CN1614004A - 热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于生物化工技术领域的涉及一种热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法。其构建方法是以热带假丝酵母工业生产菌株为出发菌株，阻断了一个拷贝的热带假丝酵母中负责β－氧化过程转运途径被部分阻断的肉毒碱乙酰辅酶CAT基因，构建了热带假丝酵母基因工程重组菌。达到在同样的条件下培养过程中，出发菌株和重组菌株的生长情况基本相同；重组菌株中的CAT酶活降至出发菌株的一半左右，产酸速率得到提高，可以用来考察菌体本身的某些性质，而且基因重组菌的二元酸产量和烷烃转化率都得到了明显提高。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及将热带假丝酵母中负责β-氧化过程转运途径的肉毒碱乙酰辅酶A转运酶阻断的一种热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法。
背景技术
十三碳二元酸(dicarboxylic acid，DCA)是一种重要的化工原料，是用来合成工程塑料、香料、耐寒性增塑剂、涂料、液晶等物质的重要原料。目前，十三碳二元酸主要通过热带假丝酵母(Candida tropicalis)代谢烷烃来生产。
热带假丝酵母是一种不具有有性生殖方式的二倍体酵母，在它转化烷烃生产长链二元酸的过程中，烷烃被转运进入细胞后，首先由细胞色素P450酶氧化生成α-一元醇，再进一步被氧化生成α-一元酸，这被称为α-氧化过程。接着，α-一元酸由同样的酶系催化，经过ω-氧化途径被氧化生成α、ω-二元酸。在α、ω-氧化过程中生成的一元酸和二元酸都可以进入微体，经过β-氧化被代谢消耗掉。因此，脂肪酸的β-转运对生产长链二元酸是不利的。
虽然包括十三碳二元酸在内的长链二元酸系列产品在我国已经实现了工业化生产，但反应过程中的烷烃转化率还有待进一步提高。这就需要尽可能抑制β-氧化过程，同时又要保证细胞生长和产酸需要的能量供应不受影响，使细胞的反应体系得到优化。
研究者进行了阻断β-氧化过程中某些酶的尝试。但是结果发现，如果只阻断一个拷贝，即进行不完全阻断，对产酸则影响甚微甚至毫无影响；如果完全阻断酶的作用，热带假丝酵母无法维持正常的能量供应，不能在烷烃上生长，从而无法生产二元酸。人们认为这是因为到目前为止，还没有在β-氧化系统中发现有效的调控酶。但是，要在一个如此复杂的系统中找到关键的调控酶并非易事。同β-氧化过程相比，其中的转运途径要简单得多，因此我们对β-氧化的转运途径进行了研究。
在一元酸和二元酸向β-氧化途径转运的过程中，肉毒碱乙酰基转移酶(carnitine acyltransferase，CAT)起到了重要的作用。这是因为脂肪酸β-氧化的产物乙酰辅酶A不能通过微体膜，而CAT能可逆地催化乙酰辅酶A生成乙酰肉毒碱，乙酰肉毒碱能通过微体膜，进入线粒体，经过三羧酸循环而产生能量。CAT在这里起到了非常关键的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法，其特征在于：所述热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法是以热带假丝酵母工业生产菌株为出发菌株，阻断了一个拷贝的CAT基因，构建了热带假丝酵母中肉毒碱乙酰基转移酶被部分阻断的基因工程重组菌；
具体实施方案为：
1、重组质粒pUCSS5hyg15的构建
根据已发表的热带假丝酵母中肉毒碱乙酰基转移酶(简称CAT)的DNA序列，设计合成两段引物，
上游：CACTGCTTGAGCTCCACAAA，
下游：GCTAAATCCTGCAGGCAA，
在两段引物中分别引入SacI和Sse8387I位点，以热带假丝酵母基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(简称PCR)扩增CAT基因；
反应条件：85-100℃变性5-10分钟以后，在85-100℃变性20-40秒，50-60℃退火1-4分钟，70-82℃延伸4分钟进行循环，共30个循环；
将PCR产物用限制性内切酶SacI和Sse8387I消化，将得到的热带假丝酵母CAT基因连接到pUC18质粒的SacI-Sse8387I位点，得到中间载体pUCSS5。中间载体pUCSS5上有一个SalI位点，位于CAT基因的中间位置，将潮霉素抗性基因插入pUCSS5的SalI位点，转化大肠杆菌，筛选具有潮霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明热带假丝酵母CAT基因和潮霉素基因已插入pUC18中，序列正确，重组质粒命名为pUCSS5hyg15；
2、将重组质粒pUCSS5hyg15转入热带假丝酵母
将重组质粒pUCSS5hyg15用限制性内切酶SacI消化，得到线性质粒，用LiCl法转化热带假丝酵母，得到的细胞涂到MD培养基上，在25-40℃培养2-3天，再转到含潮霉素B的YPD培养基上，25-35℃培养，筛选具有潮霉素抗性的转化子。根据热带假丝酵母中CAT前面的基因序列和潮霉素B抗性基因设计合成引物P3和P4。
上游：AAGTACACCGGCAAGATCAGACC
下游：AGCTATTTACCCGCAGGACATATCC
重组成功的转化子可以扩增出500bp的片段；通过PCR方法验证并测序后，从46个转化子中得到1个CAT基因被单拷贝敲除的重组菌，命名为CZ-15；
3、重组菌的培养
在与培养野生菌株同样的条件下，同时培养出发菌株和重组菌株。
培养条件为：接入重组菌CZ-15后在25-36℃培养24小时，此时发酵摇瓶中的菌量达到一定浓度，加氢氧化钠调pH值到7.5，加入十三碳烷烃到15％(V/V)，进入产酸期，之后每12小时或24小时调节pH到7.8，产酸期为4-5天。
本发明的有益效果是在同样的条件下培养过程中，达到了出发菌株和重组菌株的生长情况基本相同；重组菌株中的CAT酶活降至出发菌株的一半左右，产酸速率得到提高；可以用来考察菌体本身的某些性质，而且基因重组菌的二元酸产量和烷烃转化率都得到了明显提高。
附图说明
图1为重组质粒pUCSS5hyg15的构建过程示意图。
图2为转化子的PCR验证示意图。
图3为出发菌株和重组菌株的生长曲线。
图4为出发菌株和重组菌株的CAT酶活和产酸速率。
图5为出发菌株F10-1和重组菌株CZ-15的产酸情况。
具体实施方式
本发明提供一种热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法。所述热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法是以热带假丝酵母工业生产菌株为出发菌株，阻断了一个拷贝的CAT基因，构建了肉毒碱乙酰基转移酶被部分阻断的基因工程菌。
具体实施方案为：
1、重组质粒pUCSS5hyg15的构建
根据已发表的热带假丝酵母中肉毒碱乙酰基转移酶的DNA序列，设计合成两段引物，
上游：CACTGCTTGAGCTCCACAAA，
下游：GCTAAATCCTGCAGGCAA，
在两段引物中分别引入SacI和Sse8387I位点，以热带假丝酵母基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应扩增CAT基因。
反应条件为94℃变性5分钟，以下在94℃变性30秒，56℃退火2分钟，72℃延伸4分钟循环，共30个循环。
将PCR产物用限制性内切酶SacI和Sse8387I消化，将得到的热带假丝酵母CAT基因连接到pUC18质粒的SacI-Sse8387I位点，得到中间载体pUCSS5。中间载体pUCSS5上有一个SalI位点，位于CAT基因的中间位置，将潮霉素抗性基因插入pUCSS5的SalI位点，转化大肠杆菌，筛选具有潮霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明热带假丝酵母CAT基因和潮霉素基因已插入pUC18中，序列正确，重组质粒命名为pUCSS5hyg15。
具体过程如图1所示：
从热带假丝酵母F10-1基因组上扩增得到cat基因片段。用SacI和Sse8387I双酶切该片段和pUC18质粒，将两者连接起来得到质粒pUCSS5。将潮霉素B抗性基因用SalI酶消化，插入到质粒pUCSS5上cat基因中的SalI酶切位点上，得到质粒pUCSS5hyg15。
2、将重组质粒pUCSS5hyg15转入热带假丝酵母
将重组质粒pUCSS5hyg15用限制性内切酶SacI消化，得到线性质粒，用LiCl法转化热带假丝酵母，得到的细胞涂到MD培养基上，在30℃培养2-3天，再转到含潮霉素B的YPD培养基上，30℃培养，筛选具有潮霉素抗性的转化子。根据热带假丝酵母中CAT前面的基因序列和潮霉素B抗性基因设计合成引物P3和P4(如图2所示)。
具体实施方案为：
1、重组质粒pUCSS5hyg15的构建
根据已发表的热带假丝酵母肉毒碱乙酰基转移酶的DNA序列，设计合成两段引物，
上游：CACTGCTTGAGCTCCACAAA
下游：GCTAAATCCTGCAGGCAA
在两段引物中分别引入SacI和Sse8387I位点，以热带假丝酵母基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应扩增CAT基因；
反应条件为85-100℃变性5-10分钟，以下在85-100℃变性20-40秒，50-60℃退火1-4分钟，70-82℃延伸4分钟循环，共30个循环；
将PCR产物用限制性内切酶SacI和Sse8387I消化，将得到的热带假丝酵母CAT基因连接到pUC18质粒的SacI-Sse8387I位点，得到中间载体pUCSS5。中间载体pUCSS5上有一个SalI位点，位于CAT基因的中间位置，将潮霉素抗性基因插入pUCSS5的SalI位点，转化大肠杆菌，筛选具有潮霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明热带假丝酵母CAT基因和潮霉素基因已插入pUC18中，序列正确，重组质粒命名为pUCSS5hyg15；
2、将重组质粒pUCSS5hyg15转入热带假丝酵母
将重组质粒pUCSS5hyg15用限制性内切酶SacI消化，得到线性质粒，用LiCl法转化热带假丝酵母，得到的细胞涂到MD培养基上，在25-40℃培养2-3天，再转到含潮霉素B的YPD培养基上，25-35℃培养，筛选具有潮霉素抗性的转化子。根据热带假丝酵母中CAT前面的基因序列和潮霉素B抗性基因设计合成引物P3和P4。
上游：AAGTACACCGGCAAGATCAGACC
下游：AGCTATTTACCCGCAGGACATATCC
重组成功的转化子可以扩增出500bp的片段；通过PCR方法验证并测序后，从46个转化子中得到1个CAT基因被单拷贝敲除的重组菌，命名为CZ-15；
3、重组菌的培养
在与培养野生菌株同样的条件下，同时培养出发菌株和重组菌株。
培养条件为：接入重组菌CZ-15后在25-36℃培养24小时，此时发酵摇瓶中的菌量达到一定浓度，加氢氧化钠调pH值到7.5，加入十三碳烷烃到15％(V/V)，进入产酸期，之后每12小时或24小时调节pH到7.8，产酸期为4-5天。
重组菌的通常培养条件为：接入重组菌CZ-15后在30℃培养24小时，此时发酵摇瓶中的菌量达到一定浓度，加氢氧化钠调pH值到7.5，加入十三碳烷烃到15％(V/V)，进入产酸期，之后每12小时或24小时调节pH到7.8，产酸期为4-5天。
实验结果
在同样的条件下培养过程中，出发菌株和重组菌株的生长情况基本相同，并没有明显的差异，菌体生长曲线见图3所示。
敲除一个CAT等位基因后，重组菌株中的CAT酶活降至出发菌株的一半左右，产酸速率得到提高(如图4、图5所示)。而且在产酸速率提高的过程中，CAT酶活则不断下降。
因为热带假丝酵母的遗传背景还不完全清楚，而且它是一种二倍体酵母，基因改造的困难较大，所以之前国内外文献所作的研究都是在营养缺陷型菌株上进行的，这样便于筛选，可以用来考察菌体本身的某些性质，而且基因重组菌的二元酸产量和烷烃转化率都得到了明显提高。
Claims (1)
1.一种热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法，其特征在于：所述热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法是以热带假丝酵母工业生产菌株为出发菌株，阻断了一个拷贝的CAT基因，构建了肉毒碱乙酰基转移酶被部分阻断的基因工程重组菌；
具体实施方案为：
1)重组质粒pUCSS5hyg15的构建
根据已发表的热带假丝酵母中肉毒碱乙酰基转移酶的DNA序列，设计合成两段引物，
上游：CACTGCTTGAGCTCCACAAA，
下游：GCTAAATCCTGCAGGCAA，
在两段引物中分别引入SacI和Sse8387I位点，以热带假丝酵母基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应扩增CAT基因；
反应条件为85-100℃变性5-10分钟，以下在85-100℃变性20-40秒，50-60℃退火1-4分钟，70-82℃延伸4分钟循环，共30个循环；
将PCR产物用限制性内切酶SacI和Sse8387I消化，将得到的热带假丝酵母CAT基因连接到pUC18质粒的SacI-Sse8387I位点，得到中间载体pUCSS5，中间载体pUCSS5上有一个SalI位点，位于CAT基因的中间位置，将潮霉素抗性基因插入pUCSS5的SalI位点，转化大肠杆菌，筛选具有潮霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明热带假丝酵母CAT基因和潮霉素基因已插入pUC18中，序列正确，重组质粒命名为pUCSS5hyg15；
2)将重组质粒pUCSS5hyg15转入热带假丝酵母
将重组质粒pUCSS5hyg15用限制性内切酶SacI消化，得到线性质粒，用LiCl法转化热带假丝酵母，得到的细胞涂到MD培养基上，在25-40℃培养2-3天，再转到含潮霉素B的YPD培养基上，25-35℃培养，筛选具有潮霉素抗性的转化子；根据热带假丝酵母中CAT前面的基因序列和潮霉素B抗性基因设计合成引物P3和P4；
上游：AAGTACACCGGCAAGATCAGACC，
下游：AGCTATTTACCCGCAGGACATATCC，
重组成功的转化子可以扩增出500bp的片段；通过PCR方法验证并测序后，从46个转化子中得到1个CAT基因被单拷贝敲除的重组菌，命名为CZ-15；
3)重组菌的培养
培养条件为：接入重组菌CZ-15后在25-36℃培养24小时，此时发酵摇瓶中的菌量达到一定浓度，加氢氧化钠调pH值到7.5，加入十三碳烷烃到15％(V/V)，进入产酸期，之后每12小时或24小时调节pH到7.8，产酸期为4-5天。
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