ES2795842T3 - Producción mejorada de ácidos grasos y derivados de ácidos grasos por microorganismos recombinantes - Google Patents

Producción mejorada de ácidos grasos y derivados de ácidos grasos por microorganismos recombinantes Download PDF

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Abstract

Una cianobacteria recombinante transformada con una secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una acil-ACP tioesterasa procedente de una planta superior, unida operativamente a un promotor heterólogo y una secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT) procedente de una cianobacteria unida operativamente a un promotor heterólogo, en donde la cianobacteria produce al menos un ácido graso libre o al menos un derivado de ácido graso, y en donde la LPAAT tiene una identidad de al menos 85 % con la SEQ ID NO: 2, y la tioesterasa tiene una identidad de al menos 85 % con la SEQ ID NO: 44.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción mejorada de ácidos grasos y derivados de ácidos grasos por microorganismos recombinantes REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS
Esta solicitud contiene referencias a secuencias de aminoácidos y/o a secuencias de ácidos nucleicos que se han presentado simultáneamente con el presente documento como archivo de texto de listado de secuencias "60930641_1.txt", con un tamaño de archivo de 126 kilobytes (kb), creado el 24 de febrero de 2012.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a los campos de bioingeniería, bioquímica metabólica y biología molecular. En particular, la invención se refiere a la producción de productos de ácidos grasos en un microorganismo recombinante o célula hospedadora genomodificada para reducir o minimizar la inhibición por retroalimentación de enzimas de la síntesis de ácidos grasos y a métodos de producción de productos de ácidos grasos utilizando dichos microorganismos recombinantes o células hospedadoras.
Antecedentes de la invención
La producción de fuentes renovables para una variedad de combustibles y productos químicos es de gran importancia en un mundo con una creciente demanda de dichos productos. Mientras que el petróleo es un producto de plantas en descomposición y otras materias que se ha incubado balo la superficie terrestre durante millones de años, algunos esfuerzos actuales se centran en el uso directo de plantas y otros organismos para generar, por ejemplo, lípidos, entre los que se puede incluir ácidos grasos y sus derivados, para uso en las industrias de combustible y química. Los ácidos grasos están compuestos por cadenas de alquilo largas, similar al petróleo, y son un metabolito primario utilizado por las células para las funciones de almacenamiento químico y energético. La mejora de la adaptabilidad, controlabilidad y rentabilidad de la producción de ácidos grasos y derivados de ácidos grasos (en conjunto "productos de ácidos grasos") sería beneficiosa para el desarrollo de energía renovable y fuentes químicas.
La síntesis de ácidos grasos en una célula es un ciclo repetitivo en donde la proteína transportadora de acilo y malonilo (malonil-ACP, por las siglas del inglés malonyl-acyl carrier protein) se condensa con un sustrato de carbono para formar una cadena creciente de acil-ACP. La producción de ácidos grasos por cianobacterias genomodificadas se ha descrito en la publicación de solicitud de Estados Unidos N.° 2009/0298143, que desvela la introducción de un gen no originario que codifica una acil-ACP tioesterasa grasa para liberar ácidos grasos de la ACP. Sin embargo, como sucede con muchos procesos celulares, la inhibición por retroalimentación mediante productos intermedios y/o diversos productos finales puede limitar la producción de ácidos grasos. Por ejemplo, la inhibición por retroalimentación de enzimas clave de la síntesis de ácidos grasos, tales como ACCasa, FabH y FabI, está mediada por acil-ACP de cadena media a larga. Véase Handke et al., Metabolic Eng. 13:28-37 (2011); Figura 1 (línea discontinua).
Sumario de la invención
La presente invención describe modificaciones genéticas adicionales para mejorar los rendimientos de productos de ácido graso en una cianobacteria recombinante genomodificada para que exprese un gen no originario que codifique una tioesterasa. Dichas modificaciones incluyen la expresión de un gen adicional no originario codificante de la ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT, por las siglas del inglés lysophosphatidic acid acyltransferase), que utiliza sustratos de acil-ACP o acil-CoA para acilar el grupo hidroxilo sn-2 del ácido lisofosfatídico para formar ácido fosfatídico, un precursor de los lípidos de membrana. La LPAAT tiene, preferentemente, una preferencia de sustrato de longitud de cadena acilo diferente de la preferencia de sustrato de longitud de cadena acilo de la tioesterasa producida por la expresión de un gen no originario por el microorganismo recombinante. Modificaciones adicionales del microorganismo hospedador pueden incluir opcionalmente la atenuación de un gen de acil-ACP sintetasa o de un gen de acil-CoA sintetasa, que participa en el reciclaje y la degradación, respectivamente, de ácidos grasos, y/o la sobreexpresión de uno o más polipéptidos que tienen actividad lipolítica (por ejemplo, lipasas) que pueden liberar ácidos grasos de los lípidos (véase, por ejemplo, la Figura 1).
En un aspecto, la invención proporciona una cianobacteria recombinante transformada con una secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una acil-ACP tioesterasa procedente de una planta superior unida operativamente a un promotor heterólogo y una secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT) derivada de una cianobacteria unida operativamente a un promotor heterólogo, en donde la cianobacteria produce al menos un ácido graso libre o al menos un derivado de ácido graso, y en donde la LPAAT tiene una identidad de al menos 85 % con la SEQ ID NO: 2, y la tioesterasa tiene una identidad de al menos 85 % con la SEQ ID NO: 44. Un producto de ácido graso puede ser, por ejemplo, un ácido grado libre, un aldehído graso, un alcohol graso, un éster de ácido graso, un éster de cera, un alcano o un alqueno.
La cianobacteria recombinante, que incluye un gen de tioesterasa no originario, incluye además una molécula de ácido nucleico no originario que incluye una secuencia que codifica una LPAAT, en donde la secuencia que codifica la LPAAT puede ser homóloga (originaria de la misma especie) o heteróloga (originaria de una especie diferente) con respecto a la cianobacteria hospedadora. Por ejemplo, un gen de LPAAT no originario de la misma especie o de una especie diferente, unido operativamente a un promotor heterólogo, puede introducirse en la cianobacteria hospedadora, o de manera alternativa, se puede introducir un gen de LPAAT homólogo o heterólogo en la cianobacteria hospedadora de tal manera que el gen de LPAAT se recombine en el genoma hospedador y se una operativamente a un promotor que sea endógeno al hospedador. Además, de manera alternativa, una cianobacteria recombinante, que incluye un gen de LPAAT no originario, puede comprender un gen de LPAAT endógeno que reside en el genoma de la cianobacteria hospedadora unido operativamente a un promotor heterólogo introducido en la cianobacteria e integrado en el genoma, por ejemplo, por recombinación homóloga. Una molécula de ácido nucleico no originario que incluye un gen de LPAAT en una cianobacteria proporcionada en el presente documento procede de una cianobacteria.
La cianobacteria recombinante comprende al menos un gen de LPAAT no originario y al menos un gen de tioesterasa no originario que puede escindir un sustrato de acil tioéster, en el que la LPAAT y la tioesterasa tienen, preferentemente, diferentes especificidades de sustrato de longitud de cadena de acilo. Por ejemplo, la cianobacteria recombinante puede incluir una molécula de ácido nucleico no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato por uno o más sustratos de acilo de cadena larga (por ejemplo, acil-ACP o acil-CoA C16 y/o C18) y un gen no originario que codifique un tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato por uno o más sustratos de acilo de cadena media (por ejemplo, sustratos de acil-ACP de C8, C10, C12 y/o C14). De manera alternativa, la cianobacteria recombinante puede incluir una molécula de ácido nucleico no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato por uno o más sustratos de acilo de cadena media (por ejemplo, sustratos de acil-ACP de C8, C10, C12 y/o C14) y un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato por uno o más sustratos de acilo de cadena larga (por ejemplo, acil-ACP o acil-CoA de C16 y/o C18). En otro ejemplo, la cianobacteria recombinante puede incluir un gen no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo C16 (por ejemplo, acil-ACP de C16 y/o acil-CoA de C16) y un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato por uno o más de un sustrato de acilo de C8, C10, C12 o C14 (por ejemplo, acil-ACP de C8, C10, C12 y/o C14). De manera alternativa, la cianobacteria recombinante puede incluir un gen no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato por sustratos de acilo de C18 (por ejemplo, acil-ACP de C18 y/o acil-CoA de C18) y un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato por uno o más de un sustrato de acilo de C8, C10, C12, C14 o C16 (por ejemplo, acil-ACP de C8, C10, C12, C14 y/o C16). En otros ejemplos no limitantes, una cianobacteria recombinante puede incluir un gen no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo de C18 y un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo de C16; una cianobacteria recombinante puede incluir un gen no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo de C18 y un gen no originario que codifique un gen de tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato por sustratos de acilo de C14 y C16; o una cianobacteria recombinante puede incluir un gen no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo de C18 y un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato por sustratos de acilo de C12, C14 y C16. En ejemplos adicionales, una cianobacteria puede incluir un gen no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo de C16 y un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo de C14; una cianobacteria puede incluir un gen no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo de C16 y un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo de C12, y una cianobacteria puede incluir un gen no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo de C16 y un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato por sustratos de acilo de C12 y C14.
Una cianobacteria recombinante incluye una molécula de ácido nucleico no originario que es al menos 85 %, por ejemplo, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o aproximadamente 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.
El promotor heterólogo puede ser un promotor regulable, y opcionalmente puede ser un promotor inducible. Por ejemplo, el promotor puede inducirse con luz, temperatura, o con adición o eliminación de un compuesto a los medios de crecimiento, tal como, por ejemplo, un azúcar o análogo de azúcar, una hormona, una sal, un metal, etc. En ejemplos particulares, una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen de tioesterasa que expresa una cianobacteria recombinante, está unida operativamente a un promotor heterólogo que puede ser, por ejemplo, regulable, y opcionalmente puede ser inducible. Además, una secuencia de ácido nucleico que codifica LPAAT y una secuencia de ácido nucleico que codifica tioesterasa pueden unirse operativamente a diferentes copias del mismo promotor, o a diferentes promotores regulados por la misma o diferentes condiciones o el mismo o diferentes compuestos. De manera alternativa, una secuencia de ácido nucleico que codifica LPAAT y una secuencia de ácido nucleico que codifica tioesterasa pueden unirse operativamente al mismo promotor, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica LPAAT y la secuencia que codifica tioesterasa se pueden organizar como un operón.
Además, una cianobacteria recombinante puede comprender opcionalmente además un gen de acil-ACP sintetasa o un gen de acil-CoA sintetasa atenuado o alterado. Por ejemplo, el gen endógeno de acil-ACP sintetasa o el gen de acil-CoA sintetasa puede ser una diana del ARN antisentido, de uno o más micro ARN, de un ARNip (p. ej., generado por una construcción de ARNhc) o de una o más ribozimas, para reducir la expresión del gen de la acil-ACP sintetasa o del gen de la acil-CoA sintetasa. De manera alternativa, el gen endógeno de acil-ACP sintetasa o el gen de acil-CoA sintetasa puede interrumpirse, truncarse o delecionarse, por ejemplo, por mutagénesis insercional, modificación del genoma de meganucleasas y/o recombinación homóloga.
La cianobacteria recombinante que incluye un gen de LPAAT no originario y un gen de tioesterasa no originario, puede incluir opcionalmente además un gen no originario que codifique un polipéptido que tenga actividad lipolítica, que puede ser, por ejemplo, una lipasa, una esterasa, una cutinasa o una amidasa. Adicionalmente, o de manera alternativa, la cianobacteria recombinante puede tener un gen atenuado que codifique una acil-ACP sintetasa, una acil-CoA sintetasa o una acil-CoA oxidasa.
Además adicionalmente o de manera alternativa, una cianobacteria recombinante que incluye un gen de LPAAT no originario y un gen de tioesterasa no originario puede incluir adicionalmente opcionalmente además uno o más genes no originarios que codifiquen enzimas para producir derivados de ácidos grasos tales como aldehídos grasos, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, ésteres de cera, alcanos y alquenos. Son ejemplos no limitativos de dichas enzimas las acil-ACP reductasas formadoras de aldehído, las acil-CoA reductasas formadoras de aldehído, las ácido carboxílico reductasas, las ácido graso reductasas formadoras de aldehído, las acil-ACP reductasas formadoras de alcohol, las acil-CoA reductasas formadoras de alcohol, las aciltransferasas, las sintasas de cera, las aldehído graso descarbonilasas y ácido graso descarboxilasas.
La cianobacteria recombinante que incluye un gen de LPAAT no originario y un gen de tioesterasa no originario, puede producir al menos 10 % más de un producto de ácido graso que una cianobacteria idéntica en todos los aspectos, excepto que carece de una molécula de ácido nucleico no originario que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una LPAAT. Por ejemplo, una cianobacteria recombinante puede producir al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 %, al menos 200 %, al menos 400 %, al menos 600 %, al menos 800 % o al menos 1000 % más que la cantidad del producto de ácido graso producido por una cianobacteria de otra manera idéntica que no incluye la molécula de ácido nucleico no originario que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una LPAAT cultivada en las mismas condiciones.
La cianobacteria recombinante puede ser una cianobacteria, por ejemplo, de los siguientes géneros Agmenellum, Anabaena, Anabaenopsis, Anacystis, Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Dactylococcopsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitlerinema, Gloeobacter, Gloeocapsa, Gloeothece, Halospirulina, Iyengariella, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Pleurocapsa, Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudanabaena, Rivularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina, Stanieria, Starria, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Tolypothrix, Trichodesmium, Tychonema o Xenococcus.
En el presente documento también se proporcionan métodos para producir un producto de ácido graso, en donde el método incluye cultivar cualquiera de las cianobacterias recombinantes de la invención en condiciones en las que se produzca al menos un producto de ácido graso. El al menos un producto de ácido graso es uno o más de un ácido graso libre, un aldehído graso, un alcohol graso, un éster de ácido graso, un éster de cera, o un hidrocarburo, y en donde el producto de ácido graso se secreta en el medio. En algunos ejemplos, la cianobacteria recombinante produce al menos un ácido graso libre de Cs a C24, tal como al menos un ácido graso libre de C12 a C18, tal como, por ejemplo, ácido graso libre de C12 a C16. De manera alternativa o además, el ácido graso o derivado de ácido graso producido usando los métodos proporcionados en el presente documento, comprende al menos un alcohol graso o aldehído graso de Cs a C24, tal como al menos un alcohol graso o aldehído graso de C12 a C18, tal como un alcohol graso o aldehído graso de C12 a C16; o al menos un éster de cera que tiene una cadena A de Cs a C24 o de C12 a C18 o, por ejemplo, una cadena A de C12 a C16 y una cadena B de Cs a C24 o de C12 a C18 o, por ejemplo, una cadena B de C12 a C16; o al menos un alcano o alqueno de C11 a C23, tal como un alcano o alqueno de C11 a C15. El método puede incluir además aislar un producto de ácido graso de la cianobacteria, del medio de cultivo, o de una combinación de los mismos. Además, la cianobacteria recombinante puede secretar al menos una parte del producto de ácido graso en el medio de cultivo, y opcionalmente toda o una parte del producto secretado puede aislarse del medio de cultivo.
En diversos métodos, la cantidad de producto de ácido graso que produce la cianobacteria recombinante puede ser al menos 10 % mayor, al menos 20 % mayor, al menos 30 % mayor, al menos 40 % mayor, al menos 50 % mayor, al menos 60 % mayor, al menos 70 % mayor, al menos 80 % mayor, al menos 90 % mayor o al menos 100 % mayor, que la cantidad que produce una cianobacteria de otra manera idéntica que carece de la secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una LPAAT que se cultiva en las mismas condiciones.
Además se desvela un producto de ácido graso producido utilizando los métodos de la invención. El producto de ácido graso puede ser, por ejemplo, un ácido graso, un alcohol graso, un aldehído graso, un alcano, un alqueno, un éster de ácido graso o un éster de cera. El producto de ácido graso puede tener al menos una cadena de carbono que tenga una longitud de C7 a C24 y en algunas realizaciones preferidas, el producto de ácido graso incluye uno o más ácidos grasos libres, aldehídos grasos, alcoholes grasos, alcanos o alquenos que tienen longitudes de cadena de C12 a C18, por ejemplo, longitudes de cadena de C12 a C16, o uno o más ésteres de ácidos grasos que tienen una o tanto una cadena A como una cadena B de C8 a C24 o de C12 a C18, por ejemplo, de C12 a C16. Por ejemplo, un éster de cera producido usando los métodos proporcionados en el presente documento puede tener una cadena A y B de C8 a C24 o de C12 a C18, o en algunos ejemplos, de C12 a C16.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una diagrama que muestra modificaciones genéticas propuestas para aliviar la inhibición por retroalimentación de la biosíntesis de ácidos grasos al reducir el conjunto de ACP-C18. Las abreviaturas son FFA (free fatty acid): ácido grasos libre, AAS: acil-ACP sintasa, Cc1FatB1: acil-ACP tioesterasa de Cuphea carthagenensis con una preferencia de sustrato de C12, C14 y C16 y LPAAT Sll1752 C18:0 de Synechocystis sp.
6803 con una preferencia de sustrato de acilo de C18.
La Figura 2 es una representación esquemática de un ejemplo de un vector de integración que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una LPAAT (sll1752).
La Figura 3 es una representación esquemática de un ejemplo de un vector de integración que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil-ACP tioesterasa (Cc1FatB1).
La Figura 4 es una representación esquemática de un ejemplo de un vector para alterar un gen que codifica una acil-ACP sintetasa (slr1609).
La Figura 5 es un gráfico que muestra la producción total no normalizada de ácidos grasos libres (pg/ml) de cepas de Synechocystis sp. 6803 que comprenden (de izquierda a derecha) el gen de acil-ACP tioesterasa de Cc1FatB1 (Control 1A), el gen de sll1752 recombinante que codifica una LPAAT C18:0 (sll1752), un gen de acil-ACP sintetasa atenuado (AASKO), seguido de tres clones distintos (Parche 3, Parche 5, Parche 6) que contienen el gen de acil-ACP tioesterasa de Cc1FatB1 en combinación con el gen de sll1752 inducible (1A/sll1752), y finalmente el gen de LPAAT sll1752 en combinación con el gen de acil-ACP sintetasa atenuado (AASKO).
La Figura 6 es una tabla que proporciona las cantidades (pg/ml) de ácidos grasos libres de longitudes de cadena particulares y el grado de saturación producido por cepas de Synechocystis sp. PCC 6803 que comprenden el gen de acil-ACP tioesterasa de Cc1FatB1 (Control 1A), el gen de sll1752 recombinante que codifica una LPAAT C18: 0 (sll1752), un gen de acil-ACP sintetasa atenuado (AASKO), tres clones distintos (Clon 3, Clon 5, Clon 6) que contienen el gen de acil-ACP tioesterasa de Cc1FatB1, así como el gen de sll1752 recombinante (1A/sll1752) y el gen de sll1752 recombinante en combinación con el gen de acil-ACP sintetasa atenuado (sll1752/AASKO).
Descripción detallada de la invención
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. En caso de conflicto, regirá la presente solicitud, incluidas las definiciones. A no ser que el contexto requiera otra cosa, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Aunque en la práctica o el ensayo de la presente invención, pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán obvias a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se define una serie de términos y expresiones. Como se usa en la presente divulgación y en las reivindicaciones, las formas en singular "un", "uno", "una", "el" y "la", incluyen formas en plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.
Dondequiera que en el presente documento se describan realizaciones con la expresión "que comprende" también se proporcionan realizaciones análogas descritas de otra manera en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
La expresión "y/o" como se utiliza en una frase tal como "A y/o B" del presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" y "B".
El término "gen" se usa de manera generalizada para referirse a cualquier segmento de molécula de ácido nucleico (normalmente ADN, aunque opcionalmente ARN) que codifica una proteína o ARN expresado. Por tanto, los genes incluyen secuencias que codifican ARN expresado (que puede incluir secuencias codificantes de polipéptidos). Los genes pueden comprender además las secuencias reguladoras necesarias para su expresión. Los genes pueden obtenerse de una variedad de fuentes, incluida la clonación de una fuente de interés o la síntesis a partir de información de secuencia conocida o prevista, y puede incluir secuencias diseñadas para que tengan parámetros deseados.
La expresión "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a, por ejemplo, ADN o ARN (por ejemplo, ARNm). Las moléculas de ácido nucleico pueden ser bicatenarias o monocatenarias, el ARN o ADN monocatenario puede ser la cadena codificante (sentido) o la cadena no codificante (antisentido).
Una molécula de ácido nucleico puede "proceder de" una fuente indicada, que incluye el aislamiento (total o parcial) de un segmento de ácido nucleico de una fuente indicada o la purificación de un polipéptido de una fuente indicada. Una molécula de ácido nucleico también puede proceder de una fuente indicada, por ejemplo, mediante clonación directa, amplificación por PCR o síntesis artificial a partir de la fuente de polinucleótidos indicada o basada en una secuencia asociada a la fuente de polinucleótidos indicada. Los genes o las moléculas de ácido nucleico procedentes de una fuente o especie particular también incluyen genes o moléculas de ácido nucleico que tienen modificaciones de secuencia con respecto a las moléculas de ácido nucleico fuente. Por ejemplo, un gen o una molécula de ácido nucleico procedente de una fuente (por ejemplo, un gen de referencia particular) puede generar una o más mutaciones con respecto al gen o a la molécula de ácido nucleico fuente que no son intencionadas o que se introducen deliberadamente, y si una o más mutaciones, incluyendo sustituciones, deleciones o inserciones, se introducen deliberadamente, las alteraciones de secuencia se pueden introducir mediante mutación aleatoria o dirigida de células o ácidos nucleicos, por amplificación u otras técnicas de biología molecular, o por síntesis química. Un gen o una molécula de ácido nucleico que procede de un gen o de una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un ARN o polipéptido funcional puede codificar un ARN o polipéptido funcional que tenga una identidad de secuencia de al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98% o al menos 99 % con el ARN o polipéptido funcional de referencia o fuente, o con un fragmento funcional del mismo. Por ejemplo, un gen o una molécula de ácido nucleico que procede de un gen o de una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un ARN o polipéptido funcional puede codificar un ARN o polipéptido funcional que tenga una identidad de secuencia de al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % con el ARN o polipéptido funcional de referencia o fuente, o con un fragmento funcional del mismo.
Como se usa en el presente documento, un ácido nucleico "aislado" o una proteína "aislada" se elimina de su medio natural o del contexto en el que el ácido nucleico o la proteína existe en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína o molécula de ácido nucleico aislada se elimina de la célula u organismo con el que está asociado en su entorno originario o natural. Un ácido nucleico aislado o una proteína aislada puede estar, en algunos casos, parcial o sustancialmente purificado(a), pero no se requiere un nivel particular de purificación para el aislamiento. Por tanto, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada puede ser una secuencia de ácido nucleico que se ha escindido del cromosoma, genoma o episoma en el que está integrado en la naturaleza.
Una molécula de ácido nucleico o secuencia de nucleótidos o proteína o secuencia polipeptídica "purificada", carece sustancialmente de material celular y de componentes celulares. La molécula de ácido nucleico o proteína purificada puede carecer de productos químicos además de tampón o disolvente, por ejemplo. "Carece sustancialmente" no pretende significar que otros componentes, además de las nuevas moléculas de ácido nucleico, sean indetectables. En algunas circunstancias, "carece sustancialmente" puede significar que la molécula de ácido nucleico o la secuencia de nucleótidos está carece de al menos 95 % (p/p) de material y componentes celulares.
Las expresiones "origen natural" y "tipo silvestre" se refieren a una forma que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico, una secuencia de nucleótidos o una proteína de origen natural o de tipo silvestre, pueden estar presentes y aisladas de una fuente natural, y no se modifican intencionalmente mediante manipulación humana.
Como se usa en el presente documento, "atenuado" significa reducido en cantidad, grado, intensidad o fuerza. La expresión génica atenuada puede referirse a una cantidad y/o tasa de transcripción significativamente reducida del gen en cuestión, o de la traducción, plegamiento o ensamblaje de la proteína codificada. Como ejemplos no limitantes, un gen atenuado puede ser un gen mutado o alterado (por ejemplo, un gen alterado por deleción parcial o total, o por mutación insercional) o que tiene una expresión disminuida debido a la alteración de secuencias reguladoras de genes.
La expresión "molécula de ácido nucleico exógeno" o "gen exógeno" se refiere a una molécula de ácido nucleico o a un gen que se ha introducido ("transformado") en una célula. Una célula transformada puede referirse a una célula recombinante, en la pueden introducirse uno o más genes exógenos adicionales. Un descendiente de una célula transformada con una molécula de ácido nucleico también puede referirse a "transformado" si ha heredado la molécula de ácido nucleico exógeno. El gen exógeno puede ser de una especie diferente (y por tanto "heterólogo") o puede ser de la misma especie (y por tanto "homólogo"), en relación con la célula que se transforma. Una molécula de ácido nucleico, un gen o una proteína "endógeno(a)", es una molécula de ácido nucleico, un gen o una proteína originario(a) tal como aparece en el hospedador o como lo produce de manera natural dicho hospedador.
En el presente documento, el término "originario(a)" se usa para referirse a secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos tal como se producen de manera natural en el hospedador. En el presente documento el término "no originario" se usa para referirse a secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos que no se producen de manera natural en el hospedador. Una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos que se ha eliminado de una célula hospedadora, sometido a manipulación en el laboratorio e introducido o reintroducido en una célula hospedadora, se considera "no originaria". Los genes sintéticos o parcialmente sintéticos introducidos en una célula hospedadora son "no originarios". Los genes no originarios incluyen además genes endógenos al microorganismo hospedador unidos operativamente a una o más secuencias reguladoras heterólogas que se han recombinado en el genoma del hospedador.
Una molécula de ácido nucleico "recombinante" o "genomodificada" es una molécula de ácido nucleico que se ha alterado a través de manipulación humana. Como ejemplos no limitantes, una molécula de ácido nucleico recombinante que: 1) se ha sintetizado o modificado in vitro, por ejemplo, utilizando técnicas químicas o enzimáticas (por ejemplo, mediante el uso de síntesis química de ácidos nucleicos, o mediante el uso de enzimas para la replicación, polimerización, digestión (exonucleolítica o endonucleolítica), ligamiento, transcripción inversa, transcripción, modificación de bases (incluyendo, por ejemplo, metilación), integración o recombinación (incluyendo recombinación homóloga y específica de sitio)) de moléculas de ácido nucleico; 2) incluye secuencias de nucleótidos unidas que no están unidas en la naturaleza, 3) se ha genomodificado usando técnicas de clonación molecular de modo que carece de uno o más nucleótidos con respecto a la secuencia de la molécula de ácido nucleico natural, y/o 4) se ha manipulado usando técnicas de clonación molecular de modo que tenga uno o más cambios o reordenamientos de secuencia con respecto a la secuencia de ácido nucleico de origen natural. Como ejemplos no limitantes, un ADNc es una molécula de ADN recombinante, como lo es cualquier molécula de ácido nucleico que se haya generado in vitro mediante una o más reacciones de la polimerasa, o cuyos enlazadores se hayan unido, o que se haya integrado en un vector, tal como un vector de clonación o un vector de expresión.
La expresión "proteína recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína producida mediante genotecnología.
Cuando se aplica a organismos, los términos recombinante, genomodificado(a) o modificado(a) mediante genotecnología, se refiere a organismos que se han manipulado mediante la introducción de una secuencia de ácido nucleico heterólogo o recombinante en el organismo, e incluye genes desactivados, mutaciones dirigidas y reemplazo de genes, reemplazo, deleción o inserción de promotores, así como la introducción de transgenes en el organismo. Los organismos recombinantes o modificados mediante genotecnología, también pueden ser organismos en los que se han introducido construcciones para "atenuar" genes. Dichas construcciones incluyen, pero sin limitación, construcciones de iARN, microARN, ARNhc, antisentido y ribozimática. También se incluyen organismos cuyos genomas se han alterado por la actividad de meganucleasas o nucleasas de dedos de zinc. La molécula de ácido nucleico heterólogo o recombinante puede integrarse en el genoma del organismo recombinante/modificado mediante genotecnología o, en otros casos, no integrarse en el genoma del organismo recombinante/modificado mediante genotecnología. Como se usa en el presente documento, "microorganismo recombinante" o "célula hospedadora recombinante" incluye descendencia o derivados de los microorganismos recombinantes de la invención. Dado que pueden producirse determinadas mutaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o a influencias ambientales, dicha descendencia o derivados pueden, de hecho, no ser idénticos a la célula original, pero siguen estando incluidos en el alcance de la expresión tal como se usa en el presente documento.
El término "promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). Un promotor incluye el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Un promotor puede incluir un sitio de inicio de la transcripción, así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo, pero no siempre, contienen cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores procariotas pueden contener -10 y -35 secuencias consenso promotoras procariotas. En la técnica se conoce bien una gran cantidad de promotores, incluidos los promotores constitutivos, inducibles y represibles, procedentes de una variedad de fuentes diferentes. Entre las fuentes representativas se incluyen, por ejemplo, tipos de virus, células de mamíferos, de insectos, de plantas, de levaduras y de bacterias, y se dispone fácilmente de promotores adecuados de estas fuentes, o se pueden fabricar sintéticamente, basándose en secuencias en línea disponibles públicamente o, por ejemplo, de depósitos como la ATCC (American Type Culture Collection, colección americana de cultivos tipo) y otras fuentes comerciales o individuales. Los promotores pueden ser unidireccionales (es decir, iniciar la transcripción en una dirección) o bidireccionales (es decir, inician la transcripción en ambas direcciones fuera de las cadenas opuestas). Un promotor puede ser un promotor constitutivo, un promotor reprimible, o un promotor inducible. Como ejemplos no limitantes de promotores se incluyen, por ejemplo, el promotor de T7, el promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor del SV40 (virus de simio 40) y el promotor del RSV (virus del sarcoma de Rous). Como ejemplos de promotores inducibles se incluyen el promotor de lac, el promotor de pBAD (araA), el promotor de Tet (Patentes de Estados Unidos N.° 5464758 y 58 l4 618) y el promotor de ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1996) 93 (8): 3346-3351).
El término "heterólogo", cuando se usa en referencia a un polinucleótido, un gen, un ácido nucleico, un polipéptido o una enzima, se refiere a un polinucleótido, un gen, un ácido nucleico, un polipéptido o una enzima, que no se encuentra de manera natural en el organismo hospedador. Cuando se hace referencia a una secuencia reguladora de genes o a una secuencia auxiliar de ácido nucleico utilizada para mantener o manipular una secuencia de genes (por ejemplo, una región no traducida 5', una región no traducida 3', una secuencia de adición de poli A, una secuencia intrónica, sitios de corte y empalme, sitio de unión a ribosomas, una secuencia de sitio interno al ribosoma, una región de homología del genoma, sitio de recombinación, etc.), "heterólogo" significa que la secuencia reguladora o secuencia auxiliar es de una fuente diferente a la del gen con el que la secuencia reguladora o auxiliar de ácido nucleico se yuxtapone en una construcción, genoma, cromosoma o episoma. Por tanto, en el presente documento, un promotor unido operativamente a un gen al cual no está unido operativamente en su estado natural (es decir, en el genoma de un organismo no modificado mediante genotecnología), se refiere a un "promotor heterólogo". a pesar de que el promotor pueda proceder de la misma especie (o, en algunos casos, del mismo organismo) que la del gen con el que está unido.
Como se usa en el presente documento, el término "proteína" o "polipéptido" pretende abarcar un "polipéptido" en singular así como "polipéptidos" en plural, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no a una longitud específica del producto. Por tanto, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos", o cualquier otro término utilizado para referirse a una o más cadenas de dos o más aminoácidos, se incluye en la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" puede utilizarse en lugar de cualquiera de estos términos o indistintamente.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "porcentaje de identidad" u "homología", con respecto a secuencias de ácido nucleico o de polipéptidos, se definen como el porcentaje de nucleótidos o de restos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los polipéptidos conocidos, después de alinear las secuencias para el porcentaje máximo de identidad e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de homología. Las inserciones o deleciones en los extremos N-terminal o C-terminal no se interpretarán como que afectan a la homología, y las deleciones y/o inserciones internas en la secuencia de polipéptidos de menos de aproximadamente 30, menos de aproximadamente 20 o menos de aproximadamente 10 restos de aminoácidos, no se interpretarán como que afectan a la homología.
La identidad u homología de secuencia a nivel de secuencia de nucleótidos o aminoácidos se puede determinar mediante análisis BLAST (del inglés, Basic Local Alignment Search Tool) que usa el algoritmo empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Altschul (1997), Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 y Karlin (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268), que están diseñados para la búsqueda de similitud de secuencia. La estrategia utilizada por el programa BLAST es considerar primero segmentos similares, con y sin huecos, entre una secuencia de consulta y una secuencia de la base de datos, para evaluar después la significación estadística de todas las coincidencias que se identifican y finalmente extraer solo aquellas coincidencias que satisfacen un umbral de significación preseleccionado. Para un tratamiento de aspectos básicos en búsquedas de similitud de secuencia en bases de datos, véase Altschul (1994), Nature Genetics 6, 119-129. Los parámetros de búsqueda para histogramas, descripciones, alineamientos, previsiones (es decir, el umbral de significación estadística para informar sobre coincidencias frente a secuencias de bases de datos), límite, matriz y filtro (baja complejidad), pueden estar en la configuración predeterminada. La matriz de puntuación por defecto utilizada por blastp, blastx, tblastn y tblastx, es la matriz BLOSUM62 (Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), recomendada para secuencias de consulta con una longitud mayor de 85 (bases de nucleótidos o de aminoácidos).
Para blastn, diseñado para comparar secuencias de nucleótidos, la matriz de puntuación se establece con las proporciones de M (es decir, la puntuación por recompensa de un par de restos coincidentes) con respecto a N (es decir, la puntuación por penalización de restos no coincidentes), en donde los valores predeterminados de M y N pueden ser 5 y -4, respectivamente. Los cuatro parámetros de blastn pueden ajustarse de la siguiente manera: Q=10 (penalización por creación de huecos); R=10 (penalización por extensión de huecos); wink=1 (genera aciertos de palabras en cada posición winkth a lo largo de la consulta); y gapw=16 (establece el ancho de la ventana dentro de la cual se generan las alineaciones con huecos). La configuración de los parámetros de Blastp equivalente para la comparación de secuencias de aminoácidos puede ser: Q=9; R=2; wink=1; y gapw=32. Una comparación entre secuencias de Bestfit, disponible en el paquete GCG versión 10.0, puede usar parámetros de ADN GAP=50 (penalización por creación de huecos) y LEN=3 (penalización por extensión de huecos), y las configuraciones equivalentes en las comparaciones de proteínas pueden ser GAP=8 y LEN=2.
Por tanto, cuando se hace referencia a las secuencias de polipéptidos o de ácido nucleico de la presente invención, se incluyen identidades de secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 % u 85 %, por ejemplo, de al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o aproximadamente 100 % de identidad de secuencia con la secuencia del polipéptido o la secuencia de ácido nucleico de longitud completa, o con fragmentos de las mismas, que comprenden una secuencia consecutiva de al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 125, al menos 150 o más restos de aminoácidos de la proteína completa; variantes de dichas secuencias, por ejemplo, en donde se ha insertado al menos un resto de aminoácido N y/o C terminal en, y/o dentro de, la(s) secuencia(s) develada(s) que contiene(n) la inserción y la sustitución. Las variantes contempladas pueden incluir, además o como alternativa, aquellas que contienen mutaciones predeterminadas, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o mutagénesis dirigida o por PCR, y los polipéptidos o ácidos nucleicos correspondientes de otras especies, incluyendo, pero sin limitación, los descritos en el presente documento, los alelos u otras variantes de origen natural de la familia de polipéptidos o ácidos nucleicos que contienen una inserción y sustitución; y/o derivados en los que el polipéptido se ha modificado de manera covalente por sustitución, medios químicos, enzimáticos u otros medios apropiados con un residuo distinto de un aminoácido de origen natural que contenga la inserción y sustitución (por ejemplo, un residuo detectable tal como una enzima).
Como se usa en el presente documento, la frase "sustitución de aminoácidos conservativa" o "mutación conservativa" se refiere al reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido con una propiedad común. Una forma funcional de definir propiedades comunes entre aminoácidos individuales, es analizar las frecuencias normalizadas de los cambios de aminoácidos entre las proteínas correspondientes de organismos homólogos (Schulz (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Según dichos análisis, los grupos de aminoácidos pueden definirse cuando los aminoácidos de un grupo se intercambian preferentemente entre sí y, por lo tanto, se asemejan más entre sí en su impacto sobre la estructura general de las proteínas (Schulz (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Como ejemplos de grupos de aminoácidos definidos de esta manera pueden incluirse: un "grupo con carga/polar" que incluye Glu, Asp, Asn, Gln, Lys, Arg e His; un "grupo aromático o cíclico" que incluye Pro, Phe, Tyr y Trp; y un "grupo alifático" que incluye Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Ser, Thr y Cys. Dentro de cada grupo, también pueden identificarse subgrupos. Por ejemplo, el grupo de aminoácidos con carga/polar puede subdividirse en subgrupos que incluyen: el "subgrupo con carga positiva" que comprende Lys, Arg e His; el "subgrupo con carga negativa" que comprende Glu y Asp; y el "subgrupo polar" que comprende Asn y Gln. En otro ejemplo, el grupo aromático o cíclico puede subdividirse en subgrupos que incluyen: el "subgrupo con anillo de nitrógeno" que comprende Pro, His y Trp; y el "subgrupo con fenilo" que comprende Phe y Tyr. En otro ejemplo más, el grupo alifático puede subdividirse en subgrupos que incluyen: el "subgrupo alifático no polar grande" que comprende Val, Leu e Ile; el "subgrupo alifático ligeramente polar" que comprende Met, Ser, Thr y Cys; y el "subgrupo de restos pequeños" que comprende Gly y Ala. Como ejemplos de mutaciones conservativas se incluyen sustituciones de aminoácidos de los aminoácidos de los subgrupos anteriores, tales como, pero sin limitación: Lys por Arg o viceversa, de modo que pueda conservarse una carga positiva; Glu por Asp o viceversa, de modo que pueda conservarse una carga negativa; Ser por Thr o viceversa, de modo que pueda conservarse un -OH libre; y Gln por Asn o viceversa, de modo que pueda conservarse un -NH2 libre.
Como se usa en el presente documento, "expresión" incluye la expresión de un gen al menos al nivel de producción de ARN, y un "producto de expresión" incluye el producto resultante, por ejemplo, un polipéptido o ARN funcional (por ejemplo, un ARN ribosómico, un ARNt, un ARN antisentido, un micro ARN, un ARNhc, una ribozima, etc.), de un gen expresado. La frase "expresión aumentada" incluye una alteración en la expresión génica para facilitar la producción aumentada de ARNm y/o la expresión aumentada de polipéptidos. "Producción aumentada" incluye un aumento en la cantidad de expresión de un polipéptido, en el nivel de la actividad enzimática de un polipéptido, o una combinación de ambos, en comparación con la producción o la actividad enzimática originaria del polipéptido.
El término "segregado" incluye el transporte de polipéptidos o productos de ácidos grasos producidos por los microorganismos recombinantes o por los métodos de la invención en el espacio periplasmático o medio extracelular. "Secreción aumentada" incluye secreción en exceso de la cantidad de secreción de origen natural, por ejemplo, que es al menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % o al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 % o más, en comparación con el nivel de secreción de origen natural.
Las realizaciones de la presente invención proporcionan la "inserción", por ejemplo, la adición, integración, incorporación o introducción, la activación o regulación positiva de determinadas moléculas de ácido nucleico o secuencias de polinucleótidos particulares, con o sin secuencias reguladoras adicionales, dentro de los microorganismos o de las células hospedadoras que afectan a la actividad, tal como la expresión de una enzima, de determinadas moléculas de ácido nucleico o de secuencias de polinucleótidos particulares. En determinadas realizaciones, un microorganismo de interés puede genomodificarse mediante recombinación homóloga dirigida para insertar un gen de interés o un promotor particular que afecte a la expresión de un gen o conjunto de genes particular.
Las realizaciones de la presente invención proporcionan microorganismos recombinantes en los que las moléculas de ácido nucleico o las secuencias de polinucleótidos particulares están parcial, sustancial o completamente delecionadas, silenciadas, inactivadas o reguladas negativamente para afectar a la actividad para la que codifican, tal como la expresión de una enzima. Los genes pueden estar parcial, sustancial o completamente delecionados, silenciados, inactivados o regulados negativamente por la inserción de secuencias de ácido nucleico que alteran la función y/o expresión del gen (por ejemplo, transducción de P1 u otros métodos conocidos en la técnica). Los términos "eliminar", "eliminación", y "desactivación", pueden utilizarse indistintamente con los términos "deleción", "deleción parcial", "deleción sustancial", o "deleción completa". En determinadas realizaciones, un microorganismo de interés puede genomodificarse mediante recombinación homóloga dirigida para desactivar un gen de interés particular. Incluso en otras realizaciones, para silenciar, inactivar o regular negativamente, parcial, sustancial o completamente, un gen de interés particular, se puede usar iARN o ADN antisentido (ADNas).
Puede entenderse que estas inserciones, deleciones u otras modificaciones de determinadas moléculas de ácido nucleico o secuencias de polinucleótidos particulares, abarcan una o más "modificaciones genéticas" o "transformaciones" de tal manera que puede entenderse que las cepas resultantes de los microorganismos o las células hospedadoras estén "modificadas genéticamente" o "transformadas".
Como se usa en el presente documento, "regulado(a) positivamente" o "regulación positiva" incluye un aumento en la expresión de un gen o una molécula de ácido nucleico de interés o de la actividad de una enzima, por ejemplo, un aumento en la expresión génica o la actividad enzimática en comparación con la expresión o actividad en un gen o enzima de otra manera idéntico que no se ha regulado positivamente.
Como se usa en el presente documento, "regulado(a) negativamente" o "regulación negativa" incluye una disminución en la expresión de un gen o una molécula de ácido nucleico de interés o de la actividad de una enzima, por ejemplo, una disminución en la expresión génica o la actividad enzimática en comparación con la expresión o actividad en un gen o enzima de otra manera idéntico que no se ha regulado negativamente.
El término "Pfam" se refiere a una amplia colección de dominios y familias de proteínas mantenida por el Consorcio Pfam y disponible en varios sitios web mundiales patrocinados, incluyendo: pfam.sanger.ac.uk/ (Welcome Trust, Sanger Institute); pfam.sbc.su.se/ (Centro de Bioinformática de Estocolmo); pfam.janelia.org/ (Janelia Farm, Instituto Médico Howard Hughes); pfam.jouy.inra.fr/ (Institut national de la Recherche Agronomique); y pfam.ccbb.re.kr. La última versión de Pfam es Pfam 26.0 (noviembre de 2011) basada en la base de datos de proteínas UniProt versión 15.6, una mezcla de Swiss-Prot versión 57.6 y TrEMBL versión 40.6. Los dominios y familias Pfam se identifican usando alineamientos múltiples de secuencias y modelos ocultos de Markov (HMM, Hidden Markov Models). Las asignaciones de la familia o dominio Pfam-A, son asignaciones de alta calidad generadas por una alineación de semillas curada utilizando miembros representativos de una familia de proteínas y perfilando modelos ocultos de Markov basados en la alineación de semillas. (A menos que se especifique lo contrario, las coincidencias de una proteína consultada con un dominio o familia Pfam son coincidencias Pfam-A). Después, todas las secuencias identificadas que pertenecen a la familia se utilizan para generar automáticamente una alineación completa con la familia (Sonnhammer (1998) Nucleic Acids Research 26, 320-322; Bateman (2000) Nucleic Acids Research 26, 263­ 266; Bateman (2004) Nucleic Acids Research 32, Database Issue, D138-D141; Finn (2006) Nucleic Acids Research Database Issue 34, D247-251; Finn (2010) Nucleic Acids Research Database Issue 38, d211-222). Al acceder a la base de datos Pfam, por ejemplo, utilizando cualquiera de los sitios web citados anteriormente, secuencias de proteínas pueden consultarse frente a los HMM utilizando el programa informático de búsqueda de homología HMMER (por ejemplo, HMMER2, HMMER3, o una versión superior, hmmer.janelia.org/). Las coincidencias significativas que identifican una proteína consultada como perteneciente a una familia Pfam (o que tiene un dominio Pfam particular) son aquellas en las que la puntuación en bits es mayor que o igual al umbral de recopilación del dominio Pfam. También pueden usarse valores de expectativa (valores e) como criterio de inclusión de una proteína consultada en una Pfam o para determinar si una proteína consultada tiene un dominio Pfam particular, donde valores bajos de e (mucho menores que 1,0, por ejemplo, menores que 0,1, o menores que o iguales a 0,01) representan bajas probabilidades de que una coincidencia se deba al azar.
Una enzima, tal como una LPAAT o una tioesterasa, que actúa en sustratos de acil tioéster (por ejemplo, que utiliza sustratos de acil-ACP y/o acil-CoA), a menudo tiene actividad en sustratos de diferentes longitudes de cadena, pero puede tener mayor actividad en uno o más sustratos que en otros. Por ejemplo, "preferencia de sustrato" se refiere al sustrato o a los sustratos en los que una enzima es más activa. Las diferentes acil-ACP tioesterasas pueden tener diferentes grados de especificidad de longitud de cadena, a veces denominada "preferencia" de la enzima para escindir una longitud particular de ácido graso de la ACP, y las tioesterasas suelen ser activas en la escisión de un ácido graso de una longitud de cadena particular, mientras que tienen menor actividad en la escisión de uno o más ácidos grasos de otra longitud de cadena. De manera similar, una LPAAT puede tener una preferencia de sustrato por uno o más sustratos de acilo, tales como sustratos de acil-ACP o acil-CoA de longitudes de cadena de carbono particulares.
Como se usa en el presente documento, un ácido graso o acil-ACP de "longitud de cadena media" es un ácido graso o acil-ACP que tiene una longitud de cadena de 8-14 carbonos.
Como se usa en el presente documento, un ácido graso o acil-ACP de "cadena larga" es un ácido graso o acil-ACP que tiene una longitud de cadena de más de 14 carbonos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "producto de ácido graso" incluye ácidos grasos libres; mono-, di- o triglicéridos; aldehídos grasos; alcoholes grasos; ésteres de ácidos grasos (incluidos, pero sin limitación, ésteres de cera); e hidrocarburos (incluidos, pero sin limitación, alcanos y alquenos).
Rutas metabólicas para la producción de ácidos grasos
La ruta de la biosíntesis de ácidos grasos está muy conservada en procariotas y en los cloroplastos de algas eucariotas y plantas superiores. La ruta de la biosíntesis de ácidos grasos comienza desde el metabolito central acetil-CoA. La biosíntesis de ácidos grasos se inicia mediante la conversión de acetil-CoA en malonil-CoA, catalizada por acetil-CoA carboxilasa (ACCasa). Después, la malonil-CoA se convierte en malonil-ACP, catalizada por malonil-CoA-ACP transacilasa (FabD en E. coli). Finalmente, la malonil-ACP se convierte en acil-ACP, catalizada por el complejo enzimático de la ácido graso sintasa (FAS). El complejo de la ácido graso sintasa inicia el ciclo de alargamiento condensando primero la malonil-ACP con la acetil-ACP, catalizado por una beta-cetoacil-ACP sintasa III (por ejemplo, FabH de E. coli). La p-cetoacil-ACP (3-cetoacil-ACP) formada por la reacción de FabH se reduce a un p-hidroxiacil-ACP (3-hidroxiacil-ACP) por la 3-cetoacil-ACP reductasa (por ejemplo, FabG). Después, la phidroxiacil-ACP se activa con una p-hidroxiacil-ACP deshidratasa (por ejemplo, FabA, FabZ) para formar trans-2-enoil-ACP, que a su vez se reduce con la enoil-ACP reductasa (por ejemplo, Fab I, Fab K, FabL) para formar el producto acil-ACP alargado con 2 carbonos. Los ciclos posteriores se inician mediante una condensación catalizada por la beta-cetoacil-ACP sintasa I o II (por ejemplo, FabB o FabF) de malonil-ACP con acil-ACP. Los ciclos de condensación, reducción, deshidratación y reducción, se repiten con cada ciclo, añadiendo dos carbonos de la malonil-ACP, hasta que la cadena de acilo se transfiera a otra molécula (por ejemplo, glicerol 3-fosfato) mediante una transacilasa o se separe de la ACP mediante una tioesterasa, tal como FatA o FatB en cloroplastos, para formar ácidos grasos libres.
A diferencia de los cloroplastos de las plantas, las cianobacterias no producen ácidos grasos libres, y a diferencia de E. coli y otras bacterias heterótrofas, las cianobacterias no producen acil-CoA. Después del alargamiento de los ácidos grasos con la cadena de acilo unida de manera covalente a la proteína transportadora de acilo, las acil transferasas de las cianobacterias transfieren la cadena de acilo a un esqueleto de glicerol para producir lípidos de membrana.
Para producir derivados de ácidos grasos tales como alcoholes grasos, aldehídos grasos, ésteres de cera, alcanos o alquenos en microorganismos, normalmente es necesario introducir uno o más genes codificantes de una o más enzimas para convertir los productos intermedios de acil-tioéster (por ejemplo, acil-CoA o acil-ACP) en el producto final deseado (por ejemplo, un alcohol, aldehído, alcano, alqueno o éster de cera). Por ejemplo, si los aldehídos grasos y/o los alcanos son el producto final deseado, para reducir la acil-CoA a aldehídos grasos; puede introducirse un gen que codifique una aldehído reductasa grasa formadora de aldehído (por ejemplo, acil-CoA reductasa formadora de aldehído, 1.2.1.42 o 1.2.1.50; véase también la patente de Estados Unidos N.° 6.143.538); adicionalmente o de manera alternativa, puede introducirse un gen de ácido carboxílico reductasa (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2010/135624 y WO 2010/042664) para reducir los ácidos grasos libres a aldehídos grasos. Además, puede introducirse un gen que codifique una alcohol graso oxidasa (por ejemplo, 1.1.3.20) o una alcohol graso deshidrogenasa (por ejemplo, 1.1.1.164) para convertir los alcoholes grasos a aldehídos grasos. Los aldehídos grasos pueden procesarse adicionalmente a alcanos con la introducción de un gen codificante de una aldehído graso descarbonilasa (por ejemplo, 4.1.99.5). Si los alcoholes grasos, los alquenos y/o los ésteres de cera son el producto final deseado, puede introducirse un gen que codifique una acil grasa reductasa formadora de alcohol (por ejemplo, acil-CoA reductasa formadora de alcohol, 1.2.1.50) en la célula hospedadora. Además, puede introducirse un gen de aldehído graso reductasa para reducir los aldehídos grasos a alcoholes grasos. Los alcoholes grasos pueden procesarse adicionalmente a alquenos con la introducción de uno o más genes codificantes de una alcohol graso deshidratasa. Los ésteres de ácidos grasos, incluidos los ésteres de cera, pueden formarse introduciendo genes codificantes de polipéptidos que catalicen la condensación de un alcohol con un acil graso tioéster, tal como aciltransferasas y cera sintasas.
En algunas realizaciones de la invención descritas anteriormente, la conversión de acil-ACP en alcohol graso puede producirse mediante la síntesis de un aldehído graso, en donde una acil reductasa (por ejemplo, una acil-CoA reductasa formadora de aldehído o una acil-ACP reductasa formadora de aldehído) expresada en la célula hospedadora reduce primero la acil-ACP a un aldehído graso. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la célula hospedadora se puede genomodificar para que sobreexprese una reductasa endógena formadora de aldehído graso (por ejemplo, insertando elementos de control transcripcional promotor y/o potenciador cerca del gen de la reductasa formadora de aldehído graso). En otras realizaciones, la célula hospedadora puede genomodificarse para que exprese una reductasa exógena formadora de aldehído graso.
Ácido Lisofosfatídico Aciltransferasas
Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido lisofosfatídico aciltransferasa" o "LPAAT", o "1-acil-snglicerol-3-fosfato aciltransferasa" o "AGPAT" (codificada por pIsC en E. coli y otros procariotas), incluye aquellas enzimas capaces de convertir un ácido lisofosfatídico en un ácido fosfatídico transfiriendo una cadena de acilo desde un sustrato de acilo tal como acil-CoA o acil-ACP a la posición sn2 del ácido lisofosfatídico. La LPAAT incluye aquellas enzimas que corresponden al número de la Comisión de Enzimas 2.3.1.51.
La LPAAT y la enzima glicerol-3-fosfato aciltransferasa (glicerolfosfato aciltransferasa; GPAT; codificada por plsB en E. coli) que cataliza la conversión de glicerol-3-fosfato en ácido lisofosfatídico, comparte firmas canónicas de aciltransferasa tales como HXXXXD o NHXXXXD y XXXXXXG, donde X es un aminoácido arbitrario, separado por 60 a 83 restos de aminoácidos (Okazaki, K., et al. (2006) Plant Physiol. 141:546-56). En muchos organismos se han identificado ácidos nucleicos que codifican las GPAT y las LPAAT que tienen estas secuencias de firma, incluso en Arabidopsis thaliana (Zheng et al. (2003) Plant Cell 15:1872-87; Kim y Huwang (2004) Plant Physiol. 134:1206-16; Yu et al. (2003) Plant Cell Physiol. 15:1872-87) y en Synechocystis sp. PCC6803 (Weier et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1127-34; Okazaki, K., et al. (2006) Plant Physiol. 141:546-56). Por ejemplo, una LPAAT localizada en el retículo endoplásmático (microsómico), que está codificada por el gen LAT2 de Limnanthes douglasii o por el gen LPAT2 de A. thaliana, tiene 68 o 69 restos de aminoácidos entre las firmas canónicas de aciltransferasa y puede utilizar sustratos de acilo de C18, tales como CoA C18:1, para la síntesis de lípidos de membrana (Brown et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:267-78; Kim et al. (2005) Plant Cell 17:1073-89). Otras LPAAT ubicadas en el retículo endoplásmático específicas de semilla, pueden tener 63 restos de aminoácidos o aproximadamente 63 restos de aminoácidos entre las firmas canónicas de aciltransferasa y pueden utilizar sustratos de acilo inusuales, por ejemplo, sustratos de acilo C12:0 o C22:1 que, en diversas especies de plantas, se incorporan en lípidos de almacenamiento de semillas (Brown et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:267-78; Knutzon et al. (1995) Plant Physiol. 109:999-1006; Lassner et al. (1995) Plant Physiol. 109:1389-94).
Las LPAAT útiles en los microorganismos y métodos proporcionados en este documento, pueden tener uno o más dominios conservados encontrados en sll1752 LPAAT de cianobacterias (SEQ ID NO: 2), según se caracteriza en la base de datos de dominios conservados mantenida por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (disponible en ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml), tales como, pero sin limitación: cd07992 (Lisofosfolípido Aciltransferasas (LPLAT) de la Biosíntesis de Glicerofosfolípidos: similar a AAK14816 desconocido), cd07989 (Lisofosfolípido Aciltransferasas (LPLAT) de la Biosíntesis de Glicerofosfolípidos: similar a AGPAT), cd06551 (Lisofosfolípido Aciltransferasas (LPLAT) de la biosíntesis de glicerofosfolípidos), cd07993 (Lisofosfolípido Aciltransferasas (LPLAT) de la Biosíntesis de Glicerofosfolípidos: similar a GPAT), cd07988 (Lisofosfolípido Aciltransferasas (LPLAT) de la Biosíntesis de Glicerofosfolípidos: ABO13168 desconocido), cd07987 (Lisofosfolípido Aciltransferasas (LPLAT) de la Biosíntesis de Glicerofosfolípidos: similar a MGAT), COG0204: PlsC (1-acil-snglicerol-3-fosfato aciltransferasa), TIGR00530: AGP aciltrn (1-acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltransferasas), cd07991: LPLAT similar a LPCAT1 (Lisofosfolípido Aciltransferasas (LPLAT) de la Biosíntesis de Glicerofosfolípidos: similar a LPCAT1), cd07990 (Lisofosfolípido Aciltransferasas (LPLAT) de la Biosíntesis de Glicerofosfolípidos: similar a LCLAT1) y cd07986 (Lisofosfolípido Aciltransferasas (LPLAT) de la Biosíntesis de Glicerofosfolípidos: ACT 14924 desconocido).
Dado que las LPAAT son esenciales para la producción de ácido fosfatídico en todos los organismos celulares, excepto en las arqueas (Archaea), las LPAAT pueden identificarse a partir de una gran variedad de especies, utilizando, por ejemplo, las firmas canónicas de la secuencia de aciltransferasa descritas anteriormente y/o medios bioinformáticos para identificar dominios conservados característicos de las LPAAT, tales como, pero sin limitación, los proporcionados anteriormente, así como por inclusión en Pfam PF01553 ("Aciltransferasa"), que tiene un límite de recopilación de 21,1. La actividad de LPAAT y la especificidad del sustrato pueden determinarse utilizando, por ejemplo, un ensayo de aciltransferasa como se describe en Okazaki, K. et al. (2006) Plant Physiol. 141:546-56, en el documento WO2007141257 o en la patente de los Estados Unidos 5.563.058, en el que cualquiera de los métodos puede adaptarse para utilizar acil-ACP o acil-CoA como sustrato, o utilizando cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento.
Para aumentar los niveles de ácidos grasos libres producidos por las células o los microorganismos hospedadores recombinantes, un gen que codifica una LPAAT con una preferencia de sustrato de longitud de cadena de acilo particular, puede expresarse en una cianobacteria recombinante que expresa un gen de tioesterasa no originario como se proporciona en el presente documento. Se puede seleccionar un gen LPAAT en función de la preferencia del sustrato de la enzima codificada en relación con la preferencia del sustrato de la tioesterasa producida por el microorganismo o la célula hospedadora recombinante. En algunos aspectos de la invención, se puede seleccionar una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato de longitud de cadena de acilo diferente a la de la tioesterasa producida por la expresión de un gen no originario, que puede ser, por ejemplo, una acil-ACP tioesterasa, una acil-CoA tioesterasa o una 4-hidroxibenzoil tioesterasa. En algunos aspectos de la invención, se selecciona una LPAAT que tenga una preferencia de longitud de cadena de sustrato de acilo complementaria con respecto a la preferencia de sustrato de la tioesterasa producida por la cianobacteria recombinante, donde los sustratos de acilo preferidos por la LPAAT no son sustratos preferidos de la tioesterasa, y los sustratos de acilo preferidos por la tioesterasa no son sustratos preferidos de la LPAAT. Por ejemplo, en determinados aspectos, se selecciona una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato de acilo de longitud de cadena media, por ejemplo, una preferencia por usar acil-ACP o acil-CoA C12 y/o C14, y en otros aspectos, se selecciona una LPAAt que tenga una preferencia de sustrato de acil-ACP de longitud de cadena larga, por ejemplo, una preferencia por usar un sustrato de acil-ACP C16 y/o C18. En determinados aspectos, se selecciona una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato de acil-ACP de longitud de cadena media y se selecciona una acil-ACP tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato de acil-ACP o acil-CoA de longitud de cadena larga. En determinados aspectos, se selecciona una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato de acilo de longitud de cadena larga y se selecciona una acil-ACP tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato de acil-ACP de longitud de cadena media. El sustrato de acil-ACP preferido puede tener una cadena de acilo saturada o puede tener una cadena de acilo insaturada.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la LPAAT codificada por una secuencia de ácido nucleico no originario en la cianobacteria recombinante, tiene una preferencia de sustrato por moléculas de acil-ACP o acil-CoA que tienen longitudes de cadena de acilo más largas que los sustratos de acilo preferidos por la tioesterasa producida por la expresión de un gen de tioesterasa no originario en la cianobacteria recombinante. Sin limitar la invención a ningún mecanismo particular, la LPAAT puede tener una preferencia de sustrato por un sustrato de acilo que tenga una cadena de acilo más larga que el sustrato de acilo preferido por la tioesterasa producida por la cianobacteria recombinante, de tal manera que durante la biosíntesis de ácidos grasos, los productos intermedios de acil-ACP son escindidos por la tioesterasa o, si escapan de la escisión a la longitud de cadena de sustrato preferida, sus cadenas de acilo se alargan aún más en el ciclo de biosíntesis de ácidos grasos de modo que alcanzan una longitud de cadena preferida por la LPAAT. La LPAAT puede actuar sobre el sustrato acil-ACP, transfiriendo la cadena de acilo a un glicerolípido y de ese modo eliminando los productos intermedios de acil-ACP que se han alargado más allá de la preferencia de sustrato de la tioesterasa. Dichos productos intermedios podrían acumularse de otra manera en la célula y, por lo tanto, regular negativamente la síntesis de ácidos grasos. Por ejemplo, el microorganismo recombinante puede expresar una acil-ACP tioesterasa, acil-CoA tioesterasa o 4-hidroxibenzoil tioesterasa, que tenga una preferencia de sustrato de acilo de cadena media (por ejemplo, por sustratos de acilo C8, C10, C12 y/o C14 tales como acil-ACP y/o acil-CoA) y una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato de acilo de cadena larga (por ejemplo, por sustratos de acilo C16, C18, C20, C22 o C24 tales como acil-ACP y/o acil-CoA). En algunos ejemplos, la cianobacteria recombinante expresa un gen no originario que codifica una tioesterasa que tiene preferencia por un sustrato de acilo C12 y/o C14 y expresa un gen no originario que codifica una LPAAT que tiene preferencia por uno o más sustratos de acilo C16 y/o C18. En otro ejemplo, tanto la tioesterasa como la LPAAT codificadas por genes no originarios en la célula recombinante, pueden tener preferencias de sustrato de acilo de cadena larga, donde la LPAAT prefiere uno o más sustratos que tengan una longitud de cadena de acilo más larga que la longitud de cadena de acilo del sustrato (o sustratos) preferido por la tioesterasa. Por ejemplo, una cianobacteria recombinante puede expresar un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato de acilo C16 y un gen no originario que codifique una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato de acilo C18. En ejemplos adicionales, la cianobacteria recombinante expresa un gen no originario que codifica una tioesterasa que tiene preferencia por un sustrato de acilo C12, C14, y/o C16 y expresa un gen no originario que codifica una LPAAT que tiene preferencia por un sustrato de acilo C18. Por ejemplo, la cianobacteria recombinante puede expresar un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato de acilo C12 o una preferencia de sustrato de acilo C14. Por ejemplo, la cianobacteria recombinante puede expresar una LPAAT que tenga una preferencia de sustrato de acilo C18 y puede expresar un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato de acilo C16, o la cianobacteria recombinante puede expresar un gen no originario que codifique una tioesterasa que tenga una preferencia de sustrato de acilo C14 y C16 o una preferencia por sustratos de acilo C12, C14 y C16.
Las LPAAT de procariotas comúnmente tienen una preferencia de sustrato de acilo C16, aunque la invención considera que las LPAAT de procariotas tienen preferencias de sustrato por cualquier longitud de cadena de acilo, en particular, pero no exclusivamente, longitudes de cadena C16 y C18.
Se ha demostrado que la LPAAT codificada por el gen sll1752 de Synechocystis sp. PCC 6803 (número de registro de GenBank/EMBL NP 440396 o BAA17076; SEQ ID NO: 2), cuyos ortólogos están ampliamente conservados en genomas de cianobacterias publicados, tiene preferencia por sustratos de acilo C18 0 y C18:1 (Okazaki, K., et al. (2006) Plant Physiol. 141:546-56). La LPAAT codificada por el gen sll1752 de Synechocystis sp. PCC 6803, tiene una distancia de 64 restos de aminoácidos entre las firmas canónicas de aciltransferasa, que es similar a la de las LPAAT específicas de semillas de plantas superiores.
Las LPAAT de cianobacterias consideradas como ortólogos del polipéptido codificado por sll 1752 (Registro de Genbank NP_440396; identificador génico 16329668; SEQ ID NO: 2) de Synechocystis incluyen, pero sin limitación, la fosfolípido/glicerol aciltransferasa de Cyanothece sp. PCC 8801 (Registro de Genbank YP_002372580; identificador génico 218247209; SEQ ID NO: 3), la fosfolípido/glicerol aciltransferasa de Crocosphaera watsonii WH 8501 (Registro de Genbank ZP_00513647; identificador génico 67920127; SEQ ID NO: 4), la proteína hipotética CY0110_27159 de Cyanothece sp. CCY0110 (Registro de Genbank ZP_01731155; identificador génico 126660033; SEQ ID NO: 5), el producto proteico sin nombre de Microcystis aeruginosa PCC 7806 (Registro de Genbank CAO89042; identificador génico 159026728; SEQ ID NO: 6), la proteína hipotética all4871 de Nostoc sp. PCC 7120 (Registro de Genbank NP_488911; identificador génico 17232363; SEQ iD NO: 7), el producto proteico sin nombre de Anabaena variabilis ATCC 29413 (Registro de Genbank YP_322656; identificador génico 75908360; SEQ ID NO: 8), la fosfolípido/glicerol aciltransferasa de ’Nostoc azollae’ 0708 (Registro de Genbank YP_003721758; identificador génico 298491581; SEQ ID NO: 9), la fosfolípido/glicerol aciltransferasa de Raphidiopsis brookii D9 (Registro de Genbank ZP_06305519; identificador génico 282897518; SEQ ID NO: 10), la proteína de dominio aciltransferasa de Microcoleus chthonoplastes PCC 7420 (Registro de Genbank ZP_05026385; identificador génico 254412612; SEQ ID NO: 11), la fosfolípido/glicerol aciltransferasa de Cylindrospermopsis raciborskii CS-505 (Registro de Genbank ZP_06306989; identificador génico 282899007; SEQ ID NO: 12), la proteína hipotética conservada de Oscillatoria sp. PCC 6506 (Registro de Genbank ZP_07110610; identificador génico 300865867; SEQ ID NO: 13), la fosfolípido/glicerol aciltransferasa de Nodularia spumigena CCY9414 (Registro de Genbank ZP_01628592; identificador génico 119509444; SEQ ID NO: 14), y la fosfolípido/glicerol aciltransferasa de Microcoleus vaginatus FGP-2 (Registro de Genbank ZP_08495621; identificador génico 334121556; SEQ ID NO:15). Estos y otros ortólogos de sll1752 (SEQ ID NO: 2) de Synechocystis se tienen en cuenta para su uso en los microorganismos y métodos proporcionados en el presente documento. Las cianobacterias recombinantes que incluyen una secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una LPAAT y que producen al menos un ácido graso libre o al menos un derivado de ácido graso, pueden incluir secuencias no originarias que codifican las LPAAT que tienen una identidad de al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos el 99 % o 100 % con la SEQ ID NO:2.
Tioesterasas
Como se usa en el presente documento, el término "tioesterasa" pretende incluir hidrolasas capaces de actuar sobre un enlace tioéster. Dichas enzimas pueden corresponder, por ejemplo, a los números de la Comisión de Enzimas 3.1.2.2, 3.1.2.14, 3.1.2.18, 3.1.2.19, 3.2.1.20, 3.1.2.22, 3.1.2.23 o 3.1.2.27. Una tioesterasa expresada en un microorganismo recombinante o en una célula hospedadora de la invención, es una acil-ACP tioesterasa. Por ejemplo, una cianobacteria o célula hospedadora recombinante puede transformarse con un gen que codifique una acil-ACP tioesterasa exógena, tal como un gen que codifique un polipéptido que cuando se consulte en la base de datos Pfam, proporcione una coincidencia con Pfam PF01643 que tenga una puntuación en bits menor que o igual a 20,3 (el límite de recopilación de PF01643). El gen de acil-ACP-tioesterasa codifica una acil-ACP-tioesterasa de una especie de planta superior. Los genes que codifican acil-ACP tioesterasas procedentes de plantas superiores pueden incluir, sin limitación, genes que codifican acil-ACP tioesterasas de especies del género Cuphea (por ejemplo, Cuphea carthagenensis, Cuphea wrightii (por ejemplo, AAC49784.1 GI:1336008), Cuphea lanceolata (por ejemplo, CAA54060, GI495227), Cuphea palustris, (por ejemplo, AAC49783.1 GI:1336006; AAC49179.1 GI:1215718); Cuphea hookeriana (por ejemplo, AAC72882.1 GI:3859830; AAC49269.1 GI:1292906; AAC72881.1 GI:3859828; AAC72883.1 GI:3859832), Cuphea calophylla (por ejemplo, ABB71580.1 GI:81361963) o genes de varias especies de Cuphea desveladas en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos US 2011/0020883, o genes de otras especies de plantas superiores. Por ejemplo, una cianobacteria utilizada en los métodos y cultivos desvelados en el presente documento, puede incluir un gen que codifique una acil-ACP tioesterasa de especies tales como, aunque si limitación, Arabidopsis (XP_002885681.1 GI:297835598; NP_172327.1 GI:15223236); Arachis hypogaea (por ejemplo, AB038556.1 G i:133754634); especies de Brassica (por ejemplo, CAA52069.1 GI: 435011), Camelia oleifera (por ejemplo, ACQ57189.1 GI:229358082); Cinnamonum camphorum (por ejemplo, AAC49151.1 GI:1143156); Cocos nucifera; Glycine max (por ejemplo, ABD91726.1 GI:90192131); Garcinia mangostana (por ejemplo, AAB51525.1 GI:1930081); Gossypium hirsutum (por ejemplo, AAD01982.1 GI:4104242); Helianthus annuus (por ejemplo, AAQ08226 GI:33325244); Jatropha curcas (por ejemplo, ABU96744.1 GI:156900676); Macadamia tetraphylla (por ejemplo, ADA79524.1 GI:282160399); Elaeis oleifera (por ejemplo, AAM09524.1 GI:20067070); Elaeis guineensis (por ejemplo, AAD42220 GI:30962820); Oryza sativa (por ejemplo, BAA83582.1 GI:5803272); Populus tomentosa (por ejemplo, ABC47311 GI:83778888); Umbellularia californica (por ejemplo, AAC49001.1 GI:595955); Ulmus americana (por ejemplo, AAB71731.1 GI:2459533); y Zea mays (ACG41291.1 GI:195643646), o cualquiera de las desveladas en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.455.167; 5.654.495 y 5.455.167 y en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2009/0298143 y 2011/0020883. También se incluyen acil-ACP tioesterasas de musgos (Bryophyta), tal como, por ejemplo, Physcomitrella patens, (por ejemplo, XP 001770108 GI:168035219). Estos ejemplos no son limitantes con respecto a los tipos o ejemplos específicos de genes de acil-ACP tioesterasa que pueden usarse.
Los genes que codifican acil-ACP tioesterasas de plantas y briófitas, pueden incluir secuencias que codifican péptidos de tránsito para el transporte a los plástidos que opcionalmente se pueden delecionar para la expresión de tioesterasas truncadas en el extremo N en cianobacterias hospedadoras. Los genes que codifican tioesterasas pueden incluir opcionalmente además, truncamientos adicionales, tales como, aunque sin limitación, truncamientos en el extremo N-terminal que incluyen una parte, tal como hasta diez, hasta veinte, o hasta treinta aminoácidos, de una secuencia de acil-ACP tioesterasa madura.
Normalmente, las acil-ACP tioesterasas pueden ser activas hasta cierto punto en sustratos de acil-ACP que tienen una pluralidad de diferentes longitudes de cadena de acilo, pero puede tener mayor actividad (por ejemplo, tener una preferencia de sustrato por) sobre uno o más sustratos de acil-ACP que tienen longitudes de cadena acilo particulares que en otros sustratos de longitud de cadena. En algunos ejemplos, una enzima que tiene una preferencia de sustrato por sustratos de longitud de cadena acilo particulares, produce al menos el doble de producto del sustrato o sustratos preferidos que de un sustrato no preferido y, por ejemplo, puede producir al menos tres veces, al menos cuatro veces o al menos cinco veces más producto de un sustrato preferido que de un sustrato no preferido. Por ejemplo, una acil-ACP tioestesasa puede tener una preferencia de sustrato por uno o más sustratos de acil-ACP que tienen longitudes de cadena de acilo de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y/o 24 carbonos. Además o como alternativa, la acil-ACP tioesterasa puede hidrolizar uno o más sustratos de acil-ACP que tengan una longitud de cadena de acilo de 8 a 18 carbonos, por ejemplo, de 12 a 18 carbonos. Por ejemplo, la acil-ACP tioesterasa puede hidrolizar uno o más sustratos de acil-ACP que tengan una longitud de cadena de acilo de 12 a 16 carbonos. Además o como alternativa, una acil-ACP tioesterasas de la presente invención puede, en algunas realizaciones, tener nivel de actividad más alto en un sustrato de acil-ACP que tenga una longitud de cadena de acilo de 12, 14 y/o 16 carbonos.
Microorganismos y células hospedadoras
Las algas, para uso en la invención, incluyen, sin limitación, microalgas, tales como, pero sin limitación, especies de los géneros Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Borodinella, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Dunaliella, Ellipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Franceia, Fragilaria, Gloeothamnion, Haematococcus, Halocafeteria, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Pavlova, Parachlorella, Pascheria, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochytrium, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetraselmis, Viridiella o Volvox.
Las especies de cianobacterias que pueden utilizarse para la producción de productos de ácidos grasos incluyen, sin limitación, especies de los géneros Agmenellum, Anabaena, Anabaenopsis, Anacystis, Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chroococcus, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Dactylococcopsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitlerinema, Gloeobacter, Gloeocapsa, Gloeothece, Flalospirulina, lyengariella, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Pleurocapsa, Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudanabaena, Rivularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina, Stanieria, Starria, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Tolypothrix, Trichodesmium, Tychonema y Xenococcus. Por ejemplo, el microorganismo fotosintético recombinante puede ser una especie de los génerosCyanobium, Cyanothece o Cyanobacterium, o además, de manera alternativa, el microorganismo fotosintético recombinante puede ser una especie de los géneros Gloeobacter, Lyngbya o Leptolyngba. De manera alternativa, el microorganismo fotosintético recombinante puede ser una especie de los géneros Synechococcus, Synechocystis o Thermosynechococcus. Se conocen diversas especies de cianobacterias y se han manipulado utilizando técnicas de biología molecular, incluyendo entre ellas las cianobacterias unicelulares Synechocystis sp. PCC6803 y Synechococcus elongates PCC7942, cuyos genomas se han secuenciado por completo.
La invención proporciona una cianobacteria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico no natural que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una LPAAT y una secuencia de ácido nucleico no natural que codifica una tioesterasa. La secuencia de ácido nucleico que codifica la LPAAT y la secuencia de ácido nucleico que codifica la tioesterasa pueden estar presentes en la misma o en diferentes moléculas de ácido nucleico. La cianobacteria recombinante puede producir un producto de ácido graso, tal como un ácido graso, alcohol graso, aldehído graso, éster de ácido graso, éster de cera o hidrocarburo (tal como un alcano o alqueno). La célula hospedadora recombinante puede comprender, por ejemplo, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que codifican una LPAAT descrita en el presente documento y puede comprender cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que codifican una tioesterasa descrita en el presente documento. La célula hospedadora recombinante puede comprender, por ejemplo, cualquiera de los vectores descritos en el presente documento.
La célula hospedadora recombinante puede comprender un gen no originario que codifique una LPAAT con una identidad de secuencia de al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO: 2.
Como ejemplos ilustrativos de cianobacterias recombinantes que expresan un gen de LPAAT no natural y un gen de tioesterasa no natural, se incluyen, cianobacterias recombinantes que expresan un gen no originario que codifica una LPAAT que tiene una preferencia de sustrato de C18, tal como una LPAAT que tiene una identidad de al menos 85 % con la SeQ ID NO: 2 (por ejemplo, una identidad de al menos 90 % o de al menos 95 % con la SEQ ID NO: 2) y una acil-ACP tioesterasa de planta superior que tiene una preferencia de sustrato por uno o más de un sustrato de acilo C12, C14 o C16, por ejemplo, la tioesterasa FatB1 de Umbellularia californica que prefiere C12 (AAC49001.1 GI:595955), la tioesterasa de Cinnamomum camphorum que prefiere C14 (Q39473.1 GI:8469216), la acil-ACP tioesterasa de Elaeis oleifera truncada en el extremo N-terminal que prefiere C16 (SEQ ID NO: 56), la acil-ACP tioesterasa de Elaeis guineensis que prefiere C16 (SEQ ID NO: 57) o una versión truncada de la misma, la tioesterasa FatB2 de Cuphea palustris que prefiere c 14 y C16 (AAC49180.1 GI:1215720), la tioesterasa Cc1FatB1 de Cuphea carthagenensis, o una variante de la misma (por ejemplo, el polipéptido truncado de SEQ ID NO: 44), o acil-ACP tioesterasas de otras especies del género Cuphea (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos US 2011/0020883), que incluye, por ejemplo, la acil-ACP tioesterasa Cd1FatB1 que prefiere C14, C16 truncada en el extremo N terminal de SEC ID N°: 54 o una variante de la misma, la tioesterasa Cp1FatB1 C14 o que prefiere C16 truncada en el extremo N terminal de SEQ ID NO: 55 o una variante de la misma, o la tioesterasa C. hookeriana FatBI que prefiere C16 (Q39513.1 GI:8469217). También se consideran específicamente las tioesterasas que tienen una identidad de al menos 85 %, por ejemplo, una identidad de al menos 90 % o de al menos 95 % con las acil-ACP tioesterasas de Umbelularia, Cinnamomum, Cuphea y Elaeis mencionadas anteriormente, en donde las acil-ACP tioesterasas tienen especificidades de sustrato C12, C14 y/o C16.
La célula hospedadora recombinante que expresa un gen de LPAAT en combinación con un gen de tioesterasa, produce una mayor cantidad de un producto de ácido graso que una célula hospedadora de control que no expresa el gen de LPAAT. En algunas realizaciones, la cantidad de producto de ácido graso que produce un cultivo de la célula hospedadora recombinante que expresa un gen no originario que codifica una LPAAT y un gen no originario que codifica una tioesterasa es al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 225 %, 250 %, 275 %, 300 %, 325 %, 350 %, 375 %, 400 %, 425 %, 450 %, 475 %, 500 %, 525 %, 550 %, 575 %, 600 %, 625 %, 650 %, 675 %, 700 %, 725 %, 750 %, 775 %, 800 %, 825 %, 850 %, 875 %, 900 %, 925 %, 950 %, 975 % o 1000 % mayor que la cantidad de éster de cera producida por una célula hospedadora de control que no expresa el gen de LPAAT no originario.
En algunas realizaciones, la célula hospedadora recombinante que expresa una LPAAT y una tioesterasa produce una mayor cantidad de un producto de ácido graso que una célula hospedadora de control que no expresa la LPAAT y la tioesterasa. En algunas realizaciones, la cantidad de un producto de ácido graso producido por un cultivo de la célula hospedadora recombinante que expresa una LPAAT y una tioesterasa es al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 225 %, 250 %, 275 %, 300 %, 325 %, 350 %, 375 %, 400 %, 425 %, 450 %, 475 %, 500 %, 525 %, 550 %, 575 %, 600 %, 625 %, 650 %, 675 %, 700 %, 725 %, 750 %, 775 %, 800 %, 825 %, 850 %, 875 %, 900 %, 925 %, 950 %, 975 % o 1000 % mayor que la cantidad de producto de ácido graso que produce una célula hospedadora de control que no expresa la LPAAT y la tioesterasa.
Modificaciones adicionales de la célula hospedadora para la producción de ácido graso libre (FFA)
Se pueden realizar modificaciones adicionales en las cianobacterias recombinantes o en las células hospedadoras de la invención, para afectar a la producción de ácidos grasos libres. Por ejemplo, la cianobacteria recombinante puede incluir uno o más genes no originarios adicionales cuya expresión aumente la producción de un producto de ácido graso. El gen adicional puede estar codificado por una molécula de ácido nucleico que sea igual que la molécula de ácido nucleico que codifique la LPAAT y/o que la molécula de ácido nucleico que codifique la tioesterasa, o el gen adicional puede estar codificado por una molécula de ácido nucleico distinta. Cuando dos o más genes están codificados por la misma molécula de ácido nucleico (por ejemplo, en el mismo vector de expresión), opcionalmente, la expresión de cada gen puede regularse independientemente por un mismo o diferente promotor y/o potenciador. En determinadas realizaciones, el gen adicional puede aumentar la velocidad y/o el nivel de producción de derivados de ácidos grasos o ácidos grasos libres.
Por ejemplo, la célula hospedadora recombinante que expresa una LPAAT y una tioesterasa, puede expresar además al menos un gen recombinante o exógeno adicional que codifique un polipéptido que tenga actividad lipolítica. Por ejemplo, una célula hospedadora recombinante de la invención puede incluir uno o más genes que codifiquen uno o más polipéptidos que tengan actividad lipolítica, donde el polipéptido o los polipéptidos que tienen actividad lipolítica son capaces de producir ácidos grasos libres a partir de lípidos de membrana o lípidos de almacenamiento, por ejemplo, fosfolípidos, triacilgliceroles, diacilgliceroles, monoacilgliceroles, o similares, o combinaciones de los mismos. Los polipéptidos que tienen actividad lipolítica pueden ser, por ejemplo, lipasas, esterasas, cutinasas o amidasas.
Sin limitar la invención a ningún mecanismo particular, se considera que la sobreexpresión de un gen de LPAAT puede dar como resultado una producción significativamente mayor de lípidos de membrana o de almacenamiento. El exceso de lípidos de membrana o de almacenamiento puede activarse por polipéptidos con actividad lipolítica (tal como, por ejemplo, una o más lipasas o amidasas) para liberar ácidos grasos adicionales (que opcionalmente pueden convertirse en derivados de ácidos grasos), por lo tanto aumentando adicionalmente la cantidad de productos de ácidos grasos que produce el microorganismo recombinante (véase, por ejemplo, el modelo proporcionado en la Figura 2).
El uso de genes que codifican polipéptidos que tienen actividad lipolítica en microorganismos para la producción de ácidos grasos libres, se desvela en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 13/324,653 otorgada conjuntamente titulada "Production of Free Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives by Recombinant Microorganisms Expressing Polypeptides Having Lipolytic Activity", presentada el 13 de diciembre de 2011. El polipéptido que tiene actividad lipolítica puede ser, por ejemplo, una lipasa, por ejemplo, que libera un ácido graso de un glicerolípido (incluido un monoglicérido, un diglicérido, un triglicérido, un fosfolípido, un galactolípido, etc.) o puede ser una amidasa. Por ejemplo, el microorganismo recombinante puede incluir un gen no originario que codifique una lipasa, como, pero sin limitación, una lipasa que sea un miembro de un Pfam perteneciente al clan AB Hidrolasa Pfam (CL0028). Por ejemplo, un gen no originario que codifica un polipéptido que tiene actividad lipolítica puede codificar una lipasa que incluya un dominio LipA identificado como dominio de proteína conservado COG1075, o que esté incluido en la familia de proteínas Pfam PF01674 (Lipasa 2); una molécula de ácido nucleico no originario que codifique una lipasa que incluya un dominio de Lipasa 3 identificado como dominio de proteína conservado COG3675, o que esté incluido en la familia de proteínas Pfam PF01764 (Lipasa 3); una molécula de ácido nucleico no originario que codifique una lipasa que esté incluida en la familia de proteínas Pfam PF07819 (PGAP1); o una molécula de ácido nucleico no originario que codifique un polipéptido que esté incluido en cualquiera de las familias de proteínas Pfam PF03583, Pfam PF00151 (lipasa), Pfam p F00561 (Ab hidrolasa 1), Pfam PF02230 (Ab hidrolasa 2), Pfam PF07859 (Ab hidrolasa 3), Pfam PF08386 (Ab hidrolasa 4), Pfam PF12695 (Ab hidrolasa 5), Pfam PF12697 (Ab hidrolasa 6), Pfam PF12715 (Ab hidrolasa 7), Pfam PF04083 (Ab hidro lipasa). En algunas realizaciones, un gen exógeno de lipasa introducido en un microorganismo puede codificar una proteína con una secuencia de aminoácidos que tenga un parámetro de valor E de 0.01 o menor cuando se consulta utilizando el Perfil Pfam de HMM (modelos ocultos de Markov) para cualquiera de Pfam PF01674, Pfam PF 01764, Pfam PF07819, Pfam PF03583 y/o Pfam PF00151. Además, el microorganismo recombinante puede incluir un gen no originario que codifique una amidasa que tenga actividad lipolítica, tal como, pero sin limitación, una amidasa que recluta a Pfam PF01425 (Amidasa) con una puntación en bits mayor que el límite de recopilación de 20,1 y puede catalizar la liberación de ácidos grasos procedente de lípidos.
Además o como alternativa, se contemplan cianobacterias recombinantes que están genomodificadas para que incluyan secuencias reguladoras de genes que induzcan o aumenten la expresión de un gen endógeno de lipasa. Por ejemplo, una cianobacteria puede genomodificarse de tal manera que se inserte un promotor heterólogo cadena arriba de una región codificante de un gen endógeno de lipasa. El promotor heterólogo puede reemplazar a un promotor endógeno y/o puede insertarse cadena arriba o cadena abajo del promotor endógeno que regula la expresión del gen endógeno de lipasa, por ejemplo, usando recombinación homóloga o recombinación específica de sitio. El promotor heterólogo puede ser un promotor constitutivo o un promotor inducible que aumente la expresión del gen endógeno de lipasa.
Se pueden realizar modificaciones adicionales a las cianobacterias recombinantes de la invención para afectar a la producción de ácidos grasos libres. Por ejemplo, una cianobacteria recombinante o una célula hospedadora de la invención, puede incluir una o más moléculas de ácido nucleico exógeno que codifiquen un polipéptido que participe en la síntesis de un ácido graso, incluyendo, pero sin limitación, una acetil-CoA carboxilasa, una malonil CoA: a Cp transacilasa o una beta-cetoacil-ACP sintasa.
Adicionalmente, o de manera alternativa, la cianobacteria recombinante puede comprender una modificación de una molécula de ácido nucleico endógena que codifique, por ejemplo, una acil-CoA sintetasa, acil-ACP sintetasa, acil CoA deshidrogenasa, glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, acetaldehído CoA deshidrogenasa, piruvato deshidrogenasa, acetato cinasa, y similares, y combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, la modificación regula negativamente el ácido nucleico endógeno e incluye deleción, silenciamiento o inactivación parcial, sustancial o completa, del ácido nucleico o sus elementos reguladores.
En algunos ejemplos, la célula hospedadora puede tener expresión atenuada de un gen endógeno que codifique una acil-ACP sintetasa que participe en el reciclaje de ácidos grasos en lípidos. El gen endógeno de acil-ACP sintetasa puede estar, por ejemplo, regulado negativamente por deleción o mutación del promotor, o la proteína que codifica el gen puede delecionarse o alterarse internamente, por ejemplo, por mutagénesis insercional. De manera alternativa, se puede delecionar todo el gen de la acil-CoA sintetasa, por ejemplo, por recombinación homóloga u otras técnicas de modificación del genoma. En otras alternativas adicionales, para atenuar la expresión del gen endógeno de la acil-ACP sintetasa, en la célula hospedadora pueden introducirse construcciones que disminuyan la expresión (knockdown) de genes, tales como, aunque sin limitación, construcciones ribozimáticas, antisentido, o de iARN.
Adicionalmente, o de manera alternativa, la cianobacteria recombinante puede modificarse de modo que uno o más genes que codifican las enzimas de la ruta de oxidación beta se hayan inactivado y/o regulado negativamente, y/o de modo que las propias enzimas que están operativas en dichas rutas de oxidación beta puedan inhibirse. Esto podría impedir la degradación de los ácidos grasos liberados por las acil-ACP, mejorando así el rendimiento de los productos de ácidos grasos. En los casos en los que los productos deseados sean ácidos grasos de cadena media, se puede realizar la inactivación y/o regulación negativa de genes que codifican las enzimas acil-CoA sintetasa y/o acil-CoA oxidasa que utilizan preferentemente estas longitudes de cadena como sustratos. Las mutaciones en los genes que codifican enzimas acil-CoA sintetasa y/o acil-CoA oxidasa específicas de cadena media, de manera que la actividad de las enzimas se vea disminuida, pueden ser adicional o alternativamente eficaces para aumentar el rendimiento de los productos de ácidos grasos producidos y/o liberados. En los genes pueden introducirse mutaciones utlizando métodos recombinantes o no recombinantes.
Los genes pueden ser específicamente objeto de una alteración, deleción, generación de secuencias antisentido, generación de ribozimas, iARN, modificación del genoma de meganucleasas y/u otras estrategias recombinantes. La inactivación de los genes, puede realizarse además o como alternativa, mediante técnicas de mutación al azar, tales como exposición a UV y/o a mutágenos químicos, y los genes y/o las enzimas resultantes pueden explorarse con respecto a mutantes con la actividad deseada. Las propias proteínas pueden inhibirse mediante la generación intracelular de anticuerpos apropiados, la generación intracelular de inhibidores peptídicos, o similares, o alguna de estas combinaciones.
En realizaciones adicionales, una cianobacteria recombinante de la invención puede modificarse de modo que uno o más genes codificantes de enzimas de la ruta de la biosíntesis de almacenamiento de hidratos de carbono y/o polihidroxialcanoato (PHA) estén inactivados o regulados negativamente, y/o de modo que las propias enzimas que están operativas en dichas rutas estén inhibidas. Como ejemplos se incluyen, pero sin limitación, enzimas implicadas en la síntesis de glicógeno, almidón o crisolaminarina, incluyendo glucanosintasas y/o enzimas ramificantes. Otros ejemplos incluyen enzimas implicadas en la biosíntesis de p Ha tales como acetoacetil-CoA sintasa y PHA sintasa.
Modificaciones para la producción de derivados de ácidos grasos
Las cianobacterias recombinantes de la invención pueden incluir modificaciones adicionales para la producción de derivados de ácidos grasos tales como, por ejemplo, aldehídos grasos, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, ésteres de cera e hidrocarburos, incluyendo alcanos y alquenos. En algunas realizaciones, la cianobacteria recombinante comprende una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una acil-CoA reductasa, una ácido carboxílico reductasa y/o una acil-ACP reductasa exógena y puede producir un alcohol graso.
Por ejemplo, para la producción de aldehídos grasos, que opcionalmente se pueden convertir en productos tales como alcoholes grasos, ésteres de cera o alcanos, una cianobacteria transgénica, como se proporciona en el presente documento, puede incluir uno o más genes exógenos que codifiquen una reductasa formadora de aldehído, tales como, por ejemplo, una acil-CoA reductasa formadora de aldehído, una acil-ACP reductasa formadora de aldehído, o una ácido carboxílico reductasa. Los genes, o partes de los genes, que se enumeran en el GenBank y en otras bases de datos genéticas y que se espera que codifiquen proteínas que sean homólogas a las acil-CoA reductasas conocidas que producen aldehídos grasos, denominadas en el presente documento "acil-CoA reductasas grasas generadoras de aldehído", pueden introducirse en varios microorganismos para analizar la producción de aldehídos grasos o alcoholes grasos específicos producidos a partir de ellos. Como ejemplos no limitantes de acil-CoA reductasas generadoras de aldehído graso se incluyen el gen de Acr1 de Acinetobacter baylyi (Registro U77680, GI:1684885), el gen de AcrM-1 de Acinetobacter sp. M-1 (Registro YP 001086217, GI:18857900) y los genes de luxC y luxE de diversas bacterias fotoluminiscentes, por ejemplo, de especies de los géneros Altermonas, Photobacterium, Shewanella, Vibrio o Xenorhabdus. Las enzimas codificadas por estos y otros genes identificados, por ejemplo, por homología de secuencias o dominios de proteínas, pueden analizarse para determinar sus sustratos y productos usando ensayos conocidos en la técnica.
Como ejemplos no limitantes de ácido carboxílico reductasas que pueden utilizarse en la invención se incluyen el gen del CAR (receptor de antígeno quimérico) de Nocardia (Registro AY495697; GI:40796034) y sus homólogos, algunos de los cuales se desvelan en el documento US2010/0105963.
En algunos ejemplos, la célula hospedadora puede incluir un gen no originario que codifica una acil-ACP reductasa formadora de aldehído tal como, pero sin limitación, cualquiera de los desvelados en los documentos WO 2009/140696 y WO 2011/066137. Por ejemplo, la célula hospedadora recombinante puede comprender una acil-ACP reductasa formadora de aldehído que tenga una identidad de secuencia de al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90% o 95 % con una reductasa formadora de aldehído, por ejemplo, como se desvela en los documentos WO 2009/140696 o WO 2011/066137, tal como, por ejemplo, cualquiera de las reductasas que tengan los números de registro AAM82647; AAM82647; BAD78241; ABA22149; BAB76983; ZP_03763674; ACL42791; ZP_01628095; ZP_01619574; YP_001865324; YP_721978; NP_682102; YP_001518341; YP_002371106; ZP_05027136; ZP_03273554; NP_442146; ZP_01728620; ZP_05039135; YP_001802846; NP_926091; YP_001660322; ZP_00516920; CAO90781; ZP_01085337; YP_001227841; ABD96327; NP_897828; YP_001224378; ABD96480; ZP_01123215; ABB92249; ZP_01079773; YP_377636; NP_874926; NP_895058; ABD96274; ABD96442; ZP_01469469; ZP_05045052; YP_001014416; YP_001010913; YP_381056; YP_001550421; NP_892651; YP_001090783; ZP_01472595; YP_293055; ZP_05138243; YP_731192; YP_001483815; YP_001008982; YP_473896; YP_478638; o YP_397030. En algunas realizaciones, la célula hospedadora recombinante incluye un gen exógeno que codifica una acil-ACP reductasa formadora de aldehído, donde la acil-ACP reductasa formadora de aldehído puede ser de una especie de cianobacteria y puede ser de la misma especie que la del microorganismo hospedador, o puede ser de una especie diferente. De manera alternativa, un hospedador de cianobacteria puede genomodificarse para que sobreexprese un gen endógeno de acil-ACP reductasa.
Para la producción de alcoholes grasos, una cianobacteria recombinante, como se proporciona en el presente documento, puede incluir un gen exógeno que codifique una acil reductasa formadora de alcohol tal como bfar de Bombyx mori; jjfar de Simmondsia chinensis, una acil-CoA reductasa de Titicum aestivum, mfar1 de Mus musculus, mfar2 de Mus musculus, hfar de H. sapiens, FARXIII de Ostrinia scapulalis, MS2 de Z. mays, la supuesta acil-coA reductasa grasa de Oryza sativa (registro de GenBank BAC84377) o MS2, FAR4, FAR6 o CER4 de Arabidopsis thaliana. Una acil-CoA reductasa grasa formadora de alcohol también puede ser una enzima procariota, tal como, por ejemplo, las que tienen los números de registro de Genbank AAC45217 (acil-CoA reductasa grasa de Acinetobacter baylyi), YP_047869 (Acinetobacter sp. ADP1 acil-CoA reductasa grasa), BAB85476 (M-1 acil coenzima A reductasa de Acinetobacter sp.), YP_001086217 (acil coenzima A reductasa de Acinetobacter baumannii ATCC 17978), YP_580344 SDR deshidrogenasa/reductasa de cadena corta [Psychrobacter cryohalolentis K5], YP_001280274 (SDR deshidrogenasa/reductasa de cadena corta de Psychrobacter sp. PRwf-1), la acil reductasa de Marinobacter algicola DG893 (Registro ZP_01892457), la acil deshidrogenasa de cadena corta de Marinobacter aquaeolei Maqu_2507 (YP_959769) Marinobacter aquaeolei VT8 Maqu_2220 (YP_959486), Hahella chejuensis Hch_05075 (YP_436183), Marinobacter adhaerens HP15_810 (ADP96574) o una acil reductasa de especies del género Oceanobacter (e.g., RED65_09894, Registro EAT13695). Las reductasas formadoras de alcohol pueden incluir las que pueden utilizar acil-ACP como sustrato, como se desvela en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite, otorgada conjuntamente N.° 61/539,640, titulada "Fatty Alcohol-Forming Acyl-ACP Reductases", presentada el 27 de septiembre de 2011.
De manera alternativa o además, la cianobacteria recombinante comprende una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una acil-CoA reductasa exógena, una ácido carboxílico reductasa y/o una acil-ACP reductasa y una cera sintasa exógena y puede producir un éster de cera. Los ésteres de cera incluyen una cadena A y una cadena B unidas a través de un enlace éster, uno o ambos de los cuales pueden proceder de un ácido graso generado por las cianobacterias recombinantes de la invención. Los ésteres de cera producidos por las cianobacterias recombinantes de la invención incluyen, por ejemplo, longitudes de cadena A de 8 a 24 carbonos, por ejemplo, de 12 a 18 carbonos o de 12 a 16 carbonos, y/o longitudes de cadena B de 8 a 24 carbonos, por ejemplo, de 12 a 18 carbonos, o de 12 a 16 carbonos. Por ejemplo, los ésteres de cera pueden tener longitudes de cadena A B que incluyan, pero sin limitación, de 16 a 48 carbonos, de 24 a 36 carbonos o de 24 a 32 carbonos.
Las sintasas de cera incluyen polipéptidos que tienen el número de clasificación de enzimas EC (enzyme classification) 2.3.1.75, así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de un acil-tioéster en ésteres grasos, por ejemplo, algunas aciltransferasas, incluyendo algunas DGAT. Algunos péptidos de cera sintasa también pueden catalizar otras reacciones, por ejemplo, para producir ésteres grasos, algunos péptidos de cera sintasa aceptarán las acil-CoA de cadena corta y los alcoholes de cadena corta. En la patente de Estados Unidos N.° 7.118.896, se proporcionan métodos para identificar la actividad cera sintasa. Los ejemplos no limitantes de cera sintasas que una molécula de ácido nucleico exógeno introducida en una cianobacteria recombinante como se describe en el presente documento puede codificar, incluyen, la ester de cera sintasa /acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa bifuncional de Simmondsia chinensis (AAD38041), la cera sintasa de Acinetobacter sp. cepa ADP 1 (CAG67733), Pseudomonas aeruginosa (AAG06717), Arabidopsis thaliana (Q93ZR6), Alcanivorax (eDx 90960), Rhodococcus opacus (YP_002782647), Homo sapiens (Q6E213), Mus musculus (Q6E1M8) o Petunia x hybrida (AAZ08051).
En algunas realizaciones, las cianobacterias recombinantes de la invención comprenden al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una ácido graso descarboxilasa exógena o una aldehido graso descarboxilasa exógena, o adicionalmente al menos una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una acil-CoA reductasa exógena, ácido carboxílico reductasa, o acil-ACP reductasa, y pueden producir un alcano y/o alqueno. Los alcanos y alquenos producidos por los microorganismos recombinantes o las células hospedadoras de la invención pueden, por ejemplo, tener longitudes de cadena de 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y/o 23 carbonos, incluyendo, por ejemplo, longitudes de cadena de 7, 9, 11, 13, 15 y/o 17 carbonos, o longitudes de cadena de 7, 9, 11, 13 y/o 15 carbonos, o longitudes de cadena de 11, 13 y/o 15 carbonos.
Además, las cianobacterias recombinantes de la invención que producen un alcohol graso, aldehído graso, éster de ácido graso, éster de cera o hidrocarburos, incluyendo un alcano o un alqueno, pueden incluir, opcionalmente, una molécula de ácido nucleico que codifique una acil-CoA sintetasa exógena, o puede genomodificarse para que tenga una expresión regulada positivamente de un gen endógeno de acil-CoA sintetasa.
Además, opcionalmente, la célula hospedadora recombinante puede genomodificarse para que exprese un transportador transmembrana exógeno para facilitar la secreción de uno o más productos de ácidos grasos. Por ejemplo, la célula hospedadora recombinante puede incluir un gen no originario que codifique un transportador de casete de unión a ATP (ABC, siglas del inglés ATP-binding cassette) o una bomba de RND. En algunas realizaciones, la secuencia del transportador es al menos 80 % idéntica a la de una proteína transportadora codificada por los genes de Arabidopsis, CER5, WBC11, AtMRPS, AmiS2 y AtPGP1 o por genes transportadores de ácidos grasos (FATP) de especies de los géneros Saccharomyces, Drosophila, de micobacterias o de mamíferos. También se desvelan genes que codifican variantes de estas y otras enzimas de origen natural que participan en la síntesis de productos de ácidos grasos que tienen una identidad de al menos 65 % con las proteínas mencionadas o de origen natural, en donde la actividad de la enzima no está sustancialmente reducida con respecto a la de la enzima de tipo silvestre o mencionada anteriormente.
Las células hospedadoras recombinantes descritas anteriormente pueden utilizarse en cualquiera de los métodos de producción de un producto de ácido graso como se describe en el presente documento.
Moléculas de ácido nucleico
Las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos descritos en el presente documento pueden utilizarse en cualquiera de los métodos de la invención, y pueden incluirse en cualquiera de las cianobacterias recombinantes de la invención. Se proporcionan moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias que codifican las LPAAT para su uso en cianobacterias hospedadoras y métodos para producir productos de ácidos grasos, incluidos los ácidos grasos libres, aldehídos grasos, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, ésteres de cera, alcanos y/o alquenos. Una molécula de ácido nucleico como se desvela en el presente documento puede aislarse y/o purificarse. En algunas realizaciones, la expresión en una cianobacteria hospedadora de una molécula de ácido nucleico recombinante o secuencia que codifica una LPAAT como se describe en el presente documento, da como resultado un nivel de producción más alto de un ácido graso o un derivado de ácido graso por la cianobacteria hospedadora en comparación con el nivel de producción en una cianobacteria de control, donde la cianobacteria de control se cultiva en las mismas condiciones y es sustancialmente idéntica, en todos los aspectos, a la cianobacteria que expresa la molécula o secuencia de ácido nucleico no originario que codifica la LPAAT, con la excepción de que la cianobacteria de control no expresa una molécula de ácido nucleico no originario que codifique una LPAAT.
En realizaciones adicionales, la expresión en una cianobacteria hospedadora de una secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una LPAAT y una secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una tioesterasa como se describe en el presente documento, da como resultado un nivel de producción más alto de un producto de ácido graso por la cianobacteria hospedadora en comparación con el nivel de producción en una cianobacteria de control, donde la cianobacteria de control se cultiva en las mismas condiciones y es sustancialmente idéntica, en todos los aspectos, a la cianobacteria que expresa la(s) molécula(s) de ácido nucleico o secuencias recombinantes, con la excepción de que la cianobacteria de control no expresa una tioesterasa y no expresa secuencias de ácido nucleico no originario que codifique una LPAAT.
En algunas realizaciones, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican mutantes de deleción de una LPAAT donde uno o más aminoácidos se han delecionado de la proteína. Por ejemplo, el polipéptido codificado puede carecer de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 u 80 aminoácidos del extremo N y/o C y puede tener una secuencia de aminoácidos al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente de SEQ ID NO: 2. En algunos ejemplos, las secuencias delecionadas pueden incluir secuencias de direccionamiento, por ejemplo, al menos una parte de un péptido de tránsito al cloroplasto, al menos una parte de una secuencia de direccionamiento mitocondrial, al menos una parte de una secuencia de direccionamiento al retículo endoplasmático, etc.
Además, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácidos de LPAAT de origen natural, tales como, pero sin limitación, variantes de la secuencia de LPAAT de SEQ ID NO: 2. Las variantes pueden ser de origen natural o no natural, tales como las inducidas por diversos mutágenos y procesos mutagénicos. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico codifica una variante de una LPAAT en la que al menos un resto de aminoácido N y/o C terminal se ha insertado en, y/o dentro de, la secuencia de referencia. En algunas realizaciones, al menos un resto de aminoácido N y/o C terminal se ha delecionado de, y/o dentro de, la secuencia de referencia. En algunas divulgaciones, las moléculas de ácido nucleico pueden codificar variantes que pueden ser secuencias que contienen mutaciones predeterminadas, por ejemplo, por recombinación homóloga o mutagénesis dirigida o por PCR; proteínas correspondientes de otras especies; alelos u otras variantes de origen natural; y/o derivados en los que la proteína se ha modificado de manera covalente, a través de medios químicos, enzimáticos u otros medios apropiados, con un residuo distinto de un aminoácido natural.
Una sustitución, inserción o deleción, puede afectar negativamente a la proteína cuando la secuencia alterada inhibe sustancialmente una función biológica asociada a la proteína. En determinados aspectos de la divulgación, una variante de una LPAAT puede tener una actividad que se reduce en no más de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 %, en comparación con la actividad de la LPAAT de la que procede la variante (por ejemplo, SEQ ID NO: 2). En algunos aspectos de la divulgación, la cantidad de un producto de ácido graso producido por una célula hospedadora que expresa la LPAAT variante no es inferior a aproximadamente 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 85 %, 80 % o 75 % de la cantidad o el producto de ácido graso producido por una célula hospedadora que expresa la LPAAT de la que procede la variante (por ejemplo, SEQ ID NO: 2).
La invención también se refiere a fragmentos y variantes de una LPAAT que tienen una actividad aumentada en comparación con la de los polipéptidos de referencia. En determinados aspectos, el fragmento o la variante de LPa At puede tener una actividad que está aumentada en al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 % o 1000 % en comparación con la actividad de la LPAAT de la que procede la variante. En determinados aspectos, la cantidad de ácido graso o derivado de ácido graso producida por una célula hospedadora que expresa el fragmento o la variante es al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 % o 1000 % de la cantidad de producto de ácido graso que produce una célula hospedadora que expresa la LPAAT de la que procede el fragmento o la variante.
Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico desveladas, puede comprender, opcionalmente además, una secuencia de ácido nucleico adicional de al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000 o 1500 nucleótidos de un organismo fotosintético.
Otras modificaciones
La invención también se refiere a variantes adicionales de las secuencias de nucleótidos de la invención. En algunas realizaciones, las variantes de secuencia de nucleótidos codifican fragmentos o variantes de los polipéptidos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, las variantes de la secuencia de nucleótidos son de origen natural. En otras realizaciones, las variantes de la secuencia de nucleótidos son de origen no natural, tales como las inducidas por diversos mutágenos y procesos mutagénicos. En determinadas realizaciones, las variantes de la secuencia de nucleótidos son una combinación de origen natural y no natural. Se puede modificar una secuencia de ácido nucleico dada, por ejemplo, según métodos estándar de mutagénesis o evolución artificial o de intercambio de dominios, para producir secuencias modificadas. Por ejemplo, en Stemmer (1994) Nature 370, 389­ 391 y Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91, 10747-10751, se describen métodos de evolución acelerada. La alteración química o enzimática de los ácidos nucleicos y polipéptidos expresados puede realizarse por métodos estándar. Por ejemplo, una secuencia puede modificarse mediante la adición de grupos fosfato, grupos metilo, lípidos, azúcares, péptidos o compuestos orgánicos o inorgánicos, mediante la inclusión de nucleótidos o aminoácidos modificados, o similares.
Para la expresión óptima de una proteína recombinante, en determinados casos, puede ser beneficioso emplear secuencias codificantes que producen ARNm con codones utilizados preferentemente por la célula hospedadora para ser transformados ("optimización de codones"). Por tanto, para mejorar la expresión de transgenes, el uso de codones del transgén puede coincidir con el sesgo de codones específico del organismo en el que se desea que se exprese el transgén. Se cree que los mecanismos exactos subyacentes a este efecto son muchos, pero puede incluir el equilibrio adecuado de los grupos de ARNt aminoacilados disponibles con las proteínas que se sintetizan en la célula, junto con una traducción más eficiente del ARN mensajero (ARNm) transgénico cuando se satisface esta necesidad. En algunas realizaciones, solo una parte de los codones se cambia para reflejar un uso de codones preferido de una cianobacteria hospedadora. En determinadas realizaciones, uno o más codones se cambian por codones que no son necesariamente el codón más preferido del microorganismo hospedador que codifica un aminoácido particular. Se dispone de información adicional sobre la optimización de codones, por ejemplo, en la base de datos de uso de codones de GenBank. Las secuencias codificantes pueden ser secuencias con codones optimizados para la producción óptima de un producto deseado en el organismo hospedador seleccionado para la expresión. En determinadas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico no originaria que codifica una LPAa T y/o la secuencia de ácido nucleico no originaria que codifica una tioesterasa es un secuencia con codones optimizados para la expresión en una cianobacteria.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico de la divulgación codifican proteínas de fusión que comprenden una LPAAT. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender secuencias de polinucleótidos que codifiquen glutatión-S-transferasa (GST) o una parte de la misma, tiorredoxina o una parte de la misma, proteína de unión a maltosa o una parte de la misma, poli-histidina (por ejemplo, His6), poli-HN, poli-lisina, una secuencia de etiqueta de hemaglutinina, HSV-Tag y/o al menos una parte de HIV-Tat fusionada a la secuencia codificante de LPAAT.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico de la divulgación comprenden secuencias no codificantes adicionales tales como secuencias 3' y 5' no codificantes (que incluyen, por ejemplo, secuencias reguladoras) que pueden ser homólogas o heterólogas al gen LPAAT.
Construcciones de ácido nucleico
La invención también se refiere a construcciones que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una LPAAT y/o una tioesterasa que puede incluir además una o más secuencias que regulan o median la transcripción, traducción o integración de secuencias de nucleótidos en un genoma hospedador. Por ejemplo, la invención se refiere a construcciones de expresión que comprenden uno o más "elementos de control de expresión" o secuencias que regulan la transcripción de expresión de un gen unido operativamente, o la traducción del ARN transcrito. Por ejemplo, un elemento de control de la expresión puede ser un promotor que puede estar unido operativamente al gen de interés (por ejemplo, un gen de LPAAT) en una construcción de expresión o "casete de expresión". En algunas realizaciones de lo anterior, el promotor es regulable, por ejemplo, inducible.
En aspectos de la divulgación en los que la construcción de ácido nucleico no contiene un promotor en unión operativa con la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen de interés (por ejemplo, un gen de LPAAT), la secuencia de ácido nucleico puede transformarse en las células de tal manera que vuelva a estar en unión operativa con un promotor endógeno, por ejemplo, mediante recombinación homóloga, integración específica de sitio y/o integración vectorial. En algunos aspectos, las secuencias genómicas del hospedador incluidas en una construcción de ácido nucleico para mediar en la recombinación homóloga en el genoma del hospedador, pueden incluir secuencias reguladoras de genes, por ejemplo, una secuencia promotora, que puede regular la expresión de un gen de LPAAT de la construcción de ácido nucleico. En dichos aspectos, el transgén o los transgenes de la construcción pueden unirse operativamente a un promotor que es endógeno al microorganismo hospedador. En algunas realizaciones, el promotor o los promotores endógenos son regulables, por ejemplo, inducibles.
Un promotor unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una LPAAT puede ser un promotor que sea heterólogo con respecto al gen de LPAAT. En algunas realizaciones de la divulgación anterior, el promotor puede ser un promotor inducible, es decir, un promotor que media en la transcripción de un gen unido operativamente en respuesta a un estímulo particular. Dichos promotores pueden ser ventajosos, por ejemplo, para minimizar cualquier efecto nocivo sobre el crecimiento de la célula hospedadora y/o para maximizar la producción del producto de ácido graso. Un promotor inducible puede ser sensible, por ejemplo, a la luz o a la oscuridad o a la alta o baja temperatura, y/o puede ser sensible a compuestos específicos. El promotor inducible puede ser, un promotor de ara, un promotor de lac, promotor de trp, un promotor de tet (por ejemplo, patente de Estados Unidos N.° 5.851.796), un promotor híbrido que incluya una parte de un promotor de trp, lac, o tet, un promotor sensible a hormonas (p. ej., un promotor sensible a la ecdisona, tal como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 6.379.945), un promotor de metalotionina (por ejemplo, patente de Estados Unidos N.° 6.410.828), un promotor relacionado con la patogénesis (PR) que puede ser sensible a un producto químico tal como, por ejemplo, ácido salicílico, etileno, tiamina y/o BTH (patente de Estados Unidos N.° 5.689.044), o similares, o alguna combinación de los mismos. Un promotor inducible también puede responder a la luz o la oscuridad (patente de Estados Unidos N.° 5.750.385, patente de Estados Unidos N.° 5.639.952), a metales (Eukaryotic Cell 2: 995-1002 (2003)) o a la temperatura (patente de Estados Unidos N.° 5.447.858; Abe et al. Plant Cell Physiol. 49: 625-632 (2008); shroda et al. Plant J. 21: 121-131 (2000)). La lista anterior es ejemplar y no limitante. La secuencia promotora puede ser de cualquier organismo, siempre que sea funcional en el organismo hospedador. En determinadas realizaciones, los promotores inducibles se forman fusionando una o más partes o dominios de un promotor inducible conocido, con al menos una parte de un promotor diferente que puede intervenir en la célula hospedadora, por ejemplo, para conferir inducibilidad a un promotor que intervenga en la especie hospedadora.
Para la transformación de cianobacterias, se puede utilizar una variedad de promotores que intervengan en las cianobacterias, incluyendo, pero sin limitación, los promotores de ara lac y trc, así como derivados que también son inducibles mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) tal como el promotor de trcY o trcE. Otros promotores que pueden encontrar uso en la invención incluyen promotores que están naturalmente asociados a genes de resistencia a antibióticos transmitidos por cromosomas bacterianos o transposones (por ejemplo, neomicina fosfotransferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, espectinomicina adeniltransferasa, o similares, o combinaciones de los mismos), promotores asociados a diversos genes heterólogos de bacterias y de cianobacterias originarios, promotores de virus y fagos, promotores sintéticos, o similares, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el promotor, o promotores, pueden seleccionarse de promotores procariotas de una variedad de especies, incluidas especies de eubacterias y cianobacterias, tales como, por ejemplo, un promotor de araC o pBAD, un promotor de rha, un promotor de Pm, un promotor de xylS, un promotor de nir, un promotor de nar, un promotor de pho, un promotor de tet, un promotor de cys, un promotor de metalotioneína, un promotor de ftf, un promotor de gln, un promotor de choque térmico, un promotor inducible por frío o un promotor vírico. Los promotores anteriores son ejemplares y no limitativos. Como promotores aislados de cianobacterias que pueden utilizarse pueden incluirse, pero sin limitación, los siguientes: nrs (inducible por níquel), secA (secreción; controlado por el estado redox de la célula), rbc (operón de Rubisco), psaAB (proteínas del centro de reacción de PS I; reguladas por luz), psbA (proteína D1 de PSII; inducible por luz), y similares, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los promotores están regulados por compuestos de nitrógeno, tales como, por ejemplo, promotores de nar, ntc, nir o nrt. En algunos aspectos de la divulgación, los promotores están regulados por fosfato (por ejemplo, promotores de pho o pst) o metales, por ejemplo, el promotor de nrs (Liu y Curtis (2009) Proc Natl Acad Sciences USA 106: 21550-21554) o el promotor de petE (Buikema y Haselkorn (2001) Proc Natl Acad Sciences USA 98: 2729-2734). Los promotores inducibles, como los utilizados en las construcciones de la presente divulgación, puede utilizar una o más partes o dominios de los promotores mencionados anteriormente y/u otros promotores inducibles fusionados a al menos una parte de un promotor diferente que pueda intervenir en el organismo hospedador, por ejemplo, para conferir inducibilidad a un promotor que intervenga en la especie hospedadora.
Asimismo, para la construcción del vector de expresión puede utilizarse una gran variedad de terminadores transcripcionales. Como ejemplos de posibles terminadores pueden incluirse, pero sin limitación, psbA, psaAB, rbc, secA, proteína de recubrimiento de T7, y similares, y combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos de la divulgación, una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante de la invención puede comprender tanto una secuencia de ácido nucleico que codifica una LPAAT como una secuencia de ácido nucleico que codifica una tioesterasa. Las secuencias de ácido nucleico que codifican la LPAAT y la tioesterasa pueden ser, por ejemplo, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento.
En determinados aspectos de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una LPAAT y la secuencia de ácido nucleico que codifica una tioesterasa, pueden unirse operativamente al mismo promotor y/o potenciador. Por ejemplo, en aspectos particulares de la divulgación, los dos genes (que codifican una LPAAT y una tioesterasa) pueden organizarse como un operón, en el que, por ejemplo, después de una secuencia promotora viene, en la dirección 5' a 3', una secuencia codificante de tioesterasa y después una secuencia codificante de LPAAT. En una configuración alternativa del operón, después de una secuencia promotora viene, en la dirección 5' a 3', una secuencia codificante de LPAAT y después una secuencia codificante de tioesterasa. En algunos aspectos de la divulgación, una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir dos o más genes dispuestos en tándem, donde la molécula de ácido nucleico aislada no incluye una secuencia promotora que intervenga en el microorganismo hospedador previsto cadena arriba de los dos o más genes. En estos aspectos, el operón sin promotor puede diseñarse para su integración (por ejemplo, recombinación homóloga) en un sitio del genoma del hospedador que puede incluir una secuencia promotora, de modo que el operón sintético puede regularse transcripcionalmente gracias a un promotor en el genoma del microorganismo hospedador. Además, el operón puede diseñarse para la integración (por ejemplo, recombinación homóloga) en un sitio del genoma del hospedador que puede incluir una secuencia potenciadora, de modo que el operón introducido puede regularse transcripcionalmente gracias a un potenciador en el genoma del microorganismo hospedador. En cualquiera de los operones desvelados anteriormente que incluyen genes de LPAAT y de tioesterasa, se pueden incluir una o más secuencias reguladoras adicionales en la molécula de ácido nucleico aislada, por ejemplo, se puede incluir una secuencia para mejorar la traducción cadena arriba de cualquiera de las secuencias codificantes de genes, y/o se puede incluir opcionalmente un terminador transcripcional en o cerca del extremo 3' del operón sintético.
Además de un gen de LPAAT y de un gen de tioesterasa, en un operón sintético, como se proporciona en el presente documento, pueden incluirse uno o más genes adicionales, donde el uno o más genes adicionales pueden incluir, por ejemplo, uno o más genes que codifican enzimas o proteínas de la ruta de síntesis de ácidos grasos y/o uno o más genes que codifican enzimas o proteínas que pueden mejorar la síntesis de productos de ácidos grasos, uno o más genes que pueden mejorar la fotosíntesis o la fijación de carbono, y/o uno o más genes indicadores o marcadores de selección.
La secuencia de ácido nucleico que codifica una LPAAT y la secuencia de ácido nucleico que codifica una tioesterasa pueden proporcionarse en la misma construcción de ácido nucleico donde están unidas operativamente a diferentes promotores y/o potenciadores de la transcripción. Los promotores y potenciadores pueden ser, por ejemplo, cualquiera de los promotores y potenciadores transcripcionales descritos en el presente documento.
El vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una LPAAT está diseñado para la transformación en cianobacterias. El vector puede permitir la recombinación homóloga de la secuencia codificante de LPAAT con el genoma de la cianobacteria.
Una molécula de ácido nucleico aislada de la presente divulgación puede incluir las secuencias desveladas en el presente documento que codifican una LPAAT u otro polipéptido en un vector, tal como, pero sin limitación, un vector de expresión. Un vector puede ser un ácido nucleico que se haya generado mediante intervención humana, incluyendo medios recombinantes y/o por síntesis química directa, y puede incluir, por ejemplo, uno o más de: 1) un origen de replicación para la propagación de las secuencias de ácido nucleico en uno o más hospedadores (que pueden incluir o no el hospedador de producción); 2) uno o más marcadores de selección; 3) uno o más genes indicadores; 4) una o más secuencias de control de expresión, tal como, pero sin limitación, secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, secuencias terminadoras, secuencias para mejorar la traducción, etc.; y/o 5) una o más secuencias para promover la integración de las secuencias de ácido nucleico en el genoma del hospedador, por ejemplo, una o más secuencias que tienen homología con una o más secuencias de nucleótidos del microorganismo hospedador. Un vector puede ser un vector de expresión que incluya uno o más "elementos de control de expresión" de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción y/o traducción de un ácido nucleico particular en una célula hospedadora. El vector puede ser un plásmido, una parte de un plásmido, una construcción vírica, un fragmento de ácido nucleico, o similar, o una combinación de los mismos.
El vector puede ser un vector con un número de copias alto, un vector lanzadera que puede replicarse en más de una especie de célula, un vector de expresión, un vector de integración, o una combinación de los mismos. Normalmente, el vector de expresión puede incluir un ácido nucleico que comprende un gen de interés unido operativamente a un promotor en un "casete de expresión" que también puede incluir, pero sin limitación, un terminador transcripcional, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de corte y empalme o una secuencia de reconocimiento de corte y empalme, un intrón, un potenciador, una señal de poliadenilación, un sitio interno de entrada al ribosoma y elementos similares. La presente divulgación puede implicar microorganismos recombinantes transformados con un ácido nucleico aislado que comprende un gen de interés bajo el control de un promotor heterólogo. De manera alternativa, si el vector no contiene un promotor unido operativamente con un ácido nucleico aislado que comprende un gen de interés, el ácido nucleico aislado puede transformarse en los microorganismos o en las células hospedadoras de modo que se una operativamente unido a un promotor endógeno por recombinación homóloga, integración específica de sitio y/o integración vectorial.
La presente invención proporciona adicionalmente cianobacterias recombinantes transformadas con un ácido nucleico aislado que comprende un gen de interés que está unido operativamente a uno o más elementos de control de la expresión. En algunos casos, puede ser ventajoso expresar la proteína a un punto determinado durante el crecimiento del microorganismo recombinante, por ejemplo, para minimizar cualquier efecto nocivo sobre el crecimiento del microorganismo recombinante y/o para maximizar la producción del producto de ácido graso de interés. En dichos casos, uno o más genes exógenos introducidos en la cianobacteria recombinante pueden unirse operativamente a un promotor inducible, que media la transcripción de un gen unido operativamente en respuesta a un estímulo particular.
Los vectores de transformación pueden incluir además o como alternativa, un marcador de selección, tal como, pero sin limitación, un gen de resistencia a fármacos, un gen de resistencia a herbicidas, una enzima metabólica y/o un factor necesario para la supervivencia del hospedador (por ejemplo, un marcador auxotrófico), o similares, o una combinación de los mismos. Las células transformadas pueden seleccionarse en función de la capacidad de crecer en presencia del antibiótico y/u otro marcador de selección en condiciones en las que las células que carecen del casete de resistencia o marcador auxotrófico no podrían crecer. Además, en un vector puede haber un marcador no seleccionable, tal como un gen que codifique una proteína o enzima fluorescente que genere un producto de reacción detectable.
Un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende un gen de interés, también puede ser un vector de integración que incluya una o más secuencias que promuevan la integración del gen de interés o un casete de expresión génica en el genoma del microorganismo hospedador o de la célula hospedadora. Por ejemplo, un vector de integración utilizado para transformar cianobacterias puede incluir al menos una secuencia de al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500 o al menos 600 nucleótidos con homología con una secuencia en el genoma del organismo hospedador para permitir que se produzca la integración del gen de interés o casete de expresión génica en el genoma del microorganismo hospedador o de la célula hospedadora a través de recombinación homóloga. En algunos ejemplos, el gen o casete de expresión génica está flanqueado por secuencias homólogas en una región del cromosoma hospedador para promover la integración del gen de interés o del casete de expresión génica en el cromosoma del hospedador. De manera alternativa o además, un vector de integración puede incluir una o más secuencias que promuevan la recombinación específica de sitio o la integración aleatoria, tales como, pero sin limitación, secuencias reconocidas por recombinasas, integrasas o transposasas. El vector de integración puede incluir además un gen que codifique una recombinasa, integrasa o transposasa.
Transformación de microorganismos y células hospedadoras
Un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende un gen de interés puede introducirse en las cianobacterias mediante técnicas convencionales de transformación y/o transfección. Los términos "transformación", "transfección", "conjugación", y "transducción", como se usan en el presente contexto, pretenden comprender una multiplicidad de métodos conocidos por los expertos en la técnica para la introducción de ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN exógeno) en una célula hospedadora, incluida la coprecipitación con fosfato de calcio y/o cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada químicamente, electroporación, bombardeo de partículas, o similares, o combinaciones de los mismos. Pueden encontrarse ejemplos de métodos adecuados para la transformación y/o transfección de células hospedadoras, por ejemplo, en Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2010), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Las células hospedadoras para su uso en la invención pueden transformarse por cualquier medio factible, incluyendo, sin limitación, el uso de la transformación mediada por pistola de partículas, transformación mediada por láser o electroporación. Las bacterias fotosintéticas pueden transformarse por cualquier método adecuado, incluyendo, como ejemplos no limitantes, absorción de ADN natural (Chung et al. (1998) FEMS Microbiol. Lett. 164: 353-361; Frigaard et al. (2004) Methods Mol. Biol. 274: 325-40; Zang et al. (2007) J. Microbiol. 45: 241-245), conjugación, transducción, transformación con perlas de vidrio (Kindle et al. (1989) J. Cell Biol. 109: 2589-601; Feng et al. (2009) Mol. Biol. Rep. 36: 1433-9; patente de Estados Unidos N.° 5.661.017), transformación con bigotes de carburo de silicio (Dunahay et al. (1997) Methods Mol. Biol. (1997) 62: 503-9), biolística (Dawson et al. (1997) Curr. Microbiol. 35: 356-62; Hallmann et al. (1997) Proc. Natl. Acad. USA 94: 7469-7474; Jakobiak et al. (2004) Protist 155:381-93; Tan et al. (2005) J. Microbiol. 43: 361-365; Steinbrenner et al. (2006) Appl Environ. Microbiol. 72: 7477­ 7484; Kroth (2007) Methods Mol. Biol. 390: 257-267; patente de Estados Unidos N.° 5.661.017) electroporación (Kjaerulff et al. (1994) Photosynth. Res. 41: 277-283; Iwai et al. (2004) Plant Cell Physiol. 45: 171-5; Ravindran et al. (2006) J. Microbiol. Methods 66: 174-6; Sun et al. (2006) Gene 377: 140-149; Wang et al. (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol. 76: 651-657; Chaurasia et al. (2008) J. Microbiol. Methods 73: 133-141; Ludwig et al. (2008) Appl. Microbiol. Biotechnol. 78: 729-35), transformación mediada por láser o incubación con ADN en presencia o después de un tratamiento previo con cualquiera de los dendrímeros de poli(amidoamina) (Pasupathy et al. (2008) Biotechnol. J. 3: 1078-82), polietilenglicol (Ohnuma et al. (2008) Plant Cell Physiol. 49: 117-120), lípidos catiónicos (Muradawa et al. (2008) J. Biosci. Bioeng. 105: 77-80), dextrano, fosfato de calcio o cloruro de calcio (Mendez-Alvarez et al. (1994) J. Bacteriol. 176: 7395-7397), opcionalmente después del tratamiento de las células con enzimas degradadoras de la pared celular (Perrone et al. (1998) Mol. Biol. Cell 9: 3351-3365).
Métodos de producción de productos de ácidos grasos
La invención abarca métodos de producción de un producto de ácido graso cultivando las cianobacterias recombinantes descritas en el presente documento, en condiciones en las que se produce al menos un producto de ácido graso. Los métodos pueden comprender además aislar al menos un producto de ácido graso. En algunas realizaciones, el microorganismo libera o secreta en el medio de crecimiento al menos una parte del ácido graso y/o derivado del ácido graso producido por las cianobacterias recombinantes. En algunas realizaciones, la expresión de un polipéptido codificado por las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento puede inducirse en la cianobacteria recombinante para producir el producto de ácido graso.
La liberación y la secreción, tal como se utilizan en el presente documento en el contexto de los productos de la invención, se utilizan indistintamente para referirse a un proceso por el cual los mecanismos de transporte activo y/o pasivo permiten que los productos de la invención atraviesen la membrana celular para salir de la célula. Los ejemplos de dichos mecanismos de transporte pueden incluir, pero sin limitación, difusión en función del gradiente, difusión facilitada, transporte activo y combinaciones de los mismos.
El cultivo se refiere a fomentar intencionadamente el crecimiento (por ejemplo, aumentar el tamaño de las células, el contenido celular y/o la actividad celular) y/o la propagación (por ejemplo, aumentar el número de células por mitosis) de una o más células utilizando condiciones seleccionadas y/o controladas. La combinación tanto del crecimiento como de la propagación puede denominarse proliferación. Los ejemplos no limitantes de condiciones seleccionadas y/o controladas pueden incluir el uso de un medio definido (con características conocidas tales como pH, fuerza iónica y/o fuente de carbono), temperatura, tensión de oxígeno, niveles de dióxido de carbono específicos, crecimiento en un biorreactor, o similar, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la cianobacteria puede crecer en condiciones heterótrofas, utilizando una fuente de carbono reducida, o en condiciones mixotróficas, utilizando tanto luz como una fuente de carbono reducida. Además o como alternativa, la cianobacteria puede cultivarse en condiciones fototróficas. Cuando crece en condiciones fototróficas, la cianobacteria puede usar ventajosamente la luz como fuente de energía. Para la síntesis de biomoléculas por el microorganismo, puede utilizarse una fuente de carbono inorgánica, tal como CO2 o bicarbonato. "Carbono inorgánico", tal como se usa en el presente documento, incluye compuestos o moléculas que contienen carbono que un organismo no puede utilizar como fuente de energía sostenible. Normalmente, el "carbono inorgánico" puede estar en forma de CO2 (dióxido de carbono), ácido carbónico, sales de bicarbonato, sales de carbonato, sales de carbonato de hidrógeno, o similares, o combinaciones de los mismos, que no puede oxidarse para obtener energía sostenible ni utilizarse como fuente de energía reductora por parte de los organismos. Si en el medio de cultivo de una cianobacteria que crece en un medio fototrófico se proporciona una molécula o un compuesto de carbono orgánico, generalmente la célula no lo puede absorber y/o metabolizar para obtener energía y/o normalmente no está presente en una cantidad suficiente para proporcionar energía sostenible para el crecimiento del cultivo celular. Sin embargo, las cianobacterias que crecen en un medio heterotrófico pueden utilizar moléculas de carbono orgánico. Por tanto, la presente invención incluye un proceso para convertir una fuente de carbono en un producto de ácido graso que comprende poner en contacto la fuente de carbono con una cianobacteria recombinante de la invención. En algunos aspectos, la fuente de carbono es una fuente de carbono inorgánica y en otros aspectos la fuente de carbono es una fuente de carbono orgánico.
Las cianobacterias que pueden ser útiles de acuerdo con los métodos de la presente invención se pueden encontrar en varios lugares y entornos en todo el mundo. Sin desear vincularse a ninguna teoría, se observa que, quizás como consecuencia de su aislamiento de otras especies y de su divergencia evolutiva, el medio de crecimiento particular para un crecimiento y generación óptimos de lípidos y/u otros constituyentes de hidrocarburos, puede variar. En algunos casos, es posible que determinadas cepas de cianobacterias no sean capaces de crecer en un medio de crecimiento particular debido a la presencia de algún componente inhibidor o a la ausencia de algún requisito nutricional esencial de la cepa de cianobacteria particular.
Generalmente los medios de crecimiento sólidos y líquidos están disponibles en una gran variedad de fuentes, al igual que las instrucciones para la preparación de medios particulares adecuados para una gran variedad de cepas de cianobacterias.
En algunas realizaciones, los medios utilizados para cultivar un organismo que produce ácidos grasos pueden incluir una mayor concentración de un metal (normalmente proporcionado como una sal y/o en forma iónica) tal como, por ejemplo, sodio, potasio, magnesio, calcio, estroncio, bario, berilio, plomo, hierro, níquel, cobalto, estaño, cromo, aluminio, cinc, cobre, o similares, o combinaciones de los mismos (particularmente metales multivalentes, tales como magnesio, calcio y/o hierro), con respecto a una formulación de medio estándar, tal como, por ejemplo, medio BG-11 estándar (Medio 616 ATc C, Tabla 5), o un medio modificado tal como Medio 854 ATc C (bG-11 modificado para contener vitamina B12) o Medio 617 ATCC (BG-11 modificado para cianobacterias marinas, que contiene NaCl adicional y vitamina B12).
Por ejemplo, un medio utilizado para el crecimiento de microorganismos productores de ácidos grasos libres, puede incluir al menos 2 veces, por ejemplo al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, entre 2 veces y 10 veces y/o entre 10 veces y 100 veces la cantidad de metal (por ejemplo, calcio) en comparación con un medio estándar. El medio utilizado para el crecimiento de microorganismos que pueden producir ácidos grasos libres puede incluir, por ejemplo, al menos 0,5 mM, entre aproximadamente 0,5 mM y aproximadamente 1 mM, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 2 mM, entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 5 mM, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 10 mM, entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 25 mM, y más de 25 mM de metal (por ejemplo, calcio) en la formulación.
En realizaciones adicionales, utilizando la cantidad en exceso de metal (por ejemplo, calcio) en el medio, al menos una parte del ácido graso o de los ácidos grasos puede quedar retenida como precipitados de jabón, lo que puede provocar la disminución de los efectos tóxicos del ácido graso libre o de los ácidos grasos libres. La adición de metal (por ejemplo, calcio) en el medio, puede aumentar además o como alternativa, la tolerancia de los microorganismos en medios con una concentración relativamente alta de ácidos grasos libres. Además o como alternativa, las cepas productoras de ácidos grasos pueden ser ventajosamente más contundentes con un contenido excesivo de metales (por ejemplo, calcio). Aunque en el presente documento el componente en exceso se describe como un metal, se contempla que el componente pueda describirse más generalmente como una fuente de contraiones de carboxilato, por ejemplo, una fuente de contraiones formadores de jabón, una fuente de iones metálicos (indicada como "metal" en el presente documento), una fuente de contraiones multivalente (es decir, que tiene una valencia de 2 o mayor), una fuente de contraiones divalente, o alguna combinación de las mismas. Otros detalles con respecto a esta fuente de contraiones de metal/carboxilato se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite, otorgada conjuntamente N.° 13/324636, titulada "Culturing a Microorganism in a Médium with an Elevated Level of a Carboxylate Counterion Source", presentada el 13 de diciembre de 2011.
Los métodos de cultivo pueden incluir inducir la expresión de un gen particular descrito en el presente documento para la producción de productos de ácidos grasos y/o regular la ruta metabólica en la cianobacteria. Inducir la expresión puede incluir añadir un nutriente o compuesto al cultivo, eliminar uno o más componentes del medio de cultivo, aumentar o disminuir la luz y/o la temperatura, y/u otras manipulaciones que promueven la expresión del gen de interés. Dichas manipulaciones pueden depender en gran medida de la naturaleza del promotor (heterólogo) unido operativamente al gen de interés.
En algunas realizaciones de la presente invención, las cianobacterias recombinantes pueden cultivarse en un biorreactor. Un "biorreactor" se refiere a un recinto o recinto parcial en el que se cultivan células, opcionalmente en suspensión y, cuando es en suspensión, es preferentemente en un líquido acuoso. Los biorreactores pueden ofrecer muchas ventajas para su uso en métodos de crecimiento heterótrofo y propagación. Para producir biomasa para su uso como alimento, las cianobacterias se fermentan preferentemente en grandes cantidades en líquido, tal como, por ejemplo, en cultivos en suspensión. Los biorreactores, tales como fermentadores de acero, pueden dar cabida a volúmenes de cultivo muy grandes (en diversas realizaciones de la invención pueden utilizarse biorreactores de
40000 litros y de mayor capacidad). Normalmente, los biorreactores también pueden permitir el control de una o más condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, tensión de oxígeno, niveles de dióxido de carbono y similares, así como combinaciones de los mismos. Normalmente, los biorreactores pueden configurarse, por ejemplo, utilizando puertos conectados a conducciones, para permitir que componentes gaseosos, tales como CO2 , aire rico en CO2 , oxígeno y/o nitrógeno, se pongan en contacto (por ejemplo, a través de burbujeo) con un cultivo líquido. Otros parámetros de cultivo, tales como el pH de los medios de cultivo, la identidad y/o la concentración de oligoelementos y/o nutrientes, la identidad y/o concentración de otros componentes de los medios, o similares, o combinaciones de los mismos, normalmente se puede manipular más fácilmente utilizando un biorreactor.
Las cianobacterias pueden cultivarse además o como alternativa en un biorreactor dotado de una fuente de luz artificial, un "fotobiorreactor", y/o puede tener una o más paredes suficientemente transparentes a la luz, incluyendo la luz solar, para permitir, facilitar y/o mantener un crecimiento aceptable de cianobacterias. Para la producción de productos de ácidos grasos, los microorganismos fotosintéticos o las células hospedadoras pueden cultivarse además o como alternativa en matraces de agitación, tubos de ensayo, viales, platos de microtitulación, placas de
Petri, o similares, o combinaciones de los mismos.
Además o como alternativa, las cianobacterias recombinantes pueden cultivarse en estanques, canaletas, recipientes de cultivo en el mar, fosas, salinas, canales, o similares, o combinaciones de los mismos. Al igual que con los biorreactores estándar, al cultivo puede suministrarse una fuente de carbono inorgánico (tal como, pero sin limitación, CO2, bicarbonato, sales de carbonato y similares), incluyendo, pero sin limitación, aire, aire rico en CO2 , gases de combustión, o similares, o combinaciones de los mismos. Cuando se suministran gases de combustión y/o de otras fuentes inorgánicas que puedan contener CO además de CO2 , puede ser necesario tratar previamente dichas fuentes de tal manera que el nivel de CO introducido en el (foto)biorreactor no constituya una dosis peligrosa y/o letal con respecto al crecimiento y/o a la supervivencia de las cianobacterias.
Los métodos incluyen el cultivo de una cianobacteria recombinante que incluya una o más proteínas como se describe en el presente documento para producir al menos un producto de ácido graso, en el que el método da como resultado la producción de al menos 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %,
25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 110 %,
120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %,
900 % o 1000% más que la cantidad del producto de ácido graso producido por una cianobacteria de otra manera idéntica que no incluye la(s) proteína(s), cultivada en las mismas condiciones. Además o como alternativa, los métodos incluyen producir al menos 100 mg, al menos 110 mg, al menos 120 mg, al menos 130 mg, al menos
140 mg, al menos 150 mg, al menos 160 mg, al menos 170 mg, al menos 180 mg, al menos 190 mg, al menos
200 mg, al menos 210 mg, al menos 220 mg, al menos 230 mg, al menos 240 mg, al menos 250 mg, al menos 260 mg, al menos 270 mg, al menos 280 mg, al menos 290 mg, al menos 300 mg, al menos 310 mg, al menos 320 mg, al menos 330 mg, al menos 340 mg, al menos 350 mg, al menos 360 mg, al menos 370 mg, al menos 380 mg, al menos 390 mg, al menos 400 mg, al menos 450 mg, al menos 500 mg, al menos 550 mg, al menos 600 mg, menos 650 mg, al menos 700 mg, al menos 750 mg, al menos 800 mg, al menos 850 mg, al menos 900 mg, menos 950 mg, por litro de cultivo de un producto de ácido graso cultivando las cianobacterias recombinantes descritas en el presente documento. Aunque muchas veces el objetivo puede ser producir y/o recuperar la mayor cantidad posible de producto de ácido graso, en algunos casos, la cantidad del producto de ácido graso producido y/o recuperado por el método descrito en el presente documento puede limitarse a 600 mg o menos por litro de cultivo, por ejemplo a 550 mg o menos por litro de cultivo, o a 500 mg o menos por litro de cultivo.
Los productos de ácidos grasos pueden recuperarse del cultivo por medios de recuperación conocidos por los expertos habituales en la materia, tal como por extracción de cultivo completo, por ejemplo, utilizando disolventes orgánicos. En algunos casos, la recuperación de los productos de ácidos grasos se puede mejorar mediante la homogeneización de las células. Cuando los productos de ácidos grasos se liberan o secretan suficientemente de
los microorganismos al medio de cultivo, el método de recuperación se puede adaptar para recuperar de manera eficaz solo los productos de ácidos grasos liberados, solo los productos de ácidos grasos producidos y almacenados en los microorganismos, o los productos de ácidos grasos tanto producidos como liberados.
Los productos de ácidos grasos secretados/liberados en el medio de cultivo por las cianobacterias recombinantes descritas anteriormente, pueden recuperarse de varias maneras. Puede emplearse, por ejemplo, un método de aislamiento directo, por ejemplo, por división, usando solventes inmiscibles. Además o como alternativa, pueden emplearse adsorbentes particulados. Estos pueden incluir partículas lipófilas y/o resinas de intercambio iónico, dependiendo del diseño del método de recuperación. Pueden circular en el medio separado y después recogerse, y/o el medio puede pasar sobre una columna de lecho fijo, por ejemplo, una columna cromatográfica, que contiene estas partículas. Los productos de ácidos grasos se pueden eluir de los adsorbentes particulados, por ejemplo, usando un disolvente apropiado. En dichas circunstancias, un método de aislamiento puede incluir llevar a cabo la evaporación del disolvente, seguido de un procesamiento adicional de los productos de ácidos grasos aislados, para producir productos químicos y/o combustibles que pueden usarse para una variedad de fines comerciales.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el nivel de un producto de ácido graso, por ejemplo, un ácido graso C8-C24, un ácido graso C12-C24 o un ácido graso C12-C18, tal como, por ejemplo, al menos uno de un ácido graso C12, C14, C16 y/o C18, puede aumentarse en el cultivo con respecto a un cultivo de una cianobacteria de otra manera idéntica, pero sin las modificaciones genéticas de la invención.
Debe entenderse que la divulgación de la presente invención se extiende a métodos, productos y sistemas según los diversos aspectos de la invención que comprenden combinaciones de una o más características analizadas en el presente documento con referencia a determinadas realizaciones de la invención con una o más características adicionales analizadas en el presente documento con referencia a determinadas otras realizaciones de la invención.
Ejemplos
La invención, tal y como se ha descrito anteriormente, puede entenderse fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen con fines ilustrativos de determinados aspectos y realizaciones de la presente invención, y que no pretenden limitar la invención.
Ejemplo 1. Producción de ácidos grasos libres en la inhibición por retroalimentación reducida en cepas de Synechocystis sp. PCC6803
Aunque la invención no está ligada a ninguna teoría, los inventores plantearon la hipótesis de que la acil-ACP C18:0, que no es un sustrato preferido de la de acil-ACP tioesterasa de Cc1FatB1 no originaria expresada en la célula, podría acumularse en células productoras de ácidos grasos que expresan la acil-ACP tioesterasa deCc1FatB1 que prefiere C12-C16, posiblemente limitando la producción de ácidos grasos mediante la inhibición por retroalimentación, y que la sobreexpresión de un gen de LPAAT que prefiere C18, podría limitar cualquier efecto inhibidor al reducir el conjunto de acil-ACP C18:0 a través de la condensación, catalizada por LPAAT, de acil-ACP C18:0 con ácido lisofosfatídico para generar ácido fosfatídico. Véase, por ejemplo, la Figura 1. Además de limitar la inhibición por retroalimentación de la síntesis de ácidos grasos, los inventores consideraron que la modificación podría ayudar a estabilizar la membrana celular al promover la biosíntesis de lípidos de la membrana.
1.1. Construcción del vector de LPAAT
Se diseñó una construcción de expresión que incluía un gen codificante de LPAAT con preferencia por las acil-ACP C18:0. El vector pSGI-NB55 (SEQ ID NO: 27; Figura 2) se construyó para sobreexpresar el gen de la Ácido Lisofosfatídico Acil Transferasa (LPAAT) sll1752 (número de registro de Genbank, ID del gen; SEQ ID NO: 1) de Synechocystis sp. PCC 6803 utilizando un promotor de trcY (SEQ ID NO: 28). El gen sll1752 se amplificó a partir de ADN genómico de Synechocystis utilizando los cebadores NB395 (SEQ ID No : 29) y NB396 (SEQ ID NO: 30) que contenían una superposición de secuencia de aproximadamente 15 pb con el vector de integración de cianobacterias pSGI-YC63 (SEQ ID NO: 31). El vector pSGI-YC63 contenía un marcador de espectinomicina para la selección, brazos "RS2 ascendente" (SEQ ID NO: 32) y "RS2 descendente" (SEQ ID NO: 33) homólogos para la integración en el sitio RS2 del genoma de Synechocystis sp. PCC 6803, el represor lacIQ para el promotor de trcY (SEQ ID NO: 28) para impulsar la expresión de sll1752, y un origen de replicación de pUC para la propagación del vector en E. coli. El vector pSGI-YC63 (SEQ ID NO: 31) se amplificó por PCR para producir una molécula de ácido nucleico linealizada utilizando los cebadores NB393 (SEQ ID NO: 34) y NB394 (s Eq ID NO: 35). El producto de PCR purificado para el esqueleto del vector y el gen sll1752 se combinaron en E. coli utilizando el kit de clonación por PCR de Quick y se propagó en células Alpha-Select Gold de E. coli.
1.2. Construcción del vector de tioesterasa de Cc1FatB1. Un gen de tioesterasa de la planta superior Cuphea carthagenensis, Cc1FatB1 (US 2009/0298143; WO 2009/076559), se clonó en un vector diseñado para promover la integración génica en el sitio RS1 del genoma de Synechocystis sp. PCC 6803.
La construcción de acil-ACP tioesterasa pSGI-NB158 (SEQ ID NO: 36; Figura 3) contenía un origen de replicación de P15A para la propagación en E. coli, amplificado a partir del vector pACYC184 usando los cebadores NB470 (SEQ ID NO: 37) y NB471 (SEQ ID NO: 38); un marcador de resistencia a kanamicina para la selección, amplificado a partir del vector de integración de cianobacterias SGI-YC28 usando los cebadores NB466 (SEQ ID NO: 39) y NB467 (SEQ ID NO: 40), fragmentos "RS1 ascendente" (SEQ ID NO: 41) y "RS1 descendente" (SEQ ID NO: 42) para la recombinación homóloga en Synechocystis 6803, amplificados usando los cebadores NB466 y NB467, respectivamente; el promotor de trcY (SEQ ID NO: 28) y un represor de lacIQ para el gen de tioesterasa de Cc1FatB1 impulsado por promotor de trcY de Cuphea (SEQ ID NO: 43) que codifica una acil-ACP tioesterasa truncada en el extremo N (SEQ ID NO: 44) que tiene una preferencia de sustrato por las acil-ACP C12-C16. Para amplificar el casete de tioesterasa trcY-Cc1FatB1 a partir de un vector de expresión anterior, se utilizaron los cebadores NB 462 (SEQ ID NO: 45) y NB 463 (SEQ ID NO: 46). El fragmento IQ de lac se amplificó utilizando los cebadores NB464 (SEQ ID NO: 47) y NB 465 (SEQ ID NO: 48) de otro vector, y el gen de resistencia a kanamicina se amplificó utilizando los cebadores NB466 (SEQ ID NO: 49) y NB467 (SeQ ID NO: 50) del vector pSGI-YC28 (véase la Tabla 1). Los cebadores se diseñaron para que incluyesen secuencias que se incorporasen en los extremos terminales de los productos finales de la PCR de tal manera que los fragmentos amplificados tuviesen una homología terminal de 10-20 pb los con fragmentos de ácido nucleico a clonar adyacentes a los fragmentos. La clonación se realizó utilizando el kit de clonación por PCR de Quick (BPS Biosciences, San Diego). Los clones se transformaron y propagaron en células Alpha-Select Gold competentes E. coli (Bioline, Tauton).
Tabla 1. Cebadores utilizados en la construcción de vectores
Figure imgf000028_0001
1.3. Construcción del vector de desactivación de acil-ACP sintetasa
El vector pSGI-NB19 (SEQ ID NO:51) se utilizó para desactivar el gen de acil-ACP sintetasa slr1609 de Synechocystis sp. PCC 6803. Para amplificar el fragmento del gen slr1609 de Synechocystis sp. PCC 6803, se utilizaron los cebadores NB1 (SEQ ID NO:52) y NB9 (SEQ ID NO:53). Este fragmento se ligó al vector TOPO PCR2.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante, y la construcción del plásmido se propagó en células TOP10 de E. coli (Life Technologies, Carlsbad, CA). Este plásmido se cortó con una enzima de restricción Mfe1 (New England Biolabs, Ipswich, MA). El fragmento GmR se amplificó por PCR a partir de un plásmido pAW4 con los cebadores NB87 y NB88 que contenían sitios de restricción Mfe1 utilizados para cortar los extremos del fragmento de la PCR. Después, esto se ligó en el vector TOPO que contenía el fragmento slr1609 de la etapa anterior para crear el plásmido pSGI-NB19 (SEQ ID NO:51).
1.4. Producción de ácidos grasos libres
Synechocystis sp. PCC 6803 se transformó con la construcción de expresión génica pSGI-NB55 LPAAT (SEQ ID NO:27; Figura 2), la construcción de expresión pSGI-NB158 acil-ACP tioesterasa (s Eq ID NO:36; Figura 3) o la construcción pSGI-NB19 con el gen de la acil-ACP sintetasa atenuado (AAS KO, siglas del inglés Acyl-ACP Synthetase Knock Out) (SEQ ID NO:51; Figura 4) o las combinaciones de pSGI-NB55 y pSGI-NB158 o pSGI-NB55 y pSGI-NB19 esencialmente de acuerdo con Zang et al. (2007) J. Microbiology 45: 241-245. Resumiendo, las células crecieron con luz constante hasta alcanzar una densidad óptica de 730 (DO730) de aproximadamente 0,7 a 0,9 (una DO730 de ~ 0,25 corresponde a ~ 1 x 108 células/ml) y se recogieron por centrifugación a ~ 2000 g durante ~ 15 minutos a temperatura ambiente (~ 20-25°°C). El sedimento celular se resuspendió en aproximadamente 0,3 veces el volumen de medio de crecimiento BG-11 reciente y se utilizó inmediatamente para la transformación. Aproximadamente, se añadió 1 microgramo de ADN plasmídico (que contenía la construcción pSGI-NB55 (SEQ ID NO: 27) que incluía un gen de LPAAT, o la construcción pSGI-NB158 acil-ACP tioesterasa (SEQ ID NO: 36) o la construcción pSGI-NB19 con AAS desactivado (AAS KO) (SEQ ID NO: 51)) a ~ 0,3 ml de células, se mezcló cuidadosamente y se incubó con iluminación durante aproximadamente 5 horas a ~ 30°°C sin agitación. Las células se extendieron sobre un filtro (membrana de policarbonato Track-Etched de Whatmann Nuclepore, PC ~ 47 mm, ~ 0,2 micrómetros) colocado en placas de agar BG-11 de ~ 50 ml y se dejó recuperar con luz durante aproximadamente 16 a 24 horas, después de esto, para seleccionar transformantes, el filtro se levantó y se colocó en una placa BG-11 nueva que contenía espectinomicina (10 pg/ml) para la selección de la construcción de expresión pSGI-NB55de LPAAT (SEC ID NO: 27), kanamicina (10 pg/ml) para la selección de la construcción de expresión pSGI-NB158 de acil-ACP tioestearasa (SEQ ID NO: 36) o gentamicina (5 pg/ml) para la selección de la construcción pSGI-NB19 con el gen de acil-ACP sintetasa desactivado (SEQ ID NO: 51). Las colonias resultantes se exploraron adicionalmente mediante PCR para detectar la presencia de los genes de tioesterasa, utilizando los cebadores que se utilizaron para generar los fragmentos de genes.
Tabla 2. Medio BG-11
Figure imgf000029_0001
Para la producción de ácidos grasos, parches de células de Synechocystis transformadas con las construcciones deseadas (en función de la selección por tamaño utilizando cebadores específicos para la exploración por PCR) se rasparon y se hicieron crecer en 25 ml de medio BG-11 (ATCC 616, como se muestra en la Tabla 2; los pesos de los componentes son aproximados; pH final 7,1; se esterilizaron en autoclave a aproximadamente 121°°C durante aproximadamente 15 minutos) con antibióticos apropiados. Los cultivos líquidos se hicieron crecer en matraces de agitación a 30° C, ~ 65 pmol/m2/s luz, a aproximadamente 215 rpm con un aporte de CO2 de ~ 5 % hasta la turbidez

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una cianobacteria recombinante transformada con una secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una acil-ACP tioesterasa procedente de una planta superior, unida operativamente a un promotor heterólogo y una secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT) procedente de una cianobacteria unida operativamente a un promotor heterólogo, en donde la cianobacteria produce al menos un ácido graso libre o al menos un derivado de ácido graso, y en donde la LPAAT tiene una identidad de al menos 85 % con la SEQ ID NO: 2, y la tioesterasa tiene una identidad de al menos 85 % con la SEQ ID NO: 44.
2. La cianobacteria recombinante de la reivindicación 1, en donde la LPAAT transfiere grupos acilo sobre sustratos C16 o C18.
3. La cianobacteria recombinante de la reivindicación 1 o 2, en donde la cianobacteria recombinante comprende además una construcción para regular negativamente la expresión de un gen de acil-ACP sintetasa o de un gen de acil-CoA sintetasa endógeno, en donde la construcción es una construcción antisentido, una construcción de micro ARN, una construcción ribozimática o una construcción de alteración génica.
4. La cianobacteria recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cianobacteria recombinante comprende además una construcción para regular negativamente la expresión de un gen de acil-ACP sintetasa o de un gen de acil-CoA sintetasa endógeno, en donde la construcción es una construcción de ARN antisentido, una construcción de microARN o una construcción ribozimática.
5. La cianobacteria recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la cianobacteria recombinante es del género Agmenellum, Anabaena, Anabaenopsis, Anacystis, Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Dactylococcopsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitlerinema, Gloeobacter, Gloeocapsa, Gloeothece, Halospirulina, Iyengariella, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Pleurocapsa, Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudanabaena, Rivularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina, Stanieria, Starria, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Tolypothrix, Trichodesmium, Tychonema o Xenococcus.
6. La cianobacteria recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cianobacteria produce: al menos un 10 % más de producto de ácido graso en comparación con una cianobacteria de otra manera idéntica que carece de la secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT), y opcionalmente en donde el producto de ácido graso es uno o más de un ácido graso, un aldehído graso, un alcohol graso, un éster de ácido graso, un éster de cera o un hidrocarburo.
7. La cianobacteria recombinante de la reivindicación 6, en donde el producto de ácido graso es un producto de ácido graso C8-C24, preferentemente un producto de ácido graso C12-C18 o un producto de ácido graso C12-C16, en donde, opcionalmente, el producto de ácido graso está saturado.
8. Un método de producción de un producto de ácido graso que comprende cultivar la cianobacteria recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en condiciones en las que se produce al menos un producto de ácido graso, en donde el producto de ácido graso es uno o más de un ácido graso libre, un aldehído graso, un alcohol graso, un éster de ácido graso, un éster de cera, o un hidrocarburo, y en donde el producto de ácido graso se secreta en el medio.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la cianobacteria recombinante se cultiva de manera fotoautótrofa, y en donde el medio de cultivo no incluye una cantidad sustancial de carbono reducido.
10. El método de la reivindicación 9, en donde se induce la expresión de una, o ambas, de la secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una LPAAT y de la secuencia de ácido nucleico no originario que codifica una tioesterasa.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde al menos un producto de ácido graso producido es un ácido graso libre C8-C24, un alcohol graso o un aldehído graso.
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