CN105112455A - 产生碳氢化合物的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本为描述了用于产生诸如醛、烷和烯的碳氢化合物的组合物和方法。某些碳氢化合物可用于生物燃料。

Description

产生碳氢化合物的方法和组合物
本申请是申请号为200980117663.9的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年5月16日提交的美国临时申请第61/053955号的优先权，在此将其内容全部并入。
发明背景
石油是地球上发现的、液体、气体或固体形式的有限的天然资源。石油主要由碳氢化合物组成，碳氢化合物主要由碳和氢组成。石油还含有大量的处于不同形式的其他元素，例如氮、氧或硫。
石油是宝贵资源，但是以相当大的金融和环境代价对石油产品进行开发。首先，必须发现石油资源。石油勘探是耗资并有风险的投资。勘探深水井的费用可以超过1亿美元。此外，不能保证这些井会含有石油。据估计，仅40％的钻井成为产生商业碳氢化合物的生产井。除经济费用外，石油勘探存在严重的环境代价。例如近海勘探扰乱周围海洋环境。
发现生产井后，必须以巨大代价从地球开采石油。在初次采收(primaryrecovery)中，地下的自然压力足以开采约20％的井中石油。当该自然压力降低时，如果经济上合算，则使用二次采收(secondrecovery)。通常，二次采收涉及通过例如水注射、天然气注射或气举等增加井压。使用二次采油，采收到另外5％至15％的石油。一旦二次采收方法不起作用，如果经济上合算，可以使用三次采收方法。三次方法涉及降低石油的粘度以使其更易开采。使用三次采收方法，采收到另外5％至15％的石油。因此，即使在最佳条件下，仅可以开采50％的井中石油。石油开采也存在环境代价。例如，石油开采可以导致大量石油渗漏上升至表面。此外，近海钻井涉及挖掘河床，这扰乱或破坏周围海洋环境。
因为石油矿藏不是在地球各处均匀发现的，所以石油必须从石油产生区长距离运输到石油消耗区。除运输费用外，还存在大规模油泄漏的环境风险。
从地球开采的原油在天然形式时具有少数商业用途。其是具有不同长度和复杂性的碳氢化合物(例如，石蜡(或烷)、烯烃(或烯)、炔、环烷(napthenes)(或环烷(cylcoalkanes))、脂肪族化合物、芳香族化合物等)的混合物。此外，原油含有其他有机化合物(例如含有氮、氧、硫等的有机化合物)和杂质(例如硫磺、盐、酸、金属等)。
因此，在商业上可以使用前，必须提炼并纯化原油。由于其高能量密度及其便利的可运输性，大部分石油被提炼为燃料，例如运输燃料(例如汽油、柴油、航空燃料等)、燃用油、液化石油气等。
原油还是用于产生石化产品的原材料的主要来源。两类主要的来自石油的原材料是短链烯烃(例如乙烯和丙烯)和芳香族化合物(例如苯和二甲苯异构体)。这些原材料来源于原油中较长链的碳氢化合物，这是通过以相当大的费用使用各种方法，例如催化裂化、蒸汽裂化或催化重整，裂化原油。这些原材料用于制造不能直接从原油提炼的石化产品，例如单体、溶剂、去垢剂或粘合剂。
来源于原油的原材料的一个实例是乙烯。乙烯被用于生产石化产品，例如聚乙烯、乙醇、氧化乙烯、乙二醇、聚酯、乙二醇醚、乙氧基化物、乙酸乙烯酯、1,2-二氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯、氯乙烯和聚氯乙烯。原材料的其他实例是丙烯，丙烯用于生产异丙醇、丙烯腈、聚丙烯、氧化丙烯、丙烯二醇、乙二醇醚、丁烯、异丁烯、1,3-丁二烯、合成橡胶、聚烯烃、α-烯烃、脂肪醇、丙烯酸、丙烯聚合物、氯化丙烯、环氧氯丙烷和环氧树脂。
然后，这些石化产品可以用于制造特种化学品，例如塑料、树脂、纤维、橡胶、药品、润滑剂或凝胶。可以产自石化材料的具体特种化学品为：脂肪酸、碳氢化合物(例如长链、支链、饱和的、不饱和的等)、脂肪醇、酯、脂肪醛、酮、润滑剂等。
特种化学品具有很多商业用途。脂肪酸在商业上被用作表面活性剂，例如在去垢剂和肥皂中。它们还可以被用作燃料中的添加剂、润滑油、涂料、漆、蜡烛、色拉油、起酥油、化妆品和乳化剂。此外，在橡胶产品中脂肪酸被用作促进剂活性剂。脂肪酸还可以被用作生产甲基酯、酰胺、胺、酰基氯、酐、乙烯酮二聚物以及过氧酸和酯的原料。
碳氢化合物具有很多商业用途。例如链较短的烷被用作燃料。甲烷和乙烷是天然气的主要成分。链较长的烷(例如5至16个碳)被用作运输燃料(例如汽油、柴油或航空燃料)。具有多于16个碳原子的烷是燃油和润滑油的重要组分。即使在室温下为固体的较长的烷也可以被用作，例如石蜡。含有约35个碳的烷见于用于路面(roadsurfacing)的沥青中。此外，可以裂化较长链的烷以生产商业上有用的较短链的碳氢化合物。
与短链烷类似，短链烯被用于运输燃料中。较长链的烯被用于塑料、润滑剂和合成润滑剂中。此外，烯被用作生产醇类、酯、增塑剂、表面活性剂、叔胺、增强型采油剂(enhancedoilrevoveryagent)、脂肪酸、硫醇、烯基琥珀酸酐、环氧化物、氯化烷、氯化烯、蜡、燃油添加剂和粘性流减阻剂。
脂肪醇具有很多商业用途。链较短的脂肪醇在化妆品和食品工业中，用作乳化剂、润滑剂和增稠剂。由于其两性分子属性，脂肪醇起非离子表面活性剂的作用，所述非离子表面活性剂可用作去垢剂。此外，脂肪醇被用于蜡、树胶、树脂、药物软膏和洗剂、润滑油添加剂、纺织品抗静电和整理剂、增塑剂、化妆品、工业溶剂和脂肪溶剂中。
酯具有很多商业用途。例如作为替代燃料的生物柴油是由酯(例如脂肪酸甲基酯、脂肪酸乙基酯等)组成。一些低分子量的酯是挥发性的，具有令人愉悦的气味，这使得它们可用作芳香剂或调味剂。另外，酯被用作漆、涂料和清漆的溶剂。此外，一些天然存在的物质，例如蜡、脂肪和油是由酯组成的。酯还被用作树脂和塑料中的软化剂、增塑剂、灭火剂以及汽油和油中的添加剂。此外，酯可以用于制造聚合物、胶片、纺织品、染料和药品。
醛用于生产很多特种化学品。例如，醛用于生产聚合物、树脂(例如胶木(Bakelite))、染料、调味剂、增塑剂、香水、药品和其他化学品。一些被用作溶剂、防腐剂或消毒剂。一些天然和合成的化合物，例如维生素和激素是醛。此外，很多糖含有醛基。
酮在商业上被用作溶剂。例如，丙酮常常被用作溶剂，但其也是制造聚合物的原材料。酮还用于漆、涂料、爆炸物、香水和纺织品加工中。此外，酮用于生产醇、烯、烷、亚胺和烯胺。
此外，原油是润滑剂的来源。来自石油的润滑剂通常由烯烃组成，特别是聚烯烃和α-烯烃。润滑剂可以从原油提炼或使用提炼自原油的原材料生产。
从原油获得这些特种化学品需要大量的金融投资以及大量的能量。因为原油中的长链碳氢化合物常常被裂化以产生较小的单体，其也是低效的过程。这些单体然后被用作生产更复杂的特种化学品的原材料。
除勘探、开采、运输和提炼石油的问题外，石油是有限的并逐渐减少的资源。估计世界石油消耗为每年300亿桶。据估计，以现有生产水平，世界石油储量预计在2050年前会耗竭。
最后，基于石油的燃料的燃烧释放温室气体(例如二氧化碳)和其他形式的空气污染(例如一氧化碳、二氧化硫等)。随着世界对燃料需求的增加，温室气体和其他形式的空气污染的排放也增加。大气中温室气体的累积导致增加全球变暖。因此，除局部破坏环境外(例如油泄漏、海洋环境的挖掘等)，燃烧石油还破坏全球环境。
由于石油所引起的内在挑战，存在对于不需要像石油一样被勘探、开采、长距离运输或大量提炼的可再生石油资源的需要。存在对于可以经济地生产而不会产生石油工业和基于石油的燃料的燃烧所产生的类型的环境破坏的可再生石油资源。基于相似原因，还存在对于通常来自石油的化学品的可再生资源的需要。
发明概述
本发明至少部分基于编码碳氢化合物生物合成多肽的蓝细菌基因的鉴定。因此，在一方面，本发明特征为产生碳氢化合物的方法，所述方法包括在宿主细胞中产生包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列的多肽或其变体，并从所述宿主细胞分离所述碳氢化合物。
在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36具有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽包含具有一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽具有脱羰酶活性。在其他实施方案中，所述多肽包含具有一个或多个保守型氨基酸取代的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列。例如，所述多肽包含一个或多个以下保守型氨基酸取代：诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的脂肪族氨基酸被另一脂肪族氨基酸替换；丝氨酸被苏氨酸替换；苏氨酸被丝氨酸替换；诸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基被另一酸性残基替换；诸如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺基的残基被另一携带酰胺基的残基替换；诸如赖氨酸和精氨酸的碱性残基被另一碱性残基交换；以及诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基被另一芳香族残基替换。在一些实施方案中，所述多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多的氨基酸取代、添加、插入或缺失。在一些实施方案中，所述多肽具有脱羰酶活性。
在其他实施方案中，所述多肽包含以下的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:37或SEQIDNO:38或SEQIDNO:39；或(ii)SEQIDNO:40以及(a)SEQIDNO:37、(b)SEQIDNO:38和(c)SEQIDNO:39中的任一个；或(iii)SEQIDNO:41或SEQIDNO:42或SEQIDNO:43或SEQIDNO:44。在某些实施方案中，所述多肽具有脱羰酶活性。
在另一方面，本发明特征为产生碳氢化合物的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35。在一些实施方案中，所述方法还包含从所述宿主细胞分离所述碳氢化合物。
在其他实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的互补物或其片段杂交，例如，在低严紧性、中严紧性、高严紧性或非常高的严紧性条件下。
在其他实施方案中，所述核苷酸序列编码包含以下的多肽：(i)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列；或(ii)具有一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含具有一个或多个保守型氨基酸取代的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽具有脱羰酶活性。
在其他实施方案中，所述核苷酸序列编码与包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列的多肽具有相同生物活性的多肽。在一些实施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35，或其片段。在其他实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的互补物或其片段杂交，例如在低严紧性、中严紧性、高严紧性或非常高的严紧性条件下。在一些实施方案中，所述生物活性是脱羰酶活性。
在一些实施方案中，所述方法包括用重组载体转化宿主细胞，所述重组载体包含与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组载体还包含可操作地连接到所述核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是发育调节性、细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性启动子。在具体实施方案中，所述重组载体包含至少一个选自以下的序列：(a)可操作地连接到所述核苷酸序列的调节序列；(b)可操作地连接到所述核苷酸序列的选择标记；(c)可操作地连接到所述核苷酸序列的标记序列；(d)可操作地连接到所述核苷酸序列的纯化部分；(e)可操作地连接到所述核苷酸序列的分泌序列；和(f)可操作地连接到所述核苷酸序列的引导序列(targetingsequence)。在某些实施方案中，所述核苷酸序列被稳定并入所述宿主细胞的基因组DNA，并且所述核苷酸序列的表达受可调型启动子区的控制。
在本文所述的任何方面中，所述宿主细胞可以选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞和细菌细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞。在其他实施方案中，所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞选自以下的属：埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、链孢霉属(Neurospora)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、根毛霉属(Rhizomucor)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、毛霉菌属(Mucor)、蚀丝霉属(Myceliophtora)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、金黄孢子菌属(Chrysosporium)、酵母属(Saccharomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophamonas)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)或链霉菌属(Streptomyces)。
在具体实施方案中，所述宿主细胞为迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)细胞、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)细胞、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)细胞、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)细胞、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)细胞、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)细胞、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)细胞、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)细胞、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞或解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)细胞。
在其他实施方案中，宿主细胞为康氏木霉(Trichodermakoningii)细胞、绿色木霉(Trichodermaviride)细胞、里氏木霉(Trichodermareesei)细胞、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)细胞、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)细胞、烟曲霉(Aspergillusfumigates)细胞、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)细胞、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)细胞、黑曲霉(Aspergillusniger)细胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞、特异腐质霉(Humicolainsolens)细胞、棉毛状腐质霉(Humicolalanuginose)细胞、混浊红球菌(Rhodococcusopacus)细胞、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)细胞或米黑毛酶(Mucormichei)细胞。
在其他实施方案中，所述宿主细胞是浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)细胞或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是放线菌(Actinomycetes)细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞。
在具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞、例如菌株B、菌株C、菌株K或菌株W大肠杆菌细胞。
在其他实施方案中，所述宿主细胞是蓝细菌宿主细胞。在具体实施方案中，所述蓝细菌宿主细胞是表1中列出的细胞。
在一些实施方案中，所述碳氢化合物由所述宿主细胞分泌
在某些实施方案中，所述宿主细胞超表达本文所述的底物。在一些实施方案中，所述方法还包括用编码本文所述的酶的核酸转化宿主细胞，并且所述宿主细胞超表达本文所述的底物。在其他实施方案中，所述方法还包括在至少一种本文所述的底物的存在下培养所述宿主细胞。在一些实施方案中，所述底物是脂肪酸衍生物、酰基ACP、脂肪酸、酰基CoA、脂肪醛、脂肪醇或脂肪酯。
在一些实施方案中，所述脂肪酸衍生物底物是不饱和脂肪酸衍生物底物、单不饱和脂肪酸衍生物底物或饱和脂肪酸衍生物底物。在其他实施方案中，所述脂肪酸衍生物底物是直链脂肪酸衍生物底物、支链脂肪酸衍生物底物或包括环状部分的脂肪酸衍生物底物。
在本文所述的方面的某些实施方案中，所产生的碳氢化合物是烷。在一些实施方案中，所述烷是C3-C25烷。例如，所述烷是C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24或C25烷。在一些实施方案中，所述烷是十三烷、甲基十三烷、十九烷、甲基十九烷、十七烷、甲基十七烷、十五烷或甲基十五烷。
在一些实施方案中，所述烷是直链烷、支链烷或环状烷。
在某些实施方案中，所述方法还包括在饱和脂肪酸衍生物的存在下培养宿主细胞，并且所产生的碳氢化合物是烷。在某些实施方案中，所述饱和脂肪酸衍生物是C6-C26脂肪酸衍生物底物。例如，所述脂肪酸衍生物底物是C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25或C26脂肪酸衍生物底物。在具体实施方案中，所述脂肪酸衍生物底物是2-甲基二十烷醛、二十烷醛、十八烷醛、十四烷醛、2-甲基十八烷醛、硬脂醛或棕榈醛。
在一些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞或从培养基分离所述烷。在其他实施方案中，所述方法还包括裂化或提炼所述烷。
在本文所述的方面的某些实施方案中，所产生的碳氢化合物是烯。在一些实施方案中，所述烯是C3-C25烯。例如，所述烯是C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24或C25烯。在一些实施方案中，所述烯是十五烯、十七烯、甲基十五烯或甲基十七烯。
在一些实施方案中，所述烯是直链烯、支链烷或环状烯。
在某些实施方案中，所述方法还包括在不饱和脂肪酸衍生物的存在下培养宿主细胞，并且所产生的碳氢化合物是烯。在某些实施方案中，所述不饱和脂肪酸衍生物是C6-C26脂肪酸衍生物底物。例如，所述脂肪酸衍生物底物是C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25或C26不饱和脂肪酸衍生物底物。在具体实施方案中，所述脂肪酸衍生物底物是十八烯醛、十六烯醛、甲基十六烯醛或甲基十八烯醛。
在另一方面，本发明特征为遗传改造的微生物，其包含稳定并入所述微生物的基因组DNA的外源控制序列。在一个实施方案中，所述控制序列被整合到多核苷酸的上游，该多核苷酸包含与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少约70％的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35。
在一些实施方案中，所述多核苷酸对于所述微生物是内源的。在一些实施方案中，所述微生物相对于野生型微生物表达水平增高的碳氢化合物。在一些实施方案中，所述微生物是蓝细菌(cyanobacterium)。
在另一方面，本发明特征为制造碳氢化合物的方法，所述方法包括在适于基因表达的条件下，培养本文所述的遗传改造的微生物，并分离所述碳氢化合物。
在另一方面，本发明特征为制造碳氢化合物的方法，所述方法包括使底物与以下接触：(i)与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列具有至少70％的同一性的多肽或其变体；(ii)与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少70％的同一性的核苷酸序列所编码的多肽或其变体；(iii)包含SEQIDNO:37、38或39的氨基酸序列的多肽；(iv)包含SEQIDNO:40以及(a)SEQIDNO:37、(b)SEQIDNO:38和(c)SEQIDNO:39中的任一个的氨基酸序列的多肽；或(v)SEQIDNO:41、42、43或44。在一些实施方案中，所述多肽具有脱羰酶活性。
在一些实施方案中，所述多肽与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同一性。在一些实施方案中，所述多肽具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽由与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述多肽由具有SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，所述生物底物是脂肪酸衍生物、酰基ACP、脂肪酸、酰基CoA、脂肪醛、脂肪醇或脂肪酯。
在一些实施方案中，所述底物是饱和脂肪酸衍生物，并且所述碳氢化合物是烷，例如C3-C25烷。例如，所述烷是C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24或C25烷。在一些实施方案中，所述烷是十三烷、甲基十三烷、十九烷、甲基十九烷、十七烷、甲基十七烷、十五烷或甲基十五烷。
在一些实施方案中，所述烷是直链烷、支链烷或环状烷。
在一些实施方案中，所述饱和脂肪酸衍生物是2-甲基二十烷醛、二十烷醛、十八烷醛、十四烷醛、2-甲基十八烷醛、硬脂醛或棕榈醛。
在其他实施方案中，所述生物底物是不饱和脂肪酸衍生物，并且所述碳氢化合物是烯，例如C3-C25烯。例如，所述烯是C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24或C25烯。在一些实施方案中，所述烯是十五烯、十七烯、甲基十五烯或甲基十七烯。
在一些实施方案中，所述烯是直链烯、支链烷或环状烯。
在一些实施方案中，所述不饱和脂肪酸衍生物是十八烯醛、十六烯醛、甲基十六烯醛或甲基十八烯醛。
在另一方面，本发明特征为由本文所述的任何方法或微生物所产生的碳氢化合物。在具体实施方案中，所述碳氢化合物是δ13C为约-15.4或更高的烷或烯。例如，所述烷或烯的为δ13C约-15.4至约-10.9，例如约-13.92至约-13.84。在其他实施方案中，所述烷或烯的fM 14C为至少约1.003。例如，所述烷或烯的fM 14C为至少约1.01或至少约1.5。在一些实施方案中，所述烷或烯的fM 14C为约1.111至约1.124。
在另一方面，本发明特征为包括由本文所述的任何方法或微生物所产生的碳氢化合物的生物燃料。在具体实施方案中，所述碳氢化合物是δ13C为约-15.4或更高的烷或烯。例如，所述烷或烯的δ13C为约-15.4至约-10.9，例如约-13.92至约-13.84。在其他实施方案中，所述烷或烯具有至少约1.003的fM 14C。例如，所述烷或烯的fM 14C为至少约1.01或至少约1.5。在一些实施方案中，所述烷或烯的fM 14C为约1.111至约1.124。在一些实施方案中，所述生物燃料是柴油、汽油或喷气燃料(jetfuel)。
在另一方面，本发明特征为由SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的不多于约500个核苷酸组成的分离的核酸。在一些实施方案中，所述核酸由SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的不多于约300个核苷酸、不多于约350个核苷酸、不多于约400个核苷酸、不多于约450个核苷酸、不多于约550个核苷酸、不多于约600个核苷酸或不多于约650个核苷酸组成。在一些实施方案中，所述核酸编码具有脱羰酶活性的多肽。
在另一方面，本发明特征为由不多于约99％、不多于约98％、不多于约97％、不多于约96％、不多于约95％、不多于约94％、不多于约93％、不多于约92％、不多于约91％、不多于约90％、不多于约85％或不多于约80％的SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的核苷酸组成的分离的核酸。在一些实施方案中，所述核酸编码具有脱羰酶活性的多肽。
在另一方面，本发明特征为由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的不多于约200、不多于约175、不多于约150或不多于约100个氨基酸组成的分离的多肽。在一些实施方案中，所述多肽具有脱羰酶活性。
在另一方面，本发明特征为由不多于约99％、不多于约98％、不多于约97％、不多于约96％、不多于约95％、不多于约94％、不多于约93％、不多于约92％、不多于约91％、不多于约90％、不多于约85％或不多于约80％的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸组成的分离的多肽。在一些实施方案中，所述多肽具有脱羰酶活性。
定义
在整个本说明书中，可以使用缩写基因名称或多肽名称进行引用，但是应当理解到，该缩写基因或多肽名称表示基因或多肽的种类。这些基因名称包括编码相同多肽和具有相同生理功能的同源多肽的所有基因。多肽名称包括具有相同活性(例如催化相同基础化学反应活性)的所有多肽。
本文引用的登录号来自美国国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth,U.S.A)所维护的NCBI数据库(国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation))。除非另作说明，登录号按照截止到2009年四月的数据库中提供的。
EC号由国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(NC-IUBMB))(可获取自http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)制定。本文引用的EC号来自由东京大学部分资助的京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomics)所维护的KEGG配体数据库。除非另作说明，EC号按照截止到2008年三月的数据库中提供的。
本文所用冠词“a”和“an”是指该冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。作为实例，“元件(anelement)"表示一个元件或多于一个元件。
本文所用术语“约”表示给定数值的±20％的值。因此，“约60％”表示在60±(60的20％)之间的值(即48至70)。
如本文所用术语“醛”表示具有通式RCHO的碳氢化合物，所述RCHO特征为不饱和羰基(C＝O)。在优选的实施方案中，所述醛是产生自脂肪酸或脂肪酸衍生物的任何醛。在一个实施方案中，R基长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳。
如本文所用的“醛生物合成基因”或“醛生物合成多核苷酸”是编码醛生物合成多肽的核酸。
如本文所用的“醛生物合成多肽”是作为醛的生物合成途径的部分的多肽。这些多肽可以作用于生物底物以产生醛。在一些情况下，所述醛生物合成多肽具有还原酶活性。
如本文所用的术语“烷”表示仅含有单一碳-碳键的碳氢化合物。
如本文所用的“烷生物合成基因”或“烷生物合成多核苷酸”是编码烷生物合成多肽的核酸。
如本文所用的“烷生物合成多肽”是作为烷的生物合成途径的部分的多肽。这些多肽可以作用于生物底物以产生烷。在一些情况下，所述烷生物合成多肽具有脱羰酶活性。
如本文所用的“烯生物合成基因”或“烯生物合成多核苷酸”是编码烯生物合成多肽的核酸。
如本文所用的“烯生物合成多肽”是作为烯的生物合成途径的部分的多肽。这些多肽可以作用于生物底物以产生烯。在一些情况下，所述烯生物合成多肽具有脱羰酶活性。
如本文所用的术语“减弱”表示削弱、降低或缩小。例如，可以通过修饰多肽来减弱多肽以降低其活性(例如，通过修饰编码所述多肽的核苷酸序列)。
如本文所用的术语“生物柴油”表示可以作为来源于石油的柴油的替代品的生物燃料。生物柴油可以以被称为“纯(neat)”生物柴油的纯品形式或作为以任何浓度与基于石油的柴油的混合物用于内燃柴油发动机。生物柴油可以包括酯或碳氢化合物，例如醛和烷。
如其中所用的术语“生物燃料”是指来源于生物量的任何燃料。生物燃料可以替代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括运输工具燃料(例如汽油、柴油、喷气燃料(jetfuel)等)、燃用燃料和发电燃料。生物燃料是可再生能源。
如本文使用，术语“生物量”是指来源于生物材料的碳源。生物量可以被转变为生物燃料。生物量的一个示例性来源是植物物质。例如，玉米、甘蔗或柳枝稷可以用作生物量。生物量的另一非限制性实例是动物物质，例如牛粪。生物量还包括来自工业、农业、林业和家庭的废品。可以用作生物量的这些废品的实例是发酵废渣、秸秆、无用杂物、污水、垃圾和剩余食物。生物量还包括例如碳水化合物(例如单糖、二糖或多糖)的碳源。
如本文所用的短语“碳源”是指适于用作原核或简单真核细胞生长的碳的来源的底物或化合物。碳源可以是不同形式的，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽和气体(例如CO和CO2)。这些包括，例如各种单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如木糖和阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖、麦芽糖和松二糖；纤维素原料，例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；饱和或不饱和脂肪酸酯，例如琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯；醇，例如乙醇或其混合物。碳源还可以是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。优选的碳源是生物量。另一优选的碳源是葡萄糖。
如本文所用的“降低浊点的添加剂”是添加到组合物以减少或降低溶液的浊点的添加剂。
如本文所用的短语“液体的浊点”表示溶解的固体不再完全可溶的温度。在该温度下，固体开始作为第二相沉淀，给予液体浑浊的外观。在石油工业中，浊点是指这样的温度：在该温度下固化物质或其他重碳氢化合物在原油、提炼油或燃料中结晶以形成浑浊的外观。固化物质的存在影响该液体的流动特性、该液体堵塞燃料过滤器、喷嘴的倾向等、固化物质在冷表面(例如管道或热交换器污垢)上的聚积以及该液体与水的乳化特性。
如果两个序列的每个碱基都匹配(即能够形成WatsonCrick碱基对)，则核苷酸序列与另一核苷酸序列是“互补的”。术语“互补链”在本文中与术语“互补物”互换使用。核酸链的互补物可以是编码链的互补物或非编码链的互补物。
如本文所用的术语“足以允许表达的条件”表示允许宿主细胞产生诸如本文所述的多肽、醛或烷的所需产物的任何条件。合适的条件包括，例如发酵条件。发酵条件可以包含很多参数，例如温度范围、通气水平和培养基组分。这些条件中每一个单独地并联合地允许宿主细胞生长。示例性培养基包括培养液或胶。通常，所述培养基包括诸如葡萄糖、果糖、纤维素等的碳源，该碳源可以直接被宿主细胞代谢。此外，培养基中可以使用酶以便于动员(例如淀粉或纤维素的解聚为可发酵的糖)和随后碳源的代谢。
为了确定条件是否足以允许表达，可以将宿主细胞培养例如约4、8、12、24、36或48小时。培养中和/或培养后，可以获取样品并分析样品以确定该条件是否允许表达。例如，可以测试样品或宿主细胞在其中生长的培养基中的宿主细胞的所需产物的存在。当测试产物的存在时，可以使用诸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS的检测。
应当理解到，本文所述的多肽可以具有另外的对于多肽功能没有本质影响的保守型或非必需氨基酸取代。特定取代是否会被允许(即不会不利地影响例如脱羧酶活性的所需生物性质)，可以按照Bowieetal.,Science(1990)247:13061310中所述进行测定。“保守型氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
如本文所用的“控制元件”表示转录控制元件。控制元件包括启动子和增强子。术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指作为激活基因表达的开关发挥功能的DNA序列。如果基因被激活，认为其被转录或参与转录。转录涉及由基因合成mRNA。因此，启动子充当转录调节元件并且还提供基因转录为mRNA的起始位点。控制元件与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用(Maniatisetal,Science236:1237,1987)。
如本文所用的术语“酯合酶”表示能够产生脂肪酯的肽。更具体而言，酯合酶是将硫酯转变为脂肪酯的肽。在优选的实施方案中，所述酯合酶将硫酯(例如酰基CoA)转变为脂肪酯。
在可选的实施方案中，酯合酶使用硫酯和醇作为底物产生脂肪酯。酯合酶能够使用短和长链硫酯作为底物。此外，酯合酶能够使用短和长链醇作为底物。
酯合酶的非限制性实例是蜡合酶、蜡酯合酶、酰基CoA:醇转酰酶、酰基转移酶和脂肪酰辅酶A:脂肪醇酰基转移酶。示例性的酯合酶被分在酶分类号EC2.3.1.75中。示例性的GenBank登录号提供于图40中。
如本文使用，术语“脂肪酸”表示具有通式RCOOH的羧酸。R表示脂肪族基团，优选地表示烷基。R可以包含约4到约22个碳原子。脂肪酸可以为饱和的、单不饱和的或多不饱和的。在优选的实施方案中，所述脂肪酸由脂肪酸生物合成途径产生。
如本文所用的术语“脂肪酸生物合成途径”表示产生脂肪酸的生物合成途径。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸酶，所述脂肪酸酶可以按照本文所述经改造产生脂肪酸，并且在一些实施方案中可以与其他酶一起表达以产生具有所需碳链特征的脂肪酸。
如本文所用的术语“脂肪酸衍生物”表示部分地产生于生产宿主生物体的脂肪酸生物合成途径的产物。“脂肪酸衍生物”还包括部分地产生于酰基ACP或酰基ACP衍生物的产物。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸合酶酶类，所述脂肪酸合酶酶类可以按照本文所述经改造产生脂肪酸衍生物，并且在一些实施例中可以与其他酶一起表达以产生具有所需碳链特征的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括，例如脂肪酸、酰基CoA、脂肪醛、短和长链醇、碳氢化合物、脂肪醇和酯(例如蜡、脂肪酸酯或脂肪酯)。
如本文所用的术语“脂肪酸衍生酶”表示在脂肪酸衍生物的产生中可以被表达或超表达的所有酶。这些酶在本文统称为脂肪酸衍生酶。这些酶可以是脂肪酸生物合成途径的一部分。脂肪酸衍生酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、酰基CoA合酶、酰基CoA还原酶、醇脱氢酶、醇酰基转移酶、脂肪醇形成酰基CoA还原酶、酯合酶、醛生物合成多肽和烷生物合成多肽。脂肪酸衍生酶将底物转变为脂肪酸衍生物。在一些实施例中，所述底物可以是被脂肪酸衍生酶转变为不同的脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物。
如本文所用的术语“脂肪醇形成肽”表示能够催化酰基CoA转变为脂肪醇的肽，包括脂肪醇形成酰基CoA还原酶(FAR，EC1.1.1.*)、酰基CoA还原酶(EC1.2.1.50)或醇脱氢酶(EC1.1.1.1)。此外，本领域技术人员应当理解到，一些脂肪醇形成肽还会催化其他反应。例如，除脂肪酸外，一些酰基CoA还原酶肽会接受其他底物。因此，还包括这些非特异性肽。编码脂肪醇形成肽的核酸序列是本领域已知的，并且这些肽是可公开获取的。示例性的GenBank登录号提供于图40中。
如本文所用的“脂肪酸酶”表示参与脂肪酸生物合成的任何酶。脂肪酸酶可以在宿主细胞中表达或超表达以产生脂肪酸。脂肪酸酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶和硫酯酶。
如本文所用的术语“脂肪酯”表示酯。在优选的实施方案中，脂肪酯是产生自脂肪酸的任何酯，例如脂肪酸酯。在一个实施方案中，脂肪酯含有A侧(即连接于羧基氧的碳链)和B侧(即包含母体羧基的碳链)。在优选的实施方案中，当所述脂肪酯来源于脂肪酸生物合成途径时，A侧由醇贡献，并且B侧由脂肪酸贡献。任何醇可以用于形成脂肪酯的A侧。例如，所述醇可以来自脂肪酸生物合成途径。可选地，所述醇可以通过非脂肪酸生物合成途径产生。此外，所述醇可以是外源提供的。例如，在脂肪酯是由生物体产生的情况下，所述醇可以提供在发酵液(fermentationbroth)中。可选地，例如在脂肪酯是由还产生醇的生物体产生的情况下，诸如脂肪酸或乙酸的羧酸可以是外源提供的。
包含A侧或B侧的碳链可以是任何长度。在一个实施方案中，酯的A侧的长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或18个碳。酯的B侧的长度为至少约4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个碳。A侧和/或B侧可以是直链或支链。支链可以具有一个或多个分支点。此外，支链可以包括环状分支。而且，A侧和/或B侧可以是饱和的或不饱和的。如果是不饱和的，A侧和/或B侧可以具有一个或多个不饱和点。
在一个实施方案中，脂肪酯是生物合成产生的。在该实施方案中，首先脂肪酸被“活化”。“活化的”脂肪酸的非限制性实例是酰基CoA、酰基ACP和酰基磷酸盐。酰基CoA可以是脂肪酸生物合成或降解的直接产物。此外，酰基CoA可以由游离脂肪酸、CoA或三磷酸腺苷(ATP)合成。产生酰基CoA的酶的实例是酰基CoA合酶。
在脂肪酸被活化后，其可以被容易地转移到接受体亲核体。示例性的亲核体为醇、硫醇或磷酸盐。
在一个实施方案中，脂肪酯是蜡。蜡可以来自长链醇和长链脂肪酸。在另一实施方案中，所述脂肪酯可以来自脂肪酰基硫酯和醇。在另一实施方案中，所述脂肪酯是脂肪酸硫酯，例如脂肪酰辅酶A(CoA)。在其他实施方案中，所述脂肪酯是脂肪酰基泛酸酯、酰基载体蛋白(ACP)或脂肪磷酸酯。脂肪酯具有很多用途。例如，脂肪酯可以被用作生物燃料。
如本文所用的“现代碳比例(fractionofmoderncarbon)”或“fM”与分别由称为草酸标准HOxI和HOxII的国家标准技术研究院(NationalInstituteofStandardsandTechnology(NIST))标准参考物(SRMs)4990B和4990C所定义的具有相同意义。基本定义涉及0.95倍的14C/12C同位素比例HOxI(参考AD1950)。这粗略地等于衰变校正的工业革命前树木(decay-correctedpre-IndustrialRevolutionwood)。对于现今生命生物圈(植物物质)而言，fM约为1.1。
可以按照以下计算两个序列之间“同源性”。序列以最佳比较目的进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入空位用于最佳比对，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。在优选的实施方案中，用于比较目的的而比对的参考序列长度为参考序列长度的至少约30％、优选地至少约40％、更优选地至少约50％、更优选地至少约60％并且更优选地至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。然后比较位于对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(如本文所用的，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列所共享的相同位置数的函数，这考虑到空位数和每个空位的长度，为了两个序列的最佳比对需要引入空位。
可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同源性百分比的测定。在优选的实施方案中，使用以下测定两个氨基酸序列之间的同源性百分比：NeedlemanandWunsch(1970)、J.Mol.Biol.48:444453的算法，其被并入GCG软件包中的GAP程序中，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一优选的实施方案中，使用以下测定两个核苷酸序列之间的同源性百分比：GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的参数组(和如果操作者不确定应当应用哪些参数确定分子是否在要求的同源性限制内而应该使用的参数组)是具有12的空位罚分、4的空位延伸罚分和5的移码空位罚分的Blossum62评分矩阵。
如本文所用的“宿主细胞”是用于产生本文所述的产物(例如本文所述的醛或烷)的细胞。可以改造宿主细胞以表达或超表达所选择的基因或具有所选择的基因的减弱的表达。宿主细胞的非限制性实例包括植物、动物、人、细菌、酵母或丝状真菌细胞。
如本文所用的术语“在低严紧性、中严紧性、高严紧性或非常高的严紧性条件下杂交”描述用于杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可以见于CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物学实验技术),JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。该参考资料中描述了水性和非水性方法并且可以使用任一方法。本文涉及的具体杂交条件如下：1)低严紧性杂交条件在约45℃下、在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，然后是在至少50℃下、在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严紧性条件，洗涤温度可以升至55℃)；2)中严紧性杂交条件在约45℃下在、在6×SSC中，然后是在60℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严紧性杂交条件在约45℃的6×SSC中，然后是在65℃下、在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及优选地4)非常高严紧性杂交条件为65℃的0.5M磷酸钠、7％SDS，然后是在65℃下、在0.2×SSC、1％SDS中洗涤一次或多次。除非另作规定，非常高的严紧性条件(4)是优选的条件。
本文中涉及诸如DNA或RNA的核酸所用的术语“分离的”是指分别从所述核酸的天然来源中存在的其他DNA或RNA中隔离的分子。此外，“分离的核酸”包括核酸片段，例如不是天然存在的片段。本文所用的术语“分离的”还指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且包括纯化的内源多肽和重组多肽两者。当核酸或多肽是通过重组DNA技术产生时，本文使用的术语“分离的”还指基本上游离于细胞物质、病毒物质或培养基的核酸或多肽。当核酸或多肽是化学合成时，本文所用的术语“分离的”还指基本上游离于化学前体或其他化学品的核酸或多肽。
如本文所用的“细胞中的基因表达水平”是指由所述细胞中基因编码的mRNA、前体mRNA新生转录物、转录加工中间体、成熟mRNA和/或降解产物的水平。
如本文所用的术语“微生物”表示来自古菌域、细菌域和真核域的原核和真核微生物种类，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物。如本文所用的术语“微生物细胞”表示来自微生物的细胞。
如本文所用的术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)以及适当情况下，指核糖核酸(RNA)。该术语还包括产生自核苷酸类似物的RNA或DNA的类似物，以及适用于所述实施方案的单链(有义或反义)和双链多核苷酸、EST、染色体、cDNA、mRNA和rRNA。
如本文所用的术语“可操作地连接”表示所选择的核苷酸序列(例如编码本文所述的多肽)与启动子接近以允许所述启动子调节该选择的核苷酸序列的表达。此外，按照转录和翻译的方向，所述启动子位于所述选择的核苷酸序列的上游。“可操作地连接”表示将核苷酸序列和调节序列连接以便当合适的分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时允许基因表达。
本文所用术语“或”表示术语“和/或”并且与术语“和/或”交换使用，除非上下文明确表示并非如此。
如本文所用的“超表达”表示在细胞中以高于对应野生型细胞中正常表达浓度的浓度表达核酸、多肽或碳氢化合物或使之被表达。例如，当在重组宿主细胞中多肽以与其在相同种类的非重组宿主细胞中的浓度相比更高的浓度存在时，所述多肽在所述重组宿主细胞中能够“超表达”。
如本文所用的“分配系数”或“P”定义为化合物在有机相中的平衡浓度除以在水相中(例如发酵液)平衡时的浓度。在本文所述的两相系统的一个实施方案中，生产过程中所述有机相是由醛或烷形成的。但是，在一些实施例中，可以例如通过提供辛烷层来提供有机相以便于产物分离。当描述两相系统时，化合物的分配特性可以描述为logP。例如，logP为1的化合物会10:1分配到有机相。logP为-1的化合物会1:10分配到有机相。通过选择合适的发酵液和有机相，具有高logP值的醛或烷在发酵容器中也会分离到有机相中，即使处于很低的浓度。
如本文所用的术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”表示通过例如分离或隔离从分子的环境中移除或分离所述分子。“基本上纯化的”分子为至少约60％、优选地至少约75％以及更优选地至少约90％游离于与其相关的其他组分。如本文所用的这些术语还指从样品中去除污染物。例如，污染物的去除可以导致样品中醛或烷的百分比增加。例如，当醛或烷在宿主细胞中产生时，可以通过去除宿主细胞蛋白纯化醛或烷。纯化后，样品中醛或烷的百分比增加。
术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”不需要绝对纯。它们是相对的术语。因此，例如当醛或烷在宿主细胞中产生时、纯化的醛或纯化的烷是基本与其他细胞组分(例如核酸、多肽、脂质、碳水化合物或其他碳氢化合物)隔离的醛或烷。在另一实施例中，纯化的醛或纯化的烷制剂是这样的制剂，在该制剂中，所述醛或烷基本游离于例如可能存在于后续发酵的那些污染物。在一些实施方案中，当样品重量的至少约50％是由醛或烷组成时，所述醛或烷是纯化的。在其他实施方案中，当样品重量的至少约60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多是由醛或烷组成时，所述醛或烷是纯化的。
如本文使用，术语“重组多肽”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常将编码所表达的多肽或RNA的DNA插入合适的表达载体，并且所述表达载体接下来用于转化宿主细胞以产生所述多肽或RNA。
如本文所用的术语“基本相同”(或“基本同源”)是用于指含有足够数量的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同的(例如具有相似侧链，例如保守氨基酸取代)氨基酸残基或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，这样所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。
如本文所用的术语“合酶”表示催化合成过程的酶。如本文所用的术语合酶包括合酶、合成酶和连接酶。
如本文所用的术语“转染”表示将核酸(例如通过表达载体)通过核酸介导的基因转移引入到受体细胞。
如本文所用的“转化”是指这样的过程，在该过程中，细胞的基因型由于细胞摄入外源核酸而改变。这可以导致表达重组形式的RNA或多肽的转化的细胞。在由转移的基因反义表达的情况下，天然存在形式的多肽的表达被破坏。
如本文使用，“转运蛋白”是便于一种或多种化合物移入和/或移出细胞器和/或细胞的多肽。
如本文所用，多肽X的“变体”是指具有多肽X的氨基酸序列的多肽，其中一个或多个氨基酸残基被改变。所述变体可以具有保守型改变或非保守型改变。使用本领域熟知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR)，可以找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不影响生物活性的指导。
在用于多核苷酸序列的情况下，术语“变体”可以包括与基因或其编码序列的多核苷酸序列相关的多核苷酸序列。该定义还可以包括，例如“等位基因”变体、“剪接”变体、“物种”变体或“多态性”变体。剪接变体可以与参考多核苷酸具有显著的同一性，但是由于在mRNA加工中的可选的外显子剪接，会通常具有更多或更少的多核苷酸数。对应的多肽可以具有另外的功能结构域或结构域缺失。物种变体是在物种之间彼此不同的多核苷酸序列。得到的多肽通常会具有显著的相对于彼此的氨基酸同一性。多态性变体是在给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列中的变异。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运另一核酸的核酸分子，所述核酸分子连接到所述另一核酸。一种有用的载体是附加体(即能够染色体外的复制的核酸)。有用的载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。能够指导基因的表达的载体在本文被称为“表达载体”，所述载体被可操作地连接到所述基因。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体经常是“质粒”的形式，所述“质粒”通常是指在其载体形式时不与染色体结合的环状双链DNA环。在本说明书中，因为质粒是最通常使用的载体形式，所以“质粒”和“载体”是交换使用的。但是，还包括发挥等同功能并随后至今成为本领域已知的表达载体的这些其他形式。
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员通常理解的具有相同的意义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，仍然在下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考资料通过引用全文并入。如有冲突，以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅是举例说明并不意图限制。
根据下文的详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优势会清晰。
附图简述
图1：上图是海洋原绿球菌(Prochlorococcusmarinus)CCMP1986细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪；下图是上图的7.55分钟时的峰的质量裂解谱(massfragmentationpattern)。
图2：上图是点状念珠蓝细菌(Nostocpunctiforme)PCC73102细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪；下图是上图的8.73分钟时的峰的质量裂解谱。
图3：上图是无类囊体蓝细菌(Gloeobaceterviolaceus)ATCC29082细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪；下图是上图的8.72分钟时的峰的质量裂解谱。
图4：上图是集胞蓝细菌(Synechocysticsp.)PCC6803细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪；下图是上图的7.36分钟时的峰的质量裂解谱。
图5A是集胞蓝细菌(Synechocystissp.)PCC6803野生型细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图5B是具有sll0208和sll0209基因缺失的集胞蓝细菌PCC6803细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图6A是大肠杆菌MG1655野生型细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图6B是表达细长聚球蓝细菌(Synechococcuselongatus)PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图7是表达蓝丝菌(Cyanothecesp.)ATCC51142cce_1430(YP_001802846)(SEQIDNO:69)的大肠杆菌细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图8A是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400610(Synpcc7942_1593)(SEQIDNO:1)的大肠杆菌细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图8B描述图8A在6.98分钟时的峰和十五烷的质量裂解谱。图8C描述图8A在8.12分钟时的峰和8-十七烯的质量裂解谱。
图9是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP00108838)(SEQIDNO:5)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图10是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和集胞蓝细菌PCC6803sll0208(NP442147)(SEQIDNO:3)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图11是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和念珠蓝细菌(Nostocsp.)PCC7210alr5283(NP489323)(SEQIDNO:7)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图12是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密码子优化的海滨蓝藻菌(Acaryochlorismarina)MBIC11017AM1_4041(YP_001518340)(SEQIDNO:46)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图13是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密码子优化的细长嗜热聚球蓝细菌(Thermosynechococcuselongatus)BP-1tll1313(NP_682103)(SEQIDNO:47)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图14是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密码子优化的聚球蓝细菌(Synechococcussp.)JA-3-3AbCYA_0415(YP_473897)(SEQIDNO:48)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图15是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和无类囊体蓝细菌PCC7421gll3146(NP926092)(SEQIDNO:15)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图16是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密码子优化的海洋原绿球菌MIT9313PMT1231(NP895059)(SEQIDNO:49)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图17是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和海洋原绿球菌CCMP1986PMM0532(NP892650)(SEQIDNO:19)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图18是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密码子优化的海洋原绿球菌NATL2APMN2A_1863(YP_293054)(SEQIDNO:51)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图19表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密码子优化的聚球蓝细菌RS9917RS9917_09941(ZP_01079772)(SEQIDNO:52)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图20是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密码子优化的聚球蓝细菌RS9917RS9917_12945(ZP_01080370)(SEQIDNO:53)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图21是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和蓝丝菌ATCC51142cce_0778(YP_001802195)(SEQIDNO:27)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图22是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和蓝丝菌PCC7425Cyan7425_0398(YP_002481151)(SEQIDNO:29)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图23是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和蓝丝菌PCC7425Cyan7425_2986(YP_002483683)(SEQIDNO:31)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图24A是表达海洋原绿球菌CCMP1986PMM0533(NP_892651)(SEQIDNO:71)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图24B是表达海洋原绿球菌CCMP1986PMM0533(NP_892651)(SEQIDNO:71)和海洋原绿球菌CCMP1986PMM0532(NP_892650)(SEQIDNO:19)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图25A是大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图25B是表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041(YP_001518340)(SEQIDNO:9)的大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图26A是表达集胞蓝细菌PCC6803sll0209(NP_442146)(SEQIDNO:67)的大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图26B是表达集胞蓝细菌PCC6803sll0209(NP_442146)(SEQIDNO:67)和集胞蓝细菌PCC6803sll0208(NP_442147)(SEQIDNO:3)的大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图27A是表达耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)菌株MC2155MSMEG_5739(YP_889972)(SEQIDNO:85)的大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图27B是表达耻垢分枝杆菌菌株MC2155MSMEG_5739(YP_889972)(SEQIDNO:85)和点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:5)的大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图28是大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD细胞产生的碳氢化合物的图示，所述细胞单独表达耻垢分枝杆菌菌株MC2155MSMEG_5739(YP_889972)(SEQIDNO:85)或表达耻垢分枝杆菌菌株MC2155MSMEG_5739(YP_889972)(SEQIDNO:85)与以下的组合：念珠蓝细菌PCC7120alr5283(SEQIDNO:7)、点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(SEQIDNO:5)、海洋原绿球菌CCMP1986PMM0532(SEQIDNO:19)、无类囊体蓝细菌PCC7421gll3146(SEQIDNO:15)、聚球蓝细菌RS9917_09941(SEQIDNO:23)、聚球蓝细菌RS9917_12945(SEQIDNO:25)或海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041(SEQIDNO:9)。
图29A是I型核糖核酸酶还原酶亚基β蛋白RNRβ的三维结构展示。图29B是海洋原绿球菌MIT9313PMT1231(NP_895059)(SEQIDNO:17)的三维结构的展示。图29C是海洋原绿球菌MIT9313PMT1231(NP_895059)(SEQIDNO:17)的活性位点三维结构的展示。
图30A是表达点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:5)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图30B是表达点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)Y123F变体的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图30C是表达点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)Y126F变体的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图31描述了使用点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:6)和十八烷醛(A)；Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:6)、十八烷醛、菠菜铁氧还蛋白还原酶和NADPH(B)；十八烷醛、菠菜铁氧还蛋白、菠菜铁氧还蛋白还原酶和NADPH(C)；或Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:6)、菠菜铁氧还蛋白和菠菜铁氧还蛋白(D)，体外产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图32描述了使用点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:6)、NADPH、十八烷醛和(A)菠菜铁氧还蛋白和菠菜铁氧还蛋白还原酶；(B)点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02003626(ZP_00109192)(SEQIDNO:88)和点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02001001(ZP_00111633)(SEQIDNO:90)；(C)Npun02003626(ZP_00109192)(SEQIDNO:88)和点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02003530(ZP_00109422)(SEQIDNO:92)；或(D)Npun02003626(ZP_00109192)(SEQIDNO:88)和点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02003123(ZP_00109501)(SEQIDNO:94)，体外产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图33A是使用十八酰CoA、细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)、NADH和Mg2+体外产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图33B是使用十八酰CoA、细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)、NADPH和Mg2+体外产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图33C是使用十八酰CoA、细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)和NADPH体外产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图34A是使用十八酰CoA、标记的NADPH、细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)和未标记的NADPH体外产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图34B是使用十八酰CoA、标记的NADPH、细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)和S-(4-2H)NADPH体外产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。图34C是使用十八酰CoA、标记的NADPH、细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)和R-(4-2H)NADPH体外产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图35是由Che-9培养基中的表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)的大肠杆菌MG1655ΔfadE细胞所产生的无细胞上清中碳氢化合物的GC/MS追踪。
图36是由Che-9培养基中的表达细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:5)的大肠杆菌MG1655ΔfadE细胞所产生的无细胞上清中碳氢化合物的GC/MS追踪。
图37是表达念珠蓝细菌PCC7120alr5283(NP_489323)(SEQIDNO:7)和念珠蓝细菌PCC7120alr5284(NP_489324)(SEQIDNO:81)的大肠杆菌MG1655细胞产生的碳氢化合物的GC/MS追踪。
图38是来自宏基因组数据库的细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400610(Synpcc7942_1593)(SEQIDNO:1)的同系物的实例列表。
图39是来自宏基因组数据库的细长聚球蓝细菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)的同系物的实例列表。
图40是鉴定出可以被表达、超表达或减弱以增加特定底物的产生的各种基因的表。
详细描述
本发明提供了从例如酰基ACP、脂肪酸、酰基CoA、脂肪醛的底物或脂肪醇底物(例如PCT/US08/058788中所述的，在此通过引用特别并入)产生醛、脂肪醇和碳氢化合物(例如烷、烯和炔)的组合物和方法。此类醛、烷和烯作为生物燃料(例如汽油、柴油、喷气燃料等的替代品)、特种化学品(例如润滑剂、燃料添加剂等)或用于后续化学转变(例如，燃料、聚合物、塑料、纺织品、溶剂、粘合剂等)的原料是有用的。本发明部分地基于参与醛、烷和烯生物合成的基因的鉴定。
这些烷和烯生物合成基因包括，例如细长聚球蓝细菌PCC7942Synpcc7942_1593(SEQIDNO:1)、集胞蓝细菌PCC6803sll0208(SEQIDNO:3)、点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(SEQIDNO:5)、念珠蓝细菌PCC7120alr5283(SEQIDNO:7)、海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041(SEQIDNO:9)、细长嗜热聚球蓝细菌BP-1tll1313(SEQIDNO:11)、聚球蓝细菌JA-3-3ACYA_0415(SEQIDNO:13)、无类囊体蓝细菌PCC7421gll3146(SEQIDNO:15)、海洋原绿球菌MIT9313PM123(SEQIDNO:17)、狭义的海洋原绿球菌pastoris亚种(Prochlorococcusmarinussubsp.pastorisstr.)CCMP1986PMM0532(SEQIDNO:19)、狭义的海洋原绿球菌(Prochlorococcusmarinusstr.)NATL2APMN2A_1863(SEQIDNO:21)、聚球蓝细菌RS9917RS9917_09941(SEQIDNO:23)、聚球蓝细菌RS9917RS9917_12945(SEQIDNO:25)、蓝丝菌ATCC51142cce_0778(SEQIDNO:27)、蓝丝菌PCC7245Cyan7425DRAFT_1220(SEQIDNO:29)、蓝丝菌PCC7245cce_0778(SEQIDNO:31)、多变鱼腥蓝细菌(Anabaenavariabilis)ATCC29413YP_323043(Ava_2533)(SEQIDNO:33)和细长聚球蓝细菌PCC6301YP_170760(syc0050_d)(SEQIDNO:35)。其他烷和烯生物合成基因在表1和图38中列出。
醛生物合成基因包括，例如细长聚球蓝细菌PCC7942Synpcc7942_1594(SEQIDNO:65)、集胞蓝细菌PCC6803sll0209(SEQIDNO:67)、蓝丝菌ATCC51142cce_1430(SEQIDNO:69)、狭义的海洋原绿球菌pastoris亚种CCMP1986PMM0533(SEQIDNO:71)、无类囊体蓝细菌PCC7421NP_96091(gll3145)(SEQIDNO:73)、点状念珠蓝细菌PCC73102ZP_00108837(Npun02004176)(SEQIDNO:75)、多变鱼腥蓝细菌ATCC29413YP_323044(Ava_2534)(SEQIDNO:77)、细长聚球蓝细菌PCC6301YP_170761(syc0051_d)(SEQIDNO:79)和念珠蓝丝菌PCC7120alr5284(SEQIDNO:81)。其他醛生物合成基因在表1和图39中列出。
使用本文所述的方法，使用一个或多个本文所述的醛、烷和/或烯生物合成基因或多肽或所述基因或多肽的变体，利用宿主细胞或无细胞方法，可以制备醛、脂肪醇、烷和烯。
表1.蓝细菌基因组中醛和烷生物合成基因同系物
醛、烷和烯生物合成基因和变体
本文所述的方法和组合物包括，例如具有SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的核苷酸序列的烷或烯生物合成基因及其多核苷酸变体。在一些情况下，所述烷或烯生物合成基因编码一个或多个本文所述的氨基酸基序。例如，所述烷或烯生物合成基因可以编码包含SEQIDNO:37、38、39、41、42、43或44的多肽。所述烷或烯生物合成基因还可以包括包含SEQIDNO:40以及SEQIDNO:37、38或39中任一多肽。
本文所述的方法和组合物还包括，例如具有SEQIDNO:65、67、69、71、73、75、77、79或81的核苷酸序列的醛生物合成基因及其多核苷酸变体。在一些情况下，所述醛生物合成基因编码一个或多个本文所述的氨基酸基序。例如，所述醛生物合成基因可以编码包含SEQIDNO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的多肽。
变体可以是天然存在的或体外产生的。特别是，可以使用基因工程技术产生这些变体，例如定点诱变、随机化学诱变、外切核酸酶III缺失操作和标准克隆技术。可选地，可以使用化学合成或修饰操作产生这些变体、片段、类似物或衍生物。
制造变体的方法是本领域熟知的。这些方法包括这样的操作，在该操作中，修饰获得自天然分离物的核酸序列以生成编码多肽的核酸，所述多肽具有增强其在工业或实验室应用中的价值的特征。在这些操作中，生成并表征了相对于获得自天然分离物的序列具有一个或多个核苷酸差异的大量变体序列。通常，这些核苷酸差异导致相对于来自天然分离物的核酸所编码的多肽的氨基酸改变。
例如，可以使用易错PCR(参见，例如Leungetal.,Technique1:11-15,1989；和Caldwelletal.,PCRMethodsApplic.2:28-33,1992)产生变体。在易错PCR中，在DNA聚合酶的复制保真度低的条件下进行PCR，这样沿着PCR产物的整个长度获得了高效点突变。简单地说，在这些操作中，将待诱变的核酸(例如醛或烷生物合成多核苷酸序列)与PCR引物、反应缓冲液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶和适当浓度的dNTPs混合，以实现沿着PCR产物的整个长度的高效点突变。例如，可以使用20fmoles的待诱变的核酸(例如醛或烷生物合成多核苷酸序列)，30pmole的每种PCR引物，包含50mMKCl、10mMTrisHCl(pH8.3)和0.01％明胶的反应缓冲液，7mMMgCl2，0.5mMMnCl2，5单位的Taq聚合酶，0.2mMdGTP，0.2mMdATP，1mMdCTP和1mMdTTP进行反应。PCR可以进行30个以下循环：94℃持续1分钟、45℃持续1分钟和72℃持续1分钟。但是，应当理解到这些参数可以视情况变化。然后，将诱变后的核酸克隆到合适的载体中并且评价所述诱变后的核酸编码的多肽的活性。
还可以使用寡核苷酸定向诱变以在任何目的克隆DNA中产生位点特异性突变来产生变体。寡核苷酸诱变描述于，例如Reidhaar-Olsonetal.,Science241:53-57,1988。简单地说，在这些操作中，合成大量带有一个或多个待被引入克隆DNA中的突变的双链寡核苷酸并且将其插入待诱变的克隆DNA(例如醛或烷生物合成多核苷酸序列)。重获含有诱变后的DNA的克隆并且评价其编码的多肽的活性。
产生变体的另一方法是组合PCR(assemblyPCR)。组合PCR涉及来自小DNA片段混合物的PCR产物的组合。大量的不同PCR反应在相同小管中平行发生，伴随一个反应的产物引发另一反应的产物。组合PCR描述于例如美国专利第5,965,408号。
生成变体的又一方法是有性PCR诱变。在有性PCR诱变中，作为基于序列同源性的DNA分子随机破碎的结果，体外发生了不同但高度相关的DNA序列的DNA分子之间的被迫的同源重组。然后是通过在PCR反应中的引物延伸固定交换。有性PCR诱变描述于例如Stemmer,PNAS,USA91:10747-10751,1994。
还可以通过体内诱变产生变体。在一些实施方案中，核酸序列中的随机突变通过在携带一个或多个DNA修复途径中的突变的例如大肠杆菌菌株的细菌菌株中增殖所述序列来生成。这些“致突变(mutator)”菌株具有比野生型菌株更高的随机突变率。在这些菌株的一个菌株中增殖DNA序列(例如醛或烷生物合成多核苷酸序列)会最终在所述DNA中产生随机突变。适用于体内诱变的致突变菌株描述于例如PCT公布第WO91/16427号。
还可以使用盒诱变产生变体。在盒诱变中，双链DNA分子的小的区被不同于天然序列的合成的寡核苷酸“盒”替换。该寡核苷酸经常含有完全和/或部分随机化的天然序列。
回归整体诱变(Recursiveensemblemutagenesis)也可以用于产生变体。回归整体诱变是开发用以产生表型相关的突变体的多样性群体的蛋白工程(即蛋白诱变)的运算法则，所述群体成员的氨基酸序列是不同的。该方法使用反馈机制来控制连续轮的组合盒诱变。回归整体诱变描述于例如Arkinetal.,PNAS,USA89:7811-7815,1992。
在一些实施方案中，使用指数整体诱变(exponentialensemblemutagenesis)产生变体。指数整体诱变是产生具有高百分比的独特并且有功能的变体的组合文库的过程，其中小群残基被平行随机化以鉴定每个改变的位置上导致功能性蛋白的氨基酸。指数整体诱变描述于例如Delegraveetal.,Biotech.Res.11:1548-1552,1993。随机诱变和定点诱变描述于例如Arnold,Curr.Opin.Biotech.4:450-455,1993。
在一些实施方案中，如例如美国专利第5,965,408号和第5,939,250号中所述，使用改组操作产生变体，其中许多编码不同多肽的核酸中的部分融合在一起以产生编码嵌合多肽的嵌合核酸序列。
多核苷酸变体还包括核酸类似物。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链进行修饰以改善例如核酸的稳定性、杂交或溶解性。碱基部分中的修饰包括将脱氧胸苷修饰为脱氧尿苷和将脱氧胞苷修饰为5-甲基-2'-脱氧胞苷或5-溴-2'-脱氧胞苷。糖部分的修饰包括修饰核糖糖的2'羟基以形成2'-O-甲基糖或2'-O-烯丙基糖。可以修饰脱氧核糖磷酸主链以产生吗啉核酸，其中每个碱基部分连接到六元吗啉环，或产生肽核酸，其中脱氧磷酸主链被假肽主链代替并保留4个碱基(参见，例如Summertonetal.,AntisenseNucleicAcidDrugDev.(1997)7:187-195；和Hyrupetal.,Bioorgan.Med.Chem.(1996)4:5-23.)。此外，脱氧磷酸主链可以被例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、亚磷酰胺、或烷基磷酸三酯主链所代替。
醛和烷生物合成多肽Synpcc7942_1594(SEQIDNO:66)和Synpcc7942_1593(SEQIDNO:2)在其他蓝细菌中均有同系物(非限制性实例描述于表1中)。因此，编码表1中列出的同系物的任何多核苷酸序列或其变体可以被用作本文所述方法中的醛或烷生物合成多核苷酸。每种表1中列出的蓝细菌都具有两个基因的拷贝。基因产物序列同一性的水平范围对于Synpcc7942_1594(SEQIDNO:66)而言为61％至73％，对于Synpcc7942_1593(SEQIDNO:2)而言为43％至78％。
醛生物合成多肽Synpcc7942_1594(SEQIDNO:66)的其他同系物在图39中列出，并且编码图39中列出的同系物的任何多核苷酸序列或其变体可以被用作本文所述的方法中的醛生物合成多核苷酸。烷生物合成多肽Synpcc7942_1593(SEQIDNO:2)的其他同系物在图38中列出，并且编码图38中列出的同系物的任何多核苷酸序列或其变体可以被用作本文所述的方法中的烷生物合成多核苷酸。
在某些情况下，为了在特定宿主细胞中表达，醛、烷和/或烯生物合成基因进行密码子优化。例如为了在大肠杆菌中表达，可以如例如Grosjeanetal.,Gene18:199-209(1982)中所述，优化一个或多个密码子。
醛、烷和烯生物合成多肽和变体
本文所述的方法和组合物还包括具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列的烷或烯生物合成多肽及其多肽变体。在一些情况下，烷或烯生物合成多肽是包括一个或多个本文所述的氨基酸基序的多肽。例如，所述烷或烯生物合成多肽可以包括SEQIDNO:37、38、39、41、42、43或44的氨基酸序列。所述烷或烯生物合成多肽还可以包括SEQIDNO:40以及SEQIDNO:37、38或39的任何一个的氨基酸序列。
本文所述的方法和组合物还包括具有SEQIDNO:66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的醛生物合成多肽及其多肽变体。在一些情况下，醛生物合成多肽是包括一个或多个本文所述的氨基酸基序的多肽。例如，所述醛生物合成多肽可以包括SEQIDNO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
醛、烷和烯生物合成多肽变体可以是其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)所取代的变体。这些取代的氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码所编码的残基。
保守型取代为由具有相似性质的另一氨基酸取代多肽中给定氨基酸的那些取代。典型的保守型取代是以下替换：诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的脂肪族氨基酸被另一脂肪族氨基酸替换；丝氨酸被苏氨酸替换，或反之亦然；诸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基被另一酸性残基替换；诸如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺基的残基被另一携带酰胺基的残基替换；诸如赖氨酸和精氨酸的碱性残基被另一碱性残基交换；以及诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基被另一芳香族残基替换。
其他多肽变体是那些其中一个或多个氨基酸残基包括取代基的变体。还有其他多肽变体是那些其中所述多肽与另一化合物结合的变体，如增加多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。
另外的多肽变体是那些其中其他氨基酸被融合到所述多肽的变体，所述其他氨基酸例如前导序列、分泌序列、前蛋白序列或便于所述多肽的纯化、富集或稳定的序列。
在一些情况下，烷或烯生物合成多肽变体与具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列的多肽保持相同的生物学功能(例如保持烷或烯生物合成活性)并具有与其基本相同的氨基酸序列。
在其他情况下，所述烷或烯生物合成多肽变体与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或多于约95％的同源性。在另一实施方案中，所述多肽变体包括片段，所述片段包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸。
在一些情况下，醛生物合成多肽变体与具有SEQIDNO:66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的多肽保持相同的生物学功能(例如保持醛生物合成活性)，并具有与其基本相同的氨基酸序列。
在其他情况下，所述醛生物合成多肽变体与SEQIDNO:66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或多于约95％的同源性。在另一实施方案中，所述多肽变体包括片段，所述片段包含SEQIDNO:66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸。
所述多肽变体或其片段可以通过使用本文所述的技术分离编码它们的核酸或通超表达编码它们的合成的核酸来获得。可选地，多肽变体或其片段可以通过生物化学富集或纯化操作来获得。多肽变体或片段的序列可以通过蛋白水解消化、凝胶电泳和/或微测序来确定。然后使用本文所述的任何程序，可以将所述烷或烯生物合成多肽变体或片段的序列与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列进行比较。用本文所述的任何程序，可以将所述醛生物合成多肽变体或片段的序列与SEQIDNO:66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列进行比较。
使用常规方法，可以检测所述多肽变体及其片段的产生醛、产生脂肪醇、产生烷和/或产生烯的活性。例如，在允许所述多肽变体发挥功能的条件下，可以使所述多肽变体或片段与底物(例如脂肪酸衍生物底物或本文所述的其他底物)接触。可以测量底物水平的下降或醛、烷或烯水平的升高以分别测定产生醛、产生脂肪醇、产生烷和/或产生烯的活性。
抗醛、抗脂肪醇、抗烷和抗烯生物合成多肽抗体
本文所述的醛、脂肪醇、烷和烯生物合成多肽还可以用于产生针对醛、脂肪醇、烷和烯生物合成多肽的抗体。这些抗体可以用于，例如利用本领域已知的方法检测醛、脂肪醇、烷或烯生物合成多肽的表达。所述抗体可以是，例如多克隆抗体；单克隆抗体或其抗原结合片段；例如嵌合抗体、重构抗体(reshapedantibody)、人源化抗体的修饰的抗体或其片段(例如Fab'、Fab、F(ab')2)；或例如单链抗体、单结构域抗体(DAB)、Fv、单链Fv(scFv)等的生物合成抗体。
制造和使用多克隆和单克隆抗体的方法描述于，例如Harlowetal.,UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolI(使用抗体：实验室指南：操作手册I).ColdSpringHarborLaboratory(1998年12月1日)。制造修饰的抗体和抗体片段(例如嵌合抗体、改形抗体、人源化抗体或其片段，所述片段例如Fab'、Fab、F(ab')2片段)或生物合成抗体(例如单链抗体、单结构域抗体(DABs)、Fv、单链Fv(scFv)等)的方法是本领域已知的并且可以见于，例如Zola,MonoclonalAntibodies:PreparationandUseofMonoclonalAntibodiesandEngineeredAntibodyDerivatives(单克隆抗体：单克隆抗体和改造抗体衍生物的制备和使用),施普林格(SpringerVerlag)(2000年12月15；第一版)。
底物
本文所述的组合物和方法可以用于从合适的底物产生醛、脂肪醇、烷和/或烯。尽管不希望被特定理论约束，还是认为本文所述的烷或烯生物合成多肽通过脱羰机制从底物产生烷或烯。在一些情况下，所述底物是脂肪酸衍生物，例如脂肪醛，并且具有特定分支模式和碳链长度的烷可以从例如脂肪醛的具有那些特定特征的脂肪酸衍生物产生。在其他情况下，所述底物是不饱和脂肪酸衍生物，例如不饱和脂肪醛，并且具有特定分支模式和碳链长度的烯可以从例如不饱和脂肪醛的具有那些特定特征的不饱和脂肪酸衍生物产生。
尽管不希望被特定理论约束，还是认为本文所述的醛生物合成多肽通过还原机制从底物产生醛。在某些情况下，所述底物是酰基ACP。
尽管不希望被特定理论所约束，还是认为本文所述的脂肪醇是通过还原机制从底物产生。在某些情况下，所述底物是脂肪醛。
因此，可以修饰导致这些底物的产生的生物合成途径中的每一个步骤以产生或过量产生目的底物。例如，可以在宿主细胞中表达、超表达或减弱参与脂肪酸生物合成途径、脂肪醛途径和脂肪醇途径的已知基因，以产生所需底物(参见，例如PCT/US08/058788，在此特通过引用并入)。示例性基因在图40中提供。
底物的合成
脂肪酸合酶(FAS)是一组催化酰基链的起始和延长的多肽(Marrakchietal.,BiochemicalSociety,30:1050-1055,2002)。酰基载体蛋白(ACP)以及FAS途径中的酶控制所产生的脂肪酸衍生物的长度、饱和度和分支。脂肪酸生物合成途径涉及前体乙酰CoA和丙二酰CoA。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰CoA羧化酶(acc)基因家族的酶催化(参见，例如Heathetal.,Prog.LipidRes.40(6):467-97(2001))。
可以通过重组表达或超表达乙酰CoA和/或丙二酰CoA合酶基因改造宿主细胞以表达脂肪酸衍生物底物。例如，为了增加乙酰CoA产生，可以在宿主细胞中表达一个或多个以下基因：pdh、panK、aceEF(编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)、fabH、fabD、fabG、acpP和fabF。这些基因的示例性GenBank登录号为：pdh(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK(也称为coaA、AAC76952)、aceEF(AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。此外，可以通过用含有相应基因的无效或缺失突变的条件复制或非复制质粒进行转化或通过取代启动子或增强子序列，在改造的宿主细胞中减弱或敲除fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB的表达水平。这些基因的示例性GenBank登录号为：fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。得到的宿主细胞当在合适的环境中生长时，会具有增加的乙酰CoA产生水平。
丙二酰CoA超表达可以通过将accABCD(例如登录号AAC73296、EC6.4.1.2)引入宿主细胞来实现。可以通过将编码脂肪酶(例如，登录号CAA89087、CAA98876)的DNA序列引入宿主细胞，在宿主细胞中进一步超表达脂肪酸。
此外，抑制PlsB可以导致长链酰基ACP水平的增加，这会抑制途径中的早期步骤(例如，accABCD、fabH和fabI)。plsB(例如，登录号AAC77011)D311E突变可以用于增加可用酰基CoA的量。
此外，可以改造宿主细胞以超表达sfa基因(fabA的抑制基因，例如，登录号AAN79592)，从而增加单不饱和脂肪酸的产生(Rocketal.,J.Bacteriology178:5382-5387,1996)。
在一些情况下，可以改造宿主细胞以表达、超表达或减弱硫酯酶的表达，从而增加脂肪酸底物产生。脂肪酸底物的链长度由硫酯酶控制。在一些情况下，可以超表达tes或fat基因。在其他情况下，C10脂肪酸可以通过减弱使用C18:1-ACP的硫酯酶C18(例如，登录号AAC73596和P0ADA1)，并表达使用C10-ACP的硫酯酶C10(例如，登录号Q39513)来产生。这导致了碳链长度为10的脂肪酸的相对同种群体。在其他情况下，C14脂肪酸可以通过减弱产生非C14脂肪酸的内源硫酯酶并且表达使用C14-ACP的硫酯酶(例如，登录号Q39473)来产生。在一些情况下，C12脂肪酸可以通超表达使用C12-ACP的硫酯酶(例如，登录号Q41635)并且减弱产生非C12脂肪酸的硫酯酶来产生。使用本领域已知的方法可以证实乙酰CoA、丙二酰CoA和脂肪酸的过量产生，例如，通过在细胞裂解后使用放射性操作、HPLC和GC-MS。可以用于本文所述的方法中的硫酯酶的非限制性实例在表2中列出。
表2.硫酯酶
*Mayeretal.,BMCPlantBiology7:1-11,2007
分支醛、脂肪醇、烷和烯的形成
通过使用分支脂肪酸衍生物作为底物，可以产生含有分支点的醛、脂肪醇、烷、烯。例如，虽然大肠杆菌天然产生直链脂肪酸衍生物(sFAs)，但是可以通过在大肠杆菌中引入且表达或超表达提供分支前体的基因(例如bkd、ilv、icm和fab基因家族)改造大肠杆菌，以产生支链脂肪酸衍生物(brFAs)。此外，可以改造宿主细胞以表达或超表达编码用于brFAs的延长的蛋白的基因(例如ACP、FabF等)，和/或缺失或减弱通常导致sFAs的对应宿主细胞基因。
形成brFAs中的第一步骤是通过支链氨基酸氨基转移酶产生对应α-酮酸。宿主细胞可以内源包括编码这些酶的基因或这些基因可以被重组引入。例如，大肠杆菌内源表达这样的酶I1vE(EC2.6.1.42；GenBank登录YP_026247)。在一些宿主细胞中，可以不表达异源支链氨基酸氨基转移酶。但是，大肠杆菌I1vE或任何其他支链氨基酸氨基转移酶(例如，来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的I1vE(GenBank登录AAF34406)、来自恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的I1vE(GenBank登录NP_745648)或来自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)的I1vE(GenBank登录NP629657))，如果不是内源的，可以被引入和重组表达。
第二步骤是将α-酮酸氧化脱羧为对应的支链酰基CoA。该反应可以由支链α-酮酸脱氢酶复合物(bkd；EC1.2.4.4.)(Denoyaetal.,J.Bacteriol.177:3504,1995)催化，该复合物由E1α/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酸转酰酶)和E3(二氢硫辛酸脱氢酶)亚基组成。这些支链α-酮酸脱氢酶复合物与丙酮酸和α-酮戊二酸脱氢酶复合物相似。具有brFAs和/或生长在支链氨基酸上的任何微生物可以用作分离用于在例如大肠杆菌的宿主细胞中表达的bkd基因的来源。此外，大肠杆菌具有E3组分，作为其丙酮酸脱氢酶复合物(lpd、EC1.8.1.4、GenBank登录NP_414658)的一部分。因此，仅表达E1a/β和E2bkd基因就足够了。表3列出了来自几种微生物的、可以在宿主细胞中重组引入并表达以提供支链酰基CoA前体的bkd基因的非限制性实例。
表3.来自选择的微生物的Bkd基因
在另一实例中，通过丁烯酰CoA还原酶(Ccr、EC1.6.5.5、1.1.1.1)和异丁酰CoA变位酶(大亚基IcmA、EC5.4.99.2；小亚基IcmB、EC5.4.99.2)的共表达，异丁酰CoA可以在宿主细胞中产生，例如在大肠杆菌中(Han和Reynolds,J.Bacteriol.179:5157,1997)。丁烯酰CoA是大肠杆菌和其他微生物中脂肪酸生物合成的中间体。来自所选微生物的ccr和icm基因的非限制性实例在表4中列出。
表4.来自选择的微生物的Ccr和icm基因
除bkd基因的表达外，brFA生物合成的起始利用对支链酰基CoA具有特异性的β-酮脂酰-酰基-载体-蛋白合酶III(FabH、EC2.3.1.41)(Lietal.,J.Bacteriol.187:3795-3799,2005)。这些FabH酶的非限制性实例在表5中列出。参与任何含有brFA的微生物的脂肪酸生物合成的fabH基因可以在宿主细胞中表达。来自不天然产生brFA的宿主细胞的Bkd和FabH酶可能不支持brFA产生。因此，可以重组表达bkd和fabH。可以将含有bkd和fabH基因的载体插入这样的宿主细胞中。同样，Bkd和FabH产生的内源水平可能不足以产生brFA。这种情况下，可以超表达它们。此外，可以表达或超表达脂肪酸生物合成途径的其他组分，例如酰基载体蛋白(ACPs)和β-酮脂酰-酰基-载体-蛋白合酶II(fabF、EC2.3.1.41)(候选者的非限制性实例在表5中列出)。除表达这些基因外，可以在宿主细胞中减弱内源脂肪酸生物合成途径中的一些基因(例如，大肠杆菌基因fabH(GenBank登录号NP_415609)和/或fabF(GenBank登录号NP_415613))。
表5.来自选择的具有brFAs的微生物的FabH、ACP和fabF基因
环状醛、脂肪醇、烷和烯的形成
通过使用环状脂肪酸衍生物作为底物，可以产生环状醛、脂肪醇、烷和烯。为了产生环状脂肪酸衍生物底物，可以将提供环状前体的基因(例如ans、chc和plm基因家族)引入宿主细胞并使其表达，以允许从环状前体起始脂肪酸生物合成。例如，为了将例如大肠杆菌的宿主细胞转变为能够合成ω-环状脂肪酸衍生物(cyFA)的细胞，可以在宿主细胞中引入并表达提供环状前体环己基羰基CoA(CHC-CoA)的基因(Croppetal.,NatureBiotech.18:980-983,2000)。在大肠杆菌中提供CHC-CoA的基因的非限制性实例包括：来自山丘链霉菌(Streptomycescollinus)的安莎三烯(ansatrienin)基因簇的ansJ、ansK、ansL、chcA和ansM(Chenetal.,Eur.J.Biochem.261:98-107,1999)或来自链霉菌(Streptomycessp.)HK803的磷内酯霉素B(phoslactomycinB)基因簇的plmJ、plmK、plmL、chcA和plmM(Palaniappanetal.,J.Biol.Chem.278:35552-35557,2003)，以及来自山丘链霉菌、阿维链霉菌(S.avermitilis)或天蓝色链霉菌的chcB基因(Pattonetal.,Biochem.39:7595-7604,2000)(参见表6)。然后，可以表达表5中所列的基因，以允许ω-环状脂肪酸的起始和延长。可选地，可以从产生cyFA的微生物中分离同源基因并在宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达该同源基因。
表6.用于合成CHC-CoA的基因
表5中列出的基因(fabH、ACP和fabF)允许ω-环状脂肪酸衍生物的起始和延长，因为它们具有宽泛的底物特异性。如果任何这些基因与表6中列出的基因的共表达不产生cyFA，则可以分离(例如通过使用简并PCR引物或异源DNA序列探针)并共表达来自产生cyFAs的微生物的fabH、ACP和/或fabF同系物(例如表7中列出的那些)。
表7.含有ω-环状脂肪酸的微生物的非限制性实例
*利用环庚基羰基-CoA而不是环己基羰基-CoA作为cyFA生物合成的前体
醛、脂肪醇和烯饱和水平
通过调节脂肪酸衍生物中间体的饱和度，可以控制脂肪酸衍生物的饱和度。可以表达或超表达sfa、gns和fab基因家族以控制脂肪酸的饱和。图40列出了这些基因家族中可以用于本文所述的方法和宿主细胞的基因的非限制性实例。
通过改造宿主细胞以超表达fabB或通过使宿主细胞在低温生长(例如低于37℃)，可以改造宿主细胞以产生不饱和脂肪酸。FabB具有对于cis-δ3癸烯酰ACP的偏向性并导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸产生。fabB的超表达导致显著百分比的不饱和脂肪酸的产生(deMendozaetal.,J.Biol.Chem.258:2098-2101,1983)。基因fabB可以在不是天然具有该基因的宿主细胞中插入和表达。然后，这些不饱和脂肪酸衍生物可以在被改造的宿主细胞中用作产生脂肪酸衍生物，例如脂肪醛、脂肪醇或烯的中间体。
在其他情况下，可以缺失脂肪酸生物合成的阻抑物，例如fabR(GenBank登录NP_418398)，这也可以导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸产生的增加(Zhangetal.,J.Biol.Chem.277:15558,2002)。可以在其他宿主细胞中进行相似的缺失。例如，通过超表达fabM(反式-2,顺式-3-癸烯酰-ACP异构酶、GenBank登录DAA05501)和来自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的fabK(反式-2-烯酰-ACP还原酶II，GenBank登录NP_357969)的受控表达(Marrakchietal.,J.Biol.Chem.277:44809,2002)，同时缺失大肠杆菌fabI(反式-2-烯酰-ACP还原酶，GenBank登录NP_415804)，可以实现不饱和脂肪酸衍生物的进一步增加。在一些实例中，可以减弱内源fabF基因，从而增加所产生的棕榈油酸酯(C16:1)的百分比。
其他底物
可以用于在本文所述的方法中产生醛、脂肪醇、烷和烯的其他底物是酰基ACP、酰基CoA、脂肪醛或脂肪醇，它们描述于例如PCT/US08/058788。可以被改变以在宿主细胞中表达或超表达这些底物的示例性的基因在图40中列出。其他示例性的基因描述于PCT/US08/058788。
宿主细胞的基因工程以产生醛、脂肪醇、烷和烯
如本文所述，可以用各种宿主细胞产生醛、脂肪醇、烷和/或烯。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本文所述的多肽可以在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞)中表达。其他示例性的宿主细胞包括来自以下属的成员的细胞：埃希氏菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、曲霉属、木霉属、脉孢菌属、镰刀菌属、腐质霉属、根毛霉属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、毛霉菌属、蚀丝霉属、青霉属、平革菌属、侧耳属、栓菌属、金黄孢子菌属、酵母属、裂殖酵母属、耶氏酵母属或链霉菌属。其他示例性的宿主细胞可以是迟缓芽孢杆菌细胞、短芽孢杆菌细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、嗜碱芽孢杆菌细胞、凝结芽孢杆菌细胞、环状芽孢杆菌细胞、短小芽孢杆菌细胞、苏云金芽孢杆菌细胞、克劳氏芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞、康氏木霉细胞、绿色木霉细胞、里氏木霉细胞、长枝木霉细胞、泡盛曲霉细胞、烟曲霉细胞、臭曲霉细胞、构巢曲霉细胞、黑曲霉细胞、米曲霉细胞、特异腐质霉细胞、棉毛状腐质霉细胞、米黑根毛霉细胞、米黑毛酶细胞、浅青紫链霉菌细胞、鼠灰链霉菌细胞或放线菌细胞。
宿主细胞的其他非限制性实例是表1中列出的那些。
在优选的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在更优选的实施方案中，所述宿主细胞来自大肠杆菌菌株B、C、K或W。其他合适的宿主细胞对于本领域技术人员是已知的。
本领域熟知的各种方法可以用于遗传改造宿主细胞以产生醛、脂肪醇、烷和/或烯。所述方法包括使用载体，优选表达载体，所述载体含有编码本文所述的醛、脂肪醇、烷和/或烯生物合成多肽或其多肽变体或片段的核酸。如本文所用，术语“载体”是指能够转运另一核酸的核酸分子，所述核酸分子连接到所述另一核酸。一种载体是“质粒”，所述质粒是指可以连接有另外的DNA节段的环状双链DNA环。另一种载体是病毒载体，其中另外的DNA节段可以被连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加体哺乳动物载体)当引入到宿主细胞中时，被整合到宿主细胞的基因组中，并因此随同宿主基因组一起复制。此外，某些载体，例如表达载体，能够指导与其可操作地连接的基因的表达。通常，重组DNA技术所用的表达载体经常是质粒的形式。但是，也可以使用其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本文所述的重组表达载体包括以适于宿主细胞中的核酸表达的形式的本文所述的核酸。所述重组表达载体可以包括一个或多个基于将被用于表达的宿主细胞所选择的控制序列。所述控制序列可操作地连接到待表达的核酸序列。这些控制序列描述于，例如Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表达技术：酶学方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)。控制序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些控制序列和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些控制序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应当理解到，表达载体的设计可以取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。可以将本文所述的表达载体引入宿主细胞，以产生本文所述核酸所编码的多肽，包括融合多肽。
可以设计重组表达载体用于在原核或真核细胞(例如，例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达醛、脂肪醇、烷和/或烯生物合成多肽或变体。适合的宿主细胞在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表达技术：酶学方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)中进一步作了详细讨论。可选地，所述重组表达载体可以在体外进行转录和翻译，例如通过使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
最经常用含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体在例如大肠杆菌的原核生物中进行多肽的表达。融合载体将许多氨基酸添加到其中编码的多肽，通常添加到重组多肽的氨基末端。这些融合载体通常担任3个用途：(1)增加重组多肽的表达；(2)增加重组多肽的可溶性；和(3)通过作为亲和纯化中的配体，帮助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点。这使得在融合多肽纯化后，重组多肽能够从融合部分分离。这些酶的实例及其同源识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。示例性的融合表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smithetal.,Gene(1988)67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.)和pRITS(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到靶重组多肽。
诱导型、非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amannetal.,Gene(1988)69:301-315)和pET11d(Studieretal.,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表达技术：酶学方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)60-89)。从pTrc载体表达靶基因依赖于来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。从pET11d载体表达靶基因依赖于来自共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)所介导的T7gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由来自携带T7gn1基因的定居λ原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，所述T7gn1基因受lacUV5启动子的转录控制。
使重组多肽表达最大化的一种策略是，在具有受损的蛋白水解切割所述重组多肽的能力的宿主细胞中表达多肽(参见Gottesman,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表达技术：酶学方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)119-128)。另一策略是改变待插入表达载体中的核酸序列，这样每个氨基酸的单独密码子是所述宿主细胞优选使用的那些密码子(Wadaetal.,NucleicAcidsRes.(1992)20:2111-2118)。通过标准DNA合成技术可以进行该核酸序列的改变。
在另一实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞。在该实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldarietal.,EMBOJ.(1987)6:229-234)、pMFa(Kurjanetal.,Cell(1982)30:933-943)、pJRY88(Schultzetal.,Gene(1987)54:113-123)、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)和picZ(InvitrogenCorp,SanDiego,Calif.)。
可选地，使用杆状病毒表达载体，可以在昆虫细胞中表达本文所述的多肽。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括，例如pAc系列(Smithetal.,Mol.CellBiol.(1983)3:2156-2165)和pVL系列(Lucklowetal.,Virology(1989)170:31-39)。
在又一实施方案中，使用哺乳动物表达载体，可以在哺乳动物细胞中表达本文所述的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,Nature(1987)329:840)和pMT2PC(Kaufmanetal.,EMBOJ.(1987)6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能可以由病毒调节元件提供。例如，通常使用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于原核和真核细胞都合适的其他表达系统描述于Sambrooketal.,eds.,MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd(分子克隆：实验手册，第2版),ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989的16和17章中。
通过常规转化或转染技术可以将载体引入原核或真核细胞。如本文所用，术语“转化”和“转染”是指许多领域公认的用于将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可以见于例如Sambrooketal.(同上)。
对于细菌细胞的稳定转化，已知的是，根据所用的表达载体和转化技术，仅小部分的细胞会摄入并复制所述表达载体。为了鉴定和选择这些转化体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因伴随目的基因引入宿主细胞中。选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，所述药物诸如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素。编码选择标记的核酸可以在与编码本文所述的多肽相同的载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可以通过药物选择鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，具有并入的选择标记基因的细胞会存活，而其他细胞死亡)。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是，根据使用的表达载体和转染技术，仅小部分的细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因伴随目的基因引入宿主细胞中。优选的选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，所述药物诸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。编码选择标记的核酸可以在与编码本文所述的多肽相同的载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可以通过药物选择鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，具有并入的选择标记基因的细胞会存活，而其他细胞死亡)。
在某些方法中，在单一宿主细胞中共表达醛生物合成多肽和烷或烯生物合成多肽。在可选的方法中，在单一宿主细胞中共表达醛生物合成多肽和醇脱氢酶多肽。
转运蛋白
转运蛋白可以将多肽和碳氢化合物(例如醛、烷和/或烯)输出宿主细胞。很多转运和外排蛋白用于排出种类广泛的化合物并且可以被天然修饰，从而对于特定类型的碳氢化合物具有选择性。
合适的转运蛋白的非限制性实例是ATP结合盒(ABC)转运蛋白、外排蛋白和脂肪酸转运蛋白(FATP)。合适的转运蛋白的其他非限制性实例包括来自诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、拟南芥(Arabidopsisthalania)、真养产碱杆菌(Alkaligeneseutrophus)和红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)的生物体的ABC转运蛋白。示例性的可以使用的ABC转运蛋白在图40中列出(例如CER5、AtMRP5、AmiS2和AtPGP1)。宿主细胞也可以对于其分泌碳氢化合物的内源能力进行选择。碳氢化合物产生和分泌进入宿主细胞环境的效率(例如培养基、发酵液)可以表达为细胞内产物与细胞外产物的比值。在一些实施例中，该比值可以为约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。
发酵
通过使用有益发酵技术，可以增强醛、脂肪醇、烷和/或烯的产生和分离。使产量最大化同时降低费用的一种方法是增加被转变为碳氢化合物产物的碳源的百分比。
在正常的细胞生命周期中，碳被用于细胞功能，例如产生脂质、糖类、蛋白质、有机酸和核酸。降低生长相关活性所需的碳的量可以增加碳源转变为产物的效率。这可以通过例如首先使宿主细胞生长到所需密度(例如，达到生长对数期高峰的密度)来实现。在这点上，可以使用复制检查点基因(replicationcheckpointgene)阻止细胞生长。具体而言，群体感应机制(quorumsensingmechanisms)(综述于Camillietal.,Science311:1113,2006；VenturiFEMSMicrobio.Rev.30:274-291,2006；和Readingetal.,FEMSMicrobiol.Lett.254:1-11,2006)可以用于激活例如p53、p21的检查点基因或其他检查点基因。
可以被激活以阻止大肠杆菌中细胞复制和生长的基因包括umuDC基因。umuDC基因的超表达阻止从静止期到指数性生长的进展(Murlietal.,J.ofBact.182:1127,2000)。UmuC是可以对非编码损伤进行跨损伤修复(translesionsynthesis)的DNA聚合酶，所述非编码损伤是大部分UV和化学诱变的机制基础。umuDC基因产物参与跨损伤修复的过程并且还作为DNA序列损伤检查点。umuDC基因产物包括UmuC、UmuD、umuD'、UmuD'2C、UmuD'2和UmuD2。同时，产生产物的基因可以被激活，从而在制造醛、烷和/或烯的同时，使对于待使用的复制和保持途径的需要最小化。通过umuC和umuD与合适的终产物产生基因的重新合成，可以改造宿主细胞以在prpBCDE启动子系统下的pBAD24中表达来自大肠杆菌的umuC和umuD。
输入碳转变为醛、脂肪醇、烷和/或烯的百分比可以是成本动因。该过程的耗费越小，该过程越有效率(即输入碳转变为醛、脂肪醇、烷和/或烯的较高的百分比)。对于含氧碳源(例如葡萄糖和其他基于碳水化合物的来源)，氧必须以二氧化碳的形式释放。对于每2个释放的氧原子，碳原子也被释放，这导致约34％(w/w)的最大理论代谢效率(对于脂肪酸来源的产物)。但是，这个数字对于其他碳氢化合物产物和碳源会变化。文献中的通常效率约低于5％。经改造产生醛、烷和/或烯的宿主细胞可以具有大于约1、3、5、10、15、20、25和30％的效率。在一个实例中，宿主细胞可以表现出约10％至约25％的效率。在其他实例中，这些宿主细胞可以表现出约25％至约30％的效率。在其他实例中，宿主细胞可以表现出大于30％的效率。
可以另外改造宿主细胞以表达重组纤维小体，例如PCT申请第PCT/US2007/003736号中描述的那些。这些纤维小体可以允许宿主细胞使用纤维素原料作为碳源。例如，可以另外改造宿主细胞以表达转化酶(EC3.2.1.26)，这样蔗糖可以被用作碳源。相似地，可以使用美国专利第5,000,000号、第5,028,539号、第5,424,202号、第5,482,846号和第5,602,030号中描述的教导改造宿主细胞，这样宿主细胞可以有效地吸收碳并使用纤维素原料作为碳源。
在一个实例中，发酵室可以将正在进行连续还原的发酵封闭。这种情况下，可以创造稳定的还原环境。通过二氧化碳的释放(以气体形式)可以保持电子平衡。提高NAD/H和NADP/H平衡的努力也可以有助于稳定电子平衡。通过改造宿主细胞以表达NADH:NADPH转氢酶，也可以增强细胞内NADPH的可利用性。一个或多个NADH:NADPH转氢酶的表达将糖酵解中产生的NADH转变为NADPH，所述NADPH可以增强醛、烷和/或烯的产生。
对于小规模生产，改造的宿主细胞可以在例如约100mL、500mL、1L、2L、5L或10L的批量中生长；发酵；并且基于合适的质粒中所编码的特定基因，经诱导而表达所需醛、脂肪醇、烷和/或烯。例如，携带pBAD24(具有氨苄西林抗性和醛、脂肪醇、烷或烯合成途径)以及pUMVC1(具有卡那霉素抗性和乙酰CoA/丙二酰CoA超表达系统)的大肠杆菌BL21(DE3)细胞可以在2L瓶中、37℃下、在补充了75μg/mL氨苄西林和50μg/mL卡那霉素的500mLLB培养基中、以大于200rpm振荡孵育过夜，直到培养物达到大于0.8的OD600。当达到大于0.8的OD600时，细胞可以补充25mM丙酸钠(pH8.0)以激活用于生产的改造的基因系统，并且通过激活UmuC和UmuD蛋白阻止细胞增殖。诱导可以在30℃进行6小时。孵育后，可以使用GC-MS检查培养基的醛、脂肪醇、烷和/或烯。
对于大规模生产，改造的宿主细胞可以在10L、100L、1000L或更大的批量中生长；发酵；并且基于合适的质粒中所编码的特定基因，经诱导而表达所需醛、脂肪醇、烷和/或烯。例如，携带pBAD24(具有氨苄西林抗性和醛、脂肪醇、烷或烯合成途径)以及pUMVC1(具有卡那霉素抗性和乙酰CoA/丙二酰CoA超表达系统)的大肠杆菌BL21(DE3)细胞可以按照500mL种子培养物(seedculture)对应10L发酵物(5L对应100L发酵物等)在具有50μg/mL卡那霉素和75μg/mL氨苄西林的LB培养基(无甘油)中37℃进行孵育并以大于200rpm振荡，直到培养物达到大于0.8的OD600(通常16小时)。可以持续补充培养基以保持25mM丙酸钠(pH8.0)，从而激活用于生产的改造的基因系统并且通过激活umuC和umuD蛋白阻止细胞增殖。培养基可以持续补充葡萄糖以保持25g/100mL的浓度。
第一小时的诱导后，可以每小时移除不多于10％的全部细胞体积的等分部分并允许其静置而不摇动以允许醛、烷和/或烯上升至表面并经历自发的相分离。然后可以收集醛、脂肪醇、烷和/或烯组分，并且将水相返回到反应室。可以连续操作反应室。当OD600下降至0.6以下时，可以用生长自种子培养物的新批次替换细胞。
使用无细胞方法产生醛、脂肪醇、烷和烯
在本文所述的一些方法中，可以使用本文所述的纯化的多肽和本文所述的底物产生醛、脂肪醇、烷和/或烯。可以改造宿主细胞以表达如本文所述的醛、脂肪醇、烷和/或烯生物合成多肽或变体。可以在适于允许多肽表达的条件下培养宿主细胞。然后，可以使用已知方法产生无细胞提取物。例如，可以使用去垢剂或通过超声处理裂解宿主细胞。可以使用已知方法纯化所表达的多肽。获得无细胞提取物后，可以将本文所述的底物添加到所述无细胞提取物并保持在允许所述底物转变为醛、脂肪醇、烷和/或烯的条件下。然后，可以使用已知技术分离并纯化醛、脂肪醇、烷和/或烯。
产生后加工
在发酵中产生的醛、脂肪醇、烷和/或烯可以从发酵培养基中分离。可以使用用于从水性培养基分离醛、脂肪醇、烷和/或烯的任何已知技术。一个示例性分离过程是两相(twophase)(两相(bi-phasic))分离过程。该过程涉及使遗传改造的宿主细胞在足以产生醛、脂肪醇、烷和/或烯的条件下发酵，允许醛、脂肪醇、烷和/或烯收集在有机相中并从水性发酵液分离该有机相。该方法可以在批次和连续发酵环境中实施。
两相分离利用醛、脂肪醇、烷和/或烯的相对不混溶性促进分离。不混溶是指化合物相对不溶于水的能力并且由化合物的分配系数定义。本领域技术人员应当理解到，通过选择发酵液和有机相，使产生的醛、烷和/或烯具有高logP值，在发酵容器中醛、烷和/或烯即使处于非常低的浓度也可以分离到有机相。
通过本文所述的方法产生的醛、脂肪醇、烷和/或烯，在发酵液以及细胞质中可以是相对不混溶的。因此，醛、脂肪醇、烷和/或烯可以细胞内或细胞外地收集在有机相中。有机相中产物的收集可以减轻醛、脂肪醇、烷和/或烯对细胞功能的影响并可以允许宿主细胞产生更多产物。
本文所述的方法可以导致同种化合物的产生，其中至少约60％、70％、80％、90％或95％的产生的醛、脂肪醇、烷和/或烯会具有改变少于约6个碳、少于约4个碳或少于约2个碳的碳链长度。也可以产生具有相对一致的饱和度的这些化合物。这些化合物可以直接用作燃料、燃料添加剂、特种化学品、用于生产其他化学化合物(例如聚合物、表面活性剂、塑料、纺织品、溶剂、粘合剂等)的起始原料或个人护理产品添加剂。这些化合物也可以用作例如氢化、催化裂解(通过氢化、热解或两者)的后续反应的原料以制造其他产品。
在一些实施方案中，使用本文所述的方法产生的醛、脂肪醇、烷和/或烯可以含有约50％至约90％的碳；或约5％至约25％的氢。在其他实施方案中，使用本文所述的方法产生的醛、脂肪醇、烷和/或烯可以含有约65％至约85％的碳；或约10％至约15％的氢。
燃料组合物和特种化学品组合物
本文所述的醛、脂肪醇、烷和/或烯可以用作或转变为燃料或特种化学品。本领域技术人员应当理解到，取决于燃料或特种化学品的既定目的，可以产生和使用不同的醛、脂肪醇、烷和/或烯。例如，分支醛、脂肪醇、烷和/或烯对于意图在寒冷气候中使用的汽车燃料是理想的。此外，当本文所述的醛、脂肪醇、烷和/或烯用作燃料或特种化学品生产的原料时，本领域技术人员应当理解到，醛、脂肪醇、烷和/或烯原料的特性会影响所产生的燃料或特种化学品的特性。因此，可以通过生产特定的醛、脂肪醇、烷和/或烯用作原料来选择燃料或特种化学品产品的特性。
使用本文所述的方法，可以从醛、脂肪醇、烷和/或烯中产生具有所需燃料品质的生物燃料。生物学产生的醛、脂肪醇、烷和/或烯代表生物燃料的新来源，其可以被用作喷气燃料、柴油或汽油。一些使用醛、脂肪醇、烷和/或烯制造的生物燃料未从可再生资源产生过，并且是新的物质组合物。基于双重碳同位素指纹谱，这些新燃料或特种化学品可以区别于来自石化产品的碳的燃料或特种化学品。此外，可以通过双重碳同位素指纹谱确定生物来源的碳的具体来源(例如葡萄糖与甘油相比)(参见，例如美国专利第7,169,588号，特别是第4栏第31行至第6栏第8行)。
基于14C(fM)和双重碳同位素指纹谱，醛、脂肪醇、烷和/或烯及相关的生物燃料、特种化学品和混合物可以区别于其来源于石油化学品的对应物。在一些实施例中，生物燃料组合物中的醛、脂肪醇、烷和/或烯的现代碳(fM 14C)部分可以为例如至少约1.003、1.010或1.5。
在一些实施例中，可以制备生物燃料组合物，其包括δ13C为约-15.4至约-10.9的醛、脂肪醇、烷和/或烯，其中所述醛、脂肪醇、烷和/或烯占据组合物中至少约85％的生物来源材料(即来自可再生资源，例如生物量、纤维素原料和糖)。
区别这些生物来源的产品的能力对于在商业中追踪这些材料是有益的。例如，包含生物来源的和基于石油的碳同位素谱两者的燃料或特种化学品可以区别于仅由基于石油的原料制造的燃料和特种化学品。因此，本文所述的醛、脂肪醇、烷和/或烯作为生物燃料，可基于其独特的谱在商业中进行跟踪或在商业中进行鉴定。此外，可以鉴定出其他竞争材料是生物来源的或来自石油化学资源。
燃料添加剂用于增强燃料或发动机的性能。例如，燃料添加剂可以用于改变冻/凝点、浊点、润滑性、粘性、氧化稳定性、点火性能、辛烷水平和/或闪点。在美国，所有的燃料添加剂必须在环境保护署(EnvironmentalProtectionAgency)注册。通过联系EPA或通过浏览EPA的网站可公开获取燃料添加剂的名称和销售该燃料添加剂的公司。本领域技术人员应当理解到，本文所述的基于醛的和/或基于烷的生物燃料可以与一种或多种燃料添加剂混合以赋予所需品质。
本文所述的基于醛、脂肪醇、烷和/或烯的生物燃料可以与其他燃料混合，例如各种醇，如乙醇和丁醇，和石油来源的产品，如汽油、柴油或喷气燃料。
在一些实施例中，所述混合物可以包括至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％或60％重量的醛、脂肪醇、烷或烯。在其他实例中，可以制备这样的生物燃料组合物：其包括至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的醛、脂肪醇、烷或烯，所述醛、脂肪醇、烷或烯包括长度为8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个碳的碳链。这类生物燃料组合物可以另外包括至少一种选自以下的添加剂：可以将浊点降低至低于约5℃或0℃的降低浊点添加剂、表面活性剂、微乳化液、至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的来自甘油三酸酯的柴油燃料、石油来源的汽油或来自石油的柴油燃料。
实施例
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例并不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例1.选择的蓝细菌中烷生物合成的检测和验证
选择七种蓝细菌用于烷生物合成的验证和检测，所述蓝细菌的全基因组序列可公开获取：细长聚球蓝细菌PCC7942、细长聚球蓝细菌PCC6301、多变鱼腥蓝细菌ATCC29413、集胞蓝细菌PCC6803、点状念珠蓝细菌PCC73102、无类囊体蓝细菌ATCC29082和海洋原绿球菌CCMP1986。该名单中仅前三个蓝细菌菌株据报道含有烷(Hanetal.,J.Am.Chem.Soc.91:5156-5159(1969)；Fehleretal.,Biochem.9:418-422(1970))。菌株在振荡瓶中100mL合适的培养基(在表8中列出)中在30℃、以约3500lux的光强度光合自养生长3-7天。按照以下提取细胞用于检测烷：来自1mL培养体积的细胞以13,000rpm离心1分钟，细胞团在甲醇中重悬，涡漩1分钟并然后超声处理30分钟。以13000rpm离心3分钟后，将上清转移到新的小瓶并通过GC-MS进行分析。在30mDP-5毛细柱(0.25mm内径)或30m高温DP-5毛细柱(0.25mm内径)使用以下方法分析样品。
1μL无分流进样(入口温度保持在300℃)到GC/MS柱后，烘箱保持在100℃持续3分钟。以20℃/分钟的速率将温度升至320℃。烘箱保持在320℃再持续5分钟。运载气体氦的流速是1.3mL/分钟。MS四极子从50至550m/z进行扫描。产物峰的保留时间和裂解谱与权威参考进行比较以确认峰的一致性。
七个菌株中，六个主要产生十七烷以及一个产生十五烷(海洋原绿球菌CCMP1986)；这些菌株中的一个除十七烷外还产生甲基-十七烷(多变鱼腥蓝细菌ATCC29413)(参见表8)。因此，证实了三种先前报道的蓝细菌中的烷生物合成并且在先前不知产生烷的四种蓝细菌中检测到烷生物合成：海洋原绿球菌CCMP1986(参见图1)、点状念珠蓝细菌PCC73102(参见图2)、无类囊体蓝细菌ATCC29082(参见图3)和集胞蓝细菌PCC6803(参见图4)。
图1A描述了用甲醇提取的海洋原绿球菌CCMP1986细胞的GC/MS追踪。7.55分钟时的峰与十五烷(Sigma)具有相同的保留时间。在图1B中，显示了十五烷峰的质量裂解谱。212峰对应于十五烷的分子量。
图2A描述了用甲醇提取的点状念珠蓝细菌PCC73102细胞的GC/MS追踪。8.73分钟时的峰与十七烷(Sigma)具有相同的保留时间。在图2B中，显示了十七烷峰的质量裂解谱。240峰对应于十七烷的分子量。
图3A描述了用甲醇提取的无类囊体蓝细菌ATCC29082细胞的GC/MS追踪。8.72分钟时的峰与十七烷(Sigma)具有相同的保留时间。在图3B中，显示了十七烷峰的质量裂解谱。240峰对应于十七烷的分子量。
图4A描述了用甲醇提取的集胞蓝细菌PCC6803细胞的GC/MS追踪。7.36分钟时的峰与十七烷(Sigma)具有相同的保留时间。在图4B中，显示了十七烷峰的质量裂解谱。240峰对应于十七烷的分子量。
表8.选择的蓝细菌中检测到的碳氢化合物
实施例2.集胞蓝细菌PCC6803中sll0208和sll0209基因的缺失导致烷生物合成的丢失
集胞蓝细菌PCC6803的编码推定的脱羰酶(sll0208；NP_442147)(SEQIDNO:3)和生成醛的酶(sll0209；NP_442146)(SEQIDNO:67)的基因按照以下方式缺失。分别使用引物sll0208/9-KO1(CGCGGATCCCTTGATTCTACTGCGGCGAGT)与引物sll0208/9-KO2(CACGCACCTAGGTTCACACTCCCATGGTATAACAGGGGCGTTGGACTCCTGTG)以及引物sll0208/9-KO3(GTTATACCATGGGAGTGTGAACCTAGGTGCGTGGCCGACAGGATAGGG-CGTGT)与引物sll0208/9-KO4(CGCGGATCCAACGCATCCTCACTAGTCGGG)，扩增约1kb的上游和下游侧翼DNA。PCR产物用于使用引物sll0208/9-KO1和sll0208/9-KO4的交叉(cross-over)PCR中，以扩增约2kb的sll0208/sll0209缺失盒，该缺失盒被克隆到克隆载体pUC19的BamHI位点。然后，使用引物Kan-aph-F(CATGCCATGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTG)和Kan-aph-R(CTAGTCTAGAGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAA)，从质粒pRL27(Larsenetal.,Arch.Microbiol.178:193(2002))扩增卡那霉素抗性盒(aph、KanR)，然后用NcoI和XbaI切除所述卡那霉素抗性盒并克隆到sll0208/sll0209缺失盒的NcoI和AvrII位点，从而在pUC19中创造了sll0208/sll0209缺失、KanR插入盒。将不在蓝细菌中复制的含有盒的载体转化到集胞蓝细菌PCC6803中(Zangetal.,2007,J.Microbiol.,vol.45,pp.241)，并且在30℃下，在装备光源的孵育器中，在含有100μg/mL卡那霉素的BG-11琼脂平皿上选择转化体(例如通过双重同源重组的染色体整合体)。将卡那霉素抵抗的菌落再画线一次并然后利用使用诊断引物的PCR进行基因型分析。
将确认的缺失-插入突变体在装备光源的振荡孵育器中的12mL具有50μg/mL卡那霉素的BG11培养基中于30℃培养4天。然后离心1mL的培养基(1分钟、13,000g)并且用0.1mL甲醇提取细胞团。提取后，将样品再次离心，并且如实施例1中所述，将上清进行GC-MS分析。
如图5中所示，sll0208和sll0209基因缺失的集胞蓝细菌PCC6803菌株丢失其产生十七烯和十八烯醛的能力。该结果表明，集胞蓝细菌PCC6803中的sll0208和sll0209基因和其他蓝细菌中的直系同源基因(参见表1)负责这些生物中烷和脂肪醛生物合成。
实施例3.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594的异源表达大肠杆菌中脂肪醛和脂肪醇的产生
扩增编码细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594(YP_400611；推定的生成醛的酶)(SEQIDNO:65)的基因组DNA，并克隆到载体OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体(“OP80-PCC7942_1594”)转化到大肠杆菌MG1655中，并且使细胞于37℃在具有1％(w/v)葡萄糖作为碳源并补充了100μg/mL壮观霉素的M9基本培养基中生长。当培养物的OD600达到0.8-1.0时，用1mMIPTG进行诱导，并且使细胞在37℃再生长18-20小时。用0.5mL乙酸乙酯提取来自0.5mL培养物的细胞。超声处理60分钟后，将样品以15000rpm离心5分钟。如实施例1中所述，通过GC-MS分析溶剂层。
如图6所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594的载体所转化的大肠杆菌细胞产生以下脂肪醛和脂肪醇：十六烷醛、十八烯醛、十四烯醇、十六烯醇、十六烷醇和十八烯醇。该结果表明PCC7942orf1594(i)体内生成作为脱羰的可能底物的醛，并且(ii)可以还原作为底物的酰基ACP，酰基ACP是野生型大肠杆菌细胞中最充足的活化脂肪酸的形式。因此，该酶被称为酰基ACP还原酶。在体内，脂肪醛显然是通过内源大肠杆菌醛还原酶活性被进一步还原为对应的脂肪醇。
实施例4.通过蓝丝菌ATCC51142cce_1430的异源表达大肠杆菌中脂肪醛和脂肪醇的产生
扩增编码蓝丝菌ATCC51142cce_1430(YP_001802846；推定的生成醛的酶)(SEQIDNO:69)的基因组DNA，并克隆到载体OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体转化到大肠杆菌MG1655中，并且使细胞于37℃在具有1％(w/v)葡萄糖作为碳源并补充了100μg/mL壮观霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图7所示，用携带蓝丝菌ATCC51142cce_1430的载体转化的大肠杆菌细胞产生以下脂肪醛和脂肪醇：十六烷醛、十八烯醛、十四烯醇、十六烯醇、十六烷醇和十八烯醇。该结果表明ATCC51142cce_1430(i)体内生成作为脱羰的可能底物的醛，并且(ii)可以还原作为底物的酰基ACP，酰基ACP是野生型大肠杆菌细胞中最充足的活化脂肪酸的形式。因此，该酶也是酰基ACP还原酶。
实施例5.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和细长聚球蓝细菌PCC7942orfl593的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
扩增编码细长聚球蓝细菌PCC7942orfl593(YP_400610；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:1)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例1中所述通过GC-MS进行分析。
如图8所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1593的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的PCC7942_1593分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例6.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
扩增编码点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:5)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例1中所述通过GC-MS进行分析。
如图9所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十三烷、十五烯、十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的Npun02004178分别将十四烷醛、十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛转变为十三烷、十五烯、十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例7.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和集胞蓝细菌PCC6803sll0208的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
扩增编码集胞蓝细菌PCC6803sll0208(NP_442147；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:3)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例1中所述通过GC-MS进行分析。
如图10中所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带集胞蓝细菌PCC6803sll0208的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的Npun02004178分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例8.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和念珠蓝细菌PCC7210alr5283的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
扩增编码念珠蓝细菌PCC7210alr5283(NP_489323；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:7)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例1中所述通过GC-MS进行分析。
如图11所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带念珠蓝细菌PCC7210alr5283的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的alr5283分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例9.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
对编码海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041(YP_001518340；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:9)的基因组DNA进行密码子优化，用于在大肠杆菌中表达(SEQIDNO:46)，合成并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图12所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生十三烷、十五烯、十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的AM1_4041分别将十四烷醛、十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛转变为十三烷、十五烯、十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例10.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和细长嗜热聚球蓝细菌BP-1tll1313的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
对编码细长嗜热聚球蓝细菌BP-1till1313(NP_682103；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:11)的基因组DNA进行密码子优化，用于在大肠杆菌中表达(SEQIDNO:47)，合成并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图13中所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带细长嗜热聚球蓝细菌BP-1till1313的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的till1313分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例11.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和聚球蓝细菌JA-3-3AbCYA_0415的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
对编码聚球蓝细菌JA-3-3AbCYA_0415(YP_473897；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:13)的基因组DNA进行密码子优化，用于在大肠杆菌中表达(SEQIDNO:48)，合成并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图14所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带聚球蓝细菌JA-3-3AbCYA_0415的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的Npun02004178分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例12.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和无类囊体蓝细菌PCC7421gll3146的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
扩增编码无类囊体蓝细菌PCC7421gll3146(NP_926092；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:15)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例1中所述通过GC-MS进行分析。
如图15所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带无类囊体蓝细菌PCC7421gll3146的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的gll3146分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例13.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和海洋原绿球菌MIT9313PMT1231的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
对编码海洋原绿球菌MIT9313PMT1231(NP_895059；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:17)的基因组DNA进行密码子优化，用于在大肠杆菌中表达(SEQIDNO:49)，合成并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化入大肠杆菌MG1655，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图16所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带海洋原绿球菌MIT9313PMT1231的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的PMT1231分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例14.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和海洋原绿球菌CCMP1986PMM0532的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
扩增编码海洋原绿球菌CCMP1986PMM0532(NP_892650；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:19)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例1中所述通过GC-MS进行分析。
如图17所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带海洋原绿球菌CCMP1986PMM0532的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的PMM0532分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例15.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和海洋原绿球菌NATL2APMN2A_1863的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
对编码海洋原绿球菌NATL2APMN2A_1863(YP_293054；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:21)的基因组DNA进行密码子优化，用于在大肠杆菌中表达(SEQIDNO:51)，合成并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图18所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带海洋原绿球菌NATL2APMN2A_1863的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的PMN2A_1863分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例16.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和聚球蓝细菌RS9917RS9917_09941的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
对编码聚球蓝细菌RS9917RS9917_09941(ZP_01079772；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:23)的基因组DNA进行密码子优化，用于在大肠杆菌中表达(SEQIDNO:52)，合成并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图19所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带聚球蓝细菌RS9917RS9917_09941的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的RS9917_09941分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例17.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和聚球蓝细菌RS9917RS9917_12945的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
对编码聚球蓝细菌RS9917RS9917_12945(ZP_01080370；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:25)的基因组DNA进行密码子优化，用于在大肠杆菌中表达(SEQIDNO:53)，合成并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图20所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带聚球蓝细菌RS9917RS9917_12945的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的RS9917_12945分别将十六烷醛和十八烯醛转变为十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例18.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和蓝丝菌ATCC51142cce_0778的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
合成编码蓝丝菌ATCC51142cce_0778(YP_001802195；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:27)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化入大肠杆菌MG1655，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图21所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带蓝丝菌ATCC51142cce_0778的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十三烷、十五烯、十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的ATCC51142cce_0778分别将十四烷醛、十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛转变为十三烷、十五烯、十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例19.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和蓝丝菌PCC7425Cyan7425_0398的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
合成编码蓝丝菌PCC7425Cyan7425_0398(YP_002481151；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:29)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图22所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带蓝丝菌PCC7425Cyan7425_0398的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十三烷、十五烯、十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的Cyan7425_0398分别将十四烷醛、十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛转变为十三烷、十五烯、十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例20.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和蓝丝菌PCC7425Cyan7425_2986的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
合成编码蓝丝菌PCC7425Cyan7425_2986(YP_002483683；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:31)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图23所示，用携带细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和携带蓝丝菌PCC7425Cyan7425_2986的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了与实施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但还产生了十三烷、十五烯、十五烷和十七烯。该结果表明大肠杆菌中的Cyan7425_2986分别将十四烷醛、十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛转变为十三烷、十五烯、十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脱羰酶。
实施例21.通过海洋原绿球菌CCMP1986PMM0533和海洋原绿球菌CCMP1986PMM0532的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
扩增编码海洋原绿球菌CCMP1986PMM0533(NP_892651；推定的生成醛的酶)(SEQIDNO:71)和海洋原绿球菌CCMP1986PMM0532(NP_892650；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:19)的基因组DNA，并分别克隆到载体OP-80的NcoI与EcoRI位点和载体OP-183的NdeI与XhoI位点。将得到的构建体分别转化入及共转化到大肠杆菌MG1655中，并使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图24A所示，仅用携带海洋原绿球菌CCMP1986PMM0533的载体转化的大肠杆菌细胞不产生了任何脂肪醛或脂肪醇。但是，用携带PMM0533和携带PMM0532的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了十六烷醇、十五烷和十七烯(图24B)。该结果表明当PMM0533与例如PMM0532的脱羰酶相互作用时，PMM0533仅提供用于脱羰反应的脂肪醛底物。
实施例22.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041的异源表达在产生脂肪酰CoA的大肠杆菌菌株中烷和烯的产生
合成编码海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041(YP_001518340；推定的脂肪醛脱羰酶)(SEQIDNO:9)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体与OP80-PCC7942_1594共转化到大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD中。在Ptrc启动子的控制下，该菌株表达细胞质形式的大肠杆菌硫酯酶、‘TesA和大肠杆菌酰基CoA合成酶、FadD，并因此产生脂肪酰CoAs。使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例1中所述通过GC-MS进行分析。
如图25所示，用细长聚球蓝细菌PCC7942_1594和海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041共转化的这些大肠杆菌细胞也产生了烷和脂肪醇。该结果表明细长聚球蓝细菌PCC7942_1594能利用酰基CoA作为底物产生十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛，然后所述十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛被海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041分别转变为十五烯、十五烷和十七烯。
实施例23.通过集胞蓝细菌PCC6803sll0209和集胞蓝细菌PCC6803sll0208的异源表达在产生脂肪酰CoA的大肠杆菌菌株中烷和烯的产生
合成编码集胞蓝细菌PCC6803sll0208(NP_442147；推定的脂肪醛脱羰酶)(SEQIDNO:3)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。合成编码集胞蓝细菌PCC6803sll0209(NP_442146；酰基ACP还原酶)(SEQIDNO:67)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NcoI与EcoRI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体共转化到大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD。在Ptrc启动子的控制下，该菌株表达细胞质形式的大肠杆菌硫酯酶、‘TesA和大肠杆菌酰基CoA合成酶、FadD，并因此产生了脂肪酰CoAs。使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例26中所述通过GC-MS进行分析。
如图26所示，用集胞蓝细菌PCC6803sll0209转化的这些大肠杆菌细胞不产生任何脂肪醛或脂肪醇。但是，当用集胞蓝细菌PCC6803sll0208和sll0209共转化时，它们产生了烷、脂肪醛和脂肪醇。该结果表明集胞蓝细菌PCC6803sll0209能利用酰基CoA作为底物产生例如十四烷醛、十六烷醛和十八烯醛的脂肪醛，但只有与脂肪醛脱羰酶共表达时。脂肪醛显然是通过内源大肠杆菌醛还原酶活性被进一步还原为对应的脂肪醇、十四烷醇、十六烷醇和十八烯醇。在本实验中，十八烯醛被集胞蓝细菌PCC6803sll0208转变为十七烯。
实施例24.通过点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178和其一些同系物的异源表达在产生脂肪醛的大肠杆菌菌株中烷和烯的产生
扩增编码点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838；推定的脂肪醛脱羰酶)(SEQIDNO:5)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。扩增编码耻垢分枝杆菌菌株MC2155orfMSMEG_5739(YP_889972，推定的羧酸还原酶)(SEQIDNO:85)的基因组DNA，并克隆到载体OP-180(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位点，受Ptrc启动子控制。将两个得到的构建体共转化到大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA中。在该菌株中，脂肪醛由MSMEG_5739提供，所述MSMEG_5739将游离脂肪酸(通过‘TesA的作用形成)还原为脂肪醛。使细胞于37℃在补充了100μg/mL壮观霉素和100μg/mL羧苄青霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞，并且如实施例1中所述通过GC-MS进行分析。
如图27所示，用携带点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178和携带耻垢分枝杆菌菌株MC2155MSMEG_5739的载体共转化的这些大肠杆菌细胞产生了十三烷、十五烯和十五烷。该结果表明大肠杆菌中的Npun02004178将羧酸还原酶MSMEG_5739提供的十四烷醛、十六烯醛和十六烷醛还原为十三烷、十五烯和十五烷。如图28所示，在建立的相同实验中，以下脂肪醛脱羰酶在大肠杆菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA中表达时，也将MSMEG_5739提供的脂肪醛转变为对应的烷：念珠蓝细菌PCC7210alr5283(SEQIDNO:7)、海洋原绿球菌CCMP1986PMM0532(SEQIDNO:19)、无类囊体蓝细菌PCC7421gll3146(SEQIDNO:15)、聚球蓝细菌RS9917_09941(SEQIDNO:23)、聚球蓝细菌RS991712945(SEQIDNO:25)和海滨蓝藻菌MBIC11017AM1_4041(SEQIDNO:9)。
实施例25：蓝细菌脂肪醛脱羰酶属于非血红素二铁蛋白类。点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178中保守组氨酸定点诱变为苯丙氨酸不废除其催化功能
如实施例13中所讨论的，来自海洋原绿球菌MIT9313(SEQIDNO:18)的假定的蛋白PMT1231是活性脂肪醛脱羰酶。根据可以分辨率获得的PMT1231的三维结构(pdb2OC5A)(参见图29B)，蓝细菌脂肪醛脱羰酶与非血红素二铁蛋白具有结构相似性，特别是与I型核糖核酸酶还原酶亚基β蛋白RNRβ(StubbeandRiggs-Gelasco,TIBS1998,vol.23.,pp.438)(参见图29A)。Ia型和Ib型RNRβ含有介导RNRα的催化活性的二高铁酪氨酰基(核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸)。在大肠杆菌RNRβ中，该酪氨酸在位置122处，并且紧邻于一个活性位点的铁分子。结构比对表明，PMT1231在与RNRbtyr122相同的位置含有苯丙氨酸，这提示蓝细菌脂肪醛脱羰酶的不同催化机制。但是，所有脱羰酶的比对表明，在所有序列中两个酪氨酸残基都是完全保守的，对于PMT1231，为tyr135和tyr138，tyr135紧邻一个活性位点的铁分子(参见图29C)。为了研究两个保守酪氨酸残基之一是否参与蓝细菌脂肪醛脱羰酶的催化机制，按照以下，在Npun02004178(tyr123和tyr126)中用苯丙氨酸替换这些残基。
将编码细长聚球蓝细菌PCC7942ORF1594(SEQIDNO:65)的基因组DNA克隆到载体OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位点，受Ptrc启动子控制。也将编码点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(SEQIDNO:5)的基因组DNA克隆到载体OP-183(pACYC177衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。用后一构建体作模板以在脱羰酶蛋白的位置123和126引入突变，分别使用引物gttttgcgatcgcagcatttaacatttacatccccgttgccgacg和gttttgcgatcgcagcatataacattttcatccccgttgccgacg将酪氨酸改变为苯丙氨酸。然后将得到的构建体转化到大肠杆菌MG1655中。使细胞于37℃在补充了1％葡萄糖(w/v)和100μg/mL羧苄青霉素与壮观霉素的M9基本培养基中生长。按照实施例3培养和提取细胞。
如图30所示，两个Npun02004178Tyr至Phe蛋白变体当与细长聚球蓝细菌PCC7942ORF1594共表达时，是有活性的并产生了烷。该结果表明与Ia型和Ib型RNRβ蛋白相反，脂肪醛脱羰酶的催化机制不涉及酪氨酰基。
实施例26：点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178的生物化学表征
将编码点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(SEQIDNO:5)的基因组DNA克隆到载体pET-15b的NdeI和XhoI位点，受T7启动子控制。得到的Npun02004178蛋白含有N末端His标签。通过常规化学转化技术，用该质粒转化大肠杆菌BL21菌株(DE3)(Invitrogen)。通过以下进行蛋白表达：首先将大肠杆菌菌株的菌落接种在5mL补充了100mg/L羧苄青霉素的LB培养基中，并在37℃振荡过夜，以产生起始培养物。用该起始培养物接种0.5L补充了100mg/L羧苄青霉素的LB培养基。在37℃振荡培养物，直到OD600值达到0.8，并然后添加IPTG至1mM的终浓度。然后，在37℃振荡培养物约3小时。然后，在4℃将培养物以3700rpm离心20分钟。然后，将小团重悬于10mL含有100mM磷酸钠缓冲液的、pH7.2的、补充了细菌蛋白酶逮捕剂(BacterialProteaseArrest)(GBiosciences)的缓冲液中。然后，将细胞在冰上用12W以1.5秒的超声然后静置1.5秒，处理9秒。将该操作5次重复，每个超声处理循环之间间隔1分钟。在4℃，将无细胞提取物以10000rpm离心30分钟。将5mL的Ni-NTA(Qiagen)添加到上清，并将混合物在4℃轻微搅动。使浆液通过柱，从裂解液去除树脂。然后，用30mL含有100mM磷酸钠缓冲液的、pH7.2的、外加30mM咪唑的缓冲液洗涤树脂。最后，用10mLpH7.2的、外加250mM咪唑的100mM磷酸钠缓冲液洗脱蛋白。用200体积pH7.2的、具有20％甘油的100mM磷酸钠缓冲液透析蛋白溶液。使用Bradford检测(Biorad)测定蛋白浓度。获得5.6mg/mL的Npun02004178蛋白。
为了合成用于脱羰酶反应的十八烷醛，将500mg的十八烷醇(Sigma溶解于25mL二氯甲烷。然后，将200mg的氯铬酸吡啶(TCIAmerica)添加到溶液中并搅动过夜。在真空下干燥反应混合物以去除二氯甲烷。将剩余产物重悬于己烷中并通过Whatman滤纸进行过滤。然后，在真空下干燥滤出液，并且重悬于5mL的己烷中，并通过二氧化硅快速色谱进行纯化。将己烷中的混合物上样到重力供给柱(gravityfedcolumn)，然后用两个柱体积的己烷进行洗涤。然后，用8:1的己烷和乙酸乙酯的混合物洗脱十八烷醛。收集含有十八烷醛的部分并使用下文所述的GC/MS方法进行分析。通过本方法测定的最终产物纯度为95％。
为了测试Npun02004178蛋白脱羰活性，建立以下酶检测。在具有以下组分的、pH7.2的、100mM磷酸钠缓冲液中建立200μL反应，所述以下组分为其各自的终浓度：30μM纯化的Npun02004178蛋白、200μM十八烷醛、0.11μg/mL菠菜铁氧还蛋白(Sigma)、0.05单位/mL菠菜铁氧还蛋白还原酶(Sigma)和1mMNADPH(Sigma)。阴性对照包括没有Npun02004178的以上反应、没有十八烷醛的以上反应和没有菠菜铁氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶和NADPH的以上反应。每个反应在用100μL乙酸乙酯提取前，在37℃孵育2小时。使用以下参数通过GC/MS分析样品：运行时间：13.13分钟；柱：HP-5-MSPartNo.19091S-433E(长度30米；I.D.：0.25mm窄径；膜：0.25ìM)；进样：1ìlAgilent6850入口；入口：300C无分流；运载气体：氦；流速：1.3mL/分钟；烘烤温度：75℃保持5分钟、以40℃/分钟到达320、320保持2分钟；检测器：Agilent5975BVLMSD；检测器温度：330℃；扫描：50-550M/Z。用Sigma的十七烷作为测定化合物保留时间和裂解谱的可信参考。
如图31所示，在Npun02004178的存在下，观察到十八烷醛体外转变为十七烷。通过Npun02004178的十八烷醛的酶促脱羰依赖于加入菠菜铁氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白和NADPH。
接下来，确定了蓝细菌铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶能否替代体外脂肪醛脱羰酶检测中的菠菜蛋白。将以下4个基因各自克隆到pET-15b的NdeI和XhoI位点：点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02003626(ZP_00109192，没有n末端别藻蓝蛋白连接物结构域的铁氧还蛋白氧化还原酶petH)(SEQIDNO:87)、点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02001001(ZP_00111633、铁氧还蛋白1)(SEQIDNO:89)、点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02003530(ZP_00109422，铁氧还蛋白2)(SEQIDNO:91)和点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02003123(ZP_00109501，铁氧还蛋白3)(SEQIDNO:93)。如上文所述表达和纯化这4种蛋白。获得1mg/mL的每种铁氧还蛋白和4mg/mL的铁氧还蛋白氧化还原酶。使用较早描述的酶促安排，用蓝细菌铁氧还蛋白氧化还原酶进行测试三种蓝细菌铁氧还蛋白，所述设置具有以下改动。铁氧还蛋白还原酶的终浓度为60μg/mL，铁氧还蛋白为50μg/mL。提取的酶促反应是通过GC/MS，使用以下参数：运行时间：6.33分钟；柱：J&W122-5711DB-5ht(长度15米；I.D.：0.25mm窄径；膜：0.10μM)；进样：1μLAgilent6850入口；入口：300℃无分流；运载气体：氦；流速：1.3mL/分钟；烘烤温度：100℃保持0.5分钟、以30℃/分钟到达260、260保持0.5分钟；检测器：Agilent5975BVLMSD；检测器温度：230℃；扫描：50-550M/Z。
如图32所示，在NADPH和蓝细菌铁氧还蛋白氧化还原酶以及三种蓝细菌铁氧还蛋白中任一种存在下，观察到Npun02004178依赖的十八烷醛至十七烷的体外转变。
实施例27.细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594的生物化学表征
将编码细长聚球蓝细菌PCC7492orf1594(SEQIDNO:65)的基因组DNA克隆到载体pET-28b的NcoI和XhoI位点，受T7启动子控制。得到的PCC7942_orf1594蛋白含有C末端His标签。用该质粒转化大肠杆菌BL21菌株(DE3)(Invitrogen)并且按照实施例22所述表达和纯化PCC7942_orf1594蛋白。蛋白溶液保存在以下缓冲液中：50mM磷酸钠、pH7.5、100mMNaCl、1mMTHP、10％甘油。使用Bradford检测(Biorad)测定蛋白浓度。获得2mg/mL的PCC7942_orf1594蛋白。
为了测试PCC7942_orf1594蛋白酰基ACP或酰基CoA还原酶活性，建立以下酶检测。在具有以下组分的、pH7.5的、50mMTris-HCl缓冲液中建立100μL反应，所述以下组分为其各自的终浓度：10μM纯化的PCC7942_orf1594蛋白、0.01-1mM酰基CoA或酰基ACP、2mMMgCl2、0.2-2mMNADPH。将反应在37℃孵育1小时，并且添加100μL乙酸乙酯(含有5mg/11-十八烷烯作为内部标准)时停止。将样品涡漩15分钟并且以最高速离心3分钟，用于相分离。将80μL的顶层转移到GC玻璃小瓶，并按照实施例26所述通过GC/MS进行分析。根据内部标准，计算所形成的醛的量。
如图33所示，PCC7942_orf1594能够将十八烷酰CoA还原为十八烷醛。还原酶活性需要诸如Mg2+、Mn2+或Fe2+的二价阳离子和作为电子供体的NADPH。NADH不支持还原酶活性。PCC7942_orf1594也能够将十八烯酰CoA和十八烯酰-ACP还原为十八烯醛。在2mMNADPH的存在下，还原十八烷酰CoA、十八烯酰CoA和十八烯酰-ACP的Km值分别测定为45±20μM、82±22μM和7.8±2μM。这些结果表明，PCC7942_orf1594体外还原酰基CoAs和酰基ACPs，并且与酰基CoAs相比，该酶显然对酰基ACPs具有更高的亲和力。在用于PCC7942_orf1594的0.5mM十八烷酰CoA的存在下，NADPH的Km值测定为400±80μM。
接下来，检查了由PCC7942_orf1594催化的从NADPH到脂肪醛的立体特异性氢化物转移。按照以下流程制备含氘NADPH。将5mgNADP+和3.6mgD-葡萄糖-1-d添加到2.5mL的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)。通过添加5单位的来自用于产生R-(4-2H)NADPH的巨大芽孢杆菌(USB公司)或用于产生S-(4-2H)NADPH的嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)(Sigma)的葡萄糖脱氢酶，起始标记的NADPH的酶促产生。将反应在37℃孵育15分钟，使用10KDaMWCOAmiconUltra离心滤器(Millipore)进行离心过滤，在干冰上速冻并保存在-80℃。
体外检测反应含有50mMTris-HCl(pH7.5)、10μM纯化的PCC7942_orf1594蛋白、1mM十八烷酰CoA、2mMMgCl2和50μL含氘NADPH(按照上文所述制备)，总体积100μL。孵育1小时后，如上文所述提取并分析酶促反应的产物。通过GC/MS检测到的得到的脂肪醛为十八烷醛(参见图34)。因为从NADPH的氢化物转移是立体特异性的，所以合成了R-(4-2H)NADPH和S-(4-2H)NADPH。仅使用S-(4-2H)NADPH，观察到具有加1的单位质量的十八烷醛。脂肪醛被标记的事实表明，含重氢的氢已经从标记的NADPH转移到标记的脂肪醛。这表明该酶反应使用NADPH，并且由PCC7942_orf1594催化的氢化物转移是立体特异性的。
实施例28.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594的异源表达在大肠杆菌中脂肪醛和脂肪醇的细胞内和细胞外产生
扩增编码细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594(YP_400611；酰基ACP还原酶)(SEQIDNO:65)的基因组DNA，并克隆到载体OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位点受Ptrc启动子控制。将得到的构建体共转化到大肠杆菌MG1655ΔfadE中，并且使细胞于37℃在15mL具有3％(w/v)作为碳源的葡萄糖并分别补充了100μg/mL壮观霉素和羧苄青霉素的Che-9基本培养基中生长。当培养物的OD600达到0.8-1.0时，用1mMIPTG诱导所述培养物并且使细胞在37℃再生长24-48小时。Che-9基本培养基规定为：6g/LNa2HPO4、3g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、2g/LNH4Cl、0.25g/LMgSO4×7H2O、11mg/LCaCl2、27mg/LFe3Cl×6H2O、2mg/LZnCl×4H2O、2mg/LNa2MoO4×2H2O、1.9mg/LCuSO4×5H2O、0.5mg/LH3BO3、1mg/L硫胺、200mMBis-Tris(pH7.25)和0.1％(v/v)Triton-X100。当培养物的OD600达到1.0-1.2时，用1mMIPTG诱导所述培养物并且允许细胞在37℃再生长40小时。如实施例26中所述，用0.5mL乙酸乙酯提取来自0.5mL培养物的细胞，用于总碳氢化合物产生。此外，通过离心(4000g、室温、10分钟)分离细胞和上清，并分别提取。
该培养物产生620mg/L脂肪醛(十四烷醛、十七烯醛、十七烷醛和十八烯醛)和1670mg/L脂肪醇(十二烷醇、十四烯醇、十四烷醇、十七烯醇、十七烷醇和十八烯醇)。图35显示提取的上清的色谱图。经测定，73％的脂肪醛和脂肪醇在无细胞上清中。
实施例29.通过细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594和点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178的异源表达在大肠杆菌中烷和烯的细胞内和细胞外产生
扩增基因组DNA编码细长聚球蓝细菌PCC7942orf1594(YP_400611；酰基ACP还原酶)(SEQIDNO:65)，并克隆到载体OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位点，受Ptrc启动子控制。扩增编码点状念珠蓝细菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838；脂肪醛脱羰酶)(SEQIDNO:5)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体共转化到大肠杆菌MG1655ΔfadE中，并且使细胞于37℃在15mL具有3％(w/v)作为碳源的葡萄糖并分别补充了100μg/mL壮观霉素和羧苄青霉素的Che-9基本培养基中生长。按照实施例28中所述，使细胞生长、从培养基分离、提取和分析。
该培养物产生了323mg/L烷和烯(十三烷、十五烯、十五烷和十七烯)、367mg/L脂肪醛(十四烷醛、十七烯醛、十七烷醛和十八烯醛)和819mg/L脂肪醇(十四烷醇、十七烯醇、十七烷醇和十八烯醇)。图36表示提取的上清的色谱图。经测定，86％的烷、烯、脂肪醛和脂肪醇在无细胞上清中。
实施例30.通过念珠蓝细菌PCC7210alr5284和念珠蓝细菌PCC7210alr5283的异源表达大肠杆菌中烷和烯的产生
扩增编码念珠蓝细菌PCC7210alr5284(NP_489324；推定的生成醛的酶)(SEQIDNO:81)的基因组DNA，并克隆到载体OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位点，受Ptrc启动子控制。扩增编码念珠蓝细菌PCC7210alr5283(NP_489323；推定的脱羰酶)(SEQIDNO:7)的基因组DNA，并克隆到载体OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位点，受Ptrc启动子控制。将得到的构建体共转化到大肠杆菌MG1655中，并且使细胞于37℃在15mL具有3％(w/v)作为碳源的葡萄糖并分别补充了100μg/mL壮观霉素和羧苄青霉素的Che-9基本培养基中生长(如实施例28所述)。按照实施例3所述，提取和分析来自0.5mL培养物的细胞，并如实施例26所述通过GC-MS进行分析。
如图37所示，用携带念珠蓝细菌PCC7210alr5284和携带念珠蓝细菌PCC7210alr5283的载体共转化的大肠杆菌细胞产生了十三烷、十五烯、十五烷、十四烷醇和十六烷醇。该结果表明念珠蓝细菌PCC7210alr5284和alr5283的共表达足以使大肠杆菌产生脂肪醇、烷和烯。
其他实施方案
应当理解到，尽管对本发明结合其详细的描述进行了描述，但上文的描述意图举例说明而不是限制附加的权利要求的范围所界定的本发明的范围。其他方面、优点和改动在以下权利要求的范围内。

Claims (12)

1.从经改造的微生物产生烷或烯的方法，所述方法包括：
在所述经改造的微生物中表达第一基因，所述第一基因编码催化酰基ACP转变为脂肪醛的酰基-ACP还原酶；
在所述经改造的微生物中表达第二基因，所述第二基因编码催化脂肪醛转变为烷或烯的脱羰酶；
在有效地于无细胞上清中产生烷或烯的条件下在含有碳水化合物碳源的培养基中培养所述经改造的微生物。
2.权利要求1的方法，其中所述酰基-ACP还原酶具有针对酰基-ACP比针对酰基-CoA更高的亲和力。
3.权利要求1的方法，其中所述经改造的微生物选自酵母、真菌、丝状真菌、藻类和细菌。
4.权利要求3的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。
5.权利要求1的方法，其中烷或烯包括C13至C21烷或烯。
6.包含经改造的微生物的细胞培养物，其中，催化酰基ACP转变为脂肪醛的酰基-ACP还原酶和催化脂肪醛转变为烷或烯的脱羰酶在所述经改造的微生物中过表达，并且当在有效地表达所述酰基-ACP还原酶和所述脱羰酶的条件下在含有碳源的培养基中培养所述经改造的微生物时，在所述细胞培养物中产生烷或烯。
7.权利要求6的细胞培养物，其中所述经改造的微生物选自酵母、真菌、丝状真菌、藻类和细菌。
8.权利要求7的细胞培养物，其中所述细菌是大肠杆菌。
9.权利要求6的细胞培养物，其中烷或烯包括C13至C21烷或烯。
10.权利要求6的细胞培养物，其中烷或烯选自十三烷、甲基十三烷、十九烷、甲基十九烷、十七烷、甲基十七烷、十五烷、甲基十五烷、十五烯、十七烯、甲基十五烷和甲基十七烯。
11.权利要求6的细胞培养物，包括具有δ13C为约-15.4或更高的烷或烯。
12.权利要求6的细胞培养物，包括具有fM 14C为至少约1.003的烷或烯。
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