CN103194418B - 一种制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法 - Google Patents

一种制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103194418B
CN103194418B CN201210001015.0A CN201210001015A CN103194418B CN 103194418 B CN103194418 B CN 103194418B CN 201210001015 A CN201210001015 A CN 201210001015A CN 103194418 B CN103194418 B CN 103194418B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
microorganism
nucleotide sequence
hydrocarbon compound
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201210001015.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103194418A (zh
Inventor
刘天罡
吴凯悦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Hesheng Technology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Zhenzhi Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Zhenzhi Biological Science & Technology Co Ltd filed Critical Wuhan Zhenzhi Biological Science & Technology Co Ltd
Priority to CN201210001015.0A priority Critical patent/CN103194418B/zh
Priority to PCT/CN2013/070036 priority patent/WO2013102436A1/zh
Publication of CN103194418A publication Critical patent/CN103194418A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103194418B publication Critical patent/CN103194418B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10G—CRACKING HYDROCARBON OILS; PRODUCTION OF LIQUID HYDROCARBON MIXTURES, e.g. BY DESTRUCTIVE HYDROGENATION, OLIGOMERISATION, POLYMERISATION; RECOVERY OF HYDROCARBON OILS FROM OIL-SHALE, OIL-SAND, OR GASES; REFINING MIXTURES MAINLY CONSISTING OF HYDROCARBONS; REFORMING OF NAPHTHA; MINERAL WAXES
    • C10G1/00—Production of liquid hydrocarbon mixtures from oil-shale, oil-sand, or non-melting solid carbonaceous or similar materials, e.g. wood, coal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/04—Liquid carbonaceous fuels essentially based on blends of hydrocarbons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10G—CRACKING HYDROCARBON OILS; PRODUCTION OF LIQUID HYDROCARBON MIXTURES, e.g. BY DESTRUCTIVE HYDROGENATION, OLIGOMERISATION, POLYMERISATION; RECOVERY OF HYDROCARBON OILS FROM OIL-SHALE, OIL-SAND, OR GASES; REFINING MIXTURES MAINLY CONSISTING OF HYDROCARBONS; REFORMING OF NAPHTHA; MINERAL WAXES
    • C10G2300/00—Aspects relating to hydrocarbon processing covered by groups C10G1/00 - C10G99/00
    • C10G2300/10—Feedstock materials
    • C10G2300/1011—Biomass
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P30/00—Technologies relating to oil refining and petrochemical industry
    • Y02P30/20—Technologies relating to oil refining and petrochemical industry using bio-feedstock

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了烃类化合物的制备方法。其中，用于制备烃类化合物的微生物包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列编码聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体。利用该微生物能够有效地生产烃类化合物。

Description

一种制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及烃类化合物的制备方法。更具体地，本发明涉及一种微生物、一种适于转化微生物的系统、一种制备重组微生物的方法、一种生产烃类化合物的方法、一种烃类化合物、以及一种制备生物燃料的系统。
背景技术
第一代生物柴油，主要以动植物油脂为原料油，通过化学法或酶法催化的酯交换工艺来制备。这种生产方式的不足在于生产原料短缺、甲醇的使用以及甘油副产物的去除等问题。目前，在工业上用于制备生物柴油的主要油脂原料(如大豆油、菜籽油等)同时也是人类生活的必需品，而大量种植油料作物又受到耕地不足、粮食供应不足、天气地理环境不适等多方面限制。
第二代生物柴油，则是近年来随着合成生物学和代谢工程的迅速发展，通过选择合适的微生物并利用各种生物技术改造其代谢合成途径(如脂肪酸合成途径、异戊二烯合成途径等)而获得的。研究人员能利用微生物直接生产性能更加优越、品质更高的新型第二代生物柴油——长链烷烃。但是第二代生物柴油的生产仍然受到微生物自身代谢途径的限制，得到的产物产量低、副产物多。
目前利用生物方法生产燃料的方法，仍有待改进。
发明内容
本发明旨在解决现有技术的问题之一。为此，根据本发明的一个方面，本发明提出了一种微生物，其特征在于，包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列编码聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体。利用根据本发明实施例的微生物，能够有效地生产烃类化合物。
根据本发明的实施例，上述微生物还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，进一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列编码硫酯酶基因sgcE10或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，进一步包括第三核酸序列，其中，所述第三核酸序列编码乙酰辅酶A羧化酶基因或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述乙酰辅酶A羧化酶基因为选自accA、accB、accC和accD的至少一种。
根据本发明的一个实施例，进一步包括第四核酸序列，其中，所述第四核酸序列编码烯醇还原酶基因mupE、fabI或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为大肠杆菌。
根据本发明的第二方面，本发明还提出了一种适于转化微生物的系统。根据本发明的实施例，该适于转化微生物的系统包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列编码聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体。利用该系统，能够转化微生物，从而得到前述的微生物，进而可以有效地生产烃类化合物。
根据本发明的实施例，上述适于转化微生物的系统还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，进一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列编码硫酯酶基因sgcE10或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述第一核酸序列与所述第一核酸序列被设置于不同的载体上。
根据本发明的一个实施例，进一步包括第三核酸序列，其中，所述第三核酸序列编码乙酰辅酶A羧化酶基因或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述乙酰辅酶A羧化酶基因为选自accA、accB、accC和accD的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述第一、第二和第三核酸序列被设置在相互不同的载体上。
根据本发明的一个实施例，进一步包括第四核酸序列，其中，所述第四核酸序列编码烯醇还原酶基因mupE、fabI或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述第一、第二、第三和第四核酸序列被设置在相互不同的载体上。
根据本发明的一个实施例，进一步包括IPTG-诱导型启动子，其中，所述第一、第二、第三或第四核酸序列的至少之一被设置在所述IPTG-诱导型启动子的控制之下。
根据本发明的一个实施例，所述IPTG-诱导型启动子为选自T7启动子、tac启动子和lac启动子的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为大肠杆菌。
根据本发明的第三方面，本发明提出了一种制备重组微生物的方法，其特征在于，包括使用前面所述的适于转化微生物的系统转化微生物，以便获得所述重组微生物。利用该方法，能够有效地制备重组微生物，该重组微生物能够有效地生产烃类化合物。
根据本发明的实施例，上述制备重组微生物的方法，还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为大肠杆菌。
根据本发明的一个实施例，所述重组微生物包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列编码聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述重组微生物进一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列编码硫酯酶基因sgcE10或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述重组微生物进一步包括第三核酸序列，其中，所述第三核酸序列编码乙酰辅酶A羧化酶基因或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述乙酰辅酶A羧化酶基因为选自accA、accB、accC和accD的至少一种。
根据本发明的一个实施例，进一步包括第四核酸序列，其中，所述第四核酸序列编码烯醇还原酶基因mupE或其功能等同体。
根据本发明的第四方面，本发明还提出了一种生产烃类化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤：培养微生物，以便生产所述烃类化合物；以及分离所述烃类化合物，其中，所述微生物包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列编码聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体。利用该方法，能够有效地生产烃类化合物。
根据本发明的实施例，上述用于生产烃类化合物的方法，还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述微生物进一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列编码硫酯酶基因sgcE10或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述微生物进一步包括第三核酸序列，其中，所述第三核酸序列编码乙酰辅酶A羧化酶基因或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述乙酰辅酶A羧化酶基因为选自accA、accB、accC和accD的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述烃类化合物具有化学式CxHy，其中x＝4-40的任意整数，y＝6-82的任意整数。
根据本发明的一个实施例，所述烯烃化合物为十五烯烃。
根据本发明的一个实施例，进一步包括第四核酸序列，其中，所述第四核酸序列编码烯醇还原酶基因mupE、fabI或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述烃类化合物为烷烃化合物。
根据本发明的一个实施例，所述烃类化合物为十五烷烃。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述微生物为大肠杆菌。
根据本发明的一个实施例，进一步包括对所述烯烃化合物进行氢化的步骤。
根据本发明的一个实施例，所述氢化反应是在10％Pd/C的作用下进行的。
根据本发明的一个实施例，分离所述烃类化合物进一步包括：使所述烃类化合物进入有机相；以及从有机相中纯化所述烃类化合物。
根据本发明的第五方面，本发明还提出了一种烃类化合物，其是通过前面所述的制备烃类化合物的方法制备的。
根据本发明的实施例，该烃类化合物可以用作生物燃料。
根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种制备生物燃料的系统，包括：
生物反应器，其中，所述生物反应器中设置有前面所述的微生物，用于在所述生物反应器中产生烃类化合物。
根据本发明的实施例，上述用于制备生物燃料的系统还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，进一步包括：氢化装置，所述氢化装置与所述生物反应器相连，以便从所述生物反应器接收所述烃类化合物，并对所述烃类化合物进行氢化。
根据本发明的一个实施例，所述氢化装置中设置有10％Pd/C，以便催化所述氢化反应。
根据本发明的一个实施例，所述氢化装置为耐高温高压的反应容器。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了质粒pWK1的基本构造，sgcE基因克隆于pET28a载体，基因片段的两端带有BamH I和HindIII位点。
图2显示了质粒pWK2的基本构造，sgcE10基因克隆于pET28a载体，基因片段的两端带Nde I和Spe I、Xho I位点。
图3显示了质粒pWK3的基本构造，sgcE10基因克隆于pET28a载体，基因片段的两端带Nde I和Spe I、Xho I位点。
图4显示了质粒pWK4的基本构造，sgcE和sgcE10基因串联克隆于pET28a载体，基因片段的两端带Xba I和Xho I位点。
图5显示了质粒pWK7的基本构造，sgcE、sgcE10和mupE基因串联克隆于pET28a载体，基因片段的两端带Xba I和Xho I位点。
图6显示了大肠杆菌WK1经IPTG诱导后，其培养物进行提取后的GC-MS结果图。目标分子C15H32已经用箭头指出。
图7显示了大肠杆菌WK2经IPTG诱导后，其培养物进行提取后的LC-APCI-MS结果图。图中M/Z＝199.14827即为目标分子C15H18。
图8显示了大肠杆菌WK2经IPTG诱导后，其培养物进行提取后的GC-MS结果图。目标分子C15H32已经用箭头指出。
图9显示了大肠杆菌WK3经IPTG诱导后，其培养物进行提取后的LC-APCI-MS结果图。图中M/Z＝201.16383即为目标分子C15H20。
图10显示了大肠杆菌WK3经IPTG诱导后，其培养物进行提取后的LC-APCI-MS结果图。图中M/Z＝205.19503即为目标分子C15H24。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
缩写及术语
提供下列关于术语和方法的解释一遍更好的描述本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。本文使用的“包括”表示“包含”，单数形式的“一个”，除非上下明确的另外指出。例如，“包括一个细胞”指包含一个或者多个这类细胞，“包括硫酯酶”指包含一种或者多种硫酯酶肽以及本领域普通技术人员已知的其同等物，等等。术语“或者”是指陈述的可选择要素或者两个或更多个要素组合中的单个要素，除非上下文明确的另外指出。例如短语“生物燃料或者其中间体”是指生物燃料、生物燃料中间体或者生物燃料和生物燃料中间体两者的组合。
除非另外解释，所有本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管与本文描述的类似或者等同的方法和材料可用于本发明的实施或者实验，但下文描述了适合的方法和材料。所述材料、方法和实施例子只是说明性的，而不是用于限制。根据下面的详细说明和权利要求，本发明的其他特征将是明显。
登录号：贯穿本说明书的登录号来源于美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(国立生物技术信息中心)。所述登录号是2011年3月1日由该数据库提供的。
酶分类号(EC)：贯穿本说明书提供的EC编号来自京都基因与基因百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomics)维护的KEGG Ligand数据库，这由东京大学部分资助。所述EC编号是2011年3月1日由该数据库提供的。
碳源：通常指适合作为原核生物或者简单真核生物细胞生长的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各种形式，包括但不限于聚合物，糖、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽，等等。这些包括，例如，各种单糖诸如葡萄糖、低聚糖、多糖、纤维素质、木糖和阿拉伯糖，二糖，诸如蔗糖、饱和或者不饱和的脂肪酸、琥珀酸盐、乳酸盐、乙酸盐、乙醇，等等，或者其混合物。此外，碳源还可以是光合作用产物，包括但不限于葡萄糖。
可检测的：能够确定出现或者存在。例如，使用下面实施例子提供的方法，从发酵液中产物是可检测的。
DNA：脱氧核糖核酸。DNA是长链聚合物，其包括大部分的有机体(一些病毒具有包括核糖核酸RNA的基因)的遗传物质。DNA聚合物中的重复单位是4种不同的核苷酸，其包括4中碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种，所述碱基上结合有脱氧核糖，而磷酸基与所述脱氧核糖连接。DNA分子中被称为密码子的是核苷酸三联体编码肽的氨基酸。术语密码子还指mRNA中3核苷酸的对应(和互补)序列，所述DNA序列被转录成所述mRNA。
内源的：当在本文中对核酸分子和特定的细胞或者微生物使用时，是指位于细胞内的核酸序列或者肽，其不是利用重组工程技术导入细胞的。例如，当细胞最初从自然界分离时，已经存在于所述细胞中的基因。即使调控序列诸如激活转录或者翻译的启动子或者增强子序列已经通过重组技术被改变，基因仍被认为是内源的。
外源的：本文中对核酸分子和特定的细胞使用时，是指不是来源于自然界发现的特定细胞的任意核酸分子。因此，一旦非天然存在的核酸分子被引入细胞，则其被认为是外源的。对特定细胞来说，天然存在的核酸分子也可以是外源的。例如，一旦从细胞X分离的完整编码序列被引入细胞Y，则该编码序列对细胞Y来说是外源核酸，即使X和Y是相同的细胞类型。
表达：基因的编码信息被转变为细胞的结构与功能诸如蛋白、转移RNA或者核糖体RNA的过程。表达的基因包括那些被转录为mRNA然后被翻译为蛋白的基因，以及那些被转录为RNA但不被翻译为蛋白的基因(例如，转移和核糖体RNAs)。
发酵肉汤：包括任意支持微生物生命(即主动代谢碳的微生物)的培养基。发酵培养基通常包含碳源。碳源是可以被微生物用作(利用或者不利用其他的酶)能量的任何物。
烃：包括那些包含元素碳(C)和氢(H)的化合物。所有的烃都由碳骨架以及与该骨架连接的氢原子构成。有时，该术语被用作术语“脂肪烃”的简称。基本上存在3种类型的烃：(1)芳香族烃，其具有至少一个芳香环；(2)饱和烃，亦称为烷，其缺少双键、三键或者芳香键；和(3)不饱和烃，其在碳原子之间具有一个或者多个双键或者三键，被分成：烯烃、炔和二烯。液体的地质提取的烃被称作石油或者矿物油，而气态的地质烃被称作天然气。所有这些均是作为制备有机化学品的原料的燃料和原材料的主要来源，它们通常是石油地质工具在地球表面下发现的。沉积岩中的石油储备是用于能源和化学工业的烃的主要来源。烃在经济上非常重要，因为它们包括了主要化石燃料(煤、石油、天然气，等等)和生物燃料以及塑料、蜡、溶剂和油类的成分。
分离的：“分离的”生物学组分(诸如核酸分子、蛋白或者细胞)已经基本上从该组分天然存在的其他生物学组分中分离或者纯化，诸如其他染色体的和染色体外的DNA和RNA，以及蛋白。已经被“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语还包括在宿主细胞中利用重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子和蛋白。
微生物：包括来自古细菌域、真细菌域和真核生物域的原核和真核微生物种，后者包括酵母和丝状酵母、原生动物、藻类或者更高等的原生生物。术语“微生物细胞”可以与“微生物”互换使用。
核酸分子：包括RNA和DNA分子，其包括但不限于，cDNA、基因组DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，例如那些化学合成或者重组产生的核酸分子。核酸分子可以是双链或者单链的。单链时，核酸分子可以是正义链或者反义链。此外，核酸分子可以是环状或者线性的。
可操作的连接：当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作的连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或者表达，则所述启动子与所述编码序列为可操作的连接。通常，可操作连接的DNA序列是连接的，并且必要时在相同阅读框内连接两个蛋白编码区域。作为单个信使RNA串联转录的分离基因的结构被称为操纵子。因此将基因紧密相邻置于单个启动子的转录调节下，例如在质粒载体中，则构成合成操纵子。
ORF(开放阅读框)：不含任何终止密码子的一系列编码氨基酸的核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可以被翻译为肽。
过表达：当基因的转录速率与其内源转录速率相比提高的时候。在一些实例中，过表达还包括基因的翻译速率高于该基因的内源翻译速率。检测过表达的方法是本领域公知的。例如可以利用RT-PCR评价转录的RNA水平，以及利用SDS-PAGE凝胶分析评价蛋白水平。
纯化的：术语“纯化的”并不需要绝对的纯度；它只是一个相对术语。因此，例如，纯化的生物燃料或其中间体是指比位于其细胞环境内的产物浓度更高的产物。
重组：重组核酸分子或者蛋白，其具有非天然存在的序列，具有由人工组合序列的两个另外分离的序列片段制备的序列，或者以上两者。例如可以通过化学合成或者人工操作核酸分子或者蛋白的分离片段，诸如遗传工程技术，实现这种人工组合。重组还用于描述以下核酸分子，它们已经被人工处理，但包含的调控序列和编码区与分离所述核酸的生物体中发现的相同。重组细胞或者微生物是包含外源核酸分子诸如重组核酸分子的细胞或者微生物。
转化或者重组细胞：例如通过分子生物学技术，已经被引入核酸分子(诸如编码酰基辅酶A合酶的核酸分子)的细胞。转化包括能够将核酸分子引入这类细胞的所有技术，包括但不限于，利用病毒载体转染、接合作用、利用质粒载体转化、通过电穿孔的裸DNA引入、脂质体转染和颗粒枪加速。
在允许产物生成的条件下：任何允许微生物产生所需产物(诸如烷烃、烯烃等)的发酵条件。发酵条件通常包括温度范围、通气水平和培养基选择，将上述条件组合时允许微生物生长。示例性培养基包括肉汤或者凝胶。通常，培养基包括碳源诸如葡萄糖、果糖、纤维素或者可以被微生物直接代谢的类似物，或者可以在培养基中使用促进代谢碳源的酶。为了确定培养条件是否允许产物生成，将微生物培养8、16或者24小时，收集并分析样品。例如，可以检测样品或者培养基(细胞在其中生长)的细胞中所需产物存在。当分析产物的存在时，可以使用下面实例提供的那些方法。
载体：作为引入细胞从而产生转化细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在细胞中复制的核酸序列，诸如复制原点。载体还可以包括一种或者多种选择性标志物基因和本领域已知的其他遗传成分。
在本发明中所使用的术语“第一”、“第二”等类似的术语，是为了区别的目的，而不以任何方式表明或者暗示各自所表示术语之间的重要性的区别。
微生物
根据本发明的第一方面，本发明提出了一种微生物。该微生物，包括第一核酸序列。该第一核酸序列编码聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体。利用该微生物，可以通过在微生物细胞内过表达聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体，从而发挥聚酮合酶的生物活性，进而聚酮合酶可以与宿主微生物体内的固有基因相互作用，从可再生碳源产生烃类化合物。发明人发现，利用该微生物所得到的烃类化合物可以作为生物燃料或者其中间体。在本文中所使用的术语“功能等同体”是指这样的一种基因，其能够在宿主细胞内发挥与例如sgcE相同的功能，但在序列上与例如sgcE有所区别的基因，从而利用该功能等同体也能够有效地生产烃类化合物。通过在微生物中引入外源DNA序列，可以在微生物细胞内表达具有生物活性的蛋白，这些蛋白能够代谢可再生碳源以产生烃类化合物作为生物燃料或其中间体。因此，可以将这些微生物用于生产烃类化合物，以便得到可以作为生物燃料或者生物燃料中间体的烃类化合物。
根据本发明的实施例，第一核酸序列不受特别限制，只要其能够编码SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列(即NCBI登录号：AAL06699.1所描述的sgcE蛋白序列)即可。根据本发明的具体示例，第一核酸序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，发明人惊奇地发现，当采用该核苷酸序列时，sgcE基因在微生物细胞尤其是在大肠杆菌细胞中的表达效率可以得到显著地提高，进而可以进一步提高生产烃类化合物的效率。
根据本发明的实施例，在微生物中还可以进一步包含编码其他基因的核酸序列，从而赋予微生物额外的功能。根据本发明的实施例，在微生物中进一步包括第二核酸序列，该第二核酸序列编码硫酯酶基因sgcE10或其功能等同体。由此，通过硫酯酶基因sgcE10的生物学功能，可以便于所合成的烃类化合物成为游离状态，从而便于最终分离回收烃类化合物，从而可以显著地提高，将这些微生物应用于制备烃类化合物时的生产效率。
根据本发明的实施例，第二核酸序列不受特别限制，只要其能够编码SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列(即NCBI登录号：AAL06692.1所描述的sgcE10蛋白序列)即可。根据本发明的具体示例，第二核酸序列具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，发明人惊奇地发现，当采用该核苷酸序列时，sgcE10基因在微生物细胞尤其是在大肠杆菌细胞中的表达效率可以得到显著地提高，进而可以进一步提高生产烃类化合物的效率。
根据本发明的一个实施例，在该微生物中，可以进一步包含第三核酸序列。该第三核酸序列编码乙酰辅酶A羧化酶基因或其功能等同体。根据具体的示例，所采用的乙酰辅酶A羧化酶基因为选自accA、accB、accC和accD的至少一种。由此，可以显著提高利用该微生物生产烃类化合物的生产效率。
根据本发明的一个实施例，在该微生物中，还可以进一步包括第四核酸序列。该第四核酸序列编码烯醇还原酶基因mupE、fabI或其功能等同体。通过在该微生物的细胞中过表达烯醇还原酶基因mupE、fabI或其功能等同体，可以在微生物细胞内就能够完成对所合成烃类化合物的氢化过程，由此，可以直接获得饱和度较高的烃类化合物，更适于作为生物燃料，从而可以显著提高生物燃料的制备效果。根据本发明的实施例，优选过表达FabI或其功能等同体，发明人惊奇地发现，FabI在微生物细胞内能够实现更好的兼容性，从而与MupE相比能够具有更高的烃类化合物生产效率。
根据本发明的实施例，第四核酸序列不受特别限制，只要其能够编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列(即NCBI登录号：AAM12917.1所描述的MupE蛋白序列)即可。根据本发明的具体示例，第四核酸序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，发明人惊奇地发现，当采用该核苷酸序列时，mupE基因在微生物细胞尤其是在大肠杆菌细胞中的表达效率可以得到显著地提高，进而可以进一步提高生产烃类化合物的效率。
在本发明中，所使用的术语“微生物”可以为真核微生物，也可以为原核微生物。其类型并不受特别限制。例如，根据本发明的实施例，可以采用的微生物包括但不限於细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母。可以为上述微生物的至少一种。根据本发明的实施例，优选采用大肠杆菌作为生产生物燃料的微生物。
适于转化微生物的系统、制备重组微生物的方法
根据本发明的实施例，可以通过常规的分子生物学方法获得上述微生物。由此，本发明还提出了一种适于转化微生物的系统。利用该系统可以通过常规的方法，将目的基因引入微生物细胞中，从而得到前面所述的适于制备烃类化合物的微生物。根据本发明的实施例，该系统包括第一核酸序列，该第一核酸序列编码聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体。由此，可以通过常规的分子生物学手段，将第一核酸序列引入到微生物中，从而可以在微生物细胞中过表达聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体。进一步可以通过在微生物细胞内过表达聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体，从而发挥聚酮合酶的生物活性，进而聚酮合酶可以与宿主微生物体内的固有基因相互作用，从可再生碳源产生烃类化合物。
另外，为了在微生物细胞中引入其他的核酸序列，从而为所得到的重组微生物赋予额外的生物学功能。根据本发明的实施例，在该适于转化微生物的系统中，还可以具有其他的核酸序列。根据本发明的实施例，在该适于转化微生物的系统中进一步包括第二核酸序列，该第二核酸序列编码硫酯酶基因sgcE10或其功能等同体。从而可以借助该适于转化微生物的系统，在微生物中引入硫酯酶基因sgcE10或其功能等同体。由此，通过硫酯酶基因sgcE10的生物学功能，可以便于所合成的烃类化合物成为游离状态，从而便于最终分离回收烃类化合物，从而可以显著地提高，将这些微生物应用于制备烃类化合物时的生产效率。根据本发明的一个实施例，在该适于转化微生物的系统中，可以进一步包含第三核酸序列。该第三核酸序列编码乙酰辅酶A羧化酶基因或其功能等同体。根据具体的示例，所采用的乙酰辅酶A羧化酶基因为选自accA、accB、accC和accD的至少一种。由此，可以通过借助该适于转化微生物的系统，在微生物细胞中引入乙酰辅酶A羧化酶基因或其功能等同体，从而借助乙酰辅酶A羧化酶基因的生物学功能，可以显著提高利用该微生物生产烃类化合物的生产效率。根据本发明的一个实施例，在该适于转化微生物的系统中，还可以进一步包括第四核酸序列。该第四核酸序列编码烯醇还原酶基因mupE、fabI或其功能等同体。借助该适于转化微生物的系统，能够有效地将适于转化微生物的系统引入到微生物细胞中。通过在该微生物的细胞中过表达烯醇还原酶基因mupE、fabI或其功能等同体，可以在微生物细胞内就能够完成对所合成烃类化合物的氢化过程，由此，可以直接获得饱和度较高的烃类化合物，更适于作为生物燃料，从而可以显著提高生物燃料的制备效果。根据本发明的实施例，优选过表达FabI或其功能等同体，发明人惊奇地发现，FabI在微生物细胞内能够实现更好的兼容性，从而与MupE相比能够具有更高的烃类化合物生产效率。
借助上述适于转化微生物的系统，转化微生物的方法，并不受特别限制，可以为诸如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、接合作用、转导等等，可以将异源DNA序列(即前面所述的第一、第二、第三和第四核酸序列)稳定地或者瞬时引入宿主细胞，所述异源DNA序列参与产生生物燃料或其中间物。根据本发明的实施例，对于稳定转化，异源DNA序列还包括选择性标志物，诸如，抗生素抗性，例如新霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素的抗性，弥补营养缺陷型的基因等等。由此，根据本发明的实施例，本发明还提供了一种获得重组微生物的方法，该方法包括使用前面适于转化微生物的系统转化微生物，以便获得所述重组微生物。由此，根据本发明实施例，所得到的重组微生物中可以包含异源核酸序列，例如第一、第二、第三和第四核酸序列。关于这些核酸序列，前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。
根据本发明的实施例，将上述异源DNA序列(即前面所述的第一、第二、第三和第四核酸序列)引入宿主细胞的顺序并不受特别限制。既可以是同时引入到微生物细胞中，也可以是依次引入到微生物细胞中。根据本发明的实施例，可以将各个异源DNA序列设置在不同的载体上，例如各个核酸序列包含在不同的载体上。这些载体可以是本领域中任何已知的表达载体。合适的表达载体包括，但不限于，病毒载体，诸如杆状病毒载体，噬菌体载体，诸如噬菌体载体，质粒，噬菌体，粘粒，fosmids，细菌人工染色体，病毒载体(例如，基于以下病毒的病毒载体：牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒，等等)，基于P1的人工染色体，酵母质粒，酵母人工染色体，和任意对目的特定宿主具有特异性的其他载体(诸如大肠杆菌、Pseudomonas pisum和酿酒酵母)。根据本发明的实施例，表达载体上可以进一步包括一种或者多种选择性标志基因，以提供用于选择转化宿主细胞的表型性状。所述选择性标志基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞存活或者生长必需的蛋白。没有转化包含选择性标志基因的载体的宿主细胞将不会在培养基中存活。通常的选择基因编码以下蛋白：(a)提供对抗生素或者其他毒素的抗性，例如，氨苄青霉素，新霉素，甲氨喋呤或者四环素，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或者(c)提供复合培养基没有的重要营养物，例如，编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。在可选的实施方式中，选择性标志基因是提供氨苄青霉素或者卡那霉素抗性(用于原核宿主细胞，诸如大肠杆菌)的基因。
根据本发明的实施例，该适于转化微生物的系统可以进一步包括表达调控序列(启动子，增强子，等等)，以指导所编码基因产物的合成，优选启动子，更优选IPTG-诱导型启动子。所述第一、第二、第三或第四核酸序列的至少之一被设置在所述IPTG-诱导型启动子的控制之下。由此，可以通过在IPTG-诱导型启动子的控制下，由此容易通过启动子的调控，表达目的蛋白，从而实现烃类化合物的合成。根据本发明的实施例，可以用于本发明的启动子可以来源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。根据使用的宿主/载体系统，表达载体可以使用大量合适的转录和翻译控制元件中的任意一种，包括组成型和诱导型启动子，转录增强子元件，转录终止子，等等(参见例如，Bitter et al.，Methods inEnzymology，153：156-544，1987，通过参照并入本文)。
根据本发明的实施例，用于原核宿主细胞的合适启动子包括，但不限于，能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，噬菌体λ的PR和PL启动子，大肠杆菌的trp、recA、热休克和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶和∑特异性启动子，杆菌噬菌体启动子，链霉菌启动子，噬菌体λ的int启动子，pBR322 β-内酰胺酶基因的bla启动子，和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子的综述可参见Glick，J.Ind.Microbiol.1：277，1987；Watson et al.，Benjamin Cummins(1987)；和Sambrook et al.，上文，通过参照并入本文。
根据本发明的实施例，用于真核宿主内使用的合适真核启动子的非限制性实例来源于病毒，包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子；疱疹病毒的TK启动子；SV40早期启动子；Rous肉瘤病毒启动子；巨细胞病毒启动子；酵母gal4基因启动子；和IgG启动子。
根据本发明的实施例，合适的诱导型启动子包括不限于，受体蛋白、代谢物或者化学制品影响的启动子。这些包括：牛白血病病毒启动子，金属硫蛋白启动子，地塞米松诱导型MMTV启动子，SV40启动子，MRP pol III启动子，四环素诱导型CMV启动子以及那些来自trp和lac操纵子的启动子。
根据本发明的一些实施例，前述的核酸序列可以被连接到组成型启动子上。因而利用该系统转化微生物所得到的重组微生物能够持续地表达外源基因，从而代谢合成烃类化合物。
根据本发明的实施例，上述适于转化微生物的系统，可以转化的微生物的类型并不受特别限制。可以为真核微生物，也可以为原核微生物。其类型并不受特别限制。例如，根据本发明的实施例，可以采用的微生物包括但不限於细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母。可以为上述微生物的至少一种。根据本发明的实施例，优选用于转化大肠杆菌，以便用于生产生物燃料。
烃类化合物及其生产方法和系统
根据本发明的实施例，本发明还提出了一种生产烃类化合物的方法。该方法包括包括下列步骤：培养微生物，以便生产所述烃类化合物；以及分离所述烃类化合物，其中，所述微生物包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列编码聚酮合酶基因sgcE或其功能等同体。通过在合适的条件下对根据本发明实施例的微生物进行培养，在微生物细胞中表达聚酮合酶sgcE或其功能等同体的作用下，微生物细胞通过对底物的代谢，可以合成烃类化合物。本领域技术人员可以通过对微生物以及所采用的外源核酸的载体进行分析，能够获得最适合的培养条件。
另外，根据本发明的实施例，微生物中还可以包含额外的核酸序列，例如第一、第二、第三和第四核酸序列。关于这些核酸序列，前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。
根据本发明的实施例，可以通过在培养微生物的过程中，提高生物合成途径中间物的细胞内浓度(例如，遗传修饰的宿主细胞的中间物浓度)以进一步提高终产物的产量。有许多方式可以增加中间物的胞内浓度，包括不限于，增加培养基中生物合成途径底物的浓度；增强在生物合成途径中起作用的酶的催化活性；增加底物(例如，初始底物)的细胞内浓度，所述底物是在生物合成途径中起作用的酶的底物；等等。
通过本发明生产烃类化合物的方法，可以有效地获得具有化学式CxHy的烃类化合物，其中x＝4-40的任意整数，y＝6-82的任意整数。根据具体的示例，可以有效地获得十五烯烃。根据本发明的实施例，通过在微生物中引入第四核酸序列，即所述第四核酸序列编码烯醇还原酶基因mupE、FabI或其功能等同体。可以有效地在微生物细胞中实现对烯烃的还原，获得烷烃化合物，例如十五烷烃。根据本发明的实施例，优选过表达FabI或其功能等同体，发明人惊奇地发现，FabI在微生物细胞内能够实现更好的兼容性，从而与MupE相比能够具有更高的烃类化合物生产效率。
另外，根据本发明的实施例，对于微生物所生产的烯烃，例如十五烯烃。可以通过氢化反应的化学处理方法，实现将其还原为烷烃。根据具体的实例，可以采用10％Pd/C作为催化剂，完成该氢化反应。
因此，根据本发明的实施例，可以有效地获得生物燃料，或者其中间体。因此可以在产生有用生物燃料或其中间体的发酵过程中使用经过修饰的微生物，并且可以利用可再生碳源(生物质)作为起始原料。
根据本发明的实施例，所采用的微生物的类型不受特别限制。可以为真核微生物，也可以为原核微生物。例如，根据本发明的实施例，可以采用的微生物包括但不限於细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母。可以为上述微生物的至少一种。根据本发明的实施例，优选采用大肠杆菌，以便用于生产生物燃料。这是因为对于大肠杆菌或酵母而言，易于遗传修饰，易于控制生长、产生以及减少或者消除降低生物合成途径效率的副反应。此外，这种修饰的微生物可以直接利用可再生能源以生产可直接用做生物燃料的燃料，不需要专门的储存或运输方法。
通过使用特定的发酵技术可以增强生物燃料或者其中间体的生产和分离。例如，将产生最大化并降低成本的方法是增加碳源百分比，所述碳源被转变为烃类产物。在正常的细胞生命周期中，碳被用于细胞功能包括产生脂、糖、蛋白、有机酸和核酸。降低生长相关活性必需的碳的量可以增加碳源转变为输出物的功效。这可以通过首先增殖微生物到所需密度来实现，诸如在对数生长期的顶峰实现的密度。在这个时间点，复制检查点基因可用于终止细胞生长。输入的碳数转变为烃类产物的百分比是成本动因。效率越高(即百分比更高)，则方法越低廉。对于含氧碳源(即基于葡萄糖和其他糖的来源)，氧必须以二氧化碳的形式释放。每释放2个氧原子，还释放一个碳原子，导致约34％(w/w)的最大理论代谢效率。但是对于其他烃类产物和碳源来说，该数字是变化的。文献中通常的效率是约小于5％。生成烃类产物的工程化微生物可以具有大于1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％和30％的效率。
可以从发酵培养基中分离发酵期间生成的生物燃料或其中间体。可以使用任何已知的从水介质分离烃类化合物的技术。本文提供一个示例性分离法是两相(双相)分离法。该方法涉及在足以产生生物燃料或者其中间体的条件下发酵遗传工程化的制备宿主，允许在有机相中收集生物燃料或者其中间体并从水性发酵肉汤分离有机相。
双相分离利用生物燃料或者其中间体的相对不混溶性促进分离。不混溶是指化合物相对不能溶于水，由化合物的分配系数定义。分配系数P被定义为化合物在有机相(在双相系统中，有机相通常是生成过程中由生物燃料或者其中间体形成的相，但是，在一些实例中可以提供有机相(诸如乙酸乙酯以促进产物分离))中的平衡浓度除以水相(即发酵肉汤)中处于平衡状态的浓度。当描述两相系统时，通常采用logP来描述P。logP为10的化合物将为有机相分配10∶1，而logP为0.1的化合物将为水相分配10∶1.本领域普通技术人员将理解，通过选择发酵肉汤和有机相使生成的烃类化合物具有高logP值，即使发酵容器中浓度非常低，烃类化合物也将进入有机相。
通过本文所述方法产生的烃类化合物在发酵肉汤以及细胞质中是相对不混溶的。因此，烃类化合物会在胞内或者胞外于有机相中聚集。产物在有机相中的聚集将削弱烃类化合物对细胞功能的影响，这将允许制备宿主产生更多的产物。换言之，烃类化合物的浓度不会对宿主细胞有显著的影响。
根据本发明的实施例，本发明还提供了一种烃类化合物，其实通过前述的制备烃类化合物的方法所得到。根据具体的实施例，该烃类化合物，可以用作生物燃料。根据本发明实施例的烃类化合物可以用作生物燃料或者其中间物，即为烷烃或者烯烃。为烷烃者可以直接用作燃料，而为烯烃者则可以通过加氢还原或者酶催化法得到烷烃再用于燃料。本领域普通技术人员将理解，根据燃料的预定目的，可以制备和使用不同的烃类化合物。例如，对于预期在寒冷气候中使用的汽车燃料，可能希望支化烷烃，因此利用本文提供的教导，可以制备支化烃。利用本文描述的方法，可以制备包括产物单一的烷烃类燃料，其具有需要的燃料质量。与石油衍生的燃料或者源自甘油三酯的生物柴油相比，它们不含杂质，此外，基于烷烃类燃料可以与其他燃料或者燃料添加剂组合以产生具有所需性质的燃料。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种制备生物燃料的系统，其包括生物反应器和氢化装置。根据本发明的实施例，生物反应器中设置有根据本发明的微生物，这些微生物用于在生物反应器中产生烃类化合物。根据本发明的实施例，氢化装置与生物反应器相连，可以从生物反应器中接受烃类化合物，从而实现对烃类化合物的氢化。如前所述，可以通过化学处理地方法实现对烃类化合物的氢化，例如可以在氢化装置中设置有10％Pd/C，以便催化所述氢化反应。为此，根据本发明的一个实施例，氢化装置可以为耐高温高压的反应容器，由此，可以实现有效地将烃类化合物进行氢化处理。
关于在该系统中所采用的微生物，前面已经进行了详细描述，此处不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
构建下列质粒用于在BL21(DE3)宿主细胞中引入外源核酸序列。所有被克隆的基因均在IPTG-诱导型启动子(T7，tac或者lac启动子)的控制下。
在本实施例中引入了聚酮合酶基因sgcE(SEQ ID NO：1)。聚酮合酶基因sgcE表达蛋白聚酮合酶SgcE(SEQ ID NO：5)。外源的聚酮合酶与烯醇-ACP-还原酶基因fabI(SEQ IDNO：2)表达得到的烯醇-ACP-还原酶FabI(SEQ ID NO：6)相互作用可以合成十五烷。
按照标准分子生物学方法，进行基因的克隆和载体的构建，简言之，包括下列步骤：
将sgcE基因克隆于pET28a上。质粒质粒pWK1(图1)是sgcE基因通过BamH I和HindIII克隆于pET28a载体而得到的。将构建得到的质粒pWK1转化到含质粒pMSD8的大肠杆菌BL21(DE3)中，得到大肠杆菌菌株WK1。
实施例2，生产作为生物燃料的烃类化合物
在37摄氏度过夜培养的大肠杆菌WK1种液，按体积比1∶100的比例稀释到200ml的LB培养基中；在37摄氏度培养3小时后，在大肠杆菌WK1的OD600为0.4-0.6时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.1mM；在加入IPTG诱导15-20小时后，用乙酸乙酯萃取菌液，有机相回收后旋转蒸发溶剂干燥至1-2ml。样品经0.22μm滤膜过滤后，用GC-MS检测。
实验结果：在大肠杆菌WK1菌体沉淀中可以明显的检测到生物柴油正十五烷C15H32(图6)。说明通过在大肠杆菌中引入sgcE，能够有效地得到烷烃化合物。
实施例3
在本实施例中引入了聚酮合酶基因sgcE(SEQ ID NO：1)和硫酯酶基因sgcE10(SEQ IDNO：3)。聚酮合酶基因sgcE和硫酯酶基因sgcE10分别表达蛋白为聚酮合酶SgcE(SEQ IDNO：5)和硫酯酶SgcE10(SEQ ID NO：7)。
按照标准分子生物学方法，进行基因的克隆和载体的构建，简言之，包括下列步骤：
将sgcE10基因克隆于pET28a上。质粒pWK2(图2)是sgcE10基因通过Nde I和XhoI克隆于pET28a载体而得到的。sgcE和sgcE10基因串联克隆于pET28a载体上。以SpeI和Xho I酶切质粒pWK2，回收线性DNA片段；以Xba I和Xho I酶切质粒pWK1后，回收sgcE基因片段；将sgcE基因片段和pWK2载体片段相连接，转化入大肠杆菌，通过卡那霉素抗性筛选和酶切验证鉴定sgcE片段正确插入的克隆，即得到质粒pWK4(图4)。
将构建得到的质粒pWK4转化到含质粒pMSD8的大肠杆菌BL21(DE3)中，就得到大肠杆菌菌株WK2。
实施例4 生产作为生物燃料中间体的烃类化合物
在37摄氏度过夜培养的大肠杆菌WK2种液，按体积比1∶100的比例稀释到200ml的LB培养基；在37摄氏度培养3小时后，大肠杆菌WK2的OD600为0.4-0.6时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.1mM；在加入IPTG诱导15-20小时后，用乙酸乙酯萃取菌液，有机相回收后旋转蒸发溶剂干燥至1-2ml。样品经0.22μm滤膜过滤后，用LC-APCI-MS检测。
实验结果：在大肠杆菌WK2菌体沉淀中可以明显的检测到生物柴油前体十五烯C15H18(图7)和少量的C15H32(图8)。结果显示通过基因工程改造的大肠杆菌WK2能用于生产生物柴油前体十五烯C15H18。
将得到的烯烃进行加氢还原可以得到C15H32。简言之：将得到的烯烃沉淀收集在能耐高温高压的500ml圆底烧瓶中，加入10％ Pd/C。将反应容器密封，排除空气，5分钟后通入氢气，使压力在25摄氏度下上升到35psi，边反应边搅拌反应物直到不能在观察到液滴，反应大约需要16个小时来完成。
实施例5
在本实施例中引入了聚酮合酶基因sgcE(SEQ ID NO：1)、硫酯酶基因sgcE10(SEQ IDNO：3)和烯醇还原酶基因mupE(SEQ ID NO：4)。聚酮合酶基因sgcE、硫酯酶基因sgcE10和烯醇还原酶基因mupE分别表达蛋白为聚酮合酶SgcE(SEQ ID NO：5)、硫酯酶SgcE10(SEQID NO：7)和烯醇还原酶MupE(SEQ ID NO：8)。
按照标准分子生物学方法，进行基因的克隆和载体的构建，简言之，包括下列步骤：
A)将mupE基因克隆于pET28a上
pWK3(图3)mupE基因通过Nde I和Xho I克隆于pET28a载体而得到的。
B)sgcE、sgcE10和mupE基因串联克隆与pET28a载体上
按照上面B)中同样的方法，以Spe I和Xho I酶切质粒pWK3，回收线性DNA片段；以Xba I和Xho I酶切质粒pWK4后，回收sgcE10+sgcE基因片段；将sgcE10+sgcE基因片段和pWK3载体片段相连接，转化入大肠杆菌，通过卡那霉素抗性筛选和酶切验证鉴定sgcE10+sgcE片段正确插入的克隆，即得到质粒pWK7(图5)。
将构建得到的质粒pWK7转化到含质粒pMSD8的大肠杆菌BL21(DE3)中，就得到大肠杆菌菌株WK3。
实施例6
在37摄氏度过夜培养的大肠杆菌WK3种液，按体积比1∶100的比例稀释到200ml的LB培养基；在37摄氏度培养3小时后，大肠杆菌WK3的OD600为0.4-0.6时加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.1mM；在加入IPTG诱导15-20小时后，用乙酸乙酯萃取菌液，有机相回收后旋转蒸发溶剂干燥至1-2ml。样品经0.22μm滤膜过滤后，用LC-APCI-MS和GC-MS检测。
实验结果：在大肠杆菌WK3菌体沉淀中可以明显的检测到生物柴油前体十五烯C15H18、C15H20(图9)、C15H24(图10)和十五烷C15H32。
将得到的烯烃进行加氢还原得到C15H32。将得到的烯烃沉淀收集在一个能耐高温高压的500ml圆底烧瓶中，加入10％ Pd/C。将反应容器密封，排除空气，5分钟后通入氢气，使压力在25℃上升到35psi，边反应边搅拌反应物直到不能在观察到液滴，反应大约需要16个小时来完成。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包括于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种生产烃类化合物的方法，其特征在于，包括下列步骤：
培养微生物，以便生产所述烃类化合物；以及
分离所述烃类化合物，所述烃类化合物为十五烯烃和/或十五烷烃，
其中，所述微生物包括：
第一核酸序列，所述第一核酸序列编码聚酮合酶基因sgcE，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
第二核酸序列，所述第二核酸序列编码硫酯酶基因sgcE10，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；以及
第四核酸序列，所述第四核酸序列编码烯醇还原酶基因mupE，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，
所述微生物为大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括对所述烯烃化合物进行氢化的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氢化反应是在10%Pd/C的作用下进行的。
CN201210001015.0A 2012-01-04 2012-01-04 一种制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法 Active CN103194418B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210001015.0A CN103194418B (zh) 2012-01-04 2012-01-04 一种制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法
PCT/CN2013/070036 WO2013102436A1 (zh) 2012-01-04 2013-01-04 制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210001015.0A CN103194418B (zh) 2012-01-04 2012-01-04 一种制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103194418A CN103194418A (zh) 2013-07-10
CN103194418B true CN103194418B (zh) 2014-09-03

Family

ID=48717237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210001015.0A Active CN103194418B (zh) 2012-01-04 2012-01-04 一种制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN103194418B (zh)
WO (1) WO2013102436A1 (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7105491B2 (en) * 1999-01-06 2006-09-12 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Biosynthesis of enediyne compounds by manipulation of C-1027 gene pathway
BR122020013701B1 (pt) * 2008-05-16 2021-06-01 Genomatica, Inc Microorganismo geneticamente modificado para produção de um hidrocarboneto, método de produção de um alcano ou alceno e cultura de células

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013102436A1 (zh) 2013-07-11
CN103194418A (zh) 2013-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200172853A1 (en) Gas-fed fermentation reactors, systems and processes
US20100196982A1 (en) Methods for The Direct Conversion of Carbon Dioxide Into a Hydrocarbon Using a Metabolically Engineered Photosynthetic Microorganism
CN110382681A (zh) 利用垂直流动区的进气发酵反应器、系统和方法
CN102144030A (zh) 啶南平a生物合成基因
CN103571892B (zh) 二氢查耳酮的生物技术生产方法
CN102245779A (zh) 大宗化学品的生物合成
CN101384719A (zh) 用于生成萜的方法和用于该方法的mep转化后的微生物
CN105916976A (zh) 碳水化合物富集的重组微生物
CN113564193B (zh) 一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用
CN105112436A (zh) 一种己二酸的全生物合成方法
CN106754607A (zh) 一种产酪醇的重组菌株及其构建方法
CN107548418A (zh) 分离和纯化降龙涎醚的方法
CN104164397B (zh) 重组微生物及其用途
CN116970659B (zh) 一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法
CN104673814B (zh) 一种来自于阴沟肠杆菌的l‑苏氨酸醛缩酶及其应用
CN105754899A (zh) 一种n-脱氧核糖转移酶、编码基因及其高产菌株和应用
CN103194419B (zh) 微生物及其用途
CN103194418B (zh) 一种制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法
CN116875524A (zh) 一种在微生物中调控多基因表达的方法及其应用
CN107119065B (zh) 一种用于生产哌啶甲酸的重组质粒、基因工程菌株及方法
CN109055417A (zh) 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用
CN107849586A (zh) 芳香化合物的生产
CN109929853A (zh) 嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用
CN106148336A (zh) 新型的l-苏氨酸-诱导型启动子及其应用
CN103865946B (zh) 基于代谢调控高产土霉素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220714

Address after: 430075 room d102, building B5, building b4-b8, Wuhan National Biological Industry (Jiufeng innovation) base, No. 666, Gaoxin Avenue, East Lake New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei

Patentee after: Wuhan Hesheng Technology Co.,Ltd.

Address before: 430000 building B5, R & D building, Wuhan Institute of biotechnology, No. 666, Gaoxin Avenue, East Lake Development Zone, Wuhan, Hubei Province

Patentee before: WUHAN J1 BIOTECH Co.,Ltd.