JP5761352B2 - アルカンの製造方法及びアルカン合成能を有する組換え微生物 - Google Patents
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Description
フェレドキシンとは、内部に鉄-硫黄クラスター(Fe-Sクラスター)を含む鉄硫黄タンパク質であり、電子伝達体として機能するタンパク質である。アルカン合成酵素によりアルカンを合成する系においてフェレドキシンを存在させるには、一例として、アルカン合成能を有する微生物や、アルカン合成能を付与された組換え微生物にフェレドキシンをコードする遺伝子を導入すればよい。フェレドキシン遺伝子としては、特に限定されず、如何なる生物由来の遺伝子を使用しても良い。例えば、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース等の遺伝子情報を格納したデータベースを参照することで、様々な生物種由来のフェレドキシン遺伝子に関する塩基配列やフェレドキシンのアミノ酸配列を特定することができる。
フェレドキシンNADPHレダクターゼとは、フェレドキシンとNADPHとの間の酸化還元反応を触媒する酵素である。アルカン合成酵素によりアルカンを合成する系においてフェレドキシンとともにフェレドキシンNADPHレダクターゼを存在させるには、一例として、アルカン合成能を有する微生物や、アルカン合成能を付与された組換え微生物にフェレドキシンをコードする遺伝子及びフェレドキシンNADPHレダクターゼをコードする遺伝子を導入すればよい。フェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子としては、特に限定されず、如何なる生物由来の遺伝子を使用しても良い。例えば、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース等の遺伝子情報を格納したデータベースを参照することで、様々な生物種由来のフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子に関する塩基配列やフェレドキシンNADPHレダクターゼのアミノ酸配列を特定することができる。
本発明において、上述したフェレドキシン遺伝子やフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子を導入する微生物は、アルカン合成能を有する微生物又はアルカン合成能を付与された組換え微生物である。
Anabaena variabilis ATCC29413、Nostoc punctiforme PCC73102、Gloeobacter violaceus PCC7421、Nostoc sp. PCC7120、Cyanothece sp. PCC7425及びCyanothece sp. ATCC51142を挙げることができる(参考:Science 30 July 2010. Vol. 329, No. 5991, pp. 559-562)。
以上で説明したように、本発明によれば、アルカン合成能を有する微生物や、アルカン合成能を付与された組換え微生物といったin vivoの系、アルカン合成酵素により基質を含む反応液中でアルカンを合成するin vitroの系によってアルカンを優れた生産性で合成できる。
本実施例では、アルカン生産能を付与するとともに、フェレドキシン遺伝子及び/又はフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子を導入した組換え体酵母を作製し、フェレドキシン、フェレドキシンNADPHレダクターゼのアルカン生産性能に対する効果確認した。
クローニングした遺伝子の恒常的発現を目的とし、pESCベクター(STRATAGENE社製)への恒常性プロモーター(Ppgk及びPgap)の挿入を実施した。PgapとはSaccharomyces cerevisiae YPH499由来のGlyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase(gap)遺伝子のプロモーターである。まず酵母YPH499株からGenとるくん(タカラバイオ社製)を用いて精製したゲノムDNAを鋳型としたPCRによりPgapを含むDNA断片を取得した。ポリメラーゼはKOD-Plus-Ver.2(東洋紡社製)を用いた。Pgapを含むDNA断片を増幅するため以下の一対のプライマーを設計し、反応液組成及び反応サイクル条件は下記に示すとおりとした。
(Primer #2)BamHI-Pgap-R, 5'-CTCTGGATCCTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3'(配列番号6)
〔反応液組成〕
YPH499 genome DNA(100 ng/μl) 1μl
10×buffer for KOD-Plus-Ver.2 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 4μl
Primer #1(10μM) 1.5μl
Primer #2(10μM) 1.5μl
KOD-Plus (1U/μl) 1μl
dH2O 31μl
50μl
〔反応サイクル条件〕
95℃ 2分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×25サイクル-72℃3分-4℃ストック
(Primer #2)EcoRI-Ppgk1-R, 5'-ATAAGAATTCTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG-3'(配列番号9)
〔反応液組成〕
YPH499 genome DNA(100 ng/μl) 1μl
10×buffer for KOD-Plus-Ver.2 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 4μl
Primer #1(10μM) 1.5μl
Primer #2(10μM) 1.5μl
KOD-Plus (1U/μl) 1μl
dH2O 31μl
50μl
〔反応サイクル条件〕
95℃ 2分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×25サイクル-72℃3分-4℃ストック
上記で作製したpESCpgkgap-HISを制限酵素Bam HIとNot Iで消化し、得られた1.4kbpのインサート断片を、制限酵素Bam HIとNot Iで消化したpESC-URAベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドpESCpgkgap-URAと命名した。
Nostoc sp. AT27347のゲノムDNAを鋳型にしてPCRによりアルカン合成酵素遺伝子(alkS遺伝子)を含むDNA断片を取得した。PCRにはKOD-Plus-Ver.2 (東洋紡社製)を用いた。alkS遺伝子を含むDNA断片を増幅するため以下の一対のプライマーを設計し、反応液組成及び反応サイクル条件は下記に示すとおりとした。
(Primer #2)YalkS_R2, 5'-CAGACTCGAGTTAAGCTGCTGTAAGTCCGTAGG-3'(配列番号12)
〔反応液組成〕
Nostoc sp.PCC27347ゲノムDNA(100 ng/μl) 1μl
10×buffer for KOD-Plus-Ver.2 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 4μl
Primer #1(10μM) 1.5μl
Primer #2(10μM) 1.5μl
KOD-Plus (1U/μl) 1μl
dH2O 31μl
50μl
〔反応サイクル条件〕
94℃ 2分-(98℃ 10秒、55℃ 30秒、68℃ 1分30秒)×30サイクル-68℃ 3分-16℃ストック
S.cerevisiae YPH499のゲノムDNAを鋳型にしてPCRによりフェレドキシン遺伝子(Yfdx遺伝子)を含むDNA断片を取得した。PCRにはKOD-Plus-Ver.2 (東洋紡社製)を用いた。Yfdx遺伝子を含むDNA断片を増幅するため以下の一対のプライマーを設計し、反応液組成及び反応サイクル条件は下記に示すとおりとした。
(Primer #2)Yfdx_R2, 5'-GGAACTCGAGTTAACTAAAATCGTTGTTATTAACG-3'(配列番号16)
〔反応液組成〕
YPH499 genome DNA(100 ng/μl) 1μl
10×buffer for KOD-Plus-Ver.2 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 4μl
Primer #1(10μM) 1.5μl
Primer #2(10μM) 1.5μl
KOD-Plus (1U/μl) 1μl
dH2O 31μl
50μl
〔反応サイクル条件〕
94℃ 2分-(98℃ 10秒、55℃ 30秒、68℃ 1分30秒)×30サイクル-68℃ 3分-16℃ストック
S.cerevisiae YPH499のゲノムDNAを鋳型にしてPCRによりフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子(Yfdr遺伝子)を含むDNA断片を取得した。PCRにはKOD-Plus-Ver.2 (東洋紡社製)を用いた。Yfdr遺伝子を含むDNA断片を増幅するため以下の一対のプライマーを設計し、反応液組成及び反応サイクル条件は下記に示すとおりとした。
(Primer #2)Yfdr_R2, 5'-GGCCACTAGTTTATATGCCTTCTACACCGTTCC-3'(配列番号18)
〔反応液組成〕
YPH499 genome DNA(100 ng/μl) 1μl
10×buffer for KOD-Plus-Ver.2 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 4μl
Primer #1(10μM) 1.5μl
Primer #2(10μM) 1.5μl
KOD-Plus (1U/μl) 1μl
dH2O 31μl
50μl
〔反応サイクル条件〕
94℃ 2分-(98℃ 10秒、55℃ 30秒、68℃ 1分30秒)×30サイクル-68℃ 3分-16℃ストック
PCR産物をQIAquick PCR purification kit(QIAGEN社製)で精製した後、制限酵素NotIとSpeIで消化し、アガロースゲル電気泳動を行なって約1.5kbの断片を切り出し、MinElute Gel extraction kit(QIAGEN社製)で精製し、Insert部分とした。プラスミドpESCpgkgap-HISを制限酵素NotIとSpeIで消化し、約7.4kbの断片を切り出し、MinElute Gel extraction kit(QIAGEN社製)で精製し、Vector部分とした。
プラスミドpESCpgkgap-HIS-Yfdxを制限酵素NotIとSpeIで消化し、約7.9kbの断片を切り出し、MinElute Gel extraction kit(QIAGEN社製)で精製し、Vector部分とした。また、プラスミドpESCpgkgap-HIS-Yfdrを制限酵素NotIとSpeIで消化し、約1.5kbの断片を切り出し、MinElute Gel extraction kit(QIAGEN社製)で精製し、Insert部分とした。上記2つの断片をLigation-Convenience Kit(ニッポンジーン社製)を用いてライゲーションし、大腸菌HST08(タカラバイオ社製)を形質転換した。50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地上で生育したコロニーを50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で培養しプラスミドを抽出した。抽出には、QIAprep spin Miniprep Kit(QIAGEN社製)を用いた。得られた
プラスミドをpESCpgkgap-HIS-YfdxYfdrと命名した(図4)。
上述したように作製した各種発現プラスミドを用いて酵母S.cerevisia YPH499株を形質転換した。形質転換にはFrozen Yeast Transformation Kit II(ZymoResearch社製)を用い、添付のマニュアルに従った。SD-Ura,His(BIO101社製)+adenine hemisulfate寒天培地上で生育したクローンを形質転換体として、アルカン生産性評価に供試した。なお、本例では、pESCpgkgap-URA-alkSを用いてalkS遺伝子を導入した形質転換体、pESCpgkgap-URA-alkS及びpESCpgkgap-HIS-Yfdxを用いてalkS遺伝子及びフェレドキシン遺伝子を導入した形質転換体、pESCpgkgap-URA-alkS及びpESCpgkgap-HIS-Yfdrを用いてalkS遺伝子及びフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子を導入した形質転換体、並びにpESCpgkgap-URA-alkS及びpESCpgkgap-HIS-YfdxYfdr/YPH499を用いてalkS遺伝子、フェレドキシン遺伝子及びフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子を導入した形質転換体を作製した。
上述のように作製した4種類の形質転換体を3mLのSD-Ura,His+adenine hemisulfate液体培地に植菌し、30℃で3日間培養した。得られた培養液の一部を最終濃度が1mMとなるようにTetradecanalを添加した5mLのSD-Ura,His+adenine hemisulfate液体培地に植菌し、30℃で3,4日間培養した。5mlの培養液を、室温、3000rpmで10min遠心し、上清を除き、飽和食塩水500μlに懸濁した後、20ml容バイアル瓶(Agilent社製)に移して、GC/MS分析を行なった。
ヘッドスペースサンプラー HP7694(Hewlett-Packard社製)
Zone Temp Oven 80℃
Loop 150℃
TR.LINE 200℃
Event Time GC CYCLE TIME 10min
Vial EQ TIME 15min
PRESSURIZ. TIME 0.50min
Loop Fill TIME 0.2min
Loop EQ TIME 0.2min
INJECT TIME 1.00min
Vial Parameter SHAKE HIGH
他 バイアル加圧 15psi
ループサイズ 3ml
GC/MS HP6890/5973 GC/MSシステム(Hewlett-Packard, Wilmington, DE)
使用カラム HP-INNOWAX(Agilent製:19091N-213)
インレット温度 260℃
検出器温度 260℃
インジェクションパラメーター
スプリット比 1/20
キャリアーガス ヘリウム1.0ml/分
オーブン加熱条件
60℃ 1分
25℃/分で260℃まで加熱
260℃ 1分
PRESSURIZ. TIME 0.50min
Loop Fill TIME 0.2min
Loop EQ TIME 0.2min
INJECT TIME 1.00min
Vial Parameter SHAKE HIGH
他 バイアル加圧 15psi
ループサイズ 3ml
本実験例では、アルカン生産能を付与するとともに、フェレドキシン遺伝子及び/又はフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子を導入した組換え体大腸菌を作製し、フェレドキシン、フェレドキシンNADPHレダクターゼのアルカン生産性能に対する効果確認した。
Nostoc sp. ATCC27437のゲノムDNAを鋳型にしてPCRによりアルカン合成酵素遺伝子(alkS遺伝子)を含むDNA断片を取得した。PCRにはポリメラーゼとしてKOD-Plus-Ver.2(東洋紡社製)を用いた。alkS遺伝子を含むDNA断片を増幅するため以下の一対のプライマーを設計し、反応液組成及び反応サイクル条件は下記に示すとおりとした。
(Primer #2)alkS_R, 5'-GCGCGCCTCGAGTTAAGCTGCTGTAAGTCCGTAG-3'(配列番号20)
〔反応液組成〕
Nostoc sp. ATCC27437ゲノムDNA(100 ng/μl) 1μl
10×buffer for KOD-Plus-Ver.2 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 4μl
Primer #1(10μM) 1.5μl
Primer #2(10μM) 1.5μl
KOD-Plus (1U/μl) 1μl
dH2O 31μl
50μl
〔反応サイクル条件〕
94℃ 2分-(98℃ 10秒、55℃ 30秒、68℃ 1分30秒)×30サイクル-68℃ 3分-16℃ストック
大腸菌W3110のゲノムDNAを鋳型にしてPCRによりフェレドキシン遺伝子(Efdx)遺伝子を含むDNA断片を取得した。PCRにはKOD-Plus-Ver.2 (東洋紡社製)を用いた。Efdx遺伝子を含むDNA断片を増幅するため以下の一対のプライマーを設計し、反応液組成及び反応サイクル条件は下記に示すとおりとした。
(Primer #2)Efdx_R, 5'-CAGACTCGAGTTAATGCTCACGCGCATGGTTG-3'(配列番号22)
〔反応液組成〕
W3110 genome DNA(100 ng/μl) 1μl
10×buffer for KOD-Plus-Ver.2 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 4μl
Primer #1(10μM) 1.5μl
Primer #2(10μM) 1.5μl
KOD-Plus (1U/μl) 1μl
dH2O 31μl
50μl
〔反応サイクル条件〕
94℃ 2分-(98℃ 10秒、55℃ 30秒、68℃ 1分30秒)×30サイクル-68℃ 3分-4℃ストック
大腸菌W3110のゲノムDNAを鋳型にしてPCRによりフェレドキシンNADPHレダクターゼ(Efdr)遺伝子を含むDNA断片を取得した。PCRにはKOD-Plus-Ver.2 (東洋紡社製)を用いた。Efdr遺伝子を含むDNA断片を増幅するため以下の一対のプライマーを設計し、反応液組成及び反応サイクル条件は下記に示すとおりとした。
(Primer #2)Efdr_R, 5'-ATTCGGATCCTTACCAGTAATGCTCCGCTGTC-3'(配列番号26)
〔反応液組成〕
W3110 genome DNA(100 ng/μl) 1μl
10×buffer for KOD-Plus-Ver.2 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 4μl
Primer #1(10μM) 1.5μl
Primer #2(10μM) 1.5μl
KOD-Plus (1U/μl) 1μl
dH2O 31μl
50μl
〔反応サイクル条件〕
94℃ 2分-(98℃ 10秒、55℃ 30秒、68℃ 1分30秒)×30サイクル-68℃ 3分-4℃ストック
PCR産物をQIAquick PCR purification kit(QIAGEN社製)で精製した後、制限酵素NcoIとBamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動を行なって約0.8kbの断片を切り出し、MinElute Gel extraction kit(QIAGEN社製)で精製し、Insert部分とした。プラスミドpCOLADuet-1(ノバジェン社製)を制限酵素NcoIとBamHIで消化し、約3.7kbの断片を切り出し、MinElute Gel extraction kit(QIAGEN社製)で精製し、Vector部分とした。
プラスミドEfdx-pCOLAを制限酵素NcoIとBamHIで消化し、約4.1kbの断片を切り出し、MinElute Gel extraction kit(QIAGEN社製)で精製し、Vector部分とした。また、プラスミドEfdr-pCOLAを制限酵素NcoIとBamHIで消化し、約0.8kbの断片を切り出し、MinElute Gel extraction kit(QIAGEN社製)で精製し、Insert部分とした。上記2つの断片をLigation-Convenience Kit(ニッポンジーン社製)を用いてライゲーションし、大腸菌HST08(タカラバイオ社製)を形質転換した。50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地上で生育したコロニーを50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で培養しプラスミドを抽出した。抽出には、QIAprep spin Miniprep Kit(QIAGEN社製)を用いた。得られたプラスミドをEfdxEfdr-pCOLAと命名した(図9)。
上述したように作製した各種発現プラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)株(ノバジェン社製)を形質転換した。形質転換は添付のマニュアルに従った。ストレプトマイシンおよびカナマイシンを各50μg/mlずつを含むLB寒天培地上で生育したクローンを形質転換体として、アルカン生産性評価に供試した。なお、本例では、alkS_pCDFを用いてalkS遺伝子を導入した形質転換体、alkS_pCDF及びEfdx-pCOLAを用いてalkS遺伝子及びフェレドキシン遺伝子を導入した形質転換体、alkS_pCDF及びEfdr-pCOLAを用いてalkS遺伝子及びフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子を導入した形質転換体、alkS_pCDF及びEfdxEfdr-pCOLAを用いてalkS遺伝子、フェレドキシン遺伝子及びフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子を導入した形質転換体を作製した。
上述のように作製した4種類の形質転換体を3mLのLB-Sm、Km(各50μg/ml)液体培地に植菌し、37℃で一晩培養した。得られた培養液の一部を最終濃度が1mMとなるようにTetradecanalおよびIPTGを添加した5mLのLB-Sm、Km(各50μg/ml)液体培地に植菌し、30℃で3,4日間培養した。5mlの培養液を、室温、3000rpmで10min遠心して上清を除き、飽和食塩水500μlに懸濁した後、20ml容バイアル瓶(Agilent社製)に移して、GC/MS分析を行なった。
Claims (3)
- アルデヒドをアルカンに変換する活性を有するアルカン合成酵素をコードするアルカン合成酵素遺伝子、フェレドキシン遺伝子及びフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子が導入されたアルカン合成能を有する組換え酵母を培地にて培養し、当該培地にアルカンを生産する、アルカンの製造方法。
- 炭素数9〜16のアルカンを製造することを特徴とする請求項1記載のアルカンの製造方法。
- アルデヒドをアルカンに変換する活性を有するアルカン合成酵素をコードするアルカン合成酵素遺伝子、フェレドキシン遺伝子及びフェレドキシンNADPHレダクターゼ遺伝子が導入された、アルカン合成能を有する組換え酵母。
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