CN101384719A - 用于生成萜的方法和用于该方法的mep转化后的微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于生成萜的方法和用于该方法的MEP转化后的微生物。公开了一种能够生成选择的萜的微生物，所述微生物表达外源途径，该途径用于类萜单元并且优选外源萜合酶的形成。用这种方法，可从微生物的培养基中分离出高含量的萜。

Description

用于生成萜的方法和用于该方法的MEP转化后的微生物
技术领域
本发明涉及具有产生焦磷酸异戊烯酯和/或焦磷酸二甲基烯丙酯的外源途径的微生物，并且涉及在细胞和/或培养基中积聚类萜的方法。
背景技术
类异戊二烯(也称为类萜或萜)是一大类、多样的具有可观经济效益的复杂天然产物。如今，大多从植物中提取或化学合成类异戊二烯作为药物(例如红豆杉醇、红没药醇、番茄烯、青蒿素)、动物饲料添加剂和食品着色剂(各种类葫萝卜素)或调味料和香料(例如薄荷醇、广藿香醇、香柏酮)。类异戊二烯是由异戊二烯单元(2-甲基-1，3-丁二烯)构成，并且所有天然的类异戊二烯的生物前体都是焦磷酸异戊烯酯(IPP)。类异戊二烯在活体细胞(在此仅涉及几种例如在激素调节(固醇)、光合作用(类胡萝卜素和其它))中起重要的作用。
在活体细胞中，通过两条不同的途径，即依赖甲羟戊酸(下文称MEV)途径或不依赖甲羟戊酸途径或MEP途径都能够产生IPP。大多数生物体依赖专有的产生类异戊二烯化合物的途径，但是植物和一些微生物同时具有两条途径。通过MEV途径合成IPP的前体为在中心碳代谢中合成的乙酰辅酶A。通过MEP途径合成IPP的前体为在中心碳代谢中合成的糖酵中间体甘油醛-3-磷酸酯(GAP)和丙酮酸酯(PYR)。依赖甲羟戊酸途径和MEP途径都产生了焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)和IPP，并且在IPP之后生成焦磷酸香叶酯(GPP)、焦磷酸法呢酯(FPP)和焦磷酸香叶基香叶酯(GGPP)的反应步骤不管使用依赖甲羟戊酸途径、MEP途径或两者在细胞中都是相同的。就是从这些中间体生成了各种天然的类异戊二烯化合物。
通过传统的化学方法产生有机分子的化学工业愈加倾向于应用微生物细胞工厂的生产方法。朝向绿色化学驱使这种发展的主要推动力为：这种所谓的“生物技术方法”更加有利于环境，由微生物产生的许多化合物太复杂很难通过有机合成来获得以及微生物细胞工厂代表着特定化合物的无限供给。目前，类异戊二烯是通过从植物中提取或化学合成来大规模地生产。两种方法的主要缺点为产率较低以及成本高。第三种选择为通过体外酶转化来生产期望的类异戊二烯，但是该方法受限于可用的前体并且因此大多数情况下在经济上不可行。
用于产生类异戊二烯的微生物的代谢工程可以由廉价的碳源用发酵方法导致大量的类异戊二烯的产生，并且由此解决了许多工业类异戊二烯生产中目前存在的问题(Maury等，2005，Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.100：19)，同时使得发现于天然化合物的类异戊二烯族中的巨大多样性的生物技术开发成为可能。
由基因工程微生物已经产生了大量的类异戊二烯产物，包括柠檬烯(Carter等，2003，Phytochem.64:425)、类胡萝卜素(Kajiwara等，1997，Biochem.J.324：421)、表雪松醇(Jackson等，2003，Org.lett5：1629)、紫杉二烯(Huang等，2001，Biorg.Med.Chem9：2237)和其它。为了增强大肠杆菌(E.coli)中类异戊二烯的生成，已经将dxs基因(编码DXP合酶)、dxr基因(DXP还原异构酶)和idi基因(IPP异构酶)过量表达并获得了上述几种类异戊二烯产物的很好的结果(回顾于Maury等，2005)。已经由大肠杆菌通过表达大肠杆菌青蒿酸生成链中来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的依赖甲羟戊酸途径获得了青蒿酸(amorphadiene)生成的额外增加(Martin等，2003，Nat.Biotechnol.21：796)。同样在酵母中已经产生了一些类异戊二烯化合物，其包括酿酒酵母中的表雪松醇(Jackson等，2003，Org.Lett.5：1629)、酿酒酵母中的番茄烯和β-胡萝卜素(Yamano等，1994，Biosci.Biotechnol.Biochem.58：1112)和产朊假丝酵母(Candida utilis)(Miura等，1998，Appl.Environ.Microbiol.64：1226)。在一些情况中，通过过量表达HMG1(编码HMG-CoA还原酶)在酵母中已显示出类异戊二烯生成的增强(回顾于Maury等，2005)。
尽管有上述的背景，仍然需要生成萜和类萜的另外的方法，特别是相对于现有已知的方法以较高产率和较低成本和时间密集的方式在微生物中积聚萜的方法。由此本发明的目的是提供一种生成满足这种需要的萜和类萜的方法。
本发明的另一目的是解决生物体中足够量的萜前体的供给从而增强生物体中萜的积聚的问题。
本发明的特别的目的在于生产一种微生物，所述微生物能够向周围环境积聚和/或分泌大量的萜。这种微生物的萜的生成优选随时间推移而稳定进行。
本发明的又一目的在于提供用于产生萜的生物平台，其能够生成任何制造者选择的萜。这种单一的系统大体上能够在一段时间内生成一种特定的萜，但是能够将其容易地改变来生成另一种萜或萜的混合物。当然也可以使用相同的系统来独立地生成不同的萜。此外，该平台能够允许对于调味料和香料业有用的萜衍生化合物的生成。作为本发明的非限定性的特殊实例为来自朱栾倍半萜的香柏酮的生成。
此外，用于本发明萜的生物生成平台优选具有高的生成能力并且不含内毒素以及所有与其相关的问题。
本发明的又一目的是提供能高度积聚高水平的亲脂化合物的生物生成平台，甚至是在通常不溶解该化合物或它们的前体的含水培养基中时。
发明内容
引人注目的是本发明人成功地并且稳定地转化了具有外源MEP途径的微生物。该微生物在其天然状态不具有生成萜的MEP途径并且被设计成获得这样的途径。在合适的培养基上微生物的培养过程中该微生物显示出对所选萜化合物的高生成。令人惊奇的是所述转化微生物相对于转化前生成所述萜的能力能够生成增加量的任何所选萜。
因此，第一方面，本发明提供了一种真核微生物，其具有将5-磷酸1-脱氧-D-木酮糖酯(DXP)转化为焦磷酸异戊烯酯(IPP)和/或焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)的外源MEP途径。
术语“外源代谢途径”在此定义为一种能够引入到野生型微生物中生成重组微生物的代谢途径，一种不存在于野生型微生物的天然基因组中的代谢，即对于天然的微生物来说所述代谢不是“天然的”。
本发明优选的微生物是真菌，更具体地为酵母属的酵母。
现有技术对于本发明所要求的微生物的转化没有记载。存在于自然界的真菌和酵母缺乏生成萜的MEP途径。它们通过依赖甲羟戊酸途径来生成萜，该途径不用5-磷酸1-脱氧-D-木酮糖酯(DXP)作为IPP和/或DMAPP的前体。
K.Reiling等在WO 2005/033287 A1中已经描述了在细菌中引入依赖甲羟戊酸途径，该细菌可以天然具有或不具有该途径。这些作者同样暗示了修改酵母细胞以在其中整合DXP途径酶的一般可能性。然而，该文献没有给出关于可获得这样的转化的方式并且因此未提供对于获得本发明有用的任何教示。实际上，没有获得所述转化方式具体教示时，是不可能预测到这样尝试的结果的。MEP途径包括了大量的酶，每一种都特异对应于仅一种特定底物，并且以稳定的方式一起引入所有的酶以提供能够产生增加量的IPP和/或DMAPP从而产生增加量的期望萜的重组微生物是很难实现的。在此本发明人提供一种对于该问题令人惊讶的解决方案。
在WO 00/01649 A1中，J.Millis等建议可能在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中引入大肠杆菌MEP途径的两种酶，dxs基因和dxr基因。再一次，可实现该步骤的方式没有进行详细的描述并且对于结果甚至有这样令人不安的论述：对于由这样的转化可能获得的MEP前体仍然可在之后进一步被工程化后的微生物通过内源酶代谢掉。公知酿酒酵母不具有这样的内源酶，并且没有对于该效果的具体引导，很明显是作者的主观臆断。然而很清楚的是没有人实现这样的转化并且并不清楚以怎样的暗示出的方式来实现是可能的。
其它的现有技术，以WO 02/18617 A2和WO 02/083720 A2为代表的文献为例，虽然教示了怎样转化含有用于产生萜的天然的MEP途径的微生物，但却集中在天然MEP途径的扩增或转化上，为了增加萜或类胡萝卜素的生成，通过使所含的一些酶过量表达或通过其它方法使扩增天然途径成为可能。
因此就我们所知，现有技术中从未教示过如本发明要求的转化的真核微生物。
本发明还提供了一种在微生物的细胞和/或培养基中积聚类萜的方法，该方法包含工程化微生物使其包含产生IPP和/或DMAPP的外源途径的步骤。
再一方面，本发明提供了生成类萜的方法，该方法包含在有益于所述类萜生成的培养基中培养本发明的微生物，并且将类萜从培养基和/或微生物中分离的步骤。
本发明还提供了制备能够积聚和/或生成萜的微生物的方法，该方法包含用外源MEP途径的基因和至少一种编码萜合酶的基因转化天然缺乏生成萜的MEP途径的微生物的步骤。
又一方面，本发明提供了一种增加微生物中类萜前体的量的方法，该方法包含用外源MEP途径的基因转化天然缺乏生成萜的MEP途径的微生物的步骤。
本发明还涉及一种质粒。因此，本发明提供了一种含有至少三种MEP途径基因的质粒。本发明还提供了一种含有至少三种MEP途径基因和萜合酶的质粒。根据本发明的优选实施方式，本发明提供了一种含有四种MEP途径酶的质粒。在本发明另一具体的方面，有两种质粒：一种质粒含有四种MEP途径基因(即来自大肠杆菌)，并且另一种质粒含有三种MEP途径基因和萜合酶。
本发明还涉及使用这样的质粒转化缺乏天然MEP途径的真核微生物的方法。术语“天然”在此指的是存在于自然界发现的微生物中的MEP途径。
附图说明
图1示出了大肠杆菌的合成IPP和DMAPP的MEP途径。
1：3-磷酸D-甘油醛酯，2：丙酮酸酯，3：5-磷酸1-脱氧-D-木酮糖酯(DXP)，4：4-磷酸2-C-甲基-D-赤藓糖醇酯(MEP)，5：4-二磷酸胞苷酰基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇(CDP-ME)，6：2-磷-4-二磷酸胞苷酰基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇(CDP-ME2P)，7：2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环焦磷酸酯(cyclodiphosphate)(MECDP)，8：4-焦磷酸1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯酯(HMBPP)，9：焦磷酸异戊烯酯(IPP)，10：焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)。
不同基因编码的酶为：dxs：DXP合酶，dxr：DXP还原异构酶，ispD：MEP胞苷酰基转移酶，ispE：CDP-ME激酶，ispF：MECDP合酶，gcpE：MECDP还原酶，lytB：HMBPP还原酶，idi：IPP异构酶。
图2示出的是pIP001和pIP002两种质粒，每种质粒都含有四种萜途径的外源序列。特别地，pIP001含有大肠杆菌MEP途径的四种基因(dxs，dxr，ispD，ispE)，并且pIP002含有MEP途径的三种基因(ispF，gcpE，lytB)和萜合酶。
图3示出了通过在酿酒酵母中同源重组的MEP途径基因的目标整合。
不同的片段即片段A～L由PCR扩增。随后，在2次连续的融合PCR过程中将特定的片段融合在一起以最终获得片段A/B/C，D/E/F，G/H/I和J/K/L。片段A和F提供了染色体组整合串lytB/gcpE/ispF所需的同源区域而片段G和L提供了染色体组整合串dxs/dxr/ispD/ispE必需的同源区域。将片段A/B/C和D/E/F一起整合到酿酒酵母中获得目标插入串lytB/gcpE/ispF。由于体内同源重组，将片段G/H/I和J/K/L一起整合到酿酒酵母中以获得目标整合串dxs/dxr/ispD/ispE。
图4示出了MEP途径基因的表达的评价。
A：来自菌株YIP-DV-02的样本，B：来自菌株YIP-0V-02的样本。在此将肌动蛋白基因用作内标。
图5示出了抑甲羟酶素(lovastatin)对含有MEP途径和朱栾倍半萜合酶基因的酵母菌株(YIP-DV-02)生长的效果，并且仅具有朱栾倍半萜合酶基因的菌株(YIP-0V-01)作为对照。
图6示出了使用选择性标记Kl URA3使得ERG13缺失的策略。将两侧面连有直接重复序列的Kl URA3用在末端具有接头(Adaptamers)的引物从pWJ107在两个单独的片段(但是两者有重叠)中扩增。通过PCR使用酿酒酵母基因组作为模板从插入位点上游和下游大约500bp片段分别进行扩增。融合PCR允许四种PCR片段组合成为两种。后者被转化到酿酒酵母中并且由于体内的同源重组Kl URA3构造在ERG13位点上进行整合。
图7示出了产生酿酒酵母菌株的番茄烯的构建中使用的三种质粒，pIP033、pIP034和pIP035，每种质粒都含有来自于草生欧文氏菌(E.herbicola)的pCR4TOPO中的三种密码子优化的crt基因的一种。
图8示出了产生酿酒酵母菌株的番茄烯的构建中使用的四种质粒，pIP036(具有crtE的pESC-URA)、pIP037(具有crtI的pESC-HIS)、pIP038(具有crtI和crtB的pESC-HIS)和pIP039(具有crtE、crtB和crtI的pESC-URA)，每种质粒含有来自于草生欧文氏菌(E.herbicola)的pESC-URA或pESC-HIS载体中的三种密码子优化的crt基因的一种或多种。
具体实施方式
本发明涉及并且使用具有外源途径的真核微生物。
根据本发明的优选实施方式，微生物是真核微生物，更优选酵母。
合适微生物的非穷举列表包括：
一类属于酵母属例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)、巴氏酵母(S.pastorianus)、奇异酵母(S.paradoxus)、S.exiguous、S.servazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum)、S.kluyveri、S.castellii，一类属于克鲁维酵母属例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K marxianus var.marxianus)、K.thermotolorens、K.waltii、K.delphensis、K.nonfermentas、K.wickerhamii，一类属于假丝酵母属例如产朊假丝酵母(C.utilis)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、C.castellii、C.humilis，一类属于接合酵母属例如Z.rouxii、Z.bailii、Z.fermentati、Z.bisporus、Z.florentinus，一类属于毕赤酵母属例如P.stipidis、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、P.sorbithophila、P.anomala，或其它种类例如汗逊酵母(Hansenulapolymorpha)、耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)、Debaromyces hansenii、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、有孢圆酵母属(Torulasporadelbueckii)、棉阿舒囊霉属(Ashbya gossipie)、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、产黄青霉(Penecillium chrysogenum)、米根霉(Rhizopus oryzae)、毛霉(Mucor circenelloides)。
更优选地，所述微生物是酵母，甚至更优选地，所述微生物是酿酒酵母。例如2006年1月27日保藏于DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德国)的酿酒酵母菌株，保藏号：DSM 17900。
用于本发明目的的外源途径是这样的一种途径，其活性可以通过所定义的中间步骤并且由所定义的起始材料形成化合物，野生型微生物中不存在这样的途径。更优选地，所述外源途径为来源于不同物种的途径。
所述外源途径是MEP途径(4-磷酸2-C-甲基-D-赤藻糖醇酯途径)。在本发明的优选实施方式中该途径能够将5-磷酸1-脱氧-D-木酮糖酯(DXP)转变为焦磷酸异戊烯酯(IPP)和/或焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)。当然，该能力指的是体内条件，并且为途径启动所必需的任何辅助因素，矿物等都具备的条件。
根据本发明的优选实施方式，外源MEP途径能够将甘油醛-3-磷酸酯(GAP)和丙酮酸转变为焦磷酸异戊烯酯(IPP)和/或焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)。
根据本发明的优选实施方式，本发明的微生物含有编码选自5-磷酸1-脱氧-D-木酮糖酯(DXP)合酶，5-磷酸1-脱氧-D-木酮糖酯(DXP)还原异构酶，4-磷酸2-C-甲基-D-赤藻糖醇酯(MEP)胞苷酰基转移酶，4-二磷酸胞苷酰基-2-C-甲基-D-赤藻糖醇(CDP-ME)激酶，2-C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环焦磷酸酯(MECDP)合酶，2-C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环焦磷酸酯(MECDP)还原酶和4-焦磷酸1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯酯(HMBPP)还原酶的组中的至少一种功能性酶的外源基因。
为了方便和简单的目的，将术语“基因”(例如在表述“外源基因”中)用于代表含有编码具体蛋白的信息的任何核苷酸序列。因此术语“基因”也同样用于指代除了细菌之外的生物体(例如植物、动物)的DNA，其通常含有非编码部分例如内含子或者是非编码部分已经移除。该术语也同样用于指代例如cDNA。
优选地，所述微生物显示出在上述段落中列举的一种、一些或全部的酶的酶活性。更优选地，其显示出MEP途径的所有酶的活性。
对于本发明的目的而言，这些酶具有催化图1所述反应的能力。例如DXP合酶是一种具有催化3-磷酸D-甘油醛酯和丙酮酸形成DXP能力的酶。
对于本发明的目的而言术语“功能性的”指可以任何方式观察到和/或推断出酶的活性。例如，可以从与外源途径相比缺乏生成IPP的其它途径的微生物中存在IPP即可推断出外源MEP途径的功能。
术语“功能性的”还指在此所提及的外源基因实际上通过微生物来表达。
例如，所述微生物可以在其阻碍天然途径不能生成IPP的野生型的途径中具有缺失。在这种情况下，外源途径的功能可以从微生物生成的IPP并由此存活的能力推导出来。例如，如果微生物是酿酒酵母菌株，缺失可构造在MEV途径的必要基因中，例如ERG13基因。缺失盒可以如现有技术所公开的那样使用含有突出物的引物来产生，用于同源重组以删除必要MEV基因。通常可证明含有这种缺失的可成活的菌株依赖于外源途径。
然而，在优选实施方式中，微生物具有功能性的主要为野生型的MEV途径和功能性的主要为外源的MEP途径。MEV途径被定义为能够将乙酰辅酶A和乙酰基乙酰辅酶A转变为IPP和/或DMAPP的途径。
MEP途径的酶的实例和优选实施方案为那些具有以下EC号的酶：DXP合酶：EC 2.2.1.7；DXP还原异构酶：EC 1.1.1.267；MEP胞苷酰基转移酶：EC 2.7.7.60；CDP-ME激酶：EC 2.7.1.148；MECDP合酶：EC 4.6.1.12；MECDP还原酶EC 1.17.4.3和HMBPP还原酶：EC 1.17.1.2。
编码这些酶的外源基因公开于公用的数据库中，由此可为本领域技术人员使用。这些MEP途径的基因的实例是大肠杆菌的那些基因。这些样本具有以下的序号：例如dxs：(AAC73523，GI：1786622，U00096.2)；dxr：(AAC73284，GI：1786369，U00096.2)；ispD：(AAC75789，GI：1789104，U00096.2)；ispE：(AAC74292，GI：1787459，U00096.2)；ispF：(AAC75788，GI：1789103，U00096.2)；gcpE：(AAC75568，GI：1788863，U00096.2)；lytB：(AAC73140，GI：1786212，U00096.2)。
在优选的实施方式中，所述微生物含有编码功能性的DXP还原异构酶(dxr)、MEP胞苷酰基转移酶(ispD)、CDP-ME激酶(ispE)、MECDP合酶(ispF)、MECDP还原酶(gcpE)和HMBPP还原酶(lytB)的外源基因。优选地，所述微生物还含有编码DXP合酶(dxs)的外源基因。
优选地，所述微生物含有编码IPP异构酶(图1中idi)的外源基因。
优选地，所述微生物含有编码FPP合酶的外源基因。编码IPP异构酶和FPP合酶的基因已经被公开了并且可为技术人员使用。这些基因的外源拷贝可对增加本发明的微生物的萜的生成是有用的。
在优选实施方式中，所述微生物含有至少一种编码功能性萜合酶的外源基因。本发明的微生物的重要的优点在于可生成任何技术人员所选的萜时的稳定性。因此可应用任何编码序列的萜合酶在微生物中外源表达。本发明的特殊之处在于MEP途径酶的功能性导致了IPP的外源生成，而萜合酶可以是能够将以下给出的前体转变成为任何萜的酶。
术语萜合酶包括酶、复合体和/或能够从一种或几种前体合成萜的一组酶。具体地，对于本发明的目的而言，萜的前体为焦磷酸法呢酯(FPP)、焦磷酸香叶酯(GPP)、焦磷酸香叶基香叶酯(GGPP)和它们任意的两种或更多种的组合。
优选地，萜合酶是一种单一的、复杂的和/或能够从GPP、FPP、GGPP或它们的至少两种的组合合成萜的一组酶。
萜是饱和的或不饱和的、非强制选择的取代的烃，其基于异戊二烯单元(C5)或主要由其构成。萜可为无环或成环的。在此使用的萜包括萜、萜衍生物和被称为类萜的化合物，其可以落入或不落入一种或两种前述的化合物分类。萜的衍生物包括经过一步或多步官能化步骤例如羟基化、异构化、氧化还原或酰化作用的化合物。优选地，对于本发明的目的来说，萜是一种能够满足上述条件和/或其碳骨架(至少是部分但优选全部)来源于MEP和/或MEV途径的化合物。因此，萜包括萜醇例如C15H26O和C10H18O化合物例如广藿香醇、表雪松醇、荜澄茄醇、里哪醇、橙花叔醇；和二醇，例如香紫苏醇。萜还包括焦磷酸酯化合物例如焦磷酸冰片酯(单萜)和焦磷酸()酯(copalyl diphosphate)(二萜)，在此仅提及大量萜的种类中的少数样本。
在此使用的“衍生物”是从已知或推定的化合物得到的并含有母体物质的必要元素的任何化合物。
例如，萜是具有C10、C15、C20、C30、C40、C45等等的碳骨架的化合物。
因此，术语萜包含单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜和/或聚萜。在本发明的优选实施方式中，萜合酶是单萜合酶、倍半萜合酶和/或二萜合酶。优选地，其为倍半萜合酶。
根据优选实施方式，本发明的萜为倍半萜。例如，所述倍半萜为荜澄茄醇、广藿香醇、法呢烯、青蒿酸(amorphadiene)和/或朱栾倍半萜。编码这些萜的合酶的基因在公共数据库中是可得到的，例如序号为AY508730，CQ813505，AY566286，AY523409，DQ309034，AF024615，AF374462，AF138959，AY006482，CQ813508的基因。
萜合酶和编码它们的基因可为技术人员根据参数选择广泛使用和选择。少数几个非限定性实例是单萜合酶，例如柠檬烯合酶(L13459，D49368，AAM53944)、松萜合酶(AF543530，AF543528)、桧萜合酶(AF051901)、焦磷酸冰片酯合酶(AF051900)、1，8-桉树脑合酶(AF051899)和里哪醇合酶(AF154124，U58314)。具有可用序列的二萜合酶的实例为蓖麻烯合酶(P59287)、紫杉二烯合成酶(U48796)和松香二烯合酶(U50708)。这些实例仅是用于说明本发明的广泛应用。编码萜合酶的迄今有待分离的序列可同样适用于本发明的原则。
优选地，萜合酶是外源的。因此萜不是由天然的和/或野生型微生物生成的。然而，本发明还包含这样的实例，其中的微生物已经含有编码产生萜的合酶的天然的和/或野生型基因。在这种情况下，本发明的微生物含有相同基因的另外拷贝，或编码能够生成相同或不同萜的萜合酶的外源基因。那样的话，可产生较高量的相同萜或该萜与不同萜的混合物。
根据本发明的优选实施方式，本发明的微生物基于每g微生物的干物质提供了至少30μg的萜，更优选至少100μg的萜的产率。微生物的萜产率优选根据实施例10的步骤来建立。
优选地，外源基因在启动子的控制之下。优选地，这些启动子在外源基因的附近。甚至更优选，每种外源基因即MEP途径的那些基因和萜合酶基因分别单独在位于各自编码序列的上游的启动子的控制之下。可以使用任何启动子，例如强的和/或弱的组成型启动子或诱导性启动子。优选的启动子的实例为可诱导半乳糖的酿酒酵母启动子例如GAL1和GAL10，或强的组成型酿酒酵母启动子例如TPI1和TEF1。
优选地，每种上述外源基因都是与终止子序列相关联的。优选地，终止子序列位于外源基因的下游。对于启动子序列来说，终止子序列可以选自巨大的已知或仍待描述的终止子序列池。实例为CYC1、ADH1、TPI1或FBP1的酿酒酵母终止子。
微生物可含有或不含有另外的外源基因。典型地，另外的外源基因包括标记序列例如抗性或营养缺陷的标记，其表明在已选微生物中存在外源基因的选择。
本发明的潜在的一个问题在于在微生物的连续传代过程中大量外源基因材料的稳定性。大的质粒很难构建并且不易被微生物吸收(take up)和维持。此外维持质粒增加了细胞的能量的耗费，并且这将使生产能力降低。然而，如果使用很多小的质粒，其中的一些将在每次的复制循环中丢失。另外，不同质粒或者同一质粒中的同源区域可发生重组，导致外源基因材料的丢失。
引人注目地，本发明人能够通过稳定地引入外源途径来转化微生物，外源途径的基因可存在于微生物的质粒中。
因此本发明提供了如下文所述的关于微生物的一种质粒和/或一对质粒。这些质粒令人惊奇地通过外源MEP途径稳定地转化微生物。优选地，该微生物包含具有外源途径的基因和非强制性选择的编码萜合酶的基因的至少两种质粒。更优选其含有两(2)种质粒。
在优选实施方式中，微生物含有至少两种质粒，一种质粒含有至少三(3)种外源途径基因，另一种质粒含有其它三(3)种外源途径基因。优选地，所有的基因是具有不同的酶活性的基因。
因此本发明提供了一种含有3种外源途径基因的质粒，非强制性选择地还包含至少一种编码功能性DXP合酶的外源基因。更优选所述质粒含有MEP途径的4种基因。
本发明还提供了含有3种外源途径的基因和另外的至少一种编码功能性萜合酶的外源基因。
因此，所述微生物优选含有两种质粒，一种含有外源途径的四(4)种不同基因，其中包括编码DXP合酶的基因；另一种质粒含有MEP途径的三种基因和编码萜合酶的基因。
在本发明的优选实施方式中，所述微生物含有至少两(2)种质粒，加在一起其含有dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、gcpE、lytB和编码萜合酶的基因。换句话说，所述的至少两种质粒(例如三种或四种质粒)含有这些基因从而每种基因存在于至少两种质粒中的至少一种中。
任何合适的载体和/或质粒都可用来包含外源基因。用于转化微生物的合适的载体的实例为pESC载体(例如pESC-URA，Stratagene)、pYES载体(例如pYES2/CT，Invitrogen)和pRS载体(例如pRS426，Sikorski和Hieter，1989，Genetics 122：19)。
根据优选的备选实施例，编码外源途径的基因被整合到微生物的基因组中。
与外源途径基因位于质粒中的实施方式相比，该实施方式具有许多优点。首先，整合到基因组中增加了在连续传代过程中外源基因的整合稳定性。其次，随后的优化步骤(例如进化工程)更容易实现。再次，该系统对于编码萜合酶的基因的定位更加灵活。于是后者可以存在于相对较小的质粒中和/或也整合到基因组中。因此，整合到基因组中的基本优点在于稳定性和至少灵活性。
因此，在优选实施方式中，将外源途径基因和/或DXS合酶基因整合到微生物的基因组中，并且编码萜合酶的基因存在于质粒中和/或整合到基因组中。优选地，编码萜合酶的基因存在于质粒中从而为具有各种合酶的微生物的转化提供便利。
或者，所述外源萜合酶基因可以被插入到微生物的基因组中，并且外源的MEP途径基因和/或DXP合酶基因存在于例如上述的质粒中。
涉及基因组和/或质粒中的外源基因的重新分配的另外改变将会由技术人员来确定并且在此不详细讨论。
对于本发明的目的来说，微生物的基因组等同于全部的染色体DNA，但是排除质粒DNA和线粒体DNA。
所有的外源DNA可以是密码子优化的。因此，外源DNA的密码子优选被修改以相应于微生物的优选密码子。还可以修改密码子以减小外源DNA的GC含量并且改变mRNA二级结构构成。这使得能获得更高水平的外源表达于微生物中的MEP途径酶和/或萜合酶。
麦角甾醇是特定微生物例如真菌特别是酵母生长必需的化合物。但是，为了使碳朝着本发明所选择萜的生成方向流动，优选减少本发明微生物中的麦角甾醇生成。优选通过仅使用弱组成型和/或抑制型启动子来取代麦角甾醇生物合成的启动子达到这一目的。优选地，用弱组成型或抑制型启动子替代酵母中编码基因ERG9鲨稀合酶的天然启动子。例如在酵母中可用酿酒酵母的MET3启动子代替天然启动子。可通过融合PCR和双重(bipartite)基因打靶(Edemiz等，1997，Genome Research 7：1174)来取代启动子。
如果所述生物为真菌，并且优选为酿酒酵母属菌株，水解重要中间体用于萜积聚的磷酸酯例如FPP和/或GGPP优选全部或部分失活。在酿酒酵母中，基因LPP1(YDR284C)和DPP1(YDR284C)的产物显示出具有这种活性(Faulkner等，1999，J.Biol.Chem.274：14831)。因而如果本发明的微生物中存在这些或相似的基因就最好将其缺失掉。
本发明提供了一种在微生物细胞和/或培养基上积聚萜，生成萜和增加微生物中萜前体的量的方法。
所述萜可在细胞中积聚。例如，其可在细胞质、线粒体、细胞膜或其它细胞器中积聚。许多萜为脂溶性化合物，其在细胞的质体膜上积聚。
对于本发明的目的，术语“在培养基上积聚”同样包括在两阶段发酵过程中的溶剂中积聚。
在该方法中使用的萜和微生物为如上所述的萜和微生物。微生物的培养基在25℃(室温)下可以是液体或固体，但是优选为液体。
所述培养基根据所选微生物的需要来选择。因此所述培养基含有生长和/或萜的生成所需的所有成分和因子。通常，选择与用于萜的生成不同的培养基用于微生物生长。通常微生物到达其存活循环的一个复制为最小化并且转录和/或蛋白合成最大化的阶段来实现萜的生成。培养基通常需要含有至少短期内菌株存活所需的所有的因子。
根据本发明的优选实施方式，培养微生物的步骤和/或从培养基中分离萜的步骤是通过两阶段发酵法来实现的。
因此，向培养基中加入不互溶且生物适应的有机溶剂。
这些溶剂形成第二个能够积聚萜和/或避免其从蒸发或其它现象的损失的相，优选为疏水性的。这样，可将所述有机溶剂用于发酵中代谢产物的原位分离(Frenz等，1989，Enzyme Microb.Technol.11：717；Sim等，2001，Biotechnol.Lett.23：201)。对于本发明的目的来说，两阶段发酵是一种培养微生物的方法，其特征在于在微生物的培养基中存在或向其中加入至少一种有机溶剂以形成至少一种两相系统。
优选地，有机溶剂不能明显影响微生物的生长和/或存活。两阶段发酵所用的合适的溶剂例如为邻苯二甲酸二异壬酯、邻苯二甲酸二丁酯、油醇、二己醚和十二烷。
从而两阶段发酵还包括从培养基中萜的至少部分分出和/或分离。
用于积聚萜的方法包括将该微生物工程化使其包含用于产生IPP和/或DMAPP的外源MEP途径的步骤。所述工程化可在上述材料的基础上实施。因此，该工程化可为质粒的转化和/或外源基因材料的基因组的整合。所述的基因工程化的步骤为技术人员公知并且对于任何特定的方法技术都无任何限制。
根据优选实施方式，该方法包含工程化该微生物使其包含外源萜合酶的步骤。优选地，通过转化所述微生物使其含有包含编码外源途径酶的基因的质粒来实施该工程化步骤。
在另一实施方式中，该方法包含在有益于所述萜生成的条件下培养微生物的步骤。这些条件为技术人员公知。通常它们可通过选择适当的培养基、发酵容器、温度和pH来调节。
如果实施两阶段发酵，生成萜的方法可包括从培养基、从细胞和/或从有机溶剂中分离萜的步骤。所述萜可通过任何现有技术使用的方法进行分离，例如色谱法，萃取和蒸馏，但不限于这些方法。
因此，根据本发明的微生物和方法提供了改进和灵活的平台，该平台用于多种单独的萜或它们的混合物的生成，并且该平台可通过可能的进一步的微生物转化来进一步完善，该转化通过能将萜转变为调味料和香料工业中特别有用的其它化合物的其它酶的整合或扩增来实现。一个明显的这样的应用是通过适合的酶整合到本发明的微生物中，通过质粒或基因组合并，将适合的萜转变为类胡萝卜素。另一个例子为朱栾倍半萜转变为香柏酮，其通过能够影响这种转变的细胞色素P450单加氧酶的微生物代谢中另外的插入来实现。因此本发明提供了生成萜和它们衍生物以及由此产生的前体的有用的和有利的工具。
实施例
用以下的实施例详细说明本发明而非因此限定其范围。除非另外指出，给出的百分比为基于重量的百分比。
实施例1～4
通过PCR使用表1中所列的引物将dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、gcpE和lytB基因从大肠杆菌的基因组DNA中扩增出来。
使用表4中所列的引物将编码萜合酶的基因，特别是编码广藿香醇合酶的基因(PatTps177，GeneBank序号：AY508730)、荜澄茄醇合酶(GFTpsC，GenBank序号：CQ813505)和朱栾倍半萜合酶(GFTpsD，GenBank序号：CQ813508)从含有这些基因的pET11a或pET101质粒中扩增出来。这些萜合酶的序列，以及各自基因的分离和上述质粒的构建都公开于WO05/052163、WO05/056803(广藿香醇合酶)和WO04/031376(朱栾倍半萜合酶和荜澄茄醇合酶)中。
PCR条件为Expand高保真(Expand HighFidelity)标准条件(RocheApplied Science)。通过凝胶电泳将DNA片段分开，然后使用高纯度PCR产物纯化试剂盒(Roche Applied Science)对期望大小的片段进行纯化。
实施例1～4，(a)部分
用在表1或表4中给出的限制性酶将dxr、ispD、ispF、lytB、朱栾倍半萜合酶基因和荜澄茄醇合酶基因和质粒(pESC-TRP或pESC-URA)的纯化后的PCR产物消化并用
Figure A200780005285D00231
 II凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。对于萜合酶基因来说，使用pESC-TRP，其余见表1。在体外，消化后质粒与消化后PCR产物的连接在4℃下按照T4DNA连接酶(Roche Applied Science)给出的标准步骤以插入物/载体为至少3:1进行16小时。将得到的连接混合物用于转化化学感受态大肠杆菌细胞(DH5α)(Inoue等，1990，Gene96：23)，并且转化物在添加有氨苄青霉素的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，2％琼脂，pH7，75mg/L氨苄青霉素)上进行选择。
然后通过纯化质粒和用合适的限制性酶消化来检验转化物。如果转化物含有正确大小的质粒，那么将1μg的质粒DNA纯化并且送检进行测序。
获得的质粒如下：
dxr到pESC-TRP中：pIP020；ispD到pESC-URA中：pIP018；ispF到pESC-TRP中：pIP016；lytB到pESC-URA中：pIP009；朱栾倍半萜合酶到pESC-TRP中：pIP027；荜澄茄醇合酶到pESC-TRP中：pIP013。
表1用于克隆大肠杆菌途径基因的PCR引物
Figure A200780005285D00241
“克隆技术”不仅包括通过列出的限制性酶对模板的消化，之后进行连接并将得到的产物转化到大肠杆菌中，还包括在酿酒酵母中的缺口修复，在体内进行构建。
实施1～4，(b)部分
剩余的基因dxs、ispE、gcpE和选择的萜合酶基因，通过如下的传统的克隆或缺口修复方法将其每一种插入前述的质粒(pIP020，pIP018，pIP009)中。
gcpE、朱栾倍半萜合酶和荜澄茄醇合酶的PCR产物按如下流程进行克隆：
表2
 
PCR产物 克隆质粒 得到的质粒
gcpE pIP009(lytB到pESC-URA中) pIP008
朱栾倍半萜合酶 pIP016(ispF到pESC-TRP中) pIP015
荜澄茄醇合酶 pIP016(ispF到pESC-TRP中) pIP014
PCR产物和质粒分别用表1或表4中指出的限制性酶消化，纯化，在体外连接，然后转化到大肠杆菌中，选择转化株并通过如确切的在上述实施例1～4(a)给出的期望质粒测序进行验证。
缺口修复方法用于将dxs克隆到pIP020中，将ispE克隆到pIP018中，将广藿香醇合酶克隆到pIP016中从而获得每种包含两种额外基因的质粒。
克隆的方法使用了酵母中的同源重组从而加入到同源DNA序列中(DeMarini等，2001，BioTechniques 30：520-52)。该技术在于生成末端同源于质粒上插入位点的PCR产物来构建。用于克隆dxs和ispE的引物在表1中给出，克隆萜合酶的引物在表4中。
根据如下流程对PCR产物(dxs，ispE，萜合酶)和目标质粒进行消化：
表3
 
PCR产物 克隆质粒 限制性酶 得到的质粒
dxs PIP020 BamHI和SaII pIP019
IspE PIP018 SaII pIP017
广藿香醇合酶 pIP016 XmaI PIP012
使用标准转化步骤(Gietz和Woods，2002，Methods in Enzymology 350：87)将消化后的PCR产物和质粒两者转化到酿酒酵母YIP-00-02(MATatrpl ura3)中。转化株在SC-trp培养基(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基料，2g/L减少色氨酸脱出的混合液，2％葡萄糖，2％琼脂)或SC-ura培养基(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基料，2g/L减少尿嘧啶脱出混合液，2％葡萄糖，2％琼脂)上选择。在30℃下培养2～3天，所有的转化株接种在含SC-trp(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基料，2g/L减少色氨酸脱出的混合液，2％葡萄糖)或SC-ura(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基料，2g/L减少尿嘧啶脱出混合液，2％葡萄糖)单独的试管中并且在30℃下培养12小时。将来自这次培养中的全部DNA分离(Sambrook和Russell，2000，Molecular cloning a laboratory manual 3rd ed.6.31-6.32)并且随后用于转化化学感受态大肠杆菌细胞(DH5α)(Inoue等，1990)。转化株在含有添加了氨苄青霉素的LB培养基的平板上进行选择。
表4
 
基因 引物 序列 克隆技术
荜澄茄醇合酶 GFTpsCM2A CGGGATCCCGTGGGCCCTatggcacttcaagattcaga BamHI
GFTpsCM2B AAGACGTCGACGCTTCAAAAGGGAACAGGCTTCT SalI
朱栾倍半萜合酶 GFTpsD6M2A cgggatcccgtgggccctatgtcgtctggagaaacatt BamHI
GFTpsD6M2B aagacgtcgacgctTCAAAATGGAACGTGGTCTC SalI
广藿香醇合酶 Ps_GAP_f ACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCAATGGAGTTGTATGCCCAAAGTGTTG 缺口修复
Ps_GAP_r TTCTTCGGAAATCAACTTCTGTTCCATGTCGACGCCTTAATATGGAACAGGGTGAAGGTACAAC 缺口修复
“克隆技术”不仅包括通过列出的限制性酶对模板的消化，之后进行连接并将得到的产物转化到大肠杆菌中，还包括在酿酒酵母中的缺口修复，在体内进行构建。
实施例5：在酿酒酵母体内通过同源重组进行质粒重组(缺口修复)
为了降低质粒的不稳定性和促进酿酒酵母基因组中基因的进一步整合，将4种质粒两两结合在一起最终获得两种主要的质粒：一种具有dxs、dxr、ispD、ispE(pIP001)，另一种具有gcpE、lytB、ispF和倍半萜合酶基因(在朱栾倍半萜的例子中，该质粒称为pIP002)。不同质粒的组合通过酿酒酵母中的缺口修复来实现(DeMarini等，2001，BioTechniques 30:520-52)。
为了构建质粒pIP002，使用引物pfus_grf和pfus_grr(表1)通过PCR对含有ispF、编码朱栾倍半萜合酶的基因、GAL1和GAL10启动子、以及CYC1和ADH1终止子(pIP015)的DNA段进行扩增。得到的PCR产物使用高纯度PCR产物纯化试剂盒(Roche AppliedScience)进行纯化。将质粒pIP008(含有gcpE和lytB的pESC-URA)用MfeI消化，凝胶电泳后用
Figure A200780005285D00271
 II凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。将纯化和消化后的质粒与PCR产物一起用于酿酒酵母YIP-00-03(MATa ura3)(Gietz和Woods，2002)的转化。转化株在含有SC-ura的培养基的平板上进行选择。在30℃培养2～3天之后，将所有的转化株接种到含5mL的SC-ura的单独的试管中在30℃下培养12小时。从这个培养物中分离出总DNA(Sambrook和Russell，2000)并随后用于转化化学感受态大肠杆菌细胞(DH5α)(Inoue等，1990)。转化株在含有添加了氨苄青霉素的LB培养基的平板上进行选择。然后通过纯化质粒和用合适的限制性酶消化进行酶的消化来检验转化株。在转化株含有期望的质粒的情况下，纯化1μg的质粒DNA并送检测序。将得到的含有gcpE、lytB、ispF和朱栾倍半萜合酶的质粒pESC-URA命名为pIP002(图2)。
使用相同的流程来构建质粒pIP001，即使用引物pfus_grf和pfus_grr(表1)通过PCR对含有ispD、ispE、GAL1和GAL10启动子，以及CYC1和ADH1终止子的DNA段进行扩增。得到的PCR产物使用高纯度PCR产物纯化试剂盒(Roche Applied Science)进行纯化。将含有dxs和dxr的pESC-TRP用XcmI消化，凝胶电泳后用
Figure A200780005285D0028140129QIETU
II凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。将纯化和消化后的质粒与PCR产物一起用于酿酒酵母YIP-00-02(MATa trpl ura3)(Gietz和Woods，2002)的转化。转化株在含有SC-trp的培养基的平板上进行选择。在30℃培养2～3天之后，将所有的转化株接种到含5mL的SC-trp的单独的试管中在30℃下培养12小时。从这个培养物中分离出总DNA(Sambrook和Russell，2000)并随后用于转化化学感受态大肠杆菌细胞(DH5α)(Inoue等，1990)。转化株在含有添加了氨苄青霉素的LB培养基的平板上进行选择。然后通过纯化质粒和用合适的限制性酶消化进行酶的消化来进行检验转化株。在转化株含有期望的质粒的情况下，纯化1μg的质粒DNA并送检测序。将得到的含有dxs、dxr、ispD和ispE的质粒pESC-TRP命名为pIP001(图2)。
通过用pIP014和pIP012替代pIP015，重复上述用于生成质粒pIP002的流程来获得分别含有荜澄茄醇合酶基因和广藿香醇合酶基因的质粒pIP003和pIP005。
实施例6：从质粒中表达MEP途径用于生成类萜的酿酒酵母菌株的构建
将纯化的质粒pIP001和pIP002(图2)相继转化(Gietz和Woods，2002)到酿酒酵母YIP-00-02(MATa trpl ura3)株中。用pIP001转化后，转化株在含有SC-trp培养基的平板上进行选择。将转化株菌落纯化并且用pIP002转化。将转化株在含有SC-trp-ura(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基料，2g/L减少色氨酸脱出混合液，2％葡萄糖，2％琼脂)的平板上进行选择。将一定量的转化株在一系列含有5mL的SC-trp-ura单独的检测试管中接种并且在30℃下培养12小时。从这些培养物中，从每个转化株中分离总DNA(Sambrook和Russell，2000)。通过PCR来检验MEP途径基因的存在。选择特征在于MEP途径基因的存在的三种克隆和朱栾倍半萜合酶基因来进行进一步的特征化，并且命名为YIP-DV-01、YIP-DV-02和YIP-DV-03。YIP-DV-02保藏于DSMZ，保藏号为DSM17900。将编码MEP途径的7种酶的每一种基因通过PCR从菌株YIP-DV-02扩增出来并且送检测序(MWG-Biotech AG DNA Sequencing Service)。得到的序列与存储于中的大肠杆菌MEP途径基因的原始基因序列进行比较以检验突变的缺失。
如所述的酿酒酵母菌株YIP-DV-01、YIP-DV-02和YIP-DV-03的构建来实现表达MEP途径和编码荜澄茄醇合酶或编码广藿香醇合酶基因一起表达的酿酒酵母菌株的构建。为了构建含有gcpE、lytB、ispF和倍半萜合酶的质粒，遵循如实施例5所述的相同的步骤，但将朱栾倍半萜合酶替换为合适的上述列举的倍半萜合酶。所有这些表达MEP途径和表达荜澄茄醇合酶或广藿香合酶的菌株分别命名为YIP-DC-01和YIP-DP-01。
实施例7：酿酒酵母基因组中MEP途径基因的整合
为了稳定MEP途径基因的表达，将7种基因的表达盒整合到酿酒酵母的基因组中。在酿酒酵母中使用体内同源重组和双重基因打靶方法(Ederniz et al，1997，Genome Research 7：1174)来实现这一目的。两种基因串的整合在两个特定位点实现。整合的步骤如下(图3)。对于每个基因串(dxs/dxr ispD/ispE或gcpE/lyt BispF)来说，首先从质粒pIP001或pIP002生成6种PCR产物(图3)。然后这些PCR产物在随后的两次融合PCR中融合到一起。例如片段A、B和C首先分别被扩增出来。然后将它们在两次融合PCR中融合，得到长的直线型片段A/B/C(图3)。所得到的融合的PCR片段的特征在于选择标记(乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)URA3或KanMX)水平的区域重叠和末端与基因组上两个不同整合位点同源(图3)。该整合位点为第一串的ura3位点和第二基因组的pDC6(编码丙酮酸脱羧酶的同工酶)或基因组的非编码区域。这些特点对于酿酒酵母的两个基因串的目标插入是必需的。根据Expand高保真标准条件(Roche Applied Science)进行PCR，在每一次PCR和PCR融合步骤后使用高纯度PCR产物纯化试剂盒(Roche Applied Science)来纯化PCR产物。通过标准流程(Gietz和Woods，2002)将最后的片段用于酿酒酵母YIP-00-03(MATa ura3)的转化。将转化株在含有SC-ura培养基的平板上对所述串lytB/gcpE-KlURA3-ispF的插入进行选择并且在含有添加了遗传霉素(geneticin)的SC-ura培养基的平板对两种插入进行选择。在30℃下培养2～3天后，单独的菌落在5mL的SC-ura+遗传霉素培养基(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基料，2g.L-1减少尿嘧啶脱出混合液，2％葡萄糖，200mg.L-1遗传霉素，2％琼脂)中培养过夜。从该培养物中分离总DNA(Sambrook和Russell，2000)。在特定位点的基因串的整合通过PCR来检验。所选的最菌株之一为YIP-D0-01。
实施例8：酿酒酵母中大肠杆菌MEP途径基因的表达的评估
为了检验所有酿酒酵母中大肠杆菌MEP途径的7种基因的表达，通过发酵使用RT-PCR(反转录PCR)来评估它们的表达曲线。为了具体地检测每种MEP途径基因的表达，针对它们中的每一种都设计了一套特定的引物(图5)并优化了PCR的条件。
在震荡烧瓶中培养菌株YIP-DV-02和YIP-0V-02，使用半乳糖(20g.L-1)作为碳源，保持培养温度在30℃并且以150rpm速度搅拌，样本进入不同的生长阶段并根据FastRNAPro Red试剂盒(Qbiogene)提取总RNA。为了除去所含的任何的DNA的痕迹，根据Turbo DNase-freeTM试剂盒(Ambion，Foster City，CA)所述的标准条件应用Turbo DNaseTM(Ambion)随后处理RNA样本。然后将所述RNA样本存放在-80℃下。在检验浓度和RNA样本的同一性后，随后进行RT-PCR。根据反转录延伸标准条件(Roche)使用每种MEP途径基因特定的引物(表6)实施反转录的第一单链DNA的合成。通过将试管置于冰上使得反应停止。然后使用Taq DNA聚合酶和每种基因的特定的引物来实现PCR反应。dxs、ispD、ispE、ispF和lytB的退火温度为55℃，dxr和gcpE的为57℃，肌动蛋白为53℃(用于内标)。延伸温度为90秒并且扩增进行35个循环。为了确定所观察到DNA片段是从mRNA中扩增出来而不是从质粒DNA中扩增出来的，以与RT-PCR相同的条件但不使用反转录步骤来进行对照PCR。这些对照PCR显示没有或极少量的来自DNA的污染扩增，其并不影响RT-PCR试验。
表5通过RT-PCR评估MEP途径基因的表达所用的引物
Figure A200780005285D00321
对于每种MEP途径基因来说，mRNA都是特定地在酿酒酵母YIP-DV-02的较晚的培养阶段在半乳糖耗尽之后发现的。在未用MEP途径基因转化的对照菌株YIP-0V-02中没有观察到条带(图4)。该实验清楚地显示了7种MEP途径基因在YIP-DV-02中的表达。
实施例9：抑甲羟酶素对于震荡烧瓶中表达MEP途径基因的酿酒酵母生长的效果
为了检测含有来自于大肠杆菌的MEP途径的酿酒酵母中MEP途径的功能性，将抑甲羟酶素(mevinolin)作为甲羟戊酸途径的抑制剂。然而，抑甲羟酶素是一种无活性内酯，但是在水解后形式下其为HMG-CoA还原酶的极度有效的抑制剂。在60℃下水浴1小时在乙醇的NaOH[15％(v/v)乙醇，0.25％(w/v)NaOH]中水解抑甲羟酶素。冷却后，将20mg/ml的抑甲羟酶素的贮备液过滤灭菌并且储存在-20℃随后使用。
在含有定义的最少量的培养基(Verduyn等，1992，Yeast8:501)，不同水平的抑甲羟酶素和作为碳源的20g/L的半乳糖的检测试管中进行接种使其从预培养物到具有600nm下0.01的光学密度(OD)，并且在30℃和150rpm下培养，通过测量OD来跟踪生长(图5)。可以观察到在抑甲羟酶素的存在下含有MEP途径和朱栾倍半萜合酶的菌株(酿酒酵母YIP-DV-02)相对于仅具有天然甲羟戊酸途径和朱栾倍半萜合酶(YIP-0V-01)的对照菌株来说显示出较好的生长。对照菌株在20小时后在OD为大约12时完全停止生长，而表达MEP途径的菌株继续生长了超过60小时并且到达了约30的OD(图5)。这清楚地显示了大肠杆菌MEP途径在酿酒酵母YIP-DV-01菌株中功能性表达。
实施例10：用于类萜的原位分离的两阶段发酵
为了有效积聚疏水和高挥发性的萜，可使用以互不溶的和生物适应的有机溶剂作为第二阶段的两阶段发酵。两阶段发酵已经用于发酵过程中一些代谢物的原位分离(Frenz等，1989，EnzymeMicrob.Technol.11：717；Sim等，2001，Biotechnol.Lett.23:201)。在该实例中，将十二烷用于朱栾倍半萜的原位分离。检测由表达MEP途径和朱栾倍半萜合酶的酿酒酵母(YIP-DV-02)生成的朱栾倍半萜。作为参考，同样培养仅表达朱栾倍半萜合酶的菌株(YIP-0V-01)。在第一个菌株中，朱栾倍半萜合酶从半乳糖诱导启动子进行表达，而在后一种菌株中，朱栾倍半萜合酶从组成型TPI1启动子开始表达。这意味着在菌株之间在朱栾倍半萜生成水平中观察到的差异是MEP途径和同样潜在的朱栾倍半萜合酶的启动子的效果。
为了确定每份微生物干物质的萜的产率(生物量)，应用如下的步骤：
用菌株YIP-0V-01或YIP-DV-02的过夜培养物在含有100ml的定义的最少量的培养基(Verduyn等，1992，Yeast8:501)和15g/L的半乳糖的长颈的用棉花封口的500ml的锥形烧瓶中进行接种，直到在600nm的光密度(OD)为0.05，并在30℃和150rpm下培养。当在600nm的OD到达1.0时，向每个震荡烧瓶中添加10ml的十二烷(相当于10％的成熟培养基)。对于生长来说十二烷不显示任何明显的效果(数据未显示)。在对数生长阶段的末尾，一旦半乳糖被耗尽，将所述培养基离心通过GC-MS分析上层有机相的朱栾倍半萜(见下文)。添加十二烷之后的每小时检测一次OD。当OD测量第一次显示指数生长结束时即为半乳糖耗尽的时间。
结果在表6中给出。该试验证明了使用两阶段发酵用于原位分离挥发性类萜的朱栾倍半萜的可能性。表5显示了含有MEP途径的菌株与仅表达外源甲羟戊酸(MEV)途径的菌株相比积聚了多大约10倍的朱栾倍半萜。
表6用于评估由具有15g/L的半乳糖的震荡烧瓶中同一批生长的YIP-0V-01和YIP-DV-02菌株生成的朱栾倍半萜的两阶段发酵
 
菌株 朱栾倍半萜浓度(μg/L) 产率(μg/gDW) 生产力(μg/L/h)
YIP-0V-01 19.5 5.3 1.2
YIP-DV-02 186 39.9 8.3
为了萜的分析和定量，按如下使用质谱仪和气相色谱的组合：
将装有Finnigan Focus DSQ质谱仪和ZB-5ms毛细柱(30m×250μm ID×0.25μm膜厚，Phenomenex)的Finnigan Focus的气相色谱用于样本的分析。使用GC柱温程序：80℃持续1min，10℃/min坡升至130℃，随后3℃/min坡升至160℃，最后10℃/min坡升至270℃并在270℃保持5min来进行GC-MS分析。1ml/min的氦气作为载气。在分流模式下运转GC-MS0.8min并且之后打开分流阀以50ml/min进行分流。
通过使用具有0.45μm孔径的硝化纤维过滤器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)以细胞干重确定生物量。首先，将过滤器在180W的微波炉中预干燥10min，并称重。过滤已知体积的细胞培养物，然后残留物用蒸馏水洗涤。最后将过滤器在180W的微波炉中干燥15min并称重。
按如下方法计算每生物量萜的浓度：表3中100ml的生长培养基中相应的浓度以C＝0.01*Cv/0.1＝Cv/10来计算，Cv为如上所述的GC-MS建立起来的十二烷相中朱栾倍半萜的浓度。萜(朱栾倍半萜)生物量上的产率为积聚的朱栾倍半萜浓度除以积聚的生物量浓度(从十二烷添加的时刻到半乳糖的耗尽的时刻)。产率＝(Cv/10)/(Xt-X0)，其中Xt为半乳糖的耗尽的时刻的生物量浓度(和朱栾倍半萜的量)，和X0为十二烷添加的时刻的生物量浓度。生产力以积聚的朱栾倍半萜浓度除以积聚时间来计算。生产力＝(Cv/10)/(Tt-T0)，其中Tt为半乳糖的耗尽的时刻(和朱栾倍半萜的量)，并且T0为十二烷添加的时刻。
试验显示出指数生长期在半乳糖上同一批的需氧生长过程中，朱栾倍半萜由YIP-DV-02以每g生成的生物量干重为39.9μg的朱栾倍半萜的产率生成。这符合8.3μg每L培养基每小时的体积测定生产力(表6)。
实施例11：表达来自于大肠杆菌的MEP途径和具有甲羟戊酸途径中的必要基因的缺失的酿酒酵母菌株的构建
通过用缺失盒进行转化，将酿酒酵母YIP-00-02(MATa ura3trpl)用于构建具有甲羟戊酸途径中的必要基因的缺失的菌株。用含为随后的融合PCR连接到酿酒酵母基因组的ERG13的上游和下游区域的突出部分的引物，通过从质粒pWJ1077中PCR扩增K.l.URA3标记来产生酿酒酵母基因ERG13的缺失盒(Reid等，2002，Methods Enzymol.350，258-277)。使用酿酒酵母作为模板通过PCR获得这些区域(图6和表7)。获得的4种片段通过融合PCR结合得到搭接部分K.l.URA3标记的2种片段。根据Expand高保真的标准条件(Roche Applied Science)实施PCR。在每个PCR和融合PCR步骤后将PCR产物用高纯度PCR产物纯化试剂盒(Roche Applied Science)进行纯化。
表7用于ERG13的缺失的引物
Figure A200780005285D00361
接头(Adaptamers)用小写字母显示。
使用标准方法(Gietz和Woods，2002)将得到的DNA片段用于转化酿酒酵母YIP-00-02，并且由于体内同源重组，ERG13被缺失。ΔERG13转化株在添加有甲羟戊酸(50mg/L)，麦角甾醇(10mg/L)和Tween80(0，5％)的SC-ura培养基上进行选择。从每种转化株中分离出总DNA后通过诊断PCR(Sambrook和Russell，2000)和通过在存在/缺失甲羟戊酸，麦角甾醇或Tween80下的生长表现型来检验ERG13的正确缺失。获得酿酒酵母菌株MATa trpl Δerg13并命名为YIP-M0-06。
通过在添加有5-氟乳清酸(5-FOA)(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基料，2g/L减少尿嘧啶脱出混合液，50mg/L尿嘧啶，1g/L5-FOA，2％葡萄糖，2％琼脂)的合成培养基上培养已环出K.l.URA3标记之后，酿酒酵母YIP-M0-06(MATa trpl Δerg13)的代谢物需求可通过引入来自于大肠杆菌的MEP途径来克服。通过用质粒pIP001和pIP002，pIP001和pIP003，pIP001和pIP004，pIP001和pIP005，或者质粒pIP001和pIP006转化该菌株，分别获得菌株YIP-DV-04(Δerg13MEP途径和朱栾倍半萜合酶)，YIP-DC-03(Δerg13，MEP途径和荜澄茄醇合酶)，YIP-DC-04(Δerg13，MEP途径和密码子优化的荜澄茄醇合酶)，YIP-DP-03(Δerg13，MEP途径和广藿香醇合酶)和YIP-DP-04(Δerg13，MEP途径和密码子优化的广藿香醇合酶)。
实施例12：表达来自大肠杆菌的MEP途径生成番茄烯的酿酒酵母菌株的构建
通过将该菌株通过在添加有5-氟乳清酸(5-FOA)(6.7g/L无氨基酸的酵母氮基料，2g/L减少尿嘧啶脱出混合液，50mg/L尿嘧啶，1g/L5-FOA，2％葡萄糖，2％琼脂)的合成培养基上划板首先选择酿酒酵母YIP-D0-01的ura3变异体。选择后的YIP-D0-01(MATaura3 MEP)菌株用于番茄烯生成基因的表达。
番茄烯生物合成基因来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的分别编码焦磷酸香叶基香叶酯合酶，八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素去饱和酶的crtE基因(Genebank序号：AAA21260)、crtB基因(Genebank序号：AAA21264)和crtI基因(Genebank序号：AAA21263)。在酵母中将番茄烯生物合成基因的核苷酸序列修改以优化它们的表达。改变密码子而不改变氨基酸序列。合成三种crt密码子优化的基因使其具有添加在基因末端的合适的限制性位点并且其最初克隆于pCR4TOPO质粒(Invitrogen)中，含有crtE、crtB和crtI基因的质粒分别命名为pIP033、pIP034和pIP035(图7)。
使用限制性酶消化pCR4TOPO质粒上的crt基因并将其亚克隆到酵母表达载体pESC-URA和pESC-HIS(Stratagene)中。pIP033和pESC-URA质粒DNA用SacI和NotI限制性酶消化，并且进行琼脂糖凝胶电泳。使用GFX凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Biosciences)对得到的条带进行凝胶纯化，在体内连接，随后转化到大肠杆菌中，选择转化株并通过限制性分布分析和测序来检验转化株。将来自于显示出crtE基因的正确连接的转化株转入到pESC-URA载体中，将质粒pIP036纯化并储存。
随后将pIP035和pESC-HIS质粒DNA用SacI和SpeI限制性酶消化。得到的片段进行凝胶纯化，体内连接，随后转化到大肠杆菌中，选择转化株并且通过限制性分布和测序来检验转化株。将具有正确的crtI基因的转化株转化到pESC-HIS载体中，纯化质粒(pIP037)。
之后将pIP034和pIP037质粒DNA用SalI和XhoI限制性酶消化。以如上所述相同的方式获得、纯化和储存质粒pIP038(将crtB基因转入pIP037载体)。
为了降低质粒的不稳定性和利于在酿酒酵母基因组中基因的进一步整合，将两种质粒(pIP036和pIP38)结合在一起获得质粒pIP039。两种质粒的组合通过在酿酒酵母中使用缺口修复方法(DeMarini等，2001，BioTechniques30:520-52)实现。为了构建质粒pIP039，使用引物pfus_grf和pfus_grr(表1)通过PCR扩增含有crtI、crtB、GAL1和GAL10促进子，CYC1和ADH1终止子(pIP038)的DNA片段。得到的PCR产物用高纯度PCR产物纯化试剂盒(Roche AppliedScience)进行纯化。质粒pIP036(含有crtE的pESC-URA)用MfeI消化，凝胶电泳后使用
Figure A200780005285D00391
II凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。纯化和消化后的质粒与PCR产物一起用于酿酒酵母YIP-00-03(MATa ura3)的转化。在含有SC-ura培养基的平板上选择转化株。30℃下培养2～3天后，将所有的转化株在单独的含有5mL的SC-ura的测试试管中接种并且在30℃下培养12小时。从该培养物中分离总DNA并将其用于随后的化学感受态大肠杆菌DH5α细胞。转化株在添加了氨苄青霉素的LB培养基的平板上进行选择。然后通过纯化质粒和用合适的限制性酶进行酶的消化来检验转化株。在转化株含有期望的质粒的情况下，纯化1μg的质粒DNA并将其送检测序。获得含有crtE、crtB和crtI基因的所得质粒pESC-URA并命名为pIP039。图8显示了不同的所构建的含有crt基因的pESC载体。
用构建好的含有crtE、crtI和crtB的质粒pIP039转化酿酒酵母YIP-D0-01(MATa ura3 MEP)来构建表达大肠杆菌的MEP途径生成番茄烯的酿酒酵母菌株。所得的菌株为YIP-DK-01。
工业应用
本发明的微生物用于复杂的萜化合物、它们的前体和它们的衍生物的生成。

Claims (21)

1.重组微生物，其含有将5-磷酸1-脱氧-D-木糖酮酯(DXP)转变为焦磷酸异戊烯酯(IPP)和/或焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)的外源途径，而所述微生物的天然代谢缺乏该途径。
2.权利要求1所述的微生物，其进一步包含生成DXP的外源基因。
3.权利要求1或2所述的微生物，其包含4-磷酸2-甲基赤藻糖醇酯(MEP)途径的外源基因。
4.权利要求2或3所述的微生物，其为真菌，优选为酵母属。
5.前述权利要求任一项所述的微生物，其含有编码功能性的DXP还原异构酶、MEP胞苷酰基转移酶、CDP-ME激酶、MECDP合酶、MECDP还原酶和HMBPP还原酶的外源基因。
6.权利要求2所述的微生物，其含有编码功能性的DXP合酶、DXP还原异构酶、MEP胞苷酰基转移酶、CDP-ME激酶、MECDP合酶、MECDP还原酶和HMBPP还原酶的外源基因。
7.前述权利要求任一项所述的微生物，其还包含编码功能性萜合酶的至少一种外源基因。
8.权利要求7所述的微生物，当在合适的微生物培养基上合成萜时，基于每g微生物干重获得至少100μg萜的产率。
9.前述权利要求任一项所述的微生物，其进一步包含编码功能性单萜合酶、倍半萜合酶和/或二萜合酶的至少一种外源基因。
10.前述权利要求任一项所述的微生物，其中外源途径的基因存在于微生物的质粒中。
11.权利要求10所述的微生物，其含有两种质粒，每种质粒包含至少3种外源途径的基因。
12.权利要求10所述的微生物，其含有至少两种(2)质粒，这些质粒共同包含dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、gcpE、lytB基因和编码萜合酶的基因。
13.权利要求12所述的微生物，其中所述基因承载于两种质粒上。
14.权利要求1～9任一项所述的微生物，其中编码外源途径的基因被整合到微生物的基因组中。
15.根据权利要求4所述的微生物，该微生物为保藏号DSM17900的酿酒酵母菌株YIP-DV-02。
16.一种在微生物细胞和/或培养基中积聚萜的方法，其中所述微生物为根据权利要求1～15任一项所述的重组微生物。
17.权利要求16所述的方法，包含在适合的培养基中培养所述微生物的步骤。
18.生成萜的方法，该方法包含在适合所述萜生成的培养基上培养权利要求1～15任一项所述的微生物的步骤和非强制性选择的从所述培养基和/或所述微生物中分离该萜的步骤。
19.权利要求17或18所述的方法，其中培养微生物的步骤至少部分通过两阶段发酵来实施。
20.制备能够积聚和/或生成萜的重组微生物的方法，该方法包括转化这样的微生物的步骤，该微生物缺乏天然MEP途径并具有外源MEP途径基因和至少一种编码萜合酶的基因。
21.增加缺乏天然MEP途径的微生物中萜前体含量的方法，该方法包括转化具有外源MEP途径基因和非强制性选择的编码萜合酶的至少一种基因的微生物的步骤。
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