유 미생물 바이오매스의 화학적 개질은 수소 및 촉매의 존재하에 증가된 온도에서의 탈산소화 및 수소 및 촉매의 존재 및 가스 및 나프타 화합물의 제거하에 이성질화(isomerization)를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 지질-함유 미생물 바이오매스의 화학적 개질은 바이오매스를 비누화하여, 지질로부터 지방산 염을 생성시키는 것을 포함한다. 제 1 구체예에서, 바이오매스는 프로토테카 속의 미세 조류로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 바이오매스를 비누화하는 것은 지질의 당지질 및/또는 지방산 에스테르 구성성분의 적어도 한 부분을 지방산염으로 변환시키기에 충분한 염기와 바이오매스를 접촉하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 염기는 알칼리 금속 수산화물, 예컨대, NaOH 또는 KOH이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 바이오매스와 염을 접촉하여, 용액으로부터 지방산 염을 침전시키는 것을 추가적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 염은 수용성 알칼리 금속 할라이드, 예컨대 NaCl 또는 KCl을 포함한다.

일부 구체예에서, 미생물의 두개의 구별가능한 균주 또는 종은 개별적으로 배양되며, 두 배양에서 유래된 바이오매스를 혼합한 후, 상기 바이오매스에 1% 이상의 지질을 개질시키는 화학적 반응을 적용시킨다. 일부 구체예에서, 미생물의 두개 이상의 구별 가능한 균주는 상이한 당지질 프로파일을 갖는다.

제 1 양태에서, 본 발명은 비누를 만들기 위한 비누화 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 미생물 집단을 배양하는 단계, DCW로 5% 이상의 지질을 포함하는(당지질 또는 지방산 에스테르 포함) 미생물 바이오매스를 수확하는 단계, 바이오매스를 알칼리성 가수분해 반응시켜 당지질 또는 지방산 에스테르의 한 부분 이상을 지방산 염으로 화학적 변환시켜 비누를 생산하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 알칼리성 가수분해 반응은 바이오매스를 염기와 접촉시키고, 선택적으로 상기 바이오매스를 가열하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 염기는 알칼리 금속 수산화물, 예컨대, NaOH 또는 KOH이다. 일부 구체예에서, 바이오매스 중에서 100% 미만의 당지질 및 지방산 에스테르는 지방산 염으로 변환된다. 일부 구체예에서, 바이오매스 중 1% 미만의 당지질 및 지방산 에스테르는 지방산 염으로 변환된다.

비누화 방법의 일부 구체예에서, 상기 방법은 바이오매스의 다른 구성성분으로부터 지방산 염을 실질적으로 분리시키는 것을 추가적으로 포함한다. 본 발명의 일부 방법은 분리된 지방산 염을 물에서 끓이고, 염을 수성 용액에 도입시킴으로서 지방산 염을 재-침전시켜, 정제된 비누를 생산하는 것을 추가적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 염은 수용성 알칼리 금속 할라이드, 예컨대 NaCl 또는 KCl이다.

본 발명의 일부 비누화 방법은 정제된 비누 또는 비누화된 오일 구성성분과 에센셜 오일, 향료 오일(fragrance oils), 플레이버 오일(flavor oils), 보타니칼(botanicals), 추출물, CO₂ 추출물, 점토, 색소, 이산화 티타늄, 운모, 틴팅 허브(tinting herbs), 그리터(glitters), 엑스폴리안트(exfoliants), 과일 씨앗, 섬유, 곡물 파우더, 너트 밀, 종자 밀, 오일 비드, 왁스 비드, 허브, 히드로졸, 비타민, 밀크 파우더, 보존제, 항산화제, 토코페롤, 염, 당류, 식물성 오일, 왁스, 글리세린, 해조류, 영양 오일, 보습 오일, 식물성 버터, 프로필렌 글리콜, 파라벤, 꿀, 꿀벌 왁스, 알로에, 폴리솔베이트, 옥수수전분, 코코아 파우더, 산호 파우더, 습윤제(humectants), 검, 유화제 및 증점제로 이루어진 군에서 선택된, 하나 이상의 첨가제(additives)를 혼합하는 것을 추가적으로 구성한다. 제 1 구체예에서, 상기 혼합물은 화장품으로 패키지된다. 또 다른 구체예에서, 화장품은 페이셜 클린저를 포함한다.

비누화 방법의 일부 구체예에서, 지방산 염 대 이것이 분리된 바이오매스의 비는 건조 중량 기준으로, 10% 지방산 염 대 90% 바이오매스 및 90% 지방산 염 대 10% 바이오매스 사이이다. 일부 방법에서, 바이오매스 내에서 지질 대 비-지질 물질의 비를 50 중량 % 초과로 증가시키는 사전 농축단계 없이, 상기 바이오매스에 알칼리성 가수분해 반응을 시킨다. 일부 방법에서, 수확된 바이오매스는 알칼리성 가수분해 반응 전에, 용해 이외의 처리를 하지 않는다. 다른 방법에서, 상기 바이오매스는 바이오매스 중 지질 대 비-지질 물질의 비를 수확 단계에서의 비에 비해 증가시키는 사전 농축단계와 함께 알칼리성 가수분해 반응이 적용된다. 일부 구체예에서, 알칼리성 가수분해 반응이 적용된 바이오매스는 수확단계에서의 바이오매스와 같이 동일한 상대적 비율로 물 이외의 구성성분을 포함한다. 일부 구체예에서, 지질은 알칼리성 가수분해 반응이 적용된 바이오매스의 90% 이하를 포함한다.

비누화 방법의 일부 구체예에서, 수확된 바이오매스는 DCW로 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상의 지질 함량을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 지질은 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95%이상의 포화된 지방산 구성성분을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 비누화 방법은 바이오매스에 알칼리성 가수분해 반응을 적용하기 전, 바이오매스를 분해하는 단계를 추가적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 바이오매스를 분해하는 것은, 미생물 집단을 기계적으로 용해하여, 용해물을 생성하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 오일은 비누화 전에 바이오매스로부터 추출된다. 일부 구체예에서, 추출된 오일은 실질적으로 무색상 또는 무색소이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 지방산 알킬 에스테르를 함유하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 함유하는 하나이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물의 다양한 구체예에서, 20% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C18이다. 일부 구체예에서, 30% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C18이다. 일부 구체예에서, 40% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C18이다. 일부 구체예에서, 50% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C18이다. 일부 구체예에서, 50% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C16 또는 더 긴 쇄 길이이다. 일부 구체예에서, 10% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C14 또는 더 짧은 쇄 길이이다. 일부 구체예에서, 20% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C14 또는 더 짧은 쇄 길이이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 완전히 포화된 지질을 함유하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 지질을 함유하는 더 가벼운 상 및 하나이상의 종 또는 균주로부터의 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 수산화된 지질을 함유하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 유리 지방산을 함유하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 미생물 집단을 배양함으로서 생산된 바이오매스의 알칼리성 가수분해에서 유도된 비누화된 오일을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 콩, 유채, 카놀라, 야자, 야자 커넬, 코코넛, 옥수수, 야채 폐기물(waste vegetable), 중국 수지(Chinese tallow), 올리브, 해바라기, 면 종자, 닭 지방, 우지, 돼지 수지(porcine tallow), 미세조류, 거대조류(macroalgae), 쿠페아(Cuphea), 아마(flax), 땅콩, 고급 백색 그리스(choice white grease), 라드, 카멜리나 사티바(Camelina sativa), 머스타드 종자 캐슈 너트(mustard seed cashew nut), 귀리, 루핀(lupine), 케나프(kenaf), 카렌듈라(calendula), 대마, 커피, 아마씨(아마), 헤이즐넛, 유포르비아(euphorbia), 펌킨 종자, 코리엔더(coriander), 카멜리아, 참깨, 홍화, 쌀, 퉁 오일 나무, 코코아, 코프라, 피움 양귀비(pium poppy), 피마자 콩, 피칸, 호호바, 자트로파(jatropha), 마카다미아, 브라질 너트, 아보카도, 화석 오일 또는 이들의 증류액 분획(distillate fraction)으로 이루어 진 오일 군에서 선택된 하나 이상 및 선택적으로 하나를 초과하는 오일을 추가적으로 포함한다.

다양한 구체예에서, 비누화된 오일 조성물은 고체(파우더 포함), 또는 액체일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 바이오매스에서 유래된 카로테노이드 및/또는 바이오매스로부터 유래된 비-비누화된 당지질 및/또는 바이오매스로부터 유래된 다당류를 추가적으로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 비누화된 오일은 상기 조성물의 총 질량의 50% 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 비누화된 오일은 상기 조성물의 총 질량의 75% 이상을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 비누화된 오일은 상기 조성물의 총 질량의 50% 미만을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 비누화된 오일은 상기 조성물의 총 질량의 25% 미만을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이오매스로부터 유래된 구성성분은 조성물의 총 질량의 50% 이상을 구성한다. 일부 구체예에서, 바이오매스로부터 유래된 구성성분은 조성물의 총 질량의 50% 이하를 구성한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 비누화된 오일 조성물을 포함한 키트 및 경구 보충제(oral supplement)에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 경구 보충제는 비타민 또는 허브를 포함한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 다양한 유형의 글리세롤의 존재하에 추가 글루코스와 함께 그리고 추가 글루코스 없이 배양시킬 때, 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 균주의 리터 당 DCW를 나타낸다.

도 2는 다양한 유형의 글리세롤의 존재하에 추가의 글루코스와 함께 배양시킬 때, 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 균주의 리터 당 DCW를 나타낸다.

도 3은 추가의 글루코스와 함께 다양한 유형의 글리세롤의 존재하에 배양시킬 때, 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 균주의 배양액 중 상대 지질 농도를 나타낸다.

도 4는 다양한 유형의 글리세롤의 존재하에 추가 글루코스와 함께 그리고 추가 글루코스 없이 배양시킬 때, 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 균주의 배양액 중 지질 농도를 나타낸다.

도 5는 추가의 글루코스와 함께 다양한 유형의 글리세롤의 존재하에 배양시킬 때 (글리세롤은 글루코스 이후에 순차적으로 첨가됨), 클로렐라(Chlorella)의 두 가지 종 및 균주의 DCW의 퍼센트로서 지질을 나타낸다.

도 6은 추가의 글루코스와 함께 다양한 유형의 글리세롤의 존재하에 배양시킬 때, 클로렐라(Chlorella)의 두가지 종 및 균주의 DCW의 퍼센트로서 지질을 나타낸다.

도 7은 2% 글루코스 및 1% 글루코스 + 1% 시약급(reagent grade) 글리세롤의 존재하에 배양시킬 때, 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 균주의 배양액 중 상대 지질 농도를 나타낸다.

도 8은 글루코스의 존재하에 시약급의 글리세롤과 함께 그리고 글리세롤 없이 배양시킬 때 (글리세롤은 글루코스와 차례로 또는 함께 첨가됨), 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 균주의 DCW의 퍼센트로서 지질을 나타낸다.

도 9는 추가의 글루코스와 함께 다양한 유형의 글리세롤의 존재하에 배양시킬 때 (글리세롤은 글루코스와 차례로 또는 함께 첨가됨), 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 균주의 배양액의 상대 지질 농도를 나타낸다.

도 10은 추가의 글루코스와 함께 다양한 유형의 글리세롤의 존재하에 배양시킬 때 (글리세롤은 글루코스와 차례로 또는 함께 첨가됨), 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 균주의 리터 당 DCW를 나타낸다.

도 11(a)는 글루코스, 시약급 글리세롤, 비-산성화된 바이오디젤 부산물 글리세롤, 및 글리세롤과 글루코스의 조합물의 존재하에 배양시킬 때, 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis)의 DCW의 퍼센트로서 지질을 나타낸다.

도 11(b)는 다양한 유형의 글리세롤 및 글리세롤과 글루코스의 조합물의 존재하에 배양시킬 때, 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelliculosa)의 DCW의 퍼센트로서 지질을 나타낸다.

도 12(a)는 다양한 유형의 글리세롤 및 글리세롤과 글루코스의 조합물의 존재하에 배양시킬 때, 씬데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus)의 DCW의 퍼센트로서 지질을 나타낸다.

도 12(b)는 다양한 유형의 글리세롤 및 바이오디젤 부산물 글리세롤과 글루코스의 조합물의 존재하에 배양시킬 때, 씬데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus)의 리터 당 DCW를 나타낸다.

도 13은 다양한 유형의 글리세롤 및 비-산성화된 바이오디젤 부산물 글리세롤과 글루코스의 조합물의 존재하에 배양시킬 때, 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelliculosa)의 리터 당 DCW를 나타낸다.

도 14(a) 및 (b)는 추가의 글루코스와 함께 산성화되고 비-산성화된 바이오디젤 부산물 글리세롤의 존재하에 배양시킬때 (글리세롤은 글루코스와 차례로 또는 함께 첨가됨), 씬데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus) 및 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelliculosa)의 리터 당 DCW를 나타낸다.

도 15는 크실로스 또는 글루코스 단독에 비해 클로렐라(Chlorella)의 성장에 대한 크실로스와 글루코스의 조합물의 상승적인 효과를 나타낸다.

도 16은 글루코스 및 과당에서 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 성장을 나타낸다.

도 17은 자당 전화효소(invertase)의 존재 또는 부재하에 글루코스, 자당 또는 여러 당밀 샘플(BS1, BS2 및 HTM으로 지정됨) 중 하나의 존재하에 배양시킬 때, 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 리터 당 DCW를 나타낸다.

도 18은 자당 전화효소(invertase)의 존재 또는 부재하에 글루코스, 자당 또는 여러 당밀 샘플(BS1, BS2 및 HTM으로 지정됨) 중 하나의 존재하에 배양시킬 때, 상대적 세포 밀도에 의해 측정된, 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 성장을 나타낸다.

도 19는 UTEX 250에서 추출된 오일과 비교하여, 균주 LJTEX 1435로부터 추출된 헥산인 오일의 시각적 비교를 나타낸다.

도 20은 비누에 포함된(embedded) 고 오일 조류 세포를 나타낸다.

도 21 a-c는 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 8개의 상이한 균주로부터 23s rRNA의 게놈 DNA 서열을 비교하는 분지도(Cladogram)를 나타낸다.

도 22-27은 유일한 탄소원으로서 순수 사탕수수의 세개의 상이한 농도에서 성장한 미세조류의 상이한 균주의 성장 곡선을 나타낸다.

도 28은 미세조류 종에서 지질 쇄의 다양성의 요약을 나타낸다.

도 29a-i는 미세조류의 23개 균주로부터 23S rRNA의 게놈 DNA 서열을 비교한 분지도를 나타낸다.

I. 정의

본원에서 사용된 특정 용어의 정의는 당업자의 편의를 위해 하기에 제공된다.

핵산에 관하여 "미세조류에서 활성(Active in microalgae)"은 미세조류에서 기능성인 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 유전자이식 미세조류에 항생제 내성을 제공하기 위해 항생제 내성 유전자 운반에 사용된 프로모터는 미세조류에서 활성이다. 미세조류에서 활성인 프로모터의 예는 특정 조류 종에 내인성인 프로모터 및 식물 바이러스에서 발견된 프로모터를 포함한다.

"아실 운반 단백질" 또는 "ACP"는 4'-포스포판테테인 잔기(moiety)의 원위 티올에서 티올 에스테르로서 지방산 합성 동안 발생하는 아실 쇄에 결합하는 단백질이고, 지방산 합성효소 복합체의 구성성분을 포함한다. 지방산 아실-ACP 티오에스테라제와 연관하여 아실 운반 단백질에 대하여 문구 "자연적으로 공동-발현되는"은 ACP 및 티오에스테라제가 이들이 유래된 조직 또는 유기체에서 자연적으로 공동-발현(자연에서)되는 것을 의미하는데, 그 이유는, 예컨대, 두 효소를 엔코딩하는 유전자가 흔히 조절 서열의 통제하에 있거나, 이들이 동일한 자극에 반응하여 발현되기 때문이다.

"아실-CoA 분자" 또는 "아실-CoA"는 코엔자임 A의 4-포스포판테테인 잔기의 원위 티올에서 티올 에스테르 결합을 통해 코엔자임 A에 공유결합적으로 부착된 아실 잔기를 포함하는 분자이다.

"무균"은 다른 살아있는 유기체에 의한 오염이 없는 유기체의 배양액을 의미한다.

"바이오디젤"은 지질의 트랜스에스테르화로부터 생산된 지방산 에스테르를 지칭한다. 이 에스테르는 트랜스에스테르화 반응의 구성성분에 따라 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 또는 기타 에스테르일 수 있다.

"바이오매스"는 세포의 성장 및/또는 번식에 의해 생성된 물질을 지칭한다. 바이오매스는 세포 및/또는 세포내 내용물 뿐만 아니라 세포외 물질도 포함할 수 있다. 세포외 물질은 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"생물반응기"는 세포, 예를 들어 미생물이 현탁액에서 선택적으로 배양되는 봉입체(enclosure) 또는 부분 봉입체를 의미한다.

"촉매"는 생성물의 일부가 되지 않으면서 생성물로의 반응물의 화학적 반응을 촉진하거나 증진시킬 수 있는, 분자 또는 거대분자 복합체와 같은 시약을 지칭한다. 따라서, 촉매는 반응의 속도를 증가시키고, 이후 촉매는 또 다른 반응물에 대해 작용하여 생성물을 형성할 수 있다. 촉매는 반응에 요구되는 전반적인 활성화 에너지를 낮추어 반응이 보다 신속하거나 낮은 온도에서 진행되도록 하고/하거나, 반응 평형이 더욱 신속하게 달성될 수 있도록 한다. 촉매의 예는 생물학적 촉매인 효소, 비생물학적 촉매인 열을 포함한다.

"셀룰로오스(cellulosic) 물질"은 셀룰로오스, 예컨대, 글루코스, 크실로스, 아라비노스, 이당류, 올리고당류, 리그닌, 푸르푸랄(furfural) 및 기타 분자의 소화 생산물을 의미한다.

"공동-배양", 및 "공동-재배"와 같은 이의 변이형은 동일한 생물반응기에 둘 이상의 세포 유형의 존재를 지칭한다. 둘 이상의 세포 유형은 둘 모두가 미세조류와 같은 미생물일 수 있거나, 상이한 세포 유형과 배양된 미세조류 세포일 수 있다. 배양 조건은 둘 이상의 세포 유형의 성장 및/또는 번식을 촉진하는 것이거나, 나머지에 대한 세포 성장을 유지하면서 둘 이상의 세포 유형 중 하나의 세포 유형 또는 세포 유형의 서브셋의 성장 및/또는 번식을 촉진하는 것일 수 있다.

본원에서 사용된 "공동인자"는 효소가 이의 효소적 활성을 수행하기 위해 요구되는, 기질 이외의 임의의 분자를 지칭한다.

"상보적인 DNA"("cDNA")는 예를 들어, 전령 RNA(mRNA)의 역전사 또는 증폭(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응("PCR")을 통해)에 의해 수득될 수 있는, mRNA의 DNA 복제물(copy)이다.

"배양된" 및 이의 변이형은 적절한 배양 조건의 이용에 의한 하나 이상의 세포의 성장(세포 크기, 세포의 함량, 및/또는 세포 활성의 증가) 및/또는 번식(유사분열을 통한 세포 수의 증가)의 의도적 촉진을 지칭한다. 성장과 번식 둘 모두의 조합을 증식이라고 부를 수 있다. 하나 이상의 세포는 미세조류와 같은 미생물의 세포일 수 있다. 적절한 조건의 예는 규정된 배지의 사용(pH, 이온 강도, 탄소원과 같은 공지된 특징을 지님), 특정된 온도, 산소 장력, 및 생물반응기에서의 이산화탄소 수준의 이용을 포함한다. 상기 용어는 궁극적으로 화석화되어 지질학적 미정제 오일을 생성하는 유기체의 자연적인 성장과 같이, 자연에서의 미생물의 성장이나 번식 또는 이와 다르게 직접적인 인간 개입이 없는 미생물의 성장 또는 번식을 지칭하지 않는다.

"외인성 유전자"는 세포로 형질전환된(도입된) 핵산을 지칭한다. 형질전환된 세포는 재조합 세포로 지칭될 수 있으며, 여기에 추가 외인성 유전자(들)가 도입될 수 있다. 외인성 유전자는 형질전환되는 세포에 대해 상이한 종(및 그래서 이종인), 또는 동일한 종(및 그래서 동종인)으로부터 올 수 있다. 동종 유전자의 경우에, 도입된 유전자는 유전자의 내인성 복제물에 대하여 세포의 게놈에서 상이한 위치를 차지하거나, 이를 대체하거나 둘 모두를 대체하는 내인성 유전자의 상이한 조절 통제하에 있다. 외인성 유전자는 세포 내에서 하나보다 많은 복제물로 존재할 수 있다. 외인성 유전자는 게놈으로의 삽입체로서 또는 에피솜 분자로서 세포에 유지될 수 있다.

"외생적으로 제공된"은 세포 배양의 배양 배지에 제공된 분자를 지칭한다.

"추출된"은 용매의 이용으로, 또는 용매의 이용 없이, 수성 바이오매스로부터 분리된 오일 또는 지질을 지칭한다.

"지방산 아실-ACP 티오에스테라제"는 지질 합성 동안 아실 운반 단백질(ACP)로부터 지방산의 절단을 촉매화하는 효소이다.

"고정된 탄소원"는 고체 또는 액체 형태로 주변 온도 및 압력에서 존재하는 탄소, 일반적으로는 유기 분자를 함유하는 분자를 의미한다.

본원에서 사용된 "진균"은 균류계로부터 키틴질의 세포벽을 특징으로 하는 종속영양 유기체를 의미한다.

"이원자"는 탄소 또는 수소 이외의 원자를 의미한다. 이원자의 예는 마그네슘, 칼슘, 포타슘, 소듐, 황, 인, 철 및 구리이다.

"균질액"은 물리적으로 분열된 바이오매스를 의미한다.

"소수성 분획"은 수성상에 비해 소수성 상에서 더욱 가용성인 물질의 부분 또는 분획을 지칭한다. 소수성 분획은 물에서 실제로 불용성이고 일반적으로 비극성이다.

"증가된 지질 수율"은 미생물 배양의 지질 생산성을 증가시키는 것을 지칭하는데, 이는 예를 들어 배양액의 리터 당 세포의 건조 중량을 증가시키거나, 지질을 구성하는 세포의 비율을 증가시키거나, 단위 시간 당 배양액 부피의 리터 당 지질의 전체적인 양을 증가시킴에 의해 달성될 수 있다.

"유도가능한 프로모터"는 특정 자극에 반응하여 작동가능하게 연결된(operably linked) 유전자의 전사를 매개하는 프로모터이다.

"작동가능하게 연결된"은 두개의 핵산 서열, 예컨대 조절 서열(일반적으로 프로모터) 및 연결된 서열 사이에 기능적 연결을 지칭한다. 프로모터가 유전자의 전사를 매개할 수 있는 경우, 프로모터는 외인성 유전자와 작동가능하게 연결된 것이다.

"동일계 내(in situ)"는 "그 위치에" 또는 "이의 원래 위치에"를 의미한다. 예를 들어, 배양액은 촉매를 분비시키는 제 1 미생물, 예컨대, 미세조류 및 기질을 분비하는 제2 미생물을 포함할 수 있고, 여기서 제 1 및 제 2 미생물은 물질의 추가 분리 또는 가공을 요구하지 않으며 공동-배양액에서 동일계 내 발생하는 특정 화학적 반응에 필요한 구성성분들을 생산한다.

"리파아제"는 지질 물질 내의 에스테르 결합의 가수분해를 촉매화하는 효소이다. 리파아제는 글리세롤 및 지방산으로의 지질의 가수분해를 촉매화하고, TAG를 지방산 알킬 에스테르로의 트랜스에스테르화를 촉매화하는 작용을 할 수 있다.

"지질"은 미생물로부터 획득될 수 있는 친유성 분자이다. 이들이 물론 다른 기능을 수행한다 할지라도, 지질의 주요 생물학적 작용은 에너지를 저장하고, 세포막의 구조적 성분으로 작용하며, 신호 분자로서 역할을 하는 것이다. 지질은 비극성 용매(예컨대, 에테르 및 클로로포름)에 용해될 수 있고, 물에 비교적 불용성이다. 지질은 주로, 길고, 소수성인 탄화수소 "꼬리"로 구성된다. 지질의 예는 지방산(포화되거나 불포화됨); 글리세리드 또는 당지질(예컨대, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드(TAGs 포함) 또는 중성 지방, 및 포스포글리세리드 또는 글리세로포스포리피드); 비글리세리드(스핑고리피드, 콜레스테롤 및 스테로이드 호르몬을 포함하는 스테롤 지질, 테르페노이드를 포함하는 프레놀지질, 왁스, 및 폴리케타이드); 및 복잡한 지질 유도체 (당-연결된 지질, 또는 당지질, 및 단백질-연결된 지질)을 포함한다. 지질의 또 다른 예는 유리 지방산; 지방산의 에스테르; 스테롤; 색소(예를 들어, 카로테노이드 및 옥시카로테노이드), 크산토필, 피토스테롤, 에르고티오닌, 리포산, 베타-카로텐 및 토코페롤을 포함하는 항산화제를 포함한다. 또한, 폴리불포화 지방산, 예컨대, 아라키돈산, 스테아리돈산, 콜레스테롤, 데스모스테롤, 아스타크산틴, 칸타크산틴, 및 n-6 및 n-3 높게 불포화된 지방산, 예컨대, 아이코사펜타엔산(EPA), 도코사펜타엔산 및 도코나헥사엔산(DHA)를 포함한다.

"지질 경로 효소"는 지질 대사, 즉 지질 합성, 개질 또는 분해와 관련된 효소이며, 지방산 아실-ACP 티오에스테라제, 및 아실 운반 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"영양소의 제한된 농도"는 배양되는 유기체의 번식을 제한하는 배양액에서의 영양소 농도이다. "영양소의 비제한적인 농도"는 주어진 배양 기간 동안 최대 번식을 지지할 수 있는 영양소 농도이다. 따라서, 주어진 배양 기간 동안 생성된 세포의 수는 제한된 농도의 영양소가 존재하에 영양소가 비제한적일 때보다 더 낮다. 영양소가 최대 번식을 뒷받침하는 것보다 큰 농도로 존재할 때, 영양소가 배양액에 "과량"으로 존재한다고 한다.

"당지질 프로파일"은 상이한 탄소 쇄 길이의 배열 및 특정 바이오 매스 샘플 중에서 당지질의 포화 수준을 지칭한다. 예를 들어, 샘플은 대략 당지질의 60%가 C18:1이고, 20%가 C18:0이고, 15%가 C16:0이며, 5%가 C14:0인, 당지질을 포함할 수 있다. 탄소의 길이가 "C18"에서와 같이, 포화와 관계없이 참고되는 경우, 이러한 참고는 임의의 양의 포화를 포함할 수 있다; 예를 들어, C18과 같이 20%의 지질을 포함하는 바이오매스는 동등하거나 다양한 양으로 C18:0, C18:1, C18:2 등을 포함할 수 있으며, 이들의 총 합은 미생물 바이오매스의 20%를 구성한다.

"용해물"은 용해된 세포의 내용물을 함유하는 용액을 지칭한다. "용해하는"은 적어도 약간의 세포내 내용물을 방출하기에 충분한 세포성 막 및 선택적으로 세포벽을 분해하는 것을 지칭한다. "용해"는 종종 본래의 모습을 손상시키는 기계적, 바이러스성 또는 삼투압 메카니즘에 의한, 적어도 약간의 세포내 내용물을 방출하기에 충분한 원형질막 및 선택적으로 생물학적 유기체의 세포벽의 분해를 지칭한다.

"미세조류"는 (a) 엽록체 또는 엽록체 잔존물을 함유하는 진핵생물, 또는 (b) 시아노박테리아인 미생물 유기체를 의미한다. 미세조류는 고정된 탄소원을 에너지로서 대사시킬 수 없는 절대 광영양체뿐만 아니라 고정된 탄소원과 떨어져 혼자서 생존할 수 있는 종속영양체를 포함한다. 미세조류는 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 같이, 세포 분열 직후 자매 세포로부터 분리하는 단세포 유기체를 지칭할 수 있고, 또한 두 별개의 세포 유형의 단순한 다세포 광합성 미생물인, 예를 들어 볼복스(Volvox)와 같은 미생물을 지칭할 수 있다. "미세조류"는 아그메넬룸(Agmenellum), 아나바에나(Anabaena), 및 피로보트리스(Pyrobotrys)와 같은, 세포-세포 부착을 나타내는 다른 미생물의 광합성 유기체를 포함할 뿐만 아니라, "미세조류"는 프로토테카(prototheca)의 속 및 편모조류(dinoflagellate)의 미세조류와 같이, 광합성을 수행하는 능력을 잃어버린 엽록체-유사 구조를 포함하는 유기체도 포함한다.

"미생물(Microorganism)" 및 "미생물(microbe)"은 미세한 단세포 생물을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 이용된다.

"오일"은 지질학적으로 유래된 미정제 오일, 지질학적으로 유래된 미정제 오일의 증류 분획, 식물성 오일, 조류 오일, 및 미생물 지질을 포함하나, 이에 제한되지 않는 소수성, 친유성, 비극성 탄소-함유 물질을 의미한다.

본원에서 사용된 "유질성 효모"는 지질로서 DCW의 10%보다 많이 축적할 수 있는 효모를 의미한다. 유질성 효모는 예컨대, 야로비아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)와 같은 효모뿐만 아니라, 효모의 조작된 균주, 예컨대 지질로서 DCW의 10%보다 많이 축적하도록 조작된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다.

"삼투압 충격"은 삼투압력의 갑작스런 감소에 후속하는 박테리아, 조류, 또는 기타 세포의 용액 내에서의 파열(rupture)을 지칭한다. 삼투압 충격은 때때로, 세포성 성분을 용액 안으로 방출하도록 유도된다.

"광생물반응기"는 이의 적어도 일부가 적어도 부분적으로 투명하거나 부분적으로 개방되어 있어서, 이를 통해 빛이 통과할 수 있고, 여기서 하나 이상의 미세조류 세포가 배양되는 컨테이너를 지칭한다. 광생물반응기는 폴리에틸렌 백 또는 에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)의 경우에서와 같이 밀폐될 수 있거나, 야외 못의 경우에서와 같이 주위로 개방될 수 있다.

"다당류-분해 효소"는 임의의 다당류의 가수분해 또는 해중합반응을 촉매화할 수 있는 효소를 지칭한다. 예를 들어, 셀룰라아제는 셀룰로오스의 가수분해를 촉매화하는 다당류 분해 효소이다.

"다당류"(또는 "글리칸")은 글루코시드 결합에 의해 서로 연결된 다당류를 구성하는 탄수화물이다. 셀룰로오스는 특정 식물 세포벽을 구성하는 다당류의 한 예이다. 셀룰로오스는 효소에 의해 해중합되어, 단당류, 예컨대, 크실로스 및 글루코스를 비롯하여, 더 큰 이당류 및 올리고당을 산출할 수 있다.

생물반응기의 본문 중에서, "포트(port)"는 물질, 예컨대, 가스, 액체 및 세포의 유입 또는 유출을 가능케 하는 생물반응기 내 개구부(opening)를 지칭한다. 포트는 보통 광생물반응기로부터 리딩된 터브에 결합된다.

참조를 위해 이용된, 세포 또는 핵산, 단백질 또는 벡터에 대한 "재조합은 세포, 헥산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질 또는 본래의(자연적으로 발생한)핵산 또는 단백질의 개조의 도입에 의해 개질되었음을 의미하거나, 세포가 이렇게 개질된 세포에서 유래된 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 비-본래의 유전자를 발현하거나(유전자가 세포의 원래의 형태(비-재조합)에서 발견되지 않음), 비-재조합 세포에서 하는 것보다 다르게 본래의 유전자를 발현, 즉, 비-재조합 세포에서의 유전자 발현에 비해 본래의 유전자가 과다-발현, 저-발현되거나(under-expressed), 전혀 발현되지 않는다. "재조합 핵산"은, 예를 들어, 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 이용하여, 핵산의 조작에 의해 시험관 내(in vitro)에서 자연에서 발견되지 않는 형태로 일반적으로 형성된 핵산을 지칭한다(및 자연적으로 발생한 핵산의 정제된 제조물을 포함할 수 있음). 따라서, 분리된 핵산(선 형태로), 또는 시험관 내에서 정상적으로 연결되지 않은(예를 들어, 서로에 대해 작동가능하게 연결된 두개의 상이한 핵산을 위치시키기 위해) DNA 분자를 연결하여(ligating) 형성된 발현 벡터가 재조합이다. 재조합 핵산이 숙주 또는 유기체 내로 도입될 때, 이는 즉, 숙주 세포의 생체내 세포 조직을 이용하여, 비-재조합적(non-recombinantly)으로 복제할 수 있으나; 재조합적으로 생산되고 후속하여 비-재조합적으로 복제된 이러한 핵산은 여전히 재조합으로 여겨진다. 유사하게, "재조합 단백질"은 재조합 기술을 이용하여 즉, 재조합 핵산 발현을 통해 제작된 단백질이다.

"비누화된 오일"은 미생물 소스로부터 지방산 에스테르의 비누화 중에 생성된 관련 화합물 및 카르복실산 염을 지칭한다. 지방산 에스테르는 미생물로부터 생산된 트리아실글리세롤(TAGs)로부터 유래될 수 있다. 미생물 소스로부터의 오일과 연관된 화합물은 카로테노이드, 토코페롤, 토코트리엔올 및 생물학적 기원의 다른 화합물을 포함한다.

"초음파분해(Sonication)"는 음파 에너지를 이용하여, 생물학적 물질, 세포를 분해하는 과정을 지칭한다.

"스토버(Stover)"는 곡물이 수확된 후 남은 농작물의 건조된 줄기 및 잎을 지칭한다.

"자당 이용 유전자"는 발현시, 세포가 자당을 에너지원으로서 이용하는 능력을 돕는 유전자이다. 자당 운반체(transporters), 자당 전화효소, 및 헥소키나아제, 예컨대, 글루코키나아제 및 플룩토키나아제는 자당 이용 유전자의 예들이다.

II . 일반론

특정 미생물은 다른 분야들 중에서 수송 연료 및 석유화학 산업에서 이용하기 위해 다량으로 지질을 생산하도록 이용될 수 있다. 본 발명은 상당하게 비용을 감소시키고, 지질 및 미생물로부터의 가치있는 지질-유도 화합물 획득의 효율성을 높이는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 사용되기에 적합한 미생물은 미세조류, 유질성 효모, 진균, 박테리아 및 시아노박테리아를 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 미세조류의 속은 지질-생산 미세조류 클로렐라(Chlorella)이다. 또한 본 발명은 트리아실글리세롤(TAGs)를 지방산 알킬 에스테르로의 동일계 트랜스에스테르화를 위한 방법을 제공하며, 이는 바이오디젤 연료 및/또는 다른 분야에 유용하고, 뿐만 아니라 미생물 바이오매스에서 지질의 화학적 개질에 대한 다른 방법도 제공한다.

또한 본 발명은 지질(예컨대 트리글리세리드)로서 5% 이상의 이들의 DCW를 생성하는 미생물 집단을 배양함으로서, 지방산 알킬 에스테르(예를 들어, 지방산 메틸 에스테르(FAME))를 만드는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 미생물 바이오매스는 배양액으로부터 수확되며, 선택적으로 건조되어 물을 제거시킨다. 그 다음 트랜스에스테르화는 저-알킬 알코올 및 촉매(예를 들어, NaOH)의 첨가에 의해 달성되어, 지방산 알킬 에스테르를 함유하는 친유성 상 및 친수성 세포 물질을 함유하는 친수성 상을 생성시킨다. 친유성 상은 친수성 상으로부터 쉽게 분리될 수 있다.

친유성 구성성분이 바이오매스로부터 추출된 후 트랜스에스테르화되는 분리 공정 단계의 개입이 없는, 바이오매스의 직접적 트랜스에스테르화는 전통적인 추출 및 정제 과정 후 트랜스에스테르화를 수행하는 방법에 비해, 바이오디젤을 상당하게 감소된 비용으로 생산할 수 있도록 한다.

본 발명의 방법은 당지질을 지방산 알킬 에스테르로 동일계 트랜스에스테르화 하는 것을 통해, 바이오디젤의 생성에 추가적인 이점을 제공한다. 특히, 본 발명의 미생물은 세포의 당지질 내용물의 변조(modulation)를 가능케하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 놀랍게도, 총 당지질의 더 많은 비율이 DCW의 작용으로서 점점 더 높은 오일:비-오일 비를 포함하는 세포 내에서 지방산 알킬 에스테르로 변환될 수 있음이 발견되었다. 더욱이, 이러한 더 높은 오일:비-오일 비는 또한 또 다른 예측하지 못한 이점을 제공한다: 점점 더 높은 오일:비-오일 비를 포함하는 세포로부터 생성된 지방산 알킬 에스테르는, 더 낮은 오일:비-오일 비를 갖는 세포로부터 생산된 것보다 더 낮은 농도의 이원자를 갖는다. 상기 제공된 방법은 현재 당업계의 정설과 뚜렷히 대조되며, 즉, 미세 조류의 광독립영양적 성장이 바이오연료 생산을 위한 미세조류 배양의 최상의 방법이다(예를들어, [Rodolfi, et al , Biotechnology & Bwengineering 102(1) 100-112 (2008)] 참조- 미세조류 균주의 이들의 바이오매스 생산성 및 광생물반응기 외부에서의 성장에 대한 지질 함량을 위한 스크리닝의 논의). 또한, 바이오매스의 오일 함량이 높아질수록, 직접적 화학적 개질 후 생산된 결과물의 질도 높아진다는 것이 발견되었다. 본 발명은 더 높은 질의 화학적 생산물의 생산을 위한 직접적 화학적 개질을 위해, 더 높은 오일 함량을 성취하기 위한 미생물을 배양하는 종송영양 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 지질-함유 미생물 바이오매스를 화학적으로 개질시키는, 또 다른 방법을 제공하며, 이 방법은 수소첨가, 인터에스테르화, 수산화, 가수분해 및 비누화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법은 다양한 미생물 및 본원에 기술된 배양 조건과 함께 이용되어, 다수의 분야에서 다양한 화학적 생산물을 생산할 수 있다.

본 발명은 또한 유용한 조성물을 제공하는데, 이 조성물은 지방산 알킬 에스테르를 함유하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물; 완전히 포화된 지질을 함유하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물; 지질을 함유하는 더 가벼운 상 및 하나 이상의 종 또는 균주로부터 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물; 수산화된 지질을 함유하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물; 및 유리 지방산을 함유하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 미생물 집합을 배양함으로서 생산된 바이오매스의 알칼리성 가수분해로부터 유래된 비누화된 오일로 구성된 조성물을 제공한다.

III . 미생물

본 발명에 유용한 미생물은 바이오디젤 생산용 및 지방산 에스테르 생산용, 또 다른 목적용, 예컨대, 산업상 화학적 원료 및 식용 오일을 비롯하여, 기타 화학적 독립체의 생산용 화학적 개질에 적합한 지질을 생산한다. 바이오디젤 및 화학적 생산에 적합한 지질은, 지방산 분자를 함유하는 TAGs를 포함한다. 일부 구체예에서, 적합한 지방산은 8 이상, 10 이상, 12 이상, 14 이상, 16 이상, 18 이상, 20 이상, 22 이상, 24 이상, 26 이상, 28 이상, 30 이상, 32 이상, 또는 34 이상의 탄소 원자 또는 그 이상을 포함한다. 바이오디젤에 바람직한 지방산은 일반적으로 16 및 18개의 탄소 원자를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 지방산은 포화(탄소-탄소 이중결합 또는 삼중결합이 없음), 모노 불포화(단일 이중 결합), 폴리불포화(두개 이상의 이중 결합)되며, 선형(원형 아님)이며/이거나, 이들의 구조 내에 분지가 거의 없거나 적다.

일부 구체예에서, 본 발명의 동일계 트랜스에스테르화 및 개질 방법에 유용한 배양 미생물은 건조시, 5% 이상, 10% 이상, 15 % 이상, 20 % 이상, 또는 25 % 이상의 오일 함량을 포함하는 바이오매스를 산출한다. 또 다른 구체예에서, 상기 건조된 바이오매스는 30% 이상, 35 % 이상, 40 % 이상, 45 % 이상, 50 % 이상, 55 % 이상, 60 % 이상, 65 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 80 % 이상, 85 % 이상, 또는 90 % 이상의 오일 함량을 포함한다. 본원 중에 사용된 "건조" 또는 "건조된"은 실질적으로 모든 물이 부재한 것을 지칭한다. 또한 바이오매스는 건조되지 않고 화학적으로 개질될 수 있다; 예를 들어, 바이오매스는 원심분리된 세포 페이스트(paste)를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 동일계 트랜스에스테르화 및 또 다른 화학적 개질 방법에 유용한 배양 미생물은 10% 이상의 지질이 C18, 15% 이상의 지질이 C18, 20% 이상의 지질이 C18, 또는 25% 이상의 지질이 C18인 바이오매스를 산출한다. 또 다른 구체예에서, 바이오매스는 30% 이상의 C18, 35% 이상의 C18, 40% 이상의 C18, 45% 이상의 C18, 또는 50% 이상의 C18인 지질 구성성분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 바이오매스는 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상 또는 50% 이상의 C14 및/또는 C16 또는 더 긴 쇄 길이의 지질 구성성분을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 바이오매스는 10% 이상 또는 20% 이상의 C14, 또는 더 짧은 쇄 길이의 지질 구성성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 유용한 미생물은 자연적으로 발생하거나 유전적으로 조작되어 지질 산출을 증가시킬 수 있고, 원하는 탄소 쇄 길이(예를 들어, C18) 지방산을 더 높은 비율로 포함하는 TAGs를 생성시키거나, 특정 원료(예를 들어, 당밀)을 에너지원 및 탄소원으로서 이용할 수 있다. 이러한 유전적으로 조작한 개질은 "지질 경로 조작"이라는 주제하에 하기에 상술된다.

높은 수준의 적합한 지질을 자연적으로 생산하는 미생물이 일반적으로 선호된다 하더라도, 적합한 지질을 생산하는 미생물의 임의의 종이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 더욱이, 특정 발효 조건이 적용된 경우, DCW의 퍼센트로서 높은 수준의 지질을 생산할 수 있는 미생물도 바람직하다. 본 발명의 방법에 미세조류가 이용될 수 있고, 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 미세조류의 비제한적 예시(속 및 종 둘 모두)가 표 1에 나열되어 있다.

미세조류의 예

아크난테스 오리엔탈리스(Achnanthes orientalis), 아그메넬룸(Agmenellum), 암피프로라히알린(Amphiprora hyaline), 암포라 코페이포르미스(Amphora coffeiformis), 암포라 코페이포르미스리니아(Amphora coffeiformis linea), 암포라 코페이포르미스 펑타타(Amphora coffeiformispunctata), 암포라 코페이포르미스 타일로리(Amphora coffeiformis taylori), 암포라 코페이포르미스테누이스(Amphora coffeiformis tenuis), 암포라 델리카티시마(Amphora delicatissima), 암포라 델리카티시마 카피타타(Amphora delicatissima capitata), 암포라 종(Amphora sp.), 아나바에나(Anabaena), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus), 안키스트로데스무스팔카투스(Ankistrodesmus falcatus), 보에켈로비아 후그란디이(Boekelovia hooglandii), 보로디넬라종(Borodinella sp.), 보트리오콕시이스 브라우니이(Botryococciis braunii), 보트리오코커스 수데티쿠스(Botryococcus sudeticus), 카르테리아(Carteria), 카에토세로스그라실리스(Chaetoceros gracilis), 카에토세로스 뮤엘레리(Chaetoceros muelleri), 카에토세로스 뮤엘레리 서브살숨(Chaetoceros muelleri subsalsum), 카에토세로스 종(Chaetoceros sp.), 클로렐라 아니트라타(Chlorella anitrata), 클로렐라 안타르크티카(Chlorella Antarctica), 클로렐라 아우레오비리디스(Chlorella aureoviridis), 클로렐라 캔디다(Chlorella candida), 클로렐라 캡슐레이트(Chlorella capsulate), 클로렐라데시케이트(Chlorella desiccate), 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 에메르소니이(Chlorella emersonii), 클로렐라 푸스카(Chlorella fusca), 클로렐라 푸스카 var. 바쿠올라타(Chlorella fuscavar. vacuolata), 클로렐라 글루코트로파(Chlorella glucotropha), 클로렐라 인퓨시오눔(Chlorella infusionum), 클로렐라 인퓨시오눔 var. 악토필라(Chlorella infusionum var. actophila), 클로렐라 인퓨시오눔 var. 오세노필라(Chlorella infusionum var. auxenophila), 클로렐라 케슬러리(Chlorella kessleri), 클로렐라 로보포라(Chlorella lobophora) (균주 SAG 37.88), 클로렐라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis), 클로렐라 루테오비리디스 var. 오레오비리디스(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis), 클로렐라 루테오비리디스 var. 루테센스(Chlorella luteoviridis var. lutescens), 클로렐라 미니아타(Chlorella miniata), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 뮤타빌리스(Chlorella mutabilis), 클로렐라 녹투르나(Chlorella nocturna), 클로렐라 파르바(Chlorella parva), 클로렐라포토필라(Chlorella photophila), 클로렐라 프링세이미이(Chlorella pringsheimii), 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) (UTEX 균주 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25 중 임의의 것 포함), 클로렐라 프로토테코이드 var. 액시디콜라(Chlorella protothecoides var.acidicola), 클로렐라 레귤라리스(Chlorella regularis), 클로렐라 레귤라리스 var.미니마(Chlorella regularis var. minima), 클로렐라 레귤라리스 var. 움브리카타(Chlorella regularis var. umbricata), 클로렐라 레이시글리이(Chlorella reisiglii), 클로렐라 사카로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 사카로필라 var. 엘립소이데아(Chlorella saccharophila var. ellipsoidea), 클로렐라 살리나(Chlorella salina), 클로렐라 심플렉스(Chlorella simplex), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 종(Chlorella sp.), 클로렐라 스파에리카(Chlorella sphaerica), 클로렐라 스티그마토포라(Chlorella stigmatophora), 클로렐라 반니엘리이(Chlorella vanniellii), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 불가리스 에프 테르티아(Chlorella vulgaris f tertia), 클로렐라 불가리스 var. 오토트로피카(Chlorella vulgaris var. autotrophica), 클로렐라 불가리스 var. 비리디스(Chlorella vulgaris var. viridis), 클로렐라 불가리스 var. 불가리스(Chlorella vulgaris var. vulgaris), 클로렐라 불가리스 var. 불가리스 에프 테르티아(Chlorella vulgaris var. vulgaris f tertia), 클로렐라 불가리스 var. 불가리스 에프 비리디스(Chlorella vulgaris var. vulgaris f viridis), 클로렐라 크산텔라(Chlorella xanthella), 클로렐라 조핑기엔시스(Chlorella zofingiensis), 클로렐라 트레보우시오이드(Chlorella trebouxioides), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로로코쿰 인퓨시오눔(Chlorococcum infusionum), 클로로코쿰 종(Chlorococcum sp.), 클로로고니움(Chlorogonium), 크로모나스 종(Chroomonas sp.), 크리소스파에라 종(Chrysosphaera sp.), 크리코스파에라 종(Cricosphaera sp.), 크립테코디니움 코흐니이(Crypthecodinium cohnii), 크립토모나스 종(Cryptomonas sp.), 시클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 시클로텔라 메네지니아나(Cyclotella meneghiniana), 시클로텔라 종(Cyclotella sp.), 두날리엘라 종(Dunaliella sp.), 두날리엘라 바르다윌(Dunaliella bardawil), 두날리엘라 비오쿨라타(Dunaliella bioculata), 두날리엘라 그라눌레이트(Dunaliella granulate), 두날리엘라 마리팀(Dunaliella maritime), 두날리엘라미누타(Dunaliella minuta), 두날리엘라 파르바(Dunaliella parva), 두날리엘라 페이르세이(Dunaliella peircei), 두날리엘라 프리몰렉타(Dunaliella primolecta), 두날리엘라살리나(Dunaliella salina), 두날리엘라 테리콜라(Dunaliella terricola), 두날리엘라테르티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 비리디스(Dunaliella viridis), 두날리엘라 테르티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 에레모스파에라 비리디스(Eremosphaera viridis), 에레모스파에라 종(Eremosphaera sp.), 엘립소이돈 종(Ellipsoidon sp.), 유글레나(Euglena), 프란세이아 종(Franceia sp.), 프라길라리아 크로토넨시스(Fragilaria crotonensis), 프라길라리아종(Fragilaria sp.), 글레오캅사 종(Gleocapsa sp.), 글로에오탐니온 종(Gloeothamnion sp.), 히메노모나스 종(Hymenomonas sp.), 이소크리시스 아프. 갈바나(Isochrysis aff. galbana), 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana), 레포신클리스(Lepocinclis), 미크락티니움(Micractinium), 미크락티니움(Micractinium) (UTEXLB 2614), 모노라피디움 미누툼(Monoraphidium minutum), 모노라피디움 종(Monoraphidium sp.), 난노클로리스 종(Nannochloris sp.), 난노클로롭시스살리나(Nannochloropsis salina), 난노클로롭시스 종(Nannochloropsis sp.), 나비쿨라악셉타타(Navicula acceptata), 나비쿨라 비스칸테라에(Navicula biskanterae), 나비쿨라 슈도테넬로이드(Navicula pseudotenelloides), 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelliculosa), 나비쿨라 사프로필라(Navicula saprophila), 나비쿨라 종(Navicula sp.), 네프로클로리스 종(Nephrochloris sp.), 네프로셀미스 종(Nephroselmis sp.), 니츠키아 커뮤니스(Nitschia communis), 니츠키아알렉산드리나(Nitzschia alexandrina), 니츠키아 커뮤니스(Nitzschia communis), 니츠키아디시파타(Nitzschia dissipata), 니츠키아 프러스툴룸(Nitzschia frustulum), 니츠키아한츠슈이아나(Nitzschia hantzschiana), 니츠키아 인코스피쿠아(Nitzschia inconspicua), 니츠키아인터미디아(Nitzschia intermedia), 니츠키아 미크로세팔라(Nitzschia microcephala), 니츠키아 푸실라(Nitzschia pusilla), 니츠키아 푸실라 엘립티카(Nitzschia pusilla elliptica), 니츠키아 푸실라모노엔시스(Nitzschia pusilla monoensis), 니츠키아 쿼드란귤라(Nitzschia quadrangular), 니츠키아종(Nitzschia sp.), 오크로모나스 종(Ochromonas sp.), 오오시스티스 파르바(Oocystis parva), 오오시스티스 푸실라(Oocystis pusilla), 오오시스티스 종(Oocystis sp.), 오실라토리아 림네티카(Oscillatoria limnetica), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 오실라토리아서브레비스(Oscillatoria subbrevis), 파스케리아 악시도필라(Pascheria acidophila), 파블로바 종(Pavlova sp.), 파구스(Phagus), 포르미디움(Phormidium), 플라티모나스 종(Platymonas sp.), 플뢰로크리시스 카르테아에(Pleurochrysis carterae), 플뢰로크리시스 덴테이트(Pleurochrysis dentate), 프뢰로크리시스 종(Pleurochrysis sp.), 프로토테카 위케르하미이(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis), 프로토테카 좁피이(Prototheca zopfii), 피라미모나스 종(Pyramimonas sp.), 피로보트리스(Pyrobotrys), 사르시노이드 크리소파이트(Sarcinoid chrysophyte), 씬데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus), 스키조키트리움(Schizochytrium), 스피로기라(Spirogyra), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스티코코커스 종(Stichococcus sp.), 시네코코커스종(Synechococcus sp.), 테트라에드론(Tetraedron), 테트라셀미스 종(Tetraselmis sp.), 테트라엘미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 탈라시오시라 웨이스플로기이(Thalassiosira weissflogii), 및 비리디엘라 프리데리시아나(Viridiella fridericiana)

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 유질성 효모의 비제한적 예는 표 2에 나열되어 있다.

유질성 효모의 예

크립토코커스 쿠르바투스(Cryptococcus curvatus), 크립토코커스 테리콜루스(Cryptococcus terricolus), 캔디다 종(Candida sp.), 리포마이세스 스타르케이(Lipomyces starkeyi), 림포마이세스 리포퍼(Lipomyces lipofer), 엔도미콥시스 베르날리스(Endomycopsis vernalis), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis), 및 야로비아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 진균의 비제한적 예는 표 3에 나열되어 있다.

진균의 예

모르티에렐라(Mortierella), 모르티에를라 비나세아(Mortierella vinacea), 모르티에렐라알핀(Mortierella alpine), 피티움 데바리아눔(Pythium debaryanum), 뮤코 시르시넬로이드(Mucorcircinelloides), 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스퍼질러스테레우스(Aspergillus terreus), 페니실리움 일락시눔(Pennicillium iilacinum), 헨세눌로(Hensenulo), 카에토미움(Chaetomium), 클라도스포리움(Cladosporium), 말브란케아(Malbranchea), 리조푸스(Rhizopus), 및 피티움(Pythium)

본 발명에 이용되는 미생물의 선택에 영향을 미치는 고려사항으로는 바이오디젤 생산에 적합한 지질의 생산에 추가하여, (1) 세포 중량의 퍼센트로서 높은 지질 함량; (2) 성장의 용이성; 및 (3) 가공의 용이성을 포함한다. 바람직한 미생물은 종속영양적으로 성장하거나(빛 없이 당에서), 예를 들어 미국 특허출원 제 60/941,581호(2007년 6월 1일 출원), 제 60/959, 174호(2007년 7월 10일 출원), 제 60/968, 291호(2007년 8월 27일 출원) 및 제 61/024, 069호(2008년 1월 28일 출원)에 기재된 방법을 이용하여 그렇게 되도록 조작된다.

공정 고려사항은, 예를 들어, 세포를 용해 하기위한 효과적인 수단의 가용성을 포함할 수 있다. 또한, 박테리아, 특히, 유질성 박테리아, 예컨대 로도코커스(Rhodococus) 속의 종, 예컨대 로도코커스 오파쿠스(Rhodococcus opacus) 및 로도코커스 종(Rhodococcus sp)이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에 이용되기 위한 미세조류의 종은 시험 미세조류의 게놈의 특정 타겟 영역의 증폭에 의해 동정(identify)될 수 있다. 예를 들어, 미세조류의 특정 종 또는 균주의 동정은 프라이머를 이용하고 게놈의 임의의 영역을 이용하는 방법론을 이용하여, 핵 및/또는 엽록체 DNA의 증폭 및 시퀀싱을 통해 이뤄질 수 있다(예를 들어, Wu et al, Bot Bull Acad Sm (2001) 42 115-121 "Identification of Chlorella spp Isolates using ribosomal DNA sequences" 참조). 계통발생적 분석의 잘 성립된 방법, 예컨대 증폭 및 리보좀 내부 전사 영역의 시퀀싱(ITS1 및 ITS2 rDNA), 23S rRNA, 18s rRNA, 및 다른 보존된 게놈 영역의 시퀀싱은 본원에 상술된 방법에서 이용될 수 있는 지질 생산 유기체 및 기타 탄화수소 및 미세조류의 종을 동정하는데 이용될 수 있다. 조류의 분류 및 동정 방법의 예는, 예를 들어, 문헌[Genetics, 2005 Aug, 170(4) 1601-10 및 RNA, 2005 Apr, 11(4) 361-4]을 참조하라.

또한, 게놈 DNA 비교는 본 발명의 방법에 이용되기 위한 적합한 미세조류 종을 동정하는데 이용될 수 있다. 보존된 DNA 영역(23 S rRNA을 엔코딩하는 DNA를 포함하나 이에 제한되지는 않음)은 미세조류 종으로부터 증폭될 수 있으며, 공통서열과 비교하여 본 발명의 방법에 이용된 미세조류와 분류학적으로 연관된 미세조류 종을 스크리닝할 수 있다. 클로렐라(Chlorella) 및 프로토테카(Prototheca) 속 내의 종에 대한 이러한 DNA 서열 비교의 예는 하기 실시예에 나타나있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용되기 위한 미세조류는 SEQ ID NO 3-6에 나열된 서열 중 하나 이상과 99% 이상, 98% 이상, 97% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 94% 이상, 93% 이상, 92% 이상, 91% 이상, 90% 이상, 89% 이상, 88% 이상, 87% 이상, 86% 이상의 뉴클레오티드 상동성을 갖는 23S rRNA를 엔코딩하는 게놈 DNA 서열을 가진다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용되기 위한 미세조류는 SEQ ID NO 3-29에 나열된 서열 중 하나 이상과 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상의 뉴클레오티드 상동성을 갖는 23S rRNA를 엔코딩하는 게놈 DNA 서열을 가진다.

본 발명의 방법에 이용될 수 있는 클로렐라는 필룸 클로로피타(phylum Chlorophyta)에 속하는 단일-세포 녹색 조류의 속이다. 클로렐라는 형상에 있어서 직경이 약 2 내지 10 ㎛인 구형이고, 편모가 없다. 클로렐라의 몇가지 종은 자연적으로 종속영양성이다. 클로렐라(Chlorella), 특히 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)는 이의 높은 지질의 조성, 특히 바이오디젤에 적합한 장-쇄 지질 조성 및 다른 분자 내로의 화학적 개질로 인해, 본 발명에 사용하기에 바람직한 미생물이다. 더욱이, 이 미세조류는 종송영양적으로 성장한다.

프로토테카는 본 발명의 방법에서 유용한 클로렐라의 비-광합성 돌연변이로 생각되는 단일-세포 미세조류의 속이다. 클로렐라가 그의 에너지를 광합성을 통해 획득할 수 있는 반면, 프로토테카 속의 종은 절대 종속영양생물(obligate heterotrophs)이다. 프로토테카는 형상에 있어서 직경이 약 2 내지 15 마이크로미터인 구형이고, 편모가 없다. 프로토테카, 특히 프로토테카 모리폴미스(Prototheca moriformis)는 이의 지질 조성, 특히 비누화에 적합한 포화된 지질로 인해, 본 발명에서 이용되기에 바람직한 미생물이다. 더욱이, 이 미세조류에서 추출된 지질은 색소 오염물질이 매우 적고, 추가적으로 비누화 시키기에 적합하다.

식물 및 동물과 같이, 조류 및 다른 미생물도 다른 에너지원(예를 들어, 햇빛)이 이용불가능할 경우, 사용을 위해 지질 형태로 초과 에너지를 저장한다. 더욱이, 오일 함량의 조절은 수성환경에 사는 조류가 물에 뜨게 하고, 따라서 햇빛에 접촉을 최적화하여 광합성 과정을 수행하도록 한다. 오일 함량의 조절에 의해 부력을 조정하는 능력은 미세조류 세포가 고등 식물과 비교하여 높은 세포성 오일 농도를 생성할 수 있도록 야기시킨다. 고 오일 함량의 특성은 본원에 상술한 바와 같이, 고-오일 바이오매스가 저-오일 바이오매스, 특히, 광합성적으로-유도된 저-오일 바이오매스에 비해 더 높은 순도의 TAG 유도체를 산출시키기 때문에, 오일-함유 바이오매스의 동일계 화학적 개질에 유리하다. 따라서, 고-오일 바이오매스를 생성하는데 이용될 수 있는 미생물이 본 발명의 방법에서 이용되기에 바람직하다.

A. 성장 방법

미생물은 선택적 유전적 조작을 수행할 목적과 지질의 생산을 위해 배양될 수 있다. 전자의 배양 유형은 적어도 초기에, 출발 미생물이 성장할 수 있는 조건 하에서, 소규모 수행된다. 예를 들어, 출발 미생물이 광독립영양생물라면, 초기 배양은 빛의 존재하에 수행된다. 배양 조건은, 미생물이 빛에 독립적으로 성장하도록 진화되거나 조작된 경우 변화될 수 있다. 지질의 생산을 목적으로 한 배양은 보통 대규모로 수행된다.

1. 광합성적 성장 방법

광합성 미생물, 예컨대 미세조류는 예를 들어, 광생물반응기에 포함될 수 있는, 액체 배양 배지에서 빛의 존재하에 성장될 수 있다. 미세조류 배양액을 때리는 광자의 수뿐만 아니라 다른 파라미터, 예컨대 파장 스펙트럼 및 일당 암:명 시간의 비도 조작될 수 있다. 또한 미세조류는 천연광 뿐만 아니라, 천연광과 인공광의 동시 및/또는 교대적인 조합에서도 배양될 수 있다. 예를 들어, 클로렐라 속의 미세조류를 일광시간 동안 천연광에서 배양하고, 밤시간 동안 인공광에서 배양시킬 수 있다.

미세조류와 같은 미생물을 성장시키기 위한 광생물 반응기의 가스 함량을 조작할 수 있다. 광생물 반응기의 부피 중 일부는 액체보다 가스를 함유할 수 있다. 가스 입구는 가스를 광생물 반응기로 주입하는데 이용될 수 있다. 공기, 공기/CO₂ 혼합물, 아르곤 등과 같은 영족 가스를 포함하는 임의의 가스를 광생물반응기로 주입할 수 있다. 광생물 반응기로의 가스의 유입 속도도 조작될 수 있다. 광생물 반응기로의 가스 흐름의 증가는 미세조류 배양액의 탁도를 증가시킨다. 광생물반응기로 가스를 운반하는 포트의 배치도 주어진 가스 유속에서 배양액의 탁도에 영향을 줄 수 있다. 공기/CO₂ 혼합물은 특정 유기체의 최대 성장을 위해 CO₂의 최적 량을 발생시키도록 조절될 수 있다. 미세조류는 100% 공기에서보다, 예를 들어 3% CO₂/97% 공기 하에서 빛을 비출 때 현저하게 빠르게 성장한다. 3% CO₂/97% 공기에는 공기에서 발견된 것보다 CO₂가 약 100배 더 많다. 예를 들어, 약 99.75% 공기:0.25% CO₂, 약 99.5% 공기:0.5% CO₂, 약 99.0% 공기:1.00% CO₂, 약 98.0% 공기:2.0% CO₂, 약 97.0% 공기:3.0% CO₂, 약 96.0% 공기:4.0% CO₂, 및 약 95.00% 공기: 5.0% CO₂의 공기:CO₂ 혼합물이 생물반응기 또는 광생물 반응기로 본원 발명에 따라 주입될 수 있다. 보트리오코커스(Botryococcus) 세포를 함유하는 광생물 반응기로 주입된 5.0% CO₂:95% 공기 혼합물이 문헌[J Agnc Food Chem. 2006 Jun;28,54(13):4593-9, J Biosci Bweng 1999,87(6):811-5, 및 J Nat Prod 2003 Jun;66(6) 772-8)에 보고되어 있다.

미세조류는 다양한 상이한 유형의 투명 또는 반투명 물질 중 어느 하나로 구성된 개폐된 광생물반응기에서 성장되고 유지될 수 있다. 이러한 물질은 Plexiglas® 봉입체, 유리 봉입체, 폴리에틸렌과 같은 물질로 만들어진 백, 투명 또는 반투명 파이프, 및 기타 물질을 포함한다. 미세조류는 또한 열린 포토광생물반응기, 예컨대 레이스웨이 연못, 고정된 연못, 및 기타 둘러싸이지 않은 컨테이너에서 성장되고 유지될 수 있다.

"조류 쉐이딩(Algal shading)"은 빛 소스가 광합성 배양액의 모든 세포를 투과하여 도달하는 능력이 없는 것을 지칭한다. 빛 소스에 가장 근접한 세포는 빛 소스로부터 떨어진 세포를 가릴 것이며(shade)(엽록체 내의 광자의 흡수 및 이들의 물리적 실재에 의해), 띠라서 탄소 원료를 지질 또는 다른 세포 성장 및 번식에 필수적인 물질로 변환시키는데 요구되는 에너지에 대한 다른 세포의 노출을 제한한다. 배양액을 혼합함으로서, 모든 세포를 빛 소스에 노출시키는 메카니즘을 제공할 수 있으나, 그럼에도 불구하고 "쉐이딩"은 총 노출 기간에 영향을 미쳐서, DCW 퍼센트로서 더 낮은 오일 함량과 느린 성장을 야기시킨다. 그 결과, 높은 밀도의 세포 및/또는 높은 오일 함량을 달성하기 위해 더 긴 성장 기간이 요구될 수 있다. 연장된 성장 기간에도, 유일한 에너지원으로서 빛에서 성장된 세포는 좀처럼 DCW 퍼센트로서 15% 이상의 오일을 포함하지 않는다. 더욱이, 미세조류의 광합성적 성장은 바이오매스 내에 높은 수준의 엽록소를 야기하고, 마그네슘이 엽록소의 구성성분이기 때문에 직접적으로 트랜스에스테르화된 바이오매스 내에 훨씬 더 높은 양의 마그네슘을 유발하며, 엽록소는 친유성 상에 축적하는 매우 소수성인 화합물이다. 더욱이, 더 높은 카로테노이드 수준은 종속영양적으로 성장된 조류에서보다 광합성적으로 성장된 조류에서 축적한다.

2. 지질 생산을 위한 종속영양적 성장 방법

광합성 성장 방법과 반대로, 미세조류는 빛의 침투가 불가능한 생물반응기에 포함된 배양액을 함유한 액체 배지에서 배양될 수 있다. 종속영양적 배양 방법은, 예컨대 성장 및 지질 생산을 위한 에너지를 제공하기 위해 고정된 탄소원(예를 들어, 글루코스, 글리세롤, 셀룰로오스 등)의 이용에 의존한다. 배양 조건 파라미터는 총 지질 생산을 최적화하기 위해 조작될 수 있다.

미세조류 배양 배지는 일반적으로 고정된 질소원, 미량 원소, 선택적으로 pH 유지를 위한 완충용액, 및 인산염과 같은 구성성분을 포함한다. 다른 성분으로는 고정된 탄소원, 예컨대, 아세테이트 또는 글루코스 및 특히 해수 미세조류를 위한 염, 예컨대 염화나트륨을 포함할 수 있다. 미량 원소의 예로는, 예를 들어 ZnCl₂, H₃BO₃, CoCl₂, 6H₂O, CuCl₂·2H₂O, MnCl₂·4H₂O 및 (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O의 개개 형태의 아연, 붕소, 코발트, 구리, 망간, 및 몰리브덴을 포함한다. 이들 및 다른 배양 파라미터, 예컨대 배양 배지의 pH, 미량 원소의 농도 및 동정 및 기타 배지의 성분은 또한 원하는 생산 결과를 얻기 위해 본 발명의 방법에서 조작될 수 있다.

고정된 탄소 원에서 성장할 수 있는 유기체의 경우, 고정된 탄소원은 예를 들어, 글루코스, 과당, 자당, 갈락토스, 크실로스, 만노스, 람노스, 글리세롤, 셀룰로오스원, 및/또는 플로리도시드(floridoside)일 수 있다. 하나 이상의 탄소원은 외인성적으로 제공된 하나 이상의 고정된 탄소원의 약 50μM 이상, 약 100μM 이상, 약 500μM 이상, 약 5mM 이상, 약 50mM 이상, 및 약 500mM의 농도로 공급될 수 있다. 클로렐라의 다수의 종의 경우, 예를 들어, 종속영양적 성장은 바이오매스의 높은 생산 및 세포 내 높은 지질 함량의 축적을 유발한다.

지질 생산의 경우, 재조합 세포를 포함하는 세포는 일반적으로 대량으로 배양되거나 발효된다. 배양은 큰 액체 부피로 이뤄질 수 있다(예를 들어 현탁 배양). 다른 예는 세포의 적은 배양을 시작으로 지질 생산과 함께 동시에 세포의 성장 및 번식에 의해 거대한 바이오매스로 확대된다. 생물반응기 또는 스틸 발효기가 거대 배양액 부피를 수용하는데 이용될 수 있다. 에탄올의 생산에 이용된 매우 큰 발효기와 같이, 맥주 및/또는 와인의 생산에 이용된 것과 유사한 발효기가 적합하다.

발효기 내에 배양을 위한 적절한 영양 소스가 제공된다. 이것은 원료, 예컨대, 하나 이상의 하기의 것을 포함한다: 고정된 탄소원, 예컨대, 글루코스, 옥수수전분, 해중합된 셀룰로오스, 자당, 사탕수수, 사탕무, 유청, 또는 밀당; 지방원, 예컨대, 지방 또는 식물성 오일; 질소원, 예컨대, 단백질, 대두박(soybean meal), 옥수수 침출액(cornsteep liquor), 암모니아(순수 또는 염 형태), 질산염(nitrate) 또는 질산염(nitrate salt), 또는 질소분자; 및 인 소스, 예컨대 인산염. 또한, 발효기는 배양 조건, 예컨대, 온도, pH, 산소 장력, 및 이산화탄소 수준의 조절이 가능하다. 산소 또는 질소와 같은 가스성 구성성분은 액체 배양액을 통해 거품이 일어날 수 있다.

발효기는 세포가 이들의 성장 주기의 다양한 단계를 겪도록 이용될 수 있다. 예로서, 지질-생성 세포의 접종물이 배지에 도입된 후, 세포가 성장을 시작하기 전에 지연기(lag period)(lag phase)에 도입될 수 있다. 지연기 이후에, 성장 속도는 꾸준히 증가하여 로그기 (log phase) 또는 대수증식기 (exponential phase)로 들어간다. 대수증식기 이후에 영양소, 특히 질소의 감소로 인해 세포 분할이 느려지거나 완전한 정지한다. 이렇게 느려진 후, 성장이 중단되고, 고정된 탄소 원료를 원하는 생산물, 예컨대 TAG로 변환하는 안정기(steady state)로 들어간다. 안정기를 오랜 기간 동안 유지하는 것은 원하는 생산물, 예컨대 본원에 기술된 미생물의 경우 지질인 높은 퍼센트의 DCW를 야기한다. 몇가지 예를 들면, 안정기에서 미생물 세포를 유지시키는 것이 요망되는데, 이는 세포가 탄수화물, 예컨대 글루코스를 지질로 변환시키는 한편, 연장된 기간 동안 세포분열을 겪지 않아 세포 건조 중량 퍼센트로서, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 또는 60% 초과의 지질을 지니는 미생물 바이오매스를 생성시킨다. 질소 제한은 일반적으로 세포가 세포분열을 겪는 것을 방지하기에 충분하다.

본원에 기재된 조건을 이용하여 성장된 미생물 및 당업계에 공지된 미생물은 20 중량% 이상의 지질, 바람직하게는 40 중량% 이상의 지질, 더욱 바람직하게는 50 중량% 이상의 지질, 더욱 바람직하게는 60 중량% 이상의 지질, 더욱 바람직하게는 70 중량% 이상의 지질, 및 가장 바람직하게는 80 중량% 이상의 지질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 미생물은 본원에 기재된 조건을 이용하여 배양되어 1 주일 이내의 배양 기간 내에 20 중량% 이상의 지질 구성성분을 획득한다. 일부 구체예에서, 배양 기간은 14일 이내, 13일 이내, 12일 이내, 11일 이내, 10일 이내, 9일 이내, 8일 이내, 6일 이내, 5일 이내, 4일 이내, 3일 이내이다. 앞서 말한 배양 기간 중 어느 하나에서, 미생물은 DCW로 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상의 지질을 산출할 수 있다. 일부 구체예에서, 미생물은 본원에 기재된 조건을 이용하여 배양되어 2일 이상의 배양 기간 내에 20 중량% 이상의 지질 구성성분을 획득한다. 일부 구체예에서, 배양 기간은 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상이다. 앞서 말한 배양 기간 중 어느 하나에서, 미생물은 DCW로 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상의 지질을 산출할 수 있다.

공정 조건은 바이오디젤 또는 다른 타겟 분자로서 사용되기에 적합한 지질의 산출을 증가시키도록 조절될 수 있고/있거나 생산비용을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 미생물(예를 들어, 미세조류)는 하나 이상의 영양소, 예를 들어, 질소의 농도를 제한하면서 배양된다. 이러한 조건은 질소가 과량으로 제공된 배양액에서 산출된 미생물 지질보다 미생물 지질 산출량을 증가시키는 경향이 있다. 특정 구체예에서, 지질 산출량의 증가는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, 또는 500% 이상이다. 미생물은 총 배양 기간의 일부분 동안 또는 총 기간 동안 제한된 양의 영양소의 존재하에 배양될 수 있다. 특정 구체예에서, 영양소 농도는 총 배양기간 동안 약 2배 이상의 농도로 제한된 농도와 비-제한된 농도 사이에서 순환된다. 더욱이 및 도면에서 보여지듯이, 특정 고정된 탄소 원료, 예컨대, 글리세롤이 다른 고정된 탄소 원료의 비교할만한 양에 비교된 지질인, 세포 중량의 퍼센트를 증가시키는데 이용될 수 있다.

지질 산출량을 증가시키기 위해, 아세트산이 지질-생산 미생물(예를 들어, 미세조류)를 위한 원료로 사용될 수 있다. 아세트산은 지방산 합성(즉, 아세틸-CoA)을 시작하는 대사과정의 포인트에 직접적으로 공급한다; 따라서, 배양액에 아세트산을 제공하는 것은 지방산 생산을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 구체예에서, 미생물은 충분한 양의 아세트산의 존재하에 배양되어, 아세트산의 부재하에서의 미생물 지질(예를 들어, 지방산) 산출에 비해 확실히 미생물 지질 산출 및/또는 미생물 지방산을 증가시킨다.

또 다른 구체예에서, 지질 산출은 지질 경로 효소(예를 들어, 지방산 합성 효소)에 대한 하나 이상의 공동인자의 존재하에, 지질-생산 미생물(예를 들어, 미세조류)를 배양함으로서 증가된다. 일반적으로, 이러한 구체예에서, 공동인자의 농도는 공통인자의 부재하에서의 미생물 지질 산출에 비해 미생물 지질(예를 들어, 지방산)산출을 증가시키기에 충분하다. 특정 구체예에서, 공동인자는 공동인자를 엔코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 미생물(예를 들어, 미세조류)을 배양액에 포함함으로서, 배양액에 제공된다. 대안적으로, 공동인자는 공동인자의 합성에 참여하는 단백질을 엔코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 미생물(예를 들어, 미세조류)를 포함함으로서, 배양액에 제공될 수 있다. 특정 구체예에서, 적합한 공동인자는 지질 경로 효소에 필요한 임의의 비타민, 예컨대, 예를 들어, 비오틴 또는 판토테네이트를 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 또는 이러한 공동인자의 합성에 참여하는 공통인자를 엔코딩하는 유전자는 잘 알려져 있으며, 당업계에 공지된 작제물 및 기술을 이용하여 미생물(예를 들어, 미세조류)에 도입될 수 있다.

건조 중량 기준으로 높은 퍼센트의 오일/지질 축적을 지니는 미세조류 바이오매스는 당업계에 공지된 다양한 상이한 배양 방법을 이용해 생성되어왔다. 높은 퍼센트의 축적된 오일/지질을 지니는 미세조류 바이오매스가 본 발명에 따라서 유용하다. Li 등은 높은 철 농도를 이용하여, 독립영양성 조건(즉, 광합성 성장 조건)하에 성장된, 고정 배양액에서 DCW로 최대 56.6% 지질과 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)의 배양을 기술하고 있다(Li et al, Bioresource Technology 99(11): 4717-22(2008)). 로돌피(Rodolfi)등은 질소 겹핍 조건하에서 광생물반응기에서 각각 성장된, 60%의 지질 DCW 및 39 8%의 지질 DCW과 함께, 나노클로롭시스 종(Nanochloropsis sp .) 및 차에토세로스 칼시트란(Chaetoceros calcitrans)의 배양을 기술하고 있다(Rodolfi et al , Biotechnology & Bioengineenng 102(1):100-112(2008)). 살로브첸코(Solovchenko)등은 광영양적(phototrophically)이면서 저 질소 조건하에서 배양된 경우, 대략 30%의 지질 축적(DCW)을 지닌 파네토클로리스 인시스(Panetochloris incise)의 배양을 기술하고 있다(Solovchenko et al, Journal of Applied Phcology 20 245- 251 (2008)). 질소 결핍과 함께 특정 종속영양적 조건하에서 성장된, 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)는 최대 55%의 지질(DCW)을 생산할 수 있다(Miao and Wu, Bioresource Technology 97 841-846 (2006)). 클로렐라 에멀소니(Chlorella emersonii), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 및 클로렐라 미누티스시마(Chlorella minutissima)를 포함하는 기타 클로렐라 종은 저-질소 배지 조건에서 교반된 탱크 생물반응기에서 성장된 경우, 최대 63% 축적된 오일(DCW)을 가짐이 기재되어 있다(Illman et al, Enzyme and Microbial Technology 27:631-635 (2000)). DCW로 더 높은 퍼센트의 지질 축적이 보고되었으며, 이는 증가된 NaCl 조건에서 성장된 두마헬라 테르티오렉타(Dumahella tertiolecta) 배양액에서의 70% 지질(DCW) 축척(Takagi et al, Journal of Biosaence and Bioengineenng 101(3) 223-226 (2006)) 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 배양액에서의 75% 지질 축적(Banerjee et al, Critical Reviews in Biotechnology 22(3):245-279(2002))을 포함한다. 이 방법 및 유사한 방법은 미세조류의 광합성 및 종속영양적 성장에 이용되어 오일을 생산할 수 있다.

본원에 기술된 배양방법에 의해 생성되고, 본 발명에 따라 이용하기 유용한 미세조류 바이오매스는 건조 중량 기준으로 10% 이상의 미세조류 오일을 포함한다. 일부 구체예에서, 미세조류 바이오매스는 건조 중량 기준으로 15% 이상, 25% 이상, 35% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 또는 60% 이상의 미세조류 오일을 포함한다. 일부 구체예에서, 미세조류 바이오매스는 건조 중량 기준으로 10-90% 미세조류 오일, 25-75% 미세조류 오일, 40-75% 미세조류 오일, 또는 50-70% 미세조류 오일을 포함한다.

다양한 구체예에서, 미세조류 바이오매스는 건조 중량 기준으로, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 33% 이상, 34% 이상, 35% 이상, 36% 이상, 37% 이상, 38% 이상, 38% 이상, 40% 이상, 41% 이상, 42% 이상, 43% 이상, 44% 이상, 45% 이상, 46% 이상, 47% 이상, 48% 이상, 49% 이상, 50% 이상의 미세조류 오일을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 미세조류 바이오매스는 건조 중량 기준으로, 51% 이상, 52% % 이상, 53% % 이상, 54% % 이상, 55% % 이상, 56% % 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 또는 90% 이상의 미세조류 오일을 포함한다.

a. 비-전통적 탄소원의 이용

미생물은 비-전통적인 탄소원, 예컨대, 자당, 크실로스, 셀룰로오스 물질, 수수 시럽, 및 폐기물질 상에서 성장하거나 조작될 수 있다. 적합한 셀룰로오스 물질은 주로 식품 또는 섬유 제품이 아닌, 풀(herbaceous) 및 목본 에너지 작물(woody energy crops)을 비롯하여, 농작물, 예컨대, 식물 부분, 주로 줄기와 잎으로부터의 잔여물을 포함한다. 예는 농작물 폐기물, 예컨대 사탕수수 버개스(sugarcane bagasse), 쌀겨(rice hull), 옥수수 섬유(줄기, 잎, 옥수수 껍질 및 옥수수 속 포함), 밀짚, 볏짚, 사탕무 펄프, 감귤 펄프, 감귤껍질; 산림 폐기물, 예컨대 활엽수 및 침엽수 간벌, 및 벌채 작업으로부터의 활엽수 및 침엽수 잔여물; 나무 폐기물, 예컨대 제재 폐기물 (나무 조각, 톱질먼지) 및 펄프 밀 폐기물; 도시 폐기물, 예컨대 도시 고형 폐기물의 종이 파편, 도시 나무 폐기물 및 도시 그린 폐기물, 예컨대 도시 잔디 깎기; 및 목조 폐기물을 포함한다. 추가의 셀룰로오스로는 스위치그래스, 하이브리드 포플러 나무, 및 억새와 같은 전용 셀룰로오스 수확물, 섬유 케인(cane) 및 섬유 수수가 있다. 이러한 물질로부터 생성된 5-탄소당은 크실로스를 포함한다.

또 다른 종속영양적 성장 방법에서, 미세조류 종은 혼합된 탄소원, 예컨대, 수수 시럽 또는 순수한 수수를 이용할 수 있다. 수수 시럽은 스위트 수수 케인(sweet sorghum cane)의 쥬스로부터 생산된다. 이의 당 프로파일은 주로 글루코스(덱스트로스), 과당 및 자당으로 이뤄진다. 미세조류 균주는 수수를 유일한 탄소원으로서 이용할 수 있는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides), 클로렐라 루테오빌디스(Chlorella luteovirdis), 프로토테카 모리폴미스(Prototheca monformis), 클로렐라 케슬러리(Chlorella kessleri), 파라클로렐라 케슬러리(Parachlorella kessleri) 및 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora)의 여러 균주로부터의 미세조류는 하기 실시예에 기술된 바와 같이, 종속영양적 조건에서 수수 시럽을 이용할 수 있다.

일부 미생물은 화합물의 종속영양성 소스인 고정된 탄소원, 예컨대, 생활 폐기물, 2차적으로 처리된 하수, 폐기물, 및 다른 고정된 탄소원 및 다른 영양소, 예컨대, 황산염, 인산염 및 질산염에서 성장하도록 조작될 수 있거나, 자연적으로 성장한다. 하수 구성성분은 지질의 생산에서 영양분 소스로서의 역할을 하며, 상기 배양은 바이오디젤의 생산 및 동일계 트랜스에스테르화를 위하거나, 본 발명의 방법에 따른 다른 화학적 개질을 위한, 값싼 지질의 소스를 제공한다.

바이오디젤 또는 다른 화학적으로 개질된 지질의 생산 비용을 감소시키기 위해, 지질 트랜스에스테르화의 부산물로서 생산된, 미정제, 부분적으로 정제되거나 정제된 글리세롤을 발효를 위한 원료로서 사용할 수 있다(예를 들어, 지질-생산 미생물 배양). 따라서, 본 발명은 제 1 미생물 배양액에서 미생물(예를 들어, 미세조류)를 배양하는 단계; 하기 기술된 바와 같이, 미생물 바이오매스를 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계; 글리세롤을 원료로서 제 2 미생물 배양액에 첨가하는 단계에 관한 방법을 제공한다. 제 1 및 제 2 미생물 배양액은, 그럴 필요는 없으나, 동일한 미생물 배양액일 수 있다. 원한다면, 본 발명에 따라서 연속적인 시스템이 실행될 수 있으며, 배양액으로부터 회수한 지질로부터 생산된 글리세롤은 다시 동일한 배양액으로 공급될 수 있다.

클로렐라(Chlorella), 나비쿨라(Navicula), 씬데스무스(Scenedesmus) 및 스피루리나(Spiruhna) 속의 미생물을 포함하는, 진핵 미생물 및 원핵 미생물 둘 모두의 다양한 속의 발효를 위한 글리세롤의 이용과 통합한, 개선된 배양 파라미터가 본원에 개시되어 있다. 실시예의 기재와 같이, 클로렐라(Chlorella), 나비쿨라(Navicula), 씬데스무스(Scenedesmus) 및 스피루리나(Spiruhna)를 비롯하여 다수의 별개의 클로렐라 종의 배양을 포함하는 매우 분지형인 진화 계통의 미생물은 정제된 시약-급 글리세롤뿐만 아니라, 바이오디젤 트랜스에스테르화로부터의 산성화된 및 비-산성화된 글리세롤 부산물 상에서도 매우 잘 성장한다. 몇 가지 예를 들어, 미세조류, 예컨대, 클로렐라 균주는 글루코스의 존재하에서보다 글리세롤의 존재하에서 더 빠르게 세포 분열을 한다.

본 발명의 방법은 예를 들어, 세포에 우선 글리세롤을 공급하여 세포 밀도를 빠르게 증가시키고, 그 후 글루코스를 공급하여 지질을 축적하도록 하는 두 단계의 성장 과정을 통해 배양된, 미생물을 이용할 수 있다. 이는 트랜스에스테르화 과정의 글리세롤 부산물이 다시 생산 과정으로 돌아간다는 점에서, 상당한 경제적 이점을 제공할 수 있다. 또 다른 공급 방법, 예컨대, 글리세롤과 글루코스의 혼합물이 제공되는 방법, 및 글루코스가 성장 단계 동안 제공되고, 글리세롤이 지질 생산 단계 동안 제공되는 방법이 제공된다. 이러한 혼합물의 제공은 경제적 이점을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 미생물에 대체적인 당, 예컨대, 자당을 글레세롤과 다양한 조합으로 공급하는 방법을 포함한다. 이러한 대안은 원핵생물 및 진핵생물 둘 모두를 포함하는, 매우 분지형인 진화 계통으로부터의 미생물과 함께 설명되었으며, 본 발명의 방법에 따라 미생물 발효를 위한 이러한 대안적인 배양 조건의 실행가능성을 입증한다.

다양한 클로렐라 종, 및 클로렐라 종에 속하는 다양한 균주는 동일한 양의 시약급 글리세롤보다, 트랜스에스테르화로부터의 글리세롤 부산물의 존재하에 더욱 잘 수행한다. 트랜스에스테르화로부터의 글리세롤 부산물은 보통 잔여 메탄올 및 다른 오염물질과 함께 글리세롤을 포함한다. 예를 들어, 도 1-6은 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides) 및 클로렐라 케슬러리(Chlorella kessleri)의 균주가 순수 시약급 글리세롤에서 성장된 경우보다, 바이오디젤 트랜스에스테르화로부터의 산성화된 및 비-산성화된 글리세롤 부산물에서 더 좋은 생산성을 보임을 입증한다. 다른 미생물, 예컨대, 씬데스무스(Scenedesmus ) 및 나비쿨라(Navicula) 미세조류 또한 동일한 양의 시약급 글리세롤보다 트랜스에스테르화로부터의 글리세롤 부산물의 존재하에서 더 잘 수행할 수 있다.

도 1은 리터 당 건조 세포 중량(L 당 DCW)이 순수한 글리세롤보다 바이오디젤 글리세롤 부산물에서 더 높았고, 이러한 경향이 세포가 글리세롤에서 그 자체로 또는 글루코스와 조합하여 성장되는 경우, 그대로 유지됨을 입증한다. 도 2는 클로렐라(Chlorella)의 추가의 균주들에서의 동일한 경향을 나타낸다. 도 12(b)는 씬데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus)의 L 당 DCW가 순수한 시약급 글리세롤보다 산성화되고 비산성화된 바이오디젤 부산물 글리세롤 상에서 더 높음을 입증한다. 도 13은 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelhculosa)의 L 당 DCW가 순수한 시약급 글리세롤보다 비산성화된 바이오디젤 부산물 글리세롤 상에서 더 높음을 입증한다.

도 3 및 4는 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 클로렐라(Chlorella)의 종 내에 있는 다수의 균주에서, 리터 당 지질 수준(또는 지질 함량)은, 세포가 동등한 농도의 순수한 시약급 글리세롤의 존재하에 배양될 때보다 바이오디젤 글리세롤 부산물의 존재하에 배양될 때 더 높음을 입증한다

도 5 및 6은 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 클로렐라(Chlorella)의 종 내에 있는 다수의 균주가 동등한 농도의 순수한 시약급 글리세롤의 존재하에 배양될 때보다 바이오디젤 글리세롤 부산물의 존재하에 배양될 때 더 높은 퍼센트의 DCW를 지질로서 축적시킴을 입증한다. 도 11은 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis) 및 나비쿨라 펠리쿨로사( Navicula pelliculosa) 둘 모두가 동등한 농도의 순수한 시약급 글리세롤의 존재하에 배양될 때보다 바이오디젤 글리세롤 부산물의 존재하에 배양될 때 더 높은 퍼센트의 DCW를 지질로서 축적시킬 수 있음을 입증한다. 도 12(a)는 씬데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus)가 동등한 농도의 순수한 시약급 글리세롤의 존재하에 배양될 때보다 바이오디젤 글리세롤 부산물의 존재하에 배양될 때 더 높은 퍼센트의 DCW를 지질로서 축적시킬 수 있음을 입증한다.

더욱이, 미세조류, 예컨대, 클로렐라(Chlorella), 씬데스무스(Scenedesmus), 나비쿨라(Navicula), 및 스피루리나(Spiruhna)를 포함하는, 다수의 종의 미생물은 글루코스만이 존재하는 때보다, 글리세롤 및 글루코스의 혼합물의 존재하에서 바이오디젤 생산자로서 더 좋은 특성을 나타낸다. 따라서, 도 7은 클로렐라(Chlorella)가 2% 글루코스의 존재하에서보다 1% 글리세롤/1% 글루코스의 존재하에서 배양액 리터 당 더 높은 지질 수준(함량)을 축적할 수 있음을 입증한다. 도 12(b)는 씬데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus)의 L 당 DCW가 2% 글루코스의 존재하에서보다 1 % 바이오디젤 부산물 글리세롤/1% 글루코스의 존재하에서 배양될 때, 더 높음을 입증한다. 도 13은 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelliculosa)의 L 당 DCW가 2% 글루코스의 존재하에서보다 1 % 바이오디젤 부산물 글리세롤/1% 글루코스의 존재하에서 배양될 때, 더 높음을 입증한다.

도 8은 클로렐라(Chlorella)가 글루코스만의 존재하에 배양되는 경우보다, 동등한 농도(중량 퍼센트)의 글리세롤 및 글루코스의 혼합물의 존재하에서 배양될 때, 더 높은 퍼센트의 DCW를 지질로서 축적할 수 있음을 입증한다. 도 11(a)는 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis)가 글루코스만의 존재하에 배양되는 경우보다, 동등한 농도(중량 퍼센트)의 바이오디젤 부산물 글리세롤 및 글루코스의 혼합물의 존재하에서 배양될 때, 더 높은 퍼센트의 DCW를 지질로서 축적할 수 있음을 입증한다. 도 11(b)는 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelliculosa)가 글루코스만의 존재하에 배양되는 경우보다, 동등한 농도(중량 퍼센트)의 시약급 글리세롤 및 글루코스의 혼합물의 존재하에서 배양될 때, 더 높은 퍼센트의 DCW를 지질로서 축적할 수 있음을 입증한다. 도 12(b)는 씬데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus)가 글루코스만의 존재하에 배양되는 경우보다, 동등한 농도(중량 퍼센트)의 바이오디젤 부산물 글리세롤 및 글루코스의 혼합물의 존재하에서 배양될 때, 더 높은 퍼센트의 DCW를 지질로서 축적할 수 있음을 입증한다. DCW의 퍼센트로서 지질을 증가시키는 이러한 방법은 바이오매스에 직접적인 트랜스에스테르화를 시키는 경우, 더 낮은 퍼센트의 지질 바이오매스보다 바이오매스 내에서 더 낮은 양의 이원자를 산출하는 바이오매스를 생성시키는데 유용하다.

미세조류, 예컨대, 클로렐라(Chlorella), 씬데스무스(Scenedesmus), 및 나비쿨라(Navicula)를 포함하는 미생물에 글리세롤과 글루코스를 글리세롤과 글루코스의 단일 배치 혼합물로서가 아니라, 순차적으로 첨가함으로서, 추가적 수율 증가를 생성할 수 있음이 추가적으로 발견되었다. 클로렐라(Chlorella)의 다수의 종 및 클로렐라(Chlorella)의 종에 속하는 다수의 균주의 이러한 속성을 바이오디젤 글리세롤 부산물과 시약급 글리세롤의 존재하에 테스트하였다.

따라서, 도 8은 클로렐라(Chlorella)가 동일한 양의 글리세롤과 글루코스를 실험 초기에 함께 첨가하였을 때 보다, 글리세롤을 제 1 기간 동안 배양액에 첨가시킨 후, 글루코스를 첨가하고 제 2 기간 동안 배양을 지속하였을 때, 더 높은 퍼센트의 DCW를 지질로서 축적할 수 있음을 입증한다. DCW 퍼센트로서 지질을 증가시키는 이러한 방법은, 바이오매스에 직접적인 트랜스에스테르화 또는 다른 화학적 개질 방법을 적용시킬 때, 더 낮은 퍼센트의 지질 바이오매스보다 바이오디젤 또는 다른 생산물에서 더 낮은 양의 이원자를 산출하는 바이오매스를 생성시키는데 유용하다. 도 9는 클로렐라(Chlorella)가 동일한 양의 글리세롤과 글루코스가 배양 초기에 함께 첨가될 때보다, 글리세롤과 글루코스가 순차적으로 첨가될 때, 리터당 더 높은 지질 수준(함량)을 보임을 나타낸다. 이러한 경향은 산성화된 바이오디젤 부산물 글리세롤, 비-산성화된 바이오디젤 부산물 글리세롤, 또는 시약급 글리세롤을 사용하는 경우 관찰되었다.

도 10은 동일한 양의 글리세롤과 글루코스를 실험 초기에 함께 첨가할 때 보다, 글리세롤과 글루코스를 순차적으로 첨가할 때, 배양액의 L 당 더 높은 DCW를 축적하는 클로렐라(Chlorella)의 2개의 상이한 종의 4개의 상이한 균주를 나타낸다. 이러한 경향은 산성화된 바이오디젤 부산물 글리세롤, 비산성화된 바이오디젤 부산물 글리세롤 또는 시약 등급 글리세롤을 이용할 때 관찰되었다. 도 14(a) 및 (b)는 씬데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus)와 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelliculosa) 둘 모두가 바이오디젤 부산물 글리세롤만이 제 1 기간동안 배양액에 첨가된 후에, 글루코스를 첨가할 때, 발효 초기에 동일한 양의 글리세롤과 글루코스를 첨가함에 비하여, L 당 DCW가 증가함을 나타낼 수 있음을 입증한다.

따라서, 미생물 지질 생산의 생산성의 세 가지 상이한 마커(L 당 DCW, 지질 L 당 그램, 및 지질로서 DCW의 퍼센트)는 바이오디젤 부산물 및 탄소원의 일시적 분리의 이용에 의해 개선된다.

바이오디젤 또는 다른 화학적으로-개질된 지질의 비용은 또한, 셀룰로오스 바이오매스를 원료로서 이용함으로서 감소될 수 있다. 셀룰로오스 바이오매스(예를 들어, 스토버, 예컨대 옥수수 스토버)는 값이 싸고, 쉽게 이용가능하나, 이 물질을 효모를 위한 원료로서 사용하기 위한 시도가 실패하였다. 특히, 이러한 원료는 효모 성장에 대한 억제성이 발견되었고, 효모는 셀룰로오스 물질로부터 생산된 5-탄당(예컨대, 헤미-셀룰로오스로부터 크실로스)을 이용하지 못한다. 대조적으로, 미세조류는 가공된 셀룰로오스 물질에서 성장할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 트랜스에스테르화될 수 있는 지질의 생산을 위해 셀룰로오스 물질 및/또는 5-탄당의 존재하에서 미세조류를 배양하는 방법을 제공한다. 셀룰로오스 물질은 일반적으로 셀룰로오스(40-60% 건조 중량), 헤미셀룰로오스(20-40% 건조 중량), 및 리그닌(10-30% 건조 중량)을 포함한다.

놀랍게도, 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)는 글루코스와 크실로스만의 존재하에 배양될 때보다, 글루코스와 크실로스의 조합에서 배양될 때, 더 높은 수준의 생산성을 나타낼 수 있다. 이러한 시너지 효과는 클로렐라를 도 15에서 보여지듯이, 크실로스와 글루코스의 조합에서, 예컨대, 셀룰로오스 물질에서 배양을 가능케 한다는 점에서, 상당한 이점을 제공한다.

바이오디젤로서 사용하기 적합한 지질의 수율을 증가시키고/증가시키거나 생산비용을 감소시키기 위한 공정 조건의 특정 예는, 상기 기술된 바와 같이 개별적으로, 또는 조합하여 이용될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 상기 기술된 방법에 훨씬 더 이용되기 적합한 미생물을 생산하기 위해, 미생물, 예컨대, 미세조류의 선별 및/또는 유전적 조작을 포함한다. 예를 들어, 번식 및/또는 지질 생산을 증가시키기 위해, 상기 기술된 원료 중 임의의 원료를 이용하는 더 좋은 능력을 가진 미생물의 이용은 본 발명의 방법의 범위 이내이다.

바이오디젤 또는 다른 화학적으로-개질된 지질의 생산 비용은 예를 들어, 사탕수수로부터 생산된 자당을 포함하는, 자당을 공급원료로서 이용함으로써 또한 감소될 수 있다. 본 발명의 방법은 자당을 탄소원으로서 이용할 수 있는 클로렐라의 조작된 종의 이용을 포함한다. 예를 들어, 자당 운반체 및 자당 전화효소의 발현은 클로렐라(Chlorella)가 자당을 배양 배지로부터 세포 내로 운반하도록 하고, 자당을 가수분해하여, 글루코스와 과당을 산출하도록 한다. 선택적으로, 내인성 헥소키나아제 활성이 과당의 최대 인산화에 대해 불충분한 경우, 과당효소(fructokinase)도 물론 발현될 수 있다. 적합한 자당 운반체의 예는 젠뱅크(Genbank) 수탁번호 CAD91334, CAB92307, 및 CAA53390에 기재된 것들을 포함한다. 적합한 자당 전화효소의 예는, 젠 뱅크 수탁 번호 CAB95010, NP_012104 및 CAA06839에 기재된 것들을 포함한다. 적합한 과당효소의 예는 젠 뱅크 수탁 번호 P26984, P26420 및 CAA43322에 기재된 것들을 포함한다. 하나 이상의 이러한 유전자를 엔코딩하는 미세조류(클로렐라 포함)를 형질전환 하기 위한 벡터는, 예를 들어, 국제 공개공보 제 WO2008/151149호에 기술된 바와 같이, 지정될 수 있다.

자당 전화효소의 분비는 자당을 세포로 운반할 수 있는 운반체의 발현에 대한 필요성을 방지할 수 있다. 이것은 분비된 전화효소가 자당의 분자를 글루코스 분자 및 과당 분자로 전환하는 것을 촉매화하고, 이들 두 분자는 본원에 기술된 미생물에 의해 운반되고 이용될 수 있기 때문이다. 분비 신호를 지니는 자당 전화효소의 발현은 세포 외부에서 전화효소의 활성을 생성시킨다. 예를 들어, 클로렐라 내의 분비 신호 활성에 대한 문헌[Hawkins et al , Current Microbiology Vol 38 (1999), pp 335-341]을 참조하라. 이러한 단백질의 발현은 세포 외 에너지원으로서 자당을 이용하기 위한 에너지원으로서 세포 외 글루코스를 미리 이용할 수 있도록 한다. 본원에서 세포외 과당 및 세포외 글루코스를 에너지원으로서 이용할 수 있다고 기재된 세포, 예컨대 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)에서, 전화효소의 분비는 자당을 효과적이고 값싼 에너지원으로서 이용하기에 필수적인 유일한 촉매 활성을 제공할 수 있다.

외인성 분비가능한 자당 전화효소를 발현하는 미생물의 성장 가능성은 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)의 배양 배지로 전화효소를 첨가함으로서 설명된다. 전화효소의 첨가는 세포가 리그닌(예를 들어, 당밀)을 함유하는 당 소스에서 발효될 수 있도록 만든다. 조류 또는 다른 미생물은 본원에 기재된 바와 같이, 순수 글루코스에서 그러하듯이, 당밀에서 잘 성장하도록 조작될 수 있으며, 사탕수수 가공의 이러한 저-가치 폐기물의 이용이 탄화수소의 생산에서 상당한 비용 절약을 제공할 수 있다. 도 19-20은 세포외 자당 전화효소의 존재 또는 부재하에서 글루코스 또는 자당에서의 성장과 비교하여, 세개의 당밀 소스(BSl, BS2 및 HTM으로 지정됨)에서의 세포의 성장을 나타내고 있다.

자당 전화효소는 또한 자당 운반체를 발현하는 세포뿐만 아니라, 자당을 세포 내로 들어가도록 하는 임의의 탄수화물 운반체를 발현시키는 세포에서 세포내 적으로 발현될 수 있다.

B. 지질 경로 조작( engineering )

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 이용되기 유용한 미생물은 미생물의 배양(예를 들어, 자당 공급원료의 이용이 유리하도록 자당 전화 유전자의 발현) 또는 본 발명의 직접적인 화학적 개질을 수행(예를 들어, 바이오매스 분해가 유리하도록 용해 유전자의 발현 및/또는 트랜스에스테르화를 촉매화하도록 리파아제 유전자의 발현)하는데 유용할 수 있는 특정 유전자를 발현하도록 선택적으로 조작될 수 있다. 더욱이, 선택적 유전적 조작은 미생물의 지질 경로를 조작하는데 유리하게 이용될 수 있다. 이 경로는 생산된 지질의 특성 및/또는 비율을 변경하고/하거나 지질 내로의 탄소의 유동을 증가시키도록 개질될 수 있다.

1. 생산된 지질의 특성 및/또는 비율 변경

미세조류의 경우, 일부 야생형 세포는 이미 양호한 성장 특성을 지니고 있으나 요망되는 유형 또는 양의 지질을 생성하지 않는다. 예로는 피로보트리스(Pyrobotrys), 포르미디움(Phormidium), 아그메넬룸(Agmenellum), 카르테리아(Carteria), 레포신클리스(Lepocinclis), 피로보트리스(Pyrobotrys), 니츠스치아(Nitzschia), 레포신스리스(Lepocinclis), 아나바에나(Anabaena), 유글레나(Euglena), 스피로기라(Spirogyra), 클로로코쿰(Chlorococcum), 테트라에드론(Tetraedron), 오실라토리아(Oscillatoria), 파거스(Phagus), 및 클로로고니움(Chlorogonium)이 있고, 이들은 도시 하수 또는 폐수에서 성장하는 요망되는 성장 특성을 지닌다. 이러한 세포는 개선된 지질 생성 특성을 지니도록 조작될 수 있다. 요망되는 특성은 단위 부피 및/또는 단위 시간 당 지질 수율의 최적화, 탄소 사슬 길이(예컨대, 탄화수소 공급원료를 필요로 하는 바이오디젤 생산 또는 산업 적용을 위해)의 최적화, 이중 또는 삼중 결합 수의 감소, 선택적으로 0까지 감소, 고리 및 사이클릭 구조의 제거 또는 배제, 및 지질이나 다른 지질 집단 중의 특정 종들의 수소:탄소 비 감소를 포함한다. 또한, 원하는 지질을 생산하는 미세조류도 훨신 더 유리한 산출을 지니도록 조작될 수 있다. 이러한 미세조류의 예는 클로렐라(Chlorella) 속의 종들을 포함한다.

특정 구체예에서, 지방산 합성을 위한 대사에서 분지점을 제어하는 하나 이상의 중요 효소(key enzymes)는 지질 생성을 개선하도록 상향조절되거나 하향조절될 수 있다. 상향조절은, 예를 들어 세포를 전사를 증가시키는 강력한 프로모터 및/또는 인핸서 요소를 이용하여, 관심있는 효소를 엔코딩하는 유전자가 발현되는 발현 작제물로 세포를 형질전환시킴에 의해 달성될 수 있다. 이러한 작제물은 형질전환체가 선별될 수 있도록 선택가능한 마커를 포함할 수 있고, 이것은 작제물의 증폭 및 엔코딩된 효소의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 상향조절에 적합한 효소의 예는 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 역할을 하는 피루베이트 탈수소효소를 포함한다(미세조류로부터의 일부 예는 젠뱅크 수탁 번호 NP_415392; AAA53047; QlXDM1; 및 CAF05587을 포함한다). 피루베이트 탈수소효소의 상향조절은 아세틸-CoA의 생성을 증가시킬 수 있으므로, 지방산 합성을 증가시킨다. 아세틸-CoA 카르복실라아제는 지방산 합성에서 최초 단계를 촉매화한다. 따라서, 이 효소는 지방산의 생산을 증가시키도록 상향조절될 수 있다(미세조류로부터의 일부 예는 젠뱅크 수탁 번호 BAA94752; AAA75528; AAA81471; YP_537052; YP_536879; NP_045833; 및 BAA57908을 포함한다). 지방산 생산은 지방산 합성 동안 성장하는 아실 쇄를 포함하는 아실 운반 담백질(ACP)의 상향조절에 의해서도 증가될 수 있다(미세조류로부터의 일부 예는 젠뱅크 수탁 번호 A0T0F8; P51280; NP_849041; YP_874433을 포함). 글리세롤-3-인산염 아실트랜스퍼라아제는 지방산 합성의 속도-제한 단계를 촉매화한다. 이 효소의 상향조절은 지방산 생산을 증가시킬 수 있다 (미세조류로부터의 일부 예는 젠뱅크 수탁 번호 AAA74319; AAA33122; AAA37647; P44857; 및 ABO94442를 포함한다). 전술한 단백질이 클로렐라(Chlorella) 속의 종들을 포함하는 미세조류에서의 발현을 위한 후보들이다.

관심있는 효소의 하향조절은, 예컨대 안티센스, 촉매적 RNA/DNA, RNA 간섭(interference)(RNAi), "녹-아웃", "녹-다운", 또는 다른 돌연변이발생 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 효소 발현/기능은 또한 인트라보디(intrabody)를 이용하여 억제될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 하향조절에 적합한 효소의 예는 아세틸-CoA를 트리카르복실산(TCA) 사이클의 일부로서 소비하는 시트레이트 합성효소를 포함한다. 시트레이트 합성효소의 하향조절은 더 많은 아세틸-CoA를 지방산 합성 경로로 강제할 수 있다.

총체적 조절제(regulators)는 지방산 생합성 경로의 유전자 발현을 조절한다. 따라서, 지방산의 하나 이상의 총체적 조절제는 적절한 경우 다수의 지방산 합성 유전자의 발현을 각각 억제 또는 강화시키고, 궁극적으로는 지질 생산을 증가시키도록 상향- 또는 하향-조절될 수 있다. 예로는, 스테롤 조절 인자 결합 단백질(SREBPs),예컨대 SREBP-1a 및 SREBP-1c를 포함한다(예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NP_035610 및 Q9WTN3). 총체적 조절제는 제어 포인트 효소의 조절과 관련하여 상기 개시된 대로 상향-조절되거나 하향-조절될 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 지질 합성 동안 아실 운반 단백질로부터 원하는 탄소 쇄 길이를 지닌 지방산의 분열을 유리하게 할 수 있는, 지질 경로 효소, 예컨대, 예를 들어, 지방산 아실-ACP 티오에스테라제(수탁번호를 포함한 표 4 예를 참조) 또는 아실 운반 단백질(ACP)을 엔코딩하는 하나 이상의 외인성 유전자를 발현하도록 유전적으로 조작된 미생물(예를 들어, 미세조류, 유질성 효모, 박테리아 또는 진균)을 이용하여 실행될 수 있다. 지방산 아실-ACP 티오에스테라제는 특정 탄소 쇄 길이를 지닌 지방산에 대한 이의 특이성을 기초로 하여 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 지방산 아실-ACP 티오에스테라제는 유도가능 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자에서 발현될 수 있고/있거나, 세포내 구획에서 발현될 수 있다. 일부 구체예에서, 지방산 아실-ACP 티오에스테라제를 엔코딩하는 유전자 및 자연적으로 공동-발현된 ACP는, 상기 기술된 바와 같이, 다른 지질 경로 효소를 엔코딩하는 선택적으로 하나 이상의 유전자와 함께, 세포내로 형질전환될 수 있다. 또 다른 구체예에서, ACP 및 지방산 아실-ACP 티오에스테라제는 이들이 특정 조직 또는 유기체에서 자연적으로 공동-발현되거나, 공동-발현되지 않는지와 무관하게, 서로에 대해 친화력을 가질 수 있으며 이는 상기 두가지가 본 발명의 방법 및 미생물에서 함께 사용되는 경우, 이점을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법은 이러한 효소의 자연적으로 공동-발현된 쌍을 발현하는 세포를 비롯하여, ACP로부터 길이-특이적 탄소 쇄의 분열을 유리하게 하도록 서로 상호작용하기 위한 친화력을 공유하는 쌍으로 실시될 수 있다.

본 발명의 이용에 적합한 추가적 개질의 예는 현재 거절된 US 가출원 제 60/837,839호(2006년 8월 15일 출원) 및 미국 특허 가출원 제 11/893,364호(2007년 8월 15일 출원)(본원에 참조로서 통합됨)에 기재되어 있다. 이 출원은 첫번째는 고정된 탄소원(예컨대, 자당)의 운반체를 엔코딩하고, 두번째는 자당 전화 효소를 엔코딩하는 두 개 이상의 외인성 유전자를 발현하도록 미생물 균주를 유전적으로 조작하는 것을 개시한다. 생산된 발효가능 유기체는 기존의 공지된 생산 방법에 의해 획득가능한 것보다, 더 낮은 제조 비용으로 지질을 생산한다. 또한 이 동시-계속중인(co-pending) 출원은, 상기 기재된 두개의 외인성 유전자의 삽입이 직접적 및/또는 랜럼 돌연변이발생을 통해 다당류 생합성의 분해와 결합될 수 있고, 이는 지질 생산에 훨씬 더 많은 탄소 유동을 유발한다는 것을 개시하고 있다. 개별적으로 및 조합으로, 영양적 전환, 지질 생산을 변형하도록 조작 및 외인성 효소로의 처리는 미생물에 의해 생산된 지질 구성을 변형시킨다. 상기 변형은 생산된 지질의 양, 다른 지질에 비하여 생산된 하나 이상의 지질 종의 함량 및/또는 미생물에서 생산된 지질 종의 유형을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 미세조류는 더 높은 함량 및/또는 TAGs 퍼센트, 또는 특정 탄소 길이 지방산 분자의 더 높은 비율을 지닌 TAGs를 생산하도록 조작될 수 있다.

본 발명의 미생물 및 방법과 사용되기에 적합한 지방산 아실-ACP 티오에스테라제는 표 4에 나열된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

지방산 아실-ACP 티오에스테라제 및 젠뱅크 수탁번호

움벨루라이아 칼리포르닉(Umbellularia californic) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크#AAC49001) 신나모뭄 캄포라(Cinnamomum camphora) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #Q39473) 움벨루라이아 칼리포르니카(Umbellularia californica) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크#Q41635) 미리스티카 프래그란스(Myristica fragrans) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #AAB71729) 미리스티카 프래그란스(Myristica fragrans) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #AAB71730) 엘라에이스 귀닌시스(Elaeis guineensis) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #ABD83939) 엘라에이스 귀닌시스(Elaeis guineensis) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #AAD42220) 포풀러스 토멘토사(Populus tomentosa) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #ABC47311) 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크#NP_172327) 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #CAA85387) 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #CAA85388) 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #Q9SQI3) 쿠페아 란세올라타(Cuphea lanceolata) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #CAA54060) 쿠페아 후케리아나(Cuphea hookeriana) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #AAC72882) 쿠페아 칼로펠라 아종 메소스테몬(Cuphea calophylla subsp. mesostemon) 지방산 아실-ACP 티오에스테라아제 (젠뱅크 #ABB71581) 쿠페아 란세올라타(Cuphea lanceolata) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #CAC19933) 엘라에이스 귀닌시스(Elaeis guineensis) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #AAL15645) 쿠페아 후케리아나(Cuphea hookeriana) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #Q39513) 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #AAD01982) 비티스 비니페라(Vitis vinifera)지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #CAN81819) 가르시니아 망고스타나(Garcinia mangostana) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #AAB51525) 브라시카 준세아(Brassica juncea) 지방산 아실-ACP 티오에스테라제 (젠뱅크 #ABI18986) 마드후카 롱기폴리아(Madhuca longifolia) 지방산 아실-ACP 티오에스테라아제 (젠뱅크 #AAX51637) 브라시카 나푸스(Brassica napus) 지방산 아실-ACP 티오에스테라아제 (젠뱅크 #ABH11710) 오리자 사티바(Oryza sativa) (인디카 컬티바-그룹(indica cultivar-group)) 지방산 아실-ACP 티오에스테라아제 (젠뱅크 #EAY86877) 오리자 사티바(Oryza sativa) (자포니카 컬티바-그룹(japonica cultivar-group)) 지방산 아실-ACP 티오에스테라아제 (젠뱅크 #NP_001068400) 오리자 사티바(Oryza sativa) (인디카 컬티바-그룹) 지방산 아실-ACP 티오에스테라아제 (젠뱅크#EAY99617) 쿠페아 후케리아나(Cuphea hookeriana) 지방산 아실-ACP 티오에스테라아제 (젠뱅크 #AAC49269)

본 발명의 미생물 및 방법과 사용되기 위한 또 다른 적합한 효소는 표 4에 나열된 단백질 중 하나와 70% 이상의 아미노산 상동성을 가지며, 동일한 요망된 효소적 활성을 보이는(즉, 아실 운반 단백질로부터 지방산의 절단) 것을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 효소적 활성은 하나 이상의 상기 기술된 서열(이들 중 전부가 본원에 참고로서 통합됨)과 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 99% 이상의 상동성을 가지는 서열 내에 존재한다.

상기 기술된 지질 경로 효소는 미생물(예를 들어, 미세조류, 유질성 효모, 또는 진균) 또는 미생물 집단으로부터의 다양한 지질의 생산에서 유용하며, 여기서 지방산 아실-ACP 티오에스테라제는 지질 합성 동안에 아실 운반 단백질(ACP)로부터 지방산을 절단한다. 이러한 지질 경로 효소는 특정 수의 탄소 원자를 포함하는 기질에 작용하기 위한 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, 지방산 아실-ACP 티오에스테라제는 ACP로부터 16개의 탄소 원자를 지니는 지방산을 절단하기 위한 특이성을 가질 수 있다. 따라서, 다양한 구체예에서, 미생물은 기질 내에 포함된 탄소 원자 수에 관하여 효소적 활성(예를 들어, ACP로부터 지방산을 절단)을 촉매화하기 위한 특이성을 지니는 단백질을 엔코딩하는 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 효소적 특이성은, 다양한 구체예에서, 8 내지 34개의 탄소 원자, 바람직하게는 8 내지 18개의 탄소원자, 더욱 바람직하게는 14 내지 18개의 탄소원자를 지니는 기질에 대한 것일 수 있다.

발현되기 위한 외인성 유전자의 요망되는 조합을 선별함으로서, 발명자는 미생물에 의해 생성된 지질 성분을 맞출 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 배양된 경우, 미생물은 ACP에 연결된 지방산을 합성하고, 지방산-아실 ACP 티오에스테라제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매화하여 추가 효소적 공정을 통해 TAG 통합 지방산 분자를 산출한다.

2. 지질 경로로의 증가된 탄소 유동

일부 미세조류는 상당한 양의 비지질 대사산물, 예컨대 다당류를 생산한다. 다당류 생합성이 세포가 이용할 수 있는 총 대사 에너지의 상당한 비율을 이용할 수 있으므로, 지질-생산 세포의 돌연변이발생에 이어 감소되거나 배제된 다당류 생성에 대해 스크리닝하는 것은 더 높은 수율의 지질을 생성할 수 있는 신규한 균주를 발생시킨다.

클로렐라 내에서 트랜스유전자의 발현의 예는 문헌(예를 들어, [Current Microbiology Vol 35 (1997), pp 356-362; Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2000 Jul; 16(4) 443-6, Current Microbiology VoI 38 (1999), pp 335-341; Appl Microbiol Bwtechnol(2006) 72:197-205, Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002, Current Genetics 39:5, 365-370 (2001), Plant Cell Reports 18:9, 778-780, (1999); Biologia Plantanum 42(2) 209-216, (1999); Plant Pathol J 21(1) 13-20, (2005)] 참조)에 기재되어 있다. 클로렐라 내로 트랜스유전자를 도입하기 위한 임의의 편리한 기술은 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.

유질성 효모(예를 들어, 야로비아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)내에서 트랜스유전자의 발현의 예시는 문헌(예를 들어, [Bordes et al, J Microbiol Methods Jun 27 (2007)] 참조)에서 발견될 수 있다. 진균(예를 들어, 모르티에렐라알핀(Mortierella alpine), 무콜 실시넬로이드(Mucor circinelloides), 및 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus)) 내에서 트랜스유전자의 발현의 예시는 문헌(예를 들어, [Microbiology, Jul, 153(Pt. 7) 2013-25(2007); Mol Genet Genomics, Jun;271(5):595-602(2004); Curr Genet, Mar;21(3):215-23(1992); Current Microbiology, 30(2):83-86(1995); Sakuradani, NISR Research Grant, "Studies of Metabolic Engineering of Useful Lipid-producmg Microorganisms" (2004); 및 PCT/JP2004/012021] 참조)에서 또한 발견될 수 있다. 박테리아, 예컨대, 대장균(E. coli) 내에서 외인성 유전자의 발현의 예는 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, Sambrook et al(3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press] 참조).

IV . 동일계 트랜스에스테르화의 방법

본 발명의 방법에 따른 지방산 알킬 에스테르로의 TAGs의 동일계 트랜스에스테르화는 본원에 기술된 미생물 배양액에서 생성된 바이오매스에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 바이오매스는 바이오매스의 종 또는 상이한 균주의 두개 이상의 배양액으로부터 결합된 바이오매스를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 균주 또는 종은 상이한 당지질 프로파일을 갖는다(실시예 22 및 24에 설명됨).

본 발명의 일부 방법에서, 미생물 바이오매스를 우선 배양 배지로부터 수확하고, 건조하고, 그 다음 선택적인 바이오매스 분해 공정을 거친 후 트랜스에스테르화를 시킨다. 본 발명의 또 다른 방법에서, 미생물 바이오매스를 바이오매스 분해 공정을 거친 후, 건조 및 트랜스에스테르화 시킨다. 일부 방법에서, 바이오매스의 수확은 예를 들어, 세포 배양 생물반응기의 내용물을 스크린 또는 필터링 기구와 유사한 기구를 통해 통과시킴으로서, 물 및 세포 배양 배지로부터 바이오매스의 세포성 구성성분을 분리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이오매스의 수확은 세포 배양액의 세포성 구성성분을 패이스트 또는 저 수분-함량 조성물로 가공하는 것을 포함한다.

A. 건조 방법

본원에 기술된 배양된 미생물로부터 생성된 바이오매스를 건조하는 것은 하기에서 더 상세히 기재된, 트랜스에스테르화 반응 동안, 기질로서 다른 방법으로 이용가능한 물을 제거하는 것이며, 이는 요망되는 지방산 알킬 에스테르 이외에, 유리 지방산의 형성을 유도한다. 본 발명의 동일계 트랜스에스테르화 방법에서 사용된 바이오매스의 양은 트랜스에스테르화 공정에서 사용된 알코올:바이오매스의 비, 알코올의 비용 및 트랜스에스테르화가 수행될 반응 용기의 크기에 놓여진 기타 부피 제한 또는 비용에 따라 건조되어야 한다. 바이오매스에 대한 "허용 건조"를 경정하는, 바이오매스의 건조 비용에 대하여 균형을 맞춘 이러한 인자는 높이 평가될 것이다.

일부 구체예에서, 상기 바이오매스는 바이오매스가 드럼 내에서 회전되며, 공기의 적용과 함께 건조되는 드럼 건조기를 이용해 건조될 수 있으며, 이는 가열되어 건조 공정을 진척시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 오븐 또는 스프레이 건조기가 사용되어, 바이오매스의 건조를 유리하게 할 수 있다. 대안적으로, 상기 바이오매스는 동결건조 과정을 통해 건조될 수 있다. 동결건조 과정은 간결하게 바이오매스가 냉동-건조 챔버에서 냉각되는 "냉동-건조" 과정으로 설명될 수 있다. 냉동-건조 챔버에 진공을 적용하는 것은 바이오매스로부터 물의 승화(제 1 건조) 및 탈착(desorption)(제 2 건조)을 유발하고, 이는 하기 기재된 추가 공정에 적합한 산물을 생성한다. 또 다른 구체예에서, 앞서 말한 조합은 본원에 기술된 방법에 따라 추가적 가공을 위해 바이오매스를 적절하게 건조하는데 이용될 수 있다.

B. 바이오매스 분해 방법

일부 구체예에서, 바이오매스를 분해시킨 후 동일계 에스테르화하여 미생물의 세포내 내용물이 더 쉽게 알코올에 접근하도록 하고 트랜스에스테르화 시약을 촉매화하는 것이 요망될 수 있다. 이는 TAGs를 지방산 알킬 에스테르 또는 본 발명에 따른 기타 분자로 변환시키기에 유리하도록 도울 수 있다.

본 발명의 일부 방법에서, 바이오매스의 분해는 바이오매스를 상기 기술된 하나 이상의 건조 방법에 적용하기 이전에 이뤄질 수 있다. 다른 방법에서, 바이오매스의 분해는 이러한 건조 공정을 따를 수 있다. 일부 방법에서, 물은 바이오매스를 건조 공정에 적용하거나 적용하지 않으면서, 바이오매스의 분해 전 또는 후에 제거된다. 성장된 후, 미생물은 선택적으로 배양배지를 배양함으로서 분리되어, 농축된 미생물 바이오매스를 생성시킨다. 바이오매스의 분해는 미생물 세포의 용해에 의해 성립되어 용해물을 생성할 수 있다. 세포 용해는 효소, 예컨대 프로테아제 또는 다당류 분해 효소, 예컨대, 아밀라아제의 이용을 통해, 초음파, 기계적 용해의 이용을 통해, 삼투압 충역, 용해성 바이러스의 감염 및/또는 하 나 이상의 용해성 유전자의 발현을 통해, 염기의 첨가, 산의 첨가, 열-유도 용해를 포함하는 편리한 수단에 의해 달성될 수 있다. 용해는 미생물에 의해 생성된 세포내 분자를 방출하기 위해 수행된다. 미생물의 이러한 각각의 용해 방법은 단일 방법으로 또는 조합하여 이용될 수 있다.

세포 분해의 정도는 현미경 분석에 의해 관찰될 수 있다. 본원에 기술된 하나 이상의 방법을 이용하여, 일반적으로 70%를 초과하는 세포 파손(breakage)이 관찰된다. 바람직하게는, 세포 파손은 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과 및 가장 바람직하게는 약 100%이다.

특정 구체예에서, 예를 들어, 세포 지질의 노출을 증가시켜 트랜스에스테르화를 촉매화하기 위해(예컨대 하기 기술된 바와 같이 표현된, 리파아제 또는 화학적 촉매) 미생물은 성장 후에 용해된다. 리파아제 발현(예를 들어, 유도성 프로모터를 통해)의 시점, 세포 용해, 및 트랜스에스테르화 반응 조건(예를 들어, 물의 제거, 알코올의 첨가 등)의 조절은 리파아제-매개 트랜스에스테르화로부터 지방산 에스테르의 산출을 최적화하기 위해 조절될 수 있다.

본 발명의 제 1 구체예에서, 미생물을 용해하는 방법은 미생물을 함유한 세포성 현탁액을 가열시키는 것을 포함한다. 이러한 구체예에서, 미생물을 함유한 배양 배지(또는 배양배지로부터 분래된 미생물 현탁액)은 미생물, 즉 미생물의 세포벽 및 세포막이 분해되거나 파괴될 때까지 가열된다. 일반적으로, 적용된 온도는 50℃ 이상이다. 높은 온도, 예컨대, 60℃ 이상, 70℃ 이상, 80℃ 이상, 90℃ 이상, 100℃ 이상, 110℃ 이상, 120℃ 이상, 130℃ 이상, 또는 그보다 높은 온도가 더 효과적으로 세포 용해에 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해하는 방법은 미생물을 포함하는 세포성 현탁액에 염기를 첨가하는 것을 포함한다. 상기 염기는 사용된 미생물의 단백질성(proteinaceous) 화합물의 적어도 일부분을 가수분해하기에 충분하도록 강해야 한다. 단백질을 가용화시키기에 유용한 염기는 화학업계에 공지되어 있다. 이 방법에서 유용한 예시적 염기는 리튬, 소듐, 포타슘, 칼슘, 및 이들의 혼합물의 수산화물, 탄산염 및 중탄산염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 염기는 KOH이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해하는 방법은 미생물을 포함한 세포성 현탁액에 산을 첨가하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해하는 방법은 효소와 함께 미생물을 용해시키는 것을 포함한다. 미생물을 용해하기 위한 효소는 프로테아제 및 다당류-분해 효소, 예컨대, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 셀룰라아제, 및 드리셀라아제(driselase)를 포함한다. 다당류-분해 효소, 선택적으로, 클로렐라(Chlorella) 또는 클로렐라 바이러스(Chlorella virus)로부터의 다당류-분해 효소가 바람직하다. 오일 함유 바이오매스를 용해시키기 위한 바람직한 효소 쌍은 알칼라아제(alcalase) 및 만나웨이(mannaway)(노보자임스(Novozymes))이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해하는 방법은 초음파, 즉, 초음파분해(sonication)를 이용하여 수행된다. 세포는 또한 고주파음을 이용해 용해될 수 있다. 상기 소리는 전기적으로 생성되고 금속 팁을 통해 적절하게 농축된 세포 현탁액으로 운반될 수 있다. 이러한 음파분해(또는 초음파분해)는 세포 현탁액에서 공동의 생성에 기초하여 세포의 완전성을 파괴시킨다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해하는 방법은 기계적 수단에 의해 수행된다. 세포는 기계적으로 용해되고 임의로 균질화되어 지질 트랜스에스테르화를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 압력분쇄기를 이용하여 세포 함유 슬러리를 제한된 오리피스 밸브를 통해 펌핑할 수 있다. 고압(1500 바 이하)을 적용시킨 다음, 배출 노즐을 통해 즉시 팽창시킨다. 세포 분열은 세개의 상이한 메카니즘에 의해 달성된다: 밸브 상에 충돌, 오리피스에서 높은 액체 전단 응력, 및 배출시 급격한 압력 강하로 세포의 파열 야기. 이 방법은 세포내 분자들을 방출시킨다. 대안적으로, 볼 밀을 이용할 수 있다. 볼 밀에서, 세포는 비드와 같은 소형 연마용 입자와 함께 현탁액에서 교반된다. 세포는 전단 응력, 비드 사이에서의 분쇄 및 비드와의 충돌로 인해 파괴된다. 비드는 세포를 파괴시켜 세포의 내용물을 방출시킨다. 세포는 또한 예컨대 블렌딩(예컨대, 고속 또는 웨어링 블렌더(Waringblender)), 프렌치(french) 프레스, 또는 심지어 약한 세포벽의 경우에는 원심분리를 사용하여, 전단 응력에 의해 파괴될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해하는 방법은 삼투압 충격을 적용함으로서 수행된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해하는 방법은 증기 처리에 의해 즉, 가압 증기의 첨가를 통해서 수행된다. 세포 분해를 위한 미세조류의 증기 처리는 예를 들어, 미국 특허 제 6,750,048호에 기재되어 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해하는 방법은 용해성 바이러스를 이용한 미생물의 감염을 포함한다. 본 발명의 방법에 이용하기 적합한 미생물을 용해하기 위한 매우 다양한 바이러스가 공지되어 있으며, 특정 미생물에 대하여 특정 용해성 바이러스를 선택하고 이용하는 것은 당업자의 기술 수준 내에 있다. 예를 들어, 파라메시움 부르사리아 클로렐라(Paramecium bursaria chlorella) 바이러스(PBCV-1)는 특정 단세포, 진핵 클로렐라-유사 녹색 조류에서 복제되고 이를 용해시키는 큰 정20면체 플라크-형성 이중 가닥 DNA 바이러스 그룹의 원형이다(피코드나비리대(Phycodnaviridae) 패밀리, 클로로바이러스(Chlorovirus) 속). 따라서, 배양액을 적합한 클로렐라 바이러스로 감염시킴에 의해 임의의 민감한 미세조류, 예컨대 C. 프로토테코이드(C. protothecoides)가 용해될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Adv. Virus Res 2006,66 293-336, Virology, 1999 Apr 25,257(1) 15-23, Virology, 2004 Jan 5,318(1):214-23; Nucleic Acids Symp Ser 2000;(44):161-2; J Virol 2006 Mar,80(5): 2437-44; 및 Annu.Rev.Microbiol 1999;53:447-94]을 참고하라.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 미생물을 용해시키는 방법은 자가용해를 포함한다. 이 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 미생물은 미생물을 용해시킬 용해성 유전자를 생성하도록 유전적으로 조작된다. 이 용해성 유전자는 유도가능한 프로모터를 이용해 발현되어, 세포가 우선 요망되는 밀도로 배양 배지에서 성장된 후, 수확된 후, 프로모터의 유도에 의해 용해성 유전자가 발현되어 세포를 용해시킬 수 있다. 제 1 구체예에서, 용해성 유전자는 다당류-분해 효소를 엔코딩한다. 특정 기타 구체예에서, 용해성 유전자는 용해성 바이러스로부터의 유전자이다. 따라서, 예를 들어, 클로렐라 바이러스로부터의 용해성 유전자는 클로렐라, 예컨대, C. 프로토테코이드(C. protothecoides)에서 발현될 수 있다.

용해성 유전자의 발현은 바람직하게는 자극, 예컨대 소 분자, 빛, 열 및 기타 자극의 존재에 의해 유도된, 유도가능한 프로모터, 예컨대, 미세조류 내에서 프로모터의 활성을 이용해 이뤄진다. 클로렐라 바이러스로부터의 용해성 유전자가 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Virology 260, 308-315(1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387 (1999); 및 Virology 230, 361-368 (1997)]을 참조하라.

특정 구체예에서, 미생물은 성장 후에 용해되는데, 예를 들어, 세포성 지질의 노출을 증가시켜 트랜스에스테르화를 촉매화한다(예컨대, 하기 논의된 리파아제, 또는 화학적 촉매). 리파아제 발현(예를 들어, 유도성 프로모터를 통해)의 시점, 세포 용해, 및 트랜스에스테르화 반응 조건(예를 들어, 물의 제거, 알코올의 첨가 등)의 개질은 리파아제-매개 트랜스에스테르화로부터 지방산 에스테르의 산출을 최적화하기 위해 조절될 수 있다.

C. 트랜스에스테르화

본원에 기술된 바와 같은 미생물에 의해 생산된 지질은 본 발명에 따라 트랜스에스테르화 공정이 적용되어, 지방산 알킬 에스테르를 함유한 친유성 상 및 세포 물질 및 글리세롤을 포함한 친수성 상을 생성시킨다. 본 발명의 일부 방법에서, 친유성 상은 그 후 친수성 세포 물질로부터 분리된다.

1. 일반적인 화학적 공정

동물 및 식물 오일은, 전형적으로 3가 알코올, 글리세롤을 지닌 유리 지방산의 에스테르인 트리아실 글리세롤(TAGs)로 구성된다. 트랜스에스테르화에서, TAG 중에서 글리세롤은 저 알킬 알코올, 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올로 대체된다. 전형적인 반응 도식은 다음과 같다:

이 도식에서, 알콜이 염기로 탈양성자화되어 더 강력한 친핵제가 된다. 일반적으로, 에탄올 또는 메탄올은 상당히 과량(최대 50배)으로 사용된다. 일반적으로, 이 반응은 지나치게 천천히 진행되거나 거의 진행되지 않을 것이다. 열을 비롯하여 산 또는 염기는 반응이 신속하게 진행되는 것을 돕기 위해 사용될 수 있다. 산 또는 염기는 트랜스에스테르화 반응에 의해 소모되지 않으므로, 이들은 반응물이 아니라 촉매이다. 거의 모든 바이오디젤은 염기-촉매화된 기술을 이용하여 생산되는데, 이는 오직 저온 및 저압만이 요구되고 98% 초과의 전환 수율을 생성하기 때문이다(단, 출발 오일은 수분 및 유리 지방산이 적어야한다).

트랜스에스테르화의 특별한 경우는 화학적 결합을 파괴하기 위한 글리세롤분해(glycerolysis) 또는 글리세롤(글리세린)의 이용이다. 글리세롤분해 반응은 보통 산 또는 염기의 첨가에 의해 촉매화된다. 글리세롤분해는 단순히 에스테르, 지방, 유리지방산 또는 TAGs로 수행될 수 있으며, 여기서 메틸 에스테르는 과량의 글리세롤과 반응하여, 모노 및/또는 디글리세리드를 형성하며, 이는 메탄올을 부산물로서 생성한다. 모노 및 디글리세리드는 유화제로서 유용하며, 식품에 흔히 첨가된다.

2. 트랜스에스테르화를 위한 재조합 리파아제의 이용

트랜스에스테르화는 또한 염기 대신 효소, 예컨대 리파아제를 이용하여 실험적으로 수행되었다. 리파아제-촉매화된 트랜스에스테르화는 예를 들어 실온 내지 80℃의 온도, 및 1:1 초과, 바람직하게는 약 3:1의 TAG 대 저급 알코올의 몰비에서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 트랜스에스테르화에 사용하기에 적합한 리파아제에는 하기 표 5에 나열된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 트랜스에스테르화에 유용한 리파아제의 다른 예는 예를 들어, 미국 특허 제 4,798,793호, 제 4,940,845호, 제 5,156,963호, 제 5,342,768호, 제 5,776,741호 및 WO89/01032에서 확인된다(이들 각각은 본원에 참고로서 통합됨).

트랜스에스테르화에 이용되기 위한 리파아제

바이오디젤에 적합한 지방산 에스테르를 생산하기 위해 리파아제를 사용하는 것에 대한 하나의 도전은, 리파아제의 가격이 강 염기 과정에 의해 사용된 수산화나트륨(NaOH)의 가격보다 훨씬 더 고가라는 것이다. 이러한 도전은 재사용될 수 있는 고정된(immobilized) 리파아제를 사용함으로써 해소되었다. 그러나, 고정된 리파아제의 활성은, 리파아제에 기초한 과정이 생산 비용의 측면에서 강 염기 과정과 경쟁할 수 있도록 최소의 주기 수 동안 재사용된 후에도 유지되어야만 한다. 고정된 리파아제를, 트랜스에스테르화에 전형적으로 사용된 저급 알코올로 중독시킨다(poisoning). 본원에 참고로서 통합된, 미국 특허 제6,398,707호(위 등(Wu et al.)에게 2002년 6월 4일 자로 등록됨)는 부동화된 리파아제의 활성을 향상시키고 감소된 활성을 갖는 고정된 리파아제를 재생시키는 방법을 기술하고 있다.

특정 구체예에서, 재조합 리파아제는 리파아제가 작용하는, 지질을 생산하는 동일한 미생물에서 발현된다. 적합한 재조합 리파아제는 표 5에 나열된 것들을 포함하고/포함하며 이들은 표 5에 나열된 젠뱅크 수탁 번호하에 기재되거나, 표 5에 나열된 리파아제 중 하나와 70% 이상의 아미노산 상동성을 가지며 리파아제 활성을 보이는 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 구체예에서, 효소적 활성은 상기 기술된 서열 중 하나와 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 99% 이상의 상동성을 갖는 서열에 존재하며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.

미생물에서, 예컨대, 미세조류에서 리파아제 유전자의 발현을 위한 대표적인 벡터 디자인은 미세조류에서 활성하는 프로모터와 작동가능하게 연결된 리파아제를 엔코딩하는 유전자를 포함한다. 대안적으로, 벡터가 리파아제 유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하지 않는다면, 리파아제는 세포로 형질전환되어, 벡터 통합 지점에서 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터 없이 형질전환하는 방법은 미세조류에서 설명되어 왔다(예를 들어 [Plant Journal 14:4, (1998), pp 441-447] 참조). 벡터는 또한 항생제 또는 제초제, 즉 선택가능한 마커에 내성을 부여하는 단백질을 엔코딩하는 제 2 유전자를 포함할 수 있다. 선택적으로, 하나 또는 둘 모두의 유전자(들)는 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3'의 미번역된 서열이 뒤따른다. 2개의 유전자를 엔코딩하는 발현 카세트는 벡터 내에서 또는 개별 벡터 상에서 물리적으로 연결될 수 있다. 개별 벡터 분자가 세포를 형질전환시키기 위해 동시에 사용되는, 미세조류의 공동-형질전환이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, Protist 2004 Dec; 155(4): 381-93] 참조). 형질전환된 세포는 선택적으로, 내성 결핍 세포 카세트가 성장하지 않는 조건 하에서 항생제 또는 다른 선택가능한 마커의 존재하에서 성장하는 능력을 기초로 선택될 수 있다.

리파아제 및 선택가능 마커를 엔코딩하는 DNA는 코돈-최적화된 cDNA 일 수 있다. 미세조류에서 발현을 위한 유전자를 리코딩하는 방법이 미국 특허 제 7,135,290호에 기재되어 있다. 추가 정보는 www.kazusa. 또는 jp/codon에서 얻을 수 있다.

많은 프로모터가 미세조류에서 활성을 갖는데, 이는 형질전환된 조류에 대해 내인성인 프로모터를 비롯하여, 형질전환된 조류에 대해 내인성이 아닌 프로모터(즉, 다른 조류로부터의 프로모터, 고등식물로부터의 프로모터, 및 식물 바이러스 또는 조류 바이러스로부터의 프로모터)를 포함한다. 미세조류에서 활성을 갖는 외인성 및/또는 내인성 프로모터 및 미세조류에서 기능성인 항생제 내성 유전자가 당업계에 공지되어 있다. 외인성 유전자를 발현시키는데 사용된 프로모터는 이종 유전자 또는 이종 유전자가 될 수 있는 유전자에 자연적으로 연결된 프로모터일 수 있다. 일부 프로모터는 하나 이상의 미세조류 종에서 활성을 가진다. 다른 프로모터는 종-특이성이다. 바람직한 프로모터는 프로모터, 예컨대 클라미도모나스 레인할드티(Chlamydomonas reinhardtii)로부터의 RBCS2 및 바이러스성 프로모터, 예컨대, 카우리플로워 모자이크 바이러스(CMV) 및 클로렐라 바이러스를 포함하며, 이는 다수의 미세조류 종에서 활성을 보인다(예를 들어, [Plant Cell Rep 2005 Mar;23(10-11): 727-35; J Microbiol. 2005 Aug;43(4):361-5; Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(l): 63-73] 참조).

프로모터, cDNAs, 및 3'UTRs는 물론 벡터의 다른 인자는 기본 소스로부터 분리된 단편을 이용한 클로닝 기술을 통해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al(3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press)]; 및 US Patent 4,683,202 참조). 대안적으로, 인자는 공지된 방법을 이용하여 합성적으로 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Gene 1995 Oct 16,164(1): 49-53] 참조).

세포는 예를 들어, 유전자 총(biolistics), 전기천공법, 글라스 비드 형질전환(glass bead transformation) 및 실리콘 카바이드 단결정 형질전환(silicon carbide whisker transformation)을 포함하는, 임의의 기술에 의해 형질전환될 수 있다.

특정 구체예에서, 리파아제는 유도성 방식 및/또는 타겟팅된 방식으로 발현된다. 리파아제 유전자를 발현하기 위한 유도성 프로모터의 이용은, 조건이 조절된 경우(필요한 경우, 트랜스에스테르화를 강화하기 위해, 예를 들어, 세포의 분해 후, 반응 혼합물의 물 함량의 감소 및/또는 TAGs를 지방산 에스테르로 변환시키기 위해 충분한 알코올을 첨가), 미생물의 성장 후에 리파아제의 생산을 가능케 한다. 본 발명에서 유용한 유도성 프로모터는 자극, 예컨대, 외인성적으로 생산된 소 분자, 온도(가열 또는 냉각),빛 등에 반응하여, 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 매개하는 것을 포함한다. 적합한 프로모터는 본질적으로, 침묵 유전자의 전사를 활성화할 수 있거나, 바람직하게는, 실질적으로는, 낮은 수준으로 전사된, 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 상향 조절 할 수 있다. 후자의 경우, 리파아제의 전사 수준은 바람직하게는 그것이 발현된 미생물의 성장을 실질적으로 방해하지 않는다.

특정 구체예에서, 하나 이상의 세포 구획으로 리파아제의 발현을 표적화하는 것이 유리할 수 있는데, 상기 세포 구획에서는 리파아제가 트랜스에스테르화 반응이 개시될 때까지 대부분의 세포 지질로부터 격리된다.

3. 더 높은 오일:비-오일 비율을 지닌 바이오매스의 이점

농업 생산물의 직접적인 트랜스에스테르화는 미국 특허 출원 공개공보 제 20030229237호(2003년 12월 11일 공개) 및 제 20050020842호(2005년 1월 27일 공개)에서 보고된 바와 같이, 수행되어 왔다. 이러한 공정은 트랜스에스테르화 공정을 위한 기질로서 물질, 예컨대, 콩, 코코넛, 야자, 옥수수, 면, 아마, 유채/카놀라, 홍화, 해바라기 또는 다른 종자-오일 공급원료 또는 동물성 지방을 이용하여 지방산 알킬 에스테르를 생산한다.

본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 트랜스에스테르화 방법에서 유용한 TAGs 생성을 위해, 미생물 이용의 특별한 이점은, 바이오매스 내 오일 대 비-오일의 미를 조절할 수 있는 능력이며, 이는 예상외로 두가지 유리한 특성을 부여한다는 것을 발견하였다. 첫번째는, 하기 실시예에서 보여지듯이, 높은 오일 대 비-오일 비를 지닌 바이오매스의 트랜스에스테르화는 TAGs를 지방산 알킬 에스테르로 변환에서 증가된 효율성을 유도한다. 두번째는, 역시 하기 실시예에서 보여지듯이, 높은 오일 대 비-오일 비를 지닌 바이오매스의 트랜스에스테르화는 원치않는 이원자를 감소된 비율로 지니는 바이오디젤 생산물을 생성한다는 것이다. 후자의 경우, 트랜스에스테르화에 의해 생성된 친유성 상은 중량 기준으로, 60 ppm 이하의 양으로 인을 포함한다. 일부 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 인의 함량은 25 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 인의 함량은 10 ppm 이하이다. 또 다른 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 황의 함량은 80 ppm 이하이며, 또 다른 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 황의 함량은 60 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 황의 함량은 15 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 철의 함량은 2 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 아연의 함량은 40 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 아연의 함량은 12 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 마그네슘 및 칼슘의 혼합된 함량은 5 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 소듐 및 포타슘의 혼합된 함량은 50 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 친유성 상에서 중량 기준으로 소듐 및 포타슘의 혼합된 함량은 15 ppm 이하이다. 본 발명의 일부 방법은 생산물을 산출하는데, 두개 이상의 하기 이원자 또는 이원자의 조합은 트랜스에스테르화된 물질의 친유성 상에서 하기 농도로 농도가 제한된다: 황은 15 ppm 미만; 인은 20.001%미만의 총 질량; 마그네슘 및 칼슘의 혼합된 함량은 5 ppm 이하이며; 소듐 및 포타슘의 혼합된 함량은 15 ppm 이하이다.

종속영양적으로 성장된 고 오일 바이오매스의 또 다른 양태는, 특히 미세조류는, 트랜스에스테르화 후 친유성 상을 유발하는 카로테노이드의 함량이다. 본 발명의 일부 구체예에서, 루테인의 함량은 친유성 상 그램 당 400 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, 루테인의 함량은 친유성 상 그램 당 200 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, 루테인의 함량은 친유성 상 그램 당 100 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, 루테인의 함량은 친유성 상 그램 당 40 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, 루테인의 함량은 친유성 상 그램 당 5 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, 루테인의 함량은 친유성 상 그램 당 10 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, 루테인의 함량은 친유성 상 그램 당 30 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, 친유성 상은 상기 기술된 최대 및 최하 수준의 임의의 조합 사이의 루테인 함량을 포함한다(예컨대, 친유성 상 그램 당 400 마이크로그램 이하 및 5 마이크로그램 이상). 일부 구체예에서, 루테인의 함량은 친유성 상 그램 당 대략 35 마이크로그램이다.

일부 구체예에서, 제아잔틴(zeaxanthin)의 함량은 친유성 상 그램 당 275 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, 제아잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 150 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, 제아잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 75 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, 제아잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 25 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, 제아잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.5 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, 제아잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 10 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, 제아잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 20 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, 친유성 상은 상기 기술된 최대 및 최하 수준의 임의의 조합 사이의 제아잔틴 함량을 포함한다(예컨대, 친유성 상 그램 당 275 마이크로그램 이하 및 0.5 마이크로그램 이상). 일부 구체예에서, 제아잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 대략 23 마이크로그램이다.

일부 구체예에서, α-크립토잔틴(α-Cryptoxanthin)의 함량은 친유성 상 그램 당 8 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, α-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 5 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, α-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 2 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, α-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.1 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, α-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.001 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, α-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.01 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, α-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.05 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, 친유성 상은 상기 기술된 최대 및 최하 수준의 임의의 조합 사이의 α-크립토잔틴 함량을 포함한다(예컨대, 친유성 상 그램 당 8 마이크로그램 이하 및 0.01 마이크로그램 이상). 일부 구체예에서, α-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 대략 0.06 마이크로그램이다.

일부 구체예에서, β-크립토잔틴(β-Cryptoxanthin)의 함량은 친유성 상 그램 당 18 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, β-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 8 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, β-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 4 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, β-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 2 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, β-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.1 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, β-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 1 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, β-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 1.5 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, 친유성 상은 상기 기술된 최대 및 최하 수준의 임의의 조합 사이의 β-크립토잔틴 함량을 포함한다(예컨대, 친유성 상 그램 당 18 마이크로그램 이하 및 0.1 마이크로그램 이상). 일부 구체예에서, β-크립토잔틴의 함량은 친유성 상 그램 당 대략 1.8 마이크로그램이다.

일부 구체예에서, α-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 1.9 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, α-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 1 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, α-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.1 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, α-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.09 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, α-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.0005 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, α-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.01 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, α-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.05 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, 친유성 상은 상기 기술된 최대 및 최하 수준의 임의의 조합 사이의 α-카로틴 함량을 포함한다(예컨대, 친유성 상 그램 당 1.9 마이크로그램 이하 및 0.0005 마이크로그램 이상). 일부 구체예에서, α-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 대략 0.08 마이크로그램이다.

일부 구체예에서, β-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 14 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, β-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 10 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, β-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 4 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, β-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 1.5 마이크로그램 이하이다. 일부 구체예에서, β-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.1 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, β-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 0.9 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, β-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 1 마이크로그램 이상이다. 일부 구체예에서, 친유성 상은 상기 기술된 최대 및 최하 수준의 임의의 조합 사이의 β-카로틴 함량을 포함한다(예컨대, 친유성 상 그램 당 14 마이크로그램 이하 및 0.1 마이크로그램 이상). 일부 구체예에서, β-카로틴의 함량은 친유성 상 그램 당 대략 1.2 마이크로그램이다.

오일 대 비-오일의 높은 비율로 구성된 바이오매스에 본 발명의 방법을 적용하여, TAGs가 지방산 알킬 에스테르로의 변환에의 증가된 효율성, 및 친유성 상으로 도입된 이원자의 감소된 비율이 뜻밖의 이점이라 할 수 있다. 오일이 트랜스에스테르화 될 수 있는 향상된 효율성 및 트랜스에스테르화 산물 내 이원자의 감소된 비율을 보이는 실시예가 하기에 기술되어 있다.

일부 구체예에서, 트랜스에스테르화 및 화학적 개질의 다른 방법이 적용된 건조된 바이오매스의 오일 대 비오일 비는 1:20 이상, 1:19 이상, 1:18 이상, 1:17 이상, 1:16 이상, 1:15 이상, 1:14 이상, 1:13 이상, 1:12 이상, 1:11 이상, 1:10 이상, 1:9 이상, 1:8 이상, 1:7 이상, 1:6 이상, 1:5 이상, 1:4 이상, 1:3 이상, 1:2 이상, 1:1 이상이다. 또 다른 구체예에서, 트랜스에스테르화가 적용된 건조된 바이오매스의 오일 대 비오일 비는 적어도 1.1:1 이상, 1.2:1 이상, 1.3:1 이상, 1.4:1 이상, 1.5:1 이상, 1.6:1 이상, 1.7:1 이상, 1.8:1 이상, 1.9:1 이상, 2:1 이상, 3:1 이상, 4:1 이상, 5:1 이상, 6:1 이상, 7:1 이상, 8:1 이상, 9:1 이상, 10:1 이상이다.

V. 지질-함유 바이오매스의 화학적 개질의 또 다른 방법

본 발명은 수소화, 인터에스테르화, 수산화, 및 가수분해 플러스 유도체화를 포함하는, 다양한 산업적 및 기타 적용에 유용한 생산물을 산출하는 트랜스에스테르화 이외의 화학적 개질 방법을 제공한다. 트랜스에스테르화에 관한 상기 기술된 것과 유사한 방식으로, 이러한 화학적 개질이 또한 본원에 기술된 미생물 배양액으로부터 생성된 바이오매스에 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 바이오매스는 미생물의 두개 이상의 별개의 균주 또는 종의 배양액으로부터 결합된 바이오매스를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 별개의 균주 또는 종은 상이한 당지질 프로파일(실시예 22에서 설명된 바와 같이)을 갖는다. 본 발명의 일부 방법에서, 상기 미생물 바이오매스는 우선 배양 배지로부터 수확된 후, 1% 이상의 지질을 공유결합적으로 개질시키는 화학적 반응이 적용된다. 일부 구체예에서는, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상의 지질이 화학적 과정에 의해 개질된다.

A. 수소화: 이중 결합의 포화

수소화는 유리 지방산의 또는 당지질의 지방산 구성성분 내 이중결합에 대해 수소를 첨가하는 것이다. 상기 수소화 과정은 액체 오일을 특정 적용에 더욱 적합할 수 있는 반-고체 또는 고체 지방으로 변환시키는 것을 가능케 한다. 수소화는 잘-공지된 화학적 공정이며, 일반적으로 증가된 온도(예를 들어, 140~225℃)에서, 수소의 존재하에, 오일 혼합물을 미세하게 나뉘어진 전이금속(예를 들어, 니켈, 팔라듐, 플라티늄, 또는 로듐) 촉매에 접촉하는 것을 포함한다.

본원에 기술된 방법에 의해 생산된 바이오매스의 수소화는 지질로서, 20% 이상의 DCW의 퍼센트를 지닌 미생물 바이오매스를 포함하는, 본원에서 제공된 하나 이상의 방법 및/또는 물질과 연관되어 수행되어, 하기에서 보고되는 바와 같이, 제품을 생산할 수 있다: 미국 특허 제 7,288,278호(식품 첨가제 또는 의약품), 제 5,346,724호(윤활 제품), 제 5,475,160호(지방산 알코올), 제 5,091,116호(식용 오일), 제 6,808,737호(마가린 및 스프래드를 위한 구조적 지방), 제5,298,637호(감소된-칼로리 지방 대체물), 제 6,391,815호(수소화 촉매 및 황 흡착제), 제 5,233,099호 및 제 5,233,100호(지방산 알코올), 제 4,584,139호(수소화 촉매), 제 6,057,375호(거품 제거제),및 제 7,118,773호(식용 에멀젼 스프래드)(이들 각각은 본원에 참조로서 통합됨).

B. 인터에스테르화 : 당지질 의 지방산 구성성분 교환

자연적으로 생산된 당지질은 일반적으로 지방산 구성성분의 균일한 분배를 가지지 않는다. 오일의 내용 중에, 인터에스테르화는 두 개의 서로다른 당지질의 에스테르 사이에서 아실 라디칼의 교환을 지칭한다. 인터에스테르화 과정은 당지질의 혼합물의 지방산 구성성분이 재배치되어 분배 패턴을 개질할 수 있는 매카니즘을 제공한다. 인터에스테르화는 잘-공지된 화학적 공정이며, 일반적으로 촉매, 예컨대, 알칼리 금속 또는 알칼리 금속 알킬레이트(예를 들어, 소듐 메톡사이드) 존재하에, 일정 기간(예를 들어, 30분) 동안 오일 혼합물을 가열(약 200℃까지)하는 것을 포함한다. 이러한 공정은 오일 혼합물의 지방산 구성성분의 분배 패턴을 무작위화 시키는데 사용될 수 있거나, 원하는 분배 패턴을 생성하도록 유도될 수 있다. 이러한 지질의 화학적 개질의 방법은 본원에서 제공된 물질, 예컨대, 20% 이상의 DCW 지질 퍼센트를 지닌 미생물 바이오매스에서 수행될 수 있다.

지방산의 특정 분배 패턴이 추구되는, 유도된 인터에스테르화는 현존할 수 있는 일부 TAGs의 녹는점 이하의 온도에서, 오일 혼합물을 유지시킴으로서 수행될 수 있다. 이는, 이러한 TAGs의 선택적 결정화를 유발시키고, TAGs이 결정화됨으로서, 반응 혼합물로부터 이들을 효과적으로 제거한다. 상기 공정은 대부분의 지방산이 오일 중에서 침전될 때까지 계속될 수 있다. 유도된 인터에스테르화 공정은, 예를 들어, 장-쇄 지방산을 단-쇄 대응부로 치환함으로서 저 칼로리 함량을 지닌 산물을 생산하는데 이용될 수 있다. 유도된 인터에스테르화는 불필요한 트랜스 아이소머를 생산할 수 있는, 수소화에 의존하지 않고, 식품 첨가제 또는 식품 제품(예를 들어, 마가린)의 생산에서 추구되는 원하는 녹는점 및 구조적 특성을 제공할 수 있는 지방 혼합물을 지닌 생산물을 생산하는데 또한 이용될 수 있다.

본원에 기술된 방법에 의해 생산된 바이오매스의 인터에스테르화는 하기에서 보고된 바와 같이, 하나 이상의 방법 및/또는 물질과 연관되어 수행되어, 제품을 생산할 수 있다: 미국 특허 제 6,080,853호(비소화성 지방 대체물), 제 4,288,378호(땅콩 버터 안정제), 제 5,391 ,383호(식용 스프레이 오일), 제 6,022,577호(식품 제품을 위한 식용 지방), 제 5,434,278호(식품 제품을 위한 식용 지방), 제 5,268,192호(저 칼로리 견과 제품), 제 5,258,197(감소된 칼로리 식용 조성물), 제 4,335,156호(식용 지방 제품), 제 7,288,278호(식품 첨가제 또는 의약품), 제 7,115,760호(분획화 과정), 제 6,808,737호(구조성 지방), 제 5,888,947호(엔진 윤활제), 제 5,686,131호(식용 오일 혼합물), 및 제 4,603,188호 (경화가능 우레탄 조성물)(이들 각각은 본원에 참조로서 통합됨).

본 발명의 제 1 구체예에서, 상기 기술된 바와 같이, 바이오매스의 트랜스에스테르화는 폴리올(본원에 참고문헌으로서 통합된, 미국 특허 제 6,465,642호에서 보고된 바와 같이)과 트랜스에스테르화된 생성물의 반응이 뒤따라, 폴리올 지방산 폴리에스테르를 생성한다. 트랜스에스테르화는 또한 본원에 참조로서 통합된, 미국 특허 제 6,278,006호에서 보고된 바와 같이, 단쇄 지방산 에스테르를 지닌 미생물 바이오매스에서 수행될 수 있다.

C. 수산화: 이중 결합에 물을 첨가함으로서 포화

수산화는 이중 결합에 물을 첨가하여 포화 및 수산기 잔기의 통합을 유발하는 것에 관한 것이다. 수산화 과정은 당지질의 하나 이상의 지방산 구성성분을 히드록시 지방산으로 변환시키는 것에 대한 메카니즘을 제공한다. 수산화는 예를 들어, 미국 특허 제 5,576,027호(본원에 참조로서 통합됨)에서 보고된 방법을 통해 수행될 수 있다. 피마자 오일 및 이의 유도체를 포함하는, 수산화된 지방산은 식품 첨가제, 계면활성제, 색소 습윤제, 거품방지제, 방수 첨가제, 가소화제(plasticizing agents), 화장품 유화제, 및/또는 탈취제를 포함하는 여러 산업적 적용을 비롯하여, 전자제품, 의약품, 페인트, 잉크, 접착제 및 윤활제에서 구성성분으로서 유용하다.

본원에 기술된 방법에 의해 생산된 미생물 바이오매스의 수산화는 하기에서 보고된 바와 같이, 하나 이상의 방법 및/또는 물질과 연관되어 수행되어, 제품을 생산할 수 있다: 미국 특허 제 6,590,113호(오일-기초 코팅 및 잉크), 제 4,049,724호(수산화 과정), 제 6,113,971호(올리브 오일 버터), 제 4,992,189호(윤활제 및 윤활유 첨가제), 제 5,576,027호(수산화된 우유), 및 제 6,869,597호(화장품)(이들 각각은 본원에 참조로서 통합됨).

수산화된 당지질은 에스토리드로 변환될 수 있다. 에스토리드는 수산화된 지방산 구성성분이 또 다른 지방산 분자로 에스테르화된, 당지질로 이루어진다. 수산화된 당지질의 에스토리드로의 변환은 본원에 참조로서 통합된, 문헌[Isbell et al, JAOCS 71(2):169-174 (1994)]에 기재된 바와 같이, 당지질과 지방산의 혼합물을 가열하고, 이 혼합물을 미네랄산과 접촉시킴에 의해서 수행될 수 있다. 에스토리드는 하기에서 보고된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 적용에 유용하다: 미국 특허 제 7,196,124호(엘라스토머 물질 및 바닥 커버링), 제 5,458,795호(고-온 적용을 위한 비후화된 오일), 제 5,451,332호(산업적 적용을 위한 유체), 제 5,427,704호(연료 첨가제), 및 제 5,380,894호(윤활제, 그리스, 가소제, 및 프린팅 잉크)(이들 각각은 본원에 참조로서 통합됨).

D. 가수분해 플러스 유도체화 : 유리 지방산의 절단 및 개질

본 발명의 방법에 의해 생산된 당지질로부터 지방산 구성성분의 가수분해는, 유도되어 다른 유용한 화학적 독립체를 생산할 수 있는 유리 지방산을 산출시킨다. 가수분해는 물 및 산 또는 염기 촉매의 존재하에서 발생한다. 유리된 유리 지방산은 하기 보고된 바와 같이, 다양한 제품을 산출하기 위해 유도될 수 있다: 미국 특허 제 5,304,664(높게 황산화된 지방산), 제 7,262,158호(클린징 조성물), 제 7,115,173호(섬유 유연제 조성물), 제 6,342,208호(피부 치료를 위한 에멀젼), 제 7,264,886호(방수 조성물), 제 6,924,333호(페인트 첨가제), 제 6,596,768호(지질-풍부 반추 원료), 및 제 6,380,410호(세정제 및 클린저를 위한 계면활성제)(이들 각각은 본원에 참조로서 통합됨).

E. 지질-함유 미생물 바이오매스를 개질시키기 위한 추가 화학적 반응

지질-함유 미생물 바이오매스에서 수행될 수 있는 다른 화학적 반응은 미국 특허 제 6,051,539호에서 보고되는 바와 같이, 트리아실글리세롤과 사이클로프로파네이팅제(cyclopropanating agent)를 함께 반응시켜 유동성 및/또는 산화 안정성을 강화시키는 것; 미국 특허 제 6,770,104호에서 보고되는 바와 같이, 트리아실글리세롤로부터 왁스를 제조하는 것; 및 문헌["The effect of fatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidized tnacylglycerols", Journal of the American Oil Chemists' Society, 79:1, 59-63, (2001) 및 Free Radical Biology and Medicine, 37:1, 104-114(2004)]에서 보고되는 바와 같이, 트리아실글리세롤의 에폭시화를 포함한다(이들 문헌 각각은 본원에 참조로서 통합됨).

일부 방법에서, 개질의 첫번째 단계는 이중 결합을 포화시키기 위한 수소화공정(hydroprocessing)이며, 수소 및 촉매의 존재하에 증가된 온도에서 탈산소화 과정이 후속한다. 일부 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응에서 발생한다. 또 다른 방법에서, 탈산소화는 수소화 전에 발생한다. 이성질화는 그 후, 또한 산소와 촉매 존재하에서 선택적으로 수행된다. 마지막으로, 가스와 나프타 구성성분이 원한다면 제거될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,475,160호(트리글리세리드의 수소화); 제 5,091,116호(탈산소화, 수소화 및 가스 제거), 제 6,391,815호(수소화), 및 제 5,888,947호(이성질화)(이들 문헌 각각은 본원에 참조로서 통합됨).

F. 오일-함유 미생물 바이오매스 및 추출된 오일의 비누화

1. 비누화의 기초 화학

동물 및 식물 오일은, 전형적으로 트리히드릭 알코올(trihydric alcohol), 글리세롤을 지닌 지방산의 에스테르인, 트리아실글리세롤(TAGs)로 구성된다. 알칼리성 가수분해 반응에서, TAG 중 글리세롤이 제거되고, 알칼리 금속 양이온, 예컨대, 소듐 또는 포타슘과 연관될 수 있는 세개의 카르복실산 음이온이 남아, 지방산 염을 생성한다. 일반적인 반응 도식은 하기와 같다:

이러한 도식에서, 카르복실산 구성성분은 글리세롤 잔기로부터 절단되고, 수산기로 대체된다. 상기 반응에서 사용된 염기(예를 들어, KOH)의 양은 비누화의 요망되는 정도에 의해 결정된다. 발명의 목적이, 예를 들어, TAG 조성물 내에 처음부터 존재하는 약간의 오일을 포함하는 비누 제품을 생산하는 것이라면, 모든 TAGs를 지방산 염으로 변환시키기에 불충분한 염기의 양이 반응 혼합물로 도입된다. 정상적으로, 이 반응은 수성 용액에서 수행되고, 천천히 진행되나, 열이 가해짐에 따라 촉진될 수 있다. 지방산 염의 침전은 염, 예컨대, 수용성 알칼리 금속 할라이드(예를 들어, NaCl 또는 KCl)를 반응 혼합물에 첨가함에 의해 촉진될 수 있다. 바람직하게는, 상기 염은 알칼리 금속 수산화물, 예컨대, NaOH 또는 KOH이다. 대안적으로는, 예를 들어, 트리에탄올아민 및 아미노메틸프로판올을 포함하는, 알카놀아민과 같은 다른 염기가 반응 도식에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 대안은 투명한 비누 제품을 생산하는데 바람직할 수 있다.

2. 오일 함유 바이오매스의 비누화

오일 함유 미생물 바이오매스의 비누화는 본 발명의 방법에 따라, 무손상(intact) 바이오매스 또는 알칼리성 가수분해 반응이 적용되기 이전에 분열된 바이오매스에서 수행될 수 있다. 전자의 경우, 본원에 기술된 바와 같이, 미생물의 배양을 통해 생성된 무손상 미생물 바이오매스는 직접적으로 염기와 접촉하여, 바이오매스의 에스테르-함유 지질 구성성분을 지방산 염으로 변환시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 미생물이 배양된 물의 일부 또는 전부가 제거되고, 바이오매스는 바이오매스의 요망되는 부분의 당지질 및 지방산 에스테르 구성성분을 비누화시키기에 충분한 염기의 양을 포함하는 수송 용액에서 재현탁된다. 일부 구체예에서, 바이오매스 내 100% 미만의 당지질 및 지방산 에스테르가 지방산 염으로 변환된다.

본 발명의 일부 방법에서, 바이오매스는 분열된 후, 알칼리성 가수분해 반응이 적용된다. 바이오매스의 분열은 세포를 용해하기 위한, 열-유도된 용해, 기계적 용해 등을 포함하는 임의의 하나 이상의 상기 기술된 방법을 통해 성립되어 미생물의 세포내 내용물이 염기에 더욱 쉽게 접촉할 수 있도록 할 수 있다. 이것은 TAGs 또는 지방산 에스테르의 지방산 염으로 변환을 유리하게 하는데 도움이 될 수 있다. 산-유도성 용해가 바이오매스를 분해한 후 비누화시키는데 이용될 수 있을지라도, 다른 방법이 임의의 남은 산을 알칼리성 가수분해 반응 동안 중화하는데 추가적 염기가 소비될 것이라는 가능성을 감소시키는데 더욱 요망될 수 있고, 이는 지방산 염에 대한 변환 효율성에 영향을 미칠 수 있다. 열의 적용이 알칼리성 가수분해 반응을 촉진시킬 수 있기 때문에, 열-유도성 용해는 비누화 반응 중에 또는 전에 이용되어, 지방산 염을 생산할 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 바이오매스는 알칼리성 가수분해 반응이 적용되기 이전에, 임의의 처리 또는 분해 이외의 임의의 처리가 적용되지 않는다. 일부 구체예에서, 바이오매스 중에서 지질 대 비-지질 물질의 비를 50 중량 % 초과(또는 50% 초과)까지 증가시키기 위한 바이오매스의 사전 농축이 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 또 다른 구체예에서, 바이오매스는 사전 농축 단계 없이, 알칼리성 가수분해 반응이 적용된다. 일부 구체예에서, 알칼리성 가수분해 반응이 적용된 바이오매스는 수확 지점에서 바이오매스와 같이 동일한 상대적 비율로 물 이외의 구성성분을 포함한다. 실질적으로 모든 물이 제거된, 이러한 구체예에서, 바이오매스는 세포성 에멀젼 또는 실질적으로 건조된 에멀젼 농축액을 포함한다.

본원에 기술된 임의의 미생물은 비누화된 오일의 생산을 위한 지질-함유 바이오매스를 생산하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 미생물은 또한 본원에 기술된 방법으로부터 생산된 비누화된-오일 조성물에 대해 또 다른 특성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 상이한 종의 미세 조류를 비롯하여, 상이한 조건하에서 성장한 미세조류는 색상이 다양하다(녹색, 노란색, 오렌지색, 붉은색 등을 포함). 색상을 미세조류에 부여하는 소량의 화합물은 의도적으로 보유되어, 비누화된-오일 조성물을 생성할 수 있고 그에 따라 천연 색소를 생산한다. 일부 구체예에서, 카로테노이드 및 크산토필를 포함하는, 바이오매스의 다른 구성성분은 비누화된-오일 조성물 내에 또한 소량으로 보유될 수 있다.

바이오매스의 비누화 양은 본 발명의 방법에서 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 바이오매스의 당지질 구성성분도 포함하는 비누화된-오일 조성물을 생산하는 것이 요망된다. 알칼리성 가수분해 반응에서 사용되기에 적합한 염기(예를 들어, NaOH)의 양은 바이오매스의 당지질 및 지방산 에스테르 함량의 분석에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 과량의 염기를 사용하여, 지질-함유 바이오매스를 직접적으로 비누화하는 것이 바람직한데, 이는 일부 염기가 바이오매스의 다른 구성성분화 반응함으로서 소비될 수 있기 때문이다. 일부 구체예에서, 바이오매스의 에스테르-함유 지질 구성성분을 비누화시키는데 과량의 염기를 사용하는 것은 원치 않는 알칼리성인 비누화된 오일 조성물을 야기한다. 이러한 예에서, 상기 조성물은 비누화된 오일 조성물을 물에서 끓이고, 염, 에컨대, NaCl, KCl등을 첨가하여 지방산 염을 재-현탁화시킴으로서, 조성물의 알칼리성을 감소시키도록 정제될 수 있다. 정제된 비누 조성물은 그 후, 예를 들어 과량의 물 제거, 다양한 첨가제를 비누 조성물에 도입, 비누를 바(bars) 또는 다른 모양 내에서 주조시키는 등, 추가적 가공이 적용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법으로부터 생성된 지방산 염(또는 비누화된 오일로도 지칭됨)은 에센셜 오일, 향료 오일, 플레이버 오일, 보타니칼, 추출물, CO₂ 추출물, 점토, 색소, 이산화 티타늄, 운모, 틴팅 허브, 그리터, 엑스폴리안트, 과일 씨앗, 섬유, 곡물 파우더, 너트 밀, 종자 밀, 오일 비드, 왁스 비드, 허브, 히드로졸, 비타민, 밀크 파우더, 보존제, 항산화제, 토코페롤, 염, 당류, 식물성 오일, 왁스, 글리세린, 해조류, 영양 오일, 보습 오일, 식물성 버터, 프로필렌 글리콜, 파라벤, 꿀, 꿀벌 왁스, 알로에, 폴리솔베이트, 옥수수전분, 코코아 파우더, 산호 파우더, 습윤제, 검, 유화제 및 증점제, 또는 기술된 임의의 기타 첨가제에서 선택된 하나 이상의 첨가제와 함께 결합될 수 있다.

3. 추출된 오일의 비누화

바이오매스의 추출된 지질 구성성분의 비누화 정도는, 추출된 오일 내 존재하는 당지질 또는 지방산 에스테르 이외의 구성성분과 상호작용을 통해 염기가 소비될 것이라는 가능성이 감소되었기 때문에, 더욱 쉽게 조절될 수 있다. 지질 구성성분의 추출은 종래의 헥산-추출 절차를 통해, 또는 오일-추출 또는 무용매 추출 절차를 통해 수행될 수 있다.

종래의 헥산-추출(또 다른 적합한 유기 용매가 또한 사용될 수 있다)은 일반적으로 바이오매스 또는 용해물과 헥산을, 지질이 헥산을 포함한 용액을 형성하는 것이 가능하도록 충분한 시간 동안, 일정 양으로 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 혼합물은 그 후 여과될 수 있고, 예를 들어 로토증발(rotoevaporation)에 의해 헥산이 제거될 수 있다. 헥산 추출 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.

오일 추출은 용해물 구성성분의 사전 분리 없이, 오일을 직접적으로 용해물에 첨가하는 것을 포함한다. 오일의 첨가 후, 용해물은 자발적으로 또는 원심분리의 결과등으로, 상이한 층으로 분리한다. 이 층은 무거운 고체 펠렛의 밀도가 감소하는 순서로, 수성 층, 에멀젼 층, 및 오일 층을 포함할 수 있다. 에멀젼 상은 지질 및 수성 층의 에멀젼이다. 용해물, 원심분리기의 힘, 존재한다면, 임의의 부피의 수성 배지 및 기타 인자에 관하여, 첨가된 오일의 퍼센트에 따라(w/w 또는 v/v), 에멀젼 및 오일 상 둘 중 하나 또는 둘 모두가 존재할 수 있다. 세포 용해물 또는 오일을 동반한 에멀젼 상의 인큐베이션 또는 처리는, 미생물에 의해 생산된 지질이 오일 중에서 가용성이 되는 것이 가능하기에 충분한 시간 동안 수행되어 이질적 혼합물을 형성한다.

다양한 구체예에서, 추출 공정에서 사용된 오일은, 콩, 유채, 카놀라, 야자, 야자 커넬, 코코넛, 옥수수, 야채 폐기물 오일, 중국 수지, 올리브, 해바라기, 면 종자, 닭 지방, 우지, 돼지 수지, 미세조류, 거대조류, 쿠페아, 아마, 땅콩, 고급 백색 그리스(라드, lard), 카멜리나 사티바(Camelina sativa), 머스타드 종자 캐슈 너트, 귀리, 루핀, 케나프, 카렌듈라, 대마, 커피, 아마씨, 헤이즐넛, 유포르비아, 펌킨 종자, 코리엔더, 카멜리아, 참깨, 홍화, 쌀, 퉁 오일 나무, 코코아, 코프라, 피움 양귀비, 피마자 콩, 피칸, 호호바, 자트로파, 마카다미아, 브라질 너트 및 아보카도로 이루어진 군에서 선택된다. 용해물에 첨가된 오일의 양은 일반적으로, 오일이 결합되어 있는 용해물의 5%(v/v 및/또는 w/w로 측정됨)를 초과한다. 따라서, 오일의 바람직한 세포 용해물의 v/v 또는 w/w는 5% 초과, 또는 6% 이상, 7% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상이다.

지질은 또한, 무용매 추출 방법에 의해, 유기 용매 또는 오일의 실질적인 또는 임의의 사용 없이, 용해물을 냉각함으로서, 용해물로부터 추출될 수 있다. 이러한 방법에서, 용해물은 바람직하게는 상기 실온과 결합된 산 처리에 의해 생산된다. 상기 온도가 실온과 65°C 사이라면, 바람직하게는, 초음파처리가 또한 사용될 수 있다. 원심분리기 상 또는 고정된 이러한 용해물은 층, 이중 한 층은 수성:지질 층("에멀젼 층")인 층으로 분리될 수 있다. 또 다른 층은 고체 펠렛, 수성 층, 및 지질 층을 포함할 수 있다. 지질은 동결 해동(freeze thawing) 또는 이와 다르게 에멀젼을 냉각시킴에 의해 에멀젼 층으로부터 추출될 수 있다. 이러한 방법에서, 임의의 유기 용매 또는 오일을 첨가하는 것은 필요하지 않다. 임의의 용매 또는 오일이 첨가될 경우, 이는 용해물의 5% v/v 또는 w/w 이하일 수 있다.

분리되거나 추출된 지질은 그 후, 본원에 기재된 바와 같이 알칼리성 가수분해 반응이 적용되며, 이 반응에서 반응 혼합물에 첨가된 염기의 양은 원하는 양의 지질 조성물의 당지질 및 지방산 에스테르 구성성분을 비누화시키도록 맞춰질 수 있다. 조성물 내에서 에스테르화된 지질 양의 근사값 또는 정량화가 구체화된 오일의 비율을 비누화하는데 요구되는 염기의 양을 맞추는데 이용될 수 있고, 따라서, 생성된 조성물 내에 남아있는 비-비누화된 오일의 양을 조절하는 기회를 제공한다. 일부 구체예에서, 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상의 오일이 생성환 조성물 내에서 비-비누화되어 남아있다. 또 다른 구체예에서, 생성된 조성물이 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 또는 0.5 중량% 이하의 비-비누화된 오일을 포함하도록, 모든 또는 실질적으로 모든 오일을 비누화하는 것이 요망될 수 있다

본 발명의 다양한 구체예에서, 미생물 바이오매스 또는 오일은 다양한 탄소 쇄 길이를 지닌 지질, 및 다양한 포화 수준을 지닌 지질을 포함할 수 있다. 상기 지질의 특성은 비누화 반응이 적용된 바이오매스 또는 오일을 생성시키는데 이용된 하나 이상의 미생물 집단의 천연 당지질 프로파일에 의한 결과일 수 있거나, 특정 지질을 더 높은 비율로 생산하는 미생물의 유전자도입 균주가 생산되는 지질 경로 조작(본원에 기재된 바와 같은)의 결과일 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이, 트랜스에스테르화 또는 다른 화학적 개질이 적용된 미생물 바이오매스는 지질 대 미생물 건조 중량의 비를 증가시키는 사전 농축 과정이 선택적으로 적용될 수 있다. 일부 구체예에서, 바이오매스 내 지질 대 비-지질 물질의 비는 10 중량% 초과, 20 중량% 초과, 30 중량% 초과, 40 중량% 초과, 50 중량% 초과, 60 중량% 초과, 70 중량% 초과, 80 중량% 초과, 90 중량% 초과, 100 중량% 초과까지 증가된다. 본 발명의 일부 방법에서, 바이오매스는 사전 농축 단계 없이, 또는, 일부 구체예에서는 50% 초과까지 비를 증가시키는 사전 농축 단계 없이, 화학적 반응이 적용된다. 지질 대 비-지질 물질의 비의 농축은 예를 들어, 미생물 바이오매스 이외의 소스로부터(예를 들어, 제 2 미생물 바이오매스 배양액으로부터, 식물 또는 종자-오일 소스 등으로부터) 획득된 지질의 첨가에 의해 성취될 수 있다. 선택적 농축이 적용되든 안되든, 지질 구성성분은 화학적 반응이 적용된 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하, 95% 이하의 바이오매스를 포함하고, 바람직하게는 지질 구성성분은 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 또는 45% 이상의 바이오매스를 포함한다. 일부 구체예에서, 수확된 바이오매스는 DCW로 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상의 지질 구성성분을 포함한다.

일부 구체예에서, 물이 바이오매스로부터 제거된 후, 바이오매스에 비누화(또는 다른 화학적 개질) 반응이 적용된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 바이오매스에 비누화(또는 다른 화학적 개질) 반응이 적용되기 이전에, 미생물 바이오매스는 물 제거 및/또는 용해 이외의 임의의 처리가 적용되지 않는다. 일부 구체예에서, 화학적 반응이 적용된 바이오매스는 발효로부터 수확한 지점에서 물 이외의 구성성분을 바이오매스와 같이 동일한 상대적 비율로 포함한다. 본문 중에서, "동일한 상대적 비율"은 바이오매스의 수확에 이어, 일부 구성성분의 세포의 이용 또는 대사적 변환, 수확된 바이오매스 내에서 일부 구성성분의 화학적 변환(외인성 시약 또는 촉매의 적용 없이), 수확된 바이오매스로부터 가스의 누출, 및/ 또는 쉽게 조절 불가능한 상대적 비율의 유사한 개질과 관련된 변화를 겪은 후, 구성성분의 비율이 실질적으로 동일하게 남은 것을 의미한다. 문구 "동일한 상대적 비율"은 또한 실험적 다양성의 일부 수준에 대한 계산의 평균이다(예를 들어, ± 5%).

본 발명의 일부 방법에서, 공유결합적으로 개질된 지질은 지질의 화학적 개질 후에, 바이오매스의 다른 구성성분으로부터 분리된다. 일부 구체예에서, 지질 분리는 공유결합적으로 개질된 지질이 더 가벼운 비-수성 층을 형성하고, 바이오매스의 구성성분이 하나 이상의 더 무거운 상을 형성하는 상 분리를 포함한다. 더 가벼운 비-수성 상은 그 후 제거되어, 공유결합적으로 개질된 지질 구성성분을 분리할 수 있다. 일부 구체예에서, 바이오매스의 친수성 세포 물질로부터 공유결합적으로 개질된 지질을 포함하는 친유성 상의 분리는 원심분리 또는 다른 기술에 의해 촉진될 수 있다. 공유결합적으로 개질된 지질 대 이것이 분리된 바이오매스의 비는 건조 중량으로 10% 지질 대 90% 바이오매스와 90% 지질 대 10% 바이오매스 사이일 수 있다.

4. 포화된 오일의 더 높은 함량 및 더 적은 착색 불순물을 가진 바이오매스의 이점

본원에 기술된 비누화 방법에서 사용하기 위한 바이오매스 및/또는 추출된 오일이 다양한 당지질 프로파일 및 다양한 비율의 기타 구성성분(예컨대, 색소)을 가지는 많은 미생물 중 임의의 하나로부터 유래 될 수 있다 할지라도, 바람직한 구체예에서는, 바이오매스 및/또는 추출된 오일은 상대적으로 높은 비의 TAGs 내 포화된 지방산과, 상대적으로 낮은 비율의 색상을 오일에 부여하는 구성성분(예를 들어, 색소)을 포함한다. 제 1 구체예에서, 바이오매스 및/또는 추출된 오일은 프로토테카(Prototheca) 속의 미세조류에서 유래된다.

비누화된 오일의 지방산 구성성분의 포화 특성을 비롯하여 착색된 구성성분의 존재는 비누화된 오일을 포함하는 구성성분의 저장 수명뿐만 아니라, 미적인 질에도 영향을 미친다. 포화된 지방산은 이들의 비포화된 대응물보다 덜 산화되는 경향이 있다. 따라서, 비누화된 오일 제품의 제조물 내에서 상대적으로 높은 비율의 포화된 지방산: 불포화된 지방산 구성성분을 지닌 비누화된 오일의 이용은 전반적으로 더 긴 저장 수명을 유발하고, 종종 불쾌한 냄새를 가지는 산화 생산물의 발달을 최소화한다. 유사하게, 산화시 통합된 비누화된 오일 조성물의 외관을 변화시키는 경향이 있는 착색된 불순물의 상대적 부재는 조성물의 미적 질 및 이러한 제품, 특히 연장된 저장 수명을 넘은 제품에 대한 소비자 만족도를 향상시킨다. 생산된 비누의 소부지는 특정 색상 또는 색상의 결핍을 비누의 브랜드와 연관시키는 경향이 있으며, 매번 동일한 색상의 제품을 기대한다. 비누화된 오일의 색상 결핍은 생산된 비누화된 오일에 더욱 일관성이 있게 한다.

더 높은 비율의 포화된 지방산은 하기 논의될, 비누화된 조성물의 제조에 특별한 이점을 제공하는데, 이는 바이오매스(또는 추출된 오일) 내에 당지질의 일부가 비-비누화된채 남아있다는 것이다. 이미 논의하였듯이, 당지질의 퍼센트는 비누화 반응에 사용된 염기의 양을 조절함으로서, 비개질(비-비누화)된 채 남아있을 수 있고, 따라서, 기존에 존재했던 당지질의 동일한 비율을 유지하는 비누 제품을 생산한다. 비누화반응에서 과량의 당지질의 존재는 흔히 "슈퍼페팅(superfatting)"으로 지칭된다. 비누화 반응 후 생산물 내에 남아있는 여분의 오일은 조성물 내에 보습 특성을 부여하나, 산화가 적용된 임의의 오일과 같이, 불쾌한 냄새가 나는 조성물의 개발을 유도할 수 있다. 반응 혼합물의 "슈퍼페팅" 구성성분과 같이, 높은 비율의 포화된 지방산: 불포화된 지방산 구성성분의 이용은 상대적으로 더 긴 저장 수명을 지닌 제품을 생산하고, 악취를 풍기는 산화적 산물의 생산을 최소화한다.

다양한 구체예에서, 포화된 지방산 구성성분은 미생물 바이오매스 또는 본 발명의 방법에 따라 알칼리성 가수분해 반응이 적용된 추출 오일의 1-100% 에스테르-함유 지질 구성성분으로 구성된다. 바람직한 구체예에서, 포화된 지방산 구성성분은 알칼리성 가수분해 반응 내에 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상의 에스테르-함유 지질 구성성분을 포함한다.

일부 구체예에서, 색상-생성 불순물(예를 들어, 카로테노이드)는 미생물 바이오매스 또는 추출된 오일 내에서 500 ppm 이하, 250ppm 이하, 100ppm 이하, 75ppm 이하, 25ppm 이하의 농도로 존재한다. 색상-생성 불순물은 카로테노이드, 예컨대, 루테인, 베타 카로틴, 제아잔틴, 아스타잔틴, 엽록소를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 미생물 바이오매스 또는 추출된 오일 내 존재하는 엽록소의 함량은 0.1 mg/kg 미만, 0.05 mg/kg 미만, 또는 0.01 mg/kg 미만이다.

일부 구체예에서, 비누화 전 또는 후에, 미생물 오일 또는 비누 각각은 비누화된 오일 그램 당 60 마이크로그램 미만, 59 마이크로그램 미만, 58 마이크로그램 미만, 57 마이크로그램 미만, 56 마이크로그램 미만, 55 마이크로그램 미만, 54 마이크로그램 미만, 53 마이크로그램 미만, 52 마이크로그램 미만, 51 마이크로그램 미만, 50 마이크로그램 미만, 49 마이크로그램 미만, 48 마이크로그램 미만, 47 마이크로그램 미만, 46 마이크로그램 미만, 45 마이크로그램 미만, 44 마이크로그램 미만, 43 마이크로그램 미만, 42 마이크로그램 미만, 41 마이크로그램 미만, 40 마이크로그램 미만, 39 마이크로그램 미만, 38 마이크로그램 미만, 37 마이크로그램 미만, 36 마이크로그램 미만, 35 마이크로그램 미만, 34 마이크로그램 미만, 33 마이크로그램 미만, 32 마이크로그램 미만, 31 마이크로그램 미만, 30 마이크로그램 미만, 29 마이크로그램 미만, 28 마이크로그램 미만, 27 마이크로그램 미만, 26 마이크로그램 미만, 25 마이크로그램 미만, 24 마이크로그램 미만, 23 마이크로그램 미만, 22 마이크로그램 미만, 21 마이크로그램 미만, 20 마이크로그램 미만, 19 마이크로그램 미만, 18 마이크로그램 미만, 17 마이크로그램 미만, 16 마이크로그램 미만, 15 마이크로그램 미만, 14 마이크로그램 미만, 13 마이크로그램 미만, 12 마이크로그램 미만, 11 마이크로그램 미만, 10 마이크로그램 미만, 9 마이크로그램 미만, 8 마이크로그램 미만, 7 마이크로그램 미만, 6 마이크로그램 미만, 5 마이크로그램 미만, 4 마이크로그램 미만의 카로테노이드를 포함한다.

프로토테카 위커하미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis ), 프로토테카 모리폴미스(Prototheca monformis ) 및 프로토테카 좁피(Prototheca zopfii)를 포함하나 이에 제한되지 않는, 프로토테카(Prototheca) 속의 미세조류는 실시예 28에 설명하였듯이, 높은 비율의 포화된 지질 구성성분을 자연적으로 생산한다. 더욱이, 프로토테카(Prototheca) 속의 미세조류에서 추출된 오일은 일반적으로 색상-생성 불순물을 거의 포함하지 않으며, 이는 비누화된 오일을 포함하는 무색상 조성물의 생산을 가능케 한다. 따라서, 이러한 미생물을 본 발명에 따라 비누화 방법을 실시하기 위한 바이오매스 또는 오일의 소스로서 이용하는 것은 바람직하다.

VI . 조성물

본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있는 조성물을 제공한다. 본 발명의 각각의 다양한 조성물에서, 미생물 바이오매스는 박테리아, 시아노박테리아, 진핵 미세조류, 유질성 효소, 및 진균으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 미생물 바이오매스는 표 1에 나열된 진핵 미세조류로 이루어진 군에 있는 미생물로부터 유래된 바이오매스로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 미생물 바이오매스는 클로렐라(Chlorella) 속의 종이며, 일부 구체예에서, 상기 종은 클로렐라 푸스카(Chlorella fusca), 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 케슬러리(Chlorella kessleri), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 사카로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 및 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)로 이루어진 군에서 선택된다. 제 1 구체예에서, 상기 종은 클로렐라 프로테코이드(Chlorella protothecoides)이다. 일부 구체예에서, 미생물 바이오매스는 표 2에 나열된 유질성 효모로 이루어진 군에서 선택된 효모에서 유래되거나, 표 3에 나열된 진균으로 이루어진 군에서 선택된 진륜류에서 유래된다.

제 1 구체예에서, 본 발명은 지방산 알킬 에스테르를 포함하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 포함하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

조성물의 다양한 구체예에서, 20% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C18이다. 또 다른 구체예에서, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C18이다. 일부 구체예에서, 50% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C16 또는 더 긴 쇄 길이이다. 일부 구체예에서, 10% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C14 또는 더 짧은 쇄 길이이다. 일부 구체예에서, 20% 이상의 지방산 알킬 에스테르는 C14 또는 더 짧은 쇄 길이이다.

일부 구체예에서, 조성물은 다양한 함량으로 이원자를 포함한다. 일부 구체예에서, 더 가벼운 상에서 중량 기준으로 취합된 칼슘 및 마그네슘의 함량은 5 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 더 가벼운 상 내 인의 함량은 질량 기준으로, 0.001% 이하이다. 일부 구체예에서, 더 가벼운 상 내 황의 함량은 15 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 더 가벼운 상에서 중량 기준으로 취합된 포타슘 및 소듐의 함량은 5 ppm 이하이다. 일부 구체예에서, 더 가벼운 상의 총 카로테노이드 함량은 그램 당 100 마이크로그램 이하의 카로테노이드이다.

또 다른 구체에에서, 본 발명은 완전히 포화된 지질을 포함하는 가장 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 포함하는 하나 이상의 무거운 상을 포함하는 조성물을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 지질을 포함하는 더 가벼운 상 및 하나 이상의 종 또는 균주로부터 유래한 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 수산화된 지질을 함유하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 유리 지방산을 포함하는 더 가벼운 상 및 미생물 바이오매스를 함유하는 하나 이상의 더 무거운 상을 포함하는 조성물을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은, 미생물 집단을 배양함으로서 생산된 바이오매스의 알칼리성 가수분해로부터 유래된 비누화된 오일을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 비누화된 오일이 유래된 바이오매스는, 분리되어 배양된 미생물의 두개 이상의 개별 균주 또는 종으로부터의 바이오매스 혼합물을 포함한다. 제 1 구체예에서, 결합된 바이오매스로부터의 미생물의 두개 이상의 개별 균주 또는 종은 상이한 당지질 프로파일을 포함한다. 상이한 구체예에서, 상기 조성물은 고체(파우더 포함) 또는 액체일 수 있다.

본 발명의 비누화된 오일 조성물은 본원에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 미생물 종에서 유래된 지방산 염을 포함할 수 있고, 비누화된 오일이 제조된 바이오매스로부터 직접적으로 유래된 또 다른 구성성분 또는 카로테노이드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 비누화된 오일 조성물은 β-카로틴, α-카로틴, 아스타잔틴, α-크립토잔틴, β-크립토잔틴, 루테인, 리코펜, 피토엔(phytoene), 피토플루인(phytofluene), 및/또는 제아잔틴을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 비누화된 오일 조성물은 국제 공개공보 제 WO/2007/084769호(본원에 참조로서 통합됨)에 기술된 것과 같은 조류 다당류를 포함한다.

일부 구체예에서, 비누화된 오일 조성물은 바이오매스로부터 유래된 다양한 비율의 비-비누화된 당지질을 포함한다. 다양한 구체예에서, 바이오매스로부터 유래된 비-비누화된 당지질은 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상의 비누화된 오일 조성물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 비-비누화된 당지질은 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 비누화된 오일 조성물을 포함한다.

본 발명에 따른 비누화된 오일 조성물의 다양한 구체예에서, 비누화된 오일은 조성물의 총 질량의 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 비누화된 오일은 조성물의 총 질량의 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하를 포함한다. 일부 구체예에서, 비누화된 오일, 비-비누화된 오일, 카로테노이드등을 포함하는(이에 제한되지 않음) 바이오매스로부터 유래된 구성성분은 조성물의 총 질량의 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상을 구성한다. 또 다른 구체예에서, 바이오매스로부터 유래된 구성성분은 조성물의 총 질량의 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하를 구성한다.

비누화된 오일 조성물의 일부 구체예에서, 상기 조성물은 콩, 유채, 카놀라, 야자, 야자 커넬, 코코넛, 옥수수, 야채 폐기물(waste vegetable), 중국 수지(Chinese tallow), 올리브, 해바라기, 면 종자, 닭 지방, 우지, 돼지 수지(porcine tallow), 미세조류, 거대조류(macroalgae), 쿠페아(Cuphea), 아마(flax), 땅콩, 고급 백색 그리스(choice white grease), 라드, 카멜리나 사티바(Camelina sativa), 머스타드 종자 캐슈 너트(mustard seed cashew nut), 귀리, 루핀(lupine), 케나프(kenaf), 카렌듈라(calendula), 대마, 커피, 아마씨(아마), 헤이즐넛, 유포르비아(euphorbia), 펌킨 종자, 코리엔더(coriander), 카멜리아, 참깨, 홍화, 쌀, 퉁 오일 나무, 코코아, 코프라, 피움 양귀비(pium poppy), 피마자 콩, 피칸, 호호바, 자트로파(jatropha), 마카다미아, 브라질 너트 또는 아보카도에서 선택된 하나 이상의 오일을 추가적으로 포함한다.

비누화된 오일 조성물의 일부 구체예에서, 하나 이상의 첨가제가 지방산 염과 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 첨가제는 예를 들어, 스킨 클린저로서 사용시 조성물의 클렌징 효율성을 최적화시키기 위해 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 첨가제는 소비자에게 어필하는 조성물에 대해 첨가제에 의해 부여된 특성에 관하여 선택된다. 일부 구체예에서, 첨가제는 클린징 효율성의 최적화 및 소비자 어필 둘 모두를 위해 선택된다. 다양한 구체예에서, 첨가제는 에센셜 오일, 향료 오일, 플레이버 오일, 보타니칼, 추출물, CO₂ 추출물, 점토, 색소, 이산화 티타늄, 운모, 틴팅 허브, 그리터, 엑스폴리안트, 과일 씨앗, 섬유, 곡물 파우더, 너트 밀, 종자 밀, 오일 비드, 왁스 비드, 허브, 히드로졸, 비타민, 밀크 파우더, 보존제, 항산화제, 토코페롤, 염, 당류, 식물성 오일, 왁스, 글리세린, 해조류, 영양 오일, 보습 오일, 식물성 버터, 프로필렌 글리콜, 파라벤, 꿀, 꿀벌 왁스, 알로에, 폴리솔베이트, 옥수수전분, 코코아 파우더, 산호 파우더, 습윤제, 검, 유화제 및 증점제로부터 선택된다. 이러한 첨가제는 다수의 스킨 케어 성분 및 목욕 부속품 공급업체에서 상업적으로 이용가능하다.

에센셜 오일은 피망, amyris, 안젤리카 뿌리, 아니스 열매, 바질, 베이, 베르가못(bergamot), 후추, 카유풋 나무(cajeput), 녹나무, 카난가(cananga), 카다몬, 당근 종자, 계수나무, 개박하(catnip), 시더우드(cedarwood), 카모마일, 계피나무 껍질, 계피 잎, 시트로넬라 자바(citronella Java), 클레리 세이지(clary sage), 클로브버드(clovebud), 고수풀(coriander), 콘민트(cornmint), 사이프러스(cypress), 다바나(davana), 딜 종자(dill seed), 엘레미(elemi), 유칼립투스, 회향(fennel), 전나무, 유향(frankincense), 제라늄 버번(geranium bourbon), 제라늄 로스트(geranium roast), 제라늄, 징거, 자몽 핑크(grapefruit pink), 자몽, 구륜 발삼(gurjun balsam), 히솝풀(hyssop), 점퍼베리(jumper berry), 라반딘(lavandin), 라반듈라(lavandula), 라벤더, 레몬 밀틀(lemon myrtle), 레몬티 트리(lemon tea tree), 레몬, 레몬글라스(lemongrass), 림(lime), 리치아 큐베바(litsea cubeba), 만다린, 만저럼(marjoram), 멀레인(mullein), 몰약(myrrh), 네로리(nerori), 네로리나, 니아울리(niaouli), 육두구, 오렌지, 팔마로사(palmarosa), 패출리(patchouli), 페퍼민트, 페티그레인(petitgrain), 솔잎, 라벤사라, 라빈트사라, 로사리나, 장미, 로즈마리, 로즈우드, 세이지, 백단(sandalwood), 녹양박하, 감송, 스타아니스(staranise), 귤, 티 트리, 백리향(thyme), 툴시(tulsi), 버베나(verbena), 베티버(vetiver), 일랑일랑(ylang ylang), 및 zdravetz 또는 이들의 조합을 포함한다.

향료 오일, 플레이버 오일은 절대 튤립, 아몬드, 아마레또, 호박, 아나리스, 사과, 사과 계피, 사과 스파이스, 살구, 살구 크림, 아라비안 사향, 아시아 배, 아시아 매화, 가을 숲, 바나나, 바질, 바질 넥타린, 베이 럼, 베이베리(bayberry), 벌가모트(bergamot), 베리 엔 크림, 생일 케이크, 블랙 체리, 블랙 티, 블랙베리 차, 블랙커런트(blackcurrent), 블루 나일(blue nile), 블루베리딜라이트(blueberry delight), 블람블베리(brambleberry) 보존제, 갈색설탕, 풍선껌, 버터크림, 버터스카치, 칼라릴리(calla lily), 멜론, 카라멜 사과, 카네이션, 당근 케이크, 차이 티, 카모마일, 중국 사향, 중국비(china rain), 작약꽃(chinese peony), 국화, 계피, 코코넛, 코코넛 크림, 솜사탕, 크랜베리, 오이, 오이참외, 수선화, 민들레, 델피니움(delphinium), 듀베리(dewberry), 둘세데레체(dulce de leche), 얼그레이 차, 부활절 쿠키, 달걀 노그, 이집트 사향, 인채티드 숲(enchanted forest), 영국 라벤더, 영국 배, 에버그린, 무화과, 플란지파니(frangipani), 유향, 프랑스 바닐라, 프레시 사과, 프레시 양조커피(brewed coffee), 과일 펀치(fruit punch), 치자(gardenia), 제라늄, 징거 릴리(ginger lily), 생강빵(gingerbread), 포도, 자몽, 녹색사과, 녹색잔디, 녹차, 구아바, 구아바 꽃, 하와이 흰색 생강, 헬리오트로프(heliotrope), 대마, 초본, 홀리데이 프룻케이크(holiday fruitcake), 홀리베리(hollyberry), 꿀생강, 꿀, 인동덩굴(honeysuckle), 자스민, 자스민 차, 점퍼베리(jumper berries), 키위, 라벤터, 가죽, 레몬, 레몬 파슬리, 라일락, 라임, 로간베리(loganberry), 연꽃, 목련, 만다린, 망고, 망고 및 키위, 메이플, 밀크초콜렛, 미모사(mimosa), 민티라임, 멀베리, 몰약, 네오리, 오크모스(oakmoss), 오트밀, 오션 람(ocean ram), 오렌지블라썸, 오렌지 셔벗(orange sherbet), 오렌지 바닐라, 파파야, 패션 프루트(passion fruit), 패출리, 복숭아, 복숭아 및 크림, 피어베리(pearberry), 페퍼민트, 피카키(pikaki), 피나콜라다, 파인애플, 석류, 호박파이, 건포도와 아몬드, 라즈베리, 볶은 견과류, 로즈우드, 세이지, 백단(sandalwood), 사사플라스(sasafras), 씨 모스(sea moss), 시베리안 파인(siberian pine), 스노우베리, 스페인 이끼, 향신료, 딸기, 설탕자두, 선탠로션, 스위트 클로브(sweet clove), 스위트 글라스(sweet gass), 완두콩, 탄제린(tangerine), 타이 코코넛, 팀버(timber), 토미토잎, 바닐라, 수박, 흰색 초콜렛, 야생 벗나무, 등나무, 위치 블루(witches brew), 및 일랑일랑, 또는 이들의 조합을 포함한다.

익스폴리안트(exfoliants)는 죽은 피부 세포, 때 또는 다른 물질을 피부 표면으로부터 제거하는데 이용되며, 과일 종자 및 섬유, 곡물 파우더, 너트 및 종자 밀, 및 오일 또는 왁스 비드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 과실 섬유는 블루베리, 크랜베리, 포도, 키위, 나무딸기, 블랙베리, 딸기 등을 포함한다. 곡물 파우더는, 다양한 정도의 굵기(coarseness)로 가공된, 귀리 파우더 및 아몬드 파우더 등을 포함한다. 폴리머 비드(예컨대, 폴리에틸렌으로부터 제작됨)등이 또한 사용될 수 있다. 죽은 피부 세포 및/또는 피부의 가장 바깥층의 제거는 생리활성제, 예컨대, 본 발명의 조성물 중에 또한 존재할 수 있는, 카로테노이드를 위한 기회를 제공하여, 피부의 더 깊은 층에 대해 더 좋은 접근성을 갖도록 한다.

추출물 및 CO₂ 추출물은 종래의 추출 절차 또는 액화된 이산화탄소의 이용을 통해 유래된 초목(herbal) 추출물을 포함한다. 허브는 알로에 베라 잎(aloe vera leaf), 알팔파 잎(alfalfa leaf), 알칸나 뿌리(alkanet root), 안나토 종자(annatto seed), 알로우루트(arrowroot), 우엉 뿌리, 카렌듈라 꽃잎, 당근 뿌리, 카모마일 꽃, 컴프리 잎(comfrey leaf), 콘실크, 더치블루폽피(dutch blue poppies), 회향 종자, 인삼뿌리, 인삼, 녹차 잎, 자스민 꽃, 점퍼베리, 라벤더 눈, 레몬 껍질, 레몬글라스, 마시멜로우 뿌리, 니틀(nettles), 귀리 밀짚, 오렌지껍질, 팝리카(paprika), 파슬리(parsley), 페퍼민트 잎, 장미 눈, 장미 꽃잎, 장미힙(rosehip), 로즈마리 잎, 쉐이브글라스(shavegrass), 녹양박하 잎(spearmint leaf), 및 세인트 존스 워트(St.john's wort) 및 이들의 조합을 포함한다.

색소 및 그리터는 그린 #5, 그린 #8, 오렌지 #4, 레드 #22, 레드 #33, 바이올렛 #2, 블루 #1, 그린 #3, 레드 #40, 옐로우 #5, 옐로우 #6, 그린 #6, 레드 #17을 비롯하여, 진주광택의 미카스(pearlescent micas) 및 틴팅허브, 예컨대, 헨나잎(henna leaf), 백단, 심황, 크랜베리, 키위, 라즈베리, 알칸나, 안나토, 당근 뿌리, 니틀, 팝리카, 및 파슬리를 포함한다.

다양한 구체예에서, 상기 기재된 첨가제를 하나 이상 포함하는 비누화된 오일 조성물이 화장품으로 사용되기 위해 제형화된다. 일부 구체예에서, 화장품은 개별 몸 또는 몸의 일부(예를 들어, 얼굴, 다리 등)에서 사용되기 위한 개인 위생 제품, 예컨대, 클린징 조성물이다.

제 1 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 비누화된 오일 조성물 및 구강 보충제(oral supplement)를 포함하는 키트에 관한 것이다. 제 1 구체예에서, 구강 보충제는 비타민이다. 또 다른 구체예에서, 구강 보충제는 허브이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 첨가제와의 혼합물로, 본원에 기술된 바와 같이 생성된 바이오매스의 알칼리성 가수분해로부터 유래된 비누화된 오일을 이용하는 방법 및 화장품으로서 상기 혼합물을 포장하는 방법에 관한 것이다. 제 1 구체예에서, 상기 화장품은 클린징 조성물(예를 들어, 페이셜 클린저)을 포함한다.

종래의 DNA 분석 방법은 본 발명에 따라 미생물 바이오매스로부터 유래된 구성성분의 존재를 감지하는데 이용될 수 있다.

특허, 특허 출원 및 공개공보를 포함하는 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 이전에 구체적으로 통합되었는지 여부와 관계없이, 본원에 참고문헌으로서 전체로서 통합된다. 본원에서 언급된 공개공보는 본 발명과 연관되어 사용될 수 있는 시약, 방법론 및 개념을 설명 및 개시할 목적으로 인용되었다. 본원에는 이러한 참고문헌이 본원에서 상술된 발명에 관한 선행기술이라는 입장으로 해석되는 것이 아무것도 없다. 특히, 하기 특허 출원은 모든 목적을 위해 본원에 참조문헌으로서 전체로서 통합된다: "Direct Chemical Modification of Microbial Biomass" 라는 주제로 2008년 4월 9일에 출원된 미국 가출원 제 61/043,620호; "Soaps and Cosmetic Products Produced from Oil-Beaπng Microbial Biomass and Oils" 라는 주제로 2008년 6월 20일에 출원된 미국 가출원 제 61/074,610호; "Cosmetic Compositions Comprising Microalgal Components" 라는 주제로, 2008년 11월 7일 출원된 국제 공개공보 제 WO 2008/151149호 및 미국 가출원 제 61/112,464호.

본 발명이 이의 특정 구체예와 연관되어 기술되었을지라도, 추가적 변형이 가능하다고 이해될 것이다. 일반적으로 본 발명의 원리를 구현하며, 본 발명의 분야에 공지되거나 통상의 실시 내에 있고 본원에서 이전에 설명된 본질적인 특징들에 적용될 수 있는 본 발명의 개시내용으로부터 벗어나는 것을 포함하는, 하기 본 발명의 변형, 이용 또는 개조는 하기 청구항의 범위 내에 포함된다. 하기 실시예는 예시를 위한 것으로 청구된 발명을 제한하려는 것은 아니다.

VII . 실시예

실시예 1

다른 언급이 없는 한, 본원 및 하기 실시예에 기재된 모든 균주 및 는 더 유니버시티 오브 텍사스 컬쳐 컬렉션(University of Texas Culture Collection)의 조류(Austin, TX)로부터 획득하였다. 이러한 실시예에서, 클로렐라 균주를 글리세롤과 글루코스 상에서 성장을 테스트하였다. 하기 클로렐라 종 및 균주를 배양하였다: 클로렐라 케슬러리(균주 263, 397, 398, 2228); 클로렐라 소로키니아나(균주 1663, 1665, 1669, 1671, 1810); 클로렐라 사카로필라(2911; 2469); 클로렐라 프로토테코이드(31, 249, 250, 264). 각각의 균주를 고체 배지로부터 25ml 액체 베이스 배지(2g/L 효모 추출물, 2.94 mM NaNO₃, 0.17mM CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.3mM MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.4mM K₂HPO₄, 1.28mM KH₂PO₄, 0.43mM NaCl) 내로 접종시키고, 75μEm^-2s^-1의 빛 세기 하에서 72시간 동안 27℃에서 진탕시키면서 성장시켰다. 이러한 배양액을 각각의 균주를, 2ml의 (a) 베이스 배지만; (b) 0.1% 글루코오스를 함유하는 베이스 배지; 및 (c) 0.5% 시약 등급의 글리세롤(EM Science, 카탈로그 #GX0185-6)를 함유하는 베이스 배지를 함유하는 24-웰 플레이트로 ml 당 1×10⁵의 최종 세포 밀도로 접종시키는데 사용하였다. 플레이트를 암실에 두고 27℃에서 72시간 동안 진탕시키면서 성장시켰다. 3개의 조건에서 성장한 각각의 균주 샘플을 증류수 중에서 1.9:1로 희석시키고, 흡광도를 몰리큘러 디바이씨즈 스펙트라맥스(Molecular Devices SpectraMax) 340PC에서 600nm에서 판독하였다. 모든 균주들은 베이스 배지만 존재하는 경우와 비교하여 글루코오스 및 글리세롤의 존재하에서 성장하는 것으로 나타났다.

실시예 2

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드 #1(균주 250), #2(균주 264) 및 클로렐라 케슬레리 #1(균주 398) 스톡 배양액(stock cultures)을 개질된 프로테오스 배지에서 유지시켰다. 개질된 프로테오스 배지는 리터 당 0.25g의 NaNO₃, 0.09g K₂HPO₄, 0.175g K₂HPO₄, 0.025g CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.075g MgSO₄ㆍ7H₂O 및 2g의 효모 추출물로 구성되었다(g/L). 바이오디젤 생산으로부터의 글리세롤 폐물(산성화된 글리세롤(AG) 및 비-산성화된 글리세롤(NAG))을 임페리얼 웨스턴 프로덕츠(Imperial Westhern Products: 미국 캘리포니아 셀마)로부터 입수하였다. "순수" 또는 "시약 등급" 글리세롤은 EM 사이언스(머크 KGA의 계열사), 카탈로그 #GX0185-6으로부터 입수하였다. 각각의 균주에 대해서, 1ml의 하기 상이한 배지를 24-웰 플레이트에서 제조하였다.

1. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤

2. 프로테오스 + 1% 산성화된 글리세롤

3. 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤

4. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤 + 1% 글루코오스 (72시간 후에 첨가됨)

5. 프로테오스 + 1% 산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스 (72시간 후에 첨가됨)

6. 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스 (72시간 후에 첨가)

각각의 균주를 상이한 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 저장하고, 이것을 430rpm에서 라브네트(Labnet: 영국 버크셔에 소재함)제품인 오비탈 진탕기로 교반하였다. 최초 성장 72시간 후에, 1%(w/v) 글루코오스를 샘플 #4, 5 및 6에 첨가하고 세포를 추가 24시간 동안 배양하였다. 건조 세포 중량을 측정하기 위해, 각 배양액 1ml를 에펜도르프(Eppendorf) 5415C 원심분리기에서 5분 동안 5,000rpm에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청을 제거한 후에, 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시키고 실험실 수준의 냉동 건조기(미국 미주리 랩콩코)에서 동결건조시켰다. 결과는 도 1에 표시되어 있다.

실시예 3

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드 #1(균주 250), #3(균주 249) 및 클로렐라 케슬러리 #2(균주 397) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다(실시예 2 참조). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰플레이트 중에서 제조하였다.

1. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤 + 1% 글루코오스

2. 프로테오스 + 1% 산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스

3. 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스

각각의 균주를 상이한 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 96시간 후에, 세포 성장을 건조 세포 중량에 대해 측정하였다(실시예 2 참고). 결과가 도 2에 표시되어 있다.

실시예 4

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드 #3(균주 249), #4(균주 31) 및 클로렐라 케슬러리 #2(균주 397) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다(실시예 2 참조). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

1. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤 + 1% 글루코오스

2. 프로테오스 + 1% 산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스

3. 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스

각각의 균주를 상이한 글리세롤(순수, 산성화시키거나 비-산성화된)을 함유하는 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 96시간 후에, 지질 함량을 측정하였다. 세포 중의 지질 함량의 양을 측정하기 위해, 100㎕ 배양액을 수집하고 이것을 동일한 부피의 배지로 한번 세척하였다. 각각의 튜브에, 5㎕의 세척된 세포 및 200㎕의 황산(18M)을 첨가하였다. 튜브를 90℃에서 수조 중에서 30분 동안 인큐베이션하고 1ml의 인산-바닐린 시약을 튜브에 첨가하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인산-바닐린 시약을 제조하기 위해서, 0.12g의 바닐린을 20ml의 물에 첨가하고, 85% 인산을 사용하여 부피를 100ml로 조정하였다. 530nm에서의 광 밀도를, 샘플로 5㎕ 물을 함유하는 대조 튜브에 대해 유리 큐벳 중에서 판독하였다. 결과는 도 3에 표시되어 있다.

실시예 5

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드 #2(균주 264), 및 클로렐라 케슬러리 #1(균주 398) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다(실시예 2 참조). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

1. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤

2. 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤

3. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤 + 1% 글루코오스 (72시간 후에 첨가됨)

4. 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스 (72시간 후에 첨가됨)

각각의 균주를 상이한 글리세롤(순수하거나 비-산성화된)을 함유하는 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 최초 성장 72시간 후에, 1% 글루코오스를 샘플 #3 및 #4에 첨가하고 세포를 추가 24시간 동안 배양하였다. 지질 함량을 모든 샘플에서 측정하였다(실시예 4 참고). 비특이적인 흡광도를 체크하기 위해서 600nm에서의 광 밀도를 또한 측정하고, 지질의 양을 계산하기 위해 이것을 O.D. 530nm에서 감하였다. 대조 커브는 1 내지 10㎍의 범위 내의 클로로포름에 용해시킨 트리올레인으로 구성되었다. 그 결과는 도 4에 표시되어 있다.

실시예 6

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드 #3(균주 249), 및 클로렐라 케슬러리 #2(균주 397) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다(실시예 2 참조). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

1. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤 + 1% 글루코오스 (72시간 후에 첨가됨)

2. 프로테오스 + 1% 산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스 (72시간 후에 첨가됨)

3. 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스 (72시간 후에 첨가됨)

각각의 균주를 상이한 글리세롤(순수, 산성화된, 또는 비-산성화된)을 함유하는 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 최초 성장 72시간 후에, 1% 글루코오스를 첨가하고 세포를 추가 24시간 동안 배양하였다. DCW 및 지질 함량을 모든 샘플에서 측정하였다(실시예 2 및 5 참고). 지질 퍼센트를 DCW로 나눈 총 지질 함량으로부터 계산하였다. 그 결과는 도 5에 표시되어 있다.

실시예 7

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드 #2(균주 264), 및 클로렐라 케슬러리 #1(균주 398) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다(실시예 2 참조). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

1. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤 + 1% 글루코오스 (72시간 후에 첨가됨)

2. 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스 (72시간 후에 첨가됨)

각각의 균주를 1% 순수 또는 1% 비-산성화된 글리세롤을 함유하는 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 최초 성장 72시간 후에, 1% 글루코오스를 첨가하고 세포를 추가 24시간 동안 배양하였다. DCW 및 지질 함량을 모든 샘플에서 측정하였다(실시예 1 및 4 참고). 지질 퍼센트를 건조 세포 중량으로 나눈 총 지질 함량으로부터 계산하였다. 그 결과는 도 6에 표시되어 있다.

실시예 8

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드 #1(균주 250), #4(균주 31), 및 클로렐라 케슬러리 #2(균주 397) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다(실시예 2 참조). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

1. 프로테오스 + 2% 글루코오스

2. 프로테오스 + 1% 글리세롤 + 1% 글루코오스

각각의 균주를 상이한 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 최초 성장 96시간 후에, 지질 함량을 측정하였다(실시예 5 참조). 결과는 도 7에 표시되어 있다.

실시예 9

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드 #3(균주 249), #4(균주 31), 및 클로렐라 케슬러리 #1(균주 398) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다(실시예 2 참조). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

1. 프로테오스 + 2% 글루코오스

2. 프로테오스 + 1% 글리세롤 + 1% 글루코오스

3. 프로테오스 + 1% 글리세롤 + 1% 글루코오스(72시간 후에 첨가됨)

각각의 균주를 상이한 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 최초 성장 72시간 후에, 1%(w/w) 글루코오스를 #3 배지에 첨가하고 세포를 추가 24시간 동안 배양하였다. DCW 및 지질 함량을 모든 샘플에서 측정하였다(실시예 2 및 5 참고). 지질 퍼센트를 건조 세포 중량으로 나눈 총 지질 함량으로부터 계산하였다. 그 결과는 도 8에 표시되어 있다.

실시예 10

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드 #1(균주 250), #3(균주 249), 및 클로렐라 케슬러리 #2(균주 397) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다(실시예 2 참조). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

1. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤 + 1% 글루코오스

2. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤 + 1% 글루코오스(72시간 후에 첨가됨)

3. 프로테오스 + 1% 산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스

4. 프로테오스 + 1% 산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스(72시간 후에 첨가됨)

5 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스

6 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스(72시간 후에 첨가됨)

각각의 균주를 상이한 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 최초 성장 72시간 후에, 1%(w/w) 글루코오스를 #2,4 및 #6 배지에 첨가하고 세포를 추가 24시간 동안 배양하였다. 지질 함량을 모든 샘플에서 측정하였다(실시예 4 참고). 결과는 도 9에 표시되어 있다.

실시예 11

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드 #1(균주 250), #3(균주 249), #4(균주 31) 및 클로렐라 케슬러리 #2(균주 397) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다(실시예 2 참조). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

1. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤 + 1% 글루코오스

2. 프로테오스 + 1% 순수 글리세롤 + 1% 글루코오스(72시간 후에 첨가됨)

3. 프로테오스 + 1% 산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스

4. 프로테오스 + 1% 산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스(72시간 후에 첨가됨)

5. 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스

6. 프로테오스 + 1% 비-산성화된 글리세롤 + 1% 글루코오스(72시간 후에 첨가됨)

각각의 균주를 상이한 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 최초 성장 72시간 후에, 1%(w/w) 글루코오스를 #2,4 및 #6 배지에 첨가하고 세포를 추가 24시간 동안 배양하였다. DCW를 모든 샘플에서 측정하였다(실시예 2 참고). 결과는 도 10에 표시되어 있다.

실시예 12

균주 및 배지: (a) 스피루리나 플라텐시스(UTEX 2340) 및 (b) 나비쿨라 펠리쿨로사(UTEX 667) 스피루리나 스톡 배양액을 스피루리나 배지에서 유지시켰고 나비쿨라를 토양 추출 배지(SEM)에서 유지시켰다. 스피루리나 배지는 162

로 구성되었다. 토양 추출 배지는

및 토양 추출물로 이루어졌다. 바이오디젤 생산물로부터의 글리세롤 폐물(산성화된 글리세롤(AG) 및 비-산성화된 글리세롤(NAG))는 임페리얼 웨스턴 프로덕츠(Imperial Westhern Products: 미국 캘리포니아 셀마)로부터 입수하였다. 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

각각의 균주를 상이한 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 96시간 후에, 지질 함량을 측정하였다. 세포 중의 지질 함량의 양을 측정하기 위해, 100㎕ 배양액을 수집하고 이것을 동일한 부피의 배지로 한번 세척하였다. 각각의 튜브에, 5㎕의 세척된 세포 및 200㎕의 황산 18M을 첨가하였다. 튜브를 90℃에서 수조 중에서 30분 동안 인큐베이션하고 1ml의 인산-바닐린 시약을 튜브에 첨가하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인산-바닐린 시약을 제조하기 위해서, 0.12g의 바닐린을 20ml의 물에 첨가하고, 85% 인산을 사용하여 부피를 100ml로 조정하였다. 530nm에서의 광 밀도를, 샘플로 5㎕ 물을 함유하는 대조 튜브에 대해 유리 큐벳 중에서 판독하였다. 대조 커브는 1 내지 10㎍의 범위 내의 클로로포름에 용해시킨 트리올레인으로 구성되었다.

건조 세포 중량을 측정하기 위해, 0.5ml의 각 배양액을 5분 동안 5,000rpm에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청을 제거한 후에, 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시키고 프리즈 드라이 시스템(Freeze Dry system (Labconco, MO, USA))에서 밤새 건조시켰다. 지질 퍼센트를 건조 세포 중량으로 나눈 총 지질 함량으로부터 계산하였다. 결과를 도 11에 나타내었다.

실시예 13

균주 및 배지: 씬데스무스 아르마투스(UTEX 2552) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다. 개질된 프로테오스 배지는 리터 당 0.25g의 NaNO₃, 0.09g K₂HPO₄, 0.175g K₂HPO₄, 0.025g CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.075g MgSO₄ㆍ7H₂O 및 2g의 효모 추출물로 구성되었다(g/L). 각각의 성장 조건에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

씬데스무스 아르마투스(UTEX 2552)를 상이한 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 96시간 후에, 세포 성장을 DCW로 측정하였고, 지질 함량을 인산-바닐린 분석으로 측정하였다(실시예 12 참고). 지질 퍼센트를 건조 세포 중량으로 나눈 총 지질 함량으로부터 계산하였다. 결과는 도 12에 나타나있다.

실시예 14

균주 및 배지: 나비쿨라 페리쿨로사(UTEX 667) 스톡 배양액을 토양 추출 배지 상에 유지시켰다(실시예 12 참고). 각각의 성장 조건에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

나비쿨라 페리쿨로사(UTEX 667)를 글루코스 또는 상이한 글리세롤(순수, 산성화된, 또는 비-산성화된)을 포함하는 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 96시간 후에, 세포 성장을 DCW로 측정하였다(실시예 12 참고). 결과를 도 13에 나타내었다.

실시예 15

균주 및 배지: 씬데스무스 아르마투스(UTEX 2552) 및 나비쿨라 페리쿨로사(UTEX 667) 스톡 배양액을 씬데스무스 아르마투스에 대하여는 개질된 프로테오스 배지 및 나비쿨라 페리쿨로사에 대하여는 토양 추출 배지에서 유지시켰다(실시예 1 참고). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

씬데스무스 아르마투스

5. 프로테오스 + 1 % 산성화된 글리세롤 + 1 % 글루코스

6. 프로테오스 + 1 % 산성화된 글리세롤 + 1 % 글루코스(72시간 후 첨가됨)

나비쿨라 펠리쿨로사

1. SEM + 1% 산성화된 글리세롤 + 1% 글루코스

2. SEM + 1% 산성화된 글리세롤 + 1% 글루코스(72시간 후 첨가됨)

각각의 균주를 배지에 5 ×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 최초 성장 72시간 후에, 1% 글루코스를 샘플 #2에 첨가하고 세포를 추가 24시간동안 배양하였다. 세포 성장을 DCW로 측정하였다(실시예 12 참고). 결과는 도 14(a) 및 (b)에 나타나있다.

실시예 16

균주 및 배지: 클로렐라 프로토테코이드(UTEX 31) 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지 상에 유지시켰다(실시예 1 참조). 각각의 균주에 대해서, 하기 상이한 배지 1ml를 24-웰 플레이트 중에서 제조하였다.

4. 프로테오스

5. 프로테오스 + 0.5% 글루코스

6. 프로테오스 + 0.5% 크실로스

7. 프로테오스 + 0.25% 글루코스 + 0.25% 크실로스

클로렐라 프로토테코이드 #4(UTEX 31)를 다양한 당(글루코스, 또는 크실로스)를 포함한 배지에서 3×10⁵ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 성장 72시간 후에, 각 배양액의 세포 수를 세어 세포 성장을 측정하였다. 결과는 도 15에 나타나있다.

실시예 17

클로렐라 프로테코이드 균주 #1,#3 및 #4 스톡 배양액을 개질된 프로테오스 배지에서 유지시켰다(실시예 1 참고). 각 조건에 대하여, 하기 상이한 배지 1ml을 24-웰 플레이트에서 제조하였다.

1. 프로테오스

2. 프로테오스 + 1% 글루코스

3. 프로테오스 + 1% 과당

각각의 균주를 상이한 당(글루코스, 또는 과당)을 포함한 배지에 1 ×10⁶ 세포/ml 농도로 접종하였다. 배양액을 암실에 두고 랩네트(영국 버크셔) 제품인 오비탈 진탕기로 430rpm에서 진탕시켰다. 성장 96시간 후에, 각 배양액의 세포 수를 세어 세포 밀도를 측정하였다. 결과는 도 16에 나타나있다.

실시예 18

자당에서의 클로렐라

클로렐라 프로테코이드(UTEX 249)를 클로렐라 프로토테코이드 (UTEX 249)를 1% 자당을 함유하는 프로테오스 배지(2.94mM NaNO₃, 0.428mM K₂HPO₄, 1.28mM K₂HPO₄, 0.427mM NaCl, 0.17mM CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.3mM MgSO₄ㆍ7H₂O, 프로테오스 펩톤 1g/L)의 3개의 50ml 플라스크 내로 ml 당 4 × 10⁵ 세포의 최종 세포 밀도로 접종하였다. 전화효소 (시그마#14504)를 0.01U/ml 및 0.05U/ml의 2개의 배양액에 첨가하였다. 3개의 모든 배양액을 150rpm에서 진탕시키면서 약 60시간 동안 암실에서 성장시켰다. 최종 세포 계수를, 암실에서 약 60시간 동안 진탕시킨 후의 3개의 모든 배양액에 대해 수행하였다. 대조 플라스크는 ml 당 4.4× 10⁵ 세포에 도달한 반면, 0.01U/ml 및 0.05U/ml 플라스크에서는 각각 1 × 10⁸ 및 3×10⁸의 세포 밀도에 도달하였다. 각각의 플라스크를 현미경 분석에 의해 실험 마지막에 오염에 대해 체크하였으나, 모두가 깨끗하였다

실시예 19

자당 전화효소와 함께 당밀에서의 클로렐라 프로토테코이드 성장

접종을 위한 클로렐라 세포의 제조: 고체 프로테오스 플레이트로부터 접종편을 취하여 클로렐라의 10ml의 액체 배양을 개시하였다. 배양액을 대략 2일 동안 26℃에서 빛 아래서 성장시켰다. 750nm에서 광 밀도계(OD)를 사용하여 그리고 건조 세포 중량을 측정함으로써 성장을 측정하였다.

당밀 및 당 스톡 용액의 제조: 하기 표 6에 도시되었듯이, 사탕수수의 당의 상업적 가공으로부터 획득된, 글루코스, 자당 및 세 개의 상이한 당밀 샘플(BSl, BS2 및 HTM으로 라벨링됨)을 이용하여 5% 스톡 용액을 제조하였다. 모든 스톡의 pH는 6 내지 6.6의 범위 내에 있는 것으로 확인되었고, 이후 스톡을 오토클레이브하였다.

[표 6] 당밀 및 당 용액

전화효소 용액의 제조: 전화효소 40 단위/ml 스톡 용액을 1mg의 400 단위/mg 전화효소(시그마)를 10 밀리리터의 증류수 중에서 재구성함으로써 제조하였다.

실험 조건 및 설정: 베이스 프로테아제 배지 중의 각각의 1% 최종 당밀/당 농도, 0.05 단위/ml 전화효소, 및 ml 당 1.0 ×10⁶ 세포의 클로렐라 프로토테코이드로 구성되는 10ml 배양액을 제조하였다. 상기 배양액을 하기와 같이 넘버링하였다: (1) 단지 대조만의 배지; (2) 1% HTM; (3) 1% BS1; (4) 1% BS2; (5) 1% 글루코오스; 및 (6) 1% 자당. 유사 대조 셋을 또한 전화효소를 첨가하지 않고 제조하였다. 배양액을 28℃에서 250rpm에서 진탕시키면서 5일 동안 암실에서 성장시켰다.

결과: 클로렐라 프로토테코이드 세포의 성장은, 암실 중에서 각각의 공급원료 상에서 5일 동안 인큐베이션한 후에 평가하였다. 도 19 내지 20에 도시된 바대로, 세포들은 순수 글루코오스 상에서의 성장에 필적하는 수율로, 자당 전화효소의 존재하에서 당밀 상에서 성장할 수 있다.

실시예 20

고-오일 및 저-오일 바이오매스의 생성

재료 및 방법: 트랜스에스테르화를 위한 클로렐라 프로토테코이드#1(균주 250) 바이오매스를 문헌[Appl Microbiol Biotechnol 78:29-36(2008)]에 기재된바와 같이, 본질적으로, 유가식 발효로서(fed-batch fermentation), 고정된 탄소 소스로서 글루코스의 존재하에 종속영양적으로 성장시켰다. 샘플 "LO-1"을 실험적 성장(60시간) 중에 취득하였고, 이는 광합성 성장으로 확득한 것과 유사한 양의 오일 함량을 포함하였다. 샘플 "080020-1"을 배양액 내의 모든 질소가 소비되고, 배양액이 지질 축적의 안정기에 들어선 후, 115 시간에 취득하였다.

지질 함량: 오일의 총 지질 함량(트랜스에스테르화 전)을 HPLC 분석으로 측정하였다. 대략 건조된 바이오매스 10 mg를 KOH로 포화된 이소프로판올 1ml과 혼합하고, 80℃에서 4시간동안 인큐베이션하였다. 세포 펠렛으로부터 지질을 추출하고, 80℃에서 4시간동안 가열한 이소프로판올 포타슘 수산화물 용액을 이용하여 가수분해시켰다. 추출한 샘플을 아그리엔트(Aglient) 1100 HPLC로 하기 방법을 이용하여 분석하였다. 브로모펜아실 프로마이드(60 mg/ml)로 샘플을 유도하였고, 루나(Luna) 5u C8(2) 100A 150×2mm 컬럼(Phenomenex)에 로딩시켰다. 샘플을 100% 아세토니트릴: 테스라히드로퓨란(95:5)까지 물 구배를 이용하여 상기 컬럼으로부터 녹여서 분리하였다. DAD 분석 감지기를 이용하여 254 nm에서 파장에서 신호를 감지하였다.

샘플 "LO-1"은 8.6% 오일을 포함하였고, 샘플 "080020-1"는 28% 오일을 포함하였다.

실시예 21

미생물 바이오매스의 직접적인 트랜스에스테르화

샘플 제조: 상기 기술된 바와 같이 제조된, 저-오일 함량 및 고-오일 함량을 각각 포함하는 바이오매스의 젖은 펠렛(Wet pellets)을 동결건조시켰다. 샘플로부터 건조된 바이오매스를 굵은 파우더로 분쇄하고, 진공 하에서 55℃에서 밤새 재 건조시켰다. 퍼센트 수분을 메틀럴 토레도 모이스쳐 분석기(Mettler Toledo Moisture analyzer)를 이용하여 각 샘플에 대해 <3%가 될 때까지 측정하였다.

트랜스에스테르화: 무수 메탄올/1N NaOH를 바이오매스의 부피의 4배인 스크류 캡 글라스 병에서 건조된 바이오매스(<3% 수분)에 첨가하여 1:5 비율로 건조시켰다. 스틸 바를 병 내에 넣어 타이트하게 봉인하였다. 상기 혼합물을 55℃에서 7시간동안 강력하게 교반하였다. 바이오매스를 와트만 필터 종이를 통해 여과하고, 상기 여과액이 투명해질 때까지 메탄올로 세척하였다. 모든 세척액을 둥근 플라스크에서 기존 여과액과 결합시켰고, 메탄올을 로토밥(rotovap)을 이용해 희석시켰다. 클로로폼(1 파트)를 첨가하고, 잘 혼합한 후, 분별 깔대기에 넣었다. 그 다음 메탄올(2 파트)를 플라스크에 첨가하고, 잘 혼합하고, 분별 깔대기에 첨가하였다. DI 수(0.8 볼륨)를 플라크스에 첨가하고, 혼합하고, 분별 깔대기에 첨가하였다. 분별 깔대기의 내용물을 강하게 흔들고(벤팅 이용), 분리되도록 하였다. 낮은 층(클로로폼/오일)을 무게를 측정하기 전의 플라스크에 수집하고, 신선한 클로로폼을 제 2 추출을 위해 깔대기에 다시 첨가하였다. 그 다음 클로로폼을 고토밥을 이용해 희석하였다. 플라스크의 무게를 다시 재어 산출물 측정을 제공하였다. 지질 함량을 상기 기술한 바와 같이 HPLC로 재 측정하였다. 문헌[Schmid et al, J of Applied Phycology 7:487-494 (1995)]에 기재된 바와 같이, HPLC 방법을 이용하여 트랜스에스테르화된 조성물의 카로테노이드 구성성분의 분석적 측정을 수행하였다.

결과: 표 7은 저-오일(LO-1-8.6% 지질) 및 고-오일(080020-1-28% 지질) 바이오매스로부터 트랜스에스테르화된 산물의 결과를 나타내고 있다. 모든 카로테노이드는 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 친유성 층의 mcg/g이다.

트랜스에스테르화된 저-오일 및 고-오일 바이오매스의 조성

실시예 22

고 오일 함량을 달성하기 위한 미세조류의 배양

미세조류 균주를 DCW로 높은 퍼센트의 오일을 달성하기 위해 배양하였다. 동결 보존된 세포(Cryopreserved)를 실온에서 해동시키고, 500μl의 세포를 2% 글루코스를 함유한 4.5ml 배지(4.2 g/L K₂HPO₄, 3.1 g/L NaH₂PO₄, 0.24 g/L MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.25 g/L 시트르산 모노하이드레이트, 0.025 g/L CaCl₂ 2H₂O, 2 g/L 효모 추출물)에 첨가하고, 7일동안 28℃에서 교반하면서(200 rpm) 6-웰 플레이트에서 성장시켰다. 1ml의 배양액을 14,000 rpm에서 5분 동안 무게를 재기 전인 에펜돌프 튜브에서 원심분리하여 DCW를 측정하였다. 배양 상청을 버리고, 생성된 세포 펠렛을 1 ml의 비이온화된 물로 세척하였다. 배양액을 다시 원심분리하고, 상청을 버리고, 세포 펠렛을 냉동될 때까지 -80℃에 두었다. 그 다음 샘플을 24시간 동안 동결건조하고, DCW를 계산하였다. 배양액 내 총 지질을 측정하기 위해, 배양액 3ml을 제거하고, 안콤 시스템(Ankom system (Ankom Inc , Macedon, NY))를 이용해 제조업자의 프로토콜에 따라 분석하였다. 샘플을 알콤 XT10 추출기를 이용해 제조업자의 프로토콜에 따라 용매 추출하였다. 산 가수분해된 건조 샘플과 추출되고 건조된 용매 사이에서 질량의 차이로 총 지질을 측정하였다. 퍼센트 오일 DCW 측정을 표 8에 나타내었다.

[표 8]. 고 오일 함량 달성을 위한 미세조류 배양

실시예 23

고 오일 함량을 지닌 미세조류의 유전자형 분석( Genotyping )

상기 표 8에 나열된 23개의 균주로부터의 미세조류 샘플을 유전자형 분석하였다. 게놈 DNA를 조류 바이오매스로부터 하기와 같이 분리하였다. 세포(대략 200 mg)을 액체 배양액으로부터 14,000 × g에서 5분 원심분리하였다. 그 다음 세포를 살균된 증류수에서 재현탁시키고, 14,000 × g에서 5분 원심분리하였으며, 상청을 제거하였다. 지름 2mm 이하의 단일 글라스 비드를 바이오매스에 첨가하고, 튜브를 15분 이상 80℃에 두었다. 샘플을 제거하고, 150μl의 그린딩 완충용액(grinding buffer)(1 % 살코실(Sarkosyl), 0.25 M 자당, 50 mM NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM 트리스-HCl, pH 8.0, RNase A 0.5 ug/ul)을 첨가하였다. 펠렛을 간단히 볼텍싱하고, 40 μl의 5 M NaCl을 첨가함으로서 재현탁시켰다. 샘플을 간단히 볼텍싱하고, 66 μl의 5% CTAB(세틸 트리메틸망오늄 브로마이드)를 첨가하고 최종적으로 간단히 볼텍싱하였다. 샘플을 14,000 × g에서 10분 원심분리한 다음 65℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 상층을 깨끗한 튜브로 옮기고, 300μl 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 12:12:1로 한번 추출한 후, 14,000 × g에서 5분 동안 원심분리하엿다. 생성된 수성상을 0.7 부피의 이소프로판올(~190 μl)을 포함한 깨끗한 튜브로 옮기고, 반대로하여 혼합하고, 실온에서 30분 동안 또는 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 14,000 × g에서 10분 동안 원심분리하여 DNA를 회수하였다. 그 다음 생성된 펠렛을 70% 에탄올로 두번 세척하고, 100% 에탄올로 최종적으로 세척한다. 펠렛을 20-30분 동안 실온에서 공기 건조시키고, 50 μl의 1OmM TrisCl, 1mM EDTA(pH 8.0)에서 재현탁시켰다.

상기 기재된 바와 같이 제조된, 총 조류 DNA 5μl을 pH 8.0 10mM 트리스에서 희석하였다. PCR 반응, 최종 부피 20μl을 하기와 같이 설정하였다. 10μl의 2 x iProof HF 마스터 믹스(BIO-RAD)를 0.4 μl 프라이머 SZ02613(5'- TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3'(SEQ ID NO: 1)에 10 mM 스톡 농도로 첨가하였다. 이 프라이머 서열은 젠 뱅크 수탁번호 L43357 중 위치 567-588에서 시작하고, 고등 식물 및 조류 색소체 게놈에서 높게 보존된다. 그 다음 10mM 스톡 농도로 0.4μl 프라이머

를 첨가하였다. 이 프라이머 서열은 젠 뱅크 수탁번호 L43357 중 위치 1112-1093DP에 상보적이며, 고등식물 및 조류 색소체 게놈에서 높게 보존된다. 그 다음, 희석된 총 DNA 5 μl 및 3.2μl dH₂O를 첨가하였다. PCR 반응을 하기와 같이 수행하였다: 35 사이클 동안

후, 1분 동안 72℃ 및 25℃에서 홀딩. PCR 산물을 정제하기 위해, PH 8.0의 10mM 트리스 20μl를 각 반응에 첨가한 후, 40μl의 페놀:클로로폼: 이소아밀 알코올 12:12:1을 추출하고, 볼텍싱하며, 14,000 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. PCR 반응을 S-400 컬럼(GE Healthcare)에 적용하였고, 2분 동안 3,000 × g에서 원심분리 하였다. 정제된 PCR 산물을 후속하여 PCR8/GW/TOPO 및 LB/Spec 플레이트로 선별된 양성 클론으로 TOPO 클로닝하였다. 정제된 플라스미드 DNA를 M13 순방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 양쪽 방향으로 시퀀싱하였다. Geneious DNA 분석 소프트웨어를 이용하여 생성된, 뿌리없는 나무(unrooted tree) 및 서열 정렬을 도 29a-29i에 도시하였다. 균주 1-23(실시예 22, 표 8에서 지정된)로부터의 서열이 첨부된 서열 목록에서 SEQ ID NOs: 7-29로 나열되어 있다.

실시예 24

조류 종에서 지질 쇄의 다양성

조류의 다양한 종의 배양액을 유지시키고, 모든 실험을 개질된 프로테아제 배지에서 수행하였다(실시예 2에서 기술한 바와 같이). 각 균주에 대하여, 10ml의 배양액을 50ml 플라스크에 하기와 같이 설정하였다:

1. 탄소 첨가가 없는 프로테오스 성장 배지

2. 1% 글루코스를 포함한 프로테오스 성장 배지

각 균주를 최초 씨딩 밀도 1.0 × 10⁶ 세포/ml로, 상기 기술된 두개의 조건에서 성장시켰다. 배양액을 암실에 두고, 250rpm에서 7일 동안 교반하였다. 세포를 7일 성장 기간 후 수확하였고, 건조 중량 세포로 측정함으로서 대조군에 대하여 암실에서의 성장을 분석하였다. DCW를 하기와 같이 측정하였다: 배양액 1ml를 원심분리하고, 생성된 펠렛을 물로 헹구어 임의의 염 또는 남은 배지를 제거하고, 최종적으로, 헹군 펠렛을 -80 온도(degree C)에서 냉각하였으며; 밤새 프리즈 드라이 시스템(Freeze Dry System (Labconco, MO, USA))에서 밤새 동결 건조하였다. 하기 표 9에 나열된 모든 종은 글루코스를 탄소원으로서 암실에서 성장된 것이다. 글루코스의 부재(조건 1)에서 성장된 세포는 존재하지 않는다. 당지질 프로파일을 실시예 20과 같이 측정하였다.

[표 9]. 다앙한 조류 종의 당지질 프로파일

표 8에 제시되고, 실시예 22에서 기재된 바와 같이 성장된 균주의 서브셋으로부터의 지질 샘플 또한, HPLC를 이용하여 지질 프로파일을 분석하였다. 결과를 도 29에 나타내었다.

실시예 25

고-오일 클로렐라 프로토테코이드 바이오매스의 비누화

고-오일 함량을 갖는 바이오매스를 생성하고 실시예 20에 기재된 방법에 따라 분석하였다. 상기 바이오매스는 45% 지질, 20% 탄수화물, 10% 단백질, 10% 기타 세포성 구성성분, 10% 물, 및 5% 염을 포함한다. 구체예에서, 바이오매스는 부분적으로 탈수된 세포 매스 내에 부유하는 지질 구상체를 포함하는 건조된 총 조류 세포를 포함할 수 있다.

지질 세포성 비누의 제조: 상기 확인된 바이오매스를 물에 분산시켜 세포 에멀젼 농축액 중 오일을 형성시켰다. 그 다음, 원하는 양의 당지질 및 지방산 에스테르를 지방산 염으로 변환시키기에 충분한 과량의 KOH를 바이오매스를 포함하는 수성 용액에 희석시켰다. 그 다음, 그 혼합물을 교반하여 알칼리성 가수분해 반응을 촉진시키고, 30분에서 12시간 동안 80-90℃ 사이의 온도로 가열하여, 지질을 지방산 염으로 변환시키는 것을 완성하였다. 증발로의 물 손실은 필요에 따라 반응 공정을 통해 대체된다. 다양한 첨가제가 글리세린(투명도에 대해, 보습 특성을 부여함), 에틸렌디아민(EDTA, 경수 조건에서 사용되는 경우 성능을 강화하기 위한 킬레이트제), 코코아미도프로필 베타인(세정 및 헹굼성을 부여하는데 사용되는 양쪽성 계면활성제), 및 비누 제품을 생산하기 위한 향료를 포함하는, 비누화된 조성물에 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 비누 제품은 하기 표 10에 나타난 성분을 지닌 세포성 비누를 포함한다.

[표 10]. 바이오매스에서 직접적으로 제작된 세포성 비누의 성분

이 실시예에 기재된 세포성 비누는 탄수화물 및 조류 세포로부터의 단백질의 존재에 의해 조성물에 부여된 천연 수화성 및 피부 연화성을 비롯하여 조류 카로테노이드 및 다른 화합물의 통합에서 유래된 항산화적 특성을 포함한다.

대안적으로, 유기 베이스, 예컨대, 트리에탄올아민이 알칼리성 가수분해 반응에 사용되어, 투명한 제품을 생산할 수 있다. 트리에탄올아민 또는 또다른 유기 베이스는 또한 일반적으로, 클린저로 사용될 경우 피부에 자극을 유발할 가능성이 적은 더 순한 제품을 생산할 것이다.

선택적으로, 지방산 염은 NaCl 또는 KCl 염을 첨가하여 혼합물로부터 침전될 수 있고, 본원에 기술된 다양한 첨가제와 혼합한 조성물에 사용되기 위해 분리될 수 있다.

도 20은 48% 오일 DCW 클로렐라 프로토테코이드 바이오매스를 이용해 제작된 비누의 현미경사진을 나타낸다. 상기 비누는 10% w/w 조류 바이오매스를 포함하였다.

실시예 26

클로렐라 프로토테코이드 바이오매스로부터의 헥산 -추출 오일의 비누화

실시에 20에 기술된 방법에 따라 바이오매스를 생성하였다. 바이오매스로부터의 지질의 종래 헥산 추출이 수행되었다. 그 다음, 지질과, 원하는 양의 지질을 지방산 염으로 변환시키기에 충분한 양의 염기를 포함하는 NaOH 또는 KOH의 수성 용액을 혼합시킴으로서 헥산 추출된 지질을 비누화하였고, 선택적으로 상기 혼합물을 가열하여 반응을 촉진시켰다. 그 다음, 지방산 염을 NaCl 또는 KCl을 첨가하여 침전시켰다. 헥산-추출된 바이오매스로부터 유래된 비누화된 오일 조성물은 더 높은 비율의 오염된 카로테노이드를 포함하는데, 이는 헥산이 미생물 바이오매스로부터 이러한 화합물을 추출하는 효율성 때문이다.

실시예 27

클로렐라 프로테코이드 바이오매스로부터 무용매 -추출된 오일의 비누화

실시예 20에 기재된 방법에 따라 바이오매스를 생성하였다. 바이오매스로부터 지질의 무용매 추출은 물리적 압력을 이용하여 바이오매스를 압박 및 용해시킴으로서 수행되었다. 그 다음 지질과, 원하는 양의 지질을 지방산 염으로 변환시키기에 충분한 양의 염기를 포함하는 NaOH 또는 KOH의 수성 용액을 혼합시킴으로서 추출된 지질을 비누화하였고, 선택적으로 상기 혼합물을 가열하여 반응을 촉진시켰다. 그 다음, 지방산 염을 NaCl 또는 KCl을 첨가하여 침전시켰다. 헥산-추출된 바이오매스로부터 유래된 비누화된 오일 조성물은 헥산-추출된 지질과 비교하여 상대적으로 더 낮은 비율의 오염된 카로테노이드를 포함하는데, 이는 이러한 화합물이 무용매 절차를 이용하여 미생물 바이오매스에서 추출되어 효율성을 감소시키기 때문이다.

실시예 28

프로토테카 균주의 당지질 프로파일

5개의 프로토테카 균주를 2% 글루코스를 포함하는 배지에서 배양하였고, 7일 동안 28℃에서 교반하면서(200 rpm) 6-웰 플레이트에서 성장시켰다. 표준 HPLC 방법을 이용하여 지질 프로파일을 측정하였다. 특정 균주에 대한 지질 프로파일은, 상이한 배양 배지에서 성장된 경우, 상당한 변화를 보이지 않았다. 결과는 하기 표 11에 나타나있다.

[표 11]. 프로토테카 균주의 당지질 프로파일

UTEX 1435로부터의 바이오매스에 헥산 추출을 적용하였다. 추출된 오일은 매우 적은 색소를 포함하였다. 도 19는 클로렐라 프로토테코이드 UTEX 250로부터의 오일과 비교하여 UTEX 1435 오일 샘플을 나타내고 있다.

실시예 29

프로토테카 모리폴미스 UTEX 1435로부터 추출된 오일의 카로테노이드 및 엽록소 분석

프로토테카 모리폴미스(UTEX 1435) 바이오매스로부터의 헥산 추출된 오일을 상기 실시예 26에 기재된 방법에 따라 생성하였고, HPLC를 이용하여 카로테노이드 및 엽록소를 분석하였다. 전반적으로, 카로테노이드 수준은 상기 표 7에 기재된 오일 내 카로테노이드 수준보다 훨씬 더 낮았다. 추가적으로, 오일의 엽록소 함량은 0.01mg/kg 미만이었다. 이 결과는 매우 소량의 색소를 지니는 UTEX 1435 바이오매스로부터 추출된 오일을 이용한, 도 19에 제시된 결과와 일치한다. UTEX 1435 바이오매스로부터 추출된 오일에 대한 카로테노이드 및 엽록소 분석을 하기 표 12에 요약하였다.

[표 12]. 프로토테카 모리폴미스 UTEX 1435로부터 추출된 오일의 카로테노이드 분석

실시예 30

클로렐라 프로토테코이드의 8개 균주로부터 23S rRNA 의 게놈 DNA 분석

클로렐라 프로토테코이드의 8개 균주(UTEX 25, UTEX 249, UTEX 250, UTEX 256, UTEX 264, UTEX 411, CCAP 211/17, 및 CCAP 211/8d)로부터 게놈 DNA를 분리하고, 상기 실시예 23에 기재된 방법에 따라 23S rRNA의 게놈 DNA 분석을 수행하였다.

테스트된 클로렐라 프로토테코이드의 모든 균주가 UTEX 25를 제외하고, 순서대로 동일하였다. 결과는 도 21a-21c에 도시된 분지도로 요약되어 있다. 모든 8개 균주의 서열이 부착된 서열 목록에서 SEQ ID NOs: 3-4로 나열되어 있다.

또한, 프로토테카 모리폴미스 UTEX 1436(SEQ ID NO: 5)에 대한 23s rRNA 게놈 서열을 다른 프로토테카 종 및 클로렐라 프로토테코이드와 비교하였다. 상기 비교는, 프로토테카 모리폴미스 UTEX 1436에 대한 23s rRNA 게놈 서열이 다른 프로토테카 유전자형(SEQ ID NO:6)과 비유사함을 나타내었다.

실시예 31

사탕수수 이용 스크린

균주: 사탕수수를 유일한 탄소원으로 이용할 수 있는 미세조류 군주를 확인하기 위한 스크린에서 하기 균주들을 이용하였다: 10개 균주는 클로렐라 프로토테코이드(UTEX 25, UTEX 31, UTEX 411, CCAP 221/8D, UTEX 249, UTEX 250, UTEX 256, UTEX 264, SAG 211-lOD, 및 CCAP 211/17)이다. 6개 균주는 프로토테카 모리폴미스(UTEX 1435, UTEX 1437, UTEX 288, UTEX 1439, UTEX 1441 및 UTEX 1434이다. 다른 균주는 클로렐라 루테오비리디스(UTEX 22 및 SAG 2214), 클로렐라 케슬러리(UTEX 2229), 파라클로렐라 케슬러리(SAG 12.80) 및 프로토테카 스타그노라(UTEX 1442)를 포함하였다.

배양 조건: 미세 조류 균주(상기 확인됨)의 종배양을 24 웰 플레이트에서 1ml 액체 배양액으로 시작하였고, 빛에서 48시간 동안 350 rpm이하로 교반하면서, 독립영양적으로 성장시켰다. 순수 사탕수수를 과당 21.0% w/w, 포도당 28.0% w/w, 자당 16.0% w/w 및 말토오스 <0 5% w/w의 당 프로파일을 가지는 마스담 사탕수수 밀(Maasdam Sorghum Mill)(Lynnville, Iowa)에서 구입하였다. 그 다음 상기 배양액을 유일한 탄소원으로서 2%, 5% 또는 7% (v/v) 순수 사탕수수(순수 스톡에서 희석됨)를 포함하는 액체 배지로 옮기고, 그 다음 상기 배양액을 350 rpm 이하로 교반하면서, 암실에서 종속영양적으로 성장시켰다. 배양액으로부터 24, 40, 48, 67 및 89 시간에 샘플을 뽑고, 분광 광도계에서 A750 리딩을 이용하여 성장을 측정하였다. 도 22-27에 나타낸 바와 같이, 테스트된 각각의 균주에 대하여 성장이 관찰되었다.

SEQUENCE LISTING <110> SOLAZYME, INC. <120> DIRECT CHEMICAL MODIFICATION OF MICROBIAL BIOMASS AND MICROBIAL OILS <130> 026172-002830PC <140> PCT/US2009/040123 <141> 2009-04-09 <150> 61/043,620 <151> 2008-04-09 <150> 61/074,610 <151> 2008-06-20 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 tgttgaagaa tgagccggcg ac 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 cagtgagcta ttacgcactc 20 <210> 3 <211> 546 <212> DNA <213> Chlorella protothecoides <400> 3 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa cgtggcaagg ttaaggaaac gtatccggag 60 ccgaagcgaa agcaagtctg aacagggcga ttaagtcatt ttttctagac ccgaacccgg 120 gtgatctaac catgaccagg atgaagcttg ggtgacacca agtgaaggtc cgaaccgacc 180 gatgttgaaa aatcggcgga tgagttgtgg ttagcggtga aataccagtc gaactcggag 240 ctagctggtt ctccccgaaa tgcgttgagg cgcagcggtt cataaggctg tctaggggta 300 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cgtaatagct cactg 565 <210> 5 <211> 565 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 5 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa ggtggcatgg ttaaggaaat attccgaagc 60 cgtagcaaaa gcgagtctga atagggcgat aaaatatatt aatatttaga atctagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaagctt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaga acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cgatgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaatacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 6 <211> 573 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 6 tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 7 <211> 565 <212> DNA <213> Chlorella protothecoides <400> 7 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata 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tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 10 <211> 565 <212> DNA <213> Chlorella kessleri <400> 10 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 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acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360 ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548 <210> 14 <211> 548 <212> DNA <213> Parachlorella kessleri <400> 14 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaga agtggcttgg ttaaggataa ctatccggag 60 ccagagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ttaaaggtca ctttttctag acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360 ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548 <210> 15 <211> 565 <212> DNA <213> Parachlorella kessleri <400> 15 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa agtggcgtgg ttaaggaaaa attccgaagc 60 cttagcgaaa gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 16 <211> 541 <212> DNA <213> Prototheca stagnora <400> 16 tgttgaagaa tgagccggcg agttaaaaaa aatggcatgg ttaaagatat ttctctgaag 60 ccatagcgaa agcaagtttt acaagctata gtcatttttt ttagacccga aaccgagtga 120 tctacccatg atcagggtga agtgttggtc aaataacatg gaggcccgaa ccgactaatg 180 gtgaaaaatt agcggatgaa ttgtgggtag gggcgaaaaa ccaatcgaac tcggagttag 240 ctggttctcc ccgaaatgcg tttaggcgca gcagtagcaa cacaaataga ggggtaaagc 300 actgtttctt ttgtgggctt cgaaagttgt acctcaaagt ggcaaactct gaatactcta 360 tttagatatc tactagtgag accttggggg ataagctcct tggtcaaaag ggaaacagcc 420 cagatcacca gttaaggccc caaaatgaaa atgatagtga ctaaggacgt gagtatgtca 480 aaacctccag caggttagct tagaagcagc aatcctttca agagtgcgta atagctcact 540 g 541 <210> 17 <211> 573 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 17 tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 18 <211> 573 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 18 tgttgaagaa tgagccggcg acttaaaata aatggcaggc taagagaatt aataactcga 60 aacctaagcg aaagcaagtc ttaatagggc gctaatttaa caaaacatta aataaaatct 120 aaagtcattt attttagacc cgaacctgag tgatctaacc atggtcagga tgaaacttgg 180 gtgacaccaa gtggaagtcc gaaccgaccg atgttgaaaa atcggcggat gaactgtggt 240 tagtggtgaa ataccagtcg aactcagagc tagctggttc tccccgaaat gcgttgaggc 300 gcagcaatat atctcgtcta tctaggggta aagcactgtt tcggtgcggg ctatgaaaat 360 ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact agaaatgacg atatattagt gagactatgg 420 gggataagct ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg 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gcgagtctga atagggcgat caaatatttt aatatttaca atttagtcat 120 tttttctaga cccgaacccg ggtgatctaa ccatgaccag gatgaaactt gggtgatacc 180 aagtgaaggt ccgaaccgac cgatgttgaa aaatcggcgg atgagttgtg gttagcggtg 240 aaataccagt cgaacccgga gctagctggt tctccccgaa atgcgttgag gcgcagcagt 300 acatctagtc tatctagggg taaagcactg tttcggtgcg ggctgtgaaa acggtaccaa 360 atcgtggcaa actctgaata ctagaaatga cggtgtagta gtgagactgt gggggataag 420 ctccattgtc aagagggaaa cagcccagac caccagctaa ggccccaaaa tggtaatgta 480 gtgacaaagg aggtgaaaat gcaaacacaa ccaggaggtt ggcttagaag cagccatcct 540 ttaaagagtg cgtaatagct cactg 565 <210> 21 <211> 546 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 21 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaaa cgtggcaagg ttaaggacat gtatccggag 60 ccgaagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ctaagtcatt ttttctagac ccgaacccgg 120 gtgatctaac catgaccagg atgaagcttg ggtgacacca agtgaaggtc cgaaccgacc 180 gatgttgaaa aatcggcgga tgagttgtgg ttagcggtga aataccagtc gaactcggag 240 ctagctggtt ctccccgaaa tgcgttgagg cgcagcggtt cataaggctg tctaggggta 300 aagcactgtt tcggtgcggg ctgcgaaagc ggtaccaaat cgtggcaaac tctgaatact 360 agatatgcta tttatgagcc agtgagacgg tgggggataa gcttcatcgt cgagagggaa 420 acagcccaga tcactagcta aggcccctaa atgatcgtta agtgacaaag gaggtgagaa 480 tgcagaaaca accaggaggt ttgcttagaa gcagccaccc tttaaagagt gcgtaatagc 540 tcactg 546 <210> 22 <211> 550 <212> DNA <213> Chlorella sorokiniana <400> 22 tgttgaagaa tgagccggcg acttatagga agtggcaggg ttaaggaaga atctccggag 60 cccaagcgaa agcgagtctg aaaagggcga tttggtcact tcttatggac ccgaacctgg 120 atgatctaat catggccaag ttgaagcatg ggtaacacta tgtcgaggac tgaacccacc 180 gatgttgaaa aatcggggga tgagctgtga ttagcggtga aattccaatc gaattcagag 240 ctagctggat ctccccgaaa tgcgttgagg cgcagcggcg acgatgtcct gtctaagggt 300 agagcgactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa gtcgtggcaa actccgaata 360 ttaggcaaag gattccgtga gccagtgaga ctgtggggga taagcttcat agtcaagagg 420 gaaacagccc agaccatcag ctaaggcccc taaatggctg ctaagtggaa aaggatgtga 480 gaatgctgaa acaaccagga ggttcgctta gaagcagcta ttccttgaaa gagtgcgtaa 540 tagctcactg 550 <210> 23 <211> 548 <212> DNA <213> Parachlorella beijerinkii <400> 23 tgttgaagaa tgagccggcg acttagaaga agtggcttgg ttaaggataa ctatccggag 60 ccagagcgaa agcaagtctg aatagggcgc ttaaaggtca ctttttctag acccgaaccc 120 gggtgatcta accatgacca ggatgaagct tgggtaacac cacgtgaagg tccgaaccga 180 ccgatgttga aaaatcggcg gatgagttgt ggttagcggt gaaataccaa tcgaactcgg 240 agctagctgg ttctccccga aatgcgttga ggcgcagcgg tttatgaggc tgtctagggg 300 taaagcactg tttcggtgcg ggctgcgaaa gcggtaccaa atcgtggcaa actctgaata 360 ctagatatgc tattcatgag ccagtgagac ggtgggggat aagcttcatc gtcaagaggg 420 aaacagccca gatcaccagc taaggcccca aaatggtcgt taagtggcaa aggaggtgag 480 aatgctgaaa caaccaggag gtttgcttag aagcagccac cctttaaaga gtgcgtaata 540 gctcactg 548 <210> 24 <211> 556 <212> DNA <213> Chlorella luteoviridis <400> 24 tgttgaagaa tgagccggcg acttataggg ggtggcgtgg ttaaggaagt aatccgaagc 60 caaagcgaaa gcaagttttc aatagagcga ttttgtcacc ccttatggac ccgaacccgg 120 gtgatctaac cttgaccagg atgaagcttg ggtaacacca agtgaaggtc cgaactcatc 180 gatcttgaaa aatcgtggga 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Claims (42)

1. (a) 종속영양적 조건 하에서 프로토테카(Prototheca) 속의 미세조류의 집단을 배양하여 건조 세포 중량 기준으로 10% 이상의 미세조류 지질 및 500 ppm 이하의 색상-생성 불순물을 포함하는 바이오매스를 생성하는 단계; 및
   (b) 상기 지질을 공유결합적으로 개질시키는 화학적 반응을 상기 지질에 적용시키는 단계로서, 상기 화학적 반응은 트랜스에스테르화(transesterification), 인터에스테르화(interesterification), 수산화(hydroxylation), 사이클로프로판화(cyclopropanation), 에폭시화(epoxidation), 수소화공정(hydroprocessing), 탈산소화(deoxygenation), 이성질화(isomerization), 수소화(hydrogenation) 또는 가수분해(hydrolysis)를 포함하는 단계를 포함하는,
   미생물 지질을 화학적으로 개질시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 화학적 반응을 적용시키기 이전에 상기 미세조류 지질이 바이오매스로부터 추출되는, 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 미세조류 지질을 바이오매스에서 화학적 반응에 적용시키는, 방법.
4. 제 3항에 있어서, 화학적 반응을 미세조류 지질에 적용시키기 전에 상기 바이오매스의 세포를 용해시키는, 방법.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세조류가 프로토테카 위커하미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리폴미스(Prototheca monformis) 및 프로토테카 좁피(Prototheca zopfii)로 구성된 군으로부터 선택된 종인, 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 미세조류가 프로토테카 모리폴미스(Prototheca monformis)인, 방법.
7. (a) 프로토테카(Prototheca) 속의 미세조류 세포를 포함하는 미세조류 바이오매스를 제공하는 단계로서, 상기 바이오매스는 건조 세포 중량 기준으로 5% 이상의 미세조류 지질 및 500 ppm 이하의 색상-생성 불순물을 포함하는 단계; 및
   (b) 지방산 염을 포함하는 비누를 형성하는 비누화를 상기 미세조류 지질에 적용시키는 단계를 포함하는, 비누를 제조하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 종속영양적 조건 하에서 미세조류를 배양하여 미세조류 바이오매스를 생성하는 단계, 및 상기 미세조류 바이오매스로부터 미세조류 지질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
9. 제 7항에 있어서, 비누화 이전에 상기 미세조류 지질이 미세조류 바이오매스로부터 추출되는, 방법.
10. 제 7항에 있어서, 미세조류 바이오매스를 염기를 함유하는 수용액과 접촉시켜 지방산 염을 포함하는 비누를 형성함으로써 비누화가 수행되는, 방법.
11. 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세조류가 프로토테카 위커하미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리폴미스(Prototheca monformis) 및 프로토테카 좁피(Prototheca zopfii)로 구성된 군으로부터 선택된 종인, 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 미세조류가 프로토테카 모리폴미스(Prototheca monformis)인, 방법.
13. 제 9항에 있어서, 상기 미세조류 지질이 비누화 이전에 야자 오일, 코코넛 오일, 올리브 오일, 코코아 오일, 닭 지방, 우지, 돼지 수지(porcine tallow), 콩 오일, 유채 오일, 카놀라 오일, 야자 커넬 오일, 옥수수 오일, 야채 폐기물 오일, 중국 수지(Chinese tallow), 해바라기 오일, 면 종자 오일, 미세조류 오일, 거대조류(macroalgae) 오일, 쿠페아(Cuphea) 오일, 아마(flax) 오일, 땅콩 오일, 고급 백색 그리스(choice white grease), 라드(lard), 카멜리나 사티바(Camelina sativa) 오일, 머스타드 종자 오일, 캐슈 너트(cashew nut) 오일, 귀리 오일, 루핀(lupine) 오일, 케나프(kenaf) 오일, 카렌듈라(calendula) 오일, 대마(hemp) 오일, 커피 오일, 아마씨(아마)(linseed (flax)) 오일, 헤이즐넛 오일, 유포르비아(euphorbia) 오일, 펌킨 종자 오일, 코리앤더(coriander) 오일, 카멜리아(camellia) 오일, 참깨 오일, 홍화 오일, 쌀 오일, 퉁(tung) 오일, 코프라(copra) 오일, 양귀비 오일, 피마자 오일, 피칸 오일, 호호바(jojoba) 오일, 자트로파(jatropha) 오일, 마카다미아(macadamia) 오일, 브라질 너트 오일, 아보카도 오일, 및 화석 오일 또는 이들의 증류액 분획(distillate fraction)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 오일과 혼합되는, 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 비누가,
    (a) 15% 이상의 완전히 포화된 비누화된 지방산;
    (b) 50% 이상의 완전히 포화된 비누화된 지방산;
    (c) 10% 이상의 C16:0 비누화된 지방산, 및 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산;
    (d) 10% 이상의 C16:0 비누화된 지방산;
    (e) 10% 이상의 C14 또는 더 짧은 쇄 길이의 비누화된 지방산;
    (f) 10% 이상의 C18 비누화된 지방산;
    (g) 30% 이상의 C18 비누화된 지방산;
    (h) 50% 이상의 C18 비누화된 지방산;
    (i) 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 10% 이상의 C18:1 비누화된 지방산;
    (j) 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 30% 이상의 C18:1 비누화된 지방산;
    (k) 10% 이상의 C16 비누화된 지방산, 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 10% 이상의 C18:1 비누화된 지방산;
    (l) 10% 이상의 C16 비누화된 지방산, 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 30% 이상의 C18:1 비누화된 지방산;
    (m) 10% 이상의 C14 또는 더 짧은 쇄 길이의 비누화된 지방산, 10% 이상의 C16 비누화된 지방산, 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 10% 이상의 C18:1 비누화된 지방산; 또는
    (n) 20% 이상의 C14 또는 더 짧은 쇄 길이의 비누화된 지방산, 10% 이상의 C16 비누화된 지방산, 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 30% 이상의 C18:1 비누화된 지방산을 포함하는, 방법.
15. 제 7항 내지 제 10항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 비누.
16. 제 15항에 있어서, 미세조류가 프로토테카 위커하미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리폴미스(Prototheca monformis) 및 프로토테카 좁피(Prototheca zopfii)로 구성된 군으로부터 선택된 종인, 비누.
17. 비누화된 미세조류 지질의 지방산 염 및 500 ppm 이하의 색상-생성 불순물을 포함하는 비누로서, 상기 미세조류 지질이 프로토테카(Prototheca) 속의 미세조류를 포함하는 바이오매스로부터 유래되고, 상기 미세조류 지질을 염기를 함유하는 수용액과 접촉시킴으로써 상기 미세조류 지질이 비누화되는, 비누.
18. 제 17항에 있어서, 비누화된 미세조류 지질과 함께 미세조류 세포 바이오매스를 포함하는, 비누.
19. 제 17항에 있어서, 야자 오일, 코코넛 오일, 올리브 오일, 코코아 오일, 닭 지방, 우지, 돼지 수지(porcine tallow), 콩 오일, 유채 오일, 카놀라 오일, 야자 커넬 오일, 옥수수 오일, 야채 폐기물 오일, 중국 수지(Chinese tallow), 해바라기 오일, 면 종자 오일, 미세조류 오일, 거대조류(macroalgae) 오일, 쿠페아(Cuphea) 오일, 아마(flax) 오일, 땅콩 오일, 고급 백색 그리스(choice white grease), 라드(lard), 카멜리나 사티바(Camelina sativa) 오일, 머스타드 종자 오일, 캐슈 너트(cashew nut) 오일, 귀리 오일, 루핀(lupine) 오일, 케나프(kenaf) 오일, 카렌듈라(calendula) 오일, 대마(hemp) 오일, 커피 오일, 아마씨(아마)(linseed (flax)) 오일, 헤이즐넛 오일, 유포르비아(euphorbia) 오일, 펌킨 종자 오일, 코리앤더(coriander) 오일, 카멜리아(camellia) 오일, 참깨 오일, 홍화 오일, 쌀 오일, 퉁(tung) 오일, 코프라(copra) 오일, 양귀비 오일, 피마자 오일, 피칸 오일, 호호바(jojoba) 오일, 자트로파(jatropha) 오일, 마카다미아(macadamia) 오일, 브라질 너트 오일, 아보카도 오일, 및 화석 오일 또는 이들의 증류액 분획(distillate fraction)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비누화된 오일의 지방산 염을 추가로 포함하는, 비누.
20. 제 19항에 있어서, 상기 비누가,
    (a) 15% 이상의 완전히 포화된 비누화된 지방산;
    (b) 50% 이상의 완전히 포화된 비누화된 지방산;
    (c) 10% 이상의 C16:0 비누화된 지방산, 및 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산;
    (d) 10% 이상의 C16:0 비누화된 지방산;
    (e) 10% 이상의 C14 또는 더 짧은 쇄 길이의 비누화된 지방산;
    (f) 10% 이상의 C18 비누화된 지방산;
    (g) 30% 이상의 C18 비누화된 지방산;
    (h) 50% 이상의 C18 비누화된 지방산;
    (i) 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 10% 이상의 C18:1 비누화된 지방산;
    (j) 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 30% 이상의 C18:1 비누화된 지방산;
    (k) 10% 이상의 C16 비누화된 지방산, 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 10% 이상의 C18:1 비누화된 지방산;
    (l) 10% 이상의 C16 비누화된 지방산, 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 30% 이상의 C18:1 비누화된 지방산;
    (m) 10% 이상의 C14 또는 더 짧은 쇄 길이의 비누화된 지방산, 10% 이상의 C16 비누화된 지방산, 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 10% 이상의 C18:1 비누화된 지방산; 또는
    (n) 20% 이상의 C14 또는 더 짧은 쇄 길이의 비누화된 지방산, 10% 이상의 C16 비누화된 지방산, 10% 이상의 C18:0 비누화된 지방산, 및 30% 이상의 C18:1 비누화된 지방산을 포함하는, 비누.
21. 제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세조류가 프로토테카 위커하미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리폴미스(Prototheca monformis) 및 프로토테카 좁피(Prototheca zopfii)로 구성된 군으로부터 선택된 종인, 비누.
22. 제 21항에 있어서, 상기 미세조류가 프로토테카 모리폴미스(Prototheca monformis)인, 비누.
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