ES2696773T3

ES2696773T3 - Métodos y composiciones para producir ácidos grasos y alcoholes grasos

Info

Publication number: ES2696773T3
Application number: ES15153942T
Authority: ES
Inventors: Andreas Schirmer; Mathew Rude; Shane Brubaker
Original assignee: REG Life Sciences LLC
Current assignee: REG Life Sciences LLC
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2019-01-17
Anticipated expiration: 2029-05-18
Also published as: US20180080053A1; US10150975B2; CN102027109B; CA2722441C; JP2011520455A; US8323924B2; EP2288694B1; CN105483068A; BR122020013701B1; WO2009140696A3; MX343063B; CN105112455B; US20100221798A1; US20190360009A1; KR101739511B1; US20210040514A1; US8658404B2; MX2010012192A; ES2667718T3; ES2667469T3

Abstract

Célula huésped no humana para su uso en la producción de un aldehído graso o un alcohol graso, dicha célula modificada por ingeniería genética para expresar un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65 o 69, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad acil-ACP o acil-CoA reductasa y que es de una cianobacteria.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para producir ácidos grasos y alcoholes grasos

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/053.955, presentada el 16 de mayo de 2008.

Antecedentes de la invención

El petróleo es un recurso natural y limitado que se encuentra en la Tierra en formas líquida, gaseosa o sólida. El petróleo está compuesto principalmente por hidrocarburos, que están compuestos principalmente por carbono e hidrógeno. También contiene cantidades significativas de otros elementos, tales como nitrógeno, oxígeno o azufre, en diferentes formas.

El petróleo es un recurso valioso, pero los productos de petróleo se desarrollan a costes considerables, tanto financieros como ambientales. En primer lugar, deben encontrarse fuentes de petróleo. La exploración de petróleo es una apuesta costosa y arriesgada. El coste de explorar pozos de agua profundos puede superar los 100 millones de dólares. Además, no existe garantía de que estos pozos contengan petróleo. Se estima que sólo el 40% de los pozos perforados conduce a pozos productivos que generan hidrocarburos comerciales. Además del coste económico, la exploración de petróleo conlleva un alto coste ambiental. Por ejemplo, la exploración mar adentro altera los medios marinos circundantes.

Después de que se descubra un pozo productivo, el petróleo debe extraerse de la Tierra a un elevado coste. Durante la recuperación primaria, la presión natural subterránea es suficiente para extraer aproximadamente el 20% del petróleo en el pozo. Según cae esta presión natural, se emplean métodos de recuperación secundaria, si fuera económico. Generalmente, la recuperación secundaria implica aumentar la presión del pozo mediante, por ejemplo, inyección de agua, inyección de gas natural o extracción por inyección de gas. Al usar métodos de recuperación secundaria, se recupera de un 5% a un 15% adicional de petróleo. Una vez que se agotan los métodos de recuperación secundaria, pueden usarse métodos de recuperación terciaria, si fuera económico. Los métodos terciarios implican reducir la viscosidad del petróleo para que sea más fácil de extraer. Al usar métodos de recuperación terciaria, se recupera de un 5% a un 15% adicional de petróleo. Por tanto, incluso en las mejores circunstancias, sólo puede extraerse el 50% del petróleo en un pozo. La extracción de petróleo también conlleva un coste ambiental. Por ejemplo, la extracción de petróleo puede dar como resultado grandes filtraciones de petróleo que aflora a la superficie. Además, la perforación mar adentro implica dragar el fondo marino lo que altera o destruye el medio marino circundante.

Puesto que los depósitos de petróleo no se encuentran de manera uniforme en toda la Tierra, el petróleo debe transportarse a lo largo de grandes distancias desde las regiones productoras de petróleo hasta regiones consumidoras de petróleo. Además de los costes de envío, también existe el riesgo ambiental de vertidos de petróleo devastadores.

En su forma natural, el petróleo crudo extraído de la Tierra tiene pocos usos comerciales. Es una mezcla de hidrocarburos (por ejemplo, parafinas (o alcanos), olefinas (o alquenos), alquinos, naftenos (o cicloalcanos), compuestos alifáticos, compuestos aromáticos, etc.) de longitud y complejidad variables. Además, el petróleo crudo contiene otros compuestos orgánicos (por ejemplo, compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, oxígeno, azufre, etc.) e impurezas (por ejemplo, azufre, sal, ácido, metales, etc.).

Por tanto, el petróleo crudo debe refinarse y purificarse antes de que pueda usarse comercialmente. Debido a su elevada densidad energética y a su fácil transportabilidad, la mayor parte del petróleo se refina dando combustibles, tales como combustibles para transporte (por ejemplo, gasolina, diésel, combustible para aviación, etc.), aceite para calefacción, gas de petróleo licuado, etc.

El petróleo crudo también es una fuente principal de materiales de partida para producir productos petroquímicos. Las dos clases principales de materiales de partida derivados de petróleo son olefinas de cadena corta (por ejemplo, etileno y propileno) y compuestos aromáticos (por ejemplo, isómeros de benceno y xileno). Estos materiales de partida se derivan de hidrocarburos de cadena más larga en petróleo crudo craqueándolo a un coste considerable usando una variedad de métodos, tales como craqueo catalítico, craqueo a vapor o reformado catalítico. Estos materiales de partida se usan para elaborar productos petroquímicos, que no pueden refinarse directamente a partir de petróleo crudo, tal como monómeros, disolventes, detergentes o adhesivos.

Un ejemplo de un material de partida derivado de petróleo crudo es etileno. El etileno se usa para producir productos petroquímicos tales como, polietileno, etanol, óxido de etileno, etilenglicol, poliéster, glicol éter, etoxilato, acetato de vinilo, 1,2-dicloroetano, tricloroetileno, tetracloroetileno, cloruro de vinilo y poli(cloruro de vinilo). Un ejemplo adicional de un material de partida es propileno, que se usa para producir alcohol isopropílico, acrilonitrilo, polipropileno, óxido de propileno, propilenglicol, glicol éteres, butileno, isobutileno, 1,3-butadieno, elastómeros sintéticos, poliolefinas, alfa-olefinas, alcoholes grasos, ácido acrílico, polímeros acrílicos, cloruro de alilo, epiclorohidrina y resinas epoxídicas.

Estos productos petroquímicos pueden usarse entonces para elaborar productos químicos especializados, tales como plásticos, resinas, fibras, elastómeros, productos farmacéuticos, lubricantes o geles. Productos químicos especializados particulares que pueden producirse a partir de materiales de partida petroquímicos son: ácidos grasos, hidrocarburos (por ejemplo, de cadena larga, cadena ramificada, saturados, insaturados, etc.), alcoholes grasos, ésteres, aldehídos grasos, cetonas, lubricantes, etc.

Los productos químicos especializados tienen muchos usos comerciales. Se usan ácidos grasos comercialmente como tensioactivos, por ejemplo, en detergentes y jabones. También pueden usarse como aditivos en combustibles, aceites lubricantes, pinturas, lacas, velas, aceite para ensalada, manteca, cosméticos y emulsionantes. Además, se usan ácidos grasos como activadores del acelerador en productos de caucho. Pueden usarse ácidos grasos como materia prima para producir ésteres metílicos, amidas, aminas, cloruros de ácido, anhídridos, dímeros de cetena, y ácidos peroxi y ésteres.

Los hidrocarburos tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, se usan alcanos de cadena más corta como combustibles. Metano y etano son los constituyentes principales del gas natural. Se usan alcanos de cadena más larga (por ejemplo, desde cinco hasta dieciséis carbonos) como combustibles para transporte (por ejemplo, gasolina, diésel o combustible para aviación). Los alcanos que tienen más de dieciséis átomos de carbono son componentes importantes de aceites combustibles y aceites lubricantes. Incluso alcanos más largos, que son sólidos a temperatura ambiente, pueden usarse, por ejemplo, como cera de parafina. Los alcanos que contienen aproximadamente treinta y cinco carbonos se encuentran en betún, que se usa para revestimiento de carreteras. Además, los alcanos de cadena más larga pueden craquearse para producir hidrocarburos de cadena más corta útiles comercialmente.

Como los alcanos de cadena corta, se usan alquenos de cadena corta en combustibles para transporte. Se usan alquenos de cadena más larga en plásticos, lubricantes y lubricantes sintéticos. Además, se usan alquenos como materia prima para producir alcoholes, ésteres, plastificantes, tensioactivos, aminas terciarias, aceites de recuperación de aceite potenciada, ácidos grasos, tioles, anhídridos alquenilsuccínicos, epóxidos, alcanos clorados, alquenos clorados, ceras, aditivos de combustible y reductores de flujo de arrastre.

Los alcoholes grasos tienen muchos usos comerciales. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias cosmética y alimentaria como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfifílica, los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no iónicos, que son útiles como detergentes. Además, se usan alcoholes grasos en ceras, gomas, resinas, pomadas y lociones farmacéuticas, aditivos de aceites lubricantes, agentes textiles antiestáticos y de acabado, plastificantes, cosméticos, disolventes industriales y disolventes para grasas.

Los ésteres tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, el biodiésel, un combustible alternativo, está comprendido por ésteres (por ejemplo, éster metílico de ácido graso, ésteres etílicos de ácido graso, etc.). Algunos ésteres de bajo peso molecular son volátiles con un olor agradable que los hace útiles como fragancias o agentes saborizantes. Además, se usan ésteres como disolventes para lacas, pinturas y barnices. Además, algunas sustancias que se producen de manera natural, tales como ceras, grasas y aceites están comprendidas por ésteres. Los ésteres también se usan como agentes suavizantes en resinas y plásticos, plastificantes, retardantes de llama y aditivos en gasolina y aceite. Además, los ésteres pueden usarse en la fabricación de polímeros, películas, textiles, colorantes y productos farmacéuticos.

Se usan aldehídos para producir muchos productos químicos especializados. Por ejemplo, se usan aldehídos para producir polímeros, resinas (por ejemplo, baquelita), colorantes, saborizantes, plastificantes, perfumes, productos farmacéuticos y otros productos químicos. Algunos se usan como disolventes, conservantes o desinfectantes. Algunos compuestos naturales y sintéticos, tales como vitaminas y hormonas, son aldehídos. Además, muchos azúcares contienen grupos aldehído.

Se usan comercialmente cetonas como disolventes. Por ejemplo, se usa frecuentemente acetona como disolvente, pero también es un material de partida para elaborar polímeros. También se usan cetonas en lacas, pinturas, explosivos, perfumes y procesamiento de textiles. Además, se usan cetonas para producir alcoholes, alquenos, alcanos, iminas y enaminas.

Además, el petróleo crudo es una fuente de lubricantes. Los lubricantes derivados de petróleo están compuestos normalmente por olefinas, particularmente poliolefinas y alfa-olefinas. Los lubricantes pueden o bien refinarse a partir de petróleo crudo o bien fabricarse usando materiales de partida refinados a partir de petróleo crudo.

Obtener estos productos químicos especializados a partir de petróleo crudo requiere una inversión financiera significativa así como una gran cantidad de energía. También es un procedimiento ineficaz porque, con frecuencia, los hidrocarburos de cadena larga en petróleo crudo se craquean para producir monómeros más pequeños. Estos monómeros se usan entonces como material de partida para fabricar los productos químicos especializados más complejos.

Además de los problemas con la exploración, la extracción, el transporte y el refinamiento de petróleo, el petróleo es un recurso limitado y cada vez más escaso. Una estimación del consumo de petróleo mundial es de 30 miles de millones de barriles al año. Según algunas estimaciones, se prevé que a los niveles actuales de producción, las reservas mundiales de petróleo podrían agotarse antes del año 2050.

Finalmente, la quema de combustibles a base de petróleo libera gases de efecto invernadero (por ejemplo, dióxido de carbono) y otras formas de contaminación atmosférica (por ejemplo, monóxido de carbono, dióxido de azufre, etc.). Según aumenta la demanda mundial de combustibles, la emisión de gases de efecto invernadero y otras formas de contaminación atmosférica también aumenta. La acumulación de gases de efecto invernadero en la atmósfera conduce a un aumento del calentamiento global. Por tanto, además de dañar el medio ambiente a nivel local (por ejemplo, vertidos de petróleo, dragado de medios marinos, etc.), quemar petróleo también daña el medio ambiente a nivel global.

Debido a los desafíos inherentes planteados por el petróleo, existe la necesidad de una fuente de petróleo renovable que no requiere exploración, extracción y transporte a lo largo de largas distancias, o sustancialmente refinada como el petróleo. También existe la necesidad de una fuente de petróleo renovable que pueda producirse de manera económica y sin crear el tipo de daño ambiental producido por la industria del petróleo y la quema de combustibles a base de petróleo. Por motivos similares, también existe la necesidad de una fuente renovable de productos químicos que se derivan normalmente de petróleo.

La entrada de base de datos UnitProt Q54795 se refiere a SEQ ID NO: 66; la anotación automática lo identifica como una oxidorreductasa no especificada adicionalmente.

La entrada de base de datos EMBL U59236 se refiere a SEQ ID NO: 65; la entrada dejó la secuencia sin anotar. Los documentos WO 2007/136762 A2 y WO 2008/119082 A2 describen la producción de alcoholes grasos mediante expresión recombinante de un gen de tioesterasa y un gen de acil-CoA reductasa en un huésped de producción de E. coli.

Sumario de la invención

La invención se basa, al menos en parte, en la identificación de genes cianobacterianos que codifican para polipéptidos biosintéticos de hidrocarburos. Por consiguiente, la presente invención proporciona lo siguiente:

1. Una célula huésped no humana para su uso en la producción de un aldehído graso o un alcohol graso, dicha célula se modifica por ingeniería genética para expresar un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65 ó 69, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad acil-ACP o acil-CoA reductasa y que es de una cianobacteria.

2. Una célula no humana según el punto 1, en la que el polinucleótido está comprendido por un vector recombinante.

3. Una célula no humana según el punto 1, en la que el polinucleótido se incorpora de manera estable en el ADN genómico de la célula huésped.

4. Una célula no humana según uno cualquiera de los puntos 1-3, en la que la célula huésped es una célula microbiana.

5. Una célula no humana según uno cualquiera de los puntos 1-4, en la que la célula huésped es una célula bacteriana.

6. Una célula no humana según uno cualquiera de los puntos 1-5, en la que la célula huésped es una célula de Escherichia o una célula cianobacteriana.

Además se da a conocer en el presente documento un método de producción de un aldehído, comprendiendo el método producir en una célula huésped un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82, o una variante del mismo, y aislar el aldehído de la célula huésped.

Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de identidad con SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82.

Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82 con una o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad reductasa. Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74,

76, 78, 80 u 82, con una o más sustituciones de aminoácido conservadoras. Por ejemplo, el polipéptido comprende una o más de las siguientes sustituciones de aminoácido conservadoras: reemplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina por una treonina; reemplazo de una treonina por una serina; reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, por otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que porta un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, por otro residuo que porta un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, con otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, por otro residuo aromático. El polipéptido puede tener aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,

100, o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de

SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ó 64. En determinadas realizaciones, el polipéptido tiene actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento un método de producción de un aldehído, comprendiendo el método expresar en una célula huésped un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73,

75, 77, 79 u 81. En algunas realizaciones, el método comprende además aislar el aldehído de la célula huésped.

Además se da a conocer en el presente documento una secuencia de nucleótidos que se hibrida con un complemento de SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81, o con un fragmento del mismo, por ejemplo, en condiciones de baja rigurosidad, media rigurosidad, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad.

Además se da a conocer en el presente documento una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que comprende: (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82; o (ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82 con una o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82 con una o más sustituciones de aminoácido conservadoras. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene la misma actividad biológica que un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID

^{N o :}66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 65,

67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81 o un fragmento de la misma. Además se da a conocer en el presente documento una secuencia de nucleótidos que se hibrida con un complemento de SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81 o con un fragmento del mismo, por ejemplo, en condiciones de baja rigurosidad, media rigurosidad, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad. En algunas realizaciones, la actividad biológica es actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento un método que comprende transformar una célula huésped con un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. En algunas realizaciones, el vector recombinante comprende además un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor regulado por desarrollo, específico de orgánulos, específico de tejidos, inducible, constitutivo o específico de células. En realizaciones particulares, el vector recombinante comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia reguladora acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos; (b) un marcador de selección acoplado operativamente a la secuencia de nucleótidos; (c) una secuencia de marcador acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos; (d) un resto de purificación acoplado operativamente a la secuencia de nucleótidos; (e) una secuencia de secreción acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos; y (f) una secuencia de direccionamiento acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos. En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos se incorpora de manera estable en el ADN genómico de la célula huésped, y la expresión de la secuencia de nucleótidos está bajo el control de una región de promotor regulada.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la célula huésped puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula de mamífero, célula vegetal, célula de insecto, célula de levadura, célula de hongo, célula de hongos filamentosos y célula bacteriana.

En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana Gram positiva. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana Gram negativa.

En algunas realizaciones, la célula huésped se selecciona del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces.

En realizaciones particulares, la célula huésped es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus licheniformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis o una célula de Bacillus amyloliquefaciens.

En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhodococcus opacus, una célula de Rhizomucor miehei o una célula de Mucor michei.

En aún otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Streptomyces lividans o una célula de Streptomyces murinus. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Actinomycetes.

En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula CHO, una célula COS, una célula VERO, una célula BHK, una célula HeLa, una célula Cv1, una célula MDCK, una célula 293, una célula 3T3 o una célula PC12.

En realizaciones particulares, la célula huésped es una célula E. coli, tal como una cepa B, una cepa C, una cepa K o una cepa W de una célula de E. coli.

En otras realizaciones, la célula huésped es una célula huésped cianobacteriana. En realizaciones particulares, la célula huésped cianobacteriana es una célula enumerada en la tabla 1.

En algunas realizaciones, el aldehído se secreta por la célula huésped.

En determinadas realizaciones, la célula huésped sobreexpresa un sustrato descrito en el presente documento. El método puede incluir además transformar la célula huésped con un ácido nucleico que codifica para una enzima descrita en el presente documento, y la célula huésped sobreexpresa un sustrato descrito en el presente documento. El método puede incluir además cultivar la célula huésped en presencia de al menos un sustrato descrito en el presente documento. El sustrato puede ser un derivado de ácido graso, una acil-ACP, un ácido graso, una acil-CoA, un aldehído graso, un alcohol graso o un éster graso.

El sustrato de derivado de ácido graso es un sustrato de derivado de ácido graso insaturado, un sustrato de derivado de ácido graso monoinsaturado o un sustrato de derivado de ácido graso saturado. El sustrato de derivado de ácido graso puede ser un sustrato de derivado de ácido graso de cadena lineal, un sustrato de derivado de ácido graso de cadena ramificada o un sustrato de derivado de ácido graso que incluye un resto cíclico.

El derivado de ácido graso puede ser un derivado de ácido graso C3-C25. Por ejemplo, el derivado de ácido graso es un derivado de ácido graso C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24 o C25. En particular, el sustrato de derivado de ácido graso es tetradecanoil-ACP, hexadecanoil-ACP, hexadecenoil-ACP u octadecenoil-ACP.

En determinados aspectos descritos en el presente documento, el aldehído es un aldehído C3-C25. Por ejemplo, el aldehído es un aldehído C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24 o C25. En algunas realizaciones, el aldehído es tetradecanal, hexadecanal, hexadecenal, octadecanal, octadecenal, metiltetradecanal, metiltetradecenal, metilhexadecanal, metilhexadecenal, metiloctadecanal o metiloctadecenal.

El aldehído puede ser un aldehído de cadena lineal, un aldehído de cadena ramificada o un aldehído cíclico.

El método puede incluir además aislar el aldehído de la célula huésped o del medio de cultivo.

Además se da a conocer en el presente documento un microorganismo modificado por ingeniería genética que comprende una secuencia de control exógena incorporada de manera estable en el ADN genómico del microorganismo. En una realización, la secuencia de control se integra aguas arriba de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81.

El polinucleótido puede ser endógeno al microorganismo. El microorganismo puede expresar un nivel aumentado de un aldehido en relación con un microorganismo silvestre. El microorganismo puede ser una cianobacteria.

Además se da a conocer en el presente documento un método de elaboración de un aldehído, comprendiendo el método cultivar un microorganismo modificado por ingeniería genética descrito en el presente documento en condiciones adecuadas para expresión génica, y aislar el aldehído.

Además se da a conocer en el presente documento un método de elaboración de un aldehído, que comprende poner en contacto un sustrato con (i) un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82, o una variante del mismo; (ii) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 70% de identidad con SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71,

73, 75, 77, 79 u 81, o una variante del mismo; o (iii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de

SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ó 64. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido que tiene al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de identidad con SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76,

78, 80 u 82. En algunas realizaciones, el polipéptido has la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72,

74, 76, 78, 80 u 82.

Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. En algunas realizaciones, el polipéptido está codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81.

El sustrato biológico puede ser un derivado de ácido graso, una acil-ACP, un ácido graso, una acil-CoA, un aldehído graso, un alcohol graso o un éster graso.

El derivado de ácido graso puede ser un derivado de ácido graso C3-C25. Por ejemplo, el derivado de ácido graso es un derivado de ácido graso C3, C4, C5, C6, C7, Cs, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23,

C24 o C25. En particular, el sustrato de derivado de ácido graso es tetradecanoil-ACP, hexadecanoil-ACP, hexadecenoil-ACP u octadecenoil-ACP.

El aldehído puede ser un aldehído C3-C25. Por ejemplo, el aldehído es un aldehído C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24 o C25. Se da a conocer en el presente documento un aldehído que es tetradecanal, hexadecanal, hexadecenal, octadecanal, octadecenal, metiltetradecanal, metiltetradecenal, metilhexadecanal, metilhexadecenal, metiloctadecanal o metiloctadecenal.

Además se da a conocer en el presente documento un aldehído producido mediante cualquiera de los métodos o microorganismos descritos en el presente documento. El aldehído puede tener un 813C de aproximadamente -15,4 o mayor. Por ejemplo, el aldehído tiene un 813C de aproximadamente -15,4 a aproximadamente -10,9, por ejemplo, de aproximadamente -13,92 a aproximadamente -13,84. El aldehído también puede tener un fM14C de al menos aproximadamente 1,003. Por ejemplo, el aldehído tiene un fM14C de al menos aproximadamente 1,01 o al menos aproximadamente 1,5. El aldehído puede tener un fM14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.

Además se da a conocer en el presente documento un método de producción de un alcohol graso, comprendiendo el método producir en una célula huésped un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID

NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82, o una variante del mismo, y aislar el alcohol graso de la célula huésped. El alcohol graso puede secretarse por la célula.

Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82 con una o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad reductasa. El polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82, con una o más sustituciones de aminoácido conservadoras. Por ejemplo, el polipéptido comprende una o más de las siguientes sustituciones de aminoácido conservadoras: reemplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina por una treonina; reemplazo de una treonina por una serina; reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, por otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que porta un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, por otro residuo que porta un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, con otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, por otro residuo aromático. Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido que tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ó 64. En determinadas realizaciones, el polipéptido tiene actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento un método de producción de un alcohol graso, comprendiendo el método expresar en una célula huésped un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. El método puede comprender además aislar el alcohol graso de la célula huésped.

Además se da a conocer en el presente documento una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene la misma actividad biológica que un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID ^{N o :}66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos se hibrida con un complemento de SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81 o con un fragmento del mismo, por ejemplo, en condiciones de baja rigurosidad, media rigurosidad, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad. En algunas realizaciones, la actividad biológica es actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento un método que comprende transformar una célula huésped con un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. Además se da a conocer en el presente documento un vector recombinante que comprende además un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor regulado por desarrollo, específico de orgánulos, específico de tejidos, inducible, constitutivo o específico de células. En realizaciones particulares, el vector recombinante comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia reguladora acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos; (b) un marcador de selección acoplado operativamente a la secuencia de nucleótidos; (c) una secuencia de marcador acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos; (d) un resto de purificación acoplado operativamente a la secuencia de nucleótidos; (e) una secuencia de secreción acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos; y (f) una secuencia de direccionamiento acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos. En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos se incorpora de manera estable en el ADN genómico de la célula huésped, y la expresión de la secuencia de nucleótidos está bajo el control de una región de promotor regulada. El método puede incluir además expresar un gen que codifica para una alcohol deshidrogenasa recombinante en la célula huésped.

Además se dan a conocer en el presente documento métodos que pueden producir alcoholes grasos que comprenden un alcohol graso C6-C26. En algunas realizaciones, el alcohol graso comprende un alcohol graso C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 o C26. En realizaciones particulares, el alcohol graso es 1-decanol, 1-dodecanol, alcohol 1 -miristílico, 1-hexadecanol, octadecenol, tetradecenol o hexadecenol.

El alcohol graso puede comprender un alcohol graso de cadena lineal. El alcohol graso puede comprender un alcohol graso de cadena ramificada. El alcohol graso puede comprender un resto cíclico.

El alcohol graso puede ser un alcohol graso insaturado. El alcohol graso puede ser un alcohol graso monoinsaturado. El alcohol graso puede ser un alcohol graso saturado.

Además se da a conocer en el presente documento un alcohol graso producido por cualquiera de los métodos o cualquiera de los microorganismos descritos en el presente documento, o un tensioactivo que comprende un alcohol graso producido por cualquiera de los métodos o cualquiera de los microorganismos descritos en el presente documento.

El alcohol graso puede tener un 813C de aproximadamente -15,4 o más. El alcohol graso puede tener un 813C de aproximadamente -15,4 a aproximadamente -10,9, o de aproximadamente -13,92 a aproximadamente -13,84.

El alcohol graso puede tener un fM14C de al menos aproximadamente 1,003. El alcohol graso puede tener un fM14C de al menos aproximadamente 1,01 o al menos aproximadamente 1,5. El alcohol graso puede tener un fM14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.

Además se da a conocer en el presente documento un ácido nucleico aislado que consiste en no más de aproximadamente 500 nucleótidos de SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. En algunas realizaciones, el ácido nucleico consiste en no más de aproximadamente 300 nucleótidos, no más de aproximadamente 350 nucleótidos, no más de aproximadamente 400 nucleótidos, no más de aproximadamente 450 nucleótidos, no más de aproximadamente 550 nucleótidos, no más de aproximadamente 600 nucleótidos, o no más de aproximadamente 650 nucleótidos, de SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento un ácido nucleico aislado que consiste en no más de aproximadamente el 99%, no más de aproximadamente el 98%, no más de aproximadamente el 97%, no más de aproximadamente el 96%, no más de aproximadamente el 95%, no más de aproximadamente el 94%, no más de aproximadamente el 93%, no más de aproximadamente el 92%, no más de aproximadamente el 91%, no más de aproximadamente el 90%, no más de aproximadamente el 85%, o no más de aproximadamente el 80% de los nucleótidos de SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81. En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido aislado que consiste en no más de aproximadamente 200, no más de aproximadamente 175, no más de aproximadamente 150, o no más de aproximadamente 100 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad reductasa.

Además se da a conocer en el presente documento un polipéptido aislado que consiste en no más de aproximadamente el 99%, no más de aproximadamente el 98%, no más de aproximadamente el 97%, no más de aproximadamente el 96%, no más de aproximadamente el 95%, no más de aproximadamente el 94%, no más de aproximadamente el 93%, no más de aproximadamente el 92%, no más de aproximadamente el 91%, no más de aproximadamente el 90%, no más de aproximadamente el 85%, o no más de aproximadamente el 80% de los aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad reductasa.

Definiciones

En toda la memoria descriptiva, puede hacerse una referencia usando un nombre de gen o nombre de polipéptido abreviado, pero se entiende que un nombre de gen o de polipéptido abreviado de este tipo representa el género de genes o polipéptidos. Tales nombres de genes incluyen todos los genes que codifican para el mismo polipéptido y polipéptidos homólogos que tienen la misma función fisiológica. Los nombres de polipéptido incluyen todos los polipéptidos que tienen la misma actividad (por ejemplo, que catalizan la misma reacción química fundamental). Los números de registro a los que se hace referencia en el presente documento se derivan de la base de datos del NCBI (Centro Nacional para Información de Biotecnología) mantenida por el Instituto Nacional de Salud, EE. UU. A menos que se indique lo contrario, los números de registro son tal como se proporcionan en la base de datos de abril de 2009.

Los números de EC los establece el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB) (disponible en http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). Los números de EC a los que se hace referencia en el presente documento se derivan de la base de datos KEGG Ligand, mantenida por la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto, patrocinada en parte por la Universidad de Tokio. A menos que se indique lo contrario, los números de EC son tal como se proporcionan en la base de datos de marzo de 2008.

Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

El término “aproximadamente” se usa en el presente documento para significar un valor ± 20% de un valor numérico dado. Por tanto, “aproximadamente el 60%” significa un valor de entre 60 ± (el 20% de 60) (es decir, entre 48 y 70). Tal como se usa en el presente documento, el término “aldehído” significa un hidrocarburo que tiene la fórmula RCHO caracterizado por un grupo carbonilo insaturado (C=O). En una realización preferida, el aldehído es cualquier aldehído hecho de un ácido graso o derivado de ácido graso. En una realización, el grupo R es de al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 carbonos de longitud.

Tal como se usa en el presente documento, un “gen biosintético de aldehído” o un “polinucleótido biosintético de aldehído” es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de aldehído.

Tal como se usa en el presente documento, un “polipéptido biosintético de aldehído” es un polipéptido que es una parte de la ruta biosintética de un aldehído. Tales polipéptidos pueden actuar sobre un sustrato biológico para dar un aldehído. En algunos casos, el polipéptido biosintético de aldehído tiene actividad reductasa.

Tal como se usa en el presente documento, el término “alcano” significa un hidrocarburo que contiene sólo enlaces sencillos carbono-carbono.

Tal como se usa en el presente documento, un “gen biosintético de alcano” o un “polinucleótido biosintético de alcano” es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de alcano.

Tal como se usa en el presente documento, un “polipéptido biosintético de alcano” es un polipéptido que es una parte de la ruta biosintética de un alcano. Tales polipéptidos pueden actuar sobre un sustrato biológico para dar un alcano. En algunos casos, el polipéptido biosintético de alcano tiene actividad descarbonilasa.

Tal como se usa en el presente documento, un “gen biosintético de alqueno” o un “polinucleótido biosintético de alqueno” es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de alqueno.

Tal como se usa en el presente documento, un “polipéptido biosintético de alqueno” es un polipéptido que es una parte de la ruta biosintética de un alqueno. Tales polipéptidos pueden actuar sobre un sustrato biológico para dar un alqueno. En algunos casos, el polipéptido biosintético de alqueno tiene actividad descarbonilasa.

Tal como se usa en el presente documento, el término “atenuar” significa debilitar, reducir o disminuir. Por ejemplo, un polipéptido puede atenuarse modificando el polipéptido para reducir su actividad (por ejemplo, modificando una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido).

Tal como se usa en el presente documento, el término “biodiésel” significa un biocombustible que puede ser un sustituto de diésel, que se deriva de petróleo. Puede usarse biodiésel en motores diésel de combustión interna o bien en forma pura, que se denomina biodiésel “puro”, o bien como una mezcla en cualquier concentración con diésel a base de petróleo. El biodiésel puede incluir ésteres o hidrocarburos, tales como aldehídos y alcanos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “biocombustible” se refiere a cualquier combustible derivado de biomasa. Los biocombustibles pueden sustituirse por combustibles a base de petróleo. Por ejemplo, los biocombustibles son inclusivos de combustibles para transporte (por ejemplo, gasolina, diésel, carburante, etc.), combustibles de calefacción y combustibles de generación de electricidad. Los biocombustibles son una fuente de energía renovable.

Tal como se usa en el presente documento, el término “biomasa” se refiere a una fuente de carbono derivada de material biológico. La biomasa puede convertirse en un biocombustible. Una fuente de biomasa a modo de ejemplo es materia vegetal. Por ejemplo, maíz, caña de azúcar o pasto pueden usarse como biomasa. Otro ejemplo no limitativo de biomasa es materia animal, por ejemplo estiércol de vaca. La biomasa también incluye productos residuales de la industria, agricultura, silvicultura y hogares. Ejemplos de tales productos residuales que pueden usarse como biomasa son restos de fermentación, paja, madera, aguas residuales, basura y restos de comida. La biomasa también incluye fuentes de carbono, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos o polisacáridos).

Tal como se usa en el presente documento, la frase “fuente de carbono” se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para usarse como fuente de carbono para crecimiento de células procariotas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden estar en diversas formas, incluyendo, pero sin limitarse a polímeros, hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos y gases (por ejemplo, CO y CO2). Estos incluyen, por ejemplo, diversos monosacáridos, tales como glucosa, fructosa, manosa, y galactosa; oligosacáridos, tales como fructo-oligosacárido y galacto-oligosacárido; polisacáridos tales como xilosa y arabinosa; disacáridos, tales como sacarosa, maltosa, y turanosa; material celulósico, tal como metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio; ésteres de ácidos grasos saturados o insaturados, tales como succinato, lactato, y acetato; alcoholes, tales como etanol o mezclas del mismo. La fuente de carbono también puede ser un producto de la fotosíntesis, incluyendo, pero sin limitarse a, glucosa. Una fuente de carbono preferida es biomasa. Otra fuente de carbono preferida es glucosa.

Tal como se usa en el presente documento, un “aditivo de reducción del punto de turbidez” es un aditivo añadido a una composición para disminuir o reducir el punto de turbidez de una disolución.

Tal como se usa en el presente documento, la frase “punto de turbidez de un fluido” significa la temperatura a la que los sólidos disueltos ya no son completamente solubles. Por debajo de esta temperatura, los sólidos empiezan a precipitar como fase secundaria dando al fluido un aspecto turbio. En la industria del petróleo, punto de turbidez se refiere a la temperatura por debajo de la que un material solidificado u otro hidrocarburo pesado cristalizan en un aceite crudo, aceite refinado, o combustible para formar un aspecto turbio. La presencia de materiales solidificados influye en el comportamiento de flujo del fluido, la tendencia del fluido a atascar los filtros de combustible, inyectores, etc., la acumulación de materiales solidificados sobre superficies frías (por ejemplo, un ensuciamiento de intercambiador de calor o tubería), y las características de emulsión del fluido con agua.

Una secuencia de nucleótidos es “complementaria” a otra secuencia de nucleótidos si cada una de las bases de las dos secuencias coincide (es decir, puede formar pares de bases de Watson Crick). El término “hebra complementaria” se usa en el presente documento de manera intercambiable con el término “complemento”. El complemento de una hebra de ácido nucleico puede ser el complemento de una hebra codificante o el complemento de una hebra no codificante.

Tal como se usa en el presente documento, el término “condiciones suficientes para permitir la expresión” significa cualquier condición que permite que una célula huésped produzca un producto deseado, tal como un polipéptido, aldehído, o alcano descrito en el presente documento. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentación. Las condiciones de fermentación pueden comprender muchos parámetros, tales como intervalos de temperatura, niveles de aireación y composición de los medios. Cada una de estas condiciones, de manera individual y en combinación, permite que la célula huésped crezca. Los medios de cultivo a modo de ejemplo incluyen caldos o geles. Generalmente, el medio incluye una fuente de carbono, tal como glucosa, fructosa, celulosa, o similar, que puede metabolizarse mediante una célula huésped directamente. Además, pueden usarse enzimas en el medio para facilitar la movilización (por ejemplo, la despolimerización de almidón o celulosa a azúcares fermentables) y posterior metabolismo de la fuente de carbono.

Para determinar si las condiciones son suficientes para permitir la expresión, puede cultivarse una célula huésped, por ejemplo, durante aproximadamente 4, 8, 12, 24, 36 ó 48 horas. Durante y/o después de cultivar, pueden obtenerse muestras y analizarse para determinar si las condiciones permiten la expresión. Por ejemplo, las células huésped en la muestra o el medio en el que las células huésped se cultivaron pueden someterse a prueba para determinar la presencia de un producto deseado. Cuando se somete a prueba la presencia de un producto, pueden usarse ensayos, tales como, pero sin limitarse a, CCF, HPLC, CG/FID, CG/EM, CL/EM, EM.

Se entiende que los polipéptidos descritos en el presente documento pueden tener sustituciones de aminoácidos conservadoras o no esenciales adicionales, que no tienen un efecto sustancial sobre las funciones del polipéptido. Si una sustitución particular será o no tolerada (es decir, no afectará de manera adversa a las propiedades biológicas deseadas, tales como actividad descarboxilasa) puede determinarse tal como se describe en Bowie et al., Science (1990) 247:1306 1310. Una “sustitución de aminoácido conservadora” es una en la que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Tal como se usa en el presente documento, “elemento de control” significa un elemento de control de la transcripción. Los elementos de control incluyen promotores y potenciadores. El término “elemento de promotor”, “promotor” o “secuencia de promotor” se refiere a una secuencia de ADN que funciona como un interruptor que activa la expresión de un gen. Si el gen se activa, se dice que está transcrito o que participa en la transcripción. Transcripción implica la síntesis de ARNm a partir del gen. Por tanto, un promotor sirve como elemento regulador de la transcripción y también proporciona un sitio para el inicio de la transcripción del gen en ARNm. Los elementos de control interactúan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción (Maniatis et al., Science 236:1237, 1987).

Tal como se usa en el presente documento, el término “éster sintasa” significa un péptido que puede producir ásteres grasos. Más específicamente, una éster sintasa es un péptido que convierte un tioéster en un éster graso. En una realización preferida, la éster sintasa convierte un tioéster (por ejemplo, acil-CoA) en un éster graso.

En una realización alternativa, una éster sintasa usa un tioéster y un alcohol como sustratos para producir un éster graso. Las éster sintasas pueden usar tioésteres de cadena corta y larga como sustratos. Además, las éster sintasas pueden usar alcoholes de cadena corta y larga como sustratos.

Ejemplos no limitativos de éster sintasas son cera sintasas, cera-éster sintasas, acil-CoA:alcohol transacilasas, aciltransferasas y acil graso-coenzima A:alcohol graso aciltransferasas. Éster sintasas a modo de ejemplo se clasifican en número de clasificación de enzima EC 2.3.1.75. En la figura 40 se proporcionan números de registro de GenBank a modo de ejemplo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ácido graso” significa un ácido carboxílico que tiene la fórmula RCOOH. R representa un grupo alifático, preferiblemente un grupo alquilo. R puede comprender entre aproximadamente 4 y aproximadamente 22 átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden ser saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. En una realización preferida, el ácido graso está compuesto por una ruta biosintética de ácido graso.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ruta biosintética de ácido graso” significa una ruta biosintética que produce ácidos grasos. La ruta biosintética de ácido graso incluye enzimas de ácido graso que pueden modificarse por ingeniería genética, tal como se describe en el presente documento, para producir ácidos grasos, y en algunas realizaciones puede expresarse con enzimas adicionales para producir ácidos grasos que tienen características de cadena de carbono deseadas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “derivado de ácido graso” significa productos compuestos en parte a partir de la ruta biosintética de ácido graso del organismo huésped de producción. “Derivado de ácido graso” también incluye productos compuestos en parte a partir de acil-ACP o derivados de acil-ACP. La ruta biosintética de ácido graso incluye enzimas ácido graso sintasa que pueden modificarse por ingeniería genética tal como se describe en el presente documento para producir derivados de ácidos grasos, y en algunos ejemplos pueden expresarse con enzimas adicionales para producir derivados de ácidos grasos que tienen características de cadena de carbono deseadas. Los derivados de ácidos grasos a modo de ejemplo incluyen por ejemplo, ácidos grasos, acil-CoA, aldehído graso, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos, alcoholes grasos y ésteres (por ejemplo, ceras, ésteres de ácido graso o ésteres grasos).

Tal como se usa en el presente documento, el término “enzimas de derivados de ácidos grasos” significa todas las enzimas que pueden expresarse o sobreexpresarse en la producción de derivados de ácidos grasos. Estas enzimas se denominan conjuntamente en el presente documento enzimas de derivados de ácidos grasos. Estas enzimas pueden ser parte de la ruta biosintética de ácido graso. Los ejemplos no limitativos de enzimas de derivados de ácidos grasos incluyen ácido graso sintasas, tioesterasas, acil-CoA sintasas, acil-CoA reductasas, alcohol deshidrogenasas, alcohol aciltransferasas, acil-CoA reductasa que forma alcohol graso, éster sintasas, polipéptidos biosintéticos de aldehído y polipéptidos biosintéticos de alcano . Enzimas de derivados de ácidos grasos convierten un sustrato en un derivado de ácido graso. En algunos ejemplos, el sustrato puede ser un derivado de ácido graso que la enzima de derivado de ácido graso convierte en un derivado de ácido graso diferente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “péptido que forma alcohol graso” significa un péptido que puede catalizar la conversión de acil-CoA en alcohol graso, incluyendo acil-CoA reductasa que forma alcohol graso (FAR, EC 1.1.1.*), acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50) o alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). Además, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos de los péptidos que forman alcohol graso catalizarán también otras reacciones. Por ejemplo, algunos péptidos de acil-CoA reductasa aceptarán otros sustratos además de ácidos grasos. Por tanto, también se incluyen tales péptidos no específicos. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para péptidos que forman alcohol graso se conocen en la técnica, y tales péptidos están disponibles públicamente. En la figura 40 se proporcionan números de registro de GenBank a modo de ejemplo.

Tal como se usa en el presente documento, “enzima de ácido graso” significa cualquier enzima implicada en la biosíntesis de ácido graso. Las enzimas de ácido graso pueden expresarse o sobreexpresarse en células huésped para producir ácidos grasos. Los ejemplos no limitativos de enzimas de ácido graso incluyen ácido graso sintasas y tioesterasas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “éster graso” significa un éster. En una realización preferida, un éster graso es cualquier éster que está compuesto por un ácido graso, por ejemplo un éster de ácido graso. En una realización, un éster graso contiene un lado A (es decir, la cadena de carbono unida al oxígeno carboxilato) y un lado B (es decir, la cadena de carbono que comprende el carboxilato original). En una realización preferida, cuando el éster graso se deriva a partir de la ruta biosintética de ácido graso, el lado A está contribuido por un alcohol, y el lado B está contribuido por un ácido graso. Cualquier alcohol puede usarse para formar el lado A de los ésteres grasos. Por ejemplo, el alcohol puede derivarse de la ruta biosintética de ácido graso. Alternativamente, el alcohol puede producirse a través de las rutas biosintéticas de ácidos no grasos. Además, el alcohol puede proporcionarse de manera exógena. Por ejemplo, el alcohol puede suministrarse en el caldo de fermentación en casos en los que el éster graso se produce mediante un organismo. Alternativamente, un ácido carboxílico, tal como un ácido graso o ácido acético, puede suministrarse de manera exógena en casos en los que el éster graso se produce mediante un organismo que también puede producir alcohol.

Las cadenas de carbono que comprenden el lado A o el lado B pueden ser de cualquier longitud. En una realización, el lado A del éster es al menos de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 ó 18 carbonos de longitud. El lado B del éster es de al menos aproximadamente 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ó 26 carbonos de longitud. El lado A y/o el lado B pueden ser de cadena lineal o ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener uno o más puntos de ramificación. Además, las cadenas ramificadas pueden incluir ramas cíclicas. Además, el lado A y/o el lado B pueden ser saturados o insaturados. Si son insaturados, el lado A y/o el lado B pueden tener uno o más puntos de insaturación.

En una realización, el éster graso se produce de manera biosintética. En esta realización, en primer lugar se “activa” el ácido graso. Ejemplos no limitativos de ácidos grasos “activados” son acil-CoA, acil-ACP y fosfato de acilo. Acil-CoA puede ser un producto directo de biosíntesis o degradación de ácido graso. Además, acil-CoA puede sintetizarse a partir de un ácido graso libre, una CoA, o un nucleótido trifosfato de adenosina (ATP). Un ejemplo de una enzima que produce acil-CoA es acil-CoA sintasa.

Después de que se active el ácido graso, pueden transferirse fácilmente a un nucleófilo receptor. Nucleófilos a modo de ejemplo son alcoholes, tioles o fosfatos.

En una realización, el éster graso es una cera. La cera puede derivarse de un alcohol de cadena larga y un ácido graso de cadena larga. En otra realización, el éster graso puede derivarse de un acil-tioéster graso y un alcohol. En otra realización, el éster graso es un tioéster de ácido graso, por ejemplo acil graso-coenzima A (CoA). En otras realizaciones, el éster graso es un pantotenato de acilo graso, una proteína portadora de acilo (ACP) o un éster de fosfato graso. Los ésteres grasos tienen muchos usos. Por ejemplo, pueden usarse ésteres grasos como biocombustible.

Tal como se usa en el presente documento, “fracción de carbono moderno” o “fM” tiene el mismo significado que el definido por los Materiales de referencia convencionales (SRM) 4990B y 4990C del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NTST), conocidos como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se refiere a 0,95 veces la razón de isótopo 14C/12C HOxI (denominado AD 1950). Esto es aproximadamente equivalente a madera previa a la Revolución Industrial con decaimiento corregido. Para la biosfera viva actual (material vegetal), la fM es de aproximadamente 1.1.

Los cálculos de “homología” entre dos secuencias pueden realizarse tal como sigue. Las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en uno o ambos de un primer y un segundo aminoácido o secuencia de ácido nucleico para alineación óptima y pueden descartarse secuencias no homólogas con fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia que se alinea con fines de comparación es de al menos aproximadamente el 30%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 40%, más preferiblemente de al menos aproximadamente el 50%, incluso más preferiblemente de al menos aproximadamente el 60%, e incluso más preferiblemente de al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Se comparan entonces los residuos de aminoácido o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido. Cuando una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se usa en el presente documento, “identidad” de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a “homología” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, considerando el número de huecos y la longitud de cada hueco, que han de introducirse para alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación de porcentaje de homología entre dos secuencias pueden lograrse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:444 453, algoritmo que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando o bien una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En aún otra realización preferida, el porcentaje de homología entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un conjunto particularmente preferido de parámetros (y el que debe usarse si el practicante está inseguro sobre qué parámetros deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología de las reivindicaciones) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalidad de hueco de 12, una penalidad de extensión de hueco de 4 y una penalidad de hueco de desplazamiento del marco de lectura de 5.

Tal como se usa en el presente documento, un “célula huésped” es una célula usada para producir un producto descrito en el presente documento (por ejemplo, un aldehído o alcano descrito en el presente documento). Una célula huésped puede modificarse para expresar o sobreexpresar genes seleccionados o para tener expresión atenuada de genes seleccionados. Los ejemplos no limitativos de células huésped incluyen células vegetales, de animales, humanas, bacterianas, de levadura o de hongos filamentosos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “se hibrida en condiciones de baja rigurosidad, media rigurosidad, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad” describe condiciones para la hibridación y el lavado. Puede encontrarse una guía para realizar las reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y puede usarse cualquier método. Las condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en el presente documento son tal como sigue: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% al menos a 50°C (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55°C para condiciones de rigurosidad baja); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 60°C; 3) condiciones de hibridación de rigurosidad alta en ^sS^c6X a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 65°C; y preferiblemente 4) condiciones de hibridación de rigurosidad muy altas son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65°C, seguido por uno o más lavados a SSC 0,2X, SDS al 1% a 65°C. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones preferidas a menos que se especifique lo contrario.

El término “aislado” tal como se usa en el presente documento con respecto a ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN, se refiere a moléculas separadas de otros ADN u ARN, respectivamente, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Además, un “ácido nucleico aislado” incluye fragmentos de ácido nucleico, tales como fragmentos que no se producen de manera natural. El término “aislado” también se usa en el presente documento para referirse a polipéptidos, que se aíslan a partir de otras proteínas celulares, y abarca tanto polipéptidos endógenos purificados como polipéptidos recombinantes. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente libre de material celular, material viral, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Tal como se usa en el presente documento, el “nivel de expresión de un gen en una célula” se refiere al nivel de ARNm, transcrito(s) nacientes de pre-ARNm, transcrito que procesa productos intermedios, ARNm maduro(s) y/o productos de degradación codificados por el gen en la célula.

Tal como se usa en el presente documento, el término “microorganismo” significa especies microbianas procariotas y eucariotas de los dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, incluyendo el último levadura y hongos filamentosos, protozoos, algas, o Protista superiores. El término “célula microbiana”, tal como se usa en el presente documento, significa una célula de un microorganismo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ácido nucleico” se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (ARN). El término también incluye análogos de o bien ARN o bien ADN compuestos por análogos de nucleótido, y, tal como es aplicable a la realización que está describiéndose, polinucleótidos monocatenarios y bicatenarios (sentido o antisentido), EST, cromosomas, ADNc, ARNm y ARNr.

Tal como se usa en el presente documento, el término “unido operativamente” significa que una secuencia de nucleótidos seleccionada (por ejemplo, que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento) está en proximidad con un promotor para permitir que el promotor regule la expresión de la secuencia de nucleótidos seleccionada. Además, el promotor se sitúa aguas arriba de la secuencia de nucleótidos seleccionada en cuanto a la dirección de la transcripción y traducción. Por “unido operativamente” quiere decirse que una secuencia de nucleótidos y una(s) secuencia(s) reguladora(s) se conectan de tal manera para permitir la expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas de activador de la transcripción) se unen a la(s) secuencia(s) reguladora(s).

El término “o” se usa en el presente documento para significar, y se usa de manera intercambiable con, el término “y/o”, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Tal como se usa en el presente documento, “sobreexpresar” significa expresar o provocar que se exprese un ácido nucleico, polipéptido o hidrocarburo en una célula a una concentración mayor que la que se expresa normalmente en una célula silvestre correspondiente. Por ejemplo, un polipéptido puede “sobreexpresarse” en una célula huésped recombinante cuando el polipéptido está presente en una mayor concentración en la célula huésped recombinante en comparación con su concentración en una célula huésped no recombinante de la misma especie.

Tal como se usa en el presente documento, “coeficiente de reparto”, o “P”, se define como la concentración en equilibrio de un compuesto en una fase orgánica dividida entre la concentración en equilibrio en una fase acuosa (por ejemplo, caldo de fermentación). En una realización de un sistema bifásico descrito en el presente documento, la fase orgánica se forma mediante el aldehido o alcano durante el proceso de producción. Sin embargo, en algunos ejemplos, puede proporcionarse una fase orgánica, tal como proporcionando una capa de octano, para facilitar la separación del producto. Cuando se describe un sistema bifásico, las características de reparto de un compuesto pueden describirse como logP. Por ejemplo, un compuesto con un logP de 1 repartiría 10:1 con respecto a la fase orgánica. Un compuesto con un logP de -1 repartiría 1:10 con respecto a la fase orgánica. Al elegir un caldo de fermentación y fase orgánica apropiados, un aldehído o alcano con un alto valor de logP puede separarse para dar la fase orgánica incluso a concentraciones muy bajas en el recipiente de fermentación.

Tal como se usa en el presente documento, el término “purificar”, “purificado” o “purificación” significa la retirada o aislamiento de una molécula de su entorno mediante, por ejemplo, aislamiento o separación. Moléculas “sustancialmente purificadas” están al menos aproximadamente el 60% libres, preferiblemente al menos aproximadamente el 75% libres, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% libres de otros componentes con los que se asocian. Tal como se usa en el presente documento, estos términos también se refieren a la retirada de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la retirada de contaminantes puede dar como resultado un aumento del porcentaje de aldehídos o alcanos en una muestra. Por ejemplo, cuando se producen aldehídos o alcanos en una célula huésped, los aldehídos o alcanos pueden purificarse mediante la retirada de proteínas de la célula huésped. Tras la purificación, el porcentaje de aldehídos o alcanos en la muestra se aumenta. Los términos “purificar”, “purificado” y “purificación” no requieren pureza absoluta. Son términos relativos. Por tanto, por ejemplo, cuando se producen aldehídos o alcanos en células huésped, un aldehído purificado o alcano purificado es uno que se separa sustancialmente de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos, hidratos de carbono u otros hidrocarburos). En otro ejemplo, una preparación de aldehído purificado o alcano purificado es una en la que el aldehído o alcano está sustancialmente libre de contaminantes, tales como aquellos que pueden estar presentes tras la fermentación. En algunas realizaciones, un aldehído o un alcano se purifica cuando al menos aproximadamente el 50% en peso de una muestra está compuesto por el aldehído o alcano. En otras realizaciones, un aldehído o un alcano se purifican cuando al menos aproximadamente el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 92%, el 95%, el 98% o el 99% o más en peso de una muestra está compuesto por el aldehído o alcano.

Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido recombinante” se refiere a un polipéptido que se produce mediante técnicas de ADN recombinante, en la que generalmente ADN que codifica para el polipéptido expresado o ARN se inserta en un vector de expresión adecuado y que a su vez se usa para transformar una célula huésped para producir el polipéptido o ARN.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente idéntico” (o “sustancialmente homólogo”) se usa para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número suficiente de residuos de aminoácido o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadas) con respecto a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos de modo que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos primera y segunda tienen actividades similares.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sintasa” significa una enzima que cataliza un procedimiento de síntesis. Tal como se usa en el presente documento, el término sintasa incluye sintasas, sintetasas y ligasas. Tal como se usa en el presente documento, el término “transfección” significa la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, por medio de un vector de expresión) en una célula receptora mediante transferencia de genes mediada por ácido nucleico.

Tal como se usa en el presente documento, “transformación” se refiere a un procedimiento en el que el genotipo de una célula se cambia como resultado de la captación celular de ácido nucleico exógeno. Esto puede dar como resultado que la célula transformada exprese una forma recombinante de un ARN o polipéptido. En el caso de expresión antisentido del gen transferido, se altera la expresión de una forma que se produce de manera natural del polipéptido.

Tal como se usa en el presente documento, una “proteína de transporte” es un polipéptido que facilita el movimiento de uno o más compuestos en y/o fuera de un orgánulo celular y/o una célula.

Tal como se usa en el presente documento, una “variante” de polipéptido X se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de polipéptido X en la que uno o más residuos de aminoácido se alteran. La variante puede tener cambios conservadores o cambios no conservadores. Puede encontrarse una guía para determinar qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin afectar a la actividad biológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, software LASERGENE (DNASTAR).

El término “variante”, cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótido, puede abarcar una secuencia de polinucleótido relacionada con la de un gen o la secuencia codificante del mismo. Esta definición también puede incluir, por ejemplo, variantes “alélicas”, “de corte y empalme”, “de especies” o “polimórficas”. Una variante de corte y empalme puede tener una identidad significativa con respecto a un polinucleótido de referencia, pero tendrá generalmente un número mayor o menor de polinucleótidos debido a corte y empalme alternativo de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipéptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especies son secuencias de polinucleótido que varían de una especie a otra. Los polipéptidos resultantes tendrán generalmente una identidad de aminoácido significativa en relación entre sí. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótido de un gen particular entre individuos de una especie dada.

Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector útil es un episoma (es decir, un ácido nucleico que puede realizar replicación extracromosómica). Vectores útiles son aquellos que pueden realizar replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los que se unen. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que se unen operativamente se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de “plásmidos”, que se refieren generalmente a bucles de ADN bicatenario circular que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” se usan de manera intercambiable, puesto que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, también se incluyen otras formas de vectores de expresión que sirven funciones equivalentes y que se vuelven conocidas en la técnica posteriormente aquí presente.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente invención, se describen a continuación métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitativos.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de Prochlorococcus marinus CCMP1986. La figura 1B es un patrón de fragmentación de masa del pico a 7,55 min de la figura 1A.

La figura 2A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de Nostoc punctiforme PCC73102. La figura 2B es un patrón de fragmentación de masa del pico a 8,73 min de la figura 2A.

La figura 3A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de Gloeobaceter violaceus ATCC29082. La figura 3B es un patrón de fragmentación de masa del pico a 8,72 min de la figura 3A.

La figura 4A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de Synechocystic sp. PCC6803. La figura 4B es un patrón de fragmentación de masa del pico a 7,36 min de la figura 4A.

La figura 5A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células silvestres de Synechocystis sp. PCC6803. La figura 5B es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de Synechocystis sp. PCC6803 con una deleción de los genes sll0208 y sll0209.

La figura 6A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células silvestres de E. coli MG1655. La figura 6B es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65).

La figura 7 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli que expresan Cyanothece sp. ATCC51142 cce_1430 (YP_001802846) (SEQ ID NO: 69).

La figura 8A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400610 (Synpcc7942_1593) (SEQ ID NO: 1). La figura 8B representa patrones de fragmentación de masa del pico a 6,98 min de la figura 8A y de pentadecano. La figura 8C representa patrones de fragmentación de masa del pico a 8,12 min de la figura 8A y de 8-heptadeceno.

La figura 9 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 5).

La figura 10 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Synechocystis sp. PCC6803 sll0208 (NP_442147) (SEQ ID NO: 3).

La figura 11 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Nostoc sp. PCC7210 alr5283 (NP_489323) (SEQ ID NO: 7).

La figura 12 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Acaryochloris marina optimizado con codón MBIC11017 AM1_4041 (YP_001518340) (SEQ ID NO: 46).

La figura 13 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Thermosynechococcus elongatus optimizado con codón BP-1 tll1313 (NP_682103) (SEQ ID ⁿO: 47).

La figura 14 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Synechococcus sp. optimizado con codón JA-3-3Ab CYA_0415 (YP_473897) (SEQ ID NO: 48).

La figura 15 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Gloeobacter violaceus PCC7421 gll3146 (NP_926092) (SEQ ID NO: 15).

La figura 16 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Prochlorococcus marinus optimizado con codón MIT9313 PMT1231 (NP_895059) (SEQ ID NO: 49).

La figura 17 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0532 (NP_892650) (SEQ ID NO: 19).

La figura 18 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Prochlorococcus marinus optimizado con codón NATL2A PMN2A_1863 (YP_293054) (SEQ ID NO: 51).

La figura 19 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Synechococcus sp. optimizado con codón RS9917 RS9917_09941 (ZP_01079772) (SEQ ID NO: 52).

La figura 20 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Synechococcus sp. optimizado con codón RS9917 RS9917_12945 (ZP_01080370) (SEQ ID NO: 53).

La figura 21 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Cyanothece sp. ATCC51142 cce_0778 (YP_001802195) (SEQ ID NO: 27).

La figura 22 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Cyanothece sp. PCC7425 Cian7425_0398 (YP_002481151) (SEQ ID NO: 29).

La figura 23 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Cyanothece sp. PCC7425 Cyan7425_2986 (YP_002483683) (SEQ ID NO: 31).

La figura 24A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0533 (NP_892651) (S^eQ ID NO: 71). La figura 24B es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0533 (NP_892651) (SEQ ID NO: 71) y Prochlorococcus marinus CCMP1986 PMM0532 (NP_892650) (SEQ ID NO: 19).

La figura 25A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc 'tesA-fadD. La figura 25B es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc 'tesA-fadD que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Acaryochloris marina MBIC11017 AM1_4041 (YP_001518340) (SEQ ID NO: 9).

La figura 26A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc 'tesA-fadD que expresan Synechocystis sp. PCC6803 sll0209 (NP_442146) (SEQ ID NO: 67). La figura 26B es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc 'tesA-fadD que expresan Synechocystis sp. PCC6803 sll0209 (n P_442146) (SEQ ID NO: 67) y Synechocystis sp. PCC6803 sll0208 (NP_442147) (SEQ ID NO: 3).

La figura 27A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc-'tesA que expresan la cepa de M. smegmatis MC2155 Ms MEG_5739 (YP_889972) (SEQ ID NO: 85). La figura 27B es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc- 'tesA que expresan la cepa de M. smegmatis MC2 155 MSMEG_5739 (YP_889972) (SEQ ID NO: 85) y Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 5).

La figura 28 es una representación gráfica de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc- 'tesA que expresan la cepa de M. smegmatis MC2 155 MSMEG_5739 (YP_889972) (SEQ ID NO: 85) o bien sola o bien en combinación con Nostoc sp. PCC7120 alr5283 (SEQ ID NO: 7), Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (SEQ ID NO: 5), P. marinus CCMP1986 PMM0532 (SEQ ID NO: 19), G. violaceus PCC7421 gll3146 (SEQ ID NO: 15), Synechococcus sp. RS9917_09941 (SEQ ID NO: 23), Synechococcus sp. RS9917_12945 (SEQ ID NO: 25), o A., marina MBIC11017 AM1_4041 (SEQ ID NO: 9).

La figura 29A es una representación de la estructura tridimensional de una proteína de la subunidad p de ribonucleasa reductasa clase I, RNRp. La figura 29B es una representación de la estructura tridimensional de Prochlorococcus marinus MIT9313 PMT1231 (NP_895059) (SEQ ID NO: 17). La figura 29C es una representación de la estructura tridimensional del sitio activo de Prochlorococcus marinus MiT9313 PMT1231 (NP_895059) (SEQ ID NO: 17).

La figura 30A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 5). La figura 30B es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838), variante Y123F. La figura 30C es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838), variante Y126F.

La figura 31 representa trazas de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 6) y octadecanal (A); Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 6), octadecanal, ferredoxina reductasa de espinaca, y NADPH (B); octadecanal, ferredoxina de espinaca, ferredoxina reductasa de espinaca, y NADPH (C); o Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 6), ferredoxina de espinaca, y ferredoxina de espinaca (D).

La figura 32 representa trazas de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 6), NADPH, octadecanal, y o bien (A) ferredoxina de espinaca y ferredoxina reductasa de espinaca; (B) N. punctiforme PCC73102 Npun02003626 (ZP_00109192) (SEQ ID NO: 88) y N. punctiforme PCC73102 Npun02001001 (ZP_00111633) (SEQ ID NO: 90); (C) Npun02003626 (ZP_00109192) (SEQ ID NO: 88) y N. punctiforme PCC73102 Npun02003530 (ZP_00109422) (SEQ ID NO: 92); o bien (D) Npun02003626 (ZP_00109192) (SEQ ID NO: 88) y N. punctiforme PCC73102 Npun02003123 (ZP _00109501) (SEQ ID NO: 94).

La figura 33A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66), NADH y Mg2+. La figura 33B es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66), NADPH y Mg2+. La figura 33C es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66) y NADPH.

La figura 34A es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, NADPH marcado, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66), y NADPH no marcado. La figura 34B es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, NADPH marcado, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66), y S-(4-2H)NADPH. La figura 34C es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, NADPH marcado, Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66), y R-(4-2H)NADPH.

La figura 35 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos en el sobrenadante libre de células producido por células de E. coli MG1655 AfadE en medios Che-9 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65).

La figura 36 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos en el sobrenadante libre de células producido por células de E. coli MG1655 AfadE en medios Che-9 que expresan Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Nostoc punctiforme PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 5).

La figura 37 es un trazo de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Nostoc sp. PCC7120 alr5283 (NP_489323) (SEQ ID NO: 7) y Nostoc sp. PCC7120 alr5284 (NP_489324) (SEQ ID NO: 81).

La figura 38 es una lista de ejemplos de homólogos de Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400610 (Synpcc7942_1593) (SEQ ID NO: 1) a partir de una base de datos metagenómica.

La figura 39 es una lista de ejemplos de homólogos de Synechococcus elongatus PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) a partir de una base de datos metagenómica.

La figura 40 es una tabla que identifica diversos genes que pueden expresarse, sobreexpresarse o atenuarse para aumentar la producción de sustratos particulares.

Descripción detallada

Se dan a conocer en el presente documento composiciones y métodos de producción de aldehídos, alcoholes grasos e hidrocarburos (tales como alcanos, alquenos y alquinos) a partir de sustratos, por ejemplo, una acil-ACP, un ácido graso, una acil-CoA, un aldehído graso o un sustrato de alcohol graso (por ejemplo, tal como se describe en el documento PCT/US08/058788). Tales aldehídos, alcanos y alquenos son útiles como biocombustibles (por ejemplo, sustitutos para gasolina, diésel, carburante, etc.), productos químicos especializados (por ejemplo, lubricantes, aditivo de combustible, etc.), o materia prima para conversión química adicional (por ejemplo, combustibles, polímeros, plásticos, textiles, disolventes, adhesivos, etc.). La invención se basa, en parte, en la identificación de genes que están implicados en la biosíntesis de aldehído, alcano y alqueno.

Tales genes biosintéticos de alcano y alqueno incluyen, por ejemplo, Synechococcus elongatus PCC7942 Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO: 1), Synechocystis sp. pCc6803 sll0208 (SEQ ID NO: 3), Nostoc punctiforme PCC 73102 Npun02004178 (SEQ ID NO: 5), Nostoc sp. PCC 7120 alr5283 (SEQ ID NO: 7), Acaryochloris marina MBIC11017 AM1_4041 (SEQ ID NO: 9), Thermosynechococcus elongatus BP-1 tll1313 (SEQ ID NO: 11), Synechococcus sp. JA-3-3A CYA_0415 (SEQ ID NO: 13), Gloeobacter violaceus PCC 7421 gll3146 (SEQ ID NO: 15), Prochlorococcus marinus MIT9313 PM123 (SEQ ID NO: 17), Prochlorococcus marinus subsp. pastoris cepa CCMP1986 PMM0532 (SEQ ID NO: 19), Prochlorococcus marinus cepa NATL2A PMN2A_1863 (SEQ ID NO: 21), Synechococcus sp. RS9917 RS9917_09941 (SEQ ID NO: 23), Synechococcus sp. RS9917 RS9917_12945 (SEQ iD NO: 25), Cyanothece sp ATCC51142 cce_0778 (SEQ ID NO: 27),Cyanothece sp PCC7245 Cyan7425DRAFT_1220 (SEQ ID NO: 29), Cyanothece sp. PCC7245 cce_0778 (SEQ ID NO: 31), Anabaena variabilis ATCC29413 YP_323043 (Ava_2533) (SEQ ID NO: 33), y Synechococcus elongatus PCC6301 YP_170760 (syc0050_d) (SEQ ID NO: 35). Otros genes biosintéticos de alcano y alqueno se enumeran en la tabla 1 y la figura 38.

Los genes biosintéticos de aldehído incluyen, por ejemplo, Synechococcus elongatus PCC7942 Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 65), Synechocystis sp. PCC6803 sll0209 (SEQ ID NO: 67), Cyanothece sp ATCC51142 cce_1430 (SEQ ID NO: 69), Prochlorococcus marinus subsp. pastoris cepa CCMP1986 PMM0533 (SEQ ID NO: 71), Gloeobacter violaceus PCC7421 NP_96091 (gll3145) (SEQ ID NO: 73), Nostoc punctiforme PCC73102 ZP_00108837 (Npun02004176) (SEQ ID NO: 75), Anabaena variabilis ATCC29413 YP_323044 (Ava_2534) (SEQ ID NO: 77), Synechococcus elongatus PCC6301 YP_170761 (syc0051_d) (SEQ ID NO: 79), y Nostoc sp. PCC 7120 alr5284 (^sE^qID NO: 81). Otros genes biosintéticos de aldehído se enumeran en la tabla 1 y la figura 39.

Usando los métodos descritos en el presente documento, pueden prepararse aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos usando uno o más genes biosintéticos de aldehído, alcano y/o alqueno o polipéptidos descritos en el presente documento, o variantes de los mismos, usando células huésped o métodos libres de células.

Tabla 1: Homólogos de genes biosintéticos de aldehído y alcano en genomas cianobacterianos

Variantes y genes biosintéticos de aldehido, alcano y alqueno

Los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, genes biosintéticos de alcano o alqueno que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35, así como variantes de polinucleótido de las mismas. En algunos casos, el gen biosintético de alcano o alqueno codifica para uno o más de los motivos de aminoácido descritos en el presente documento. Por ejemplo, el gen biosintético de alcano o alqueno puede codificar para un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 37, 38, 39, 41, 42, 43 ó 44. El gen biosintético de alcano o alqueno también puede incluir un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 40 y también uno cualquiera de SEQ ID NO: 37, 38 ó 39.

Los métodos y composiciones descritos en el presente documento también incluyen, por ejemplo, genes biosintéticos de aldehído que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81, así como variantes de polinucleótido de las mismas. En algunos casos, el gen biosintético de aldehído codifica para uno o más de los motivos de aminoácido descritos en el presente documento. Por ejemplo, el gen biosintético de aldehído puede codificar para un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63 ó 64.

Las variantes pueden producirse de manera natural o crearse in vitro. En particular, tales variantes pueden crearse usando técnicas de modificación por ingeniería genética, tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de deleción de exonucleasa III y técnicas de clonación convencionales. Alternativamente, tales variantes, fragmentos, análogos o derivados pueden crearse usando síntesis químicas o procedimientos de modificación.

En la técnica se conocen bien métodos de elaborar variantes. Estos incluyen procedimientos en los que secuencias de ácido nucleico obtenidas a partir de aislados naturales se modifican para generar ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos que tienen características que potencian su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En tales procedimientos, se genera y se caracteriza un gran número de secuencias de variante que tienen una o más diferencias de nucleótido con respecto a la secuencia obtenida a partir del aislado natural. Normalmente, estas diferencias de nucleótido dan como resultado cambios de aminoácido con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de los aislados naturales.

Por ejemplo, pueden crearse variantes usando PCR propensa a error (véase, por ejemplo, Leung et al., Technique 1:11-15, 1989; y Caldwell et al., PCR Methods Applic. 2:28-33, 1992). En PCR propensa a error, se realiza PCR en condiciones en las que la fidelidad de copiado de la ADN polimerasa es baja, de modo que se obtiene una elevada tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Brevemente, en tales procedimientos, los ácidos nucleicos que van a mutagenizarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido biosintético de aldehído o alcano), se mezclan con cebadores de PCR, tampón de reacción, MgCl2, MnCl2, Taq polimerasa, y una concentración apropiada de dNTP para lograr una elevada tasa de mutación puntual a lo largo de toda la longitud del producto de ^pC^r. Por ejemplo, la reacción puede realizarse usando 20 fmoles de ácido nucleico que va a mutagenizarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido biosintético de aldehído o alcano), 30 pmoles de cada cebador de PCR, un tampón de reacción que comprende KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,3) y gelatina al 0,01%, MgCl27 mM, MnCh 0,5 mM, 5 unidades de Taq polimerasa, dGTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 1 mM y dTTP1 mM. Puede realizarse PCR durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min y 72°C durante 1 min. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros pueden variarse según sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutagenizados se clonan entonces en un vector apropiado y las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutagenizados se evalúan.

También pueden crearse variantes usando mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para generar mutaciones específicas del sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis de oligonucleótidos se describe en, por ejemplo, Reidhaar-Olson et al., Science 241:53-57, 1988. Brevemente, en tales procedimientos una pluralidad de oligonucleótidos bicatenarios que portan una o más mutaciones que van a introducirse en el ADN clonado se sintetizan y se insertan en el ADN clonado que va a mutagenizarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido biosintético de aldehído o alcano). Los clones que contienen el ADN mutagenizado se recuperan, y las actividades de los polipéptidos que codifican se evalúan.

Otro método para generar variantes es PCR de ensamblaje. PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de PCR a partir de una mezcla de pequeños fragmentos de ADN. Se produce un gran número de diferentes reacciones de PCR en paralelo en el mismo vial, cebando los productos de una reacción los productos de otra reacción. Se describe PCR de ensamblaje en, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.965.408.

Todavía otro método de generación de variantes es mutagénesis de PCR sexual. En la mutagénesis de PCR sexual, se produce recombinación homóloga forzada entre moléculas de ADN de secuencia de ADN diferente, pero muy relacionada, in vitro como resultado de fragmentación aleatoria de la molécula de ADN basándose en la homología de secuencia. Esto se sigue por fijación del cruzamiento mediante extensión de cebador en una reacción de PCR. Se describe mutagénesis de PCR sexual en, por ejemplo, Stemmer, PNAS, USA 91:10747-10751, 1994.

También pueden crearse variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunas realizaciones, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de ácido nucleico propagando la secuencia en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, que lleva mutaciones en una o más de las rutas de reparación de ADN. Tales cepas “mutágenas” tienen una tasa de mutación aleatoria mayor que la de una cepa silvestre. Propagar una secuencia de ADN (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido biosintético de aldehído o alcano) en una de estas cepas generará eventualmente mutaciones aleatorias dentro del ADN. Las cepas mutágenas adecuadas para su uso para mutagénesis in vivo se describen en, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 91/16427.

También pueden generarse variantes usando mutagénesis de casete. En la mutagénesis de casete, una pequeña región de una molécula de ADN bicatenario se sustituye por un “casete” de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido contiene a menudo una secuencia nativa completa y/o parcialmente aleatorizada.

También puede usarse mutagénesis conjunta recurrente para generar variantes. La mutagénesis conjunta recurrente es un algoritmo para la modificación por ingeniería genética de proteínas (es decir, mutagénesis de proteínas) desarrollada para producir poblaciones diversas de mutantes relacionados fenotípicamente cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método usa un mecanismo de retroalimentación para controlar rondas sucesivas de mutagénesis de casete combinatoria. Se describe mutagénesis conjunta recurrente en, por ejemplo, Arkin et al., PNAS, USA 89:7811-7815, 1992.

En algunas realizaciones, se crean variantes usando mutagénesis de conjunto exponencial. La mutagénesis de conjunto exponencial es un procedimiento para generar bibliotecas combinatorias con un elevado porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en la que pequeños grupos de residuos se aleatorizan en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conducen a proteínas funcionales. Se describe mutagénesis de conjunto exponencial en, por ejemplo, Delegrave et al., Biotech. Res. 11:1548-1552, 1993. Se describen mutagénesis aleatoria y dirigida al sitio en, por ejemplo, Arnold, Curr. Opin. Biotech. 4:450-455, 1993.

En algunas realizaciones, se crean variantes usando procedimientos de intercambio en los que porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican para distintos polipéptidos se fusionan juntas para crear secuencias de ácido nucleico quiméricas que codifican para polipéptidos quiméricos tal como se describe en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.965.408 y 5.939.250.

Las variantes de polinucleótido también incluyen análogos de ácido nucleico. Los análogos de ácido nucleico pueden modificarse en el residuo de base, residuo de azúcar, o esqueleto de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad del ácido nucleico. Las modificaciones en el resto de base incluyen desoxiuridina para desoxitimidina y 5-metil-2'-desoxicitidina o 5-bromo-2'-doxicitidina para desoxicitidina. Las modificaciones del residuo de azúcar incluyen modificación del 2'-hidroxilo del azúcar de ribosa para formar azúcares 2'-O-metilo o 2'-O-alilo. El esqueleto de fosfato de desoxirribosa puede modificarse para producir ácidos nucleicos de morfolino, en el que cada resto de base se une a un anillo morfolino de 6 miembros, o ácidos nucleicos peptídicos, en los que el esqueleto de desoxifosfato se reemplaza por un esqueleto pseudopeptídico y las cuatro bases se conservan. (Véase, por ejemplo, Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:187-195; y Hyrup et al., Bioorgan. Med. Chem. (1996) 4:5-23). Además, el esqueleto de desoxifosfato puede sustituirse por, por ejemplo, un esqueleto de fosforotioato o fosforoditioato, un esqueleto de fosforoamidita o fosfotriéster de alquilo. Los polipéptidos biosintéticos de aldehído y alcano Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 66) y Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO: 2) tienen homólogos en otras cianobacterias (se representan ejemplos no limitativos en la tabla 1). Por tanto, cualquier secuencia de polinucleótido que codifica para un homólogo enumerado en la tabla 1, o una variante del mismo, puede usarse como polinucleótido biosintético de aldehído o alcano en los métodos descritos en el presente documento. Cada cianobacteria enumerada en la tabla 1 tiene copias de ambos genes. El nivel de identidad de secuencia de los productos génicos oscila entre el 61% y el 73% para Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 66) y entre el 43% y el 78% para Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO: 2).

Se enumeran homólogos adicionales del polipéptido biosintético de aldehído Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 66) en la figura 39, y puede usarse cualquier secuencia de polinucleótido que codifica para un homólogo enumerado en la figura 39, o una variante del mismo, como polinucleótido biosintético de aldehído en los métodos descritos en el presente documento. Se enumeran homólogos adicionales del polipéptido biosintético de alcano Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO: 2) en la figura 38, y puede usarse cualquier secuencia de polinucleótido que codifica para un homólogo enumerado en la figura 38, o una variante del mismo, como polinucleótido biosintético de alcano en los métodos descritos en el presente documento.

En determinados casos, un gen biosintético de aldehído, alcano y/o alqueno se optimiza por codón para la expresión en una célula huésped particular. Por ejemplo, para la expresión en E. coli, pueden optimizarse uno o más codones tal como se describe en, por ejemplo, Grosjean et al., Gene 18:199-209 (1982).

Variantes y polipéptidos biosintéticos de aldehído, alcano y alqueno

Los métodos y composiciones descritos en el presente documento también incluyen polipéptidos biosintéticos de alcano o alqueno que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36, así como variantes de polipéptido de la misma. En algunos casos, un polipéptido biosintético de alcano o alqueno es uno que incluye uno o más de los motivos de aminoácido descritos en el presente documento. Por ejemplo, el polipéptido biosintético de alcano o alqueno puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 38, 39, 41, 42, 43 ó 44. El polipéptido biosintético de alcano o alqueno también puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y también una cualquiera de SEQ ID NO: 37, 38 ó 39.

Los métodos y composiciones descritos en el presente documento también incluyen polipéptidos biosintéticos de aldehído que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82, así como variantes de polipéptido de la misma. En algunos casos, un polipéptido biosintético de aldehido es uno que incluye uno o más de los motivos de aminoácido descritos en el presente documento. Por ejemplo, el polipéptido biosintético de aldehído puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63 ó 64. Variantes de polipéptido biosintético de aldehído, alcano y alqueno pueden ser variantes en las que uno o más residuos de aminoácido se sustituyen por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado). Tal residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético.

Sustituciones conservadoras son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Sustituciones conservadoras típicas son los siguientes reemplazos: reemplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina por una treonina o viceversa; reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, por otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que porta un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, por otro residuo que porta un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, con otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, por otro residuo aromático.

Otras variantes de polipéptido son aquellas en las que uno o más residuos de aminoácido incluyen un grupo sustituyente. Todavía otras variantes de polipéptido son aquellas en las que el polipéptido se asocia con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol).

Variantes de polipéptido adicionales son aquellas en las que aminoácidos adicionales se fusionan con el polipéptido, tal como una secuencia líder, una secuencia secretora, una secuencia de proproteína, o una secuencia que facilita la purificación, el enriquecimiento o la estabilización del polipéptido.

En algunos casos, una variante de polipéptido biosintético de alcano o alqueno conserva la misma función biológica que un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6 , 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36 (por ejemplo, conserva actividad biosintética de alcano o alqueno) y tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma.

En otros casos, las variantes de polipéptido biosintético de alcano o alqueno tienen al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, o más de aproximadamente el 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6 , 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36. En otra realización, las variantes de polipéptido incluyen un fragmento que comprende al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 ó 150 aminoácidos consecutivos del mismo.

En algunos casos, una variante de polipéptido biosintético de aldehído conserva la misma función biológica que un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 , 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82 (por ejemplo, conserva actividad biosintética de aldehído) y tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma.

En aún otros casos, las variantes de polipéptido biosintético de aldehído tienen al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, o más de aproximadamente el 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 , 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82. En otra realización, las variantes de polipéptido incluyen un fragmento que comprende al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 ó 150 aminoácidos consecutivos del mismo.

Las variantes de polipéptido o fragmentos de las mismas pueden obtenerse aislando ácidos nucleicos que las codifican usando técnicas descritas en el presente documento o expresando ácidos nucleicos sintéticos que las codifican. Alternativamente, pueden obtenerse variantes de polipéptido o fragmentos de las mismas mediante procedimientos de enriquecimiento o purificación bioquímicos. La secuencia de variantes de polipéptido o fragmentos puede determinarse mediante digestión proteolítica, electroforesis en gel y/o microsecuenciación. La secuencia de las variantes de polipéptido biosintético de alcano o alqueno o fragmentos pueden entonces compararse con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6 , 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36 usando cualquiera de los programas descritos en el presente documento. La secuencia de las variantes de polipéptido biosintético de aldehído o fragmentos puede compararse con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 , 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82 usando cualquiera de los programas descritos en el presente documento. Las variantes de polipéptido y fragmentos de las mismas pueden someterse a ensayo para determinar actividad de producción de aldehído, alcohol graso, alcano y/o alqueno usando métodos de rutina. Por ejemplo, las variantes de polipéptido o fragmento pueden ponerse en contacto con un sustrato (por ejemplo, un sustrato de derivado de ácido graso u otro sustrato descrito en el presente documento) en condiciones que permiten que la variante de polipéptido funcione. Una disminución en el nivel del sustrato o un aumento en el nivel de un aldehído, alcano o alqueno pueden medirse para determinar la actividad de producción de aldehido, alcohol graso, alcano o alqueno, respectivamente. Anticuerpos de polipéptido biosintético antialdehído, antialcohol graso, antialcano y antialqueno

Los polipéptidos biosintéticos de aldehído, alcohol graso, alcano y alqueno descritos en el presente documento también pueden usarse para producir anticuerpos dirigidos contra polipéptidos biosintéticos de aldehído, alcohol graso, alcano y alqueno. Tales anticuerpos pueden usarse, por ejemplo, para detectar la expresión de un polipéptido biosintético de aldehído, alcohol graso, alcano o alqueno usando métodos conocidos en la técnica. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo; un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo quimérico, anticuerpo reconfigurado, anticuerpo humanizado, o fragmento del mismo (por ejemplo, Fab', Fab, F(ab')2); o un anticuerpo biosintético, por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla, anticuerpo de dominio único (DAB), Fv, Fv de cadena sencilla (scFv), o similares. Se describen métodos de elaboración y uso de anticuerpos policlonales y monoclonales, por ejemplo, en Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory (1 de diciembre de 1998). En la técnica se conocen métodos para elaborar anticuerpos modificados y fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos reconfigurados, anticuerpos humanizados, o fragmentos de los mismos, por ejemplo, fragmentos Fab', Fab, F(ab')2); o anticuerpos biosintéticos (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio único (DAB), Fv, Fv de cadena sencilla (scFv), y similares), y pueden encontrarse, por ejemplo, en Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag (15 de diciembre de 2000; 1a edición).

Sustratos

Las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden usarse para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos a partir de un sustrato apropiado. Sin querer limitarse por ninguna teoría particular, se cree que los polipéptidos biosintéticos de alcano o alqueno descritos en el presente documento producen alcanos o alquenos a partir de sustratos por medio de un mecanismo de descarbonilación. En algunos casos, el sustrato es un derivado de ácido graso, por ejemplo, un aldehído graso, y puede producirse un alcano que tiene patrones de ramificación particulares y longitud de cadena de carbono a partir de un derivado de ácido graso, por ejemplo, un aldehído graso, que tiene esas características particulares. En otros casos, el sustrato es un derivado de ácido graso insaturado, por ejemplo, un aldehído graso insaturado, y puede producirse un alqueno que tiene patrones de ramificación particulares y longitud de cadena de carbono a partir de un derivado de ácido graso insaturado, por ejemplo, un aldehído graso insaturado, que tiene esas características particulares.

Sin querer limitarse por ninguna teoría particular, se cree que los polipéptidos biosintéticos de aldehído descritos en el presente documento producen aldehídos a partir de sustratos por medio de un mecanismo de reducción. En determinados casos, el sustrato es una acil-ACP.

Sin querer limitarse por ninguna teoría particular, se cree que los alcoholes grasos descritos en el presente documento se producen a partir de sustratos por medio de un mecanismo de reducción. En determinados casos, el sustrato es un aldehído graso.

Por consiguiente, cada etapa dentro de una ruta biosintética que conduce a la producción de estos sustratos puede modificarse para producir o sobreproducir el sustrato de interés. Por ejemplo, genes conocidos implicados en la ruta biosintética de ácido graso, la ruta de aldehído graso y la ruta de alcohol graso pueden expresarse, sobreexpresarse o atenuarse en células huésped para producir un sustrato deseado (véase, por ejemplo, el documento PCT/US08/058788). Se proporcionan genes a modo de ejemplo en la figura 40.

Síntesis de sustratos

La ácido graso sintasa (FAS) es un grupo de polipéptidos que catalizan el inicio y la elongación de cadenas de acilo (Marrakchi et al., Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002). La proteína portadora de acilo (ACP) junto con las enzimas en la ruta de FAS controla la longitud, el grado de saturación y la ramificación de los derivados de ácidos grasos producidos. La ruta biosintética de ácido graso implica los precursores acetil-CoA y malonil-CoA. Las etapas en esta ruta se catalizan mediante enzimas de las familias génicas de acetil-CoA carboxilasa (acc) y biosíntesis de ácido graso (fab) (véase, por ejemplo, Heath et al., Prog. Lipid Res. 40(6):467-97 (2001)).

Pueden modificarse por ingeniería genética células huésped para expresar sustratos de derivado de ácido graso expresando o sobreexpresando de manera recombinante genes de acetil-CoA y/o malonil-CoA sintasa. Por ejemplo, para aumentar la producción de acetil-CoA, uno o más de los siguientes genes pueden expresarse en una célula huésped: pdh, panK, aceEF (que codifica para el componente deshidrogenasa Elp y el componente dihidrolipoamida aciltransferasa E2p de los complejos de piruvato y 2-oxoglutarato deshidrogenasa), fabH, fabD, fabG, acpP y fabF. Los números de registro de GenBank a modo de ejemplo para estos genes son: pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (también conocido como coaA, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), fabD (AAC74176), fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), fabF (AAC74179). Además, los niveles de expresión de fadE, gpsA, ldhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA y/o ackB pueden atenuarse o inactivarse en una célula huésped modificada por ingeniería genética mediante transformación con plásmidos replicativos o no replicativos condicionalmente que contienen mutaciones anuladoras o de deleción de los genes correspondientes o sustituyendo secuencias de promotor o de potenciador. Números de registro de GenBank a modo de ejemplo para estos genes son: fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), ldhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356) y ackB (BAB81430). Las células huésped resultantes tendrán niveles de producción de acetil-CoA aumentados cuando se hacen crecer en un ambiente apropiado.

La sobreexpresión de malonil-CoA puede efectuarse introduciendo accABCD (por ejemplo, número de registro AAC73296, EC 6.4.1.2) en una célula huésped. Los ácidos grasos pueden sobreexpresarse además en células huésped introduciendo en la célula huésped una secuencia de ADN que codifica para una lipasa (por ejemplo, números de registro CAA89087, CAA98876).

Además, la inhibición de PlsB puede conducir a un aumento en los niveles de acil-ACP de cadena larga, que inhibirá etapas tempranas en la ruta (por ejemplo, accABCD, fabH y fabI). La mutación de plsB (por ejemplo, número de registro AAC77011) D311E puede usarse para aumentar la cantidad de acil-CoA disponible.

Además, una célula huésped puede modificarse por ingeniería genética para sobreexpresar un gen sfa (supresor de fabA, por ejemplo, número de registro AAN79592) para aumentar la producción de ácidos grasos monoinsaturados (Rock et al., J. Bacteriology 178:5382-5387, 1996).

En algunos casos, pueden modificarse por ingeniería genética células huésped para expresar, sobreexpresar o atenuar la expresión de una tioesterasa para aumentar la producción de sustrato de ácido graso. La longitud de cadena de un sustrato de ácido graso se controla mediante tioesterasa. En algunos casos, un gen tes o fat puede sobreexpresarse. En otros casos, pueden producirse ácidos grasos C10 atenuando tioesterasa C18 (por ejemplo, números de registro AAC73596 y P0ADA1), que usa C181-ACP, y que expresa tioesterasa C10 (por ejemplo, número de registro Q39513), que usa C10-ACP. Esto da como resultado una población relativamente homogénea de ácidos grasos que tienen una longitud de cadena de carbono de 10. En aún otros casos, pueden producirse ácidos grasos C14 atenuando tioesterasas endógenas que producen ácidos no grasos C14 y que expresan las tioesterasas, que usan C14-ACP (por ejemplo, número de registro Q39473). En algunas situaciones, pueden producirse ácidos grasos C12 expresando tioesterasas que usan C12-ACP (por ejemplo, número de registro Q41635) y atenuando tioesterasas que producen ácidos no grasos C12. La sobreproducción de acetil-CoA, malonil-CoA y ácido graso puede verificarse usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando precursores radiactivos, HPLC, y CG-EM posterior a la lisis celular. En la tabla 2 se enumeran ejemplos no limitativos de tioesterasas que pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento.

Tabla 2: Tioesterasas

* Mayer et al., BMC Plant Biology 7:1-11, 2007

Formación de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos ramificados

Pueden producirse aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos que contienen puntos de ramificación usando derivados ramificados de ácidos grasos como sustratos. Por ejemplo, aunque E. coli produce de manera natural derivados de cadena lineal de ácidos grasos (sFA), E. coli también puede modificarse por ingeniería genética para producir derivados de cadena ramificada de ácidos grasos (brFA) introduciendo y expresando o sobreexpresando genes que proporcionan precursores ramificados en E. coli (por ejemplo, familias de genes bkd, ilv, icm y fab). Además, una célula huésped puede modificarse por ingeniería genética para expresar o sobreexpresar genes que codifican para proteínas para la elongación de brFA (por ejemplo, ACP, FabF, etc.) y/o para delecionar o atenuar los genes de célula huésped correspondientes que conducen normalmente a sFA.

La primera etapa en la formación de brFA es la producción de los ácido a-ceto correspondientes mediante una aminoácido aminotransferasa de cadena ramificada. Las células huésped pueden incluir de manera endógena genes que codifican para tales enzimas o tales genes pueden introducirse de manera recombinante. E. coli, por ejemplo, expresa de manera endógena una enzima de este tipo, IlvE (EC 2.6.1.42; registro de GenBank YP_026247). En algunas células huésped, puede no expresarse una aminoácido aminotransferasa de cadena ramificada heteróloga. Sin embargo, puede introducirse y expresarse de manera recombinante, si no es endógena, E. coli IlvE o cualquier otra aminoácido aminotransferasa de cadena ramificada (por ejemplo, IlvE de Lactococcus lactis (registro de GenBank AAF34406), IlvE de Pseudomonas putida (registro de GenBank NP_745648), o IlvE de Streptomyces coelicolor (registro de GenBank NP_629657)).

La segunda etapa es la descarboxilación oxidativa de los ácidos a-ceto con la acil-CoA de cadena ramificada correspondiente. Esta reacción puede catalizarse mediante un complejo de ácido a-ceto deshidrogenasa de cadena ramificada (bkd; EC 1.2.4.4.) (Denoya et al., J. Bacteriol. 177:3504, 1995), que consiste en subunidades de E1a/p (descarboxilasa), E2 (dihidrolipoil transacilasa) y E3 (dihidrolipoil deshidrogenasa). Estos complejos de ácido a-ceto deshidrogenasa de cadena ramificada son similares a los complejos de piruvato y a-cetoglutarato deshidrogenasa. Cualquier microorganismo que posee brFA y/o crece sobre aminoácidos de cadena ramificada puede usarse como fuente para aislar genes bkd para la expresión en células huésped, por ejemplo, E. coli. Además, E. coli tiene el componente E3 como parte de su complejo de piruvato deshidrogenasa (lpd, EC 1.8.1.4, registro de GenBank NP_414658). Por tanto, puede ser suficiente expresar sólo los genes E1a/p y E2 bkd. La tabla 3 enumera ejemplos no limitativos de genes bkd de varios microorganismos que pueden introducirse y expresarse de manera recombinante en una célula huésped para proporcionar precursores de acil-CoA de cadena ramificada.

Tabla 3: Genes bkd de microorganismos seleccionados

En otro ejemplo, puede elaborarse isobutiril-CoA en una célula huésped, por ejemplo en E. coli, mediante la coexpresión de una crotonil-CoA reductasa (Ccr, EC 1.6.5.5, 1.1.1.1) e isobutiril-CoA mutasa (subunidad grande IcmA, EC 5.4.99.2; subunidad pequeña IcmB, EC 5.4.99.2) (Han y Reynolds, J. Bacteriol. 179:5157, 1997). Crotonil-CoA es un producto intermedio en la biosíntesis de ácido graso en E. coli y otros microorganismos. En la tabla 4 se enumeran ejemplos no limitativos de genes ccr e icm de microorganismos seleccionados.

Tabla 4: Genes ccr e icm de microorganismos seleccionados

Además de la expresión de los genes bkd, el inicio de la biosíntesis de brFA usa proteína portadora de p-cetoacil-acil sintasa III (FabH, EC 2.3.1.41) con especificidad por acil-CoA de cadena ramificada (Li et al., J. Bacteriol. 187:3795-3799, 2005). En la tabla se enumeran 5 ejemplos no limitativos de tales enzimas FabH. Pueden expresarse genes fabH que están implicados en la biosíntesis de ácido graso de cualquier microorganismo que contiene brFA en una célula huésped. Las enzimas Bkd y FabH de células huésped que no producen de manera natural brFA pueden no soportar la producción de brFA. Por tanto, bkd y fabH pueden expresarse de manera recombinante. Pueden insertarse vectores que contienen los genes bkd y fabH en una célula huésped de este tipo. De manera similar, el nivel endógeno de producción de Bkd y FabH puede no ser suficiente para producir brFA. En este caso, pueden sobreexpresarse. Además, otros componentes de la ruta de biosíntesis de ácido graso pueden expresarse o sobreexpresarse, tales como proteínas portadoras de acilo (ACP) y proteína portadora p-cetoacil-acil sintasa II (fabF, EC 2.3.1.41) (en la tabla 5 se enumeran ejemplos no limitativos de candidatos). Además de expresar estos genes, algunos genes en la biosíntesis endógena de la ruta de ácido graso pueden atenuarse en la célula huésped (por ejemplo, los genes de E. coli fabH (n.° de registro de GenBank NP_415609) y/o fabF (n.° de registro de GenBank NP_415613)).

Tabla 5: Genes FabH, ACP y fabF de microorganismos seleccionados con brFA

Formación de aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos cíclicos

Pueden producirse aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos cíclicos usando derivados de ácidos grasos cíclicos como sustratos. Para producir sustratos de derivado de ácido graso cíclicos, pueden introducirse genes que proporcionan precursores cíclicos (por ejemplo, las familias de genes ans, chc y plm) en la célula huésped y expresarse para permitir el inicio de biosíntesis de ácido graso de precursores cíclicos. Por ejemplo, para convertir una célula huésped, tal como E. coli, en una que puede sintetizar derivados de ácidos grasos ro-cíclicos (cyFA), un gen que proporciona el precursor cíclico ciclohexilcarbonil-CoA (CHC-CoA) (Cropp et al., Nature Biotech. 18:980-983, 2000) puede introducirse y expresarse en la célula huésped. Los ejemplos no limitativos de genes que proporcionan CHC-CoA en E. coli incluyen: ansJ, ansK, ansL, chcA y ansM de la agrupación de genes ansatrienina de Streptomyces collinus (Chen et al., Eur. J. Biochem. 261: 98-107, 1999) o plmJ, plmK, plmL, chcA y plmM de la agrupación de genes de foslactomicina B de Streptomyces sp. HK803 (Palaniappan et al., J Biol. Chem. 278:35552-35557, 2003) junto con el gen chcB (Patton et al., Biochem. 39:7595-7604, 2000) de S. collinus, S. avermitilis o S. coelicolor (véase la tabla 6). Los genes enumerados en la tabla 5 pueden expresarse entonces para permitir el inicio y la elongación de ácidos grasos ro-cíclicos. Alternativamente, los genes homólogos pueden aislarse a partir de microorganismos que producen cyFA y expresados en una célula huésped (por ejemplo, E. coli).

Tabla 6: Genes para la síntesis de CHC-CoA

*Sólo se anota chcA en la entrada de GenBank U72144, ansJKLM son según Chen et al. (Eur. J. Biochem. 261:98-107, 1999).

Los genes enumerados en la tabla 5 (fabH, ACP y fabF) permiten el inicio y la elongación de derivados de ácidos grasos ro-cíclicos porque tienen amplia especificidad de sustrato. Si la coexpresión de cualquiera de estos genes con los genes enumerados en la tabla 6 no produce cyFA, entonces pueden aislarse homólogos de fabH, ACP y/ o fabF de microorganismos que producen cyFA (por ejemplo, los enumerados en la tabla 7) (por ejemplo, usando cebadores de PCR de degeneración o sondas de secuencia de ADN heterólogas) y coexpresarse.

Tabla 7: Ejemplos no limitativos de microorganismos que contienen ácidos grasos ro-cíclicos

*Usa cicloheptilcarbonil-CoA y no ciclohexilcarbonil-CoA como precursor para la biosíntesis de cyFA.

Niveles de saturación de aldehído, alcohol graso y alqueno

El grado de saturación en derivados de ácidos grasos puede controlarse regulando el grado de saturación de productos intermedios de derivado de ácido graso. Las familias de genes sfa, gns y fab pueden expresarse o sobreexpresarse para controlar la saturación de ácidos grasos. La figura 40 enumera ejemplos no limitativos de genes en estas familias de genes que pueden usarse en los métodos y células huésped descritos en el presente documento.

Las células huésped pueden modificarse por ingeniería genética para producir ácidos grasos insaturados modificando por ingeniería genética la célula huésped para sobreexpresar fabB o haciendo crecer la célula huésped a bajas temperaturas (por ejemplo, menos de 37°C). FabB tiene preferencia sobre cis-83decenoil-ACP y da como resultado producción de ácido graso insaturado en E. coli. La sobreexpresión de fabB da como resultado la producción de un porcentaje significativo de ácidos grasos insaturados (de Mendoza et al., J. Biol. Chem. 258:2098-2101, 1983). El gen fabB puede insertarse en y expresarse en células huésped que no tienen de manera natural el gen. Estos derivados de ácidos grasos insaturados pueden usarse entonces como productos intermedios en células huésped que se modifican por ingeniería genética para producir derivados de ácidos grasos, tales como aldehídos grasos, alcoholes grasos o alquenos.

En otros casos, un represor de la biosíntesis de ácido graso, por ejemplo, fabR (registro de GenBank NP_418398), puede delecionarse, lo que dará como resultado una producción aumentada de ácido graso insaturado en E. coli (Zhang et al., J. Biol. Chem. 277:15558, 2002). Pueden realizarse deleciones similares en otras células huésped. Puede lograrse un aumento adicional de derivados de ácidos grasos insaturados, por ejemplo, sobreexpresando fabM (trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerasa, registro de GenBank DAA05501) y expresión controlada de fabK (trans-2-enoil-ACP reductasa II, registro de GenBank NP_357969) de Streptococcus pneumoniae (Marrakchi et al., J. Biol. Chem. 277: 44809, 2002), mientras se deleciona E. coli fabI (trans-2-enoil-ACP reductasa, registro de GenBank NP_415804). En algunos ejemplos, el gen fabF endógeno puede atenuarse, aumentado por tanto el porcentaje de palmitoleato (C16:1) producido.

Otros sustratos

Otros sustratos que pueden usarse para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos en los métodos descritos en el presente documento son acil-ACP, acil-CoA, un aldehído graso o un alcohol graso, que se describen en, por ejemplo, el documento PCT/US08/058788. En la figura 40 se enumeran genes a modo de ejemplo que pueden alterarse para expresar o sobreexpresar estos sustratos en células huésped. Otros genes a modo de ejemplo se describen en el documento PCT/US08/058788.

Modificación por ingeniería genética de células huésped para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos

Pueden usarse diversas células huésped para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos, tal como se describe en el presente documento. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido descrito en el presente documento puede expresarse en células bacterianas (tales como E. coli), células de insecto, células de levadura o mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células VERO, células BHK, células HeLa, células Cv1, células MDCK, células 293, células 3T3 o células PC12). Otras células huésped a modo de ejemplo incluyen células de los miembros del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. Aún otras células huésped a modo de ejemplo pueden ser una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus licheniformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis, una célula de Bacillus amyloliquefaciens, una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhizomucor miehei, una célula de Mucor michei, una célula de Streptomyces lividans, una célula de Streptomyces murinus o una célula de Actinomycetes.

Otros ejemplos no limitativos de células huésped son los enumerados en la tabla 1.

En una realización preferida, la célula huésped es una célula de E. coli. En una realización más preferida, la célula huésped es de las cepas de E. coli B, C, K o W. Otras células huésped adecuadas las conocen los expertos en la técnica.

Pueden usarse diversos métodos bien conocidos en la técnica para modificar por ingeniería genética células huésped para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Los métodos incluyen el uso de vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de aldehído, alcohol graso, alcano y/o alqueno descrito en el presente documento, o una variante de polipéptido o fragmento del mismo. Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo vector es un vector viral, en el que puede ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores pueden realizar replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y se replican de ese modo junto con el genoma huésped. Además, determinados vectores, tales como vectores de expresión, pueden dirigir la expresión de genes a los que se unen de manera operativa. En general, los vectores de expresión usados en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. Sin embargo, también pueden usarse otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados).

Los vectores de expresión recombinante descritos en el presente documento incluyen un ácido nucleico descrito en el presente documento en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Los vectores de expresión recombinantes pueden incluir una o más secuencias de control, seleccionadas basándose en la célula huésped que va a usarse para la expresión. La secuencia de control está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse. Tales secuencias de control se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias de control incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden introducirse en células huésped para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificados por los ácidos nucleicos tal como se describe en el presente documento.

Pueden diseñarse vectores de expresión recombinante para la expresión de un polipéptido biosintético de aldehído, alcohol graso, alcano y/o alqueno o variante en células procariotas o eucariotas (por ejemplo, células bacterianas, tales como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero). Se comentan adicionalmente células huésped adecuadas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras de promotor de T7 y polimerasa de T7.

La expresión de polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se lleva a cabo con la mayor frecuencia con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos o bien de fusión o bien no de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, habitualmente en el extremo amino-terminal del polipéptido recombinante. Tales vectores de fusión sirven normalmente para tres fines: (1) aumentar la expresión del polipéptido recombinante; (2) aumentar la solubilidad del polipéptido recombinante; y (3) ayudar en la purificación del polipéptido recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. Con frecuencia, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante del resto de fusión tras la purificación del polipéptido de fusión. Los ejemplos de tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión a modo de ejemplo incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith et al., Gene 67:31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRITS (Pharmacia, Piscataway, N.J.), que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, al polipéptido recombinante diana.

Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles, no de fusión, incluyen pTrc (Amann et al., Gene (1988) 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). La expresión génica diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción de ARN polimerasa del huésped a partir de un promotor de fusión de trp-lac híbrido. La expresión génica diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripción de un promotor de fusión de gn10-lac de T7 mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada (gn1 de T7). Esta polimerasa viral se suministra por cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3) a partir de un profago X residente que aloja un gen gn1 de T7 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de polipéptido recombinante es expresar el polipéptido en una célula huésped con una capacidad alterada para escindir proteolíticamente el polipéptido recombinante (véase Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico que va a insertarse en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido son los usados preferiblemente en la célula huésped (Wada et al., Nucleic Acids Res. (1992) 20:2111-2118). Tal alteración de secuencias de ácido nucleico puede llevarse a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN convencionales.

En otra realización, la célula huésped es una célula de levadura. En esta realización, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.).

Alternativamente, puede expresarse un polipéptido descrito en el presente documento en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto en cultivo (por ejemplo, células Sf9) incluyen, por ejemplo, la serie pAc (Smith et al., Mol. Cell Biol. (1983) 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39).

En aún otra realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden expresarse en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. (1987) 6:187-195). Cuando se usan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión pueden proporcionarse por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores habitualmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus del simio 40. Otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas se describen en los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Pueden introducirse vectores en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal como se usan en el presente documento, los términos “transformación” y “transfección” se refieren a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped, por ejemplo, en Sambrook et al. (citado anteriormente).

Para la transformación estable de células bacterianas, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transformación usados, sólo una pequeña fracción de células captarán y replicarán el vector de expresión. Con el fin de identificar y seleccionar estos transformantes, puede introducirse un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican para un marcador seleccionable en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento o pueden introducirse en un vector separado. Pueden identificarse células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido mediante selección con fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Para una transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usados, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, puede introducirse un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican para un marcador seleccionable en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento o pueden introducirse en un vector separado. Pueden identificarse las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido mediante selección con fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

En determinados métodos, se coexpresan un polipéptido biosintético de aldehído y un polipéptido biosintético de alcano o alqueno en una única célula huésped. En métodos alternativos, se coexpresan un polipéptido biosintético de aldehído y un polipéptido de alcohol deshidrogenasa en una única célula huésped.

Proteínas de transporte

Las proteínas de transporte pueden exportar polipéptidos e hidrocarburos (por ejemplo, aldehídos, alcanos y/o alquenos) fuera de una célula huésped. Muchas proteínas de transporte y eflujo sirven para excretar una amplia variedad de compuestos y pueden modificarse de manera natural para ser selectivas para tipos particulares de hidrocarburos.

Ejemplos no limitativos de proteínas de transporte adecuadas son proteínas de transporte de casete de unión a ATP (ABC), proteínas de eflujo y proteínas transportadoras de ácidos grasos (FATP). Los ejemplos no limitativos adicionales de proteínas de transporte adecuadas incluyen las proteínas de transporte de ABC de organismos tales como Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thalania, Alkaligenes eutrophus y Rhodococcus erythropolis. Las proteínas de transporte de ABC a modo de ejemplo que pueden usarse se enumeran en la figura 40 (por ejemplo, CER5, AtMRP5, AmiS2 y AtPGP1). También pueden elegirse células huésped por su capacidad endógena para secretar hidrocarburos. La eficacia de la producción de hidrocarburos y secreción en el entorno de la célula huésped (por ejemplo, medio de cultivo, caldo de fermentación) puede expresarse como una razón de producto intracelular con respecto a producto extracelular. En algunos ejemplos, la razón puede ser de aproximadamente 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 ó 1:5.

Fermentación

La producción y el aislamiento de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos puede potenciarse empleando técnicas de fermentación beneficiosas. Un método para maximizar la producción al tiempo que se reducen los costes es aumentar el porcentaje de la fuente de carbono que se convierte en productos de hidrocarburo.

Durante ciclos de vida celulares normales, se usa carbono en funciones celulares, tales como producción de lípidos, sacáridos, proteínas, ácidos orgánicos y ácidos nucleicos. Reducir la cantidad de carbono necesaria para actividades relacionadas con el crecimiento puede aumentar la eficacia de conversión de la fuente de carbono en producto. Esto puede lograrse, por ejemplo, haciendo crecer en primer lugar células huésped hasta una densidad deseada (por ejemplo, una densidad que se alcanza al máximo de la fase de crecimiento logarítmica). En tal punto, pueden emplearse genes de punto de control de la replicación para detener el crecimiento de células. Específicamente, pueden usarse mecanismos de percepción de quórum (revisado en Camilli et al., Science 311:1113, 2006; Venturi FEMS Microbio. Rev. 30:274-291, 2006; y Reading et al., FEMS Microbiol. Lett. 254:1-11, 2006) para activar genes de punto de control, tales como p53, p21 u otros genes de punto de control.

Los genes que pueden activarse para detener la replicación y el crecimiento celular en E. coli incluyen genes umuDC. La sobreexpresión de genes umuDC detiene la progresión desde la fase estacionaria hasta el crecimiento exponencial (Murli et al., J. of Bact. 182: 1127, 2000). UmuC es una ADN polimerasa que puede llevar a cabo la síntesis translesión sobre lesiones no codificantes (la base mecanística de la mayoría de las mutagénesis por UV y químicas). Los productos del gen umuDC están implicados en el proceso de síntesis translesión y también sirven como un punto de control de daño de la secuencia de ADN. Los productos del gen umuDC incluyen UmuC, UmuD, umuD', UmuD'2C, UmuD'2 y UmuD2. Simultáneamente, pueden activarse genes que producen productos, minimizando así la necesidad de usar rutas de replicación y mantenimiento mientras se prepara un aldehído, alcano y/o alqueno. También pueden modificarse por ingeniería células huésped para expresar umuC y umuD de E. coli en pBAD24 bajo el sistema del promotor prpBCDE mediante síntesis de novo de este gen con los genes de producción de producto final apropiados.

El porcentaje de carbonos introducidos convertidos en aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos puede ser un impulsor de coste. Cuanto más eficaz es el proceso (es decir, mayor es el porcentaje de carbonos introducidos convertidos en aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos), menos caro será el proceso. Para fuentes de carbono que contienen oxígeno (por ejemplo, fuentes a base de glucosa y otros hidratos de carbono), el oxígeno debe liberarse en forma de dióxido de carbono. Por cada 2 átomos de oxígeno liberados, también se libera un átomo de carbono conduciendo a una eficacia metabólica teórica máxima de aproximadamente el 34% (p/p) (para productos derivados de ácidos grasos). Sin embargo, esta cifra cambia para otros productos de hidrocarburo y fuentes de carbono. Las eficacias típicas en la bibliografía son aproximadamente inferiores al 5%. Las células huésped modificadas por ingeniería genética para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos pueden tener una eficacia superior a aproximadamente el 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 y 30%. En un ejemplo, las células huésped pueden mostrar una eficacia de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 25%. En otros ejemplos, tales células huésped pueden mostrar una eficacia de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 30%. En otros ejemplos, las células huésped pueden mostrar una eficacia superior al 30%.

La célula huésped puede modificarse por ingeniería genética adicionalmente para expresar celulosomas recombinantes, tales como los descritos en la solicitud de PCT número PCT/US2007/003736. Estos celulosomas pueden permitir que la célula huésped use material celulósico como fuente de carbono. Por ejemplo, la célula huésped puede modificarse por ingeniería genética adicionalmente para expresar invertasas (EC 3.2.1.26) de modo que puede usarse sacarosa como fuente de carbono. De manera similar, la célula huésped puede modificarse por ingeniería genética usando las enseñanzas descritas en las patentes estadounidenses n.os 5.000.000; 5.028.539; 5.424.202; 5.482.846 y 5.602.030; de modo que la célula huésped puede asimilar carbono eficazmente y usar materiales celulósicos como fuentes de carbono.

En un ejemplo, la cámara de fermentación puede encerrar una fermentación que está experimentando una reducción continua. En este caso, puede crearse un entorno reductor estable. El equilibrio electrónico puede mantenerse mediante la liberación de dióxido de carbono (en forma gaseosa). Esfuerzos para aumentar el equilibrio de NAD/H y NADP/H también pueden facilitar la estabilización del equilibrio electrónico. También puede potenciarse la disponibilidad de NADPH intracelular modificando por ingeniería genética la célula huésped para expresar una NADH:NADPH transhidrogenasa. La expresión de una o más NADH:NADPH transhidrogenasas convierte la NADH producida en la glicólisis en NADPH, lo que puede potenciar la producción de aldehídos, alcanos y/o alquenos. Para la producción a pequeña escala, las células huésped modificadas por ingeniería genética pueden hacerse crecer en lotes de, por ejemplo, aproximadamente 100 ml, 500 ml, 1 l, 2 l, 5 l, o 10 l; fermentarse; e inducirse para expresar aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos deseados basándose en los genes específicos codificados en los plásmidos apropiados. Por ejemplo, pueden incubarse células de E. coli BL21 (DE3) que llevan pBAD24 (con resistencia a ampicilina y la ruta de síntesis de aldehído, alcohol graso, alcano o alqueno) así como pUMVC1 (con resistencia a kanamicina y el sistema de sobreexpresión de acetil-CoA/malonil-CoA) durante la noche en matraces de 2 l a 37°C agitados a > 200 rpm en 500 ml de medio LB complementado con ampicilina 75 pg/ml y kanamicina 50 pg/ml hasta que los cultivos alcancen una DO600 de > 0,8. Tras lograr una DO600 de > 0,8, las células pueden complementarse con propionato de sodio 25 mM (pH 8,0) para activar los sistemas de genes modificados por ingeniería genética para la producción y para detener la proliferación celular activando las proteínas UmuC y UmuD. Puede realizarse inducción durante 6 h a 30°C. Tras la incubación, los medios pueden examinarse para determinar aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos usando CG-EM.

Para producción a gran escala, las células huésped modificadas por ingeniería genética pueden hacerse crecer en lotes de 10 l, 100 l, 1000 l, o mayores; fermentarse; e inducirse para expresar aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos deseados basándose en los genes específicos codificados en los plásmidos apropiados. Por ejemplo, pueden incubarse células de E. coli BL21 (DE3) que llevan pBAD24 (con resistencia a ampicilina y la ruta de síntesis de aldehído y/o alcano) así como pUMVC1 (con resistencia a kanamicina y el sistema de sobreexpresión de acetil-CoA/malonil-CoA) a partir de un cultivo de siembra de 500 ml para fermentaciones de 10 l (5 l para fermentaciones de 100 l, etc.) en medios LB (libres de glicerol) con kanamicina 50 pg/ml y ampicilina 75 pg/ml a 37°C, y agitarse a > 200 rpm hasta que los cultivos alcancen una DO600 de > 0,8 (normalmente 16 h). Pueden complementarse los medios continuamente para mantener propionato de sodio 25 mM (pH 8,0) para activar los sistemas de genes modificados por ingeniería genética para la producción y para detener la proliferación celular activando las proteínas umuC y umuD. Pueden complementarse los medios continuamente con glucosa para mantener una concentración de 25 g/100 ml.

Tras la primera hora de inducción, pueden retirarse alícuotas de no más del 10% del volumen celular total cada hora y permitirse que se asienten sin agitación para permitir que los aldehídos, alcanos y/o alquenos afloren a la superficie y experimenten una separación de fase espontánea. Entonces puede recogerse el componente de aldehído, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno, y devolverse la fase acuosa a la cámara de reacción. La cámara de reacción puede operarse de manera continua. Cuando la DO600 cae por debajo de 0,6, las células pueden sustituirse por un nuevo lote hecho crecer a partir de un cultivo de siembra.

Producción de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos usando métodos libres de células

En algunos métodos descritos en el presente documento, puede producirse un aldehído, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno usando un polipéptido purificado descrito en el presente documento y un sustrato descrito en el presente documento. Por ejemplo, una célula huésped puede modificarse por ingeniería genética para expresar polipéptido biosintético de aldehído, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno o variante tal como se describe en el presente documento. La célula huésped puede cultivarse en condiciones adecuadas para permitir la expresión del polipéptido. Pueden generarse entonces extractos libres de células usando métodos conocidos. Por ejemplo, las células huésped pueden lisarse usando detergentes o mediante sonicación. Los polipéptidos expresados pueden purificarse usando métodos conocidos. Tras obtener los extractos libres de células, pueden añadirse los sustratos descritos en el presente documento a los extractos libres de células y mantenerse en condiciones que permitan la conversión de los sustratos en aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos pueden entonces separarse y purificarse usando técnicas conocidas.

Procesamiento tras la producción

Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos durante la fermentación pueden separarse de los medios de fermentación. Puede usarse cualquier técnica conocida para separar aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos de medios acuosos. Un procedimiento de separación a modo de ejemplo es un procedimiento de separación de dos bases (bifásico). Este procedimiento implica fermentar las células huésped modificadas por ingeniería genética en condiciones suficientes para producir un aldehído, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno, permitiendo que el aldehido, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno se recojan en una fase orgánica, y separando la fase orgánica del caldo de fermentación acuoso. Este método puede practicarse en un entorno de fermentación tanto discontinua como continua.

La separación bifásica usa la inmiscibilidad relativa de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos para facilitar la separación. Inmiscible se refiere a la incapacidad relativa de un compuesto para disolverse en agua y se define por el coeficiente de reparto del compuesto. Un experto habitual en la técnica apreciará que al elegir un caldo de fermentación y fase orgánica, de modo que el aldehído, alcano y/o alqueno que está produciéndose tenga un alto valor de logP, el aldehído, alcano y/o alqueno pueden separarse en la fase orgánica, incluso a concentraciones muy bajas, en el recipiente de fermentación.

Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos por los métodos descritos en el presente documento pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, así como en el citoplasma. Por tanto, el aldehído, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno pueden recogerse en una fase orgánica o bien de manera intracelular o bien extracelular. La recogida de los productos en la fase orgánica puede reducir el impacto del aldehído, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno sobre la función celular y puede permitir que la célula huésped produzca más producto.

Los métodos descritos en el presente documento pueden dar como resultado la producción de compuestos homogéneos en los que al menos aproximadamente el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 95% de los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos tendrán longitudes de la cadena de carbono que varían en menos de aproximadamente 6 carbonos, menos de aproximadamente 4 carbonos, o menos de aproximadamente 2 carbonos. Estos compuestos también pueden producirse con un grado relativamente uniforme de saturación. Estos compuestos pueden usarse directamente como combustibles, aditivos de combustible, productos químicos especializados, materiales de partida para la producción de otros compuestos químicos (por ejemplo, polímeros, tensioactivos, plásticos, textiles, disolventes, adhesivos, etc.), o aditivos de productos de cuidado personal. Estos compuestos también pueden usarse como materia prima para reacciones posteriores, por ejemplo, hidrogenación, craqueo catalítico (por medio de hidrogenación, pirólisis, o ambas), para producir otros productos.

En algunas realizaciones, los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos usando los métodos descritos en el presente documento pueden contener entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 90% de carbono; o entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 25% de hidrógeno. En otras realizaciones, los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos usando los métodos descritos en el presente documento pueden contener entre aproximadamente el 65% y aproximadamente el 85% de carbono; o entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 15% de hidrógeno.

Composiciones de combustible y composiciones de productos químicos especializados

Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descritos en el presente documento pueden usarse como o convertirse en un combustible o como un producto químico especializado. Un experto habitual en la técnica apreciará que, según el fin previsto del combustible o producto químico especializado, pueden producirse y usarse diferentes aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Por ejemplo, un aldehído, alcohol graso, alcano y/o alqueno ramificado puede ser deseable para combustible de automóviles que pretende usarse en climas fríos. Además, cuando los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descritos en el presente documento se usan como materia prima para la producción de combustible o producto químico especializado, un experto habitual en la técnica apreciará que las características de la materia prima de aldehído, alcohol graso, alcano y/o alqueno afectarán a las características del combustible o producto químico especializado producido. Por tanto, las características del producto de combustible o producto químico especializado pueden seleccionarse produciendo aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos particulares para su uso como materia prima.

Usando los métodos descritos en el presente documento, pueden producirse biocombustibles que tienen calidades de combustible deseadas a partir de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos de manera biológica representan una nueva fuente de biocombustibles, que pueden usarse como carburante, diésel o gasolina. Algunos biocombustibles elaborados usando aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos no se han producido a partir de fuentes renovables y son nuevas composiciones de materia. Estos nuevos combustibles o productos químicos especializados pueden distinguirse de combustibles o productos químicos especializados derivados de carbono petroquímico basándose en la huella de carbono isotópico doble. Además, la fuente específica de carbono de fuentes biológicas (por ejemplo, glucosa frente a glicerol) puede determinarse mediante la huella de carbono isotópico doble (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.169.588, en particular col. 4, línea 31, a col. 6, línea 8).

Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos y los biocombustibles, productos químicos especializados y mezclas asociados pueden distinguirse de sus homólogos derivados de productos petroquímicos basándose en 14C (fM) y huella de carbono isotópico doble. En algunos ejemplos, el aldehído, alcohol graso, alcano y/o alqueno en la composición de biocombustible pueden tener una fracción de carbono moderno (fM14C) de, por ejemplo, al menos aproximadamente 1,003, 1,010 ó 1,5.

En algunos ejemplos, puede elaborarse una composición de biocombustible que incluye aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos que tienen 813C de desde aproximadamente -15,4 hasta aproximadamente -10,9, donde los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos representan al menos aproximadamente el 85% de material de fuentes biológicas (es decir, derivado a partir de un recurso renovable, tal como biomasa, materiales celulósicos y azúcares) en la composición.

La capacidad para distinguir estos productos derivados de manera biológica es beneficiosa para monitorizar estos materiales en el mercado. Por ejemplo, combustibles o productos químicos especializados que comprenden tanto perfiles de isótopo de carbono derivados de manera biológica como a base de petróleo pueden distinguirse de combustibles y productos químicos especializados elaborados únicamente por materiales a base de carbono. Por tanto, los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descritos en el presente documento pueden seguirse en el mercado o identificarse en el mercado basándose en su perfil único. Además, pueden identificarse otros materiales competidores como derivados de manera biológica o derivados de una fuente petroquímica.

Se usan aditivos de combustible para potenciar el rendimiento de un combustible o motor. Por ejemplo, pueden usarse aditivos de combustible para alterar el punto de congelación/gelificación, punto de turbidez, poder de lubricación, viscosidad, estabilidad oxidativa, calidad de ignición, nivel de octano y/o punto de inflamación. En los Estados Unidos, todos los aditivos de combustible deben registrarse en la Agencia de Protección Ambiental. Los nombres de los aditivos de combustible y las empresas que comercializan los aditivos de combustible están disponibles públicamente contactando con la EPA o viendo la página web de la agencia. Un experto habitual en la técnica apreciará que los biocombustibles a base de aldehído y/o alcano descritos en el presente documento pueden mezclarse con uno o más aditivos de combustible para conferir una calidad deseada.

Los biocombustibles a base de aldehído, alcoholes grasos, alcano y/o alqueno descritos en el presente documento pueden mezclarse con otros combustibles, tales como diversos alcoholes, tales como etanol y butanol, y productos derivados de petróleo, tales como gasolina, diésel o carburante.

En algunos ejemplos, la mezcla puede incluir al menos aproximadamente el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50% o el 60% en peso del aldehído, alcoholes grasos, alcano, o alqueno. En otros ejemplos, puede elaborarse una composición de biocombustible que incluye al menos aproximadamente el 5%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de un aldehído, alcoholes grasos, alcano o alqueno que incluyen una cadena de carbono que es de 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 carbonos de longitud. Tales composiciones de biocombustible puede incluir además al menos un aditivo seleccionado de un aditivo de reducción del punto de turbidez que puede reducir el punto de turbidez hasta menos de aproximadamente 5°C, o 0°C; un tensioactivo; una microemulsión; al menos aproximadamente el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de combustible diésel a partir de triglicéridos; gasolina derivada de petróleo; o combustible diésel a partir de petróleo.

Ejemplos

La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplo 1. Detección y verificación de la biosíntesis de alcanos en cianobacterias seleccionadas

Se seleccionaron siete cianobacterias, cuyas secuencias de genoma completo están disponibles públicamente, para la verificación y/o detección de la biosíntesis de alcanos: Synechococcus elongatus PCC7942, Synechococcus elongatus PCC6301, Anabaena variabilis ATCC29413, Synechocystis sp. PCC6803, Nostoc punctiforme PCC73102, Gloeobacter violaceus ATCC 29082 y Prochlorococcus marinus CCMP1986. Sólo las tres primeras cepas cianobacterianas de esta lista se había notificado anteriormente que contenían alcanos (Han et al., J. Am. Chem. Soc. 91:5156-5159 (1969); Fehler et al., Biochem. 9:418-422 (1970)). Las cepas se hicieron crecer de manera fotoautotrófica en matraces de agitación en 100 ml de los medios apropiados (enumerados en la tabla 8) durante 3-7 días a 30°C a una intensidad de luz de aproximadamente 3.500 lux. Se extrajeron las células para la detección de alcanos tal como sigue: se centrifugaron células a partir de un volumen de cultivo de 1 ml durante 1 min a 13.000 rpm, se resuspendieron los sedimentos celulares en metanol, se agitaron con vórtex durante 1 min y luego se sonicaron durante 30 min. Tras la centrifugación durante 3 min a 13.000 rpm, se transfirieron los sobrenadantes a viales nuevos y se analizaron mediante CG-EM. Se analizaron las muestras o bien en una columna capilar DP-530 m (diámetro interno de 0,25 mm) o bien en una columna DP-5 30 m de alta temperatura (diámetro interno de 0,25 mm) usando el siguiente método.

Tras una inyección sin división de 1 pl (temperatura de entrada mantenida a 300°C) sobre la columna de CG/EM, se mantuvo el horno a 100°C durante 3 min. Se elevó la temperatura hasta 320°C a una velocidad de 20°C/min. Se mantuvo el horno a 320°C durante 5 min adicionales. La velocidad de flujo del gas portador helio fue de 1,3 ml/min. El cuadrupolo de EM realizó un barrido desde 50 hasta 550 m/z. Se compararon los tiempos de retención y patrones de fragmentación de picos de producto con referencias auténticas para confirmar la identidad de pico.

De las siete cepas, seis producían principalmente heptadecano y una producía pentadecano (P. marinus CCMP1986); una de estas cepas producía metil-heptadecano además de heptadecano (A. variabilis ATCC29413) (véase la tabla 8). Por tanto, se verificó la biosíntesis de alcanos en tres cianobacterias notificadas previamente, y se detectó biosíntesis de alcanos en cuatro cianobacterias que no se sabía previamente que producían alcanos: ^{P. m a rin u s} CCMP1986 (véase la figura 1), ^{N. p u n c tifo rm e} PCC73102 (véase la figura 2), ^{G. v io lace us} ATCC 29082 (véase la figura 3) y ^{S yn e ch o cys tis s p}. PCC6803 (véase la figura 4).

La figura 1A representa el trazo de CG/EM de células de ^{P ro ch lo ro co ccu s m a rin u s} CCMP1986 extraídas con metanol. El pico a 7,55 min tenía el mismo tiempo de retención que pentadecano (Sigma). En la figura 1B, se muestra el patrón de fragmentación de masas del pico de pentadecano. El pico 212 corresponde al peso molecular de pentadecano.

La figura 2A representa el trazo de CG/EM de células de ^{N o s to c p u n c tifo rm e} PCC73102 extraídas con metanol. El pico a 8,73 min tiene el mismo tiempo de retención que heptadecano (Sigma). En la figura 2B, se muestra el patrón de fragmentación de masas del pico de heptadecano. El pico 240 corresponde al peso molecular de heptadecano. La figura 3A representa el trazo de CG/EM de células de ^{G lo e o b a c e te r v io la ce u s} ATCC29082 extraídas con metanol. El pico a 8,72 min tiene el mismo tiempo de retención que heptadecano (Sigma). En la figura 3B, se muestra el patrón de fragmentación de masas del pico de heptadecano. El pico 240 corresponde al peso molecular de heptadecano.

La figura 4A representa el trazo de CG/EM de células de ^{S y n e ch o cys tic s p}. PCC6803 extraídas con metanol. El pico a 7,36 min tiene el mismo tiempo de retención que heptadecano (Sigma). En la figura 4B, se muestra el patrón de fragmentación de masas del pico de heptadecano. El pico 240 corresponde al peso molecular de heptadecano. Tabla 8: Hidrocarburos detectados en cianobacterias seleccionadas

El análisis genómico produjo dos genes que estaban presentes en las cepas productoras de alcanos. Los homólogos de ^{S yn e ch o co ccu s e lo n g a tu s} PCC7942 de estos genes se representan en la tabla 9 y son Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO: 1) y Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 65).

Tabla 9: Genes cianobacterianos productores de alcanos

Ejemplo 2. La deleción de los genes sll0208 y sll0209 en ^{S yn e ch o cys tis s p}. PCC6803 conduce a pérdida de biosíntesis de alcanos

Los genes que codifican para la supuesta descarbonilasa (sll0208; NP_442147) (SEQ ID NO: 3) y enzima generadora de aldehído (sll0209; NP_442146) (SEQ ID NO: 67) de ^{S yn e ch o cys tis s p}. PCC6803 se delecionaron tal como sigue. Se amplificó aproximadamente 1 kb de ADN flanqueante en el sentido de 5' y en el sentido de 3' usando el cebador sll0208/9-KO1 (CGCGGATCCCTTGATTCTACTGCGGCGAGT) con cebador sll0208/9-KO2 (CACGCACCTAGGTTCACACTCCCATGGTATAACAGGGGCGTTGGACTCC TGTG) y cebador sll0208/9-KO3 (GTTATACCATGGGAGTGTGAACCTAGGTGCGTGGCCGACAGGATAGGG-CGTGT) con cebador sll0208/9-KO4 (CGCGGATCCAACGCATCCTCACTAGTCGGG), respectivamente. Se usaron los productos de PCR en una PCR cruzada con cebadores sll0208/9-KO1 y sll0208/9-KO4 para amplificar el casete de deleción de sll0208/sll0209 de aproximadamente 2 kb, que se clonó en el sitio BamHI del vector de clonación pUC 19. Entonces se amplificó un casete de resistencia a kanamicina (aph, KanR) a partir del plásmido pRL27 (Larsen et al., Arch. Microbiol. 178:193 (2002)) usando los cebadores Kan-aph-F (CATGCCATGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTG) y Kan-aph-R (CTAGTCTAGAGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAA), que entonces se cortó con NcoI y XbaI y se clonó en los sitios NcoI y AvrII del casete de deleción sll0208/sll0209, creando un casete de inserción de KanR con deleción de sll0208/sll0209 en pUC 19. El vector que contiene el casete, que no se replica en cianobacterias, se transformó en Synechocystis sp. PCC6803 (Zang et al., 2007, J. Microbiol., vol. 45, págs. 241) y se seleccionaron transformantes (por ejemplo, integrantes cromosómicos mediante recombinación homóloga doble) en placas de agar BG-11 que contenían kanamicina 100 pg/ml en un incubador equipado con luz a 30°C. Volvieron a sembrarse en estría colonias resistentes a kanamicina una vez y luego se sometieron a análisis genotípico usando PCR con cebadores de diagnóstico.

Se cultivaron mutantes de inserción con deleción confirmada en 12 ml de medio BG11 con kanamicina 50 pg/ml durante 4 días a 30°C en un incubador-agitador equipado con luz. Entonces se centrifugó 1 ml de caldo (1 min a 13.000 g) y se extrajeron los sedimentos celulares con 0,1 ml de metanol. Tras la extracción, se centrifugaron de nuevo las muestras y se sometieron los sobrenadantes a análisis de CG-EM tal como se describió en el ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 5, las cepas de Synechocystis sp. PCC6803 en las que se delecionaron los genes sll0208 y sll0209 perdieron su capacidad para producir heptadeceno y octadecenal. Este resultado demuestra que los genes sll0208 y sll0209 en Synechocystis sp. PCC6803 y los genes ortólogos en otras cianobacterias (véase la tabla 1) son responsables de la biosíntesis de alcanos y aldehidos grasos en estos organismos.

Ejemplo 3. Producción de aldehidos grasos y alcoholes grasos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942

Se amplificó el ADN genómico que codifica para orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 (YP_400611; supuesta enzima generadora de aldehído) (SEQ ID NO: 65) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se transformó el constructo resultante (“OP80-PCC7942_1594”) en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 con glucosa al 1% (p/v) como fuente de carbono y complementado con espectinomicina 100 pg/ml. Cuando el cultivo alcanzó una DO600 de 0,8-1,0, se indujo con IPTG 1 mM y se hicieron crecer las células durante 18-20 h adicionales a 37°C. Se extrajeron células a partir de 0,5 ml de cultivo con 0,5 ml de acetato de etilo. Tras la sonicación durante 60 min, se centrifugó la muestra a 15.000 rpm durante 5 min. Se analizó la capa de disolvente mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 6, células de E. coli transformadas con el vector que lleva orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 produjeron los siguientes aldehídos grasos y alcoholes grasos: hexadecanal, octadecenal, tetradecenol, hexadecenol, hexadecanol y octadecenol. Este resultado indica que orf1594 de PCC7942 (i) genera aldehídos in vivo como posibles sustratos para la descarbonilación y (ii) puede reducir acil-ACP como sustratos, que son la forma más abundante de ácidos grasos activados en células de E. coli silvestres. Por tanto, la enzima se denominó acil-ACP reductasa. In vivo, los aldehídos grasos aparentemente se reducen adicionalmente a los correspondientes alcoholes grasos mediante una actividad aldehído reductasa de E. coli endógena.

Ejemplo 4. Producción de aldehídos grasos y alcoholes grasos en E. coli a través de expresión heteróloga de cce 1430 de Cyanothece sp. ATCC51142

Se amplificó el ADN genómico que codifica para cce_1430 de Cyanothece sp ATCC51142 (YP_001802846; supuesta enzima generadora de aldehído) (SEQ ID NO: 69) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se transformó el constructo resultante en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 con glucosa al 1% (p/v) como fuente de carbono y complementado con espectinomicina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 7, células de E. coli transformadas con el vector que lleva cce_1430 de Cyanothece sp ATCC51142 produjeron los siguientes aldehídos grasos y alcoholes grasos: hexadecanal, octadecenal, tetradecenol, hexadecenol, hexadecanol y octadecenol. Este resultado indica que cce_1430 de ATCC51142 (i) genera aldehídos in vivo como posibles sustratos para la descarbonilación y (ii) puede reducir acil-ACP como sustratos, que son la forma más abundante de ácidos grasos activados en células de E. coli silvestres. Por tanto, esta enzima es también una acil-ACP reductasa.

Ejemplo 5. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y orf1593 de Synechococcus elongatus PCC7942

Se amplificó el ADN genómico que codifica para orf1593 de Synechococcus elongatus PCC7942 (YP_400610; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 1) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 8, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y PCC7942_1593 de S. elongatus produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PCC7942_1593 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 6. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102

Se amplificó el ADN genómico que codifica para Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 5) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 9, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y Npun02004178 de N. punctiforme PCC73102 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal, hexadecanal y octadecenal en tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 7. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y sll0208 de Svnechocvstis sp. PCC6803

Se amplificó el ADN genómico que codifica para sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803 (NP_442147; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 3) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 10, células de E. coli contransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 8. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y alr5283 de Nostoc sp. PCC7210

Se amplificó el ADN genómico que codifica para alr5283 de Nostoc sp. PCC7210 (NP_489323; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 7) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se cultivaron las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 11, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y alr5283 Nostoc sp. de PCC7210 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que alr5283 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 9. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y AM1 4041de Acaryochloris marina MBIC11017

Se optimizaron los codones del ADN genómico que codifica para AM1_4041 de Acaryochloris marina MBIC11017 (YP_001518340; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 9) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 46), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 12, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y AM1_4041 de A. marina MBIC11017 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que AM1_4041 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal, hexadecanal y octadecenal en tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 10. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y BP-1 tll1313 de Thermosynechococcus elongatus

Se optimizaron los codones del ADN genómico que codifica para BP-1 tll1313 de Thermosynechococcus elongatus (NP_682103; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 11) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 47), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 13, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y BP-1 tll1313 de T. elongatus produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que tll1313 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 11. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y CYA 0415 de Synechococcus sp. JA-3-3Ab

Se optimizaron los codones del ADN genómico que codifica para CYA_0415 de Synechococcus sp. JA-3-3Ab (YP_473897; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 13) para la expresión en E. coli (SEQ ID NO: 48), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 14, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y CYA_0415 de Synechococcus sp. JA-3-3Ab produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 12. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 Synechococcus elongatus PCC7942 y gll3146 de Gloeobacter violaceus PCC7421

Se amplificó el ADN genómico que codifica para gll3146 de Gloeobacter violaceus PCC7421 (NP_926092; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 15) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 15, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y gll3146 de G. violaceus PCC7421 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que gll3146 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 13. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y PMT1231 de Prochlorococcus marinus MIT9313

Se optimizaron los codones del ADN genómico que codifica para PMT1231 de Prochlorococcus marinus MIT9313 (NP_895059; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID No : 17) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 49), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 16, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y PMT1231 de P. marinus MIT9313 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PMT 1231 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 14. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y PMM0532 de Prochlorococcus marinus CCMP1986

Se amplificó el ADN genómico que codifica para PMM0532 de Prochlorococcus marinus CCMP1986 (NP_892650; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 19) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 17, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 S. elongatus y PMM0532 de P. marinus CCMP1986 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PMM0532 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 15. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y PMN2A 1863 de Prochlorococcus marinus NATL2A

Se optimizaron los codones del ADN genómico que codifica para PMN2A_1863 de Prochlorococcus marinus NATL2A (YP_293054; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 21) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 51), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 18, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y PMN2A_1863 de P. marinus NATL2A produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PMN2A_1863 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 16. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y RS991709941 de Synechococcus sp. RS9917

Se optimizaron los codones del ADN genómico que codifica para RS9917_09941 de Synechococcus sp. RS9917 (ZP_01079772; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 23) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 52), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 19, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y RS9917_09941 de Synechococcus sp. RS9917 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que RS9917_09941 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 17. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y RS9917 12945 de Synechococcus sp. RS9917

Se optimizaron los codones del ADN genómico que codifica para RS9917_12945 Synechococcus sp. RS9917 (ZP_01080370; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 25) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 53), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 20, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y RS9917_12945 de Synechococcus sp. RS9917 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que RS9917_12945 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 18. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y cce 0778 de Cyanothece sp. ATCC51142

Se sintetizó el ADN genómico que codifica para cce_0778 de Cyanothece sp ATCC51142 (YP_001802195; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 27) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 21, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y cce_0778 de Cyanothece sp ATCC51142 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que cce_0778 de ATCC51142 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal, hexadecanal y octadecenal en tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 19. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y Cyan 7425 0398 de Cyanothece sp. PCC7425

Se sintetizó el ADN genómico que codifica para Cyan7425_0398 de Cyanothece sp PCC7425 (YP_002481151; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 29) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 22, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y Cyan7425_0398 de Cyanothece sp PCC7425 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Cyan7425_0398 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal, hexadecanal y octadecenal en tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 20. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y Cyan7425 2986 de Cyanothece sp. PCC7425

Se sintetizó el ADN genómico que codifica para Cyan7425_2986 de Cyanothece sp PCC7425 (YP_002483683; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 31) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 23, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan PCC7942_1594 de S. elongatus y Cyan7425_2986 de Cyanothece sp PCC7425 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Cyan7425_2986 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal, hexadecanal y octadecenal en tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.

Ejemplo 21. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de PMM0533 de Prochlorococcus marinus CCMP1986 y PMM0532 de Prochlorococcus marinus CCMP1986

Se amplificó el ADN genómico que codifica para PMM0533 de P. marinus CCMP1986 (NP_892651; supuesta enzima generadora de aldehído) (SEQ ID NO: 71) y PMM0532 de Prochlorococcus marinus CCMP1986 (NP_892650; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 19) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-80 y los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183, respectivamente. Se transformaron por separado los constructos resultantes y se cotransformaron en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 pg/ml y carbenicilina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 24A, células de E. coli células transformadas con sólo el vector que lleva PMM0533 de P. marinus CCMP1986 no produjeron ningún aldehído graso o alcohol graso. Sin embargo, células de E. coli cotransformadas con vectores que llevan PMM0533 y PMM0532 produjeron hexadecanol, pentadecano y heptadeceno (figura 24B). Este resultado indica que PMM0533 sólo proporciona sustratos de aldehído graso para la reacción de descarbonilación cuando interacciona con una descarbonilasa, tal como PMM0532.

Ejemplo 22. Producción de alcanos y alquenos en una cepa de E. coli productora de acil graso-CoA a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y AM1 4041 de Acaryochloris marina MBIC11017

Se sintetizó el ADN genómico que codifica para AM1_4041 de Acaryochloris marina MBIC1 1017 (YP_001518340; supuesta aldehído graso descarbonilasa) (SEQ ID NO: 9) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc'tesA-fadD. Esta cepa expresa una versión citoplasmática de la tioesterasa de E. coli, ‘TesA, y la acil-CoA sintetasa de E. coli, FadD, bajo el control del promotor Ptrc, y por tanto produce acil graso-CoA. Se cultivaron las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 25, estas células de E. coli cotransformadas con PCC7942_1594 de S. elongatus y AM1_4041 de A. marina MBIC11017 también produjeron alcanos y alcoholes grasos. Este resultado indica que PCC7942_1594 de S. elongatus puede usar acil-CoA como sustrato para producir hexadecenal, hexadecanal y octadecenal, que entonces se convierte en pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, mediante AM1_4041 de A. marina MBIC11017.

Ejemplo 23. Producción de alcanos y alquenos en una cepa de E. coli productora de acil graso-CoA a través de expresión heteróloga de sll0209 de Svnechocvstis sp. PCC6803 y sll0208 de Svnechocvstis sp. PCC6803

Se sintetizó el ADN genómico que codifica para sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803 (NP_442147; supuesta aldehído graso descarbonilasa) (SEQ ID NO: 3) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se sintetizó el ADN genómico que codifica para Synechocystis sp. PCC6803 sll0209 (NP_442146; acil-ACP reductasa) (SEQ ID NO: 67) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformaron los constructos resultantes en E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc'tesA-fadD. Esta cepa expresa una versión citoplasmática de la tioesterasa de E. coli, ‘TesA, y la acil-CoA sintetasa de E. coli, FadD, bajo el control del promotor Ptrc, y por tanto produce acil graso-CoA. Se cultivaron las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 26, estas células de E. coli transformadas con sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803 no produjeron ningún aldehído graso o alcohol graso. Sin embargo, cuando se cotransformaron con sll0208 y sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803, produjeron alcanos, aldehídos grasos y alcoholes grasos. Este resultado indica que sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803 puede usare acil-CoA como sustrato para producir aldehídos grasos tales como tetradecanal, hexadecanal y octadecenal, pero sólo cuando se coexpresa con una aldehído graso descarbonilasa. Los aldehídos grasos aparentemente se reducen adicionalmente a los correspondientes alcoholes grasos, tetradecanol, hexadecanol y octadecenol, mediante una actividad aldehído reductasa de E. coli endógena. En este experimento, se convirtió octadecenal en heptadeceno mediante sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803.

Ejemplo 24. Producción de alcanos y alquenos en una cepa de E. coli productora de aldehído graso a través de expresión heteróloga de Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 y varios de sus homólogos

Se amplificó el ADN genómico que codifica para Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838; supuesta aldehído graso descarbonilasa) (SEQ ID NO: 5) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se amplificó el ADN genómico que codifica para el orf MSMEG_5739 de la cepa de Mycobacterium smegmatis MC2 155 (YP_889972, supuesta ácido carboxílico reductasa) (SEQ ID NO: 85) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-180 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformaron los dos constructos resultantes en E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc -‘tesA. En esta cepa, MSMEG_5739 proporcionó aldehídos grasos, que reduce ácidos grasos libres (formados por la acción de ‘TesA) a aldehídos grasos. Se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 1.

Tal como se muestra en la figura 27, estas células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevan Npun02004178 de N. punctiforme PCC73102 y MSMEG_5739 de la cepa de M. smegmatis MC2 155 produjeron tridecano, pentadeceno y pentadecano. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal y hexadecanal proporcionados por la ácido carboxílico reductasa MSMEG_5739 en tridecano, pentadeceno y pentadecano. Tal como se muestra en la figura 28, en la misma configuración experimental, las siguientes aldehído graso descarbonilasas también convirtieron aldehídos grasos proporcionados por MSMEG_5739 en los correspondientes alcanos cuando se expresaron en E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc - 'tesA:Nostocsp. alr5283 de PCC7210 (SEQ ID NO: 7), PMM0532 de P. marinus CCMP1986 (SEQ ID NO: 19), gll3146 de G. violaceus PCC7421 (SEQ ID NO: 15), RS9917_09941 de Synechococcus sp. (SEQ ID NO: 23), RS9917_12945 de Synechococcus sp. (SEQ ID NO: 25) y AM1_4041 de A marina MBIC11017 (SEQ ID NO: 9).

Ejemplo 25: Las aldehído graso descarbonilasas cianobacterianas pertenecen a la clase de proteínas de di-hierro sin grupo hemo. La mutagénesis dirigida al sitio de histidinas conservadas a fenilalaninas en Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 no suprime su función catalítica

Tal como se comentó en el ejemplo 13, la proteína hipotética PMT1231 de Prochlorococcus marinus MIT9313 (SEQ ID NO: 18) es una aldehído graso descarbonilasa activa. Basándose en la estructura tridimensional de PMT1231, que está disponible a una resolución de 1,8 A (pdb2OC5A) (véase la figura 29B), las aldehído graso descarbonilasas cianobacterianas tienen una similitud estructural con las proteínas de di-hierro sin grupo hemo, en particular con proteínas de subunidad p de ribonucleasa reductasa de clase I, RNRp (Stubbe y Riggs-Gelasco, TIBS 1998, vol. 23., págs. 438) (véase la figura 29A). RNRp de clase Ia e Ib contiene un radical tirosilo diférrico que media en la actividad catalítica de RNRa (reducción de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos). En RNRp de E. coli, esta tirosina está en la posición 122 y está en proximidad estrecha a una de las moléculas de hierro del sitio activo. La alineación estructural mostró que PMT1231 contenía una fenilalanina en la misma posición que RNRb tyr122, lo que sugiere un mecanismo catalítico diferente para aldehído graso descarbonilasas cianobacterianas. Sin embargo, una alineación de todas las descarbonilasas mostró que dos residuos de tirosina estaban completamente conservados en todas las secuencias, tyr135 y tyr138 con respecto a PMT1231, estando tyr135 en proximidad estrecha (5,5 A) a una de las moléculas de hierro del sitio activo (véase la figura 29C). Para examinar si cualquiera de los dos residuos de tirosina conservados está implicado en el mecanismo catalítico de aldehído graso descarbonilasas cianobacterianas, se reemplazaron estos residuos por fenilalanina en Npun02004178 (tyr 123 y tyr126) tal como sigue.

Se clonó el ADN genómico que codifica para ORF1594 de S. elongatus PCC7942 (SEQ ID NO: 65) en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. También se clonó el ADN genómico que codifica para Npun02004178 de N. punctiforme PCC73102 (SEQ ID NO: 5) en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC177) bajo el control del promotor Ptrc. Se usó este último constructo como molde para introducir una mutación en las posiciones 123 y 126 de la proteína descarbonilasa, cambiando las tirosinas a fenilalaninas usando los cebadores gttttgcgatcgcagcatttaacatttacatccccgttgccgacg y gttttgcgatcgcagcatataacattttcatccccgttgccgacg, respectivamente. Entonces se transformaron los constructos resultantes en E. coli MG1655. Se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con glucosa al 1% (p/v), y carbenicilina y espectinomicina 100 pg/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3.

Tal como se muestra en la figura 30, las dos variantes de proteína Npun02004178 Tyr a Phe eran activas y produjeron alcanos cuando se coexpresaron con ORF1594 de S. elongatus PCC7942. Este resultado indica que en contraposición a las proteínas RNRp de clase Ia y Ib, el mecanismo catalítico de aldehído graso descarbonilasas no implica un radical tirosilo.

Ejemplo 26: Caracterización bioquímica de Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102

Se clonó el ADN genómico que codifica para Npun02004178 de N. punctiforme PCC73102 (SEQ ID NO: 5) en los sitios NdeI y XhoI del vector pET-15b bajo el control del promotor de T7. La proteína Npun02004178 resultante contenía una etiqueta de His N-terminal. Se transformó una cepa de E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen) con el plásmido mediante técnicas de transformación química rutinarias. Se llevó a cabo la expresión de proteínas inoculando en primer lugar una colonia de la cepa de E. coli en 5 ml de medio LB complementado con 100 mg/l de carbenicilina y se agitó durante la noche a 37°C para producir un cultivo iniciador. Se usó este cultivo iniciador para inocular 0,5 l de medio LB complementado con 100 mg/l de carbenicilina. Se agitó el cultivo a 37°C hasta que se alcanzó un valor de DO600 de 0,8, y entonces se añadió IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Entonces se agitó el cultivo a 37°C durante aproximadamente 3 h adicionales. Entonces se centrifugó el cultivo a 3.700 rpm durante 20 min a 4°C. Entonces se resuspendió el sedimento en 10 ml de tampón que contenía tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2 complementado con Bacterial ProteaseArrest (GBiosciences). Entonces se sonicaron las células a 12 W sobre hielo durante 9 s con 1,5 s de sonicación seguido por 1,5 s de descanso. Se repitió este procedimiento 5 veces con intervalos de un minuto entre cada ciclo de sonicación. Se centrifugó el extracto libre de células a 10.000 rpm durante 30 min a 4°C. Se añadieron 5 ml de Ni-NTA (Qiagen) al sobrenadante y se agitó suavemente la mezcla a 4°C. Se hizo pasar la suspensión sobre una columna que eliminaba la resina del lisado. Entonces se lavó la resina con 30 ml de tampón que contenía tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2 más imidazol 30 mM. Finalmente, se eluyó la proteína con 10 ml de tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2 más imidazol 250 mM. Se dializó la disolución de proteína con 200 volúmenes de tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2 con glicerol al 20%. Se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford (Biorad). Se obtuvieron 5,6 mg/ml de proteína Npun02004178.

Para sintetizar octadecanal para la reacción de descarbonilasa, se disolvieron 500 mg de octadecanol (Sigma) en 25 ml de diclorometano. A continuación, se añadieron 200 mg de clorocromato de piridinio (TCI America) a la disolución y se agitó durante la noche. Se secó la mezcla de reacción a vacío para eliminar el diclorometano. Se resuspendieron los productos restantes en hexano y se filtraron a través de papel de filtro Whatman. Entonces se secó el filtrado a vacío y se resuspendió en 5 ml de hexano y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en sílice. Se cargó la mezcla sobre la columna alimentada por gravedad en hexano y luego se lavó con dos volúmenes de columna de hexano. Entonces se eluyó el octadecanal con una mezcla 8:1 de hexano y acetato de etilo. Se agruparon las fracciones que contenían octadecanal y se analizaron usando los métodos de CG/EM descritos a continuación. El producto final era el 95% puro tal como se determinó mediante este método.

Para someter a prueba la proteína Npun02004178 para determinar la actividad de descarbonilación, se establecieron los siguientes ensayos enzimáticos. Se establecieron reacciones de 200 pl en tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2 con los siguientes componentes a sus concentraciones finales respectivas: 30 pM de proteína Npun02004178 purificada, octadecanal 200 pM, ferredoxina de espinaca 0,11 pg/ml (Sigma), ferredoxina reductasa de espinaca 0,05 unidades/ml (Sigma) y NADPH 1 mM (Sigma). Los controles negativos incluían la reacción anterior sin Npun02004178, la reacción anterior sin octadecanal y la reacción anterior sin ferredoxina de espinaca, ferredoxina reductasa y NADPH. Se incubó cada reacción a 37°C durante 2 h antes de extraerse con 100 pl de acetato de etilo. Se analizaron las muestras mediante CG/EM usando los siguientes parámetros: tiempo de ejecución: 13,13 min; columna: HP-5-EM n.° de parte 19091S-433E (longitud de 30 metros; D.I.: orificio estrecho de 0,25 mm; película: 0,25iM); inyección: entrada 1 il Agilent 6850; entrada: 300 C sin división; gas portador: helio; flujo: 1,3 ml/min; temp. del horno: 75°C mantenidos 5 min, 320 a 40°C/min, 320 mantenidos 2 min; det.: Agilent 5975B VL MSD; temp. de det.: 330°C; barrido: 50-550 M/Z. Se usó heptadecano de Sigma como referencia auténtica para determinar el tiempo de retención de los compuestos y el patrón de fragmentación.

Tal como se muestra en la figura 31, se observó conversión in vitro de octadecanal en heptadecano en presencia de Npun02004178. La descarbonilación enzimática de octadecanal mediante Npun02004178 era dependiente de la adición de ferredoxina de espinaca reducatasa, ferredoxina y NADPH.

A continuación, se determinó si ferredoxinas y ferredoxina reductasas cianobacterianas pueden reemplazar a las proteínas de espinaca en el ensayo de aldehído graso descarbonilasa in vitro. Se clonaron por separado los siguientes cuatro genes en los sitios Ndel y Xhol de pET-15b: Npun02003626 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00109192, ferredoxina oxidoreductasa petH sin el dominio de ligador de aloficocianina n-terminal) (SEQ ID NO: 87), Npun02001001 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00111633, ferredoxina 1) (SEQ ID NO: 89), Npun02003530 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00109422, ferredoxina 2) (SEQ ID NO: 91) y Npun02003123 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00109501, ferredoxina 3) (SEQ ID NO: 93). Se expresaron las cuatro proteínas y se purificaron tal como se describió anteriormente. Se obtuvieron 1 mg/ml de cada ferredoxina y 4 mg/ml de la ferredoxina oxidoreductasa. Se sometieron a prueba las tres ferredoxinas cianobacterianas con la ferredoxina oxidoreductasa cianobacterianas usando la configuración enzimática descrita anteriormente con los siguientes cambios. La concentración final de la ferredoxina reductasa era de 60 pg/ml y las ferredoxinas estaban a 50 pg/ml. Las reacciones enzimáticas extraídas fueron mediante CG/EM usando los siguientes parámetros: tiempo de ejecución: 6,33 min; columna: J&W 122-5711 DB-5ht (longitud de 15 metros; D.I.: orificio estrecho de 0,25 mm; película: 0,10 pM); inyección: entrada de 1 pl Agilent 6850; entrada: 300°C sin división; gas portador: helio; flujo: 1,3 ml/min; temp. del horno: 100°C mantenidos 0,5 min, 260 a 30°C/min, 260 mantenidos 0,5 min; det.: Agilent 5975B VL MSD; temp. de det.: 230°C; barrido: 50-550 M/Z.

Tal como se muestra en la figura 32, se observó conversión in vitro dependiente de Npun02004178 de octadecanal en heptadecano en presencia de NADPH y la ferredoxina oxidoreductasa cianobacterianas y cualquiera de las tres ferredoxinas cianobacterianas.

Ejemplo 27. Caracterización bioquímica de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942

Se clonó el ADN genómico que codifica para orf1594 de S. elongatus PCC7492 (SEQ ID NO: 65) en los sitios NcoI y XhoI del vector pET-28b bajo el control del promotor de T7. La proteína PCC7942_orf1594 resultante contenía una etiqueta de His C-terminal. Se transformó una cepa de E. coli b L21 (DE3) (Invitrogen) con el plásmido y se expresó la proteína PCC7942_orf1594 y se purificó tal como se describió en el ejemplo 22. Se almacenó la disolución de proteína en el siguiente tampón: fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, THP 1 mM, glicerol al 10%. Se determinó la concentración de proteína usando el ensayo Bradford (Biorad). Se obtuvieron 2 mg/ml de proteína PCC7942_orf1594.

Para someter a prueba la proteína PCC7942_orf1594 para determinar la actividad acil-ACP o acil-CoA reductasa, se establecieron los siguientes ensayos enzimáticos. Se establecieron reacciones de 100 pl en tampón Tris-HCl 50 mM a pH 7,5 con los siguientes componentes a sus concentraciones finales respectivas: 10 pM de proteína PCC7942_orf1594 purificada, acil-CoA o acil-ACP 0,01-1 mM, MgCh 2 mM, NADPH 0,2-2 mM. Se incubaron las reacciones durante 1 h a 37°C y se detuvieron añadiendo 100 pl de acetato de etilo (que contenía 1-octadeceno 5 mg/l como patrón interno). Se agitaron con vórtex las muestras durante 15 min y se centrifugaron a velocidad máx. durante 3 min para la separación de fases. Se transfirieron 80 pl de la capa superior a viales de vidrio de CG y se analizaron mediante CG/EM tal como se describió en el ejemplo 26. Se calculó la cantidad de aldehído formada basándose en el patrón interno.

Tal como se muestra en la figura 33, PCC7942_orf1594 podía reducir octadecanoil-CoA a octadecanal. La actividad reductasa requería cationes divalentes tales como Mg2+, Mn2+ o Fe2+ y NADPH como donador de electrones. NADH no soportaba actividad reductasa. PCC7942_orf1594 también podía reducir octadecenoil-CoA y octadecenoil-ACP a octadecenal. Se determinaron los valores de Km para la reducción de octadecanoil-CoA, octadecenoil-CoA y octadecenoil-ACP en presencia de NADPH 2 mM como 45 ± 20 pM, 82 ± 22 pM y 7,8 ± 2 pM, respectivamente. Estos resultados demuestran que PCC7942_orf1594, in vitro, reduce tanto acil-CoA como acil-ACP y que la enzima tiene aparentemente una mayor afinidad por acil-ACP en comparación con acil-CoA. El valor de Km para NADPH en presencia de octadecanoil-CoA 0,5 mM para PCC7942_orf1594 se determinó como 400 ± 80 pM.

A continuación, se examinó la transferencia de hidruro estereoespecífica desde NADPH hasta un aldehído graso catalizada por PCC7942_orf1594. Se preparó deutero-NADPH según el siguiente protocolo. Se añadieron 5 mg de NADP+ y 3,6 mg de D-glucosa-1-d a 2,5 ml de tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0). Se inició la producción enzimática de NADPH marcado mediante la adición de 5 unidades de glucosa deshidrogenasa de o bien Bacillus megaterium (USB Corporation) para la producción de R-(4-2H)NADPH o bien Thermoplasma acidophilum (Sigma) para la producción de S-(4-2H)NADPH. Se incubó la reacción durante 15 min a 37°C, se filtró por centrifugación usando un filtro de centrífuga Amicon Ultra de MWCO de 10 KDa (Millipore), se congeló inmediatamente sobre hielo seco y se almacenó a -80°C.

La reacción de ensayo in vitro contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), 10 pM de proteína PCC7942_orf1594 purificada, octadecanoil-CoA 1 mM, MgCl22 mM y 50 pl de deutero-NADPH (preparado tal como se describió anteriormente) en un volumen total de 100 pl. Tras una incubación de 1 h, se extrajo el producto de la reacción enzimática y se analizó tal como se describió anteriormente. El aldehído graso resultante detectado mediante CG/EM era octadecanal (véase la figura 34). Debido a que la transferencia de hidruro desde NADPH es estereoespecífica, se sintetizaron tanto R-(4-2H)NADPH como S-(4-2H)NADPH. Se observó octadecanal con una masa unitaria de uno positivo usando sólo el S-(4-2H)NADPH. El hecho de que el aldehído graso estaba marcado indica que el hidrógeno deuterado se ha transferido desde el NADPH marcado hasta el aldehído graso marcado. Esto demuestra que se usa NADPH en esta reacción enzimática y que la transferencia de hidruro catalizada por PCC7942_orf1594 es estereoespecífica.

Ejemplo 28. Producción intracelular y extracelular de aldehídos grasos y alcoholes grasos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942

Se amplificó el ADN genómico que codifica para orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 (YP_400611; acil-ACP reductasa) (SEQ ID NO: 65) y se clonó en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformó el constructo resultante en E. coli MG1655 AfadE y se hicieron crecer las células a 37°C en 15 ml de medio mínimo Che-9 con glucosa al 3% (p/v) como fuente de carbono y complementado con espectinomicina y carbenicilina 100 pg/ml, respectivamente. Cuando el cultivo alcanzó una DO600 de 0,8-1,0, se indujo con IPTG 1 mM y se hicieron crecer las células durante 24-48 h adicionales a 37°C. El medio mínimo Chc-9 se define como: Na2HPO46 g/l, KH2PO43 g/l, NaCl 0,5 g/l, NH4Cl 2 g/l, MgSO40,25 g/l x 7 H2O, CaCl211 mg/l, Fe3Cl 27 mg/l x 6 H2O, ZnCl 2 mg/l x 4 H2O, Na2MoO42 mg/l x 2 H2O, CuSO41,9 mg/l x 5 H2O, H3BO30,5 mg/l, tiamina 1 mg/l, Bis-Tris 200 mM (pH 7,25) y Triton-X100 al 0,1% (v/v). Cuando el cultivo alcanzó una DO600 de 1,0-1,2, se indujo con IPTG 1 mM y se permitió que las células crecieran durante 40 h adicionales a 37°C. Se extrajeron células a partir de 0,5 ml de cultivo con 0,5 ml de acetato de etilo para determinar la producción de hidrocarburos totales tal como se describió en el ejemplo 26. Adicionalmente, se separaron las células y el sobrenadante mediante centrifugación (4.000 g a TA durante 10 min) y se extrajeron por separado.

El cultivo produjo 620 mg/l de aldehídos grasos (tetradecanal, heptadecenal, heptadecanal y octadecenal) y 1670 mg/l de alcoholes grasos (dodecanol, tetradecenol, tetradecanol, heptadecenol, heptadecanol y octadecenol). La figura 35 muestra el cromatograma del sobrenadante extraído. Se determinó que el 73% de los aldehídos grasos y alcoholes grasos estaban en el sobrenadante libre de células.

Ejemplo 29. Producción intracelular y extracelular de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102

Se amplificó el ADN genómico que codifica para orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 (YP_400611; acil-ACP reductasa) (SEQ ID NO: 65) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se amplificó el ADN genómico que codifica para Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838; aldehído graso descarbonilasa) (SEQ ID NO: 5) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformaron los constructos resultantes en E. coli MG1655 AfadE y se hicieron crecer las células a 37°C en 15 ml de medio mínimo Che9 con glucosa al 3% (p/v) como fuente de carbono y complementado con espectinomicina y carbenicilina 100 pg/ml, respectivamente. Se hicieron crecer las células, se separaron del caldo, se extrajeron y se analizaron tal como se describió en el ejemplo 28.

El cultivo produjo 323 mg/l de alcanos y alquenos (tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno), 367 mg/l de aldehídos grasos (tetradecanal, heptadecenal, heptadecanal y octadecenal) y 819 mg/l de alcoholes grasos (tetradecanol, heptadecenol, heptadecanol y octadecenol). La figura 36 muestra el cromatograma del sobrenadante extraído. Se determinó que el 86% de los alcanos, alquenos, aldehidos grasos y alcoholes grasos estaban en el sobrenadante libre de células.

Ejemplo 30. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de expresión heteróloga de alr5284 de Nostoc sp. PCC7210 y alr5283 de Nostoc sp. PCC7210

Se amplificó el ADN genómico que codifica para alr5284 de Nostoc sp. PCC7210 (NP_489324; supuesta enzima generadora de aldehído) (SEQ ID NO: 81) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se amplificó el ADN genómico que codifica para alr5283 de Nostoc sp. PCC7210 (ⁿP_489323; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 7) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector ^oP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformaron los constructos resultantes en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en 15 ml de medio mínimo Che9 con glucosa al 3% (p/v) como fuente de carbono y complementado con espectinomicina y carbenicilina 100 pg/ml, respectivamente (tal como se describió en el ejemplo 28). Se extrajeron células a partir de 0,5 ml de cultivo y se analizaron tal como se describió en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describió en el ejemplo 26.

Tal como se muestra en la figura 37, células de E. coli cotransformadas con los vectores que llevaban alr5284 de Nostoc sp. PCC7210 y alr5283 de Nostoc sp. PCC7210 produjeron tridecano, pentadeceno, pentadecano, tetradecanol y hexadecanol. Este resultado indica que la coexpresión de alr5284 y alr5283 de Nostoc sp. PCC7210 es suficiente para que E. coli produzca alcoholes grasos, alcanos y alquenos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Célula huésped no humana para su uso en la producción de un aldehido graso o un alcohol graso, dicha célula modificada por ingeniería genética para expresar un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65 o 69, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad acil-ACP o acil-CoA reductasa y que es de una cianobacteria.

2. Célula huésped no humana según la reivindicación 1, en la que el polinucleótido está comprendido por un vector recombinante.

3. Célula huésped no humana según la reivindicación 1, en la que el polinucleótido se incorpora de manera estable en el ADN genómico de la célula huésped.

4. Célula huésped no humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la célula huésped es una célula microbiana.

5. Célula huésped no humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la célula huésped es una célula bacteriana.

6. Célula huésped no humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la célula huésped es una célula de Escherichia o una célula cianobacteriana.