MX2010012192A - Metodos y composiciones para producir hidrocarburos. - Google Patents

Metodos y composiciones para producir hidrocarburos.

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Abstract

En la presente se describe composiciones y métodos para producir aldehídos, alcanos y alquenos. Los aldehídos, alcanos y alquenos se pueden usar en biocombustibles.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA PRODUCIR HIDROCARBUROS Antecedentes de la Invención El petróleo es un recurso natural, limitado, encontrado en el Globo Terráqueo en formas líquida, gaseosa o sólida. El petróleo se compone principalmente de hidrocarburos, que están comprendidos principalmente de carbono e hidrógeno. También contiene cantidades significativas de otros elementos, tal como, nitrógeno, oxígeno, o azufre, en diferentes formas.
El petróleo es un recurso valioso, pero los productos de petróleo se desarrollan a costos considerables, tanto financieros como ambientales. Primero, se deben descubrir fuentes de petróleo. La exploración de petróleo es una aventura riesgosa. El costo de explorar pozos en aguas profundas puede exceder $100 millones de dólares. Además, no hay garantía que estos pozos contendrán petróleo. Se estima que sólo 40% de los pozos perforados conducen a pozos productores que generan hidrocarburos comerciales. Además del costo económico, la exploración de petróleo lleva un alto costo ambiental. Por ejemplo, la exploración en ultramar perturba los ambientes marinos circundantes.
Después de que se descubre un pozo productor, se debe extraer el petróleo del Globo terráqueo a un gran costo. Durante la recuperación primaria, la presión natural REF.:214901 subterránea es suficiente para extraer cerca de 20% del petróleo en el pozo. Conforme cae esta presión natural, se emplean métodos de recuperación secundaria, si es que son económicos. En general, la recuperación secundaria comprende el incremento de la presión del pozo, por ejemplo, por inyección de agua, inyección de gas natural o levantamiento por gas. Usando los métodos de recuperación secundaria, se. recupera un 5% a 15% adicional de petróleo. Una vez que se agotan los métodos de recuperación secundaria, se pueden usar métodos de recuperación terciaria, si es que son económicos. Estos métodos terciarios incluyen reducir la viscosidad del petróleo para hacerlo más fácil de extraer. Usando los métodos de recuperación terciaria, se recupera un 5% a 15% adicional de petróleo. Por lo tanto, aun bajo las mejores circunstancias, sólo se puede extraer el 50% del petróleo en un pozo. La extracción de petróleo también lleva un costo ambiental. Por ejemplo, la extracción de petróleo puede dar por resultado grandes infiltraciones de petróleo que se levanta a la superficie. Además, de perforación en ultramar comprende el dragado del fondo marino lo que desestabiliza o destruye el ambiente marino circundante.
Puesto que no se encuentran de manera uniforme los depósitos de petróleo a todo lo largo del Globo terráqueo, el petróleo se debe transportar sobre grandes distancias desde las regiones productoras de petróleo a las regiones consumidoras de petróleo. Además de los costos de envío, también existe el riesgo ambiental de derrames desbastadores de petróléo.
En su forma natural, el petróleo crudo extraído del Globo Terráqueo tiene pocos usos comerciales. Es una mezcla de hidrocarburos (por ejemplo, parafinas (o alcanos) , olefinas (o alquenos) , alquinos, naftenos (o cicloalcanos) , compuestos alif ticos, compuestos aromáticos, etcétera) de longitud y complejidad variable. Además, el petróleo crudo contiene otros compuestos orgánicos (por ejemplo, compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, oxígeno, azufre, etcétera) e impurezas (por ejemplo, azufre, sal, ácido, metales, etcétera) .
Por lo tanto, el petróleo crudo se debe refinar y purificar antes de que se pueda usar de forma comercial. Debido a su alta densidad energética y su fácil transportabilidad, la mayoría del petróleo se refina en combustibles, tal como combustibles para el transporte (por ejemplo, gasolina, diesel, combustible de aviación, etcétera) , petróleo de calentamiento, gas de petróleo licuado, etcétera.
El petróleo crudo también es una fuente primaria de materias primas para producir petroquímicos . Las dos clases principales de materias primas derivadas del petróleo son olefinas de cadena corta (por ejemplo, etileno y propileno) y productos aromáticos (por ejemplo, isómeros de benceno y xileno) . Estas materias primas se derivan de hidrocarburos de cadena más larga en petróleo crudo al fraccionarlo a costo considerable usando una variedad de métodos, ' tal como fraccionamiento catalítico, fraccionamiento con vapor o reformación catalítica. Estas materias primas se usan para producir petroquímicos , que no se pueden refinar directamente del petróleo crudo, tal como monómeros , solventes, detergentes o adhesivos.
Un ejemplo de una materia prima derivada del petróleo crudo es él etileno. Se usa etileno para producir petroquímicos tal como, polietileno, etanol, óxido de etileno, etilenglicol , poliéster, glicol-éter, etoxilato, acetato de vinilo, 1, 2-dicloroetano, tricloroetileno, tetracloroetileno, cloruro de vinilo, y cloruro de polivinilo. Un ejemplo adicional de una materia prima es propileno, que se usa para producir alcohol isopropílico, acrilonitrilo, polipropileno, óxido de propileno, propilenglicol , glicol-éteres, butileno, isobutileno, 1,3-butadieno, elastómeros sintéticos, poliolefinas, alfa-poliolefinas , alcoholes grasos, ácido acrílico, polímeros acrílicos, cloruro de alilo, epiclorhidrina y resinas epoxi .
Estos productos petroquímicos entonces se pueden usar para producir productos químicos de especialidad, tal como plásticos, resinas, fibras,, elastómeros, productos farmacéuticos, lubricantes o geles. Los productos químicos particulares de especialidad que se pueden producir de materias primas petroquímicas son: ácidos grasos, hidrocarburos (por ejemplo, de larga cadena, de cadena ramificada, saturados, insaturados, etcétera) , alcoholes grasos, ésteres, aldehidos grasos, cetonas, lubricantes, etcétera .
Los productos químicos de especialidad tienen muchos usos comerciales. Los ácidos grasos se usan comercialmente como agentes tensioactivos, por ejemplo, en detergentes y jabones. También se pueden usar como aditivos en combustibles, aceites lubricantes, pinturas, lacas, velas, aceite para ensaladas, manteca, cosméticos y emulsionadores . Además, se usan ácidos grasos como activadores de aceleración en productos de caucho. También se pueden usar ácidos grasos como una materia prima para producir ésteres de metilo, amidas, aminas, cloruros de ácido, anhídridos, dímeros de ceteno y peroxiácidos y ésteres .' Los hidrocarburos tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, los alcanos de cadena más corta se usan como combustibles. El metano y etano son los constituyentes principales del gas natural. Se usan alcanos de cadena más larga (por ejemplo, de cinco a dieciséis carbonos) como combustibles para el transporte (por ejemplo, gasolina, diesel o combustible de aviación) . Los alcanos qué tienen más de dieciséis átomos de carbono son componentes importantes de aceites combustibles y aceites lubricantes. Los alcanos aún más largos, que son sólidos a temperatura ambiente, se pueden usar, por ejemplo, como una cera parafínica. Los alcanos que contienen aproximadamente treinta y cinco carbonos se encuentran en el betún, que se usa para el afirmado de carreteras. Además, se pueden fraccionar a alcanos de cadena más larga para producir hidrocarburos comercialmente útiles de cadena más corta.
Igual que los alcanos de cadena corta, los alquenos de cadena corta se usan en combustibles para el transporte. Se usan alquenos de cadena más larga en plásticos, lubricantes y lubricantes sintéticos. Además,' se usan alquenos como una materia prima para producir alcoholes, esteres, plastificantes , agentes tensioactivos , aminas terciarias, agentes mejorados de recuperación de petróleo, ácidos grasos, tioles, anhídridos alquenilsuccínicos, epóxidos, alcanos clorados, alquenos clorados, ceras, aditivos combustibles y reductores de flujo obstaculizado.
Los alcoholes grasos tienen muchos usos comerciales. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias de cosméticos y ' alimentos como emulsionadores , emolientes y espesadores . Debido a su naturaleza anfifílica, los alcoholes grasos se comportan como agentes tensoactivos no iónicos, que son útiles como detergentes. Además, se usan alcoholes grasos en ceras, gomas, resinas, bálsamos y lociones farmacéuticas, aditivos de aceites lubricantes, agentes de terminado y antiestáticos textiles, plastificantes , cosméticos, solventes industriales, y solventes para grasas .
Los ésteres tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, el biodiesel, un combustible alternativo, está comprendido de ésteres (por ejemplo, éster metílico de ácido graso, ésteres etílicos de ácido graso, etcétera) . Algunos ésteres de bajo peso molecular son volátiles, con un olor agradable que los hace útiles como fragancias o agentes saborizantes . Además, se usan ésteres como solventes para lacas, pinturas y barnices. Adicionalmente, algunas sustancias que se presentan de forma natural, tal como ceras, grasas y aceites están comprendidas de ésteres. También se usan ésteres como agentes ablandadores en resinas y plásticos, plastificantes, retardantes a la flama, y aditivos en gasolina y aceite. Además, se pueden usar ésteres en la elaboración de polímeros, películas, textiles, tintes y productos farmacéuticos.
Se usan aldehidos para producir muchos productos químicos de especialidad. Por ejemplo, se usan aldehidos para producir polímeros, resinas (por ejemplo, de Baquelita) , tintes, saborizantes, plastificantes , perfumes, productos farmacéuticos y otros productos químicos. Algunos se usan como solventes, conservadores o desinfectantes. Algunos compuestos naturales y sintéticos, tal como vitaminas y hormonas, son aldehidos. Además, muchos azúcares contienen grupos aldehido.
Se usan cetonas de forma comercial como solventes.
Por ejemplo, frecuentemente se usa acetona como un solvente, pero también es una materia prima para producir polímeros. También se usan cetonas en lacas, pinturas, explosivos, perfumes y procesamiento textil. Además, las cetonas se usan para producir alcoholes, alquenos, alcanos, iminas y enaminas .
Además, el petróleo crudo es una fuente de lubricantes . Los lubricantes derivados del petróleo están compuestos típicamente de olefinas, particularmente poliolefinas y alfa-olefinas . Los lubricantes ya sea se pueden refinar de petróleo crudo o producir usando materias primas refinadas de petróleo crudo.
La obtención de estos productos químicos de especialidad de petróleo crudo requiere una inversión financiera significativa, así como una gran cantidad de energía.^ También es un proceso ineficiente debido a que frecuentemente se fraccionan hidrocarburos de cadena larga en el petróleo crudo para producir monómeros más pequeños. Estos monómeros entonces se usan como la materia prima para producir los productos químicos más complejas de especialidad .
Además de los problemas con la exploración, extracción, transporte y refinación de petróleo, el petróleo es un recurso limitado y decreciente. Un estimado del consumo mundial de petróleo es .de 30 billones de barriles por año. Por algunos estimados, se predice que a los niveles actuales de producción, las reservas mundiales de petróleo se pueden agotar antes del año 2050.
Finalmente, la quema de combustibles basados en petróleo libera gases de tipo invernadero (por ejemplo, dióxido de carbono) y otras formas de contaminación del aire {por ejemplo, monóxido de carbono, dióxido de azufre, etcétera) . Conforme se incrementa la demanda mundial de combustible, también se incrementa la emisión de gases tipo invernadero y de otras formas de contaminación del aire. La acumulación de gases tipo invernadero en la atmósfera conduce a un calentamiento global incrementado. Por lo tanto, además de dañar localmente .el ambiente (por ejemplo, derrames de petróleo, dragado de ambientes marinos, etcétera) , la quema de petróleo también daña globalmente el ambiente.
Debido a los retos inherentes presentados por el petróleo, existe la necesidad de una fuente renovable de petróleo que no necesite ser explorada, extraída, transportada sobre largas distancias, o sustancialmente . refinada tal como el petróleo. También existe la necesidad de una fuente renovable de petróleo que se pueda producir de manera económica sin crear el tipo de daño ambiental producido por la industria del petróleo y la quema de combustibles basados en petróleo. Por razones similares, también existe la necesidad de una fuente renovable de productos químicos que se deriven típicamente del petróleo.
Breve Descripción de la Invención La invención se basa, al menos en parte, en la identificación de genes cianobacterianos que codifican para polipéptidos biosintéticos de hidrocarburos. Por consiguiente, en un aspecto, la invención presenta un método para producir un hidrocarburo, el método que comprende producir en una célula hospedadora un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36, o una variante de la misma, y aislar el hidrocarburo de la célula hospedadora.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad a la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, .14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36 con una o más sustituciones, adiciones, inserciones o ' supresiones de aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa . En aun' otras modalidades, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36, con una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, el polipéptido comprende una o más de las siguientes sustituciones conservadoras de aminoácido: reemplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, con otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina con una treonina; reemplazo de una treonina con una serina, reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, con otro residuo aminoácido; reemplazo de un residuo que tiene grupo amida, tal · como asparagina y glutamina, con otro residuo que tiene un grupo amida; intercambio de' un residuo básico, al como lisina y arginina, con otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, con otro residuo aromático. En otras modalidades, el polipéptido tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más sustituciones adiciones, inserciones o supresiones de aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa.
En otras modalidades, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de: (i) SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39, o (ii) SEQ ID NO: 40 y cualquiera de (a) SEQ ID NO: 37, (b) SEQ ID NO: 38 y (c) , SEQ ID NO: 39, o (iii) SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44. En ciertas modalidades, el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa.
En otro aspecto, la invención presenta un método para producir un hidrocarburo, el método que comprende expresar en una célula hospedadora un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, por lo menos cerca 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 35. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, \3-3 o 35. En algunas modalidades, el método comprende además aislar el hidrocarburo de la célula hospedadora.
En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos hibridiza a un complemento de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, O 35 o un fragmento de la misma, por ejemplo, bajo condiciones de baja severidad, de severidad media, de alta severidad, o de muy - alta severidad.
En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos codifica para un polipéptido que comprende: (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36, o (ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36 con una o más sustituciones de adiciones, inserciones o supresiones de aminoácido. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36 con uno o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa .
En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos codifica para un polipéptido que tiene la misma actividad biológica como un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15-, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 35 o un fragmento de la misma. En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos hibridiza un complemento de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 35 ? un fragmento de la misma, por ejemplo, bajo condiciones de severidad baja, de severidad media, de alta severidad, o de muy alta severidad. En algunas modalidades, la actividad biológica es actividad de descarbonilasa .
En algunas modalidades, el método comprende transformar una célula hospedadora con un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, por lo menos cerca 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, .17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 35. En algunas modalidades, el vector recombinante comprende además un promotor enlazado de manera operable a la secuencia de nucleótidos . En algunas modalidades, el promotor es promotor regulado en el desarrollo, específico al organelo, específico al tejido, inducible, constitutivo o específico a la célula. En modalidades particulares, el vector recombinante comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de (a) una secuencia reguladora acoplada de manera operativa a la secuencia de nucleótidos; . (b) un marcador de selección acoplado de manera operativa a la secuencia de nucleótidos; (c) una secuencia marcadora acoplada de manera operativa a la secuencia de nucleótidos; (d) una porción de purificación acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos; (e) una secuencia de secreción acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos, y (f) una secuencia se selección de diana acoplada de manera operativa a la ' secuencia de nucleótidos. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos se incorpora de manera estable en el ADN genómico de la célula hospedadora, y la expresión de la secuencia de nucleótidos si está bajo el control de una región promotora, regulada.
En cualquiera de los aspectos descritos en la presente, la célula hospedadora se puede seleccionar del grupo que consiste de una célula mamífera, célula vegetal, célula insectil, célula de levadura, célula fungoidea, fungoidea filamentosa y célula bacteriana.
En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula bacteriana Gram-positiva . En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula bacteriana Gram-negativa .
En algunas modalidades, la célula hospedadora se selecciona del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharo yces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Stre fcomyces.
En modalidades particulares, ' la célula hospedadora es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus licheniformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula Bacillus clausii, una célula de Bacillus egaterium, una célula de Bacillus subtilis o una célula de Bacillus amyloliquefaciens.
En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de Trichoderma koningii , una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una' célula de Aspergillus oryzae, una célula Humicola insolens, una célula Humicola lanuginose, una célula Rhodococcus opacus, una célula Rhizomucor miehei o una célula de Mucor michei.
En aun otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de Streptomyces lividans o 'una célula de Strepto yces murínus. En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de Actinomycetes .
En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula CHO, una célula COS, una célula VERO, una célula BHK, una célula HeLa, una célula Cvl, una célula MDCK, una célula 293, una célula 3T3, o una célula PC12.
En modalidades particulares, la célula hospedadora es una célula de E. coli, tal como una célula de E. coli de la cepa B, de la cepa C, de la cepa K o de la cepa W.
En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula hospedadora cianobacteriana . En modalidades particulares, la célula hospedadora cianobacteriana es una célula listada en la Tabla 1.
En algunas modalidades, el hidrocarburo se selecciona de la célula hospedadora.
En ciertas, modalidades, la célula hospedadora sobreexpresa un sustrato descritos en la presente . En algunas modalidades, el método incluye además transformar la célula hospedadora con un ácido nucleico que codifica para una enzima "descrita en la presente, y la célula hospedadora sobreexpresa un sustrato descrito en la presente. En otras modalidades, el método incluye además cultivar la célula hospedadora en la presencia de al menos un sustrato descrito en la presente. En algunas modalidades, el sustrato es un derivado de ácido graso, un acil-ACP, un ácido graso, un acil-CoA, un aldehido graso, un alcohol graso o un éster graso.
En algunas modalidades, el sustrato del derivado de ácido graso es un sustrato de derivado de ácido graso insaturado, un sustrato de derivado de ácido graso monoinsaturado, o un sustrato de derivado de ácido graso saturado. En otras modalidades, el sustrato de derivado de ácido graso es un sustrato de derivado de ácido graso de cadena recta, un sustrato de derivado de ácido graso de cadena ramificada, o un sustrato de derivado de ácido graso que incluye una porción cíclica.
En ciertas modalidades de los aspectos descritos en la presente, el hidrocarburo producido es un alcano. En algunas modalidades, el alcano es un C3-C25 alcano. Por ejemplo, el alcano es un C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, Ci0, Cu, Cl2/ C13 , C14 , C15 , Ci6, C17 , Ci8 , C19 , C20 / ¾1 , C22 , C23 / 24 O C 5 alcano. En algunas modalidades, el alcano es tridecano, metiltridecano, nonadecano, metilnonadecano, heptadecano, metilheptadecano, pentadecano o metilpentadecano.
En algunas modalidades, el alcano es un alcano de cadena recta, un alcano de cadena ramificada, o un alcano cíclico .
En ciertas modalidades, el método comprende además cultivar la célula hospedadora en la presencia de un derivado de ácido graso saturado, y el hidrocarburo producido es un alcano. En ciertas modalidades, el derivado de ácido graso saturado es un sustrato de derivado de ácido graso de C6-C26-Por ejemplo, el sustrato de derivado de ácido graso es un sustrato de derivado de ácido graso de C6 , C , C8 , C9 , Ci0 , Cu , Cl2 / C13 , C14 , C15 , Ci6, C17 , Cíe , Ci9, C20 / C21, C22 , C23 , 24 ; C25 O C26- En modalidades particulares, el sustrato de derivado de ácido graso es 2 -metilicosanal , icosanal, octadecanal, tetradecanal , 2 -metiloctadecanal , estearaldehído o palmitaldehído .
En. algunas modalidades, el método comprende además aislar el alcano de la célula hospedadora o del medio de cultivo. En otras modalidades, el método incluye además fraccionar o refinar el alcano.
En ciertas modalidades de los aspectos descritos en la presente, el hidrocarburo producido es un alqueno. En algunas modalidades, el alqueno es un C3 - C25 alqueno. Por ejemplo, el alqueno es un C3 , C4 , C5 , C6 , C7 , C8 , C9 , Ci0 , Cu , Cl2 , C13 , C14 , C15, Ci6, C17, Cis , C19 , C20 , C21 , C22 , C23 , C24 O C25 alqueno. En algunas modalidades, el alqueno es pentadeceno, heptadeceno, metilpentadeceno o metilheptadeceno.
En algunas modalidades, el alqueno es un alqueno de cadena recta, un alqueno de cadena ramificada o un alqueno cíclico .
En ciertas modalidades, el método comprende además cultivar la célula hospedadora en la presencia de un derivado de ácido graso insaturado, y el hidrocarburo producido es un alqueno. En ciertas modalidades, el derivado de ácido graso insaturado es un sustrato de derivado de ácido graso de C6-C26- Por ejemplo, el sustrato de derivado de ácido graso es un sustrato de derivado de ácido graso insaturado de C. I C7, CS, Cg, Cío, CU, C12 , C13 , Ci4, Cis, Ci6, Ci7( Cíe, C19 , C20 , C21 , C22 , C23, C24, C25 o C2é¦ En modalidades particulares, el sustrato de derivado de ácido graso es octadecenal, hexadecenal, metilhexadecenal o metiloctadecenal .
En otro aspecto, la invención presenta un microorganismo genéticamente manejado que comprende una secuencia exógena de control incorporada de manera estable en el ADN genómico del microorganismo. En una modalidad, la secuencia de control se integra en la dirección 5' de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 35. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos tiene al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 35. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 35.
En algunas modalidades, el polinucleótido es endógeno al microorganismo. En algunas modalidades, el microorganismo expresa un nivel incrementado de un hidrocarburo con relación a un microorganismo tipo silvestre. En algunas modalidades, el microorganismo es una cianobacteria .
En otro aspecto, la invención presenta un- método para producir un hidrocarburo, el método que comprende cultivar un microorganismo genéticamente manejado, descrito en la presente, bajo condiciones adecuadas para la expresión génica, y aislar el hidrocarburo.
En otro aspecto, la invención presenta un método para producir un hidrocarburo, que comprende poner en contacto un sustrato con (i) un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36, o una variante de la misma, (ii) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 35, o una variante de la misma, (iii) un polipéptido que comprende la' secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 38, o 39, (iv) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y cualquiera de (a) SEQ ID NO: 37, (b) SEQ ID NO: 38, y (c) , SEQ . ID NO: 39; o (v) la SEQ ID NO: 41, 42, 43 o 44. En algunas modalidades, el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa .
En algunas modalidades, el polipéptido tiene al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, por lo menos cerca de 94 %, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36. Eñ algunas modalidades, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36.
En algunas modalidades, el polipéptido se codifica por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1, 3, 5, ?, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 35. En algunas modalidades, el polipéptido se codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 35.
En algunas modalidades, el sustrato biológico es un derivado de ácido graso, un acil-ACP, un ácido graso, un acil-CoA, un aldehido graso, un alcohol graso o un éster graso.
En algunas modalidades, el sustrato es un derivado de ácido graso saturado, y el hidrocarburo es un alcano, por ejemplo, un C3-C25 alcano. Por ejemplo, el alcano es un C3, C4, C5 , C6, C7 , Cs , C9, Cío, CII# C12 , C13 , Ci4 , C15 , Cis, C17 , Cis, C19, C20 C2i, ^22 , C23 , C24 o C25 alcano. En algunas modalidades, el alcano es tridecano, metiltridecano, nonadecano, metilnonadecano, heptadecano, metilheptadecano , pentadecano o metilpentadecano .
En algunas modalidades, el alcano es un alcano de cadena recta, un alcano de cadena ramificada o un alcano cíclico.
En algunas modalidades, el derivado de ácido graso saturado es 2 -metilicosanal , icosanal, octadecanal, tetradecanal , 2 -metiloctadecanal , estearaldehído o palmitaldehido .
En otras modalidades, el sustrato biológico es un derivado de ácido graso insaturado, y el hidrocarburo es un alqueno, por ejemplo, un C3-C25 alqueno. Por ejemplo, el alqueno es un C3, C4, Cs, C6, C7, C8# C9, Cío, Cu, Ci2, C13 , C1 , C15 , i6, C17 , Cía , C19 , C20/ C21 , C22; C23 24 o C25 alcano . En algunas modalidades, el alqueno es pentadeceno, heptadeceno, metilpentadeceno o metilheptadeceno.
En algunas modalidades, el alqueno es un alqueno de cadena recta, un alqueno de cadena ramificada, o un alqueno cíclico .
En algunas modalidades, el derivado de ácido grasos insaturado es octadecenal, hexadecenal, metilhexadecenal o metiloctadecenal -- - En otro aspecto, la invención presenta un hidrocarburo producido por cualquiera de los métodos o microorganismos descritos en la presente. En modalidades particular-es, el hidrocarburo es un alcano o un alqueno que tiene una 513C de aproximadamente -15.4 o mayor. Por ejemplo, el alcano o alqueno tiene una 513C de aproximadamente -15.4 a aproximadamente -10.9, por ejemplo, de aproximadamente -13.92 a -13.84. En otras modalidades, el alcano o alqueno tiene una fM14C de al menos aproximadamente 1.003. Por ejemplo, el alcano o alqueno tiene una fM14C de al menos aproximadamente 1.01 o menos aproximadamente 1.5. En algunas modalidades, el alcano o alqueno' tiene una fM14C de aproximadamente 1.111 a aproximadamente 1.124.
En. otro aspecto, la invención presenta un biocombustible que incluye un hidrocarburo producido por cualquiera de los métodos o microorganismos descritos en la presente. En modalidades particulares, el hidrocarburo es un alcano o alqueno que tiene una 613C de aproximadamente -15.4 o mayor. Por ejemplo, el alcano o alqueno tiene una 513C de aproximadamente -15.4 a aproximadamente -10.9, por ejemplo, de aproximadamente -13.92 a aproximadamente -13.84. En otras modalidades, el alcano o alqueno tiene una fM14C de al menos aproximadamente 1.003. Por ejemplo, el alcano o alqueno tiene una fM14C de al menos aproximadamente 1.01 a aproximadamente 1.5. En algunas modalidades, el alcano o alqueno tiene una fM1C de aproximadamente 1.111 a aproximadamente 1.124. En algunas modalidades, el biocombustible es diesel, gasolina o combustible de avión.
En otro aspecto, la invención presenta un ácido nucleico aislado que consiste de no más de aproximadamente 500 nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 35. En algunas modalidades, el ácido nucleico consiste de no más de aproximadamente 300 nucleótidos, no más de aproximadamente 350 nucleótidos, no más de 400 nucleótidos, no más de aproximadamente 450 nucleótidos, no más de aproximadamente 550 nucleótidos, no más de aproximadamente 600 nucleótidos, o no más de aproximadamente 650 nucleótidos, de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,. 31, 33 o 35. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad de descarbonilasa .
En otro aspecto, la invención presenta un ácido nucleico aislado que consiste de no más de aproximadamente 99%, no más de aproximadamente 98%, no más de aproximadamente '97%, no más de aproximadamente 96%, no más de aproximadamente 95%, no más de aproximadamente 94%, no más de aproximadamente 93%, no más de aproximadamente 92%, no más de aproximadamente 91%, no más de aproximadamente 90%, no más de aproximadamente 85%, o% no más de aproximadamente 80% de los nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 35. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad de descarbonilasa.
En otro aspecto, la invención presenta un polipéptido aislado que consiste de no más de aproximadamente 200, no más de aproximadamente 175, no más de aproximadamente 150, o no más de aproximadamente 100 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36. En algunas modalidades, el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa .
En otro aspecto, la invención presenta un polipéptido aislado que consiste de no más de aproximadamente del 99%, no más de aproximadamente 98%, no más de aproximadamente 97%, no más de aproximadamente 96%, no más de aproximadamente 95%, no más de aproximadamente 94%, no más de aproximadamente 93%, no más de aproximadamente 92%, no más de aproximadamente 91%, no más de aproximadamente 90%, no más de aproximadamente 85%, o no más de aproximadamente 80% de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 , 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36. En algunas modalidades, el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa.
Definiciones A todo lo largo de la especificación, se puede hacer referencia usando un nombre abreviado de gen o nombre abreviado de polipéptido, pero se entiende que este nombre abreviado de gen o polipéptido representa el género de los genes o polipéptidos . Estos nombres de genes incluyen todos los genes que codifican para el mismo polipéptido y polipéptidos homólogos que tienen la misma función fisiológica. Los nombres de polipéptido incluyen todos los polipéptidos que tienen la misma actividad (por ejemplo, que catalizan para la misma reacción química fundamental) .
Los números de acceso referidos en la presente se derivan de la base de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information) mantenida por el National Instituye of Health, E.U.A. A menos que se indique de otro modo, los números de acceso son como se proporcionan en la base de datos con fecha de Abril del 2009.
Se establecen números de EC por el Nomenclature Committee International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) (disponible en http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). Los números de CE EC referidos en la presente se derivan de la base de datos de ligandos KEGG, mantenida por la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics, patrocinada en parte por la Universidad de Tokio. A menos de que se indique de otro modo, los números de EC son como se proporcionan en la base de datos con fecha de Marzo del 2008.
Los artículos "una" y "una" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
El término "aproximadamente" se usa en la presente para querer decir un valor ± 20% de un valor numérico determinado. De esta manera, "aproximadamente 60%", significa un valor de entre 60 ± (20% de 60) (es decir, entre 48 y 70) .
Como se usa en la presente, el término "aldehido", significa un hidrocarburo que tiene la fórmula RCHO caracterizo por un grupo carbonilo insaturado (C=0) . En una modalidad preferida, aldehido es un aldehido producido de un ácido graso o un derivado de ácido graso. En una modalidad, el grupo R es aL menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 carbonos en longitud.
Como se usa en la presente, un "gen biosintético de aldehido" o un "polinucleótido biosintético de aldehido" es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de aldehido.
Como se usa en la -presente, un "polipéptido biosintético de aldehido" · es un polipéptido que es una parte de la ruta biosintética de un aldehido. Estos polipéptidos pueden actuar en un sustrato biológico para producir un aldehido. En algunos casos, el polipéptido biosintético de aldehido tiene actividad de reductasa.
Como se usa en la presente, el término "alcano" , significa " un hidrocarburo que contiene sólo enlaces individuales carbono-carbono .
Como se usa en la presente, un "gen biosintético de alcano" o un "polinucleótido biosintético de alcano" es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de alcano .
Como se usa . en la presente, un "polipéptido biosintético de alcano" es un polipéptido que es una parte de la ruta biosintética de un alcano. Estos polipéptidos pueden actuar en un sustrato biológico para producir un alcano. En algunos casos, el polipéptido biosintético de alcano tiene actividad de descarbonilasa .
Como se usa en la presente, un "gen biosintético de. alqueno" o un "polinucleótido biosintético de alqueno" es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de alqueno.
Como se usa en la presente, un "polipéptido biosintético de alqueno" es un polipéptido que es una parte de la ruta biosintética de un alqueno. Estos polipéptidos pueden actuar en un sustrato biológico para producir un alqueno. En algunos casos, el polipéptido biosintético de alqueno tiene actividad de descarbonilasa.
Como se usa en la presente, el término "atenuar" significa debilitar, reducir o disminuir. Por ejemplo, se puede atenuar un polipéptido al modificar el polipéptido para de este modo reducir su actividad (por ejemplo, al modificar una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido) .
Como se usa en la presente, el término "biodiesel" , significa un biocombustible que puede ser un sustituto de diesel, ,que se deriva del petróleo. Se puede usar biodiesel en maquinas diesel de combustión interna, ya sea en una forma pura, que se refiere como biodiesel "puro" , o como una mezcla a cualquier concentración con diesel basado en petróleo.
El biodiesel puede incluir ásteres o hidrocarburos, tal como aldehidos y alcanos .
Como se usa en la presente, el término "biocombustible" se refiere a cualquier combustible derivado de biomasa. Los biocombustibles se pueden sustituir de combustibles derivados del petróleo. Por ejemplo, los biocombustibles son incluyentes de combustibles de transporte (por ejemplo, gasolina, diesel, combustible de avión, etcétera) , combustibles de calentamiento, combustibles generadores de electricidad. Los biocombustibles son una fuente renovable de energía.
Como se usa en la presente, el término "biomasa" se refiere a una fuente de carbono derivada de material biológico . La biomasa se puede convertir en un biocombustible. Una fuente de ejemplo de biomasa es materia vegetal. Por ejemplo, como biomasa se puede usar maíz, caña de azúcar, o césped de pradera. Otro ejemplo no limitante de biomasa es materia animal, por ejemplo, abono de vaca. La biomasa también incluye productos residuales de la industria, agricultura, silvicultura y domésticos. Los ejemplos de estos productos residuales que se pueden usar como biomasas son desperdicio de fermentación, paja, madera, aguas residuales, desperdicios y sobrantes. La biomasa también incluye fuentes de carbono, tal como carbohidratos (por ejemplo, monosacáridos , disacáridos o polisacáridos) .
Como se usa en la presente, la frase "fuente de carbono" se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para ser usado como una fuente de carbono para crecimiento de células procariotas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden estar en varias formas, incluyendo pero no limitado a, polímeros, carbohidratos, ácidos, alcoholes, aldehidos, cetonas, aminoácidos, péptidos y gases (por ejemplo, CO y C02) . Estos incluyen, por ejemplo, varios monosacáridos tal como glucosa, fructosa, mañosa y galactosa; oligosacáridos , tal como fructo-oligosacárido y galacto-oligosacárido, polisacáridos tal como xilosa y arabinosa, disacáridos., tal como sacarosa, maltosa y turanosa; material celulósico, tal como metilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica, ésteres de ácidos grasos saturados o insaturados, tal como succinato, lactato y acetato; alcoholes, tal como el etanol o mezclas del mismo. La fuente de carbono también puede ser un producto de la fotosíntesis, incluyendo pero no limitado a, glucosa. Una fuente preferida de carbono es la biomasa. Otra fuente preferida de carbono es la glucosa.
Como se usa en la presente, un "aditivo disminuidor del punto de turbidez" es un aditivo adicionado a una composición para disminuir o bajar el punto de turbidez . de una solución.
Como se usa en la presente, la frase "punto de turbidez en fluido", significa la temperatura a la cual los sólidos disueltos no son completamente solubles por más tiempo. Por abajo de esta temperatura, los sólidos empiezan a precipitarse como una fase secundaria dando al fluido una apariencia turbia. En la industria del petróleo, el punto de turbidez se refiere a la temperatura por abajo de la cual un material solidificado u otro hidrocarburo pesado cristalizan en un petróleo crudo, petróleo refinado o combustible para formar una apariencia turbia. La presencia de materiales solidificados tiene influencia en el comportamiento de flujo del fluido, en la tendencia del fluido a atascar filtros de combustible, inyectores, etcétera, en la acumulación de materiales solidificados en superficies frías (por ejemplo, una incrustación en tubería o intercambiador de calor) , y las características de emulsión del fluido con agua.
Una secuencia de nucleótidos es "complementaria" a otra secuencia de nucleótidos si cada una de las bases de las dos secuencias corresponde (es decir, una es capaz de formar pares de base de Watson, Crick) . El término "hebra complementaria" se usa en la presente de forma indistinta con el término "complemento" . El complemento de una hebra de ácido nucleico puede ser el complemento de una hebra codificante o el complemento' de una hebra no codificante.
Como se usa en la presente, el término "condiciones suficientes para permitir la expresión" significa cualquier condición que permita que una célula hospedadora produzca un producto deseado, tal como un polipéptido, aldehido, o alcano descrito en la presente. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo condiciones de fermentación. Las condiciones de fermentación- pueden incluir muchos parámetros, tal como intervalos de temperatura, niveles de aireación, y composición de medios. Cada una' de estas condiciones, de manera individual y en combinación, permite que crezca la célula hospedadora. Los medios de cultivo de ejemplo incluyen caldos o geles. En general, el medio incluye una fuente de carbono, tal como glucosa, fructosa, celulosa, o similares, que se puede metabolizar directamente por una' célula hospedadora. Además, se pueden usar enzimas en el medio para facilitar la movilización (por ejemplo, la despolimerización de almidón o celulosa a azúcares fermentables) y la metabolización subsiguiente de la fuente de carbono.
Para determinar si las condiciones son suficientes para permitir la expresión, se puede cultivar una célula hospedadora, por ejemplo, durante aproximadamente 4, 8, 12, 24, 36, o 48 horas. Durante y/o después del cultivo, se pueden obtener muestras y analizar para determinar si las condiciones permiten la expresión. Por ejemplo, las células hospedadoras en la muestra o en el medio en el cual se cultivaron las células hospedadoras, se pueden probar para la presencia de un producto deseado. Cuando se prueba para la presencia de un producto, se pueden usar ensayos, tal como, pero no limitado a, TLC, HPLC, GC/FID, GC/MS, LC/MS, MS . · Se entiende que los polipéptidos descritos en la presente pueden tener sustituciones conservadoras, o no esenciales, adicionales de aminoácidos, que no tienen un efecto sustancial en las funciones del polipéptido. Si o no .se tolerará una sustitución particular (es decir, no afectará de manera adversa las propiedades biológicas deseadas, tal como la actividad de descarboxilasa) se puede determinar, como se describe en Bowie et al., Ciencia (1990) 247:1306 1310. Un "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual se reemplaza el residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, .arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) .
Como se usa en la presente, el "elemento de control" significa un elemento de control transcripcional . Los elementos de control incluyen promotores e intensificadores . El término "elemento promotor", "promotor" o "secuencia promotora" se refiere a una secuencia de ADN que funciona como un conmutador que activa la' expresión de un gen. Si' se activa el gen, se' dice que se transcribe o que participa en la transcripción. La transcripción comprende la síntesis de ARNm del gen. Por lo tanto, un promotor sirve como un elemento regulador transcripcional y también proporciona un sitio para el inicio de la transcripción del gen en ARNm. Los elementos de control interactúan de manera específica con proteínas celulares - comprendidas en la transcripción (Maniatis et al, Science 236:1237, 1987).
Como se usa en la presente, el término "éster-sintasa" , significa un péptido capaz de producir ésteres grasos. De manera específica, una éster-sintasa es un péptido que convierte un tioéster a un éster graso. En una modalidad preferida, la éster-sintasa convierte un tioéster [por ejemplo, acil-CoA) a un éster graso.
En una modalidad alternativa, una éster- sintasa usa un tioéster y un alcohol como sustratos para producir un éster graso. Las éster-sintasas son capaces de usar tioésteres de cadena larga y corta como sustratos. Además, las éster-sintasas son capaces de usar como sustratos los alcoholes de cadena larga y corta.
Los ejemplos no limitantes de éster-sintasas son cera-sintasas , cera-éster-sintasas , acil-CoA:alcohol-transacilasas , aciltransferasas y acil grasócoenzima A: alcohol graso-aciltransferasas . Las éster-sintasas de ejemplo, se clasifican en la clasificación enzimátíca número EC .2.3.1.75. Los Números de Acceso al GenBank de ejemplo se proporcionan en la Figura 40.
Como se usa en la presente, el término "ácido graso", significa un ácido carboxilico que tiene la fórmula RCOOH. R representa un grupo alifático, preferentemente un grupo alquilo. R puede comprender entre aproximadamente 4. y aproximadamente 22 átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden estar saturados, monoinsaturados o poliinsaturados . En una modalidad preferida, el ácido graso se produce de una ruta biosintética de ácidos grasos.
Como se usa en la presente, el término "ruta biosintética de ácido graso" , significa una ruta biosintética que produce ácidos grasos. La ruta biosintética de ácidos grasos incluye enzimas de ácidos grasos que se pueden manejar, como se describe en la presente, para producir ácidos grasos, y en algunas modalidades se pueden expresar con enzimas adicionales para producir ácidos grasos que tienen características deseadas de cadenas de carbono.
Como se usa en la presente, el término "derivado de ácido graso" significa productos producidos en parte de. la ruta biosintética de ácidos grasos del organismo hospedador de producción. El "derivado de ácido graso" incluye productos producidos en parte de acil-ACP o derivados de acil-ACP. La ruta biosintética de ácidos grasos incluye enzimas ácido graso- sintasas que se pueden manejar como se describe en la presente para producir derivados de ácidos grasos, y en algunos ejemplos, se pueden expresar con enzimas adicionales para producir derivados de ácidos grasos que tienen características deseadas de cadenas de carbono. Los derivados de ejemplo de ácidos grasos incluyen, por ejemplo, ácidos grasos, acil-CoA, aldehido graso, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos, alcoholes grasos y ésteres {por ejemplo, ceras, ésteres de ácidos grasos o- ésteres grasos).
Como se usa en la presente, el término "enzimas derivadas de ácidos grasos" significa todas las enzimas que se pueden expresar o sobreexpresar ' en la producción de derivados de ácidos grasos. Estas enzimas se refieren colectivamente en la presente como enzimas de derivados de ácidos grasos. Estas enzimas pueden ser parte de la ruta biosintética de ácidos grasos. Los ejemplos no limitantes de enzimas de derivados de ácidos grasos incluyen ácido graso-sintasas, tioesterasas, acil-CoA-sintasas , acil-CoA-reductasas, alcohol-deshidrogenasas , alcohol-aciltransferasas , acil-CoA-reductasa formadora de alcoholes grasos, éster-sintasas , polipéptidos biosintéticos de aldehido y polipéptidos biosintéticos de alcano. Las enzimas de derivados de ácidos grasos convierten un sustrato en un derivado de ácido graso. En algunos ejemplos, el sustrato puede ser un derivado de ácido graso que la enzima de derivado de ácido graso convierte en un diferente derivado de ácido graso.
Como se usa en la presente', el término "péptidos formadores de alcoholes grasos" , significa un péptido capaz de catalizar la conversión de acil-CoA a alcohol graso, incluyendo acil-CoA-reductasa formadora de alcohol graso (FAR, EC 1.1.1.*), acil-CoA-reductasa (EC 1.2.1.50), o alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). Adicionalmente , un experto en la técnica apreciará que algunos péptidos formadores de alcoholes grasos catalizarán también otras reacciones. Por ejemplo, algunos péptidos de acil-CoA-reductasa aceptarán otros sustratos además de los ácidos grasos. Por lo tanto estos péptidos no específicos, también se incluyen. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para péptidos formadores de alcoholes grasos, se conocen en la técnica, y estos péptidos están públicamente disponibles. Los Números de Acceso al GenBank.de ejemplo se proporcionan en la Figura 40.
Como se usa en la presente, "enzima de ácido graso" , significa una enzima comprendida en la biosíntesis de ácidos grasos . Las enzimas de ácido graso se pueden expresar o sobreexpresar en células hospedadoras para producir ácidos grasos. Los ejemplos no limitantes de enzimas de ácidos grasos incluyen tioesterasas y sintasas de ácidos grasos.
Como se usa en la presente, el término "éster. graso", significa un éster. En una modalidad preferida, un éster graso es cualquier éster producido de uñ ácido graso, por ejemplo, un éster de ácido graso. En una modalidad, un éster graso contiene un lado A (es decir, la cadena de carbono unida al oxígeno de carboxilato) y un lado B (es decir, la cadena de carbono que comprende el carboxilato de origen) . En una modalidad preferida, cuando el éster graso se deriva de la ruta biosintética de ácidos grasos, el lado A se contribuye por un alcohol,- y el lado B se contribuye por un ácido graso. Se puede usar cualquier . alcohol para formar el lado A de los ésteres grasos. Por ejemplo, el alcohol se puede derivar de la ruta biosintética de ácidos grasos. De manera alternativa, el alcohol se puede producir a través de rutas biosintéticas no de ácidos grasos. Además, el alcohol se puede proporcionar de manera exógena. Por ejemplo, el alcohol se puede suministrar en el caldo de. fermentación en casos donde el éster graso se produzca por un organismo. De manera alternativa, se puede suministrar de manera exógena un ácido carboxílico, tal como un ácido graso o ácido acético, en casos donde el éster graso se produzca por un organismo que también produce alcohol.
Las cadenas de carbono que comprenden el lado A o el lado B pueden ser de cualquier longitud. En una modalidad, el lado A del éster es al menos de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 carbonos de longitud. El lado B del éster es al menos de aproximadamente 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, o 26 carbonos de longitud. El lado A y/o el lado B pueden ser de cadena recta o ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener uno o más puntos de ramificación. Además, las cadenas ramificadas pueden incluir ramificaciones cíclicas. Adicionalmente, el lado A y/o el lado B pueden estar saturados o insaturados . Si están insaturados, el lado A y/o el lado B pueden tener uno o más puntos de insaturación.
En una modalidad, el éster graso se produce de manera biosintética . En esta modalidad, primero se "activa" el ácido graso. Los ejemplos no limitantes de ácidos grasos "activados" son acil-CoA, acil-ACP y acil- fosfato . El Acil-CoA puede ser un producto directo de la biosíntesis o degradación de ácidos grasos. Además, se puede sintetizar acil-CoA de un ácido graso libre, un CoA, o un adenosina-nucleótido- trifosfato (ATP) . Un ejemplo de una enzima que produce acil-CoA es acil-CoA-sintasa.
Después de que se activa el ácido graso, se puede transferir fácilmente a un nucleófilo receptor. Los nucleofilos de ejemplo son alcoholes, tioles o fosfatos.
En una modalidad, el éster graso es una cera. La cera se puede derivar de un alcohol de cadena larga y un ácido graso de cadena larga. En otra modalidad, el éster graso se puede derivar de un acil-tioéster graso y un alcohol. En otra modalidad, el éster graso es un tioéster de ácido graso, por ejemplo acil-coenzima A (CoA) grasa. En otras modalidades, el éster graso es un acil-pantotenato graso, una proteína portadora de acilo (ACP) , o un éster de fosfato graso. Los ésteres grasos tienen muchos usos. Por ejemplo, los ésteres grasos se pueden usar como un biocombustible .
Como se usa en la presente, "fracción de carbono moderno" o "fM" tiene el mismo significado como se define por National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B y 4990C, conocidos como normas de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se refiere á 0.95 veces la relación de isótopos 14C/12C HOxI (referida a AD 1950) . Esto es aproximadamente equivalente a la madera pre-Revolución Industrial corregida para descomposición. Para la biosfera viviente actual (material vegetal), fM es- aproximadamente 1.1.
Los cálculos de "homología" entre dos secuencias se pueden realizar como sigue. Las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir separaciones en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para alineación óptima y las secuencias no homologas se pueden omitir para propósitos de comparación) . En una modalidad preferida, la longitud de una secuencia de referencia que se alinea para propósitos de comparación es al menos aproximadamente 30%, de manera preferente al menos aproximadamente 40%, de manera más preferente al menos aproximadamente 50%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 60%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, o aproximadamente 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos de aminoácido o nucleótidos en las posiciones correspondientes de aminoácido o en las posiciones correspondientes de nucleótido entonces se comparan. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la posición ' correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en la presente, "identidad" de aminoácido o de ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o de ácido nucleico) . El por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de separaciones y la longitud de cada separación, que se necesita introducir para la alineación óptima de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y la determinación del porciento de homología entre dos secuencias se pueden lograr usando un algoritmo matemático. En una modalidad preferida, el por ciento de homología entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needléman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:444 453, que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando ya sea la matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En aun otra modalidad preferida, el porciento de homología entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna . CMP y un peso de separación de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto particularmente preferido de parámetros (y uno que se debe usar si el practicante está en incierto con respecto a que parámetros se' deben aplicar para ¦ determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología de las reivindicaciones) es una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalidad de separación de 12, una penalidad de extensión de separación 4, y una penalidad de separación de marco de lectura de 5.
Como se usa en la presente, una "célula hospedadora" es una célula usada para producir un producto descrito en la presente (por ejemplo, un aldehido o alcano descrito en la presente) . Se puede modificar una célula hospedadora para ue exprese o sobreexprese genes seleccionados o tenga expresión atenuada de genes seleccionados. Los ejemplos no limitantes de células hospedadoras incluyen células vegetales, animales, humanas, bacterias, de levadura o fungoideas filamentosas.
Como se usa en la presente, el término "hibridaza bajo condiciones de baja severidad, severidad media, de alta severidad, o de muy alta, severidad", describe condiciones para la hibridación y lavado. .La guía para realizar reacciones de hibridación se puede encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se puede usar cualquier método. Las condiciones específicas de hibridación referidas en la presente son como sigue: 1) condiciones de hibridación de baja severidad en' 6X cloruro de sodio / citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por dos lavados en 0.2X SSC, 0.1% de SDS al menos a 50°C (la temperatura de los lavados se puede incrementar a 55°C para condiciones de baja severidad) , 2) condiciones de hibridación de severidad media en 6X SSC a aproximadamente de 45 °C, seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% de SDS a.60°C, 3) condiciones de hibridación alta' severidad en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% de SDS a 65°C, y de manera preferente 4) condiciones de hibridación de muy alta severidad son fosfato de sodio 0.5 M, 7% de SDS a 65 °C, seguido por uno o más lavados a 0.2X SSC, 1% de SDS a 65°C. Las condiciones de (4) de muy alta severidad son las condiciones preferidas a menos que se especifique de otro modo .
El término "aislado" como se usa en la presente con respecto a ácidos nucleicos, tal como ADN o ARN, se refiere a moléculas separadas de los otros ADN o ARN, respectivamente, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Además, un "ácido nucleico aislado" incluye fragmentos de ácido nucleico, tal como fragmentos que no se presentan de manera natural. El término "aislado" también se usa en la presente para referirse a polipéptidos , que se aislan de otras proteínas celulares, y abarcan tanto polipéptidos endógenos purificados como polipéptidos recombinantes . El término "aislado" como se usa en la presente también se refiere a ácido nucleico o polipéptido que está sustancíalmente libre de material celular, material viral, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas de ADN recombinante . El término "aislado" como se usa en la presente también se refiere a un ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza de forma química.
Como se usa en la presente, el "nivel de expresión de un gen en una célula" se refiere al nivel de ARNm, transcriptos nacientes pre-ARNm, productos intermedios de procesamiento de transcriptos, ARNm maduros, y/o productos de degradación codificados por el gen en la célula.
Como se usa en la presente, el término "microorganismo" significa especie microbiana procariotica y eucariótica de los dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, este último que incluye levadura y hongos filamentosos, protozoarios , algas, o Protista . superiores. El término "célula microbiana", como se usa en la presente, significa una célula de microorganismo.
Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos , tal como ácido desoxirribonucleico (ADN) , y donde es apropiado, ácido ribonucleico (ARN) . El término también incluye análogos ya sea de ARN o ADN producidos de análogos de nucleótidos, y como es aplicable a la modalidad que describe, polinucleótidos de hebra individual (homosentido o antisentido) y de doble hebra, EST, cromosomas, ADNc, ARNm, y rARN.
Como se usa- en la presente, el término "operablemente enlazado" significa que una secuencia seleccionada de nucleótidos (por ejemplo, que codifica para un polipéptido descrito en la presente) está en proximidad con un promotor para permitir que el promotor regule la expresión de la secuencia seleccionada de nucleótidos. Además, el promotor está localizado en la dirección 5' de la secuencia seleccionada de nucleótidos en términos de la dirección de transcripción y traducción. Por "operablemente enlazado" se quiere decir que una secuencia de nucleótidos y una secuencia reguladora se conectan de una manera tal para permitir la expresión génica cuando se unen las moléculas apropiadas (por. ejemplo, proteínas activadoras transcripcionales) a las secuencias reguladoras.
El término "o" se usa en . la presente para querer decir, y se usa de manera indistinta con, el término "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se usa en la presente, . "sobreexpresa" significa que expresa o provoca que se exprese un ácido nucleico, polipéptido, o hidrocarburo en una célula a una mayor concentración de lo que normalmente se expresa en una célula correspondiente tipo silvestre. Por ejemplo, un polipéptido se puede "sobre-expresar" en una célula hospedadora recombinante cuando el polipéptido se presente en una mayor concentración en la célula hospedadora recombinante en comparación a su concentración en una célula hospedadora no recombinante de la misma especie.
Como se usa en la presente, "coeficiente de división" . o "P", se define como la concentración de equilibrio de un compuesto en una fase orgánica dividida por la concentración en equilibrio en una fase acuosa (por ejemplo, caldo de fermentación) . En una modalidad de un sistema bifásico descrito en la presente, la fase orgánica se forma por el aldehido o alcaho durante el proceso de producción. Sin embargo, en algunos ejemplos, se puede proporcionar una fase orgánica, tal como al proporcionar una capa de octano, para facilitar la separación del producto. Cuando se describe un sistema de dos fases, las características de división de un compuesto se pueden describir como logP. Por ejemplo, un compuesto con un logP de 1 se dividirá 10:1 a la fase orgánica. Un compuesto con un logP de -1 se dividirá 1:10 a la fase orgánica. Al elegir un caldo apropiado de fermentación y una fase orgánica apropiada, un aldehido o alcano con un alto valor de logP puede separarse en la fase orgánica aún a muy bajas concentraciones en el recipiente de fermentación.
Como se usa en la presente, el término "purificar", "purificado" o "purificación" significa la remoción o aislamiento de una molécula de su ambiente, por ejemplo, por aislamiento o separación. Las moléculas "sustancialmente purificadas" están al menos aproximadamente 60 % libres, de manera preferente al menos aproximadamente 75 % libres, y de manera preferente al menos aproximadamente 90 % libres de otros componentes con los cuales están asociados . Como se usa en la presente, estos términos también se refieren a la remoción de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la remoción de contaminantes puede dar por resultado un incremento en el porcentaje de aldehidos o alcanos en una muestra. Por ejemplo, cuando se producen aldehidos o alcanos en una célula hospedadora, los aldehidos o alcanos se pueden purificar mediante la remoción de proteínas de la célula hospedadora. Después de la purificación, se incrementa el porcentaje de aldehidos o alcanos en la muestra.
Los términos "purificar" , "purificado" o "purificación" no requieren pureza absoluta. Son términos relativos, de esta manera, por ejemplo cuando se producen aldehidos o alcanos en células hospedadoras , un aldehido purificado o alcano purificado es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos , lípidos, carbohidratos, u otros hidrocarburos). En otro ejemplo, una prepáración de aldehido purificado o de alcano purificado es una en la cual el aldehido o alcano está sustancialmente libre de contaminantes, tal como aquellos que pueden estar presentes después de la fermentación. En algunas modalidades, un aldehido o un alcano se purifican cuando al menos aproximadamente 50 % en peso de una muestra está compuesta del aldehido o alcano. En otras modalidades, se purifica un aldehido o un alcano cuando al menos aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, o 99 % o más en peso de una muestra está compuesto del. aldehido o alcano.
Como se usa en la presente, el término "polipéptido recombinante" se refiere a un polipéptido que se produce por técnicas de ADN recombinante, en donde en general el ADN que codifica para el polipéptido o ARN expresado, se inserta en un vector adecuado de expresión y que a su vez se usa para transformar una célula hospedadora que a su vez produce el polipéptido o ARN.
Como se usa en la presente, el término "sustancialmente idéntico" (o "sustancialmente homólogo") se usa para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contiene un número suficiente de residuos de aminoácido o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones conservadas de aminoácido) a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos tal que la primera y segunda secuencias de aminoácidos o nucleótidos tengan actividades similares.
Como se usa en la presente, el término "sintasa" significa una enzima que cataliza un proceso de síntesis. Como se usa en la presente, el término sintasa incluye sintasas, sintetasas, y ligasas.
Como se usa en la presente, el término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, mediante un vector de expresión) en una célula receptora por transferencia génica mediada por ácido nucleico.
Como se usa en la presente, "transformación" se refiere a un proceso en el cual se cambia el genotipo de una célula como resultado de la captación celular de ácido nucleico exógeno. Esto puede dar por resultado la célula transformada que expresa una forma recombinante de un ARN o polipéptido. En el caso de expresión antisentido del gen transferido, se interrumpe la expresión de una forma del polipéptido que se presenta de manera natural.
Como se usa en la presente, una "proteína de transporte" es un polipéptido que facilita el movimiento de uno o más compuestos hacia y/o desde un organelo celular y/o una célula.
Como se usa en la presente, una "variante" del polipéptido' X se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido X en el cual se alteran uno o más residuos de aminoácido. La variante puede tener cambios conservadores o cambios no conservadores. La guía en la determinación de que residuos de aminoácido se pueden sustituir, insertar o suprimir sin afectar la actividad biológica, se puede encontrar usando programas de computadora bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software LASERGENE (DNASTAR) .
El término "variante" , cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótido, puede abarcar una secuencia de polinucleótido relacionada a aquella de un gen o la secuencia codificante del mismo. Esta definición también puede incluir, por ejemplo, "variantes alélicas" , "de empalme" , de "especie" o "polimórficas" . Una variante de empalme puede tener identidad significativa a un polinucleótido de referencia, pero en general tendrá un mayor o menor número de polinucleótidos debido a un empalme alternativo de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipéptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias de polinucleótido qué varían de una especie a otra. Los polipéptidos resultantes tendrán en general identidad significativa de aminoácidos entre sí. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótido de un gen particular entre individuos de una especie determinada.
Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector útil es un episoma (es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extra-cromosómica) . Los vectores útiles son aquellos capaces de replicación y/o expresión autónoma de ácidos . nucleicos a los cuales están enlazados. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados de forma operativa se refieren en la presente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante frecuentemente están en la forma de "plásmidos" , que se refiere en general a asas circulares de ADN de doble hebra que, en su forma de vector, no se unen al cromosoma. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se usan de manera indistinta, puesto que el plásmido es la forma más comúnmente usada del vector. Sin embargo, también se incluyen otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que se van a llegar a conocer subsiguientemente a la presente en la técnica.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por el experto en la técnica a la cual corresponde esta invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden usar . en la práctica o prueba de la presente invención, se describen más adelante los métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no se propone que sean limitantes.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones..
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células CCMP1986 Prochlorococcus mariñus . La Figura IB es un patrón de fragmentación en masa del pico a 7.55 min de la Figura 1A.
La Figura 2A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células PCC73102 Nostoc punctiforme. La Figura 2B es un patrón de fragmentación en masa del pico a 8.73 min de la Figura 2A.
La Figura 3A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células ATCC29082 Gloeobaceter violaceus. La Figura 3B es un patrón de fragmentación en masa del pico a 8.72 min de la Figura 3A.
La Figura 4A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células PCC6803 Synechocystic sp. La Figura 4B es un patrón de fragmentación en masa del pico a 7.36 min de la Figura 4A.
La Figura 5A es una traza de GC/MS de hidrocarburos producidos por células PCC6803 tipo silvestre Synechocystis sp. La Figura 5B es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células PCC6803 Synechocystis sp. , con una supresión de los genes S110208 y S110209.
La Figura 6A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 tipo silvestre E. coli. La Figura 6B es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli ¦ que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID NO:65).
La Figura 7 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células de E. coli que expresan Cyanothece sp. ATCC51142 cce_1430 (YP_001802846) (SEQ ID NO:69).
La Figura 8A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células de E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID NO: 65) y Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400610 (Synpcc7942_1593) (SEQ ID N0:1) . La Figura 8B representa patrones de fragmentación en masa del pico a 6.98 min de la Figura 8A y de pentadecano. La Figura 8C representa patrones de fragmentación en masa del pico a 8.12 min de la Figura 8A y de 8-heptadeceno .
La Figura 9 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células de MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID NO: 65) y Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID N0:5).
La Figura 10 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células de · MG1655.E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Synechocystis sp. PCC6803 S110208 (NP_442147) (SEQ ID NO : 3 ) .
La Figura 11 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células de MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID NO: 65) y Nostoc sp . PCC7210 alr5283 (NP_489323) (SEQ ID NO: 7 ) .
La Figura 12 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID NO: 65) y Acaryochloris marina optimizado por codón MBIC11017 AM1_4041 (YP_001518340) (SEQ ID NO:46).
La Figura 13 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Thermosynechococcus elongatus optimizado por codón BP-1 tlll313 (NP 682103) (SEQ ID NO-.47) .
La Figura 14 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Synechococcus sp. Optimizado por codón JA3-3Ab CYA_0415 (YP_473897) (SEQ ID NO:48) .
La Figura 15 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Gloeobacter violaceus PCC7421 gll3146 (NP_926092) (SEQ ID NO: 15).
La Figura 16 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID NO: 65) y Prochlorococcus marinus optimizado por codón MIT9313 P T1231 (NP_895059) (SEQ ID NO:49) .
La Figura 17 es un trazo de GC/MS dé hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0532 (NP_892650) (SEQ ID NO: 19).
La Figura 18 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID NO: 65) y Prochlorococcus mariunus optimizado por COdÓn NATL2A PMN2A 1863 (YP 293054) (SEQ ID NO: 51).
La Figura 19 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO:65) y Synechococcus sp., optimizado por codón RS9917 RS9917_09941 (ZP_01079772 ) (SEQ ID NO:52) .
La Figura 20 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID NO:65) y Synechococcus sp . , optimizado por codón RS9917 RS9917_12945 (ZP_01080370) (SEQ ID NO:53).
La Figura 21 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Cyanothece sp. ATCC51142 cce_0778 (YP_0Ó1802195) (SEQ ID NO:27) .
La Figura 22 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Cyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_0398 (YP_002481151) (SEQ ID NO: 29) .
La Figura 23 es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan · Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID NO: 65) y Cyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_2986 (YP 002483683) (SEQ ID N0:31) .
La Figura 24A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por . células MG1655 E. ¦ coli que expresan Prochlorococcus arinus CCMP 1986 PMM0533 (NP_892651) (SEQ ID NO: 71) . La Figura 24B es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0533 (NP_892651) (SEQ ID NO: 71) y Prochlorococcus mariunus CCMP1986 PMM0532 (NP_892650) (SEQ ID NO:19).
La Figura 25A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli AfadE lacZ: : Ptrc '-tesA-fadD. La Figura 25B es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 AfadE lacZ::Ptrc 'tesA-fadD E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Acaryochloris marina MBIC11017 AM1_4041 (YP_001518340) (SEQ ID NO: 9).
La Figura 26A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 AfadE lacZ: :Ptrc 'tesA-fadD E. coli que expresan Synechocystis sp . PCC6803 S110209 (NP_442146) (SEQ ID NO:67). La Figura 26B es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 AfadE lacZ::Ptrc 'tesA-fadD E. coli que expresan Synechocystis sp. PCC6803 S110209 (NP_442146) (SEQ ID NO:67) y Synechocystis sp. PCC6803 S110208 (NP_442147) (SEQ ID NO : 3 ) .
La Figura 27A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 AfadD lacZ::Ptrc ' tesA E. coli que expresan M. smegmatis cepa MC2 155 MSMEG_5739 (YP_889972) (SEQ ID NO: 85). La Figura 27B es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos por células MG1655 AfadD lacZ: :Ptrc ' tesA E. coli que expresan M. smegmatis cepa MC2 .155 MSMEG_5739 (YP_889972) (SEQ ID NO: 85) y Nostoc punctifor e PCC73102 Npun02004178 ( ZP_00108838 ) (SEQ ID NO:5).
La Figura 28 es una representación gráfica de los hidrocarburos producidos por células MG1655 AfadD lacZ: :PtIC ' tesA E. coli que expresan M. smegmatis cepa MC2 155 MSMEG_5739 (YP_889972) (SEQ ID NO: 85) ya sea solas o en combinación con Nostoc sp. PCC7120 alr5283 (SEQ ID N0:7), Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (SEQ ID NO:5), P. mariunus CCMP1986 PMM0532 (SEQ ID NO:19), G. violaceus PCC7421 gll3146 (SEQ ID NO:15), Synechococcus sp. RS9917_09941 (SEQ ID NO:23); Synechococcus sp. RS9917_12945 (SEQ ID NO:25), O A. marina MBIC11017 AM1_4041 (SEQ ID NO : 9 ) .
La Figura 29A es una representación de la estructura tridimensional de una proteína de subunidad' ß de ribonucleasa-reductasa clase I, R R . La Figura 29B es una representación de la estructura tridimensional de Prochlorococcus marinus MIT9313 PMT1231 (NP_895059) (SEQ ID NO: 17) . La Figura 29C es una representación de la estructura tridimensional del sitio activo de Prochlorococcus marinus MIT9313 PMT1231 (NP_895059) (SEQ ID NO:17).
La Figura 30A es un trazo de GC/MS de los hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID N0:5). La Figura 30B es un trazo de GC/MS de los hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) variante Y123F. La Figura 30C es un trazo de GC/MS de los hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) variante Y126F.
La Figura 31 representa trazos de GC/MS de los hidrocarburos producidos al usar in vitro Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 6) y octadecanal (A); Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO-.6), octadecanal, ferredoxina-reductasa de espinaca, y NADPH (B) ; octadecanal, ferredoxina de espinaca, ferredoxina-reductasa de espinaca, y NADPH (C) ; o Npun02004178 (ZP_00108838 ) (SEQ ID NO: 6), ferredoxina de espinaca, y ferredoxina de espinaca (D) .
La Figura 32 representa trazos de GC/MS de los hidrocarburos producidos al usar in vitro Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO : 6 ) , NADPH, octadecanal, y ya sea (A) ferredoxina de espinaca y ferredoxina-reductasa de espinaca; (B) N. punctiforme PCC73102 Npun02003626 (ZP_00109192) (SEQ ID NO: 88) y N. punctiforme PCC73102 Npun02001001 (ZP_00111633 ) (SEQ ID NO: 90); (C) Npun02003626 ( ZP_00109192 ) (SEQ ID NO: 88) y N. punctiforme PCC73102 Npun02003530 (ZP_00109422) (SEQ ID NO:92); o (D) Npun02003626 (ZP_00109192) (SEQ ID NO:88) y N. punctiforme PCC73102 Npun02003123 (ZP_00109501) (SEQ ID NO: 94) .
La Figura 33A es un trazo de GC/MS de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID N0:66), NADH, y Mg2+. La Figura 33B es un trazo de GC/MS de los hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO:66),- NADPH, y Mg2+. La Figura 33C es un trazo de GC/MS de los hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66) y NADPH.
La Figura 34A es un trazo de GC/MS de los hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, NADPH marcado, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO:66), y NADPH no marcado. La Figura 3 B es un trazo de GC/MS de los hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, NADPH marcado, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66), y S- (4 -2H) NADPH . La Figura 34C es un trazo de GC/MS de los hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, NADPH marcado, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594 ) (SEQ ID NO:66), y R-(4-2H) NADPH .
La Figura 35 es un trazo de GC/MS de los hidrocarburos en el sobrenadante libre de células producido por célula MG1655 AfadE E. coli en el medio Che-9 que expresa Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) .
La Figura 36 es un trazo de GC/MS de los hidrocarburos en el sobrenadante libre de células producido por AfadE E. coli MG1655 en el medio Che-9 que expresa Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_l594) (SEQ ID NO: 65) y Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO:5) .
La Figura 37 es un trazo de GC/MS de. hidrocarburos producidos por células MG1655 E. coli que expresan Nostoc sp. PCC7120 alr5283 (NP_489323) (SEQ ID NO: 7) y Nostoc sp. PCC7120 alr5284 (NP_489324) (SEQ ID N0:81).
, La Figura 38 es. una lista de ejemplos de homólogos de Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400610 (Synpcc7942_1593 ) (SEQ ID N0:1) de una base de datos metagenómica .
La Figura 39 es una lista de ejemplos de homólogos de Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) de una base de datos metagenómica.
La Figura 40 es una tabla que identifica varios genes que se pueden expresar, sobre-expresar, o atenuar para incrementar la' producción de sustratos particulares.
Descripción Detallada de la Invención La invención proporciona composiciones y métodos para producir aldehidos, alcoholes grasos, e hidrocarburos (tal como alcanos, alquenos, y alquinos) de sustratos, por ejemplo, un acil-ACP, un ácido graso, un acil-CoA, un aldehido graso, o un sustrato de alcohol graso (por ejemplo, como se describe en PCT/US08/058788 , incorporada específicamente en la presente como referencia) . Estos aldehidos, alcanos y alquenos son útiles como biocombustibles (por ejemplo, sustitutos de gasolina, diesel, combustible de avión, etc.), productos químicos de especialidad (por ejemplo, lubricantes, aditivo de combustible, etc.), o como materia prima para conversión química adicional (por ejemplo, combustibles, polímeros, plásticos, textiles, solventes, adhesivos, etc.) . La invención se basa en parte en la identificación de genes que están comprendidos en la biosíntesis de aldehidos, alcanos y alquenos .
Estos genes biosintéticos de alcanos y alquenos incluyen, por ejemplo, Synechococcus elongatus PCC7942 Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO:l), Synechocystis sp. PCC6803 S110208 (SEQ ID NO:3), Nostoc punctiforme PCC 73102 Npun02004178 (SEQ ID NO:5), Nostoc sp. PCC 7120 alr5283 (SEQ ID N0:7), Acaryochloris marina MBIC11017 AM1_4041 (SEQ ID N0:9), Thermosynechococcus elongatus BP-1 tlll313 (SEQ ID NO: 11), Synechococcus sp. JA-3-3A CYA_0415 (SEQ ID NO:13), Gloeobacter violaceus PCC 7421 gll3146 (SEQ ID NO: 15), Prochlorococcus marinus MIT9313 PM123 (SEQ ID NO: 17), Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1986 PMM0532 (SEQ ID NO: 19), Prochlorococcus marinus str. NATL2A PMN2A_1863 (SEQ ID NO:21), Synechococcus sp. RS9917 RS9917_09941 (SEQ ID NO:23), Synechococcus sp. RS9917 RS9917_12945 (SEQ ID NO:25), Cyanothece s . ATCC51142 cce_0778 (SEQ ID NO:27), Cyanothece sp. PCC7245 Cyan7425DRAFT_1220 (SEQ ID NO:29), Cyanothece sp. PCC7245 cce_0778 (SEQ ID NO:31), Anabaena variabilis ATCC29413 YP_323043 (Ava_2533) (SEQ ID NO:33), y Synechococcus elongatus PCC6301 YP_170760 (syc0050_d) (SEQ ID NO: 35) . Otros genes biosintéticos de aléanos y alquenos están listados en la Tabla 1 y en la Figura 38.
Los genes biosintéticos de aldehido incluyen, por ejemplo, Synechococcus elongatus PCC7942 Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO:65), Synechocystis sp. PCC6803 sll0209 (SEQ ID NO:67), Cyanothece sp. ATCC51142 cce_1430 (SEQ ID NO:69), Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1986 PMM0533 (SEQ ID NO: 71), Gloeobacter violaceus PCC7421 NP_96091 (gll3145) (SEQ ID NO:73), Nostoc punctiforme PCC73102 ZP_00108837 (Npun02004176) (SEQ ID NO: 75), Anabaena variabilis ATCC29413 YP_323044 (Ava_2534) (SEQ ID NO:77), Synechococcus elongatus PCC6301 YP_170761 (syc0051_d) (SEQ ID NO:79), y Nostoc sp. PCC 7120 alr5284 (SEQ ID NO:81). Otros genes biosintéticos de aldehido se listan en la Tabla 1 y en la Figura 39.
Usando los métodos descritos en la presente, se pueden preparar aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos usando uno o más genes o polipéptidos biosintéticos de aldehidos, alcanos y/o alquenos, descritos en la presente, o variantes de los mismos, utilizando células hospedadoras o métodos libres de células.
Tabla 1: Homólogos de genes biosintéticos de aldehidos y alcanos en genomas cianobacterianos Cianobacteria Gen Bio-sintético de Gen Bio-sintético de Alcano, número de Aldehidos, número de acceso % de ID acceso % de ID Synechococcus elongatus PCC 7942 YP_400610 100 YP_400611 100 Synechococcus elongatus PCC 6301 YP_170760 100 YP_170751 100 Microcoleus chthonoplastes PCC 7420 EDX75019 77 EDX74978 70 ' ñrthrospira máxima CS-328 EDZ94963 78 EDZ94968 68 Lyngbya sp. PCC 8106 ZP_01619575 77 · ZP_01619574 69 Nodularia spumigena CCY9414 ZP_01628096 77 ZP_01628095 70 TrichodesmLum erythraeum IMS101 YP_721979 76 YP_721978 69 Cianobacteria Gen Bio-sintético de Gen Bio-sintético de Alcano, número de Aldehidos, número de acceso % de ID acceso % de H> Microcystis aeruginosa NIES-843 YP_001660323 75 YP_001660322 68 Microcystis aeruginosa PCC 7806 CAO90780 74 CAO90781 67 Nostoc sp. PCC 7120 NP_489323 74 NP_489324 72 Nostoc azollae 0708 EEG05692 73 EEG05693 70 Anabaena variabilis ATCC 29413 YP_323043 74 YP_323044 73 Crocosphaera watsonii WH 8501 ZP_00514700 74 ZP_00516920 67 Synechocystis sp. PCC 6803 NP_442147 72 NP 442146 68 Synechococcus sp. PCC 7335 EDX86803 73 EDX87870 67 Cyanothece sp. ATCC 51142 YP_001802195 73 YP_001802846 67 Cyanothece sp. CCY0110 ZP_01728578 72 ZP_01728620 68 Nostoc punetiforme PCC 73102 ZP_00108838 72 ZP_00108837 71 Acaryochloris marina MBIC11017 YP_001518340 71 YP_001518341 66 Cyanothece sp. PCC 7425 YP_002481151 71 YP_002481152 70 Cyanothece sp. PCC 8801 ZP_02941459 70 ZP_02942716 69 Thermosynechococcus elongatus BP-1 NP_682103 70 NP_682102 70 Synechococcus sp. JA-2-3B 1 a (2-13) YP_478639 68 YP_478638 63 Synechococcus sp. RCC307 YP^001227842 67 YP_001227841 64 Synechococcus sp. WH 7803 YP_001224377 68 YP_001224378 65 Synechococcus sp. WH 8102 NP_897829 70 NP_897828 65 Synechococcus sp. WH 7805 ZP_01123214 68 ZP_01123215 65 sin Synechococcus GOM 3012 tipo A ABD96376 70 BD96375 65 Cianobacteria Gen Bio-sintético de Gen Bio-sintético de Alcano, número de Aldehidos, númsro de acceso % de ID acceso % de ID marino no cultivado Synechococcus sp. JA-3-3Ab YP_473897 68 YP_473896 62 sin Synechococcus GOM 306 tipo A ABD96328 70 ABD96327 65 marino no cultivado Synechococcus GOM 3M9 tipo A marino ABD96275 68 ABD96274 65 no cultivado Synechococcus sp. CC9311 YP_731193 63 YP_731192 63 Synechococcus 5B2 tipo A marino no ABB92250 69 ABB92249 64 cultivado Synechococcus sp. WH 5701 ZP_01085338 66 ZP_01085337 67 Gloeobacter violaceus PCC 7421 NP_926092 '63 NP_926091 67 Synechococcus sp. RS9916 ZP_01472594 69 ZP_01472595 66 Synechococcus sp. RS9917 ZP_01079772 68 ZP_01079773 65 Synechococcus sp. CC9605 YP_381055 66 YP_381056 66 Cyanobium sp . PCC 7001 EDY39806 64 EDY38361 64 Prochlorococcus marinus str. MIT9303 YP_001016795 63 YP_001016797 66 Prochlorococcus marínus str. MIT9313 NP 895059 63 NP 895058 65 Synechococcus sp. CC9902 YP_377637 66 YP_377636 65 Prochlorococcus marinus str. MIT9301 YP_001090782 62 YP_001090783 62 Synechococcus sp. BL107 ZP_01469468 65 ZP_01469469 65 Cianobacteria Gen Bio-sintético de Gen Bio-sintético de Alcano, número de Aldehidos, número de acceso % de ID acceso % de ID Prochlorococcus marinus str. AS9601 YP_001008981 62 YP_001008982 61 Prochlorococcus marinus str. MIT9312 YP_397029 62 YP_397030 61 Prochlorococcus marinus subsp. NP_892650 60 NP_892651 63 pastoris str. CCMP1986 Prochlorococcus marinus str. MIT9211 YP_001550420 61 YP_001550421 63 Cyanothece sp. PCC 7425 YP_002,483683 59 - Prochlorococcus marinus str. NATL2A YP_293054 59 YP_293055 62 Prochlorococcus marinus str. NATL1A YP_001014415 59 YP_001014416 62 Prochlorococcus marinus subsp. NP_874925 59 NP_874926 64 marinus str. CCMP1375 Prochlorococcus marinus str. MIT. YP_001010912 57 YP_001010913 63 9515_05961 Prochlorococcus marinus str. MIT YP_001483814 59 YP_001483815 62 9215-06131 Synechococcus sp. RS9917 ZP_01080370 43 -sin Synechococcus GOM 5D20 tipo A ABD96480 65 marino no cultivado Genes Biosintéticos de Aldehidos, Alcanos y Alquenos, y Variantes Los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen, por ejemplo, genes biosintéticos de alcanos o alquenos que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N0:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 35, así como variantes de polinucleótido de las mismas. En algunos casos, los genes biosintéticos de alcanos o alquenos codifican para uno más de los motivos de aminoácido descritos en la presente. Por ejemplo, los genes biosintéticos de alcanos o alquenos pueden codificar para un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 37, 38, 39, 41, 42, 43, o 44. Los genes biosintéticos de alcanos o alquenos también pueden incluir un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 0 y también cualquiera de SEQ ID NO:37, 38 o 39.
Los métodos y composiciones descritos en la presente también incluyen, por ejemplo, genes biosintéticos de aldehidos que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, u 81, así como . variantes de polinucleótido de las mismas. En algunos casos, el gen biosintético de aldehido codifica para uno o más de los motivos de aminoácido descritos en la presente. Por ejemplo, el gen biosintético de aldehido puede codificar para un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, o 64.
Las variantes se pueden presentar de forma natural o se pueden crear in vitro. En particular, estas variantes se pueden crear usando técnicas de ingeniería genética, tal como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de supresión con Exonucleasa III, y técnicas normales de clonación. De manera alternativa, estas variantes, fragmentos, análogos o derivados se pueden crear usando síntesis química o procedimientos de modificación.
En la técnica son bien conocidos los métodos para producir estas variantes. Estos incluyen procedimientos en los cuales se modifican secuencias de ácido nucleico, obtenidas de productos aislados naturales, para generar ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos que tienen características que mejoran su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En estos procedimientos, se generan y caracterizan un gran número de secuencias variantes que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida del aislado natural. Típicamente, estas diferencias de nucleótidos dan por resultado cambios de aminoácido con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de los aislados naturales.
Por ejemplo, se puede crear variantes usando PCR propensa a error (ver, por ejemplo, Leung et al., Technique 1:11-15, 1989; y .Caldwell et al., PCR Methods Applic. 2:28-33, 1992) . En la PCR (propensa a error, la PCR se realiza bajo condiciones donde es baja la fidelidad de copia de la ADN-polimerasa, tal que se obtiene una alta proporción de mutaciones puntuales a lo largo de la longitud completa del producto de PCR. De forma breve, en estos procedimientos, los ácidos nucleicos que se van a mutageneizar (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido, biosintética de aldehidos o alcanos) , se mezclan con cebadores de PCR, amortiguador de reacción, MgCl2, MnClí, Taq-polimerasa, y una concentración apropiada de dNTPs para lograr una alta proporción de mutación puntual a lo largo de la longitud completa del producto de PCR. Por ejemplo, la reacción se puede realizar usando 20 fmoles de ácido nucleico que se va a mutageneizar (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido, biosintética de aldehidos o alcanos) , 30 pmole de cada cebador de PCR, un amortiguador de reacción que comprende KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8.3) , y 0.01 % de gelatina, MgCl2 7 mM, MnCl2 0.5 mM, 5 unidades dé Taq-polimerasa, dGTP 0.2 mM, dATP 0.2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP lmM. La PCR se puede realizar durante 30 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 45 °C durante 1 minuto, y 72 °C durante 1 minuto. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar como, sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutageneizados entonces se clonan en un vector apropiado y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutageneizados.
También se pueden crear variantes usando mutagénesis dirigida a oligonucleótido para generar mutaciones específicas de sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis de oligonucleótido se describe, por ejemplo en Reidhaar-Olson et al., Science 241:53-57, 1988. De forma breve, en estos procedimientos, una pluralidad de oligonucleótidos de doble hebra que tienen una o más mutaciones que se van a introducir en el ADN clonado, se sintetizan e insertan en el ADN clonado que se va a mutageneizar (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido, biosintética de aldehidos o alcanos) . Se recuperan los clones que contienen el ADN mutageneizado, y se valoran las actividades de los polipéptidos que codifican.
Otro método para generar variantes es PCR de montaje. La PCR de montaje comprende el montaje de un producto de PCR de una mezcla de pequeños fragmentos de ADN. Se presenta en paralelo en el mismo frasco un gran número de diferentes reacciones de PCR, con los productos de una reacción que ceban los productos de otra reacción. La PCR de montaje se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos número 5,965,408.
Aún otro método para generar variantes es mutagénesis de PCR sexual. En la mutagénesis de PCR sexual, se presenta recombinación homologa forzada entre moléculas de ADN' de secuencia diferente, pero altamente relacionada, de ADN in vitro como resultado de fragmentación aleatoria de la molécula de ADN en base a la homología de secuencia. Esto se sigue por fijación del entrecruzamiento por extensión de cebador en una reacción de PCR. La mutagénesis de PCR sexual se describe, por ejemplo, en Stemmer, PNAS, USA 91:10747-10751,1994.
También se pueden crear variantes por mutagénesis in vivo. En algunas modalidades, las mutaciones aleatorias en una secuencia de ácido nucleico se generan al propagar la secuencia en una cepa bacteriana, tal como cepa de E. coli, que tiene mutaciones en una o más de las rutas de reparación de ADN. Estas cepas "imitadoras" tienen una más alta proporción de mutación aleatoria que aquella de una cepa tipo silvestre. La propagación de una secuencia de ADN (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido, biosintética de aldehidos o alcanos) en una de estas cepas generará eventualmente mutaciones aleatorias dentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para el uso para mutagénesis in vivo se describen, por ejemplo, en la Publicación PCT No. WO 91/16427.
También se pueden generar variantes usando mutagénesis de cásete. En la mutagénesis de cásete, se reemplaza una región pequeña de una molécula de ADN de doble hebra con un "cásete" de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido contiene frecuentemente una secuencia nativa completa y/o parcialmente aleatorizada .
También se puede usar mutagénesis de conjuntó recursivo para generar variantes . La mutagénesis de conjunto recursivo es un algoritmo para manejar proteínas (es decir, mutagénesis de proteínas) desarrollada para producir diversas poblaciones de mutantes fenotípicamente relacionados cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método usa un mecanismo de retroalimentación para controlar rondas sucesivas de mutagénesis combinatoria de cásete. La mutagénesis de conjunto recursivo se describe, por ejemplo en, Arkin et al., PNAS, USA 89:7811-7815, 1992.
En algunas modalidades, se crean variantes usando mutagénesis de conjunto exponencial. La mutagénesis de conjunto exponencial es un proceso para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales en donde se aleatorizan pequeños grupos de residuos en paralelos para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conducen a proteínas funcionales. La mutagénesis de conjunto exponencial se describen, por ejemplo, en Delegrave et al., Biotech. Res. 11:1548-1552, 1993. La mutagénesis aleatoria y dirigida al sitio se describen, por ejemplo en, Arnold, Curr. Opin. Biotech. 4:450-455, 1993.
En algunas modalidades, se crean variantes usando procedimientos de transposición en donde las porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican para distintos polipéptidos se fusionan conjuntamente para crear secuencias quiméricas de ácido nucleico que codifican para polipéptidos quiméricos como se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos números 5,965,408 y 5,939,250.
Las variantes de polinucleótido también incluyen análogos de ácido nucleico. Los análogos de ácido nucleico se. pueden modificar en la porción base, porción de azúcar, o estructura de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad del ácido nucleico. Las modificaciones en la porción base incluyen desoxiuridina por desoxitimidina y 5-metil-2 ' -desoxicitidina o 5-bromo-2'-desoxicitidina por desoxicitidina. Las modificaciones de la porción de azúcar incluyen modificación del 2'-hidroxilo del azúcar ribosa para formar azúcares de 2'-0-metilo o 2'-0-alilo. La estructura de desoxiribosa-fosfato se puede modificar para producir ácidos nucleicos de morfolino, en el cual cada porción base se enlaza a un anillo de morfolino de seis miembros, o ácidos nucleicos peptídicos, en el cual se reemplaza la estructura de desoxifosfato por una estructura de pseudopéptido y se retienen las cuatro bases. (Ver, por ejemplo, Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:187-195; y Hyrup et al., Bioorgan. Med. Chem. (1996) 4:523) . Además, la estructura de desoxifosfato se puede reemplazar, por ejemplo, con una estructura de fosforotioato o fosforoditioato, una fosforoamidita, o una estructura de alquil-fosfotriéster .
Los polipéptidos biosintéticos de aldehidos y alcanos Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 66) y Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO: 2) tienen homólogos en otras cianobacteriás (en la Tabla 1 se representan los ejemplos no limitantes) . De esta manera, cualquier secuencia de polinucleótido que codifique para un homólogo listado en la Tabla 1, o una variante del mismo, se puede usar como un polinucleótido biosintético de aldehidos o alcanos en los métodos descritos en la presente. Cada cianobacteria listada en la Tabla 1 tiene copias de ambos genes . El nivel de identidad de secuencia de los productos génicos varía desde 61 % a 73 % para Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 66) y de 43 % a 78 % para Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO:2).
En la Figura 39 se listan homólogos adicionales del polipéptido biosintético de aldehidos Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 66), y cualquier secuencia de polinucleótido que codifique para un homólogo listado en la Figura 39, o una variante del mismo, se puede usar como un polinucleótido biosintético de aldehidos, en los métodos descritos en la presente. En la Figura 38 se listan homólogos adicionales del polipéptido biosintético de alcanos Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO:2), y cualquier secuencia de polinucleótido que codifique para un homólogo listado en la Figura 38, o una variante del mismo, se puede usar como un polinucleótido biosintético de aléanos en los métodos descritos en la presente.
En ciertos casos, un gen biosintético de aldehidos, aléanos y/o alquenos se optimiza por codón para la expresión en una célula hospedadora, particular. Por ejemplo, para la expresión en E. coli, se pueden optimizar uno o más codones como se describe, por ejemplo, en Grosjean et al., Gene 18 : 199-209 (1982) .
Polipéptidos Biosintéticos de Aldehidos, Alcanos y Alquenos, y Variantes Los métodos y composiciones descritos en la presente también incluyen polipéptidos biosintéticos de alcanos o alquenos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36, así como variantes de polipéptido de las mismas. En algunas modalidades, un polipéptido biosintético de alcanos o alquenos es uno que incluye uno o más de los motivos de aminoácido descritos en la presente. Por ejemplo, el polipéptido biosintético de alcanos o alquenos puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 38, 39, 41, 42, 43, o 44. El polipéptido biosintéticos de alcanos o alquenos también pueden incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y también cualquiera de SEQ ID NO:37, 38 o 39.
Los métodos y composiciones descritos en la presente también incluyen polipéptidos biosintéticos de aldehidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, o 82, así como variantes de polipéptido de las mismas. En algunos casos, un polipéptido biosintético de aldehidos es uno que incluye uno o más de los motivos de aminoácido descritos en la presente. Por ejemplo, el polipéptido biosintético de aldehidos puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62/ 63, o 64.
Las variantes del polipéptido biosintético de aldehidos, alcanos y alquenos pueden ser variantes en las cuales se sustituyen uno o más residuos de aminoácido con un residuo conservado o no conservado de aminoácido (preferentemente un residuo conservado de aminoácidos) . Este residuo sustituido de aminoácido puede ser uno codificado por el código genético, o no.
Las sustituciones conservadoras son aquellas que sustituyen un aminoácido terminado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Las sustituciones conservadoras típicas son los siguientes reemplazos: el reemplazo de un aminoácido alif tico, tal como alanina, valina, leucina y isoleucina, con otro aminoácido alifático; el reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; el reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, con otro residuo ácido; el reemplazo de un residuo que tiene un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, con otro residuo que tiene un grupo amida; el intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, con otro residuo básico; y el reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, con otro residuo aromático.
Otras variantes de polipéptido son aquellas en las cuales uno o más residuos de aminoácido incluyen un grupo sustituyente . Aún otras variantes de polipéptido son aquellas en las cuales el polipéptido está asociado con otro-compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) .
Las variantes adicionales de polipéptido son aquellas en las cuales se fusionan aminoácidos adicionales al polipéptido, tal como una secuencia guía, una secuencia secretoria, una secuencia de proproteína, o una secuencia que facilita la purificación, enriquecimiento o estabilización del polipéptido.
En algunos casos, una variante de polipéptido sintético de alcanos o alquenos retiene la misma xfunción biológica como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36 (por ejemplo, retiene actividad biosintética de alcanos o alquenos) que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a esta.
En otros casos, las variantes del polipéptido biosintético de alcanos o alquenos tienen al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o más de aproximadamente 95 %, de homología a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36. En otra modalidad, las variantes de polipéptido incluyen un fragmento que comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos del mismo.
En algunos casos, una variante de polipéptido biosintético de aldehido retiene la misma función biológica como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, o 82 (por ejemplo, retiene actividad biosintética de aldehidos) y tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a esta.
En aún otros casos, las variantes del polipéptido biosintético de aldehidos tienen al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %., al menos aproximadamente 95 %, o más de aproximadamente 95 % de homología a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68·, 70, 72, 74, 76, 78, 80, o 82. En otra modalidad, las variantes de polipéptido incluyen un fragmento que comprende al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos del mismo.
Las variantes de polipéptido, o fragmentos de las mismas, se pueden obtener al aislar ácidos nucleicos que codifican para estos usando técnica descritas en la presente o al expresar ácidos nucleicos sintéticos que codifican para estos. De manera alternativa, se pueden obtener variantes de polipéptido o fragmentos de las mismas a través de procedimientos de purificación o enriquecimiento bioquímico. La secuencia de las variantes de polipéptido, o fragmentos, se puede determinar por digestión proteolítica, electroforesis en gel, y/o microsecuenciación . La secuencia de las variantes o fragmentos del polipéptido biosintético de alcanos o alquenos entonces se puede comparar a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36 usando cualquiera de los programas descritos en la presente. La secuencia de las variantes o fragmentos del polipéptido biosintético de aldehidos se puede comparar a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, o 82 usando cualquiera de los programas descritos en la presente.
Las variantes de polipéptido y fragmentos de las mismas se pueden valorar para actividad productora de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos usando métodos de rutina. Por ejemplo, las variantes de polipéptido, o fragmentos, se pueden poner en contacto con un sustrato (por ejemplo, un sustrato de derivado de ácido graso u otro •sustrato descrito en la presente) bajo condiciones que permitah que funcione la variante de polipéptido. Una disminución en el nivel del sustrato o un incremento en el nivel de un aldehido, alcano, alqueno, se puede medir para determinar la actividad productora de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos o .alquenos, respectivamente.
Anticuerpos Anti-Polipéptidos Biosintéticos de Aldehidos, Alcoholes Grasos, Alcanos y Alquenos Los polipéptidos biosintéticos de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos o alquenos, descritos en la presente, también se pueden usar para producir anticuerpos dirigidos contra polipéptidos biosintéticos de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos. Estos anticuerpos se pueden usar, por ejemplo, para detectar la expresión de un polipéptido biosintético de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos o alquenos, usando métodos conocidos en la técnica. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo; un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo reformado, un anticuerpo humanizado, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab' , Fab, F(ab')2); o un anticuerpo biosintético , por ejemplo, un anticuerpo de cadena individual, anticuerpo de dominio individual (DAB) , Fv, Fv de cadena individual (scFV) , o similares .
Los métodos para producir y usar anticuerpos policlonales y monoclonales se describen, por ejemplo en Harlow et al., Using Antibodies : A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory (01 de diciembre de 1998) . Los métodos para producir anticuerpos modificados y fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos reformados, anticuerpos humanizados, o fragmentos de los mismos, por ejemplo, fragmentos Fab', Fab, F(ab' )2) ; o anticuerpos de biosintéticos (por ejemplo, anticuerpos de cadena individual, anticuerpos de dominio individual (DABs) , Fv, Fv de cadena individual (scFv) , y similares) , se conocen en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoconal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag (15 de diciembre de 2000; Ira edición) .
Substratos Las composiciones y métodos descritos en la presente se pueden usar para producir aldehidos, alcoholes grasos, aléanos y/o alquenos a partir de un sustrato apropiado . En tanto que no se desea que se una por una teoría particular, se cree que los polipéptidos biosintéticos de alcanos . o alquenos, descritos en la presente, producen alcanos o alquenos de sustratos mediante un mecanismo de descarbonilización. En algunos casos, el sustrato es un derivado de ácido graso, por ejemplo, un aldehido graso, y un alcano que tiene patrones particulares de ramificación y la longitud de la cadena de carbono se puede producir de un derivado de ácido graso, por ejemplo, un aldehido graso, que tiene estas características 'particulares . En otros casos, el sustrato es un derivado de ácido graso insaturado, por ejemplo, un aldehido graso insaturado, y un alqueno que tiene patrones particulares de ramificación y la longitud de la cadena de carbono se puede producir de un derivado de ácido graso insaturado, por ejemplo, un aldehido graso insaturado, que tienen estas características particulares.
En tanto que no se desea que se una por una teoría particular, se cree que los polipéptidos biosintéticos de aldehidos descritos en la presente producen aldehidos a partir de sustratos mediante un mecanismo de reducción. En ciertos casos, el sustrato es un acil-ACP.
En tanto que no se desea que se una por una teoría particular, se cree que los alcoholes grasos descritos en la presente se producen de sustratos mediante un mecanismo de reducción. En ciertos casos, el sustrato es un aldehido graso .
Por consiguiente, cada paso dentro de una ruta biosintética que conduzca a la producción de estos sustratos se puede modificar para producir o producir en exceso el sustrato de interés. Por ejemplo, los genes conocidos, comprendidos en la ruta biosintética de ácidos grasos, la ruta de aldehidos grasos, y la ruta de alcoholes grasos se pueden expresar, sobreexpresar, o atenuar en células hospedadoras para producir un sustrato deseado (ver, por ejemplo PCT/US08/058788 , específicamente incorporada en la presente como referencia) . En la Figura 40 se proporcionan genes de ejemplo.
Síntesis de Sustratos La ácido graso-sintasa (FAS) es un grupo de polipéptidos que catalizan el inicio y alargamiento de cadenas de acilo (Marrakchi et al., Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002). La proteína portadora de acilo (ACP) junto con las enzimas en la ruta de FAS controla la longitud, el grado de saturación y la ramificación de los derivados producidos de ácido graso. La ruta biosintética de ácidos grasos comprende los precursores acetil-CoA y malonil-CoA. Estos pasos en esta ruta se catalizan por enzimas de la biosíntesis de ácidos grasos (fab) y las familias de genes de acil-CoA-carboxilasa (acc) (ver, por ejemplo, Heath et al., Prog. Lipid Res. 40(6):467-97 (2001)).
Se pueden manejar células hospedadoras para expresar sustratos de derivados de "ácidos grasos al expresar o sobre-expresar de manera recombinante genes de acetil-CoA y/o malonil-CoA-sintasa . Por ejemplo, para incrementar la producción de acetil-CoA, se pueden expresar uno o más de los siguientes genes en una célula hospedadora: pdh, panK, aceEF (que codifica para el componente de Elp-deshidrogenasa y el componente de E2p-dihidrolipoamida-aciltransferasa de los complejos de piruvato y 2 -oxoglutarato-deshidrogenasa) , fabH, fabD, fabG, acpP, y fabF. Los números de acceso al GenBank de ejemplo para estos genes son: pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226) , panK (también conocido como coaA, AAC76952) , aceEF (AAC73227, AAC73226) , fabH (AAC74175) , fabD (AAC74176) , fabG (AAC74177) , acpP (AAC74178) , fabF (AAC74179) . Adicionalmente , los niveles de expresión de fadE, gpsA, ldhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA, y/o ackB se pueden atenuar o suprimir en una célula hospedadora manejada por transformación con plásmidos condicionalmente replicantes o no replicantes que contienen mutaciones nulas o por supresión de los genes correspondientes o al sustituir secuencias promotoras o intensificadoras . Los números de acceso al GenBank de ejemplo para estos gene son: fadE (AAC73325) , gspA (AAC76632) , ldhA (AAC744S2), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958) , ackA (AAC75356) , y ackB (BAB81430) . Las células hospedadoras resultantes tendrán niveles incrementados de producción de acetil-CoA cuando se cultiven en un ambiente apropiado .
Se puede efectuar la sobreexpresion de malonil-CoA al introducir accABCD (por ejemplo, número de acceso AAC73296, EC 6.4.1.2) en una célula hospedadora . Adicionalmente se -pueden sobre-expresar ácidos grasos en células hospedadoras al introducir en la célula hospedadora una secuencia de ADN que codifique para una lipasa fpor ejemplo, números de accesos CAA89087, CAA98876) .
Además, la inhibición de PlsB puede conducir a un incremento en los niveles de acil-ACP de cadena larga, que inhibirá- los pasos tempranos en la rita (por ejemplo, accABCD, fabR, y fabl) . La mutación plsB (por ejemplo, número de acceso AAC77011) D311E se puede usar para incrementar la cantidad de acil-CoA disponible.
Además, se puede manejar una célula hospedadora para sobreexpresar un gen sfa (supresor de fabA, por ejemplo, número de acceso AAN79592) para incrementar la producción de ácidos grasos monoinsaturados (Rock et al., J Bacteriology 178 : 5382-5387, 1996) .
En algunos casos, se pueden manjar células hospedadoras para expresar, sobre-expresar o atenuar la expresión de una tioesterasa para incrementar la producción del sustrato de ácido graso. La longitud de cadena de un sustrato de ácido graso se controla por tioesterasa. En algunos casos, se puede sobre-expresar un gen tes o fat. En otros casos, se pueden producir ácidos grasos de Ci0 al atenuar tioesterasa Ci8 (por ejemplo, números de acceso AAC73596 y POADA1), que usa C18:i-ACP, y expresando trioesterasa Cío (por ejemplo, número de acceso Q39513), que usa Ci0-ACP. Esto da por resultado una población relativamente homogénea de ácidos grasos que tienen una longitud de la cadena de carbonos de 10. En aún otros casos, se pueden producir ácidos grasos de Ci4 al atenuar tioesterasas endógenas que no producen ácidos grasos de C14 y expresando las tioesterasas, que usan C14-ACP (por ejemplo, número de acceso Q39473) . En algunas situaciones, se pueden producir ácidos grasos de C12 al expresar tioesterasas que usan C12 -ACP (por ejemplo, número de acceso Q41635) y atenuando tioesterasas que no producen ácidos grasos de Ci2. Se puede verificar la sobreproducción de acetil-CoA, de malonil-CoA y de ácido graso usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, al usar precursores radioactivos, HPLC, y GC-MS subsiguiente a lisis celular. Los ejemplos no limitantes de tioesterasas que se pueden usar en los métodos descritos en la presente se listan en la Tabla 2.
Tabla 2: Tioesterasas Número de Acceso Organismo Gen Producto Fuente preferencial producido AAC72883 Cuphea fatA Cl8 : 1 hookeríana AAL79361 Helianthus fatAl annus * Mayer et al., BMC Plant Biology 7:1-11, 2007 Formación de Aldehidos Ramificados, Alcoholes Grasos, Alcanos y Alquenos Se pueden producir aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos que contienen puntos de ramificación al usar derivados de ácidos grasos ramificados como sustratos. Por ejemplo, aunque E. coli produce de manera natural derivados de ácido graso de cadena recta (sFA) , se puede manejar E. coli para que produzca derivados de. cido graso de cadena ramificada (brFA) al introducir y expresar o sobreexpresar genes que proporcionen precursores ramificados en la E. coli (por ejemplo, las familias de genes bkd, ilv, icm, y fab) . Adicionalmente , se pueden manejar una célula hospedador/a para sobreexpresar o expresar genes que codifique para proteínas para el alargamiento de brFAs (por ejemplo, ACP, FabF, etc.), y/o para suprimir o atenuar los genes correspondientes de células hospedadoras que conducen normalmente a sFA.
El primer paso en la formación de brFA es la producción de los correspondientes a-ceto-ácidos por una aminoácido-aminotransferasa de cadena ramificada. Las células hospedadoras pueden incluir de manera endógena genes que codifiquen para estas enzimas o estos genes se pueden introducir de manera recombinante . Por ejemplo, E. coli expresa de manera endógena esta enzima IIvE (EC 2.6.1.42; acceso GenBank YP_026247) . En algunas células hospedadoras, no se puede expresar una aminoácido-aminotransferasa heterologa de cadena ramificada. Sin embargo, E. coli IIvE o cualquier otra aminoácido-aminotransferasa de cadena ramificada (por ejemplo, IIvE de Lactococcus lactis (acceso GenBank AAF34406) , IIvE de Pseudomonas putida (acceso GenBank NP_745648) , o IIvE de Streptomyces coelicolor (acceso GenBank NP_629657)), si no es endógena, se puede introducir y expresar de manera recombinante .
El segundo paso es la descarbozilación oxidativa de los a-cetoácidos al correspondiente acil-CoA de cadena ramificada. Esta reacción se puede catalizar por un complejo de oí-ceto-ácido-deshidrogenasa de cadena ramificada (bkd; EC 1.2.4.4.) (Denoya et al., J Bacteriol . 177:3504, 1995), que consiste de subunidades ?1a/ß (descarboxilasa) , E2 (dihidrolipoil-transacilasa) , y E3 (dihidrolipoil-deshidrogenasa) . Estos complejos de a-ceto-ácido-deshidrogenasa de cadena ramificada son similares a complejo de piruvato- y a-cetoglutarato-deshidrogenasa . Se puede usar cualquier organismo que posea brFA y crezca en aminoácidos de cadena ramificada como una fuente para aislar genes bkd para la expresión en células hospedadoras , por ejemplo, E. coli. Adicionalmente, E. coli tiene el componente E3 como parte de su complejo de piruyato-deshidrogenasa (lpd, EC 1.8.1.4, acceso GenBank NP_414658) . De esta manera, puede ser suficiente expresar sólo los genes El a/ß y E2 bkd. La Tabla 3 lista ejemplos no limitantes de genes bkd de varios microorganismos que se pueden introducir y expresar de manera recombinante en una célula hospedadora para proporcionar acil-CoA-precursores de cadena ramificada.
Tabla 3 : Genes Bkd de microorganismos seleccionados Organismo Gen Acceso GenBank No.
Streptomyces avermitilis JWcdA (Ela) BAC72074 bkdB (Elb) BAC72075 bkdC (E2) BAC72076 Streptomyces avermitilis bkdF (Ela) BAC72088 bkdG (??ß) BAC72089 bkdH (E2) BAC72090 Bacillus subtilis bkdAA (Ela). NP_390288 bkdAB (??ß) NP_390288 bkdB (E2) NP_390288 Pseudomonas putida ¿JdAl (Ela) AAA65614 bkdA2 (??ß) AAA65615 bJcdC (E2) AAA65617 En otro ejemplo, se puede producir isobutiril-CoA en una célula hospedadora, por ejemplo en E. coli, a través de la co-expresión de una crotonil-CoA reductasa (Ccr, EC 1.6.5.5, 1.1.1.1) e isobutiril -CoA mutasa (subunidad grande IcmA, EC 5.4.99.2; subunidad pequeña IcmB, EC 5.4.99.2) (Han y Reynolds, J. Bacteriol. 179:5157, 1997) . Crotonil-CoA es un producto intermedio en la biosíntesis de ácidos grasos en E. coli y otros microorganismos. Los ejemplos no limitantes de genes ccr e icm de microorganismos seleccionados se listan en la Tabla 4.
Tabla 4 : Genes ccr e icm de microorganismos seleccionados Además la expresión de los genes bkd, el inicio de la biosíntesis de brFA utiliza ß-cetoacil-proteína-portadora-de-acilo-sintasa III (FabH, EC 2.3.1.41) con especificidad para acil-CoAs de cadena ramificada (Li et al, J. Bacteriol. 187:3795-3799, 2005). Los ejemplos no limitantes de estas enzimas de FabH se listan en la Tabla 5. Los genes fabH que están comprendidos en la biosíntesis de ácidos grasos de cualquier microorganismo que contenga brFA se pueden expresar en una célula hospedadora. Las enzimas Bkd y FabH de célula hospedadoras que no producen de manera natural brFA no pueden soportar la producción de brFA. Por lo tanto, se pueden expresar de manera recombinante bkd y fabH. Los vectores que contienen los genes bkd y fabH se pueden insertar en esta célula hospedadora. De manera similar, el nivel endógeno de producción de Bkd y FabH no puede ser suficiente para producir brFA. En este caso, se pueden sobreexpresar. Adicionalmente , otros componentes de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos se pueden expresar o sobreexpresar, tal como proteínas portadores de acilo (ACP) y ß-cetoacil-proteína-portadora-de-acilo-sintasa II {fabF, EC 2.3.1.41) (en la Tabla 5 se listan ejemplos no limitantes de candidatos) . Además de expresar estos genes, algunos genes en la ruta de biosíntesis endógena de ácidos grasos se pueden atenuar en la célula hospedadora {por ejemplo, los genes de E., coli fabH (acceso GenBank número NP_415609) y/o fabF (acceso GenBank número NP_415613) ) .
Tabla 5 : Genes FabH, ACP y fabF de microorganismos seleccionados con brFAs Organismo Gen Acceso GenBank No.
Bacillus subtilis fabH A NP_389015 fabH B NP_388898 ACP NP_389474 fabF NP_389016 Stenotrophomonas SmalDRAFT_081 ZP_01643059 maltophila 8 (FabH) SmaÍDRAFT_082 ZP_01643063 1 (ACP) SmalDRAFT_082 ZP_01643064 2 (FabF) Legionella pneumophila FabH YP_123672 ACP YP_123675 fabF YP_123676 Formación de Aldehidos Cíclicos, Alcoholes Grasos, Alcanos y Alquenos Se pueden producir aldehidos cíclicos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos al usar derivados de ácidos grasos cíclicos como sustratos. Para producir sustratos de derivados de ácidos grasos cíclicos, se pueden introducir genes que proporcionen precursores cíclicos {por ejemplo, las familias de genes ans , che y plm) en la célula hospedadora y expresar para permitir el inicio de la biosíntesis de ácidos grasos a partir de precursores cíclicos. Por ejemplo, para convertir una célula hospedadora, tal como E. coli, en una capaz de sintetizar derivados de ácido graso ?-cíclicos (cyFA) , en la célula hospedadora se puede introducir y expresar . un gen que comprenda el precursor cíclico ciclohexilcarbonil -CoA (CHC-CoA) (Cropp et al, Nature Biotech. 18:980-983, 2000) . Los ejemplos no limitantes de genes que proporcionan CHC-CoA en E. coli incluyen: ansJ, ansK, ansL, chcA y ansM de la agrupación de genes de ansatrienina de Streptomyces collinus (Chen et al., Eur . J. Biochem. 261:98-107, 1999) o plmJ, plmK, plmL, chcA y plmM de la agrupación de genes de foslactomicina B de Streptomyces sp. HK803 (Palaniappan et al., J. Biol. Chem. 278:35552-35557, 2003) conjuntamente con el gen chcB (Patton et al., Biochem. 39:7595-7604, 2000) de S. collinus , S. ayermitilis o S. coelicolor (ver Tabla 6) . Los genes listados en la Tabla 5 entonces se pueden expresar para permitir el inicio y el alargamiento de ácidos grasos ?-cíclicos. De manera alternativa, se pueden aislar los genes homólogos de microorganismos que producen cyFA y expresar en una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) .
Tabla 6: Genes para síntesis de CHC-CoA *Solo chcA se anota en la entrada GenBank U72144, ansJKLM están de acuerdo con Chen et al. (E r. J. Bioche . 261:98-107, 1999) .
Los genes listados en la Tabla 5 {fabH, ACP, y fabF) permiten el inicio y alargamiento de derivados de ácidos graos ?-cíclicos debido a que tienen amplia especificidad al sustrato. Si la coexpresión de cualquiera de estos genes con los genes listados en la Tabla 6 no produce cyFA, entonces se pueden aislar los homólogos fabH, ACP y/o fabF de microorganismos que producen cyFA (por ejemplo, aquellos listados en la Tabla 7) (por ejemplo, al usar cebadores degenerados de PCR o sondas heterólogas de secuencia de ADN) y coexpresar.
Tabla 7: Eiemplos no limitantes de microorcranismos aue *Usa cicloheptilcarbonil-CoA y no ciclohexilcarbonil-CoA como precursor para biosíntesis de cyFA.
Niveles de Saturación de Aldehido, Alcoholes Grasos y Alquenos Se puede controlar el grado de saturación en los derivados de ácidos grasos al regular el grado de saturación de los compuestos intermedios de derivados de ácidos grasos. Las familias de genes sfa, gns y fab se pueden expresar o sobreexpresar para controlar la saturación de ácidos grasos. La Figura 40 lista ejemplos no limitantes de genes en estas familias génicas que se pueden usar en los métodos y células hospedadoras descritas en la misma.
Las células hospedadoras se pueden manejar para producir ácidos grasos insaturados al manejar la célula hospedadora para sobreexpresar fabB o al cultivar la célula hospedadora a bajas temperaturas (por ejemplo, menos de 37°C) . FabB tiene preferencia a cis-53decenoil-ACP y da por resultado producción de ácidos grasos insaturados en E. coli. La sobreexpresión de fabB da por resultado la producción de un porcentaje significativo de ácidos grasos insaturados (de Mendoza et al., J". Biol . Chem. 258:2098-2101, 1983). El gen fabB se puede insertar en y expresar en células hospedadoras que no tienen de manera natural el gen. Estos derivados de ácidos grasos insaturados entonces se pueden usar como productos intermedios en células hospedadoras que se manejan para producir derivados de ácidos grasos, tal como aldehidos grasos, alcoholes grasos o alquenos .
En otros ¾casos, se puede suprimir un represor de la biosíntesis de ácidos grasos, por ejemplo, fabR (acceso GenBank NP_418398) , que también dará por resultado producción incrementada de ácidos grasos insaturados en E. coli (Zhang et al., J. Biol. Chem. 277: 15558, 2002). Se pueden hacer supresiones similares en otras células hospedadoras. Por ejemplo, se puede lograr un incremento adicional en derivados de ácidos grasos insaturados, al sobreexpresar fabM (trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerasa, acceso GenBank DAA05501) y la expresión controlada de fabK (trans-2-enoil-ACP reductasa II, acceso GenBank NP_357969) de Streptococcus pneumoniae (Marrakchi et al, J. Biol Chem. 277: 44809, 2002), en .tanto que se suprime fabl de E. coli (trans-2-enoil- ACP reductasa, acceso GenBank NP_415804) . En algunos ejemplos, el gen fabF endógeno se puede atenuar, incrementado de este modo el porciento de palmitoleato (C16:l) producido.
Otros Sustratos Otros sustratos que se pueden usar para producir aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos en los métodos descritos en la presente son acil-ACP, acil-CoA, un aldehido graso o un alcohol graso, que se describen en, por ejemplo, PCT/US08/058788. Los genes de ejemplo que se pueden alterar para expresar o sobreexpresar estos sustratos en células hospedadoras se listan en la Figura 40. Otros genes de ejemplo se describen en PCT/US08/058788.
Ingeniería Genética de Células Hospedadoras para Producir Aldehidos, Alcoholes Grasos, Alcanos y Alquenos Se pueden usar varias células hospedadoras para producir aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos, como se describe en la presente. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido descrito en la presente se puede expresar en células bacterianas (tal como E. coli), células insectiles, células de mamífero o levadura (tal como células de ovario de Hámster Chino (CHO) , células COS, células VERO, células BHK, células HeLa, células Cvl, células MDCK, células 293, células 3T3 o células PC12) . Otras células hospedadoras de ejemplo, incluyen células de los miembros de los géneros Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Pseudomonas , Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporiu , Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces . Aún otras célula hospedadoras de ejemplo pueden ser una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus , una célula de Bacillus licheniformis, una célula de Bacillus alkalophilus , una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans , una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis , una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis, una célula de Bacillus amyloliquefaciens, una célula de Trichoderma koningii , una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei,' una célula de Trichoderma longibrachiatu , una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhizomucor iehei, una célula de Mucor michei, una célula de Streptomyces lividans, una célula de Streptomyces murinus o una célula de Actinomycetes .
Otros ejemplos no limitantes de células hospedadoras son aquellos listados en la Tabla 1.
En una modalidad preferida, la célula hospedadora es una célula de E. coli. En una modalidad más preferida, la célula hospedadora es de las cepas B, C, K o de E. coli. Otras células hospedadoras adecuadas se conocen por aquellos expertos en la técnica.
Los varios métodos bien conocidos en la técnica se pueden usar para manejar genéticamente células hospedadoras para producir aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos . Los métodos incluyen el uso vectores, preferentemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de aldehidos, alcoholes- grasos, alcanos y/o alquenos, descrito en la presente, o una variante de polipéptido o fragmento del mismo. Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a una asa de circular de ADN de doble hebra en la cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro de tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores mamíferos episomáticos ) . Se integran otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomáticos) en el genoma de una célula hospedadora en la introducción en la célula hospedadora y de este modo se replican junto con el genoma hospedador. Además, ciertos vectores, tal como vectores de expresión, son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados de forma operativa. En general, los vectores de expresión usados en técnicas de ADN recombinante frecuentemente están en la forma de plásmidos . Sin embargo, también se pueden usar otras formas de vectores de expresión, tal como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos en replicación, adenovirus y virus adeno-asociados) .
Los vectores de expresión recombinante descritos en la presente incluyen un ácido nucleico descrito en la presente en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora. Los vectores de expresión recombinante pueden incluir una o más secuencias de control, seleccionadas en base de la célula hospedadora que se va a usar para la expresión. La secuencia de control se enlaza de manera operable a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Estas secuencias de control se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California. (1990) . Las secuencias de control incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido) . Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender factores tal como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etcétera. Los vectores de expresión descritos en la presente se pueden introducir en células hospedadoras para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificador por los ácidos nucleicos como se describe en la presente.
Los vectores de expresión recombinantes se pueden diseñar para la expresión de un polipéptido biosintético de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos o variante en células procarióticas o eucarióticas (por ejemplo, células bacterianas- tal como E. coli, células insectiles (usando vectores de expresión de baculovirus) , células de levadura o células de mamífero) . Las células hospedadoras adecuadas se analizan adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California. (1990) . De manera alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, al usar secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 polimerasa.
La expresión de polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, frecuentemente se lleva a cabo con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de ya sea polipéptidos de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión adicionan varios aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, usualmente al término amino del polipéptido recombinante. Estos vectores de fusión sirven típicamente para tres propósitos: (1) para incrementar la expresión del polipéptido recombinante; (2) para incrementar la solubilidad del polipéptido recombinante; y (3) para ayudar en la purificación del polipéptido recombinante al actuar como un ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en. la unión de la porción de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante de la porción de fusión después de la purificación del polipéptido de. fusión. Los ejemplos de estas enzimas, y sus secuencias cognadas de reconocimiento, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa . Los vectores de expresión de fusión de ejemplo incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith et al, Gene (1988) 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.), y pRITS (Pharmacia, Piscataway, N. J.), que fusionan glutationa S-transíerasa (GST) , proteína de unión maltosa E , o proteína A, respectivamente, al polipéptido recombinante diana .
Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli, inducibles, no de fusión incluyen pTrc (Amann et al, Gene (1988) 69:301-315) y pET lid (Studier et al, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California. (1990) 60-89) . La expresión del gen diana del vector pTrc depende de la transcripción de ARN polimerasa del hospedador de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión del gen diana del vector pET lid depende de la transcripción del promotor de fusión T7 gnlO-lac mediado por una ARN-polimerasa viral co-expresada (T7 gnl) . Esta polimerasa viral se suministra por cepas hospedadoras BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un prófago ? residente que tiene un gen T7 gnl bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.
Una estrategia para aumentar al máximo la expresión de polipéptido recombinante es expresar el polipéptido en una célula hospedadora con una capacidad deteriorada para escindir proteolíticamente el polipéptido recombinante (ver Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California. (1990) 119-128) . Otras estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico que se va a insertar en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos preferencialmente utilizados en la célula ospedadora (Wada et al, Nucleic Acids Res. (1992) 20:2111-2118). Esta alteración de secuencias de ácido nucleico se puede llevar a cabo por técnicas normales de síntesis de ADN.
En otra modalidad, la célula hospedadora es una célula de levadura. En esta modalidad, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari et al, EMBO J. (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan et al, Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al, Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, California) y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, California) .
De · manera alternativa, se puede expresar un polipéptido descrito en la presente en células insectiles usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células insectiles cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen, por ejemplo, la serie pAc (Smith et al, Mol. Cell Biol. (1983) 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39).
En aún otra modalidad, los ácidos nucleicos descritos en la presente se pueden expresar en células mamíferas usando un vector mamífero de expresión. Los ejemplos de vectores de expresión mamífera incluyen pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) y pMT2PC (Kaufman et'al, EMBO J. (1987) 6:187-195). Cuando se usan en célula mamíferas, se pueden proporcionar funciones de control del vector de expresión por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus Simiesco 40. Otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procarióticas como eucarióticacs se describen en los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al, eds . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2- edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989.
Se pueden introducir vectores en células procarióticas o eucarióticas mediante técnicas convencionales de transformación o transíección. Como se usa en la presente, los términos "transformación" y "transíección" se refieren a una variedad de técnicas reconocidas para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, incluyendo co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación . Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al. (supra) .
Para transformación estable de células bacterianas, se conoce que, dependiendo de la técnica de transformación y del vector de expresión, usados, solo una pequeña fracción de células tomará y replicará el vector de expresión. A fin de' identificar y seleccionar estos transformantes, se puede introducir un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tal como ampicilina, canamicina, cloramfenicol o tetraciclina . Los ácidos nucleicos se codifican para un marcador seleccionable se pueden introducir en una célula hospedadora en el mismo vector como aquel que codifica para un polipéptido descrito en la presente o se pueden introducir en un vector separado. Las células transfectables de . manera estable con el ácido nucleico introducir se pueden identificar por selección con fármacos (por ejemplo, células que tienen incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que morirán las otras células) .
Para transfección estable de células mamíferas, se conoce que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección usada, solo una pequeña fracción de células puede integrarse del ADN extraño en su genoma. A fin de identificar y seleccionar estos integrantes, se puede introducir un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células h'ospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables , preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tai como G418, higromicina y metotrexato. Se pueden introducir ácidos nucleicos que codifican para un marcador seleccionable en una célula hospedadora en el mismo vector como aquel que codifica para un polipéptido descrito en la presente o se puede introducir en un vector separado. Las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido se puede identificar por selección de fármaco (por ejemplo, sobrevivirán las células que tienen incorporado el gen marcador seleccionable, en tanto que morirán las otras células) .
En ciertos métodos, un polipéptido biosintético de aldehidos y un polipéptido biosintético de alcanos o alquenos se co-expresan en una célula hospedadora individual. En métodos alternativos, en una célula hospedadora se coexpresan un polipéptido biosintético de aldehidos y un polipéptido de alcohol desliidrogenasa .
Proteínas de Transporte Las proteínas de transporte pueden exportar polipéptidos e hidrocarburos (por ejemplo, aldehidos, alcanos y/o alquenos) fuera de una célula hospedadora. Muchas proteínas de transporte y efluvio sirven para excretar una amplia variedad de compuestos y se puede modificar de manera natural para ser selectivas a tipos particulares de hidrocarburos .
Los ejemplos no limitantes de proteínas adecuadas de transporte son proteínas de transporte del Cásete de Unión de ATP (ABC) , proteínas de efluvio, y proteínas • transportadoras de ácidos grasos (FATP) . Los ejemplos no limitantes, adicionales de proteínas adecuadas de transporte incluyen las proteínas' de transporte de ABC de organismos tal como Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thalania, Alkaligenes eutrophus y Rhodococcus erythropolis . Las proteínas de transporte de ABC de ejemplo que se pueden usar se listan en la Figura 40 (por ejemplo, CER5 , AtMRP5, AmiS2 y AtPGPl) . También se pueden elegir células hospedadoras por su capacidad endógena para segregar hidrocarburos. La eficiencia de producción y se secreción de hidrocarburos en el ambiente de la célula hospedadora (por ejemplo, medio de cultivo, caldo de fermentación) se puede expresar como una relación de producto intracelular a producto extracelular . En algunos ejemplos, la relación puede ser aproximadamente 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5.
Fermentación La producción y aislamiento de aldehidos, alcoholes grasos, aléanos y/o alquenos se puede mejorar al emplear técnicas de fermentación benéficas. Un método para aumentar al máximo la producción en tanto que reduce los costos es incrementar el porcentaje de la fuente de carbono que se convierte a productos de hidrocarburo.
Durante los ciclos normales de vida celular," se usa carbono en las funciones celulares, tal como producción de lípidos sacáridos, proteínas, ácidos orgánicos y ácidos nucleicos. La reducción de la cantidad de carbono necesaria para actividades relacionadas al crecimiento puede incrementar la eficiencia de conversión de la fuente de carbono al producto. Esto se puede lograr, por ejemplo, al cultivar primero células hospedadoras a una densidad deseada (por ejemplo, una densidad lograda en el pico de la fase logarítmica de crecimiento) . En este punto, se pueden implementar puntos de verificación de replicación para detener el crecimiento de las células. Específicamente, se pueden usar mecanismos de percepción de quorum (revisado en Camilli et al., Science 311:1113, 2006; Venturi FEMS Microbio. Rev. 30:274-291, 2006; y Reading et al, FEMS Microbiol . Lett. 254:1-11, 2006) para activar genes de punto de verificación, tal como los genes p53, p21, u otros genes de punto de verificación.
Los genes que se pueden activar para detener la replicación y crecimiento celular en E. coli incluyen los genes umuDC. La sobreexpresión de los genes umuDC detiene el progreso de la fase estacionaria al crecimiento exponencial (Murli et al, J. of Bact. 182:1127, 2000). UmuC es un ADN-polimerasa que puede llevar a cabo síntesis translesión sobre lesiones no codificantes, la base mecanística de la mayoría de las mutagénesis químicas y de UV. Los productos del gen umuDC están comprendidos en el proceso de síntesis translesión y también sirven como un punto de verificación de daño de la secuencia de ADN. Los productos del gen umuDC incluyen UmuC, UmuD, umuD' , UmuD'2C, UmuD'2 y UmuD2. De manera simultánea, se pueden activar genes productores de productos, reduciendo el mínimo de esto modo la necesidad de rutas de replicación y mantenimiento que se usan en tanto que se está produciendo un aldehido, alcano y/o alqueno. También se pueden manejar células hospedadoras para expresar umuC y umuD de E. coli en pBAD24 bajo el sistema del promotor prpBCDE a través de la síntesis de novo de este gen con los genes apropiados de producción de producto final.
El porcentaje de carbonos de entrada convertidos a aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos puede ser un activador del costo. Entre más eficiente sea el proceso (es decir, mayor el porcentaje de carbono de entrada convertidos a aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos), menos costoso será el proceso. Para fuentes de carbono que contiene oxígeno (por ejemplo, fuentes basadas en glucosa y otros carbohidratos) , el oxígeno se debe librar en la forma de dióxido de carbono. Por cada 2 átomos de oxígeno liberados, también se libera un átomo de carbono que conduce a una eficiencia metabólica teórica máxima de aproximadamente 34 % (p/p) (para productos derivados de ácidos grasos) . Esta figura, sin embargo, cambia para otros productos de hidrocarburos y otras fuentes de carbono. Las eficiencias típicas en la literatura son aproximadamente de menos de 5 %. Las células hospedadoras manejadas para producir aldehidos, alcanos y/o alquenos pueden tener más de aproximadamente 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 % de eficiencia. En un ejemplo, las células hospedadoras pueden exhibir una eficiencia de aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 %. En otros ejemplos, estas células .hospedadoras pueden exhibir una eficiencia de aproximadamente 25 % a aproximadamente 30 %. En otros ejemplos, las células hospedadoras pueden exhibir una eficiencia mayor que 30 ¾.
La célula hospedadora se puede manejar adicionalmente para expresar celulosomas recombinantes , tal como aquellas descritas en número de publicación PCT PCT/US2007/003736. Estas celulosomas pueden permitir que la célula hospedadora use material celulósico como una fuente de carbono. Por ejemplo, la célula hospedadora se puede manejar adicionalmente para expresar invertasas (EC 3.2.1.26) de modo que se usar sacarosa como una fuente de carbono. De manera similar, la célula hospedadora se puede manejar usando las enseñanzas descritas en la Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,000,000; 5,028,539; 5,424,202; 5,482,846; y 5,602,030; de modo que la célula hospedadora puede asimilar eficientemente el carbono y usar materiales celulósicos como fuentes de carbono.
En un ejemplo, la cámara de fermentación puede encerrar una fermentación que esté sufriendo una reducción continua. En este caso, se puede crear un ambiente reductor estable. El equilibrio de electrones se puede mantener por la liberación de dióxido de carbono (en forma gaseosa) . Los esfuerzos para aumentar el equilibrio NAD/H y NADP/H también pueden facilitar la estabilización del equilibrio de electrones. La disponibilidad de NADPH intracelular también se puede mejorar al manejar las célula hospedadora para que exprese una NADH: NADPH transhidrogenasa . La expresión de una o más NADH: ADPH transhidrogenasas convierte el NADH producido en glicolisis a NADPH, que puede mejorar la producción de aldehidos, alcanos y/o alquenos.
Para producción a pequeña escala, las células hospedadoras manejadas se pueden cultivar en lotes de, por ejemplo, aproximadamente 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L, 5 L o 10 L; fermentar; e inducir para expresar los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos deseados en base a los genes específicos codificados en los plásmidos apropiados.
Por ejemplo, células BL21 (DE3 ) E. coli que tienen pBAD24 (con resistencia a ampicilina y la ruta de síntesis de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos o alquenos) así como pUMVCl (con resistencia a canamicina y el sistema de sobreexpresión de acetil CoA/malonil. CoA) se puede incubar durante la noche en matraces de 2 L a 37 °C agitar a > 200 rpm en 500 mL de medio LB complementado con 75 yg/mL de ampicilina y 50 µ?/mL de canamicina hasta que los cultivos alcancen una OD60o de > 0.8. Al lograr una OD60o de > 0.8, las células se pueden complementar con proprionato de sodio 25 mM (pH 8.0) para activar los sistemas génicos manejados para la producción y detener la proliferación celular al activar las proteínas UmuC y UmuD. La inducción se puede realizar durante 6 hrs a 30°C. Después de la incubación, el medio de se puede examinar para aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos usando GC-MS.
Para la producción a gran escala, las células hospedadoras manejadas se pueden cultivar en lotes de 10 L, 100 L, 1000 L o mayor; fermentar; e inducir para expresar aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos deseados en base a los genes específicos codificados en los plásmidos apropiados. Por ejemplo, las células BL21(DE3) E. coli que tienen pBAD24 (con' resistencia a ampicilina y la ruta de síntesis de aldehido y/o alcano) así como pUMVCl (con resistencia a canamicina y el sistema de sobreexpresión de acetil-CoA/malonil-CoA) se pueden incubar de un cultivo de siembra de 500 mL para fermentaciones de 10 L (5 L para fermentaciones de 100 L, etcétera) en medio LB (libre de glicerol) con 50 ig/ L de canamicina y 75 \xq/mL de ampicilina a 37°C, y agitar a > 200 rpm hasta que los cultivos alcancen una OD60o de > 0.8 (típicamente 16 hrs) . Los medios se pueden suministrar continuamente para mantener proprionato de sodio 25 mM (pH 8.0) para activar los sistemas génicos mejorados para la producción y para detener la proliferación celular al activar las proteínas umuC y umuD . Se pueden complementar continuamente los medios con glucosa para mantener una concentración de 25 g/100 mL.
Después de la primera hora de inducción, se pueden remover alícuotas de no más de 10 % del volumen celular total cada hora y dejar asentar sin agitación para permitir que los aldehidos, alcanos y/o alquenos suban a la superficie y sufran una separación espontánea de fase. El componente de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos entonces se puede recolectar, y la fase acuosa se regresa a la cámara de reacción. La cámara de reacción se puede operar de forma continua. Cuando la OD6oo cae por abajo de 0.6, las células se pueden reemplazar con un nuevo lote cultivado de un cultivo de siembra.
Producción de Aldehidos, Alcoholes Grasos, Alcanos y Alquenos usando Métodos Libres de Células En algunos métodos descritos en la presente, puede producir un aldehido, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno usando un polipéptido purificado descrito en la presente y un sustrato descrito en la presente. Por ejemplo, se puede manejar una célula hospedadora para expresar el polipéptido biosintético . de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos o variante como se describe en la presente. La célula hospedadora se puede cultivar bajo condiciones adecuadas para permitir la expresión del polipéptido. Entonces, los extractos libres de células se pueden generar usando métodos conocidos. Por ejemplo, se pueden lisar las células hospedadoras usando detergentes o por tratamiento por ultrasonido. Los polipéptidos expresados se pueden purificar usando métodos conocidos. Después de obtener los extractores libres de células, los sustratos descritos en la presente se pueden adicionar a los extractos libres de células y mantener bajo condiciones que permitan la conversión de los sustratos a aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos entonces se pueden separar y purificar usando técnicas conocidas.
Procesamiento de Post-Producción Los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos durante la fermentación se pueden separar del medio de fermentación. Se puede usar cualquier técnica conocida para separar aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos de medios acuosos. Un proceso se separación de ejemplo es un proceso de separación de dos fases (bi- fásico) . Este proceso comprende fermentar las células hospedadoras genéticamente manejadas bajo condiciones suficientes para producir un aldehido, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno, permitir que el aldehido, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno se recolecta en una fase orgánica, y separar la fase orgánica del caldo acuoso de fermentación. Este método se puede practicar tanto en un escenario de fermentación continua y por lotes.
La separación bi-fásica usa la inmiscibilidad relativa de los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos para facilitar la separación. Inmiscible se refiere a la incapacidad relativa un compuesto para disolverse en agua y se define por el coeficiente de división del compuesto. Un experto en la técnica apreciará que al elegir un caldo de fermentación y fase orgánica, tal que el aldehido, alcano y/o alqueno en un alto valor de logP, el aldehido, alcano y/o alqueno se puede separar en la fase orgánica, aún a concentraciones muy bajas, en el recipiente de fermentación.
Los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos por los métodos descritos en la presente pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, asi como en el citoplasma. Por lo tanto, el aldehido, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno puede recolectarse en una fase orgánica ya sea de una manera intracelular o extracelularmente . La recolección de los productos en la fase orgánica puede disminuir el impacto del aldehido, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno en función celular y puede permitir que la célula hospedadora produzca más producto .
Los métodos descritos en la presente pueden dar por resultado la producción de compuestos homogéneos en donde al menos aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos tendrán longitudes de cadena de carbonos que varxan por menos de aproximadamente 6 carbonos , menos de aproximadamente 4 carbonos, o menos de aproximadamente 2 carbonos. Estos compuestos también se pueden producir con un grado relativamente uniforme de saturación. Estos compuestos se pueden usar directamente como combustibles, aditivos de combustible, productos químicos de especialidad, materiales de inicio para producción de otros compuestos químicos {por ejemplo, polímeros, surfactantes , plásticos, textiles, solventes, adhesivos, etcétera), o aditivos de productos de cuidado personal. Estos compuestos también se pueden usar como materia prima para reacciones subsiguientes, por ejemplo, hidrogenación, fraccionamiento catalítico (mediante hidrogenación, pirólisis, o ambos), para producir otros compuestos .
En algunas modalidades, los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos usando los métodos descritos en la presente pueden contener entre aproximadamente 50 % y aproximadamente 90 % de carbono;- o entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 25 % de hidrógeno. En otras modalidades, los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos usando los métodos descritos en la presente pueden ' contener entre aproximadamente 65 % y aproximadamente 85 % de carbono; o entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 15 % de hidrógeno .
Composiciones de Combustible y Composiciones de Productos Químicos de Especialidad Los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descritos en la presente se pueden usar como, o convertir en un combustible o como un producto químico de especialidad. Un experto en la técnica apreciará que, dependiendo del propósito propuesto del combustible o producto químico de especialidad, se pueden producir y usar diferentes aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Por ejemplo, un aldehido ramificado, alcohol graso, alcano y/o alqueno puede ser deseable para combustible automotriz que se propone que se use en climas fríos. Además, cuando los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descritos en la presente se usan como una materia prima para producción de combustible o productos químicos de especialidad, un experto en la técnica apreciará que las características de la material de prima de aldehido, alcohol graso, alcano y/o alqueno afectará las características del combustible o producto químico de especialidad producido. Por lo tanto, las características del combustible o producto químico de especialidad se pueden seleccionar al producir aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos particulares para el uso como materia prima.
Usando los métodos descritos en la presente, los biocombustibles que tienen cualidades deseadas de combustible se pueden producir a partir de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos biológicamente producidos representan una nueva fuente de biocombustibles, que se pueden como combustible de aviones, diesel o gasolina. Algunos biocombustibles producidos usando los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos no se han producido de fuentes renovables y son nuevas composiciones de materia. Estos nuevos combustibles o productos químicos de especialidad se pueden distinguir de los combustibles o productos químicos de especialidad derivados de carbono petroquímico en base a la huella de carbono- isotópica dual. Adicionalmente , la fuente específica de carbono de biofuente (por ejemplo, glucosa vs. glicerol) se puede determinar por la huella dual carbono-isotópica (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 7,169,588, en particular columna 4, líneas 31, a la columna 6, líneas 8) .
Los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos y los biocombustibles asociados, productos químicos de especialidad, y mezclas se pueden distinguir de sus contrapartes derivadas de petroquímicos en base a la 14C (fM) y la huella dual de carbono- isotópica. En algunos ejemplos, el aldehido, alcohol graso, alcano y/o alqueno en las composiciones de biocombustible pueden tener una fracción de carbono modelo (fM14C) , por ejemplo de al menos aproximadamente 1.003, 1.010, o 1.5.
En algunos ejemplos, una composición de biocombustible se puede producir para que incluya aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos que tienen 513C de aproximadamente -15.4 a aproximadamente -10.9, donde los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos dan cuenta de al menos aproximadamente 85 % del material de biofuente (es decir, derivado de un recurso renovable, tal como biomasa, materiales celulósicos y azúcares) en la composición.
La capacidad para distinguir estos productos biológicamente derivados es benéfica en el seguimiento de estos materiales en el comercio. Por ejemplo, los combustibles o productos químicos de especialidad que comprenden perfiles de isótopos de carbono tanto biológicamente derivados como basados en petróleo se pueden distinguir de los combustibles y productos químicos de especialidad producidos solo de materiales basados en petróleo. De esta manera los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descritos en la presente se pueden seguir en el comercio o identificar en el comercio como un biocombustible en base a su perfil único. Además, se pueden identificar otros materiales de la competencia como que se derivan de forma biológica o se derivan de una fuente pretroquímica .
Se usan aditivos de combustible para mejorar el desempeño de un combustible o motor. Por ejemplo, se pueden usar aditivos de combustible para alterar el punto de congelación/formación de gel, punto de turbidez, lubricidad, viscosidad, estabilidad oxidativa, calidad de ignición, nivel de octano y/o punto de inflamación. En los Estados Unidos de América, todos los aditivos de combustible se deben registrar con la Agente de Protección Ambiental (Environmental Protection Agency) . Los nombres de los aditivos de combustible y las compañías que venden los aditivos de combustible están públicamente disponibles al ponerse en contacto con la EPA o al ver el sitio web de la agencia. Un experto en la técnica apreciará que los biocombustibles basados en aldehidos y/o alcanos descritos en la presente se pueden mezclar con uno o más aditivos de combustible para impartir una calidad deseada.
Los biocombustibies basados en el aldehido, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno, descritos en la presente, se pueden mezclar con otros combustibles, tal como varios alcoholes, tal como etanol y butanol, y productos derivados de petróleo, tal como gasolina, diesel, o combustibles de avión.
En algunos ejemplos, la mezcla puede incluir al menos aproximadamente 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o 60 % en peso del aldehido, alcoholes grasos, alcanos o alqueno. En otros ejemplos, se puede producir una composición de biocombustible que incluye al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de un aldehido, alcoholes grasos, alcano, o alqueno que incluye una cadena de carbono que es de 8, 10, 12, 13, 14, 15,· 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 carbonos en longitud. Estas composiciones de biocombustible pueden incluir adicionalmente al menos un aditivo seleccionado de un aditivo disminuidor del punto de turbidez que puede disminuir el punto de turbidez a menos de aproximadamente 5°C, o 0°C; un agente tensiactivo; una microemulsión; al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de combustible diesel de triglicéridos ; gasolina deriva de petróleo; o combustible diesel de petróleo.
Ej emplos La invención se describe ahora en los siguientes ejemplos, que -no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplo 1. Detección y Verificación de Biosíntesis de Alcanos en Cianobacterias Seleccionadas Se seleccionaron siete cianobacterias, cuyas secuencias completas de genoma están públicamente disponibles, para verificación y/o detección de la biosíntesis de alcanos: Synec ococcus elongatus PCC7942, Synechococcus elongatus PCC6301, Anajbaena variabilis ATCC29413, Syne.chocystis sp. PCC6803, Nostoc punctiforme PCC73102, Gloeobacter violaceus ATCC 29082 y Prochlorococcus marinus CCMP1986. Solo las primeras tres cepas cianobacterianas de esta lista se han reportado anteriormente como que contienen alcanos (Han et al., J. Am. Chem. Soc. 91:5156-5159 (1969); Fehler et al, Biochem. 9:418-422 (1970)) . Las cepas se cultivaron de manera fotoautotrófica en matraces de agitación en 100 mL del medio apropiado (listado en la Tabla 8) durante 3-7 días a 30°C a una intensidad de luz de aproximadamente""3 , 500 lux. Las células se extrajeron para detección de alcanos como sigue: se centrifugaron células de 1 mL de volumen de cultivo durante 1 minuto a 13,000 rpm, los sedimentos celulares se resuspendieron en metanol, se sometieron a vórtice durante 1 minuto y luego se trataron con ultrasonido durante 30 minutos. Después de la centrifugación durante 3 minutos a 13,000 rpm, los sobrenadantes se transfirieron a frascos frescos y se analizaron por GC-MS. Las muestras se analizaron ya sea en columna capilar DP-5 30 m (0.25 mm de diámetro interno) o una columna capilar DP-5 de alta temperatura de 30 m (0.25mm de diámetro interno) usando el siguiente método.
Después de una inyección sin división de 1 µ?, (temperatura de entrada mantenida a 300°C) sobre la columna de GC/MS, el horno se mantuvo a 100 °C durante 3 minutos. La temperatura se aumentó pronunciadamente hasta 320 °C a una velocidad de 20°C/min. El horno se mantuvo a 320°C durante 5 minutos adicionales. La velocidad de flujo del gas portador helio fue 1.3 mL/min. El cuadrapolo de MS exploró desde 50 a 550 m/z . Los tiempos de retención y los patrones de fragmentación de los picos de producto se compararon con referencias auténticas para confirmar la identidad del pico.
Aparte las siete cepas, seis produjeron principalmente heptadecano y una produjo pentadecano (P. marinus CC P 1986) ; una 'de estas cepas produjo metil-heptadecano además de heptadecano {A. variabilis ATCC29413) (ver Tabla 8) . Por lo tanto, se verificó la biosíntesis de alcano entres cianobacterias anteriormente reportadas, y se reportó la biosíntesis de alcanos en cuatro cianobacterias que no se sabía anteriormente que producían aléanos: P. marinus CCMP 1986 (ver Figuras 1A-1B) , N. punctiforme PCC73102 (ver Figuras 2A-2B) , G. violaceus ATCC 29082 (ver Figuras 3A-3B y Synechocystis sp. PCC6803 (ver Figuras 4A-4B) .
La Figura 1A representa el trazo de. GC/MS de células CCMP1986 Prochlorococcus marinus extraídas con metanol. El pico a 7.55 min tuvo el mismo tiempo de retención como pentadecano (Sigma) . En la Figura IB, se muestra el patrón de fragmentación de masa del pico de pentadecano. El pico 212 corresponde al peso molecular de pentadecano.
La Figura 2A representa el trazo de GC/MS de células PCC73102 de Nostoc punctiforme extraídas con metanol. El pico a 8.73 min tuvo el mismo tiempo de retención como heptadecano (Sigma) . En la Figura 2B, se muestra el patrón de fragmentación en masa del .pico de heptadecano. El pico 240 corresponde al peso molecular de heptadecano.
La Figura 3A representa el trazo de GC/MS de células ATCC29082 de Gloeojaceter violaceus extraídas con metanol. El pico a 8.72 min tiene el mismo tiempo de retención como heptadecano (Sigma). En la Figura 3B, se muestra el patrón de fragmentación en masa del pico de heptadecano. El pico 240 corresponde al peso molecular de heptadecano.
La Figura 4A representa el trazo de GC/MS de células PCC6803 de Synechocystic sp, extraídas con metanol. El pico a 7.36 min tiene el mismo tiempo de retención como heptadecano (Sigma) . En la Figura 4B, se muestra el patrón de fragmentación en masa del pico de heptadecano. El pico 240 corresponde al peso molecular de heptadecano.
Tabla 8 : Hidrocarburos detectados en cianobacterias seleccionadas ^"células para extracción fueron un obsequio de Jacob Waldbauer (MIT) hidrocarburo principal está en negritas El análisis genómico produjo dos genes que estuvieron presentes en las cepas productoras de alcano. Los homólogos PCC7942 de Synechococcus elongatus estos genes se representan en la Tabla 9 y son Synpcc7942_1593 (SEQ ID N0:1) y Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 65) .
Tabla 9: Genes cianobacterianos productores de alcanos Ejemplo 2. Supresión de los genes sll0208 y sll0209 en Synechocystis sp. PCC6803 conduce a pérdida de Biosíntesis de Alcanos Los genes que codifican para la enzima putativa generadora de descarbonilasa (sll0208 NP_442147) (SEQ ID NO:3) y aldehidos (sll0209; NP_442146) (SEQ ID NO:67) de Synechocystis sp. PCC6803 se suprimieron como sigue.. Se amplificaron aproximadamente 1 kb de ADN flanqueador en la dirección 5' y 3' usando el cebador S110208/9-KO1 (CGCGGATCCCTTGATTCTACTGCGGCGAGT) con el cebador S110208/9- K02 (CACGCACCTAGGTTCACACTCCCATGGTATAACAGGGGCGTTGGACTCC TGTG) y el cebador S110208/9-KO3 (GTTATACCATGGGAGTGTGAACCTAGGTGC- GTGGCCGACAGGATAGGGCGTGT) con el cebador sll0208/9-KO4 ( CGCGGATCCAACGCATCCTCACTAGTCGGG) , respectivamente. Los productos de PCR se usaron en una PCR de entre cruzamiento con los cebadores S110208/9-KO1 y sll0208/?-KO4 para amplificar el cásete de supresión de sll0208/sll0209 de aproximadamente 2 kb, que se clonó en el sitio BarriHl del vector donador pUC19. Entonces se amplificó un cásete de resistencia a canamicina (aph, anR) del plásmido pRL27 (Larsen et al., Arch. Microbiol. 178:193 (2002)) usando los cebadores Kan-aph-F (CATGCCATGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTG) y Kan-aph-R (CTAGTCTAGAGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAA) , que entonces se cortó con 2VcoI y Xbal y se clonó en los sitios Ncol y Avrll del cásete de supresión de sll0208/sll0209 , creando un cásete de inserción de KanR de supresión de sll0208/sll0209 en pUC19. El vector que contiene el cásete, que no se replica en cianobacterias , se transformó en Synechocystis sp. PCC6803 (Zang et al., 2007, J. .Microbiol., volumen 45, página 241) y se seleccionaron transformantes {por ejemplo, integrantes cromosómicos por recombinación doble-homologas) en placas de agar BG-11 que contienen 100 g/mL de Canamicina en una incubadora equipada con luz a 30°C. Las colonias resistentes a canamicina se re-rallaron una vez y luego se sometieron al · análisis genotípico usando PCR con cebadores de diagnóstico.
Se cultivaron mutantes de supresión- inserción confirma en 12 mL del medio BG11 con 50 yg/mL de Canamicina durante 4 días a 30°C en una incubadora agitadora equipada con luz. Entonces se centrifugó 1 mL del caldo (1 min a 13,000 g) y los sedimentos celulares se extrajeron con 0.1 mL de metanol . Después de la extracción, las muestras se centrifugaron nuevamente y los sobrenadantes se sometieron al análisis de GC-MS como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en las Figs . 5A-5C, las cepas Synechocystis sp. PCC6803 en las cuales se suprimieron los genes S110208 y S110209 perdieron su capacidad para producir heptadeceno y octadecenal. Esto demuestra que los genes sll0208 y sll0209 en Synechocystis sp . PCC6803 y los genes ortólogos en otras cianobacterias (ver Tabla 1) son responsables de la biosíntesis de alcanos y aldehidos grasos en estos organismos .
Ejemplo 3. Producción de Aldehidos Grasos y Alcoholes Grasos en E. coli a través de Expresión Heterologa de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 El ADN genómico que codifica para Synechococcus elongatus PCC7942 orfl594 (YP 400611; enzima putativa generadora de aldehidos) (SEQ ID NO:65) se amplificó y clonó en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control de promotor Ptrc · La construcción resultante ( "OP80-PCC7942 1594") se transformó en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37 °C en medio mínimo M9 con 1 ¾ (p/v) de glucosa como fuente de carbono y se complementó con 100 de espectinomicina . Cuando el cultivo alcanzó OD6oo de 0.8-1.0, se indujo con IPTG 1 mM y las células se cultivaron durante 18-20 horas adicionales a 37 °C. Las células de 0.5 mL de cultivo se extrajeron con 0.5 mL de acetato de etilo. Después del tratamiento con ultrasonido durante 60 minutos, la muestra se centrifugó a 15,000 rpm durante 5 minutos. La capa de solvente se analizó por GC-MS como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en las Figuras 6A-6B, las células de E. coli transformadas con el vector que tiene PCC7942 orfl594 de Synechococcus elongatus produj eron' los siguientes aldehidos grasos y alcoholes grasos: hexadecanal, octadecenal, tetradecenol , hexadecenol, hexadecanol y octadecenol . Este resultado indica que PCC7942 orfl594 (i) genera aldehidos in-vivo como posibles sustratos para descarbonilac ión y (ii) puede reducir acil-ACP como sustratos, que són la forma más abundante de ácidos grasos activados en células E. coli tipo silvestre. Por lo tanto, la enzima se nombró Acil-ACP reductasa. Tn-vivo, los aldehidos grasos aparentemente se reducen adicionalmente a los correspondientes alcoholes grasos por una actividad endógena de aldehído-reductasa de E . coli.
Ejemplo 4. Producción de Aldehidos Grasos y Alcoholes Grasos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Cyanothece sp. ATCC51142 cce 1430 El ADN genómico que codifica para Cyanothece sp . ATCC51142 cce_1430 (YP_001802846 ; enzima putativa generadora de aldehidos) ( SEQ ID NO: 69) se amplificó y clonó en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc · La-construcción resultante se transformó en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 con 1 t (p/v) de glucosa como fuente de carbono y se complementó con 100 yg/mL de espectinomicina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 7, las células E. coli transformadas con el vector que tiene ATCC51142 cce_1430 de Cyanothece sp. produjeron los siguientes aldehidos grasos y alcoholes grasos: hexadecanal, octadecenal, tetradecenol , hexadecenol, hexadecanol y octadecenol. Este resultado indica que ATCC51142 cce_1430 (i) genera aldehidos in-vivo como posibles sustratos para descarbonilación y (ii) puede reducir acil-ACP como sustratos, que son la forma más abundante de ácidos grasos activados en células E. coli tipo silvestre. Por lo tanto, esta enzima también es una Acil-ACP reductasa.
Ejemplo 5. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Synechococcus elonsatus PCC7942 orf!593 El ADN genómico que codifica para Synechococcus elongatus PCC7942 orfl593 (YP_400610; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO:l) se amplificó y clonó en los sitios iVdel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°e en medio mínimo M9 complementado con 100 g/mL de espectinomicina y 100 pg/mL de carbenicilina. Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como sé describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en las Figuras 8A-8C, las células E. coli co-transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y S. elongatus PCC7942_1593 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PCC7942_1593 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 6. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 El ADN genómico que codifica para Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838 ; descarbonilasa putativa) (SEQ ID N0:5) se amplificó y clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E, coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 µ?/mL de espectinomicina y 100 g/mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 9, las células E. coli co-transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y N. punctiforme PCC73102 Npun02004178 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte tetradecanal , hexadecenal, hexadecanal y octadecenal a tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 7. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróioga. de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Synechocystis sp. PCC6803 SU0208 El ADN genómico que codifica para Synechocystis sp. PCC6803 S110208 (NP_442147; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 3) se amplificó y clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 ay las células se cultivaron a 37 °C en medio mínimo M9 complementado con 100 g/mL espectinomicina y 100 µq/taL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 10, las células E. coli co- transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y Synechocystis sp . PCC6803 sll0208 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 8. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Nostoc sp . PCC7210 alr5283 El ADN genómico que codifica para Nostoc sp. PCC7210 alr5283 (NP_489323; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 7) se amplificó y clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C.en medio mínimo M9 complementado con 100 g/mL de espectinomicina y 100 yg/mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 11, las células E. coli ¦ co-transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y Nostoc sp. PCC7210 alr5283 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que alr5283 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 9. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Acaryochloris marina MBIC11017 AMl 4041 El ADN genómico que codifica para Acaryochlúris marina MBIC11017 AM1_4041 (YP_001518340 ; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 9) se optimizó por codón para la expresión en E. coli (SEQ ID NO:46), se sintetizó, y se clonó en los sitios Ndel y Xho del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 g/mL de espectinomicina y 100 ug/mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 12, las células E. coli co-transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y A. marina MBIC11017 AM1 4041 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que AM1_4041 en E. coli convierte tetradecanal , hexadecenal, hexadecanal y octadecenal a tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 10. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Thermosynechococcus elongatus BP-1 t!11313 El ADN genómico que codifica para Thermosynechococcus elongatus BP-l' tlll313 (NP_682103; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 11) se optimizó por codón para la expresión en E. coli (SEQ ID NO: 47), se sintetizó y se clonó en los sitios Ndel y X ol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- La-construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37 °C en medio mínimo M9 complementado con 100 pg/mL de espectinomicina y 100 pg/mL de carbenicilina. Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 13, las células E. coli co- transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y T. elongatus BP-1 tlll313 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que tlll313 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso^descarbonilasa activa.
Ejemplo 11. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elonsatus PCC7942 orf!594 y Synechococcus s . JA-3-3Ab CYA 0415 El ADN genómico que codifica para Synechococcus sp. JA-3-3Ab CYA 0415 (YP_473897; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 13) se optimizó por codón para la expresión en E. coli (SEQ ID NO:48), se sintetizó, y se clonó en los sitios Ndel y Xhol del OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- La construcción, resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG 1655 y las células se cultivaron a 37 °C en medio mínimo M9 complementado con 100 pg/mL de espectinomicina y 100 pg/mL de carbenicilina. Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 14, las células E. coli co-transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y Synechococcus sp. JA-3-3Ab CYA_0415 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido grasódescarbonilasa activa.
Ejemplo 12. Producción de Aléanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Gloeobacter violaceus PCC7421 g!13146 El ADN genómico que codifica para Gloeobacter violaceus PCC7421 gll3146 (NP_926092 descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 15) se amplificó y clonó en- los sitios Ndel y X ol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 µ?/p?". de espectinomicina y 100 g/mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 15, las células E. coli co- transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y G. violaceus PCC7421 gll3146 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que gll3146 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 13. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Prochlorococcus marinus MIT9313 P T 1231 El ADN genóraico que codifica para Prochlorococcus marinus MIT9313 PMT1231 (NP_895059; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 17) se optimizó por codón para la expresión en E. coli (SEQ ID NO:49), se sintetizó y se clonó en los sitios Ndel y XhoX del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37 °C en medio mínimo M9 complementado con 100 yg/mL de espectinomicina y 100 yg/mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 16, las células E. coli co- transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y P.marinus IT9313 PMT1231 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PMT1231 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceoe, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 14. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0532 El ADN genómico que codifica para Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0532 (NP_892650; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 19) se amplificó y clonó en los sitios iVdel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942JL594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 µ?/p??. de espectinomicina y 100 vq/mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 17, las células E. ¦ coli co- transíormadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y P.marinus CCMP1986 PMM0532- produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PMM0532 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 15-. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Prochlorococcus mariunus NATL2A PMN2A 1863 El ADN genómico que codifica para Prochlorococcus mariunus NATL2A PMN2A_18.63 (YP_293054; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 21) se optimizó por codón para la expresión en E. coli (SEQ ID NO: 51) , se sintetizó y se clonó en los sitios Ndel y Xho del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc - La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 µ?/t?? de espectinomicina y 100 yg/mL de carbenicilin . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 18, las células E. coli co- transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y P. mariunus NATL2A . PMN2A_1863b produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PMN2A_1863 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo . tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 16. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Synechococcus sp. RS9917 RS9917 09941 El ADN genómico que codifica para Synechococcus sp. RS9917 RS9917_09941 (ZP_01079772 ; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 23) se optimizó por codón para la expresión en E. coli (SEQ ID NO: 52) , se sintetizó, y se clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor P-trc- La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG 1655 y las células se cultivaron a 37 °C en medio mínimo M9 complementado con 100 g/mL de espectinomicina y 100 g/'mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 19, las células E. coli co- transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y Synechococcus s . RS9917 RS9917_09941 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que RS9917_09941 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 17. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Synechococcus sp. RS9917 RS9917 12945.
El ADN genómico que codifica Synechococcus sp.
RS9917 RS9917_12945 (ZP_01080370 ; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 25) se optimizó por codón para la expresión en E. coli (SEQ ID NO:53), se sintetizó, y se clonó en los sitios iVdel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37 °C en medio mínimo M9 complementado con 100 pg/mL de espectinomicina y 100 g/mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la . Figura 20, las células E. coli co- transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y Synechococcus sp . RS9917 RS9917_12945 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que RS9917_12945 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal a pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto, es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 18. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Cyanothece sp. ATCC51142 cce 0778 El ADN genómico que codifica para Cyanothece sp. ATCC51142 cce_0778 (YP_001802195 ; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 27) se sintetizó y clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc . La construcción resultante se co- transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 vq/mh de espectinomicina y 100 pg/mL de carbenicilina. Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 21, las células E. coli co- transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y Cyanothece sp . ATCC51142 cce_0778 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en -el. Ejemplo 3, pero también tridecanq, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno . Este resultado indica que ATCC51142 cce_0778 en E. coli convierte _ tetradecanal , hexadecenal, hexadecanal y octadecenal a tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 19. Producción de Aléanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Cyanothece sp . PCC7425 Cyan7425 0398 ' El ADN genómico que codifica para Cyanothece sp . PCC7425 Cyan7425_0398 · ( YP_002481151 ; descarbonilasa putativa) ( SEQ ID NO: 29) se sintetizó y clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc . La construcción resultante se co- transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 µ?/ta?, de espectinomicina y 100 g/mL de carbenicilina . Las -células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 22, las células E. coli co- transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y Cyanothece sp . PCC7425 Cyan7425_0398 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Cyan7425_0398 en E. coli convierte tetradecanal , hexadecenal, hexadecanal y octadecenal a tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 20. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 or£1594 y Cyanothece sp. PCC7425 Cyan7425 2986 El ADN genómico que codifica para Cyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_2986 (YP_002483683 ; descarboni lasa putativa) (SEQ ID NO: 31) se sintetizó y clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc . La construcción resultante se co- transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 pg/mL de espectinomicina y 100 yg/mL de carbenicilina . Las células¦ se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 23, las células E. coli co- transformadas con los vectores que tienen S. elongatus PCC7942_1594 y Cyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_2986 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos como en el Ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Cyan7425_2986 en E. coli convierte tetradecanal , hexadecenal, hexadecanal y octadecenal a tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por lo tanto es una aldehido graso-descarbonilasa activa.
Ejemplo 21. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0533 y Prochlorococcus mariunus CCMP1986 PMM0532 Los ADN genómicos que codifican para P. mariunus CCMP1986 PMM0533 (NP_892651; enzima putativa generadora de aldehidos) (SEQ ID NO: 71) y Prochlorococcus mariunus CCMP1986 PMM0532 (NP_892650; descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 19) se amplificaron y clonaron en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-80 y los sitios iVdel y Xhol del vector OP-183, respectivamente. Las construcciones resultantes se transformaron y co-transformaron de manera separada en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 g/mL de espectinomicina y 100 µg/mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en la Figura 24A, las células E. coli transformadas con solo el vector que tiene P. ariunus CCMP1986 PM 0533 no produjeron ninguna aldehido graso o alcohol graso. Sin embargo, las células E. coli co-transformadas con los vectores que tienen PMM0533 y PMM0532 produjeron hexadecanol, pentadecano y heptadeceno (Figura 24B) . Este resultado indica que PMM0533 proporciona solo sustratos de aldehidos grasos para la reacción de descarbonilación cuando interactúa con una descarbonilasa, tal como PMM0532.
Ejemplo 22. Producción de Alcanos y Alquenos en una cepa de E. coli productora de Acil-CoA Graso a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 y Acaryochloris marina MBIC11017 AMl 4041 El ADN genómico que codifica para Acaryochloris marina MBIC11017 AM1_4041 (YP_001518340 ; aldehido graso-descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 9) se sintetizó y clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- La construcción resultante se co-transformó con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc ' tesA-fadD. Esta cepa expresa una versión citoplásmica de la tioesterasa de E. coli, ¾TesA, y la acil-CoA sintetasa de E. coli, FadD, bajo el control del promotor Ptrc y por lo tanto produce acil-CoA grasas. Las células se cultivaron a 37 °C en medio mínimo M9 complementado con 100 g/mL de espectinomicina y 100 g/mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en las Figuras 25A-25B, estas células E. coli co-transformadas con S. elongatus PCC7942_1594 y A. marina MBIC11017 AM1_4041 también produj eron · alcanos y alcoholes grasos. Este resultado indica que S. elongatus PCC7942_1594 es capaz de usar acil-CoA como un sustrato para producir hexadecenal , hexadecanal y octadecenal, que entonces se convierte en pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, por A. marina MBIC11017 A 1_4041.
Ejemplo 23. Producción de Alcanos y Alquenos en una Cepa de E. coli productora de Acil-CoA Grasas a través de Expresión Heteróloga de Synechocystis sp. PCC6803 sll0209 y Synechocystis sp. PCC6803 sll0208 El ADN genómico que codifica para Synechocystis sp. PCC6803 sll0208 (NP_442147; " aldehido graso-descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 3) se sintetizó y clonó en . los sitios iVdel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. El ADN genómico que codifica para Synechocystis sp. PCC6803 S110209 (NP_442146; acil-ACP reductasa) (SEQ ID NO:67) se sintetizó y clonó en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- Las construcciones resultantes se co- ransíormaron con en E. coli MG1655 AfadE lacZ : : Ptrc v tesA-fadD. La cepa expresa una versión citoplásmica de la tioesterasa de E. coli, 'TesA, y la acil-CoA sintetasa de E. coli, FadD, bajo el control del promotor Ptrc, y por lo tanto produce acil-CoA grasa. Las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 yg/mL de espectinomicina y 100 g/mL de carbenicilina. Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en las Figuras 26A-26B, estas células E. coli transformadas con Synechocystis sp. PCC6803 S110209 no produce ningún aldehido graso o alcohol graso. Sin embargo, cuando se co-transforman con Synechocystis sp. PCC6803 sll02Ó8 y sll0209, producen alcanos, aldehidos grasos y alcoholes grasos. Este resultado indica que Synechocystis sp. PCC6803 . sll0209 es capaz de usar acil-CoA como un sustrato para producir aldehidos grasos tal como tetradecanal , hexadecanal- y octadecenal, pero solo cuando se co-expresan con una aldehido graso descarbonilasa . Los aldehidos grasos aparentemente se reducen adicionalmente a los correspondientes alcoholes grasos, tetradecanol , hexadecanol y octadecenol, por una actividad endógena de aldehido-reductasa de E. coli. En este experimento, se ' convirtió octadecenal en heptadeceno por Synechocystis sp. PCC6803 S110208.
Ejemplo 24. Producción de Alcanos y Alquenos en una Cepa de E. coli productora de Aldehidos Grasos a través de Expresión Heteróloga de Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 y Varios de sus Homólogos El ADN genómico que codifica para Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838 ; aldehido graso-descarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 5) se amplificó y clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc¦ E1 genómico que codifica para la cepa ycobacteriu.77 smegmatis MC2 155 orf MSMEG_5739 (YP_889972, ácido carboxílico-reductasa putativa) (SEQ ID NO: 85) se amplificó y clonó en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-180 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc- Las dos construcciones resultantes co-transformaron en E. coli MG1655 AfadD lacZ: :Ptrc- tesA. En esta cepa, se proporcionaron aldehidos grasos por MSMEG_5739, que reduce ácidos grasos libres (formados por la acción de yTesA) a aldehidos grasos. Las células se cultivaron a 37°C en medio mínimo M9 complementado con 100 g/mL de espectinomicina y 100 µg/mL de carbenicilina . Las células se cultivaron y extrajeron como en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC-MS como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en las Figuras 27A-27B, estas células E. coli co-transíormadas con los vectores que tienen N. punctiforme PCC73102 Npun02004178 y cepa M. smegmatis MC2 155 MSMEG_5739 produjeron tridecano, pentadeceno y pentadecano. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal y hexadecanal proporcionado por la ácido carboxílico-reductasa MSMEG_5739 a tridecano, pentadeceno y pentadecano. Como se muestra en la Figura 28, en el mismo escenario experimental, las siguientes aldehido graso-descarbonilasas también convirtieron aldehidos grasos proporcionados por MSMEG_5739 a los alcanos correspondientes cuando se expresan en E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc- ' tesA: Nostoc sp. PCC7210 alr5283 (SEQ ID N0:7), P. mariunus CCMP1986 PMM0532 (SEQ ID- NO: 19), G. violaceus PCC7421 gll3146 (SEQ ID NO: 15), Synechococcus sp . RS9917_09941 (SEQ ID NO:23), Synechococcus sp . RS9917_12945 (SEQ ID NO:25) y A. marina MBIC11017 AM1_4041 (SEQ ID NO: 9). Ejemplo 25: Aldehído-Graso-Descarbonilasas Cianobacterianas corresponden a la Clase de Proteínas No hemo Di-Hierro. La Mutagénesis Dirigida al Sitio de Histidinas Conservadas a Fenilalaninas en Nostoc Punctiforme PCC73102 Npun02004178 no Anula su Función Catalítica Como se analiza en el Ejemplo 13, la proteína hipotética PMT1231 de Prochlorococcus marinus MIT9313 (SEQ ID NO: 18) es una aldehido graso-descarbonilasa activa. En base a la estructura tridimensional de PMT1231, que está disponible a una resolución de 1.8 Á (pdb20C5A) (ver figura 29B) , las aldehido graso-descarbonilasas cianobacterianas tienen similitud estructural con . proteínas no hemo di-hierro, en particular con proteínas de la subunidad ß de ribonucleasa-reductasa clase I, RNR (Stubbe y Riggs-Gelasco, TIBS 1998, vol . 23., pp. 438) (ver Figura 29A) . Las RNR clase I y Ib contiene un radical tirosilo diférrico que media la actividad catalítica de RNRa (reducción de ribonucleótidos a desoxirriboriucleótidos) . En la RNRß de E. coli, esta tirosina está en la posición 122 y está en proximidad cercana a una de las moléculas de hierro del sitio activo. La alineación estructural mostró que PMT1231 contuvo una fenilalanina en la misma posición como RNRb tryl22, sugiriendo un diferente mecanismo catalítico para aldehido graso-descarbonilasas cianobacterianas. Sin embargo, una alineación de todas las descarbonilasas mostró que dos residuos de tirosina estuvieron completamente conservados en todas las secuencias tyrl35 y tyrl38 con respecto a PMT1231, con tyrl35 que está en proximidad cercana (5.5 Á) a una de las moléculas de hierro de sitio activo (ver Figura 29C) . Para examinar si cualquiera de los dos residuos conservados de tirosina está comprendido en el mecanismo catalítico de las aldehído-graso-descarbonilasas cianobacterianas, se reemplazaron estos residuos con fenilalanina en Npun02004178 (tyr 123 y tyrl26) como sigue.
El ADN genómico que codifica para S. elongatus PCC7942 ORF1594 (SEQ ID NO: 65) se clonó en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc · El ADN genómico que codifica para N punctiforme PCC73102 Npun02004178 (SEQ ID NO: 5) también se clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYCl-77) bajo el control del promotor Ptrc- Esta última construcción se usó como una plantilla para introducir una mutación en las posiciones 123 y 126 de la proteína de descarbonilasa, cambiando las tirosinas a fenilalanina usando los cebadores gttttgcgatcgcagcatttaacatttacatccccgttgccgacg · y gttttgcgatcgcagcatataacattttcatccccgttgccgacg, respectivamente. Las construcciones resultantes entonces se transformaron en E. coli- MG1655. Las células se cultivaron a 37 °C en medio mínimo M9 complementado con 1 % de glucosa (p/v) , y 100 g/mL de carbenicilina y espectinomicina . Las células se cultivaron y se extrajeron como en el Ejemplo 3.
Como se muestra en las Figuras 30A-30C, las dos variantes de proteína Npun02004178 Tyr a Phe fueron activas y produjeron alcanos cuando se sobre-expresaron con S. elongatus PCC7942 ORF1594. Este resultado indica que en contraste a las proteínas R R . clase la y Ib, el mecanismo catalítico de las aldehido graso-descarbonilasas no comprende un radical de tirosilo.
Ejemplo 26: Caracterización Bioquímica de Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 El ADN genómico que codifica para N punctiforme PCC73102 Npun02004178 (SEQ ID NO: 5) se clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector pET-15b bajo el control del promotor T7. La proteína Npun02004178 " resultante contuvo una marca His N-terminal. Una cepa de E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen) se transformó con el plásmido por técnicas de transformación química por rutina. Se llevó a cabo la expresión de la proteína al inocular primero una colonia de la cepa de E. coli en 5 mL de medio LB complementado con 100 mg/L de carbenicilina y se agitó durante la noche a 37 °C para producir un cultivo iniciador. Este cultivo iniciador se usó para inocular 0.5 L de medio LB complementado con 100 mg/L de carbenicilina. El cultivo se agitó a 37 °C hasta que se alcanzó un valor de OD6 o de 0.8, y luego se adicionó IPTG a una concentración final de 1 mM. El cultivo entonces se agitó a 37°C durante aproximadamente 3 horas adicionales. El cultivo entonces se centrifugó a 3700 rpm durante 20 minutos a 4°C. El sedimento entonces se re- suspendió en 10 mL de amortiguador que contiene amortiguador de fosfato de sodio 100 mM a pH 7.2 complementado con' Proteasa Arrest Bacteriana (GBiosciences) . Las células entonces se trataron con ultrasonido a 12 en hielo durante 9 s con 1.5 s de tratamiento de ultrasonido seguido por 1.5 s de descanso. Este procedimiento se repitió 5 veces con intervalos de 1 minuto entre cada ciclo de tratamiento de ultrasonido. El extracto libre de células se centrifugó a 10000 rpm. durante 30 minutos a 4°C. Se adicionaron 5 mL de Ni-NTA (Qiagen) al sobrenadante y la mezcla se agitó suavemente a 4°C. La suspensión espesa se hizo pasar sobre una columna que remueve la resina del producto lisado. La resina entonces se lavó con 30 mL de amortiguador que contiene amortiguador de fosfato de sodio 100 mM a pH 7.2 más imidazol 30 mM. Finalmente, la proteína se eluyó con 10 mL de amortiguador de fosfato de sodio 100 mM a pH 7.2 más imidazol 250 mM. La solución de proteína se dializó con 200 volúmenes de amortiguador de fosfato de sodio 100 mM a pH 7.2 con 20 ¾ de glicerol. Se determinó la concentración de proteína usando el ensayo Bradford (Biorad) . Se obtuvieron 5.6 mg/mL de proteína Npun02004178.
Para sintetizar octadecanal para la reacción de descarbonilasa, se disolvieron 500 mg de octadecanol (Sigma) en 25 mL de diclorometano . Entonces, se adicionaron 200 mg de clorocromato de piridinio (TCI America) a la solución y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se secó bajo vacío para remover el diclorometano. Los productos restantes se re-suspendieron en hexano y se filtraron a través de papel filtro Whatman. El filtrado entonces se secó bajo vacío y se re-suspendió en 5 mL de hexano y se purificó por cromatografía instantánea en sílice. La mezcla se cargó sobre la columna alimentada por gravedad en hexano y luego se lavó con dos volúmenes de columna de hexano. Entonces el octadecanal se eluyó con una mezcla 8:1 de hexáno y acetato de etilo . Las fracciones que contienen octadecanal se mezclaron y analizaron usando los métodos de GC/MS descritos más adelante. El producto final fue 95 % puro como se determina por este método.
Para probar la proteína Npun02004178 para actividad de descarbonilación, se establecieron los siguientes ensayos enzimáticos. Se establecieron reacciones de 200 µL en amortiguador de fosfato de sodio 100 mM a pH 7.2 con los siguientes componentes a sus respectivas concentraciones finales: 30 µ? de proteína Npun02004178 purificada, 200 µ? de octadecanal, 0.11 pg/mL de ferredoxina de espinaca (Sigma) , 0.05 unidades/mL de ferredoxina-reductasa de espinaca (Sigma) , y 1 mM de NADPH (Sigma) . Los controles negativos incluyeron la reacción anterior sin Npun02004178. La reacción anterior sin octadecanal, y la reacción anterior sin ferredoxina de espinaca, ferredoxina-reductasa y NADPH. Cada reacción se incubó a 37 °C durante 2 horas antes de que se extrajera con 100 L de acetato de etilo. Se analizaron las muestras por GC/MS usando los siguientes parámetros: tiempo de corrida: 13.13 min; columna: HP-5-MS Parte Ño. 19091S-433E (longitud de 30 metros; diámetro interno: 0.25 mm de diámetro estrecho; película: 0.25ÍM), inyección: entrada Agilent 6850 de 1 L; entrada: 300C sin división; gas portador: helio; flujo: 1.3 mL/min; temperatura de horno: 75°C mantenido 5 minutos, 320 a 40°C/min, 320 mantenido 2 minutos; det: Agilent 5975 VL MSD; det. Temp : 330°C, exploración: 50-550 M/Z. Se usó heptadecano de Sigma como una- referencia auténtica para determinar el tiempo . de retención del compuesto y el patrón de fragmentación.
Como se muestra en la Figura 31, se observó conversión in vitro de octadecanal a heptadecano en la presencia de Npun02004178. La descarbonilación enzimática de octadecanal por Npun02004178 fue dependiente de la adición de ferredoxina-reductasa de espinaca, ferredoxina y NADPH.
Entonces, se determinó si las ferredoxinas y ferredoxi.na-reductasas cianabacterianas pueden reemplazar las proteínas de espinaca en el ensayo de aldehido graso- descarbonilasa in .vitro. Se clonaron los siguientes 4 genes de forma separada en los sitios Ndel y Xhol de. pET-15b: N punctiforme PCC73102 Npun02003626 (ZP_00109192 , ferredoxina oxido-reductasa petH sin el dominio- ligador de aloficocianina n-terminal) (SEQ ID NO:87), N. punctiforme PCC73102 Npun02001001 ( ZP_00111633 , ferredoxina 1) (SEQ ID NO:89), N. punctiforme PCC73102 Npun02003530 (ZP_00109422 , ferredoxina 2) (SEQ ID NO: 91) y 2V. punctiforme PCC73102 Npun02003123 (ZP_00109501 , ferredoxina 3) (SEQ ID N0:93). Las cuatro proteínas se expresaron y purificaron como se describe anteriormente . Se obtuvo 1 mg/mL de cada ferredoxina y 4 mg/mL de ferredoxina-oxidoreductasa . Las tres ferredoxinas cianobacterianas se probaron con la ferredoxina- oxidoreductasa cianobacteriana usando el escenario enzimático descrito anteriormente con los siguientes cambios: la concentración final de la ferredoxina-reductasa fue 60 pg/mL y las ferredoxinas estuvieron a 50 g/mL. Las reacciones enzimáticas extraídas fueron por GC/MS usando los siguientes parámetros: tiempo de corrida: 6.33 min; columna J&W 122-5711 ' DB-5ht (longitud de 15 metros; diámetro interno: 0.25 mm de diámetro interno; película: 0.10 µ?) ; inyección: entrada Agilent 6850 de 1 L; entrada: 300°C sin división; gas portador: helio; flujo: 1.3 mL/min; temperatura de horno: 100°C mantenido 0.5 minutos, 260 a 30°C/min, 260 mantenido 5 minutos; det : Agilent 5975B VL MSD; det.. Temp: 330°C, exploración: 50-550 M/Z.
Como se muestra en la Figura 32, la conversión in vitro dependiente de Npun02004178 de octadecanal a heptadecano se observó en la presencia de NADPH y la ferredoxina-oxidoreductasa cianobacteriana y cualquiera de las tres ferredoxinas cianobacterias .
Ejemplo 27.- Caracteriación bioquímica de Synechococcus elongatus PCC7942 orf!594 El ADN genómico que codifica para S. elongatus PCC7492 orfl594 (SEQ ID NO: 65) se clonó en los sitios Ncol y Xhol del vector pET-28b bajo el control del promotor T7. La proteína PCC7942_orf1594 resultante contuvo una marca His-tag C-terminal. Se transformó una' cepa E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen) con el plásmido y se expresó la proteína PCC7942_orf1594 y se purificó como se describe en el Ejemplo 22. La solución de proteína se almacenó en el siguiente amortiguador: fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5, NaCl 100 mM, THP 1 mM, glicerol al 10 %. Se determinó la concentración de proteína usando el ensayo Bradford (Biorad) . Se obtuvieron 2 mg/mL de proteína PCC7942_orf1594.
Para probar la protelna PCC7942_orf1594 para la actividad de acil-ACP o acil-CoA-reductasa, se establecieron los siguientes ensayos enzimáticos. Se establecieron reacciones de 100 en amortiguador Tris-HCl 50 mM a pH 7.5 con los siguientes componentes a sus respectivas concentraciones finales: 10 µ? de proteína PCC7942_orf1594 purificada, 0.01-1 mM de acil-CoA o acil-ACP, 2 mM de MgCl2, 0.2-2 mM de NADPH . Las reacciones se incubaron durante 1 hora a 37 °C y luego se detuvieron al adicionar 100 L de acetato de etilo (que contiene 5 mg/L de 1-octadeceno como norma interna) . Las muestras se sometieron a vórtice durante 15 minutos y se centrifugaron a velocidad máxima durante 3 minutos para la separación de fase. Se transfirieron 80 xh de la capa superior en frascos de vidrio de GC y se analizaron por GC/MS como se describe en el Ejemplo 26. La cantidad de aldehido formado se calculó en base a la norma interna.
Como se muestra en las Figuras 33A-33C, PCC7942_orf1594 fue capaz de reducir octadecanoil-CoA u octadecanal . · La actividad de reductasa requirió cationes divalentes- tal como Mg2+, Mn2+ o Fe2+ y NADPH como donador de electrones. NADH no soporta la actividad de reductasa. También, PCC7942_orf1594 fue capaz de reducir octadecenoil-CoA y octadecenoil-ACP a octadécenal . Los valores Km para la reducción de octadecanoil-CoA, octadecenoil-CoA y octadecenoil-ACP en la presencia de NADPH 2 mM se determinó como 45 ± 20 µ?, 82 ± 22 µ? y 7.8 ± 2 µ?, respectivamente. Estos resultados demuestran que PCC7942_orf1594 , in vitro, reduce tanto acil-CoA como acil-ACP y que la enzima aparentemente tiene una mayor afinidad para acil-ACP en comparación a acil-CoA. El valor de Km para NADPH en la presencia de octadecanoil-CoA 0.5 mM para PCC7942_orf1594 se determinó .como 400 ± 80 µ?.
Entonces, se examinó la transferencia estereoespecífica de hidruro desde NADPH a un aldehido graso catalizado por PCC7942_orf1594. Se preparó Deutero-NADPH de acuerdo al siguiente protocolo. Se adicionaron 5 mg de NADP+ y 3.6 mg de D-glucosa-l-d a 2.5 mL de amortiguador de fosfato de sodio 5 mM (pH 7.0) . Se inició la producción enzimática de NADPH marcado por la adición de 5 unidades de glucosa- deshidrogenasa ya sea a partir de Bacillus megaterium (USB - Corporation) para la producción de R- (4 -2H) NADPH o Thermoplasma acidophilum (Sigma) para la producción de S-(4- 2H) ADPH. La reacción se incubó durante 15 minutos a 37°C, se filtró por centrífuga usando un filtro de centrífuga 10 KDa MWCO Amicon Ultra (Millipore) , se congeló instantáneamente en hielo seco, y se almacenó a -80°C.
La reacción de ensayo in vitro contuvo Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), 10 µ? de proteína PCC7942_orf1594 purificada, 1 mM de octadecanoil-CoA, 2 mM de MgCl2, y 50 µL de Deutero- NADPH (preparado como se describe anteriormente) en un volumen total de 100 L. después de una incubación de 1 hora, el producto de la reacción enzimática se ex-trajo y se analizó como se describe anteriormente. El aldehido graso resultante detectado por GC/MS fue octadecanal (ver Figuras 34A-34C) . Debido a que la transferencia de hidruro de NADPH es estereoespecífica, se sintetizaron tanto R- (4-2H) ADPH como S- (4-2H)NADPH. El octadecanal con una masa de más de una unidad se observó usando solo la S- (4 -2H) ADPH . El hecho que el aldehido graso se marco indica que se ha transferido el hidrógeno deuterado desde el NADPH marcado al aldehido graso marcado. Esto demuestra que NADPH se usó en esta reacción enzimática y que es estereoespecífica la transferencia de hidruro catalizada por PCC7942_orf1594.
Ejemplo 28. Producción Intracelular y Extracelular de aldehidos Grasos y Alcoholes Grasos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus PCC7942 orf1594 El ADN genómico que codifica para Synechococcus longatus PCC7942 orf1594 (YP_400611; acil-ACP-reductasa) (SEQ ID NO:65) se amplificó y se clonó en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc - La construcción resultante se co-transformó en E. coli coli MG1655 AfadE y las células se cultivaron a 37°C en 15 mL de medio mínimo Che- 9 con 3 % (p/v) de glucosa como fuente de carbono y se complementó con 100 g/ml de espectinomicina y carbenicilina, respectivamente. Cuando el cultivo alcanzó OD60o de 0.8-1.0, se indujo con IPTG 1 mm y las células se cultivaron durante 24-48 horas adicionales a 37 °C. El medio mínimo Che -9 se define como: 6g/L de Na2HP04, 3 pL de KH2P04, 0.5 iL de NaCl, 2 xh de NH4C1, 0.25 L de MgS04 x 7 H20, 11 mg/L de CaCl2, 27 mg/L de Fe3Cl x 6 H20, 2 mg/L de ZnCl x 4 H20, 2 mg/L de Na2Mo04 x 2 H20, 1.9 mg/L de CuS04 x 5 H20, 0.5 mg/L de H3B03, 1 mg/L tiamina, Bis-Tris 200 mM (pH 7.25) y 0.1 (v/v) de Triton-X100. Cuando el cultivo alcanzó OD6oo de 1.0-1.2, se indujo con IPTG 1 mM y las células se dejaron crecer durante 40 horas adicionales a 37°C. Las células de 0.5 mL de cultivo se extrajeron con 0.5 mL de acetato de etilo para la producción total de hidrocarburos como se describe en el Ejemplo 26. Adicionalmente, las células y el sobrenadante se separaron por centrifugación (4000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos) y se extrajeron de manera separada.
El cultivo produjo 620 mg/L de aldehidos grasos ( tetradecanal , heptadecenal , heptadecanal y octadecenal) y 1670 mg/L de alcoholes grasos (dodecanol, tetradecanol, tetradecanol, heptadecanol , heptadecanol y octadecanol) . La Figura 35 muestra el cromatograma del sobrenadante extraído. Se determinó que 73 £ de los aldehidos grasos y alcoholes grasos estuvieron en el sobrenadante libre de células.
Ejemplo 29. Producción Inbracelular y Extracelular de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Synechococcus elongatus . PCC7942 orf!594 y Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 El ADN genómico que codifica para Synechococcus longatus PCC7942 orfl594 (YP_400611; acil-ACP-reductasa) (SEQ ID NO: 65) se amplificó y se clonó en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc- El ADN genómico que codifica para Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838 ; aldehido graso-descarbonilasa) (SEQ ID NO: 5) se amplificó y clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- Las construcciones resultantes se co-transformaron en E. coli MG1655 AfadE y las células se cultivaron a 37 °C en 15· mL de medio mínimo Che9 con 3 % (p/v) de glucosa como fuente de carbono y se complementó con 100 g/mL de espectinomicina y carbenicilina, respectivamente. Las células se cultivaron, se separaron del caldo, se extrajeron, y se analizaron como se describe en el Ejemplo 28.
El cultivo produjo 323 mg/L de alcanos y alquenos (tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno) , 367 mg/L de aldehidos grasos (tetradecanal , heptadecenal , heptadecanal y octadecenal) y 819 mg/L de alcoholes grasos (tetradecano, heptadecenol , heptadecanol y octadecenol) . La Figura 36 muestra el cromatograma del sobrenadanre extraído. Se determinó que 86 % de los aléanos, alquenos, aldehidos grasos y alcoholes grasos estuvieron en el sobrenadante libre de células.
Ejemplo 30. Producción de Alcanos y Alquenos en E. coli a través de Expresión Heteróloga de Nostoc sp. PCC7210 alr5284 y Nostoc sp. PCC7210 alr5283 El ADN genómico que codifica para Nostoc sp. PCC7210 alr5284 (NP_489324; enzima putativa generadora de aldehidos) (SEQ ID NO: 81) se amplificó y se clonó en los sitios Ncol y EeoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. El AD genómico que codifica para Nostoc sp. PCC7210 alr5283 (NP_489323; decarbonilasa putativa) (SEQ ID NO: 7) se amplificó y clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc- Las construcciones resultantes se co-transíormaron en E. coli MG1655 y las células se cultivaron a 37 °C en 15 mL de medio mínimo Che9 con 3 ¾· (p/v) de glucosa como fuente de carbono y se complementaron con 100 g/mL de espectinomicina y carbenicilina, respectivamente (como se describe en el Ejemplo 28) . Las células de 0.5 mL de cultivo se extrajeron y analizaron como se describe en el Ejemplo 3 y se analizaron por GC/ S como se describe en el Ejemplo 26.
Como se muestra en las Figuras 27A-27B, las células E. coli co-transformadas con vectores que tienen Nostoc sp. PCC7210 alr5284 y Nostoc s . PCC7210 alr5283 produjeron tridecano, pentadeceno, pentadecano, tetradecanol y hexadecanol . Este resultado indica que la co-expresión de Nostoc sp. PCC7210 alr5284 y alr5283 es suficiente para que E. coli produzca alcoholes grasos, alcanos y alquenos .
Otras Modalidades Se va a entender que en tanto que la invención se ha descrito en unión con la descripción detallada de . la misma, se propone que la descripción anterior ilustre y no limite el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. . .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (74)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Método para producir un hidrocarburo, caracterizado porque comprende producir en una célula hospedadora un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36, o una variante de la misma, y aislar el hidrocarburo de la célula hospedadora.
2. Método para producir un hidrocarburo, á caracterizado porque comprende producir en una célula hospedadora un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 70 % de identidad a SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36, y aislar el hidrocarburo de la célula hospedadora.
3. Método para producir un hidrocarburo, caracterizado porque comprende producir en una célula hospedadora, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36, con una o más sustituciones, adiciones, inserciones o supresiones de aminoácido, en donde el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa .
4. Método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36, con una o más sustituciones conservadoras de aminoácido.
5. Método para producir un hidrocarburo, caracterizado porque comprende expresar en una célula hospedadora un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 70 de identidad de secuencia a SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 35, y aislar el hidrocarburo de la célula hospedadora.
6. Método para producir un hidrocarburo, caracterizado porque comprende expresar en una célula hospedadora un polinucleótido que hibridiza a un complemento de SEQ ID N0:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 35, o a un fragmento de las mismas, en donde el polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene la misma actividad biológica como un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36.
7. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el polipéptido o el polinucleótido de es una cianobacteria .
8. Método para producir un hidrocarburo, caracterizado porque comprende transformar una célula hospedadora con un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 70 de identidad de secuencia a SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 35, y aislar el hidrocarburo de la célula hospedadora.
9. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el vector recombinante comprende además un promotor operablemente enlazado a la secuencia de nucleótidos .
10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste de una célula mamífera, célula vegetal, célula insectil, célula de levadura, célula fungoidea, célula fungoidea filamentosa, y célula bacteriana.
11. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la célula hospedadora es una célula de E. coli.
12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la célula de E. coli es una célula de E. coli de la cepa B, de la cepa C, de la cepa K o de la cepa W.
13. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la célula hospedadora produce un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos del vector recombinante .
14. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el hidrocarburo se segrega por la célula hospedadora .
15. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el hidrocarburo es un alcano.
16. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el alcano comprende un Ci3-Ci2 alcano.
17. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el alcano se selecciona del grupo que consiste de tridecano, metiltridecano, nonadecano, metilnonadecano, heptadecano, metilheptadecano, pentadecano, y metilpentadecano .
18. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque además comprende cultivar la célula hospedadora en la presencia dé al menos un sustrato biológico para el polipéptido o para un polipéptido codificado por la secuencia dé nucleótidos.
19. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el sustrato es un derivado de ácido graso.
20. Método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende cultivar la célula hospedadora en la presencia de un derivado de ácido graso saturado .
21. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el derivado de ácido graso saturado es un derivado de ácido graso saturado de Ci4-C22-
22. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el derivado de ácido graso saturado se selecciona del grupo que consiste de 2-metilicosanal, icosanal, octadecanal, tetradecanal , 2-metiloctadecanal , estearaldehído, palmitaldehído, y sus derivados.
23. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el hidrocarburo es un alqueno.
24. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el alqueno comprende un Ci3-C2ialqueno .
25. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el alqueno se selecciona del grupo que consiste de pentadeceno, heptadeceno, metilpentadeceno, y metilheptadeceno .
26. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque además comprende cultivar la célula hospedadora en la presencia de un derivado de ácido graso insaturado .
27. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el derivado de ácido graso insaturado es un derivado de ácido graso insaturado de Ci4-C22.
28. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el derivado de ácido graso insaturado se selecciona del grupo que consiste de octadecenal, hexadecenal, metilhexadecenal y metiloctadecenal .
29. Microorganismo. genéticamente manejado, caracterizado porque comprende una secuencia exógena de control incorporada de manera estable en el ADN genómico del microorganismo en la dirección 5' de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 70 ¾· de identidad de secuencia a SEQ ID N0:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, O 35, en donde el microorganismo produce un nivel incrementado de un hidrocarburo con relación a un microorganismo tipo silvestre.
30. Microorganismo ' de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el microorganismo es una cianobacteria .
31. Método para producir un hidrocarburo, caracterizado porque comprende cultivar el microorganismo de la reivindicación 29 bajo condiciones adecuadas para la expresión génica.
32. Hidrocarburo, caracterizado porque se produce por cualquiera de los métodos de conformidad con las reivindicaciones 1-28 y 31.
33. Biocombustible, caracterizado porque comprende el hidrocarburo de la reivindicación 32.
34. Biocombustible de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el biocombustible es diesel, gasolina, o combustible de avión.
35. Biocombustible de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el hidrocarburo tiene una 613C de aproximadamente -15.4 o mayor.
36. Biocombustible de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el hidrocarburo tiene una fM14C de al menos aproximadamente 1.003.
37. Método para producir un hidrocarburo, caracterizado porque comprende poner en contacto un sustrato con (i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36, o una variante de la misma, o (ii) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70 §r de identidad con SEQ .ID N0:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 35, o una variante de la misma.
38. Método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el hidrocarburo comprende un Ci3- C2ialcano .
39. Método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el hidrocarburo se selecciona del grupo que consiste de tridecano, metiltridecano , nonadecano, metilnonadecano, heptadecano, metilheptadecano, pentadecano, y metilpentadecano .
40. Método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el sustrato se selecciona del grupo que consiste de 2-metilicosanal , icosanal, octadecanal, tetradecanal , 2-metiloctadecanal, estearaldehído, palmitaldehído , y sus derivados.
41. Método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el hidrocarburo comprende un Ci3-C2ialqueno .
42. Método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el hidrocarburo se selecciona del grupo que consiste de pentadeceno, heptadeceno, metilpentadeceno, y metilheptadeceno .
43. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el sustrato se selecciona del grupo que consiste de octadecenal, hexadecenal, metilhexadecenal y metiloctadecenal .
44. Método para producir un hidrocarburo, caracterizado porque comprende producir en una célula hospedadora un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de: (i) SEQ ID NO: 37 Ó SEQ ID NO: 38 O SEQ ID NO: 39; O (ii) SEQ ID NO:40 y cualquiera de (a) SEQ ID NO: 37, (b) SEQ ID NO: 38, y (c) SEQ ID NO: 39; O (iii) SEQ ID NO: 41 O SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43 O SEQ ID NO: 44, en donde el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa .
45. Método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el polipéptido es de una cianobacteria.
46. Método de conformidad con la reivindicación 44 o 45, caracterizado porque la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste de una célula mamífera, célula- vegetal, célula insectil, célula de levadura, célula fungoidea, célula fungoidea filamentosa, y célula bacteriana.
47. Método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la célula hospedadora es una célula de E. coli.
48. Método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el hidrocarburo se segrega por la célula hospedadora .
49. Método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el hidrocarburo comprende un Ci3-C2ialcano .
50. Método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el hidrocarburo se selecciona del grupo que consiste de tridecano, metiltridecano, nonadecano, metilnonadecano, heptadecano, tnetilheptadecano, pentadecano, y metilpentadecano .
51. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-48, caracterizado porque además comprende cultivar la célula hospedadora en la presencia de al menos un sustrato biológico para el polipéptido.
52. Método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el sustrato es un derivado de ácido graso.
53. Método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque comprende además cultivar la célula hospedadora en la presencia de un derivado de ácido graso saturado .
54. Método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el derivado de ácido graso saturado se selecciona del grupo que consiste de 2-metilicosanal, icosanal, octadecanal, tetradecanal , 2 -metiloctádecanal , estearaldehído, palmitaldehídó, y sus derivados.
55. Método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el hidrocarburo comprende un Ci3-C2ialquéno .
56. Método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el hidrocarburo se selecciona del grupo que consiste de pentadeceno, heptadeceno, metilpentadeceno, y metilheptadeceno .
57. Método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque además comprende cultivar la célula hospedadora en la presencia de un derivado de ácido graso insaturado .
58. Método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el derivado de ácido graso insaturado se selecciona del grupo que consiste de octadecenal, hexadecenal, metilhexadecenal y metiloctadecenal .
59. Método para producir un hidrocarburo, caracterizado porque comprende poner en contacto un sustrato con un polipéptido que comprendé la secuencia de aminoácidos de: (i) SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38 O SEQ ID NO: 39; o (ii) SEQ ID NO:40 y cualquiera de (a) SEQ ID NO:37, (b) SEQ ID NO: 38, y (c) SEQ ID NO: 39; o (Üi) SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:42 O SEQ ID NO:43 O SEQ ID NO: 44 , en donde el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa .
60. Método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el hidrocarburo comprende un C13-C2ialcano .
61. Método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el hidrocarburo se selecciona del grupo que consiste de tridecano, metiltridecano , nonadecano, metilnonadecano, heptadecano, metilheptadecano, pentadecano, y metilpentadecano.
62. Método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el sustrato es un derivado de ácido graso .
63. Método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el sustrato es un derivado de ácido graso saturado.
64. Método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el sustrato se selecciona del grupo que consiste de 2 -metilicosanal , icosanal, octadecanal, tetradecanal , 2-metiloctadecanal , estearaldehído, palmitaldehído, y sus derivados.
65. Método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el hidrocarburo comprende un Ci3-C2ialqueno .
66. Método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el hidrocarburo se selecciona del grupo que consiste de pentadeceno, heptadeceno, metilpentadeceno, y metilheptadeceno .
67. Método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el sustrato es un sustrato de ácido graso insaturado.
68. Método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el sustrato se selecciona del grupo que consiste de octadecenal, hexadecenal , metilhexadecenal y metiloctadecenal . ^
69. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque consiste- de no más de 500 nucleótidos de SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29., 31, 33, O 35.
70. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque consiste de no más de 90 % de los nucleótidos de SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 35.
71. Ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 69 y 70, caracterizado porque codifica para un polipéptido que tiene actividad de descarbonilasa.
72. Polipéptido aislado, caracterizado porque consiste de no más de 200 aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36.
73. Polipéptido aislado, caracterizado porque consiste de no más de 90 % de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36.
74. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 72 o 73, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad de descarbonilasa.
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US (11) US8268599B2 (es)
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MX (3) MX2010012192A (es)
WO (2) WO2009140696A2 (es)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8110670B2 (en) 2006-05-19 2012-02-07 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
US20100242345A1 (en) 2006-05-19 2010-09-30 LS9, Inc Production of fatty acids & derivatives thereof
DK2262901T3 (en) 2008-03-05 2019-01-21 Genomatica Inc ORGANISMS PRODUCING PRIMARY ALCOHOL
CA2722441C (en) 2008-05-16 2021-01-26 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing hydrocarbons
US20110146142A1 (en) * 2008-08-18 2011-06-23 Ls9, Inc. Systems and methods for production of mixed fatty esters
JP2012504963A (ja) 2008-10-07 2012-03-01 エルエス９・インコーポレイテッド 脂肪アルデヒドを生産するための方法および組成物
CA3041892C (en) 2008-10-28 2022-03-15 REG Life Sciences, LLC Methods for producing a fatty alcohol in a host cell
US20150017694A1 (en) * 2008-11-06 2015-01-15 Kiverdi, Inc. Engineered CO2-Fixing Chemotrophic Microorganisms Producing Carbon-Based Products and Methods of Using the Same
WO2013082309A1 (en) * 2011-11-29 2013-06-06 Kiverdi, Inc. Process for growing natural or engineered high lipid accumulating strain on crude glycerol and/or other sources of waste carbon for the production of oils, fuels, oleochemicals, and other valuable organic compounds
US9879290B2 (en) * 2008-11-06 2018-01-30 Kiverdi, Inc. Industrial fatty acid engineering general system for modifying fatty acids
US9957534B2 (en) 2008-11-06 2018-05-01 Kiverdi, Inc. Engineered CO2-fixing chemotrophic microorganisms producing carbon-based products and methods of using the same
AP2011005777A0 (en) 2008-12-23 2011-08-31 Ls9 Inc Methods and compositions related to thioesterase enzymes.
CA2758298A1 (en) * 2009-04-10 2010-10-14 Ls9, Inc. Production of commercial biodiesel from genetically modified microorganisms
EP2425007A4 (en) 2009-04-27 2013-01-02 Ls9 Inc PREPARATION OF FATTY ACID ESTERS
CA2766585C (en) 2009-06-30 2016-03-01 Codexis, Inc. Production of fatty alcohols with fatty alcohol forming acyl-coa reductases (far)
US7794969B1 (en) 2009-07-09 2010-09-14 Joule Unlimited, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of n-alkanes
US7955820B1 (en) 2009-07-09 2011-06-07 Joule Unlimited, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of n-alkanes
AU2011204785B2 (en) * 2009-07-09 2013-08-15 Joule Unlimited Technologies, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of N-alkanes
AU2012200694B2 (en) * 2009-07-09 2012-11-01 Joule Unlimited Technologies, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of N-alkanes
CN105969710A (zh) * 2009-09-25 2016-09-28 Reg生命科学有限责任公司 脂肪酸衍生物的产生
MX2012003604A (es) 2009-09-27 2012-09-12 Opx Biotechnologies Inc Metodo para producir acido 3-hidroxipropionico y otros productos.
WO2011062987A2 (en) * 2009-11-17 2011-05-26 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing hydrocarbons
US9217161B2 (en) 2009-12-04 2015-12-22 Richard Allen Kohn Process for producing fermentation products and fermentation medium compositions therefor
US8530221B2 (en) 2010-01-14 2013-09-10 Ls9, Inc. Production of branched chain fatty acids and derivatives thereof in recombinant microbial cells
US8859259B2 (en) 2010-02-14 2014-10-14 Ls9, Inc. Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols
US20110250663A1 (en) * 2010-04-08 2011-10-13 Ls9, Inc. Methods and compositions related to fatty alcohol biosynthetic enzymes
KR101334981B1 (ko) 2010-06-10 2013-12-02 한국과학기술원 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 탄화수소의 제조방법
WO2012006114A2 (en) 2010-06-28 2012-01-12 Codexis, Inc. Fatty alcohol forming acyl reductases (fars) and methods of use thereof
US20120135486A1 (en) * 2010-09-14 2012-05-31 C/O Joule Unlimited Technologies, Inc. Methods and Compositions for the Extracellular Transport of Biosynthetic Hydrocarbons and Other Molecules
US8372610B2 (en) 2010-09-15 2013-02-12 Ls9, Inc. Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells
EP2655605A1 (en) * 2010-12-20 2013-10-30 Matrix Genetics, LLC Modified photosynthetic microorganisms for producing lipids
US20130035513A1 (en) * 2011-01-26 2013-02-07 Ls9, Inc. Methods and compositions for enhanced production of fatty aldehydes and fatty alcohols
EP2678410B1 (en) 2011-02-17 2017-09-13 The Procter and Gamble Company Composiitons comprising mixtures of c10-c13 alkylphenyl sulfonates
WO2012112828A1 (en) 2011-02-17 2012-08-23 The Procter & Gamble Company Bio-based linear alkylphenyl sulfonates
KR20140010126A (ko) 2011-03-03 2014-01-23 터서스 파마수티칼 엘엘씨 C16:1n7-팔미톨리에이트를 포함하는 조성물들 및 방법들
WO2012129537A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Joule Unlimited Technologies, Inc. Photoalkanogens with increased productivity
EP2691510A4 (en) 2011-03-31 2014-11-12 Exxonmobil Res & Eng Co METABOLISM DIRECTIONS BY TRANSCRIPTION FACTOR OVEREXPRESSION
WO2012174451A1 (en) 2011-06-17 2012-12-20 Invista Technologies S.A.R.L. Use of hydrolases to increase monomer content in waste stream
US20130034884A1 (en) 2011-06-22 2013-02-07 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto
EP2726627A2 (en) 2011-06-30 2014-05-07 Invista Technologies S.à.r.l. Bioconversion process for producing nylon-7, nylon-7,7 and polyesters
DE102011110945A1 (de) 2011-08-15 2013-02-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von organischen Verbindungen mit alkIL-Genprodukt
US10662443B2 (en) 2011-08-15 2020-05-26 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Method for producing alkane and recombinant microorganism capable of synthesizing alkane
DE102011110946A1 (de) 2011-08-15 2016-01-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von omegafunktionalisierten Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern aus einfachen Kohlenstoffquellen
CN102952818B (zh) 2011-08-26 2016-03-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 用于在蓝细菌中提高脂肪醇产量的构建体和方法
US20140370563A1 (en) * 2011-08-26 2014-12-18 Brookhaven Science Associates, Llc Compositions and methods for the relief of inhibition of aldehyde decarbonylase
EP2753701B1 (en) 2011-09-27 2018-05-02 ExxonMobil Research and Engineering Company Acyl-acp wax ester synthases
US9556458B2 (en) 2011-10-27 2017-01-31 The Regents Of The University Of California Bacterial production of methyl ketones
US9102958B2 (en) 2011-12-16 2015-08-11 Invista North America S.á.r.l. Methods of producing 6-carbon chemicals via CoA-dependent carbon chain elongation associated with carbon storage
US9102960B2 (en) 2011-12-16 2015-08-11 Invista North America S.á.r.l. Methods of producing 6-carbon chemicals via CoA-dependent carbon chain elongation associated with carbon storage
CN103194418B (zh) * 2012-01-04 2014-09-03 武汉臻智生物科技有限公司 一种制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法
WO2013124439A2 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Shell Internationale Research Maatschappij B.V. Method for preparing a hydrocarbon
EP2814972B1 (en) 2012-02-24 2020-04-22 ExxonMobil Research and Engineering Company Enhanced production of fatty acids and fatty acid derivatives by recombinant microorganisms
US9096834B2 (en) 2012-02-24 2015-08-04 Exxonmobil Research And Engineering Company Recombinant microorganisms comprising thioesterase and lysophosphatidic acid acyltransferase genes for fatty acid production
CN104093836B (zh) 2012-02-27 2018-02-09 丰田自动车株式会社 烃合成酶基因及其利用
WO2013152051A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Ls9, Inc. Improved production of fatty acid derivatives
US9163267B2 (en) 2012-04-11 2015-10-20 REG Life Sciences, LLC Metathesis transformations of microbially-produced fatty acids and fatty acid derivatives
US9181568B2 (en) 2012-04-23 2015-11-10 Exxonmobil Research And Engineering Company Cell systems and methods for improving fatty acid synthesis by expression of dehydrogenases
DE102012207921A1 (de) 2012-05-11 2013-11-14 Evonik Industries Ag Mehrstufiges Syntheseverfahren mit Synthesegas
EP2850198B1 (en) 2012-05-17 2020-06-17 Shell International Research Maatschappij B.V. Process for producing volatile organic compounds from biomass material
IN2014DN09550A (es) 2012-05-17 2015-07-17 Shell Int Research
BR112015000671A2 (pt) * 2012-07-13 2017-06-27 Calysta Inc sistema de biorrefinaria, métodos e composições dos mesmos.
US20140051136A1 (en) 2012-08-10 2014-02-20 Opx Biotechnologies, Inc. Micoorganisms and Methods for the Production of Fatty Acids and Fatty Acid Derived Products
RU2015109898A (ru) * 2012-11-09 2017-01-10 Калиста, Инк. Композиции и способы биологического получения производных жирных кислот
CA2891353A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 REG Life Sciences, LLC Acp-mediated production of fatty acid derivatives
BR112015013413A2 (pt) 2012-12-14 2017-11-14 Invista Tech Sarl método para biosintetizar um produto e hospedeiro recombinante
EP2938734A2 (en) 2012-12-31 2015-11-04 Invista Technologies S.A R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via aromatic compounds
WO2014105788A2 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via carbon chain elongation associated with cyclohexane carboxylate synthesis
CN105073214A (zh) 2012-12-31 2015-11-18 英威达技术有限责任公司 通过甲酯保护的碳链延伸生产6碳化学物的方法
EP2938733A2 (en) 2012-12-31 2015-11-04 Invista North America S.a.r.l. Methods of producing 7-carbon chemicals via methyl-ester shielded carbon chain elongation
CN105026569A (zh) 2012-12-31 2015-11-04 英威达技术有限责任公司 通过丙酮酸和琥珀酸半醛羟醛缩合生产7-碳化学物的方法
EP2938732A1 (en) 2012-12-31 2015-11-04 Invista Technologies S.à.r.l. Methods of producing 7-carbon chemicals from long chain fatty acids via oxidative cleavage
EP2938736A2 (en) 2012-12-31 2015-11-04 Invista Technologies S.A R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via c1 carbon chain elongation associated with coenzyme b synthesis
KR102082247B1 (ko) 2013-01-16 2020-02-28 알이지 라이프 사이언시스, 엘엘씨 개선된 특성들을 갖는 아실-ａｃｐ 레덕타아제
US9034629B2 (en) 2013-01-25 2015-05-19 Joule Unlimited Technologies, Inc. Recombinant synthesis of medium chain-length alkanes
AU2014225436B2 (en) * 2013-03-07 2018-05-10 Genomatica, Inc. Downstream processing of fatty alcohol compositions produced by recombinant host cells
US9267158B2 (en) 2013-03-14 2016-02-23 Intrexon Corporation Biological production of multi-carbon compounds from methane
US10047383B2 (en) 2013-03-15 2018-08-14 Cargill, Incorporated Bioproduction of chemicals
SI2984490T1 (sl) * 2013-06-14 2020-10-30 Genomatica, Inc. Metode proizvodnje derivatov omega hidroksilirane maščobne kisline
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
US10337038B2 (en) 2013-07-19 2019-07-02 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
JP2016529259A (ja) 2013-08-19 2016-09-23 アールイージー ライフ サイエンシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 部分精製された廃グリセロールの製造
US9469586B2 (en) 2013-08-19 2016-10-18 REG Life Sciences, LLC Production of partially refined waste glycerol
CN113493759A (zh) 2013-09-13 2021-10-12 基因组股份公司 改进的乙酰-coa羧化酶变体
BR122020001956B1 (pt) 2013-12-05 2023-03-14 Genomatica, Inc Célula bacteriana recombinante para a produção de uma amina graxa e método de produção de uma amina graxa
BR112016023232B1 (pt) 2014-04-10 2023-03-14 Genomatica, Inc Processo quimioenzimático para a preparação de uma lactona ou uma cetona macrocíclica
BR112016026461A2 (pt) 2014-05-15 2017-12-12 Invista Tech Sarl métodos de produção de produtos químicos com 6 carbonos com uso de 2,6-diaminopimelato como precursor para 2-aminopimelato
JP6034332B2 (ja) 2014-05-30 2016-11-30 トヨタ自動車株式会社 組換え微生物及び当該組換え微生物を用いた物質製造方法
JP6189793B2 (ja) 2014-05-30 2017-08-30 トヨタ自動車株式会社 組換え微生物及び当該組換え微生物を用いた物質製造方法
EP3152286B1 (en) 2014-06-09 2020-01-22 Stepan Company Detergents for cold-water cleaning
EP3087179B1 (en) 2014-06-16 2020-04-08 Genomatica, Inc. Omega-hydroxylase-related fusion polypeptides with improved properties
BR112016029399A2 (pt) 2014-06-16 2017-10-17 Invista Tech Sarl métodos, reagentes e células para biossintetizar composto
US20170152531A1 (en) 2014-06-16 2017-06-01 North America S.A.R.L. Process for producing glutarate and glutaric acid methyl ester
EP3155106A2 (en) 2014-06-16 2017-04-19 Invista Technologies S.à.r.l. Methods, reagents and cells for biosynthesizing compound
BR112016029375A2 (pt) 2014-06-16 2017-10-17 Invista Tech Sarl métodos, reagentes e células para biossintetizar compostos
AU2015289430B2 (en) 2014-07-18 2020-03-05 Genomatica, Inc. Microbial production of fatty diols
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
EP3868890A1 (en) 2015-11-18 2021-08-25 Provivi, Inc. Microorganisms for the production of insect pheromones and related compounds
WO2017101987A1 (en) 2015-12-15 2017-06-22 REG Life Sciences, LLC Omega-hydroxylase-related fusion polypeptide variants with improved properties
MX2018015111A (es) 2016-06-06 2019-09-02 Provivi Inc Produccion semi-biosintetica de alcoholes grasos y aldehidos grasos.
KR20230170107A (ko) 2016-09-14 2023-12-18 게노마티카 인코포레이티드 1,3-지방 디올 화합물 및 그 유도체
JP6607204B2 (ja) * 2017-01-17 2019-11-20 トヨタ自動車株式会社 アルカン合成能を有する組換え微生物及びアルカンの製造方法
JP2020506702A (ja) 2017-02-02 2020-03-05 カーギル インコーポレイテッド Ｃ６−ｃ１０脂肪酸誘導体を生成する遺伝子組み換え細胞
JP2018143192A (ja) * 2017-03-08 2018-09-20 花王株式会社 脂肪族アルコールの生産方法
CA3058950A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Genomatica, Inc. Thioesterase variants having improved activity for the production of medium-chain fatty acid derivatives
JP7216018B2 (ja) 2017-05-17 2023-01-31 プロヴィヴィ インコーポレイテッド 昆虫フェロモンの生成のための微生物及び関連する化合物
CN109207415B (zh) 2017-07-07 2022-09-16 苏州华赛生物工程技术有限公司 一种生产胞二磷胆碱的重组微生物及生产胞二磷胆碱的方法
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
WO2020047304A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Genomatica, Inc. Xylr mutant for improved xylose utilization or improved co-utilization of glucose and xylose
JP2020080705A (ja) * 2018-11-22 2020-06-04 トヨタ自動車株式会社 変異型デカルボニラーゼ遺伝子、当該変異型デカルボニラーゼ遺伝子を有する組換え微生物及びアルカンの製造方法
CN109486835B (zh) * 2018-12-05 2022-02-11 中国科学院合肥物质科学研究院 一种源于蓝藻的产烷烃关键基因突变子及其应用
JP7131416B2 (ja) * 2019-02-01 2022-09-06 トヨタ自動車株式会社 変異型デカルボニラーゼ遺伝子、当該変異型デカルボニラーゼ遺伝子を有する組換え微生物及びアルカンの製造方法
JP2020141560A (ja) 2019-03-04 2020-09-10 トヨタ自動車株式会社 新規アルデヒド合成酵素遺伝子、当該遺伝子を有する組換え微生物及びこれを用いたアルカンの製造方法
WO2023178193A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Genomatica, Inc. Acyl-acp thioesterase variants and uses thereof

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3149170A1 (de) 1980-12-15 1982-07-29 Institut Français du Pétrole, 92502 Rueil-Malmaison, Hauts-de-Seine Brennbare komposition, welche gasoel, methanol und einen fettsaeureester enthalten und als dieseltreibstoff brauchbar sind
US5000000A (en) 1988-08-31 1991-03-19 University Of Florida Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes
US5482846A (en) 1988-08-31 1996-01-09 University Of Florida Ethanol production in Gram-positive microbes
US5424202A (en) 1988-08-31 1995-06-13 The University Of Florida Ethanol production by recombinant hosts
US5028539A (en) 1988-08-31 1991-07-02 The University Of Florida Ethanol production using engineered mutant E. coli
US7053267B2 (en) 1990-03-16 2006-05-30 Calgene Llc Plant seed oils
WO1991016427A1 (en) 1990-04-24 1991-10-31 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
CA2099619C (en) 1990-12-20 2005-03-29 William D. Hitz Nucleotide sequences of soybean acyl-acp thioesterase genes
CA2079113A1 (en) * 1991-02-22 1992-08-23 Calgene, Inc. Seed plant fatty acyl reductase proteins and genes
JPH08510469A (ja) 1993-05-25 1996-11-05 オークランド ユニサービシーズ リミテッド ニトロベンジルマスタード四級塩およびその低酸素選択性細胞毒剤としての利用
US6583266B1 (en) 1993-08-19 2003-06-24 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to mycobacterium tuberculosis and leprae for diagnostics and therapeutics
US5807893A (en) 1993-11-18 1998-09-15 Voelker; Toni Alois Plant thioesterases and use for modification of fatty acid composition in plant seed oils
US5602030A (en) 1994-03-28 1997-02-11 University Of Florida Research Foundation Recombinant glucose uptake system
US6428767B1 (en) 1995-05-12 2002-08-06 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for identifying the source of carbon in 1,3-propanediol
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US20080172931A1 (en) 1996-11-18 2008-07-24 Bp Oil Internationa Limited Fuel composition
ATE323768T1 (de) 1997-06-05 2006-05-15 Calgene Llc Fett acyl-coa: fettalkohol o-acyltransferasen
RU2212447C2 (ru) 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
JP4024676B2 (ja) * 2000-11-17 2007-12-19 メタボリックス，インコーポレイテッド 脂肪酸生合成経路からの中間鎖長のポリヒドロキシアルカノエートの産生
AU2002302919A1 (en) 2001-02-22 2002-10-03 Institut Pasteur Comparative mycobacterial geneomics as a tool for identifying targets for the diagnosis, prophylaxis or treatment of mycobacterioses
US6686133B2 (en) 2001-03-29 2004-02-03 Agfa-Gevaert Photothermographic materials processable at lower temperatures and recording processes therefor
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
DE60329983D1 (de) 2002-03-01 2009-12-24 Monsanto Technology Llc Wachsestersynthase-dna-sequenz, protein und verwendungen davon
US7056714B2 (en) 2003-03-11 2006-06-06 University Of Iowa Research Foundation, Inc. Carboxylic acid reductase polypeptide, nucleotide sequence encoding same and methods of use
US7070958B2 (en) 2003-04-18 2006-07-04 Thrombolytic Science, Inc. Methods of making pro-urokinase mutants
US7608700B2 (en) 2004-03-08 2009-10-27 North Carolina State University Lactobacillus acidophilus nucleic acid sequences encoding stress-related proteins and uses therefor
WO2005087455A1 (en) 2004-03-18 2005-09-22 Sca Hygiene Products Ab Method and device for producing a multi-ply web of flexible material, such as paper and nonwoven, and multi-ply material produced by the method
US7183089B2 (en) 2004-05-21 2007-02-27 The Regents Of The University Of California Method for enhancing production of isoprenoid compounds
US7756833B2 (en) * 2004-09-22 2010-07-13 Microsoft Corporation Method and system for synthetic backup and restore
US7960519B2 (en) 2005-05-31 2011-06-14 Pierce Biotechnology, Inc. Extraction of cellular components with fatty acid derivatives
FR2888034B1 (fr) 2005-06-29 2010-10-08 Philippe Magnier Dispositif de prevention contre l'explosion d'un transformateur electrique
MX2008002278A (es) 2005-08-15 2008-04-09 Arizona Chem Acido graso de aceite de bogol bajo en azufre.
US7482480B2 (en) * 2005-10-10 2009-01-27 Council Of Scientific & Industrial Research Process for the preparation of hydrocarbon fuel
KR101090939B1 (ko) * 2005-12-12 2011-12-08 네스테 오일 오와이제이 베이스 오일
US7998339B2 (en) * 2005-12-12 2011-08-16 Neste Oil Oyj Process for producing a hydrocarbon component
US8535916B2 (en) 2006-02-13 2013-09-17 Ls9, Inc. Modified microorganisms and uses therefor
ITTO20060239A1 (it) 2006-03-30 2007-09-30 Rotthapharm S P A Formulazione per somministrazione orale con effetti salutistici sull'apparato cardiovascolare
US20100242345A1 (en) 2006-05-19 2010-09-30 LS9, Inc Production of fatty acids & derivatives thereof
US8110670B2 (en) 2006-05-19 2012-02-07 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
EP2024491B1 (en) * 2006-05-19 2014-11-19 LS9, Inc. Production of fatty acids and derivatives thereof
CN101490241A (zh) * 2006-05-19 2009-07-22 Ls9公司 脂肪酸及其衍生物的制备
WO2007142784A1 (en) 2006-05-31 2007-12-13 Archer-Daniels-Midland Company Enzymatic method of making aldehydes from fatty acids
DE102006054324A1 (de) 2006-11-17 2008-05-21 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur bildbasierten Vermessung
US8110093B2 (en) 2007-03-14 2012-02-07 Ls9, Inc. Process for producing low molecular weight hydrocarbons from renewable resources
AU2008230735A1 (en) * 2007-03-28 2008-10-02 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
US20090004715A1 (en) 2007-06-01 2009-01-01 Solazyme, Inc. Glycerol Feedstock Utilization for Oil-Based Fuel Manufacturing
US7897369B2 (en) * 2007-08-27 2011-03-01 Regents Of The University Of Minnesota Isoprenoid wax ester synthases, isoprenoid acyl CoA-synthetases, and uses thereof
AU2008304180B2 (en) 2007-09-27 2014-02-27 Genomatica, Inc. Reduction of the toxic effect of impurities from raw materials by extractive fermentation
TWI351779B (en) 2007-12-03 2011-11-01 Advance Smart Ind Ltd Apparatus and method for correcting residual capac
WO2009085278A1 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing olefins
DK2262901T3 (en) 2008-03-05 2019-01-21 Genomatica Inc ORGANISMS PRODUCING PRIMARY ALCOHOL
CA2722441C (en) * 2008-05-16 2021-01-26 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing hydrocarbons
US8232924B2 (en) 2008-05-23 2012-07-31 Alliant Techsystems Inc. Broadband patch antenna and antenna system
WO2010021711A1 (en) 2008-08-18 2010-02-25 Ls9, Inc. Systems and methods for the production of mixed fatty esters
JP2012504963A (ja) 2008-10-07 2012-03-01 エルエス９・インコーポレイテッド 脂肪アルデヒドを生産するための方法および組成物
CA3041892C (en) 2008-10-28 2022-03-15 REG Life Sciences, LLC Methods for producing a fatty alcohol in a host cell
AP2011005777A0 (en) 2008-12-23 2011-08-31 Ls9 Inc Methods and compositions related to thioesterase enzymes.
WO2010118410A1 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Ls9, Inc. Production of fatty acid derivatives
CA2758298A1 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Ls9, Inc. Production of commercial biodiesel from genetically modified microorganisms
EP2425007A4 (en) 2009-04-27 2013-01-02 Ls9 Inc PREPARATION OF FATTY ACID ESTERS
WO2010127318A2 (en) 2009-05-01 2010-11-04 The Regents Of The University Of California Product of fatty acid esters from biomass polymers
US7955820B1 (en) * 2009-07-09 2011-06-07 Joule Unlimited, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of n-alkanes
US7794969B1 (en) * 2009-07-09 2010-09-14 Joule Unlimited, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of n-alkanes
CN105969710A (zh) 2009-09-25 2016-09-28 Reg生命科学有限责任公司 脂肪酸衍生物的产生
WO2011062987A2 (en) 2009-11-17 2011-05-26 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing hydrocarbons
US8530221B2 (en) 2010-01-14 2013-09-10 Ls9, Inc. Production of branched chain fatty acids and derivatives thereof in recombinant microbial cells
US8859259B2 (en) 2010-02-14 2014-10-14 Ls9, Inc. Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols
US8372610B2 (en) 2010-09-15 2013-02-12 Ls9, Inc. Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells
EP2760997A4 (en) 2011-09-30 2015-02-11 Codexis Inc MUSHROOM PROTEASE

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