JP2016518112A

JP2016518112A - 改質油を製造するためのチオエステラーゼおよび細胞

Info

Publication number: JP2016518112A
Application number: JP2016502205A
Authority: JP
Inventors: ジョージエヌ．ルデンコ，; ジェイソンキャソラーリ，; スコットフランクリン，
Original assignee: Solazyme Inc
Current assignee: TerraVia Holdings Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2016-06-23
Also published as: CN105143458A; AU2018267601A1; CA2904395A1; MX2015011507A; WO2014151904A1; AU2014236763A1; EP2971024A1; EP2971024A4; BR112015023192A2; AU2014236763B2; BR112015023192A8; KR20150128770A

Abstract

本発明は、調節因子と、核酸コンストラクトを発現する細胞によって生成される油中に改変脂肪酸プロファイルを生じるように作動可能な活性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現するＦａｔＢ遺伝子とを含む核酸コンストラクトであって、ＦａｔＢ遺伝子が表１ａの分岐群５に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が配列番号８８、８２、８５、および１０３のそれぞれと少なくとも９４．６％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ８およびＣ１０脂肪酸に富む、核酸コンストラクトを提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれその内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１３年願であり、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９１，８６１号明細書、および２０１３年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／９１７，２１７号明細書の優先権を主張する。

植物およびいくつかの微細藻類をはじめとする特定の生物は、脂肪酸合成のために、個別の単機能酵素の使用によって特徴付けられる、ＩＩ型脂肪酸生合成経路を利用する。対照的に、哺乳類および真菌は、単一の大型多機能タンパク質を利用する。

ＩＩ型脂肪酸生合成は、典型的に、二炭素単位で成長するアシル−ＡＣＰ（アシル−キャリアタンパク質）鎖の伸長と、それに続くアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの切断を伴う。植物中では、（ｉ）オレアート中のオレオイル−ＡＣＰ（１８：１脂肪酸）を加水分解する傾向がある、ＦａｔＡクラス遺伝子によってコードされるもの、および（ｉｉ）対応するアシル−ＡＣＰ分子からＣ８〜Ｃ１６脂肪酸を遊離させる、ＦａｔＢクラス遺伝子によってコードされるものの２つの主要なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ種が同定されている。
様々な植物からの異なるＦａｔＢ遺伝子は、異なるアシル鎖長に対する特異性を有する。その結果、異なる遺伝子産物は、植物種子中で異なる脂肪酸プロファイルを生じる。米国特許第５，８５０，０２２号明細書；米国特許第５，７２３，７６１号明細書；米国特許第５，６３９，７９０号明細書；米国特許第５，８０７，８９３号明細書；米国特許第５，４５５，１６７号明細書；米国特許第５，６５４，４９５号明細書；米国特許第５，５１２，４８２号明細書；米国特許第５，２９８，４２１号明細書；米国特許第５，６６７，９９７号明細書；および米国特許第５，３４４，７７１号明細書；米国特許第５，３０４，４８１号明細書を参照されたい。最近、改変脂肪酸プロファイルがあるトリグリセリドを製造するために、ＦａｔＢ遺伝子が油性微細藻類中にクローン化されている。国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレット、国際公開第２０１２／１０６５６０号パンフレット、および国際公開第２０１３／１５８９３８号パンフレットを参照されたい。

米国特許第５，８５０，０２２号明細書米国特許第５，７２３，７６１号明細書米国特許第５，６３９，７９０号明細書米国特許第５，８０７，８９３号明細書米国特許第５，４５５，１６７号明細書米国特許第５，６５４，４９５号明細書米国特許第５，５１２，４８２号明細書米国特許第５，２９８，４２１号明細書米国特許第５，６６７，９９７号明細書米国特許第５，３４４，７７１号明細書米国特許第５，３０４，４８１号明細書国際公開第２０１０／０６３０３２号国際公開第２０１１／１５０４１１号国際公開第２０１２／１０６５６０号国際公開第２０１３／１５８９３８号

様々な態様において、本明細書で検討される発明は、続く実施形態のいずれか１つまたは複数を含んでもよいが、それに限定されなくてもよい。

実施形態１：調節因子と、核酸コンストラクトを発現する細胞によって生成される油中に改変脂肪酸プロファイルを生じるように作動可能な活性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現するＦａｔＢ遺伝子とを含む核酸コンストラクトであって、ＦａｔＢ遺伝子が表１ａの分岐群５に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が配列番号８８、８２、８５、および１０３のそれぞれと少なくとも９４．６％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ８およびＣ１０脂肪酸に富む、核酸コンストラクト。

実施形態２：調節因子と、核酸コンストラクトを発現する細胞によって生成される油中に改変脂肪酸プロファイルを生じるように作動可能な活性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現するＦａｔＢ遺伝子とを含む核酸コンストラクトであって、ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群１〜１２の１つに含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する、核酸コンストラクト。

実施形態３：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群１に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号１９、１６１、２２、および１６０のそれぞれと少なくとも８５．９％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１４およびＣ１６脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態４：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群２に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号１３４〜１３６、１３２、１３３、１３７、１２４、１２２、１２３、１２５のそれぞれと少なくとも８９．５％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１２およびＣ１４脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態５：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群３に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号１２６および１２７のそれぞれと少なくとも９２．５％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１２およびＣ１４脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態６：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群４に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号７９と少なくとも８３．８％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１２およびＣ１４脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態７：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群６に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号１１１および１１０のそれぞれと少なくとも９９．９％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１０脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態８：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群７に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号７３、１０６、１８５、１７２、１７１、１７３、１７４のそれぞれと少なくとも８９．５％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１０およびＣ１２脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態９：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群８に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号１１２、１１３、１４２、１４５、１４３、１４４、１３９、１４０、１３８、１４１のそれぞれと少なくとも８５．９％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１２およびＣ１４脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態１０：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群９に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号１８７〜１８９のそれぞれと少なくとも８３．８％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１２およびＣ１４脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態１１：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群１０に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号１４７、１４９、１４６、１５０、１５２、１５１、１４８、１５４、１５６、１５５、１５７、１０８、７５、１９０、１９１、および１９２のそれぞれと少なくとも９５．９％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１４およびＣ１６脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態１２：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群１１に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号１２１と少なくとも８８．７％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１４およびＣ１６脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態１３：ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群１２に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、配列が、配列番号１２９および１８６のそれぞれと少なくとも７２．８％の配列同一性を有し、任意選択的に油の脂肪酸がＣ１６脂肪酸に富む、実施形態２の核酸コンストラクト。

実施形態１４：配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５３、５４、５６、５７、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７６、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０９のいずれかと、または遺伝コード縮重のために同等である配列のいずれかと、少なくとも８０％の配列同一性を有する、単離核酸、または核酸を含む組換えＤＮＡコンストラクト。

実施形態１５：配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７５、７７、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０８、１１０〜１９２のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質またはアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するその断片をコードする、単離核酸配列、またはそれを発現する宿主細胞。

実施形態１６：実施形態１５の単離核酸であって、タンパク質が、その配列を含む組換え細胞によって生成される油の脂肪酸プロファイルを改変するように作動可能な、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する、実施形態１５の単離核酸。

実施形態１７：実施形態１〜３のいずれかの核酸で細胞を形質転換するステップを含む、改変脂肪酸プロファイルを生成する組換え細胞を作成する方法。

実施形態１８：実施形態１７の方法によって作成される宿主細胞。

実施形態１９：植物細胞、微生物細胞、および微細藻類細胞から選択される、実施形態１８の宿主細胞。

実施形態２０：実施形態５または６の宿主細胞を培養するステップと、それによって生成する油を抽出するステップとを含み、任意選択的に培養が糖上の従属栄養培養である、油または油由来製品を製造する方法。

実施形態２１：油から、脂肪酸、燃料、化学物質、またはその他の油由来製品を製造するステップをさらに含む、実施形態２０の方法。

実施形態２２：任意選択的に、少なくとも２０％のＣ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４またはＣ１６脂肪酸を含む脂肪酸プロファイルを有する、実施形態２０の方法によって製造される油。

実施形態２３：実施形態２１の方法によって製造される油由来製品。

実施形態２４：微細藻類によって生成され、任意選択的にＣ２４−αステロールを欠く、実施形態２３の油。

発明の例証的実施形態の説明
定義
核酸に関して使用される場合、「単離」という用語は、典型的に天然起源核酸と共に存在する、少なくとも１つのその他の成分を含まない核酸を指す。したがって、天然起源核酸は、核酸と共に自然発生する少なくとも１つのその他の成分から分離精製されていれば、単離されている。

「天然油」または「天然脂肪」は、トリグリセリドの脂肪酸プロファイルを実質的に改変するような別の天然または合成油または画分と混合されていない、生物から得られるトリグリセリドが優勢な油を意味するものとする。特定の位置特異性トリグリセリドを含んでなる油との関連で、天然油または天然脂肪は、位置特異性トリグリセリドプロファイルを得るためにエステル交換またはその他の合成を受けておらず、むしろ位置特異性は、細胞または細胞集団によって自然に生成される。天然油または天然脂肪との関連で、本開示全体にわたり一般に使用される油および脂肪という用語は、特に断りのない限り同義的に使用される。したがって、「油」または「脂肪」は、物質の構造およびその他の条件次第で、室温において液体、固体、または部分的固体であり得る。ここで、「分画」という用語は、どのようにして達成されるかを問わず、生物によって生成されるプロファイルと比較して、その脂肪酸プロファイルを変化させるように、油から物質を除去することを意味する。「天然油」および「天然脂肪」という用語は、生物から得られる油を包含し、油は、そのトリグリセリドプロファイルを実質的に変化させない、精製、漂白および／または脱ガムをはじめとする最小の加工を受けている。天然油はまた「非エステル交換天然油」であり得て、これは、天然油が、グリセロールへのそれらのアシル結合中で脂肪酸が再分配される加工を受けておらず、本質的に生物からの回収時と同じ立体配置のままであることを意味する。

「外性遺伝子」は、（例えば形質転換／形質移入によって）細胞に導入されたＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現をコードする核酸を意味するものとし、「導入遺伝子」とも称される。外来性遺伝子を含んでなる細胞は、組換え細胞と称されてもよく、その中に追加的な外来性遺伝子が導入されてもよい。外来性遺伝子は、形質転換される細胞に対して異なる種（すなわち異種）に由来してもよく、または同一種（すなわち同種）に由来してもよい。したがって、外来性遺伝子は、遺伝子の内在性コピーに対して、細胞のゲノム中で異なる位置を占める、または異なる制御下にある、相同遺伝子を含み得る。外来性遺伝子は、細胞内に２つ以上のコピーが存在してもよい。外来性遺伝子は、例えば、ゲノム（核または色素体）内への挿入として、またはエピソーム分子として細胞内に保持されてもよい。

「脂肪酸」は、遊離脂肪酸、脂肪酸塩、またはグリセロ脂質中の脂肪酸アシル部分を意味するものとする。グリセロ脂質の脂肪酸アシル基は、トリグリセリドが加水分解または鹸化されると生じる、カルボン酸またはカルボン酸アニオンによって記述し得るものと理解される。

「微細藻類」は、葉緑体またはその他の色素体を含有して任意選択的に光合成ができる微生物であり、または光合成ができる原核微生物である。微細藻類としては、エネルギーとして固定炭素源を代謝できない偏性光独立栄養生物、ならびに固定炭素源のみで生きられる従属栄養生物が挙げられる。微細藻類としては、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）などの細胞分裂直後に姉妹細胞から分離する単細胞生物、ならび例えば、２つの明白な細胞型がある単純な多細胞光合成微生物であるボルボックス属（Ｖｏｌｖｏｘ）などの微生物が挙げられる。微細藻類としてはクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、およびプロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）などの細胞が挙げられる。微細藻類としてはまた、アグメネルム属（Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、およびピロボトリス属（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）などの細胞−細胞接着を示すその他の微生物光合成生物も挙げられる。微細藻類としてはまた、特定の渦鞭毛藻類種およびプロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種など、光合成能力を喪失した偏性従属栄養微生物も挙げられる。

「油性」細胞は、天然にまたは組換え体または古典的株の改良を通じて、乾燥細胞重量基準で少なくとも２０％の脂質を生成できる細胞である。「油性微生物」または「油性微生物」は、油性微細藻類をはじめとする微生物である。

２つ以上のアミノ酸または核酸配列の文脈で、「配列同一性百分率」という用語は、配列比較アルゴリズムを使用した評価で、または目視検査で、比較して最大対応関係について整列させた際に、同一である、または特定の同一アミノ酸残基またはヌクレオチド百分率を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。ヌクレオチドまたはアミノ酸の同一性百分率を判定するための配列比較では、典型的に１つの配列が、それに対して試験配列が比較される参照配列の機能を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力して、必要ならば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。配列比較アルゴリズムは、次に、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性百分率を計算する。比較のために、デフォルトパラメータに設定したＮＣＢＩＢＬＡＳＴソフトウェア（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用して、最適配列アラインメントを実施し得る。例えば、２つの核酸配列を比較するために、以下のデフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールのバージョン２．０．１２（２０００年４月２１日）で、ｂｌａｓｔｎを使用してもよい。Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｒｅｗａｒｄｆｏｒｍａｔｃｈ：１；Ｐｅｎａｌｔｙｆｏｒｍｉｓｍａｔｃｈ：−２；ＯｐｅｎＧａｐ：５およびＥｘｔｅｎｓｉｏｎＧａｐ：２ｐｅｎａｌｔｉｅｓ；Ｇａｐｘｄｒｏｐ−ｏｆｆ：５０；Ｅｘｐｅｃｔ：１０；ＷｏｒｄＳｉｚｅ：１１；Ｆｉｌｔｅｒ：ｏｎ。２つのアミノ酸配列のペアワイズ比較のためには、例えば、以下のデフォルトパラメータのｂｌａｓｔｐｓｅｔで、「ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールのバージョン２．０．１２（２０００年４月２１日）を使用してもよい。Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；ＯｐｅｎＧａｐ：１１およびＥｘｔｅｎｓｉｏｎＧａｐ：１ｐｅｎａｌｔｉｅｓ；Ｇａｐｘｄｒｏｐ−ｏｆｆ５０；Ｅｘｐｅｃｔ：１０；ＷｏｒｄＳｉｚｅ：３；Ｆｉｌｔｅｒ：ｏｎ。

天然油との関連で、「プロファイル」は、油中の特定の化学種またはトリグリセリドまたは脂肪酸アシル基の分布である。「脂肪酸プロファイル」は、グリセロール主鎖への結合を参照しない、油のトリグリセリド中の脂肪酸アシル基の分布である。脂肪酸プロファイルは、典型的に、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の変換と、それに続く火炎イオン化検出（ＦＩＤ）を用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって判定される。脂肪酸プロファイルは、その脂肪酸の曲線下面積から判定される、全脂肪酸シグナル中の１パーセント以上の脂肪酸として表し得る。ＦＡＭＥ−ＧＣ−ＦＩＤ測定値は、脂肪酸の重量百分率を近似する。

本明細書の用法では、油は、富化されていない油と比較して、油中の脂肪酸質量に少なくとも１０％の増大があれば、１つまたは複数の特定の脂肪酸について「富む」と言われる。例えば、本明細書に記載される異種ＦａｔＢ遺伝子を発現する細胞の場合、例えば油中のＣ８およびＣ１６脂肪酸質量が、異種ＦａｔＢ遺伝子を発現しない同一タイプの細胞によって生成される油（例えば野性型油）よりも少なくとも１０％高ければ、細胞によって生成される油は、これらの脂肪酸に富むと言われる。

「組換え体」は、外来性核酸導入または天然核酸改変によって、改変されている細胞、核酸、タンパク質またはベクターである。したがって、例えば、組換え体（宿主）細胞は、天然（非組換え）形態の細胞中に見られない遺伝子を発現し、または非組換え細胞によって発現される遺伝子とは異なるように天然遺伝子を発現し得る。組換え体細胞として、制限なしに、遺伝子産物をコードする組換え核酸、または細胞内活性遺伝子産物レベルを低下させる、変異、ノックアウト、アンチセンス、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）またはｄｓＲＮＡなどの抑制因子をコードする組換え核酸が挙げられる。「組換え核酸」は、概して、化学合成を使用して、例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびエンドヌクレアーゼの使用などの核酸操作によって、元々は生体外で形成される核酸であり、またはそうでなければ自然界で常態では見られない形態である。組換え核酸は、例えば、２つ以上の核酸を作動可能な結合に置くことで作成してもよい。したがって、本発明の目的では、自然界で常態では連結しないＤＮＡ分子を連結させることで、核によって生体外で成形される単離核酸または発現ベクターの双方が、組換え体と見なされる。組換え核酸はまた、その他の様式で、例えば化学的ＤＮＡ合成を使用して作成し得る。ひとたび組換え核酸が作成され、宿主細胞または生物に導入されたら、それは、宿主細胞の生体内細胞機構を使用して複製されてもよい；しかしこのような核酸は、ひとたび組換え的に作成されると、引き続いて細胞内で複製されるもの、本発明の目的では、依然として組換え体と見なされる。同様に、「組換えタンパク質」は、例えば組換え核酸の発現を通じて、組換え技術を使用して生成されるタンパク質である。

本発明の実施形態は、組換え細胞によって生成される油の脂肪酸プロファイルを改変するために、宿主細胞内で発現させ得る、植物から単離されたＦａｔＢ遺伝子の使用に関する。脂肪酸プロファイルを改変する能力について遺伝子をスクリーンするために、微細藻類であるプロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）が使用されるが、遺伝子は多種多様な宿主細胞で有用である。例えば、遺伝子は、細菌、その他の微細藻類、または高等植物内で発現させ得る。遺伝子は、米国特許第５，８５０，０２２号明細書；米国特許第５，７２３，７６１号明細書；米国特許第５，６３９，７９０号明細書；米国特許第５，８０７，８９３号明細書；米国特許第５，４５５，１６７号明細書；米国特許第５，６５４，４９５号明細書；米国特許第５，５１２，４８２号明細書；米国特許第５，２９８，４２１号明細書；米国特許第５，６６７，９９７号明細書；米国特許第５，３４４，７７１号明細書；および米国特許第５，３０４，４８１号明細書の方法によって高等植物内で発現させ得る。脂肪酸は、合成的にまたは生合成的に、トリグリセリド、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、およびその他の油脂化学製品にさらに変換し得る。

特定の実施形態では、トリグリセリドは、新規ＦａｔＢ遺伝子を発現する宿主細胞によって生成される。トリグリセリド含有天然油は、宿主細胞から回収し得る。天然油は、精製、脱ガム、漂白および／または脱臭し得る。油は、その天然または加工形態で、食品、化学物質、燃料、化粧品、プラスチック、およびその他の用途のために利用し得る。別の実施形態では、ＦａｔＢ遺伝子は、新規でなくてもよいが、微細藻類中の遺伝子内の発現が新規である。

遺伝子は、宿主細胞内の発現または組換えのために、プラスミドまたはその他のベクターをはじめとする多様な遺伝子コンストラクト中で使用し得る。遺伝子は、標的宿主細胞内の発現のためにコドン最適化し得る。遺伝子によって生成されるタンパク質は、生体内で、または精製形態で利用し得る。

例えば、遺伝子は、作動可能に連結するプロモーターおよび５’ＵＴＲを含んでなる発現ベクターに調製し得る。色素体細胞が宿主として使用される場合、適切には、下の実施例のように、活性色素体標的化ペプチドをＦＡＴＢ遺伝子に融合させ得る。通常、新規に特定されたＦＡＴＢ遺伝子では、Ｎ末端にほぼ５０個のアミノ酸があり、それは葉緑体への酵素の輸送に関与する色素体輸送ペプチドを構成する。下の実施例では、この輸送ペプチドが、プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞内で、これらの細胞の色素体に酵素を輸送するのに有効な３８個のアミノ酸配列で置換される。したがって、本発明は、所与の宿主細胞を内の酵素活性を最適化するために、欠失および融合タンパク質を検討する。例えば、本明細書に記載される新たに発見された植物遺伝子の代わりに、宿主または関連種からの輸送ペプチドを使用してもよい。

選択可能なマーカー遺伝子をベクターに包含させて、形質転換細胞の単離を助けてもよい。ミクロラガエ（ｍｉｃｒｏｌａｇａｅ）で有用な選択可能なマーカーの例としては、スクロースインベルターゼおよび抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。

開示される遺伝子配列はまた、植物またはその他の生物内で相補的遺伝子を阻害する、アンチセンス、または阻害性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉまたはヘアピンＲＮＡ）を調製するのに使用し得る。

細胞内で所望の脂肪酸プロファイルを生成する上で有用なことが分かったＦａｔＢ遺伝子は、下の表１に要約される。配列番号１〜１０９の配列を有する核酸またはタンパク質を使用して、組換え細胞の脂肪酸プロファイルを改変し得る。配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５３、５４、５６、５７、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７６、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７または１０９と、少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する変種などの変種核酸もまた使用し得る。多様な宿主生物に関する遺伝子のコドン最適化が検討され、遺伝子断片の使用についても同様である。プロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の株およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）のための好ましいコドンは、それぞれ下の表２および３に示される。クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）のコドン使用頻度は、表３ａに示される。シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のコドン使用頻度は、表３ｂに示され；例えば、各アミノ酸のための最も好ましいコドンを選択し得る。微細藻類および高等植物をはじめとするその他の生物のためのコドン表は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２の最も好ましいプロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）コドンが、コドン最適化のために用いられる。特定の実施形態では、下の配列表に含有される新規アミノ酸配列は、表２〜３ｂに記載されるプロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）、またはシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内の最も好ましいコドン使用頻度に従った核酸配列に、またはこれらの誘導核酸配列と、少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する核酸配列に、変換される。

本発明の実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７５、７７、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０８、または１１０〜１９２のいずれかを有する、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸がある。一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７５、７７、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０８、または１１０〜１９２のいずれかと、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の配列同一性を有するタンパク質またはタンパク質をコードする核酸がある。特定の実施形態では、発明は、上記のタンパク質または核酸（タンパク質または核酸変種断片をはじめとする）のいずれかの断片を包含し、タンパク質断片は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有し、または核酸断片は、このようなタンパク質断片をコードする。別の実施形態では、断片は、例えば特異性決定領域などの特定の機能を媒介するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの領域を含む。例証的断片は、Ｃ末端および／またはＮ末端トランケーションによって作成し得て、本明細書で開示される完全長配列の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。

特定の実施形態では、上で論じた核酸またはタンパク質変種の配列同一性百分率は、完全長核酸配列（例えば、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５３、５４、５６、５７、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７６、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７または１０９の１つ）または完全長アミノ酸配列（例えば、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７５、７７、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０８、または１１０〜１９２の１つ）を参照配列として使用して、完全長試験配列をこの参照配列と比較することで計算し得る。断片に関するいくつかの実施形態では、核酸変種またはタンパク質断片の配列同一性百分率は、断片全長にわたって計算し得る。

核酸は、単離形態であり得て、またはベクターまたはその他のコンストラクト、染色体または宿主細胞の一部であり得る。多くの場合、完全長遺伝子（およびタンパク質）は必要ないことが分かった；例えば、Ｎ末端疎水性領域（典型的にＬＰＤＷから開始する１８個のアミノ酸領域）の一部または全部の欠失は、依然として機能性遺伝子をもたらす。さらに、表１の遺伝子の特異性決定域と、その他のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの触媒領域との融合は、機能性遺伝子をもたらし得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は、それぞれ異種アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ核酸またはアミノ酸配列と融合した、開示される核酸またはアミノ酸の機能性断片（例えば特異性決定域）を包含する。

特定の実施形態では、宿主細胞（例えば植物または微細藻類細胞）は変換されて、表１ａの分岐群１〜１２の１つに含まれる組換え体ＦＡＴＢタンパク質を生成する。これらの分岐群は、配列アラインメントと、プロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）内で発現させた際の脂肪酸プロファイル変化の観察によって判定される。実施例５を参照されたい。ＦＡＴＢアミノ酸配列は、表１ａに列挙される分岐群中の各配列のｘ％アミノ酸配列同一性の範囲内であり得て、ここでｘは、これもまた表１ａに列挙される第１、第２または第３のカットオフ値である。

宿主細胞
宿主細胞は、単細胞（例えば、微細藻類、細菌、酵母）であり得て、または植物または真菌などの多細胞生物の一部であり得る。植物中でＦａｔｂ遺伝子を発現するための方法は、５，８５０，０２２；５，７２３，７６１；５，６３９，７９０；５，８０７，８９３；５，４５５，１６７；５，６５４，４９５；５，５１２，４８２；５，２９８，４２１；５，６６７，９９７；および５，３４４，７７１；５，３０４，４８１に示され、または植物生物工学で一般に知られているその他の技術を使用して達成し得る。緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）をはじめとする油性微生物の設計は、国際公開第２０１０／０６３０３２号パンフレット、国際公開第２０１１，１５０４１１号パンフレット、および国際公開第２０１２／１０６５６０号パンフレット、および下の実施例で開示される。

油性宿主細胞の例としては、油性藻類のものなどの色素体油性細胞をはじめとする、ＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する植物細胞および微生物細胞が挙げられる。微細藻類細胞の特定例としては、クロロフィトヤ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｔｙａ）、トレボウクシアフィタエ（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ）、クロレラ目（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ）、またはクロレラ科（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅ）の従属栄養または偏性従属栄養微細藻類が挙げられる。偏性従属栄養生物を含んでなる属であるクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）およびプロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種をはじめとする油性微細藻類の例は、国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、および国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレットで提供される。油性細胞は、例えば、細胞重量の２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、または約９０％±５％の油を生成し得る。任意選択的に、生成される油は、ＤＨＡまたはＥＰＡ脂肪酸が低くあり得る。例えば、油は、５％、２％、または１％未満のＤＨＡおよび／またはＥＰＡを含んでなり得る。上述の文献はまた、特に微細藻類細胞からのこのような細胞を培養して、油を抽出する方法も開示し；このような方法は、本明細書で開示される細胞に適用でき、これらの教示のために参照によって援用される。微細藻類細胞を使用する場合、これらは、独立栄養性に（偏性従属栄養生物でない限り）、または暗所で糖（例えばグルコース、フルクトースおよび／またはスクロース）を使用して、培養し得る。本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、細胞は、細胞がスクロース原材料から油を生成できるようにする、外来性インベルターゼ遺伝子を含んでなる従属栄養細胞であり得る。交互に、またはそれに加えて、細胞は、セルロース系原材料からのキシロースを代謝し得る。例えば、細胞は、活性キシロース輸送体、キシルロース‐５‐リン酸輸送体、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、およびキシロース還元酵素をコードするものなどの１つまたは複数のキシロース代謝遺伝子を発現するように遺伝子改変し得る。２０１２年１１月１５日に公開された、国際公開第２０１２／１５４６２６号パンフレット「ＧＥＮＥＴＩＣＡＬＬＹＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳＴＨＡＴＭＥＴＡＢＯＬＩＺＥＸＹＬＯＳＥ」を参照されたい。

油および関連製品
油性細胞は、脂肪酸生合成酵素をコードする、１つまたは複数の外来性遺伝子を発現する。その結果、いくつかの実施形態は、非植物または非種子油からは得られない、または完全に入手不能な天然油を特徴とする。

油性細胞は貯蔵油を生成し、それは主にトリアシルグリセリドであり、細胞の貯蔵体内に貯蔵されてもよい。未加工油は、細胞を破壊して油を単離することで、細胞から得られてもよい。国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、および国際公開第２０１１／１５０４号パンフレットは、従属栄養培養および油単離技術を開示する。例えば、油は、細胞を培養、乾燥、および圧搾することで得られてもよい。生成した油は、当該技術分野で公知のように、または国際公開第２０１０／１２０９３９号パンフレットに記載されるようにして、精製、漂白、および脱臭（ＲＢＤ）されてもよい。未加工またはＲＢＤ油は、多様な食品、化学および工業製品または工程で使用してもよい。油の回収後、有価残留バイオマスが残る。残留バイオマスの用途としては、紙、プラスチック、吸収剤、吸着材、動物飼料、ヒト栄養剤、または肥料の製造が挙げられる。

トリグリセリド（「トリアシルグリセリド」または「ＴＡＧ」とも称される）細胞油の脂肪酸プロファイルは、本明細書に記載され、これは、その中でリン脂質が除去される条件下で分析される、または（例えばクロマトグラフィーおよび質量分析法を使用して）リン脂質の脂肪酸に実質的に非感受性の分析方法で分析される、細胞から抽出された貯蔵油の非分画サンプルを指すものと理解される。油は、ＲＢＤ処理されて、リン脂質、遊離脂肪酸、および臭気が除去されもよいが、なおもトリグリセリド油中の脂肪酸プロファイルに、わずかなまたは無視できる変化のみを有する。細胞は油性であるので、場合によっては、貯蔵油が細胞内の全ＴＡＧの大半を占める。

安定性炭素同位体δ１３Ｃは、標準物質（例えばＰＤＢ；ＳｏｕｔｈＣａｒｏｌｉｎａのＰｅｅｄｅｅ層からのベレムナイト・アメリカナ（Ｂｅｌｅｍｎｉｔｅａｍｅｒｉｃａｎａ）の化石骨格のカーボナイト）と比較した、１３Ｃ／１２Ｃ比を表す。油の安定炭素同位体値δ１３Ｃ（０／００）は、使用した原材料のδ１３Ｃ値に関連し得る。いくつかの実施形態では、油は、トウモロコシまたはサトウキビなどのＣ４植物に由来する糖上で、従属栄養的に培養された油性生物に由来する。いくつかの実施形態では、油のδ１３Ｃ（０／００）は、−１０〜−１７０／００または−１３〜−１６０／００である。

上の方法によって製造される油は、場合によっては、微細藻類宿主細胞を使用して製造される。上述したように、微細藻類は、制限なしに、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、トレボウクシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、クロレラ目（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ）、クロレラ科（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｃｅａｅ）、または緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）の分類に含まれ得る。トレボウクシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）の微細藻類は、それらのステロールプロファイルに基づいて、植物油と区別され得ることが分かった。クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）によって生成される油は、ＧＣ−ＭＳで検出するとブラシカステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、およびβ−シトステロールと思われる、ステロールを生成することが分かった。しかし、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）によって生成される全てのステロールは、Ｃ２４β立体配置を有すると考えられる。したがって、カンペステロール、スチグマステロール、およびβ−シトステロールとして検出される分子は、実際には、それぞれ２２，２３−ジヒドロブラッシカステロール、プロフェラステロール、およびクリオナステロールであると考えられる。したがって、上で説明した微細藻類によって生成される油は、Ｃ２４β立体配置があるステロールの存在と、存在するステロール中のＣ２４α立体配置の不在によって、植物油と区別され得る。例えば、生成される油は、２２、２３−ジヒドロブラッシカステロールを含有する一方でカンペステロールを欠いていてもよく；クリオナステロールを含有する一方でβ−シトステロールを欠いていてもよく、および／またはポリフェラステロールを含有する一方でスチグマステロールを欠いていてもよい。交互に、またはそれに加えて、油は、大量のΔ^７−ポリフェラステロールを含有してもよい。

一実施形態では、本明細書で提供される油は植物油でない。植物油は、植物および植物種子から抽出される油である。植物油は、それらの油内容物に基づいて本明細書で提供される非植物油と区別され得る。油内容物を分析する多様な方法を用いて、油の起源、または本明細書で提供される油に異なる起源（例えば植物）の油による不純物混和があったかどうかを判定し得る。測定は、１つのまたは組み合わせた分析法に基づいて実施し得る。これらの試験としては、遊離脂肪酸の１つまたは複数の分析、脂肪酸プロファイル、全トリアシルグリセロール含有量、ジアシルグリセロール含有量、過酸化物価、分光学的特性（例えばＵＶ吸収）、ステロールプロファイル、ステロール分解産物、抗酸化剤（例えばトコフェロール）、色素（例えばクロロフィル）、ｄ１３Ｃ値、および官能分析（例えば味覚、臭気、および口当たり）が挙げられるが、これに限定されるものではない。食用脂肪および油のための食品規格集など、このような多くの試験が市販の油について標準化されている。

ステロールプロファイル解析は、有機物の生物学的起源を判定するために特に良く知られている方法である。カンペステロール、ｂ−シトステロール、およびスチガムステロール（ｓｔｉｇａｍｓｔｅｒｏｌ）は、一般的植物ステロールであり、ｂ−シトステロールは、原理植物ステロールである。例えば、ｂ−シトステロールは、トウモロコシ中でおよそ６４％、ナタネ中で２９％、ヒマワリ中で６４％、綿実中で７４％、大豆中で２６％、およびオリーブ油中で７９％と、特定の種子油の分析で存在量が最大であることが分かった（Ｇｕｌｅｔａｌ．Ｊ．ＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ５：７１−７９，２００６）。

プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ＵＴＥＸ１４３５株から単離された油を、別々に、清澄化（ＣＬ）、精製および漂白（ＲＢ）し、または精製、漂白、および脱臭（ＲＢＤ）して、ＪＡＯＣＳｖｏｌ．６０，ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ１９８３に記載される手順に従って、ステロール含有量について試験した。解析結果は、下に示される（ｍｇ／１００ｇ単位）：

これらの結果は、３つの顕著な特性を示す。第１に、エルゴステロールは、全ステロールの５０％以上を構成して、全ステロール中で最も豊富であることが分かった。エルゴステロールの量は、合算したカンペステロール、β−シトステロール、およびスチグマステロールの量を超える。エルゴステロールは、真菌に一般に見られ、植物には一般に見られないステロイドであり、その存在は、特に顕著な量で、非植物油の有用なマーカーの役割を果たす。第２に、油は、ブラシカステロールを含有することが分かった。ナタネ油を除いて、ブラシカステロールは、植物ベースの油には一般に見られない。第３に、２％未満のβ−シトステロールが存在することが分かった。β−シトステロールは、微細藻類に一般に見られない、顕著な植物ステロールであり、その存在は、特に顕著な量で、植物起源油の有用なマーカーの役割を果たす。要約すると、プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ＵＴＥＸ１４３５株は、全ステロール含有量の百分率として、大量のエルゴステロールと、痕跡量のみのβ−シトステロールの双方を含有することが分かってた。したがって、エルゴステロール：β−シトステロール比は、またはラシカステロールの存在との併用で、この油を植物油から区別するために利用し得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される油の油内容物は、全ステロールの百分率として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満のβ−シトステロールを含有する。別の実施形態では、油は、β−シトステロールを含まない。

いくつかの実施形態では、油は、β−シトステロール、カンペステロール、またはスチグマステロールの１つまたは複数を含まない。いくつかの実施形態では、油は、β−シトステロール、カンペステロール、およびスチグマステロールを含まない。いくつかの実施形態では、油は、カンペステロールを含まない。いくつかの実施形態では、油は、スチグマステロールを含まない。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される油の油内容物は、全ステロールの百分率として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の２４−エチルコレスト−５−エン−３−オールを含んでなる。いくつかの実施形態では、２４−エチルコレスト−５−エン−３−オールは、クリオナステロールである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される油の油内容物は、全ステロールの百分率として、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のクリオナステロールを含んでなる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される油の油内容物は、全ステロールの百分率として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の２４−メチルコレスタ−５−エン−３−オールを含有する。いくつかの実施形態では、２４−メチルコレスタ−５−エン−３−オールは、２２、２３−ジヒドロブラッシカステロールである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される油の油内容物は、全ステロールの百分率として、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％の２２，２３−ジヒドロブラッシカステロールを含んでなる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される油の油内容物は、全ステロールの百分率として、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の５，２２−コレスタジエン−２４−エチル−３−オールを含有する。いくつかの実施形態では、５、２２−コレスタジエン−２４−エチル−３−オールは、ポリフェラステロールである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される油の油内容物は、全ステロールの百分率として、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のポリフェラステロールを含んでなる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される油の油内容物は、エルゴステロールまたはブラシカステロールまたはその２つの組み合わせを含有する。いくつかの実施形態では、油内容物は、全ステロールの百分率として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％のエルゴステロールを含有する。いくつかの実施形態では、油内容物は、全ステロールの百分率として、少なくとも２５％のエルゴステロールを含有する。いくつかの実施形態では、油内容物は、全ステロールの百分率として、少なくとも４０％のエルゴステロールを含有する。いくつかの実施形態では、油内容物は、全ステロールの百分率として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％のエルゴステロールとブラシカステロールの組み合わせを含有する。

いくつかの実施形態では、油内容物は、全ステロールの百分率として、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％のブラシカステロールを含有する。いくつかの実施形態では、油内容物は、全ステロールの百分率として、１０％、９％、８％、７％、６％，または５％未満のブラシカステロールを含有する。

いくつかの実施形態では、エルゴステロール：ブラシカステロール比は、少なくとも５：１、１０：１、１５：１、または２０：１である。

いくつかの実施形態では、油内容物は、全ステロールの百分率として、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％のエルゴステロールと、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満のβ−シトステロールを含有する。いくつかの実施形態では、油内容物は、全ステロールの百分率として、少なくとも２５％エルゴステロールと、５％未満のβ−シトステロールを含有する。いくつかの実施形態では、油内容物は、ブラシカステロールをさらに含んでなる。

ステロールは、２７〜２９個の炭素原子（Ｃ２７〜Ｃ２９）を含有し、全ての真核生物に見られる。動物は、Ｃ２７ステロールをさらに修飾してＣ２８およびＣ２９ステロールを生成する能力が欠如しているので、Ｃ２７ステロールのみを生成する。しかし植物はＣ２８およびＣ２９ステロールを合成でき、Ｃ２８／Ｃ２９植物ステロールは、フィトステロールと称されることが多い。所与の植物のステロールプロファイルは、Ｃ２９ステロールの含有量が高く、植物中の主要ステロールは、典型的に、Ｃ２９ステロールｂ−シトステロールおよびスチグマステロールである。対照的に、非植物生物のステロールプロファイルは、より高いＣ２７およびＣ２８ステロール百分率を含有する。例えば、真菌および多数の微細藻類中のステロールは、主にＣ２８ステロールである。植物中のステロールプロファイル、特にＣ２８ステロールに対するＣ２９ステロールの顕著な優勢は、土壌サンプル中の植物および海洋物質の比率を判定するために活用されている（Ｈｕａｎｇ，Ｗｅｎ−Ｙｅｎ，ＭｅｉｎｓｃｈｅｉｎＷ．Ｇ．，”Ｓｔｅｒｏｌｓａｓｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ”；ＧｅｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＣｏｓｍｏｃｈｉｍｉａＡｃｔａ．Ｖｏｌ４３．ｐｐ７３９−７４５）。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される微細藻類油中の主要ステロールは、ｂ−シトステロールおよびスチグマステロール以外のステロールである。微細藻類油のいくつかの実施形態では、Ｃ２９ステロールは、全ステロール含有量の重量基準で、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満を構成する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される微細藻類油は、Ｃ２９ステロールよりも多くＣ２８ステロールを含有する。微細藻類油のいくつかの実施形態では、Ｃ２８ステロールは、全ステロール含有量の重量基準で、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を超えて構成する。いくつかの実施形態では、Ｃ２８ステロールはエルゴステロールである。いくつかの実施形態では、Ｃ２８ステロールはブラシカステロールである。

本発明の実施形態では、表１の遺伝子の１つまたは複数を発現する油性細胞は、少なくとも２０、４０、６０または７０％のＣ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４またはＣ１６脂肪酸がある油を生成し得る。特定の実施形態では、油中のミリステート（Ｃ１４：０）レベルは、３０％を超える。

したがって、本発明の実施形態では、本明細書で考察される核酸のいずれかによって細胞を形質転換するステップを含んでなる、油、トリグリセリド、脂肪酸、またはこれらのいずれかの誘導体を生成する工程がある。別の実施形態では、形質転換細胞を培養して油を生成し、任意選択的に、油を抽出する。このようにして抽出された油は、食品、油脂化学製品またはその他の製品を製造するのに利用し得る。

上で論じた油は、単独または組み合わせで、食品、燃料および化学物質（プラスチック、気泡、フィルムなどをはじめとする）の製造において有用である。油、トリグリセリド、油からの脂肪酸は、Ｃ−Ｈ活性化、ヒドロアミノメチル化、メトキシ−炭酸化、オゾン分解、酵素変換反応、エポキシ化、メチル化、二量体化、チオール化、メタセシス、ヒドロアルキル化、ラクトン化、またはその他の化学処理を受けてもよい。

油の抽出後、残留バイオマスが残されてもよく、それは燃料として、動物飼料として、または紙、プラスチック、またはその他の製品の成分として、利用されてもよい。例えば、従属栄養藻類からの残留バイオマスをこのような製品で使用し得る。

実施例１．新規ＦＡＴＢ配列の発見
高等植物中の種子特異的中鎖（Ｃ８〜Ｃ１６）脂肪酸生合成に関与する、新規植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの配列が単離された。種特異的脂質生成遺伝子は、油料種子内に蓄積するＲＮＡ貯留の直接照合を通じて単離された。系統学的分析に基づいて、新規酵素は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのＦａｔＢファミリーのメンバーに分類され得る。

油料植物種子は、地域の食品雑貨店から入手され、またはＮｏｒｔｈＣｅｎｔｒａｌＲｅｇｉｏｎａｌＰｌａｎｔＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｔａｔｉｏｎ（ＮＣＲＩＳ）のＵＳＤＡＡＲＳＮａｔｉｏｎａｌＰｌａｎｔＧｅｒｍｐｌａｓｍＳｙｓｔｅｍ（ＮＰＧＳ）、またはＵＳＤＡＡＲＳＮｏｒｔｈＣｅｎｔｒａｌＳｏｉｌＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｍｏｒｒｉｓ，ＭＩ）を通じて要請された。乾燥種子を液体窒素内で均質化して粉末にし、６〜８Ｍの尿素と３ＭのＬｉＣｌを含有する冷抽出緩衝液に再懸濁して、氷上で２〜３時間、または４℃で一晩、放置した。種子ホモジネートは、冷却微量遠心機（４℃）内で、２０，０００ｇで２０分間の遠心分離によって、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎフィルター（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）に通過させた。得られたＲＮＡペレットを２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、２％のＰＶＰＰ）を含有する緩衝液に再懸濁し、引き続いてＲＮＡをフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）で１回、クロロホルムで１回抽出した。最後にイソプロピルアルコール（０．７Ｖｏｌ．）を用いて、ＲＮＡを沈殿させ、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２の存在下で、遠心分離によって８０％エタノールで洗浄して乾燥させた。ＲＮＡサンプルをＴｕｒｂｏデオキシリボヌクレアーゼ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）で処理し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造会社のプロトコルに従ってさらに精製した。得られた精製ＲＮＡサンプルをペアエンドｃＤＮＡライブラリーに変換し、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉｓｅｑ２０００プラットフォームを使用して、次世代シーケンシング（２×１００ｂｐ）を実施した。ＴｒｉｎｉｔｙまたはＯａｓｅｓパッケージを使用して、ＲＮＡ配列読み取りを対応する種子トランスクリプトームに構築した。既知のチオエステラーゼとの相同性がある配列のためのマイニングトランスクリプトームによって、推定チオエステラーゼコンタイング（ｃｏｎｔａｉｎｇ）ｃＤＮＡコンティグを同定した。これらのコンピュータシミュレーションにより同定された推定チオエステラーゼｃＤＮＡは、種子ＲＮＡおよびプライマー対標的化完全長チオエステラーゼｃＤＮＡを使用して、直接逆転写ＰＣＲ分析によってさらに確認された。得られた増幅産物をクローン化し、新規に配列決定して、同定されたチオエステラーゼ遺伝子の信憑性を確認した。

新規アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと、２つの既存のチオエステラーゼ種（ＦａｔＡおよびＦａｔＢ）メンバーとの間の進化的および機能的関係を調べるために、我々は、公開された完全長（ＭａｙｅｒａｎｄＳｈａｎｋｌｉｎ，２００７）およびトランケート型（タイムデータベース）アミノ酸チオエステラーゼ配列を使用して、系統発生解析を実施した。新規タンパク質は、Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸の生合成に関与する既知のアシル−ＡＣＰＦａｔＢチオエステラーゼに分類されるようである。さらに、新規チオエステラーゼは、３つの優勢な外群にクラスター化するようであり、各クラスターメンバー間の異なる機能的類似性と進化的関連性が示唆される。

続くＦａｔＢ遺伝子のアミノ酸配列は、表４に示される。

ＣｈｓＦＡＴＢ３ｊ：

実施例２．新規ＦＡＴＢ遺伝子で形質転換された細胞のクローニングおよび脂肪酸分析
下の実施例では、ＵＴＥＸ１４３５（ｗｅｂ．ｂｉｏｓｃｉ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／ｕｔｅｘ／）株であるＡ株中における、植物油料種子トランスクリプトーム誘導異種チオエステラーゼ発現の影響を詳述する。

実施例１と同様に、ＲＮＡを乾燥植物種子から抽出し、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉｓｅｑ２０００プラットフォームを使用して、ペアエンド配列決定した。ＴｒｉｎｉｔｙまたはＯａｓｅｓパッケージを使用して、ＲＮＡ配列読み取りを対応する種子トランスクリプトームに構築し、既知のチオエステラーゼとの相同性がある配列のためのマイニングトランスクリプトームによって、推定チオエステラーゼを含有するｃＤＮＡコンティグを同定した。これらのコンピュータシミュレーションにより同定された推定チオエステラーゼｃＤＮＡは、種子ＲＮＡおよびプライマー対標的化完全長チオエステラーゼｃＤＮＡを使用して、直接逆転写ＰＣＲ分析によってさらに確認された。得られた増幅産物をクローン化し、新規に配列決定して、同定されたチオエステラーゼ遺伝子の信憑性を確認し、異なる対立遺伝子発現または種子集団内配列多様性に起因する配列変種を同定した。公開された完全長（ＭａｙｅｒａｎｄＳｈａｎｋｌｉｎ，２００７）およびトランケート型（タイムデータベース）ＦａｔＢ配列を使用して、得られたアミノ酸配列を系統発生解析した。Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸の生合成に関与するアシル−ＡＣＰＦａｔＢチオエステラーゼとクラスター化したチオエステラーゼを探求した。

アシル−ＡＣＰＦａｔＢチオエステラーゼを発現する形質転換ベクターの構築
クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）、クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）、クフェアＰＳＲ２３（ＣｕｐｈｅａＰＳＲ２３）、クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）、クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、およびクフェア・ビスコシッシマ（Ｃｕｐｈｅａｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）種からの２７個の推定アシル−ＡＣＰＦａｔＢチオエステラーゼを、プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ１４３５）のコドン使用頻度を反映するコドン最適化形態で合成した。合成された２７遺伝子の内、２４個は我々のトランスクリプトーム配列決定の試みによって同定され、クフェア・ビスコシッシマ（Ｃｕｐｈｅａｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）からの３遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ内の公開された配列であった。

２７個のＦａｔＢチオエステラーゼの内１つをコードするコンストラクトによって、基本株であるＡ株（古典的変異と高産油量スクリーニングによってＵＴＥＸ１４３５から誘導されたプロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ））を変換して、遺伝子組換え株を作成した。一例としてクスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＦＡＴＢ１ｂをコードするコンストラクトｐＳＺ２７６０を示したが、同一方法を使用して、それぞれ異なるチオエステラーゼをコードする残りの各２６コンストラクトが作成された。コンストラクトｐＳＺ２７６０は、６Ｓ：：ＣｒＴＵＢ２：ＳｃＳＵＣ２：ＣｖＮＲ：：ＰｍＡＭＴ３：ＣｃＦＡＴＢ１ｂ：ＣｖＮＲ：：６Ｓと記述し得る。形質転換ＤＮＡの配列は、表５に提供される（ｐＳＺ２７６０）。それぞれ５’−３’、ＢｓｐＱ１、ＫｐｎＩ、ＡｓｃＩ、ＭｆｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱ１からのコンストラクト内の該当する制限酵素認識部位は、下線付き太字の小文字で示される。ＢｓｐＱ１部位は、形質転換ＤＮＡの５’および３’末端を区切る。コンストラクトの５’および３’末端の太字の小文字配列は、相同組換えを通じて６Ｓ遺伝子座への組み込みを標的とする、ＵＴＥＸ１４３５からのゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に向かって、選択カセットは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子ＳＵＣ２（スクロース上で増殖する能力を与える）と、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸還元酵素（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲとの発現を駆動する、Ｃ．レインハードチイ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）β−チューブリンプロモーターを有する。プロモーターは、囲み内小文字で示される。ＳｃＳＵＣ２のイニシエータＡＴＧおよびターミネーターＴＧＡは、太字の斜体大文字で示される一方で、コード領域は、斜体小文字で示される。３’ＵＴＲは、下線付き小文字で示される。２つのカセット間のスペーサー領域は、大文字テキストで示される。クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）からの第２のカセット含有コドン最適化ＣｃＦＡＴＢ１ｂ遺伝子（表５；ｐＳＺ２７６０）は、プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）内在性ＡＭＴ３プロモーターによって駆動され、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸還元酵素（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲを有する。このカセット内では、ＡＭＴ３プロモーターは、囲み内小文字で示される。ＣｃＦＡＴＢ１ｂ遺伝子のイニシエータＡＴＧおよびターミネーターＴＧＡは、太字の斜体大文字で示される一方で、コード領域は斜体小文字で示され、スペーサー領域は大文字で示される。３’ＵＴＲは、下線付き小文字で示される。最終コンストラクトを配列決定して、正確な読み枠および標的化配列を確実にした。

表５：ｐＳＺ２７６０形質転換コンストラクト

表６中のｐＳＺ２７６０からのＣｃＦＡＴＢ１ｂなどの同定された異種ＦａｔＢ遺伝子をコードするコンストラクトをＡ株に形質転換して、スクロース上で増殖する能力について選択した。変換、細胞培養、脂質生成、および脂肪酸分析は、全て前述のように実施した。油蓄積のための低窒素条件下のスクロース上での培養後、肪酸プロファイルをＦＡＭＥ−ＧＣによって判定した。最大レベルの中鎖脂肪酸を生成する能力による判定で、各変換からの最優秀株は、表４に示される。

アシル−ＡＣＰＦａｔＢチオエステラーゼの多くは、プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）内で発現されると、中鎖活性を示すことが分かった。例えば、ＣｃＦＡＴＢ１ｂの発現は、Ｄ１６７０−１３初代形質転換体において、親株Ａ中の全脂肪酸の２％から約１５％へのミリステートレベルの増大を引き起こす。その他の例としては、０％から約３３％へのラウレートレベルの増大を示すＣｃＦＡＴＢ４、および約３４％へのミリステートレベル増大を示すＣｈｓＦＡＴＢ３が挙げられる。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのいくつかは、現行の具体化において、中鎖レベルに対する劇的な効果を示さなかったが、これらのコンストラクトのいくつかを最適化する努力がおそらくなされるであろう。

同定されてＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ１４３５）に形質転換された異種アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ配列
コードされたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの推定アミノ酸配列、天然ＣＤＳコード配列、プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）コドン最適化コード配列、および調べた配列変種の性質などの、形質転換コンストラクトの該当する配列の完全な一覧は、配列番号１〜７８として提供される。

実施例３．追加的なＦＡＴＢ遺伝子の発見およびクローニング
追加的なＦＡＴＢ遺伝子は、上述の種子から入手された。同定されたＦａｔＢ遺伝子の種および番号は、次のとおりであった：

Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸の生合成に関与するアシル−ＡＣＰＦａｔＢチオエステラーゼとクラスター化したチオエステラーゼを探求した。天然推定色素体標的化輸送ペプチド配列は、下線付きで示される。

アシル−ＡＣＰＦａｔＢチオエステラーゼを発現する形質転換ベクターの構築クフェア・カルカラータ（Ｃｕｐｈｅａｃａｌｃａｒａｔａ）、クフェア・ペインター（Ｃｕｐｈｅａｐａｉｎｔｅｒ）、クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）、クフェア・アビゲラ（Ｃｕｐｈｅａａｖｉｇｅｒａ）プルケリマ変種（ｖａｒ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、クフェア・パウシペタラ（Ｃｕｐｈｅａｐａｕｃｉｐｅｔａｌａ）、クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）、およびクフェア・イグネア（Ｃｕｐｈｅａｉｇｎｅａ）種からの９つの推定アシル−ＡＣＰＦａｔＢチオエステラーゼを、ＵＴＥＸ１４３５コドン使用頻度を反映するコドン最適化形態で合成した。先の実施例とは対照的に、天然輸送ペプチドの代わりに、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からの修飾輸送ペプチド（Ｃｐ）を用いて、新規アシル−ＡＣＰＦａｔＢチオエステラーゼを合成した。ＣｐＳＡＤ１遺伝子に由来する修飾輸送ペプチド「ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿ｔｒｉｍｍｅｄ」は、天然輸送ペプチドの代わりにＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼに対するインフレームＮ末端融合物として合成され、得られた配列は下に列挙される。新規ＦａｔＢ遺伝子を上述のプロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）にクローン化した。異種ＦａｔＢ遺伝子をコードするコンストラクトは、Ｓ６１６５株（Ｓ３１５０／Ａ株の子孫）に形質転換して、スクロース上で増殖する能力について選択した。変換、細胞培養、脂質生成、および脂肪酸分析は、全て前述のように実施した。９つの新規ＦａｔＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼについての結果は、すぐ下の表に示される。

特に注目すべきなのは：１７％のＣ１０：０および８％のＣ８：０脂肪酸レベルを提示するＣｐａｉＦＡＴＢ１；９％のＣ１０：０および１％のＣ１２：０脂肪酸レベルを提示するＣＰａｕＦＡＴＢ１；８％のＣ１０：０および１％Ｃ１２：０の脂肪酸レベルを提示するＣｉｇｎｅａＦＡＴＢ１；１８％のＣ１４：０および１２％のＣ１２：０レベルを提示するＣｃａｌｃＦＡＴＢ１；そして２２％のＣ８：０および９％のＣ１０：０脂肪酸レベルを提示するＣａＦＡＴＢ１である。

高いＣ８：０およびＣ１０：０レベルを提示するＣａＦＡＴＢ１は、特に興味深い。ＣａＦＡＴＢ１は、クファ・アビゲラ（Ｃｕｐｈａａｖｉｇｅｒａ）プルケリマ変種（ｖａｒ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）トランスクリプトーム、Ｓ１７＿Ｃａｖｉｇ＿ｔｒｉｎｉｔｙ＿７４０６およびＳ１７＿Ｃａｖｉｇ＿ｔｒｉｎｉｔｙ＿７４０７から構築された、２つの別々のコンティグから生じた。２つの部分的コンティグは、１７ヌクレオチドの重複のみを提示するが、我々は、２つのコンティグからのＣａＦＡＴＢ１をコードする推定完全長転写物を構築して、次に引き続いて、種子ＲＮＡと、完全長ＣａＦＡＴＢ１チオエステラーゼｃＤＮＡを標的化するプライマー対とを使用した直接逆転写ＰＣＲ分析によって、完全長転写物の存在を立証できた。Ｔｊｅｌｌｓｔｒｏｍｅｔａｌ．（２０１３）は、彼らが「ＣｐｕＦＡＴＢ３」（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＫＣ６７５１７８）と命名したクフェア・プルケリマ（Ｃｕｐｈｅａｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）から新たに同定された、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を開示する。ＣｐｕＦＡＴＢ３のコード配列は、我々が同定したＣａＦＡＴＢ１遺伝子と１００％同じであり、予測コード領域外部のＲＮＡ配列に、１個のヌクレオチドの違いを含有する。Ｔｊｅｌｌｓｔｒｏｍｅｔａｌ．（２０１３）は、ＣｐｕＦＡＴＢ３が、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内で発現すると平均で４．８％のＣ８：０を生成し、平均で９．２％のＣ８：０および最大レベルで約１２％のＣ８．０を生成するには、２つのアシル−ＡＣＰシンセターゼＡＡＥ１５／１６の欠失をさらに要することを示した。我々が同定したＣａＦＡＴＢ１遺伝子は、Ｓ６１６５への導入前に、ＵＴＥＸ１４３５中での発現についてコドン最適化され、ＣｐＳＡＤ１ｔｐ−ｔｒｉｍｍｅｒ輸送ペプチド融合物として作成された。ＣｐＳＡＤ１ｔｐ＿ｔｒｉｍｍｅｒ：ＣａＦＡＴＢ１遺伝子は、内在性アシル−ＡＣＰシンセターゼの欠失を要することなく、平均で１４％のＣ８：０レベルおよび最大で２２％のＣ８：０レベルを生成した。

実施例４．ＦＡＴＢ共通配列：発見、クローニング、および脂肪酸プロファイル
ＵＴＥＸ１４３５、Ｓ３１５０（上のＡ株）中の数種の新規推定中鎖ＦａｔＢチオエステラーゼを試験する過程で、我々は、株に見られる背景中鎖レベルを超える、Ｃ１０：０およびＣ１６：０活性の増大がある数種のチオエステラーゼを同定した。我々は、最優秀Ｃ１０：０およびＣ１６：０チオエステラーゼの配列比較から、理想的なＣ１０：０チオエステラーゼおよびＣ１６：０チオエステラーゼのための共通配列が得られ得ると推論した。インプットとして、Ｃ．パルストリス（Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＦａｔＢ１（ＣｐＦＡＴＢ１）、Ｃ．ＰＳＲ２３ＦａｔＢ３（ＣｕＰＳＲ２３ＦＡＴＢ３）、Ｃ．ビスコシッシマ（Ｃ．ｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）ＦａｔＢ１（ＣｖｉｓＦＡＴＢ１）、Ｃ．グロッソストマ（Ｃ．ｇｌｏｓｓｏｓｔｏｍａ）ＦａｔＢ１（ＣｇＦＡＴＢ１）、およびＣ．カルタゲネンシス（Ｃ．ｃａｒｔｈａｇｅｎｅｎｓｉｓ）ＦａｔＢ２（ＣｃｒＦＡＴＢ２）を使用して、コンセンサスＣ１０：０チオエステラーゼを作成し、ＪｃＦＡＴＢ１／ＳｚＦＡＴＢ１と称されるＣ１０：０に特有の共通配列をもたらした。インプットとして、Ｃ．ヘテロフィラ（Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）ＦａｔＢ３ａ（ＣｈｔＦＡＴＢ３ａ）、Ｃ．カルタゲネンシス（Ｃ．ｃａｒｔｈａｇｅｎｅｎｓｉｓ）ＦａｔＢ１（ＣｃｒＦＡＴＢ１）、Ｃ．ビスコシッシマ（Ｃ．ｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）ＦａｔＢ２（ＣｖｉｓＦＡＴＢ２）、Ｃ．フーケリアナ（Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）ＦａｔＢ１（ＣｈＦＡＴＢ１；ＡＡＣ４８９９０）、Ｃ．ヒッソピフォリア（Ｃ．ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）ＦａｔＢ２（ＣｈｓＦＡＴＢ２）、Ｃ．カロフィラ（Ｃ．ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ）ＦａｔＢ２（ＣｃａｌＦＡＴＢ２；ＡＢＢ７１５８１）、Ｃ．フーケリアナ（Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）ＦａｔＢ１−１（ＣｈＦＡＴＢ１−１；ＡＡＣ７２８８２）、Ｃ．ランセオラタ（Ｃ．ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）ＦａｔＢ１（ＣｌＦＡＴＢ１；ＣＡＣ１９９３３）、およびＣ．ウリグチイ（Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ）ＦａｔＢ４ａ（ＣｗＦＡＴＢ４ａ）配列を使用して、Ｃ１６：０チオエステラーゼ配列に特有のコンセンサスを作成し、ＪｃＦＡＴＢ２／ＳｚＦＡＴＢ２と称されるＣ１６：０特有の共通配列をもたらした。得られた共通配列を合成して、その他のＦａｔＢチオエステラーゼを試験するのに使用したのと同じベクターにクローン化して、上述のＳ３１５０に導入した。共通アミノ酸配列は、配列番号１０６および１０７として示され、核酸配列は、プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためのコドン最適化を利用して、これらのアミノ酸配列に基づいた。形質転換体を選択して培養し、油を抽出してＦＡＭＥ−ＧＣ−ＦＩＤによって分析した。得られた脂肪酸プロファイルを下の表に示す。

実施例５．分岐群分析
近隣結合アルゴリズムに従って、様々な新規ＦＡＴＢチオエステラーゼをクラスター化した。これらは、表１ａに列挙される１２の分岐群を形成することが分かった：上述のプロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）における発現に基づいて、推定機能を割り当てた。

説明される本発明の実施形態は、単に例示的であることが意図され、当業者には、多数のバリエーションと修正が明白であろう。全てのこのようなバリエーションと修正は、本発明の範囲内であることが意図される。

配列表
配列番号１：
クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＦＡＴＢ１ｂ変種Ｍ２５Ｌ、Ｍ３２２Ｒ、ΔＴ３６７−Ｄ３６８アミノ酸配列

配列番号２：
クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＦＡＴＢ１ｂ変種Ｍ２５Ｌ、Ｍ３２２Ｒ、ΔＴ３６７−Ｄ３６８コーディングＤＮＡ配列

配列番号３：
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＦＡＴＢ１ｂ変種Ｍ２５Ｌ、Ｍ３２２Ｒ、ΔＴ３６７−Ｄ３６８コーディングＤＮＡ配列

配列番号４
クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＦＡＴＢ４アミノ酸配列

配列番号５
クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＦＡＴＢ４コーディングＤＮＡ配列

配列番号６
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＦＡＴＢ４コーディングＤＮＡ配列

配列番号７
クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＦＡＴＢ３アミノ酸配列

配列番号８
クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＦＡＴＢ３コーディングＤＮＡ配列

配列番号９
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＦＡＴＢ４コーディングＤＮＡ配列

配列番号１０
クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ１アミノ酸配列

配列番号１１
クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号１２
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号１３
クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ２アミノ酸配列

配列番号１４
クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ２コーディングＤＮＡ配列

配列番号１５
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ２コーディングＤＮＡ配列

配列番号１６
クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ２ｂ＋ａ．ａ．２４８−２５９変種アミノ酸配列

配列番号１７
クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ２ｂ＋ａ．ａ．２４８−２５９変種コードＤＮＡ配列

配列番号１８
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ２ｂ＋ａ．ａ．２４８−２５９変種コーディングＤＮＡ配列

配列番号１９
クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ３アミノ酸配列

配列番号２０
クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ３コーディングＤＮＡ配列

配列番号２１
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ３コーディングＤＮＡ配列

配列番号２２
クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ３ｂ（Ｖ２０４Ｉ、Ｃ２３９Ｆ、Ｅ２４３Ｄ、Ｍ２５１Ｖ変種）アミノ酸配列

配列番号２３
クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ３ｂ（Ｖ２０４Ｉ、Ｃ２３９Ｆ、Ｅ２４３Ｄ、Ｍ２５１Ｖ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号２４
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（Ｃｈｓ）ＦＡＴＢ３ｂ（Ｖ２０４Ｉ、Ｃ２３９Ｆ、Ｅ２４３Ｄ、Ｍ２５１Ｖ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号２５
クフェアＰＳＲ２３（ＣｕｐｈｅａＰＳＲ２３）（Ｃｕ）ＦＡＴＢ３アミノ酸配列

配列番号２６
クフェアＰＳＲ２３（ＣｕｐｈｅａＰＳＲ２３）（Ｃｕ）ＦＡＴＢ３コーディングＤＮＡ配列

配列番号２７
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェアＰＳＲ２３（ＣｕｐｈｅａＰＳＲ２３）（Ｃｕ）ＦＡＴＢ３コーディングＤＮＡ配列

配列番号２８
クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ３アミノ酸配列

配列番号２９
クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ３コーディングＤＮＡ配列

配列番号３０
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ３コーディングＤＮＡ配列

配列番号３１
クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ４ａアミノ酸配列

配列番号３２
クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ４ａコーディングＤＮＡ配列

配列番号３３
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ４ａコーディングＤＮＡ配列

配列番号３４
クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ４ｂアミノ酸配列

配列番号３５
クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ４ｂコーディングＤＮＡ配列

配列番号３６
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ４ｂコーディングＤＮＡ配列

配列番号３７
クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ５アミノ酸配列

配列番号３８
クフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ５コーディングＤＮＡ配列

配列番号３９
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ウリグチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）ＦＡＴＢ５コーディングＤＮＡ配列

配列番号４０
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ１ａアミノ酸配列

配列番号４１
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ１ａコーディングＤＮＡ配列

配列番号４２
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ１ａコーディングＤＮＡ配列

配列番号４３
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ１ｂ（Ｐ１６Ｓ、Ｔ２０Ｐ、Ｇ９４Ｓ、Ｇ１０５Ｗ、Ｓ２９３Ｆ、Ｌ３０５Ｆ変種）アミノ酸配列

配列番号４４
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ１ｂ（Ｐ１６Ｓ、Ｔ２０Ｐ、Ｇ９４Ｓ、Ｇ１０５Ｗ、Ｓ２９３Ｆ、Ｌ３０５Ｆ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号４５
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ１ｂ（Ｐ１６Ｓ、Ｔ２０Ｐ、Ｇ９４Ｓ、Ｇ１０５Ｗ、Ｓ２９３Ｆ、Ｌ３０５Ｆ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号４６
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｂアミノ酸配列

配列番号４７
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｂコーディングＤＮＡ配列

配列番号４８
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｂコーディングＤＮＡ配列

配列番号４９
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ａ（Ｓ１７Ｐ、Ｐ２１Ｓ、Ｔ２８Ｎ、Ｌ３０Ｐ、Ｓ３３Ｌ、Ｇ７６Ｄ、Ｓ７８Ｐ、Ｇ１３７Ｗ変種）アミノ酸配列

配列番号５０
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ａ（Ｓ１７Ｐ、Ｐ２１Ｓ、Ｔ２８Ｎ、Ｌ３０Ｐ、Ｓ３３Ｌ、Ｇ７６Ｄ、Ｓ７８Ｐ、Ｇ１３７Ｗ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号５１
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ａ（Ｓ１７Ｐ、Ｐ２１Ｓ、Ｔ２８Ｎ、Ｌ３０Ｐ、Ｓ３３Ｌ、Ｇ７６Ｄ、Ｓ７８Ｐ、Ｇ１３７Ｗ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号５２
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｃ（Ｇ７６Ｄ、Ｓ７８Ｐ変種）アミノ酸配列

配列番号５３
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｃ（Ｇ７６Ｄ、Ｓ７８Ｐ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号５４
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｃ（Ｇ７６Ｄ、Ｓ７８Ｐ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号５５
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｄ（Ｓ２１Ｐ、Ｔ２８Ｎ、Ｌ３０Ｐ、Ｓ３３Ｌ、Ｇ７６Ｄ、Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｗ１２７Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｋ２５８Ｎ、Ｃ３０３Ｒ、Ｅ３０９Ｇ、Ｋ３３４Ｔ、Ｔ３８６Ａ変種）アミノ酸配列

配列番号５６
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｄ（Ｓ２１Ｐ、Ｔ２８Ｎ、Ｌ３０Ｐ、Ｓ３３Ｌ、Ｇ７６Ｄ、Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｗ１２７Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｋ２５８Ｎ、Ｃ３０３Ｒ、Ｅ３０９Ｇ、Ｋ３３４Ｔ、Ｔ３８６Ａ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号５７
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｄ（Ｓ２１Ｐ、Ｔ２８Ｎ、Ｌ３０Ｐ、Ｓ３３Ｌ、Ｇ７６Ｄ、Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｗ１２７Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｋ２５８Ｎ、Ｃ３０３Ｒ、Ｅ３０９Ｇ、Ｋ３３４Ｔ、Ｔ３８６Ａ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号５８
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｅ（Ｇ７６Ｄ、Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｇ１５２Ｓ、Ｈ１６５Ｌ、Ｔ２１１Ｎ、Ｋ２５８Ｎ、Ｃ３０３Ｒ、Ｅ３０９Ｇ、Ｋ３３４Ｔ、Ｔ３８６Ａ変種）アミノ酸配列

配列番号５９
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｅ（Ｇ７６Ｄ、Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｇ１５２Ｓ、Ｈ１６５Ｌ、Ｔ２１１Ｎ、Ｋ２５８Ｎ、Ｃ３０３Ｒ、Ｅ３０９Ｇ、Ｋ３３４Ｔ、Ｔ３８６Ａ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号６０
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｅ（Ｇ７６Ｄ、Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｇ１５２Ｓ、Ｈ１６５Ｌ、Ｔ２１１Ｎ、Ｋ２５８Ｎ、Ｃ３０３Ｒ、Ｅ３０９Ｇ、Ｋ３３４Ｔ、Ｔ３８６Ａ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号６１
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｆ（Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｇ１５２Ｓ、Ｈ１６５Ｌ、Ｔ２１１Ｎ変種）アミノ酸配列

配列番号６２
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｆ（Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｇ１５２Ｓ、Ｈ１６５Ｌ、Ｔ２１１Ｎ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号６３
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｆ（Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｇ１５２Ｓ、Ｈ１６５Ｌ、Ｔ２１１Ｎ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号６４
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｇ（Ａ６Ｔ、Ａ１６Ｖ、Ｓ１７Ｐ、Ｇ７６Ｄ、Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｓ１４３Ｉ、Ｇ１５２Ｓ、Ａ１５７Ｔ、Ｈ１６５Ｌ、Ｔ２１１Ｎ、Ｇ４１４Ａ変種）アミノ酸配列

配列番号６５
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｇ（Ａ６Ｔ、Ａ１６Ｖ、Ｓ１７Ｐ、Ｇ７６Ｄ、Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｓ１４３Ｉ、Ｇ１５２Ｓ、Ａ１５７Ｔ、Ｈ１６５Ｌ、Ｔ２１１Ｎ、Ｇ４１４Ａ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号６６
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ２ｇ（Ａ６Ｔ、Ａ１６Ｖ、Ｓ１７Ｐ、Ｇ７６Ｄ、Ｒ９７Ｌ、Ｈ１２４Ｌ、Ｉ１３２Ｓ、Ｓ１４３Ｉ、Ｇ１５２Ｓ、Ａ１５７Ｔ、Ｈ１６５Ｌ、Ｔ２１１Ｎ、Ｇ４１４Ａ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号６７
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ３ａアミノ酸配列

配列番号６８
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ３ａコーディングＤＮＡ配列

配列番号６９
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ３ａコーディングＤＮＡ配列

配列番号７０
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ３ｂ（Ｃ６７Ｇ、Ｈ７２Ｑ、Ｌ１２８Ｆ、Ｎ１７９Ｉ変種）アミノ酸配列

配列番号７１
クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ３ｂ（Ｃ６７Ｇ、Ｈ７２Ｑ、Ｌ１２８Ｆ、Ｎ１７９Ｉ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号７２
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）（Ｃｈｔ）ＦＡＴＢ３ｂ（Ｃ６７Ｇ、Ｈ７２Ｑ、Ｌ１２８Ｆ、Ｎ１７９Ｉ変種）コーディングＤＮＡ配列

配列番号７３
クフェア・ビスコシッシマ（Ｃｕｐｈｅａｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）（Ｃｖｉｓ）ＦＡＴＢ１アミノ酸配列

配列番号７４
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ビスコシッシマ（Ｃｕｐｈｅａｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）（Ｃｖｉｓ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号７５
クフェア・ビスコシッシマ（Ｃｕｐｈｅａｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）（Ｃｖｉｓ）ＦＡＴＢ２アミノ酸配列

配列番号７６
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ビスコシッシマ（Ｃｕｐｈｅａｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）（Ｃｖｉｓ）ＦＡＴＢ２コーディングＤＮＡ配列

配列番号７７
クフェア・ビスコシッシマ（Ｃｕｐｈｅａｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）（Ｃｖｉｓ）ＦＡＴＢ３アミノ酸配列

配列番号７８
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ビスコシッシマ（Ｃｕｐｈｅａｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）（Ｃｖｉｓ）ＦＡＴＢ３コーディングＤＮＡ配列

配列番号７９
クフェア・カルカラータ（Ｃｕｐｈｅａｃａｌｃａｒａｔａ）（Ｃｃａｌｃ）ＦＡＴＢ１アミノ酸配列

配列番号８０
クフェア・カルカラータ（Ｃｕｐｈｅａｃａｌｃａｒａｔａ）（Ｃｃａｌｃ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号８１
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・カルカラータ（Ｃｕｐｈｅａｃａｌｃａｒａｔａ）（Ｃｃａｌｃ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号８２
クフェア・ペインテリ（Ｃｕｐｈｅａｐａｉｎｔｅｒｉ）（Ｃｐａｉ）ＦＡＴＢ１アミノ酸配列

配列番号８３
クフェア・ペインテリ（Ｃｕｐｈｅａｐａｉｎｔｅｒｉ）（Ｃｐａｉ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号８４
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・ペインテリ（Ｃｕｐｈｅａｐａｉｎｔｅｒｉ）（Ｃｐａｉ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号８５
クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）（Ｃｈｏｏｋ）ＦＡＴＢ４アミノ酸配列

配列番号８６
クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）（Ｃｈｏｏｋ）ＦＡＴＢ４コーディングＤＮＡ配列

配列番号８７
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）（Ｃｈｏｏｋ）ＦＡＴＢ４コーディングＤＮＡ配列

配列番号８８
クフェア・アビゲラ（Ｃｕｐｈｅａａｖｉｇｅｒａ）プルケリマ変種（ｖａｒ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（Ｃａ）ＦＡＴＢ１アミノ酸配列

配列番号８９
クフェア・アビゲラ（Ｃｕｐｈｅａａｖｉｇｅｒａ）プルケリマ変種（ｖａｒ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（Ｃａ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号９０
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・アビゲラ（Ｃｕｐｈｅａａｖｉｇｅｒａ）プルケリマ変種（ｖａｒ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（Ｃａ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号９１
クフェア・パウシペタラ（Ｃｕｐｈｅａｐａｕｃｉｐｅｔａｌａ）（Ｃｐａｕ）ＦＡＴＢ１アミノ酸配列

配列番号９２
クフェア・パウシペタラ（Ｃｕｐｈｅａｐａｕｃｉｐｅｔａｌａ）（Ｃｐａｕ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号９３
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・パウシペタラ（Ｃｕｐｈｅａｐａｕｃｉｐｅｔａｌａ）（Ｃｐａｕ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号９４
クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）（Ｃｐｒｏｃ）ＦＡＴＢ１アミノ酸配列

配列番号９５
クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）（Ｃｐｒｏｃ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号９６
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）（Ｃｐｒｏｃ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号９７
クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）（Ｃｐｒｏｃ）ＦＡＴＢ２アミノ酸配列

配列番号９８
クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）（Ｃｐｒｏｃ）ＦＡＴＢ２コーディングＤＮＡ配列

配列番号９９
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）（Ｃｐｒｏｃ）ＦＡＴＢ２コーディングＤＮＡ配列

配列番号１００
クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）（Ｃｐｒｏｃ）ＦＡＴＢ３アミノ酸配列

配列番号１０１
クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）（Ｃｐｒｏｃ）ＦＡＴＢ３コーディングＤＮＡ配列

配列番号１０２
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）（Ｃｐｒｏｃ）ＦＡＴＢ３コーディングＤＮＡ配列

配列番号１０３
クフェア・イグネア（Ｃｕｐｈｅａｉｇｎｅａ）（Ｃｉｇｎｅａ）ＦＡＴＢ１アミノ酸配列

配列番号１０４
クフェア・イグネア（Ｃｕｐｈｅａｉｇｎｅａ）（Ｃｉｇｎｅａ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号１０５
プロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）のためにコドン最適化されたクフェア・イグネア（Ｃｕｐｈｅａｉｇｎｅａ）（Ｃｉｇｎｅａ）ＦＡＴＢ１コーディングＤＮＡ配列

配列番号１０６
ＪｃＦａｔＢ１共通アミノ酸配列

配列番号１０７
プロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）のためにコドン最適化されたＪｃＦａｔＢ１コンセンサスＤＮＡ配列

配列番号１０８
ＪｃＦａｔＢ２共通アミノ酸配列

配列番号１０９
プロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）のためにコドン最適化されたＪｃＦＡＴＢ２コンセンサスＤＮＡ配列

配列番号１１０
ＣｕＰＳＲ２３ＦＡＴＢ３アミノ酸配列

配列番号１１１
ＣｕＰＳＲ２３ＦＡＴＢ３ｂアミノ酸配列

配列番号１１２
ＣｗＦＡＴＢ３アミノ酸配列：

配列番号１１３
ＣｗＦＡＴＢ３ａアミノ酸配列：

配列番号１１４
ＣｗＦＡＴＢ３ｂアミノ酸配列

配列番号１１５
ＣｗＦＡＴＢ３ｃアミノ酸配列

配列番号１１６
ＣｗＦＡＴＢ４ａアミノ酸配列

配列番号１１７
ＣｗＦＡＴＢ４ａ．１アミノ酸配列

配列番号１１８
ＣｗＦＡＴＢ４ａ．２アミノ酸配列：

配列番号１１９
ＣｗＦＡＴＢ４ａ．３アミノ酸配列

配列番号１２０
ＣｗＦＡＴＢ４ｂアミノ酸配列

配列番号１２１
ＣｗＦＡＴＢ４ｂ．１アミノ酸配列

配列番号１２２
ＣｗＦＡＴＢ５アミノ酸配列

配列番号１２３
ＣｗＦＡＴＢ５ａアミノ酸配列

配列番号１２４
ＣｗＦＡＴＢ５ｂアミノ酸配列

配列番号１２５
ＣｗＦＡＴＢ５ｃアミノ酸配列

配列番号１２６
ＣｗＦＡＴＢ５．１アミノ酸配列

配列番号１２７
ＣｗＦＡＴＢ５．１ａアミノ酸配列

配列番号１２８
ＣｃＦＡＴＢ２ｂアミノ酸配列

配列番号１２９
ＣｃＦＡＴＢ３アミノ酸配列

配列番号１３０
ＣｃＦＡＴＢ３ｂアミノ酸配列

配列番号１３１
ＣｃＦＡＴＢ３ｃアミノ酸配列

配列番号１３２
ＣｈｔＦＡＴＢ１ａアミノ酸配列

配列番号１３３
ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ．１アミノ酸配列

配列番号１３４
ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ．２アミノ酸配列

配列番号１３５
ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ．３アミノ酸配列

配列番号１３６
ＣｈｔＦＡＴＢ１ａ．４アミノ酸配列

配列番号１３７
ＣｈｔＦＡＴＢ１ｂアミノ酸配列

配列番号１３８
ＣｈｔＦＡＴＢ２ｂアミノ酸配列

配列番号１３９
ＣｈｔＦＡＴＢ２ａアミノ酸配列

配列番号１４０
ＣｈｔＦＡＴＢ２ｃアミノ酸配列

配列番号１４１
ＣｈｔＦＡＴＢ２ｄアミノ酸配列

配列番号１４２
ＣｈｔＦＡＴＢ２ｅアミノ酸配列

配列番号１４３
ＣｈｔＦＡＴＢ２ｆアミノ酸配列

配列番号１４４
ＣｈｔＦＡＴＢ２ｇアミノ酸配列

配列番号１４５
ＣｈｔＦＡＴＢ２ｈアミノ酸配列

配列番号１４６
ＣｈｔＦＡＴＢ３ａアミノ酸配列

配列番号１４７
ＣｈｔＦＡＴＢ３ｂアミノ酸配列

配列番号１４８
ＣｈｔＦＡＴＢ３ｃアミノ酸配列

配列番号１４９
ＣｈｔＦＡＴＢ３ｄアミノ酸配列

配列番号１５０
ＣｈｔＦＡＴＢ３ｅアミノ酸配列

配列番号１５１
ＣｈｔＦＡＴＢ３ｆアミノ酸配列

配列番号１５２
ＣｈｔＦＡＴＢ３ｇアミノ酸配列

配列番号１５３
ＣｈｓＦＡＴＢ１アミノ酸配列

配列番号１５４
ＣｈｓＦＡＴＢ２アミノ酸配列

配列番号１５５
ＣｈｓＦａｔＢ２ｂアミノ酸配列

配列番号１５６
ＣｈｓＦａｔＢ２ｃアミノ酸配列

配列番号１５７
ＣｈｓＦａｔＢ２ｄアミノ酸配列

配列番号１５８
ＣｈｓＦＡＴＢ３アミノ酸配列

配列番号１５９
ＣｈｓＦａｔｂ３ｂアミノ酸配列

配列番号１６０
ＣｈｓＦａｔＢ３ｃアミノ酸配列

配列番号１６１
ＣｈｓＦＡＴＢ３ｄアミノ酸配列

配列番号１６２
ＣｈｓＦＡＴＢ３ｅアミノ酸配列

配列番号１６３
ＣｈｓＦＡＴＢ３ｆアミノ酸配列

配列番号１６４
ＣｈｓＦＡＴＢ３ｇアミノ酸配列

配列番号１６５
ＣｈｓＦＡＴＢ３ｈアミノ酸配列

配列番号１６６
ＣｈｓＦＡＴＢ３ｉアミノ酸配列

配列番号１６７
ＣｈｓＦＡＴＢ３ｊアミノ酸配列

配列番号１６８
ＣｃａｌｃＦＡＴＢ１（クフェア・カルカラータ（Ｃｕｐｈｅａｃａｌｃａｒａｔａ）ＦＡＴＢ１）

配列番号１６９
ＣｈｏｏｋＦＡＴＢ４（クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）ＦＡＴＢ４）

配列番号１７０
ＣａＦＡＴＢ１（クフェア・アビゲラ（Ｃｕｐｈｅａａｖｉｇｅｒａ）プルケリマ変種（ｖａｒ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）ＦＡＴＢ１）

配列番号１７１
ＣｐａｕＦＡＴＢ１（クフェア・パウシペタラ（Ｃｕｐｈｅａｐａｕｃｉｐｅｔａｌａ）ＦＡＴＢ１）

配列番号１７２
ＣｐｒｏｃＦＡＴＢ１（クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）ＦＡＴＢ１）

配列番号１７３
ＣｐｒｏｃＦＡＴＢ２（クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）ＦＡＴＢ２）

配列番号１７４
ＣｐｒｏｃＦＡＴＢ３（クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）ＦＡＴＢ３）

配列番号１７５
ＣｉｇｎｅａＦＡＴＢ１（クフェア・イグネア（Ｃｕｐｈｅａｉｇｎｅａ）ＦＡＴＢ１）

配列番号１７６
ＣｃａｌｃＦＡＴＢ１（クフェア・カルカラータ（Ｃｕｐｈｅａｃａｌｃａｒａｔａ）ＦＡＴＢ１）

配列番号１７７
ＣｈｏｏｋＦＡＴＢ４（クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）ＦＡＴＢ４）

配列番号１７８
ＣａＦＡＴＢ１（クフェア・アビゲラ（Ｃｕｐｈｅａａｖｉｇｅｒａ）プルケリマ変種（ｖａｒ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）ＦＡＴＢ１）

配列番号１７９
ＣｐａｕＦＡＴＢ１（クフェア・パウシペタラ（Ｃｕｐｈｅａｐａｕｃｉｐｅｔａｌａ）ＦＡＴＢ１）

配列番号１８０
ＣｐｒｏｃＦＡＴＢ１（クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）ＦＡＴＢ１）

配列番号１８１
ＣｐｒｏｃＦＡＴＢ２（クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）ＦＡＴＢ２）

配列番号１８２
ＣｐｒｏｃＦＡＴＢ３（クフェア・プロクンベンス（Ｃｕｐｈｅａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）ＦＡＴＢ３）

配列番号１８３
ＣｉｇｎｅａＦＡＴＢ１（クフェア・イグネア（Ｃｕｐｈｅａｉｇｎｅａ）ＦＡＴＢ１）

配列番号１８４
ＣｇＦＡＴＢ１（クフェア・グロッソストマ（Ｃｕｐｈｅａｇｌｏｓｓｏｓｔｏｍａ）ＦＡＴＢ１）＿

配列番号１８５
ＣｇＦＡＴＢ１ｂ（クフェア・グロッソストマ（Ｃｕｐｈｅａｇｌｏｓｓｏｓｔｏｍａ）ＦＡＴＢ１Ｃ１７０Ｆ，Ｍ１９８Ｔ，Ｔ３７４Ｓ変種）

配列番号１８６
ウンベルラリア・カリホルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＵｃＦＡＴＢ３アミノ酸配列

配列番号１８７
クフェア・カルタゲネンシス（Ｃｕｐｈｅａｃａｒｔｈａｇｅｎｅｎｓｉｓ）ＣＣｒＦＡＴＢ２ｃ（ＦＡＴＢ２のＶ１３８Ｌ変種）

配列番号１８８
クフェア・カルタゲネンシス（Ｃｕｐｈｅａｃａｒｔｈａｇｅｎｅｎｓｉｓ）ＣＣｒＦＡＴＢ２

配列番号１８９
ＣｃｒＦＡＴＢ２ｂ

配列番号１９０
ＣｃｒＦＡＴＢ１

配列番号１９１
ＣｃｒＦＡＴＢ１ｂ

配列番号１９２
ＣＣｒＦＡＴＢ１ｃ

Claims

調節因子と、核酸コンストラクトを発現する細胞によって生成される油中に改変脂肪酸プロファイルを生じるように作動可能な活性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現するＦａｔＢ遺伝子とを含んでなる核酸コンストラクトであって、前記ＦａｔＢ遺伝子が表１ａの分岐群５に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が配列番号８８、８２、８５、および１０３のそれぞれと少なくとも９４．６％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ８およびＣ１０脂肪酸に富む、核酸コンストラクト。
調節因子と、核酸コンストラクトを発現する細胞によって生成される油中に改変脂肪酸プロファイルを生じるように作動可能な活性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現するＦａｔＢ遺伝子とを含んでなる核酸コンストラクトであって、前記ＦａｔＢ遺伝子が表１ａの分岐群１〜１２の１つに含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する、核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群１に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号１９、１６１、２２、および１６０のそれぞれと少なくとも８５．９％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１４およびＣ１６脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群２に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号１３４〜１３６、１３２、１３３、１３７、１２４、１２２、１２３、１２５のそれぞれと少なくとも８９．５％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１２およびＣ１４脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群３に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号１２６および１２７のそれぞれと少なくとも９２．５％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１２およびＣ１４脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群４に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号７９と少なくとも８３．８％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１２およびＣ１４脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群６に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号１１１および１１０のそれぞれと少なくとも９９．９％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１０脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群７に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号７３、１０６、１８５、１７２、１７１、１７３、１７４のそれぞれと少なくとも８９．５％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１０およびＣ１２脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群８に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号１１２、１１３、１４２、１４５、１４３、１４４、１３９、１４０、１３８、１４１のそれぞれと少なくとも８５．９％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１２およびＣ１４脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群９に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号１８７〜１８９のそれぞれと少なくとも８３．８％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１２およびＣ１４脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群１０に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号１４７、１４９、１４６、１５０、１５２、１５１、１４８、１５４、１５６、１５５、１５７、１０８、７５、１９０、１９１、および１９２のそれぞれと少なくとも９５．９％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１４およびＣ１６脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群１１に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号１２１と少なくとも８８．７％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１４およびＣ１６脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
前記ＦａｔＢ遺伝子が、表１ａの分岐群１２に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、前記配列が、配列番号１２９および１８６のそれぞれと少なくとも７２．８％の配列同一性を有し、任意選択的に前記油の前記脂肪酸がＣ１６脂肪酸に富む、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５３、５４、５６、５７、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７６、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０９のいずれかと、または遺伝コード縮重のために同等である配列のいずれかと、少なくとも７０％の配列同一性を有する、単離核酸、または核酸を含んでなる組換えＤＮＡコンストラクト。
配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７５、７７、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０８、１１０〜１９２のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するタンパク質またはアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するその断片をコードする単離核酸配列、またはそれを発現する宿主細胞。
前記タンパク質が、その配列を含んでなる組換え細胞によって生成される油の脂肪酸プロファイルを改変するように作動可能な、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する、請求項１５の単離核酸。
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸で細胞を形質転換するステップを含んでなる、改変脂肪酸プロファイルを生成する組換え細胞を作成する方法。
請求項１７に記載の方法によって作成される、宿主細胞。
植物細胞、微生物細胞、および微細藻類細胞から選択される、請求項１８に記載の宿主細胞。
請求項５または６に記載の宿主細胞を培養するステップと、それによって生成する油を抽出するステップとを含んでなり、任意選択的に前記培養が糖の上の従属栄養培養である、油または油由来製品を製造する方法。
前記油から、脂肪酸、燃料、化学物質、またはその他の油由来製品を製造するステップをさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
任意選択的に、少なくとも２０％のＣ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４またはＣ１６脂肪酸を含んでなる脂肪酸プロファイルを有する、請求項２０に記載の方法によって製造される油。
請求項２１に記載の方法によって製造される、油由来製品。
微細藻類によって生成され、任意選択的にＣ２４−αステロールを欠く、請求項２３に記載の油。