DE112011105535T5

DE112011105535T5 - Verfahren zum Herstellen eines Alkans und rekombinanter Mikroorganismus, der in der Lage ist, das Alkan zu synthetisieren

Info

Publication number: DE112011105535T5
Application number: DE112011105535.8T
Authority: DE
Inventors: Masaaki Mori
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2011-08-15
Filing date: 2011-08-15
Publication date: 2014-05-08
Anticipated expiration: 2031-08-16
Also published as: JPWO2013024527A1; US10662443B2; BR112014003546A2; CN103717745B; DE112011105535B4; JP5761352B2; WO2013024527A1; CN103717745A; US20140186915A1

Abstract

Ein Verfahren zum Herstellen eines Alkans und rekombinanter Mikroorganismus mit guter Alkanproduktivität in einem Reaktionssystem zum Synthetisieren des Alkans durch Alkansynthaseaktivität werden bereitgestellt. Die Alkanproduktivität ist in einem System zum Synthetisieren des Alkans durch Alkansynthase in Gegenwart von Ferredoxin bedeutend gesteigert. Insbesondere umfasst das Verfahren zum Herstellen des Alkans nach der vorliegenden Erfindung das Synthetisieren des Alkans durch Alkansynthase in Gegenwart von Ferredoxin.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Alkans, das zum Beispiel für einen Biodieselkraftstoff verwendet werden kann und einen rekombinanten Mikroorganismus, der in der Lage ist, das Alkan zu synthetisieren.
Stand der Technik
Im Erdöl enthaltene Alkane werden nach Reinigung durch fraktionelle Destillation für verschiedene Anwendungen verwendet. Darüber hinaus werden Alkane nicht nur verbreitet als Rohmaterial in der chemischen Industrie verwendet, sondern sie werden auch als Hauptbestandteil für Dieselkraftstoff verwendet, der aus Erdöl erhalten wird. Ein Beispiel aus dem Bereich der Biotechnologie zum Herstellen eines Alkans ist im Patentdokument 1 offenbart. Patentdokument 1 offenbart einen Versuch des Synthetisierens eines Alkans mit rekombinanten Escherichia coli, in die ein von Blaugrünalgen abgeleitetes Alkansynthasegen und ein Acyl-CoA-Reduktasegen eingebracht wurden.
Darüber hinaus offenbart Patentdokument 2 eine Mikroalge (Pseudochoricystis ellipsoidea), die in der Lage ist, C_10-25 Kohlenwasserstoffe herzustellen. Ausserdem offenbart Patentdokument 3 eine Technologie zum Synthetisieren eines Alkans unter Verwendung von Hefe, die über eine Fettsäurealdehyddecarbonylaseaktivität verfügt, um die Umwandlung eines Aldehyds zu einem Alkan zu katalysieren. Darüber hinaus offenbart Nicht-Patentdokument 1 ein Verfahren zum Synthetisieren eines Alkans aus einem Aldehyd unter Verwendung eines P450-Enzyms.
Derweil offenbart Patentdokument 4 ein Verfahren für die Biosynthese von α,ω-Alkandiol durch kultivieren rekombinanter Escherichia coli, die ein CYP153-Alkan-1-Monooxygenasegen, ein Ferredoxingen und ein Ferredoxinreduktasegen in einem Medium exprimieren, das ein Alkan oder Alkanmonool enthält.
Wie oben beschrieben könnte, obgleich rekombinante Mikroorganismen, die Alkansynthasegene exprimieren, und Mikroorganismen, die in der Lage sind Alkane zu synthetisieren, bekannt sind, ihre Alkanproduktivität nicht ausreichend gewesen sein.
Stand der Technik Dokumente
Patentdokumente

Patentdokument 1: WO 2009/140695
Patentdokument 2: WO 2006/109588
Patentdokument 3: JP Patentveröffentlichung (Kohyo) No. 2010-528627A
Patentdokument 4: JP Patentveröffentlichung (Kokai) No. 2007-74959A

Nicht-Patentdokumente

Nicht-Patentdokument 1: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 10000–10004

Zusammenfassung der Erfindung
Von der Erfindung zu lösende Aufgaben
Angesichts der obigen Umstände ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen eines Alkans und einen rekombinaten Mikroorganismus mit guter Alkanproduktivität in einen Reaktionssystem zum Synthetisieren des Alkans durch Alkansynthaseaktivität bereitzustellen.
Mittel zum Lösen der Aufgabe
Als Ergebnis intensiver Forschungsbemühungen, um das obige Ziel zu erreichen, haben die Erfinder herausgefunden, dass die Alkanproduktivität in einem System zum Synthetisieren des Alkans durch Alkansynthase in Gegenwart von Ferredoxin signifikant verbessert wird. Somit haben die Erfinder die vorliegende Erfindung vollendet.
Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung folgende Punkte (1) bis (14).

(1) Verfahren zum Herstellen eines Alkanes, welches das Synthetisieren des Alkans durch Alkansynthase in Gegenwart von Ferredoxin umfasst.
(2) Herstellen des Alkans nach (1), wobei das Alkan durch einen Mikroorganismus synthetisiert wird, der in der Lage ist, das Alkan zu synthetisieren.
(3) Verfahren zum Herstellen des Alkans nach (2), wobei der Mikroorganismus ein rekombinanter Mikroorganismus ist, in den ein Alkansynthasegen eingefügt ist.
(4) Verfahren zum Herstellen des Alkans nach (2), wobei der Mikroorganismus ein rekombinanter Mikroorganismus ist, in den ein Ferredoxingen eingefügt ist.
(5) Verfahren zum Herstellen des Alkans nach (2), wobei der Mikroorganismus ein rekombinanter Mikroorganismus ist, in den ein Alkansynthesegen und ein Ferredoxingen eingefügt sind.
(6) Verfahren zum Herstellen des Alkans nach (1), wobei das Alkan in Gegenwart von Ferredoxin-NADPH-Reduktase zusätzlich zum Ferredoxin synthetisiert wird.
(7) Verfahren zum Herstellen des Alkans nach (6), wobei das Alkan durch einen Mikroorganismus synthetisiert wird, der in der Lage ist, das Alkan zu synthetisieren, in den ein Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen eingefügt ist.
(8) Verfahren zum Herstellen des Alkans nach einem von (3) bis (5) und (7), wobei der rekombinante Mikroorganismus von Hefe abgeleitet ist.
(9) Verfahren zum Herstellen des Alkans nach (1), wobei die Alkansynthase eine Aktivität zum Umwandeln eines Aldehyds zu einem Alkan hat.
(10) Verfahren zum Herstellen des Alkans nach (1), welches das Herstellen eines C_9-16 Alkans umfasst.
(11) Rekombinanter Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Alkan zu Synthetisieren, in den ein Ferredoxingen eingefügt wurde.
(12) Rekombinanter Mikroorganismus nach (11), in den ferner ein Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen eingebracht wurde.
(13) Rekombinanter Mikroorganismus nach (11), wobei die Fähigkeit, das Alkan zu Synthetisieren, durch Einfügen des Alkansynthasegens verliehen wurde.
(14) Rekombinanter Mikroorganismus nach (11), der eine rekombinante Hefe ist.

Wirkungen der Erfindung
Nach der vorliegenden Erfindung kann die Effizienz der Alkansynthese in einem Reaktionssystem zum Synthetisieren eines Alkans durch Alkansynthase und insbesondere die Alkanproduktivität verbessert werden. Insbesondere kann mit dem Verfahren zum Herstellen des Alkans nach der vorliegenden Erfindung das Alkan mit einem sehr hohen Grad an Herstellungseffizienz hergestellt werden. Somit kann das Verfahren zum Senken von Alkanproduktionskosten beitragen. Außerdem weist der rekombinante Mikroorganismus nach der vorliegenden Erfindung eine größere Leistungsfähigkeit zum Synthetisieren des Alkans als ein herkömmlicher Mikroorganismus auf, der in der Lage ist, das Alkan zu synthetisieren, und ist somit sehr nützlich für die Alkanherstellung.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt schematisch den Aufbau von pESCpgkgap-URA-alkS dar.
2 stellt schematisch den Aufbau von pESCpgkgap-HIS-Yfdx dar.
3 stellt schematisch den Aufbau von pESCpgkgap-HIS-Yfdr dar.
4 stellt schematisch den Aufbau von pESCpgkgap-HIS-YfdxYfdr dar.
5 ist ein charakteristisches Diagramm, welches die Mengen des Alkans (Tridekans) darstellt, die von den unterschiedlichen Transformanten synthetisiert wurden, die in den Beispielen hergestellt wurden.
6 stellt schematisch den Aufbau von alkS_pCDF dar.
7 stellt schematisch den Aufbau von Efdx-pCOLA dar.
8 stellt schematisch den Aufbau von Efdr-pCOLA dar.
9 stellt schematisch den Aufbau von EfdxEfdr-pCOLA dar.
10 ist ein charakteristisches Diagramm, das die Mengen des Alkans (Tridekans) darstellt, die von den verschiedenen Transformanten synthetisiert wurden, die in den Beispielen hergestellt wurden.
Ausführungsformen zum Durchführen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend mit mehr Detail unter Bezugnahme auf die Figuren und Beispiele beschrieben.
Nach der vorliegenden Erfindung wird dafür gesorgt, dass Ferredoxin in einem System zum Synthetisieren eines Alkans durch Alkansynthase vorliegt, so dass die Alkanproduktivität verbessert wird. Hier bezeichnet der Begriff „System zum Synthetisieren eines Alkans durch Alkansynthase” in vivo Systeme, die Mikroorganismen, die in der Lage sind, ein Alkan zu synthetisieren, und rekombinante Mikroorganismen, mit der verliehenen Fähigkeit, ein Alkan zu synthetisieren, umfassen und in vitro Systeme zum Synthetisieren eines Alkans durch Alkansynthase in Reaktionslösungen, die Substrate enthalten. In jedem dieser Systeme zum Synthetisieren eines Alkans ist die Alkanproduktivität in Gegenwart von Ferredoxin im Vergleich zu der in Abwesenheit von Ferredoxin stärker verbessert.
Darüber hinaus wird dafür gesorgt, dass zusätzlich zu Ferredoxin Ferredoxin-NADPH-Reduktase (kann auch als „Ferredoxin-NADP⁺-Reduktase” bezeichnet werden) vorliegt, so dass sie in der Lage ist, die Alkanproduktivität noch bedeutender zu verbessern. Insbesondere wird dafür gesorgt, dass Ferredoxin und Ferredoxin-NADPH-Reduktase in einem System zum Synthetisieren des Alkans durch Alkansynthase vorliegen, so dass die Alkanproduktivität im Vergleich zu den Fällen, in denen Ferredoxin alleine vorliegt, noch bedeutender verbessert ist.
Ferredoxin
Ferredoxin ist ein Eisenschwefelprotein, das Eisenschwefelcluster (Fe-S Cluster) enthält, und das als Elektronenträger funktioniert. Es kann zum Beispiel durch Einfügen eines Gens, das für Ferredoxin kodiert, in einem Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Alkan zu synthetisieren, oder in einen rekombinanten Mikroorganismus mit der verliehenen Fähigkeit, ein Alkan zu synthetisieren, dafür gesorgt werden, dass Ferredoxin in einem System zum synthetisieren des Alkans durch Alkansynthase vorliegt. Ein solches Ferredoxingen ist nicht sonderlich beschränkt, ein Ferredoxingen von jeglichem Organismus kann verwendet werden. Zum Beispiel können mit Bezugnahme auf eine datenbankregistrierte Geninformation, wie DDBJ/EMBL/GenBank International Nucleotide Sequence Database die Nukleotidsequenzen für Ferredoxingene, und die Aminosäuresequenzen von Ferredoxin verschiedener Spezies von Organismen beschrieben werden.
Sobald die Nukleotidsequenz eines Ferredoxingens beschrieben werden kann, kann das Gen nach einem Standardverfahren isoliert werden. Zum Beispiel kann ein vorbestimmtes organismusabgeleitetes Ferredoxingen in seiner Gesamtheit auf Basis der somit spezifizierten Nukleotidsequenz synthetisiert werden. Alternativ können Primer auf Basis der somit spezifizierten Nukleotidsequenz entworfen werden und daraufhin kann ein Ferredoxingen auch durch PCR unter Verwendung der Primer und des Genoms eines vorbestimmten Organismus als Templat isoliert werden.
Insbesondere, wenn ein Ferredoxingen in einem Mikroorganismus eingefügt wird, der in der Lage ist, ein Alkan zu synthetisieren, oder in einen rekombinanten Mikroorganismus, der die verliehene Fähigkeit hat, das Alkan zu synthetisieren, ist ein bevorzugtes Ferredoxingen vom relevanten Mikroorganismus abgeleitet. Zum Beispiel wird, wenn hier zu verwendende rekombinante Hefe als Ergebnis der Einfügung von Genen, die mit der Alkansynthese in Zusammenhang stehen, in eine vorbestimmte Hefe die Fähigkeit erworben hat, ein Alkan zu synthetisieren, das relevante hefeabgeleitete Ferredoxingen in die Zelle eingebracht.
Insbesondere wird bevorzugt ein S. cerevisiae abgeleitetes Ferredoxingen für rekombinante Hefe (rekombinante S. cerevisiae) verwendet, welche die erworbene Fähigkeit aufweist, ein Alkan zu synthetisieren. Außerdem ist ein S. cerevisiae-abgeleitetes Ferredoxingen als YAH1 Gen (oder Yfdx Gen) bekannt. Die Nukleotidsequenz des S. cerevisiae-abgeleiteten Ferredoxingens und die Aminosäuresequenz des Ferredoxins, für welches das Gen kodiert, sind jeweils in SEQ ID NO: 1 und 2 dargestellt.
Außerdem ist ein Beispiel eines Ferredoxingens nicht auf das Gen beschränkt, das für die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, kodiert, und es kann ein Gen sein, das für ein Protein kodiert, das als Ferredoxin funktioniert und das eine Aminosäuresequenz umfasst, die 70% oder mehr Identität, bevorzugt 80% oder mehr Identität, stärker bevorzugt 90% oder mehr Identität, weiter bevorzugt 95% Identität und am meisten bevorzugt 98% Identität oder mehr mit der Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist. Hier bezeichnet der Wert der Identität einen Wert, der basierend auf Standardeinstellungen unter Verwendung des BLASTN oder BLASTX Programmes, die mit dem Blastreiberhythmus versehen sind, berechnet werden kann. Insbesondere wird der Wert der Identität durch Berechnen der Anzahl von Aminosäureresten, die vollständig mit den Anderen übereinstimmen, wenn eine paarweise Abgleichsanalyse für ein Paar von Aminosäuresequenzen durchgeführt wird und dann durch Feststellen des Anteils der Anzahl solcher Reste unter allen verglichenen Aminosäureresten aufgefunden.
Darüber hinaus ist ein Beispiel eines Ferredoxingens nicht auf das Gen beschränkt, das die Aminosäuresequenz kodiert, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, und es kann ein Gen sein, das für ein Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Deletion, eine Substitution, eine Addition oder eine Insertion von 1 bis 20 Aminosäuren, bevorzugt 1 bis 15 Aminosäuren, stärker bevorzugt 1 bis 10 Aminosäuren und weiterhin bevorzugt 1 bis 5 Aminosäuren im Bezug auf die Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, und das als Ferredoxin funktioniert.
Darüber hinaus ist ein Beispiel eines Ferredoxingens nicht auf das Gen beschränkt, das die Nukleotidsequenz aufweist, die in SEQ ID No: 1 dargestellt ist, und es kann ein Gen sein, das unter stringenten Bedingungen mit der Gesamtheit oder einem Teil eines komplimentären Stranges DNA hybridisiert, der die Nukleotiksequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist und für ein Protein kodiert, das als Ferredoxin funktioniert. Der Begriff „stringente Bedingungen” verweist hier auf Bedingungen, bei denen ausdrücklich ein spezifisches Hybridkonstrukt gebildet, aber jegliches unspezifische Hybridkonstrukt nicht gebildet wird. Zum Beispiel können solche Bedingungen auf angemessene Weise durch Referenz zum molekularen Klonen bestimmt werden: A Laboratory Manual (dritte Ausgabe). Insbesondere kann Stringenz basierend auf der Temperatur der Konzentration von Salzen festgelegt werden, die in einer Lösung für Southern-Hybridisierung enthalten sind sowie der Temperatur und der Konzentration von Salzen, die in einer Lösung für einen Waschschritt der Southern-Hybridisierung enthalten sind.
Zusätzlich kann als Verfahren zum Herstellen von DNA, die eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die eine Deletion, eine Substitution, eine Addition oder eine Insertion vorherbestimmter Aminosäuren in Bezug auf die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, aufweist; oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die sich von der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, unterscheidet, jede herkömmlich bekannte Technik ohne besondere Beschränkung auf angemessene Weise verwendet werden. Zum Beispiel können vorbestimmte Nukleotide unter Verwendung ortsspezifischer Mutagenese ersetzt werden. Beispiele ortsspezifischer Mutagenese umfassen: T. Kunkel's ortsspezifische Mutagenese (Kunkel, T. A. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 82, 488–492 (1985)), oder das Gapped-Duplex-Verfahren. Darüber hinaus kann die Mutagenese auch unter Verwendung eines Mutagenesekits ausgeführt werden, das ortsspezifische Mutagenese verwendet (z. B. Mutan-K (Takara Shuzo Co., Ltd.) und Mutan-G (Takara Shuzo Co., Ltd.)), oder eines LA PCR in vitro Mutageneseserienkits (Takara Shuzo Co., Ltd.).
Währenddessen wird, wenn dafür gesorgt wird, dass Ferredoxin in einem in vitro System zum Synthetisieren von Alkanen durch Alkansynthase in einer Reaktionslösung vorliegt, die ein Substrat enthält, Ferredoxin verwendet, welches das Produkt des obigen Ferredoxingens ist. Ferredoxin als Protein kann durch herkömmlich bekannte Techniken erhalten werden. Ferredoxin, das hier verwendet werden kann, kann in einem nicht aufgereinigten Zustand, einem teilweise aufgereinigten Zustand oder einem aufgereinigten Zustand vorliegen.
Ferredoxin-NADPH-Reduktase
Ferredoxin-NADPH-Reduktase ist ein Enzym, das die Oxidations-Reduktionsreaktion zwischen Ferredoxin und NADPH katalysiert. Zum Beispiel durch Einfügen eines Gens, das für Ferredoxin kodiert und eines Gens, das für Ferredoxin-NADPH-Reduktase kodiert in einem Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Alkan zu synthetisieren, oder einen rekombinanten Mikroorganismus, dem die Fähigkeit verliehen wurde, ein Alkan zu synthetisieren, kann dafür gesorgt werden, dass Ferredoxin-NADPH-Reduktase zusammen mit Ferredoxin in einem System zum Synthetisieren eines Alkans durch Alkansynthase vorliegt. Als Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen kann ein Gen von irgendeinem Organismus ohne besondere Beschränkungen verwendet werden. Zum Beispiel können mit Bezug auf eine datenbankregistrierte Geninformation, wie die DDBJ/EMBL/GenBank Iternational Nukleotide Sequence Database, Nukleotidsequenzen für Ferredoxin-NADPH-Reduktasegene und die Aminosäuresequenzen von Ferredoxin-NADPH-Reduktase von verschiedenen biologischen Spezies beschrieben werden.
Sobald die Nukleotidsequenz eines Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens beschrieben werden kann, kann das Gen durch ein Standardverfahren isoliert werden. Zum Beispiel kann ein vorbestimmtes von einem Organismus abgeleitetes Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen basierend auf der somit beschriebenen Nukleotidsequenz ganz synthetisiert werden, oder es können basierend auf der somit beschriebenen Nukleotidsequenz Primer entworfen werden, und das Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen kann dann durch PCR unter Verwendung des Genoms des vorbestimmten Organismus als Templat und der Primer isoliert werden.
Insbesondere wenn ein Ferredoxingen und ein Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen in einem Mikroorganismus eingefügt werden, der in der Lage ist, ein Alkan zu synthetisieren oder in einen rekombinanten Mikroorganismus, der die verliehene Fähigkeit aufweist, ein Alkan zu synthetisieren, ist ein bevorzugtes Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen ein Gen, das vom relevanten Mikroorganismus abgeleitet wurde. Darüber hinaus ist ein Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen stärker bevorzugt ein Gen, das vom gleichen Mikroorganismus abgeleitet ist, wie dem, von dem ein einzubringendes Ferredoxingen abgeleitet wird. Zum Beispiel wenn hier zu verwendende rekombinante Hefe als Ergebnis der Einfügung eines mit Alkansynthese in Zusammenhang stehenden Gens in eine vorbestimmte Hefe die Fähigkeit angenommen hat, Alkane zu synthetisieren, werden das Ferredoxingen und das Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen eingefügt, die von der relevanten Hefe abgeleitet sind.
Insbesondere werden das S. cerevisiae-abgeleitete Ferredoxingen und das S. cerevisiae-abgeleitete Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen bevorzugt für rekombinante Hefe (rekombinante S. cerevisiae) verwendet, welche die erworbene Fähigkeit aufweist, ein Alkan zu synthetisieren. Außerdem ist das S. cerevisiae-abgeleitete Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen als ARH1 Gen (oder Yfdr Gen) bekannt. Die Nukleotidsequenz des S. cerevisiae-abgeleiteten Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens und die Aminosäuresequenz von Ferredoxin-NADPH-Reduktase, für die das Gen kodiert, sind jeweils in SEQ ID NO: 3 und 4 dargestellt.
Außerdem ist ein Beispiel eines Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens nicht auf das Gen beschränkt, das für die Aminosäuresequenz kodiert, die in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, und es kann auch ein Gen sein, das für ein Protein kodiert, das als Ferredoxin-NADPH-Reduktase funktioniert, und Aminosäuresequenzen umfasst, die 70% oder mehr Identität, bevorzugt 80% oder mehr Identität, stärker bevorzugt 90% oder mehr Identität, ferner bevorzugt 95% Identität oder mehr und am meisten bevorzugt 98% oder mehr Identität mit der Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist. Der Wert der Identität kann auf Basis von Standardeinstellungen unter Verwendung des BLASTN oder BLASTX Programms, das mit dem BLAST Algorithmus versehen ist, berechnet werden. Außerdem kann der Wert der Identität durch Berechnen der Anzahl von Aminosäureresten, die vollständig den Anderen entsprechen, wenn eine paarweise Abgleichsanalyse für ein Paar von Aminosäuresequenzen durchgeführt wird, und dann Ermitteln des Anteils der Zahl solcher Reste unter allen Aminosäureresten, die verglichen werden, aufgefunden werden.
Darüber hinaus ist ein Beispiel eines Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens nicht auf das Gen beschränkt, das für die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID No: 4 dargestellt ist, und es kann ein Gen sein, das für ein Protein kodiert, das Aminosäuresequenzen aufweist, die eine Deletion, eine Substitution, eine Addition oder eine Insertion von 1 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt 1 bis 40 Aminosäuren, stärker bevorzugt 1 bis 30 Aminosäuren und ferner bevorzugt 1 bis 20 Aminosäuren in Bezug auf die Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID No: 4 dargestellt ist, und als Ferredoxin-NADPH-Reduktase funktioniert.
Darüber hinaus ist ein Beispiel eines Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens nicht auf das Gen beschränkt, das die Nukleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID No: 3 dargestellt ist, und es kann ein Gen sein, das unter stringenten Bedingungen an die Gesamtheit oder einen Teil eines komplementären Stranges DNA hybridisiert, der die Nukleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID No: 3 dargestellt ist, und für ein Protein kodiert, das als Ferredoxin-NADPH-Reduktase funktioniert. Hier bezeichnet der Wert der Identität einen Wert, der basierend auf Standardeinstellungen unter Verwendung des BLASTN oder BLASTX Programms, die mit dem BLAST Algorithmus versehen sind, berechnet werden kann. Insbesondere wird der Wert der Identität durch Berechnen der Anzahl von Aminosäureresten, die vollständig mit den Anderen übereinstimmen, wenn eine paarweise Abgleichsanalyse für ein Paar von Aminosäuresequenzen durchgeführt wird, und dann durch Feststellen des Anteils der Anzahl solcher Reste unter allen verglichenen Aminosäureresten aufgefunden.
Darüber hinaus ist ein Beispiel eines Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens nicht auf das Gen beschränkt, das die Nukleotidsequenz aufweist, die in SEQ ID No: 3 dargestellt ist, und es kann ein Gen sein, das unter stringenten Bedingungen mit der Gesamtheit oder einem Teil eines komplimentären Stranges DNA hybridisiert, der die Nukleotiksequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 3 dargestellt ist und für ein Protein kodiert, das als Ferredoxin-NADPH-Reduktase funktioniert. Der Begriff „stringente Bedingungen” verweist hier auf Bedingungen, bei denen ausdrücklich ein spezifisches Hybridkonstrukt gebildet, aber jegliches unspezifische Hybridkonstrukt nicht gebildet wird. Zum Beispiel können solche Bedingungen auf angemessene Weise durch Referenz zum molekularen Klonen bestimmt werden: A Laboratory Manual (dritte Ausgabe). Insbesondere kann Stringenz basierend auf der Temperatur der Konzentration von Salzen festgelegt werden, die in einer Lösung für Southern-Hybridisierung enthalten sind, sowie der Temperatur und der Konzentration von Salzen, die in einer Lösung für einen Waschschritt der Southern-Hybridisierung enthalten sind.
Zusätzlich kann als Verfahren zum Herstellen von DNA, die eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die eine Deletion, eine Substitution, eine Addition oder eine Insertion vorherbestimmter Aminosäuren in Bezug auf die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, aufweist; oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die sich von der Nukleotidsequenz unterscheidet SEQ ID NO: 3 dargestellt ist, jede herkömmlich bekannte Technik ohne besondere Beschränkung auf angemessene Weise verwendet werden. Zum Beispiel können vorbestimmte Nukleotide unter Verwendung ortsspezifischer Mutagenese ersetzt werden. Beispiele ortsspezifischer Mutagenese umfassen: T. Kunkel's ortsspezifische Mutagenese (Kunkel, T. A. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 82, 488–492 (1985)), oder das Gapped-Duplex-Verfahren. Darüber hinaus kann die Mutagenese auch unter Verwendung eines Mutagenesekits ausgeführt werden, das ortsspezifische Mutagenese verwendet (z. B. Mutan-K (Takara Shuzo Co., Ltd.) und Mutan-G (Takara Shuzo Co., Ltd.)), oder eines LA PCR in vitro Mutageneseserienkits (Takara Shuzo Co., Ltd.).
Währenddessen wird, wenn dafür gesorgt wird, dass Ferredoxin und Ferredoxin-NADPH-Reduktase in einem in vitro System zum Synthetisieren eines Alkans durch Alkansynthase in einer Reaktionslösung vorliegen, die ein Substrat enthält, Ferredoxin-NADPH-Reduktase verwendet, die ein Produkt des oben beschriebenen Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens ist. Ferredoxin-NADPH-Reduktase als Protein kann durch herkömmlich bekannte Techniken erhalten werden. Ferredoxin-NADPH-Reduktase, die hier verwendet werden kann, kann in einem nicht-aufgereinigten Zustand, einem teilweisen aufgereinigten Zustand oder einem aufgereinigten Zustand vorliegen.
Rekombinanter Mikroorganismus
In der vorliegenden Erfindung ist ein Mikroorganismus, in den das obige Ferredoxingen und Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen eingefügt werden, ein Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Alkan zu synthetisieren oder ein rekombinanter Mikroorganismus, dem die Fähigkeit verliehen wurde, ein Alkan zu synthetisieren.
Beispiele eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Alkan zu synthetisieren, umfassen Synechococcus elongatus PCC7942, S. elongatus PCC6301, Synechocystis sp. PCC6803, Prochlorococcus marinus CCMP1986, Anabaena variabilis ATCC29413, Nostoc punctiforme PCC73102, Gloeobacter violaceus PCC7421, Nostoc sp. PCC7120, Cyanothece sp. PCC7425 und Cyanothese sp. ATCC51142 (Bezug: Sciene 30 July 2010, Vol. 329, No. 5991, pp. 559–562).
Ferner ist ein Beispiel eines rekombinanten Mikroorganismus, dem die Fähigkeit verliehen wurde, ein Alkan zu synthetisieren, ein rekombinanter Mikroorganismus, der durch Einfügen eines Alkansynthasegens hergestellt wurde, das von dem obigen Mikroorganismus isoliert wurde, der in der Lage ist, Alkan zu synthetisieren. Als Alkansynthasegene können zum Beispiel das alkS-Gen, das von Nostoc sp. ATCC27347 (PCC7120) isoliert wurde, und das Gen (beschrieben in Science, 30. Juli 2010, Vol. 329, No. 5991, pp. 559–562) und WO 2009/140695 ) verwendet werden. Insbesondere können zum Beispiel Alkansynthasegene und dergleichen verwendet werden, die von Nostoc punctiforme PCC73102, Synechococcus elongates PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803, Cyanothece sp. ATCC51142, Acaryochlloris marina MBIC11017, Gleobacter violaceus PCC7421 und Prochlorococcus marinus str. MIT9303 isoliert wurden.
Ein Beispiel eines Mikroorganismus, in den ein Alkansynthasegen eingefügt wird, ist Hefe. Beispiele von Hefe umfassen, sind aber nicht sonderlich beschränkt auf, Hefe der Gattung Pichia, wie Pichia stipitis, Hefe der Gattung Saccharomyces, wie Saccharomyces cerevisiae, und Hefe der Gattung Candida, wie Candida tropicalis und Candida prapsilosis. Von diesen Beispielen wird Saccharomyces cerevisiae als Mikroorganismus, in den ein Alkansynthasegen eingefügt wird, bevorzugt verwendet. Als Beispiel wird das Nostoc sp. ATCC27347-abgeleitete alkS Gen in Saccharomyces cerevisiae eingefügt und daraufhin wird die resultierende rekombinante Saccharomyces cerevisiae bevorzugt verwendet, die in der Lage ist, ein Alkan zu synthetisieren.
Das obige Ferredoxingen wird in das Genom eines Mikroorganismus als Wirt, wie in das Genom von Hefe, eingebracht, so dass ein rekombinanter Mikroorganismus als rekombinante Hefe hergestellt werden kann, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Zusätzlich zu dem obigen Ferredoxingen wird das obige Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen in das Genom eines Mikroorganismus als Wirt, wie das Genom von Hefe, eingebracht, so dass ein rekombinanter Mikroorganismus als rekombinante Hefe hergestellt werden kann, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Es wird zum Beispiel ein DNA-Fragment, das ein Ferredoxingen und ein Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen enthält, in einen Expressionsvektor und bevorzugt einen Mehrfachkopievektor ligiert, der in einem Wirtsmikroorganismus funktioniert, so dass rekombinante DNA hergestellt wird, und die rekombinante DNA wird dann zur Transformation in den Mikroorganismus eingebracht. Beispiele eines Expressionsvektors, der hier verwendet werden kann, umfassen einen Plasmidvektor und einen Chromosomentransfervektor, der in das Genom eines Wirtsorganismus aufgenommen werden kann, sind aber insbesondere nicht darauf beschränkt. Ein hierzu verwendender Expressionsvektor ist nicht sonderlich beschränkt und kann auf geeignete Weise abhängig von den Wirtsmikoorganismen von allen verfügbaren Expressionsvektoren ausgewählt werden. Außerdem umfassen Beispiele eines Expressionsvektors Plasmid-DNA, Bakteriophagen-DNA, Retrotransposon-DNA und künstliche chromosomale DNA (YAC: künstliches Hefechromosom).
Beispiele von Plasmid-DNA umfassen Escherichia coli-Hefe-Übertragungsvektoren vom YCp-type wie pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 und pAUR123, Escherichia coli-Hefe-Übertragungsvektoren vom YEp-Typ, wie pYES2 und YEp13, Escherichia coli-Hefe-Übertragungsvektoren vom YIp-Typ, wie pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pAUR101 und pAUR135, Escherichia coli-abgeleitete Plasmide (ColE-basierte Plasmide wie pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396 und pTrc99A, p15A-basierte Plasmide, wie pACYC177 und pACYC184 und pSC101-basierte Plasmide, wie pMW118, pMW119, pMW218 und pMW219), Agrobakterium-abgeleitete Plasmide (z. B. pBI101), Bacillus subtilis-abgeleitete Plasmide (z. B. pUB110 und pTP5). Beispiele von Phagen-DNA umfassen λ-Phagen (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 und λZAP), ϕX174, M12mp18 und M13mp19. Beispiele von Retrotransposons umfassen einen Ty-Faktor und dergleichen. Ein Beispiel eines YAC-Vektors ist pYACC2. Ferner können hier auch Tierviren, wie ein Retrovirus oder ein Vacciniavirus und Insektenvirusvektoren, wie Baculovirus, verwendet werden.
Ein Ferredoxingen und ein Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen sollten so in einen Expressionsvektor aufgenommen werden, dass jedes der Gene exprimiert werden kann. Der Ausdruck „... aufgenommen ... so dass jedes der Gene exprimiert werden kann” bedeutet, dass das Ferredoxingen und das Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen an vorbestimmte Promotoren ligiert und dann in einen Vektor aufgenommen werden, so dass die Gene unter der Kontrolle der Promotoren in einem Wirtsorganismus, in den das Gen eingebracht wurde, exprimiert werden. Zusätzlich zu einem Ferredoxingen und einem Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen können ein Promotor und ein Terminator, sofern erwünscht ein Cis-Element, wie ein Enhancer, ein Splice-Signal, ein polyA-Anfügungssignal, ein Selektionsmarker, eine ribosomale Bindesquenz (SD-Sequenz) und dergleichen mit einem Expressionsvektor ligiert werden. Darüber hinaus umfassen Beispiele eines Selektionsmarkers Antibiotikaresistenzgene, wie ein Ampicillinresistenzgen, ein Kanamycinresistenzgen und ein Hygromycinresistenzgen.
Außerdem kann jedes herkömmlich bekannte Verfahren auf geeignete Weise als Transformationsverfahren unter Verwendung eines Expressionsvektors verwendet werden. Beispiele eines Transformationsverfahrens umfassen ein Calciumchloridverfahren, ein Verfahren mit kompetenten Zellen, ein Protoplast- oder Spheroplastverfahren und ein Verfahren mit elektrischem Puls.
Dabei können ein Ferredoxingen und Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen so eingefügt werden, dass die Anzahl der Kopien dieser Gene gesteigert ist. Insbesondere können ein Ferredoxingen und ein Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen so eingebracht werden, dass die Vielzahl der Kopien davon in der chromosomalen DNA eines Mikroorganismus vorliegen. Die Vielzahl der Kopien eines Ferredoxingens und eines Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens können in die chromosomale DNA eines Mikroorganismus durch homologe Rekombination unter Verwendung einer Sequenz eingefügt werden, von der eine Vielzahl an Kopien auf der chromosomalen DNA als Ziel vorliegt.
Außerdem kann die Expression eines Ferredoxingens und eines Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens durch verschiedene Verfahren verbessert werden, zum Beispiel, durch Ersetzen von expressionsregulierenden Sequenzen (z. B. Promotoren) von endogenen oder eingebrachten Ferredoxin und Ferredoxin-NADPH-Reduktasegenen, die in der Lage sind, die Expressionsniveaus der Gene zu steigern, oder durch Einbringen einer Regulatorsequenz, die das Expressionsniveau eines vorbestimmten Gens steigert. Beispiele eines solchen Promotors, der starke Genexpression ermöglicht, umfassen einen lac Promotor, einen trp Promotor, einen trc Promotor und einen pL Promotor, sind aber insbesondere nicht darauf beschränkt. Ferner können endogene oder eingefügte Ferredoxin- und Ferredoxin-NADPH-Reduktasegene durch Einfügen von Mutationen in Expressionskontrollregionen für die Gene so verändert werden, dass sie auf höheren Niveaus exprimiert werden können.
Alkanherstellung
Wie oben beschrieben, kann nach der vorliegenden Erfindung ein Alkan mit guter Produktivität in einem in vivo System, wie einem Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Alkan zu synthetisieren, oder einem rekombinanten Mikroorganismus, dem die Fähigkeit, verliehen wurde, ein Alkan zu synthetisieren, oder in einem in vitro System zum Synthetisieren eines Alkans durch Alkansynthase in einer Reaktionslösung, die ein Substrat enthält, synthetisiert werden.
Mit einem System, das einen Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Alkan zu synthetisieren, oder einem rekombinanten Mikroorganismus verwendet, dem die Fähigkeit, ein Alkan zu synthetisieren, verliehen wurde, kann ein Alkan in einem Medium, das für diese Mikroorganismen geeignet ist, dadurch hergestellt werden, dass in dem Medium kultiviert wird. Insbesondere kann nach der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, ein Alkan durch Alkansynthase zu synthetisieren, verbessert werden und als Ergebnis kann die Alkanproduktivität verbessert werden.
Der Ausdruck „die Fähigkeit, ein Alkan zu synthetisieren, ist verbessert” bedeutet hier, dass die Aktivität der Alkansynthase, zum Umwandeln eines Aldehyds zu einem Alkan verbessert ist. Insbesondere ist aufgrund der Gegenwart von Ferredoxin die Reaktionseffizienz einer Reaktion verbessert, die von einer Alkansynthase durchgeführt wird, um ein Alkan unter Verwendung eines Aldehyds als Substrat zu synthetisieren. Zum Beispiel zeigt das AlkS Protein, das durch das alkS Gen, das vom obigen Nostoc sp. ATCC27347 (PCC7120) isoliert wurde, eine Aktivität zum Umwandeln von Tetradecanol zu Tetradecan. In Gegenwart von Ferredoxin kann das Protein Tetradecan in einer bedeutend höheren Menge synthetisieren als in Abwesenheit von Ferredoxin. Außerdem ermöglicht zu dieser Zeit die Gegenwart von Ferredoxin-NADPH-Reduktase zusätzlich zum Ferredoxin sogar, eine noch größere Menge von Tetradecan zu synthetisieren.
Auf ähnliche Weise wird bei einem in vitro System zum Synthetisieren eines Alkans durch Alkansynthase in einer Raktionslösung, die ein Substrat enthält, die Reaktionseffizienz einer Reaktion die von einer Alkansynthase durchgeführt wird, um ein Alkan unter Verwendung eines Aldehyds als Substrat zu synthetisieren durch die Gegenwart von Ferredoxin verbessert. Daher kann nach der vorliegenden Erfindung die Alkanproduktivität auch in diesem Reaktionssystem verbessert werden.
In der vorliegenden Erfindung ist ein Beispiel des hier herzustellenden Alkans nicht sonderlich beschränkt und umfasst ein Alkan mit einer Kohlenstoffatomanzahl, die von 9 bis 16 reicht und die bevorzugt von 13 bis 16 reicht. Diese Alkanbeispiele sind hochviskose Flüssigkeiten, die als Leichtöl (Dieseltreibstoff) oder Luftfahrttreibstoff verwendet werden können. Ein solches Alkan wird aus dem obigen in vivo oder in vitro Reaktionssystem nach einem herkömmlichen Verfahren isoliert und kann dann ausgereinigt werden.
Beispiele
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung detaillierter unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben, obgleich der technische Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wurde rekombinante Hefe dadurch hergestellt, dass ihr die Fähigkeit verliehen wurde, ein Alkan herzustellen und dass ein Ferredoxingen und/oder ein Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen in sie eingebracht wurden, wobei darauf folgend die Auswirkungen von Ferredoxin-NADPH-Reduktase auf die Alkanproduktivität bestätigt wurden.
Herstellung von pESCpgkgap-HIS

Zur konstitutiven Expression geklonter Gene wurden konstitutive Promotoren (Ppgk und Pgap) in einen pESC Vektor (STRATEGENE) eingefügt. Pgap ist ein Saccharomyces cerevisiae YPH499-abgeleiteter Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (gap) Gen Promotor. Zunächst wurde unter Verwendung von PCR ein DNA Fragment, das Pgap enthielt, erhalten, wobei genomische DNA als Templat verwendet wurde, die unter Verwendung von Gen-torukum (Takara Bio Inc.) aus dem YPH499 Hefestamm aufgereinigt wurde. Die hier verwendete Polymerase war KOD-Plus-Ver. 2 (Toyobo Co., Ltd.). Zur Amplifikation des DNA Fragments, das Pgap enthält, wurde das folgende Paar Primer entwickelt und die Zusammensetzung der Reaktionslösung und die Reaktionszyklenbedingungen waren wie folgt.

Zusammensetzung der Reaktionslösung

YPH499 genomische DNA (100 ng/μl)	1 μl
10 × Puffer für KOD-Plus-Ver.2	5 μl
2 mM dNTPs	5 μl
25 mM MgSO₄	4 μl
Primer #1 (10 μM)	1,5 μl
Primer #2 (10 μM)	1,5 μl
KOD-Plus (1 U/μl)	1 μl
dH₂O	31 μl
	50 μl

Reaktionszyklenbedingungen

95 Grad Celsius für 2 Minuten – (95 Grad Celsius für 30 Sekunden, 55 Grad Celsius für 30 Sekunden, 72 Grad Celsius für 2 Minuten) × 25 Zyklen – 72 Grad Celsius für 3 Minuten – 4 Grad Celsius Aufbewahrung)

Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines MinElute PCR Aufreinigungskits (QIAGEN) aufgereinigt und dann mit BamHI und EcoRI Restriktionsenzymen verdaut. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese wurde ein Fragment von 0,7 kbp ausgeschnitten und dann unter Verwendung eines MinElute Gel Extaktionskits (QIAGEN) aufgereinigt. Das Ergebnis wurde mit einem pESC-HIS Vektor ligiert, der mit BamHI und EcoRI Restriktionsenzymen verdaut worden war. Die so erhaltene Sequenz wurde sequenziert und dadurch der Aufbau des Zielplasmids bestätigt. Die Nukleotidsequenz von Pgap ist in SEQ ID NO: 7 dargestellt. Das hierdurch erhaltene Plasmid wurde pESCgap-HIS genannt.

Als Nächstes wurde wie folgt der Saccharomyces cerevisiae YPH499 abgeleitete Phosphoglyceratkinase (pgk) Gen Promotor, Ppgk, erhalten. Zuerst wurde durch PCR ein DNA-Fragment enthalten, das Ppgk enthielt, wobei genomische DNA, die unter Verwendung von Gen-torukun (Takara Bio Inc.) aus der Hefe YPH499 aufgereinigt worden war, als Templat verwendet wurde. Die hier verwendete Polymerase war KOD-Plus-Ver. 2 (Toyobo Co., Ltd.). Zur Amplifikation des DNA Fragments, das Ppgk enthielt, wurde das folgende Paar Primer entwickelt und die Zusammensetzung der Reaktionslösung und die Reaktionszyklenbedingungen waren wie folgt.

Zusammensetzung der Reaktionslösung

Reaktionszyklenbedingungen

95 Grad Celsius für 2 Minuten – (95 Celsius für 30 Sekunden, 55 Grad Celsius für 30 Sekunden, 72 Grad Celsius für 2 Minuten) × 25 Zyklen – 72 Grad Celsius für 3 Minuten – 4 Grad Celsius Lagerung.

Das PCR Produkt wurde unter Verwendung eines MinElute PCR Aufreinigungskits (QIAGEN) aufgereinigt und dann mit MunI und EcoRI Restriktionsenzymen verdaut. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese wurde ein 0,7 kbp Fragment ausgeschnitten und dann unter Verwendung eines MinElute Gel Extaktionskits (QIAGEN) aufgereiningt. Das Ergebnis wurde mit dem EcoRI Restriktionsenzym verdaut und daraufhin wurde es mit dem pESCgap-HIS Vektor ligiert, der einer BAP Behandlung unterworfen worden war. Es wurde durch Kolonien-PCR bestätigt, dass die Einfügung in der richtigen Richtung ligiert worden war und daraufhin war ein Plasmid hergestellt. Die Sequenz wurde sequenziert und dadurch wurde der Aufbau des Zielplasmids bestätigt. Die Nukleotidsequenz von Ppgk ist in SEQ ID NO: 10 dargestellt. Das hierdurch erhaltene Plasmid wurde pESCpgkgap-HIS genannt.
Herstellung von pESCpgkgap-URA
Das oben hergestellte pESCpgkgap-HIS wurde mit BamHI und NotI Restriktionsenzymen verdaut. Das hierdurch enthaltene 1,4 kbp Einfügungsfragment wurde mit einem pESC-URA Vektor ligiert, der mit BamHI und NotI Restriktionsenzymen verdaut worden war. Die hierdurch erhaltene Sequenz wurde sequenziert und daraufhin wurde der Aufbau des Zielplasmids bestätigt. Das hiermit erhaltene Plasmid wurde pESCpgkgap-URA genannt.
Herstellung des Plasmids (pESCpgkgap-URA-alkS) zur Expression des Nostoc sp. ATCC 27347-abgeleiteten Alkansynthasegens

Ein DNA Fragment, das ein Alkansynthasegen (alkS Gen) enthielt, wurde durch PCR erhalten, wobei die genomische DNA von Nostoc sp. AT27347 als Templat verwendet wurde. KOD-Plus-Ver. 2 (Toyobo Co., Ltd.) wurde für die PCR verwendet. Für die Amplifikation des DNA-Fragments, welches das alkS Gen enthielt, wurde das folgende Paar Primer entwickelt und die Zusammensetzung der Reaktionslösung und die Reaktionszyklenbedingungen waren wie folgt.

Zusammensetzung der Reaktionslösung

Nostoc sp. PCC27347 genomische DNA (100 ng/μl)	1 μl
10 × Puffer für KOD-Plus-Ver.2	5 μl
2 mM dNTPs	5 μl
25 mM MgSO₄	4 μl
Primer #1 (10 μM)	1,5 μl
Primer #2 (10 μM)	1,5 μl
KOD-Plus (1 U/μl)	1 μl
dH₂O	31 μl
	50 μl

Reaktionszyklenbedingungen

94 Grad Celsius für 2 Minuten – (98 Grad Celsius für 10 Sekunden, 55 Grad Celsius für 30 Sekunden, 68 Grad Celsius für 1 Minute und 30 Sekunden) × 30 Zyklen – 68 Grad Celsius für 3 Minuten – 16 Grad Celsius Lagerung.

Das PCR Produkt wurde unter Verwendung eines QIAquick PCR Aufreinigungskits (QIAGEN) aufgereinigt und daraufhin mit BamHI und XhoI Restriktionsenzymen verdaut. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese wurde ein Fragment von ungefähr 0,7 kb ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Einfügungsabschnitt erhalten wurde. Das pESCpgkgap-URA Plasmid wurde mit BamHI und XhoI Restriktionsenzymen verdaut. Ein Fragment von ungefähr 7,4 kb wurde ausgeschnitten und daraufhin mit einem MinElute Gelextraktionskit (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Vektorabschnitt erhalten wurde.
Die obigen, Einfügungsabschnitt und Vektorabschnitt, wurden unter Verwendung eines Ligation-Convenience Kits (Nippon Gene Co., Ltd.) ligiert, um Escherichia coli HST08 (Takara Bio Inc.) zu transformieren. Auf einem LB-Agar-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, gewachsene Kolonien wurden in einem LB-Flüssigmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert und daraufhin wurde ein Plasmid extrahiert. Ein QIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN) wurde für die Extraktion verwendet. Das erhaltene Plasmid wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die Sequenz richtig war. Das Plasmid wurde pESCpgkgap-URA-alkS genannt (1). Außerdem sind die Nukleotidsequenz des AlkS Gens und die Aminosäuresequenz des AlkS Proteins, für welches das Gen kodiert, jeweils in SEQ ID NO: 13 und 14 dargestellt.
Herstellung des Plasmids (pESCpgkgap-HIS-Yfdx) zur Expression des S. cerevisiae-abgeleiteten Ferredoxingens

Ein DNA Fragment, welches ein Ferredoxingen (Yfdx Gen) enthielt, wurde durch PCR erhalten, wobei die genomische DNA von S. cerevisiae YPH499 als Templat verwendet wurde. KOD-Plus-Ver. 2 (Toyobo Co., Ltd.) wurde für die PCR verwendet. Für die Amplifikation des DNA-Fragmentes, welches das Yfdx Gen enthielt, wurde das folgende Paar Primer entwickelt und die Zusammensetzung der Reaktionslösung und die Reaktionszyklenbedingungen waren wie folgt.

Zusammensetzung der Reaktionslösung

Reaktionszyklenbedingungen

94°C für zwei Minuten – (98°C für 10 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 68°C für 1 Minute und 30 Sekunden) × 30 Zyklen-68°C für 3 Minuten – 16°C Aufbewahrung.

Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines QIAquick PCR-Aufreinigungskits (QIAGEN) aufgereinigt und daraufhin mit BamHI und XhoI Restriktionsenzymen verdaut. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese wurde ein Fragment von ungefähr 0,5-kb ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute-Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Einfügungsabschnitt erhalten wurde. Das pESCpgkgap-HIS Plasmid wurde mit BamHI und XhoI Restriktionsenzymen verdaut. Ein Fragment von ungefähr 7,4-kb wurde ausgeschnitten und dann mit einem MinElute-Gelextraktionskit (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Vektorabschnitt erhalten wurde.
Die obigen, Einfügungsabschnitt und Vektorabschnitt, wurden unter Verwendung eines Ligation-Convenience-Kits (Nippon Gene Co., Ltd.) ligiert, um Escherichia coli HST08 (Takara Bio Inc.) zu transformieren. Auf einem LB-Agarmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wachsende Kolonien wurden in einem LB-Flüssigmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert und daraufhin wurde ein Plasmid extrahiert. Ein QIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN) wurde für die Extraktion verwendet. Das hierdurch erhaltene Plasmid wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die Sequenz richtig war und daraufhin pESCpgkgap-HIS-Yfdx genannt (2). Zusätzlich sind die Nukleotidsequenz des Yfdx-gens und die Aminosäuresequenz von Ferredoxin, für welches das Gen kodiert, jeweils in SEQ ID NO: 1 und 2 dargestellt.
Herstellung des Plasmids (pESCpgkgap-HIS-Yfdr) zur Expression des S. cerevisiae-abgeleiteten Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens

Ein DNA-Fragment, welches das Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen (Yfdr-Gen) enthielt, wurde durch PCR erhalten, wobei die genomische DNA von S. cerevisiae YPH499 als Templat verwendet wurde. KOD-Plus-Ver.2 (Toyobo Co., Ltd.) wurde für die PCR verwendet. Zur Amplifikation des DNA-Fragments, welches das Yfdr-Gen enthielt, wurde das folgende Paar Primer entwickelt und die Zusammensetzung der Reaktionslösung und die Reaktionszyklenbedingungen waren wie folgt:

Zusammensetzung der Reaktionslösung

Reaktionszyklenbedingungen

94°C für zwei Minuten – (98°C für 10 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 86°C für 1 Minute und 30 Sekunden) × 30 Zyklen – 68°C für 3 Minuten – 16°C Aufbewahrung.

Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines QIAquick PCR-Aufreinigungskits (QIAGEN) aufgereinigt und daraufhin mit NotI und SpeI Restriktionsenzymen verdaut. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese wurde in Fragment von ungefähr 1,5 kb ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Einfügungsabschnitt erhalten wurde. Das pESCpgkgap-HIS Plasmid wurde mit NotI und SpeI Restriktionsenyzmen verdaut. Ein Fragment von ungefähr 7,4 kb wurde ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Vektorabschnitt erhalten wurde.
Die obigen, Einfügungsabschnitt und Vektorabschnitt, wurden unter Verwendung eines Ligation-Convenience-Kits (Nippon Gene Co., Ltd.) ligiert, um Escherichia coli HST08 (Takara Bio Inc.) zu transformieren. Auf einem LB Agarmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, gewachsene Kolonien wurden in einem LB Medium kultiviert, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, um ein Plasmid zu extrahieren. Ein QIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN) wurde für die Extraktion verwendet. Das hierdurch erhaltene Plasmid wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die Sequenz richtig war und daraufhin pESCpgkgap-HIS-Yfdr genannt (3). Außerdem sind die Nukleotidsequenz des Yfdr-gens und die Aminosäuresequenz von Ferredoxin-NADPH-Reduktase, für welche das Gen kodiert, jeweils in SEQ ID NO: 3 und 4 dargestellt.
Herstellung des Plasmids (pESCpgkgap-HIS-YfdxYfdr) für die Co-Expression des Yfdx-Gens und des Yfdr-Gens
Das pESCpgkgap-HIS-Yfdx Plasmid wurde mit NotI und SpeI Restriktionsenzymen verdaut. Ein Fragment von ungefähr 7,9 kb wurde ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Vektorabschnitt erhalten wurde. Außerdem wurde das pESCpgkgap-HIS-Yfdr Plasmid mit NotI und SpeI Restriktionsenyzmen verdaut. Ein Fragment von ungefähr 1,5 kb wurde ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Einfügungsabschnitt erhalten wurde. Die beiden obigen Fragmente wurden unter Verwendung eines Ligation-Convenience-Kits (Nippon Gene Co., Ltd.) ligiert, um Escherichia coli HST08 (Takara Bio Inc.) zu transformieren. Auf einem LB Agarmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, gewachsene Kolonien wurden in einem LB Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert, um ein Plasmid zu extrahieren. Ein QIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN) wurde für die Extraktion verwendet. Das hierdurch erhaltene Plasmid wurde pESCpgkgap-HIS-Yfdx-Yfdr genannt (4).
Herstellung der S. cerevisiae YPH499 Transformante
Der Hefestamm S. cerevisiae YPH499 wurde mit verschiedenen Expressionsplasmiden transformiert, die wie oben beschrieben entworfen wurden. Ein Frozen Yeast Transformation Kit II (ZymoResearch) wurde für die Transformation nach den damit gelieferten Anleitungen verwendet. Klone, die auf SD-Ura,His (BIO101) + Adeninhemisulfatagarmedium gewachsen waren, wurden als Transformanten der Bewertung der Alkanproduktivität unterworfen. Außerdem wurden in diesem Beispiel die folgenden Transformanten hergestellt: eine Transformante, die durch Einbringen des alkS-Gens unter Verwendung von pESCpgkgap-URA-alkS hergestellt wurde, eine Transformante, die durch Einbringen des alkS-Gens und des Ferredoxingens unter Verwendung von pESCpgkgap-URA-alkS und pESCpgkgap-HIS-Yfdx hergestellt wurde; eine Transformante, die durch Einbringen des alkS-Gens und des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens unter Verwendung von pESCpgkgap-URA-alkS und pESCpgkgap-HIS-Yfdr hergestellt wurde; und eine Transformante, die durch Einbringen des alkS-Gens, des Ferredoxingens und des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens unter Verwendung von pESCpgkgap-URA-alkS und pESCpgkgap-HIS-YfdxYfdr/YPH499 hergestellt wurde.
Bewertung der Alkanproduktivität
Die vier oben hergestellten Arten von Transformanten wurden getrennt in SD-Ura, His + Adeninhemisulfatflüssigmedium (3 ml) inokuliert und daraufhin bei 30°C für drei Tage kultiviert. Ein Anteil jeder der so erhaltenen Kulturlösungen wurde in ein SD-Ura, His + Adeninhemisulfatflüssigmedium (5 ml) inokuliert, das ein 1 mM Tetradecanal enthielt, und daraufhin bei 30°C für 3 und 4 Tage kultiviert. Die Kulturlösung (5 ml) wurde bei Raumtemperatur und 3.000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Das Ergebnis wurde in 500 μl einer gesättigten Salzlösung suspendiert und daraufhin in ein 20-ml-Probengefäß (Agilent) für eine GC/MS-Analyse umgefüllt.

Alkan (Tridekan), das aus Tetradekanal als Substrat biosynthetisiert wurde, wurde analysiert und daraufhin wurde die Produktivität desselben bewertet. Außerdem waren die GC/MS-Analysebedingungen wie folgt. Analytische Bedingungen des Headspace-Probenamegerätes Headspace-Probenamegerät HP7694 (Hewlett-Packard)

Zonentemp	Ofen	80°C
Schleife		150°C
TR. Leitung		200°C
Ereigniszeitdauer	GC-Zyklenzeit	10 min
Probengefäß-EQ-Zeit		15 min
Druckbeaufschlagungszeit		0,5 min
Schleifenfüllzeit		0,2 min
Schleifen-EQ-Zeit		0,2 min
Einspritzzeit		1,0 min
Probengefäßparamter	schütteln	hoch
andere	Probengefäßdruckbeaufschlagung	15 psi
	Schleifengröße	3 ml

GC/MS-Analysebedingungen GC/MS HP6890/5973 GC/MS-System (Hewlett-Packard, Wilmington, DE) Säule HP-INNOWAX (Agilent: 19091N-213)

Einlasstemperatur		260°C
Detektortemperatur		260°C
Einspritzparameter
Teilungsverhältnis	1/20
Trägergas	Helium 1,0 ml/min
Ofenheizbedingungen
60°C	1 min
Heizen mit 25°C/min auf 260°C
260°C	1 min
Druckbeaufschlagungszeit		0,5 min
Schleifenfüllzeit		0,2 min
Schleifen-EQ-Zeit		1,00 min
Probengefäßparamter	schütteln	hoch
andere	Probengefäßdruckbeaufschlagung	15 psi
	Schleifengröße	3 ml

Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. In 5 sind die Mengen synthetisierten Alkans (Tridekans) auf der verikalen Achse dargestellt. In 5 bezeichnet „YPH499” den Wirt vor der Transformation, „YPH499 alkS” bezeichnet die Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens hergestellt wurde, „YPH499 alkS Yfdx” bezeichnet die Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens und des Ferredoxingens hergestellt wurde, „YPH499 alkS Yfdr” bezeichnet die Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens und des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens hergestellt wurde und „YPH499 alkS YfdxYfdr” bezeichnet die Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens, des Ferredoxingens und des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens hergestellt wurde.
Wie anhand der in 5 dargestellten Ergebnisse verständlich wird, waren alle Transformanten, in die das alkS-Gen eingefügt wurde, in der Lage, ein Alkan (Tridekan) zu synthetisieren. Ferner wiesen, wie in 5 dargestellt, die Transformanten, die durch Einfügen des Ferredoxingens hergestellt wurden, eine bessere Fähigkeit zum Synthetisieren eines Alkans auf, als jene der Transformanten, in die kein Ferredoxingen eingefügt worden war. Derweil war verständlich, dass ein Einfügen des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens alleine die Fähigkeit zum Synthetisieren eines Alkans nicht signifikant verbessern kann. Allerdings wurde herausgefunden, dass die Transformante, die durch Einfügen sowohl des Ferredoxingens als auch des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens hergestellt wurde, eine sehr gute Fähigkeit zum Synthetisieren eines Alkans aufwies.
[Experimentelles Beispiel 1]
In diesem experimentellen Beispiel wurde eine rekombinante Escherichia coli durch Verleihen der Fähigkeit, ein Alkan herzustellen und Einfügen des Ferredoxingens und/oder des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens hergestellt und daraufhin wurden die Auswirkungen von Ferredoxin und Ferredoxin-NADPH-Reduktase auf die Alkanproduktivität bestätigt.
Herstellung des alkS-Expressionsplasmids (alkS_pCDF)

Ein DNA-Fragment, welches ein Alkansynthasegen (alkS-Gen) enthielt, wurde durch PCR unter Verwendung der genomischen DNA von Nostoc sp. ATCC27437 als Templat erhalten. KOD-Plus-Ver.2 (Toyobo Co., Ltd.) wurde als Polymerase für die PCR verwendet. Für die Amplifikation des DNA-Fragments, welches das alkS-Gen enthielt, wurde das folgende Paar Primer entworfen und die Zusammensetzung der Reaktionslösung und die Reaktionszyklenbedingungen waren wie folgt.

[Zusammensetzung der Reaktionslösung]

Nostoc sp. ATCC27437 genomische DNA (100 ng/μl)	1 μl
10 × Puffer für KOD-Plus-Ver.2	5 μl
2 mM dNTPs	5 μl
25 mM MgSO₄	4 μl
Primer #1 (10 μM)	1,5 μl
Primer #2 (10 μM)	1,5 μl
KOD-Plus (1 U/μl)	1 μl
dH₂O	31 μl
	50 μl

Reaktionszyklenbedingungen

94 Grad Celsius für 2 Minuten – (98 Grad Celsius für 10 Sekunden, 55 Grad Celsius für 30 Sekunden, 68 Grad Celsius für 1 Minute und 30 Sekunden) × 30 Zyklen – 68 Grad Celsius für 3 Minuten – 16 Grad Celsius aufbewahren.

Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines MinElute PCR-Aufreinigungskits (QIAGEN) aufgereinigt und daraufhin mit KpnI und XhoI Restriktionsenzymen verdaut. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese wurde ein Fragment von ungefähr 0,7 kbp ausgeschnitten und dann unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Einfügungsabschnitt erhalten wurde. Das pCDFDuet-1 Plasmid (Novagen) wurde mit KpnI und XhoI Restriktionsenzymen verdaut. Ein Fragment von ungefähr 7,4 kb wurde ausgeschnitten und dann unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Vektorabschnitt erhalten wurde.
Die obigen, Einfügungsabschnitt und Vektorabschnitt, wurden unter Verwendung eines Ligation-Convenience Kits (Nippon Gene Co., Ltd.) legiert, um Escherichia coli HST08 (Takara Bio Inc.) zu transformieren. Die hierdurch erhaltene Sequenz wurde sequenziert und hierdurch wurde der Aufbau des Zielplasmids bestätigt. Das hiermit erhaltene Plasmid wurde alkS_pCDF genannt (6).
Herstellung des Plasmids (Efdx-pCOLA) für die Expression eines vom Escherichia coli Stamm W3110 abgeleiteten Ferredoxingens

Ein DNA-Fragment, welches das Ferredoxingen (Efdx) enthielt, wurde durch PCR unter Verwendung von genomischer DNA von Escherichia coli W3110 als Templat erhalten. KOD-Plus-Ver.2 (Toyobo Co., Ltd.) wurde für die PCR verwendet. Zur Amplifikation des DNA-Fragments, welches das Efdx-Gen enthielt, wurde das folgende Paar Primer entworfen und die Zusammensetzung der Reaktionslösung und die Reaktionszyklenbedingungen waren wie folgt.

[Zusammensetzung der Reaktionslösung]

W3110 genomische DNA (100 ng/μl)	1 μl
10 × Puffer für KOD-PIus-Ver.2	5 μl
2 mM dNTPs	5 μl
25 mM MgSO₄	4 μl
Primer #1 (10 μM)	1,5 μl
Primer #2 (10 μM)	1,5 μl
KOD-Plus (1 U/μl)	1 μl
dH₂O	31 μl
	50 μl

Reaktionszyklenbedingungen

94 Grad Celsius für 2 Minuten – (98 Grad Celsius für 10 Sekunden, 55 Grad Celsius für 30 Sekunden, 68 Grad Celsius für 1 Minute und 30 Sekunden) × 30 Zyklen – 68 Grad Celsius für 3 Minuten – 4 Grad Celsius Aufbewahrung.

Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines QIAquick PCR-Aufreinigungskits (QIAGEN) aufgereinigt und daraufhin mit NdeI und XhoI Restriktionsenzymen verdaut. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese wurde ein Fragment von ungefähr 0,4 kb ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelaufreinigungskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Einfügungsabschnitt erhalten wurde. Das pCOLADuet-1 Plasmid (Novagen) wurde mit NdeI und XhoI Restriktionsenzymen verdaut. Ein Fragment von ungefähr 3,7 kb wurde ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelaufreinigungskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Vektorabschnitt erhalten wurde.
Die obigen, Einfügungsabschnitt und Vektorabschnitt, wurden unter Verwendung eines Ligation-Convenience Kit (Nippon Gene Co., Ltd.) legiert, um Escherichia coli HST08 (Takara Bio Inc.) zu transformieren. Auf einem LB-Agarmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, gewachsene Kolonien wurden in einem LB-Flüssigmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert, um ein Plasmid zu extrahieren. Ein QIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN) wurde für die Extraktion verwendet. Das hiermit erhaltene Plasmid wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die Sequenz richtig war, und daraufhin Efdx-Efdx-pCOLA genannt (7). Außerdem sind die Nukleotidsequenzen des Efdx-Gens und die Aminosäurefrequenz von Ferredoxin, welches das Gen kodiert, jeweils in SEQ ID NO: 23 und 24 dargestellt.
Herstellung des Plasmids (Efdr-pCOLA) für die Expression eines vom Escherichia coli W3110 Stamm abgeleiteten Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens

Ein DNA-Fragment, welches das Ferredoxin-NADPH-Reduktase(Efdr)-Gen enthielt, wurde unter Verwendung der genomischen DNA von Escherichia coli W3110 als Templat durch PCR erhalten. KOD-Plus-Ver.2 (Toyobo Co., Ltd.) wurde für die PCR verwendet. Für die Amplifikation des DNA-Fragments, welches das Edfr-Gen enthielt, wurde das folgende Paar Primer entworfen und die Zusammensetzung der Reaktionslösung und die Reaktionszyklenbedingungen waren wie folgt.

[Zusammensetzung der Reaktionslösung]

W3110 genomische DNA (100 ng/μl)	1 μl
10 × Puffer für KOD-Plus-Ver.2	5 μl
2 mM dNTPs	5 μl
25 mM MgSO₄	4 μl
Primer #1 (10 μM)	1,5 μl
Primer #2 (10 μM)	1,5 μl
KOD-Plus (1 U/μl)	1 μl
dH₂O	31 μl
	50 μl

Reaktionszyklenbedingungen

Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines QIAquick PCR-Aufreinigungskits (QIAGEN) aufgereinigt und daraufhin mit NcoI und BamHI Restriktionsenzymen verdaut. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese wurde ein Fragment von ungefähr 0,8 kb ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt wodurch ein Einfügungsabschnitt erhalten wurde. Das pCOLADuet-1plasmid (Novagen) wurde mit NcoI and BamHI Restriktionsenzymen verdaut. Ein Fragment von ungefähr 3,7 kb wurde ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Vektorabschnitt erhalten wurde.
Die obigen, Einfügungsabschnitt und Vektorabschnitt, wurden unter Verwendung eines Ligation-Convenience Kits (Nippon Gene Co., Ltd.) ligiert, um Escherichia coli HST08 (Takara Bio Inc.) zu transformieren. Auf einem LB Agarmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, gewachsene Kolonien wurden in einem LB Flüssigmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert, um ein Plasmid zu extrahieren. Ein QIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN) wurde für die Extraktion verwendet. Das hiermit erhaltene Plasmid wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die Sequenz richtig war und daraufhin Efdr-pCOLA genannt (8). Zusätzlich sind die Nukleotidsequenz des Edfr-Gens und die Aminosäuresequenz des Ferredoxins, für welches das Gen kodiert, jeweils in SEQ ID NO: 27 and 28 dargestellt.
Herstellung des Plasmids (EfdxEfdr-pCOLA) zur Koexpression des Efdx-Gens und des Efdr-Gens
Das Efdx-pCOLA-Plasmid wurde mit NcoI und BamHI Restriktionsenzymen verdaut. Ein Fragment von ungefähr 4,1 kb wurde ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Vektorabschnitt erhalten wurde. Ferner wurde das Efdr-pCOLA-Plasmid mit NcoI und BamHI Restriktionsenzymen verdaut. Ein Fragment von ungefähr 0,8 kb wurde ausgeschnitten und daraufhin unter Verwendung eines MinElute Gelextraktionskits (QIAGEN) aufgereinigt, wodurch ein Einfügungsabschnitt erhalten wurde. Die obigen zwei Fragmente wurden unter Verwendung eines Ligation-Convenience Kits (Nippon Gene Co., Ltd.) ligiert, um Escherichia coli HST08 (Takara Bio Inc.) zu transformieren. Auf einem LB Agarmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, gewachsene Kolonien wurden in einem LB Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert, um ein Plasmid zu extrahieren. Ein QIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN) wurde für die Extraktion verwendet. Das hiermit erhaltene Plasmid wurde EfdxEfdr-pCOLA genannt (9).
Herstellung einer Transformante vom Escherichia coli BL21(DE3) Stamm
Der Escherichia coli BL21(DE3) Stamm (Novagen) wurde unter Verwendung verschiedener Expressionsplasmide, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, transformiert. Die Transformation wurde nach den damit bereitgestellten Anleitungen durchgeführt. Klone, die auf LB Agarmedium, das Streptomycin und Kanamycin (jeweils 50 μg/ml) enthielt, gewachsen waren, wurden als Transformanten der Auswertung der Alkanproduktivität unterworfen. Außerdem wurden in diesem Beispiel die folgenden Transformanten hergestellt: eine Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens unter Verwendung von alkS_pCDF hergestellt wurde; eine Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens und des Ferredoxingens unter Verwendung von alkS_pCDF und Efdx-pCOLA hergestellt wurde; eine Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens und des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens unter Verwendung von alkS_pCDF und Efdx-pCOLA hergestellt wurde und eine Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens, des Ferredoxingens und des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens unter Verwendung von alkS_pCDF und EfdxEfdr-pCOLA hergestellt wurde.
Auswertung der Alkanproduktivität
Die vier Arten von Transformanten, die hergestellt wurden wie oben beschrieben, wurden getrennt in 3 mL LB-Sm, Km (jeweils 50 μg/ml) Flüssigmedium inokuliert und daraufhin über Nacht bei 37 Grad Celsius kultiviert. Jeder der Ansätze wurde getrennt in 5 mL Lb-Sm, Km (jeweils 50 μg/ml) Flüssigmedium inokuliert, das Tetradekanal und 1 mM IPTG enthielt, und daraufhin für 3 und 4 Tage bei 30 Grad Celsius kultiviert. Die Kulturlösungen (5 ml) wurden bei Raumtemperatur und 3000 upm für 10 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Nach Suspendieren in einer gesättigten Salzlösung (50 μg/ml) wurden die Ergebnisse in ein 20 ml Probengefäß (Agilent) für die GC/MS Analyse umgefüllt.
Aus Tetradekanal als Substrat biosynthetisiertes Alkan (Tridecan) wurde analysiert und die Produktivität davon wurde bewertet. Außerdem sind die für die GC/MS Analyse zu verwendenden Headspace-Probenentnahmegerätan-Alysebedingungen und GC-MS Analysebedingungen die gleichen, wie jene in Beispiel 1.
Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. In 10 sind auf der vertikalen Achse die Mengen von synthetisiertem Alkan (Tridecan) angegeben. In 10 bezeichnet „BL21(D3)” den Wirt vor der Transformation, „BL21(DE3) alkS” bezeichnet die Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens hergestellt wurde, „BL21(DE3) alkS Efdx” bezeichent die Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens und des Ferredoxingens hergestellt wurde, „BL21(DE3) alkS Efdr” bezeichnet die Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens und des Ferredoxin NADP Reduktasegens hergestellt wurde und „BL21(DE3) alkS EfdxEfdr” bezeichnet die Transformante, die durch Einfügen des alkS-Gens, des Ferrodoxingens und des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens hergestellt wurde.
Anhand der Ergebnisse, die in 10 dargestellt sind, wurde verstanden, dass alle Transformanten, die durch Einfügen des alkS-Gens hergestellt wurden, die Fähigkeit aufwiesen, ein Alkan (Tridecan) zu synthetisieren. Allerdings erbrachte die zusätzliche Einfügung des Ferredoxingens und des Ferredoxin-NADPH-Reduktasegens keine verbesserte Fähigkeit zum Synthetisieren des Alkans.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Alkans, welches das Synthetisieren des Alkans durch Alkansynthase in Gegenwart von Ferredoxin umfasst.
Verfahren zum Herstellen des Alkans nach Anspruch 1, wobei das Alkan durch einen Mikroorganismus synthetisiert wird, der in der Lage ist, das Alkan zu synthetisieren.
Verfahren zum Herstellen des Alkans nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus ein rekombinanter Mikroorganismus ist, in den ein Alkansynthasegen eingefügt ist.
Verfahren zum Herstellen des Alkans nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus ein rekombinanter Mikroorganismus ist, in den ein Ferredoxingen eingefügt ist.
Verfahren zum Herstellen des Alkans nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus ein rekombinanter Mikroorganismus ist, in den ein Alkansynthasegen und ein Ferredoxingen eingefügt sind.
Verfahren zum Herstellen eines Alkans nach Anspruch 1, wobei das Alkan in Gegenwart von Ferredoxin-NADPH-Reduktase zusätzlich zum Ferredoxin synthetisiert wird.
Verfahren zum Herstellen eines Alkans nach Anspruch 6, wobei das Alkan durch einen Mikroorganismus synthetisiert wird, der in der Lage ist, das Alkan zu synthetisieren, in den ein Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen eingefügt ist.
Verfahren zum Herstellen des Alkans nach einem der Ansprüche 3 bis 5 und 7, wobei der rekombinante Mikroorganismus von Hefe abgeleitet ist.
Verfahren zum Herstellen des Alkans nach Anspruch 1, wobei die Alkansynthase eine Aktivität zum Umwandeln von Aldehyd zu Alkan hat.
Verfahren zum Herstellen des Alkans nach Anspruch 1, welches das Herstellen eines C_9-16 Alkans umfasst.
Rekombinanter Mikroorganismus, der in der Lage ist ein Alkan zu synthetisieren, in den ein Ferredoxingen eingefügt wurde.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 11, in den ferner ein Ferredoxin-NADPH-Reduktasegen eingefügt wurde.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 11, wobei die Fähigkeit, das Alkan zu synthetisieren, durch Einfügen des Alkansynthasegens verliehen wurde.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 11, der eine rekombinante Hefe ist.