JP2020080705A - 変異型デカルボニラーゼ遺伝子、当該変異型デカルボニラーゼ遺伝子を有する組換え微生物及びアルカンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)配列番号2に示すアミノ酸配列における
29番目のバリンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
54番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
89番目のセリンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
169番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
175番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異及び
188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異
からなる群から選ばれる少なくとも1つの置換変異を有するデカルボニラーゼをコードする変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
本発明に係る変異型デカルボニラーゼ遺伝子(以下、単に変異型デカルボニラーゼ遺伝子と称する)は、野生型のデカルボニラーゼに所定の置換変異を導入したデカルボニラーゼ変異体をコードする遺伝子である。特に、置換変異を導入したデカルボニラーゼ変異体は、当該置換変異を導入する前のデカルボニラーゼ(例えば、野生型デカルボニラーゼ)と比較して優れたデカルボニラーゼ活性を示す。ここで、デカルボニラーゼ活性は、基質となるアルデヒド化合物を脱カルボニルして炭化水素を生成する活性を意味する。したがって、デカルボニラーゼ活性は、生産される炭化水素の量に基づいて評価することができる。
以上で説明したように、変異型デカルボニラーゼ遺伝子を導入した組換え微生物を使用することでアルカンを優れた生産性で合成できる。
[1.目的]
デカルボニラーゼは、次世代バイオディーゼル燃料であるアルカン(hydrocarbon)を大腸菌等の微生物で発酵生産する際のキイ酵素である。本実施例では、デカルボニラーゼの酵素活性を高める技術開発として、αへリックスを安定化させるアミノ酸置換変異を導入したデカルボニラーゼ変異体を作製し、デカルボニラーゼ活性の向上に寄与するアミノ酸置換変異の同定を行った。
2.1 試薬
本実施例で使用したプラスミド:pRSF-Duet-1とpCDF-Duet-1はNovagen社より購入した。また、本実施例において、製造元を個別に記載していない試薬は、ナカライテスクから購入した。
2.2 菌株
本実施例では、タカラバイオ社より購入したE. coli BL-21株と、ニッポンジーン社より購入したE. coli JM109株を使用した。
2.3 プラスミドの作製
2.3.1 pRSF-NpAD-PAの作製
先ず、以下のようにしてpRSF-NpAD-SeARを作製した。すなわち、Synechococcus elongatus PCC 7942株由来のアシル-ACPレダクターゼ遺伝子(YP_400611)とNostoc punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼ遺伝子(YP_001865325)を化学合成した。これらの合成遺伝子はpUC57のEcoRVサイトに挿入し、それぞれpUC57-SeAAR、pUC57-NpADと命名した。
Primer pRSF-NpAS-inf-F:5’-cgagctcggcgcgcctgcagATGCAGCAGCTTACAGACCA-3’(配列番号5)
Primer pRSF-NpAS-inf-R:5’-gcaagcttgtcgacctgcagTTAAGCACCTATGAGTCCGT-3’(配列番号6)
Primer pRSF-SeAR-inf-F:5’-aaggagatatacatatgATGTTCGGTCTTATCGGTCA-3’(配列番号7)
Primer pRSF-SeAR-inf-R:5’-ttgagatctgccatatgTCAAATTGCCAATGCCAAGG-3’(配列番号8)
そして、得られたpRSF-NpAD-SeARを鋳型として下記条件でPCRを行った。
Primer FW1: AGGAGATATACCATGCAGCAGCTTACAGACC(配列番号9)
Primer Rv1: GCTCGAATTCGGATCTTACACCACATCATCTTCGGCACCTGGCATGGCAACGCCAGCACCTATGAGTCCGTAGG(配列番号10)
また、上記pRSF-NpAD-SeARを鋳型として下記条件でPCRを行った。
Primer FW2: AAGGAGATATACATATGATGTTCGGTCTTATCGGTCA(配列番号11)
Primer Rv2: TTGAGATCTGCCATATGTCAAATTGCCAATGCCAAGG(配列番号12)
次に、上記で得られたpRSF-NpAD-PAを鋳型として、所定の位置に置換変異を導入することができるプライマーセットを用いて下記条件でPCRを行った。本実施例で使用したプライマーセットは表6にまとめた。
上記で得られたプラスミドNo.1〜66とpCDF-SeARでE. coli BL-21株を形質転換し、変異体を調製した。プラスミドNo.1〜66の代わりにpRSF-NpAD-PAを用い、pRSF-NpAD-PAとpCDF-SeARで作製した形質転換体を野生株とした。野生型及び形質転換体を培養し、MG/CMSにより、炭化水素の生産量を定量的に比較した。
詳細は省略するが、本実施例で使用したNostoc punctiforme PCC73102株由来のデカルボニラーゼのモデリングを行ったところ、10個のαヘリックス(N末端から順にヘリックス1〜10)のみから構成される特殊な構造のタンパク質であることが明らかになった。一方、αヘリックス上の疎水性と親水性の乱れによってαヘリックスが不安定化し、変性することが知られていることから(特許:WO2016/199898)、乱れをなくすようにアミノ酸の置換変異をデカルボニラーゼに導入し、当該置換変異に起因する炭化水素の生産量に及ぼす影響を調べた。
Claims (51)
- 配列番号2に示すアミノ酸配列における
29番目のバリンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
54番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
89番目のセリンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
169番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
175番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異及び
188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異
からなる群から選ばれる少なくとも1つの置換変異を有するデカルボニラーゼ変異体をコードする変異型デカルボニラーゼ遺伝子。 - 上記29番目のバリンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシン、トリプトファン、セリン、グリシン、アラニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン及びロイシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記29番目のバリンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシン、トリプトファン、セリン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記29番目のバリンに相当するアミノ酸の置換変異は、メチオニンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、チロシンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、グリシン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、バリンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、アルギニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン及びグリシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン又はチロシンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記54番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記54番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記54番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、アスパラギン酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記89番目のセリンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記89番目のセリンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記89番目のセリンに相当するアミノ酸の置換変異は、アスパラギンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、バリンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記169番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記169番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン及びアラニンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記169番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシン、トリプトファン及びアラニンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン、メチオニン、システイン及びフェニルアラニンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、スレオニン又はメチオニンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記175番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、アルギニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記175番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びヒスチジンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記175番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、リシン、グルタミン及びグルタミン酸からなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシン又はトリプトファンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる1つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 上記188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、バリンへの置換変異であることを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 配列番号2に示すアミノ酸配列に対して、V29M、E35Y、N39T、N39V、T42D、T42N、H51Y、L54Q、M60D、S89N、N94V、L169A、L169Y、L169W、N174M、N174T、L175Q、L175E、L175K、I177Y、I177W及びD188Vからなる群から選ばれる少なくとも1つの置換変異を有することを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 配列番号2に示すアミノ酸配列に対して、H51Y及び/又はL169Wを有することを特徴とする請求項1記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
- 請求項1〜請求項45のいずれか一項に記載された変異型デカルボニラーゼ遺伝子を宿主微生物に導入してなる組換え微生物。
- 上記宿主微生物は大腸菌又はKlebsiella属細菌であることを特徴とする請求項46記載の組換え微生物。
- 請求項46又は請求項47記載の組換え微生物を培養する工程を含むアルカンの製造方法。
- 上記組換え微生物を培養する培地よりアルカンを回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項48記載のアルカンの製造方法。
- 上記組換え微生物を培養する培地よりアルカンを回収し、回収したアルカンを精製する工程を更に含むことを特徴とする請求項48記載のアルカンの製造方法。
- 炭素数9〜20のアルカンを製造することを特徴とする請求項48記載のアルカンの製造方法。
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WO2016199898A1 (ja) * | 2015-06-10 | 2016-12-15 | 公立大学法人 富山県立大学 | 活性型変異酵素の製造方法および新規活性型変異酵素、並びに可溶性化変異タンパク質の製造方法 |
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