CN115287203B - 一种高效降解氨基甲酸乙酯的红酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效降解氨基甲酸乙酯的红酵母及其应用，属于食品生物技术领域。本发明提供一种高效降解氨基甲酸乙酯(EC)的红酵母DL‑XSY01，保藏编号：CGMCC No.23534。所述红酵母DL‑XSY01经筛选、鉴定、活化、发酵和包埋过程，获得EC降解制剂。本发明所获得的菌株DL‑XSY01经包埋后制成降解剂，可以用于发酵食品中EC的去除；本发明进一步使用菌株DL‑XSY01的降解剂去除不同食品体系中的EC，具有去除EC效果明显，生产成本低，使用方便、已于从食品体系中移除等特点，广泛适用于酒类饮料、发酵乳制品、酱油、醋等发酵食品中。

Description

一种高效降解氨基甲酸乙酯的红酵母及其应用
技术领域
本发明涉及一种高效降解氨基甲酸乙酯的红酵母及其应用，属于食品生物技术领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)是一种具有遗传毒性和较强致癌性的代谢产物，广泛存在于酒精饮料和发酵食品(如腐乳、酱油、乳酪、食醋、泡菜等)中。
近年来，世界各国学者先后在蒸馏酒、黄酒和葡萄酒中发现EC的存在，其中蒸馏酒和黄酒中的EC含量较高，葡萄酒中的EC含量低。EC具有抑菌和抗肿瘤活性，在20世纪40年代初期，EC被作为麻醉药物使用；1943年，有学者发现，EC具有致癌性，但是并未引起足够重视；在1974年，国际癌症研究机构将EC列为2B类致癌物质，并于2007年被升级为2A类致癌物。同时，EC被证明具有多位点致癌性，可以导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等。在动物模型的实验中，转录因子STAT3、NF-kB和细胞外信号蛋白激酶ERK被证明参与EC诱导的肿瘤的发展。另一方面，EC也被证明可以通过诱导氧化应激反应、降低解毒能力、消耗能量、破坏膜结构完整性、破坏DNA和蛋白质等方式，诱导人体肝癌细胞HepG2死亡。目前，根据FAO/WHO食品添加剂联合委员会的数据，人体通过酿造酒摄入EC的平均含量为65ng·kg-1·d-1，远高于其他发酵食品五倍之多。
EC主要以尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸等为前体，与乙醇反应产生。EC的控制方法主要包括限制前体和消减EC两大类。限制前体多使用脲酶消解尿素，但是脲酶特异性单一，需考虑前体类型及不同体系适用性，实用性受到限制，而消减EC适用范围广，较为常用，此方法一般通过EC水解酶以及产酶微生物作用，实现将EC水解为乙醇、氨和二氧化碳的过程。
但是，目前现有的EC降解菌株资源库还不能满足食品中EC生物降解的实际需求，分离并公开报道的EC降解菌株较少，而且已报道的大部分EC降解菌株为非食品来源甚至是条件性致病菌株，在一定程度上限制了菌株直接在发酵食品中EC去除的应用。
1991年，Kobashi等(Chem Pharm Bull,1991,39(12):3303-3306)从小鼠胃肠道中筛选到一株地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis sp.，但由于其EC水解酶对EC的亲和力较弱而无法投入实际应用；1994年Kobashi等(Biol Pharm Bull,1994,17(6):773-778)又分离到一株B.licheniformis sp，只表征了其EC降解酶酶学特征，但至今并无该菌株实际应用报道。1997年，Mohapatra(Lett Appl Microbiol,1997,25(6):393-396.)从海洋生物海绵中分离到一株Micrococcus sp.，从中分离的酸性EC水解酶具有较高的乙醇耐受能力，但至今并无该菌株实际应用报道。2006年，Yukie等人(Appl Microbiol Biotechnol,.2006,70(4):422-429)从土壤样品中分离到一株Rhodococcus equi，解析了其EC水解酶的序列，但该酶对EC的特异性并不强。2014年，李京京等(食品与生物技术学报,2014,33(12):1239-1245.)从从小鼠胃中筛选出一株EC降解菌株Lysinibacillus fusiformis，从其纯化的EC水解酶具有消除酱油中EC的潜力。2014年，卜攀攀等(生物工程学报,2014,30(3):404-411)从小鼠胃部获得了一株EC降解菌株肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonia，从其分离到了耐盐的EC水解酶，但由于该酶不能耐受酸胁迫，在环境pH小于6时，酶活显著下降，应用受到局限。2017年，刘等从Providencia rettgeri JN-B815中获得氨基甲酸乙酯水解酶，pH4-7范围内残余酶活达80％，乙醇浓度为35％时残余酶活达40％。此酶可在一定程度下耐受乙醇和酸性环境，但目前没有报道其实际应用能力。田亚平(Appl Biochem Biotechnol,2013:1-11)等从小鼠胃肠道中筛选分离得到一株EC降解菌株变幻青霉菌Penicilliumvariabile，从中分离EC水解酶，发现该酶能够有效的降解白酒中的EC。
而从白酒酿造过程分离获得的菌株，报道的有：徐岩等(J Agric Food Chem,2018,66(6):1583-1590.)从白酒发酵过程中分离到的Lysinibacillus sphaericus MT3，吴群(Appl Biochem Biotechnol,2013:1-13.)等从中国白酒酿造过程中分离得到胶红酵母菌株。发酵食品来源的EC降解菌株资源库亟待扩充。
因此，本发明对发酵食品中可降解EC的微生物进行筛选、分离、鉴定和应用表征，可以扩充发酵食品来源的EC降解菌株资源库，为降低发酵食品中EC提供有效手段，为保障发酵食品安全提供技术支持。
发明内容
针对现有降解菌株较少且多数非食品来源、EC降解菌剂对EC降解效果不佳的问题，本发明目的在于提供一株分离自发酵食品的酵母菌株DL-XSY01，以及用该菌株制备的降解剂。
所述圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23534，保藏日期为2021年10月08日。
所述圆红冬孢酵母DL-XSY01分离采集自山东小米醋醋厂的醋醅中，将测序结果进行Blastn分析，发现该菌与Rhodosporidium toruloides和Rhodotorula mucilaginosa的同源性最高，均达到99％。经形态学和26s rRNA鉴定，该菌株DL-XSY01为Rhodosporidiumtoruloides，命名为圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01。
所述圆红冬孢酵母DL-XSY01在YPD固体平板中生长良好，28℃培养48h，形成湿润、圆形、突起、光滑、浅粉色菌落；镜检发现菌体呈椭圆型长棒状，在4℃静置2d后呈现橘红色。最适生长温度28℃，最适pH5～6。
本发明提供了一株圆红冬孢酵母DL-XSY01或其发酵液在制备可降解氨基甲酸乙酯的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品或微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂的制备方法为：
(1)将上述圆红冬孢酵母DL-XSY01接种于YPD液体培养基中进行活化，在25～32℃、150～250rpm恒温振荡培养24～48h，获得种子液；
(2)将所述种子液按10％-20％接种量接种于发酵培养基中，在25～32℃、通气量0.6～1.0m3/min，搅拌速率150～250rpm条件下，发酵至菌体数量3×108～1.8×109CFU/mL，得到圆红冬孢酵母DL-XSY01发酵产物；
(3)将步骤(2)制备得到的所述圆红冬孢酵母DL-XSY01发酵产物进行包埋，制成微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述圆红冬孢酵母DL-XSY01在产品中的添加量至少为：3×108CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述化学品包括但不限于氨基甲酸乙酯降解剂、氨基甲酸乙酯吸附剂、氨基甲酸乙酯抑制剂、氨基甲酸乙酯分解剂，氨基甲酸乙酯降解生物菌种、氨基甲酸乙酯降解微生物菌剂。
本发明还提供了一种降解食品中氨基甲酸乙酯的方法，在食品的制备过程中，添加所述圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01或其发酵液进行氨基甲酸乙酯的降解，降解后除菌，制备得到食品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括但不限于发酵食品、酒精饮品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为白酒、黄酒、红酒、酸奶、醋、酱油。
本发明还提供了一种氨基甲酸乙酯降解剂，其特征在于，所述降解剂是按照下述方法制备得到的：
(1)将上述圆红冬孢酵母DL-XSY01接种于YPD液体培养基中进行活化，在25～32℃、150～250rpm恒温振荡培养24～48h，获得种子液；
(2)将所述种子液按10％-20％接种量接种于发酵培养基中，在25～32℃、通气量0.6～1.0m3/min，搅拌速率150～250rpm条件下，发酵至菌体数量3×108～1.8×109CFU/mL，得到圆红冬孢酵母DL-XSY01发酵产物；
(3)将步骤(2)制备得到的所述圆红冬孢酵母DL-XSY01发酵产物进行包埋，制成氨基甲酸乙酯降解剂。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：YPD液体培养基(蛋白胨20.0g，酵母粉10.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水补至1L，调pH至7.0，高压灭菌20min)。
在本发明的一种实施方式中，所述包埋的方法为：
S1.将海藻酸钠(4％)与含菌发酵液、细胞裂解液和菌体悬液以1:1的比例混合；
S2.用10mL注射器吸取并以2-10滴/秒的速度缓慢滴入固化液(0.6％CaCl2的饱和硼酸溶液)中，固化时间约5h；
S3.将固定化细胞用生理盐水冲洗3-4次，置于壳聚糖(2％)溶液中覆膜40min；
S4.再次用0.8％生理盐水冲洗3-4次，沥干水分，4℃下保存备用。
在本发明的一种实施方式中，所述小球湿润状态下粒径为3-5mm。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述圆红冬孢酵母DL-XSY01发酵产物包括：圆红冬孢酵母DL-XSY01含菌发酵液、圆红冬孢酵母DL-XSY01发酵液上清、圆红冬孢酵母DL-XSY01菌体悬液、圆红冬孢酵母DL-XSY01细胞裂解液。
在本发明的一种实施方式中，所述圆红冬孢酵母DL-XSY01含菌发酵液由所述圆红冬孢酵母DL-XSY01发酵产物经干燥，用去离子水回调至原体积的1/20制成；
所述圆红冬孢酵母DL-XSY01菌体悬液由所述圆红冬孢酵母DL-XSY01发酵产物在4000g转速下离心10min并收集并收集菌体沉淀物，稀释至浓度20OD600得到；
所述圆红冬孢酵母DL-XSY01细胞裂解液由所述圆红冬孢酵母DL-XSY01菌体悬液经过细胞破壁得到。
在本发明的一种实施方式中，所述干燥方法包括冷冻真空干燥。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述进行包埋后制备得到固定化小球，方法包括以下步骤：
S1.将海藻酸钠(4％)与含菌发酵液、细胞裂解液和菌体悬液以1:1的比例混合；
S2.用10mL注射器吸取并以2-10滴/秒的速度缓慢滴入固化液(0.6％CaCl2的饱和硼酸溶液)中，固化时间约5h；
S3.将固定化细胞用生理盐水冲洗3-4次，置于壳聚糖(2％)溶液中覆膜40min；
S4.再次用0.8％生理盐水冲洗3-4次，沥干水分，4℃下保存备用。
在本发明的一种实施方式中，所述小球湿润状态下粒径为3-5mm。
本发明还提供了上述圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01在氨基甲酸乙酯降解中的应用。
有益效果
(1)本发明从小米醋醋醅中筛选获得一株EC高效降解菌株DL-XSY01，该菌株可以利用EC作为唯一碳源生长，可有效降解EC，降解剂对EC的降解率最高可达76％，具有良好的EC生物降解效果。
(2)由于本发明所获的的菌株DL-XSY01分离自发酵食品，该菌株及其制成的EC降解剂可用于发酵食品中EC的去除，白酒中EC解率达到76％，本发明提供方法具有生产成本低、使用方便、易于从发酵产品体系中移除等特点，可以有效提高酒精饮料、酸奶、酱油和醋等发酵食品的品质和安全性。
(3)安全性评价表明：菌株DL-XSY01是安全的。抗生素敏感性中，菌株对抗生素头孢氨苄中度敏感，对10种抗生素头孢唑林、红霉素、庆大霉素、四环素、阿米卡星氨苄西林、链霉素、万古霉素、米诺环素和青霉素G敏感；溶血性实验中，DL-XSY01在羊血平板上28℃培养时未表现出溶血(γ-溶血)。然而，金黄色葡萄球菌ATCC 25923显示出β-溶血作用，阳性对照成立。此外大肠杆菌Nissle 1917显示α-溶血。因此，DL-XSY01被认为是对人体健康无危害的安全的生物体。
(4)益生性评价表明：菌株DL-XSY01在人工模拟胃液中和人工模拟肠液中有良好的存活率；对DPPH和ABTS自由基具有较好清除能力，清除率分别可达90.02％和93.67％。
生物材料保藏
一株圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01，分类命名为圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides，已于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23534，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为本发明圆红冬孢酵母DL-XSY01的显微照片。
图2为本发明圆红冬孢酵母DL-XSY01以EC为碳源时的筛选图片。
具体实施方式
下述实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本发明主要阐述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，其它的任何改变未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，都应涵盖在本发明的保护范围之内
以下结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明。除非特殊说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明中使用的各种培养基均采用常规方法配制，实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，均参照SambrookJ等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；或参照产品说明书。
下述实施例中所涉及的培养基的配制如下：
YPD液体培养基：蛋白胨20.0g，酵母粉10.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水补至1L，调pH至7.0，高压灭菌20min。
YPD固体培养基：蛋白胨20.0g，酵母粉10.0g，葡萄糖20.0g，15g琼脂，蒸馏水补至1L，调pH至7.0，高压灭菌20min，然后倒平板。
YNB液体培养基：硫酸铵5000mg，肌醇2mg，烟酸(维生素B3)0.4mg，盐酸硫胺素(维生素B1)0.4mg，硫酸铜0.04mg，磷酸二氢钾1000mg，硼酸0.5mg，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.4mg，泛酸钙(维生素B5)0.4mg，对氨基苯甲酸0.2mg，硫酸镁500mg，硫酸锰0.4mg，硫酸锌0.4mg，氯化铁0.2mg，核黄素(维生素B2)0.2mg，氯化钙100mg，碘化钾0.1mg，钼酸钠0.2mg，生物素(维生素B7、H)0.002mg，叶酸(维生素B9)0.002mg，氯化钠100mg，蒸馏水补至1L，滤头除菌。
YNB固培养基：硫酸铵5000mg，肌醇2mg，烟酸(维生素B3)0.4mg，盐酸硫胺素(维生素B1)0.4mg，硫酸铜0.04mg，磷酸二氢钾1000mg，硼酸0.5mg，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.4mg，泛酸钙(维生素B5)0.4mg，对氨基苯甲酸0.2mg，硫酸镁500mg，硫酸锰0.4mg，硫酸锌0.4mg，氯化铁0.2mg，核黄素(维生素B2)0.2mg，氯化钙100mg，碘化钾0.1mg，钼酸钠0.2mg，生物素(维生素B7、H)0.002mg，叶酸(维生素B9)0.002mg，氯化钠100mg，15g琼脂，蒸馏水补至1L，滤头除菌。
下述实施例中所涉及的EC含量测定方法如下：
采用国标方法GB5009.223-2014测定培养上清液中EC的残留量，同时设不接菌的YPD培养基作对照，每个处理3个重复。该方法的具体步骤：2mL样品上样于CleanertEC氨基甲酸乙酯专用柱上，静置10min，用10mL正己烷淋洗，真空泵抽干，用10mL 5％乙酸乙酯-乙醚溶液以1mL/min流速洗脱，收集洗脱液。接收的洗脱液在室温下氮吹至0.5mL，用甲醇定容至1mL，向其中加入0.8g无水硫酸钠(100℃，24h)，10000rpm离心，上清使用0.22μm有机滤膜过滤，流出液供气质检测(约0.5mL)，供GC/MS分析。
GC-MS分析条件如下:
毛细管色谱柱：DB-INNOWAX，30m×0.25mm(内径)×0.25μm(膜厚)；进样口温度：220℃；柱温：初温50℃，保持1min，然后以8℃/min升至180℃，程序运行完成后，240℃后运行5min；载气：氦气，纯度≥99.999％，流量1.0mL/min；离子源:EI；电离能量:70eV；离子源温度:230℃；四级杆温度:150℃；传输线温度:250℃；溶剂延迟:11min；进样方式：不分流进样；进样量：1μL；检测方式：选择离子检测(SIM)；EC选择检测离子(m/z)：44、62、74、89，定量离子62。
根据峰面积和标准曲线即可计算氨基甲酸乙酯的浓度。
降解率计算公式：
Figure BDA0003800256960000071
实施例1：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01的分离制备
1、菌株的分离和纯化：
(1)样品：采集自山东小米醋醋场的醋醅。
(2)分离筛选方法采用先进行抗氧化富集，再进行EC降解功能验证：
取醋醅1g，加入到10mL含有2mM过氧化氢的YPD液体培养基中，并将上述样品移入均质袋，拍打30min，无菌条件下，移取均质袋中的部分液体至50mL离心管中，在30℃，200rpm条件下培养48h。由于在强氧化环境中菌体的生长会受到抑制甚至不生长，而麦角硫因具有强抗氧化性，因此能够产生较高水平麦角硫因的菌株会在培养基中正常生长，而不能产生麦角硫因或产量较低的菌株则会被筛选压力淘汰。待培养基浑浊后，稀释涂布于YPD固体培养基上，液体吸收后置于30℃倒置培养48h，挑单菌落进行YPD固体培养基上平板划线，连续纯化三代，挑取单菌落进行镜检，确定未污染后，进行菌株冻存保藏，菌株命名为DL-XSY01。
S2(EC降解功能验证)：菌株DL-XSY01加入含有5g/L EC的10mL YNB液体培养基，在30℃，200rpm条件下培养24h，500rpm离心5min，取酵母沉淀稀释后均匀涂布在含有10g/L的EC为唯一碳源的YNB固体平板上，在28℃倒置培养72h，菌落形成。发现菌株DL-XSY01能以EC为唯一碳源进行良好生长，说明菌株DL-XSY01具有EC降解功能。
如图1所示，为本发明圆红冬孢酵母DL-XSY01以EC为唯一碳源时的生长图片。
2、菌株DL-XSY01的鉴定：
(1)提取菌株DL-XSY01基因组进行26s rRNA PCR鉴定，基因组提取方法按照《精编分子生物学实验指南》玻璃珠法进行提取。
PCR条件突下：
扩增体系为：2×Taq Master Mix 25μL、引物D1 2μL、引物D2 2μL、灭菌水19μL、模板2μL。PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15S；50℃退火15S；72℃延伸1min；72℃15min；30个循环；4℃无穷。
PCR结束后进行琼脂糖凝胶(1.0％)电泳检测酵母菌样品PCR产物，跑出条带且条带明亮的为PCR扩增成功的基因组，成功的基因组即可送测序。引物序列D1:GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG，D2:GGTCCGTGTTTCAAGACGG。
所述菌株DL-XSY01的26s rRNA序列如下：
TTTACGGCATTCCCTAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAGAGCTCAAATTTATAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATCTCTAGAAATGTTTTCCGCGCTGGACCGCACACAAGTCTGTTGGAATACAGCGGCATAGTGGTGAGACCCCCGTATATGGTGCGGACGCCCAGCGCTTTGTGATACATTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAATTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAACAGTACGTGAAATTGTTGGAAGGGAAACGCTTGAAGTCAGACTTGCTTGCCGAGCAATCGGTTTGCAGGCCAGCATCAGTTTTCCGGGATGGATAATGGTAGAGAGAAGGTAGCAGTTTCGGCTGTGTTATAGCTCTCTGCTGGATACATCTTGGGGGACTGAGGAACGCAGTGTGCCTTTGGCGGGGGTTTCGACCTCTTCACACTTAGGATGCTGGTGGAATGGCTTTAAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCCAAA。
将上述测序结果进行Blastn分析，发现该菌与Rhodosporidium toruloides和Rhodotorula mucilaginosa的同源性最高，均达到99％。经形态学和26s rRNA鉴定，该菌株DL-XSY01为Rhodosporidium toruloides，命名为圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)DL-XSY01。
(2)菌株DL-XSY01在YPD固体平板中生长良好，28℃培养24-48h，如图2所示，形成湿润、圆形、突起、光滑、浅粉色菌落；镜检发现菌体呈椭圆型长棒状，在4℃静置2d后呈现橘红色。最适生长温度28℃，最适pH5～6。
经形态学和26s rRNA鉴定，该EC降解菌株DL-XSY01暂定为Rhodosporidiumtoruloides。并已于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.23534。保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01菌株EC降解制剂的制备
具体步骤如下：
(1)将圆红冬孢酵母DL-XSY01菌株接种于YPD液体培养基中进行活化，在25-30℃、150-250rpm恒温振荡培养24h，获得种子液。
(2)将种子液按10％接种量接种于含有YPD发酵培养基的生产发酵罐(装液量70％)，通气量0.6～1.0m3/min，搅拌速率为300rpm，培养温度控制在28℃，培养时间为48～96h。发酵结束后得到菌体数量为3×108～1.8×109CFU/mL的DL-XSY01培养液。
发酵结束后，无菌条件下收集发酵液，直接用包装瓶分装成液体剂型。
(3)发酵完成后，将步骤(2)收集得到DL-XSY01培养液经冷冻真空干燥，利用去离子水回调体积至原体积的1/20，得到DL-XSY01发酵液；
(4)发酵完成后，将步骤(2)收集得到DL-XSY01培养液在4000g转速下离心10min收集DL-XSY01菌体沉淀物；
(5)将步骤(4)得到的菌体沉淀物用稀释剂PBS缓冲液稀释后，得到菌株DL-XSY01菌体悬液，其中菌浓为：OD 600＝20；
(6)将步骤(5)得到的菌株DL-XSY01菌体悬液经过细胞破壁得到DL-XSY01细胞裂解液；
(7)分别将步骤(3)制备得到的DL-XSY01含菌发酵液、步骤(5)制备得到的DL-XSY01菌体悬液和步骤(6)制备得到的DL-XSY01细胞裂解液，经海藻酸钠包埋，制成相应的固定化小球，具体步骤如下：
将海藻酸钠(4％)分别与步骤(3)制备得到的DL-XSY01含菌发酵液、步骤(5)制备得到的DL-XSY01菌体悬液和步骤(6)制备得到的DL-XSY01细胞裂解液以体积比为1:1的比例混合，用10mL注射器吸取并以2-10滴/秒的速度缓慢滴入固化液(0.6％CaCl2的饱和硼酸溶液)中，固化时间约5h；制备得到固定化细胞；
将固定化细胞用生理盐水冲洗3-4次，置于壳聚糖(2％)溶液中覆膜40min。再次用0.8％生理盐水冲洗3-4次，沥干水分，4℃下保存备用，制备得到EC降解剂。
分别将步骤(3)制备得到的DL-XSY01含菌发酵液、步骤(5)制备得到的DL-XSY01菌体悬液和步骤(6)制备得到的DL-XSY01细胞裂解液所制备的包埋制剂分别为EC降解剂1、EC降解剂2、EC降解剂3。
(8)分别检测EC降解剂1、EC降解剂2、EC降解剂3中的DL-XSY01的菌浓，分别为：OD600＝10、OD600＝20和OD600＝0。
实施例3：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01制备得到的EC降解剂在白酒中EC降解的应用
具体步骤如下：
分别将实施例2制备得到的EC降解剂1、EC降解剂2、EC降解剂3，各20mL，分别处理含有EC的白酒样品，具体如下：
分别向60mL 45度白酒中添加EC降解剂1、EC降解剂2和EC降解剂3各20mL，分别在250mL发酵瓶中，28℃，100rpm反应5d。
对照组：向60mL 45度白酒中添加20mL YPD培养基，在250mL发酵瓶中，28℃，100rpm反应5d。
反应结束后分别吸取上清液2mL，过0.2μm滤膜，分别测定培养上清液中EC的残留量，每个处理3个重复，结果如表1所示。
表1：不同EC降解剂的EC降解率
Figure BDA0003800256960000101
结果显示：EC降解剂1、EC降解剂2和EC降解剂3均可以降低白酒中的EC浓度，可以将EC浓度由230.3737μg/L分别降低至86.9693μg/L、100.0902μg/L和55.3112μg/L，降解率分别为62.24％，56.56％和76.00％。
可见，EC降解剂3对于白酒中EC的降解效果最好。
实施例4：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01制备得到的EC降解剂3在发酵食品中添加EC的降解实验
下述实施例中以EC降解剂3为例，证明本申请的菌株能够降解各种发酵食品及酒精饮品中的EC，下述采用的样品，均是市售产品。
下述实施例中所涉及的EC降解剂3的处理方法为：将圆红冬孢酵母DL-XSY01菌株接种于YPD液体培养基中进行活化，在25-30℃、150-250rpm恒温振荡培养24h，获得种子液。将种子液按10％接种量接种于含有YPD发酵培养基的生产发酵罐(装液量70％)，通气量0.6～1.0m3/min，搅拌速率为300rpm，培养温度控制在28℃，培养时间为48～96h。发酵结束后得到菌体数量为3×108～1.8×109CFU/mL的DL-XSY01培养液。发酵完成后，收集得到DL-XSY01培养液在4000g转速下离心10min收集DL-XSY01菌体沉淀物；用稀释剂PBS缓冲液稀释后，得到菌株DL-XSY01菌体悬液，其中菌浓为：OD600＝20；将菌体破壁得到DL-XSY01细胞裂解液，随后，与4％海藻酸钠以体积比为1:1的比例混合，用10mL注射器吸取并以2-10滴/秒的速度缓慢滴入固化液(0.6％CaCl2的饱和硼酸溶液)中，固化时间约5h；制备得到固定化细胞；将固定化细胞用生理盐水冲洗3-4次，置于壳聚糖(2％)溶液中覆膜40min。再次用0.8％生理盐水冲洗3-4次，沥干水分，4℃下保存备用。
1、制备红酒EC反应液：
红酒(12度)60mL；EC：3.0ppm；EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，28℃，100rpm，5天。
2、制备酸奶EC反应液：
酸奶60mL；EC：3.0ppm；EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，28℃，100rpm，5天。
3、制备醋EC反应液：
醋60mL；EC：3.0ppm；EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，28℃，100rpm，5天。
4、制备酱油EC反应液：
酱油60mL；EC：3.0ppm；EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，28℃，100rpm，5天。
5、制备酱EC反应液
酱30g，加入30mL去离子水，EC：3.0ppm；EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，28℃，100rpm，5天。
分别将上述所制得的发酵食品EC反应液，反应后吸取上清液2mL，过0.2μm滤膜，测定培养上清液中EC的残留量，同时设不接菌的YPD培养基作对照，每个处理3个重复，结果如表2所示。
表2：反应5天EC浓度
Figure BDA0003800256960000111
Figure BDA0003800256960000121
结果显示，DL-XSY01发酵产品及其EC降解剂对EC有很好的降解作用，发酵食品中乙醇含量、盐等成分对DL-XSY01的EC降解活性影响不大。
实施例5：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01的应用
下述实施例中以EC降解剂3为例，证明本申请的菌株能够降解实际酒精饮品中的EC，下述采用的样品，均是市售产品。
下述实施例中所涉及的EC降解剂3的处理方法同实施例4。
1、制备芝麻香型白酒EC反应液：
芝麻香型白酒：(53度)60mL；EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，28℃，100rpm，2天。
2、制备浓香型白酒EC反应液：
浓香型白酒：(45度)60mL；EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，28℃，100rpm，2天。
3、制备酱香型白酒EC反应液
酱香型白酒：(42度)60mL；EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，28℃，100rpm，2天。
4、制备清香型白酒EC反应液
清香型白酒：(38度)60mL；EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，28℃，100rpm，2天。
5、制备黄酒EC反应液：
黄酒(15度)60mL；EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，28℃，100rpm，2天。
分别将上述所制得的发酵食品EC反应液，反应后吸取上清液2mL，过0.2μm滤膜，测定培养上清液中EC的残留量，同时设不接菌的YPD培养基作对照，每个处理3个重复，结果如表3所示。
表3：反应2天的实际酒精饮品中EC浓度
Figure BDA0003800256960000122
Figure BDA0003800256960000131
结果显示，DL-XSY01发酵产品及其EC降解剂对实际发酵样品中EC有很好的降解作用，对酒精饮品中EC的降解率可以达到70％左右。
实施例6：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01在发酵过程中降低EC含量的的应用
在下述实施例中，使用DL-XSY01处理发酵过程中的醋醅，证明本申请的菌株能够在发酵过程中降低EC的产生。
下述实施例中所涉及的DL-XSY01制备方法为：将圆红冬孢酵母DL-XSY01菌株接种于YPD液体培养基中进行活化，在25-30℃、150-250rpm恒温振荡培养24h，获得种子液；将种子液按10％接种量接种于含有YPD发酵培养基的生产发酵罐(装液量70％)，通气量0.6～1.0m3/min，搅拌速率为300rpm，培养温度控制在28℃，培养时间为48～96h。发酵结束后得到菌体数量为3×108～1.8×109CFU/mL的DL-XSY01培养液。发酵完成后，收集得到DL-XSY01培养液经冷冻真空干燥，获得干燥菌体。
取5g冻干获得的菌体，加入100g醋醅中进行发酵20天，获得接菌发酵的白醋。另外直接发酵100g醋醅20天，获得未接菌发酵的白醋。
分别将上述的白醋吸取2mL，得顶EC残留量，每组样品设置3个重复，结果如表4所示。
表4:接菌发酵前后白醋中EC含量
Figure BDA0003800256960000132
结果显示，添加冻干后的DL-XSY01菌体，可以降低发酵过程中的EC浓度。
实施例7：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01菌株的性质
具体步骤如下：
1、DL-XSY01菌株安全性评价
(1)抗生素敏感性实验
使用纸片扩散法对圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01的抗生素敏感性谱进行表征。
在YPD-琼脂固体平板上挑取DL-XSY01单菌落，转移至YPD液体培养基培养，获得菌液(约1×108cfu/mL)；
取200μL DL-XSY01菌液涂布于YPD-琼脂固体平板中，分别缓慢放置庆大霉素(10μg)、链霉素(10μg)、红霉素(15μg)、四环素(30μg)、头孢氨苄(30μg)、万古霉素(30μg)、头孢唑林(30μg)、氨苄西林(10μg)、青霉素(10μg)、米诺环素(30μg)及阿米卡星(30μg)11种抗生素药敏纸片，每个纸片的间距不小于24mm；
将上述放有纸片的培养基，在28℃静置培养24h后测量并统计抑菌圈直径，分析其耐药性抗性R(≤14毫米)，中期I(14-20毫米)或敏感S(≥20毫米)，每组设置三个重复，DL-XSY01的抗生素敏感性如表5所示。
表5：DL-XSY01的抗生素敏感性
Figure BDA0003800256960000141
结果显示，菌株对抗生素头孢氨苄中度敏感，对10种抗生素头孢唑林、红霉素、庆大霉素、四环素、阿米卡星氨苄西林、链霉素、万古霉素、米诺环素和青霉素G敏感。因此，根据CLSI指南，这些结果证实DL-XSY01是安全的。
(2)溶血性实验
溶血性可分为三种，其中α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1-2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致，α溶血环中的红细胞未完全溶解，可形成α溶血环的细菌如甲型溶血性链球菌、肺炎链球菌；β溶血是在固体平板上培养时，菌落周围形成的宽大(2-4mm)、界限分明、完全透明的溶血环，β溶血环中的红细胞完全溶解，是菌体产生的溶血素使红细胞完全溶解所致，又称完全溶血，可形成β溶血环的包括乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等；γ溶血：又称不溶血，在菌落周围无溶血环。
具体步骤如下：
培养基配置：哥伦比亚琼脂+5％脱纤维羊血。
在YPD-琼脂固体平板上挑取DL-XSY01单菌落，转移至YPD液体培养基培养，获得菌液(约1×108cfu/mL)；
取菌液划线于含有5％脱纤维羊血的哥伦比亚平板中，28℃培养24h，之后观察是否有透明圈。金黄色葡萄球菌ATCC 25923作为阳性对照，每组设置三个重复。
结果显示，在此项溶血试验中，金黄色葡萄球菌ATCC 25923被用作阳性对照。DL-XSY01在羊血平板上28℃培养时未表现出溶血(γ-溶血)。然而，金黄色葡萄球菌ATCC25923显示出β-溶血作用，阳性对照成立。此外大肠杆菌Nissle 1917显示α-溶血。因此，DL-XSY01被认为是对人体健康无危害的安全的生物体。
2、DL-XSY01菌株益生性评价
(1)人工模拟胃液实验
益生菌要定植于胃肠道发挥益生作用，首先要对消化道环境具有一定的耐受性，对胃液的耐受性是其中重要筛选标准。
配制模拟胃液：稀盐酸16.4mL，加水约900mL，胃蛋白酶10g，均匀混合后加水定容至1000mL。分别调节pH为2.5，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
模拟胃液耐受性实验：
在YPD-琼脂固体平板上挑取DL-XSY01单菌落，转移至YPD液体培养基培养，获得菌液(约1×108cfu/mL)，取5mL菌液于10000rpm，4℃离心5min收集菌体，用pH 7.4的无菌磷酸盐缓冲液洗涤2次，重复如上操作。
将菌体重新悬浮于5mL的pH 2.5的人工胃液中。采用平板涂布法计算在pH 2.5的人工模拟胃液中孵育0h和3h的活菌数量，每组设置三个重复。
存活率(％)＝logCFU(N1)/logCFU(N0)*100％。
其中，N0表示在人工模拟胃液中孵育0h的活菌数，N1表示在人工模拟胃液中孵育3h后的活菌数。
同时，以大肠杆菌Nissle 1917作为阳性对照。
结果显示，在人工模拟胃液条件(含有0.3％胃蛋白酶，pH值为2.5)培养3h以后，DL-XSY01的存活率为86.73％，而阳性对照组大肠杆菌Nissle 1917的存活率为86.14％。结果表明，与大肠杆菌Nissle 1917相比，DL-XSY01在人工模拟胃液中有良好的存活率。
(2)人工模拟肠液实验
益生菌要定植于胃肠道发挥益生作用，首先要对消化道环境具有一定的耐受性，对肠液的耐受性是其中重要标准。
配置模拟肠液：用灭菌后的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)将胰蛋白酶配制成浓度为1mg/mL溶液，在加入0.3％的牛胆盐，并用1mol/L氢氧化钠调节pH值至7.4，而后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
模拟肠液耐受性实验：
在YPD-琼脂固体平板上挑取DL-XSY01单菌落，转移至YPD液体培养基培养，获得菌液(约1×108cfu/mL)；
取5mL菌液于10000rpm，4℃离心5min收集菌体，用pH 7.4的无菌磷酸盐缓冲液洗涤2次，重复如上操作。将菌体重新悬浮于5mL的pH 7.4的人工模拟肠液中。采用平板涂布法计算在pH 7.4人工模拟肠液中0h和4h的活菌数量，每组设置三个重复。
存活率(％)＝logCFU(N1)/logCFU(N0)*100％
其中，N0代表在人工模拟肠液中孵育0h的活菌数，N1代表在人工模拟肠液中孵育3h后的活菌数。
同时，以大肠杆菌Nissle 1917作为阳性对照。
结果显示，在人工模拟肠液条件(含有0.3％胰蛋白酶和0.3％牛胆盐)培养4h以后，DL-XSY01的存活率为85.92％，而阳性对照组大肠杆菌Nissle 1917的存活率为84.64％。结果表明，与大肠杆菌Nissle 1917相比，DL-XSY01在人工模拟肠液中有良好的存活率。
(3)抗氧化实验
DPPH自由基清除率试验：
采用0.0078g DPPH，用无水乙醇溶解，定容至100ml，配制得到0.2mmol/L DPPH，避光放置，现配现用。
按照上述步骤(1)制备得到菌浓为108CFU/mL的DL-XSY01菌液；
将上述108CFU/mL的DL-XSY01菌液按照体积比为1:1的比例与100％乙醇DPPH溶液(0.2mM)混合，在25℃的黑暗中培养30min。
单独使用DL-XSY01菌液和100％乙醇作为空白，而DPPH乙醇溶液作为对照。在2330×g(4120rpm)下离心10分钟后收集上清液。在517nm处测量吸光度一式三份。
ABTS自由基清除率试验：
将ABTS(14mM)和过硫酸钾(5mM)溶解在0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中，以1:1的比例混合，并在25℃下反应12～16h。
将100μL菌株DL-BJ01(108CFU/mL)添加到900μL ABTS溶液中，并在25℃下黑暗中培养15min。离心(14000g，1分钟)后，在734nm处测量上清液的吸光度。
结果显示，DL-XSY01的DPPH清除活性为90.02％，ABTS清除活性为93.67％，说明菌株DL-XSY01具有很好的抗氧化活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)DL-XSY01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23534，保藏日期为2021年10月08日。
2.权利要求1所述的圆红冬孢酵母DL-XSY01或其发酵液在制备可降解氨基甲酸乙酯的产品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为化学品或微生物菌剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述圆红冬孢酵母DL-XSY01在产品中的添加量至少为：3×108CFU/mL。
5.如权利要求2～4任一所述的应用，其特征在于，所述化学品包括但不限于氨基甲酸乙酯降解剂。
6.一种降解食品中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，在食品的制备过程中，添加权利要求1所述的圆红冬孢酵母DL-XSY01或其发酵液进行氨基甲酸乙酯的降解，降解后除菌，制备得到食品。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述食品包括但不限于发酵食品、酒精饮品。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述食品为白酒、黄酒、红酒、酸奶、醋、酱油。
9.一种氨基甲酸乙酯降解剂，其特征在于，所述降解剂是按照下述方法制备得到的：
(1)将权利要求1所述的圆红冬孢酵母DL-XSY01接种于YPD液体培养基中进行活化，在25～32℃、150～250rpm恒温振荡培养24～48h，获得种子液；
(2)将所述种子液按10％-20％接种量接种于发酵培养基中，在25～32℃、通气量0.6～1.0m3/min，搅拌速率150～250rpm条件下，发酵至菌体数量3×108～1.8×109CFU/mL，得到圆红冬孢酵母DL-XSY01发酵产物；
(3)将步骤(2)制备得到的所述圆红冬孢酵母DL-XSY01发酵产物进行包埋，制成氨基甲酸乙酯降解剂。
10.权利要求1所述的圆红冬孢酵母DL-XSY01在氨基甲酸乙酯降解中的应用。
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