EA030862B1 - Растение brassica, содержащее мутантные аллели (жирный ацил)-acp-тиоэстеразы - Google Patents

Растение brassica, содержащее мутантные аллели (жирный ацил)-acp-тиоэстеразы Download PDF

Info

Publication number
EA030862B1
EA030862B1 EA201070114A EA201070114A EA030862B1 EA 030862 B1 EA030862 B1 EA 030862B1 EA 201070114 A EA201070114 A EA 201070114A EA 201070114 A EA201070114 A EA 201070114A EA 030862 B1 EA030862 B1 EA 030862B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fatb
sequence
seq
region
exon
Prior art date
Application number
EA201070114A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201070114A1 (ru
Inventor
Беньжамин Лага
Барт Ден Бур
Барт Ламберт
Original Assignee
Байер Кропсайенс Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байер Кропсайенс Н.В. filed Critical Байер Кропсайенс Н.В.
Publication of EA201070114A1 publication Critical patent/EA201070114A1/ru
Publication of EA030862B1 publication Critical patent/EA030862B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/20—Brassicaceae, e.g. canola, broccoli or rucola
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

Изобретение относится к сельскохозяйственным растениям, которые в своих семенах содержат липиды нового состава. Изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты дикого типа и к мутантным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим белки, такие как (жирный ацил)-ацил-переносящий белок (АСР)-тиоэстераза B (FATB) Brassica, и к самим этим белкам. Изобретение также относится к растениям Brassica, к их тканям и семенам, содержащим в своем геноме по меньшей мере три мутантных аллеля fatB, где состав или профиль жирных кислот, содержащихся в масле семян, является в значительной степени модифицированным.

Description

Изобретение относится к сельскохозяйственным растениям, которые в своих семенах содержат липиды нового состава. Изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты дикого типа и к мутантным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим белки, такие как (жирный ацил)-ацил-переносящий белок (АСР)-тиоэстераза В (FATB) Brassica, и к самим этим белкам. Изобретение также относится к растениям Brassica, к их тканям и семенам, содержащим в своем геноме по меньшей мере три мутантных аллеля fatB, где состав или профиль жирных кислот, содержащихся в масле семян, является в значительной степени модифицированным.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области производства сельскохозяйственных продуктов, в частности выращивания сельскохозяйственных культур, семена которых содержат новые липидные композиции. Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты дикого типа и к мутантным молекулам, кодирующим белки (жирный ацил)-(белок-переносчик ацила, АСР)-тиоэстеразы В (FATB) Brassica, а также к самим указанным белкам. Кроме того, настоящее изобретение относится к растениям, а также к тканям и семенам растений Brassica, геном которых содержит по меньшей мере три мутантных аллеля fatB (по меньшей мере трех различных генов Brassica, кодирующих различные белки FATB), в результате чего наблюдается значительное изменение состава или профиля жирных кислот в масле семян. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам выращивания растений Brassica, которые дают семена, содержащие масло, имеющее пониженные уровни насыщенных жирных кислот, а также к маслу, которое получают из таких семян. Для получения масла из таких семян не требуется дополнительного смешивания или модификации, и с разрешения Управления по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) (FDA) Министерства здравоохранения и социальных служб (HHS), такое масло может выпускаться под маркой продукт с низким содержанием насыщенных кислот или продукт, не содержащий насыщенных кислот. Кроме того, настоящее изобретение относится к средствам (наборам) для детектирования и к способам детектирования присутствия одного или нескольких мутантных аллелей fatB и/или аллелей FATB дикого типа в растениях, тканях или семенах Brassica, а также к способам переноса одного или нескольких мутантных аллелей fatB и/или аллелей FATB дикого типа в другие растения Brassica и к способам комбинирования различных аллелей fatB и/или FATB в растениях. В частности, способы комбинирования подходящего числа мутантных аллелей fatB, кодирующих нефункциональные белки FATB и/или белки FATB, обладающие в значительной степени пониженной активностью in vivo, позволяют значительно снизить относительное содержание всех насыщенных жирных кислот и/или конкретных насыщенных жирных кислот, которые аккумулируются в масле, полученном из Brassica. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению указанных растений, их частей и/или потомства, их семян и масла, полученного из таких семян, а также к способам и/или к наборам, рассматриваемым в настоящем изобретении.
Предшествующий уровень техники
Растительные масла вызывают все возрастающий интерес с экономической точки зрения, поскольку они широко используются в пище человека, в кормах для животных и во многих отраслях промышленности. Однако состав жирных кислот в этих маслах часто не является оптимальным для многих целей их применения. Поскольку для использования масел в целях приготовления пищевых продуктов, а также в промышленных целях необходимо, чтобы такие масла имели конкретный состав жирных кислот, то значительный интерес представляет изменение состава масел, которое может быть достигнуто в результате селекции растений и/или применения новых способов биотехнологии растений, осуществляемых на молекулярном уровне (описание модификации масел Brassica см., например, Scarth and Tang, 2006, Crop. Science, 46:1225-1236).
Конкретные технологические и целебные свойства пищевых масел определяют, главным образом, по составу жирных кислот в этих маслах. Большинство растительных масел, полученных из сельскохозяйственных сортов растений, состоят, главным образом, из пальмитиновой кислоты (16:0), стеариновой кислоты (18:0), олеиновой кислоты (18:1), линолевой кислоты (18:2) и линоленовой кислоты (18:3). Пальмитиновая и стеариновая кислоты представляют собой насыщенные жирные кислоты, имеющие длину соответственно 16 и 18 атомов углерода. Олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты представляют собой ненасыщенные жирные кислоты, которые имеют 18 атомов углерода и содержат одну, две и три двойных связи соответственно. Олеиновая кислота называется мононенасыщенной жирной кислотой, а линолевая и линоленовая кислоты называются полиненасыщенными жирными кислотами.
В настоящее время масличные культуры Brassica, такие как Brassica napus (В. napus) и Brassica juncea (В. juncea), обычно известные как рапс и горчица, являются, после сои, наиболее часто культивируемыми масличными растениями (FAO, 2005; Raymer (2002), J. Janick and A. Whipkey (ed.) Trends in new crops and new uses. ASHS Press, Alexandria, V.A. Raymer, p. 122-126). Рапсовое масло, получаемое из традиционных масличных сортов Brassica (В. napus, В. гара и В. juncea) (Shahidi (1990), Shahidi (ed.) Canola and rapeseed: Production, chemistry, nutrition, and processing technology. Van Nostrand Reinhold, New York, p. 3-13; Sovero (1993), J. Janick and J.E. Simon (ed.) New crops. John Wiley & Sons, New York, p. 302307), обычно имеют содержание жирных кислот, которое составляет 5% пальмитиновой кислоты (C16:0), 1% стеариновой кислоты (C18:0), 15% олеиновой кислоты (C18:1), 14% линолевой кислоты (C18:2), 9% линоленовой кислоты (C18:3) и 45% эруковой кислоты (C22:1) по массе всех жирных кислот (выражаемых в мас.%) (Ackman (1990), Shahidi (ed.) Canola and rapeseed: Production, chemistry, nutrition, and processing technology. Van Nostrand Reinhold, New York, p. 81-98). Эруковая кислота является нежелательной жирной кислотой с точки зрения питательной ценности, и ее содержание в пищевом масле Brassica было доведено до очень низких уровней. Обычно относительное содержание насыщенных жирных кислот по отношению к общему количеству жирных кислот в масле из семян растений составляет примерно 6,57,5%, причем большую часть составляют пальмитиновая кислота и стеариновая кислота.
- 1 030862
Канадские агрономы направили свои усилия на создание так называемых сортов с низким содержанием двух компонентов, которые имели низкий уровень эруковой кислоты в масле своих семян, и низкий уровень глюкозинолатов в твердом продукте, оставшемся после экстракции масла (то есть содержание эруковой кислоты составляло менее 2 мас.%, а содержание глюкозинолата составляло менее чем 30 мкмоль/г продукта, не содержащего масла). Такие более высококачественные виды рапса, выращиваемые в Канаде, известны под названием канола. Масло канолы отличается относительно низким уровнем насыщенных жирных кислот (в среднем примерно 7 мас.%), относительно высоким уровнем мононенасыщенных жирных кислот (примерно 61 мас.%) и промежуточным уровнем полиненасыщенных жирных кислот (примерно 32 мас.%), с достаточно хорошим балансом содержания линолевой кислоты, то есть жирной кислоты омега-6 (примерно 21 мас.%) и альфа-линоленовой кислоты, то есть жирной кислоты омега-3 (примерно 11 мас.%).
В последнее время главной причиной появления интереса к пищевым жирам является явная взаимосвязь между потреблением пищи с высоким содержанием жира, в частности насыщенного жира, и развитием ишемической болезни сердца. Высокие уровни холестерина в крови, в частности плохого холестерина (липопротеина низкой плотности или ЛНП), представляют главный фактор риска развития ишемической болезни сердца. Некоторые исследования позволили предположить, что употребление пищи с высоким содержанием мононенасыщенных жиров и низким содержание насыщенных жиров может приводить к снижению уровня плохого холестерина (липопротеина низкой плотности или ЛНП) и к сохранению хорошего холестерина (липопротеина высокой плотности или ЛВП) (Nicolosi and Rogers, 1997, Med. Sci. Sports Exerc., 29:1422-1428).
В странах Северной Америки и Европы специалисты в области питания рекомендуют снижать потребление общих жиров до 30% или менее и насыщенных жиров до менее чем 10% от общей энергетической ценности (статья 21 Свода федеральных правил (C.F.R.) 101.75 (b) (3)) (по сравнению с употреблением насыщенного жира, составляющего примерно 15-20% от общего потребления калорий в большинстве промышленно развитых стран). Современные руководства по маркированию продуктов, издаваемые для сведения потребителей Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) (FDA) Министерства здравоохранения и социальных служб (HHS), требуют, чтобы продукт, выпускаемый с маркировкой продукт с низким содержанием насыщенного жира или продукт с низкой калорийностью (ст. 21 C.F.R. 101.62 (с) (2)), в отличие от обычно потребляемого стандартного продукта, имел уровни всех насыщенных жирных кислот 1 г или менее и не более чем 15% калорий насыщенных жирных кислот; и чтобы продукт, выпускаемый с маркировкой продукт, не содержащий (или содержащий 0%) насыщенного жира или продукт, не содержащий (или содержащий 0%) калорий (ст. 21 C.F.R. 101.62 (с) (1)), в отличие от обычно потребляемого стандартного продукта, имел менее чем 0,5 г насыщенного жира и менее чем 0,5 г транс-жирной кислоты (ненасыщенной жирной кислоты, продуцируемой в результате (частичной) гидрогенизации растительных масел, и рассматриваемой как кислота, опасная для здоровья, поскольку, несмотря на то, что такая кислота является ненасыщенной, она способствует увеличению риска развития ишемической болезни сердца). Это означает, что общее содержание насыщенных жирных кислот (выражаемое в мас.% насыщенных жирных кислот от общего количества жирных кислот в масле), то есть общее содержание лауриновой кислоты (C12:0; додекановой кислоты), миристиновой кислоты (C14:0; тетрадекановой кислоты), пальмитиновой кислоты (C16:0; гексадекановой кислоты), стеариновой кислоты (C18:0; октадекановой кислоты), арахидоновой кислоты (C20:0; эйкозановой кислоты), бегеновой кислоты (C22:0; докозановой кислоты) и лигноцериновой кислоты (C24:0; тетракозановой кислоты) в растительных маслах должно составлять менее чем 7 мас.%, и в этом случае, такой продукт должен иметь маркировку продукт с низким содержанием насыщенного жира, или менее чем 3,5 мас.%, и в этом случае, такой продукт должен иметь маркировку продукт, не содержащий насыщенного жира (проценты по массе указываются по отношению к стандартному количеству, составляющему 15 мл или 14 г масла - ст. 21 C.F.R. 101.12).
Масло канолы содержит приблизительно только 7 мас.% насыщенных жирных кислот по сравнению с уровнем насыщенных жирных кислот в других обычно используемых пищевых растительных маслах, таких как сафлоровое масло (8 мас.%), масло из семян льна (9 мас.%), подсолнечное масло (12 мас.%), кукурузное масло (13 мас.%), оливковое масло (15 мас.%), соевое масло (15 мас.%), арахисовое масло (19 мас.%), масло из семян хлопчатника (27 мас.%), пальмовое масло (51 мас.%) и кокосовое масло (91 мас.%) (Source POS Pilot Plant Corporation). Для дальнейшего снижения указанного уровня насыщенных жирных кислот были применены различные методы.
Модификация растительных масел может быть осуществлена химическим способом: в патенте США № 4948811 описан состав триглицеридного салатного масла/кулинарного жира, где содержание насыщенных жирных кислот от общего содержания триглицеридов жирных кислот в масле составляет примерно менее чем 3 мас.%, и такое содержание было получено посредством химической реакции или физического выделения насыщенных жиров. Однако химическая модификация растительных масел, осуществляемая в целях снижения уровня насыщенных жирных кислот, является не только более дорогостоящей процедурой, чем экстракция растительного масла из масличных растений Brassica (или из любого другого масличного растения), которые были модифицированы для улучшения качества эндогенно
- 2 030862 го пищевого растительного масла, описанного в настоящей заявке, но может также оказаться нежелательной с точки зрения лечебной ценности масел, употребляемых человеком в пищу, из-за возможного случайного присутствия остатков используемых химических продуктов и предполагаемых побочных продуктов.
Другим возможным способом изменения состава жирных кислот является генная инженерия. Так, например, в заявке на патент США No. 2004/0132189 описано снижение уровня насыщенных жирных кислот в линиях Brassica, коэкспрессирующих последовательности (бета-кетоацил-ацил-переносящий белок)-синтазы I и IV Cuphea pullcherima, а также дельта-9-десатуразы сафлора, примерно до 3 мас.% и ниже 3,4 мас.% по отношению к уровню насыщенных жирных кислот в ^трансформированных контрольных линиях, в которых уровень насыщенных жирных кислот составляет примерно 6,0 мас.%. В заявке WO06/042049 описаны растения Brassica, семена которых экспрессируют ген дельта-9-десатуразы и не содержат насыщенных жирных кислот или содержат пониженные уровни насыщенных жирных кислот. Однако недостатком указанных трансгенных методов для промышленного производства такого продукта является необходимость в получении разрешения как собственных Регуляторных органов, так и регуляторных органов других стран мира.
Состав жирных кислот в растительных маслах может быть также модифицирован традиционными методами селекции. В этих методах, в качестве источника для внесения природных мутаций, влияющих на состав жирных кислот, используется зародышевая плазма. Так, например, в публикации Raney et al. (1999, Proc. 10th Int. Rapeseed Cong.: New horizons for an old crop, Canberra, Australia) описано скрещивание популяций, полученных от межвидовых кроссов растения В. napus с растениями В. rapa и В. oleracea, где уровень насыщенных жирных кислот, выражаемый как общее содержание миристиновой, пальмитиновой, стеариновой, арахидоновой, бегеновой и лигноцериновой кислоты, снижен до менее чем 6 мас.%, и где уровень насыщенных жирных кислот, выражаемый как общее содержание миристиновой, пальмитиновой и стеариновой кислоты, был снижен до менее чем 5 мас.%.
Были предприняты попытки увеличить число доступных мутаций, из которых могут быть отобраны мутанты с нужными свойствами с использованием мутагенов. Так, например, в WO 91/15578 описаны растения рапса, которые, после самоопыления, были способны давать семена, содержащие масло, имеющее содержание насыщенных жирных кислот не более чем 4 мас.% в форме пальмитиновой и стеариновой кислоты, где указанные семена могут быть получены путем химического мутагенеза с последующей селекцией.
В растениях синтез жирной кислоты de novo происходит исключительно в строме пластид, где ацильные цепи ковалентно связываются с растворимым белком-переносчиком ацилов (АСР) в процессе прохождения циклов удлинения. Удлинение углеродной цепи может прекращаться в результате переноса ацильной группы на глицерин-3-фосфат с последующим сохранением этой цепи в пластидном прокариотическом пути биосинтеза липидов. Альтернативно, специфические тиоэстеразы могут прерывать прокариотический (пластидный) путь посредством гидролиза только что образованного ацил-АСР с образованием свободной жирной кислоты и АСР. Затем свободная жирная кислота высвобождается из пластид и поступает на цитоплазматический эукариотический путь биосинтеза липидов. Такой путь осуществляется в эндоплазматическом ретикулуме и ответственен за образование фосфолипидов, триглицеридов и других нейтральных липидов. Поэтому в результате гидролиза ацил-АСР и высвобождения жирной кислоты, ацил-АСР-тиоэстеразы катализируют прохождение первой стадии коммитирования в эукариотическом пути биосинтеза липидов в клетках растений и играет решающую роль в распределении синтезированных ацильных групп de novo между указанными двумя путями (Lohden and Frentzen, 1988, Planta 176:506-512; Browse and Somerville, 1991, Annu Rev Plant Physiol., Plant Mol Biol., 42: 467-506; Gibson et al., 1994, Plant Cell, Environ, 17: 627-637).
В работах Jones et al. (1995, Plant Cell, 7:359-371) и Voelker et al. (1997, Plant Physiology, 114, 669677) описаны два различных, но родственных класса генов тиоэстеразы в высших растениях, которые были названы FATA и FATB. Эти два класса тиоэстераз могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей и/или по их специфичности/предпочтительности к субстрату. Тиоэстеразы FATA (называемые также тиоэстеразами класса I) отдают явное предпочтение С18:1-ацил- или олеоил-АСР и обладают лишь небольшой активностью по отношению к С18:0-ацил- и С16:0-ацил-АСР (то есть предпочтительность к ацилу распределяется следующим образом: 18:1>>18:0>>16:0). В противоположность этому, члены FATB (также называемые тиоэстеразами класса II) предпочитают насыщенные ацил-АСРгруппы в качестве субстрата, а длина цепи субстрата значительно варьируется и составляет от С8 до С18 ацил-АСР (Mayer and Shanklin, 2005, J. Biol., Chem., 280(5): 3621-3627). Кроме того, члены FATB могут быть дополнительно подразделены на две функциональных группы. Некоторые ферменты FATB обладают специфичностью к субстрату (насыщенный ацил)-АСР с длиной цепи С8-С14 (тиоэстеразы, предпочитающие ацил со средней длиной цепи-АСР) и обнаруживаются у видов, продуцирующих ферменты, предпочитающие субстрат со средней длиной цепи, при этом, их экспрессия ограничивается тканями, продуцирующими ферменты, предпочитающие субстрат со средней длиной цепи. Ферменты, принадлежащие ко второй группе FATB, предпочитающей С14-С18-ацил-АСР (преимущественно пальмитоилАСР, например, ферменты с предпочтительностью в следующем порядке: С16:0 > С18:1 > С18:0; тиоэ
- 3 030862 стеразы, предпочитающие длинноцепочечный ацил-АСР), вероятно, присутствуют во всех основных частях растений, и обнаруживаются не только у растений, продуцирующих ферменты, предпочитающие субстрат со средней длиной цепи (Jones et al., 1995, Plant Cell, 7:359-371). Причина существования растений с различными типами тиоэстераз и их конкретные роли в данных растениях пока еще остаются, в основном, неясными.
Гены FATA были выделены из растений различных видов, включая растения вида Brassica. Так, например, в патентах США №№ 5530186, 5530186 и 5945585 описаны гены FATA сои; в работе Hellyer et al. (1992, Plant Mol. Biol., 20:763-780) описаны ферменты FATA растения Brassica napus; в работе Loader et al. (1993, Plant Mol. Biol., 23(4): 769-778) описаны выделение и характеризация двух клонов ацил-АСРтиоэстераз, выделенных из библиотеки кДНК зародыша растения Brassica napus с использованием олигонуклеотидов, полученных из базы данных последовательности белка олеоил-АСР-тиоэстеразы В. napus; а в работе Mandal et al. (2000, Bioch. Soc. Transactions 28(6): 967-968) описано клонирование последовательностей гена ацил-АСР-тиоэстеразы от В. juncea, которые гомологичны последовательностям генов FATA, происходящих от растений других видов.
Гены FATB, кодирующие ферменты FATB, специфичные к субстрату (насыщенный ацил)-АСР с длиной цепи С8-С14 (тиоэстеразы, предпочитающие ацил со средней длиной цепи)-АСР), были выделены из растений различных видов, продуцирующих ферменты, предпочитающие субстрат со средней длиной цепи, как описано в нижеследующих работах.
В WO91/16421 описано выделение лауроил-(C12:0)-АСР-предпочитающей тиоэстеразы, происходящей от калифорнийского лавра (Umbellularia californica), C10:0-ацил-АСР-предпочитающей тиоэстеразы, происходящей от камфорного дерева (Cuphea hookeriana) и стеароил-(С18:0)-АСР-предпочитающей тиоэстеразы, происходящей от сафлора (Carthamus tinctorius), и экспрессия тиоэстеразы калифорнийского лавра в семенах Brassica, приводящая к повышению уровня лаурата, в отличие от уровня лаурата в нетрансгенных семенах Brassica.
В WO92/20236 описано выделение С8:0-С14:0-ацил-АСР-предпочитающих тиоэстераз и экспрессия лауроил-(С12:0)-АСР-предпочитающей тиоэстеразы калифорнийского лавра в растениях Arabidopsis и Brassica campestris, приводящая к повышению уровней лаурата.
В публикации Voelker et al. (1992, Science 257: 72-74) описана экспрессия кДНК FATB (Uc FATB1), кодирующей лауроил-(С12:0)-АСР-тиоэстеразу калифорнийского лавра, у которого в масле семян накапливается каприновая (С10:0) и лауриновая кислота (С12:0), а также в семенах Arabidopsis thaliana, которые обычно не накапливают лаурата, где указанная экспрессия приводит к накапливанию лаурата в зрелых семенах. В публикации Voelker et al. (1996, Plant J. 9:229-241) описана трансформация того же самого трансгена FATB в Brassica napus, приводящая к накапливанию лаурата почти до 60 моль % от общего количества ацильных групп триглицеридов.
В публикации Eccleston и Ohlrogge (1998, Plant Cell, 10:613-621) описана экспрессия С12:0-ацилАСР-тиоэстеразы Umbellularia californica в семенах Brassica napus, приводящая к получению масла семян, содержащего от 1,8 до 59,6 мол.% лаурата (С12:0).
В WO94/10288 описано выделение С8:0-С10:0-ацил-АСР-предпочитающих тиоэстераз.
В публикации Martini et al. (1995, Proc. 9th Int. Rapeseed dong. Cambridge, UK, p. 461-463) указывается, что два гена FATB ^phea lanceolata, отдельно трансформированных в В. napus, дают накапливание каприловой (С8:0) и каприновой кислоты (С10:0) в масле семян Brassica на низком уровне.
В публикации Dehesh et al. (1996, Plant J. 9(2):167-172) описана экспрессия кДНК FATB (СП FATB2) мексиканской акации Qiphea hookeriana, в масле семян которой накапливается до 75 моль % каприлата (С8:0) и капрата (С10:0), в семенах трансгенной канолы, в которых обычно не накапливаются такие жирные кислоты, где указанная экспрессия приводит к накапливанию каприлата (С8:0), капрата (С10:0) и лаурата (С12:0) до 11,27 и 2 мол.% соответственно.
Гены FATB, кодирующие ферменты FATB, специфичные к субстрату насыщенный ацилАСР/предпочитающие насыщенный ацил-АСР с длиной цепи С14-С18 (тиоэстеразы, предпочитающие длинноцепочечный ацил-АСР), были выделены из растений различных видов.
В WO95/13390 описано выделение последовательностей пальмитоил (С16:0)-АСР-тиоэстеразы из лука-порея, манго, вяза и камфорного дерева, и их применение для увеличения и снижения уровней насыщенных жирных кислот в сое и в каноле посредством генетической трансформации.
В публикации Jones et al. (1995, Plant Cell, 7:259-371) описана экспрессия кДНК пальмитоил(С16:0)АСР-тиоэстеразы камфорного дерева (ЗД FATB1) в трансгенных растениях Brassica napus, приводящая к увеличению уровней пальмитата (С16:0) от 6 до 35 мол.%.
В публикации Voelker et al. (1997, Plant Physiol. 114:669-677) описана экспрессия С14:0-С18:0-ацилАСР-тиоэстеразы мускатного ореха (Myristica fragrans), в масле которого накапливается преимущественно миристат (14:0), а также в семенах Brassica napus, где указанная экспрессия приводит к обогащению масла семян С14-С18-насыщенными кислотами.
В публикации Voelker et al. (1997, Plant Physiol. 114:669-677) также описана экспрессия С10:0С16:0-ацил-АСР-тиоэстеразы вяза (Ulmus americana), в масле которого накапливается преимущественно капрат (10:0), а также в семенах Brassica napus, где указанная экспрессия приводит к обогащению масла
- 4 030862 семян С10-С18-насыщенными кислотами, преимущественно пальмитатом (C16:0), миристатом (C14:0) и капратом (C10:0).
В WO96/23892 описаны последовательности миристоилСМ^-АСР-тиоэстеразы Cuphea palustris, камфорного дерева и мускатного ореха и их применение для продуцирования миристата в клетках растений.
В WO96/06936 описаны кДНК пальмитоилС^^-АСР-тиоэстеразы сои и канолы и их применение для повышения и снижения уровней насыщенных жирных кислот в сое и каноле посредством генетической трансформации.
В публикации Dormann et al. (2000, Plant Physiol., 123:637-643) описана сверхэкспрессия кДНК (длинноцепочечный ацил-АСР)-тиоэстеразы Arabidopsis (AtFATB1) под контролем семяспецифического промотора в Arabidopsis, приводящая к накапливанию большого количества пальмитата (C16:0) в семенах (от 10 мол.% в контроле дикого типа и до 38,6 мол.%). Экспрессия антисмысловой кДНК FATB1 Arabidopsis под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты 35S приводит к значительному снижению уровня пальмитата в семенах (от 11 мол.% в контроле дикого типа и до 6 мол.%) и в цветках и лишь к незначительному изменению уровня жирных кислот в листьях и корнях.
В публикации Bonaventure et al. (2003, Plant Cell., 15:1020-1033) указывается, что содержание глицеролипидов в пальмитате (C16:0) в мутанте Arabidopsis, в который был введен ген FATB с Т-ДНКвставкой (в Arabidopsis присутствуют два гена FATA, но только один ген FATB; см. Mekhedov et al. 2000, Plant Physiol., 122:389-402 и Beisson et al. 2003, Plant Physiol., 132: 681-697), снижалось на 42% в листьях, на 56% в цветках, на 48% в корнях и на 56% в семенах. Кроме того, уровень стеарата (C18:0) снижался на 50% в листьях и на 30% в семенах. Скорость роста мутантов значительно снижалась, и такие мутантные растения давали семена с низкой жизнеспособностью, с пониженной прорастаемостью и с измененной морфологией, что указывало на то, что FATB играет важную роль в росте растения и развитии семян.
В публикации Bonaventure et al. (2004, Plant Physiol., 135:1269-1279) указывается, что скорость синтеза жирных кислот в листьях трансгенного FATB-дефицитного мутантного растения Arabidopsis повышалась на 40%, что приводило к экспорту приблизительно такого же количества пальмитата из пластиды как у растений дикого типа, но при этом, экспорт олеата повышался примено на 55%.
В публикации Pandian et al. (2004, обзорный документ, 4th Int. Crop Sci. Cong.) сообщается о выделении полноразмерных последовательностей генов FATB В. napus (GenBank рег. № DQ847275) и В. juncea (GenBank рег. № DQ856315); о создании конструкции, обеспечивающей сайленсинг генов с инвертированными повторами (под контролем семяспецифического промотора), где указанная конструкция имеет 740 п.н. консервативного фрагмента части последовательности В. napus, которая более чем на 90% гомологична последовательностям FATB В. juncea и Arabidopsis thaliana, но менее чем на 40% гомологична последовательностям генов FATA этих трех видов; и о их трансформации в Arabidopsis thaliana, В. napus и В. juncea. Целью такого конструирования является создание трансгенных растений с пониженным уровнем пальмитиновой кислоты в масле семян. В этой публикации отсутствуют какие-либо упоминания о влиянии такой конструкции с сайленсингом генов на конечный состав масла семян (результаты не приводятся), а также отсутствует описание альтернативных методов выращивания растений Brassica с низким содержанием насыщенных жирных кислот в масле семян.
В публикации Mayer and Shanklin (2005, J. Biol., Chem., 280(5):3621-3627) описана структурная модель белка FATB Arabidopsis, где N-концевой домен содержит остатки, которые влияют на специфичность (см. также Mayer and Shanklin, 2007, ВМС Plant Biology, 7(1):1-11), а C-концевой домен содержит каталитические остатки.
Несмотря на тот факт, что последовательности некоторых генов FATB известны специалистам, необходимость в выявлении роли этих генов и ферментов, участвующих в продуцировании и накоплении насыщенных жирных кислот в масле семян растений и в разработке методов (в частности, нетрансгенных методов) снижения относительного количества всех насыщенных жирных кислот и/или конкретных насыщенных жирных кислот в семенах, не оказывающего негативного влияния на рост и развитие растения, остается актуальной. В настоящее время отсутствуют сельскохозяйственные культуры (нетрансгенные) Brassica, семена которых давали бы масло с содержанием насыщенных жирных кислот значительно менее 7%. Поэтому необходимость в разработке средств и методов выращивания растений и масличных культур, которые описаны в нижеследующем подробном описании настоящего изобретения, в описании графического материала, в примерах и формуле изобретения, остается актуальной. Описание сущности изобретения
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что растения Brassica napus содержат 6 различных генов FATB, и что уровни насыщенных жирных кислот в растениях Brassica, в частности в масле семян указанных растений Brassica, могут контролироваться путем регуляции числа и/или выбора типов генов/аллелей FATB, которые функционально экспрессируются в семенах, то есть продуцируют функциональный (биологически активный) белок FATB. Путем комбинирования минимального числа мутантных аллелей шести генов FATB (аллелей fatB) и сохранения минимального числа аллелей FATB дикого типа, дающего минимальный уровень функционального белка FATB, может быть изменен уро
- 5 030862 вень насыщенных жирных кислот в масле семян, в частности может быть значительно снижено относительное количество насыщенных жирных кислот (в частности, количество пальмитиновой кислоты). Считается, что для гарантии нормального роста растения и развития семян и для поддержания продуцирования минимального количества насыщенных жирных кислот и/или конкретных насыщенных жирных кислот в конкретных тканях необходимо присутствие минимального числа аллелей FATB дикого типа.
Таким образом, в одном варианте своего первого аспекта, настоящее изобретение относится к растению Brassica (и его частям, таким как семена), содержащему в своем геноме по меньшей мере три мутантных аллеля FATB, где указанными мутантными аллелями FATB являются аллели по меньшей мере трех различных генов FATB, выбранные из группы, состоящей из FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATBC1, FATB-C2 и FATB-C3, и где в семенах указанного растения продуцируется масло, имеющее уровни насыщенных жирных кислот, равные или менее 6, 5, 4 или 3,5 мас.% (например, равные или менее 3, 2 или 1 мас.%) по отношению к общему количеству жирных кислот в масле семян.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к (выделенным) последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующей белки FATB дикого типа и/или мутантные белки FATB, a также их фрагменты, и к способам применения указанных последовательностей нуклеиновой кислоты в целях изменения состава масла семян Brassica. Настоящее изобретение также относится к самим белкам и к их применению.
Настоящее изобретение также относится к множеству семян Brassica, к растениям Brassica и к частям растений, содержащим по меньшей мере три (мутантных) аллеля fatB, а поэтому значительно меньшее количество функциональных белков FATB по сравнению с семенами, растениями и тканями, содержащими аллели FATB, кодирующие соответствующие функциональные белки. Большинство таких семян содержит масло, имеющее измененное относительное количество и/или измененный состав насыщенных жирных кислот. В одном из аспектов изобретения, в частности, количество пальмитиновой кислоты (C16:0) значительно меньше по сравнению с ее количеством в масле, продуцируемом семенами, в которых отсутствуют мутантные аллели fatB (по меньшей мере три мутантных аллеля fatB) (то есть семенами, которые вместо мутантных аллелей содержат аллели FATB дикого типа).
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к маслу семян, имеющему измененное относительное количество и/или измененный состав насыщенных жирных кислот, где указанное масло может быть получено путем сбора семян растений Brassica согласно изобретению и экстракции масла из этих семян, либо оно может быть получено путем его экстракции из множества семян Brassica согласно изобретению, и к применению указанного масла семян.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам выращивания и селекции растений, частей растений и семян, содержащих по меньшей мере три таких мутантных аллеля fatB, присутствующих по меньшей мере в трех различных локусах генома (то есть по меньшей мере в трех различных локусах по меньшей мере трех различных генов FATB, выбранных из группы, состоящей из FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3), и к идентификации присутствия мутантных аллелей fatB и аллелей FATB дикого типа в растении или в его части. Настоящее изобретение также относится к способам (таким как мутагенез и/или отбор с помощью маркера) продуцирования и/или идентификации аллелей fatB или растений или частей растения, содержащих такие аллели, и объединения подходящего числа аллелей fatB и/или различных типов аллелей fatB в одном растении, что будет приводить к значительному снижению уровней насыщенных жирных кислот в масле семян этого растения.
Настоящее изобретение также относится к способам использования растений, большого количества семян, частей растения и т.п. согласно изобретению в целях получения из измельченных семян Brassica масла, которое может быть маркировано как продукт с низким содержанием насыщенных жирных кислот или продукт, не содержащий насыщенных жирных кислот. Используемый здесь термин растительный продукт означает любой продукт, полученный из растения согласно изобретению, включая части растения, такие как семена, а также из муки семян этого растения, из жмыха, жиров или масел этого растения.
Описание графического материала
Фиг. 1 - представлен график, иллюстрирующий результаты, полученные после осуществления полуколичественной ОТ-ПЦР, описанной в примере 3. Указаны время (11-й, 21-й и 34-й дни после цветения) (ось X) и уровень экспрессии каждого гена FATB в семенах (исходя из 10 нг РНК), выраженный как количество геномной ДНК (в нг), которое дает полосу с интенсивностью, сравнимой с интенсивностью полосы ОТ-ПЦР-продукта, полученного в результате ОТ-ПЦР-реакции, специфичной по отношению к гену FATB (ось Y).
Фиг. 2 - схематически представлен ген FATB-A1 (с интронами), кодирующий белок FATB-A1 дикого типа от ярового масличного рапса (S) Brassica napus. (SEQ ID NO: 13).
Фиг. 3 - схематически представлен ген FATB-A2 (с интронами), кодирующий белок FATB-A1 дикого типа от ярового масличного рапса (S) Brassica napus. (SEQ ID NO: 15).
Фиг. 4 - схематически представлен ген FATB-A3 (с интронами), кодирующий белок FATB-A1 дикого типа от ярового масличного рапса (S) Brassica napus. (SEQ ID NO: 17).
- 6 030862
Фиг. 5 - схематически представлен ген FATB-C1 (с интронами), кодирующий белок FATB-A1 дикого типа от ярового масличного рапса (S) Brassica napus. (SEQ ID NO: 19).
Фиг. 6 - схематически представлен ген FATB-C2 (с интронами), кодирующий белок FATB-A1 дикого типа от ярового масличного рапса (S) Brassica napus. (SEQ ID NO: 21).
Фиг. 7 - схематически представлен ген FATB-C3 (с интронами), кодирующий белок FATB-A1 дикого типа от ярового масличного рапса (S) Brassica napus. (SEQ ID NO: 23).
На фиг. 2-7 экзоны показаны серыми рамками, интроны показаны горизонтальными линиями между экзонами; положения мутаций, описанных в примерах (обозначаемые EMSxx в соответствии с их названием FATB-Xx-EMSxx, как описано в примерах), показаны вертикальными линиями; длины и положения FATB-специфических зондов с SEQ ID NO: 25 и 28 показаны вертикальными линиями, расположенными ниже схематического представления генов FATB; положения FATB-специфических праймеров (обозначаемых ID xx в соответствии с их последовательностями SEQ ID NO: xx) показаны стрелками, а масштабная шкала указывает длину соответствующих генов FATB.
Фиг. 8 - график, иллюстрирующий корреляцию между присутствием 0-4 мутантных аллелей FATB в гомозиготных растениях Brassica и уровнем общих насыщенных жирных кислот (то есть С14:0-, С16:0-, С18:0-, С20:0-, С22:0- и С24:0-жирных кислот) (в мас.% от общего количества жирных кислот) в масле семян растений Brassica. Проанализированные растения Brassica представляют собой потомство растений Brassica, содержащее три или четыре мутантных аллеля FATB, то есть аллели FATB-AX-EMSY или FATB-CX-EMSY, представленные в табл. 23 в гетерозиготном состоянии. Мутантные аллели FATB обозначены aX-Y и cX-Y или аХ и сХ, а аллели FATB дикого типа обозначены АХ и СХ.
Общие определения
Используемый здесь термин масло с низким уровнем насыщенных жирных кислот или с низким уровнем насыщенного жира означает масло семян, содержащее (в среднем) менее чем 7 мас.% общих насыщенных жирных кислот от общего мас.% жирных кислот в масле. Мас.% насыщенных жирных кислот в масле семян с низким содержанием жирных кислот составляет 6, 5, 4 мас.% или менее, но выше 3,5 мас.% (например, 3,6 мас.%).
Используемый здесь термин масло, в котором отсутствуют насыщенные жирные кислоты или масло, не содержащее жира означает масло семян, содержащее (в среднем) менее чем 3,6 мас.% общих насыщенных жирных кислот от общего мас.% жирных кислот в масле. Мас.% насыщенных жирных кислот в масле семян, не содержащих жира, составляет 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5 или 1 мас.% или менее.
Термин сельскохозяйственное растение означает виды растений, культивируемых как сельскохозяйственные культуры, такие как Brassica napus (AACC, 2n=38), Brassica juncea (AABB, 2п=36), Brassica carinata (BBCC, 2n=34), Brassica rapa (syn. В. campestris) (AA, 2n=20), Brassica oleracea (CC, 2n=18) или Brassica nigra (BB, 2n=16). В это определение не входят дикорастущие растения, такие как Arabidopsis thaliana.
Термин последовательность нуклеиновой кислоты (или молекула нуклеиновой кислоты) означает молекулу ДНК или РНК в одноцепочечной или двухцепочечной форме, в частности ДНК, кодирующую белок или фрагмент белка согласно изобретению. Термин эндогенная последовательность нуклеиновой кислоты означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая присутствует в клетках растений, например эндогенный аллель гена FATB, присутствующего в ядерном геноме клетки Brassica.
Термин ген означает последовательность ДНК, содержащую область (транскрибируемую область), которая транскрибируется в молекулу РНК (например, пре-мРНК, содержащую интронные последовательности, а затем сплайсируемую в зрелую мРНК) в клетке, и которая функционально присоединена к регуляторным областям (например, к промотору). Таким образом, ген может содержать несколько функционально присоединенных последовательностей, таких как промотор, 5'-лидерная последовательность, содержащая, например, последовательности, участвующие в инициации трансляции, белок-кодирующая область (кДНК или геномную ДНК) и 3'-нетранслируемая последовательность, содержащая, например, сайты терминации транскрипции. Термин эндогенный ген используется для его дифференциации от таких генов как чужеродный ген, трансген или химерный ген, и означает ген растения определенного рода, вида или сорта, который был введен в это растение путем трансформации (то есть этот ген не является трансгеном), но который обычно присутствует в растении данного рода, вида или сорта, либо который был введен в это растение из растений другого рода, вида или сорта, в которых он обычно присутствует, где указанное введение осуществляют стандартными методами скрещивания или соматической гибридизации, например, путем слияния протопластов. Аналогичным образом, эндогенный аллель гена может быть получен не путем его введения в растение или его ткань посредством трансформации этого растения, a, например, путем его продуцирования посредством мутагенеза и/или селекции растения, или скрининга природных популяций растений.
Термин экспрессия гена или генная экспрессия означает процесс, при котором область ДНК, функционально присоединенная к соответствующим регуляторным областям, в частности к промотору, транскрибируется в молекулу РНК. Затем молекула РНК процессируется (посредством посттрансляционных процессов) в клетке, например, в результате сплайсинга РНК и инициации трансляции с образованием аминокислотной цепи (полипептида), и терминации трансляции посредством кодонов терминации
- 7 030862 трансляции. Используемый здесь термин функционально экспрессируемый относится к продуцированию функционального белка, а термин функционально не-экспрессируемый относится к продуцированию белка, обладающего пониженной активностью или не обладающего определенной функцией (биологической активностью), либо термин функционально не-экспрессируемый означает, что данный белок вообще не продуцируется (также см. ниже).
Используемые здесь термины белок или полипептид являются взаимозаменяемыми и означают молекулы, состоящие из цепи аминокислот, но этот термин не определяет конкретный механизм действия, размер, трехмерную структуру или происхождение белка или полипептида. Понятие белок может также охватывать фрагмент или часть белка FATB. Используемый здесь термин выделенный белок означает белок, которые больше не присутствует в его природном окружении, например in vitro или в клетках-хозяевах рекомбинантных бактерий или растений. Фермент представляет собой белок, обладающий ферментативной активностью, такой как функциональные белки FATB, обладающие способностью гидролизовать субстрат(ы), а именно, жирный ацил-АСР с образованием свободных жирных кислот и АСР (EC_number 3.1.2.).
Термины нацеливающий пептид или пептид-переносчик означают аминокислотные последовательности, которые доставляют белок во внутриклеточные органеллы, такие как пластиды. Белки FATB дикого типа у своего N-конца содержат пептид, доставляющий белок в пластиды (или пептид, переносящий белок в пластиды).
Термин зрелый белок или зрелый белок FATB означает функциональный фермент FATB, не содержащий пептида, переносящего данный белок в пластиды. Термин белок-предшественник означает зрелый белок вместе со своим пептидом-переносчиком.
Используемый здесь термин ген FATB означает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок (жирный ацил-АСР)-тиоэстеразу типа II (то есть белок FATB). Функциональный белок FATB обладает (жирный ацил-АСР)-тиоэстеразной активностью, то есть обладает способностью гидролизовать жирный ацил-АСР-субстраты, а предпочтительно субстраты, такие как насыщенный жирный ацил-АСР (например, пальмитоил-АСР; С16:0-АСР) с образованием свободной жирной кислоты (например, С16:0) и АСР, которые могут быть протестированы с помощью биологического анализа. Для определения функции и/или функциональности конкретного гена/белка FATB может быть, например, использована бактериальная экспрессионная система, описанная Salas и Ohlrogge (2002, Archives of Biochemistry and Biophysics 403:25-34), либо может быть осуществлен колориметрический скрининг на тиоэстеразную активность, проводимый на планшете с агаром, как описано Mayer и Shanklin (2007, ВМС Plant Biology, 7(1):1-11). Для определения общей активности FATB в растении или в ткани растения, анализ на гидролиз субстрата (жирный ацил)-АСР может быть проведен на экстрактах растений, как описано, например, в публикации Bonaventure et al. (2003, Plant Cell, 15:1020-1033) и Eccleston & Ohlrogge (1998, Plant Cell, 10: 613-622).
Используемый здесь термин аллель(и) означает любые одну или несколько альтернативных форм гена в конкретном локусе. В диплоидной (или амфидиплоидной) клетке организма, аллели данного гена локализованы в конкретном положении или локусе (в нескольких локусах) хромосомы. На каждой хромосоме из пары гомологичных хромосом присутствует один аллель.
Используемый здесь термин гомологичные хромосомы означает хромосомы, которые содержат информацию об аналогичных биологических признаках и включают одни и те же гены в одних и тех же локусах, но, возможно, различные аллели этих генов. Гомологичные хромосомы представляют собой хромосомы, которые спариваются в процессе мейоза. Негомологичные хромосомы, представляющие все биологические признаки организма, образуют в данной клетке набор и ряд наборов, называемых плоидностью. Диплоидные организмы содержат два набора негомологичных хромосом, где одна гомологичная хромосома происходит от одного родителя, а другая от другого родителя. В амфидиплоидных видах присутствует, в основном, два набора диплоидных геномов, где хромосомы двух геномов называются гомологичными хромосомами (и аналогичным образом, локусы или гены двух геномов называются гомологичными локусами или генами). Диплоидные или амфидиплоидные виды растений могут содержать большое число различных аллелей в конкретном локусе.
Используемый здесь термин гетерозиготный означает генетическое состояние, при котором два различных аллеля присутствуют в конкретном локусе, но расположены отдельно на соответствующих парах гомологичных хромосом в клетке. И наоборот, используемый здесь термин гомозиготный означает генетическое состояние, при котором два идентичных аллеля присутствуют в конкретном локусе, но расположены отдельно на соответствующих парах гомологичных хромосом в клетке.
Используемый здесь термин локус (множество локусов) означает конкретный участок или конкретные участки или сайты на хромосоме, в которых, например, присутствует ген или генетический маркер. Так, например, локус FATB-A1 означает положение на хромосоме генома А, где присутствует(ют) ген(ы) FATB-A1 (и два аллеля FATB-A1).
В соответствии с настоящим изобретением употребляемые здесь термины растение или растения также включают, если это не оговорено особо, части растения (клетки, ткани или органы, семена и отдельные части, такие как корни, листья, цветки, пыльца и т.п.), потомство растений, которое сохраняет
- 8 030862 отличительные свойства родителей (в частности, состав масла семян), такое как семена, образующиеся в результате самоопыления или скрещивания, например гибридные семена (образующиеся в результате скрещивания двух инбредных родительских линий), гибридные растения и происходящие от них части.
Термин молекулярный анализ (или тест) означает анализ, который позволяет определить (прямо или опосредованно) присутствие или отсутствие одного или нескольких конкретных аллелей FATB в одном или нескольких локусах FATB (то есть в одном или нескольких локусах FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и/или FATB-C3). В одном из вариантов изобретения такой анализ позволяет определить, является ли конкретный (дикого типа или мутантный) аллель гомозиготным или гетерозиготным в локусе любого отдельного растения.
Используемый здесь термин FATB дикого типа (например, FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 или FATB-C3 дикого типа) означает природный аллель, присутствующий в растениях Brassica и кодирующий функциональный белок FATB (например, функциональный FATB-A1, FATBA2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 или FATB-C3 соответственно). В противоположность этому, термин мутантный FATB (например, мутантный FATB-A1, FATB-A2, FATB-АЗ, FATB-C1, FATB-C2 тллтл FATB-C3) означает аллель FATB, которые не кодирует функциональный белок FATB, то есть аллель FATB, кодирующий не-функциональный белок FATB (например, нефункциональный FATB-A1, FATBA2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 или FATB-C3 соответственно) или не кодирующий белок FATB. Таким мутантным аллелем FATB является аллель FATB дикого типа, который содержит одну или несколько мутаций в своей последовательности нуклеиновой кислоты, где указанная(ые) мутация(и) предпочтительно приводит(ят) к значительному снижению (абсолютного или относительного) количества функционального белка FATB в клетках in vivo. Мутантные аллели последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих белок FATB, обозначены здесь fatB (например, fatB-a1, fatB-a2, fatB-a3, fatB-c1, fatB-c2 или fatB-c3 соответственно). Мутантными аллелями могут быть либо природные мутантные аллели, которые представляют собой мутантные аллели, существующие в природе (например, продуцируемые спонтанно без использования человеком мутагенов), либо индуцированные мутантные аллели, которые индуцируются человеком искусственно, например путем мутагенеза.
Термин значительно пониженное количество функционального белка FATB (например, функционального белка FATB-A1, FATB-A2, FATB^3, FATB-C1, FATB-C2 и/или FATB-O3) означает количество функционального белка FATB, продуцируемого клетками, содержащими мутантный аллель FATB, которое по меньшей мере на 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 100% (то есть нефункционального белка, продуцируемого клеткой) меньше количества функционального белка FATB, продуцируемого клетками, не содержащими мутантного аллеля FATB. Это определение охватывает продуцирование нефункционального белка (например, усеченного белка), не обладающего биологической активностью in vivo, снижение абсолютного количества функционального белка (например, не-функционального белка, образующегося в результате мутации в гене) и/или продуцирование белка с пониженной биологической активностью, то есть белка с недостаточной активностью (такого как усеченный белок или белок, продуцируемый в результате альтернативного мРНК-сплайсинга) по сравнению с активностью функционального белка дикого типа. Аналогичным образом, термин мутантный белок FATB охватывает белок, кодируемый мутантной последовательностью нуклеиновой кислоты (аллелем fatB), где указанная мутация приводит к значительному снижению ферментативной активности FATB in vivo и/или элиминации такой активности по сравнению с активностью белка, кодируемого не-мутантной последовательностью дикого типа (аллелем FATB).
Используемый здесь термин мутагенез означает процесс, при котором растительные клетки (например, семена или ткани Brassica, такие как пыльца и т.п.) подвергаются однократному или многократному контактированию с мутагенным агентом, таким как химическое вещество (такое как этилметилсульфонат (EMS), этилнитрозомочевина (ENU), и т.п.) или ионизирующему облучению (нейтронами (такими как быстрые нейтроны, вызывающие мутагенез и т.п.), гамма-лучами (такими как лучи, испускаемые источником кобальт 60), рентгеновскими лучами и т.п.), или их комбинациями. В большинстве случаев, мутациями, созданными путем облучения, являются крупные делеции или другие обширные повреждения, такие как транслокации или сложные реаранжировки, а мутациями, вызванными химическими мутагенами, чаще всего являются дискретные повреждения, такие как точковые мутации. Так, например, EMS алкилирует гуаниновые основания, что приводит к ошибочному спариванию оснований, а алкилированный гуанин спаривается с тиминовым основанием, что приводит, главным образом, к образованию транзиций G/C А/Т. После мутагенеза из обработанных клеток регенерируют растения Brassica известными методами. Так, например, полученные семена Brassica могут быть засеяны в соответствии со стандарными процедурами культивирования и после самоопыления эти растения дают семена. Альтернативно, гаплоидные проростки с двойным набором хромосом могут быть собраны и сразу культивированы с получением гомозиготных растений. Другие семена, которые образуются в результате такого самоопыления в данной или последующей генерации, могут быть собраны и скринированы на присутствие мутантных аллелей FATB. Некоторые известные методы скрининга на специфические мутантные аллели, например, Deleteagene™ (Delete-a-gene; Li et al., 2001, Plant J., 27: 235-242) включают анализы, прово
- 9 030862 димые с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), в целях выявления делеционных мутантов, образующихся в результате мутагенеза, вызываемого быстрыми нейтронами, а метод TILLING (специально индуцированные локальные повреждения в геномах; McCallum et al., 2000, Nat. Biotechnol., 18:455-457) позволяет идентифицировать EMS-индуцированные точковые мутации и т.п. Другие методы скрининга на присутствие специфических мутантных аллелей FATB описаны ниже в примерах.
Используемый здесь термин ортолог гена или белка означает гомологичный ген или белок, который присутствует в других видах и который имеет такую же функцию, как и исходный ген и белок, но его последовательность (обычно) изменяется после того, как вид, имеющий эти гены, подвергается дивергенции (то есть эти гены происходят от общего предка в результате видообразования). Таким образом, ортологи генов FATB Brassica napus могут быть идентифицированы в растениях других видов (например, Brassica juncea и т.п.) путем сравнения обеих последовательностей (например, на основе процента идентичности последовательностей по всей их длине или по длине конкретных доменов), и/или путем функционального анализа.
Используемый здесь термин сорт употребляется в соответствии с общепринятым соглашением UPOV и означает группу растений, входящую в один ботанический таксон низшего известного ранга, где указанная группа может быть определена по свойствам, присущим данному генотипу или комбинации генотипов, при этом она может быть дифференцирована от любой другой группы растений по меньшей мере по одному из указанных свойств и рассматривается как таксономическая единица, подходящая для ее размножения в неизменной (стабильной) форме.
Термин включающий интерпретируется как указание на присутствие указанных частей, стадий или компонентов, но не исключает присутствия одной или нескольких других частей и стадий или одного или нескольких других компонентов. Таким образом, растение, содержащее определенные признаки, могут включать и другие признаки.
При этом следует отметить, что в настоящем описании подразумевается, что слово, употребляемое в единственном числе (например, растение или корень), может означать существительное во множественном числе (например, множество растений, множество корней). Так, например, употребление существительного в единственном числе, означающего какой-либо элемент, не исключает возможности наличия более чем одного элемента, если это не оговорено особо, и если это явно не противоречит контексту изобретения. Таким образом, термин в единственном числе обычно означает по меньшей мере один.
В соответствии с настоящим изобретением идентичность последовательностей двух родственных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, выражаемая в процентах, означает число положений в двух оптимально выравниваемых последовательностях, имеющих идентичные остатки (x100), деленное на число сравниваемых положений. Пробел, то есть положение при выравнивании, где остаток присутствует в одной последовательности, и отсутствует в другой, рассматривается как положение с неидентичными остатками. Оптимальное сопоставление двух последовательностей достигается путем выравнивания двух последовательностей по всей длине в соответствии с алгоритмом глобального выравнивания Нидлмана и Вюнша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48 (3): 443-53) имеющемся в общедоступном пакете программ European Molecular Biology, Open Software Suite (EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277; см., например, http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html), с использованием параметров по умолчанию (штраф на пробел-пропуск = 10 (для нуклеотидов)/10 (для белков) и штраф на пробел-удлинение = 0,5 (для нуклеотидов)/0,5 (для белков)). Для нуклеотидов используемой оценочной матрицей по умолчанию является EDNAFULL, а для белков, оценочной матрицей по умолчанию является EBLOSUM62.
Используемый здесь термин по существу, идентичный или в основном, аналогичный относится к последовательностям, которые, при их оптимальном выравнивании, определенном выше, имеют, по меньшей мере, определенный минимальный процент идентичности (как будет определено ниже).
Термин жесткие условия гибридизации может быть использован для идентификации нуклеотидных последовательностей, которые, по существу, идентичны данной нуклеотидной последовательности. Жесткость условий гибридизации зависит от последовательности, и такие условия могут варьироваться в каждом конкретном случае. В основном, условия жесткости выбирают так, чтобы температура гибридизации для конкретных последовательностей при определенной ионной силе и при определенном pH была примерно на 5°C ниже температуры плавления (Tm). Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе и при определенном pH), при которой 50% последовательностей-мишеней гибридизуется с точно соответствующим зондом. Обычно условия жесткости выбирают так, чтобы концентрация соли составляла примерно 0,02 моль при pH 7, а температура составляла по меньшей мере 60°C. Чем ниже концентрация соли и/или выше температура, тем выше жесткость условий. Условиями жесткости для гибридизации РНК-ДНК (в нозерн-блот-анализе используют зонд, размером, например, 100 нуклеотидов) являются, например, условия, которые включают по меньшей мере одну промывку в 0,2Х SSC при 63°C в течение 20 мин, или эквивалентные условия.
Гибридизация в условиях высокой жесткости может быть проведена, например, при 65°C в водном растворе, содержащем 6x SSC (20x SSC содержит 3,0 М NaCl, 0,3 М Na-цитрат, pH 7,0), 5x раствор Денхардта (100x раствор Денхардта содержит 2% фиколл, 2% поливинилпирролидон, 2% альбумин бы
- 10 030862 чьей сыворотки), 0,5% додецилсульфат натрия (ДСН) и 20 мкг/мл денатурированной ДНК-носителя (одноцепочечной ДНК спермы рыб со средней длиной 120-3000 нуклеотидов), используемой в качестве неспецифического конкурента по связыванию. После гибридизации, промывка в условиях высокой жесткости может быть осуществлена в несколько стадий, где конечную промывку (примерно 30 мин) проводят при температуре гибридизации в 0,2-0,1x SSC, 0,1% ДСН.
Г ибридизация в условиях умеренной жесткости может быть проведена в условиях, эквивалентных условиям гибридизации в вышеописанном растворе, но примерно при 60-62°C. Промывка в условиях умеренной жесткости может быть проведена при температуре гибридизации в 1x SSC, 0,1% ДСН.
Гибридизация в условиях низкой жесткости может быть проведена в условиях, эквивалентных условиям гибридизации в вышеописанном растворе, но примерно при 50-52°C. Промывка в условиях низкой жесткости может быть проведена при температуре гибридизации в 2x SSC, 0,1% ДСН; см. также руководство Sambrook et al. (1989) и Sambrook & Russell (2001).
Подробное описание изобретения
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что растение Brassica napus (геном ААСС, 2п=4х=38), которое является аллотетраплоидным (амфидиплоидным) видом, содержащим, в основном, два диплоидных генома (геном А и С), что обусловлено происхождением этого вида от диплоидных предков, содержит всего шесть локусов FATB и генов FATB в своем геноме, три гена на геноме А (обозначаемых здесь FATB-A1, FATB-A2 и FATB-A3) и три гена на геноме С (обозначаемых здесь FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3). Считается, что ген FATB-A1 гомологичен гену FATB-C1, ген FATB-A2 гомологичен гену FATB^2, а ген FATB-A3 гомологичен гену FATB-C3, то есть гены А локализуются на геноме А и происходят от диплоидного предка В. rapa (АА), а гены С локализуются на геноме С В. napus и происходят от диплоидного предка В. oleracea (CC).
Как и в любом диплоидном геноме, в каждом локусе FATB генома, для каждого гена FATB могут присутствовать два аллеля (один аллель, представляющий собой генную последовательность, локализованную на одной хромосоме, а другой на гомологичной хромосоме). Нуклеотидные последовательности этих двух аллелей могут быть идентичными (гомозиготными) или различными (гетерозиготными) в любом данном растении, хотя, в целом, в данных видах, число различных возможных аллелей для каждого гена FATB может быть гораздо большим, чем два.
Кроме того, было обнаружено, что для значительного снижения процента (мас.%) насыщенных жирных кислот в масле семян растений, не достаточно, чтобы мутация, которая приводит к значительному снижению количества функционального белка FATB, кодируемого эквивалентным мутантным аллелем fatB дикого типа, была введена только в один или два из этих шести генов FATB. Очевидно, что для получения растений, у которых масло семян будет содержать низкий уровень насыщенных кислот или вообще не будет содержать насыщенных кислот, необходимо, что эти растения имели по меньшей мере три мутантных аллеля fatB из трех различных генов FATB (выбранных из FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3).
Таким образом, в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к растениям, содержащим по меньшей мере 3 мутантных аллеля fatB из трех различных генов FATB, где указанные мутантные аллели fatB дают значительно более низкое количество функционального белка FATB, кодируемого эквивалентом этих мутантных аллелей дикого типа, и таким образом, они дают в целом значительно более низкое количество функциональных белков FATB, продуцируемых в клетках растений, в частности в развивающихся семенах in vivo.
Путем объединения достаточного числа копий специфических мутантных аллелей fatB с достаточным числом копий специфических аллелей FATB дикого типа в одном растении можно точно скорректировать количество и/или тип функциональных белков FATB, что, в свою очередь, может влиять на экспорт (количество и/или тип) свободных насыщенных жирных кислот из пластиды и тем самым на состав жирных кислот в масле, полученном из семян. Абсолютное и относительное количество каждого из шести белков FATB может быть скорректировано так, чтобы можно было получить растения, которые продуцировали бы определенное количество белка(ов) FATB, достаточное для роста и развития этих растений, и чтобы в масле семян этих растений продуцировались и запасались жирные кислоты в нужном количестве и/или нужного типа. Так, например, в одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к растениям и их частям, содержащим по меньшей мере один функционально экспрессируемый аллель FATB, выбранный из FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3 и кодирующий полностью функциональный белок FATB, где остальными аллелями могут быть мутантные аллели fatB.
Таким образом, в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к растениям или к их частям, содержащим набор из n мутантных аллелей fatB (из 6 генов FATB), n < 12, предпочтительно n < 11 (например, n = 10, 9 или 8), где по меньшей мере один аллель продуцирует функциональный белок FATB.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к мутантным растениям или к их частям, которые являются гомозиготными по тройному мутантному FATB (п=6, то есть гомозиготному по мутантным аллелям трех генов, выбранных из 6 генов FATB), гомозиготными по квадруплетному мутант
- 11 030862 ному FATB (n=8) и/или гетерозиготными по квинтуплетному мутантному FATB (n=10), где указанные мутантные аллели выбраны из генов FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3.
Таким образом, в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к растениям, которые являются гомозиготными по тройному мутантному FATB, где указанные растения могут иметь следующий генотип:
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-аЗ/fatB-аЗ, FATB-
C1/FATB-C1 , FATB-C2/FATB-C2 , FATB-СЗ/FATB-СЗ ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-АЗ, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-АЗ/FATB-АЗ, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-СЗ/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-АЗ, FATB-
C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-АЗ , fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-АЗ , fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, FATB-АЗ/FATB-A3, FATB-
Cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl , FATB-C2/FATB-C2 , FATB-C3/FATB-СЗ ,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2 , fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-Al/FATB-Al , fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-АЗ , fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-Al/FATB-Al , fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-АЗ , fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-Al/FATB-Al , fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-АЗ , FATB-
Cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-Al/FATB-Al , FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3 или
- FATB-Al/FATB-Al, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-АЗ, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3.
- 12 030862
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к растениям, которые являются гомозиготными по квадруплетному мутантному FATB, где указанные растения могут иметь следующий генотип:
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/fatB-cl , FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-
Cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl , fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl , fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl , FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3 или
- FATB-A1/FATB-A1, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatBcl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3.
В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к растениям, которые являются гомозиготными по квинтуплетному мутантному FATB, где указанные растения могут иметь следующий генотип:
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl , fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl , FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-аЗ/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/ fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3 или
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB~a3/fatB~a3, fatB- cl/ fatB-cl , fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3.
В другом аспекте изобретения растения или их части являются гомозиготными по тройному (n=6), квадруплетному (n=8) и/или квинтуплетному (n=10) аллелю FATB, и содержат дополнительный мутантный аллель, где указанные мутантные растения или их части являются гетерозиготными по дополнительному мутантному аллелю FATB (то есть n=7, n=9 и n=11 соответственно) и где указанный мутант
- 13 030862 ный аллель выбран из остальных генов FATB дикого типа (то есть FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 или FATB-C3).
Таким образом, в другом своем варианте настоящее изобретение относится к растениям, которые являются гомозиготными по тройному мутантному FATB и содержат один дополнительный мутантный аллель FATB, где указанные растения могут иметь следующий генотип:
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/FATB-Cl , FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1 , fatB-c2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
Cl/FATB-Cl , FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-АЗ, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatBcl/fatB-cl, fatB-c2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2 , fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-АЗ, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-АЗ, FATB-
C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2 , fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/FATB-Cl, FATB-C2/FATB-C2 , fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB-
Cl/FATB-Cl, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2 , fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/FATB-Cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/FATB-A3, fatB- 14 030862 cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-A3/FATB-A3, fatB cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2 , fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB cl/fatB-cl, fatB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3 , FATB C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/FATB-A3, FATB C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3 , fatB cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2 , FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB cl/fatB-cl, fatB-c2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2 , fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB Cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB~a3, FATB C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB C1/FATB-C1, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB cl/FATB-Cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB C1/FATB-C1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-АЗ, fatB
- 15 030862 cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-СЗ/FATB-СЗ,
- FATB-Al/FATB-Al , fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB' cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB' cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-АЗ, fatB' cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- FATB-Al/FATB-Al , fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB' cl/fatB-cl, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/FATB-Al , fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, FATB· Cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-АЗ , FATB' Cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB~a2/fatB~a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB' cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/FATB-Al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB' cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB' cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-Al/FATB-Al , FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB' cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/FATB-Al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB' cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB' cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- FATB-Al/FATB-Al , FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB' cl/fatB-cl, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/FATB-Al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB' C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB' C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-Al/FATB-Al , FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB' cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/FATB-Al , FATB-A2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB' cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-Al/FATB-Al , fatB-a2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB' cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-сЗ/fatB-сЗ или
- FATB-Al/FATB-Al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/FATB-A3, fatB' cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-сЗ/fatB-сЗ.
- 16 030862
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к растениям, которые являются гомозиготными по квадруплетному мутантному FATB и содержат один дополнительный мутантный аллель FATB, где указанные растения могут иметь следующий генотип:
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/FATB-C2, FATB-C3/FATB-C3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/FATB-C3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-C3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/FATB-Cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-alf fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-АЗ, fatB- cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-АЗ, FATB-
Cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-СЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- 17 030862 cl/fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/fatB-cl , fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-alf FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/FATB-C1 , fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/FATB-A2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/ fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/FATB-АЗ , fatB- cl/ fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/ fatB-cl , fatB-c2/fatB-c2, FATB-C3/FATB-СЗ,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl /fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/FATB-C3,
- fatB-al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/ fatB-cl, FATB-C2/FATB-C2, fatB-сЗ/fatB-сЗ,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl /fatB-cl, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, FATB-
C1/FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-A1/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl /FATB-C1, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/FATB-A1, fatB-a2/fatB-a2, FATB-A3/FATB-A3, fatB- cl/ fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-АЗ, fatB- cl/ fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/FATB-Al, FATB-A2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/ fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3 или
- FATB-Al/FATB-Al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatBcl/ fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к растениям, которые являются гомозиготными по квинтуплетному мутантному FATB и содержат один дополнительный мутантный аллель FATB, где указанные растения могут иметь следующий генотип:
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/ fatB-cl , fatB-c2/fatB-c2, FATB-СЗ/fatB-сЗ,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/ fatB-cl, fatB-c2/FATB-C2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/FATB-Cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/FATB-A3, fatB- cl/ fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3,
- fatB-al/fatB-al, fatB-a2/FATB-A2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/ fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-сЗ/fatB-сЗ или
- fatB-al/FATB-Al, fatB-a2/fatB-a2, fatB-a3/fatB-a3, fatB- cl/ fatB-cl, fatB-c2/fatB-c2, fatB-c3/fatB-c3.
Кроме того, настоящее изобретение относится к в последовательностям нуклеиновой кислоты дикого типа и к мутантным генам/аллелям FATB растений вида Brassica, а также к белкам FATB дикого типа и к мутантным белкам FATB. Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования и объединения мутантных аллелей FATB и аллелей FATB дикого типа в растениях Brassica, а также к растениям Brassica и их частям, содержащим конкретные комбинации аллелей FATB дикого типа и мутантных аллелей FATB в своем геноме, где из семян указанных растений может быть получено масло,
- 18 030862 содержащее низкий уровень насыщенных жирных кислот или не содержащее насыщенных жирных кислот, и где указанные растения предпочтительно обнаруживают нормальный рост и имеют нормальный фенотип. Использование этих растений для переноса мутантных аллелей FATB в другие растения также является вариантом настоящего изобретения, поскольку в результате могут быть получены продукты любого из описанных здесь растений. Кроме того, настоящее изобретение относится к наборам для селекции и к способам селекции с использованием маркера (MAS) для объединения или детектирования генов и/или аллелей FATB. Каждый из вариантов изобретения более подробно описан ниже.
Последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению
Настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты дикого типа (FATB), кодирующим функциональные белки FATB, и к мутантным последовательностям нуклеиновой кислоты (fatB) (содержащим одну или несколько мутаций, а предпочтительно мутаций, которые приводят к значительному снижению биологической активности кодируемого белка FATB или к прекращению продуцирования белка FATB) генов FATB растения вида Brassica, в частности Brassica napus, a также от других сельскохозяйственных культур Brassica. Так, например, растение вида Brassica, содержащее геном А и/или С, может содержать различные аллели генов FATB-A или FATB-C, которые могут быть идентифицированы и объединены в одном растении согласно изобретению. Кроме того, мутации в аллели FATB дикого типа могут быть введены методами мутагенеза, в результате чего могут быть получены мутантные аллели, используемые в настоящем изобретении. Поскольку специфические аллели FATB предпочтительно объединяют в растении Brassica napus посредством скрещивания и селекции, то в одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты FATB и/или fatB, присутствующим в растении Brassica (то есть эндогенным), которое может быть скрещено с растением Brassica napus, или которое может быть использовано для выращивания синтетического растения Brassica napus. Скрещивание различных видов Brassica описано в литературе, например, в публикации Snowdon (2007, Chromosome research 15: 85-95). Межвидовое скрещивание может быть применено, например, для переноса генов, например, из генома С растения В. napus (AACC) в геном С растения В. carinata (BBCC), или даже из генома С растения В. napus (AACC) в геном В растения В. juncea (AABB) (в результате спорадического события незаконной рекомбинации между их геномами С и В). Повторно синтезированные или синтетические линии Brassica napus могут быть продуцированы путем скрещивания исходных предков В. oleracea (CC) и В. rapa (AA). При межвидовом, а также межродовом скрещивании, барьеры несовместимости могут быть успешно преодолены у кроссов, полученных от сельскохозяйственных культур Brassica и родственных им культур, например, методами спасения эмбриона или слияния протопластов (например, Snowdon, см. выше).
Однако выделенные последовательности нуклеиновой кислоты FATB и fatB (например, выделенные из растений путем клонирования или путем конструирования посредством синтеза ДНК), а также любые их варианты и фрагменты также входят в объем настоящего изобретения, поскольку они могут быть использованы для определения эндогенно присутствующей последовательности в растении или в его части, независимо от того, кодирует ли данная последовательность функциональный белок или белок, обладающий значительно пониженной функциональной активностью, или не обладающий такой активностью (например, путем экспрессии в рекомбинантных клетках-хозяевах и в ферментных анализах), и для отбора и переноса специфических аллелей из одного растения Brassica в другое растение, с получением растения, имеющего нужную комбинацию функциональных и мутантных аллелей.
Последовательности нуклеиновой кислоты FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3 были выделены из озимого масличного рапса Brassica napus (WOSR) и ярового масличного рапса (SOSR), как указано в списке последовательностей. Последовательности FATB дикого типа указаны в списке последовательностей, а мутантные последовательности fatB, входящие в состав этих последовательностей, и последовательности, в основном, аналогичные этим последовательностям, описаны ниже и в примерах настоящей заявки со ссылками на последовательности FATB дикого типа. Геномная ДНК, кодирующая белок FATB, и соответствующая пре-мРНК содержит 5 экзонов (экзоны 1-5, начиная с 5'-конца), прерываемых 4 интронами (интронами 1-4, начиная с 5'-конца). В кДНК и в соответствующей процессированной мРНК (то есть в сплайсированной РНК) интроны удалены и присоединены экзоны, как указано в списке последовательностей. Последовательности экзонов являются эволюционно более консервативными, а поэтому они являются менее вариабельными, чем интронные последовательности интронов.
Последовательности нуклеиновой кислоты FATB-A1 или последовательности нуклеиновой кислоты варианта FATB-A1 согласно изобретению представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 2 (WOSR FATB-A1) при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептидапереносчика и/или последовательности SEQ ID NO: 14 (SOSR FATB-A1), при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, или последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 1 (WOSR FATB-A1), при выравнивании в при
- 19 030862 сутствии или в отсутствии интронов 1-4, и/или последовательности SEQ ID NO: 13 (SOSR FATB-A1), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4. Эти последовательности нуклеиновой кислоты могут также называться последовательностями, которые по существу, аналогичны или по существу, идентичны последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
Последовательности нуклеиновой кислоты FATB-A2 или последовательности нуклеиновой кислоты варианта FATB-A2 согласно изобретению представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 4 (WOSR FATB-A2) при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептидапереносчика, и/или последовательности SEQ ID NO: 16 (SOSR FATB-A2), при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, или последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 3 (WOSR FATB-A2), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4, и/или последовательности SEQ ID NO: 15 (SOSR FATB-A2), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4. Эти последовательности нуклеиновой кислоты могут также называться последовательностями, которые по существу, аналогичны или по существу, идентичны последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
Последовательности нуклеиновой кислоты FATB-A3 или последовательности нуклеиновой кислоты варианта FATB-A3 согласно изобретению представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 6 (WOSR FATB-A3), при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептидапереносчика, и/или последовательности SEQ ID NO: 18 (SOSR FATB-A3), при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, или последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 5 (WOSR FATB-A3), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4, и/или последовательности SEQ ID NO: 17 (SOSR FATB-A3), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4. Эти последовательности нуклеиновой кислоты могут также называться последовательностями, которые по существу, аналогичны или по существу, идентичны последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
Последовательности нуклеиновой кислоты FATB-C1 или последовательности нуклеиновой кислоты варианта FATB-C1 согласно изобретению представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 8 (WOSR FATB-C1), при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептидапереносчика, и/или последовательности SEQ ID NO: 20 (SOSR FATB-C1), при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, или последовательностей нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 7 (WOSR FATB-C1), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4, и/или последовательности SEQ ID NO: 19 (SOSR FATB-C1), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4. Эти последовательности нуклеиновой кислоты могут также называться последовательностями, которые по существу, аналогичны или по существу, идентичны последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
Последовательности нуклеиновой кислоты FATB-C2 или последовательности нуклеиновой кислоты варианта FATB-C2 согласно изобретению представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 10 (WOSR FATB-C2), при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика и/или последовательности SEQ ID NO: 22 (SOSR FATB-C2), при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, или последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 9 (WOSR FATB-C2), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4, и/или последовательности SEQ ID NO: 21 (SOSR FATB-C2), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4. Эти последовательности нуклеиновой кислоты могут также называться последовательностями, которые по существу, аналогичны или по существу, идентичны последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
Последовательности нуклеиновой кислоты FATB-C3 или последовательности нуклеиновой кислоты варианта FATB-C3 согласно изобретению представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 12 (WOSR FATB-C3), при выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, и/или последовательности SEQ ID NO: 24 (SOSR FATB-C3), при выравнивании в при
- 20 030862 сутствии или в отсутствии пептида-переносчика, или последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 11 (WOSR FATB-C3), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4, и/или последовательности SEQ ID NO: 23 (SOSR FATB-C3), при выравнивании в присутствии или в отсутствии интронов 1-4. Эти последовательности нуклеиновой кислоты могут также называться последовательностями, которые по существу, аналогичны или по существу, идентичны последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
Таким образом, настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональные белки FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3 данного типа, включая их варианты и фрагменты (более подробно описанные ниже), а также к мутантным вариантам любых указанных последовательностей нуклеиновой кислоты, где указанная мутация в последовательности нуклеиновой кислоты предпочтительно приводит к инсерции, делеции или замене одной или нескольких аминокислот по сравнению с белком дикого типа. Предпочтительно указанная(ые) мутация(и) в последовательности нуклеиновой кислоты приводит(ят) к модификации одной или нескольких аминокислот (то есть к инсерции, делеции и/или замене одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности дикого типа), и тем самым к значительному снижению биологической активности белка FATB. Термин значительное снижение биологической активности мутантного белка FATB означает снижение ферментативной активности (то есть ацил-АСР-тиоэстеразной активности) по меньшей мере на 30, по меньшей мере на 40, 50 или более, по меньшей мере на 90 или на 100% (отсутствие биологической активности) по сравнению с активностью белка дикого типа.
Настоящее изобретение относится к эндогенным и выделенным последовательностям нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение также относится к фрагментам последовательностей FATB и к последовательностям нуклеиновой кислоты варианта FATB, определенным выше, которые могут быть использованы в качестве праймеров или зондов, а также в качестве компонентов наборов согласно другому аспекту изобретения (также см. ниже). Фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты FATB или fatB или ее варианта (определенного в настоящей заявке) может иметь различные длины, например по меньшей мере 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 смежных нуклеотидов последовательности FATB или fatB (или ее варианта).
Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие функциональные белки FATB.
Последовательности нуклеиновой кислоты, представленные в списке последовательностей, кодируют функциональные белки FATB дикого типа от растения Brassica napus. Таким образом, эти последовательности являются эндогенными для растений WOSR и SOSR, из которых они были выделены. Другие виды растения Brassica, а также его сорта, линии скрещивания или разновидности дикого типа могут быть скринированы на другие аллели FATB, кодирующие те же самые белки FATB или их варианты. Так, например, идентификация аллелей FATB, которые являются эндогенными для других растений и тканей Brassica, таких как различные роста, линии или разновидности Brassica napus, может быть осуществлена методами гибридизации нуклеиновых кислот (например, с помощью Саузерн-блот-анализа, проводимого в жестких условиях гибридизации) или ПЦР-методами, а растения и ткани Brassica juncea (в частности, аллели FATB на геноме А), Brassica carinata (в частности, аллели FATB на геноме С), Brassica rapa (геном А) и Brassica oleracea (геном С) могут быть скринированы на другие аллели FATB дикого типа. Для скрининга таких растений или их тканей на присутствие аллелей FATB могут быть использованы последовательности нуклеиновой кислоты FATB, представленные в списке последовательностей, или варианты или фрагменты любых из этих последовательностей. Так, например, полноразмерные последовательности или их фрагменты могут быть использованы в качестве зондов или праймеров. Так, например, для амплификации последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих белки FATB, происходящие от геномной ДНК растения или его ткани, могут быть использованы специфические или вырожденные праймеры. Эти последовательности нуклеиновой кислоты FATB могут быть выделены и секвенированы стандартными методами молекулярной биологии. Для характеризации аллеля(ей), например, для того, чтобы определить, какая последовательность аллеля FATB соответствует белку FATB или его варианту, и какой белок FATB или его вариант кодируется данной последовательностью, может быть применен биоинформационный анализ.
Факт кодирования функционального белка FATB последовательностью нуклеиновой кислоты может быть установлен методами рекомбинантных ДНК, известными специалистам, например, по экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах (например, в бактериях, таких как E.coli) с последующим анализом ацил-АСР-тиоэстеразной активности и/или специфичности полученного белка или клеток к субстрату. Так, например, гидролиз (жирный ацил)-АСР после рекомбинантной экспрессии в Е. coli описан в публикациях Doermann et al., 2000 (Plant Physiology, 123: 637-643) и Doermann et al. 1995 (Arch Biochem Biophys, 316: 612-618), Yuan et al. (1995, PNAS, Vol. 92: 10639-10643), Salas and Ohlrogge (2002, Archives of Biochemistry and Biophysics, 403:25-34) и Mayer and Shanklin (2007, BMC Plant Biology, 7(1): 1-11). Кроме того, анализы на гидролиз (жирный ацил)-АСР, проводимые с использованием неочищенных гомогенатов ткани растений, были описаны в публикациях Eccleston and Ohlrogge (for C12:0- and C18:1-ACP hydrolysis; 1998, Plant Cell, 10: 613-622), Salas and Ohlrogge (2002, Archives of Biochemistry and
- 21 030862
Biophysics 403:25-34) и Bonaventure et al. (for C16:0-ACP and C18:1-ACP hydrolysis; 2003, Plant Cell, 15:1020-1033).
Кроме того, следует отметить, что последовательности нуклеиновой кислоты FATB и их варианты (или фрагменты любых таких последовательностей) могут быть идентифицированы in silico путем скрининга баз данных нуклеиновых кислот в основном на аналогичные последовательности. Аналогичным образом, последовательность нуклеиновой кислоты может быть синтезирована химическим методом. Настоящее изобретение также относится к фрагментам молекул нуклеиновых кислот согласно изобретению, более подробно описанным ниже. Такими фрагментами являются последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие только зрелый белок или меньшие фрагменты, содержащие все последовательности экзонов и/или интронов или их части и т.п.
Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие мутантные белки FATB.
Последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие одну или несколько нуклеотидных делеций, инсерций или замен по сравнению с последовательностями нуклеиновой кислоты дикого типа, являются другим вариантом настоящего изобретения, поскольку они представляют собой фрагменты таких мутантных молекул нуклеиновой кислоты. Такие мутантные последовательности нуклеиновой кислоты (называемые последовательностями fatB) могут быть получены и/или идентифицированы различными известными методами, более подробно описанными ниже. И в данном случае, такие молекулы нуклеиновой кислоты получают в эндогенной и в выделенной форме. В одном из вариантов изобретения мутация(и) приводит(ят) к одной или к нескольким модификациям (делециям, инсерциям и/или заменам) в аминокислотной последовательности кодируемого белка FATB (то есть такая мутация не является молчащей мутацией). В другом варианте изобретения, мутация(и) в последовательности нуклеиновой кислоты приводит(ят) к значительному снижению или к полной элиминации биологической активности кодируемого белка FATB по сравнению с белком дикого типа.
Так, например, молекулы нуклеиновой кислоты могут содержать одну или несколько мутаций, таких как:
(a) миссенс-мутация, которая представляет собой модификацию в последовательности нуклеиновой кислоты, приводящую к замене одной аминокислоты другой аминокислотой;
(b) нонсенс-мутация или мутация с образованием стоп-кодона, которая представляет собой модификацию в последовательности нуклеиновой кислоты, приводящую к введению преждевременного стоп-кодона, и таким образом, к терминации трансляции (приводящей к образованию усеченного белка); а поскольку гены растений содержат кодоны терминации трансляции TGA (UGA в РНК), ТАА (UAA в РНК) и TAG (UAG в РНК), то любые нуклеотидные замены, инсерции и делеции, приводящие к образованию одного из этих кодонов транслируемой зрелой мРНК (с сохранением рамки считывания), будут обеспечивать терминацию трансляции.
(c) инсерционная мутация одной или нескольких аминокислот, вносимая путем добавления одного или нескольких кодонов в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты;
(d) делеционная мутация одной или нескольких аминокислот, вносимая путем делеции одного или нескольких кодонов в кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты;
(e) мутация со сдвигом рамки считывания, приводящая к трансляции последовательности нуклеиновой кислоты в другой рамке считывания, расположенной ниже данной мутации. Мутация со сдвигом рамки считывания может возникать по различным причинам, таким как инсерция, делеция или удвоение одного или более нуклеотидов, а мутации, которые также влияют на пре-мРНК-сплайсинг (мутации сайта сплайсинга), могут приводить к сдвигу рамки считывания;
(f) мутация сайта сплайсинга, которая изменяет или элиминирует нормальный сплайсинг последовательности пре-мРНК, что приводит к образованию белка, имеющего аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности дикого типа. Так, например, один или несколько экзонов в процессе РНК-сплайсинга могут быть пропущены, что приводит к образованию белка, в котором отсутствуют аминокислоты, кодируемые пропущенными экзонами. Альтернативно, рамка считывания может изменяться в результате неправильного сплайсинга, либо могут сохраняться один или несколько интронов, либо могут быть продуцированы альтернативные доноры или акцепторы сплайсинга, либо сплайсинг может инициироваться в альтернативном положении (например, в интроне), либо могут продуцироваться альтернативные сигналы полиаденилирования. Правильно осуществляемый сплайсинг пре-мРНК представляет собой сложный процесс, на который могут влиять различные мутации в нуклеотидной последовательности FATB-кодирующего гена. В высших эукариотах, таких как растения, главная сплайсома осуществляет сплайсинг интронов, содержащих GU в 5'-сайте сплайсинга (донорном сайте) и AG в 3'-сайте сплайсинга (акцепторном сайте). Согласно GU-AG-правилу (или GT-AGправилу; см. Lewin, Genes VI, Oxford University Press 1998, pp885-920, ISBN 0198577788), составляют примерно 99% сайтов сплайсинга ядерных эукариотических генов, а интроны, содержащие другие динуклеотиды у 5'- и 3'-сайта сплайсинга, такие как GC-AG и AU-AC составляют примерно лишь 1 и 0,1% соответственно.
Как уже упоминалось выше, желательно, чтобы мутация(и) в последовательности нуклеиновой кислоты, предпочтительно приводила к образованию мутантного белка, обладающего значительно пони
- 22 030862 женной ферментативной активностью или вообще не обладающего такой активностью in vivo. В основном, любая мутация, которая приводит к образованию белка, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную инсерцию, делецию и/или замену по сравнению с белком дикого типа, может значительно снижать ферментативную активность или элиминировать такую активность. Однако следует отметить, что мутации в некоторых частях белка, по всей вероятности, приводят к ослаблению функции мутантного белка FATB, например такие мутации приводят к продуцированию усеченных белков, в которых отсутствуют значительные части функциональных доменов, таких как каталитический домен.
Описанные здесь белки FATB Brassica имеют длину примерно в 412-424 аминокислот и содержат ряд структурных (и функциональных) доменов. Такими доменами являются: N-концевой пластидный пептид-мишень размером примерно 60 аминокислот, за которыми следует гидрофобная область длиной примерно 18 аминокислот (предположительно образующая спиральный трансмембранный якорь). Такая N-концевая часть содержит всего приблизительно 90 аминокислот, а за ней расположен зрелый белок FATB (начиная с N-концевых аминокислот LPDWSM). Этот белок содержит тандемный повтор, состоящий из спирального домена/4-цепочечного складчатого домена (домена НЕЕЕЕ или домена 4НВТ, также называемого мотивом хот-дог), разделенных линкерной областью (Mayer and Shanklin, 2005, J. Biol. Chem., 280(5): 3621-3627). Первый (N-концевой) спиральный домен/4-цепочечный складчатый домен (который кодируется частью экзона 1, целым экзоном 2 и 3, и частью экзона 4) содержит аминокислотные остатки, которые предположительно влияют на специфичность к субстрату, в частности такими аминокислотными остатками являются два консервативных метионина (Met или М), консервативный лизин (Lys или K), консервативный валин (Val или V), и консервативный серии (Ser или S) (Mayer and Shanklin, 2007, ВМС Plant Biology, 7(1):1-11), а второй (C-концевой) спиральный/4-цепочечный складчатый домен (кодируемый главным образом экзоном 5) содержит каталитические аминокислотные остатки, в частности папаин-подобную каталитическую триаду из консервативного аспарагинового (Asn или N) остатка, консервативного гистидинового (His или Н) остатка и консервативного цистеина (Cys или С). Такая каталитическая триада расположена во втором спиральном домене/4-цепочечном складчатом домене, кодируемом экзоном 5 указанного белка. Второй домен НЕЕЕЕ содержит дополнительные аминокислотные остатки, которые, предположительно, влияют на специфичность к субстрату, и такими аминокислотными остатками являются, в частности, консервативный триптофан (Trp или W) (Mayer and Shanklin, 2007, см. выше).
Таблица 1а
Белки FATB WOSR - области и положения аминокислот (а.к.)
FATB-A1 SF.Q ID:2 FATB-A2 SF.Q ID:4 FATB-A3 SF.Q IDA FATB-C1 SF.Q ID: 8 FATB-C2 SF,QID:10 FATB-C3 SF.QID:12 AtFATB SF.QID:80
Размер белка (а.к.) 414 424 415 412 415 415 412
N-концевой 1-90 1-90 1-91 1-88 1-90 1-91 1-88
Зрелый белок 91-414 91-424 92-415 89-412 91-415 92-415 89-412
а.к. кодируемые экзоном 1 1-168 1-168 1-169 1-166 1-168 1-169 1-166
а.к. кодируемые экзоном 2 169-213 169-213 170-214 167-211 169-213 170-214 167-211
а.к. кодируемые экзоном 3 214-251 214-251 215-252 212-249 214-251 215-252 212-249
а.к. кодируемые экзоном 4 252-308 252-308 253-309 250-306 252-308 253-309 250-306
а.к. кодируемые экзоном 5 309-414 309-424 310-415 307-412 309-415 310-415 207-412
4НВТ 140-277 140-277 141-278 138-275 140-277 141-278 138-275
линкер 278-302 278-302 279-303 276-300 278-302 279-303 276-300
4НВТ 303-407 303-407 304-408 301-405 303-407 304-408 301-405
Консервативные Met (М) 164 164 165 162 164 165 162
Lys (К) 176 176 177 174 176 177 174
Val (V) 200 200 201 198 200 201 198
Met (Μ) 231 231 232 229 231 232 229
Ser(S) 264 264 265 262 264 265 262
Trp (W) 311 311 312 309 311 312 309
Asn (N) 317 317 318 315 317 318 315
His (H) 319 319 320 317 319 320 317
Cys (C) 354 354 355 352 354 355 352
- 23 030862
Таблица 1b
Белки FATB SOSR области и положения аминокислот (а.к.)
FATB-A1 SEQ ID: 14 FATB-A2 SEQ ID: 16 FATB-A3 SEQ ID: 18 FATB-C1 SEQ ID:20 FATB-C2 SEQ ID:22 FATB-C3 SEQ ID:24
Размер белка (а.к.) 413 415 415 412 415 415
N-концевой 1-89 1-90 1-91 1-88 1-90 1-91
Зрелый белок 90-413 91-415 92-415 89-412 91-415 92-415
а.к. кодируемые экзоном 1 1-167 1-168 1-169 1-166 1-168 1-169
а.к. кодируемые экзоном 2 168-212 169-213 170-214 167-211 169-213 170-214
а.к. кодируемые экзоном 3 213-250 214-251 215-252 212-249 214-251 215-252
а.к. кодируемые экзоном 4 251-307 252-308 253-309 250-306 252-308 253-309
а.к. кодируемые экзоном 5 308-413 309-415 310-415 307-412 309-415 310-415
4НВТ 139-276 140-277 141-278 138-275 140-277 141-278
линкер 277-301 278-302 279-303 276-300 278-302 279-303
4НВТ 302-406 303-407 304-408 301-405 303-407 304-408
Консервативные Met (М) 163 164 165 162 164 165
Lys (К) 175 176 177 174 176 177
Val (V) 199 200 201 198 200 201
Met (Μ) 230 231 232 229 231 232
Ser(S) 263 264 265 262 264 265
Tip (W) 310 311 312 309 311 312
Asn (N) 316 317 318 315 317 318
His (H) 318 319 320 317 319 320
Cys (C) 353 354 355 352 354 355
Таким образом, в одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, содержащим одну или несколько мутаций любых типов, описанных выше. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к последовательностям fatB, содержащим одну или несколько делеционных мутаций, одну или несколько мутаций, приводящих к образованию стопкодона (нонсенс-мутаций), и/или одну или несколько мутаций сайта сплайсинга. Настоящее изобретение относится к любой из вышеуказанных мутантных последовательностей нуклеиновой кислоты, полученных per se (в изолированной форме), поскольку такие последовательности являются эндогенными для растений и их частей.
Используемый здесь термин делеционная мутация в аллеле FATB означает мутацию в аллеле FATB, где по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 200, 500, 1000 или более оснований делетированы из соответствующего аллеля FATB дикого типа, и где указанная делеция приводит к образованию мутантного аллеля FATB, транскрибируемого и транслируемого в мутантный белок, который обладает значительно пониженной активностью in vivo или вообще не обладает такой активностью. Делеция может приводить к сдвигу рамки считывания и/или она может вводить преждевременный стоп-кондон, либо она может приводить к удалению одной или нескольких аминокислот (например, крупных частей) кодируемой последовательности и т.п. Точный молекулярный механизм, лежащий в основе процесса, благодаря которому делеция приводит к образованию мутантного белка, обладающего значительно пониженной биологической активностью, не имеет важного значения. Настоящее изобретение также относится к растениям и их частям, в которых специфические аллели FATB полностью делетированы, то есть к растениям и их частям, в которых отсутствуют один или несколько аллелей FATB.
Используемый здесь термин нонсенс-мутация в аллеле FATB означает мутацию в аллеле FATB, где в кодирующую ДНК и в соответствующую последовательность мРНК соответствующего аллеля FATB дикого типа вводят один или несколько кодонов терминации трансляции. Кодонами терминации трансляции являюся TGA (UGA в мРНК), ТАА (UAA) и TAG (UAG). Таким образом, любая мутация (делеция, инсерция или замена), которая приводит к образованию стоп-кодона в той же рамке считывания кодирующей последовательности (последовательности экзона), будет приводить к терминации трансляции и к усечению аминокислотной цепи. В одном из вариантов изобретения, мутантный аллель FATB, содержащий нонсенс-мутацию, представляет собой аллель FATB, где стоп-конон вводят с сохранением рамки считывания в последовательность кодона FATB посредством замены одного нуклеотида, такой как CAG х TAG, TGG х TAG, TGG х TGA или CGA х TGA. В другом варианте изобретения, мутантный аллель FATB, содержащий нонсенс-мутацию, представляет собой аллель FATB, где стопконон вводят с сохранением рамки считывания в последовательность кодона FATB посредством замены двух нуклеотидов, такой как CAG х ТАА, TGG х ТАА, CGG х TAG или TGA, CGA х ТАА. В еще одном варианте изобретения, мутантный аллель FATB, содержащий нонсенс-мутацию, представляет собой аллель FATB, где стоп-конон вводят с сохранением рамки считывания в последовательность кодона FATB посредством замены трех нуклеотидов, такой как CGG х ТАА. Усеченный белок не содержит аминокислот, кодируемых кодирующей ДНК, расположенной ниже такой мутации (то есть C-концевая часть белка FATB), но сохраняет аминокислоты, кодируемые кодирующей ДНК, расположенной выше такой мутации (то есть N-концевая часть белка FATB). В одном из вариантов изобретения нонсенсмутация присутствует в любом положении перед консервативным остатком Cys каталитической триады,
- 24 030862 а поэтому по меньшей мере консервативный остаток Cys отсутствует, что приводит к значительному снижению активности усеченного белка. Такой мутантный белок является более усеченным по сравнению с белком дикого типа, и вероятно, что такой белок не будет обладать какой-либо ферментативной активностью. Таким образом, в другом своем варианте настоящее изобретение относится к мутантному аллелю FATB, содержащему нонсенс-мутацию, которая приводит к образованию усеченного белка, содержащего менее чем 350 аминокислот (где отсутствует консервативный Cys), менее чем 315 аминокислот (где отсутствуют все три консервативных аминокислоты, происходящие от папаин-подобной каталитической триады), менее чем 300 аминокислот (где отсутствует второй домен 4НВТ), менее чем 262 аминокислоты (где отсутствует консервативный Ser), менее чем 229 аминокислот (где отсутствует второй консервативный Met), менее чем 198 аминокислот (где отсутствует консервативный Val), менее чем 174 аминокислоты (где отсутствует консервативный Lys), менее чем 162 аминокислоты (где отсутствует первый консервативный Met) или даже меньшее число аминокислот. В еще одном варианте изобретения, нонсенс-мутация приводит к образованию одного или нескольких экзонов, не транслирующихся в белок, таких как экзон 5, экзоны 4 и 5, экзоны 3-5, или даже большего числа экзонов.
В таблицах, представленных ниже, приводится ряд возможных нонсенс-мутаций в последовательностях Brassica napus, описанных в настоящей заявке.
Таблица 2а
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-A1 (WOSR, SEQ ID NO: 1 и 2)
Число экзонов Положения
аминокислот
экзон 1 53
экзон 1
экзон 1 79
экзон 1
экзон 1 90
экзон 1
экзон 1 94
экзон 1
экзон 1
экзон 1 111
экзон 1
экзон 1 112
экзон 1
экзон 1
экзон 1 117
экзон 1
Положения Дикий тип
нуклеотидов мутантный кодон
157 сад —l· tag
157+159 сад taa
235 сад tag
235+237 сад taa
268 сад tag
268+270 сад taa
281 tgg tag
282 tgg tga
281+282 tgg taa
331 сад tag
331+333 сад taa
335 tgg —> tag
336 tgg —> tga
335+336 tgg —> taa
350 tgg tag
351 tgg tga
- 25 030862
экзон 1 350+351 tgg —> taa
экзон 1 136 406 сад —> tag
экзон 1 406+408 сад —> taa
экзон 1 143 427 сад —> tag
экзон 1 427+429 сад -о taa
экзон 1 148 442+443 egg —> tag
экзон 1 442+444 egg —> tga
экзон 1 442+443+444 egg —> taa
экзон 1 168 502 сад —> tag
экзон 1 502+504 сад —> taa
экзон 2 198 678 tgg —> tag
экзон 2 679 tgg —> tga
экзон 2 678+679 tgg —> taa
экзон 2 204 695 сад —> tag
экзон 2 695+697 сад —> taa
экзон 2 213 723 tgg -o tag
экзон 3 798 tgg -o tga
экзон 2-3 723+798 tgg -o taa
экзон 3 222 824 tgg -o tag
экзон 3 825 tgg —> tga
экзон 3 824+825 tgg —> taa
экзон 3 225 832 сад —> tag
экзон 3 832+834 сад —> taa
экзон 3 235 863 tgg —> tag
экзон 3 864 tgg -o tga
экзон 3 863+864 tgg -o taa
экзон 3 238 871 cga -o tga
экзон 3 871+872 cga -o taa
экзон 4 253 986 tgg —> tag
экзон 4 987 tgg —> tga
- 26 030862
экзон 4 986+987 tgg —> taa
экзон 4 271 1039 cga -о tga
экзон 4 1039+1040 cga -о taa
экзон 5 311 1250 tgg —> tag
экзон 5 1251 tgg -o tga
экзон 5 1250+1251 tgg -o taa
экзон 5 318 1270 cag -o tag
экзон 5 1270+1272 cag -o taa
экзон 5 328 1301 tgg -o tag
экзон 5 1302 tgg -o tga
экзон 5 1301+1302 tgg -o taa
экзон 5 341 1339 cag -o tag
экзон 5 1339+1341 cag -o taa
экзон 5 361 1399 cag -o tag
экзон 5 1399+1401 cag -o taa
экзон 5 383 1465 cag -o tag
экзон 5 1465+1467 cag -o taa
экзон 5 389 1483 cag -o tag
экзон 5 1483+1485 cag -o taa
экзон 5 401 1520 tgg -o tag
экзон 5 1521 tgg -o tga
экзон 5 1520+1521 tgg —> taa
экзон 5 410 1547 tgg —> tag
экзон 5 1548 tgg -o tga
экзон 5 1547+1548 tgg -o taa
- 27 030862
Таблица 2b
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-A1 (SOSR, SEQ ID NO: 13 и 14)
Число экзонов Положения Положения Дикий тип
аминокислот нуклеотидов мутантный кодон
экзон 1 53 157 сад tag
экзон 1 157+159 сад taa
экзон 1 78 232 сад tag
экзон 1 232+234 сад taa
экзон 1 89 265 сад tag
экзон 1 265+267 сад taa
экзон 1 93 278 tgg tag
экзон 1 279 tgg tga
экзон 1 278+279 tgg taa
экзон 1 110 328 сад tag
экзон 1 328+330 сад taa
экзон 1 111 332 tgg tag
экзон 1 333 tgg —> tga
экзон 1 332+333 tgg —> taa
экзон 1 116 347 tgg —> tag
экзон 1 348 tgg —> tga
экзон 1 347+348 tgg —> taa
экзон 1 135 403 сад —l· tag
экзон 1 403+405 сад taa
экзон 1 142 424 сад —l· tag
экзон 1 424+426 сад taa
экзон 1 147 439+440 egg —l· tag
экзон 1 439+441 egg —l· tga
экзон 1 439+440+441 egg —l· taa
экзон 1 167 499 сад tag
экзон 1 499+501 сад taa
- 28 030862
экзон 2 197 675 tgg —> tag
экзон 2 676 tgg —> tga
экзон 2 675+676 tgg —> taa
экзон 2 203 692 cag —l· tag
экзон 2 692+694 cag —> taa
экзон 2 212 720 tgg —> tag
экзон 3 795 tgg —> tga
экзон 2-3 720+795 tgg —> taa
экзон 3 221 821 tgg —> tag
экзон 3 822 tgg —> tga
экзон 3 821+822 tgg —> taa
экзон 3 224 829 cag —l· tag
экзон 3 829+831 cag -o taa
экзон 3 234 860 tgg —> tag
экзон 3 861 tgg -o tga
экзон 3 860+861 tgg -o taa
экзон 3 237 868 cga -o tga
экзон 3 868+869 cga -o taa
экзон 4 252 983 tgg -o tag
экзон 4 984 tgg —> tga
экзон 4 983+984 tgg —> taa
экзон 4 270 1036 cga —l· tga
экзон 4 1036+1037 cga -o taa
экзон 5 310 1247 tgg —> tag
экзон 5 1248 tgg -o tga
экзон 5 1247+1248 tgg -o taa
экзон 5 317 1267 cag -o tag
экзон 5 1267+1269 cag -o taa
экзон 5 327 1298 tgg —> tag
экзон 5 1299 tgg —> tga
- 29 030862
экзон 5 1298+1299 tgg -У taa
экзон 5 340 1336 сад —> tag
экзон 5 1336+1338 сад —l· taa
экзон 5 360 1396 сад —> tag
экзон 5 1396+1398 сад —l· taa
экзон 5 382 1462 сад —> tag
экзон 5 1462+1464 сад taa
экзон 5 388 1480 сад tag
экзон 5 1480+1482 сад taa
экзон 5 400 1517 tgg tag
экзон 5 1518 tgg tga
экзон 5 1517+1518 tgg -У taa
экзон 5 409 1544 tgg tag
экзон 5 1545 tgg tga
экзон 5 1544+1545 tgg taa
Таблица 3 a
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-A2 (WOSR, SEQ ID NO: 3 и 4)
Число экзонов Положения Положения Дикий тип -У
аминокислот нуклеотидов мутантный кодон
экзон 1 52 154 сад tag
экзон 1 154+156 сад taa
экзон 1 79 235 сад tag
экзон 1 235+237 сад taa
экзон 1 90 268 сад tag
экзон 1 268+270 сад taa
экзон 1 94 281 tgg tag
экзон 1 282 tgg —> tga
экзон 1 281+282 tgg —> taa
экзон 1 111 331 сад —> tag
- 30 030862
экзон 1 331+333 сад taa
экзон 1 112 335 tgg —> tag
экзон 1 336 tgg —> tga
экзон 1 335+336 tgg —> taa
экзон 1 117 350 tgg —> tag
экзон 1 351 tgg —> tga
экзон 1 350+351 tgg —> taa
экзон 1 136 406 сад —> tag
экзон 1 406+408 сад —> taa
экзон 1 143 427 сад —> tag
экзон 1 427+429 сад taa
экзон 1 168 502 сад —l· tag
экзон 1 502+504 сад taa
экзон 2 198 672 tgg —> tag
экзон 2 673 tgg tga
экзон 2 672+673 tgg taa
экзон 2 204 689 сад tag
экзон 2 689+691 сад taa
экзон 2 213 717 tgg tag
экзон 3 812 tgg —> tga
экзон 2-3 717+812 tgg —> taa
экзон 3 222 838 tgg —> tag
экзон 3 839 tgg —> tga
экзон 3 838+839 tgg —> taa
экзон 3 225 846 сад tag
экзон 3 846+848 сад taa
экзон 3 235 877 tgg tag
экзон 3 878 tgg tga
экзон 3 877+878 tgg —> taa
экзон 3 238 885+886 egg —l· tag
- 31 030862
экзон 3 885+887 egg —> tga
экзон 3 885+886+887 egg —> taa
экзон 3 248 915 ega —> tga
экзон 3 915+916 ega —> taa
экзон 4 253 1064 tgg —> tag
экзон 4 1065 tgg —> tga
экзон 4 1064+1065 tgg —> taa
экзон 4 271 1117 ega —> tga
экзон 4 1117+1118 ega —> taa
экзон 5 311 1316 tgg —> tag
экзон 5 1317 tgg —> tga
экзон 5 1316+1317 tgg —> taa
экзон 5 318 1336 cag —> tag
экзон 5 1336+1338 cag —> taa
экзон 5 328 1367 tgg —> tag
экзон 5 1368 tgg —> tga
экзон 5 1367+1368 tgg —> taa
экзон 5 341 1405 cag —> tag
экзон 5 1405+1407 cag —> taa
экзон 5 361 1465 cag —> tag
экзон 5 1465+1467 cag —> taa
экзон 5 383 1531 cag —> tag
экзон 5 1531+1533 cag —> taa
экзон 5 387 1543 ega —> tga
экзон 5 1543+1544 ega —> taa
экзон 5 389 1549 cag —> tag
экзон 5 1549+1551 cag —> taa
экзон 5 401 1586 tgg —> tag
экзон 5 1587 tgg —> tga
экзон 5 1586+1587 tgg —> taa
экзон 5 404 1594 cag —> tag
экзон 5 1594+1596 cag —> taa
экзон 5 410 1613 tgg —> tag
экзон 5 1614 tgg —> tga
экзон 5 1613+1614 tgg —> taa
- 32 030862
Таблица 3 b
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-A2 (SOSR, SEQ ID NO: 15 и 16)
Число экзонов Положения Положения Дикий тип -О
аминокислот нуклеотидов мутантный кодон
экзон 1 52 154 сад —> tag
экзон 1 154+156 сад —> taa
экзон 1 79 235 сад —> tag
экзон 1 235+237 сад —> taa
экзон 1 90 268 сад —> tag
экзон 1 268+270 сад —> taa
экзон 1 94 281 tgg —> tag
экзон 1 282 tgg -о tga
экзон 1 281+282 tgg —> taa
экзон 1 111 331 cag -o tag
экзон 1 331+333 cag -o taa
экзон 1 112 335 tgg -o tag
экзон 1 336 tgg -o tga
экзон 1 335+336 tgg -o taa
экзон 1 117 350 tgg -o tag
экзон 1 351 tgg -o tga
экзон 1 350+351 tgg -o taa
экзон 1 136 406 cag -o tag
экзон 1 406+408 cag -o taa
экзон 1 143 427 cag —l· tag
- 33 030862
экзон 1 427+429 сад —l· taa
экзон 1 168 502 сад —> tag
экзон 1 502+504 сад —l· taa
экзон 2 198 672 tgg —> tag
экзон 2 673 tgg —> tga
экзон 2 672+673 tgg —> taa
экзон 2 204 689 сад —> tag
экзон 2 689+691 сад —> taa
экзон 2 213 717 tgg —> tag
экзон 3 812 tgg —> tga
экзон 2-3 717+812 tgg —> taa
экзон 3 222 838 tgg —> tag
экзон 3 839 tgg —> tga
экзон 3 838+839 tgg —> taa
экзон 3 225 846 сад tag
экзон 3 846+848 сад taa
экзон 3 235 877 tgg tag
экзон 3 878 tgg tga
экзон 3 877+878 tgg taa
экзон 3 238 885+886 egg —l· tag
экзон 3 885+887 egg —l· tga
экзон 3 885+886+887 egg —l· taa
экзон 3 248 915 еда —l· tga
экзон 3 915+916 еда taa
экзон 4 253 1064 tgg tag
экзон 4 1065 tgg tga
экзон 4 1064+1065 tgg taa
экзон 4 271 1117 еда tga
экзон 4 1117+1118 еда taa
экзон 5 311 1316 tgg —> tag
- 34 030862
экзон 5 1317 tgg tga
экзон 5 1316+1317 tgg taa
экзон 5 318 1336 сад tag
экзон 5 1336+1338 сад taa
экзон 5 328 1367 tgg —> tag
экзон 5 1368 tgg —> tga
экзон 5 1367+1368 tgg —> taa
экзон 5 341 1405 сад —l· tag
экзон 5 1405+1407 сад taa
экзон 5 361 1465 сад tag
экзон 5 1465+1467 сад taa
экзон 5 383 1531 сад tag
экзон 5 1531+1533 сад taa
экзон 5 387 1543 cga —l· tga
экзон 5 1543+1544 cga taa
экзон 5 389 1549 сад —l· tag
экзон 5 1549+1551 сад taa
экзон 5 401 1586 tgg tag
экзон 5 1587 tgg tga
экзон 5 1586+1587 tgg taa
экзон 5 410 1613 tgg tag
экзон 5 1614 tgg tga
экзон 5 1613+1614 tgg —> taa
Таблица 4a
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-A3 (WOSR, SEQ ID NO: 5 и 6)
Число экзонов Положения Положения Дикий тип
аминокислот нуклеотидов мутантный кодон
экзон 1 52 154 саа taa
экзон 1 81 241 саа taa
- 35 030862
экзон 1 82 244 саа —> taa
экзон 1 91 271 сад —> tag
экзон 1 271+273 сад —> taa
экзон 1 95 284 tgg —> tag
экзон 1 285 tgg —> tga
экзон 1 284+285 tgg —> taa
экзон 1 112 334 cag —> tag
экзон 1 334+336 cag —> taa
экзон 1 113 338 tgg —> tag
экзон 1 339 tgg —> tga
экзон 1 338+339 tgg —> taa
экзон 1 137 409 cag —> tag
экзон 1 409+411 cag —> taa
экзон 1 144 430 cag —> tag
экзон 1 430+432 cag —> taa
экзон 1 169 505 cag —> tag
экзон 1 505+507 cag —> taa
экзон 2 199 828 tgg —> tag
экзон 2 829 tgg —> tga
экзон 2 828+829 tgg —> taa
экзон 2 205 845 cag —> tag
экзон 2 845+847 cag —> taa
экзон 2 214 873 tgg —> tag
экзон 3 947 tgg —> tga
экзон 2-3 873+947 tgg A taa
экзон 3 223 973 tgg —> tag
экзон 3 974 tgg —> tga
экзон 3 973+974 tgg A taa
экзон 3 236 1012 tgg —> tag
экзон 3 1013 tgg —> tga
- 36 030862
экзон 3 1012+1013 tgg —> taa
экзон 3 239 1020+1021 egg —> tag
экзон 3 1020+1022 egg —> tga
экзон 3 1020+1021+1022 egg —l· taa
экзон 4 254 1146 tgg —> tag
экзон 4 1147 tgg —> tga
экзон 4 1146+1147 tgg —> taa
экзон 4 272 1199 cga —> tga
экзон 4 1199+1200 cga —> taa
экзон 5 312 1420 tgg —> tag
экзон 5 1421 tgg —> tga
экзон 5 1420+1421 tgg —> taa
экзон 5 319 1440 cag —l· tag
экзон 5 1440+1442 cag -o taa
экзон 5 329 1471 tgg -o tag
экзон 5 1472 tgg -o tga
экзон 5 1471+1472 tgg -o taa
экзон 5 362 1569 cag -o tag
экзон 5 1569+1571 cag -o taa
экзон 5 384 1635 cag —l· tag
экзон 5 1635+1637 cag -o taa
экзон 5 388 1647 cga —l· tga
экзон 5 1647+1648 cga -o taa
экзон 5 390 1653 cag —l· tag
экзон 5 1653+1655 cag -o taa
экзон 5 399 1680 cga -o tga
экзон 5 1680+1681 cga -o taa
экзон 5 402 1690 tgg -o tag
экзон 5 1691 tgg —> tga
экзон 5 1690+1691 tgg —> taa
экзон 5 411 1717 tgg —> tag
экзон 5 1718 tgg —> tga
экзон 5 1717+1718 tgg —> taa
- 37 030862
Таблица 4b
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-A3 (SOSR, SEQ ID NO: 17 и 18)
Число экзонов Положения Положения Дикий тип -У
аминокислот нуклеотидов мутантный кодон
экзон 1 52 154 сад —> tag
экзон 1 154+156 сад —l· taa
экзон 1 81 241 саа —l· taa
экзон 1 82 244 саа —l· taa
экзон 1 91 271 сад —> tag
экзон 1 271+273 сад —l· taa
экзон 1 95 284 tgg —> tag
экзон 1 285 tgg —> tga
экзон 1 284+285 tgg —> taa
экзон 1 112 334 сад —> tag
экзон 1 334+336 сад —l· taa
экзон 1 113 338 tgg —> tag
экзон 1 339 tgg —> tga
экзон 1 338+339 tgg —> taa
экзон 1 137 409 сад —> tag
экзон 1 409+411 сад —l· taa
экзон 1 144 430 сад —> tag
экзон 1 430+432 сад —l· taa
экзон 1 169 505 сад tag
экзон 1 505+507 сад taa
экзон 2 199 828 tgg tag
экзон 2 829 tgg tga
- 38 030862
экзон 2 828+829 tgg —> taa
экзон 2 205 845 сад —l· tag
экзон 2 845+847 сад taa
экзон 2 214 873 tgg —> tag
экзон 3 947 tgg —> tga
экзон 2-3 873+947 tgg —> taa
экзон 3 223 973 tgg —> tag
экзон 3 974 tgg —> tga
экзон 3 973+974 tgg —> taa
экзон 3 236 1012 tgg —> tag
экзон 3 1013 tgg —> tga
экзон 3 1012+1013 tgg —> taa
экзон 4 254 1144 tgg —> tag
экзон 4 1145 tgg —> tga
экзон 4 1144+1145 tgg taa
экзон 4 272 1197 cga tga
экзон 4 1197+1198 cga taa
экзон 5 312 1402 tgg tag
экзон 5 1403 tgg tga
экзон 5 1402+1402 tgg —> taa
экзон 5 319 1422 сад —l· tag
экзон 5 1422+1424 сад taa
экзон 5 329 1453 tgg —> tag
экзон 5 1454 tgg —> tga
экзон 5 1453+1454 tgg taa
экзон 5 362 1551 сад tag
экзон 5 1551+1553 сад taa
экзон 5 384 1617 сад tag
экзон 5 1617+1619 сад taa
экзон 5 388 1629 cga —l· tga
экзон 5 1629+1630 cga taa
экзон 5 390 1635 сад tag
экзон 5 1635+1637 сад taa
экзон 5 399 1662 cga tga
экзон 5 1662+1663 cga taa
экзон 5 402 1672 tgg tag
экзон 5 1673 tgg tga
экзон 5 1672+1673 tgg taa
экзон 5 411 1699 tgg tag
экзон 5 1700 tgg tga
экзон 5 1699+1700 tgg taa
- 39 030862
Таблица 5 а
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-C1 (WOSR, SEQ ID NO: 7 и 8)
Число экзонов Положения Положения Дикий тип А
аминокислот нуклеотидов мутантный кодон
экзон 1 52 154 сад —> tag
экзон 1 154+156 сад —> taa
экзон 1 79 235 саа —> taa
экзон 1 88 262 сад —> tag
экзон 1 262+264 сад —> taa
экзон 1 92 275 tgg —> tag
экзон 1 276 tgg —> tga
экзон 1 275+276 tgg —> taa
экзон 1 109 325 cag —> tag
экзон 1 325+327 cag —> taa
экзон 1 110 329 tgg —> tag
экзон 1 330 tgg —> tga
экзон 1 329+330 tgg —> taa
экзон 1 115 344 tgg —> tag
- 40 030862
экзон 1 345 tgg —> tga
экзон 1 344+345 tgg —> taa
экзон 1 134 400 cag —> tag
экзон 1 400+402 cag -o taa
экзон 1 141 421 cag —> tag
экзон 1 421+423 cag —> taa
экзон 1 146 436+437 egg —> tag
экзон 1 436+438 egg —> tga
экзон 1 436+437+438 egg —> taa
экзон 1 166 496 cag —> tag
экзон 1 496+498 cag -o taa
экзон 2 196 667 tgg —> tag
экзон 2 668 tgg —> tga
экзон 2 667+668 tgg —> taa
экзон 2 202 684 cag -o tag
экзон 2 684+686 cag -o taa
экзон 2 211 712 tgg -o tag
экзон 3 791 tgg -o tga
экзон 2-3 712+791 tgg -o taa
экзон 3 220 817 tgg —> tag
экзон 3 818 tgg —> tga
экзон 3 817+818 tgg —> taa
экзон 3 223 825 cag —l· tag
экзон 3 825+827 cag -o taa
экзон 3 233 856 tgg -o tag
экзон 3 857 tgg -o tga
экзон 3 856+857 tgg -o taa
экзон 3 236 864 cga -o tga
экзон 3 864+865 cga -o taa
экзон 4 251 1000 tgg —> tag
- 41 030862
экзон 4 1001 tgg —> tga
экзон 4 1000+1001 tgg —> taa
экзон 4 269 1053 cga —> tga
экзон 4 1053+1054 cga taa
экзон 5 309 1259 tgg —> tag
экзон 5 1260 tgg —> tga
экзон 5 1259+1260 tgg —> taa
экзон 5 316 1279 сад —l· tag
экзон 5 1279+1281 сад taa
экзон 5 326 1310 tgg —> tag
экзон 5 1311 tgg —> tga
экзон 5 1310+1311 tgg —> taa
экзон 5 339 1348 сад —l· tag
экзон 5 1348+1350 сад taa
экзон 5 359 1408 сад —l· tag
экзон 5 1408+1410 сад taa
экзон 5 381 1474 сад —l· tag
экзон 5 1474+1476 сад taa
экзон 5 387 1492 сад —l· tag
экзон 5 1492+1494 сад taa
экзон 5 399 1529 tgg —> tag
экзон 5 1530 tgg tga
экзон 5 1529+1530 tgg taa
экзон 5 408 1556 tgg tag
экзон 5 1567 tgg tga
экзон 5 1556+1557 tgg taa
- 42 030862
Таблица 5b
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-C1 (SOSR, SEQ ID NO: , 19 и 20)
Число экзонов Положения Положения Дикий тип -О
аминокислот нуклеотидов мутантный кодон
экзон 1 52 154 сад tag
экзон 1 154+156 сад -о taa
экзон 1 79 235 саа -о taa
экзон 1 88 262 сад -о tag
экзон 1 262+264 сад -о taa
экзон 1 92 275 tgg -о tag
экзон 1 276 tgg -о tga
экзон 1 275+276 tgg —> taa
экзон 1 109 325 сад -о tag
экзон 1 325+327 сад -о taa
экзон 1 110 329 tgg -о tag
экзон 1 330 tgg —> tga
экзон 1 329+330 tgg —> taa
экзон 1 115 344 tgg —> tag
экзон 1 345 tgg —> tga
экзон 1 344+345 tgg —> taa
экзон 1 134 400 cag —l· tag
экзон 1 400+402 cag -o taa
экзон 1 141 421 cag —l· tag
экзон 1 421+423 cag -o taa
экзон 1 146 436+437 egg —l· tag
экзон 1 436+438 egg —l· tga
экзон 1 436+437+438 egg —l· taa
экзон 1 166 496 cag —l· tag
экзон 1 496+498 cag -o taa
экзон 2 196 667 tgg -o tag
- 43 030862
экзон 2 668 tgg —> tga
экзон 2 667+668 tgg —> taa
экзон 2 202 684 cag —l· tag
экзон 2 684+686 сад taa
экзон 2 211 712 tgg —> tag
экзон 3 791 tgg —> tga
экзон 2-3 712+791 tgg —> taa
экзон 3 220 817 tgg —> tag
экзон 3 818 tgg —> tga
экзон 3 817+818 tgg —> taa
экзон 3 223 825 cag —l· tag
экзон 3 825+827 cag taa
экзон 3 233 856 tgg —> tag
экзон 3 857 tgg —> tga
экзон 3 856+857 tgg taa
экзон 3 236 864 cga tga
экзон 3 864+865 cga taa
экзон 4 251 1000 tgg tag
экзон 4 1001 tgg tga
экзон 4 1000+1001 tgg —> taa
экзон 4 269 1053 cga —l· tga
экзон 4 1053+1054 cga taa
экзон 5 309 1259 tgg —> tag
экзон 5 1260 tgg —> tga
экзон 5 1259+1260 tgg taa
экзон 5 316 1279 cag tag
экзон 5 1279+1281 cag taa
экзон 5 326 1309 tgg tag
экзон 5 1310 tgg —> tga
экзон 5 1309+1310 tgg —> taa
- 44 030862
экзон 5 339 1348 сад —> tag
экзон 5 1348+1350 сад —> taa
экзон 5 359 1408 сад —> tag
экзон 5 1408+1410 сад —> taa
экзон 5 381 1474 сад —> tag
экзон 5 1474+1476 сад —> taa
экзон 5 387 1492 сад —> tag
экзон 5 1492+1494 сад —> taa
экзон 5 399 1529 tgg —> tag
экзон 5 1530 tgg —> tga
экзон 5 1529+1530 tgg —> taa
экзон 5 408 1556 tgg —> tag
экзон 5 1557 tgg —> tga
экзон 5 1556+1557 tgg —> taa
Таблица 6a
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-C2 (WOSR, SEQ ID NO: 9 и 10)
Число экзонов Положения аминокислот Положения нуклеотидов Дикий тип А мутантный кодон
экзон 1 52 154 cag —> tag
экзон 1 154+156 сад —> taa
экзон 1 79 235 сад —> tag
экзон 1 235+237 сад —> taa
экзон 1 90 268 сад —> tag
экзон 1 268+270 сад —> taa
экзон 1 94 281 tgg —> tag
экзон 1 282 tgg —> tga
экзон 1 281+282 tgg A taa
экзон 1 111 331 cag —> tag
экзон 1 331+333 cag —> taa
- 45 030862
экзон 1 112 335 tgg —> tag
экзон 1 336 tgg —> tga
экзон 1 335+336 tgg —> taa
экзон 1 117 350 tgg —> tag
экзон 1 351 tgg —> tga
экзон 1 350+351 tgg —> taa
экзон 1 136 406 сад —> tag
экзон 1 406+408 сад —> taa
экзон 1 143 427 сад —> tag
экзон 1 427+429 сад —> taa
экзон 1 168 502 сад —> tag
экзон 1 502+504 сад —l· taa
экзон 2 198 669 tgg —> tag
экзон 2 670 tgg —> tga
экзон 2 669+670 tgg taa
экзон 2 204 686 сад tag
экзон 2 686+688 сад taa
экзон 2 213 714 tgg tag
экзон 3 945 tgg tga
экзон 2-3 714+945 tgg —> taa
экзон 3 222 971 tgg —> tag
экзон 3 972 tgg —> tga
экзон 3 971+972 tgg —> taa
экзон 3 225 979 сад —> tag
экзон 3 979+981 сад taa
экзон 3 235 1010 tgg tag
экзон 3 1011 tgg tga
экзон 3 1010+1011 tgg taa
экзон 3 238 1018+1019 egg —l· tag
экзон 3 1018+1020 egg —l· tga
- 46 030862
экзон 3 1018+1019+1020 egg —> taa
экзон 3 248 1048 cga —> tga
экзон 3 1048+1049 cga —> taa
экзон 4 253 1195 tgg —> tag
экзон 4 1196 tgg —> tga
экзон 4 1195+1196 tgg —> taa
экзон 4 271 1248 cga —> tga
экзон 4 1248+1249 cga —> taa
экзон 5 311 1454 tgg —> tag
экзон 5 1455 tgg —> tga
экзон 5 1454+1455 tgg —> taa
экзон 5 318 1474 cag —l· tag
экзон 5 1474+1476 cag -o taa
экзон 5 328 1505 tgg —> tag
экзон 5 1506 tgg -o tga
экзон 5 1505+1506 tgg -o taa
экзон 5 341 1543 cag -o tag
экзон 5 1543+1545 cag -o taa
экзон 5 361 1603 cag -o tag
экзон 5 1603+1605 cag -o taa
экзон 5 383 1669 cag —l· tag
экзон 5 1669+1671 cag -o taa
экзон 5 389 1687 cag —l· tag
экзон 5 1687+1689 cag -o taa
экзон 5 401 1724 tgg -o tag
экзон 5 1725 tgg -o tga
экзон 5 1724+1725 tgg -o taa
экзон 5 410 1751 tgg -o tag
экзон 5 1752 tgg —> tga
экзон 5 1751+1752 tgg —> taa
- 47 030862
Таблица 6b
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-C2 (SOSR, SEQ ID NO: 21 и 22)
Число экзонов Положения Положения Дикий тип
аминокислот нуклеотидов мутантный кодон
экзон 1 52 154 cag tag
экзон 1 154+156 сад taa
экзон 1 79 235 сад tag
экзон 1 235+237 сад taa
экзон 1 90 268 сад tag
экзон 1 268+270 сад taa
экзон 1 94 281 tgg —> tag
экзон 1 282 tgg —> tga
экзон 1 281+282 tgg —> taa
экзон 1 111 331 cag —l· tag
экзон 1 331+333 cag —l· taa
экзон 1 112 335 tgg —> tag
экзон 1 336 tgg —> tga
экзон 1 335+336 tgg —> taa
экзон 1 117 350 tgg —> tag
экзон 1 351 tgg —> tga
экзон 1 350+351 tgg —> taa
экзон 1 136 406 cag —l· tag
экзон 1 406+408 cag —l· taa
экзон 1 143 427 cag —l· tag
экзон 1 427+429 cag —l· taa
экзон 1 168 502 cag —l· tag
экзон 1 502+504 cag —l· taa
экзон 2 198 669 tgg —> tag
экзон 2 670 tgg tga
- 48 030862
экзон 2 669+670 tgg —> taa
экзон 2 204 686 cag —> tag
экзон 2 686+688 cag —> taa
экзон 2 213 714 tgg —> tag
экзон 3 945 tgg —> tga
экзон 2-3 714+945 tgg —> taa
экзон 3 222 971 tgg —> tag
экзон 3 972 tgg —> tga
экзон 3 971+972 tgg —> taa
экзон 3 225 979 cag —> tag
экзон 3 979+981 cag —> taa
экзон 3 235 1010 tgg —> tag
экзон 3 1011 tgg —> tga
экзон 3 1010+1011 tgg —> taa
экзон 3 238 1018+1019 egg —> tag
экзон 3 1018+1020 egg —> tga
экзон 3 1018+1019+1020 egg —> taa
экзон 3 248 1048 ega —> tga
экзон 3 1048+1049 ega —> taa
экзон 4 253 1195 tgg —> tag
экзон 4 1196 tgg —> tga
экзон 4 1195+1196 tgg —> taa
экзон 4 271 1248 ega —> tga
экзон 4 1248+1249 ega —> taa
экзон 5 311 1454 tgg —> tag
экзон 5 1455 tgg —> tga
экзон 5 1454+1455 tgg A taa
экзон 5 318 1474 cag —> tag
экзон 5 1474+1476 cag —> taa
экзон 5 328 1505 tgg —> tag
- 49 030862
экзон 5 1506 tgg —> tga
экзон 5 1505+1506 tgg —> taa
экзон 5 341 1543 сад —> tag
экзон 5 1543+1545 сад —l· taa
экзон 5 361 1603 сад —> tag
экзон 5 1603+1605 сад —l· taa
экзон 5 383 1669 сад —> tag
экзон 5 1669+1671 сад —l· taa
экзон 5 389 1687 сад —> tag
экзон 5 1687+1689 сад —l· taa
экзон 5 401 1724 tgg —> tag
экзон 5 1725 tgg —> tga
экзон 5 1724+1725 tgg taa
экзон 5 410 1751 tgg tag
экзон 5 1752 tgg tga
экзон 5 1751+1752 tgg taa
Таблица 7а
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-C3 (WOSR, SEQ ID NO: 11 и 12)
Число экзонов Положения Положения Дикий тип -У
аминокислот нуклеотидов мутантный кодон
экзон 1 52 154 саа —l· taa
экзон 1 81 241 саа taa
экзон 1 82 244 саа taa
экзон 1 91 271 сад tag
экзон 1 271+273 сад taa
экзон 1 95 284 tgg tag
экзон 1 285 tgg —> tga
экзон 1 284+285 tgg —> taa
экзон 1 112 334 сад —> tag
- 50 030862
экзон 1 334+336 cag —> taa
экзон 1 113 338 tgg —> tag
экзон 1 339 tgg —> tga
экзон 1 338+339 tgg —> taa
экзон 1 137 409 cag —> tag
экзон 1 409+411 cag —> taa
экзон 1 144 430 cag —> tag
экзон 1 430+432 cag —> taa
экзон 1 169 505 cag —> tag
экзон 1 505+507 cag —> taa
экзон 2 199 1018 tgg —> tag
экзон 2 1019 tgg —> tga
экзон 2 1018+1019 tgg —> taa
экзон 2 205 1035 cag —l· tag
экзон 2 1035+1037 cag -o taa
экзон 2 214 1063 tgg -o tag
экзон 3 1138 tgg -o tga
экзон 2-3 1063+1138 tgg -o taa
экзон 3 223 1164 tgg -o tag
экзон 3 1165 tgg —> tga
экзон 3 1164+1165 tgg —> taa
экзон 3 236 1203 tgg —> tag
экзон 3 1204 tgg —> tga
экзон 3 1203+1204 tgg —> taa
экзон 3 239 1211+1212 egg -o tag
экзон 3 1211+1213 egg -o tga
экзон 3 1211+1212+1213 egg -o taa
экзон 4 254 1329 tgg -o tag
экзон 4 1330 tgg —> tga
экзон 4 1329+1330 tgg —> taa
- 51 030862
экзон 4 272 1382 cga —l· tga
экзон 4 1382+1383 cga taa
экзон 5 312 1578 tgg —> tag
экзон 5 1579 tgg —> tga
экзон 5 1578+1579 tgg —> taa
экзон 5 319 1598 cag —l· tag
экзон 5 1598+1600 cag taa
экзон 5 329 1629 tgg —> tag
экзон 5 1630 tgg —> tga
экзон 5 1629+1630 tgg —> taa
экзон 5 362 1727 cag —l· tag
экзон 5 1727+1729 cag taa
экзон 5 384 1793 cag —l· tag
экзон 5 1793+1795 cag taa
экзон 5 388 1805 cga —l· tga
экзон 5 1805+1806 cga taa
экзон 5 390 1811 cag —l· tag
экзон 5 1811+1813 cag taa
экзон 5 399 1838 cga —l· tga
экзон 5 1838+1839 cga taa
экзон 5 402 1848 tgg —> tag
экзон 5 1849 tgg tga
экзон 5 1848+1849 tgg taa
экзон 5 411 1875 tgg tag
экзон 5 1876 tgg tga
экзон 5 1875+1876 tgg taa
- 52 030862
Таблица 7b
Возможные мутации с образованием стоп-кодонов в FATB-C3 (SOSR, SEQ ID NO: , 23 и 24)
Число экзонов Положения Положения Дикий тип А
аминокислот нуклеотидов мутантный кодон
экзон 1 52 154 саа —> taa
экзон 1 81 241 саа —> taa
экзон 1 82 244 саа —> taa
экзон 1 91 271 cag —> tag
экзон 1 271+273 сад —> taa
экзон 1 95 284 tgg —> tag
экзон 1 285 tgg —> tga
экзон 1 284+285 tgg A taa
экзон 1 112 334 cag —> tag
экзон 1 334+336 cag —> taa
экзон 1 113 338 tgg —> tag
экзон 1 339 tgg —> tga
экзон 1 338+339 tgg —> taa
экзон 1 137 409 cag —> tag
экзон 1 409+411 cag —> taa
экзон 1 144 430 cag —> tag
экзон 1 430+432 cag —> taa
экзон 1 169 505 cag —> tag
экзон 1 505+507 cag —> taa
экзон 2 199 1019 tgg —> tag
экзон 2 1020 tgg —> tga
экзон 2 1019+1020 tgg —> taa
экзон 2 205 1036 cag —> tag
экзон 2 1036+1038 cag —> taa
экзон 2 214 1064 tgg —> tag
экзон 3 1139 tgg —> tga
- 53 030862
экзон 2-3 1064+1139 tgg taa
экзон 3 223 1165 tgg —l· tag
экзон 3 1166 tgg tga
экзон 3 1165+1166 tgg taa
экзон 3 236 1204 tgg —> tag
экзон 3 1205 tgg —> tga
экзон 3 1204+1205 tgg —> taa
экзон 3 239 1212+1213 egg tag
экзон 3 1212+1214 egg tga
экзон 3 1212+1213+1214 egg —l· taa
экзон 4 254 1330 tgg tag
экзон 4 1331 tgg tga
экзон 4 1330+1331 tgg taa
экзон 4 272 1383 ega —l· tga
экзон 4 1383+1384 ega taa
экзон 5 312 1579 tgg tag
экзон 5 1580 tgg tga
экзон 5 1579+1580 tgg taa
экзон 5 319 1599 cag tag
экзон 5 1599+1601 cag taa
экзон 5 329 1630 tgg tag
экзон 5 1631 tgg tga
экзон 5 1630+1631 tgg taa
экзон 5 362 1728 cag —l· tag
экзон 5 1728+1730 cag taa
экзон 5 384 1794 cag tag
экзон 5 1794+1796 cag taa
экзон 5 388 1806 ega tga
экзон 5 1806+1807 ega taa
экзон 5 390 1812 cag —l· tag
экзон 5 1812+1814 cag taa
экзон 5 399 1839 ega tga
экзон 5 1839+1840 ega taa
экзон 5 402 1849 tgg tag
экзон 5 1850 tgg tga
экзон 5 1849+1850 tgg taa
экзон 5 411 1876 tgg tag
экзон 5 1877 tgg tga
экзон 5 1876+1877 tgg taa
Очевидно, что эти мутации не ограничиваются мутациями, представленными в таблицах, приведенных выше, а также следует отметить, что аналогичные STOP-мутации могут присутствовать в аллелях fatB, отличающихся от аллелей, представленных в списке последовательностей и в вышеприведенных таблицах.
Используемый здесь термин мутация сайта сплайсинга в аллеле FATB означает мутацию в аллеле
- 54 030862
FATB, где мутация в соответствующем аллеле FATB дикого типа приводит к аномальному сплайсингу пре-мРНК, и тем самым, к образованию мутантного белка, обладающего значительно пониженной активностью или вообще не обладающего такой активностью. Мутация может присутствовать в консенсусной последовательности сайта сплайсинга. Так, например, в нижеследующей табл. описаны консенсусные последовательности, которые в том случае, если они являются мутированными, вероятно нарушают нормальный сплайсинг. Сайты сплайсинга GT-AG обычно имеют другие консервативные нуклеотиды, такие как 2 высококонсервативных нуклеотида у 5'-конца интрона (в экзоне), а чаще всего 5'AG3'. С 3'-стороны от динуклеотида GT (так, например, в интроне) может присутствовать в высокой степени консервативный тетрануклеотид 5'-AAGT-3'. Это означает, что 8 нуклеотидов могут быть идентифицированы как высококонсервативные в донорном сайте.
Тип интрона 5'-стык сплайсинга (экзонЛинтрон) Сайт сплайсинга возле 3'-конца 3' стык сплайсинга (интрон Аэкзон) Обнаружены:
GU-AG (канонические интроны; примерно 99%) CRNAGU(A/G)AGU А YnAGAN в ядерной пре-мРНК
(примерно 1% AGC AGA в ядерной пре-мРНК
Неканонические интроны (< примерно 0,1%) AAU АСА в ядерной пре-мРНК
Канонические сайты ветви CUPuAPy в 20-50 нуклеотидах, расположенных со стороны 5'-конца по отношению к акцептору сайта сплайсинга ядерной пре-мРНК
Л Означает сайт сплайсинга;
R - А или G;
Y - С или Т;
N - А, С, G или Т (но часто G); n - кратное число нуклеотидов; жирным шрифтом - консенсусные динуклеотиды в интронной последовательности; Pu - пуриновое основание;
Py - пиримидиновое основание.
Структрура сайта сплайсинга и консенсусные последовательности описаны в литературе и в доступных компьютерныех программах для идентификации последовательностей экзонов и сайтов сплайсинга, таких как программы NetPLAntgene, BDGP или Genio, est2genome, FgeneSH и т.п. Сравнение геномных последовательностей или последовательностей пре-мРНК с последовательностями транслируемого белка может быть осуществлено в целях определения или подтверждения сайтов сплайсинга и аномального сплайсинга.
Настоящее изобретение охватывает любую мутацию (инсерцию, делецию и/или замену одного или нескольких нуклеотидов), которая приводит к изменению сплайсинга пре-мРНК и тем самым к образованию белка, обладающего значительно пониженной биологической активностью. В одном из вариантов изобретения, мутантный аллель FATB, содержащий мутацию сайта сплайсинга, представляет собой аллель FATB, в котором модифицированный сплайсинг индуцируется введением в транскрибированную область ДНК FATB одной или нескольких нуклеотидных замен в консенсусных динуклеотидах, представленных выше жирным шрифтом. Так, например, ЛGU может быть, например, заменен на ЛAU в донорном сайте сплайсинга, и/или AGЛ может быть заменен на ААЛ в акцепторной последовательности сайта сплайсинга. В другом варианте изобретения, мутантный аллель FATB, содержащий мутацию сайта сплайсинга, представляет собой аллель FATB, в котором модифицированный сплайсинг индуцируется введением в транскрибированную область ДНК FATB одной или нескольких нуклеотидных замен в консервативных нуклеотидах в последовательностях экзона.
В нижеследующих таблицах указаны возможные мутации сайта сплайсинга в генах FATB, в частности в консервативных динуклеотидах канонических интронов и в нуклеотиде, непосредственно фланкирующем эти динуклеотиды в экзоне (символы '[' и ']' означают границы экзон-интрон и интрон-экзон и сайт сплайсинга; мутированные нуклеотиды подчеркнуты).
- 55 030862
Таблица 8a
Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-A1 (WOSR, SEQ ID NO: 1)
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип -о мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 504 g[gt... -о a[gt...
интрон 1 - донор 505 g[gt... ->g[at...
интрон 1 - акцептор 589 ...ag]g —> ...aa]g
интрон 1 - акцептор 590 ...ag]g ...ag]a
интрон 2 - донор 723 g[gt... -o a[gt...
интрон 2 - донор 724 g[gt... -o g [at...
интрон 2 - акцептор 797 ...ag]g -o ...aa]g
интрон 2 - акцептор 798 ...ag]g -o ...ag]a
интрон 3 - донор 911 g[gt... -o a[gt...
интрон 3 - донор 912 g[gt... -o g [ at...
интрон 3 - акцептор 980 ...ag] t -o ...aa] t
интрон 4 - донор 1153 t [gt... —> t [at...
интрон 4 - акцептор 1242 ...ag]c ->...aa]c
интрон 4 - акцептор 1243 ...ag] c -o ...ag] t
Таблица 8b
Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-A1 (SOSR, SEQ ID NO: 13)
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип -о мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 501 g[gt... -о a[gt...
интрон 1 - донор 502 g[gt... -+g[at...
интрон 1 - акцептор 586 ...ag]g -о ...aa]g
интрон 1 - акцептор 587 ...ag]g —> ...ag] a
интрон 2 - донор 720 g[gt... -o a[gt...
интрон 2 - донор 721 g[gt... -o g [ at...
интрон 2 - акцептор 794 ...ag]g -o ...aa]g
интрон 2 - акцептор 795 ...ag]g -o ...ag] a
интрон 3 - донор 908 g[gt... -o a[gt...
интрон 3 - донор 909 g[gt... -o g [ at...
интрон 3 - акцептор 977 ...ag] t -o ...aa] t
интрон 4 - донор 1150 t [gt... —> t [at...
интрон 4 - акцептор 1239 ...ag]c ->...aa]c
интрон 4 - акцептор 1240 ...ag] c -o ...ag] t
- 56 030862
Таблица 9а
Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-A2 (WOSR, SEQ ID NO: 3) .
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 504 g[gt... -^· a[gt...
интрон 1 - донор 505 g[gt... —>g[at...
интрон 1 - акцептор 583 ...ag]g —l· ...aa]g
интрон 1 - акцептор 584 ...ag]g —> ...ag]a
интрон 2 - донор 717 g[gt... -^· a[gt...
интрон 2 - донор 718 g[gt... -^· g [ at...
интрон 2 - акцептор 811 ...ag]g —l· ...aa]g
интрон 2 - акцептор 812 ...ag]g —l· ...ag] a
интрон 3 - донор 925 g[gt... -^· a[gt...
интрон 3 - донор 926 g[gt... -^· g [ at...
интрон 3 - акцептор 1058 ...ag] t ...aa] t
интрон 4 - донор 1231 t [gt... —> t [at...
интрон 4 - акцептор 1308 ...ag]c ->...aa]c
интрон 4 - акцептор 1309 ...ag] c ...ag] t
Таблица 9b Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-A2 (SOSR, SEQ ID NO: 15)
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 504 g[gt... -^· a[gt...
интрон 1 - донор 505 g[gt... —>g[at...
интрон 1 - акцептор 583 ...ag]g ...aa]g
интрон 1 - акцептор 584 ...ag]g ...ag] a
интрон 2 - донор 717 g[gt... -> a[gt...
интрон 2 - донор 718 g[gt... -^· g [ at...
интрон 2 - акцептор 811 ...ag]g —l· ...aa]g
интрон 2 - акцептор 812 ...ag]g —l· ...ag] a
интрон 3 - донор 925 g[gt... -^· a[gt...
интрон 3 - донор 926 g[gt... -^· g [at...
интрон 3 - акцептор 1058 ...ag] t ...aa] t
интрон 4 - донор 1231 t [gt... —> t [at...
интрон 4 - акцептор 1308 ...ag]c ->...aa]c
интрон 4 - акцептор 1309 ...ag] c ...ag] t
- 57 030862
Таблица 10а
Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-A3 (WOSR, SEQ ID NO: 5) .
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип А мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 507 g[gt... A a[gt...
интрон 1 - донор 508 g[gt... ->g[at...
интрон 1 - акцептор 739 ...ag]g —> ...aa]g
интрон 1 - акцептор 740 ...ag]g —> ...ag] a
интрон 2 - донор 873 g[gt... A a[gt...
интрон 2 - донор 874 g[gt... A g [at...
интрон 2 - акцептор 946 ...ag]g —> ...aa]g
интрон 2 - акцептор 947 ...ag]g —> ...ag]a
интрон 3 - донор 1060 g[gt... A a[gt...
интрон 3 - донор 1061 g[gt... A g [at...
интрон 3 - акцептор 1140 ...ag] t A ...aa] t
интрон 4 - донор 1312 c[gt... A t[gt...
интрон 4 - донор 1313 c[gt... A c[at...
интрон 4 - акцептор 1412 ...ag]c ->...aa]c
интрон 4 - акцептор 1413 ...ag] c A ...ag] t
Таблица 10b
Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-A3 (SOSR, SEQ ID NO: 17)
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип А мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 507 g[gt... A a[gt...
интрон 1 - донор 508 g[gt... ->g[at...
интрон 1 - акцептор 739 ...ag]g —> ...aa]g
интрон 1 - акцептор 740 ...ag]g —> ...ag] a
интрон 2 - донор 873 g[gt... A a[gt...
интрон 2 - донор 874 g[gt... A g [at...
интрон 2 - акцептор 946 ...ag]g —> ...aa]g
интрон 2 - акцептор 947 ...ag]g —> ...ag] a
интрон 3 - донор 1060 g[gt... A a[gt...
интрон 3 - донор 1061 g[gt... A g [at...
интрон 3 - акцептор 1138 ...ag] t A ...aa] t
интрон 4 - донор 1310 c[gt... A t[gt...
интрон 4 - донор 1311 c[gt... A c[at...
интрон 4 - акцептор 1394 ...ag]c ->...aa]c
интрон 4 - акцептор 1395 ...ag]c A ...ag]t
- 58 030862
Таблица 11а
Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-C1 (WOSR, SEQ ID NO: 7)
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 498 g[gt... -A· a[gt...
интрон 1 - донор 499 g[gt... —>g[at...
интрон 1 - акцептор 578 ...ag] g —> ...aa] g
интрон 1 - акцептор 579 ...ag]g ...ag] a
интрон 2 - донор 712 g[gt... -A· a[gt...
интрон 2 - донор 713 g[gt... -A· g [ at...
интрон 2 - акцептор 790 ...ag]g —l· ...aa]g
интрон 2 - акцептор 791 ...ag]g —l· ...ag] a
интрон 3 - донор 904 g[gt... -A· a[gt...
интрон 3 - донор 905 g[gt... -A· g [ at...
интрон 3 - акцептор 994 ...ag] t ...aa] t
интрон 4 - донор 1167 t [gt... —> t [at...
интрон 4 - акцептор 1251 ...ag]c ->...aa]c
интрон 4 - акцептор 1252 ...ag] c ...ag] t
Таблица 11b
Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-C1 (SOSR, SEQ ID NO: 19)
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 498 g[gt... -A· a[gt...
интрон 1 - донор 499 g[gt... —>g[at...
интрон 1 - акцептор 578 ...ag]g ...aa]g
интрон 1 - акцептор 579 ...ag]g ...ag] a
интрон 2 - донор 712 g[gt... -A· a[gt...
интрон 2 - донор 713 g[gt... -A· g [ at...
интрон 2 - акцептор 790 ...ag]g ...aa]g
интрон 2 - акцептор 791 ...ag]g ...ag] a
интрон 3 - донор 904 g[gt... -A· a[gt...
интрон 3 - донор 905 g[gt... -A· g [ at...
интрон 3 - акцептор 994 ...ag] t ...aa] t
интрон 4 - донор 1167 t [gt... —> t [at...
интрон 4 - акцептор 1251 ...ag]c ->...aa]c
интрон 4 - акцептор 1252 ...ag] c ...ag] t
- 59 030862
Таблица 12а
Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-C2 (WOSR, SEQ ID NO: 9)
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип -У мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 504 g[gt... -У a[gt...
интрон 1 - донор 505 g[gt... —>g[at...
интрон 1 - акцептор 580 ...ag]g —> ...aa]g
интрон 1 - акцептор 581 ...ag]g ...ag] a
интрон 2 - донор 714 g[gt... a[gt...
интрон 2 - донор 715 g[gt... g [ at...
интрон 2 - акцептор 944 ...ag]g ...aa]g
интрон 2 - акцептор 945 ...ag]g ...ag] a
интрон 3 - донор 1058 g[gt... a[gt...
интрон 3 - донор 1059 g[gt... g [ at...
интрон 3 - акцептор 1189 ...ag] t ...aa] t
интрон 4 - донор 1362 t [gt... —> t [at...
интрон 4 - акцептор 1446 ...ag]c ->...aa]c
интрон 4 - акцептор 1447 ...ag] с ...ag] t
Таблица 12b Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-C2 (SOSR, SEQ ID NO: 21)
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип -У мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 504 g[gt... -У a[gt...
интрон 1 - донор 505 g[gt... —>g[at...
интрон 1 - акцептор 580 ...ag]g —> ...aa]g
интрон 1 - акцептор 581 ...ag] g —> ...ag] a
интрон 2 - донор 714 g[gt... a[gt...
интрон 2 - донор 715 g[gt... g [ at...
интрон 2 - акцептор 944 ...ag]g ...aa]g
интрон 2 - акцептор 945 ...ag]g —l· ...ag] a
интрон 3 - донор 1058 g[gt... a[gt...
интрон 3 - донор 1059 g[gt... g [ at...
интрон 3 - акцептор 1189 ...ag] t ...aa] t
интрон 4 - донор 1362 t [gt... —> t [at...
интрон 4 - акцептор 1446 ...ag]c ->...aa]c
интрон 4 - акцептор 1447 ...ag] с ...ag] t
- 60 030862
Таблица 13a
Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-СЭ (WOSR, SEQ ID NO: 11)
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 507 g[gt... -A· a[gt...
интрон 1 - донор 508 g[gt... -эд [at...
интрон 1 - акцептор 929 ...ад]д -э ...аа]д
интрон 1 - акцептор 930 ...ад]д -э ...ад] a
интрон 2 - донор 1063 g[gt... -N a[gt...
интрон 2 - донор 1064 g[gt... -N g [at...
интрон 2 - акцептор 1137 ...ag]g ...aa]g
интрон 2 - акцептор 1138 ...ag]g ...ag]a
интрон 3 - донор 1251 g[gt... -A· a[gt...
интрон 3 - донор 1252 g[gt... -A· g [at...
интрон 3 - акцептор 1323 ...ag] t -N ...aa] t
интрон 4 - донор 1495 c[gt... -A· t[gt...
интрон 4 - донор 1496 c[gt... -N c[at...
интрон 4 - акцептор 1570 ...ag]c —>...aa]c
интрон 4 - акцептор 1571 ...ад] c -N ...ag] t
Таблица 13b
Возможные мутации сайта сплайсинга в FATB-C3 (SOSR, SEQ ID NO: 23) .
Число интронов Положения нуклеотидов Дикий тип мутантный сайт сплайсинга
интрон 1 - донор 507 g[gt... -N a[gt...
интрон 1 - донор 508 g[gt... -эд [at...
интрон 1 - акцептор 930 ...ад]д -э ...аа]д
интрон 1 - акцептор 931 ...ад] д —> ...ад] а
интрон 2 - донор 1064 g[gt... -A· a[gt...
интрон 2 - донор 1065 g[gt... -А· д [at...
интрон 2 - акцептор 1138 ...ад]д ...аа]д
интрон 2 - акцептор 1139 ...ад]д ...ад] а
интрон 3 - донор 1252 g[gt... -A· a[gt...
интрон 3 - донор 1253 g[gt... -А· д [at...
интрон 3 - акцептор 1324 ...ад] t -N ...aa] t
интрон 4 - донор 1496 c[gt... -N t[gt...
интрон 4 - донор 1497 c[gt... -N c[at...
интрон 4 - акцептор 1571 ...ag]c э...аа]с
интрон 4 - акцептор 1572 ...ag]c -N ...ag]t
Аминокислотные последовательности согласно изобретению.
Настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям FATB дикого типа (функциональным) и к мутантным аминокислотным последовательностям FATB (содержащим одну или несколько мутаций, а предпочтительно мутаций, приводящих к значительному снижению или элиминации биологической активности белка FATB), происходящего от растения вида Brassica, в частности Brassica napus, а также от других сельскохозяйственных культур вида Brassica. Так, например, растение вида Brassica содержит геном А и/или С, который может кодировать различные аминокислоты FATB-A или FATB-С. Кроме того, мутации в аллелях FATB дикого типа, и тем самым мутантные аллели, которые могут кодировать другие мутантные белки FATB, могут быть созданы методами мутагенеза. В одном из
- 61 030862 своих вариантов, настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям FATB дикого типа и/или к мутантным аминокислотным последовательностям FATB, которые присутствуют в растении Brassica (то есть эндогенно). Однако настоящее изобретение также относится к выделенным аминокислотным последовательностям FATB (например, выделенным из растения или полученным методом синтеза), а также к любым их вариантам и фрагментам.
Аминокислотные последовательности белков FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3 были выделены из озимого масличного рапса Brassica napus (WOSR) и ярового масличного рапса (SOSR), как описано в списке последовательностей. В списке последовательностей также приводятся последовательности FATB дикого типа, а мутантные последовательности FATB указанных последовательностей и последовательностей, по существу, аналогичных этим последовательностям, описаны ниже со ссылками на последовательности FATB дикого типа.
Как указывается выше, описанные здесь белки FATB Brassica имеют длину примерно 412-424 аминокислоты и содержат ряд структурных и функциональных доменов. Последовательности N-концевой части белков FATB эволюционно являются менее консервативными, чем последовательности зрелых белков FATB. Поэтому, последовательности зрелых белков FATB являются менее вариабельными, чем последовательности белков-предшественников.
В соответствии с настоящим изобретением аминокислотные последовательности FATB-A1 или аминокислотные последовательности варианта FATB-A1 представляют собой аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 2 (WOSR FATB-A1), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, и/или идентичны последовательности SEQ ID NO: 14 (SOSR FATB-A1), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика. Эти аминокислотные последовательности могут также называться по существу, аналогичными или по существу, идентичными последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
В соответствии с настоящим изобретением аминокислотные последовательности FATB-A2 или аминокислотные последовательности варианта FATB-A2 представляют собой аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 4 (WOSR FATB-A2), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, и/или идентичны последовательности SEQ ID NO: 16 (SOSR FATB-A2), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика. Эти аминокислотные последовательности могут также называться по существу, аналогичными или по существу, идентичными последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
В соответствии с настоящим изобретением аминокислотные последовательности FATB-A3 или аминокислотные последовательности варианта FATB-A3 представляют собой аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 6 (WOSR FATB-A3), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, и/или идентичны последовательности SEQ ID NO: 18 (SOSR FATB-A3), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика. Эти аминокислотные последовательности могут также называться по существу, аналогичными или по существу, идентичными последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
В соответствии с настоящим изобретением аминокислотные последовательности FATB-C1 или аминокислотные последовательности варианта FATB-C1 представляют собой аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 8 (WOSR FATB-C1), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, и/или идентичны последовательности SEQ ID NO: 20 (SOSR FATB-C1), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика. Эти аминокислотные последовательности могут также называться по существу, аналогичными или по существу, идентичными последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
В соответствии с настоящим изобретением, аминокислотные последовательности FATB-C2 или аминокислотные последовательности варианта FATB-C2 представляют собой аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 10 (WOSR FATB-C2), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, и/или идентичны последовательности SEQ ID NO: 22 (SOSR FATB-C2), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика. Эти аминокислотные последовательности могут также называться по существу, аналогичными или по существу, идентичными последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
В соответствии с настоящим изобретением аминокислотные последовательности FATB-C3 или
- 62 030862 аминокислотные последовательности варианта FATB-C3 представляют собой аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 12 (WOSR FATB-C3), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика, и/или идентичны последовательности SEQ ID NO: 24 (SOSR FATB-C3), при их выравнивании в присутствии или в отсутствии пептида-переносчика. Эти аминокислотные последовательности могут также называться по существу, аналогичными или по существу, идентичными последовательностям FATB, указанным в списке последовательностей.
Таким образом, настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям белков дикого типа, функциональных белков FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3, включая их варианты и фрагменты (более подробно определенные ниже), а также к мутантным аминокислотным последовательностям любых из указанных белков, где мутация в аминокислотной последовательности предпочтительно приводит к значительному снижению биологической активности белка FATB. Термин значительное снижение биологической активности мутантного белка FATB означает снижение ферментативной активности (то есть ацил-АСР-тиоэстеразной активности) по меньшей мере на 30, по меньшей мере на 40, 50% или более, по меньшей мере на 90 или 100% (отсутствие биологической активности) по сравнению с активностью белка дикого типа.
Настоящее изобретение относится к эндогенным и выделенным аминокислотным последовательностям. Фрагмент аминокислотной последовательности FATB или его варианта (определенного в настоящей заявке) может иметь различную длину, например по меньшей мере 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 200, 400 смежных аминокислот последовательности FATB (или ее варианта).
Аминокислотные последовательности функциональных белков FATB.
Аминокислотные последовательности, указанные в списке последовательностей, представляют собой последовательности белков дикого типа и функциональных белков FATB Brassica napus. Таким образом, эти последовательности являются эндогенными для растений WOSR и SOSR, из которых они были выделены. Другие сельскохозяйственные культуры вида Brassica, а также их сорта, линии скрещивания или разновидности дикого типа могут быть скринированы на другие функциональные белки FATB, имеющие те же самые аминокислотные последовательности или их варианты, описанные выше.
Кроме того, следует отметить, что аминокислотные последовательности FATB и их варианты (или фрагменты любых таких последовательностей) могут быть идентифицированы in silico путем скрининга баз данных аминокислот, по существу, на аналогичные последовательности. Настоящее изобретение также относится к фрагментам аминокислотных молекул согласно изобретению. Такими фрагментами являются аминокислотные последовательности зрелого белка или меньшие фрагменты, содержащие все аминокислотные последовательности или их части и т.п.
Аминокислотные последовательности мутантных белков FATB.
Аминокислотные последовательности, содержащие одну или несколько аминокислотных делеций, инсерций или замен, по сравнению с аминокислотными последовательностями дикого типа, являются другим вариантом настоящего изобретения, поскольку они представляют собой фрагменты таких мутантных аминокислотных молекул. Такие мутантные аминокислотные последовательности могут быть получены и/или идентифицированы различными известными методами, описанными выше. И в данном случае, такие аминокислотные молекулы получают в эндогенной и в выделенной форме.
В одном из вариантов изобретения мутация(и) в аминокислотной последовательности приводит(ят) к значительному снижению или к элиминации биологической активности белка FATB по сравнению с белком дикого типа. Как указывается выше, в основном, любая мутация, которая приводит к образованию белка, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную инсерцию, делецию и/или замену по сравнению с белком дикого типа, может значительно снижать (или элиминировать) ферментативную активность. Однако следует отметить, что мутации в некоторых частях белка, по всей вероятности, приводят к ослаблению функции мутантного белка FATB, например ими являются мутации, которые приводят к продуцированию усеченных белков, в которых отсутствуют значительные части функциональных доменов, таких как каталитический домен, или аминокислоты, определяющие специфичность к субстрату (см. выше), или мутации, в результате которых происходит замена консервативных аминокислотных остатков, обладающих каталитической функцией или определяющих специфичность к субстрату.
Таким образом, в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к мутантным белкам FATB, имеющим одну или несколько делеционных или инсерционных мутаций, где указанная(ые) делеция(и) или инсерция(и) приводит(ят) к образованию мутантного белка, обладающего значительно пониженной активностью in vivo или вообще не обладающего активностью in vivo. Такими мутантными белками FATB являются белки FATB, в которых по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 400 или более аминокислот делетированы или встроены по сравнению с белком FATB дикого типа, где указанная(ые) делеция(и) или инсерция(и) приводит(ят) к образованию мутантного белка, обладающего значительно пониженной активностью in vivo или вообще не обладающего активностью in vivo.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к мутантным белкам FATB, которые
- 63 030862 являются усеченными, где такое усечение приводит к образованию мутантного белка, обладающего значительно пониженной активностью in vivo или вообще не обладающего активностью in vivo. Такими усеченными белками FATB являются белки FATB, которые не содержат функциональных доменов в Cконцевой части соответствующего белка (зрелого) FATB дикого типа, и которые сохраняют N-концевую часть соответствующего белка (зрелого) FATB дикого типа. Таким образом, в одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к усеченному белку FATB, содержащему N-концевую часть соответствующего белка (зрелого) FATB дикого типа, простирающуюся до консервативного остатка Cys папаинподобной каталитической триады, но не включающую этот остаток (как указывалось выше). Мутантный белок является более усеченным по сравнению с белком дикого типа, и по всей вероятности, такой белок не будет обладать какой-либо ферментативной активностью. Таким образом, в другом своем варианте, настоящее изобретение относится к усеченному белку FATB, содержащему N-концевую часть соответствующего белка (зрелого) FATB дикого типа, простирающуюся до консервативного остатка His или Asn папаин-подобной каталитической триады, но не включающую этот остаток (как указывалось выше). В еще одном своем варианте, настоящее изобретение относится к усеченному белку FATB, содержащему N-концевую часть соответствующего белка (зрелого) FATB дикого типа, простирающуюся до консервативного остатка Met, Lys, Val, Ser или Trp, определяющего специфичность к субстрату, но не включающую этот остаток (как указывалось выше). В еще одном своем варианте, настоящее изобретение относится к усеченному белку FATB, содержащему N-концевую часть соответствующего белка (зрелого) FATB дикого типа, в котором отсутствует часть второго домена 4НВТ или весь этот домен, или часть первого домена 4НВТ или весь этот домен (как указывалось выше), или даже большее число аминокислот.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к мутантным белкам FATB, содержащим одну или несколько мутаций, а именно, замен, которые приводят к образованию мутантного белка, обладающего значительно пониженной активностью или вообще не обладающего активностью in vivo. Такими мутантными белками FATB являются белки FATB, в которых заменены консервативные аминокислотные остатки, обладающие каталитической функцией или определяющие специфичность к субстрату (например, как описано выше). Таким образом, в одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к мутантному белку FATB, содержащему замененный консервативный аминокислотный остаток, обладающий каталитической функцией, такой как консервативный остаток Asn, His и Cys папаин-подобной каталитической триады. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к мутантному белку FATB, содержащему замененный консервативный аминокислотный остаток, определяющий специфичность к субстрату, такой как консервативный остаток Met, Lys, Val, Ser или Trp.
Способы согласно изобретению
Мутантные аллели fatB могут быть получены (например, посредством мутагенеза) и/или идентифицированы различными методами, известными специалистам, например ПЦР-методами амплификации части или всей геномной ДНК или кДНК fatB.
Используемый здесь термин мутагенез означает процесс, при котором растительные клетки (например, множество семян Brassica или другие части, такие как пыльца) подвергаются обработке методом индуцирования мутаций ДНК клеток, таким как контактирование с мутагенным агентом, таким как химическое вещество (такое как этилметилсульфонат (EMS), этилнитрозомочевина (ENU), и т.п.) или ионизирующему облучению (нейтронами (такими как быстрые нейтроны, вызывающие мутагенез и т.п.), альфа-лучами, гамма-лучами (такими как лучи, испускаемые источником кобальт 60), рентгеновскими лучами, УФ-лучами и т.п.), или комбинациями двух или более из указанных методов. Таким образом, желаемый мутагенез одного или нескольких аллелей FATB может быть осуществлен химическими методами, такими как контактирование одной или нескольких тканей растения с этилметилсульфонатом (EMS), этилнитрозомочевиной и т.п., а также физическими методами, такими как облучение рентгеновскими лучами и т.п., или облучение гамма-лучами, такими как лучи, испускаемые источником кобальт 60.
После мутагенеза из обработанных семян выращивают растения Brassica либо такие растения регенерируют из обработанных клеток известными методами. Так, например, полученные семена Brassica могут быть засеяны в соответствии со стандартными процедурами культивирования, и после самоопыления, эти растения дают семена. Альтернативно, гаплоидные проростки с двойным набором хромосом могут быть собраны из обработанных микроспор или клеток пыльцы и сразу культивированы с получением гомозиготных растений. Другие семена, которые образуются в результате такого самоопыления в данном или последующем поколении, могут быть собраны и скринированы на присутствие мутантных аллелей FATB методами, известными специалистам, такими как, например, методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР, для амплификации аллелей fatB) или методы гибридизации, например Саузерн-блот-анализ и/или прямое секвенирование аллелей fatB. Для скрининга на присутствие точковых мутаций (так называемого полиморфизма по одному нуклеотиду или SNP) в мутантных аллелях FATB могут быть применены методы детектирования SNP, известные специалистам, например методы на основе лигирования олигонуклеотидов, методы удлинения на одно основание или методы, основанные на различиях в рестрикционных сайтах, такие как методы TILLING.
- 64 030862
Как было описано выше, мутагенез (спонтанный, а также индуцированный) специфического аллеля FATB дикого типа приводит к внесению одной или нескольких мутаций, а именно, делеций, инсерций или замен нуклеотидов (далее называемых областями мутаций) в полученном мутантном аллеле FATB. Таким образом, мутантный аллель FATB может быть охарактеризован по локализации и конфигурации одного или нескольких делетированных, встроенных или замененных нуклеотидов в аллеле FATB дикого типа. Сайт в аллеле FATB дикого типа, где были встроены, делетированы или заменены один или несколько нуклеотидов, соответственно также называются областью мутации. Используемый здесь термин 5'-или 3'-фланкирующая область или последовательность означает область или последовательность ДНК в мутантном аллеле FATB (или в соответствующем аллеле дикого типа), состоящую по меньшей мере из 20 п.н., а предпочтительно по меньшей мере из 50 п.н., по меньшей мере из 750 п.н., по меньшей мере из 1500 п.н. и до 5000 п.н. ДНК, отличающейся от ДНК, содержащей один или несколько делетированных, встроенных или замененных нуклеотидов, а предпочтительно ДНК мутантного аллеля FATB (или соответствующего аллеля дикого типа), который локализуется либо непосредственно выше области мутации в мутантном аллеле FATB (или в соответствующем аллеле FATB дикого типа) и является смежным с такой областью (5'-фланкирующей областью или последовательностью), либо непосредственно ниже указанной области, и является смежным с такой областью (3'-фланкирующей областью или последовательностью).
Методы, разработанные для идентификации специфических мутантных аллелей FATB, либо растений или растительного материала, содержащих специфический мутантный аллель FATB, либо продуктов, которые включают растительный материал, содержащий специфический мутантный аллель FATB, основаны на конкретных геномных свойствах специфического мутантного аллеля FATB, отличающихся от геномных свойств соответствующего аллеля FATB дикого типа, таких как специфическая рестрикционная карта геномной области, содержащей область мутации, молекулярные маркеры или последовательность фланкирующих областей и/или областей мутации.
После секвенирования специфического мутантного аллеля FATB методом молекулярной биологии могут быть получены праймеры и зонды, которые специфически распознают последовательность в 5'фланкирующей области, 3'-фланкирующей области и/или в области мутации мутантного аллеля FATB в нуклеиновой кислоте (ДНК или РНК) образца. Так, например, может быть разработан ПЦР-метод для идентификации мутантного аллеля FATB в биологических образцах (таких как образцы растений, растительного материала или продуктов, содержащих растительный материал). Такую ПЦР проводят на основе по меньшей мере двух специфических праймеров, один из которых распознает последовательность в 5'- или 3'-фланкирующей области мутантного аллеля FATB, а другой распознает последовательность в 3'или 5'-фланкирующей области мутантного аллеля FATB соответственно; либо один из которых распознает последовательность в 5'- или 3'-фланкирующей области мутантного аллеля FATB, а другой распознает последовательность в области мутации мутантного аллеля FATB, либо один из которых распознает последовательность в 5'- или 3'-фланкирующей области мутантного аллеля FATB, a другой распознает последовательность в области, охватывающей область стыка между 3'- или 5'-фланкирующей областью и областью мутации специфического мутантного аллеля FATB (как более подробно описано ниже) соответственно.
Праймеры предпочтительно имеют последовательность в 15-35 нуклеотидов, которая в оптимизированных условиях ПЦР специфически распознает последовательность в 5'- или 3'-фланкирующей области, последовательность в области мутации или последовательность, охватывающую область стыка между 3'- или 5'-фланкирующей областью и областью мутации специфического мутантного аллеля FATB, в результате чего специфический фрагмент (специфический фрагмент мутантного FATB или дискриминирующий ампликон) амплифицируется из образца нуклеиновой кислоты, содержащего специфический мутантный аллель FATB. Это означает, что в таких оптимизированных условиях ПЦР, в геноме растения будет аплифицироваться только нужный, а не какой-либо другой, мутантный аллель FATB.
Подходящими для осуществления настоящего изобретения могут быть следующие ПЦР-праймеры: олигонуклеотиды, имеющие длину от 17 нуклеотидов и примерно до 200 нуклеотидов, и содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, а предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из 5'-фланкирующей последовательности специфического мутантного аллеля FATB (то есть, например, последовательности, которая 5'фланкирует один или несколько делетированных, встроенных или замененных нуклеотидов в мутантных аллелях FATB согласно изобретению, например последовательности, которая 5'-фланкирует делеционные мутации, нонсенс-мутации или мутации сайта сплайсинга, описанные выше, или последовательности, которая 5'-фланкирует возможные мутации, приводящие к образованию стоп-кодона или мутации сайта сплайсинга, указанные выше в таблицах) у их 3'-конца (праймеры, распознающие 5'фланкирующие последовательности); или олигонуклеотиды, имеющие длину от 17 нуклеотидов и примерно до 200 нуклеотидов, и содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, а предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из 3'-фланкирующей последовательности
- 65 030862 специфического мутантного аллеля FATB (то есть, например, комплементарной последовательности, которая 3'-фланкирует один или несколько делетированных, встроенных или замененных нуклеотидов в мутантных аллелях FATB согласно изобретению, например комплементарной последовательности, которая 3'-фланкирует делеционные мутации, нонсенс-мутации или мутации сайта сплайсинга, описанные выше, или комплементарной последовательности, которая 3'-фланкирует возможные мутации, приводящие к образованию стоп-кодона или мутации сайта сплайсинга, указанные выше в таблицах) у их 3'конца (праймеры, распознающие 3'-фланкирующие последовательности); или олигонуклеотиды, имеющие длину от 17 нуклеотидов и примерно до 200 нуклеотидов, и содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, а предпочтительно 20 нуклеотидов, выбранных из последовательности области мутации специфического мутантного аллеля FATB (то есть, например, последовательности нуклеотидов, встроенных или замененных в генах FATB согласно изобретению, или комплементарной ей последовательности) у их 3'-конца (праймеры, распознающие последовательности с мутациями).
Следует отметить, что праймеры могут иметь длину более чем вышеупомянутые 17 смежных нуклеотидов, и такие праймеры могут иметь длину, например, 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 нуклеотидов или более. Праймеры могут полностью состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из вышеупомянутых нуклеотидных последовательностей фланкирующих и мутированных последовательностей. Однако нуклеотидная последовательность праймеров у их 5'-конца (то есть за пределами 3'локализованных 17 смежных нуклеотидов) имеет менее важное значение. Так, например, 5'последовательность праймеров может состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из фланкирующих или мутированных последовательностей, если это необходимо, но она может также содержать несколько (например, 1, 2, 5, 10) несоответствий. 5'-последовательность праймеров может даже полностью состоять из нуклеотидной последовательности, которая не является родственной фланкирующим или мутированным последовательностям, такой как, например, нуклеотидная последовательность, представляющая собой сайты распознавания рестриктирующих ферментов. Такие неродственные последовательности или фланкирующие последовательности ДНК с несоответствиями предпочтительно должны содержать не более 100, а более предпочтительно не более 50 или даже 25 нуклеотидов.
Кроме того, подходящие праймеры у своего 3'-конца могут содержать нуклеотидную последовательность или состоять из нуклеотидной последовательности, охватывающей область стыка между фланкирующими и мутированными последовательностями (то есть, например, область стыка между последовательностью, которая 5'-фланкирует один или несколько делетированных, встроенных или замененных нуклеотидов в мутантных аллелях FATB согласно изобретению, и последовательностью одного или нескольких встроенных или замененных нуклеотидов, или последовательностью, которая 3'фланкирует один или несколько делетированных нуклеотидов, такую как область стыка между последовательностью, которая 5'-фланкирует делеционные мутации, нонсенс-мутации или мутации сайта сплайсинга в генах FATB согласно изобретению, описанных выше, и последовательностью нонсенс-мутаций или мутаций сайта сплайсинга, или последовательностью, которая 3'-фланкирует делеционную мутацию, или область стыка между последовательностью, которая 5'-фланкирует возможную мутацию, приводящую к образованию стоп-кодона, или мутацию сайта сплайсинга, как указано выше в таблицах, и последовательностью с возможными мутациями, приводящими к образованию стоп-кодона, или мутациями сайта сплайсинга), при условии, что вышеупомянутые 3'-локализованные нуклеотиды не происходят исключительно от областей мутации или фланкирующих областей.
Специалисту в данной области также совершенно очевидно, что правильно выбранные пары ПЦР-праймеров также не должны содержать последовательности, комплементарные друг другу.
В соответствии с настоящим изобретением термин комплемент нуклеотидной последовательности, представленный в SEQ ID No: X означает нуклеотидную последовательность, которая может происходить от представленной нуклеотидной последовательности в результате замены нуклеотидов на их комплементарный нуклеотид в соответствии с правилами Чаргаффа (АоТ; GoC) и считывания этой последовательности в направлении 5' 3', то есть в направлении, противоположном направлению представленной нуклеотидной последовательности.
Примеры праймеров, подходящих для идентификации конкретных специфических мутантных аллелей FATB, описаны в разделе Примеры.
Используемый здесь термин нуклеотидная последовательность SEQ ID No.Z, простирающаяся от положения X до положения Y означает нуклеотидную последовательность, включающую оба эти положения.
При этом предпочтительно, чтобы амплифицированный фрагмент имел длину от 50 до 1000 нуклеотидов, например длину от 50 до 500 нуклеотидов, или длину от 100 до 350 нуклеотидов. Специфические праймеры могут иметь последовательности, которые на 80-100% идентичны последовательности в 5'- или 3'-фланкирующей области, последовательности в области мутации или последовательности, охватывающей область стыка между 3'- или 5'-фланкирующими областями и областями мутации специфического мутантного аллеля FATB, при условии, что имеющиеся несоответствия все же позволят осуществ
- 66 030862 лять специфическую идентификацию специфического мутантного аллеля FATB с помощью этих праймеров в оптимизированных условиях ПЦР. Однако ряд допустимых несоответствий может быть легко определен экспериментально или известен специалистам в данной области.
Детектирование и/или идентификация специфического фрагмента мутантного FATB могут быть осуществлены различными методами, например путем оценки размера после проведения гельэлектрофореза или электрофореза в капиллярном геле, или флуоресцентными методами детектирования. Специфические фрагменты мутантного FATB могут быть также непосредственно секвенированы. Специалистам также известны и другие последовательность-специфические методы детектирования амплифицированных фрагментов ДНК.
Стандартные ПЦР-протоколы описаны в литературе, например в руководстве PCR Applications Manual (Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999) и в других публикациях. Оптимальные условия проведения ПЦР, включая последовательность специфических праймеров, определены в протоколе ПЦР-идентификации для каждого специфического мутантного аллеля FATB. Однако следует отметить, что в данном протоколе ПЦР-идентификации, для получения аналогичных результатов может оказаться необходимым скорректировать и слегка модифицировать ряд параметров в соответствии с конкретными лабораторными условиями. Так, например, при применении другого метода получения ДНК может потребоваться коррекция, например, количества праймеров, количества полимераз, концентрации MgCl2 или условий гибридизации. Аналогичным образом, выбор других праймеров может определять другие оптимальные условия для осуществления протокола ПЦР-идентификации. Однако такая корректировка должна быть очевидна для специалиста в данной области и, кроме того, она подробно описана в современных руководствах по применению ПЦР, таких как руководства, цитируемые выше.
Примеры протоколов ПЦР-идентификации специфических мутантных аллелей FATB описаны в разделе Примеры.
Альтернативно, специфические праймеры могут быть использованы для амплификации специфического фрагмента мутантного FATB, который может быть использован в качестве специфического зонда для идентификации конкретного мутантного аллеля FATB в биологических образцах. Контактирование нуклеиновой кислоты биологического образца с зондом в условиях, способствующих гибридизации зонда с его соответствующим фрагментом в нуклеиновой кислоте приводит к образованию гибрида нуклеиновая кислота/зонд. Образование такого гибрида может быть детектировано (например, путем мечения нуклеиновой кислоты или зонда), и будет указывать на присутствие специфического мутантного аллеля FATB. Такие методы идентификации на основе гибридизации со специфическим зондом (например, на твердофазном носителе или в растворе) описаны в литературе. Специфическим зондом предпочтительно является последовательность, которая, в оптимизированных условиях, специфически гибридизуется с областью, присутствующей в 5'- или 3'-фланкирующей области и/или в области мутации специфического мутантного аллеля FATB (далее называемого специфической областью мутации FATB). Специфический зонд предпочтительно содержит последовательность, состоящую из 20-1000, 50-600, 100-500, 150-350 п.н., которая по меньшей мере на 80, предпочтительно на 80-85, более предпочтительно на 85-90, особенно предпочтительно на 90-95, а наиболее предпочтительно на 95-100% идентична (или комплементарна) нуклеотидной последовательности специфической области. Специфический зонд предпочтительно содержит последовательность, состоящую примерно из 15-100 смежных нуклеотидов, идентичных (или комплементарных) специфической области специфического мутантного аллеля FATB.
Подходящими для осуществления настоящего изобретения могут быть следующие специфические зонды:
олигонуклеотиды, имеющие длину от 20 и примерно до 1000 нуклеотидов и содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из 5'фланкирующей последовательности специфического мутантного аллеля FATB (то есть, например, последовательности, которая 5'-фланкирует один или несколько делетированных, встроенных или замененных нуклеотидов в мутантных аллелях FATB согласно изобретению, например последовательности, которая 5'-фланкирует делеционные мутации, нонсенс-мутации или мутации сайта сплайсинга, описанные выше, или последовательности, которая 5'-фланкирует возможные мутации, приводящие к образованию стоп-кодона или мутации сайта сплайсинга, указаны выше в таблицах) или последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична этой последовательности (зонды, распознающие 5'-фланкирующие последовательности); или олигонуклеотиды, имеющие длину от 20 и примерно до 1000 нуклеотидов, и содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из 3'фланкирующей последовательности специфического мутантного аллеля FATB (то есть, например, последовательности, которая 3'-фланкирует один или несколько делетированных, встроенных или замененных нуклеотидов в мутантных аллелях FATB согласно изобретению, например последовательности, которая 3'-фланкирует делеционные мутации, нонсенс-мутации или мутации сайта сплайсинга, описанные выше, или последовательности, которая 3'-фланкирует возможные мутации, приводящие к образованию стоп-кодона или мутации сайта сплайсинга, указаны выше в таблицах) или последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична этой последовательности (зонды, распознающие 3'-фланкирующие
- 67 030862 последовательности); или олигонуклеотиды, имеющие длину от 20 и примерно до 1000 нуклеотидов, и содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из мутированной последовательности специфического мутантного аллеля FATB (то есть, например, последовательности нуклеотидов, встроенных или замененных в генах FATB согласно изобретению, или комплементарной ей последовательности) или последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична этой последовательности (зонды, распознающие мутированные последовательности).
Зонды могут полностью состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из вышеупомянутых нуклеотидных последовательностей фланкирующих и мутированных последовательностей. Однако нуклеотидная последовательность зондов у их 5'- или 3'-концов имеет менее важное значение. Так, например, 5'- или 3'-последовательности зондов могут состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из фланкирующих или мутированных последовательностей, если это необходимо, но они могут также состоять из нуклеотидной последовательности, которая не является родственной фланкирующим или мутированным последовательностям. Такие неродственные последовательности предпочтительно должны содержать не более 50, а более предпочтительно не более 25 или даже не более 20 или 15 нуклеотидов.
Кроме того, подходящие зонды могут содержать нуклеотидную последовательность или состоять из нуклеотидной последовательности, охватывающей область стыка между фланкирующими и мутированными последовательностями (то есть, например, область стыка между последовательностью, которая 5'фланкирует один или несколько делетированных, встроенных или замененных нуклеотидов в мутантных аллелях FATB согласно изобретению, и последовательностью одного или нескольких встроенных или замененных нуклеотидов, или последовательностью, которая 3'-фланкирует один или несколько делетированных нуклеотидов, такую как область стыка между последовательностью, которая 5'-фланкирует делеционные мутации, нонсенс-мутации или мутации сайта сплайсинга в генах FATB согласно изобретению, описанных выше, и последовательностью нонсенс-мутаций или мутаций сайта сплайсинга, или последовательностью, которая 3'-фланкирует делеционную мутацию, или область стыка между последовательностью, которая 5'-фланкирует возможную мутацию, приводящую к образованию стоп-кодона, или мутацию сайта сплайсинга, как указано выше в таблицах, и последовательностью с возможными мутациями, приводящими к образованию стоп-кодона, или мутациями сайта сплайсинга), при условии, что вышеупомянутая нуклеотидная последовательность не происходит исключительно от области мутации или фланкирующих областей.
Примеры специфических зондов, подходящих для идентификации специфических мутантных аллелей FATB, описаны в разделе Примеры.
Детектирование и/или идентификация специфической области мутантного FATB, гибридизующейся со специфическим зондом, могут быть осуществлены различными методами, например путем оценки размера после проведения гель-электрофореза или флуоресцентными методами детектирования. Специалистам также известны и другие последовательность-специфические методы детектирования специфической области мутантного FATB, гибридизующейся со специфическим зондом.
Альтернативно, растения или их части, содержащие один или несколько мутантных аллелей fatB, могут быть выращены и идентифицированы другими методами, такими как метод Delete-a-gene™, который включает проведение ПЦР в целях скрининга на делеционные мутанты, образующиеся в результате мутагенеза под действием быстрых нейтронов (см. Li и Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2:254-258); метод TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes), который позволяет идентифицировать EMS-индуцированные точковые мутации путем проведения денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (ДВЭЖХ) для детектирования модификаций пар оснований с помощью анализа на образование гетеродуплекса (McCallum et al., 2000, Nat Biotech., 18:455 и McCallum et al. 2000, Plant Physiol., 123, 439-442) и т.п. Как упоминалось выше, метод TILLING включает высокоэффективный скрининг на мутации (например, с применением Cell-рестрикции мутантной гетеродуплексной ДНКгетеродуплексной ДНК дикого типа и детектирования с использованием системы секвенирующих гелей). Таким образом, настоящее изобретение включает применение метода TILLING для идентификации растений, семян и тканей, содержащих один или несколько мутантных аллелей fatB в одной или нескольких тканях, и методов выращивания и идентификации таких растений. Так, например, в одном из вариантов изобретения указанный способ согласно изобретению включает проведение стадий мутагенеза семян растений (например, EMS-мутагенеза), сбора отдельных растений или ДНК, ПЦР-амплификации представляющей интерес области, образования гетеродуплекса и высокоэффективного детектирования, идентификации мутантного растения и секвенирования мутантного ПЦР-продукта. Следует отметить, что для выращивания таких мутантных растений, с таким же успехом могут быть применены и другие методы мутагенеза и селекции.
Вместо аллелей fatB, которые были индуцированы путем введения мутаций, могут быть идентифицированы природные (спонтанные) мутантные аллели fatB, методами, известными специалистам. Так, например, для скрининга множества растений или их частей на присутствие природных мутантных аллелей fatB может быть использован метод ECOTILLING (Henikoff et al. 2004, Plant Physiology, 135(2):630
- 68 030862
6). Как и в случае описанного выше метода мутагенеза, были скринированы, предпочтительно растения вида Brassica, которые содержат геном А и/или С, для того, чтобы идентифицированный аллель fatB мог быть затем введен в другие растения вида Brassica, такие как Brassica napus, путем скрещивания (межвидового или внутривидового скрещивания) и селекции. В методе ECOTILLING, природный полиморфизм в линиях скрещивания или в родственных видах скринируют методом TILLING, описанным выше, в котором в целях ПЦР-амплификации fatB-мишени, для анализа на образования гетеродуплекса и для высокоэффективного анализа используют отдельные растения или пулы. Это может быть осуществлено путем селекции отдельных растений, имеющих нужную мутацию, которые могут быть затем использованы в программе селекции для введения желаемого мутантного аллеля.
Идентифицированные мутантные аллели могут быть затем секвенированы, и их последовательности могут быть подвергнуты сравнению с последовательностями аллеля дикого типа для идентификации мутации(й). Функциональные свойства могут быть, но необязательно, протестированы посредством экспрессии в гомологичном или гетерологичном хозяине и оценки мутантного белка FATB на его функциональность в ферментном анализе. С применением такого метода может быть идентифицировано множество мутантных аллелей fatB (и растений Brassica, содержащих один или несколько этих аллелей). Затем нужные мутантные аллели могут быть объединены с нужными аллелями дикого типа методами скрещивания и селекции, подробно описанными ниже. И наконец, может быть выращено одно растение, содержащее нужное число мутантных fatB и нужное число аллелей FATB дикого типа.
Олигонуклеотиды, подходящие для использования в качестве ПЦР-праймеров или специфических зондов для детектирования специфического мутантного аллеля FATB, могут быть также использованы в целях разработки метода определения типа зиготности специфического мутантного аллеля FATB.
Для определения типа зиготности специфического мутантного аллеля FATB может быть разработан ПЦР-анализ в целях определения присутствия специфического мутантного аллеля FATB и/или соответствующего специфического аллеля FATB дикого типа.
Для определения типа зиготности специфического мутантного аллеля FATB могут быть сконструированы два праймера, специфически распознающие аллель FATB дикого типа и расположенные в направлении друг к другу, а также содержащие область мутации, локализованную между этими праймерами. Такими праймерами могут быть праймеры, специфически распознающие 5'- и 3'-фланкирующие последовательности соответственно. С использованием такого набора праймеров можно одновременно проводить диагностическую ПЦР-амплификацию мутанта, а также соответствующего аллеля FATB дикого типа.
Альтернативно, для определения типа зиготности специфического мутантного аллеля FATB могут быть сконструированы два праймера, специфически распознающие аллель FATB дикого типа и расположенные в направлении друг к другу, где один из них специфически распознает область мутации. Такими праймерами могут быть праймеры, специфически распознающие последовательность 5'- и 3'фланкирующей области и области мутации аллеля FATB дикого типа соответственно. С использованием такого набора праймеров вместе с третьим праймером, который специфически распознает последовательность области мутации в мутантном аллеле FATB, можно одновременно проводить диагностическую ПЦР-амплификацию мутантного гена FATB, а также гена FATB дикого типа.
Альтернативно, для определения типа зиготности специфического мутантного аллеля FATB могут быть сконструированы два праймера, специфически распознающие аллель FATB дикого типа и расположенные в направлении друг к другу, где один из них специфически распознает область стыка между 5'-или 3'-фланкирующей областью и областью мутации. Такими праймерами могут быть праймеры, специфически распознающие 5'- и 3'-фланкирующую последовательность и область стыка между областью мутации и 5'- и 3'-фланкирующей областью аллеля FATB дикого типа соответственно. С использованием такого набора праймеров вместе с третьим праймером, который специфически распознает область стыка между областью мутации и 5'- или 3'-фланкирующей областью мутантного аллеля FATB, соответственно можно одновременно проводить диагностическую ПЦР-амплификацию мутантного гена FATB, а также гена FATB дикого типа.
Альтернативно, тип зиготности специфического мутантного аллеля FATB может быть определен с использованием альтернативных наборов праймеров, которые специфически распознают мутантные аллели FATB и аллели FATB дикого типа.
Если растение является гомозиготным по мутантному гену FATB или соответствующему гену FATB дикого типа, то диагностические ПЦР-анализы, описанные выше, позволяют идентифицировать один типичный предпочтительно по своей длине ПЦР-продукт для мутантного аллеля FATB или аллеля FATB дикого типа. Если данное растение является гемизиготным по мутантному аллелю FATB, то очевидно, что два специфических ПЦР-продукта будут отражать амплификацию мутантного аллеля FATB и аллеля FATB дикого типа.
Идентификация специфических ПЦР-продуктов FATB дикого типа и мутантного FATB может быть осуществлена, например, путем оценки размера данного продукта после гель-электрофореза или электрофореза в капиллярном геле (например, анализа на мутантные аллели FATB, содержащие ряд встроенных или делетированных нуклеотидов, которые дают различие в размерах для фрагментов, амплифици
- 69 030862 рованных из аллеля FATB дикого типа и мутантного аллеля FATB, где указанные фрагменты могут быть явно разделены на геле); путем оценки присутствия или отсутствия двух различных фрагментов после проведения гель-электрофореза или электрофореза в капиллярном геле, где диагностическая ПЦРамплификация мутантного аллеля FATB может быть, но необязательно, проведена отдельно от диагностической ПЦР-амплификации аллеля FATB дикого типа; путем прямого секвенирования амплифицированных фрагментов или методами флуоресцентного детектирования.
Примеры праймеров, подходящих для определения типа зиготности специфических мутантных аллелей FATB, описаны в разделе Примеры.
Альтернативно, для определения статуса зиготности специфического мутантного аллеля FATB может быть разработан гибридизационный анализ в целях определения присутствия специфического мутантного аллеля FATB и/или соответствующего специфического аллеля FATB дикого типа.
Для определения типа зиготности специфического мутантного аллеля FATB могут быть сконструированы два специфических зонда, распознающие аллель FATB дикого типа, где каждый зонд специфически распознает последовательность в аллеле FATB дикого типа, а область мутации расположена между последовательностями, распознаваемыми этими зондами. Такими зондами могут быть зонды, специфически распознающие 5'- и 3'-фланкирующие последовательности соответственно. Применение одного или предпочтительно обоих этих зондов позволяет одновременно проводить диагностическую гибридизацию мутантного аллеля FATB, а также соответствующего аллеля FATB дикого типа.
Альтернативно, для определения типа зиготности конкретного мутантного аллеля FATB могут быть сконструированы два специфических зонда, распознающие аллель FATB дикого типа, где один из этих зондов специфически распознает последовательность в аллеле FATB дикого типа, расположенную выше или ниже области мутации, а предпочтительно выше области мутации, а другой зонд специфически распознает область мутации. Такими зондами могут быть зонды, специфически распознающие последовательность 5'-или 3'-фланкирующей области, а предпочтительно 5'-фланкирующей области и области мутации аллеля FATB дикого типа соответственно. Применение одного или предпочтительно обоих этих зондов, необязательно вместе с третьим зондом, который специфически распознает последовательность области мутации в мутантном аллеле FATB, позволяет проводить диагностическую гибридизацию мутантного гена FATB и гена FATB дикого типа.
Альтернативно, для определения типа зиготности специфического мутантного аллеля FATB может быть сконструирован зонд, специфически распознающий аллель FATB дикого типа и область стыка между 5'- или 3'-фланкирующей областью, а предпочтительно 5'-фланкирующей областью, и областью мутации аллеля FATB дикого типа. С использованием такого зонда, необязательно вместе со вторым зондом, который специфически распознает область стыка между 5'- или 3'-фланкирующей областью, а предпочтительно 5'-фланкирующей областью, и областью мутации мутантного аллеля FATB, можно проводить диагностическую гибридизацию мутантного гена FATB и гена FATB дикого типа.
Альтернативно, тип зиготности специфического мутантного аллеля FATB может быть определен с использованием альтернативных наборов зондов, которые специфически распознают мутантные аллели FATB и аллели FATB дикого типа.
Если растение является гомозиготным по мутантному гену FATB или соответствующему гену FATB дикого типа, то диагностические гибридизационные анализы, описанные выше, позволяют идентифицировать один специфический продукт гибридизации, такой как один или несколько гибридизующихся фрагментов ДНК (рестрикционных фрагментов), то есть продукт, длина которого типична для мутантного аллеля FATB или аллеля FATB дикого типа. Если данное растение является гемизиготным по мутантному аллелю FATB, то очевидно, что два специфических продукта гибридизации будут отражать гибридизацию мутантного аллеля FATB и аллеля FATB дикого типа.
Идентификация специфических продуктов гибридизации FATB дикого типа и мутантного FATB может быть осуществлена, например, путем оценки размера данного продукта после гель-электрофореза или электрофореза в капиллярном геле (например, анализа на мутантные аллели FATB, содержащие ряд встроенных или делетированных нуклеотидов, которые дают различие в размерах для гибридизующихся фрагментов ДНК (рестрикционных фрагментов) аллеля FATB дикого типа и мутантного аллеля FATB, где указанные фрагменты могут быть явно разделены на геле); путем оценки присутствия или отсутствия двух различных специфических продуктов гибридизации после проведения гель-электрофореза или электрофореза в капиллярном геле, где указанная диагностическая гибридизация мутантного аллеля FATB может быть, но необязательно, проведена отдельно от диагностической гибридизации аллеля FATB дикого типа; путем прямого секвенирования гибридизующихся фрагментов ДНК (рестрикционных фрагментов) или методами флуоресцентного детектирования.
Примеры зондов, подходящих для определения зиготности специфических мутантных аллелей FATB, описаны в разделе Примеры.
Кроме того, на основе имеющейся здесь информации о конкретной последовательности, специфичной для мутантного аллеля FATB, могут быть также разработаны методы детектирования, которые являются специфичными для специфического мутантного аллеля FATB и которые отличаются от ПЦРметодов амплификации или методов амплификации на основе гибридизации. Такими альтернативными
- 70 030862 методами детектирования являются методы детектирования амплификации линейного сигнала, разработанные на основе инвазивного расщепления конкретных структур нуклеиновой кислоты, и также известные как технология Invader™, (описанная, например, в патентах США 5985557 Invasive Cleavage of Nucleic Acids, и 6001567 Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки), методы детектирования на основе ОТ-ПЦР, такие как Taqman, или другие методы детектирования, такие как SNPlex.
Наборы согласно изобретению.
Используемый здесь термин набор означает набор реагентов, используемых для осуществления способа согласно изобретению, а более конкретно, для идентификации специфического мутантного аллеля FATB в биологических образцах, или для определения типа зиготности растительного материала, содержащего специфический мутантный аллель FATB. Более конкретно, в предпочтительном варианте изобретения, набор согласно изобретению содержит по меньшей мере два описанных выше специфических праймера, используемых для идентификации специфического мутантного аллеля FATB, или по меньшей мере два или три специфических праймера, используемых для определения типа зиготности. Указанный набор может также содержать, но необязательно, любой другой описанный здесь реагент, используемый в протоколе ПЦР-идентификации. Альтернативно, в соответствии с другим вариантом изобретения, указанный набор может содержать по меньшей мере один специфический зонд, который специфически гибридизуется с нуклеиновой кислотой биологических образцов, и который может быть использован в целях идентификации присутствия специфического мутантного аллеля FATB в этих образцах, как описано выше, и в целях идентификации специфического мутантного аллеля FATB, или по меньшей мере два или три специфических зонда, используемых в целях определения типа зиготности. Указанный набор, может также, но необязательно, содержать любой другой реагент (такой как, но не ограничивающийся ими, буфер для гибридизации, метка), который может быть использован для идентификации специфического мутантного аллеля FATB в биологических образцах с использованием специфического зонда.
Набор согласно изобретению может быть использован, а его компоненты могут быть специально скорректированы для повышения контроля качества (например, чистоты партий семян), для детектирования присутствия или отсутствия специфического мутантного аллеля FATB в растительном материале или материале, содержащем указанный растительный материал или происходящем от такого материала, таком как, но не ограничивающемся ими, пищевой продукт или корм для животных.
Используемый здесь термин праймер охватывает любую нуклеиновую кислоту, способную инициировать синтез растущей нуклеиновой кислоты в зависимом от матрицы процессе, таком как ПЦР. Обычно праймерами являются олигонуклеотиды, имеющие от 10 до 30 нуклеотидов, но они могут иметь и более длинные последовательности. Праймеры могут быть получены в двухцепочечной форме, хотя предпочтительной является одноцепочечная форма. Зонды могут быть использованы в качестве праймеров, однако они могут быть сконструированы так, чтобы они связывались с ДНК- или РНК-мишенью, и такие зонды необязательно должны быть использованы в процессе амплификации.
Используемый здесь термин распознающий, если он относится к специфическим праймерам, означает, что специфические праймеры специфически гибридизуются с последовательностью нуклеиновой кислоты в специфическом мутантном аллеле FATB в условиях, описанных в данном методе (таких как условия протокола ПЦР-идентификации), где указанную специфичность определяют по присутствию позитивного и негативного контроля.
Используемый здесь термин гибридизующийся, если он относится к специфическим зондам, означает, что зонд связывается с конкретной областью в последовательности нуклеиновой кислоты специфического мутантного аллеля FATB в стандартных условиях жесткости. Используемый здесь термин стандартные условия жесткости означает условия гибридизации, описанные в настоящей заявке, или стандартные условия гибридизации, описанные в руководстве Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY), где указанная гибридизация, например, может включать следующие стадии: 1) иммобилизации фрагментов геномной ДНК растения или библиотеки ДНК ВАС на фильтре, 2) предварительной гибридизации фильтра в течение 1-2 ч при 65°C в 6Х SSC, 5X реагенте Денхардта, 0,5% ДСН и 20 мкг/мл денатурированной ДНК-носителя, 3) добавления меченного зонда для гибридизации, 4) инкубирования в течение 16-24 ч, 5) однократной промывки фильтра в течение 30 мин при 68°C в 6Х SSC, 0,1% ДСН, 6) трехкратной промывки фильтра (два раза в течение 30 мин в 30 мл и один раз в течение 10 мин в 500 мл) при 68°C в 2x SSC, 0,1% ДСН, и 7) экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой в течение 4-48 ч при -70°C.
Используемый здесь термин биологический образец означает образец растения, растительного материала или продукта, содержащего растительный материал. Термин растение охватывает ткани растения Brassica на любой стадии созревания, а также любые клетки, ткани или органы, выделенные или происходящие от любого из таких растений, включая, но не ограничиваясь ими, любые семена, листья, стебли, цветки, корни, моноклетки, гаметы, клеточные культуры, тканевые культуры или протопласты. Используемый здесь термин растительный материал означает материал, полученный или происходящий от растения. Термин продукты, содержащие растительный материал означает пищевые продукты,
- 71 030862 корма для животных или другие продукты, полученные с использованием растительного материала, или продукты, которые могут содержать растительный материал в качестве примеси. Следует отметить, что в контексте настоящего изобретения, указанные биологические образцы тестируют на присутствие нуклеиновых кислот, специфичных для конкретного мутантного аллеля FATB, и тем самым на присутствие нуклеиновых кислот в образцах. Таким образом, описанные здесь методы идентификации специфического мутантного аллеля FATB в биологических образцах позволяют идентифицировать нуклеиновые кислоты, содержащие специфический мутантный аллель FATB, в биологических образцах.
Настоящее изобретение также относится к переносу одного или нескольких специфических мутантных аллелей FATB из одного растения Brassica в другое растение Brassica, к объединению специфических аллелей FATB в одном растении, к растениям, содержащим один или несколько специфических мутантных аллелей FATB, к потомству, полученному от этих растений и к клеткам растений или к растительному материалу, происходящему от этих растений.
Таким образом, в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к способу переноса мутантного аллеля FATB из одного растения Brassica в другое растение Brassica, где указанный способ включает стадии:
(a) скрещивания растения Brassica, содержащего мутантный аллель FATB, описанный выше, со вторым растением Brassica;
(b) сбора семян гибрида F1, полученного от данного кросса;
(c) необязательно, возвратного скрещивания растений F1, выращенных из семян F1, для одного или более поколений (х), сбора семян ВСх, полученных от данных кроссов, и идентификации растений ВСх в каждом поколении, выращенных из семян ВСх, содержащих мутантный аллель FATB, описанный выше;
(d) необязательно, сбора гаплоидных растений с двойным набором хромосом из обработанных микроспор или клеток пыльцы растений F1 или ВС1 с получением гомозиготных растений;
(e) самоопыления растений F1 или ВСх, выращенных из семян F1 или ВСх;
(f) сбора семян F1 S1 или ВСх S1 после самоопыления;
(g) идентификации растений F1 S1 или ВСх S1, выращенных из семян F1 S1 или ВСх S1, содержащих мутантный аллель FATB, описанный выше.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу объединения по меньшей мере двух мутантных аллелей FATB в одном растении Brassica, где указанный способ включает стадии:
(a) переноса мутантного(ых) аллеля(ей) FATB из одного растения Brassica в другое растение Brassica, как описано выше;
(b) повторения стадии (а) до получения желаемого числа и/или типа мутантных аллелей FATB, объединенных во втором растении.
В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к способу выращивания растения Brassica, содержащего по меньшей мере 3 мутантных аллеля fatB от трех различных описанных здесь генов FATB, где указанный способ включает стадии:
(a) объединения по меньшей мере трех мутантных аллелей FATB по меньшей мере от трех различных генов FATB в одном растении Brassica, как описано выше;
(b) необязательно, идентификации растения или его части, которые являются гомозиготными или гетерозиготными по одному или нескольким мутантным аллелям FATB, путем определения типа зиготности одного или нескольких мутантных аллелей FATB, описанных выше;
(c) необязательно, идентификации растения или его части, содержащих значительно пониженное количество функционального белка FATB;
(d) необязательно, идентификации растения, семена которых дают масло, в котором состав жирных кислот значительно отличается от состава жирных кислот в масле семян соответствующего растения Brassica дикого типа;
(e) необязательно, выращивания указанных растений и выделения из семян таких растений масла для его употребления человеком в пищу.
Масло семян растений согласно изобретению.
Настоящее изобретение относится к маслу с низким содержанием насыщенных жирных кислот и к маслу не содержащему насыщенных жирных кислот, полученным из семян растений Brassica согласно изобретению, в частности, описанных здесь растений Brassica napus, а также от других масличных культур Brassica. Так, например, масличные культуры Brassica, такие как Brassica juncea и Brassica rapa, содержат мутантные гены FATB-A и/или FATB-C.
Было обнаружено, что для значительного снижения процента (мас.%) насыщенных жирных кислот в масле семян растений, не достаточно, чтобы мутация, которая приводит к значительному снижению количества функционального белка FATB, кодируемого эквивалентным мутантным аллелем fatB дикого типа, была введена только в один или два из этих шести генов FATB. Очевидно, что для получения растений, у которых масло семян содержит низкий уровень насыщенных кислот или вообще не содержит насыщенных кислот, необходимо, чтобы эти растения имели по меньшей мере три мутантных аллеля fatB от трех различных генов FATB (выбранных из FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3).
- 72 030862
Таким образом, в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к маслу с низким содержанием насыщенных жирных кислот и к маслу не содержащему насыщенных жирных кислот, полученному из семян растений Brassica, содержащих по меньшей мере 3 мутантных аллеля fatB от трех различных генов FATB (выбранных из FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 and FATBC3), где указанные мутантные аллели fatB дают значительно более низкое количество функционального белка FATB, кодируемого аллелем, эквивалентным этим мутантным аллелям, и таким образом, они дают в целом значительно более низкое количество функциональных белков FATB, продуцируемых в клетках растений, в частности в развивающихся семенах in vivo.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к маслу с низким содержанием насыщенных жирных кислот и к маслу не содержащему насыщенных жирных кислот, полученному из семян растений Brassica, которые являются гомозиготными по тройному мутантному FATB, гомозиготными по квадруплетному мутантному FATB и/или гомозиготными по квинтуплетному мутантному FATB, где указанные мутантные аллели выбраны из генов FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к маслу с низким содержанием насыщенных жирных кислот и к маслу не содержащему насыщенных жирных кислот, полученному из семян растений Brassica, которые являются гомозиготными по тройному мутантному FATB, гомозиготными по квадруплетному мутантному FATB и/или гомозиготными по квинтуплетному мутантному FATB, и которые содержат дополнительный мутантный аллель FATB, где указанные мутантные растения или их части являются гетерозиготными по дополнительному мутантному аллелю FATB, и где указанные мутантные аллели выбраны из генов FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3.
Путем объединения достаточного числа копий специфических мутантных аллелей fatB с достаточным числом копий специфических аллелей FATB дикого типа в одном растении можно точно скорректировать количество и/или тип функциональных белков FATB, что, в свою очередь, может влиять на экспорт (количество и/или тип) свободных насыщенных жирных кислот из пластиды и тем самым на состав жирных кислот в масле, полученном из семян.
Таким образом, в другом своем варианте настоящее изобретение относится к маслу семян, содержащему насыщенные жирные кислоты в определенном количестве и/или конкретного типа, и полученному из семян растений Brassica, содержащих по меньшей мере один специфический мутантный аллель FATB согласно изобретению и по меньшей мере один специфический аллель FATB дикого типа согласно изобретению, где указанная конкретная комбинация мутантного(ых) аллеля(ей) FATB и аллеля(ей) FATB дикого типа дает функциональные белки FATB в конкретном количестве и/или конкретного типа, продуцируемые в клетках растений, в частности в развивающихся семенах in vivo.
Настоящее изобретение также включает применение масла семян согласно изобретению для приготовления пищевых продуктов, в частности для приготовления пищи, которая рассматривается как пища, полезная для здоровья человека. Хотя предусматривается, что масло согласно изобретению может быть использовано, главным образом, для приготовления пищи (пищевых продуктов), однако оно может быть также использовано для приготовления корма для животных (кормовых продуктов). В других своих применениях настоящее изобретение включает смешивание масла семян с конкретно измененным относительным количеством и/или составом насыщенных жирных кислот согласно изобретению, в частности смешивание масла семян, содержащего значительно менее 7% насыщенных жирных кислот согласно изобретению, с другими растительными маслами, в частности с растительными маслами, содержащими значительно более 7% насыщенных жирных кислот, такими как масла, упомянутые в разделе Предшествующий уровень техники, для снижения уровня насыщенных жирных кислот в последних указанных растительных маслах, что делает эти масла более подходящими для применения в определенных целях, таких как, но не ограничивающихся ими, производство дизельного биотоплива.
Последовательности.
В списке последовательностей указаны последовательности геномных ДНК FATB дикого типа, кодирующие белок FATB. Эти последовательности содержат 5 экзонов, прерываемых 4 интронами. В кДНК и в соответствующей процессированной мРНК (то есть в сплайсированной РНК) интроны удалены и присоединены экзоны. Так, например, кДНК гена FATB-A1, кодирующего белок FATB-A1 дикого типа от озимого масличного рапса (WOSR) Brassica napus, имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, в положениях 1-504, 590-723, 798-911, 981-1152 и 1243-1560.
- 73 030862
Гены FATB.
SEQ ID NO 1: ДНК гена FATB-A1 (с интронами), кодирующего белок FATB-A1 дикого типа от озимого масличного рапса (WOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 2: Белок FATB-A1 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO 3: ДНК гена FATB-A2 (с интронами), кодирующего белок FATB-A2 дикого типа от озимого масличного рапса (WOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 4: Белок FATB-A2 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO 5: ДНК гена FATB-A3 (с интронами), кодирующего белок FATB-A3 дикого типа от озимого масличного рапса (WOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 6: Белок FATB-A3 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO 7: ДНК гена FATB-C1 (с интронами), кодирующего белок FATB-C1 дикого типа от озимого масличного рапса (WOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 8: Белок FATB-C1 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 7.
SEQ ID NO 9: ДНК гена FATB-C2 (с интронами), кодирующего белок FATB-C2 дикого типа от озимого масличного рапса (WOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 10: Белок FATB-C2 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 9.
SEQ ID NO 11: ДНК гена FATB-C3 (с интронами), кодирующего белок FATB-C3 дикого типа от озимого масличного рапса (WOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 12: Белок FATB-C3 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 11.
SEQ ID NO 13: ДНК гена FATB-A1 (с интронами), кодирующего белок FATB-A1 дикого типа от ярового масличного рапса (SOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 14: Белок FATB-A1 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 13.
SEQ ID NO 15: ДНК гена FATB-A2 (с интронами), кодирующего белок FATB-A2 дикого типа от ярового масличного рапса (SOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 16: Белок FATB-A2 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 15.
SEQ ID NO 17: ДНК гена FATB-A3 (с интронами), кодирующего белок FATB-A3 дикого типа от ярового масличного рапса (SOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 18: Белок FATB-A3 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 17.
SEQ ID NO 19: ДНК гена FATB-C1 (с интронами), кодирующего белок FATB-C1 дикого типа от ярового масличного рапса (SOSR) Brassica napus.
- 74 030862
SEQ ID NO 20: Белок FATB-C1 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 19.
SEQ ID NO 21: ДНК гена FATB-C2 (с интронами), кодирующего белок FATB-C2 дикого типа от ярового масличного рапса (SOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 22: Белок FATB-C2 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID N0: 21.
SEQ ID NO 23: ДНК гена FATB-СЗ (с интронами), кодирующего белок FATB-СЗ дикого типа от ярового масличного рапса (SOSR) Brassica napus.
SEQ ID NO 24: Белок FATB-СЗ дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 23.
SEQ ID NO 79: ДНК гена FATB1, кодирующего белок FATB1 дикого типа от Arabidopsis thaliana.
SEQ ID NO 80: Белок FATB1 дикого типа, кодируемый последовательностью SEQ ID NO 79.
Праймеры и зонды.
SEQ ID NO 25: 5'-зонд At FATB1
SEQ ID NO 26: олигонуклеотидный праймер KVA05-14
SEQ ID NO 27 : олигонуклеотидный праймер KVA05-15
SEQ ID NO 28 : З'-зонд At FATB1
SEQ ID NO 29: олигонуклеотидный праймер KVA05-16
SEQ ID NO 30 : олигонуклеотидный праймер KVA05-17
SEQ ID NO 31: : прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-A1 (SEQ ID NO: 13)
SEQ ID NO 32: обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-A1 (SEQ ID NO: 13)
SEQ ID NO 33: : прямой олигонуклеотид для детектирования
FATB-A2 (SEQ ID NO: 15)
SEQ ID NO 34 : обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-A2 (SEQ ID NO: 15)
SEQ ID NO 35: : прямой олигонуклеотид для детектирования
FATB-A3 (SEQ ID NO: 17)
SEQ ID NO 36: обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-A3 (SEQ ID NO: 17)
SEQ ID NO 37 : : прямой олигонуклеотид для детектирования
- 75 030862
FATB-Cl (SEQ ID NO: 19)
SEQ ID NO 38 : обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C1 (SEQ ID NO: 19)
SEQ ID NO 39: прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C2 (SEQ ID NO: 21)
SEQ ID NO 40 : обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C2 (SEQ ID NO: 21)
SEQ ID NO 41: прямой олигонуклеотид для детектирования
FATB-C3 (SEQ ID NO: 23)
SEQ ID NO 42 : обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-C3 (SEQ ID NO: 23)
SEQ ID NO 43: обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-Al
SEQ ID NO 44 : прямой олигонуклеотид для детектирования
FATB-A2
SEQ ID NO 45: обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-A2
SEQ ID NO 46: обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-A3
SEQ ID NO 47 : обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-C1
SEQ ID NO 48 : обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-C2
SEQ ID NO 49: обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-C3
SEQ ID NO 50 : прямой олигонуклеотид для детектирования
FATB-Al-EMS05
SEQ ID NO 51: прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-A1
SEQ ID NO 52 : обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-A1-: EMS05 и -Al
SEQ ID NO 53: прямой олигонуклеотид для детектирования
FATB-A1-EMS06
SEQ ID NO 54 : прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-A1
SEQ ID NO 55 : обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
- 76 030862
FATB-Al-EMS06 и -Al
SEQ ID NO 56: обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-A2-: EMS 0 5
SEQ ID NO 57: обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-A2
SEQ ID NO 58: прямой олигонуклеотид для детектирования
FATB-A2-: EMS05 и -A2
SEQ ID NO 59: обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-A2-EMS01
SEQ ID NO 60: обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-A2
SEQ ID NO 61 : прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-A2-: EMSO 1 и -A2
SEQ ID NO 62: обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-A3-EMS01
SEQ ID NO 63: обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-A3
SEQ ID NO 64: прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-A3-: EMS01 и -A3
SEQ ID NO 65: прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C1-EMS05
SEQ ID NO 66: прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C1
SEQ ID NO 67: обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C1-: EMS05, - -C1-EMS04 и -Cl
SEQ ID NO 68: прямой олигонуклеотид для детектирования
FATB-C1-EMS04
SEQ ID NO 69: прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C1
SEQ ID NO 70: прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C2-: EMS 02
SEQ ID NO 71: прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C2
SEQ ID NO 72 : обратный олигонуклеотид для детектирования
FATB-C2-: EMS 02 и -C2
SEQ ID NO 73: прямой олигонуклеотид для детектирования
- 77 030862
FATB-C2-EMS03
SEQ ID NO 74 : прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C2
SEQ ID NO 75: обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C2-: EMS03 и -C2
SEQ ID NO 76: прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C3-EMS02
SEQ ID NO 77 : прямой олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C3
SEQ ID NO 78 : обратный олигонуклеотид ДЛЯ детектирования
FATB-C3-EMS02 и -СЗ
SEQ ID NO 81 : олигонуклеотид ДЛЯ детектирования FATB-A1-
EMS0 5 SEQ ID NO 82 : олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-
EMS0 5 SEQ ID NO 83: олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-
EMS0 6 SEQ ID NO 84 : олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-
EMS0 6 SEQ ID NO 85: олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-
EMS01 SEQ ID NO 86: олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-
EMS01 SEQ ID NO 87 : олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-
EMS0 5 SEQ ID NO 88 : олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-
EMS0 5 SEQ ID NO 89: олигонуклеотид для детектирования FATB-A3-
EMS01 SEQ ID NO 90 : олигонуклеотид для детектирования FATB-A3-
EMS01 SEQ ID NO 91 : олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-
EMS0 4 SEQ ID NO 92 : олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-
EMS04 SEQ ID NO 93: олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-
- 78 030862
EMS 0 5
SEQ ID NO 94 : олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-
EMS0 5 SEQ ID NO 95: олигонуклеотид ДЛЯ детектирования FATB-C2-
EMS02 SEQ ID NO 96: олигонуклеотид для детектирования FATB-C2-
EMS02 SEQ ID NO 97: олигонуклеотид для детектирования FATB-C2-
EMS0 3 SEQ ID NO 98: олигонуклеотид для детектирования FATB-C2-
EMS0 3 SEQ ID NO 99: олигонуклеотид для детектирования FATB-C3-
EMS02 SEQ ID NO 100 : олигонуклеотид для детектирования FATB-C3-
EMS02 SEQ ID NO 101: олигонуклеотид для детектирования ENDO1
SEQ ID NO 102 : олигонуклеотид для детектирования ENDO1
Если это конкретно не указано в примерах, то все методы рекомбинантных ДНК проводились в соответствии со стандартными протоколами, описанными в руководствах Sambrook and Russell (2001) Molecular doning: A Laboratory Manual, Third Edition, 040 Spring Harbor Laboratory Press, NY, in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Сш-rent Protocols in Molecular Biol.,ogy, СштсЩ Protocols, USA and in Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology, LabFax, Second Edition, Academic Press (UK). Стандартные материалы и методы для молекулярного анализа растений описаны в руководстве Plant Molecular Biology, Labfax (1993), R.D.D. Сгоу, в совместной публикации BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UK. Стандартные материалы и методы для проведения полимеразных цепных реакций можно найти в публикациях Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, GOld Spring Harbor Laboratory Press, и McPherson at al. (2000) PCR -Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany. Стандартные процедуры для проведения AFLP-анализа описаны в публикации Vos et al. (1995, NAR 23:4407-4414) и в опубликованной заявке на патент ЕР 534858.
Примеры
Пример 1. Определение числа генов FATB в растении Brassica napus и выделение ДНКпоследовательностей генов FATB.
Для определения числа генов FATB в Brassica napus и определения последовательностей различных генов FATB были скринированы библиотеки бактериальных искусственных хромосом (ВАС) для различных сортов Brassica napus.
1.1. Выделение клонов ВАС, содержащих последовательность FATB.
Для идентификации колоний Escherichia coli, содержащих клон ВАС, имеющий последовательность FATB различных сортов Brassica napus, скринировали библиотеки ВАС элитных линий ярового масличного рапса Brassica napus (далее обозначаемых SOSR) и озимых сортов масличного рапса Brassica napus Express (далее обозначаемых WOSR Express) (средний размер клона более 120 т.п.н.), нанесенные в виде отдельных удвоенных клонов на найлоновые фильтры высокой плотности, где указанный скрининг проводили в соответствии со стандартными процедурами Саузерн-гибридизации:
ДНК-матрицы, используемые для конструирования зондов в целях детектирования генов FATB Brassica, получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Матрицы:
(a) вектор pGEM5Zf(+), содержащий 487 п.н.-фрагмент 5'-части гена FATB1 от Arabidopsis thaliana cv. ^lomUa (Atlg08510) (SEQ ID NO: 25) (pKVA48), (b) вектор pGEM5Zf(+), содержащий 352 п.н.-фрагмент 3'-части гена FATB1 от Arabidopsis thaliana cv. ^lomUa (SEQ ID NO: 28) (pKVA49).
Праймеры:
(a) прямой праймер: 5'-GAACTTTCATCAACCAGTTACC-3' (KVA05-14 - SEQ ID NO: 26), обратный праймер: 5'-TTATGC-AAGAGGATAGCTTACC-3' (KVA05-15 - SEQ ID NO: 27), (b) прямой праймер: 5-CAGTGTGTGGGTGATGATGA-3' (KVA05-16 - SEQ ID NO: 29), обратный праймер: 5'-TATTCCCACTGGAGCACTCT-3' (KVA05-17 - SEQ ID NO: 30).
ПЦР-смесь:
мкл 10х ПЦР-буфера, 2 мкл dNTP (25 мМ), 1 мкл полимеразы Taq (5 ед/мкл), 168 мкл Н2О, мкл KVA05-14 (10 мкМ), 4 мкл KVA05-15 (10 мкМ), 1 мкл pKVA48 (20 пг/мкл), мкл KVA05-16 (10 мкМ), 4 мкл KVA05-17 (10 мкМ), 1 мкл pKVA49 (20 пг/мкл),
- 79 030862 разделенная на части по 4х 50 мкл
Профиль реакции в термоячейке: 4 мин при 94°C; 5x [1 мин при 94°C (денатурация) и 1 мин при 50°C (отжиг) и 2 мин при 72°C (удлинение)]; 25x [40 с при 94°C (денатурация) и 40 с при 50°C (отжиг) и 1 мин при 72°C (удлинение)]; 5 мин при 72°C; охлаждение до 10°C.
В результате было получено:
(a) 487 п.н. ДНК-фрагмента гена Arabidopsis FATB1 (SEQ ID NO: 25; 5'-зонда AtFATB1), присутствующего в векторе pKVA48, (b) 352 п.н. ДНК-фрагмента гена Arabidopsis FATB1 (SEQ ID NO: 28; 3'-зонда AtFATB1), присутствующего в векторе pKVA49.
ДНК-фрагменты очищали, и 478 п.н.-ДНК-фрагменты (5'-зонд AtFATB1) метили в соответствии со стандартными процедурами (например, с использованием а-32Р -dCTP и сфер для мечения ДНК ReadyTo-Go - Amersham Bioscience®), а затем использовали для гибридизации с ДНК на найлоновой мембране. Альтернативно, 352 п.н. ДНК-фрагменты (3'-зонд AtFATB1) могут быть помечены и использованы для гибридизации с ДНК на найлоновой мембране.
Пре-гибридизацию осуществляли в течение 2 ч при 65°C в 30 мл нижеследующего буфера для гибридизации: 6x SSC (20x SSC содержит 3,0 М NaCl, 0,3 М Na-цитрат, pH 7,0), 5Х раствор Денхардта (100х раствор Денхардта содержит 2% фиколл, 2% поливинилпирролидон, 2% альбумин бычьей сыворотки), 0,5% ДСН и 20 мкг/мл денатурированной ДНК-носителя (одноцепочечной ДНК спермы рыб со средней длиной 120-3000 нуклеотидов).
Г ибридизацию осуществляли в нижеследующих условиях:
Меченный зонд денатурировали путем нагревания в течение 5 мин при 95°C и охлаждения на льду в течение 5 мин, а затем добавляли к 15 мл буфера для гибридизации (такого же буфера, который был использован для пре-гибридизации)
Гибридизацию осуществляли в течение ночи при 65°C.
Блоты три раза промывали в течение 30 мин при 65°C в пробирках для гибридизации (один раз 30 мл 6xSSC с 0,1% ДСН и два раза 30 мл 2xSSC с 0,1% ДСН) и один раз в течение 10 мин при 65°C промывали 500 мл 2xSSC с 0,1% ДСН в камере.
Пленку Kodak X-OMAT AR экспонировали радиоактивными блотами в течение 4 ч при -70°C.
Исходя из положительных сигналов 72 колонии Е. coli, содержащие клон ВАС, имеющий последовательность FATB, собирали посредством скрининга ВАС-библиотеки от WOSR Express (всего n° позитивных колоний: 114), и 40 колоний собирали посредством скрининга ВАС-библиотеки от SOSR (всего n° позитивных колоний: 135) во второй процедуре скрининга ВАС-библиотеки (далее называемых позитивными колониями).
1.2. Выделение ВАС-клонов, содержащих полноразмерную последовательность FATB.
Для идентификации позитивных колоний, содержащих клон ВАС с полноразмерной геномной последовательностью одного из генов FATB, проводили Саузерн-блот-анализ на ДНК клона ВАС, выделенной из позитивных колоний, и на геномной ДНК, выделенной из Brassica napus:
ДНК ВАС-клона выделяли путем лизиса щелочью, как описано в литературе, из позитивных колоний, культивированных в 100 мл (для WOSR Express) или в 25 мл (для SOSR) среды бульона Луриа, содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола.
Геномную ДНК выделяли из ткани листьев озимого масличного рапса В. napus сорта Darmor (далее обозначаемого WOSR Darmor) методом с использованием бромида цетилтриметиламмония (СТАВ) (Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15).
Концентрацию ДНК в каждом препарате оценивали путем сравнения интенсивности полосы 1 мкл каждого образца с интенсивностью полосы 1, 2, 4, 8 и 20 мкл раствора, содержащего 25 нг/мкл ДНК лямбда (Life Technologies®), на 1% агарозном геле с ТВЕ (Invitrogen®) (Roche®), содержащем этидийбромид (ICN Biochemicals®).
100-200 нг (для WOSR Express) или 10 нг (для SOSR) ДНК ВАС-клона и 1,7 мкг геномной ДНК, выделенной из WOSR Darmor, гидролизовали рестриктирующими ферментами Asel и EcoRV в конечном объеме реакционной смеси 20 мкл в условиях, рекомендованных производителем (New England Biolabs). Время осуществления гидролиза и/или количество рестриктирующих ферментов корректировали для гарантии полного гидролиза образцов геномной ДНК без не-специфического разложения.
После гидролиза к образцам гидролизованной ДНК добавляли 2 мкл загрузочного красителя, содержащего РНКазу (12,5 мл 1% ксилолцианола FF; 12,5 мл 1% водорастворимого индикатора, а именно, бромфенолового синего; 25 мл глицерина; 100 мкл 0,5М EDTA pH 8; 1 мкл РНКазы (10 мг/мл)), и образцы инкубировали в течение 30 мин при 37°C.
Образцы загружали на 1% агарозный гель ТАЕ.
ДНК фага лямбда (Fermentas®) гидролизовали ферментом PstI (который генерирует 29 фрагментов (в п.н.): 11501, 5077, 4749, 4507, 2838, 2556, 2459, 2443, 2140, 1986, 1700, 1159, 1093, 805, 514, 468, 448, 339, 264, 247, 216, 211, 200, 164, 150, 94, 87, 72, 15 - фрагменты, указанные курсивом, не обнаруживались при стандартном электрофорезе) (для WOSR Express), либо в качестве стандарта размера включали 1
- 80 030862
т.п.н. ДНК-лэддера (Life Technologies) (для SOSR).
После электрофореза образцы ДНК (гидролизованного ВАС-клона и геномной ДНК) переносили на найлоновую мембрану (Hybond-N + Amersham Pharmacia Biotech®) для проведения сухого щелочного блоттинга в капиллярном геле.
Найлоновые мембраны с гидролизованным ВАС-клоном и геномной ДНК скринировали в соответствии со стандартными процедурами Саузерн-гибридизации, описанными выше для скрининга библиотеки ВАС, за исключением того, что для геномной ДНК, пленку Kodak XOMAT AR экспонировали с радиоактивными блотами в течение 2 дней при -70°C.
Исходя из сравнения паттернов гибридизации, полученных после гидролиза ДНК ВАС-клона идентифицированных позитивных колоний и геномной ДНК, выделенной из Brassica napus WOSR Darmor, рестриктирующими ферментами Asel и EcoRV, и гибридизации с 5'-зондом At FATB1 (SEQ ID NO: 25) (см. табл. 14) и с рядом ВАС-клонов, представляющих конкретный паттерн рестрикции, эти ВАС-клоны разделяли на 6 групп, и для каждой из 6 групп отбирали ВАС-клон, содержащий полноразмерную последовательность FATB (обозначенную FATB1-6).
Последовательности FATB, содержащиеся в ВАС-клонах отобранных позитивных колоний, определяли стандартными методами секвенирования (Agowa).
Таблица 14
Паттерн гибридизации гидролизованного ВАС-клона и геномной ДНК, гибридизованной с 5'-зондом AtFATB1 (SEQ ID NO: 25)
Образец ДНК: Геномная ДНК от WOSR Darmor ДНК клона WOSR Exj ВАСот Dress ДНК клона SOSR ВАСот Соответствует
рестриктированный Оцениваемая длина гибридизующихся
ферментом: фрагментов ДНК:
Asel 2,2 2,2 2,2 FATB1
8, 8 8, 8 4,5 FATB2
2,4 5, 5 2,4 FATB3
2,2 2,2 2,2 FAT В 4
3, 0 3, 0 3, 0 FAT В 5
1,7 1,7 1,7 FATB6 (а)
0, 8 0, 8 0, 8 FATB 6 (b)
EcoRV 12 11 FATB1
2,7 2,7 FATB2
3, 5 3, 5 FATB3 (а)
0, 65 0, 65 FATB3 (Ь)
4,5 4,5 FAT В 4
2, 9 2, 9 FAT В 5
4,2 4,2 FATB 6
Наличие 6 различных групп ВАС-клонов подтверждали с помощью AFLP-анализа на ДНК ВАСклона идентифицированных позитивных колоний и геномной ДНК, выделенной из Brassica napus WOSR Darmor (Vos et al., 1995, Nucleic Acids Research, 23 (21): 4407-4414).
Пример 2. Характеризация последовательностей гена FATB от Brassica napus.
После секвенирования, кодирующие области последовательностей FATB определяли с использованием FgeneSH (Softberry, Inc. Mount Kisco, NY, USA) и est2genome (Rice et al., 2000, Trends in Genetics, 16 (6): 276-277; Mott, 1997, Comput. Applic. 13:477-478), как указано в списке последовательностей.
Выравнивание различных последовательностей FATB с неполными последовательностями FATB, выделенными из В. rapa (АА) и В. oleracea (CC), показало, что последовательности FATB1, FATB2 и FATB3 происходят от генома А, а последовательности FATB4, FATB5 и FATB6 происходят от генома С.
Множественное выравнивание (программа Align Plus Scientific & Educational Software, USA; где используются нижеследующие параметры по умолчанию: штраф за несоответствие = 2, штраф за пробелпропуск = 4, штраф за пробел-удлинение = 1; для нуклеотидов: используемой оценочной матрицей по умолчанию является стандартная линейная матрица, а для белков, оценочной матрицей по умолчанию является BLOSUM62) различных кодирующих областей FATB, содержащих или не содержащих интронные последовательности, и аминокислотных последовательностей FATB, показало, что FATB1 и FATB4, FATB2 и FATB5, и FATB3 и FATB6 имеют более близкое родство друг с другом, чем с другими генами FATB, что свидетельствует о том, что они являются гомологичными генами.
Исходя из этих анализов последовательности FATB1-FATB6 были переименованы в FATB-A1, FATB-A2, FATB-A3, FATB-C1, FATB-C2 и FATB-C3 соответственно, и эти обозначения используются по всему описанию изобретения. Настоящее изобретение также относится к последовательностям белков и нуклеиновых кислот генов WOSR и SOSR Brassica napus.
Последовательности WOSR.
Геномные последовательности, то есть белок-кодирующие области FATB-A1-FATB-A3 и FATB
- 81 030862
C1-FATB-C3, включая интронные последовательности WOSR Express, представлены в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11 соответственно. Последовательности белков FATB-A1 FATB-A3 и FATB-C1-FATB-C3, кодируемых этими последовательностями нуклеиновой кислоты, представлены в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12 соответственно.
Последовательности SOSR.
Геномные последовательности, то есть белок-кодирующие области FATB-A1-FATB-A3 и FATBC1-FATB-C3, включая интронные последовательности SOSR, представлены в SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 23. Последовательности белков FATB-A1-FATB-A3 и FATB-C1-FATB-C3, кодируемых этими последовательностями нуклеиновой кислоты, представлены в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24 соответственно.
В табл. 15 указан процент идентичности (нуклеотидных) последовательностей различных кодирующих областей FATB WOSR Express (табл. 15а) и SOSR (табл. 15b) в присутствии и в отсутствии интронных последовательностей, и проиллюстрирована более высокая степень сходства между гомологичными FATB-A1 и FATB-C1, FATB-A2 и FATB-C2 и FATB-A3 и FATB-C3 (см. подчеркнутые величины), а также показано, что различные гены FATB являются более консервативными в последовательностях экзонов, чем в интронных последовательностях.
Таблица 15а
Процент идентичности (нуклеотидных) последовательностей различных кодирующих областей FATB, полученных от WOSR Express, в присутствии/в отсутствие интронных последовательностей
идентичности FATB-A1 FATB-A2 FATB-АЗ FATB-С1 FATB-C2 FATB-C3
FATB-A1 100/100 75,0/82,5 75,4/87,6 91,3/94,8 71,4/85,7 68,5/87,3
FATB-A2 100/100 70,6/83,0 77,5/83,4 85,2/94,3 64,4/83,3
FATB-A3 100/100 75,3/88,0 67,4/85,4 83,5/96,7
FATB-С1 100/100 73,0/86, 6 68,5/88,0
FATB-С 2 100/100 61,2/86,0
FATB-С 3 100/100
Таблица 15b
Процент идентичности (нуклеотидных) последовательностей различных кодирующих областей FATB, полученных от SOSR, в присутствии/в отсутствие интронных последовательностей
% идентичности FATB-A1 FATB-A2 FATB-АЗ FATB-С1 FATB-C2 FATB-C3
FATB-A1 100/100 76,1/84,1 75,6/87,6 91,4/94,8 71,4/85,7 68,6/87,5
FATB-A2 100/100 72,3/84,8 78,8/85,3 86,6/96,4 65,3/85, 1
FATB-A3 100/100 76,1/87,9 68,0/85,3 84,2/96,4
FATB-С1 100/100 73,0/86,7 68,7/88,0
FATB-С 2 100/100 61,1/86,0
FATB-С 3 100/100
В табл. 16, представленной ниже, указан процент идентичности (нуклеотидных) последовательностей различных кодирующих областей FATB (в присутствии/в отсутствие интронных последовательностей), полученных от WOSR Express (W) и SOSR (S), и показано, что более высокая степень сходства между гомологичными FATB-A1 и FATB-C1, FATB-A2 и FAT-C2, и FATB-A3 и FATB-C3 сохраняется у различных сортов или линий скрещивания Brassica napus (см. подчеркнутые величины), то есть процент идентичности последовательностей гомологичных FATB-A1 и FATB-d, например последовательностей, происходящих от различных сортов, выше процента идентичности последовательностей этих генов FATB и других генов FATB того же самого сорта.
Кроме того, можно сказать, что между аллелями WOSR и SOSR одного и того же гена (например, FATB-A1 от WOSR и FATB-A1 от SOSR; см. величины, указанные жирным шрифтом), имеется высокий процент идентичности последовательностей, что указывает на то, что сорта и линии скрещивания Brassica napus имеют в своих геномах близкородственные аллели FATB.
- 82 030862
Таблица 16
Процент идентичности последовательностей различных кодирующих областей FATB в присутствии/в отсутствие интронных последовательностей, полученных от WOSR Express (W) и SOSR (S)
% идентичности FATB-A1 FATB-A2 FATB-АЗ FATB-C1 FATB-C2 FATB-C3
(W) (W) (W) (W) (W)
FATB-A1 (S) 99,7/99,6 76,3/84,3 75,4/87,4 91,2/94,6 71,4/85,7 68,4/87,2
FATB-A2 (S) 74,8/82,3 98,3/97,8 71,2/82,9 77,5/83,4 85,2/94,3 64,3/83,2
FATB-АЗ (S) 75,6/87,9 71,7/84,9 97,8/98,6 75,4/88,0 67,4/85,4 83,4/96,6
FATB-C1 (S) 91,5/95,0 78,8/85,3 76,0/88,0 99,8/99,7 73,0/86,6 68,5/87,9
FATB-C2 (S) 71,4/85,7 86,6/96,4 68,0/85,3 73,0/86,7 100/100 61,1/86,0
FATB-C3 (S) 68,7/87,5 65,3/85,2 84,3/96,5 68,6/87,9 61,2/86,0 99,9/99,9
В табл. 17а и b указан процент идентичности различных аминокислотных последовательностей FATB для WOSR Express (табл. 17а) и SOSR (табл. 17b).
Таблица 17а
Процент идентичности различных аминокислотных последовательностей FATB для WOSR Express
% идентичности FATB-A1 FATB-A2 FATB-A3 FATB-С1 FATB-С 2 FATB-С 3
FATB-A1 100,0 86,5 90,2 96,2 88,5 89,3
FATB-A2 100,0 85,0 86, 8 95,3 83, 8
FATB-A3 100,0 89,7 87,6 98,6
FATB-С1 100,0 88,9 88,7
FATB-С 2 100,0 86,4
FATB-С 3 100,0
Таблица 17b
Процент идентичности различных аминокислотных последовательностей FATB для SOSR
% идентичности FATB-A1 FATB-A2 FATB-A3 FATB-С1 FATB-С 2 FATB-С 3
FATB-A1 100,0 89,0 90,1 96, 6 89,0 89,7
FATB-A2 100,0 87,3 88,9 98,6 86, 6
FATB-A3 100,0 89,4 87,3 97,8
FATB-С1 100,0 88,9 88,7
FATB-С 2 100,0 86,4
FATB-С 3 100,0
В табл. 18 указан процент идентичности различных аминокислотных последовательностей FATB, полученных от WOSR Express (W) и SOSR (S). Эти проценты идентичности последовательностей указывают на то, что гены FATB-A1 и FATB-C1, FATB-A2 и FATB-C2, и FATB-A3 и FATB-C3 являются гомологичными (см. подчеркнутые величины), и что более высокая степень сходства между этими гомологичными генами сохраняется у различных сортов указанных растений.
Кроме того, можно сказать, что между белками WOSR и SOSR, кодируемыми одним и тем же геном FATB (например, FATB-A1 от WOSR и FATB-A1 от SOSR; см. величины, указанные жирным шрифтом), имеется высокий процент идентичности последовательностей, что указывает на то, что сорта и линии скрещивания Brassica napus имеют в своих геномах близкородственные аллели FATB, кодирующие аналогичные белки или белки, имеющие более высокую степень сходства.
Таблица 18 Процент идентичности последовательностей различных аминокислотных последовательностей FATB, полученных от WOSR Express (W) и SOSR (S)
% FATB-A1 FATB-A2 FATB-A3 FATB-C1 FATB-C2 FATB-C3
идентичности (W) (W) (W) (W) (W) (W)
FATB-A1 (S) 99,5 88,6 89, 7 96,2 88,5 89,3
FATB-A2 (S) 86, 9 96,5 84,5 86, 8 95,3 83, 8
FATB-A3 (S) 90,7 87,8 99,3 89,7 87,6 98,6
FATB-C1 (S) 96, 6 88,9 89, 4 100,0 88,9 88,7
FATB-C2 (S) 89,0 98,6 87,3 88,9 100,0 86,4
FATB-C3 (S) 89,7 86, 6 97, 8 88,7 86,4 100,0
Пример 3. Экспрессия генов FATB Brassica.
Для анализа экспрессии различных генов FATB в различных тканях проводили полуколичественные ОТ-ПЦР-анализы, которые являются специфичными для каждого FATB, на всей РНК, выделенной из различных тканей растения Brassica plant:
Матрицы:
серия всех РНК в возрастающих количествах, то есть 0,1, 1, 10 и 100 нг, выделенных из листьев, корней, нераспустившихся бутонов, верхушек, семядолей и стручков через 11 дней после цветения рас
- 83 030862 тений, содержащих и не содержащих семена, а также из семян этих стручков через 21 и 34 дня после цветения, и каллуса SOSR Brassica napus, с использованием мининабора RNeasy Plant (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителей;
серии геномных ДНК в возрастающих количествах, а именно, 0,1 нг, 1 нг и 10 нг, выделенных из тканей листьев SOSR Brassica napus методом СТАВ (Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:1115).
Праймеры и длина фрагментов, амплифицированных из гена-мишени FATB:
для определения экспрессии гена FATB-A1 (SEQ ID NO: 13):
прямой праймер: 5'- CTGATAACGAGACGTCCTCAC-3' (SEQ ID NO: 31), обратный праймер: 5'- CATCCTGGAGACGGAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 32),
957 п.н. для РНК-матрицы FATB-A1 и
1275 п.н. для геномной ДНК-матрицы FATB-A1, для определения экспрессии гена FATB-A2 (SEQ ID NO: 15):
прямой праймер: 5'-CTGCCTGACTGGAGTATGCTG-3' (SEQ ID NO: 33), обратный праймер: 5'-GTTGTTGCTCCTGTCTTGGAG-3' (SEQ ID NO: 34),
956 п.н. для РНК-матрицы FATB-A2 и
1340 п.н. для геномной ДНК-матрицы FATB-A2, для определения экспрессии гена FATB-A3 (SEQ ID NO: 17):
прямой праймер: 5'-GCAGTGGATGATGCTTGATAC-3' (SEQ ID NO: 35), обратный праймер: 5'-CAAGTCGTTGATGGTGTTTTC-3' (SEQ ID NO: 36),
900 п.н. для РНК-матрицы FATB-A3 и
67 п.н. для геномной ДНК-матрицы FATB-A3, для определения экспрессии гена FATB-C1 (SEQ ID NO: 19):
прямой праймер: 5'-CTGCCTGACTGGAGCATGCTC-3' (SEQ ID NO: 37), обратный праймер: 5'-GTTCTTCCTCTCACCACTTCG-3' (SEQ ID NO: 38/67),
926 п.н. для РНК-матрицы FATB-C1 и
125 9 п.н. для геномной ДНК-матрицы FATB-C1, для определения экспрессии гена FATB-C2 (SEQ ID NO: 21):
прямой праймер: 5'-ATCGTTCAGGATGGTCTTGTC-3' (SEQ ID NO: 39), обратный праймер: 5'-GCAGTCTTGTCATCAAGTTTG-3' (SEQ ID NO: 40),
500 п.н. для РНК-матрицы FATB-C2 и
937 п.н. для геномной ДНК-матрицы FATB-C2, для определения экспрессии гена FATB-C3 (SEQ ID NO: 23):
прямой праймер: 5'-ACAGTGGATGATGCTTGACTC-3' (SEQ ID NO: 41), обратный праймер: 5'-CGAACATAGTCAGCAGTCTTC-3' (SEQ ID NO: 42),
582 п.н. для РНК-матрицы FATB-C3 и
1151 п.н. для геномной ДНК-матрицы FATB-C3.
ПЦР-смесь:
для ОТ-ПЦР на РНК (полученной с использованием системы одностадийной ОТ-ПЦР Superscript III с ДНК-полимеразой Taq Platinum® (Invitrogen)): 12,5 мкл 2x реакционной смеси, 1 мкл ДНК-полимеразы Superscript™ III/Platinum®Taq, 9,5 мкл Н2О Milli-Q, 1 мкл РНК (0,1, 1, 10 и 100 нг/мкл), 0,5 мкл прямого праймера (20 мкМ), 0,5 мкл обратного праймера (20 мкМ)) = общий объем 25 мкл;
для ПЦР на геномной ДНК: 12,5 мкл 2х реакционной смеси, 0,2 мкл ДНК-полимеразы Taq Platinum® (5 ед/мкл; Invitrogen), 0,5 мкл прямого праймера (20 мкМ), 0,5 мкл обратного праймера (20 мкМ), 1 мкл ДНК (0,1, 1 и 10 нг/мкл), 10,3 мкл Н2О Milli-Q = общий объем 25 мкл;
Профиль реакции в термоячейке: 30 мин при 55°C (синтез кДНК), 2 мин при 94°C; 30х [15 с при 94°C (денатурация) и 30 с при 57°C (отжиг) и 2 мин при 68°C (удлинение)]; 5 мин при 68°C; охлаждение до 10°C.
После амплификации к ПЦР-образцам добавляли 5 мкл загрузочного красителя (2,5 мл 0,1% бромфенолового синего, 2,5 мл 0,1% ксилолцианола, 5 мл глицерина, 50 мкл 0,5М EDTA, pH 8) и 15 мкл образцов загружали на 1% агарозный гель с ТАЕ (10 х (400 мМ трис-ацетат + 100 мМ EDTA) (Invitrogen®) (Roche®), содержащий этидийбромид вместе с соответствующим маркером молекулярной массы (1 т.п.н. ДНК-лэддера, GibcoBRL® Life Technologies).
Характер полосчатой структуры паттерна хромосом, полученный после амплификации общей РНК от различных тканей и геномной ДНК SOSR Brassica napus с использованием праймеров, специфичных к гену FATB, оценивали следующим образом.
Данные от образцов РНК в одностадийной ОТ-ПЦР и смеси, полученной в одностадийной ОТ-ПЦР, не принимались во внимание до тех пор, пока не были получены ПЦР-продукты и ОТ-ПЦР-продукты (если, в случае ОТ-ПЦР-продуктов, они вообще были получены; см. ниже), которые были амплифицированы из серии геномных ДНК и всех РНК в возрастающих количествах соответственно и которые указы
- 84 030862 вали на предполагаемую длину фрагмента гена-мишени FATB (как показано выше) и количество, которое возрастало пропорционально увеличению количества ДНК- и РНК-матриц соответственно.
Дорожки, не содержащие ОТ-ПЦР-продуктов, амплифицированных из серии всех РНК в возрастающих количествах для конкретного гена-мишени FATB предполагаемого размера, указывают на то, что конкретный ген-мишень FATB не экспрессируется или экспрессируется на очень низком уровне в соответствующей ткани, из которой была получена РНК-матрица.
Дорожки, содержащие ОТ-ПЦР-продукты, амплифицированные из серии всех РНК в возрастающих количествах для конкретного гена-мишени FATB предполагаемого размера, указывают на то, что конкретный ген-мишень FATB экспрессируется в соответствующей ткани, из которой была получена РНКматрица.
Для определения уровня экспрессии каждого гена FATB в конкретной ткани по отношению к уровню экспрессии других генов FATB в этой конкретной ткани, интенсивность полос, наблюдаемых на электрофоретическом геле (полученных после окрашивания ДНК этидийбромидом и наблюдаемых под ультрафиолетом) для ОТ-ПЦР-продуктов FATB, сравнивали с интенсивностью полос, наблюдаемых на электрофоретическом геле для ПЦР-продуктов FATB, амплифицированных из серии геномных ДНК в возрастающих количествах.
Результаты.
Все гены FATB экспрессировались во всех анализируемых тканях (+ в табл. 19). Уровень экспрессии каждого гена FATB в листьях и семенах стручков через 11, 21 и 34 дня (начиная с 10 нг РНК), выраженный как количество геномной ДНК (в нг), которое продуцировало полосу с интенсивностью, сравнимой с интенсивностью полосы ОТ-ПЦР-продукта, специфичного для гена FATB (как объясняется выше), показан в скобках в табл. 20.
Таблица 20
Ткани FATB-A1 FATB-A2 FATB-АЗ FATB-С1 FATB-C2 FATB-C3
Листья + (0,1) + (5) + (> 10) +(<о,1) + (5) + (Ю)
Корни + + + + + +
Нераспустившиеся бутоны + верхушки + + + + + +
Семядоли + + + + + +
Каллус + + + + + +
Стручки через 11 дней без семян + + + + + +
Стручки через 11 дней с семенами + + + + + +
Семена из стручков на 11-й день + « 0,1) + (1) + (10) + « 0,1) + (5) + (1)
Стручки без семян на 21-й день + + + + + +
Стручки на 21-й день с семенами + + + + + +
Семена из стручков на 21-й день + (0,1) + (1) + (1) + (0,1) + (5) + (1)
Стручки без семян на 34-й день + + + + + +
Семена из стручков на 34-й день +(< 0,01) + (0,05) + (0,05) + (0,05) + (0,5) + (0,05)
Время (на 11-й, 21-й и 34-й дни после цветения) и уровень экспрессии каждого гена FATB в семенах (начиная с 10 нг РНК), выраженный как количество геномной ДНК (в нг), которое продуцировало полосу с интенсивностью, сравнимой с интенсивностью полосы ОТ-ПЦР-продукта, специфичного для гена FATB (как объясняется выше), показаны на фиг. 1.
Пример 4. Генерирование и выделение мутантных аллелей FATB Brassica (fatB).
Мутации в генах FATB, идентифицированные в примере 1, были созданы и идентифицированы способами, описанными ниже. В разделе 4.1 описано получение аллелей fatB, содержащих делеции одного или нескольких нуклеотидов, например удаление частей или целого аллеля fatB (делеционные мутанты). В разделе 4.2 описано получение и выделение аллелей fatB, содержащих мутации, приводящие к образованию стоп-кодона (нонсенс-мутанты) и/или одна или несколько мутаций сайта сплайсинга.
- 85 030862
4.1. Генерирование делеционных мутантов fatB и их скрининг.
Семена растения SOSR Brassica napus (дикого типа, называемые далее семенами М0) подвергали мутагенезу методом мутагенеза быстрыми нейтронами, как описано в литературе, в результате чего получали мутантную популяцию семян (далее называемую семенами M1).
60000 растений M1 культивировали и подвергали самоопылению. От каждого отдельного растения M1 получали семена М2.
1000 растений М2, происходящих от различных растений M1, культивировали, и из образцов листьев каждого отдельного растения М2 получали образцы ДНК методом СТАВ (Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15). Растения М2 подвергали самоопылению и получали семена M3.
Концентрацию ДНК в образцах оценивали, как описано в примере 1. 1,7 мкг геномной ДНК гидролизовали рестриктирующими ферментами AseI и EcoRV в конечном объеме реакционной смеси 20 мкл в внижеследующих условиях (ферменты и буферы поставлялись компанией New England Biolabs®):
AseI-гидролизат: 17 мкл ДНК (100 нг/мкл), 1 мкл AseI (10 ед/мкл), 2 мкл буфера NEB3,
EcoRV-гидролизат: 17 мкл мкл ДНК (100 нг/мкл), 1 мкл EcoRI (10 ед/мкл), 2 мкл буфера NEB3, 0,2 мкл 100x альбумина бычьей сыворотки инкубировали в течение ночи при 37°C или в течение 4 ч при 37°C.
После гидролиза к образцам гидролизованной ДНК добавляли 2 мкл загрузочного красителя, содержащего РНКазу (12,5 мл 1% ксилолцианола FF; 12,5 мл 1% водорастворимого индикатора, а именно бромфенолового синего; 25 мл глицерина; 100 мкл 0,5М EDTA, pH 8; 1 мкл РНКазы (10 мг/мл)), и образцы инкубировали в течение 30 мин при 37°C. Образцы загружали на 1% агарозный гель ТАЕ (Invitrogen®). ДНК фага лямбда (Fermentas®), гидролизованную рестриктирующим ферментом PstI (который генерировал 29 фрагментов (в п.н.): 11501, 5077, 4749, 4507, 2838, 2556, 2459, 2443, 2140, 1986, 1700, 1159, 1093, 805, 514, 468, 448, 339, 264, 247, 216, 211, 200, 164, 150, 94, 87, 72, 15 (фрагменты, указанные курсивом, не обнаруживались при стандартном электрофорезе), включали в качестве стандарта размера.
После электрофореза образцы ДНК (гидролизованной геномной ДНК) переносили на найлоновую мембрану (Hybond-N + Amersham Pharmacia Biotech®) для проведения сухого щелочного блоттинга в капиллярном геле. Найлоновые мембраны с гидролизованной геномной ДНК скринировали в соответствии со стандартными процедурами Саузерн-гибридизации, описанными выше в примере 1 для геномной ДНК с использованием 5'-зонда FATB1 At (SEQ ID NO: 25). Пленку Kodak XOMAT AR экспонировали с радиоактивными блотами в течение 2 дней при -70°C.
Результаты.
Паттерны гибридизации, полученные после гидролиза геномной ДНК растений М2 Brassica ферментами AseI и EcoRV, и гибридизации с 5'-зондом FATB1 At (SEQ ID NO: 25), сравнивали с паттернами гибридизации, полученными после гидролиза геномной ДНК растений SOSR Brassica дикого типа ферментами AseI и EcoRV и гибридизации с 5'-зондом FATB1 At (SEQ ID NO: 25) (табл. 21). Для определения соответствия между гибридизующимися фрагментами ДНК и различными генами FATB последний паттерн гибридизации сравнивали с паттерном гибридизации ДНК ВАС-клона, имеющей полноразмерную последовательность одного из генов FATB, которые были идентифицированы в примере 1, гидролизованы ферментами AseI и EcoRV и гибридизованы с 5'-зондом FATB1 At (SEQ ID NO: 25) (см. выше табл. 14).
- 86 030862
Таблица 21
Паттерн гибридизации гидролизованной геномной ДНК от Brassica napus, гибридизованной с 5'-зондом AtFATB1
Геномная Миграция гибридизующихся Оценка длины Соответствует
ДНК, фрагментов ДНК между гибридизую-
рестирикти- полосами маркера размеров щихся
рованная фрагментов
ферментами ДНК
Более, чем Менее, чем
(т . п. н. ) (т . п. н. )
Asel 2,1 2,4 2,2 FATB-A1
2,8 4,7 4,5 FATB-A2
2,1 2,5 2,4 FATB-АЗ
2,1 2,4 2,2 FATB-С1
2,8 4,5 3, 0 FATB-С2
1,1 2,0 1,7 FATB-СЗ(а)
0,5 1,1 0, 8 FATB-СЗ (Ь)
EcoRV 5, 1 11,5 11 FATB-A1
2,6 2,8 2,7 FATB-A2
2,8 4,5 3, 5 FATB-A3 (а)
0,5 0,8 0, 65 FATB-АЗ (Ь)
2,8 4,7 4,5 FATB-С1
2,8 4,5 2, 9 FATB-С 2
2,8 4,5 4,2 FATB-С 3
Отсутствие одного из гибридизующихся фрагментов ДНК, показанных в табл. 21, указывает на то, что полноразмерные аллели FATB в растениях, подвергнутых мутагенезу, были делетированы методом мутагенеза быстрыми нейтронами.
В табл. 22 указаны гомозиготные растения М2 Brassica, содержащие идентифицированую таким образом делецию fatB и не содержащие гибридизующийся фрагмент ДНК.
Таблица 22
Мутированный Отсутствие гибридизующегося фрагмента ДНК: Растение Аллель No.
аллель FATB Геномная ДНК, Миграция Оценка длины М2 No.
рестриктированная отсутствующих отсутствующих
ферментами гибридизующихся гибридизующихся
фрагментов . ДНК фрагментов ДНК.
между полосами
маркеров размера
Более, Менее,
чем чем
(т . п . н . ) (т . п . н . )
FATB-Al Asel 2,1 2,4 2,2 LOSA018 FATB-A1-FN1
(SEQ ID NO: 13) EcoRV 5, 1 11,5 11
FATB-A2 Asel 2,8 4,7 4,5 LOSA002, FATB-A2-FN1,
(SEQ ID NO: 15) EcoRV 2, 6 2,8 2,7 LOSA003, FATB-A2-FN2,
LOSA005 FATB-A2-FN3
FATB-C 2 Asel 2,4 4,5 3 LOSA004 FATB-C2-FN1
(SEQ ID NO: 21) EcoRV 2,8 4,5 2, 9
Отсутствие специфического аллеля FATB в гомозиготных растениях М2 Brassica подтверждали с помощью нижеследующих ПЦР-анализов.
ДНК-матрица:
геномная ДНК, выделенная из листьев растений М2 Brassica, идентифицированных как растения, содержащие делецию в специфическом гене FATB или делецию всего гена FATB (FATBx), позитивный контроль: ДНК ВАС-клона гена FATBx (успешная амплификация этого позитивного контроля показала, что ПЦР осуществляли в условиях, позволяющих амплифицировать специфическую последовательность-мишень FATBx), негативный контроль: ДНК ВАС-клона генов FATB, отличающихся от гена FATBx (если был получен ожидаемый результат, то есть не наблюдалась амплификация специфического ПЦР-продукта FATBx, то это означает отсутствие детектируемой фоновой амплификации других генов FATB), контроль с использованием ДНК дикого типа: Проводили ПЦР, в которой используемой ДНКматрицей является геномная ДНК, полученная из растения М2 Brassica без делеций гена FATBx. Если
- 87 030862 был получен ожидаемый результат, то есть наблюдалась амплификация только специфического ПЦРпродукта FATBx, то это означает отсутствие детектируемой фоновой амплификации, например, других генов FATB в образце геномной ДНК, праймеры и длина фрагмента, амплифицированного из гена-мишени FATBx дикого типа (FATBxспецифический ПЦР-фрагмент):
для подтверждения наличия делеций в гене FATB-A1 или самого гена FATB-A1 (SEQ ID NO: 13): прямой праймер: 5'-CTGATAACGAGACGTCCTCAC-3' (SEQ ID NO: 31), обратный праймер: 5'-CAGTCTTAACATGGTTGAGTG-3' (SEQ ID NO: 43),
403 п.н.
для подтверждения наличия делеций в гене FATB-A2 или самого гена FATB-A2 (SEQ ID NO: 15): прямой праймер: 5'-CATGTTCCATCTTCTTCCTCG -3' (SEQ ID NO: 44), обратный праймер: 5'-TATTGGGACAACATGTGAGTG -3' (SEQ ID NO: 45),
513 п.н.
для подтверждения наличия делеции в гене FATB-A3 или самого гена FATB-A3 (SEQ ID NO: 17): прямой праймер: 5'- GCAGTGGATGATGCTTGATAC -3' (SEQ ID NO: 35), обратный праймер: 5'- TTCTTCTTAACCATCTCAGGT -3' (SEQ ID NO: 46),
487 п.н.
для подтверждения наличия делеции в гене FATB-C1 или самого гена FATB-C1 (SEQ ID NO: 19): прямой праймер: 5'- CTGCCTGACTGGAGCATGCTC -3' (SEQ ID NO: 37), обратный праймер: 5'- CCAAACCCATCTCCAAGCAGC -3' (SEQ ID NO: 47),
367 п.н.
для подтверждения наличия делеции в гене FATB-C2 или самого гена FATB-C2 (SEQ ID NO: 21): прямой праймер: 5'- ATCGTTCAGGATGGTCTTGTC -3' (SEQ ID NO: 39), обратный праймер: 5'- TAACTCACAACGAGAACCAGG -3' (SEQ ID NO: 48),
397 п.н.
для подтверждения наличия делеции в гене FATB-C3 или самого гена FATB-C3 (SEQ ID NO: 23): прямой праймер: 5'- ACAGTGGATGATGCTTGACTC -3' (SEQ ID NO: 41), обратный праймер: 5'- CTTTGATAATCTCCTTGTCAC -3' (SEQ ID NO: 49),
1035 п.н.
ПЦР-смесь: 2,5 мкл 10х ПЦР-смеси, 0,25 мкл dNTP (20 мкМ), 0,5 мкл прямого праймера (10 мкМ), 0,5 мкл обратного праймера (10 мкМ), 0,25 мкл полимеразы Taq (5 ед/мкл), 20 мкл H2O Milli-Q, 1 мкл ДНК (50 нг/мкл) = общий объем 25 мкл;
профиль реакции в термоячейке: 4 мин при 94°C; 25x [1 мин при 94°C (денатурация) и 1 мин при 57°C (отжиг) и 2 мин при 72°C (удлинение)]; 5 мин при 72°C; охлаждение до 4°C.
После амплификации к ПЦР-образцам добавляли 5 мкл загрузочного красителя (2,5 мл 0,1% бромфенолового синего, 2,5 мл 0,1% ксилолцианола, 5 мл глицерина, 50 мкл 0,5М EDTA, pH 8), и эти образцы загружали на 1% агарозный гель с ТАЕ (10х (400 мМ трис-ацетат + 100 мМ EDTA) (Invitrogen®) (Roche®) вместе с соответствующим маркером молекулярной массы (100 п.н. ДНК-маркера, Invitrogen®).
Характер полосчатой структуры паттера хромосом, полученный после амплификации геномной РНК растений М2 Brassica с использованием FATBx-специфичных праймеров, оценивали следующим образом:
данные от образцов ДНК, выделенных из листьев растений М2 Brassica, идентифицированных как содержащие делецию в гене FATBx или всего гена FATBx в одностадийной ОТ-ПЦР и в смеси, полученной в одностадийной ПЦР, не должны быть приняты во внимание до тех пор, пока не были получены:
негативный контроль, который является негативным по ПЦР-амплификации (отсутствие фрагментов), позитивный контроль, указывающий на присутствие ожидаемого ПЦР-продукта (специфического фрагмента FATBx), контроль с использованием ДНК дикого типа, указывающий на присутствие ожидаемого продукта (только специфического фрагмента FATBx), дорожки, не содержащие ПЦР-продуктов для специфического гена FATBx предполагаемого размера, указывают на то, что было получено соответствующее растение, в котором геномная ДНК-матрица содержала делецию в специфическом гене FATBx или самого этого гена.
дорожки, содержащие ПЦР-продукт для специфического гена FATBx предполагаемого размера, указывают на то, что было получено соответствующее растение, в котором геномная ДНК-матрица не содержала делецию в специфическом гене FATBx или самого этого гена.
Было подтверждено, что гомозиготное растение М2 No. LOSA018 содержит делецию FATB-A1, гомозиготное растение М2 Nrs. LOSA002, 3, 5 содержит делецию FATB-A2, а гомозиготное растение М2 Nr. LOSA004 содержит делецию FATB-C2.
- 88 030862
4.2. Генерирование и выделение аллелей FATB, содержащих одну или несколько точковых мутаций.
30000 семян от SOSR Brassica napus (семян М0) предварительно смачивали в течение 2 ч на сырой фильтровальной бумаге в деионизованной или дистиллированной воде. Одну половину этих семян обрабатывали 0,8% EMS, а другую половину обрабатывали 1% EMS (Sigma: M0880) и инкубировали в течение 4 ч.
Семена, подвергнутые мутагенезу (семана M1), 3 раза промывали и сушили в вытяжном шкафу в течение ночи. 30000 растений M1 выращивали в почве и подвергали самоопылению с получением семян М2. От каждого отдельного растения M1 собирали семена М2.
2х4800 растений М2, полученных от различных растений M1, культивировали и из образцов листьев каждого отдельного растения М2 получали образцы ДНК методом СТАВ (Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15). Растения М2 подвергали самоопылению и получали семена M3.
Образцы ДНК скринировали на присутствие точковых мутаций в генах FATB, приводящих к встраиванию стоп-кодонов или мутаций сайтов сплайсинга путем прямого секвенирования стандартными методами секвенирования (Agowa) и анализа последовательностей на присутствие точковых мутаций с использованием компьютерной программы NovoSNP (VIB Antwerp).
Таким образом, были идентифицированы нижеследующие мутантные аллели FATB (fatB).
Таблица 23а Мутации, приводящие к образованию стоп-кодонов в генах FATB SOSR
Мутированный ген Номер Положения Положения Кодон Растение Аллель №
FATB экзона аминокислот нуклеотидов дикого типа М2 №
мутантный
кодон
FATB-Al экзон 1 93 279 tgg —l· tga LOSA101, FATB-A1-EMS01,
(SEQ ID NO: 13) LOSA103, FATB-A1-EMS02,
LOSA102 FATB-A1-EMS03
экзон 1 111 333 tgg tga LOSA104 FATB-A1 -EMS 0 5 (1)
экзон 1 116 348 tgg tga LOSA105 FATB-A1-EMSO6<2)
FATB-A2 экзон 1 94 282 tgg tga LOSA111, FATB-A2-EMS04,
(SEQ ID NO: 15) LOSA112 FATB-A2-EMS 0 5 <3)
экзон 1 136 406 cag —> tag LOSA108 FATB-A2-EMS01<2)
FATB-A3 экзон 2 205 845 cag —> tag LOSA114 FATB-A3-EMS01(1)
(SEQ ID NO: 17)
FATB-Cl экзон 2 196 668 tgg tga LOSA129 FATB-C1 -EMS05 <2' 3)
(SEQ ID NO: 19)
FATB-C2 экзон 1 79 235 cag tag LOSA119 FATB-C2-EMS02 <3)
(SEQ ID NO: 21) экзон 1 111 331 cag —l· tag LOSA122 FATB-C2-EMS05
экзон 1 112 336 tgg tga LOSA120, FATB-C2-EMS03(2) ,
LOSA123 FATB-C2-EMS06
(1) Семена, содержащие FATB-A1-EMS05, FATB-A3-EMS01, FATB-C1-EMS04 и FATB-C3-EMS02 (обозначенные 08MBBN000584), были депонированы в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK) 27 июня 2008 г. под регистрационным номером NCIMB 41568.
(2) Семена, содержащие FATB-A1-EMS06, FATB-A2-EMS01, FATB-C1-EMS05 and FATB-C2-EMS03 (обозначенные 08MBBN000572), были депонированы в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK) 27 июня 2008 г. под регистрационным номером NCIMB 41567.
(3) Семена, содержащие FATB-A2-EMS05, FATB-C1-EMS05 и FATB-C2-EMS02 (обозначенные 08MBBN000553), были депонированы в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK) 27 июня 2008 г. под регистрационным номером NCIMB 41566.
- 89 030862
Таблица 23b Мутации сайта сплайсинга в генах FATB SOSR
Мутированный ген FATB Номер интрона Положения нуклеотидов Кодон дикого типа -А мутантный кодон Растение М2 № Аллель №
FATB-Al (SEQ ID NO: 13) интрон 1 - донор 502 д [gt... -A g [at... LOSA106 FATB-Al-EMS07
интрон 1 акцептор 587 ...ag]g -A ...ag] а LOSA107 FATB-Al-EMS09
FATB-A2 (SEQ ID NO: 15) интрон 1 - донор 505 g [gt... -A g [at... LOSA109 FATB-A2-EMS02
504 g[gt... -A a[gt... LOSA110 FATB-A2-EMS03
FATB-Cl (SEQ ID NO: 19) интрон 1 - донор 498 g[gt... -A a[gt... LOSA128 FATB-C1EMS04(1)
FATB-C2 (SEQ ID NO: 21) интрон 1 акцептор 581 ...ag]g -A ...ag] a LOSA121 FATB-C2-EMS04
FATB-C3 (SEQ ID NO: 23) интрон 1 - донор 508 g [gt... -A g [at... LOSA125 FATB-C3EMS02(1)
(1) Семена, содержащие FATB-A1-EMS05, FATB-A3-EMS01, FATB-C1-EMS04 и FATB-C3-EMS02 (обозначенные 08MBBN000584), были депонированы в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK) 27 июня 2008 г. под регистрационным номером NCIMB 41568.
В заключение следует отметить, что в вышеописанных примерах описан способ получения и выделения мутантных аллелей FATB. Кроме того, растительный материал, содержащий такие мутантные аллели, может быть использован для объединения желаемого мутантного аллеля и/или аллеля дикого типа в растении, как описано в нижеследующих примерах.
Пример 5. Идентификация растения Brassica, содержащего мутантный аллель FATB Brassica.
Растения Brassica, содержащие мутации в генах FATB, идентифицированные в примере 5, идентифицировали следующим образом:
5.1. Идентификация растений Brassica, содержащих делецию аллеля FATB.
Из каждого гомозиготного растения М2, которое, как было подтверждено, содержит делецию гена FATB, были выращены растения M3, и из образцов листьев каждого отдельного растения M3 были получены образцы ДНК.
Каждый образец ДНК от каждого отдельного растения M3 подвергали ПЦР-анализу, который является специфичным для гена FATB, идентифицированного как ген, содержащий делеционную мутацию (как описано в примере 4.1).
Гомозиготные растения M3, содержащие идентифицированную мутацию, подвергали самоопылению и собирали семена М4.
5.2. Идентификация растений Brassica, содержащих точковую мутацию в гене FATB.
Для каждого мутантного гена FATB, идентифицированного в образце ДНК растения М2, культивировали 50 растений М2, происходящих от такого же растения M1, как и растение М2, содержащее мутацию FATB, а затем из образцов листьев каждого отдельно растения М2 получали образцы ДНК.
Образцы ДНК скринировали на присутствие идентифицированой точковой мутации FATB как описано выше в примере 4.2.
Гетерозиготные и гомозиготные растения М2 (как было определено по электроферограммам), содержащие ту же самую мутацию, подвергали самоопылению и собирали семена M3.
Пример 6. Анализ состава жирных кислот в масле семян растений Brassica, содержащих мутантный ген FATB Brassies.
Для выявления корреляции между присутствием мутантных генов FATB в растениях Brassica и составом жирных кислот в масле семян растений Brassica, состав жирных кислот в масле семян растений Brassica, содержащих мутантный(е) ген(ы) FATB, был проанализирован путем экстракции жирных ацилов из семян и оценки относительных уровней этих ацилов в масле семян с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии, как описано ниже.
Образцы семян сушили и взвешивали. 0,8 г семян помещали в пластиковые сосуды. В каждый сосуд помещали стальной стержень-измельчитель. Затем этот сосуд заполняли 2 мл метилирующего раствора (10 г метоксида натрия в 500 мл метанола) и 0,8 мл петролейного эфира. Закрытые крышкой сосуды встряхивали в течение 30 мин на шейкере Эбербаха. В каждый сосуд добавляли 1 мл деионизованной воды, а затем сосуд снова закрывали крышкой и встряхивали. Сосуды центрифугировали в течение 5 мин при 3500 об/мин.
25-50 мкл слоя петролейного эфира от каждого образца переносили в сосуды для автоматического взятия образцов для газовой хроматографии (ГХ). В каждый сосуд добавляли 100 мкл 0,4 М фосфатного буфера и 800 мкл петролейного эфира, а затем содержимое сосудов встряхивали. 0,4-0,6 мкл слоя петролейного эфира образцов впрыскивали в газовый хроматограф для проведения анализа. Затем анализировали данные, полученные на выходе газового хроматографа, и определяли количество каждой жирной
- 90 030862 кислоты.
6.1. Корреляция между присутствием одного мутантного аллеля FATB Brassica в растениях Brassica и составом жирных кислот в масле семян указанных растений Brassica.
Для выявления корреляции между присутствием одного мутантного аллеля FATB в гомозиготных и/или гетерозиготных растениях Brassica и составом жирных кислот в масле семян растений Brassica, состав жирных кислот в масле семян растений Brassica, идентифицированных в примере 5.1, анализировали, как описано выше.
Для растений, гомозиготных по одному мутантному гену, в отличие от растений дикого типа какого-либо значимого различия в составе жирных кислот в масле семян, в частности в уровнях всех насыщенных жирных кислот (то есть уровня С14:0-, С16:0-, С18:0-, C20:0-, C22:0- и C24:0-жирных кислот), пальмитиновой кислоты (C16:0) и стеариновой кислоты (C18:0) не наблюдалось (см. табл. 24).
Таблица 24
Уровень всех насыщенных жирных кислот (то есть С14:0-, С16:0-, С18:0-, C20:0-, C22:0- и C24:0-жирных кислот; насыщ. кислот), пальмитиновой кислоты (C16:0) и стеариновой кислоты (C18:0) (в мас.% от общего количества жирных кислот) в масле семян растений Brassica, содержащих один мутантный аллель FATB (то есть аллель FATB-AX-FNY или FATB-CX-FNY, указанный в табл. 22, в столбце 2 обозначен aX-fnY и cX-fnY; а аллели FATB дикого типа обозначены АХ и СХ) в гомозиготном состоянии
Потомство растения Генотип Общее количество «насыщенных жирных кислот» SD С16: 0 SD С18 : 0 SD
дикого типа А1/ А1, А2/ А2 , АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 7,06 0,05 4,39 0,05 1,42 0,02
LOSA002 А1/ Al, a2-fnl/ a2-fnl, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 6, 93 1,93 4,21 1,04 1,50 0,44
LOSA003 А1/ Al, a2-fn2/ a2-fn2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 7,04 0,22 4,23 0,18 1,61 0,16
LOSA005 А1/ Al, a2-fn3/ a2-fn3, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 7, 17 0,08 4,36 0,08 1,73 0,10
LOSA004 А1/ А1, А2/ А2, АЗ/ АЗ, С1/ Cl, c2-fnl/ c2-fnl, СЗ/ СЗ 6, 97 0,27 4,04 0,38 1, 82 0,20
6.2. Корреляция между присутствием 1-4 мутантных аллелей FATB Brassica в растениях Brassica и составом жирных кислот в масле семян указанных растений Brassica.
Для выявления корреляции между присутствием 1-4 мутантных аллелей FATB в гомозиготных и/или гетерозиготных растениях Brassica и составом жирных кислот в масле семян растений Brassica, растения Brassica, идентифицированные в примере 5.2, или их потомство, содержащее мутантные аллели FATB, скрещивали друг с другом и состав жирных кислот в масле семян отдельных растений потомства Brassica анализировали как описано выше.
В табл. 25 и на фиг. 8 показано, что средние уровни всех насыщенных жирных кислот у растений дикого типа варьируются в пределах от 8,24 до 10,52%, у растений, гомозиготных по одному мутантному аллелю FATB - от 6,53 до 12,12%, у растений, гомозиготных по двум мутантным аллелям FATB - от 6,47 до 10,01%, у растений, гомозиготных по трем мутантным аллелям FATB - от 5,68 до 8,43%, а у растений, гомозиготных по четырем мутантным аллелям FATB - от 5,72 до 7,7%. В табл. 25 и на фиг. 8 показано, что мутации в специфических генах FATB, таких как FATB-A2 и FATB-C2, могут оказывать более сильное воздействие на уровни насыщенных жирных кислот, чем мутации в других генах FATB.
Проанализированные растения культивировали в теплице. Поскольку средние уровни всех насыщенных жирных кислот в масле семян растений дикого типа, выращенных в полевых условиях, обычно составляют примерно 6,5-7,5% вместо 8,24-10,52%, наблюдаемых у растений, выращенных в теплице, то предполагается, что общие уровни насыщенных жирных кислот в масле семян мутантных растений, выращенных в полевых условиях, могут быть пониженными. Мутантные растения выращивали в полевых условиях и определяли состав жирных кислот в масле семян.
- 91 030862
Таблица 25
Уровень всех насыщенных жирных кислот (то есть С14:0-, С16:0-, С18:0-, C20:0-, C22:0- и C24:0-жирных кислот; насыщ. кислот), пальмитиновой кислоты (C16:0) и стеариновой кислоты (C18:0) (в мас.% от общего количества жирных кислот) в масле семян растений Brassica, содержащих по меньшей мере один мутантный аллель FATB (то есть аллель FATB-AX-EMSY или FATB-CX-EMSY, указанный в табл. 23, в столбце 1 обозначен aX-emsY и cX-emsY и в столбце 2 - аХ и сХ; аллели FATB дикого типа обозначены АХ и СХ) в гомозиготном состоянии
Потомство растения, содержащее: Генотип Общее количество насыщенных жирных КИСЛОТ» SD C16: 0 SD C18 : 0 SD
Al/al-ems05, А1/ Al, А2/ A2, A3/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 8,39 0, 69 5,43 0,19 1,52 0,35
A2/a2-ems05, А1/ Al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 7,98 0,37 4,83 0,19 1, 64 0,13
A3/a3-ems01, А1/ Al, a2/ a2, A3/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 7,58 0,51 4,38 0,22 1, 64 0,16
Cl/Cl, А1/ Al, a2/ a2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 7,00 0,32 4,17 0,14 1,43 0,16
C2/C2, СЗ/СЗ al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 7,71 0,25 4,88 0,44 1,40 0,13
al/ al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 7,88 0,28 4,85 0,22 1,52 0,20
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 7,47 0,39 4,21 0,30 1,66 0,30
al/ al, a2/ a2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 7,34 0,30 3,88 0,12 1,73 0,12
Al/al-ems05, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 8, 97 ND 5,84 ND 1,52 ND
A2/a2-ems05, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, . СЗ/ СЗ 7,85 0,35 4,77 0,53 1,76 0,41
АЗ/АЗ, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 7,59 0,21 4,87 0,18 1,27 0,25
Cl/cl-ems04, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, , СЗ/ СЗ 6, 92 0,07 4,12 0,20 1,47 0,18
C2/c2-ems03, А1/ Al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 6,53 ND 4,05 ND 1,25 ND
СЗ/СЗ А1/ Al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, а2/ а2, . СЗ/ СЗ 6, 68 0,48 4,02 0,25 1,35 0,11
А1/ Al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 7,76 ND 3,88 ND 1,92 ND
А1/ Al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, , СЗ/ СЗ 5, 68 0,30 3,40 0,10 1,09 0,06
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 7,67 0,44 4,79 0,33 1,52 0,11
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, . СЗ/ СЗ 7,25 0,13 4,36 0,39 1,52 0,25
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 7,57 0,54 4,90 0,33 1,45 0,18
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, . СЗ/ СЗ 6,24 ND 3,88 ND 1,31 ND
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 8,00 ND 4,51 ND 1,92 ND
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, , СЗ/ СЗ 6,38 0,24 3, 94 0,03 1,25 0,10
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 6,32 0,19 3,74 0,09 1,40 0,04
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, . СЗ/ СЗ 6, 09 0, 67 3, 62 0,20 1,21 0,30
Al/al-ems05, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 8,28 0,54 4,84 0,26 1,66 0,17
Α2/Α2, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, . сЗ/ сЗ 8,12 0,52 4,93 0,38 1,69 0,23
A3/a3-ems01, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 8,03 0,75 4, 62 0,12 1,77 0,30
Cl/cl-ems04, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, . сЗ/ сЗ 7,05 ND 4,42 ND 1,38 ND
C2/C2, А1/ Al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 7,23 ND 4,41 ND 1,44 ND
C3/c3-ems02 А1/ Al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, . сЗ/ сЗ 7,74 ND 4,38 ND 1,71 ND
А1/ Al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, с1/ cl, С2/ С2, . сЗ/ сЗ 8,08 ND 4,86 ND 1,72 ND
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 7,90 0,59 4,71 0,43 1,61 0,11
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, . сЗ/ сЗ 7,86 0,41 4,79 0,24 1,67 0,23
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 7,20 0,36 4,35 0,04 1,35 0,06
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, . сЗ/ сЗ 7,57 0,24 4,58 0,23 1,60 0,06
al/ al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 8, 93 ND 5,46 ND 1,68 ND
al/ al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, . сЗ/ сЗ 7,45 0,17 4,44 0,12 1,57 0,07
al/ al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, с1/ cl, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 7,82 ND 4,65 ND 1,56 ND
al/ (1) al, А2/ A2, , аЗ/ аЗ. , cl / cl , С2/ < С2, сЗ/ сЗ 7,70 0,53 4,39 0,12 1,81 0,28
Al/al-ems06, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 8,46 0, 67 4,74 0,11 1,85 0,29
A2/a2-ems01, А1/ Al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 7,79 0,48 4, 62 0,18 1,57 0,17
A3/a3-ems01, А1/ Al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 8,14 0,55 4,45 0,40 1,80 0,12
C1/C1, А1/ Al, a2/ a2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 7,01 0,13 4,24 0,10 1,43 0,16
C2/C2, СЗ/СЗ al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 8,77 0, 93 4,99 0,49 2,02 0,31
al/ al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 8,73 0,32 5,44 0,40 1,65 0,54
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, , СЗ/ СЗ 7, 64 0,58 4,44 0,54 1,51 0,18
al/ al, a2/ a2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, . СЗ/ СЗ 6, 82 0,40 3, 93 0,16 1,41 0,11
- 92 030862
Al/al-ems06, Al / Al, А2/ A2, A3/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,51 0, 91 5,49 0,73 1,46 0,16
A2/a2-ems01, А1/ Al, А2/ A2, A3/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, СЗ/ СЗ 7,74 1,72 5,05 1,22 1,28 0,06
АЗ/АЗ, А1/ Al, А2/ A2, A3/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, СЗ/ СЗ 7,85 0,23 4,70 0,35 1,54 0,35
Cl/cl-ems05, А1/ Al, a2/ a2, A3/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, СЗ/ СЗ 6, 47 0,77 4,13 0,59 1,14 0,07
C2/c2-ems03, А1/ Al, a2/ a2, A3/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, СЗ/ СЗ 6, 98 0,54 4,21 0,21 1,36 0,23
СЗ/СЗ А1/ Al, a2/ a2, A3/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, СЗ/ СЗ 6, 83 ND 3, 65 ND 1,59 ND
al/ al , А2/ A2, A3/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, СЗ/ СЗ 6, 94 0,81 4,39 0,34 1,24 0,17
al/ al, А2/ A2, A3/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, СЗ/ СЗ 6,70 0,15 4,32 0,18 1,21 0,05
al/ al, a2/ a2, A3/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 7,47 0, 93 4, 64 0,59 1,33 0,11
al/ al, a2/ a2, A3/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, СЗ/ СЗ 6, 44 0,73 3, 97 0,74 1,15 0,16
al/ al, a2/ a2, A3/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, СЗ/ СЗ 6,37 0,47 3, 68 0,09 1,25 0,18
al/ al, a2/ a2, A3/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, СЗ/ сз(2) 5,72 0,34 3,24 0,04 1,22 0,20
Al/al-ems06, А1/ Al, А2/ A2, A3/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 9, 88 1,03 6, 03 1,29 1,96 0,39
A2/a2-ems05, А1/ Al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,89 0, 63 5,06 0,57 2,03 0,33
A3/a3-ems01, А1/ Al, a2/ a2, A3/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,79 0,72 5,17 0, 95 1,81 0,36
C1/C1, А1/ Al, a2/ a2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,70 0,72 5,04 1,17 1,81 0,43
C2/C2, СЗ/СЗ al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 9,34 0,41 4,93 0, 67 2,31 0,30
al/ al, А2/ A2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,78 1,00 5,14 0, 98 1,89 0,02
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,52 0, 60 4,35 0,38 2,24 0,37
al/ al, a2/ a2, аЗ/ аЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,24 1,06 4,59 0, 61 1,87 0,46
Al/al-ems06, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 10,52 ND 6, 91 ND 1,83 ND
A2/a2-ems05, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, СЗ/ СЗ 10, 45 3,52 6, 45 2,01 1,84 0, 61
АЗ/АЗ, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ cl, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,42 0,54 5,45 0, 60 1,38 0,10
Cl/cl-ems05, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ cl, с2/ с2, СЗ/ СЗ 7,20 0,40 4,20 0,22 1,42 0,19
C2/c2-ems02, А1/ Al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,89 ND 5,50 ND 1,67 ND
СЗ/СЗ А1/ Al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, СЗ/ СЗ 7,32 0,47 4,26 0,21 1,47 0,11
А1/ Al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ cl, С2/ С2, СЗ/ СЗ 7,31 1,23 4,63 1,00 1,25 0,16
А1/ Al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, СЗ/ сз^ 7,57 0, 96 4,42 0,53 1,47 0,22
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 12,12 ND 7,04 ND 2,23 ND
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, СЗ/ СЗ 8, 91 0, 95 5,50 0,70 1,65 0,28
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,59 0,81 5,41 0,77 1,50 0,20
al/ al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, СЗ/ СЗ 8,43 1,72 4,71 0, 96 1,92 0,23
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 10, 01 ND 6,32 ND 1,79 ND
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, СЗ/ СЗ 5,72 ND 3,53 ND 1,03 ND
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, СЗ/ СЗ 7,01 1,14 4,32 0,59 1,27 0,27
al/ al, a2/ a2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, СЗ/ СЗ 6, 47 0,54 3,55 0,42 1,39 0,15
Al /Al, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, СЗ/ СЗ 8,24 0, 62 4, 66 0,21 1, 66 0,29
A2/A2, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, С2/ С2, сЗ/ сЗ 7,59 0, 95 4,47 0,27 1, 64 0,43
АЗ/АЗ, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, СЗ/ СЗ 7,46 0,42 4,06 0,01 1,48 0,20
Cl/cl-ems05, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, С1/ С1, с2/ с2, сЗ/ сЗ 7,91 0,30 4,12 0,11 2,06 0,12
C2/c2-ems02, А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, СЗ/ СЗ 7,31 0,49 4,14 0,05 1,48 0,15
C3/c3-ems02 А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, С2/ С2, сЗ/ сЗ 7,76 0,33 4,55 0,15 1,67 0,16
А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, СЗ/ СЗ 6, 81 0,23 3,73 0,01 1,39 0,13
А1/ Al, А2/ A2, АЗ/ АЗ, с1/ cl, с2/ с2, сЗ/ сЗ 6, 66 0,48 3,84 0,16 1, 44 0,21
(1) Семена, содержащие FATB-A1-EMS05, FATB-A3-EMS01, FATB-C1-EMS04 и FATB-C3-EMS02 (обозначенные 08MBBN000584), были депонированы в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK) 27 июня 2008 г. под регистрационным номером NCIMB 41568.
(2) Семена, содержащие FATB-A1-EMS06, fAtB-A2-EMS01, FATB-C1-EMS05 and FATB-C2-EMS03 (обозначенные 08MBBN000572), были депонированы в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK) 27 июня 2008 г. под регистрационным номером NCIMB 41567.
(3) Семена, содержащие FATB-A2-EMS05, FATB-C1-EMS05 and FATB-C2-EMS02 (обозначенные 08MBBN000553), были депонированы в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK) 27 июня 2008 г. под регистрационным номером NCIMB 41566.
6.3. Корреляция между присутствием 5-6 мутантных аллелей FATB Brassica в гомозиготных и/или гетерозиготных растениях Brassica и составом жирных кислот в масле семян указанных растений Brassica.
Для выявления корреляции между присутствием 5-6 мутантных аллелей FATB в гомозиготных и/или гетерозиготных растениях Brassica и составом жирных кислот в масле семян растений Brassica, растения Brassica, идентифицированные в примере 5.2, или их потомство, содержащее мутантные аллели FATB, скрещивали друг с другом и состав жирных кислот в масле семян потомства растений Brassica анализировали как описано выше.
- 93 030862
Пример 7. Перенос мутантных генов FATB в (элитные) линии Brassica.
Мутантные гены FATB переносили в (элитные) линии скрещивания Brassica нижеследующим методом.
Растения, содержащие мутантный ген FATB (растение-донор), скрещивали с (элитной) линией Brassica (элитный родитель/рекурентный родитель) или с сортом, в котором отсуствует мутантный ген FATB. При этом, была использована нижеследующая схема интрогрессивной гибридизации (мутантный ген FATB был обозначен fatB, а ген дикого типа был обозначен FATB):
первичный кросс: fatB/fatB (растение-донор) X FATB/FATB (элитный родитель), растение F1: FATB/fatB, кросс Bd: FATB/fatB X FATB/FATB (рекурентный родитель), растения Bd: 50% FATB/fatB и 50% FATB/FATB, 50% FATB/fatB отбирали с использованием, например, AFLP или ПЦР-маркеров для мутантного аллеля FATB (fatB), кросс ВС2: FATB/fatB (растение Bd) X FATB/FATB (рекурентный родитель), растения ВС2: 50% FATB/fatB и 50% FATB/FATB,
50% FATB/fatB отбирали с использованием, например, AFLP или ПЦР-маркеров для мутантного аллеля FATB (fatB).
Возвратное скрещивание повторяли до тех пор, пока из растений ВС3 не были выращены растения BC6.
Растения BC6: 50% FATB/fatB и 50% FATB/FATB, 50% FATB/fatB отбирали с использованием, например, AFLP или ПЦР-маркеров для мутантного аллеля FATB (fatB), кросс BC6 S1: FATB/fatB X FATB/fatB, растения BC6 S1: 25% FATB/FATB и 50% FATB/fatB и 25% fatB/fatB, растения, содержащие fatB, отбирали с использованием, например, AFLP или ПЦР-маркеров для мутантного аллеля FATB (fatB).
Отдельные растения BC6 S1, которые являются гомозиготными по мутантному аллелю FATB (fatB/fatB), отбирали с использованием, например, AFLP или ПЦР-маркеров для мутантного аллеля и аллеля дикого типа.
Затем эти растения использовали для получения семян.
Для отбора растений, содержащих делецию аллеля FATB, могут быть проведены гибридизационные анализы или ПЦР-анализы, например анализы, описанные в примере 4.1.
Для отбора растений, содержащих точковую мутацию в аллеле FATB, может быть проведено прямое секвенирование стандартными методами секвенирования, известными специалистам, такими как методы, описанные в примере 4.2.
Альтернативно, могут быть разработаны ПЦР-анализы для дифференциации растений, содержащих специфическую точковую мутацию в аллеле FATB, от растений, не содержащих такую специфическую точковую мутацию. Таким образом, были разработаны дифференцирующие ПЦР-анализы для детектирования присутствия или отсутствия мутантных аллелей, идентифицированных, как описано в примере
4.2, и определения типа их зиготности (см. табл. 23).
ДНК-матрица:
геномная ДНК, выделенная из листьев гомозиготных или гетерозиготных мутантных растений Brassica (содержащих мутантный аллель FATB, далее называемый FATB-Xx-EMSXX), контроль с использованием ДНК дикого типа: геномная ДНК, выделенная из листьев растений Brassica дикого типа (содержащих эквивалент мутантного аллеля FATB дикого типа, далее называемый FATB-Xx-WT), позитивный контроль с использованием ДНК: геномная ДНК, выделенная из листьев гомозиготных мутантных растений Brassica, которые, как известно, содержат FATB-Xx-EMSXX, праймеры и длина фрагмента, амплифицированного из мутантного и соответствующего генамишени FATB дикого типа, указаны в табл. 26. Каждый набор праймеров состоит из одного праймера, специфичного к мутантному гену и к гену-мишени дикого типа (например, праймер LOSA104R5 является специфичным к FATB-A1-EMS06 и FATB-A1-WT), и одного праймера, специфичного к расхождению в нуклеотидах (например, праймер LOSA105MF1 является специфичным к FATB-A1-EMS06, а праймер LOSA105WF1 является специфичным к FATB-A1-WT). Обычно последний нуклеотид второго праймера соответствует расхождению в нуклеотидах (подчеркнутый нуклеотид в табл. 26), но для улучшения гибридизации между праймером и его последовательностью-мишенью может быть добавлен один (или более) дополнительный мишень-специфический нуклеотид (см., например, указанный жирным шрифтом нуклеотид в праймере LOSA112MR2, который является специфичным к аллелю FATB-A2-EMS05, по сравнению с праймером LOSA112WR2, который является специфичным к аллелю FATB-A2-WT),
ПЦР-смесь: 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера (15 мМ МдС12), 0,25 мкл dNTP (20 мМ), 1 мкл прямого праймера (10 мкМ), 1 мкл обратного праймера (10 мкМ), 0,25 мкл полимеразы Taq (5 ед/мкл), 19,5 мкл Н2О Milli-Q, 0,5 мкл ДНК (20-50 нг/мкл) = общий объем 25 мкл, профиль реакции в термоячейке: 4 мин при 95°С; 30x [1 мин при 95°С (денатурация) и 1 мин при температуре отжига, указанной в табл. 26, и 2 мин при 72°С (удлинение)]; 5 мин при 72°С; охлаждение
- 94 030862 до 4°C. Оптимальную температуру отжига определяли с помощью ПЦР в градиенте температур, где температура отжига варьировалась от 57 до 70°C, в термоячейке MJ Research PTC-200 (Biozym). Оптимальной температурой отжига для праймеров, специфичных для FATB дикого типа, является температура, при которой точный ПЦР-фрагмент предполагаемого размера может быть детектирован (как описано ниже) для образца ДНК растения Brassica дикого типа, но не для образца ДНК мутантного растения Brassica. Оптимальной температурой отжига для праймеров, специфичных для мутантного FATB, является температура, при которой точный ПЦР-фрагмент предполагаемого размера может быть детектирован (как описано ниже) для образца ДНК мутантного растения Brassica, но не для образца ДНК растения Brassica дикого типа.
После амплификации к 15 мкл ПЦР-образцов добавляли 5 мкл загрузочного красителя (оранжевого красителя), и образцы загружали на 1,5% агарозный гель.
Характер полосчатой структуры паттерна хромосом, определенный после амплификации геномной ДНК мутантных растений Brassica, оценивали следующим образом:
данные от образцов ДНК, выделенных из листьев мутантных растений Brassica, идентифицированных в одностадийной ОТ-ПЦР и в смеси, полученной в одностадийной ПЦР, не принимались во внимание до тех пор, пока не были получены:
контроль с использованием ДНК дикого типа, который указывал на наличие ПЦР-фрагмента предполагаемого размера для FATB-Xx-WT-специфического ПЦР-анализа и на отстутствие ПЦР-фрагмента предполагаемого размера для FATB-Xx-EMSXX-специфического ПЦР-анализа, позитивный ДНК-контроль, который указывал на наличие ПЦР-фрагмента предполагаемого размера для FATB-Xx-EMSXX-специфического ПЦР-анализа и на отстутствие ПЦР-фрагмента предполагаемого размера для FATB-Xx-WT-специфического ПЦР-анализа, дорожки, не содержащие ПЦР-продукта предполагаемого размера для FATB-Xx-WTспецифического ПЦР-анализа, и ПЦР-фрагмента предполагаемого размера для FATB-Xx-EMSXXспецифического ПЦР-анализа, указывают на то, что соответствующее растение, из которого была получена геномная ДНК-матрица, является мутантом, гомозиготным по FATB-Xx-EMSXX, дорожки, содержащие ПЦР-фрагмент предполагаемого размера для FATB-Xx-WT-специфического ПЦР-анализа, и для FATB-Xx-EMSXX-специфического ПЦР-анализа, указывают на то, что соответствующее растение, из которого была получена геномная ДНК-матрица, является мутантом, гетерозиготным по FATB-Xx-EMSXX, дорожки, содержащие ПЦР-фрагмент предполагаемого размера для FATB-Xx-WT-специфического ПЦР-анализа, и не содержащие ПЦР-продукта предполагаемого размера для FATB-Xx-EMSXXспецифического ПЦР-анализа, указывают на то, что соответствующее растение, из которого была получена геномная ДНК-матрица, является растением дикого типа.
- 95 030862
Таблица 26
Аллель № Праймеры Отжиг t(°C) Размер ПЦРфрагмента (п.H.)
FATB-A1-EMS05 5' GGCGGCTGAGAAGCAGTGAATA 3' (LOSA104MF1 - SEQ ID N0: 50) 5' GGACTGAAGCACACTGTCC 3' (LOSA104R3 - SEQ ID NO: 52) 57 1087
FATB-A1-WT 5' GGCGGCTGAGAAGCAGTGGATG 3' (LOSA104WF1 - SEQ ID NO: 51) 5' GGACTGAAGCACACTGTCC 3' (LOSA104R3 - SEQ ID NO: 52) 71,8 1087
FATB-A1-EMS06 5' CAGTGGATGATGCTTGACTGA 3' (LOSA105MF1 - SEQ ID NO: 53) 5' GCATACGAGTAACAACCCAA 3' (LOSA104R5 - SEQ ID NO: 55) 67 365
FATB-A1-WT 5' CAGTGGATGATGCTTGACTGG 3' (LOSA105WF1 - SEQ ID NO: 54) 5' GCATACGAGTAACAACCCAA 3' (LOSA104R5 - SEQ ID NO: 55) 68,9 365
FATB-A2-EMS01 5' GAGTTGGGTCCACTAATTTTG 3' (LOSA108F1 - SEQ ID NO: 58/59) 5' CGGAACACAAGACCATCCTA 3' (LOSA108MR11 - SEQ ID NO: 60) 67 346
FATB-A2-WT 5' GAGTTGGGTCCACTAATTTTG 3' (LOSA108F1 - SEQ ID NO: 58/59) 5' CGGAACACAAGACCATCCTG 3' (LOSA108WR1' - SEQ ID NO: 61) 67 346
FATB-A2-EMS05 5' GAGTTGGGTCCACTAATTTTG 3' (LOSA108F1 - SEQ ID NO: 58/59) 5' AGCAGCAAGCAGCATACTTC 3' (LOSA112MR2 - SEQ ID NO: 56) 67 222
- 96 030862
FATB-A2-WT 5' GAGTTGGGTCCACTAATTTTG 3' (LOSA108F1 - SEQ ID NO: 58/59) 5' TAGCAGCAAGCAGCATACTC 3' (LOSA112WR1 - SEQ ID NO: 57) 67 222
FATB-A3-EMS01 5' CAATGGCAAAACCAACAAAGC 3' (LOSA114F1 - SEQ ID NO: 64) 5' TATTTATCAACTACAACCTA 3' (LOSA114MR1 - SEQ ID NO: 62) 60 805
FATB-A3-WT 5' CAATGGCAAAACCAACAAAGC 3' (LOSA114F1 - SEQ ID NO: 64) 5' TATTTATCAACTACAACCTG 3' (LOSA114WR1 - SEQ ID NO: 63) 63 805
FATB-C1-EMS04 5' CGGTTATGAATCATTTACAA 3' (LOSA128MF1 - SEQ ID NO: 68) 5' GTTCTTCCTCTCACCACTTCG 3' (LOSA116R1 - SEQ ID NO: 38/67) 62,1 1045
FATB-C1-WT 5' CGGTTATGAATCATTTACAG 3' (LOSA128WF1 - SEQ ID NO: 69) 5' GTTCTTCCTCTCACCACTTCG 3' (LOSA116R1 - SEQ ID NO: 38/67) 57-70 1045
FATB-C1-EMS05 5' GTTAAGAAGAACTTGATATGA 3' (LOSA129MF1 - SEQ ID NO: 65) 5' GTTCTTCCTCTCACCACTTCG 3' (LOSA116R1 - SEQ ID NO: 67) 60 876
FATB-C1-WT 5' GTTAAGAAGAACTTGATATGG 3' (LOSA129WF1 - SEQ ID NO: 66) 5' GTTCTTCCTCTCACCACTTCG 3' (LOSA116R1 - SEQ ID NO: 67) 64,7 876
FATB-C2-EMS02 5' GTCTGACAACGAGACTTCGT 3' (LOSA119MF1 - SEQ ID NO: 70) 5' CAGTATTGCAATCCCGAACC 3' (LOSAC2R3 - SEQ ID NO: 72) 69,7 818
FATB-C2-WT 5' GTCTGACAACGAGACTTCGC 3' (LOSA119WF1 - SEQ ID NO: 71) 5' CAGTATTGCAATCCCGAACC 3' (LOSAC2R3 - SEQ ID NO: 72) 57-70 818
FATB-C2-EMS03 5' TGGCGGCTGAGAAACAGTGA 3' (LOSA120MF1 - SEQ ID NO: 73) 5' AGGGTACTTACAGTGAGACCC 3' (LOSAC2R1 - SEQ ID NO: 75) 70 1056
FATB-C2-WT 5' TGGCGGCTGAGAAACAGTGG 3' (LOSA120WF1 - SEQ ID NO: 74) 5' AGGGTACTTACAGTGAGACCC 3' (LOSAC2R1 - SEQ ID NO: 75) 71, 1 1056
FATB-C3-EMS02 5' CAGTCATGAACCACTTACAGA 3' (LOSA125MF2 - SEQ ID NO: 76) 5' CAACCTGCATACGAGTAACG 3' (LOSA124R2 - SEQ ID NO: 78) 67 555
FATB-C3-WT 5' CAGTCATGAACCACTTACAGG 3' (LOSA125WF2 - SEQ ID NO: 77) 5' CAACCTGCATACGAGTAACG 3' (LOSA124R2 - SEQ ID NO: 78) 69,7 555
* ho=F омозиготные, be=гетерозиготные.
Альтернативно, для дифференциации растений, содержащих специфическую точковую мутацию в аллеле FATB, от растений, не содержащих такую специфическую точковую мутацию, может быть применена технология Invader™ (Third Wave Agbio). Для детектирования присутствия или отсутствия мутантных аллелей, идентифицированых в примере 4, и определения типа их зиготности (см. табл. 23а и b),
- 97 030862 могут быть сконструированы нижеследующие дифференцирующие зонды Invader™.
Зонды, специфичные к мутантному гену-мишени FATB (который может быть идентифицирован путем присоединения последовательности flapl) или к соответствующему гену-мишени FATB дикого типа (который может быть идентифицирован путем присоединения последовательности Иар2), а также встраивающиеся зонды, которые могут быть использованы в комбинации с указанными зондами. В основном, каждый набор зондов состоит из одного зонда, специфичного к мутантному гену-мишени или к гену-мишени дикого типа, первый нуклеотид которого, расположенный за 5'-flapпоследовательностью, соответствует расхождению в нуклеотидах (подчернутый нуклеотид в табл. 27) (так называемый первичный зонд; например, зонд с последовательностью SEQ ID NO: 82 является специфичным к FATB-A1-EMS05), и из одного зонда, специфичного к нуклеотидам, расположенным выше от положения расхождения нуклеотида (так называемый олигонуклеотид invader®; например, зонд с последовательностью SEQ ID NO: 81 является специфичным к нуклеотидам, расположенным выше от положения расхождения нуклеотида между FATB-A1-EMS05 и FATB-A1-WT). Последний нуклеотид второго праймера может соответствовать расхождению в мутантных нуклеотидах, но для последнего нуклеотида могут быть использованы и другие нуклеотиды (показанные жирным шрифтом в табл. 27), при условии, что первичный зонд и олигонуклеотид invader® еще способны давать перекрывание в одно основание при гибридизации с ДНК-мишенью с образованием специфической встроенной структуры, распознаваемой ферментами Cleavase® (Third Wave Agbio). Процедуру анализа Invader™ и интерпретацию данных осуществляли в соответствии с инструкциями производителей (Third Wave Agbio). Вкратце, нуклеотидные последовательности, обозначенные flap1 и flap2, представляют собой последовательности 5'-flaps, которые были отщеплены от первичных зондов в первой стадии анализа Invader™ и которые были комплементарны последовательностям в кластере FRET™ 1 и 2 соответственно, но не комплементарны мутантным последовательностям-мишеням или последовательностям-мишеням дикого типа. Если первичные зонды отщеплялись в первой стадии и если flap1-зонд и/или flap2-зонд гибридизовался с кластером FRET™ 1 и 2 соответственно во второй стадии, то продуцируемый сигнал указывал на присутствие в образце мутантного гена-мишени FATB или соответствующего гена-мишени FATB дикого типа соответственно.
Альтернативно, зонды, специфичные к мутантному гену-мишени FATB (обозначенному 5'-flap1-x в табл. 27), использовали в комбинации с зондами, специфичными к гену, используемому в качестве внутреннего контроля (обозначенному 5'-flap2-x в табл. 27: контрольный ген был обозначен ENDO1). Если первичные зонды отщеплялись в первой стадии и если flap1-зонд и/или flap2-зонд гибридизовались с кластером FRET 1 и 2 соответственно во второй стадии, то продуцируемый сигнал указывал на присутствие в образце мутантного гена-мишени FATB и эндогенного контрольного гена соответственно. Исходя из уровня сигнала, генерируемого FRET-кластером 1, по отношению к уровню сигнала, генерируемого FRET™-кластером 2, может быть определен тип зиготности мутантного аллеля FATB (гомозиготные аллели FATB генерируют сигнал, который примерно в два раза превышает сигнал, генерируемый гетерозиготными аллелями FATB).
- 98 030862
Таблица 27
Аллель № Зонды
FATB-A1-EMS05 5' GCGCCTCGGTTTCCAGTCAAGCATCATC 3' (SEQ ID NO: 81)
5' flapl-TCACTGCTTCTCAGCC 3' (SEQ ID NO: 82)
FATB-A1-EMS06 5'GATCCATAATCACGTCAGAGCGCCTCGGTTTC3' (SEQ ID NO: 83)
5' flapl-TCAGTCAAGCATCATCC 3' (SEQ ID NO: 84)
FATB-A2-EMS01 5'CCTAATGGAAAAATTCTGACGGAACACAAGACCATCCTT 3' (SEQ ID NO: 85)
5' flapl-AAACAATTCTCCCTAAACCA 3' (SEQ ID NO: 86)
FATB-A2-EMS05 5'TGCCAAGAAAATGGTAGTTATAGCAGCAAGCAGCATACTC 3' (SEQ ID NO: 87)
5' flapl-TCAGTCAGGCAGCT 3' (SEQ ID NO: 88)
FATB-A3-EMS01 5'AAGAGAGCTTACCAAGTAGGATATTTATCAACTACAACCTT 3' (SEQ ID NO: 89)
5' flapl-ACATACGAGTAACAACCC 3' (SEQ ID NO: 90)
FATB-C1-EMS04 5'CCAGTAACAACAAGCGACTACAATCATAATCATAATCAGTACC 3' (SEQ ID NO: 91)
5' flapl-TTGTAAATGATTCATAACCGTTT 3' (SEQ ID NO: 92)
FATB-C1-EMS05 5'TAGGATATTTATCAACGACAACCTGCATACGAGTAACAACC 3' (SEQ ID NO: 93)
5' flapl-TCATATCAAGTTCTTCTTAACCA 3' (SEQ ID NO: 94)
FATB-C2-EMS02 5'CCTGGTTCTGTAGAGATATCAAAGTCTGACAACGAGACTTCGC 3' (SEQ ID NO: 95)
5' flapl-TAGCCCGCACCC 3' (SEQ ID NO: 96)
FATB-C2-EMS03 5' AGAACGCCTGGGTTTCCAGTCAAGCATCATC 3' (SEQ ID NO: 97)
5' flapl-TCACTGTTTCTCAGCC 3' (SEQ ID NO: 98)
FATB-C3-EMS02 5'CGCTCTGCGTCTATAGAAACAGTCATGAACCACTTACAGT 3' (SEQ ID NO: 99)
5' flapl-ATATATTACAATCACACTCGATTG 3' (SEQ ID NO: 100)
ENDO1 5' TGAGGAGCGTGGTGGTCCCACACCTT 3' (SEQ ID NO: 101)
5' flap2- CGATGCGACCAGC 3' (SEQ ID NO: 102)
- 99 030862
Список последовательностей <110> Bayer BioScience N.V. '
Laga, Benjamin den Boer, Bart
Lambert, Bart
120> Растение brassica, содержащее мутантные аллели (жирный ацил)-аср тиоэстеразы
<130> BCS 07-2011
<160> 102
<170> Patentin version 3.3
<210> 1
<211> 1563
<212> ДНК
<213> Brassica napus
<220> <221> <222> CDS : , (1)..(504) /у
<220>
<221> зрелый пептид
<222> (1)..(1560)
<223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 91
<220>
<221> misc feature
<222> (490)..(492)
<223> консервативный Met
<220>
<221> CDS
<222> (590)..(723)
<220>
<221> misc feature
<222> (611)..(613)
<223> консервативный Lys
<220>
<221> misc feature
<222> (683)..(685) :
<223> консервативный Val '
<220>
<221> CDS
<222> (798) .. (911)
<220>
<221> misc feature
<222> (850)..(852)
<223> консервативный Met
<220>
<221> CDS
<222> (981) .. (1152)
<220> ' 1
- 100 030862
<221> <222> <223> misc feature (1018) .. (1020) консервативный Ser
<220> <221> <222> CDS (1243) . . (1560)
<220>
<221> misc feature
<222> (1249) . . (1251)
<223> консервативный Trp
<220>
<221> misc feature
<222> (1267) . . (1269)
<223> консервативный Asn
<220>
<221> misc feature
<222> (1273) .. (1275)
<223> консервативный His
<220>
<221> misc_feature <222> (1378) . . (1380) <223> консервативный Cys
<400> 1
atg Met 1 gtg Val gee Ala ace Thr tea Ser 5 get Ala аса Thr tcc Ser tea Ser ttc Phe 10 ttc Phe cct Pro etc Leu cca Pro tet Ser 15 ttc Phe 48
ccc etc gac ccc acc gca aaa acc aac aaa/ gtc acc acc tcc acc aac 96
Pro Leu Asp Pro Thr Ala Lys Thr Asn Lys Val Thr Thr Ser Thr Asn
20 25 30
ttc tee ggc etc tec ccc act cca aac tcc tcc ggc agg atg aag gtt 144
Phe Ser Gly Leu Ser Pro Thr Pro Asn Ser Ser Gly Arg Met Lys Val
35 40 45
aaa cca aac get cag gee cca ccc aag ate aac ggc aag aga gtc ggt 192
Lys Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Arg Val Gly
50 55 60
etc cot tet ggc teg gtg aag cct gat aac gag acg tcc tea cag cat 240
Leu Pro Ser Gly Ser Val Lys Pro Asp Asn Glu Thr Ser Ser Gln His
65 70 75 80
ccc gca gca ccg agg acg ttc ate aac cag etg cct gac tgg age atg 288
Pro Ala Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met
85 90 95
ett ett get gca ata аса acc gtc ttc ttg geg get gag aag cag tgg 336
Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp
100 105 110
atg atg ett gac tgg aaa ccg agg ege tet g'4c gtg att atg gat ccg 384
Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Val Ile Met Asp Pro
115 120 125
ttt ggg tta ggg agg ate gtt cag gat ggg ett gtg ttc cgt cag aat 432
Phe Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn
130 135 140
- 101 030862
ttc tct att egg tct tat gag ata ggt get gat ege tct geg tct ata 480
Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile
145 150 155 160
gaa acg gtt atg aat cat tta cag gtaetgatta tgattatgat tatgattgta 534
Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln
165 gttgcttgtt gttactggac aaagttaata tgtattgctg ttatggttat gatag gaa592
Glu
acg Thr 170 gca Ala etc Leu aac Asn cat His gtt Val 175 aag Lys act Thr get Ala gga Gly etg ett gga gat Gly Asp ggg Gly ttt Phe 185 640
Leu 180 Leu
ggt tct act cct gag atg gtt aag aag aac ttg att tgg gtt gtt act 688
Gly Ser Thr Pro Glu Met Val Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr
190 195 200
cgt atg cag gtt gtc gtt gat aaa tat cct act tg gtaagetatt 733
Arg Met Gln Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
205 210
ctcaagcaac cctgagaatc actgcttcct ttgtcatttg cttattcaaa tatctgtctc 793
acag g - gga gat ' gtt , gtg . gaa gta gat . аса tgg ' gtg age cag tct · gga 840
Gly Asp ’ Val ’ Val i Glu ’ Val . Asp 1 Thr Trp ' Val Ser Gln Ser Gly
215 220 225
aag aac ggt atg cgt cgt gat tgg eta gtt hga gat ggc aat act gga 888
Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Gly Asn Thr Gly
230 235 240
gaa att tta аса aga gca tea ag gttagatttt tatttategg ttaggtatet 941
Glu Ile Leu Thr Arg Ala Ser Ser
245 250
gaaaatttga gttactaatg caaaatatta tttttgcag t gtg tgg gtg atg atg996
Val Trp Val Met Met
255
aat Asn aaa Lys etg Leu аса Thr 260 aga Arg aga Arg tta Leu tea Ser aag Lys 265 att Ile cct Prh gaa Glti gag Glu gtt Val 270 ega Arg ggg Gly 1044
gag ata gag cct tac ttt gtt aat tea gac cca gtc ett get gag gac 1092
Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val Leu Ala Glu Asp
275 280 285
age aga aag tta act aaa ett gat gac aag act get gac tat gtt cgt 1140
Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg
290 295 300
tct ggt etc act gtaagtatgc atactttctc ta'tcjtttcat1 caaagcctgt1192
Ser Gly Leu Thr
305 aaacttctga gattcttaca gtttttattt ggtaatttaa acttttgcag ccg cgt1248
Pro Arg
310 tgg agt gac ttg gat gtt aac cag cac gtt aac aat gtg aag tac ate1296
- 102 030862
Trp Ser Asp Leu Asp 315 Val Asn Gln His
ggg tgg ata ctg gag agt gca cct gtg
Gly Trp lie Leu Glu Ser Ala Pro Val
330 335
ctg aaa age atg act ctg gag tat ege
Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg
345 350
gtg ctt cag tec etc ace geg gtt teg
Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser
360 365
ggg аса get ggt gaa gtg gaa tgt cag
Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln
375 380
gga get gaa gtg gtg aga gga aga аса
Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr
395
аса аса act tgg gac att аса ccg tga
Thr Thr Thr Trp Asp lie Thr Pro
410
<210> : 2
<211> 414
<212> 1 Белок
<213> I Brassica napus
<400> 2
Met Val Ala Thr Ser . Ala Thr Ser
1 5
Pro Leu Asp Pro Thr , Ala Lys Thr
20
Phe Ser Gly Leu Ser Pro Thr Pro
35 40
Lys Pro Asn Ala Gln . Ala Pro Pro
50 55
Leu Pro Ser Gly Ser ' Val Lys Pro
65 70
Pro Ala Ala Pro Arg Thr Phe lie
85
Leu Leu . Ala Ala lie Thr Thr Val
100
Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg
Val 320 Asn Asn Val Lys Tyr 325 lie
ggg atg atg gag agt cag aag 1344
Gly Met Met Glu Ser 340 Gln Lys
agg gag tgc ggg agg gac agt 1392
Arg Glu Cys Gly 355 Arg Asp Ser
ggc tgc gat gtt ggt agt ctt 1440
Gly Cys Asp 370 Val Gly Ser Leu
cac ctg etc cgt etc cag gat 1488
His Leu 385 Leu Arg Leu Gln Asp 390
gag tgg agt tec aaa аса tea 1536
Glu 400 Trp Ser Ser Lys Thr 405 Ser
1563
Ser Phe 10 Phe Pro Leu Pro Ser 15 Phe
Asn 25 Lys Val Thr Thr Ser 30 Thr Asn
Asn Ser Ser Gly Arg 45 Met Lys Val
Lys lie ASn Gly 60 Lys Arg Val Gly
Asp Asn Glu 75 Thr Ser Ser Gln His 80
Asn Gln 90 Leh Pro Asp Trp Ser 95 Met
Phe 105 Leu Ala Ala Glu Lys 110 Gln Trp
Arg Ser Asp Val He Met Asp Pro
- 103 030862
115 120 125
Phe Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn
130 135 140
Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile
145 150 155 160
Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys
165 170 175
Thr Ala Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Val
180 185 190
Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val Asp
195 200 205
Lys Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser
210 215 220
Gln Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Gly
225 230 235 240
Asn Thr Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val Trp Val Met Met
245 250 255
Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pr6 Glu Glu Val Arg Gly
260 265 270
Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val Leu Ala Glu Asp
275 280 285
Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg
290 295 300
Ser Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val
305 310 315 320
Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Val Gly
325 330 335
Met Met Glu Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg
340 345 350
Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser feu1 Thr Ala Val Ser Gly
355 360 365
Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His
- 104 030862
370 375 380
Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu
385 390 395 400
Trp Ser Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr Trp Asp Ile Thr Pro
405 410 <210>3 <211>1659 <212> ДНК <213> Brassica napus <220> ,.-.Χ.. ;
<221> CDS Σ*' <222> (1) . . (504) <220 <221> зрелый пептид <222> (1)..(1656) <223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 91 <220>
<221> misc_feature <222> (490)..(492) <223> консервативный Met <2.20 ·'' ' : V 'е ' <221> CDS <222> (584) .. (717) <220 <221> misc_feature <222> (605) .. (607) <223> консервативный Lys <220>
<221> misc_feature , <222> (677)..(679) <223> консервативный Val <220>
<221> CDS <222> (812)..(925)
<220> <221> <222> <223> misc feature (864)..(866) консервативный Met
<220
<221> CDS
<222> (1059 ) . . (1230)
<220>
<221> misc feature
<222> (1096 ) . . (1098)
<223> консервативный Ser
<220
- 105 030862
<221> CDS
<222> (1309) . . (1656)
<220>
<221> misc feature
<222> (1315) .. (1317)
<223> консервативный Trp
<220>
<221> misc feature
<222> (1333) . . (1335)
<223> консервативный Asn
<220>
<221> misc feature
<222> (1339) .. (1341)
<223> консервативный His
<220>
<221> misc feature
<222> (1444) . . (1446)
<223> консервативный Cys
<400>3 atg gtg get act tgc get acg teg teg ttt ttt cat gtt cca tet tet48
Met Val Ala Thr Cys Ala Thr Ser Ser Phe Phe His Val Pro Ser Ser 15 1015
tec Ser teg Ser ett Leu gat Asp 20 acg Thr aat Asn ggg Gly aag Lys ggg Gly 25 aac Asn aga Arg gtt Val ggg Gly tcc Ser 30 act Thr aat Asn 96
ttt get gga ett aac tea acg cca age tet ggg agg atg aag gtt aag 144
Phe Ala Gly Leu Asn Ser Thr Pro Ser Ser Gly Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
cca aac get cag get cca ccc aag ate aac ggg aag aaa get aac ttg 192
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Lys Ala Asn Leu
50 55 60
cct Pro 65 ggc Gly tet Ser gta Val gag Glu ata Ile 70 tea Ser aag Lys get Ala gac Asp aac Asn 75 gag Glu act Thr teg Ser cag Gln ccc Pro 80 240
gca cac gca ccg agg acg ttt ate aac cag etg cct gac tgg agt atg 288
Ala His Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met
85 90 95
etg ett get get ata act acc att ttc ttg gca geg gag aaa cag tgg 336
Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp
.100 105 110
atg atg ett gac tgg aaa ccg agg cgt tet gat atg att atg gat cct 384
Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Ile Met Asp Pro
115 120 125
ttt Phe ggt Gly 130 tta Leu ggg Gly aga Arg att Ile gtt Val 135 cag Gln gat Asp ggt Gly ett Leu gtg Val 140 ttc Phe cgt Arg cag Gln aat Asn
ttt tcc att agg tet tat gaa ata ggt get gat ege tet geg tet ata
Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile
145 150 155 160
106 030862 gaa act gtc atg aat cat tta cag gtactgcttt gattgtggtt acactcacat 534
Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln
165 gttgtcccaa tagatatatg ctcatgacaa gctcttatgc taatgacag gaa acg gcg 592 Glu Thr Ala
170
ett Leu aat Asn cat His gtg Val 175 aag tct gcc gga Ala Gly etg Leu 180 etg gaa aat ggg Gly ttt Phe 185 ggg Gly tee Ser 640
Lys Ser Leu Glu Asn
act cct gag atg ttt aag aag aat ttg ata tgg gtc gtt get cgt atg 688
Thr Pro Glu Met Phe Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Ala Arg Met
190 195 200
cag gtt gtc gtt gat aaa tat cct act tg gtaagccatt gttagtetta 737
Gln Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
205 210
gcacttgact taaaatcatt ttgcatatta cagtgtgcgt agatcatttg cttattcaaa 797 tatctgactc acag g gga gat gtt gtg gaa gtg gat act tgg gtt agt cag 848
Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser Gln
215 220225
tct gga aag aat ggt atg cgt cgt gat tgg eta gtt egg gat tgc aat 896
Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys Asn
230 235 240
act gga gaa att gta acg ega gca tea ag gtcagagttc ttatattttg 945
Thr Gly Glu Ile Val Thr Arg Ala Ser Ser
245 250 1
gtttactcca gctattatcg ttttgctctc tgtttgtatt gtttcctctg ccattagttt1005 gataattgag tctttatagt tgtatatgta tggcaatttt cttctttttg cag t ttg1062
Leu
tgg Trp gtg Val atg Met 255 atg Met aat Asn aaa Lys etc Leu аса Thr 260 agg Arg aga Arg ttg Leu tea Ser aag Lys 265 att Ile cct Pro gaa Glu 1110
gag gtt ega ggg gaa ata gag cct tat ttt gtg aac tct gat cct gtc 1158
Glu Val Arg Gly Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val
270 275 280
att gcc gaa gac age aga aag tta аса aaa ett gat gac aag act get 1206
Ile Ala Glu Asp Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala
285 290 295 300
gac tat gtt cgt tct ggt etc act gtaagtacct tacctttcga caagcctgtc 1260 Asp Tyr Val Arg Ser Gly Leu Thr
305 aaaactcttg aggttetaat ggtttgghaa tgaacttttt tttggcag ccg agg tgg 1317
Pro Arg Trp
310
agt gac Ser Asp tgg ata ttg gat gtt aac cag cat gtt aac aat gta Asn Asn Val aag tac att lie aag Lys ggg Gly etg Leu 1365 1413
Leu Asp Val 315 etg gag agt Asn get Ala Gln cca Pro His gca Ala 335 Val 320 ggg Gly Lys agt Ser 340 Tyr 325 cag Gln
atg Met etg gag
Trp Ile Leu Glu 330 Ser Leu Glu
aaa age atg act etg gag tat ege agg gag tgc ggg aga gac agt gtg 1461
Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val
345 350 355
ett cag tct etc acc gca gtc tct gga tgt gat gtc ggt aac etc ggg 1509
Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly Cys Asp Val Gly Asn Leu Gly
360 365 370 375
аса gcc ggg gaa gtg gag tgt cag cat ttg ett ega etc cag gat gga 1557
Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly
380 385 390
get gaa gtg gtg aga gga aga аса gag tgg age tee cag аса gga gca 1605
Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp Ser Ser Gln Thr Gly Ala
395 400 405
аса act tgg gga cac tac tac ate gta aac att ggt cct ttg gtt cct 1653
Thr Thr Trp Gly His Tyr Tyr Ile Val Asn' .He Gly Pro Leu Val Pro
410 415 420
ttg taa Leu 1659
<210> <211> <212> <213> 4 424 Белок Brassica napus
<400> 4 .
- 107 030862
Met 1 Val Ala Thr Cys 5 Ala Thr Ser Ser Phe 10 Phe His Val Pro Ser 15 Ser
Ser Ser Leu Asp Thr Asn Gly Lys Gly Asn Arg Val Gly Ser Thr Asn
20 25 30
Phe Ala Gly Leu Asn Ser Thr Pro Ser Ser Gly Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Lys Ala Asn Leu
50 55 60
Pro Gly Ser Val Glu Ile Ser Lys Ala Asp Asn Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
Ala His Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met
85 90 95
Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp
100 105 110
- 108 030862
Met Met Leu Asp 115 Trp Lys Pro Arg Arg Ser 120 Asp Met Ile Met 125 Asp Pro
Phe Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn
130 135 140
Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile
145 150 155 160
Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys
165 170 175
Ser Ala Gly Leu Leu Glu Asn Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Phe
180 185 190
Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Ala Arg Met Gln Val Val Val Asp
195 200 205
Lys Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser
210 215 220
Gln Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys
225 230 235 240
Asn Thr Gly Glu Ile Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Trp Val Met Met
245 250 255
Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pro Glu Glu Val Arg Gly
260 265 270
Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pio Val Ile Ala Glu Asp
275 280 285
Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg
290 295 300
Ser Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val
305 310 315 320
Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Ala Gly
325 330 335
Met Leu Glu Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg
340 345 350
Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly
355 360 365
Cys Asp Val Gly Asn Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His
370 375 380
Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu
385 390 395 400
Trp Ser Ser Gln Thr Gly Ala Thr Thr Trp Gly His Tyr Tyr Ile Val
405 410 415
Asn Ile Gly Pro Leu Val Pro Leu
420
- 109 030862 <210> 5 <211> 1733 <212> ДНК <213> Brassica napus <220>
<221> CDS <222> (1) . . (507) ; <220>
<221> зрелый пептид <222> (1) .. (1730) <223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 92 <220>
<221> misc_feature <222> (493)..(495) <223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (740)..(873) <220>
<221> misc_feature <222> (761)..(763) <223> консервативный Lys <220>
<221> misc_feature <222> (833) .. (835) .
<223> консервативный Val <220>
<221> CDS <222> (947) .. (1060) <220>
<221> misc_feature <222> (999) . . (1001) <223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (1141) .. (1312) <220>
<221> misc_feature <222> (1178) .. (1180) <223> консервативный Ser <220>
<221> CDS <222> (1413) .. (1730) <220>
<221> misc_feature <222> (1419) ., (1421) <223> консервативный Тгр <220>
<221> misc_feature <222> (1437)..(1439) <223> консервативный Asn <220>
<221> misc_feature <222> (1443) .. (1445) <223> консервативный His <220>
<221> misc_feature <222> (1548)..(1550) <223> консервативный Cys <400> 5
- 110 030862
atg Met 1 gtg Val gcc Ala acc Thr tct Ser 5 get Ala аса Thr tec Ser tea Ser ttc Phe 10 ttc Phe cct Pro etc Leu cca Pro tct Ser 15 tec Ser 48
tct etc gac ccc aat ggc aaa acc aac aaa etc acc tec acc aac ttc 96
Ser Leu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Asn Lys Leu Thr Ser Thr Asn Phe
20 25 30
tcc gga etc aac ccc аса cca aac tct tec ggc agg tta aag gtc aaa 144
Ser Gly Leu Asn Pro Thr Pro Asn Ser Ser Gly Arg Leu Lys Val Lys
35 40 45
cca aac gcc caa get cca tec aag ate aac ggc aag aaa gtc tct etg 192
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Ser Lys lie Asn Gly Lys Lys Val Ser Leu
50 55 60
cca ggc tea gta cac ate gta aag act gat aat aac cac gat etc teg 240
Pro Gly Ser Val His lie Val Lys Thr Asp Asn Asn His Asp Leu Ser
65 70 75 80
caa caa cac gca ccc aga acg ttc ate aac cag etg cct gac tgg age 288
Gln Gln His Ala Pro Arg Thr Phe He Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser
85 90 95
atg ett etc gcc gcc ate аса acg gtc ttc tta gca get gag aag cag 336
Met Leu Leu Ala Ala lie Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln
100 105 110
tgg atg atg ett gat act aaa ccg aga ege tec gac atg att atg gat 384
Trp Met Met Leu Asp Thr Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met He Met Asp
115 120 125
ccg ttt ggg tta ggg aga ate gtt cag gat ggg ett gtg tac cgt cag 432
Pro Phe Gly Leu Gly Arg He Val Gln Asp Gly Leu Val Tyr Arg Gln
130 135 140
- 111 030862
aat ttc gat ate agg tet tat gaa ata ggt get gat ege tet gca tet 480
Asn Phe Asp lie Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser
145 150 155 160
ata gaa act gtc atg aat cac tta cag gtatattaca atcacactcg 527
Ile Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln
165 tttgatacta tagcttgacc cgcactgatg ttggttttta tatttttata aattatttag587 tgacatatag atataggtta tttagatatt tctaggttcc tacgaaccta cccggactca647 aaccctgtcc gtaaaattga gtttaatttt aaaccaaaaa aatccgatac ccgaaaaaac707 cgatctgtat ctaactcttg tcctcatgac ag gaa acg gca etc aac cat gtg760
Glu Thr Ala Leu Asn His Val
170175
aag Lys tet Ser gca Ala gga Gly 180 etg Leu etg Leu gga Gly gat Asp ggg Gly 185 ttt Phe ggt Gly tet Ser acg Thr cct Pro 190 gag Glu atg Met 808
gtt aag aag aac ttg ata tgg gtc gtt act cgt atg cag gtt gtc gtt 856
Val Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val
195 200 205
gat aaa tat cct act tg gtaagctctc ttgccactta accttaaaca903
Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
210 ’ atatgeatga atcatttgct tattcaaatg tctgtttcac cag g gga gat gtt gtt 959 Gly Asp Val Val ' ’·215
gaa Glu gta Val 220 gat Asp аса Thr tgg Trp gtc Val agt Ser 225 aag Lys tet Ser ggg Gly aag Lys aac Asn 230 ggt Gly atg Met cgt Arg cgt Arg 1007
gat tgg eta gtt egg gat tgc aat acc gga gaa ate tta аса cgt gca 1055
Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys Asn Thr Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ala
235 240 245 250 tea ag gttagettet ttttgttttt ttgtttactc cagctattat etgatgattg1110
Ser Ser agttataacc atetetatgt tacaaaacag t gtg tgg’gtg atg atg aat aaa1162
Val Trp Val Met Met Asn Lys
255
etg Leu 260 аса Thr agg Arg aga Arg tta Leu tea Ser 265 aag Lys ett Leu cct Pro gaa Glu gag Glu 270 gtt Val ega Arg ggg Gly gaa Glu ata Ile 275 1210
gag cct tac ttt gtg aac tet gac cca ate ett gee gag gac age aga 1258
Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Ile (Leu Ala, .Glu Asp Ser Arg
280 285 290
aag tta аса aag eta gat gac aag act get gac tat gtt ege tet ggt 1306
Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg Ser Gly
295 300 305
etc acc gtaagtataa atattcaact ctttatcttt tagegtgtaa aactcttgag 1362
- 112 030862
Leu Thr agattcttat gagtttagat tcttatgagt ttggtgatga.acbtttgcag ccg aga 1418
Pro Arg
310
tgg Trp agt Ser gac Asp ttg Leu 315 gat Asp gtt Val aac Asn cag Gln cat His 320 gtt Val aac Asn aac Asn gtg Val aag Lys 325 tac Tyr att Ile 1466
ggt tgg ata etc gag agt get cca gta gag atg atg gag aag cat aag 1514
Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Val Glu :Met Met .Glu Lys His Lys
330 335 340
ctg aaa age atg act ctg gag tat agg agg gaa tgc ggg aga gac agt 1562
Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser
345 350 355
gtg ett cag tet etc acc geg gtt teg gga tgc gat gtt ggt age etc 1610
Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly Cys Asp Val Gly Ser Leu
360 365 370 375
ggg аса get ggt gaa gtg gaa tgt cag cat ttg ett cga etc cag gat 1658
Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His Leu Leu Arg Leu Gln Asp
380 385 390
gga get gaa gtg gtg aag gga cga аса gtg tgg agt teg aaa аса cca 1706
Gly Ala Glu Val Val Lys Gly Arg Thr Val Trp Ser Ser Lys Thr Pro
395 400 405
tea acg act tgg gac act аса teg taa 1733
Ser Thr Thr Trp Asp Thr Thr Ser
410 415
<210> 6 <211> 415 <212> Белок <213> Brassica napus
<400> 6 Ser Ser Phe 10 Phe Pro Leu Pro Ser 15 Ser
Met 1 Val Ala Thr Ser 5 Ala Thr
Ser Leu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Asn Lys Leu Thr Ser Thr Asn Phe
20 25 30
Ser Gly Leu Asn Pro Thr Pro Asn Ser Ser Gly Arg Leu Lys Val Lys
35 40 45
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Ser Lys Ile Asn Gly Lys Lys Val Ser Leu
50 55 60
Pro Gly Ser Val His lie Val Lys Thr Asp Asn Asn His Asp Leu Ser
65 70 75 80
Gln Gln His Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser
- 113 030862
90 95
Met Leu Leu Ala 100 Ala He Thr Thr Val 105 Phe Leu Ala Ala Glu 110 Lys Gln
Trp Met Met Leu Asp Thr Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met He Met Asp
115 120 125
Pro Phe Gly Leu Gly Arg He Val Gln Asp Gly Leu Val Tyr Arg Gln
130 135 140
Asn Phe Asp He Arg Ser Tyr Glu He Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser
145 150 155 160
lie Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val
165 170 175
Lys Ser Ala Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met
180 185 190
Val Lys Lys Asn Leu He Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val
195 200 205
Asp Lys Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val
210 215 220
Ser Lys Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp
225 230 235 240
Cys Asn Thr Gly Glu He Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val Trp Val Met
245 250 255
Met Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Leu Pro Glu Glu Val Arg
260 265 270
Gly Glu He Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro He Leu Ala Glu
275 280 285
Asp Ser Arg Lys Leu Thr Lys L^U Asp Asp Lysi Thr Ala Asp Tyr Val
290 295 300
Arg Ser Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His
305 310 315 320
Val Asn Asn Val Lys Tyr He Gly Trp He Le'ii Glu Ser Ala Pro Val
325 330 335
Glu Met Met Glu Lys His Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg
- 114 030862
340 345 350
Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser
355 360 365
Gly Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln
370 375 380
His Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Lys Gly Arg Thr
385 390 395 400
Val Trp Ser Ser Lys Thr Pro Ser Thr Thr Tr.p Asp Thr Thr Ser
405 410 415
<210 7 <211> 1572 <212> ДНК <213> Brassica napus <220>
<221> CDS <222> (1)..(498) <220 . , .
<221> зрелый пептид ' ί' ’ <222> (1) .. (1569) ’ <223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 89 <220 <221> misc_feature <222> (484)..(486) <223> консервативный Met <220 Д <221> CDS ' <222> (579)..(712) <220>
<221> misc_feature <222> (610) . . (612) <223> консервативный Lys <220>
<221> misc_feature <222> (672)..(674) <223> консервативный Val <220 . .· ... ·.:
<221> CDS .
<222> (791) . . (904) <220>
<221> misc_feature <222> (843)..(845) <223> консервативный Met <220 <221> CDS
- 115 030862 <222> (995)..(1166) <220>
<221> misc_feature <222> (1032)..(1034) <223> консервативный Ser <220>
<221> CDS <222> (1252) .. (1569) <220>
<221> misc_feature <222> (1258) .. (1260) <223> консервативный Тгр <220>
<221> misc_feature <222> (1276) .. (1278) <223> консервативный Asn <220>
<221> misc_feature <222> (1282) . . (1284) <223> консервативный His <220>
<221> misc_feature <222> (1387) .. (1389) <223> консервативный Cys
<400> 7 аса Thr tcc Ser tea Ser ttc Phe 10 ttc Phe cat Pro etc Leu cca Pro tet Ser 15 tcc Ser 48
atg Met 1 gtg Val gcc Ala acc Thr tea Ser 5 get Ala
ссс etc gac ccc acc gca aaa acc aac aaa gtc acc acc tcc acc aac 96
Pro Leu Asp Pro Thr Ala Lys Thr Asn Lys Val Thr Thr Ser Thr Asn
20 25 30
ttc tcc ggc etc acc ccc acg ccg aac tcc gcc agg atg aag gtt aaa 144
Phe Ser Gly Leu Thr Pro Thr Pro Asn Ser Ala Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
сса aac get cag gcc cca ccc aag ate aac ggc aag aga gtc ggc etc 192
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Arg Val Gly Leu
50 55 60
cct ggc teg gtg gag ate ttg aag cct gat age gag act teg caa cca 240
Pro Gly Ser Val Glu Ile Leu Lys Pro Asp Ser Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
gca ccg agg acg ttc ate aac cag etg cct gac tgg age atg etc etc 288
Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu
85 90 95
gcc gcc ate acg acc gtc ttc tig geg get gag-' aag cag tgg atg atg 336
Ala Ala Ile Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met
100 105 110
etc gac tgg aaa ccg agg cgt tet gac gtg att atg gat ccg ttt ggg 384
Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Val Ile Met Asp Pro Phe Gly
115 120 125
- 116 030862
tta Leu ggg Gly 130 agg Arg ate Ile gtt Val cag Gln gat Asp 135 ggg Gly ett Leu gtg Val ttc Phe cgt Arg 140 cag Gln aat Asn ttt Phe tct Ser 432
att egg tct tat gag ata ggt get gat ege tct geg tct ata gaa acg 480
Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile Glu Thr
145 150 155 160 gtt atg aat cat tta cag gtactgatta tgattatgat tgtagtcgct528
Val Met Asn His Leu Gln
165 tgttgttact gggcaaactt aaatatgtat tgctcttatg gttgtgatag gaa acg584
Glu Thr
gca etc aac cat gtt aag Lys act get ggg . : γ ' · etg ett gga gat ggg ttt ggt Gly 632
Ala Leu 170 Asn His Val Thr 175 Ala Gly Leu Leu Gly Asp 180 Gly Phe
tct act cct gag atg gtt aag aag aac ttg ata tgg gtt gtt act cgt 680
Ser Thr Pro Glu Met Val Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg
185 190 195 200
atg cag gtt gtc gtt gat aaa tat cct act tg gtaagetatt ctcaaacaac 732
Met Gln Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr ir{5
205 210
tetgagaate actgcttcct ttgtgagtca tttgettatt caaatatctg cctcatag g 791
gga gat gtt gtg gaa gta gat аса tgg gtg age cag tct gga aag aac 839
Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser Gln Ser Gly Lys Asn
215 220 225
ggt atg cgt cgt gat tgg eta gtt ega gat ggc aat act gga gag att 887
Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Gly Asn Thr Gly Glu Ile
230 235 240
tta аса aga gca tea ag gttagatttt attttttggt ttacttgggt 934
Leu Thr Arg Ala Ser Ser
245 tagatatctg ataattgagt tataatcatc tccgtgttgt gtaaactatt ctttttgcag994 t gtg tgg gtg atg atg aat aaa etg аса aga aga tta tea aag att cct1043
Val Trp Val Met Met Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys IlePro
250 255 260265
gaa Glu gag Glu gtt Val ega Arg ggg Gly 270 gag Glu ata Ile gag Glu cct Pro tac Tyr 275 ttt Phe' gtt Val aac Asn tea Ser gac Asp 280 cca Pro 1091
gtc ett gee gag gac age aga aag tta аса aaa ett gat gac aaa act 1139
Val Leu Ala Glu Asp Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr
285 290 295
get gtc tat gtt cgt tct ggt etc act gtaagtacaa ; atacttcact 1186
Ala Val Tyr Val Arg Ser Gly Leu Thr
300 305
ctatgtttca acaaagcctg taaatttttg agtctcttac aggtttggta atgaactttt 1246 tgcag ccg cgt tgg agt gac ttg Jgat gtt aac cag drac gtt aac aat gtg1296
Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn Asn Val
- 117 030862
310
320
aag Lys tac Tyr ate ggg tgg ata etg gag Leu Glu agt Ser 330 get Ala cca gtg Pro Val ggg Gly atg Met 335 atg Met gag Glu
Ile Gly Trp 325 Ile
agt cag aag etg aaa age atg act etg gag tat ege agg gag tgt ggg
Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly
340 345 350
aga gac agt gtg etc cag tcc etc acc geg gtt teg ggc tgc gat ate
Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly Cys Asp Ile
355 360 365
ggt age etc ggg аса gee ggt gaa gtg gaa tgt cag cat etg etc aga
Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His Leu Leu Arg
370 375 380 385
etc cag gat gga gee gaa gtg gtg aga gga aga аса gag tgg agt tcc
Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp Ser Ser
390 395 400
aaa аса tea аса аса act tgg gac ate аса ccg tga
Lys Thr Ser Thr Thr Thr Trp Asp Ile Thr Pro
405 410
1344
1392
1440
1488
1536
1572 <210> 8 <211> 412 <212> Белок <213> Brassica napus
<400> 8 Ala Thr Ser 5 Ala Thr Ser Ser Phe 10 Phe Pro Leu Pro Ser 15 Ser
Met 1 Val
Pro Leu Asp Pro Thr Ala Lys Thr Asn Lys Val Thr Thr Ser Thr Asn
20 25 30
Phe Ser Gly Leu Thr Pro Thr Pro Asn Ser Ala Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Arg Val Gly Leu
50 55 60
Pro Gly Ser Val Glu Ile Leu Lys Pro Asp Ser Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu
85 90 95
Ala Ala Ile Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met
100 105 110
Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Val Ile Met Asp Pro Phe Gly
115 120 125
- 118 030862
Leu Gly 130 Arg Ile Val Gln Asp Gly 135 Leu Val „?hp Arg 1'6 > 14 0 Gln Asn Phe Ser
Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile Glu Thr
145 150 155 160
Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys Thr Ala
165 170 175
Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Val Lys Lys
180 185 190
Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val Asp Lys Tyr
195 200 205
Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser Gln Ser
210 215 220
Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu va'l Arg Asp Gly Asn Thr
225 230 '235 240
Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val Trp Val Met Met Asn Lys
245 250 255
Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pro Glu Glu Val Arg Gly Glu Ile
260 265 270
Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val Leu Ala Glu Asp Ser Arg
275 280 285
Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Val Tyr Val Arg Ser Gly
290 295 300
Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn Asn
305 310 315 320
Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Pro Val Gly Met Met
325 330 335
Glu Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys
340 345 350
Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly Cys Asp
355 360 365
Ile Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His Leu Leu
370 375 380
Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp Ser
385 390 395 400
Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr Trp Asp Ile Thr Pro
405 410
- 119 030862 <210> 9 <211> 1770 <212> ДНК <213> Brassica napus <220>
<221> CDS <222> (1) .. (504) : <220> . ; .
<221> зрелый пептид <222> (1) . . (1767) <223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 91 <220>
<221> misc_feature <222> (490)..(492) <223> консервативный Met <220> W <221> CDS <222> (581) . . (714) <220>
<221> misc_feature <222> (602) . . (604) <223> консервативный Lys <220>
<221> misc_feature <222> (674)..(676) <223> консервативный Val <220>
<221> CDS <222> (945) . . (1058) <220>
<221> misc_feature <222> (997)..(999) <223> консервативный Met <220> ' .А/ ' ’ <221> CDS <222> (1190) .. (1361) <220>
<221> misc_feature <222> (1227) .. (1229) <223> консервативный Ser <220>
<221> CDS
- 120 030862 <222> (1447) . . (1767) <220>
<221> misc_feature <222> (1453) .. (1455) <223> консервативный Тгр <220>
<221> misc_feature <222> (1471) . . (1473) <223> консервативный Asn <220>
<221> misc_feature <222> (1477) . . (1479) <223> консервативный His <220>
<221> misc_feature <222> (1582) .. (1584) <223> консервативный Cys <400> 9
atg Met 1 gtg Val get Ala act Thr tcc Ser 5 get Ala acg Thr tcc Ser teg Ser ttt Phe 10 ttt Phe cat His gtt Val cca Pro tct Ser 15 tcc Ser 48
tcc tct ctt gat act aat ggg aag ggg aac aga gtt geg tcc acg aac 96
Ser Ser Leu Asp Thr Asn Gly Lys Gly Asn Arg Val Ala Ser Thr Asn
20 25 30
ttc get gga ctt aac tea acg cca age tct ggg agg atg aag gtt aaa 144
Phe Ala Gly Leu Asn Ser Thr Pro Ser Ser Gly Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
cca aac get cag get cca ccc aag ate aac ggg aag aaa get aac ttg 192
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys He Asn Gly Lys Lys Ala Asn Leu
50 55 60
cct ggt tct gta gag ata tea aag tct gac aac gag act teg cag ccc 240
Pro Gly Ser Val Glu He Ser Lys Ser Asp Asn Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
gca ccc gca ccg agg acg ttt ate aac cag ctg cct gac tgg age atg 288
Ala Pro Ala Pro Arg Thr Phe He Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met
85 90 95
ctt etc get gee ata аса acc att ttc ttg geg get gag aaa cag tgg 336
Leu Leu Ala Ala He Thr Thr He Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp
100 105 110
atg atg ctt gac tgg aaa ccc agg cgt tct gat atg att atg gat cct 384
Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met He Met Asp Pro
115 120 125
ttc ggt tta ggg aga ate gtt cag gat ggt ctt gtc ttt cgt cag aat 432
Phe Gly Leu Gly Arg He Val Gln Asp Gly lieu Val Phe Arg Gln Asn
130 135 140
ttc tcc att agg tct tat gag ata ggt get gat ege tct geg tct ata 480
Phe Ser lie Arg Ser Tyr Glu He Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser He
145 150 155 160
gaa act gtt atg aat cat tta cag gtaggtacta ctttgattgt tatcacactt 534
- 121 030862
Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln
165 gtcaatagat atatatgctc atgacaagct cttatgctaa tgacag gaa acg gcc589
Glu Thr Ala
170
eta Leu aac Asn cat His gtg Val 175 aag Lys tet Ser gcc Ala gga Gly etg Leu 180 etg Leu gaa Glu aat Asn ggg Gly ttt Phe 185 ggt Gly tet Ser 637
act ccc gag atg ttt aag aag aac ttg ata tgg gtc gtt get cgt atg 685
Thr Pro Glu Met Phe Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Ala Arg Met
190 195 200
cag gtt gtc gtt gat aaa tat cct act tg gtaagccatt ' gteagtetta 734
Gln Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
205 210
ccacttaact taaaatcatt atgetaetgt ctctgagaat ccctggttct cgttgtgagt 794
tatccaaatt atettgeata aacttgagta tgcaagttca tgctctcact tgctcatgtg 854
actaggacat tttgcaccct tagattacat gatgtgcttg catattacag tgtgeataga 914
teattaetta ttcaaatatc tgactaacag g gga gat Gly Asp ' 215 gtt gtg gaa Val Val Glu gtg gat Val Asp 220 966
аса Thr tgg Trp gtt Val agt Ser cag tet gga Gly aag Lys aat Asn ggt Gly 230 atg Met cgt Arg cgt Arg gat Asp tgg Trp 235 etg Leu 1014
Gln 225 Ser
gtt egg gat tgc aat act gga gaa att gta acg ega gca tea ag 1058
Val Arg Asp Cys Asn Thr Gly Glu He Val Thr Arg Ala Ser Ser
240 245 250
gtcagagttc ttatgttttg gtttactgac tccagctatt atcattttgc tctctgtttg1118 tattgtttgc tctgccatta gtttgataat agagacttta tatatgtatg gcaattttct1178 tctttttgca g t ttg tgg gtg atg atg aat aaa etc аса agg aga ttg1226
Leu Trp Val Met Met Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu
255260
tea Ser aag Lys 265 att Ile cct Pro gaa Glu gag Glu gtt Val 270 ega Arg ggg Gly gaa Glu ata Ile gag Glu 275 cct Pro tat Tyr ttt Phe gtg Val 1274
aac tet gat cct gtc att gcc gaa gac age aga aag tta acc aaa ett 1322
Asn Ser Asp Pro Val Ile Ala Glu Asp Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu
280 285 290 295
gat gac aag act get gac tat gtt cgt teg ggt etc act gtaagtaccc 1371
Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg Ser Gly Leu Thr
300 305
tacctttcaa caacaagctt gtcaaaactc tcgaggttgg ttcttatgga ttggtaatga 1431 aactttttta ttcag ccg agg tgg agt gac ttg gat gtt aac cag cat gtt1482
Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val
310 315320 aac aat gta aag tac ate ggg tgg ata etg gag agt get cca gca ggg1530
- 122 030862
Asn Asn Val Lys Tyr 325 Ile Gly Trp Ile Leu Glu 330 Ser Ala Pro Ala Gly 335
atg ctg gag agt cag aag ctg aaa age atg act ctg gag tat ege agg 1578
Met Leu Glu Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg
340 345 350
gag tgc ggg aga gac agt gtg ett cag tet etc acc geg gtc tet gga 1626
Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly
355 360 365
tgt gat gtc ggt aac etc ggg аса gee ggg g.ag gtg gag tgt cag cat 1674
Cys Asp Val Gly Asn Leu Gly Thr Ala Gly Glii Val Glu Cys Gln His
370 375 380
ttg ett cgt etc cag gat gga get gaa gtg gtg aga gga aga аса gag 1722
Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu
385 390 395 400
tgg agt tcc aag аса gaa gca аса act tgg gac act get аса teg taa 1770
Trp Ser Ser Lys Thr Glu Ala Thr Thr Trp Asp Thr Ala Thr Ser
405 410 415
<210> 10
<211> 415
<212> Белок
<213> Brassica napus
<400> 10
Met Val Ala Thr Ser Ala Thr Ser Ser Phe Phe His Val Pro Ser Ser
1 5 10 15
Ser Ser Leu Asp Thr Asn Gly Lys Gly Asn Val Ala Ser Thr Asn
20 25 ' 7 f. ; 30
Phe Ala Gly Leu Asn Ser Thr Pro Ser Ser Gly Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Lys Ala Asn Leu
50 55 60
Pro Gly Ser Val Glu Ile Ser Lys Ser Asp Asn Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
Ala Pro Ala Pro Arg Thr Phe lie Asn Gln Leu Pre Asp Trp Ser Met
85 90 95
Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp
100 105 110
Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Jle Met Asp Pro
115 120 125
Phe Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phfe Arg Gln Asn
- 123 030862
130 135 140
Phe 145 Ser Ile Arg Ser Tyr 150 Glu Ile Gly Ala Asp 155 Arg Ser Ala Ser Ile 160
Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys
165 170 175
Ser Ala Gly Leu Leu Glu Asn Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Phe
180 185 190
Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Ala Arg Met Gln Val Val Val Asp
195 200 '205
Lys Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser
210 215 220
Gln Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys
225 230 235 240
Asn Thr Gly Glu Ile Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Trp Val Met Met
245 250 255
Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pro Glu Glu Val Arg Gly
260 265 270
Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val lie Ala Glu Asp
275 280 285
Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr, Ala Asp Tyr Val Arg
290 295 300
Ser Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val
305 310 315 320
Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Ala Gly
325 330 335
Met Leu Glu Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg
340 345 350
Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly
355 360 365
Cys Asp Val Gly Asn Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His
370 375 380
Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val val Arg Gly Arg Thr Glu
385 390 3 95 400
Trp Ser Ser Lys Thr Glu Ala Thr Thr Trp Asp Thr Ala Thr Ser
405 410 415
- 124 030862 <210> 11 <211> 1891 <212> ДНК <213> Brassica napus <220 <221> CDS <222> (1) .. (507) <220 <221> зрелый пептид <222> (1)..(1888) <223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 92 <220 ./ ..
<221> misc_feature ) <222> (493) .. (495) <223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (930) .. (1063) <220>
<221> misc_feature <222> (951) . . (953) <223> консервативный Lys <220 <221> misc_feature .
<222> (1023) . . (1025) <223> консервативный Val ' <220>
<221> CDS <222> (1138) . . (1251) <22 0 ..
<221> misc_feature 1 .
<222> (1190)..(1192) <223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (1324) . . (1495) <220 <221> misc_feature <222> (1361)..(1363) <223> консервативный Ser <220>
<221> CDS <222> (1571) . . (1888).
<220>
- 125 030862 <221> misc_feature <222> (1577) . . (1579) <223> консервативный Тгр <220>
<221> misc_feature <222> (1595)..(1597) <223> консервативный Asn <220>
<221> misc_feature <222> (1601) .. (1603) <223> консервативный His <220>
<221> misc_feature <222> (1706) .. (1708) <223> консервативный Cys <400> 11
atg Met 1 gtg Val gcc Ala acc Thr tet Ser 5 get Ala аса Thr tcc Ser tea Ser ttc Phe 10 ' ttc Phe cct Pro etc Leu cca Pro tet Ser 15 tcc Ser 48
tet etc gac cct aat ggc aaa acc aac aaa etc acc tcc acc aac ttc 96
Ser Leu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Asn Lys Leu Thr Ser Thr Asn Phe
20 25 30
tet gga etc aac ccc ata cca aac tet tcc ggc agg tta aag gtc aaa 144
Ser Gly Leu Asn Pro Ile Pro Asn Ser Ser Gly Arg Leu Lys Val Lys
35 40 45
cca aac gcc caa get cca tcc aag ate aac ggc aat aat gtc tcc ttg 192
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Ser Lys Ile Asn Gly Asn Asn Val Ser Leu
50 55 60
cca ggc tea gta cac ate gta aag act gat aat aac cac gat etc teg 240
Pro Gly Ser Val His Ile Val Lys Thr Asp Asn Asn His Asp Leu Ser
65 70 75 80
caa caa cac gca ccc aga acg ttc ate aac cag eta cct gac tgg age 288
Gln Gln His Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser
85 90 95
atg ett etc gcc gcc ate аса acg gtc ttc ttet get get gag aaa cag 336
Met Leu Leu Ala Ala lie Thr Thr Val Phe Leu' Ala Ala Glu Lys Gln
100 105 110
tgg atg atg ett gac teg aaa ccg agg cgt tet gat atg att atg gat 384
Trp Met Met Leu Asp Ser Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Ile Met Asp
115 120 125
ccg ttc ggg tta ggg agg ate gtt cag gat ggg ett gtg tac cgt cag 432
Pro Phe Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Tyr Arg Gln
130 135 140
aac ttc gat ate agg tet tat gaa ata ggt get gat ege tet geg tet 480
Asn Phe Asp Ile Arg Ser Tyr Glu lie Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser
145 150 155 160
ata gaa аса gtc atg aac cac tta cag gtatattaca atcacactcg 527
lie Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln
165
- 126 030862
attgatacta gagcttgaca tgttggtttt tatctttt.ta taaattgttt agtgacattt 587
tcaaacatat agatataggt tatttagata tttctaggtt cctacaaacc tacccagact 647
caaaccccgt ccggaaattt ataatattaa taccgaacag agttttattt taaaccaaaa 707
aatcagttga cccgcacggg atgttggttt ttatctattt tatacattgt ttaaggacat 767
ttttaaacat ataaatatag gttatttaga tatttetagg ttcctacgaa cctacccgga 827
aatttataat acccgaacat agtttaattt ttaaaccaaa aatccaatac ccgaaaaaac 887
caatctgtga tatgeatgat ctaactcttg tcctcgtgac ag gaa acg Glu Thr get etc Ala Leu 941
170
aac cat gtg aag tet get gga etg etg gga gat ggg ttt ggt tet acc
Asn His Val Lys Ser Ala Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr
175 180 185
cct gag atg gtt aag aag aac ttg ata tgg gtc gtt act cgt atg cag
Pro Glu Met Val Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln
190 195 200 205
gtt gtc gtt gat aaa tat cct act tg gtadgccctc t^agcactt a
Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
210
989
1037
1083 accttaaaac aatatgcatg aatcatttgc ttattcaaat gtctgcttca ccag g gga 1141 Gly 215
gat Asp gtt Val gtt Val gaa Glu gta gat Val Asp 220 аса Thr tgg gtt agt Ser 225 aag Lys tet Ser ggg Gly aag Lys aat Asn 230 ggt Gly 1189
Trp Val
atg cgt cgt gat tgg eta gtt egg gat tgt aat act gga gaa att tta 1237
Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys Asn Thr Gly Glu Ile Leu
235 240 245 аса aga gca tea ag gttagettet ttttgtttac tccagctatt atetgattat 1291
Thr Arg Ala Ser Ser
250 tgagttataa ccatctctgt gttgcaaaac ag t gtg tgg gtg atg atg aat aaa
Val Trp Val Met Met Asn Lys
255
1345
gtg Val 260 аса Thr agg Arg aga Arg tta Leu tea Ser 265 aag Lys ett Leu cct Pro gaa Glu gag Glu 270 gtt Val ega Arg ggg Gly gaa Glu ata Ile 275 1393
gag cct tac ttt gtg aac tet gac cct ate ett gee gag gac age aga 1441
Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Ile Leu Ala Glu Asp Ser Arg
280 285 290
aag tta аса aaa eta gat gag aag act get gac tat gtt ege tet ggt 1489
Lys Leu Thr Lys Leu Asp Glu Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg Ser Gly
295 300 305
etc acc gtaagtataa atatttgttt ttatctttca gcaagtgetga ttctgatggg 1545
Leu Thr :
- 127 030862
tttggtgatt atetaaettt tgcag ccg Pro 310 aga Arg tgg Trp agt Ser gac Asp ttg Teu 315 gat Asp gtt Val aac Asn 1597
cag cat gtt aac aac gtg aag tac att ggt tgg ata etc gag agt get 1645
Gln His Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala
320 325 330
cca gtg gag atg atg gag aag cat aag etg aaa age atg act etg gag 1693
Pro Val Glu Met Met Glu Lys His Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu
335 340 345 350
tat agg agg gaa tgc ggg aga gac agt gtg ett cag tct etc acc geg 1741
Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala
355 360 365
gtt teg ggt tgc gat gtt ggt age etc ggg аса get ggt gaa gtg gaa 1789
Val Ser Gly Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu
370 375 380
tgt cag cat ttg ett ega etc cag gat gga get gaa gtg gtg aag gga 1837
Cys Gln His Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Lys Gly
385 390 395
ega аса gtg tgg agt tee aaa аса cca tea аса act tgg gac act аса 1885
Arg Thr Val Trp Ser Ser Lys Thr Pro Ser' Thr Thr Trp Asp Thr Thr
400 405 410
1891 teg taa
Ser
415 <210> 12 <211> 415 <212> Белок <213> Brassica napus <400> 12
Met Val Ala Thr Ser Ala Thr Ser Ser Phe
5 10
Phe Pro Leu Pro Ser Ser
Pro Asn 50 Ala Gln Ala Pro Ser 55 Lys Ile Asn Gly Asn 60 Asn Val Ser Leu
Pro Gly Ser Val His Ile Val Lys Thr Asp Asn Asn His Asp Leu Ser
65 70 75 80
Gln Gln His Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser
85 90 95
- 128 030862
Met Leu Leu Ala 100 Ala Ile Thr Thr Val 105 Phe Leu Ala Ala Glu 110 Lys Gln
Trp Met Met Leu Asp Ser Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Ile Met Asp
115 120 125
Pro Phe Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Tyr Arg Gln
130 135 140
Asn Phe Asp Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser
145 150 155 160
Ile Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val
165 170 175
Lys Ser Ala Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met
180 185 190
Val Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val
195 200 205
Asp Lys Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val
210 215 220
Ser Lys Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp
225 230 235 240
Cys Asn Thr Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val Trp Val Met
245 250 255
Met Asn Lys Val Thr Arg Arg Leu Ser Lys Leu Pro Glu Glu Val Arg
260 265 270
Gly Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Ile Leu Ala Glu
275 280 285
Asp Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Glu Lys Thr Ala Asp Tyr Val
290 295 300
Arg Ser Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His
305 310 315 320
Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Val
325 330 335
Glu Met Met Glu Lys His Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg
340 345 350
- 129 030862
Arg Glu Cys 355 Gly Arg Asp Ser Val 360 Leu Gln Ser Leu Thr 365 Ala Val Ser
Gly Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln
370 375 380
His Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Lys Gly Arg Thr
385 390 395 400
Val Trp Ser Ser Lys Thr Pro Ser Thr Thr Trp Asp Thr Thr Ser
405 410 415
<210 13 <211> 1560 <212> ДНК <213> Brassica napus <220 <221> CDS <222> (1)..(501) <220 <221> зрелый пептид <222> (1) . . (1557) <223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 90 <220 <221> misc_feature ‘ ' <222> (487)..(489) <223> консервативный Met <220 <221> CDS <222> (587)..(720) <220>
<221> misc_feature <222> (608) .. (610) <223> консервативный Lys <220> i <221> misc_feature <222> (680)..(682) <223> консервативный Val <220> ' <221> CDS <222> (795) . . (908) · <220 <221> misc_feature ;
<222> (847)..(849) <223> консервативный Met <220 <221> CDS <222> (978) . . (1149) <220
- 130 030862 <221> misc_feature <222> (1015) . . (1017) <223> консервативный Ser <220>
<221> CDS <222> (1240) . . (1557) <220>
<221> misc_feature <222> (1246) .. (1248) <223> консервативный Trp <220>
<221> misc_feature <222> (1264) .. (1266) <223> консервативный Asn <220>
<221> misc_feature <222> (1270) ., (1272) <223> консервативный His <220>
<221> misc_feature <222> (1375) . . (1377) <223> консервативный Cys <400> 13 atg gtg gcc acc tea get аса tcc tea Met Val Ala Thr Ser Ala Thr Ser Ser
1 5
cca etc gac ccc acc gca aaa acc aac
Pro Leu Asp Pro 20 Thr Ala Lys Thr Asn 25
ttc tcc ggc etc tcc ccc act cca aac
Phe Ser Gly 35 Leu Ser Pro Thr Pro 40 Asn
aaa cca aac get cag gcc cca ccc aag
Lys Pro 50 Asn Ala Gln Ala Pro 55 Pro Lys
etc cct ggc teg gtg aag cct gat aac
Leu 65 Pro Gly Ser Val Lys 70 Pro Asp Asn
gca gca ccg agg acg ttc ate aac cag
Ala Ala Pro Arg Thr 85 Phe He Asn Gln
ctt get gca ata аса acc gtc ttc ttg
Leu Ala Ala lie 100 Thr Thr Val Phe Leu 105
atg ctt gac tgg aaa ccg agg ege tct
Met Leu Asp 115 Trp Lys Pro Arg Arg 120 Ser
ggg tta ggg agg ate gtt cag gat ggg
Gly Leu 130 Gly Arg He Val Gln 135 Asp Gly
ttc Phe 10 ttc Phe cct Pro etc Leu cca Pro tct Ser 15 tcc Ser 48
aaa gtc acc acc tcc acc aac 96
Lys Val Thr Thr Ser 30 Thr Asn
tcc tcc ggc agg atg aag gtt 144
Ser Ser Gly Arg 45 Met Lys Val
ate aac ggc aag aga gtc ggt 192
He Asn Gly 60 Lys Arg Val Gly
gag acg tcc tea cag cat ccc 240
Glu Thr 75 Ser Ser Gln His Pro 80
ctg cct gac tgg age atg ctt 288
Leu 90 Pro Asp Trp Ser Met 95 Leu
geg get gag aag cag tgg atg 336
Ala Ala Glu Lys Gln 110 Trp Met
gac c(tg att htg gat ccg ttt 384
Asp Val He Met 125 Asp Pro Phe
ctt gtg ttc cgt cag aat ttc 432
Leu Val Phe 140 Arg Gln Asn Phe
- 131 030862
480
tct att egg tct tat gag ata ggt get gat ege tct geg tct ata gaa
Ser lie Arg Ser Tyr Glu He Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser He Glu
145 150 155 160
acg gtt atg aat cat tta cag gtaetgatta tgattatgat tatgattgta
Thr Val Met Asn His Leu Gln
165
531 gttgcttgtt gttactggac aaagttaata tgtattgctg ttatggttat gatag gaa 589
Glu
acg gca etc Leu aac Asn cat His gtt Val aag act get gga etg ett gga Leu Leu Gly 180 gat ggg Asp Gly ttt Phe 637
Thr Ala 170 Lys 175 Thr Ala Gly
ggt tct act cct gag atg gtt aag aag aac ttg att tgg gtt gtt act 685
Gly Ser Thr Pro Glu Met Val Lys Lys Asn Leu lie Trp Val Val Thr
185 190 195 200
cgt atg cag gtt gtc gtt gat aaa tat cct act tg gtaagetatt 730
Arg Met Gln Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
205 210
ctcaagcaac , cctgagaatc actgcttc'ct ttgtcatttg cttattcaaa tatctgtctc 790
acag g gga < gat gtt gtg gaa gta gat аса ' tgg gtg age cag tct gga 837
Gly . bsp Val Val Glu Val Asp Thr ' Trp Val Ser Gln Ser ( Gly
215 220 225
aag aac ggt atg cgt cgt gat tgg eta gtt ega gat ggc aat act gga 885
Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Gly Asn Thr Gly
230 235 240
gaa att tta аса aga gca tea ag gttagatttt tatttategg ttaggtatet 938
Glu He Leu Thr Arg Ala Ser Ser
245
gaaaatttga gttactaatg caaaatatta tttttgcag t gtg tgg gtg atg atg 993 Val Trp Val Met Met
255
aat aaa etg аса aga aga tta tea aag att cct gaa gag gtt ega ggg 104 1
Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys He Pro Glu Glu Val Arg Gly
260 265 270
gag ata gag cct tac ttt gtt aat tea gac cca gtc ett get gag gac 108 9
Glu He Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val Leu Ala Glu Asp
275 280 285
age aga aag tta act aaa ett gat gac aag act get gac tat gtt cgt 113 7
Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg
290 295 300 tct ggt etc act gtaagtatgc atactttctc tatgtttcat caaagcctgt 1189
Ser Gly Leu Thr
305 aaacttctga gattcttaca gtttttattt ggtaatttaa aett^tgeag ccg cgt 1245 ' Pro Arg tgg agt gac ttg gat gtt aac cag cac gtt aac aat gtg aag tac ate
- 132 030862
Trp 310 Ser Asp Leu Asp Val 315 Asn Gln His Val Asn 320 Asn Val Lys Tyr Ile 325
ggg tgg ata ctg gag agt gca cct gtg ggg atg atg gag agt cag aag 1341
Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Val Gly Met Met Glu Ser Gln Lys
330 335 340
ctg aaa age atg act ctg gag tat ege agg gag tgc •ggg agg gac agt 1389
Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser
345 350 355
gtg ett cag tcc etc acc geg gtt teg ggc tgc gat gtt ggt agt ett 1437
Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly Cys Asp Val Gly Ser Leu
360 365 370
ggg аса get ggt gaa gtg gaa tgt cag cac ctg etc cgt etc cag gat 1485
Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His Leu Leu Arg Leu Gln Asp
375 380 385
gga get gaa gtg gtg aga gga aga аса gag tgg agt tcc aaa аса tea 1533
Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp Ser Ser Lys Thr Ser
390 395 400 405
аса аса act tgg gac att аса ccg tga1560
Thr Thr Thr Trp Asp Ile Thr Pro
410 <210>14 <211>413 <212> Белок <213> Brassica napus <400>14
Met Val Ala Thr Ser Ala Thr Ser Ser Phe Phe Pro Leu Pro Ser Ser
1015
Pro Leu Asp Pro 20 Thr Ala Lys Thr
Phe Ser Gly Leu Ser Pro Thr Pro
35 40
Asn 25 Lys Val Thr Thr Ser 30 Thr Asn
Asn Ser Ser Gly Arg 45 Met Lys Val
Leu 65 Pro Gly Ser Val Lys 70 Pro Asp
Ala Ala Pro Arg Thr 85 Phe Ile Asn
Asn Glu Thr 75 Ser Ser Gln His Pro 80
Gln Leu 90 Pro’ Asp Trp Ser Met 95 Leu
Leu Ala Ala Ile Thr Thr Val
100
Met
Met Leu Asp Trp Lys
Pro Arg Arg Ser Asp Val
Ile Met Asp Pro Phe
- 133 030862
115 120 125
Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn Phe
130 135 140
Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile Glu
145 150 155 160
Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys Thr
165 170 175
Ala Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Val Lys
180 185 190
Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val Asp Lys
'195 200 205
Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser Gln
210 215 220
Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Gly Asn
225 230 235 240
Thr Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val Trj5 !Val Met Met Asn
245 250 255
Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pro Glu Glu Val Arg Gly Glu
260 265 270
Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val Leu Ala Glu Asp Ser
275 280 285
Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg Ser
290 295 300
Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn
305 310 315 320
Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Val Gly Met
325 330 335
Met Glu Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr L<U Gl^ Tyr Arg Arg Glu
340 345 350
Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly Cys
355 360 365
Asp Val Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His Leu
370 375 380
Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp
385 390 395 400
Ser Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr Trp Asp Ile Thr Pro
405 410
- 134 030862
<210> 15 .
<211> 1632
<212> ДНК
<213> Brassica napus
<220>
<221> CDS <222> (1)..(504)
<220>
<221> зрелый пептид
<222> (1) .. (1629)
<223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 91
<220>
<221> misc feature
<222> (490) .. (492)
<223> консервативный Met
<220>
<221> CDS
<222> (584) . . (717)
<220> 7 : ί I Л '
<221> misc feature
<222> (605)..(607)
<223> консервативный Lys
<220>
<221> misc feature
<222> (677) .. (679)
<223> консервативный Val
<220>
<221> CDS
<222> (812)..(925)
<220>
<221> misc feature
<222> (964)..(966)
<223> консервативный Met
<220>
<221> CDS
<222> (1059) . . (1230)
<220>
<221> misc feature '
<222> (1096) . . (1098)
<223> консервативный Ser
<220>
<221> CDS
<222> (1309) .. (1629)
<220>
<221> misc feature
<222> (1315) .. (1317)
<223> консервативный Trp
<220>
<221> misc feature
<222> (1333) .. (1335)
<223> консервативный Asn
<220>
<221> misc feature
<222> (1339) . . (1341)
<223> консервативный His
<220>
<221> misc feature
<222> (1444) .. (1446)
<223> консервативный Cys
<400> 15
- 135 030862
atg Met 1 gtg Val get Ala act Thr tgc Cys 5 get Ala acg Thr teg Ser teg Ser ttt Phe 10 ttt Phe cat His gtt Val cca Pro tct Ser 15 tct Ser 48
tcc teg ett gat acg aat ggg aag ggg aac aga gtt ggg tcc act aat 96
Ser Ser Leu Asp Thr Asn Gly Lys Gly Asn Arg Val Gly Ser Thr Asn
20 25 30
ttt get gga ett aac tea acg cca age tct ggg agg atg aag gtt aag 144
Phe Ala Gly Leu Asn Ser Thr Pro Ser Ser Gly Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
cca aac get cag get cca ccc aag ate aac ggg aag aaa get aac ttg 192
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Lys Ala Asn Leu
50 55 60
cct ggc tct gta gag ata tea aag get gac aac gag act teg cag ccc 240
Pro Gly Ser Val Glu Ile Ser Lys Ala Asp Asn Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
gca cac gca ccg agg acg ttt ate aac cag etg cct gac tgg agt atg 288
Ala His Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met
85 90 95
etg ett get get ata act acc att ttc ttg gca geg gag aaa cag tgg 336
Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp
100 105 110
atg atg ett gac tgg aaa ccg agg cgt tct gat atg att atg gat cct 384
Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Ile Met Asp Pro
115 120 125
ttt ggt tta ggg aga att gtt cag gat ggt ett gtg ttc cgt cag aat 432
Phe Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn
130 135 140
ttt tcc att agg tct tat gaa ata ggt get gat cgh tct geg tct ata 480
Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu lie Gly Ala Ad]5 Arg Ser Ala Ser Ile
145 150 155 160
- 136 030862 gaa act gtc atg aat cat tta cag gtactgcttt gattgtggtt acactcacat 534
Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln
165 gttgtcccaa tagatatatg ctcatgacaa gctcttatgc taatgacag gaa acg gcg 592 Glu Thr Ala
170
ett Leu aat Asn cat His gtg Val 175 aag Lys tet Ser gcc Ala gga Gly etg Leu 180 etg Leu gaa Glu aat Asn ggg Gly ttt Phe 185 ggg Gly tee Ser 640
act cct gag atg ttt aag aag aat ttg ata tgg gtc gtt get cgt atg 688
Thr Pro Glu Met Phe Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Ala Arg Met
190 195 200
cag gtt gtc gtt gat aaa tat cct act tg gtaagccatt , gttagtetta 737
Gln Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
205 210 .,+
gcacttgact taaaatcatt ttgcatatta cagtgtgcgt agatcatttg cttattcaaa 797 tatctgactc acag g gga gat gtt gtg gaa gtg gat act tgg gtt agt cag 848
Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser Gln
215 220225
tet Ser gga Gly aag Lys aat Asn ggt Gly 230 atg Met cgt Arg cgt Arg gat Asp tgg Trp 235 eta Leu gtt Val egg Arg gat Asp tgc Cys 240 aat Asn 896
act gga gaa att gta acg ega gca tea ag gtcagagttc ttatattttg 945
Thr Gly Glu Ile Val Thr Arg Ala Ser Ser
245 250
gtttactcca gctattatcg ttttgctctc tgtttgtatt gtttcctctg ccattagttt1005 gataattgag tctttatagt tgtatatgta tggcaatttt cttctttttg cag t ttg1062
Leu
tgg Trp gtg Val atg Met 255 atg Met aat Asn aaa Lys etc Leu аса Thr 260 agg Arg aga Arg ttg Leu tea Ser aag Lys 265 att Ile cct Pro gaa Glu 1110
gag gtt ega ggg gaa ata gag cct tat ttt gtg aac tet gat cct gtc 1158
Glu Val Arg Gly Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val
270 275 280
att gcc gaa gac age aga aag tta аса aaa ett gat gac aag act get 1206
Ile Ala Glu Asp Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala
285 290 295 300
gac tat gtt cgt tet ggt etc act gtaagtacct tacctttcga caagcctgtc 1260 Asp Tyr Val Arg Ser Gly Leu Thr
305 aaaactcttg aggttetaat ggtttggtaa tgaacttttt tttggcag ccg agg tgg 1317 Pro Arg Trp
310 agt gac ttg gat gtt aac cag cat gtt aac aat gta aag tac att ggg 1365
Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly
315 320 325
- 137 030862
tgg Trp ata Ile etg Leu 330 gag Glu agt Ser get Ala cca Pro gca Ala 335 ggg Gly atg Met etg Leu gag Glu agt Ser 340 cag Gln aag Lys etg Leu 1413
aaa age atg act etg gag tat ege agg gag tgc ggg aga gac agt gtg 1461
Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu ,Cys· Gly Arg Asp Ser Val
345 350 355
ett cag tet etc acc gca gtc tet gga tgt gat gtc ggt aac etc ggg 1509
Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly Cys Asp Val Gly Asn Leu Gly
360 365 370 375
аса gcc ggg gaa gtg gag tgt cag cat ttg ett cga etc cag gat gga 1557
Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly
380 385 390
get gaa gtg gtg aga gga aga аса gag tgg age tcc aag аса gga gca 1605
Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp Ser Ser Lys Thr Gly Ala
395 400 405
аса act tgg gac act act аса teg taa 1632
Thr Thr Trp Asp Thr Thr Thr Ser
410 415
<210> 16 <211> 415 <212> Белок <213> Brassica napus
<400> Met 1 16 Thr Cys 5 Ala Thr Ser Ser Phe 10 Phe His Val Pro Ser 15 Ser
Val Ala
Ser Ser Leu Asp Thr Asn Gly Lys Gly Asn Arg Val Gly Ser Thr Asn
20 25 30
Phe Ala Gly Leu Asn Ser Thr Pro Ser Ser Gly Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Lys Ala Asn Leu
50 55 60
Pro Gly Ser Val Glu Ile Ser Lys Ala Asp Asn Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
Ala His Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met
85 90 95
Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp
100 105 110
Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Ile Met Asp Pro
115 120 125
- 138 030862
Phe Gly 130 Leu Gly Arg Ile Val 135 Gln Asp Gly Leu Val 140 Phe Arg Gln Asn
Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile
145 150 155 160
Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys
165 170 175
Ser Ala Gly Leu Leu Glu Asn Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Phe
180 185 190
Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Ala Arg Met Gln Val Val Val Asp
195 200 205
Lys Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser
210 215 220
Gln Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys
225 230 235 240
Asn Thr Gly Glu Ile Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Trp Val Met Met
245 250 255
Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pro Glu Glu Val Arg Gly
260 265 270
Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val Ile Ala Glu Asp
275 280 285
Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg
290 295 300
Ser Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val
305 310 315 320
Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Ala Gly
325 330 335
Met Leu Glu Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg
340 345 350
Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser. L6u Thr Ala Val Ser Gly
355 360 365
Cys Asp Val Gly Asn Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His
370 375 380
Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu
385 390 3:9.5 400
Trp Ser Ser Lys Thr Gly Ala Thr Thr Trp Asp Thr Thr Thr Ser
405 410 415
- 139 030862 <210> 17 <211> 1715 <212> ДНК <213> Brassica napus <220>
<221> CDS <222> (1)..(507) <220>
<221> зрелый пептид <222> (1) . . (1712) <223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 92 <220>
<221> misc_feature <222> (493)..(495) <223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (740)..(873) <220>
<221> misc_feature <222> (761)..(763) <223> консервативный Lys <220>
<221> misc_feature <222> (833) . . (835) <223> консервативный Val <220>
<221> CDS <222> (947) . . (1060) <220>
<221> misc_feature <222> (999) . . (1001) , ..
<223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (1139) .. (1310) <220>
<221> misc_feature <222> (1176) .. (1178) <223> консервативный Ser <220>
<221> CDS <222> (1395) . . (1712) <220>
<221> misc_feature <222> (1401) .. (1403) <223> консервативный Тгр <220>
<221> misc_feature <222> (1419) . . (1421) <223> консервативный Asn <220>
<221> misc_feature <222> (1425) . . (1427) <223> консервативный His <220>
<221> misc_feature <222> (1530) . . (1532) <223> консервативный Cys <400> 17
- 140 030862
atg Met 1 gtg Val gcc Ala acc Thr tct Ser 5 get Ala аса Thr tcc Ser tea Ser ttc Phe 10 ttc Phe cct Pro etc Leu cca Pro tct Ser 15 tcc Ser 48
tct etc gac ccc aat ggc aaa acc aac aaa gcc acc tcc acc aac ttc 96
Ser Leu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Asn Lys Ala Thr Ser Thr Asn Phe
20 25 30
tcc gga etc aac ccc аса cca aac tct tcc ggc agg tta aag gtc aaa 144
Ser Gly Leu Asn Pro Thr Pro Asn Ser Ser Gly Arg Leu Lys Val Lys
35 40 45
cca aac get cag get cca tcc aag ate aac ggc aag aaa gtc tcc ttg 192
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Ser Lys He Asn Gly Lys Lys Val Ser Leu
50 55 60
cca ggc tea gta cac ate gta aag act gat aat aac cac gat etc teg 240
Pro Gly Ser Val His He Val Lys Thr Asp Asn Asn His Asp Leu Ser
65 70 75 80
caa caa aac gca ccc aga acg ttc ate aac cag eta cct gac tgg age 288
Gln Gln Asn Ala Pro Arg Thr Phe He Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser
85 90 95
atg ctt etc gcc gcc ate аса acg gtc ttc tta gca get gag aag cag 336
Met Leu Leu Ala Ala He Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln
100 105 110
tgg atg atg ctt gat act aaa ccg aga ege tcc gac atg att atg gat 384
Trp Met Met Leu Asp Thr Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met He Met Asp
115 120 125
ccg ttt ggg tta ggg aga ate gtt cag gat ggg ct't gtg tac cgt cag 432
Pro Phe Gly Leu Gly Arg He Val Gln Asp Gly Leu Val Tyr Arg Gln
130 135 140
aat ttc gat ate agg tct tat gaa ata ggt get gat ege tct gca tct 480
Asn Phe Asp He Arg Ser Tyr Glu He Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser
145 150 155 160
ata gaa act gtc atg aat cac tta cag gtatattaca atcacactcg 527
lie Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln
165
- 141 030862
tttgatacta tagcttgacc egeaetgatg ttggttttta tatttttata aattgtttag 587
tgacatatag atataggtta tttagatatt tctaggttcc tacgaaccta cccggactca 647
aaccctgtcc gtaaaattga gtttaatftt aaaccaaaaa aatcpgatac ccgaaaaaac 707
egatetgtat ctaactcttg tcctcatgac ag gaa acg Glu Thr get etc aac Ala Leu Asn : cat gtg , His Val 760
170 175
aag tct gca Ala gga etg Gly Leu 180 etg gga gat ggg ttt ggt Gly tct' Ser аса Thr cct gag atg 808
Lys Ser Leu Gly Asp Gly 185 Phe Pro 190 Glu Met
gtt aag aag aac ttg ata tgg gtt gtt act cg.t atg ,cag gtt gta gtt 856
Val Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val
195 200 205
gat aaa tat cct act tg gtaagctctc ttgccactta accttaaaca 903
Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
210 atatgcatga atcatttgct tattcaaatg tctgtttcac cag g gga gat gtt gtt 959
Gly Asp Val Val
215
gaa gta gat аса Thr tgg Trp gtc Val agt Ser 225 aag Lys tct ggg aag aat Asn 230 ggt Gly atg Met cgt Arg cgt Arg 1007
Glu Val 220 Asp Ser Gly Lys
gat tgg eta gtt cgt gat tgc aat act gga gaa ate tta аса ego gca 1055
Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys Asn Thr Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ala
235 240 245 250 tea ag gttagcttta ttttgttttt gtttactcca getattatet gattattgag1110
Ser Ser ttataaccat ctctatgtta caaaacag t gtg tgg gtg atg; atg aat aaa etg1163
Val Trp Val Met: Met Asn Lys Leu
255260
аса Thr agg Arg aga Arg tta Leu tea Ser 265 aag Lys ett Leu cct Pro gaa Glu gag Glu 270 gtt Val ega Arg ggg Gly gaa Glu ata lie 275 gag Glu 1211
cct tac ttt gtg aac tct gac cca ate ett gee gag gac age aga aag 1259
Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Ile Leu Ala Glu Asp Ser Arg Lys
280 285 290
tta аса aag eta gat gac aag act get gac tat gtt ege tct ggt etc 1307
Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg Ser Gly Leu
295 300 305
acc gtaagtataa atattcaact ctttatcttt tagegtgtaa aactcttgag1360
Thr agattettat gagtttggtg atgaactttt gcag ccg aga tgg agt gac ttg gat1415
Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp 310315 gtt aac cag cat gtt aac aac gtg aag tac atfc/ ggt tgg ata etc gag1463
- 142 030862
Val Asn Gln His 320 Val Asn Asn Val Lys 325 Tyr lie Gly Trp He 330 Leu Glu
agt get cca gta gag atg atg gag aag cat aag etg aaa age atg act 1511
Ser Ala Pro Val Glu Met Met Glu Lys His Lys Leu Lys Ser Met Thr
335 340 345
etg gag tat agg agg gaa tgc ggg aga gac agt gtg ;ctt cag tct etc 1559
Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu
350 355 360
acc geg gtt teg gga tgc gat gtt ggt age etc ggg аса get ggt gaa 1607
Thr Ala Val Ser Gly Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu
365 370 375 380
gtg gaa tgt cag cat ttg ett ega cac cag gat gga get gaa gtg gtg 1655
Val Glu Cys Gln His Leu Leu Arg His Gln Asp Gly Ala Glu Val Val
385 390 395
aag gga ega аса gtg tgg agt teg aaa аса cca tea acg act tgg gac 1703
Lys Gly Arg Thr Val Trp Ser Ser Lys Thr Pro Ser Thr Thr Trp Asp
400 405 410
1715 act аса teg taa
Thr Thr Ser
415 <210> 18 <211> 415 <212> Белок <213> Brassica napus
<400> 18 Thr Ser 5 Ala Thr Ser Ser Phe 10 Phe Pro Leu Pro Ser 15 Ser
Met 1 Val Ala
Ser Leu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Asn Lys Ala Thr Ser Thr Asn Phe
20 25 30
Ser Gly Leu Asn Pro Thr Pro Asn Ser Ser Gly Arg Leu Lys Val Lys
35 40 45
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Ser Lys He Asn Gly Lys Lys Val Ser Leu
50 55 60
Pro Gly Ser Val His lie Val Lys Thr Asp Asn Asn His Asp Leu Ser
65 70 75 80
Gln Gln Asn Ala Pro Arg Thr Phe He Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser
85 90 95
Met Leu Leu Ala Ala lie Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln
100 105 110
Trp Met Met Leu Asp Thr Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met lie Met Asp
- 143 030862
115 120 125
Pro Phe Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Tyr Arg Gln
130 135 140
Asn Phe Asp Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser
145 150 155 160
Ile Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val
165 170 175
Lys Ser Ala Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met
180 185 190
Val Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val
195 200 205
Asp Lys Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val
210 215 220
Ser Lys Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp
225 230 235 240
Cys Asn Thr Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val Trp Val Met
245 250 255
Met Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Leu Pro Glu Glu Val Arg
260 265 270
Gly Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Ile Leu Ala Glu
275 280 285
Asp Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp LyS Thr Ala Asp Tyr Val
290 295 300
Arg Ser Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His
305 310 315 320
Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Val
325 330 335
Glu Met Met Glu Lys His Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg
340 345 350
Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Vdl Leu Gln Ser Leif Thr Ala val Ser
355 360 365
Gly Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln
370 375 380
His Leu Leu Arg His Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Lys Gly Arg Thr
385 390 395 400
Val Trp Ser Ser Lys Thr Pro Ser Thr Thr Trp Asp Thr Thr Ser
405 410 415
- 144 030862 <210> 19 <211> 1572 <212> ДНК <213> Brassica napus <220> ' ' '· <221> CDS <222> (1) . . (498) <220>
<221> зрелый пептид <222> (1) .. (1569) <223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 89 <220>
<221> misc_feature ' 1 ' <222> (484) . . (486) ; <223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (579) . . (712) <220>
<221> misc_feature <222> (600) . . (602) <223> консервативный Lys <220> у . : - .+ <221> misc_feature <222> (672)..(674) <223> консервативный Val <220>
<221> CDS <222> (791) .. (904) <220>
<221> misc_feature , , <222> (848) . . (850) ζ, <223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (995) .. (1166) <220>
<221> misc_feature <222> (1032) . . (1034) <223> консервативный Ser <220> . .
- 145 030862 <221> CDS <222> (1252)..(1569)
<220> <221> <222> <223> misc feature (1258) .. (1260) консервативный Trp
<220> <221> <222> <223> misc feature (1276) .. (1278) консервативный Asn
<220> <221> <222> <223> misc feature (1282) .. (1284) консервативный His
<220> <221> <222> <223> misc feature (1387) .. (1389) консервативный Cys
<400> 19
atg Met 1 gtg Val gcc Ala acc Thr tea Ser 5 get Ala аса Thr tcc Ser tea Ser ttc Phe 10 ttc Phe cct Pro etc Leu cca Pro tct Ser 15 tcc Ser
ccc etc gac ccc acc gca aaa acc aac aaa gtc acc acc tcc acc aac
Pro Leu Asp Pro Thr Ala Lys Thr Asn Lys Val Thr Thr Ser Thr Asn
20 25 30
ttc tcc ggc etc аса ccc acg ccg aac tcc gcc agg atg aag gtt aaa
Phe Ser Gly Leu Thr Pro Thr Pro Asn Ser Ala Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
cca aac get cag gcc cca ccc aag ate aac ggc aag aga gtc ggc etc
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Arg Val Gly Leu
50 55 60
cct ggc teg gtg gag ate ttg aag cct gat age gag act teg caa cca
Pro Gly Ser Val Glu Ile Leu Lys Pro Asp Ser Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
gca ccg agg acg ttc ate aac cag etg cct gac tgg age atg etc etc
Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu
85 90 95
gcc gcc ate acg acc gtc ttc ttg geg get gag aag cag tgg atg atg
Ala Ala Ile Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met
100 105 110
etc gac tgg aaa ccg agg cgt tct gac gtg att atg gat ccg ttt ggg
Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Val Ile Met Asp Pro Phe Gly
115 120 125
tta ggg agg ate gtt cag gat ggg ett gtg ttc cgt cag aat ttt tct
Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn Phe Ser
130 135 140
att egg tct tat gag ata ggt get gat ege tct geg tct ata gaa acg
Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile Glu Thr
145 150 155 160
- 146 030862 gtt atg aat cat tta cag gtactgatta tgattatgat tgtagtcgct 528
Val Met Asn His Leu Gln
165 tgttgttact ggacaaactt aaatatgtat tgctcttatg gttgtgatag gaa acg 584 . Glu Thr
gca Ala etc Leu 170 aac Asn cat His gtt Val aag Lys act Thr 175 get Ala ggg Gly etg Leu ett gga gat Leu Gly Asp 180 ggg Gly ttt Phe ggt Gly 632
tet act cct gag atg gtt aag aag aac ttg ata tgg gtt gtt act cgt 680
Ser Thr Pro Glu Met Val Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg
185 190 195 200
atg cag gtt gtc gtt gat aaa tat cct act tg gtaagetatt ctcaaacaac 732
Met Gln Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
205 210
tetgagaate actgcttcct ttgtgagtca . tttgettatt caaatatctg cctcatag g 791
gga gat gtt gtg gaa gta gat аса tgg gtg age cag tet gga aag aac 839
Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser Gln Ser Gly Lys Asn
215 220 225
ggt atg cgt cgt gat tgg ett gtt egg gat ggc aat act gga gag att 887
Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Gly Asn Thr Gly Glu Ile
230 235 240
tta аса aga gca tea ag gttagatttt . attttttggt ttacttgggt 934
Leu Thr Arg Ala Ser Ser
245
tagatatetg , ataattgagt tataatcatc : tccgtgttgt gtaaactatt ctttttgcag 994
t gtg tgg gtg atg atg aat aaa etg аса aga aga tta tea aag att cct 1043
Val Trp Val Met Met Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys Ile Pro
250 255 260 265
gaa gag gtt ega ggg gag ata gag cct tac ttt gtt aac tea gac cca 1091
Glu Glu Val Arg Gly Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro
270 275 280
gtc ett gee gag gac age aga aag tta аса aaa ctf? gat gac aaa act 1139
Val Leu Ala Glu Asp Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr
285 290 295
get gtc tat gtt cgt tet ggt etc act gtaagtacaa atacttcact 1186
Ala Val Tyr Val Arg Ser Gly Leu Thr
300 305
ctatgtttca acaaagcctg taaatttttg ι agtctcttac aggtttggta atgaactttt 1246
tgcag ccg cgt tgg agt gac ttg gat gtt ааейад cat gtt aac aat gtg 1296
Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val Asn Asn Val
310 315 320
aag tac ate ggg tgg ata etg gag agt get cca gtg ggg atg atg gag 1344
Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Val Gly Met Met Glu
325 330 335
agt cag aag etg aaa age atg act etg gag tat ege agg gag tgt ggg 1392
Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys Gly
- 147 030862
340 345 350
aga gac agt gtg etc cag tcc etc acc geg gtt teg ggc tgc gat ate 1440
Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly Cys Asp Ile
355 360 365
ggt age etc ggg аса gcc ggt gaa gtg gaa tgt cag cat etg etc aga 1488
Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His Leu Leu Arg
370 375 38.0 385
etc cag gat gga gcc gaa gtg gtg aga gga aga аса gag tgg agt tcc 1536
Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp Ser Ser
390 395 400
aaa аса tea аса аса act tgg gac ate аса ccg tga 1572
Lys Thr Ser Thr Thr Thr Trp Asp Ile Thr Pro
405 410 <210> 20 <211> 412 <212> Белок <213> Brassica napus
<400> 20
Met 1 Val Ala Thr Ser 5 Ala Thr Ser Ser Phe 10 Phe Pro Leu Pro Ser 15 Ser
Pro Leu Asp Pro Thr Ala Lys Thr Asn Lys Val Thr Thr Ser Thr Asn
20 25 30
Phe Ser Gly Leu Thr Pro Thr Pro Asn Ser Ala Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Arg Val Gly Leu
50 55 60
Pro Gly Ser Val Glu Ile Leu Lys Pro Asp Ser Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
Ala Pro Arg Thr Phe lie Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu
85 90 95
Ala Ala I le Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met
100 105 110
Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Val lie Met Asp Pro Phe Gly
115 120 .. 125
Leu Gly Arg I le Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gin Asn Phe Ser
130 135 140
Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile Glu Thr
145 150 155 160
- 148 030862
Val Met Asn His Leu 165 Gln Glu Thr Ala Leu 170 Asn His Val Lys Thr 175 Ala
Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Val Lys Lys
180 185 190
Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val Asp Lys Tyr
195 200 205
Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser Gln Ser
210 215 220
Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Gly Asn Thr
225 230 235 240
Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val Trp Val Met Met Asn Lys
245 250 255
Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys I le Pro Glu Glu Val Arg Gly Glu Ile
260 265 270
Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val Leu Ala Glu Asp Ser Arg
275 280 285
Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Val Tyr Val Arg Ser Gly
290 295 300
Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Glh His Val Asn Asn
305 310 315 320
Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala Pro Val Gly Met Met
325 330 335
Glu Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu Cys
340 345 350
Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly Cys Asp
355 360 365
Ile Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His Leu Leu
370 375 380
Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp Ser
385 390 395 400
Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr Trp Asp lie Thr' Pro
405 410
- 149 030862 <210> 21 <211>1770 <212> ДНК <213> Brassica napus <220>
<221> CDS, <222> (1) . . (504) <220>
<221> зрелый пептид :
<222> (1) . . (1767) ‘' <223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 91 <220>
<221> misc_feature <222> (490) .. (492) <223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (581)..(714) <220> .
<221> misc_feature <222> (602) .. (604) <223> консервативный Lys <220>
<221> misc_feature <222> (674)..(676) <223> консервативный Val <220>
<221 > CDS Ί····' - :: <222> (945) . . (1058) <220>
<221> misc_feature <222> (997)..(999) <223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (1190) .. (1361) <220>
<221> misc_feature . ' <222> (1227)..(1229) <223> консервативный Ser <220>
<221> CDS <222> (1447) . . (1767) <220>
<221> misc_feature <222> (1453)..(1455) ... , , <223> консервативный Тгр <220>
<221> misc_feature <222> (1471)..(1473) <223> консервативный Asn <220>
<221> misc_feature <222> (1477) . . (1479) <223> консервативный His <220>
<221> misc_feature <222> (1582) . . (1584) <223> консервативный Cys <400> 21
- 150 030862
atg Met 1 gtg Val get Ala act Thr tee Ser 5 get Ala acg Thr tee Ser teg Ser ttt Phe 10 ttt Phe cat His gtt Val cca Pro tct Ser 15 tee Ser 48
tee tct ett gat act aat ggg aag ggg aac aga gtt geg tee acg aac 96
Ser Ser Leu Asp Thr Asn Gly Lys Gly Asn Arg Val Ala Ser Thr Asn
20 25 30
ttc get gga ett aac tea acg cca age tct ggg agg atg aag gtt aaa 144
Phe Ala Gly Leu Asn Ser Thr Pro Ser Ser Gly Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
cca aac get cag get cca ccc aag ate aac ggg aag aaa get aac ttg 192
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Lys Ala Asn Leu
50 55 60
cct ggt tct gta gag ata tea aag tct gac aac gag act teg cag ccc 240
Pro Gly Ser Val Glu Ile Ser Lys Ser Asp Asn Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
gca ccc gca ccg agg acg ttt ate aac cag etg cct gac tgg age atg 288
Ala Pro Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met
85 90 95
ett etc get gcc ata аса acc att ttc ttg geg get 9ag aaa cag tgg 336
Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp
100 105 110
atg atg ett gac tgg aaa ccc agg cgt tct gat atg att atg gat cct 384
Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Ile Met Asp Pro
115 120 125
ttc ggt tta ggg aga ate gtt cag gat ggt ett gtc ttt cgt cag aat 432
Phe Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn
130 135 140
ttc tee att agg tct tat gag ata ggt get gat ege tct geg tct ata 480
Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser Ile
145 150 155 160
gaa act gtt atg aat cat tta cag gtaggtacta ctttgattgt tatcacactt 534
Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln
165 gtcaatagat atatatgctc atgacaagct cttatgctaa tgacag gaa acg gcc589
Glu Thr Ala .170 eta aac cat gtg aag tct gcc gga etg etg gaa, aat ggg ttt ggt tct637
- 151 030862
Leu Asn His Val 175 Lys Ser Ala Gly Leu 180 Leu Glu Asn Gly Phe 185 Gly Ser
act ccc gag atg ttt aag aag aac ttg ata tgg gtc gtt get cgt atg 685
Thr Pro Glu Met Phe Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Ala Arg Met
190 195 200
cag gtt gtc gtt gat aaa tat cct act tg gtaagccatt < gteagtetta 734
Gln Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
205 210
ccacttaact taaaatcatt atgetaetgt ctctgagaat ccctggttct cgttgtgagt 794
tatccaaatt atettgeata aacttgagta tgcaagttca tgctctcact tgctcatgtg 854
actaggacat tttgcaccct tagattacat gatgtgcttg catattacag tgtgeataga 914
teattaetta ttcaaatatc tgactaacag g gga gat . Gly Asp ’ 215 gtt gtg gaa Val Val Glu gtg gat Val Asp 220 966
аса tgg gtt agt cag tet gga aag aat ggt atg cgt cgt gat tgg etg 1014
Thr Trp Val Ser Gln Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu
225 230 235
gtt egg gat tgc aat act gga gaa att gta acg ega gca tea ag 1058
Val Arg Asp Cys Asn Thr Gly Glu Ile Val Thr Arg Ala Ser Ser
240 245 250
gtcagagttc ttatgttttg gtttactgac tccagctatt atcattttgc tctctgtttg 1118 tattgtttgc tctgccatta gtttgataat agagacttta tatatgtatg gcaattttct 1178 tctttttgca g t ttg tgg gtg atg atg aat aaa etc аса agg aga ttg 1226
Leu Trp Val Met Met Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu
255
tea aag att cct gaa gag gtt ega ggg
Ser Lys Ile Pro Glu Glu Val Arg Gly
265 270
aac tet gat cct gtc att gcc gaa gac
Asn Ser Asp Pro Val Ile Ala Glu Asp
280 285
gat gac aag act get gac tat gtt cgt
Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg
300
260
gaa ata gag cct tat ttt gtg 1274
Glu Ile Glu Pro Tyr Phe Val
275
age aga aag tta acc aaa ett 1322
Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu
290 295
teg Jgt etc act gtaagtaccc 1371
Ser Gly Leu Thr
305 tacctttcaa caacaagctt gtcaaaactc tcgaggttgg ttcttatgga ttggtaatga
1431 aactttttta ttcag ccg agg tgg agt gac ttg gat gtt aac cag cat gtt 1482
Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val
310 315 320
aac Asn aat Asn gta Val aag Lys tac Tyr 325 ate Ile ggg Gly tgg Trp ata Ile etg Leu 330 gag Glu agt Ser . 1 get Ala cca Pro gca Ala 335 ggg Gly 1530
atg etg gag agt cag aag etg aaa age atg act etg gag tat ege agg 1578
Met Leu Glu Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg
340 345 350
gag tgc ggg aga gac agt gtg ett cag tet etc acc geg gtc tet gga 1626
Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly
355 360 365
tgt gat gtc ggt aac etc ggg аса gcc ggg gaa gtg gag tgt cag cat 1674
Cys Asp Val Gly Asn Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His
370 375 380
ttg ett cgt etc cag gat gga get gaa gtg gtg aga gga aga аса gag 1722
Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu
385 390 395 400
tgg agt tee aag аса gaa gca аса act tgg gac act get аса teg taa 1770
Trp Ser Ser Lys Thr Glu Ala Thr Thr Trp Asp Thr Ala Thr Ser
405 .410 415
- 152 030862 <210> 22 <211> 415 <212> Белок <213> Brassica napus
<400> 22 His Val Pro Ser 15 Ser
Met 1 Val Ala Thr Ser 5 Ala Thr Ser Ser Phe 10 Phe
Ser Ser Leu Asp Thr Asn Gly Lys Gly Asn Arg Val Ala Ser Thr Asn
20 25 30
Phe Ala Gly Leu Asn Ser Thr Pro Ser Ser Gly Arg Met Lys Val Lys
35 40 45
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys Lys Ala Asn Leu
50 55 60
Pro Gly Ser Val Glu Ile Ser Lys Ser Asp Asn Glu Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
Ala Pro Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met
85 90 95
Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp
100 105 110
Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Ile Met Asp Pro
115 120 125
Phe Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn
130 135 140
Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser lie
145 150 155 160
Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys
- 153 030862
165 170 175
Ser Ala Gly Leu 180 Leu Glu Asn Gly Phe 185 Gly Ser Thr ;Pro Glu 190 Met Phe
Lys Lys Asn Leu He Trp Val Val Ala Arg Met Gln Val Val Val Asp
195 200 205
Lys Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser
210 215 220
Gln Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys
225 230 235 240
Asn Thr Gly Glu He Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Trp Val Met Met
245 250 255
Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys He Pro Glu Glu Val Arg Gly
260 265 270
Glu lie Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp ΡΡό Val lie Ala Glu Asp
275 280 285
Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg
290 295 300
Ser Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val
305 310 315 320
Asn Asn Val Lys Tyr He Gly Trp He Leu Glu Ser Ala Pro Ala Gly
325 330 335
Met Leu Glu Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg
340 345 350
Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser Gly
355 360 365
Cys Asp Val Gly Asn Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln His
370 375 380
Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu
385 390 395 400
Trp Ser Ser Lys Thr Glu Ala Thr Thr Trp Asp Thr Ala Thr Ser
405 410 415 <210> 23
- 154 030862
<211> 1892
<212> ДНК
<213> Brassica napus
<220> <221> <222> CDS '' ' (1)..(507)
<220>
<221> зрелый пептид
<222> (1)..(1889)
<223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 92
<220>
<221> misc feature
<222> (493)..(495)
<223> консервативный Met
<220>
<221> CDS
<222> (931)..(1064)
<220>
<221> misc feature
<222> (952)..(954)
<223> консервативный Lys
<220>
<221> misc feature ; ' '
<222> (1024) . . (1026)
<223> консервативный Val
<220>
<221> CDS
<222> (1139) .. (1252)
<220>
<221> misc feature
<222> (1191) .. (1193)
<223> консервативный Met
<220>
<221> CDS
<222> (1325) .. (1496)
<220>
<221> misc feature
<222> (1362) . . (1364)
<223> консервативный Ser
<220>
<221> CDS j
<222> (1572) . . (1889) : 1
<220>
<221> misc feature
<222> (1578) . . (1580)
<223> консервативный Trp
<220>
<221> misc feature
<222> (1596) .. (1598)
<223> консервативный Asn
<220>
<221> misc feature
<222> (1602) .. (1604)
<223> консервативный His
<220>
<221> misc feature
<222> (1707) . . (1709) 7
<223> консервативный Cys
<400> 23
- 155 030862
atg Met 1 gtg Val gcc Ala acc Thr tet Ser 5 get Ala аса Thr tcc Ser tea Ser ttc Phe 10 ttc Phe cct Pro etc Leu cca Pro tet Ser 15 tcc Ser 48
tet etc gac cct aat ggc aaa acc aac aaa etc acc tcc acc aac ttc 96
Ser Leu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Asn Lys Leu Thr Ser Thr Asn Phe
20 25 30
tet gga etc aac ccc ata cca aac tet tcc ggc agg tta aag gtc aaa 144
Ser Gly Leu Asn Pro Ile Pro Asn Ser Ser Gly Arg Leu Lys Val Lys
35 40 45
cca aac gcc caa get cca tcc aag ate aac ggc aat aat gtc tcc ttg 192
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Ser Lys Ile Asn Gly Asn Asn Val Ser Leu
50 55 60
cca ggc tea gta cac ate gta aag act gat aat aac cac gat etc teg 240
Pro Gly Ser Val His Ile Val Lys Thr Asp Asn Asn His Asp Leu Ser
65 70 75 80
caa caa cac gca ccc aga acg ttc ate aac cag eta cct gac tgg age 288
Gln Gln His Ala Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser
85 90 95
atg ett etc gcc gcc ate аса acg gtc ttc tta get get gag aaa cag 336
Met Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln
100 105 110
tgg atg atg ett gac teg aaa ccg agg cgt tet gat atg att atg gat 384
Trp Met Met Leu Asp Ser Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Ile Met Asp
115 120 125
ccg ttc ggg tta ggg agg ate gtt cag gat ggg ett gtg tac cgt cag 432
Pro Phe Gly Leu Gly Arg Ile Vai Gln Asp Gly Leii Val Tyr Arg Gln
130 135 140
aac ttc gat ate agg tet tat gaa ata ggt get gat ege tet geg tet 480
Asn Phe Asp Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser
145 150 155 160
ata gaa аса gtc atg aac cac tta cag gtatattaca atcacactcg 527
Ile Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln
165
attgatacta gagcttgaca tgttggtttt tatctttfcta taaattgttt agtgacattt 587
tcaaacatat agatataggt tatttagata tttctaggtt cctacaaacc tacccagact 647
caaaccccgt ccggaaattt ataatattaa taccgaacag agttttattt taaaccaaaa 707
aatcagttga cccgcacggg atgttggttt ttatctattt tatacattgt ttaaggacat 767
- 156 030862
ttttaaacat ataaatatag gttatttaga tatttetagg ttcctacgaa cctacccgga 827
aatttataat acccgaacat agtttaa'ttt ttaaaccaaA aaatccaata cccgaaaaaa 887
ccaatctgtg atatgeatga tctaactctt gtcctcgtga cag gaa acg [ get etc 942
Glu Thr Ala Leu
170
aac cat Asn His gtg Val aag Lys tet Ser get Ala gga ctg ctg gga gat ggg ttt ggt Gly tet Ser acc Thr 990
Gly 180 Leu Leu Gly Asp Gly 185 Phe
175
cct gag atg gtt aag aag aac ttg ata tgg gtc gtt act cgt atg cag 1038
Pro Glu Met Val Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val Thr Arg Met Gln
190 195 200 205
gtt gtc gtt gat aaa tat cct act tg gtaagccctc 1 ttagcactta 1084
Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
210 accttaaaac aatatgcatg aatcatttgc ttattcaaat gtctgcttca ccag g gga 1142 Gly 215
gat gtt gtt gaa gta gat аса tgg gtt agt aag tet ggg aag aat ggt 1190
Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val Ser Lys Sep Gly Lys Asn Gly
220 225 /1 J 230
atg cgt cgt gat tgg ett gtt egg gat tgt aat act gga gaa att tta 1238
Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys Asn Thr Gly Glu Ile Leu
235 240 245
аса aga gca tea ag gttagettet ttttgtttac tccagctatt atetgattat1292
Thr Arg Ala Ser Ser
250 tgagttataa ccatctctgt gttgcaaaac ag t gt^/tgg gtg atg atg aat aaa1346
Val Trp Val Met Met Asn Lys
255
gtg Val 260 аса Thr agg Arg aga Arg tta Leu tea Ser 265 aag Lys ett Leu cct Pro gaa Glu gag Glu 270 gtt Val cga Arg ggg Gly gaa Glu ata Ile 275 1394
gag cct tac ttt gtg aac tet gac cct ate ett gee gag gac age aga 1442
Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Ile Leu Ala Glu Asp Ser Arg
280 285 290
aag tta аса aaa eta gat gag aag act get gac tat gtt ege tet ggt 1490
Lys Leu Thr Lys Leu Asp Glu L^S Thr Ala Asp Tyr Val Arg Ser Gly
295 300 305
etc ace gtaagtataa atatttgttt ttatctttca gcaagtgaga ttctgatggg1546
Leu Thr
tttggtgatt atetaaettt tgcag ccg aga tgg agt gac ttg gat gtt aac 1598
Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn
310 315
cag cat gtt aac aac gtg aag tac att ggt! t’gg ata etc gag agt get 1646
Gln His Val Asn Asn Val Lys Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ala
320 325 330
- 157 030862
cca Pro 335 gtg gag atg atg gag Glu 340 aag Lys cat His aag etg aaa age atg act etg Leu gag Glu 350 1694
Val Glu Met Met Lys Leu Lys 345 Ser Met Thr
tat agg agg gaa tgc ggg aga gac agt gtg .ett cag tet etc acc geg 1742
Tyr Arg Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala
355 360 365
gtt teg ggt tgc gat gtt ggt age etc ggg аса get ggt gaa gtg gaa 1790
Val Ser Gly Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu
370 375 380
tgt cag cat ttg ett ega etc cag gat gga get gaa gtg gtg aag gga 1838
Cys Gln His Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Lys Gly
385 390 , 395
ega аса gtg tgg agt tcc aaa аса cca tea аса act tgg gac act аса 1886
Arg Thr Val Trp Ser Ser Lys Thr Pro Ser Thr Thr Trp Asp Thr Thr
400 405 410
1892 teg taa
Ser
415 <210> 24 <211> 415 <212> Белок <213> Brassica napus
<400> 24 Thr Ser 5 Ala Thr Ser Ser Phe 10 Phe Pro Leu Pro Ser 15 Ser
Met 1 Val Ala
Ser Leu Asp Pro Asn Gly Lys Thr Asn Lys Leu Thr Ser Thr Asn Phe
20 25' 30
Ser Gly Leu Asn Pro Ile Pro Asn Ser Ser Gly Arg Leu Lys Val Lys
35 40 45
Pro Asn Ala Gln Ala Pro Ser Lys Ile Asn Gly Asn Asn Val Ser Leu
50 55 60
Pro Gly Ser Val His Ile Val Lys Thr Asp Asn Asn His Asp Leu Ser
65 70 75 80
Gln Gln His Ala Pro' Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser
85 90 95
Met Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Val Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln
100 105 110
Trp Met Met Leu Asp Ser Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Ile Met Asp
115 120 125
- 158 030862
Pro Phe 130 Gly Leu Gly Arg He 135 Val Gln Asp Gly Leu 140 Val Tyr Arg Gln
Asn Phe Asp He Arg Ser Tyr Glu He Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser
145 150 155 160
He Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val
165 170 175
Lys Ser Ala Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met
180 185 190
Val Lys Lys Asn Leu He Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val
195 200 205
Asp Lys Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Val Val Glu Val Asp Thr Trp Val
210 215 220
Ser Lys Ser Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp
225 230 235 240
Cys Asn Thr Gly Glu He Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val Trp Val Met
245 250 255
Met Asn Lys Val Thr Arg Arg Leu Ser Lys Leu Pro Glu Glu Val Arg
260 265 270
Gly Glu He Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro He Leu Ala Glu
275 280 285
Asp Ser Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Glu Lyd Thr Ala Asp Tyr Val
290 295 300
Arg Ser Gly Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gln His
305 310 315 320
Val Asn Asn Val Lys Tyr He Gly Trp He Leu Glu Ser Ala Pro Val
325 330 335
Glu Met Met Glu Lys His Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg
340 345 350
Arg Glu Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Ser
355 360 365
Gly Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Thr Ala Gly Glu Val Glu Cys Gln
370 375 380
His Leu Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Lys Gly Arg Thr
385 390 395 400
Val Trp Ser Ser Lys Thr Pro Ser Thr Thr Trp Asp Thr Thr Ser
405 410 415
- 159 030862 <210> 25 <211> 487 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5' AtFATBl зонд <400>25 gaactttcat caaccagtta cctgactgga gcatgcttct tgctgctata actacgattt60 tcttagcggc tgagaaacag tggatgatgc ttgattggaa acctaggcgt tctgacatgc120 tggtggatcc ttttggtata gggagaattg ttcaggatgg ccttgtgttc cgtcagaatt180 tttctattag gtcatatgaa ataggtgctg atcgctctgc atctatagaa accgtcatga240 atcatctgca ggtaccattt gattatgatt acggttacct gttgtcactg gtttaattga300 tatgtatgaa caagctctta tgctcatgac aggaaacggc gcttaatcat gttaagactg360 ctggattgct tggagatggg tttggctcta cacctgagat gtttaagaag gacttgatat420 gggttgtcac tcgtatgcag gttgtggttg ataaatatcc tacttggtaa gctatcctct480 tgcataa487 <210> 26 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер KVA05-14 <400>26 gaactttcat caaccagtta cc22 <210>27 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер KVA05-15 <400> 27 ttatgcaaga ggatagctta cc <210>
<211>
<212>
<213>
352
ДНК
Искусственная последовательность
- 160 030862 <220>
<223> 3' AtFATBl зонд <400> 28
cagtgtgtgg gtgatgatga ataaactgac aaggagattg tcaaagattc ctgaagaggt 60
tcgaggggaa atagagcctt attttgtgaa ttctgatcct gtccttgccg aggacagcag 120
aaagttaaca aaaattgatg acaagactgc tgactatgtt cgatctggtc tcactgtaag 180
tatctagtat ttactgctgt atgtttcaac aaacctttga ccagcttgta agactctcta 240
atggcttggt aatgaacatt ttcagcctcg atggagtgac ctagatgtta accagcatgt 300
gaataatgta aagtacattg ggtggatcct ggagagtgct ccagtgggaa ta 352
<210> 29 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность. ., <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер KVA05-16 <400>29 cagtgtgtgg gtgatgatga20 <210>30 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> ! ‘ <223> Олигонуклеотидный праймер KVA05-17 <400>30 tattcccact ggagcactct20 <210>31 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой праймер для детектирования FATB-Al (SOSR) <400>31 ctgataacga gacgtcctca с21 <210>32 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный праймер для детектирования FATB-Al (SORS) <400> 32 catcctggag acggagcagg 20
- 161 030862 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
ДНК
Искусственная последовательность
Прямой праймер для детектирования FATB-A2 (SOSR) <400> 33 ctgcctgact ggagtatgct g <210> 34 <211> 21 ' <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный праймер для детектирования FATB-A2 (SOSR) <400>34 gttgttgctc ctgtcttgga g21 <210>35 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой праймер для детектирования FATB-A3 (SOSR) <400> 35 gcagtggatg atgcttgata с <210> 36 .
<211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный праймер для детектирования FATB-A3 (SOSR) <400>36 caagtcgttg atggtgtttt с21 <210>37 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой праймер для детектирования FATB-Cl (SOSR) <400> 37 ctgcctgact ggagcatgct с <210> 38 <211> 21
- 162 030862 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный праймер для детектирования FATB-C1 (SOSR) <400> 38 gttcttcctc tcaccacttc g <210> 39 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой праймер для детектирования FATB-C2 (SOSR) <400>39 atcgttcagg atggtcttgt с21 <210>40 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный праймер для детектирования FATB-C2 (SOSR) <400> 40 gcagtcttgt catcaagttt g <210> 41 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой праймер для детектирования FATB-СЗ (SOSR) <400>41 acagtggatg atgcttgact с21 <210>42 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный праймер для детектирования FATB-СЗ (SOSR) <400> 42 cgaacatagt cagcagtctt с <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
- 163 030862 <223> Обратный праймер для детектирования делеционной мутации в FATB-Al <400> 43 cagtcttaac atggttgagt g <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Прямой праймер для детектирования делеционной мутации в
FATB-A2 <400> catgttccat cttcttcctc g <210> <211> <212> <213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Обратный праймер для детектирования делеционной мутации
FATB-A2 <400> tattgggaca acatgtgagt g <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Обратный праймер для детектирования делеционной мутации
FATB-A3 <4 0 0 >
ttcttcttaa ccatctcagg t <210> <211> <212> <213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Обратный праймер для детектирования делеционной мутации
FATB-C1 <400> ccaaacccat ctccaagcag c <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Обратный праймер для детектирования делеционной мутации
FATB-C2 <400> 48 taactcacaa cgagaaccag g
- 164 030862 <210> 49 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный праймер для детектирования делеционной мутации в FATB-C3 <400>49 ctttgataat ctccttgtca с21 <210>50 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-EMS05 <400>50 ggcggctgag aagcagtgaa ta22 <210>51 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектй^Ьвания!ТАТВ-А1 <400>51 ggcggctgag aagcagtgga tg22 <210>52 <211>19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-EMS05 и -А1 <400>52 ggactgaagc acactgtcc19 <210>53 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> . : <223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-EMS06 <400>53 cagtggatga tgcttgactg а21 <210>54 <211> 21
- 165 030862 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-A1 <400>54 cagtggatga tgcttgactg g21 <210>55 <211> 20 ,t <212> ДНК' <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-EMS06 и -А1 <400>55 gcatacgagt аасаасссаа20 <210>56 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-EMS05 <400>56 agcagcaagc agcatacttc20 <210>57 <211> 20.
<212> ДНК' <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-A2 <400>57 tagcagcaag cagcatactc20 <210>58 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> · <223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-EMS05 и -А2 <400>58 gagttgggtc cactaatttt g21 <210>59 <211> 21 ..
<212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 166 030862 <223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-EMS01 <400> 59 gagttgggtc cactaatttt g 21 <210> 60 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-A2 <400> 60 cggaacacaa gaccatccta · 20 <210> 61 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-EMS01 и -А2 <400> 61 ' cggaacacaa gaccatcctg 20 <210> 62 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-A3-EMS01 <400>62 tatttatcaa ctacaaccta ‘20 <210>63 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-A3 <400>63 tatttatcaa ctacaacctg20 <210>64 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-A3-EMS01 и -АЗ <400> 64 , caatggcaaa accaacaaag с 21
- 167 030862 <210> 65 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-EMS05 <400> 65 gttaagaaga acttgatatg а 21 <210> 66 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-C1 <400>66 gttaagaaga acttgatatg g21 <210>67 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-EMS05, -C1-EMS04 и -С1 <400> 67 gttcttcctc tcaccacttc g 21 <210> 68 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-EMS04 <400>68 cggttatgaa tcatttacaa20 <210>69 <211> 20 <212> ДНК'' <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-C1 <400>69 cggttatgaa tcatttacag :20 <210>70
- 168 030862 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-C2-EMS02 <400>70 gtctgacaac gagacttcgt20 <210>71 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-C2 <400>71 gtctgacaac gagacttcgc20 <210>72 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-C2-EMS02 и -С2 <400>72 cagtattgca atcccgaacc20 <210>73 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-C2-EMS03 <400>73 tggcggctga gaaacagtga20 <210>74 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-C2 <400>74 tggcggctga gaaacagtgg20 <210>75 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 169 030862 <220>
<223> <400> agggta Обратный олигонуклеотид для детектирования 75 ctta cagtgagacc с FATB-C2-EMS03 и -С2 21
<210> 76
<211> 21
<212> днк
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-C3-EMS02
<400> 76
cagtcatgaa ccacttacag а 21
<210> 77
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой олигонуклеотид для детектирования FATB-C3
<400> 77
cagtcatgaa ccacttacag g 21
<210> 78
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный олигонуклеотид для детектирования FATB-C3-EMS02 и -СЗ
<400>78 caacctgcat acgagtaacg20 <210>79 <211>2864 <212> ДНК <213> Arabidopsis thaliana
<220> <221> <222> CDS (501) . . . (998)
<220>
<221> зрелый пептид
<222> (501) . . . (2361)
<223> зрелый пептид начинается с аминокислоты 89
<220>
<221> misc feature
<222> (984) . . .(986)
<223> консервативный Met ’
<220>
- 170 030862 <221> CDS <222> (1080) .. (1213) <220>
<221> misc_feature <222> (1101) .. (1103) <223> консервативный Lys <220>
<221> misc_feature <222> (1173) .. (1175) <223> консервативный Val <220>
<221> CDS <222> (1441) . . (1554) <220>
<221> misc_feature <222> (1493) .. (1495) <223> консервативный Met <220>
<221> CDS <222> (1782) . . (1953) <220>
<221> misc_feature <222> (1819) .. (1821) <223> консервативный Ser <220>
<221> CDS <222> (2044)..(2361) <220>
<221> misc_feature <222> (2050)..(2052) <223> консервативный Тгр <220>
<221> misc_feature <222> (2068) .. (2070) <223> консервативный Asn <220>
<221> misc_feature <222> (2074)..(2076) <223> консервативный His <220>
<221> misc_feature <222> (2179) .. (2181) <223> консервативный Cys <400> 79
acaagttttt gtttttcttt tgcgtttcta cgatctggtt ttaccggctt tagctttttc 60
tcgcttctgt tctttgttgt tttgtatttc agatctggtg ttttttttct tacctgcatc 120
aaattggttt ctaccaaaac ttcggaaacc tcttttggca aatgttgaat ctttgaatac 180
aatgacgatt tacataatag tctcagtggc cgaactggat tatcttacaa tttacgcaat 240
- 171 030862 aacaaaaagt tttttttttt tttttttttt tgtgtgtgtg tgtggtgtgt tgaagatttt300 tagtgtttgt ttacttcgtt tatggaagtc cttttcctct tctgccattt ttgtagttaa360 ctacaaatta tacctacttt aggaagatcc tcctgctagt agctaaaaga tgtagcattt420 attttattat cactcacttg agctaacttt tttcgatctt tatttggtgg cagtgtcttt480 gaacgcttca tctcctcgtc atg gtg gcc acc tet get acg teg tea ttc ttt533
Met Val Ala Thr Ser Ala Thr Ser Ser Phe Phe 1510
cct Pro gta Val cca Pro tet Ser 15 tet Ser tea Ser ett Leu gat Asp cct Pro 20 aat Asn gga Gly aaa Lys ggc Gly aat Asn 25 aag Lys att Ile 581
ggg tet acg aat ett get gga etc aat tet gca cct aac tet ggt agg 629
Gly Ser Thr Asn Leu Ala Gly Leu Asn Ser Ala Pro Asn Ser Gly Arg
30 35 40
atg aag gtt aaa cca aac get cag get cca cct aag att aat ggg aaa 677
Met Lys Val Lys Pro Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys Ile Asn Gly Lys
45 50 55
aag gtt ggt ttg cct ggt tet gta gat att gta agg act gat acc gag 725
Lys Val Gly Leu Pro Gly Ser Val Asp Ile Val Arg Thr Asp Thr Glu
60 65 70' 75
acc tea tea cac cct geg ccg aga act ttc' att aac cag tta cct gac 773
Thr Ser Ser His Pro Ala Pro Arg Thr Phe He Asn Gln Leu Pro Asp
80 85 90
tgg age atg ett ett get get ata act acg att ttc tta geg get gag 821
Trp Ser Met Leu Leu Ala Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala Glu
95 100 105
aaa cag tgg atg atg ett gat tgg aaa cct agg cgt tet gac atg ctg 869
Lys Gln Trp Met Met Leu Asp Trp Lys Pro Arg Arg Ser Asp Met Leu
110 115 120
gtg gat cct ttt ggt ata ggg aga att gtt cag gat ggc ett gtg ttc 917
Val Asp Pro Phe Gly Ile Gly Atg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe
125 130 135
cgt cag aat ttt tet att agg tea tat gaa ata ggt get gat ege tet 965
Arg Gln Asn Phe Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ser
140 145 150 155
gca tet ata gaa acc gtc atg aat cat ctg cag gtaccatttg attatgatta 1018
Ala Ser Ile Glu Thr Val Met Asn His Leu Gln
160 165
cggttacctg ttgtcactgg tttaattgat atgtatghac aagetettat gctcatgaca 1078 g gaa acg geg ett aat cat gtt aag act get gga ttg ett gga gat ggg 1127
Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys Thr Ala Gly Leu Leu Gly Asp Gly
170 175180
ttt ggc tet аса cct gag atg ttt aag aag aac ttg ata tgg gtt gtc 1175
Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Phe Lys Lys Asn Leu Ile Trp Val Val
185 190 195
act cgt atg cag gtt gtg gtt gat aaa tat cct act tg gtaagetate 1223
Thr Arg Met Gln Val Val Val Asp Lys Tyr Pro Thr Trp
- 172 030862
200 205 210
ctcttgcata aacctggttc tgcaggttca tgctctcact ctttttaacc aggtttggga 1283
aaaatgatgt gtatttcgtt ttttcagttg atactgctt't tacagtacga gatatatgct 1343
catatgacta atgacttctt gcaccctgaa ttatatgctc tgcatgcata ttatattgca 1403
tcataactca tttgcttatt caatatatgc ctcacag g gga gat gtt Gly Asp Val gtt gaa Val Glu 215 1456
gta Val gac Asp acc Thr tgg Trp 220 gtc Val agt Ser cag Gln tct Ser gga Gly 225 aag Lys aat Asn ggt Gly atg Met cgt Arg 230 cgt Arg gat Asp 1504
tgg eta gtt egg gac tgt aat act gga gaa acc tta аса ega gca tea 1552
Trp Leu Val Arg Asp Cys Asn Thr Gly Glu Thr Leu Thr Arg Ala Ser
235 240 245
ag gttagatttt cttttggtat atttataagt tattctcatt ttcttcatct 1604
Ser
gatcattcat tggtctttct gatgaagata cctgatgtct ttactctctt tttatagtgt 1664
ttgetetate atcaattaaa caaaaaacta cacaagttta tgtaatgaat aattaggaat 1724
tttttggtct catgggttag ctatttgaca gatgtattgc aaaatattat ettgeag t 1782
gtg tgg gtg atg atg aat aaa etg аса agg/’aijh ttgtea aag att cct 1830
Val Trp Val Met Met Asn Lys Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys lie Pro
250 255 260 265
gaa gag gtt ega ggg gaa ata gag cct tat ttt gtg aat tct gat cct 1878
Glu Glu Val Arg Gly Glu lie Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro
270 275 280
gtc ett gcc gag gac age aga aag tta аса aaa att gat gac aag act 1926
Val Leu Ala Glu Asp Ser Arg Lys Leu Thr Lys lie Asp Asp Lys Thr
285 290 295
get gac tat gtt ega tct ggt etc act gtaagtatet agtatttact 1973
Ala Asp Tyr Val Arg Ser Gly Leu Thr
300 305 1
gctgtatgtt tcaacaaacc tttgaccagc ttgtaagact ctctaatggc ttggtaatga 2033
acattttcag cct ega tgg agt gac eta gat gtt aac cag cat gtg aat 2082
Pro . Arg Trp Ser . Asp Leu Asp Val Asn Gln His Val . Asn
310 315
aat gta aag tac att ggg tgg ate etg gag agt get cca gtg gga ata 2130
Asn Val Lys Tyr He Gly Trp lie Leu Glu ,Ser . Ala Pro Val Gly He
320 325 '330 335
atg gag agg cag aag etg aaa age atg act etg gag tat egg agg gaa 2178
Met Glu Arg Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Glu Tyr Arg Arg Glu
340 345 350
tgc ggg aga gac agt gtg ett cag tee etc act gca gtt acg ggt tgc 2226
Cys Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Thr Gly Cys
355 360 365
- 173 030862
gat ate ggt aac ctg gca аса geg ggg gat gtg gaa tgt cag cat ttg 2274
Asp lie Gly Asn Leu Ala Thr Ala Gly Asp Val Glu Cys Gln His Leu
370 375 380
etc cga etc cag gat gga geg gaa gtg gtg aga gga aga аса gag tgg 2322
Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu Val Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp
385 390 395
agt agt aaa аса cca аса аса act tgg gga act gca ccg taagaaaaag 2371
Ser Ser Lys Thr Pro Thr Thr Thr Trp Gly Thr Ala Pro
400 405 410 aaaacacaac aacaatggct catttgaatc cccttgtaac tatatctgct actaccacct 2431 tgcttgcttg caaccaccac caccaccacc accatttcat gtcctcctcc tcacaaaagt 2491 ttcggccacc aaccctttgt atatttcttt ttttggttct tcttcttttt ttattcgatg 2551 gagatttatt atatttattt aatctttcta tttatttttt tgcttaatgg gaaatgggtg 2611 tcgtgtatca ttacgaattc tgatgttatg taacccatgt gccagcggaa gacaaaggca 2671 tcaactctct cttatcctaa atttattgta ctttgttgag ttttgtagtt gtttccagct 2731 aaacaagcac gtggacgatc cttgtaatga atttgtatga atgtgatgcc ttgtacctgt 2791 aaatttgatt gaaaggctat ttaataaaca cgaacaacca aaacggtttg tccaaacaat 2851 aaagccatcg cat
2864 <210> 80 <211> 412 <212> Белок <213> Arabidopsis thaliana <400> 80
Met 1 Val Ala Thr Ser 5 Ala Thr Ser Ser Phe 10 Phe Pro Val Pro Ser 15 Ser
Ser Leu Asp Pro Asn Gly Lys Gly Asn Lys He Gly Ser Thr Asn Leu
20 25 30
Ala Gly Leu Asn Ser Ala Pro Asn Ser Gly Arg Met Lys Val Lys Pro
35 40 j 45
Asn Ala Gln Ala Pro Pro Lys He Asn Gly Lys Lys Val Gly Leu Pro
50 55 60
Gly Ser Val Asp He Val Arg Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ser His Pro
65 70 75 80
Ala Pro Arg Thr Phe He Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu
85 90 95
Ala Ala He Thr Thr He Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met
100 105 110
- 174 030862
Leu Asp Trp 115 Lys Pro Arg Arg Ser 120 Asp Met Leu Val Asp 125 Pro Phe Gly
He Gly Arg He Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn Phe Ser
130 135 140
lie Arg Ser Tyr Glu He Gly Ala Asp Arg Ser Ala Ser He Glu Thr
145 150 155 160
Val Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys Thr Ala
165 170 175
Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Phe Lys Lys
180 185 190
Asn Leu He Trp Val Val Thr Arg Met Gln Val Val Val Asp Lys Tyr
195 200 205
Pro Thr Trp Gly Asp Val Val G1U Val Asp Thr ТГ]5 Val Ser Gln Ser
210 215 220
Gly Lys Asn Gly Met Arg Arg Asp Trp Leu Val Arg Asp Cys Asn Thr
225 230 235 240
Gly Glu Thr Leu Thr Arg Ala Ser Ser Val Trp Val Met Met Asn Lys
245 250 255
Leu Thr Arg Arg Leu Ser Lys He Pro Glu Glu Val Arg Gly Glu He
260 265 270
Glu Pro Tyr Phe Val Asn Ser Asp Pro Val Leu Ala Glu Asp Ser Arg
275 280 285
Lys Leu Thr Lys He Asp Asp Lys Thr Ala Asp Tyr Val Arg Ser Gly
290 295 300
Leu Thr Pro Arg Trp Ser Asp Leu Asp Val Asn Gift His Val Asn Asn
305 310 315 320
Val Lys Tyr He Gly Trp He Leu Glu Ser Ala Pro Val Gly lie Met
325 330 335
Glu Arg Gln Lys Leu Lys Ser Met Thr Leu Gib Tyr Arg Arg Glu Cys
340 345 l·· 350
Gly Arg Asp Ser Val Leu Gln Ser Leu Thr Ala Val Thr Gly Cys Asp
355 360 365
- 175 030862 lie Gly Asn Leu Ala Thr Ala Gly Asp Val Glu Cys Gln His Leu Leu
370 375380
Arg Leu Gln Asp Gly Ala Glu V^l Val Arg Gly Arg Thr Glu Trp Ser
385 390 '· 395 '400
Ser Lys Thr Pro Thr Thr Thr Trp Gly Thr Ala Pro
405410 <210> 81 <211> 28 ' <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-EMS05 <400> 81 gcgcctcggt ttccagtcaa gcatcatc 28 <210> 82 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> ’ ' U <223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-EMS05 <400>82 tcactgcttc tcagcc <210>83 <211> 32' <212> ДНК <213> Искусственная последовательность .
<220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-EMS06 <400>83 gatccataat cacgtcagag cgcctcggtt tc32 <210>84 <211>17 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность.
<220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-A1-EMS06 <400>84 tcagtcaagc atcatcc <210>85 <211>40
- 176 030862 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-EMS01 <400> 85 acctaatgga aaaattctga cggaacacaa gaccatcctt 40 <210> 86 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-EMS01 <400>86 aaacaattct ccctaaacca20 <210>87 <211>40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-EMS05 <400>87 tgccaagaaa atggtagtta tagcagcaag cagcatactc40 <210> 88 <211>14 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-A2-EMS05 <400> 88 tcagtcaggc agct <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
днк
Искусственная последовательность
Олигонуклеотид для детектирования FATB-A3-EMS01 <400> 89 aagagagctt accaagtagg atatttatca actacaacct t <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
- 177 030862 <223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-A3-EMS01 <400>90 acatacgagt аасаассс18 <210>91 <211>43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-EMS04 <400>91 ccagtaacaa caagcgacta caatcataat cataatcagt acc43 <210>92 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность?
<220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-EMS04 <400>92 ttgtaaatga ttcataaccg ttt23 <210>93 <211>41 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-EMS05 <400>93 taggatattt atcaacgaca acctgcatac gagtaacaac c41 <210>94 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-C1-EMS05 <400>94 tcatatcaag ttcttcttaa cca23 <210>95 <211>43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-C2-EMS02 <400> 95 cctggttctg tagagatatc aaagtctgac aacgagactt cgc 43
- 178 030862 <210> 96 <211> 12 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-C2-EMS02 <400>96 tagcccgcac cc <210>97 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-C2-EMS03 <400>97 agaacgcctg ggtttccagt caagcatcat c31 <210>98 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-C2-EMS03 <400>98 tcactgtttc tcagcc16 <210>99 <211>40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-C3-EMS02 <400>99 cgctctgcgt ctatagaaac agtcatgaac Cacttacagt40 <210> 100 <211>24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования FATB-C3-EMS02 <400> 100 atatattaca atcacactcg attg 24 <210> 101 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования ENDO1 <400>101 tgaggagcgt ggtggtccca cacctt26 <210> 102 <211>13 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для детектирования ENDO1 <400> 102 cgatgcgacc age 13
- 179 030862

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Мутантный аллель гена FATB дикого типа, причем ген FATB дикого типа кодирует функциональный белок FATB и включает молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из молекулы нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23; и молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24, где указанный мутантный аллель FATB имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23, причем g в положении 279 SEQ ID NO: 13 заменен на a, g в положении 333 SEQ ID NO: 13 заменен на a, g в положении 348 SEQ ID NO: 13 заменен на a, g в положении 282 SEQ ID NO: 15 заменен на a, с в положении 406 SEQ ID NO: 15 заменен на t, с в положении 845 SEQ ID NO: 17 заменен на t, g в положении 668 SEQ ID NO: 19 заменен на a, с в положении 235 SEQ ID NO: 21 заменен на t, с в положении 331 SEQ ID NO: 21 заменен на t, g в положении 336 SEQ ID NO: 21 заменен на a, g в положении 502 SEQ ID NO: 13 заменен на a, g в положении 587 SEQ ID NO: 13 заменен на a, g в положении 504 SEQ ID NO: 15 заменен на a, g в положении 498 SEQ ID NO: 19 заменен на a, g в положении 581 SEQ ID NO: 21 заменен на a или g в положении 508 SEQ ID NO: 23 заменен на a, и где присутствие указанного аллеля FATB в растении Brassica снижает уровни насыщенных жирных кислот в масле семян по сравнению с соответствующим растением Brassica дикого типа.
  2. 2. Растение Brassica, отличающееся тем, что оно содержит в своем геноме по меньшей мере один мутантный аллель FATB по п.1, причем уровень насыщенных жирных кислот в масле семян этого растения значительно снижен по сравнению с уровнем насыщенных жирных кислот в масле семян соответствующего растения Brassica дикого типа.
  3. 3. Растение по п.2, где указанным растением являются масличные культуры Brassica, предпочтительно Brassica napus, Brassica juncea или Brassica rapa.
  4. 4. Семя растения Brassica по п.2 или 3, где масло, полученное из указанных семян, содержит менее чем 7 мас.% от общего содержания насыщенных жирных кислот в расчете на общее содержание в мас.% жирных кислот в масле.
  5. 5. Мутантный белок FATB, кодируемый мутантным аллелем по п.1, который снижает уровни насыщенных жирных кислот в масле семян растения Brassica по сравнению с соответствующим растением Brassica дикого типа.
  6. 6. Набор для идентификации мутантного аллеля FATB по п.1 в биологическом образце, содержащий набор праймеров или зондов, где указанный набор выбран из группы, состоящей из набора праймеров или зондов, где один из указанных праймеров или зондов содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из 5'- или 3'фланкирующей последовательности области мутации ДНК мутантного аллеля FATB по п.1, а другой из указанных праймеров или зондов содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из области мутации ДНК мутантного аллеля FATB по п.1;
    набора праймеров или зондов, где один из указанных праймеров или зондов содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из 5'- или 3'фланкирующей последовательности области мутации ДНК мутантного аллеля FATB по п.1, а другой из указанных праймеров или зондов содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из области стыка между 3'- или 5'-фланкирующей последовательностью ДНК и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB по п.1;
    зонда, содержащего нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из области стыка между 3'- или 5'-последовательностью ДНК, фланкирующей областью мутации ДНК и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB по п.1.
  7. 7. Набор по п.6, где указанный набор праймеров или зондов выбран из группы, состоящей из набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 50, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей последовательности области мутации мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 52, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, где g в положении 333 заменен на a;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 53, и/или один прай
    - 180 030862 мер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей последовательности области мутации мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO:
    55, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, где g в положении 348 заменен на а;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 58, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей последовательности области мутации мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 60, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, где с в положении 406 заменен на t;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 58, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей последовательности области мутации мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO:
    56, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, где g в положении 282 заменен на а;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 64, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей последовательности области мутации мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 62, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17, где с в положении 845 заменен на t;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 68, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей последовательности области мутации мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 38, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 498 заменен на а;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 65 и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей последовательности области мутации мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 67, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 668 заменен на а;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 70, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей последовательности области мутации мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 72, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, где с в положении 235 заменен на t;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 73, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей последовательности области мутации мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 75, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, где g в положении 336 заменен на а;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 76, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей последовательности области мутации мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 78, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23, где g в положении 508 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля
    - 181 030862
    FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 81, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 82, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, где g в положении 333 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 83, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 84, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, где g в положении 348 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 85, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 86, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, где с в положении 406 заменен на t;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 87, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 88, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, где g в положении 282 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 89, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 90, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17, где с в положении 845 заменен на t;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 91, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 92, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 498 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 93, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 94, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 668 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 95, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 96, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, где с в положении 235 заменен на t;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 97, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 98, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, где g в положении 336 заменен на а; и набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области
    - 182 030862 стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 99, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 100, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23, где g в положении 508 заменен на а соответственно.
  8. 8. Способ идентификации мутантного аллеля FATB по п.1 в биологическом образце, где указанный способ включает определение наличия области мутации ДНК в нуклеиновой кислоте, присутствующей в указанном биологическом образце при помощи анализа полимеразной цепной реакции с набором, включающим набор праймеров, определенных в п.6 или 7, или при помощи гибридизационного анализа с набором, включающим набор зондов, определенных в п.6 или 7.
  9. 9. Набор для определения типа зиготности мутантного аллеля FATB по п.1 в растении, растительном материале или в семенах Brassica, где указанный набор включает набор праймеров или зондов, выбранный из группы, состоящей из набора по меньшей мере из трех праймеров или зондов, где первый праймер или зонд содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из 5'- или 3'-фланкирующей последовательности мутированной области ДНК и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного аллеля FATB по п.1 или функционального аллеля FATB, как описано в п.1, второй праймер или зонд содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из области мутации ДНК мутантного аллеля FATB по п.1, и третий праймер или зонд содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из соответствующей области ДНК дикого типа функционального аллеля FATB, как описано в п.1;
    набора по меньшей мере из трех праймеров или зондов, где первый праймер или зонд содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из 5'- или 3'-фланкирующей последовательности мутированной области ДНК и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного аллеля FATB по п.1 или функционального аллеля FATB, как описано в п.1, второй праймер или зонд содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из области стыка между 3'- или 5'-последовательностью ДНК, фланкирующей область мутации ДНК, и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB по п.1, и третий праймер или зонд содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из области стыка между 3'- или 5'-последовательностью ДНК, фланкирующей область ДНК дикого типа, и соответствующей последовательностью ДНК дикого типа функционального аллеля FATB, как описано в п.1;
    набора по меньшей мере из двух зондов, где первый зонд содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из области стыка между 3'- или 5'-последовательностью ДНК, фланкирующей область мутации ДНК, и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB по п.1, и второй зонд содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из области стыка между 3'- или 5'последовательностью ДНК, фланкирующей область ДНК дикого типа, и соответствующей последовательностью ДНК дикого типа функционального аллеля FATB, как описано в п.1.
  10. 10. Набор по п.9, где указанный набор праймеров или зондов выбран из группы, состоящей из набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 50, один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 51, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'фланкирующей последовательности области мутации и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного или функционального аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 52, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, где g в положении 333 заменен на a;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 53, один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 54, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'фланкирующей последовательности области мутации и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного или функционального аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 55, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, где g в положении 348 заменен на a;
    - 183 030862 набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 59, один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 60, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 61, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, где с в положении 406 заменен на t;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 56, один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 57, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 5'фланкирующей последовательности области мутации и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного или функционального аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 58, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, где g в положении 282 заменен на a;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 62, один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 63, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 5'фланкирующей последовательности области мутации и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного или функционального аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 64, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17, где с в положении 845 заменен на t;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'фланкирующей последовательности области мутации и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного или функционального аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 67, один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 68, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 69, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 498 заменен на a;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 65, один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 66, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'фланкирующей последовательности области мутации и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного или функционального аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 67, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 668 заменен на a;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 70, один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 71, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'фланкирующей последовательности области мутации и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного или функционального аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 72, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, где с в положении 235 заменен на t;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного ал- 184 030862 леля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 73, один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 74, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'фланкирующей последовательности области мутации и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного или функционального аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 75, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, где g в положении 336 заменен на а;
    набора праймеров, включающего один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 76, один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 77, и/или один праймер, содержащий нуклеотидную последовательность 3'фланкирующей последовательности области мутации и соответствующей области ДНК дикого типа мутантного или функционального аллеля FATB, причем указанный праймер содержит последовательность SEQ ID NO: 78, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23, где g в положении 508 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 81, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 82, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, где g в положении 333 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 83, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 84, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, где g в положении 348 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 85, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 86, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, где с в положении 406 заменен на t;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 87, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 88, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, где g в положении 282 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 89, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 90, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17, где с в положении 845 заменен на t;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 91, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 92, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 498 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля
    - 185 030862
    FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 93, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 94, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 668 заменен на а;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 95, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 96, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, где с в положении 235 заменен на t;
    набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 97, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 98, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, где g в положении 336 заменен на а; и набора зондов, содержащего один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 5'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 99, и/или один зонд, содержащий нуклеотидную последовательность области стыка между 3'-фланкирующей последовательностью и областью мутации ДНК мутантного аллеля FATB, причем указанный зонд включает последовательность SEQ ID NO: 100, где указанный мутантный аллель FATB содержит молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23, где g в положении 508 заменен на а.
  11. 11. Способ определения типа зиготности мутантного аллеля FATB по п.1 в растении, растительном материале или в семенах Brassica, где указанный способ включает определение наличия области мутации ДНК и/или соответствующей специфической области ДНК дикого типа в геномной ДНК указанного растения, растительного материала или семян при помощи анализа полимеразной цепной реакции с набором, включающим набор праймеров, определенных в п.9 или 10, или при помощи гибридизационного анализа с набором, включающим набор зондов, определенных в п.9 или 10.
  12. 12. Способ переноса по меньшей мере одного мутантного аллеля FATB по п.1 из одного растения в другое растение, где указанный способ включает стадии:
    (a) идентификации первого растения, содержащего по меньшей мере один мутантный аллель FATB, способом по п.8;
    (b) скрещивания первого растения со вторым растением, не содержащим по меньшей мере одного мутантного аллеля FATB, и сбора гибридных семян F1 от указанного кросса;
    (c) идентификации растений F1, содержащих по меньшей мере один мутантный аллель FATB, способом по п.8.
  13. 13. Семя Brassica, выбранное из группы, состоящей из семян растения Brassica, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, где g в положении 333 заменен на a, молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17, где с в положении 845 заменен на t, молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 498 заменен на a, и молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23, где g в положении 508 заменен на a;
    семян растения Brassica, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, где g в положении 348 заменен на a, молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, где с в положении 406 заменен на t, молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 668 заменен на a, и молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, где g в положении 336 заменен на a; и семян растения Brassica, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, где g в положении 282 заменен на a, молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, где g в положении 668 заменен на a, и молекулу нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, где с в положении 235 заменен на t.
  14. 14. Семя, полученное из растения по п.2 или 3.
  15. 15. Потомство, полученное из растения по п.2 или 3.
    - 186 030862
    0.00 J---------------------Фиг. 1
    EMSO1/2/3
    EMS05
    EMS06 EMS07 EMS09
    ......
    экзон 2 экзон 3 экзон 1 экзон 4 экзон 5 ► ►
    ID 31 ID 51
    ID 25
    ID 28
    ID 43 ID 55 ◄ «
    ID 52 ID 32
    ID 54
    ID .81
    ID 84 1D 8'
    FATB-Al (S) (1560 т.п.h.)
    Фиг. 2 экзон 1
    Фиг. 3
    EMS01 экзон 2 экзон 3 экзон 4 экзон 5
    ID 25ID 28 ► ► 4◄
    ID 64 ID 35 ID 46 ID 63ID 36
    ID 90
    ID 89
    FATB-A3 (S) (1715т.п.н.)
    Фиг. 4
    187 030862
    Фиг. 5
    EMS02 i экзон 1 экзон 2 экзон 3 экзон 4' экзон 5 ► ►
    ID 41 ID 77
    ID 78
    ID 28
    FATB-СЗ (S) (1892 т.п.н.)
    Фиг. 7
    188 c s : с g с c s s s ο ί ΰ ш s g s υ о с с с з з s ' δδδδΰδδδδδδδδδδδδδδδδδδοδδδδ^ p „ p ., p .. .. 3 p. rj p rj p pj p, rJ p p ., n „ r, N p U p ΐ G 7 7 G 7 3 γ 3 3 γ 3 c 3 G U 3 C 3 Ж Ж δ 3 δ ЖЖ δ δ δ δ δ δ 5 c 5 ЖЖсЖзЖ ~ c G С 3 ΰ G о э э ? 3 ? ΰ ? с 'З с ц с э з 7 G π G б 5 G % 9 ΰ s 9 с 5 3 у ρ 1 Э G ΰ Q S и ΰ с ЖЖЖЖЗЖсЖЖЖЖ2ЖЖЗЖЖЖЬсзис ϊ---ρ ρ ϊωΓ-3-ρρΖ_γ Γ5_ρ -_^ω_Ε-ρ -ρ -_ρ_3_-^----_-__ δ 5 δ δ ϋ δ δ δ δ I S J /1 δ S γ 5 δ γ 3 δ γ I □ γ I 3 g γ 3 γγ γ γ 5 s s γ 51 = 3 'Э 3 3 '4 Η ΰ 3 < '- 2 * δ 5 J < < ί m ? < 5 “ 3 < < '- ο “ + ? < '< ί < ® * δ θ 5 аз 3 я 3 Ώ 2 δ
    Ιϊ'5;«ϊ9| %aSiii5iS Υϊ’Υ'Υ у 3 ρ ·2ν7 Γ, 5 π 3 ? γ ч Λ Ν3 γ3 ?·; ; ? ?γ,., 3γ γ ι д - < ρ%. 3., ί s > ? зг+> ρ <J! ?δ id < μ a %;'й 3+γ+< s < % |r< > > > >::ii?-3ds%ialddd>d<ii = d9dd39>j>d = 33l Г” ” Г ' ..... ' ’ ί i г
    i генотип
    Фиг. 8а
    Фиг. 8b
EA201070114A 2007-07-09 2008-07-07 Растение brassica, содержащее мутантные аллели (жирный ацил)-acp-тиоэстеразы EA030862B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07075568 2007-07-09
US95894507P 2007-07-10 2007-07-10
PCT/EP2008/005551 WO2009007091A2 (en) 2007-07-09 2008-07-07 Brassica plant comprising mutant fatty acyl-acp thioesterase alleles

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201070114A1 EA201070114A1 (ru) 2010-08-30
EA030862B1 true EA030862B1 (ru) 2018-10-31

Family

ID=40076671

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201070114A EA030862B1 (ru) 2007-07-09 2008-07-07 Растение brassica, содержащее мутантные аллели (жирный ацил)-acp-тиоэстеразы

Country Status (15)

Country Link
US (2) US8981180B2 (ru)
EP (1) EP2167667B1 (ru)
JP (1) JP5677839B2 (ru)
CN (1) CN101688220B (ru)
AR (1) AR067480A1 (ru)
AU (1) AU2008274551B2 (ru)
CA (2) CA2692687C (ru)
DK (1) DK2167667T3 (ru)
EA (1) EA030862B1 (ru)
ES (1) ES2545083T3 (ru)
PL (1) PL2167667T3 (ru)
SI (1) SI2167667T1 (ru)
UA (1) UA99471C2 (ru)
WO (1) WO2009007091A2 (ru)
ZA (2) ZA200908886B (ru)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2342466T7 (es) 2003-11-21 2012-11-19 Givaudan Sa P-mentanocarboxamidas n-substituidas.
EP2491127B1 (en) 2009-10-22 2017-09-20 Dow AgroSciences LLC Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis
SI2501804T1 (sl) 2009-11-20 2016-09-30 Bayer Cropscience Nv Rastline Brassice, ki vsebujejo mutirane FAD3 alele
AU2010330777B2 (en) * 2009-12-18 2014-10-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brassica plants yielding oils with a low total saturated fatty acid content
EP2525658B1 (de) 2010-01-22 2017-03-01 Bayer Intellectual Property GmbH Akarizide und/oder insektizide wirkstoffkombinationen
AU2011253127B2 (en) * 2010-05-12 2014-10-30 Agrigenetics, Inc. Use of brown midrib-3 gene specific markers in maize for trait introgression
US9695434B2 (en) * 2010-05-25 2017-07-04 Cargill, Incorporated Brassica plants yielding oils with a low alpha linolenic acid content
EP2576765A4 (en) * 2010-05-25 2013-12-18 Cargill Inc KOHLPFLANZEN FOR OBTAINING OILS WITH LOW CONTENT ON ALPHA-LINOLENIC ACID
CN108823254A (zh) * 2010-11-03 2018-11-16 柯碧恩生物技术公司 具有降低倾点的微生物油、从其中产生的介电流体、以及相关方法
MX2013005258A (es) 2010-11-15 2013-07-05 Bayer Ip Gmbh N-aril pirazol(tio)carboxamidas.
BR112014002855A2 (pt) 2011-08-10 2017-02-21 Bayer Ip Gmbh combinações do composto ativo que incluem derivados específicos do ácido tetrâmico
EA201590164A1 (ru) 2012-07-06 2015-05-29 Байер Кропсайенс Нв Растения brassica с модифицированным составом масла семян
US9873886B2 (en) 2012-07-06 2018-01-23 Bayer Cropscience Nv Brassica ROD1 gene sequences and uses thereof
BR112015000058A2 (pt) 2012-07-06 2017-08-08 Bayer Cropscience Nv sequências de genes rod1 de soja e usos das mesmas
BR112015014307A2 (pt) 2012-12-19 2017-07-11 Bayer Cropscience Ag difluorometil-nicotínico- tetrahidronaftil carboxamidas
US9567615B2 (en) 2013-01-29 2017-02-14 Terravia Holdings, Inc. Variant thioesterases and methods of use
US9816079B2 (en) 2013-01-29 2017-11-14 Terravia Holdings, Inc. Variant thioesterases and methods of use
JP2016518112A (ja) * 2013-03-15 2016-06-23 ソラザイム, インコーポレイテッドSolazyme Inc 改質油を製造するためのチオエステラーゼおよび細胞
US9290749B2 (en) 2013-03-15 2016-03-22 Solazyme, Inc. Thioesterases and cells for production of tailored oils
US9783836B2 (en) 2013-03-15 2017-10-10 Terravia Holdings, Inc. Thioesterases and cells for production of tailored oils
CN107087416A (zh) 2014-07-24 2017-08-22 泰拉瑞亚控股公司 变体硫酯酶及使用方法
WO2016044779A2 (en) 2014-09-18 2016-03-24 Solazyme, Inc. Acyl-acp thioesterases and mutants thereof
CN107624135A (zh) 2015-04-28 2018-01-23 拜尔作物科学公司 具有修饰的种子油组成的芸苔属植物
US11021713B2 (en) 2016-05-25 2021-06-01 Cargill, Incorporated Engineered nucleases to generate deletion mutants in plants
CN109640679A (zh) 2016-08-12 2019-04-16 嘉吉公司 特种低饱和物菜籽油
US10440915B2 (en) 2016-09-01 2019-10-15 Cargill, Incorporated Canola cultivar 15RH0611
US10440916B2 (en) 2016-09-06 2019-10-15 Cargill, Incorporated Canola cultivar 15RH0612
US10440909B2 (en) 2016-09-06 2019-10-15 Cargill, Incorporated Canola cultivar 15RH0613
TW201920684A (zh) * 2017-08-17 2019-06-01 日商莎卡達種子股份有限公司 甘藍（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）植物之異型檢出法
CN112702908B (zh) * 2018-09-14 2023-02-21 孙传信 抗生物胁迫的水稻植株材料
US20220064657A1 (en) * 2019-01-04 2022-03-03 Cargill, Incorporated Engineered nucleases to generate mutations in plants
CA3047768A1 (en) 2019-06-21 2020-12-21 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7cn0425
US20230062896A1 (en) * 2020-01-31 2023-03-02 Calyxt, Inc. Increase of saturated fat in soybean
US11672218B2 (en) 2020-04-24 2023-06-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7CN0065
WO2022140762A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer
TW202342754A (zh) 2022-03-01 2023-11-01 美商巴斯夫農業解決方案種子美國有限責任公司 Cas12a切口酶
CN114958880B (zh) * 2022-04-06 2023-08-29 吉林大学 大豆脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶GmFATA2基因及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991015578A1 (en) * 1990-04-04 1991-10-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of improved rapeseed exhibiting a reduced saturated fatty acid content
WO2004001001A2 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Calgene Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
WO2004000871A2 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Monsanto Technology Llc Thioesterase-related nucleic acid sequences and methods

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5512482A (en) 1990-04-26 1996-04-30 Calgene, Inc. Plant thioesterases
US5344771A (en) 1990-04-26 1994-09-06 Calgene, Inc. Plant thiosterases
EP0563191B2 (en) 1990-12-20 2000-01-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleotide sequences of soybean acyl-acp thioesterase genes
US5945585A (en) 1990-12-20 1999-08-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Specific for palmitoyl, stearoyl and oleoyl-alp thioesters nucleic acid fragments encoding acyl-acp thiosesterase enzymes and the use of these fragments in altering plant oil composition
US5455167A (en) 1991-05-21 1995-10-03 Calgene Inc. Medium-chain thioesterases in plants
KR100321510B1 (ko) 1991-09-24 2005-01-10 키진 엔.브이. 선택적인 제한단편의 증폭:디엔에이(dna) 핑거프린트법
US5850022A (en) 1992-10-30 1998-12-15 Calgene, Inc. Production of myristate in plant cells
WO1995013390A2 (en) 1993-11-10 1995-05-18 Calgene, Inc. Plant acyl acp thioesterase sequences
EP0778896B1 (en) * 1994-08-31 2015-01-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleotides sequences of canola and soybean palmitoyl-acp thioesterase genes and their use in the regulation of fatty acid content of the oils of soybean and canola plants
US5625130A (en) * 1995-03-07 1997-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Oilseed Brassica bearing an endogenous oil wherein the levels of oleic, alpha-linolenic, and saturated fatty acids are simultaneously provided in an atypical highly beneficial distribution via genetic control
US5985557A (en) 1996-01-24 1999-11-16 Third Wave Technologies, Inc. Invasive cleavage of nucleic acids
WO2002008403A2 (en) 2000-07-25 2002-01-31 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding beta-ketoacyl-acp synthase and uses thereof
BRPI0516556B1 (pt) * 2004-10-08 2019-12-31 Dow Agrosciences Llc composição alimentícia frita, processo de obtenção de uma composição alimentícia frita, processo de redução da gordura saturada na fração de óleo de sementes de uma planta transgênica de canola e polinucleotídeo

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991015578A1 (en) * 1990-04-04 1991-10-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of improved rapeseed exhibiting a reduced saturated fatty acid content
WO2004001001A2 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Calgene Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
WO2004000871A2 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Monsanto Technology Llc Thioesterase-related nucleic acid sequences and methods

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARKER GUY C, ET AL: "Novel insights into seed fatty acid synthesis and modification pathways from genetic diversity and quantitative trait loci analysis of the Brassica C genome", PLANT PHYSIOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, USA, vol. 144, no. 4, 1 August 2007 (2007-08-01), Rockville, Md, USA, pages 1827 - 1842, XP002517760, ISSN: 0032-0889, DOI: 10.1104/PP.107.096172 *
BONAVENTURE GUSTAVO, ET AL: "Disruption of the FATB gene in Arabidopsis demonstrates an essential role of saturated fatty acids in plant growth.", THE PLANT CELL, AMERICAN SOCIETY OF PLANT BIOLOGISTS, US, vol. 15, no. 4, 1 April 2003 (2003-04-01), US, pages 1020 - 1033, XP002517757, ISSN: 1040-4651, DOI: 10.1105/TPC.008946 *
D�RMANN PETER, VOELKER T A, OHLROGGE J B: "Accumulation of palmitate in Arabidopsis mediated by the acyl-acyl carrier protein thioesterase FATB1", PLANT PHYSIOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, USA, vol. 123, no. 2, 1 June 2000 (2000-06-01), Rockville, Md, USA, pages 637 - 643, XP002517758, ISSN: 0032-0889, DOI: 10.1104/pp.123.2.637 *
LYSAK MARTIN A, ET AL: "Chromosome triplication found across the tribe Brassiceae.", GENOME RESEARCH, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, US, vol. 15, no. 4, 1 April 2005 (2005-04-01), US, pages 516 - 525, XP002517759, ISSN: 1088-9051, DOI: 10.1101/GR.3531105 *
OSBORN, T.C. CHRIS PIRES, J. BIRCHLER, J.A. AUGER, D.L. JEFFERY CHEN, Z. LEE, H.-S. COMAI, L. MADLUNG, A. DOERGE, : "Understanding mechanisms of novel gene expression in polyploids", TRENDS IN GENETICS., ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V. AMSTERDAM., NL, vol. 19, no. 3, 1 March 2003 (2003-03-01), NL, pages 141 - 147, XP004411460, ISSN: 0168-9525, DOI: 10.1016/S0168-9525(03)00015-5 *
SCARTH RACHAEL, TANG J: "Modification of Brassica oil using conventional and transgenic approaches", CROP SCIENCE, CROP SCIENCE SOCIETY OF AMERICA, US, vol. 46, no. 3, 1 May 2006 (2006-05-01), US, pages 1225 - 1236, XP002517762, ISSN: 0011-183X, DOI: 10.2135/CROPSCI2005.08-0245 *
SCHEFFLER J A, ET AL: "Desaturase multigene families of Brassica napus arose through genome duplication", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS ; INTERNATIONAL JOURNAL OF PLANT BREEDING RESEARCH, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 94, no. 5, 1 January 1997 (1997-01-01), Berlin, DE, pages 583 - 591, XP002517761, ISSN: 0040-5752, DOI: 10.1007/s001220050454 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2167667B1 (en) 2015-05-20
SI2167667T1 (sl) 2016-03-31
AR067480A1 (es) 2009-10-14
US10837066B2 (en) 2020-11-17
ZA200908886B (en) 2011-02-23
JP5677839B2 (ja) 2015-02-25
ES2545083T3 (es) 2015-09-08
US20110145944A1 (en) 2011-06-16
WO2009007091A2 (en) 2009-01-15
ZA201009002B (en) 2011-07-27
CN101688220B (zh) 2017-04-05
DK2167667T3 (en) 2015-07-27
AU2008274551A1 (en) 2009-01-15
UA99471C2 (ru) 2012-08-27
EP2167667A2 (en) 2010-03-31
AU2008274551B2 (en) 2014-05-29
CN101688220A (zh) 2010-03-31
WO2009007091A3 (en) 2009-07-23
PL2167667T3 (pl) 2015-10-30
JP2010532667A (ja) 2010-10-14
CA3128584A1 (en) 2009-01-15
US20150232951A1 (en) 2015-08-20
US8981180B2 (en) 2015-03-17
CA2692687C (en) 2021-10-26
EA201070114A1 (ru) 2010-08-30
CA2692687A1 (en) 2009-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2167667T3 (en) Brassica plant comprising the mutant fatty acyl-ACP thioesterase alleles
AU2010321249B2 (en) Brassica plants comprising mutant FAD3 alleles
JP5882225B2 (ja) 低総飽和脂肪酸含有率を有するオイルを産するアブラナ属植物
CN107580629B (zh) 芸苔属事件lbflfk和lbfdau及其检测方法
KR20190029594A (ko) 근친교배 형질전환 카놀라 계통 ns-b50027-4 및 이의 종자
US10494642B2 (en) Brassica plants with modified seed oil composition
EP3071021A1 (en) Alleles modifying brassica plant total saturated fatty acid content
CN104603276A (zh) 具有修饰的种子油组成的芸苔属植物
WO2016176476A1 (en) Brassica plants with modified seed oil composition
EP4021167A1 (en) Brassica juncea line nubj1207
NZ788009A (en) Elite event canola ns-b50027-4

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment