CN102471781B - 以脂肪醇形成酰基CoA还原酶(FAR)产生脂肪醇 - Google Patents

Abstract

描述从包括编码异源脂肪酰CoA还原酶(FAR)酶的基因的重组宿主细胞产生脂肪醇的方法，包括来源于海洋细菌且尤其是海洋γ蛋白菌诸如海杆菌属(Marinobacter)和海洋杆菌属(Oceanobacter)的FAR酶和其功能片段，以及编码FAR酶的多核苷酸和含有所述多核苷酸的载体和宿主细胞。

Description

以脂肪醇形成酰基CoA还原酶(FAR)产生脂肪醇

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年6月30日提交的临时申请第61/221,934号和于2010年3月18日提交的临时申请第61/315,380号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

对序列表的引用

根据37C.F.R.§1.821、经由文件名CX3-017US-ST25.txt以计算机可读形式(CRF)以电子方式同时提交的“序列表”通过引用并入本文。2010年6月28日创建了序列表的电子副本，且磁盘上的大小为82Kb。

背景

柴油燃料是用于柴油机的任何燃料，并包括石油柴油和生物柴油二者。石油柴油是化石燃料油的特定分馏物。其包括约75％的饱和烃类和25％的芳香烃类。生物柴油不是来源于石油而是来源于植物油或动物脂肪并包含长链烷基酯类。生物柴油通过脂质(例如，来自油炸锅的用过的植物油或种子油)与醇的酯交换而生成，且比石油柴油燃烧更清洁。生物柴油可单独使用或以任何量与石油柴油混合使用以用于现代发动机。

煤油是可燃的烃，其也是化石燃料的特定分馏物，且包含具有6至16个碳原子的烃类。煤油具有与石油柴油相当的燃烧热，且广泛用于喷气燃料中以为喷气发动机提供动力和在某些国家用于供暖。基于煤油的燃料也可利用液态氧来燃烧并用作火箭燃料(例如，RP-1)。

对石油衍生的燃料的依赖已使自然资源的供给枯竭且需要更多依赖于进口的汽油和柴油产品。此外，石油基燃料的燃烧增加了大气中温室气体(例如，二氧化碳和甲烷)的量，这助长了地球气候的逐渐变暖。

燃料，比如生物柴油，由动物产物或植物产物制成，比石油衍生的燃料燃烧更清洁，且不产生温室气体的净增量。并且，它们是可持续能源并可能减少美国对进口石油基产品的依赖。然而，存在着使用土地来生产燃料作物而非粮食作物将促使世界饥饿的担心。

脂肪酸是细胞膜的主要成分，且几乎所有生物体将其用作能量贮存的主要来源。脂肪醇是脂肪酸的还原产物，并且和脂肪酸一样可由培养的细胞酶促产生。可将脂肪醇与酸反应以形成与生物柴油燃料中存在的酯组合物相似的酯组合物，或可将脂肪醇还原以形成类煤油(kerosene-like)组合物，或与石油柴油相似的烃组合物。将脂肪酰硫酯底物(例如，脂肪酰CoA或脂肪酰ACP)转化为脂肪醇的酶常称作脂肪醇形成酰基CoA还原酶或脂肪酰还原酶(“FAR”)。

PCT公布WO 2007/136762公开了用于产生脂肪酸衍生物的遗传工程化的微生物和它们的使用方法。

PCT公布WO 2009/140695公开了包括编码参与烃生物合成的酶的蓝细菌基因的组合物和将它们用于产生醛类和醇类的方法。

Steen等人.，2010，Nature 463：559-563公开了大肠杆菌(E.coli)的工程化以直接从单糖产生特定的脂肪醇酯(fatty ester)、脂肪醇和蜡类。

Schirmer，2009，Current Opinion in Microbiology 12：274-281描述了用于产生类燃料分子的异养微生物的发酵代谢和非发酵代谢，将代谢中间体转化为类燃料分子的生物催化剂，和决定所述类燃料分子的具成本效益的产生的参数。

美国专利第5,370,996号和Metz等人(2000)Plant Physiology122：635-644公开了来自较常称作荷荷巴(jojoba)的荒漠灌丛希蒙得木(Simmondsia chinensis)的脂肪酰还原酶(FAR)酶的分离和表征。

Moto等人(2003)Proc.Nat’l Acad.Sci USA 100(16)：9156-9161公开了来自蚕蛾家蚕(Bombyx mori)的FAR酶的分离和表征。

Reiser等人(1997)J.Bacteriol.179(9)：2969-2975公开了来自产蜡酯细菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的脂肪酰CoA还原酶的分离和表征，该酶将具有从C14到C22的链长度的脂肪酰CoA底物还原为相应的脂肪醛，需要脱氢酶以将脂肪醛转化为脂肪醇。

理论上，这些FAR酶可在异源宿主中表达，作为产生用于生物燃料的非石油基的、可再生来源的脂肪醇或衍生组合物的手段。然而，当在诸如大肠杆菌和酵母的异源宿主中表达时，所获得的脂肪醇的产量不足以用于某些应用。此外，产生的脂肪醇至多仅小部分被微生物分泌，这大大增加了纯化的成本。

因此，本领域中对于诸如FAR酶的酶仍存在需求，所述酶可用于有效地产生脂肪醇以用于工业应用，所述工业应用诸如但不限于在食品工业、化妆品工业、医药工业和燃料工业中的应用。

概述

本公开内容提供分离的脂肪酰还原酶(FAR)酶、编码FAR酶的核酸、被工程化以表达FAR酶的重组微生物、利用FAR酶和/或重组微生物产生脂肪醇和其他组合物的方法，和包括脂肪醇和/或衍生自脂肪醇的组合物。本文描述的多个发明部分地基于发明人的令人惊奇的发现：在海水中发现的γ蛋白菌的种类的某些属包含FAR酶，当所述FAR酶在异源细胞中表达时能够产生高产量的总脂肪醇和分泌的脂肪醇。

特别地，本发明人已发现海杆菌属(Marinobacter)物种栖藻(algicola)海杆菌(菌株DG893)(“FAR_Maa”)、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)VT8(“FAR_Maq”)、和海洋杆菌属(Oceanobacter)物种菌株RED65(最近重分类为Bermanella marisrubri RED65)(“FAR_Ocs”)分别具有当在大肠杆菌宿主中表达时，能够比来自家蚕的FAR酶产生多约150-400倍的总脂肪醇的FAR酶。在酵母中也获得了显著较高的脂肪醇的产量。基于该令人惊奇的发现，预期海洋细菌的其他属且尤其是海洋γ蛋白菌将同样地包含FAR酶，特别当所述FAR酶在异源宿主微生物中表达时，特别地适宜于产生脂肪醇。在某些实施方案中，利用隐马尔可夫模型(“HMM”)可鉴定特别适宜于产生脂肪醇的FAR酶，所述隐马尔可夫模型通过与发现于预编译(pre-complied)组的蛋白序列的类型的相似性来鉴定蛋白。HMM中囊括了每个预编译组中的固有的类型。对于给定的序列组，HMM界定蛋白结构域或蛋白家族。使用该技术可能将与先前鉴定的适宜的FAR酶共有共同结构域的给定蛋白序列的部分进行分类。参见，例如，http://pfam.sanger.ac.uk/。在某些实施方案中，HMM被用来鉴定NAD结合结构域和/或不育结构域。

因此，在一方面，本公开内容提供来源于或获自海洋细菌诸如海洋γ蛋白菌的分离的FAR酶和/或其具有FAR活性的功能片段。在一些实施方案中，FAR酶直接分离自其天然存在于其中的海洋γ蛋白菌。在一些实施方案中，FAR酶和/或功能片段分离自经工程化以表达FAR酶或功能片段的异源宿主微生物。

在另一方面，本发明涉及来源于或获自栖藻海杆菌菌株DG893的FAR酶和其功能片段。在一个实施方案中，FAR酶或其功能片段具有与SEQ IDNO：2或其功能片段至少30％相同、至少75％相同、至少80％相同和至少90％相同的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中，分离的FAR酶具有与SEQ ID NO：2相同的氨基酸序列。

在又一方面，本发明涉及来源于或获自海洋杆菌属的菌株的FAR酶和其功能片段。在一个特定的实施方案中，FAR酶获自或来源于海洋杆菌属物种菌株RED65并具有与SEQ ID NO：6至少30％相同、至少75％相同、至少80％相同、和至少90％相同的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中，分离的FAR酶具有与SEQ ID NO：6相同的氨基酸序列。

在再一方面，本公开内容提供编码如上所述的海洋γ蛋白菌FAR酶或其功能片段的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA，且可以是单链的或双链的。其可分离自天然存在的微生物，或完全或部分地经由合成方法制备。在一个实施方案中，核酸序列编码包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14或其功能片段具有至少30％的序列同一性的氨基酸序列的脂肪酰CoA还原酶(FAR)酶。在另外的实施方案中，核酸编码包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14或其功能片段的至少75％的序列同一性(即，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和甚至至少100％的序列同一性)的FAR酶。在本方面的一些实施方案中，载体包括编码FAR酶的核酸。在一些实施方案中，编码FAR酶或其功能片段的多核苷酸与启动子可操作地连接，且任选地与控制表达的其他控制序列和元件可操作地连接。在一些实施方案中，设计或选择载体以保持与宿主微生物的基因组区分开(例如，质粒)，或以通过诸如同源重组或位点特异性整合而整合入宿主微生物的基因组中。在特定的实施方案中，将编码FAR酶或功能片段的构建体部分的密码子进行优化以用于在特定的宿主微生物中表达。

在另一方面，本公开内容提供被工程化以表达如本文描述的异源的海洋γ蛋白菌FAR基因或其功能片段的重组微生物。在一些实施方案中，重组宿主细胞包括细菌、丝状真菌和酵母。在特定的实施方案中，细菌是大肠杆菌。在另外特定的实施方案中，酵母是产油酵母。在某些实施方案中，产油酵母是解脂耶罗威亚酵母(Y.lipolytica)。在又一些另外的实施方案中，酵母是酿酒酵母(S.cerevisiae)。在某些方面，微生物是野生型微生物。在另外的方面，微生物是经遗传修饰的。

在某些特定的实施方案中，经遗传修饰的微生物还过表达编码提高微生物产生FAR酶的底物的速率的蛋白的基因，所述FAR酶的底物即，脂肪酰硫酯底物。在某些实施方案中，由过表达的基因编码的酶直接参与脂肪酸合成。在特定的实施方案中，由过表达的基因编码的酶选自脂肪酸合酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酰CoA合酶和乙酰CoA羧化酶。在一些实施方案中，由过表达的基因编码的蛋白对于微生物是内源性的。在另外的实施方案中，由过表达的基因编码的蛋白对于微生物是异源性的。

在又一方面，本公开内容提供产生包括脂肪醇和/或衍生自脂肪醇的酸酯和/或烷烃和/或烯烃的组合物的方法。在某些实施方案中，脂肪醇在无细胞的系统中产生，其中提供如上所述的FAR酶和脂肪酰硫酯底物和必需的辅因子，在温度、pH和离子强度的适宜条件下持续足以产生脂肪醇的时间。在各种实施方案中，脂肪醇由包括编码如上所述的FAR酶的异源基因的重组宿主细胞产生。在这些实施方案中，在适宜于产生脂肪醇的条件下将宿主细胞培养于包括可同化碳源的含水营养培养基(aqueous nutrientmedium)中。在某些特定的实施方案中，重组宿主细胞是细菌或酵母。在各种实施方案中，酵母是产油酵母。在特定的实施方案中，细菌是大肠杆菌且酵母选自酿酒酵母和解脂耶罗威亚酵母。

在一些实施方案中，脂肪醇由包括编码FAR酶的异源基因和提高重组宿主细胞产生FAR的酰基硫酯底物的速率的一种或多种蛋白的重组宿主细胞来产生。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白直接参与脂肪酸生物合成。在某些特定的实施方案中，所述一种或多种蛋白选自脂肪酸合酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酰CoA合酶和乙酰CoA羧化酶。在一些方面，由重组微生物产生的脂肪醇从细胞分泌到含水营养培养基中。在某些实施方案中，本文描述的方法包括分离脂肪醇的步骤。

在另一方面，本发明涉及产生脂肪醇组合物的方法，所述方法包括在适宜的培养基中培养重组微生物，其中重组微生物包括编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14或其功能片段具有至少30％的序列同一性的异源脂肪酰还原酶(FAR)酶的基因，并允许所述基因的表达，其中所述表达导致脂肪醇组合物的产生。在本方面的一些实施方案中，方法还包括分离产生的脂肪醇。在特定的实施方案中，本文描述的方法产生至少约0.5g/L的脂肪醇，以及至少5g/L和甚至至少15g/L的脂肪醇。

在又一方面，本发明涉及通过酰基CoA非依赖途径产生脂肪醇组合物的方法，所述方法包括在适宜的条件下在营养培养基中培养重组大肠杆菌，其中所述重组大肠杆菌包括编码包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14或其功能片段具有至少75％(比如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％和甚至100％)序列同一性的氨基酸序列的异源脂肪酰CoA还原酶(FAR)酶的核酸序列；允许所述FAR的表达；和产生脂肪醇组合物。

在再一方面，经工程化以表达本发明涵盖的FAR的重组微生物是包括失活的或沉默的内源脂肪酰CoA合成酶fadD基因的细菌，尤其是大肠杆菌。在另外的实施方案中，重组大肠杆菌将包括失活的或沉默的内源短链脂肪酰CoA合成酶fadK基因。在另一些另外的实施方案中，两个基因将都是失活的或沉默的。

在又一方面，本公开内容提供通过以上描述的方法产生的脂肪醇组合物。在一些实施方案中，脂肪醇组合物在无细胞的系统中产生。在另外的实施方案中，脂肪醇组合物由重组宿主细胞来产生。在特定的实施方案中，组合物包括具有饱和的、不饱和的、直链的、支链的或环状的烃链的脂肪醇。在某些实施方案中，组合物包括饱和的脂肪醇和/或单不饱和的脂肪醇。

在又一些另外的方面，本公开内容提供包括通过还原本文描述的脂肪醇组合物衍生的烷烃和/或烯烃的组合物。在某些实施方案中，还原反应用化学方法来进行。在另外的实施方案中，还原反应利用具有用于还原脂肪醇的生物合成途径的微生物来进行。在某些实施方案中，通过还原脂肪醇产生的组合物基本上包括所有烷烃和/或烯烃。在另外的实施方案中，组合物包括脂肪醇和从其衍生的烷烃和/或烯烃的混合物。

在又一方面，本公开内容提供燃料组合物，所述燃料组合物包括脂肪醇和/或从其衍生的酸酯和/或烷烃和/或烯烃。在一些实施方案中，通过以上描述的方法产生的脂肪醇组合物直接用于燃料组合物中。在各种实施方案中，将脂肪醇与羧酸反应以产生用作生物柴油燃料组合物的酸酯。在另外的实施方案中，将脂肪醇与还原剂反应以产生烷烃和/或烯烃。在某些实施方案中，脂肪醇经历酯化作用以形成脂肪醇酯。在一些实施方案中，衍生自脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃用作喷气燃料组合物的组分。在其他实施方案中，衍生的烷烃和/或烯烃用作火箭燃料的组分。在另外的实施方案中，衍生自脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃用作类石油柴油燃料组合物的组分。

附图简述

图1显示含有编码潮霉素(HygB)抗性和FAR表达的盒(cassette)的复制型解脂耶罗威亚酵母载体pCEN411(约9065bp)。Ars18是分离自解脂耶罗威亚酵母染色体DNA的自主复制序列。

图2显示编码栖藻海杆菌菌株DG893的FAR酶的密码子优化的多核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，所述FAR酶具有图6中所示的氨基酸序列(SEQID NO：2)。

图3显示编码栖藻海杆菌菌株DG893的FAR酶且为在解脂耶罗威亚酵母中表达而被优化的密码子优化的多核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，所述FAR酶具有图6中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图4显示编码海洋杆菌属物种(Oceanobacter sp.)菌株RED65的FAR酶的密码子优化的多核苷酸序列(SEQ ID NO：5)，所述FAR酶具有图7中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。

图5显示编码海洋杆菌属物种菌株RED65的FAR酶且为在解脂耶罗威亚酵母中表达而被优化的密码子优化的多核苷酸序列(SEQ ID NO：7)，所述FAR酶具有图7中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。

图6显示栖藻海杆菌菌株DG893的FAR多肽的氨基酸序列。由SEQ IDNO：1的多核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与由SEQ ID NO：3的多核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)相同。而理解的是，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4是相同的和可互换的，在本公开内容中一般将提到SEQ ID NO：2。

图7显示海洋杆菌属物种菌株RED65的FAR多肽的氨基酸序列。由SEQ ID NO：5的多核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)与由SEQID NO：7的多核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)相同。而理解的是，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8是相同的和可互换的，在本公开内容中一般将提到SEQ ID NO：6。SEQ ID NO：2的氨基酸序列和SEQ IDNO：6的氨基酸序列约47％相同。

图8显示编码来自蚕蛾家蚕的FAR多肽(SEQ ID NO：10)的密码子优化的多核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。

图9显示来自蚕蛾家蚕的FAR多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12)。

图10显示编码家蚕的FAR酶且为在解脂耶罗威亚酵母中表达而优化的密码子优化的多核苷酸序列(SEQ ID NO：11)，所述FAR酶具有SEQ IDNO：12中所示的氨基酸序列。

图11显示编码水油海杆菌的FAR酶的密码子优化的多核苷酸序列(SEQ ID NO：13)，所述FAR酶具有SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列。

图12显示水油海杆菌的FAR多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。水油海杆菌的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)与栖藻海杆菌DG893的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)具有约78％的序列同一性。

图13描绘经由以下的用于脂肪醇产生的生物合成途径：a)利用脂肪酰ACP和脂肪酰CoA中间体的酰基CoA依赖途径和b)利用脂肪酰ACP中间体但非脂肪酰CoA中间体的酰基CoA非依赖途径，其中化合物式中所用的“R”为C8至C24饱和的、不饱和的、直链的、支链的或环状的烃。发明详述

本公开内容提供FAR酶、包括编码异源FAR酶的核酸的重组宿主细胞、脂肪醇的生物合成的方法，所述方法包括转化脂肪酰硫酯复合物(比如脂肪酰CoA底物和脂肪酰ACP底物)为脂肪醇，和包括通过生物合成方法产生的脂肪醇的组合物。

定义：

除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。一般，本文使用的命名和以下描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学的实验室方法是本领域中熟知的且常用的那些。

如本文所用的，以下的术语意在具有如下的含义：本文使用以下的缩写：“FAR”表示脂肪酰还原酶或脂肪醇形成酰基CoA还原酶；“ACP”表示酰基运载蛋白(carrier protein)；“CoA”表示辅酶A；“TE”表示硫酯酶；“FAS”表示脂肪酸合酶；“FACR”表示脂肪酰CoA还原酶；“FACS”表示脂肪酰CoA合酶(合成酶)和酰基CoA合酶(合成酶)，在本文中可互换使用；且“ACC”表示乙酰CoA羧化酶。

在本文中可互换使用的“脂肪醇形成酰基CoA还原酶”或“脂肪酰还原酶”指催化脂肪酰CoA、脂肪酰ACP或其他脂肪酰硫酯复合物还原为脂肪醇的酶，该还原与NAD(P)H到NAD(P)⁺的氧化相关联，如方案I中所示：

方案I

其中“R”代表C8至C24饱和的、不饱和的、直链的、支链的或环状的烃，且“R₁”代表CoA、ACP或其他的脂肪酰硫酯底物。CoA是参与脂肪酸的合成和氧化的非蛋白酰基运载基团因子(或部分(moiety))。“ACP”是用于脂肪酸的合成的脂肪酸合酶的多肽或蛋白亚基。FAR与FACR不同。FACR仅将脂肪酰CoA中间体还原为脂肪醛，并需要另外的氧化还原酶以生成相应的脂肪醇。如本文所用的“脂肪醛”指饱和的或不饱和的脂族醛，且参考图13，其中R如以上所定义。

如本文所用的术语“脂肪酸”指式III的化合物：

其中“R”如以上所定义。可将饱和的或不饱和的脂肪酸描述为“Ca:b”，其中“a”是代表碳原子的总数的整数，且“b”是指碳链中的双键的数目的整数。

如本文所用的术语“脂肪醇”指式(II)的脂族醇，其中R如以上所定义。可将饱和的或不饱和的脂肪醇描述为“Ca:b-OH”，其中“a”是代表脂肪醇中碳原子的总数的整数，且“b”是指碳链中的双键的数目的整数。

不饱和的脂肪酸或脂肪醇可称为“顺Δ^x”或“反Δ^x”，其中“顺”和“反”指双键周围的碳链构型且“x”表示双键的第一碳的编号，其中碳1是脂肪酸的羧酸碳或与脂肪醇的-OH基团结合的碳。

术语“脂肪酰硫酯”或“脂肪酰硫酯复合物”指式(I)的化合物，其中脂肪酰基部分经由硫酯键与运载部分共价连接。脂肪酰硫酯是本文描述的FAR酶的底物。

术语“脂肪酰CoA”指其中R₁是辅酶A的式(I)的化合物。

术语“脂肪酰ACP”指其中R₁是酰基运载蛋白的式(I)的化合物。

短语“酰基CoA非依赖途径”指通过脂肪酰ACP底物到脂肪醇的直接酶促转化来产生脂肪醇而不包括游离脂肪酸或脂肪酰CoA中间体的使用。该生物合成途径不同于a)诸如在酵母中，经由酰基转移反应将脂肪酰ACP直接转化为脂肪酰CoA的脂肪酰CoA依赖途径，和b)诸如在细菌中，经由游离脂肪酸中间体将脂肪酰ACP转化为脂肪酰CoA的脂肪酰CoA依赖途径，参考图13。

酰基CoA非依赖途径具有避开从游离脂肪酸形成脂肪酰CoA底物的步骤的优点，该步骤需要使用ATP。因此，酰基CoA非依赖途径可比利用游离脂肪酸中间体的酰基CoA依赖途径使用更少的能量。

“转化”指将底物酶促转化为对应产物。“转化百分比”指在指定的条件下在一段时间内还原为产物的底物的百分比。因此，多肽的“酶促活性”或“活性”可以表示为底物到产物的“转化百分比”。

“序列同一性的百分比”、“同一性百分比”和“同源性百分比”在本文中可互换使用以指多核苷酸和多肽之间的对比，并且通过在比较窗(comparison window)中对比两个最佳比对的序列来确定，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分与参考序列(其也可包含空位以优化比对)对比可包含添加或缺失(即，空位)用于两个序列的比对。该百分比可通过以下计算：确定相同核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中都存在的位置数以得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗中位置的总数(包括序列之一具有空位的位置)并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。可选地，该百分比可通过以下计算：确定相同核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中都存在的位置数或核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的位置数以得到匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。本领域技术人员认识到，有许多可用于比对两个序列的确定的算法，且不同的方法可能得出稍微不同的结果。

用于比较的序列的最佳比对可通过以下进行：例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法，1981，Adv.Appl.Math.2：482，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法，1970，J.Mol.Biol.48：443，通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444，通过这些算法的计算机化执行(GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目测(一般参见CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法)，F.M.Ausubel等人编，Current Protocols(最新实验方法)，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.的合资企业，(1995增补版)(Ausubel))。Clustral(Chenna R.，Sugawara H.，Koike T.，Lopez R.，Gibson T.J.，HigginsD.G.，Thompson J.D.，(2003)Multiple sequence alignment with the Clustralseries of programs(利用Clustral系列程序的多序列比对)，Nucleic AcidsRes.，31，3497-3500)和T-Coffee(T-COFFEE：A novel method for multiplesequence alignments(T-COFFEE：用于多序列比对的新颖方法).Notredame，Higgins，Heringa，JMB 302(205-217)2000)软件包也可用于比对序列。

适宜于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等人，1977，Nucleic Acids Res.3389-3402。用于执行BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心的网站公共可获得的。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值的阀值得分T。T称为邻近字得分阀值(Altschul等人，同上)。这些起始邻近字击中(hit)作为启动搜索的种子以寻找含有它们的更长HSP。然后将字击中沿着每个序列的两个方向延伸，直到可增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是＞0)和N(非匹配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。当以下情况时，每个方向中的字击中的延伸被终止：累积比对得分从其最大达到值下降了量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分达到0或以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的敏感度和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4，以及两条链的对比作为缺省值。针对氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵作为缺省值(参见Henikoff和Henikoff，1989，Proc Natl Acad Sci USA 89：10915)。序列比对和序列同一性％的示例性确定可使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys，MadisonWI)中的BESTFIT或GAP程序，使用所提供的缺省参数。

“参考序列”指用于作为序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是更大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的区段。一般地，参考序列为至少20个核苷酸或氨基酸残基长度、至少25个残基长度、至少50个残基长度或核酸或多肽的全长。由于两种多核苷酸或多肽可能各自(1)包括在两种序列之间相似的序列(即完整序列的一部分)，和(2)可进一步包括在两种序列之间不同的序列，因此两种(或更多种)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过比较“比较窗”上两种多核苷酸的序列以鉴定并比较序列相似性的局部区域来进行。

“比较窗”指至少约20个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念上的区段，其中序列可以与至少20个连续核苷酸或氨基酸的参考序列比较，且其中比较窗中的序列的部分可包括与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，20％或更少的添加或缺失(即，空位)以用于两个序列的最佳比对。比较窗可以比20个连续的残基更长，并且包括，任选地30、40、50、100个或更长的窗。

“保守”氨基酸取代或突变指具有相似侧链的残基的可交换性，且因此通常包括用属于相同或相似的氨基酸定义类型的氨基酸来取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用的，如果保守突变可以替代地为从脂肪族残基到脂肪族残基、从非极性残基到非极性残基、从极性残基到极性残基、从酸性残基到酸性残基、从碱性残基到碱性残基、从芳族残基到芳族残基、或受限制残基到受限制残基的取代，则保守突变不包括从亲水残基到亲水残基、从疏水残基到疏水残基、从含羟基的残基到含羟基的残基、或从小残基到小残基的取代。此外，如本文所用的，可将A、V、L或I保守地突变为另一个脂肪族残基或另一个非极性残基。以下的表1显示示例性的保守取代。

表1：保守取代

“非保守取代”指用侧链性质显著不同的氨基酸对多肽中的氨基酸进行取代或突变。非保守取代可使用以上所列的定义的组之间的氨基酸，而非组内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代的区域中肽主链的结构(例如脯氨酸取代甘氨酸)，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。

“缺失”指通过从参考多肽中去除一个或多个氨基酸而对多肽的修饰。缺失可包括去除1个或更多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达组成参考酶的氨基酸总数的10％、或多达氨基酸总数的20％，同时保留酶促活性和/或保留工程化的酶的改良的性质。缺失可针对多肽的内部部分和/或末端部分。在各种实施方案中，缺失可包括连续的区段或可以是不连续的。术语“缺失”还用来指与相应的参考、亲代或“野生型”DNA相比，其中已去除一个或多个核苷酸或核苷酸碱基对的DNA修饰。

“插入”指相对于参考多肽，通过添加一个或多个氨基酸而对多肽的修饰。在一些实施方案中，修饰包括向天然存在的多肽插入一个或多个氨基酸，以及向其他的经修饰的多肽插入一个或多个氨基酸。可在多肽的内部部分插入，或插入到羧基或氨基末端。如本文所用的，插入包括本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续的氨基酸区段，或被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸隔开。术语“插入”还用来指与相应的参考、亲代或“野生型”DNA相比，其中已插入一个或多个核苷酸或核苷酸碱基对的DNA修饰。

相对于指定的参考序列“不同于(differt from/differ from)”指给定的氨基酸或多核苷酸序列与参考序列比对时的差异。一般，当两个序列最佳对齐时，可确定差异。差异包括与参考序列相比氨基酸残基的插入、缺失、或取代。

如本文所用的，在多肽或多核苷酸的情况下，短语“来源于”特定的生物体指起源于生物体的野生型多核苷酸或多肽，和指起源于生物体或通过野生型多核苷酸或多肽的人工操作而产生的其突变体和变体。

如本文所用的，“功能片段”指具有氨基端和/或羧基端缺失的多肽，但其中剩余的氨基酸序列与序列中对应的位置相同，且基本上保留了全长多肽的全部活性。功能片段可包括全长多肽的多达60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％。

“内源性的”多核苷酸、基因、启动子或多肽指起源于特定宿主细胞的任何多核苷酸、基因、启动子或多肽。如果多核苷酸、基因、启动子或多肽已从宿主细胞中去除、经受实验室操作，且然后重新导入到宿主细胞中，则其对于宿主细胞不是内源性的。

“异源性的”多核苷酸、基因、启动子或多肽指导入到宿主细胞中的在该细胞中一般不存在的任何多核苷酸、基因、启动子或多肽，并包括从宿主细胞中取出且然后重新导入到宿主细胞中的任何多核苷酸、基因、启动子或多肽。

关于基因“无活性的”或“失活的”是指具有至少一个受损害的功能的基因。可通过本领域中已知的多种方法使基因失活，包括但不限于，移动遗传元件(例如，转座子)的插入；基因的全部或部分的缺失，从而不生成基因产物，或基因产物为截短的和非功能性的；基因的突变，从而不生成基因产物，或基因产物为截短的和非功能性的；控制基因表达的一个或多个控制元件的缺失或突变，从而不生成基因产物；和类似的方法。在某些实施方案中，可通过非遗传修饰的方法来使基因失活，例如，利用诸如RNAi通过转录水平或转录后水平的基因沉默。

“重组宿主细胞”指已导入异源的多核苷酸、基因、启动子，例如，表达载体的细胞，或指具有整合到基因组中的异源多核苷酸或基因的细胞。

“天然存在”或“野生型”指发现于自然界中的类型。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中、可分离自自然界中的来源且未通过人工操作有意地修饰的序列。野生型生物体指未通过人工操作有意地修饰的生物体。

“密码子优化的”指编码蛋白的多核苷酸的密码子改变为特定生物体中优先使用的那些密码子，从而所编码的蛋白在感兴趣的生物体中高效表达。虽然遗传密码是简并的，即大多数氨基酸由称“同义(synonyms/synonymous)”密码子的几个密码子所代表，熟知的是，特定生物体的密码子使用是非随机的且偏好于特定的密码子三联体。对于给定的基因、共同功能或祖先来源的基因、高表达的蛋白对比低拷贝数蛋白和生物体基因组的聚集蛋白质编码区，该密码子使用偏好性可能更高。在一些实施方案中，可对编码酶的多核苷酸进行密码子优化以用于从选择用于表达的宿主生物体进行最佳生产。

“优选的、最佳、高度密码子使用偏好密码子”互换地指在蛋白质编码区中比编码相同氨基酸的其他密码子使用频率更高的密码子。优选的密码子的确定可与以下有关：单个基因、具有共同功能或起源的一组基因、高度表达的基因中的密码子使用，整个生物体的聚集蛋白质编码区中的密码子频率；相关生物体的聚集蛋白质编码区中的密码子频率或其组合。频率随基因表达水平增加的密码子通常是用于表达的最佳密码子。已知用于确定特定生物体中密码子频率(例如密码子使用、相对同义密码子使用)和密码子偏好的多种方法，包括多变量分析，例如使用聚类分析或对应分析，以及在基因中所用的密码子的有效数目(参见GCG CodonPreference(GCG密码子偏好)，Genetics Computer Group Wisconsin Package(遗传学计算机组Wisconsin软件包)；CodonW，John Peden，University ofNottingham；McInerney，J.O，1998，Bioinformatics 14：372-73；Stenico等人，1994，Nucleic Acids Res.222437-46；Wright，F.，1990，Gene 87：23-29)。可获得不断增加的生物体列表的密码子使用表(参见例如Wada等人，1992，Nucleic Acids Res.20：2111-2118；Nakamura等人，2000，Nucl.AcidsRes.28：292；Duret等人，同上；Henaut和Danchin，“Escherichia coli andSalmonella(大肠杆菌和沙门氏菌)”，1996，Neidhardt等人编，ASM Press，Washington D.C.，第2047-2066页)。其均通过引用并入本文。用于获得密码子使用的数据源可依赖于能够编码蛋白质的任何可用核苷酸序列。这些数据集包括实际已知编码表达的蛋白质的核酸序列(例如完整蛋白质编码序列-CDS)、表达的序列标签(EST)的核酸序列或基因组序列的预测编码区的核酸序列(参见例如Mount，D.，Bioinformatics：Sequence andGenome Analysis(生物信息学：序列和基因组分析)，第8章，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y，2001；Uberbacher，E.C.，1996，Methods Enzymol.266：259-281；Tiwari等人，1997，Comput.Appl.Biosci.13：263-270)，其均通过引用并入本文。

如本文所用的“表达”可包括参与FAR多肽的产生的任何步骤，包括但不限于转录和翻译。

本文定义的“控制序列”包括对本公开内容的多肽的表达必需的或有利的所有组分。对于编码多肽的核酸序列，每个控制序列可以是固有的或外源的。这种控制序列包括但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子、以及转录终止信号和翻译终止信号。控制序列可与连接子一起被提供，以用于导入促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区的连接的特定限制位点的目的。

“可操作地连接”和“可操作地相关(operably associate)”在本文中被定义为一种配置，其中控制序列被适当地放置在与DNA序列的编码序列有关的位置，以使控制序列指导多核苷酸和/或多肽的表达。

“启动子序列”是被宿主细胞识别用于表达编码区的核酸序列。控制序列可包括适当的启动子序列。启动子序列包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中表现出转录活性的任何核酸序列，包括突变启动子、截短启动子和杂合启动子，并且可获自对于宿主细胞为内源性的或异源性的编码细胞外或细胞内多肽的基因。

如本文所用的，用于指细胞的术语“被转化”或“转化”意为细胞具有整合到其基因组中或作为质粒保留经多代的非固有核酸序列。

应注意地是，除非上下文另外清楚地指出，本申请中所用的不定冠词“一(a)”和“一(an)”和定冠词“该(the)”意为一个或多个。并且，本申请中所用的术语“或”意为分隔性的“或”和连接性的“和”。

可用于本公开内容的方法中的FAR酶：

在一方面，本公开内容提供来源于或获自γ蛋白菌(比如海洋γ蛋白菌)的FAR酶和/或其具有FAR活性的功能片段。在一些实施方案中，FAR酶直接分离自其天然存在于其中的γ蛋白菌。在一些实施方案中，FAR酶和/或功能片段分离自经工程化以表达FAR酶或功能片段的异源宿主微生物。FAR酶和/或功能片段可来源于或获自海洋γ蛋白菌的几乎任何属。在某些实施方案中，用于本文公开的方法中的FAR酶对于海洋细菌是内源性的，所述海洋细菌即，从海洋环境中采集的细菌。在各种实施方案中，用于本文公开的方法中的FAR酶对于非海洋细菌的生物体是内源性的。

在一些实施方案中，FAR酶和/或功能片段可来源于或获自交替单胞菌目(Alteromonadales)的γ蛋白菌。在一些实施方案中，FAR酶和/或功能片段可来源于或获自交替单胞菌目的交替单胞菌科(Alteromonadaceae)。在某些实施方案中，FAR酶和/或功能片段可来源于或获自交替单胞菌属(Alteromonadaceae)，比如但不限于交替单胞菌属海杆菌。在一些特定的实施方案中，FAR酶和/或功能片段可来源于或获自海杆菌属物种栖藻海杆菌。在一个特定的实施方案中，FAR酶和/或功能片段可来源于或获自栖藻海杆菌物种菌株DG893。在一些特定的实施方案中，用于本文公开的方法中的FAR酶来自海洋细菌栖藻海杆菌(例如，栖藻海杆菌)DG893(SEQID NO：2)(“FAR_Maa”)。

在一些实施方案中，FAR酶和/或功能片段来源于或获自海杆菌属的物种，包括但不限于，选自栖藻海杆菌、M.alkaliphilus、水油海杆菌(M.aquaeolei)、北极海杆菌(M.arcticus)、苔藓虫海杆菌(M.bryozoorum)、济州岛海杆菌(M.daepoensis)、异常海杆菌(M.excellens)、黄海海杆菌(M.flavimaris)、M.guadonensis、除烃海杆菌(M.hydrocarbonoclasticus)、韩国海杆菌(M.koreenis)、解脂海杆菌(M.lipolyticus)、海滨海杆菌(M.litoralis)、绿岛海杆菌(M.lutaoensis)、近海生海杆菌(M.maritimus)、沉积物海杆菌(M.sediminum)、M.squalenivirans和强酒海杆菌(M.vinifirmus)以及其等值种和同义种(synonymous species)的物种。

在一个特定的实施方案中，FAR酶来源于或获自栖藻海杆菌菌株DG893，且具有与SEQ ID NO：2或其功能片段至少30％相同、至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少93％相同、至少95％相同、至少97％相同和/或至少98％相同的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中，分离的FAR酶具有与SEQ ID NO：2相同的氨基酸序列。

在一个特定的实施方案中，FAR酶来源于或获自水油海杆菌，且具有与SEQ ID NO：14或其功能片段至少30％相同、至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少93％相同、至少95％相同、至少97％相同和/或至少98％相同的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中，分离的FAR酶具有与SEQ ID NO：14相同的氨基酸序列。

在各种实施方案中，分离的FAR酶和/或功能片段获自或来源于选自由Meptuniibacter caesariensis物种菌株MED92、Reinekea属物种(Reinekeasp.)菌株MED297、海洋单胞菌属物种(Marinomonas sp.)菌株MED121、未命名的γ蛋白菌菌株HTCC2207和海杆菌属物种菌株ELB17和其等值种和同义种组成的组的海洋细菌。

在各种实施方案中，FAR酶和/或功能片段可来源于或获自海洋螺菌目(Oceanospirillilales)的γ蛋白菌。在一些实施方案中，FAR酶和/或功能片段可来源于或获自海洋螺菌目(Oceanospirillilales)的海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)。在一些实施方案中，FAR酶和/或功能片段可来源于或获自海洋螺菌科的属，比如但不限于海洋杆菌属。在一个特定的实施方案中，FAR酶和功能片段可来源于或获自海洋杆菌属物种菌株RED65，并具有与SEQ ID NO：6或其功能片段至少30％相同、至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少93％相同、至少95％相同、至少97％相同和/或至少98％相同的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中，用于本文公开的方法中的FAR酶包括与SEQ ID NO：6的序列(“FAR_Ocs”)具有100％同一性的序列或由与SEQ ID NO：6的序列(“FAR_Ocs”)具有100％同一性的序列组成。在另外特定的实施方案中，分离的FAR酶或功能片段获自或来源于Oceanobacter kriegii。在另一些另外特定的实施方案中，分离的FAR酶或功能片段获自或来源于海洋杆菌属菌株WH099。

在各种实施方案中，FAR酶来自海洋细菌并选自由FAR_Hch(哈赫拉菌(Hahella chejuensis)KCTC 2396 GenBank YP_436183.1)；FAR_Mac(来自海洋放线菌属(actinobacterium)菌株PHSC20C1)、FAR_JVC(JCVI_ORF_1096697648832，GenBank登录号EDD40059.1；来自海洋宏基因组(marine metagenome))、FAR_Fer(JCVI_SCAF_1101670217388；来自发现于厄瓜多尔加拉帕戈斯群岛费尔南迪纳岛(Fernandina Island，theGalapagos Islands，Ecuador)区域上升流中深度12米处的海洋细菌)、FAR_Key(JCVI_SCAF_1097205236585，来自发现于佛罗里达州基韦斯特(Key West Florida)海岸附近深度1.7米处的海洋细菌)、和FAR_Gal(JCVI_SCAF_1101670289386，厄瓜多尔加拉帕戈斯群岛伊莎贝拉岛(Isabella Island，Galapagos Islands，Ecuador)深度0.1米处)。以下的表中给出与栖藻海杆菌DG893(FAR_Maa)和海洋杆菌属RED65(FAR_Ocs)的近似序列同一性。

在一个特定的实施方案中，FAR酶分离自或来源于海洋细菌FAR_Gal。在另外的实施方案中，FAR酶或功能片段分离自或来源于选自由葡萄(Vitisvinifera)(GenBank登录号CAO22305.1或CAO67776.1)、食烯烃脱硫菌(Desulfatibacillum alkenivorans)(GenBank登录号NZ_ABII01000018.1)、橙色标桩菌(Stigmatella aurantiaca)(NZ_AAMD01000005.1)和栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)(GenBank登录号：AAQX01001105.1)组成的组的生物体。

在一些实施方案中，尤其适宜于产生脂肪醇的FAR酶或其功能片段通过发现于具有FAR活性的蛋白中的一个或多个结构域的存在来鉴定。在各种实施方案中，一个或多个结构域通过利用隐马尔可夫模型(“HMM”)进行多序列比对以搜索蛋白家族的大型集合，诸如，在http://pfam.sanger.ac.uk/可获得的Pfam集合来鉴定。参见R.D.Finn等人(2008)Nucl.Acids Res.Database Issue 36：D281-D288。

在某些实施方案中，用来鉴定FAR酶的一个或多个结构域属于发现于拟南芥和果蝇的雄性不育蛋白中的、以及发现于来自荷荷巴植物的脂肪酰还原酶(JJFAR)中的NAD结合结构域的家族。参见Aarts MG等人(1997)Plant J.12：615-623。该结合结构域的家族被指定为“NAD_binding_4”(PF07993；参见http://pfam.sanger.ac.uk/family？acc＝PF07993)。在各种实施方案中，发现NAD_binding_4结构域在推定的FAR酶的N末端。在各种实施方案中，用来鉴定具有FAR活性的酶的一个或多个蛋白质结构域属于称作“不育”结构域的结构域的家族(PF03015；参见http://pfam.sanger.ac.uk/family？acc＝PF03015)，其也发现于拟南芥物种和许多其他生物体的雄性不育蛋白中。参见Aarts MG等人(1997)Plant J.12：615-623。在特定的实施方案中，不育结构域发现于推定的FAR酶的C末端附近。在某些特定的实施方案中，用于本文描述的方法中的FAR酶通过N末端附近的至少一个NAD_binding_4结构域的存在和C末端附近的至少一个不育结构域的存在来鉴定。

在某些实施方案中，推定的FAR酶的NAD_binding_4结构域具有与已知NAD_binding_4结构域的氨基酸序列至少10％、比如至少15％、比如至少20％、比如至少25％、比如至少30％、比如至少35％、比如至少40％、比如至少45％、比如至少50％、比如至少60％、比如至少70％、比如至少80％、比如至少85％、比如至少90％或更多相同的氨基酸序列。参见，例如，Aarts MG等人(1997)Plant J.12：615-623。在各种实施方案中，推定的FAR酶的不育结构域具有与已知的不育结构域的氨基酸序列至少10％、比如至少15％、比如至少20％、比如至少25％、比如至少30％、比如至少35％、比如至少40％、比如至少45％、比如至少50％或更多相同的氨基酸序列。参见同上。

在一些实施方案中，推定的FAR酶的NAD_binding_4结构域具有与形成NAD_binding_4 Pfam结构域(PF07993)的定义的一个或多个示例多肽的氨基酸序列至少10％、比如至少15％、比如至少20％、比如至少25％、比如至少30％、比如至少35％、比如至少40％、比如至少45％、比如至少50％、比如至少60％、比如至少70％、比如至少80％、比如至少85％、比如至少90％或更多相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，推定的FAR酶的不育结构域具有与形成不育Pfam结构域(PF03015)的定义的一个或多个示例多肽的氨基酸序列至少10％、比如至少15％、比如至少20％、比如至少25％、比如至少30％、比如至少35％、比如至少40％、比如至少45％、比如至少50％或更多相同的氨基酸序列。在各种实施方案中，推定的FAR酶的NAD_binding_4结构域或不育结构域通过1×10^-4或更小的E-值、比如1×10^-5的E-值、比如1×10^-10的E-值、比如1×10^-15的E-值、比如1×10^-20的E-值、比如1×10^-25的E-值、比如1×10^-30或更低的E-值来鉴定。如本文所用的，术语E-值(期望值)是预期将具有与仅偶然的特殊击中相同或更好的分数的击中的数目。因此，E-值是可评估数据库搜索的显著性的标准。参见，例如，http://pfam.sanger.ac.uk/help；http://www.csb.yale.edu/userguides/seq/hmmer/docs/node5.html。

由于FAR编码序列与编码具有已知FAR活性的蛋白的序列的低同源性，先前未将本文描述的FAR酶识别为FAR酶，所述具有已知FAR活性的蛋白比如来自以下的FAR酶：希蒙得木(S.chinensis)((FAR Sim)；GenBank登录号AAD38039.1；gi|5020215|gb|AAD38039.1|AF149917_1酰基CoA还原酶[希蒙得木]-Plant Physiol.2000 Mar；122(3)：635-44.Purification of a jojoba embryo fatty acyl-coenzyme A reductase andexpression of its cDNA in high erucic acid rapeseed(荷荷巴胚芽脂肪酰辅酶A还原酶的纯化和其cDNA在高芥子酸油菜籽中的表达)；Metz JG，PollardMR，Anderson L，Hayes TR，Lassner MW.PMID：10712526)、家蚕((FARBom)；GenBank登录号BAC79425.1；gi|33146307|dbj|BAC79425.1|脂肪酰还原酶[家蚕]；Proc Natl Acad Sci USA 2003 Aug 5；100(16)：9156-61.Epub2003 Jul 18.Pheromone gland-specific fatty-acyl reductase of the silkmoth，Bombyx mori(家蚕蚕蛾的信息素腺体特异性脂肪酰还原酶).Moto K，Yoshiga T，Yamamoto M，Takahashi S，Okano K，Ando T，Nakata T，Matsumoto S.PMID：12871998)、拟南芥(GenBank登录号DQ446732.1或NM_115529.1；gi|91806527|gb|DQ446732.1|拟南芥克隆pENTR221-At3g44560；gi|8410556|ref|NM_115529.1|拟南芥雄性不育蛋白，推定的(AT3G56700)；Plant Physiol.2009 May 15；166(8)：787-96.Epub 2008Dec 4.Functional expression of five Arabidopsis fatty acyl-CoA reductasegenes in Escherichia coli(5个拟南芥脂肪酰CoA还原酶基因在大肠杆菌中的功能性表达).Doan TT，Carlsson AS，Hamberg M，Bülow L，Stymne S，Olsson P.PMID：19062129)或豆秆野螟(Ostrinia scapulalis)(GenBank登录号EU817405.1；gi|210063138|gb|EU817405.1|豆秆野螟FAR-样蛋白XIII；Insect Biochem.Mol Biol.2009Feb；39(2)：90-5.Epub 2008Oct 26Pheromone-gland-specific fatty-acyl reductase in the adzuki bean borer，Ostrinia scapulalis(Lepidoptera：Crambidae)(赤豆野螟豆杆野螟(鳞翅目：草螟科)中的信息素腺体特异性脂肪酰还原酶)Antony B，Fujii T，Moto K，Matsumoto S，Fukuzawa M，Nakano R，Tatsuki S，Ishikawa Y)。

在某些实施方案中，用于公开的产生脂肪醇的方法的FAR酶对于海洋细菌是内源性的，并具有与诸如以上描述的那些已知FAR酶的氨基酸序列具有小于约35％的序列同一性的氨基酸序列。在各种实施方案中，用于本文公开的方法中的FAR酶对于海洋细菌是内源性的，并具有与先前识别为具有FAR酶活性的多肽的氨基酸序列具有小于约33％的序列同一性，比如小于31％的序列同一性、比如小于约29％的序列同一性、比如小于约27％的序列同一性、比如小于约25％的序列同一性、比如小于约23％的序列同一性、甚至比如小于约22％的序列同一性的氨基酸序列。

在各种实施方案中，用于公开的产生脂肪醇的方法中的FAR酶对于选自由葡萄、食烯烃脱硫菌、橙色标桩菌和栎树猝死病菌组成的组的生物体是内源性的，并具有与诸如以上描述的那些已知FAR酶的氨基酸序列具有小于约65％的序列同一性的氨基酸序列。在各种实施方案中，用于本文公开的方法的FAR酶对于海洋细菌是内源性的，并具有与先前识别为具有FAR酶活性的多肽的氨基酸序列具有小于约60％的序列同一性、比如小于约55％的序列同一性、比如小于约50％的序列同一性、比如小于约45％的序列同一性、比如小于约40％的序列同一性、比如小于约35％的序列同一性、甚至比如小于约34％的序列同一性、比如小于约33％的序列同一性、比如小于约32％的序列同一性、比如小于约31％的序列同一性、比如小于约30％的序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，用于本文公开的方法中的对于栖藻海杆菌DG893内源性的FAR酶是具有SEQ ID NO：2中所列的氨基酸序列的全长多肽。在各种实施方案中，全长FAR酶具有与SEQ ID NO：2中所列的序列至少约75％相同、比如至少约80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，其中氨基酸序列与SEQ ID NO：2中所示的序列小于100％相同，所有氨基酸取代均是保守的。

在各种实施方案中，用于本文公开的方法中的对于栖藻海杆菌DG893内源性的FAR酶是全长多肽的功能片段，所述全长多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中列出。在某些实施方案中，功能片段的氨基酸序列与SEQID NO：2的对应区域的氨基酸序列至少约70％、比如至少约75％、比如至少约80％、比如至少约90％、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同。

在某些实施方案中，用于本文公开的方法中的对于水油海杆菌内源性的FAR酶是具有SEQ ID NO：14中所列的氨基酸序列的全长多肽。在各种实施方案中，全长FAR酶具有与SEQ ID NO：14中所列的序列至少约75％相同、比如至少约75％相同、比如至少约80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，其中氨基酸序列与SEQ ID NO：14中所示的序列小于100％相同，所有氨基酸取代均是保守的。

在各种实施方案中，用于本文公开的方法中的对于水油海杆菌内源性的FAR酶是全长多肽的功能片段，所述全长多肽的氨基酸序列在SEQ IDNO：14中列出。在某些实施方案中，功能片段的氨基酸序列与SEQ ID NO：14的对应区域的氨基酸序列至少约70％、比如至少约75％、比如至少约80％、比如至少约90％、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同。

在某些实施方案中，用于本文公开的方法中的对于海洋杆菌属物种RED65内源性的FAR酶是具有SEQ ID NO：6中所列的氨基酸序列的全长多肽。在各种实施方案中，FAR酶具有与SEQ ID NO：6中所列的序列至少约75％相同、比如至少80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，其中序列同一性小于100％，所有氨基酸取代均为保守的。

在各种实施方案中，用于本文公开的方法中的对海洋杆菌属物种RED65内源性的FAR酶是全长多肽的功能片段，所述全长多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO：6中列出。在某些实施方案中，功能片段具有与SEQ IDNO：6的对应区域的氨基酸序列至少约70％、比如至少约75％、比如至少约80％、比如至少约90％、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。

用于表达FAR酶的核酸：

在另一方面，本公开内容提供编码如以上描述的FAR酶或其功能片段的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA，并可以是单链的或双链的。多核苷酸可分离自天然存在的微生物或完全地或部分地经由合成方法来制备。在一些实施方案中，多核苷酸是被设计以在宿主微生物中提供所编码的FAR酶或功能片段的表达的构建体。由多核苷酸构建体编码的FAR酶或特定片段或功能片段对于宿主微生物可以是内源性的或异源性的。

在本公开内容的各个方面中，由于已知特定的密码子与其编码的氨基酸的对应性，特定FAR酶的多肽序列的可获得性提供能够编码已知序列的多肽的所有多核苷酸的描述。在某些实施方案中，遗传密码的简并性被用来产生编码如本文描述的γ蛋白菌FAR多肽的大量多核苷酸。因此，例如，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU均编码氨基酸精氨酸(R)。因此，在本发明的核酸中由密码子指定精氨酸的每个位置，可将密码子改变为以上描述的对应的密码子中的任何一个而不会改变所编码的多肽。在一些实施方案中，编码本文描述的FAR酶的多核苷酸是密码子优化的以用于在重组宿主细胞中表达。在特定的实施方案中，编码本文描述的FAR酶的多核苷酸是为在细菌、酵母或丝状真菌中的表达被密码子优化的。在各种实施方案中，编码本文描述的FAR酶的多核苷酸是为在产油酵母中的表达被密码子优化的。在某些特定的实施方案中，编码FAR酶的多核苷酸是为在大肠杆菌、酿酒酵母或解脂耶罗威亚酵母中的表达被密码子优化的。

在某些实施方案中，本公开内容提供编码来自海洋细菌的FAR酶的分离的核酸。在一些实施方案中，核酸编码具有与SEQ ID NO：2中所列的序列至少约75％相同、至少约80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列的FAR酶。在一些实施方案中、核酸编码具有与SEQ ID NO：14中所列的序列至少约75％相同、至少约80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列的FAR酶。在另外的实施方案中，核酸编码具有与SEQ ID NO：6中所列的序列至少约75％相同、比如至少80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列的FAR酶。

在各种实施方案中，本公开内容提供编码FAR酶的DNA构建体、载体和多核苷酸以用于在异源重组宿主细胞中表达。在某些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码对于海洋细菌内源性的FAR酶的序列。在一些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码对于海杆菌属物种内源性的FAR酶的序列。在各种实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码对于海洋杆菌属物种内源性的FAR酶的序列。在一些特定的实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码对于栖藻海杆菌DG893或水油海杆菌内源性的FAR酶的序列。在另外特定的实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码对于海洋杆菌属物种RED65内源性的FAR酶的序列。在一些特定的实施方案中，多核苷酸是密码子优化的多核苷酸，比如与SEQ ID NO：1、3、5、7或13具有至少90％(至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％)的序列同一性的多核苷酸。

在某些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码本发明涵盖的全长FAR多肽的序列。在一些实施方案中，DNA构建体、载体或多核苷酸包括编码对于海杆菌属菌株内源性的全长FAR的序列。在一些实施方案中，菌株是栖藻海杆菌DG893，在另外的实施方案中菌株是水油海杆菌。在另外的实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码栖藻海杆菌DG893的FAR多肽的功能片段的序列或水油海杆菌的FAR多肽的功能片段的序列。在各种实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码对于海洋杆菌属物种RED65内源性的全长FAR多肽的序列。在一些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码海洋杆菌属物种RED65的FAR多肽的功能片段的序列。

在某些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码对于栖藻海杆菌DG893内源性的全长FAR多肽的序列，所述全长FAR多肽具有与SEQ ID NO：2中所列的氨基酸序列至少约75％相同、比如至少80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码FAR酶的功能片段的序列，所述FAR酶的功能片段具有与SEQ ID NO：2的对应区域的氨基酸序列至少约80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码对于水油海杆菌内源性的全长FAR多肽的序列，所述全长FAR多肽具有与SEQ IDNO：14所列的氨基酸序列至少约75％相同、比如至少80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码FAR酶的功能片段的序列，所述FAR酶的功能片段具有与SEQ ID NO：14的对应区域的氨基酸序列至少约80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。

在各种实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码对于海洋杆菌属物种RED65内源性的全长FAR多肽的序列，所述全长FAR多肽具有与SEQ ID NO：6中所列的氨基酸序列至少约80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸包括编码FAR酶的功能片段的序列，所述FAR酶的功能片段具有与SEQ ID NO：6的对应区域的氨基酸序列至少约80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。

在另一些另外的实施方案中，本公开内容提供编码对海洋细菌内源性的FAR酶的DNA构建体、载体和多核苷酸，其中所述FAR酶选自由以下组成的组：FAR_Mac(来自海洋放线菌属物种PHSC20C1)、FAR_JVC(JCVI_ORF_1096697648832，GenBank登录号EDD40059.1；来自海洋宏基因组)、FAR_Fer(JCVI_SCAF_1101670217388；来自发现于厄瓜多尔加拉帕戈斯群岛费尔南迪纳岛(Fernandina Island，the Galapagos Islands，Ecuador)区域中上升流中深度12米处的海洋细菌)、FAR_Key(JCVI_SCAF_1097205236585，来自发现于佛罗里达州基韦斯特(Key WestFlorida)海岸附近深度1.7米处的海洋细菌)、和FAR_Gal(JCVI_SCAF_1101670289386，位于厄瓜多尔加拉帕戈斯群岛伊莎贝拉岛(Isabella Island，Galapagos Islands，Ecuador)的深度0.1米处)。

在另一些另外的实施方案中，本公开内容提供编码对海洋细菌内源性的FAR酶的DNA构建体、载体和多核苷酸，所述海洋细菌选自由以下组成的组：M.alkaliphilus、水油海杆菌、北极海杆菌、苔藓虫海杆菌、济州岛海杆菌、异常海杆菌、黄海海杆菌、M.guadonensis、除烃海杆菌、韩国海杆菌、解脂海杆菌、海滨海杆菌、绿岛海杆菌、近海生海杆菌、沉积物海杆菌、M.squalenivirans、强酒海杆菌、Meptuniibacter caesariensis物种菌株MED92、Reinekea属物种菌株MED297、海洋单胞菌属物种菌株MED121、未命名的γ蛋白菌菌株HTCC2207、海杆菌属物种菌株ELB17、Oceanobacter kriegii和海洋杆菌属菌株WH099。

在又一些另外的实施方案中，本公开内容提供编码对于选自由葡萄、食烯烃脱硫菌、橙色标桩菌和栎树猝死病菌组成的组的生物体内源性的FAR酶的DNA构建体、载体和多核苷酸。

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸编码本发明涵盖的FAR酶，且包括包含与SEQ ID NO：1、3、5、7或13的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％和至少99％的序列同一性并与SEQ ID NO：1、3、5、7或13杂交的核酸。当核酸结合时为核酸“杂交”，通常在溶液中。核酸由于多种充分表征的物理化学力而杂交，比如氢键结合、溶剂排斥、碱基堆积和类似的力。如本文所用的，术语“严格杂交洗涤条件”在诸如Southern杂交和Northern杂交的核酸杂交实验的情况下，是序列依赖性的，且在不同的环境参数下是不同的。关于核酸杂交的深入指南见于Tijssen，1993，“LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes，(利用核酸探针的生化和分子生物学杂交中的实验室技术)”第I部分，第2章(Elsevier，New York)，其通过引用并入本文。对于长度至少100个核苷酸的多核苷酸，以下限定了低严格条件至极高严格条件：遵照标准Southern印迹程序，在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切和变性的鲑精DNA、和用于低严格性的25％甲酰胺、用于中严格性和中高严格性的35％甲酰胺或用于高和极高严格性的50％甲酰胺中在42℃下进行预杂交和杂交。对于长度至少100个核苷酸的多核苷酸，利用2×SSC、0.2％SDS，至少在50℃(低严格性)、至少在55℃(中严格性)、至少在60℃(中高严格性)、至少在65℃(高严格性)、和至少在70℃(极高严格性)下最终洗涤运载体材料三次，每次15分钟。

将本文描述的编码FAR酶以用于在异源重组宿主细胞中表达的多核苷酸与启动子可操作地连接，任选地与其他控制序列可操作地连接。适宜的启动子包括组成型启动子、可调控的启动子和诱导型启动子。适当的启动子序列可获自编码对于宿主细胞为内源性的或异源性的胞外或胞内多肽的基因。用于不同强度的启动子的分离、鉴定和操作的方法是本领域中可获得的或易于从本领域中修改的。参见，例如，Nevoigt等人(2006)Appl.Environ.Microbiol.72：5266-5273，其公开内容以其整体通过引用并入本文。

在某些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸适宜于异源FAR酶在细菌中的表达。对于细菌宿主细胞，用于指导本公开内容的核酸构建体的转录的适宜的启动子包括获自以下的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)启动子和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，Proc.NatlAcad.Sci.USA 75：3727-3731(1978))，以及tac启动子(DeBoer等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 80：21-25(1993))。另外的启动子包括trp启动子、噬菌体λPL、T7启动子、发现于PromEC(http://margalit.huji.ac.il/promec/index.html)的启动子和类似的启动子。以下中描述了适宜用于本公开内容中的启动子：“Useful proteins fromrecombinant bacteria(来自重组细菌的有用的蛋白质)”于Scientific American242：74-94(1980)中；和Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York。

在各种实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸适宜于异源的FAR酶在酵母中的表达。在某些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸适宜用于异源性FAR酶在产油酵母中的表达。在各种实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸适宜于异源FAR酶在产油酵母解脂耶罗威亚酵母中的表达。在某些实施方案中，DNA构建体、载体和多核苷酸适宜于异源FAR酶在酿酒酵母中的表达。对于酵母宿主细胞，用于指导本公开内容的核酸构建体的转录的适宜的启动子是技术人员已知的，且包括但不限于，烯醇化酶(ENO-1基因)启动子、半乳糖激酶(GAL1)启动子、乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)启动子、翻译延伸因子EF-1α(TEF1)启动子以及由Romanos等人(1992)Yeast 8：423-488描述的那些启动子。在另外的实施方案中，启动子包括TEF1启动子和RPS7启动子。

对于丝状真菌宿主细胞，用于指导本公开内容的核酸构建体的转录的适宜的启动子包括获自以下基因的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定型α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)，和其突变启动子、截短启动子和杂合启动子。可用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核苷酸构建体的转录的适宜的启动子的实例是启动子诸如cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1、amy和glaA(Nunberg等人，Mol.Cell Biol.，4：2306-2315(1984)，Boel等人，EMBO J 3：1581-1585((1984)和EPA137280)。

在各种实施方案中，表达载体任选地含有用于翻译起始的核糖体结合位点(RBS)、和转录终止子，比如PinII。载体还任选地包括用于扩增表达的适当的序列，例如，增强子。

在各种实施方案中，将可用于在重组宿主细胞中表达异源FAR酶的多核苷酸与另外的控制序列可操作地连接，所述另外的控制序列包括但不限于，转录终止序列、当翻译时指导所表达的多肽进入重组宿主细胞的分泌途径的信号序列、和聚腺苷酸化序列(真核生物)。用于本公开内容的多核苷酸构建体中的适当的控制序列的选择在本领域的技术范围之内，且在各种实施方案中取决于所用的重组宿主细胞和回收产生的脂肪醇组合物的期望的方法。

本公开内容还涉及用于本文描述的方法中的重组表达载体。重组表达载体可以是任何载体，例如，质粒或病毒，其可通过重组DNA技术来操作以有利于异源FAR酶在重组宿主细胞中的表达。在某些实施方案中，表达载体被整合到重组宿主细胞的染色体中，且包括与可用于产生FAR酶的一个或多个控制序列可操作地连接的一个或多个异源基因。在另外的实施方案中，表达载体是染色体外的复制型DNA分子，例如，以低拷贝数(例如，每基因组等价物从约1拷贝至约10拷贝)或以高拷贝数(例如，每基因组等价物约10拷贝以上)呈现的线性或闭环的质粒。在各种实施方案中，表达载体包括选择标记，比如赋予包括载体的重组宿主生物体抗生素抗性(例如，氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。

在某些实施方案中，可用于表达如本文公开的FAR酶的表达载体是商业上可获得的，例如，获自Sigma-Aldrich Chemicals，St.Louis MO和Stratagene，LaJolla CA。在一些实施方案中，适宜的表达载体的例子是质粒，所述质粒来源于pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pREP4、pCEP4(Invitrogen)或pPoly(Lathe等人，1987，Gene 57：193-201)。

在某些实施方案中，本公开内容提供用于在大肠杆菌中表达异源基因的质粒。表达载体pCK110900，其包括P15A复制起点(P15Aori)、lac a CAP结合位点、lac启动子、T7核糖体结合位点(T7g10 RBS)和氯霉素抗性基因(camR)。美国专利公布第2006/0195947号的图3中描绘了该表达载体，其以其整体通过引用并入本文。

在特定的实施方案中，本公开内容提供用于异源基因在耶罗威亚酵母(Yarrowia)中表达的，尤其在解脂耶罗威亚酵母中表达的自主复制型质粒。该质粒载体(pCEN411；图1)经工程化具有用于编码对潮霉素抗性的基因(HygB^R)的表达和用于为解脂耶罗威亚酵母优化的FAR基因的表达的盒。在这些实施方案中，每个基因的表达独立地受分离自解脂耶罗威亚酵母的强组成型启动子调控：用于FAR表达的pTEF1和用于HygB^R表达的pRPS7。当将该质粒转化到解脂耶罗威亚酵母中时，其赋予对潮霉素的抗性并指导FAR的表达。可对该质粒进行进一步修饰以用于可用于脂肪醇产生的异源基因在酵母中，尤其在解脂耶罗威亚酵母中的表达。

在一些实施方案中，使如本文描述的表达载体适于过表达编码直接参与脂肪酸生物合成的非FAR的酶的基因。在特定的实施方案中，过表达的基因编码选自脂肪酸合酶(FAS)、酰基ACP硫酯酶(TE)、脂肪酰CoA合酶(FACS)和乙酰CoA羧化酶(ACC)的蛋白。在一些实施方案中，编码FAR酶的表达载体和编码第二酶(例如，FAS、TE、FACS或ACC)的表达载体是分离的核酸。在另外的实施方案中，异源FAR酶和第二酶在同样的表达载体中被编码，且每个酶的表达受不同的启动子的独立地调控。

用于转化本文描述的宿主细胞诸如细菌、酵母(包括产油酵母)和丝状真菌的方法、试剂和工具是本领域中已知的。用于转化例如细菌的一般方法、试剂和工具可在诸如以下中查找：Sambrook等人(2001)MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第三版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York。以下中描述了用于转化酵母的方法、试剂和工具：“Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(酵母遗传学和分子生物学指南)，”C.Guthrie和G.Fink，编辑.，Methods in Enzymology(酶学方法)350(Academic Press，San Diego，2002)。用于转化解脂耶罗威亚酵母的方法、试剂和工具在以下中查找：“Yarrowia lipolytica(解脂耶罗威亚酵母)，”C.Madzak，J.M.Nicaud和C.Gaillardin于“Production ofRecombinant Proteins.Novel Microbial and Eucaryotic Expression Systems(重组蛋白的产生.新颖微生物和真核表达系统)，”G.Gellissen，编辑.2005中。在一些实施方案中，将本发明的DNA构建体或载体导入到宿主细胞中可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔或其他常用技术(参见Davis等人，1986，Basic Methods in Molecular Biology(分子生物学基本方法)，其通过引用并入本文)来实现。本发明还提供用于产生重组宿主细胞的方法，其中所述方法包括：(a)提供本发明的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括编码如本文描述的FAR多肽的多核苷酸；和(b)利用所述核酸构建体转化宿主细胞以产生重组细胞。在特定的实施方案中，宿主细胞将是细菌细胞，在另外特定的实施方案中，宿主细胞将是酵母细胞。

用于产生脂肪醇的重组微生物：

在又一方面，本公开内容提供经工程化以表达如本文描述的异源FAR酶或其功能片段的重组微生物。在某些特定的方面，本公开内容提供经工程化以表达如本文描述的来自海洋γ蛋白菌的异源FAR酶或其功能片段的重组微生物，以用于从脂肪酰ACP底物产生脂肪醇。在另外的实施方案中，本公开内容提供经工程化以表达来自选自由葡萄、食烯烃脱硫菌、橙色标桩菌和栎树猝死病菌组成的组的生物体的异源FAR酶的重组微生物。在某些实施方案中，可使FAR酶在其天然存在的宿主细胞中表达。在各种实施方案中，可使FAR酶在异源宿主细胞中表达。特别地，当在本文描述的异源宿主细胞中表达时，FAR酶能够从脂肪酰ACP底物产生高产量的总脂肪醇和分泌的脂肪醇。

在各种实施方案中，可用于表达本文描述的FAR酶的异源宿主细胞选自细菌、酵母或丝状真菌。在某些实施方案中，酵母是产油酵母。

在某些实施方案中，可用作重组宿主细胞的微生物是野生型微生物。

在各种实施方案中，可用作重组宿主细胞的微生物是经遗传修饰的。如本文所用的，“遗传修饰的”微生物包括去除了一个或多个内源基因的微生物、具有与亲代微生物或野生型微生物相比降低的表达的一个或多个内源基因的微生物、或具有与亲代微生物或野生型微生物相比过表达的一个或多个内源基因的微生物。在某些实施方案中，过表达的一个或多个基因对于微生物是内源性的。在一些实施方案中，过表达的一个或多个基因对于微生物是异源性的。

在某些实施方案中，遗传修饰的微生物包括编码参与脂肪酰CoA底物的生物合成的蛋白的失活的或沉默的内源基因。在特定的实施方案中，失活的或沉默的基因编码脂肪酰ACP硫酯酶或脂肪酰CoA合成酶(FACS)。

在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞。适宜的原核细胞包括革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞和革兰氏染色不定细菌细胞。在某些实施方案中，宿主细胞包括，但不限于，选自由以下组成的组的属的物种：土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、不动杆菌属(Acinetobacter)、热酸菌属(Acidothermus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、巴克纳氏菌属(Buchnera)、Campestris、弯曲菌属(Camplyobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、着色菌属(Chromatium)、粪球菌属(Coprococcus)、蓝细菌属(Cyanobacteria)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、Faecalibacterium、弗朗西斯菌属(Francisella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、泥杆菌属(Ilyobacter)、微球菌属(Micrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、中生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、罗斯氏菌属(Roseburia)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、栅藻属(Scenedesmun)、链霉菌属(Streptomyces)、链球菌属(Streptococcus)、聚球蓝细菌属(Synechooccus)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)、养障体属(Tropheryma)、土拉菌属(Tularensis)、Temecula、海链藻属(Thalassiosira)、热聚球蓝细菌属(Thermosynechococcus)、热球菌属(Thermococcus)、脲原体属(Ureaplasma)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、木杆菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和发酵单胞菌属(Zymomonas)。在特定的实施方案中，宿主细胞是选自由以下组成的组的属的物种：土壤杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、地芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、乳酸杆菌属、分枝杆菌属、泛菌属、红球菌属、链霉菌属和发酵单胞菌属。

在某些实施方案中，重组宿主细胞是工业细菌菌株。许多细菌工业菌株是已知的，且适用于本文公开的方法中。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是芽孢杆菌属的物种，例如，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、短芽孢杆菌(B.brews)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、B.alkaophius、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。在特定的实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属的物种，并选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。

在一些实施方案中，细菌宿主细胞是欧文氏菌属的物种，例如噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、草生欧文氏菌(E.herbicola)、斑点欧文氏菌(E.punctata)或E.terreus。

在另外的实施方案中，细菌宿主细胞是泛菌属的物种，例如，柠檬泛菌(P.citrea)或成团泛菌(P.agglomerans)。

在另一些另外的实施方案中，细菌宿主细胞是链霉菌属的物种，例如，产二素链霉菌(S.ambofaciens)、不产色链霉菌(S.achromogenes)、除虫链霉菌(S.avermitilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、金霉素链霉菌(S.aureofaciens)、金色链霉菌(S.aureus)、杀真菌素链霉菌(S.fungicidicus)、灰色链霉菌(S.griseus)或浅青紫链霉菌(S.lividans)。

在另外的实施方案中，细菌宿主细胞是发酵单胞菌属的物种，例如，运动发酵单胞菌(Z.mobilis)或解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica)。

在另外的实施方案中，细菌宿主细胞是红球菌属的物种，例如混浊红球菌(R.opacus)。

在特定的实施方案中，细菌宿主细胞是埃希氏菌属的物种，例如大肠杆菌。在某些实施方案中，大肠杆菌是野生型细菌。在各种实施方案中，可用于本文描述的方法中的野生型大肠杆菌细菌菌株选自，但不限于菌株W3110、菌株MG1655和菌株BW25113。在另外的实施方案中，大肠杆菌是经遗传修饰的。可用作重组宿主细胞的遗传修饰的大肠杆菌的例子包括，但不限于，发现于奎夫中心(Keio Collection)，从日本静冈411-8540，三岛，一田1111，日本国家遗传学研究所，微生物遗传学实验室，国家生物资源项目NBRP大肠杆菌(National BioResource Project at NBRP E.coli，Microbial Genetics Laboratory，National Institute of Genetics 1111 Yata，Mishima，Shizuoka，411-8540 Japan)(www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/top/top.jsp)可获得的遗传修饰的大肠杆菌。

在特定的实施方案中，遗传修饰的大肠杆菌包括失活的或沉默的内源fadD基因，其编码酰基CoA合成酶蛋白。在另外的实施方案中，遗传修饰的大肠杆菌包括失活的或沉默的内源fadK基因，其编码内源短链酰基CoA合成酶。在又一些另外的实施方案中，遗传修饰的大肠杆菌包括失活的或沉默的内源fadD基因和失活的或沉默的内源fadK基因。在另外的实施方案中，遗传修饰的大肠杆菌包括与亲代菌株或野生型菌株相比具有降低的表达的内源fadD基因。在各种实施方案中，遗传修饰的大肠杆菌包括与亲代菌株或野生型菌株相比具有降低的表达的内源fadK基因。

在某些实施方案中，重组宿主细胞是酵母。在各种实施方案中，酵母宿主细胞是选自由以下组成的组的属的物种：假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和耶罗威亚酵母属(Yarrowia)。在特定的实施方案中，酵母宿主细胞是选自由酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属和耶罗威亚酵母属组成的组的属的物种。

在各种实施方案中，酵母宿主细胞选自由以下组成的组：多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡氏酵母(Saccaromyces carlsbergensis)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、奇异酵母(Saccharomyces norbensis)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichiatrehalophila)、发酵毕赤酵母(Pichia ferniemtans)、Pichia kodamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia quercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色假丝酵母(Candidaalbicans)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、乙醇假丝酵母(Candidaethanolic)和解脂耶罗威亚酵母和其异名等价物和分类学等价物。

在某些实施方案中，酵母宿主细胞是野生型细胞。在各种实施方案中，野生型酵母细胞菌株选自但不限于菌株BY4741、菌株FL100a、菌株INVSC1、菌株NRRL Y-390、菌株NRRL Y-1438、菌株NRRL YB-1952、菌株NRRL Y-5997、菌株NRRL Y-7567、菌株NRRL Y-1532、菌株NRRLYB-4149和菌株NRRL Y-567。在另外的实施方案中，酵母宿主细胞是经遗传修饰的。可用作重组宿主细胞的遗传修饰的酵母的例子包括，但不限于，发现于http://www.openbiosystems.com/GeneExpression/Yeast/YKO/的Open Biosystems collection中的遗传修饰的酵母。参见Winzeler等人(1999)Science 285：901-906。

在另外的实施方案中，重组宿主细胞是产油酵母。产油酵母是累积诸如三酰基甘油的脂质的生物体。产油酵母的例子包括，但不限于，选自由以下组成的组的生物体：解脂耶罗威亚酵母、副解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia paralipolytica)、Candida revkaufi、铁红假丝酵母(Candidapulcherrima)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、弯假丝酵母D(Candida curvata D)、弯假丝酵母R(Candida curvataR)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensiae)、博伊丁假丝酵母(Candidaboldinii)、粘红酵母(Rhodotorula glutinous)、禾本红酵母(Rhodotorulagraminis)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、小红酵母(Rhodotorulaminuta)、Rhodotorula bacarum、红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、浅白隐球酵母(terricolus)浅白变种(Cryptococcus(terricolus)albidus var.albidus)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、Trichosporon pullans、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、Trichosporon cutancum、丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyii)、产油油脂酵母(Lipomyces lipoferus)、子囊菌油脂酵母(Lipomyces tetrasporus)、产脂拟内孢霉(Endomycopsis vernalis)、西弗汉逊酵母(Hansenula ciferri)、土星汉逊酵母(Hansenula saturnus)和变异三角酵母(Trigonopsisvariables)。在特定的实施方案中，产油酵母是解脂耶罗威亚酵母。在某些实施方案中，解脂耶罗威亚酵母菌株包括，但不限于，DSMZ 1345、DSMZ3286、DSMZ 8218、DSMZ 70561、DSMZ 70562、DSMZ 21175和从美国农业研究局(Agricultural Research Service)(NRRL)可获得的菌株，比如但不限于NRRL YB-421、NRRL YB-423、NRRL YB-423-12和NRRLYB-423-3。

在某些实施方案中，产油酵母是野生型生物体。在另外的实施方案中，产油酵母是经遗传修饰的。

在又一些另外的实施方案中，重组宿主细胞是丝状真菌。在某些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是选自由以下组成的组的属的物种：绵霉属(Achlya)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、头孢霉属(Cephalosporium)、金孢属(Chrysosporium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、色二孢属(Diplodia)、Endothis、镰孢菌属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、胶枝霉属(Gliocladium)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、毁丝霉属(Myceliophthora)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、柄孢壳菌属(Podospora)、射脉菌属(Phlebia)、Piromyces、梨形孢属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱霉属(Scytalidium)、侧孢霉属(Sporotrichum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、栓菌属(Trametes)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、轮枝孢属(Verticillium)、草菇属(Volvariella)、和其有性型、异名等价物或分类学等价物。

在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是曲霉属物种、金孢属物种、棒囊壳属物种、镰孢菌属物种、腐质霉属物种、毁丝霉属物种、脉孢菌属物种、青霉属物种、弯颈霉属物种、栓菌属物种或木霉属物种。在另外的实施方案中，木霉属物种选自长枝木霉(T.longibrachiatum)、绿色木霉(T.viride)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)和里氏木霉(T.reesei)；曲霉属物种选自泡盛曲霉(A.awamori)、烟曲霉(A.fumigatus)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、臭曲霉(A.foetidus)、米曲霉(A.oryzae)、酱油曲霉(A.sojae)和A.kawachi；金孢属物种为C.lucknowense；镰孢菌属物种选自禾谷镰孢菌(F.graminum)、尖孢镰孢菌(F.oxysporum)和F.venenatum；毁丝霉属物种为嗜热毁丝霉(M.thermophilia)；脉孢菌属物种为粗糙脉孢菌(N.crassa)；腐质霉属物种选自特异腐质霉(H.insolens)、灰腐质霉(H.grisea)和柔毛腐质霉(H.lanuginosa)；青霉属物种选自产紫青霉(P.purpurogenum)、产黄青霉(P.chrysogenum)和疣孢青霉(P.verruculosum)；梭孢壳属物种为太瑞斯梭孢壳(T.terrestris)；且栓菌属物种选自长绒毛栓菌(T.villosa)和变色栓菌(T.versicolor)。

在一些实施方案中，丝状真菌宿主是野生型生物体。在另外的实施方案中，丝状真菌宿主是经遗传修饰的。

在某些特定的实施方案中，用于本文描述的方法中的重组宿主细胞来源于大肠杆菌、芽孢杆菌属、酵母属、链霉菌属和耶罗威亚酵母属的菌株。

在各种实施方案中，可用于本公开内容的实践中的重组宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，其易于从许多培养物保藏中心获得，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)(德国微生物和细胞培养物保藏中心)、荷兰真菌保藏所(CBS)、和美国北方农业研究所专利培养物保藏中心(NRRL)。

在各种实施方案中，重组微生物过表达编码FAR酶的基因。在一些实施方案中，FAR酶对于微生物是内源性的。在另外的实施方案中，FAR酶对于微生物是异源性的。

在某些实施方案中，重组微生物过表达编码非FAR酶的一种或多种蛋白的基因。在各种实施方案中，一种或多种过表达的蛋白提高了重组细胞产生酰基硫酯FAR底物的速率，所述酰基硫酯FAR底物例如以上所示的式(I)的化合物。在一些实施方案中，一种或多种过表达的基因编码直接参与脂肪酸生物合成的蛋白。在特定的实施方案中，一种或多种过表达的基因编码选自脂肪酸合酶(FAS)、酰基-ACP硫酯酶(TE)、脂肪酰CoA合酶(FACS)和乙酰CoA羧化酶(ACC)的蛋白。在一些实施方案中，过表达的基因对于微生物是内源性的。在另外的实施方案中，过表达的基因对于微生物是异源性的。

“脂肪酸合酶(FAS)”指催化乙酰CoA单元和丙二酰CoA单元转化为脂肪酰ACP的酶或酶复合物，如方案II中所列，并参考图13：

方案II

其中R具有如以上定义中所列出的相同含义。在某些实施方案中，FAS包括一个以上的不同的酶活性。在各种实施方案中，不同的酶活性存在于分离的多肽中。在一些实施方案中，分离的多肽形成一个或多个蛋白复合物。

术语“酰基-ACP硫酯酶(TE)”指催化酰基ACP裂解而形成脂肪酸的酶，如方案III中所示且参考图13，其中R具有如以上所列出的相同含义：

方案III

“FACS”指如以下方案IV中所示，催化在脂肪酸的酰基部分和辅酶A之间形成共价复合物的酶，其中R具有如以上所列出的相同含义：

方案IV

术语“乙酰CoA羧化酶(ACC)”指如以下方案V中所示，催化乙酰CoA转化为丙二酰CoA的酶：

方案V

通过酰基CoA非依赖途径合成脂肪醇：

图13示出脂肪醇形成的生物合成途径。FAR酶可直接作用于脂肪酰CoA底物以形成脂肪醇。然而，如本文更详细地描述的，本发明人已发现，在某些包括编码本发明涵盖的FAR的基因且缺乏功能性的内源脂肪酰CoA合成酶(FACS)的微生物中产生的脂肪醇的量与具有功能性的内源FACS基因的微生物产生的脂肪醇的量相当。参考图13，缺少功能性FACS基因的重组微生物不催化从脂肪酸形成脂肪酰CoA底物。因此，本发明人已推测，代替利用脂肪酰CoA底物，或除利用脂肪酰CoA底物之外，如本文描述的FAR酶(诸如海洋γ蛋白菌FAR酶)经由酰基CoA非依赖途径从脂肪酰ACP底物催化脂肪醇的生物合成。

在某些实施方案中，本公开内容涉及如本文描述的FAR酶用于产生脂肪醇组合物的用途，所述FAR酶例如，来自海洋细菌的FAR酶。本文描述的FAR酶利用脂肪酰ACP底物代替脂肪酰CoA底物或除脂肪酰CoA底物之外利用脂肪酰ACP底物的发现为产生脂肪醇提供更有效的方法。在宿主中，比如在大肠杆菌中，其经由游离脂肪酸将脂肪酰ACP转化为脂肪酰CoA，脂肪酰CoA复合物的形成需要ATP。因此，在酰基CoA非依赖途径中，因为如本文描述的通过FAR酶(例如，海洋细菌FAR酶)从脂肪酰ACP产生脂肪醇避开了该步骤，所以形成脂肪醇组合物使用较少的能量。本发明人关于本发明涵盖的FAR的作用机制的发现还允许在不产生脂肪酰CoA底物或与野生型微生物或亲代微生物相比产生低水平的酰基CoA底物的重组细胞中产生脂肪醇。因此脂肪醇可由缺少参与脂肪酰CoA底物的生物合成的功能性的内源酶的重组微生物来产生。因此在一些方面，脂肪醇可由表达编码本文描述的FAR酶的基因且缺少编码脂肪酰CoA合成酶(FACS)的基因和/或编码脂肪酰ACP硫酯酶(TE)的基因的重组微生物来产生。

因此，在一些实施方案中，本公开内容提供通过酰基CoA非依赖途径产生脂肪醇的作用机制，其中代替作用于脂肪酰CoA底物，或除作用于脂肪酰CoA底物之外，本发明涵盖的某些FAR酶可作用于脂肪酰ACP底物以产生脂肪醇。在本方面的一些实施方案中，本发明涵盖的FAR酶包括但不限于，来自海杆菌属物种，诸如海杆菌属物种栖藻海杆菌(DG893)和水油海杆菌，和海洋杆菌属物种菌株RED65的FAR酶或其功能片段，可在不存在被认为是FAR酶的主要底物的脂肪酰CoA底物时，或存在低水平的脂肪酰CoA底物时产生与存在正常水平的脂肪酰CoA底物时产生的脂肪醇的水平相当的脂肪醇的水平。在该方面的另外的实施方案中，本发明涉及包括编码根据本发明的FAR酶的核酸，和失活的或沉默的内源脂肪酰ACP硫酯酶基因，和失活的或沉默的内源脂肪酰CoA合成酶基因或两者的重组宿主细胞。在一些实施方案中，本文以上提供的重组微生物不产生可检测水平的脂肪酰CoA底物，在另外的实施方案中，重组微生物产生与野生型细胞相比降低的水平的脂肪酰CoA底物。

在一个优选的实施方案中，脂肪醇通过酰基CoA非依赖途径来产生，包括，在适宜的培养条件下培养重组细菌细胞，其中重组细菌细胞包括编码本发明涵盖的异源FAR多肽的基因，且其中重组细菌细胞包括选自编码酰基CoA合成酶蛋白的fadD基因、编码内源的短链酰基CoA合成酶的fadK基因，或二者的一个或多个失活的或沉默的内源多核苷酸；允许编码异源FAR酶的基因的表达和通过转化脂肪酰ACP底物产生脂肪醇。

在某些实施方案中，重组宿主细胞是大肠杆菌细胞。在本方面的一些实施方案中，FAR酶来源于栖藻海杆菌(DG893)、水油海杆菌和海洋杆菌属物种菌株RED65或其功能片段。在某些实施方案中，用于本文公开的方法中的FAR酶具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14中所列的序列或其功能片段至少约75％相同、至少约80％相同、比如至少约85％相同、比如至少约90％相同、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％相同的氨基酸序列。

产生脂肪醇和脂肪醇的组合物的方法：

在本公开内容的各个方面中，可在无细胞系统中产生脂肪醇。在某些实施方案中，提供如本文描述的FAR酶与底物和所有必需辅因子以进行从脂肪酰硫酯酶底物产生脂肪醇。在某些方面，可由表达如本文描述的异源FAR酶的重组微生物来产生脂肪醇。在特定的方面中，可由表达异源FAR酶和非FAR酶的一种或多种蛋白的重组微生物来产生脂肪醇。在一些实施方案中，由重组微生物产生的脂肪醇被分泌到营养培养基中。在另外的实施方案中，从重组微生物中萃取由微生物产生的脂肪醇。

在某些实施方案中，本公开内容涉及如本文描述的FAR酶用于在无细胞系统中产生脂肪醇组合物的用途，所述FAR酶例如，来自海洋γ蛋白菌的FAR酶。在一些实施方案中，在温度、pH和离子强度的适宜条件下和足以产生脂肪醇组合物的时间提供FAR酶与例如式(I)的脂肪酰硫酯的底物和NAD(P)H。在一些实施方案中，在温度、pH和离子强度的适宜条件下和足以通过脂肪酰CoA合酶产生FAR酶的脂肪酰CoA底物并从脂肪酰CoA底物产生脂肪醇组合物的时间提供FAR酶与脂肪酸、辅酶A、ATP、NAD(P)H和脂肪酰CoA合酶的组合物。

在本公开内容的某些实施方案中，由包括编码如本文描述的FAR酶的异源基因的重组宿主细胞来产生脂肪醇组合物，在适宜于产生脂肪醇组合物的条件下将所述重组宿主细胞培养于包括可同化碳源的含水营养培养基中。在一些实施方案中，由包括编码如本文描述的FAR酶的异源基因的重组宿主细胞来产生脂肪醇，且重组宿主细胞包括选自酰基ACP硫酯酶和脂肪酰CoA合成酶的失活的或沉默的基因。

在各种实施方案中，重组宿主细胞是细菌。在特定的实施方案中，细菌是大肠杆菌。在另外的实施方案中，重组宿主细胞是酵母。在特定的实施方案中，酵母是酿酒酵母。在某些实施方案中，酵母是产油酵母。在某些特定的实施方案中，产油酵母是解脂耶罗威亚酵母。

在各种实施方案中，由包括编码来自海洋细菌的FAR酶的异源基因的重组宿主细胞来产生脂肪醇组合物，且所述重组宿主细胞过表达编码提高重组宿主细胞产生例如以上式(I)的化合物的酰基硫酯FAR底物的速率的一种或多种蛋白的基因。在一些实施方案中，一个或多个过表达的基因编码直接参与脂肪酸生物合成的蛋白。在特定的实施方案中，一个或多个过表达的基因编码选自脂肪酸合酶(FAS)、酰基-ACP硫酯酶(TE)、脂肪酰CoA合酶(FACS)和乙酰CoA羧化酶(ACC)的蛋白。

“培养(culture/cultivation)”指在液体或固体培养基中在适宜的条件下培养微生物细胞的群体。在特定的实施方案中，培养是指底物到终产物的发酵性生物转化。培养基是熟知的且所述培养基的单独的组分可从商业来源获得，例如，以Difco^TM和BBL^TM商标获得。在一个非限制性的实例中，含水营养培养基是“丰富培养基”，其包括氮、盐和碳的复合源，比如YP培养基，其包括10g/L的蛋白胨和10g/L的酵母提取物，属于此类培养基。

在另外的非限制性实施方案中，含水营养培养基包括补充有适当的氨基酸混合物的酵母氮源(Yeast Nitrogen Base)(Difco)的混合物，例如，SC培养基。在本实施方案的特定方面中，氨基酸混合物缺少一种或多种氨基酸，因此对在重组宿主细胞内维持表达载体施加了选择性压力。

在适宜条件下进行包括用于产生脂肪醇的异源FAR基因的重组宿主细胞的发酵并持续足以产生脂肪醇的时间。用于包括细菌细胞和酵母细胞的细胞的培养和产生条件是易于获得的。细胞培养基一般在Atlas和Parks(编辑)The Handbook of Microbiological Media(微生物培养基手册)(1993)CRC Press，Boca Raton，FL中列出，其通过引用并入本文。用于细胞培养的另外的信息发现于可商业获得的文献中，诸如来自Sigma-Aldrich，Inc(St Louis，MO)的Life Science Research Cell Culture Catalogue(生命科学研究细胞培养目录)(1998)(“Sigma-LSRCCC”)和，例如，同样来自Sigma-Aldrich，Inc(St Louis，MO)的The Plant Culture Catalogue andsupplement(植物培养目录和补充物)(1997)(“Sigma-PCCS”)，其均通过引用并入本文。

在一些实施方案中，在分批发酵或连续发酵条件下培养表达如本文描述的异源FAR基因的细胞。经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵的起始设定培养基的组成，且在发酵过程中不经受人工改变。分批系统的一个变化形式是分批给料(fed-batch)发酵，其也用于本发明。在该变化形式中，随发酵进行以增量添加底物。当分解代谢物阻遏作用可能抑制细胞的代谢和当期望培养基中具有有限的量的底物时，分批给料系统是有用的。分批发酵和分批给料发酵是本领域中常见的和熟知的。连续发酵是开放的系统，其中将确定成分的发酵培养基连续添加到生物反应器中并同步地去除等量的条件培养基以加工。连续发酵一般将培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要在对数期生长中。连续发酵系统力求维持稳态生长条件。用于调节连续发酵方法的营养物和生长因子的方法以及使产物形成的速率最大化的技术是工业微生物的领域中熟知的。

在一些实施方案中，发酵在从约10℃至约60℃、从约15℃至约50℃、从约20℃至约45℃、和从约25℃至约40℃的范围内的温度下进行。在特定的方面中，发酵在从约28℃以及从约30℃的温度下进行。在另外的实施方案中，发酵进行持续从约8小时至240小时、从约8小时至168小时、从约16小时至约144小时、从约16小时至约120小时或从约24小时至约72小时的范围内的时间段。将理解的是，在其中使用热稳定宿主细胞的某些实施方案中，可在较高的温度下进行发酵。在另外的实施方案中，将在从4至8的范围内、从4.5至7.5的范围内、从5至7的范围内、和从5.5至6.5的范围内的pH下进行发酵。

可用于其中培养重组微生物的公开的方法中的含水发酵培养基或肉汤中的碳源是重组宿主菌株可同化的那些碳源。可同化碳源可以许多形式获得，且包括可再生碳源和从其获得的纤维素原料底物和淀粉原料底物。这样的例子包括例如单糖、二糖、寡糖、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸、琥珀酸酯、乙酸酯和其混合物。另外的碳源包括，但不限于，葡萄糖、半乳糖、蔗糖、木糖、果糖、甘油、阿拉伯糖、甘露糖、棉籽糖、乳糖、麦芽糖和其混合物。在一些实施方案中，术语“可发酵糖类”与术语“可同化碳源”互换地使用。在一方面，利用葡萄糖和半乳糖的混合物作为可同化碳源来进行发酵。在另一方面，利用单独的葡萄糖来进行发酵以累积生物质，在发酵之后基本上去除葡萄糖并替换为诱导物例如半乳糖，以用于诱导参与脂肪醇产生的一种或多种异源基因的表达。在又一方面，利用不介导葡萄糖阻遏作用的可同化碳源例如棉籽糖来进行发酵，以累积生物质，在发酵之后，添加诱导物例如半乳糖以诱导参与脂肪醇产生的一种或多种异源基因的表达。在一些优选的实施方案中，可同化碳源来自纤维素原料和淀粉原料，所述纤维素原料和淀粉原料来源于，但不限于，木材、木浆、纸浆、谷物、玉米秸秆、玉米纤维、大米、造纸和制浆废弃物、木本植物或草本植物、水果或蔬菜浆、酒糟、草、稻壳、麦秆、棉花、大麻、亚麻、剑麻、玉米芯、甘蔗渣、柳枝稷和其混合物。

在各种实施方案中，本公开内容涉及产生脂肪醇组合物的方法，所述方法包括在产生脂肪醇组合物的条件下，在包括可同化碳源的含水营养培养基中培养包括表达异源FAR酶的基因的重组宿主细胞，并分离脂肪醇。

在公开的方法的某些实施方案中，通过本文描述的方法产生的脂肪醇的至少10％、比如至少20％、比如至少25％、比如至少30％、比如至少40％、比如至少50％、比如至少60％、比如至少70％、比如至少80％、比如至少90％被分泌到培养基中。在特定的实施方案中，当重组微生物是大肠杆菌、耶罗威亚酵母(例如，解脂耶罗威亚酵母)或酵母(例如，酿酒酵母)时，通过本发明涵盖的方法产生的脂肪醇的至少25％和至少50％将被分泌到培养基中。

在各种实施方案中，通过本发明的方法产生的脂肪醇被进一步回收或分离。回收或分离产生的脂肪醇是指将脂肪醇与培养基或发酵过程的其他组分基本上分离。回收或分离可通过利用适宜的与水不混溶的溶剂对含水营养培养基进行溶剂萃取来进行。萃取可与脂肪醇产生同时发生，且萃取可以是连续的。溶剂去除后的相分离提供脂肪醇，然后可利用本领域中已知的方法和设备对其进一步纯化和分馏。在本公开内容的另外的方面，分泌的脂肪醇聚结(coalesce)而形成与水不混溶的相，在发酵过程中或在发酵完成之后可将该相与含水营养培养基直接分离。

在一些实施方案中，通过本文描述的方法产生的脂肪醇的60％以下、约50％以下、比如约40％以下、比如约30％以下、比如约20％以下、比如约10％以下从重组宿主细胞中分泌。在一些实施方案中，通过本文描述的方法产生的脂肪醇的至少约30％、比如至少约40％、比如至少约45％、比如至少约50％、比如至少约60％、比如至少约65％、比如至少约70％、比如至少约75％、比如至少约80％、比如至少约85％、比如至少约90％从重组宿主细胞中分泌。在某些实施方案中，通过从含水营养培养基中分离细胞来分离脂肪醇，例如通过利用有机溶剂或溶剂混合物从重组宿主细胞中离心、重悬和萃取脂肪醇。从重组宿主细胞和/或培养基中回收脂肪醇的适宜的方案是技术人员已知的。在一些实施方案中，可利用常规方法通过首先裂解细胞以释放脂肪醇且然后从裂解物中萃取脂肪醇来回收脂肪醇。还参考Yeast Protocols Handbook(酵母实验方案手册)，(2009)ClontechLaboratories，Inc.A Takara Bio Company，Mt.View CA 94043和PNAS 2003100卷，16：9156-9161。

在一些实施方案中，本公开内容涉及由重组宿主细胞产生的脂肪醇组合物，所述重组宿主细胞包括编码本发明涵盖的FAR酶和本文以上描述的FAR酶中的任何一种的基因。在一些特定的实施方案中，FAR酶来源于γ蛋白菌的海杆菌属或海洋杆菌属物种。在一些实施方案中，FAR酶来源于选自以下但不限于以下的海杆菌属物种：栖藻海杆菌DG893、M.alkaliphilus、水油海杆菌、北极海杆菌、苔藓虫海杆菌、济州岛海杆菌、异常海杆菌、黄海海杆菌、M.guadonensis、除烃海杆菌、韩国海杆菌、解脂海杆菌、海滨海杆菌、绿岛海杆菌、近海生海杆菌、沉积物海杆菌、M.squalenivirans和强酒海杆菌。在各种实施方案中，FAR酶获自选自由以下组成的组的海洋细菌：Meptuniibacter caesariensis物种菌株MED92、Reinekea属物种菌株MED297、海洋单胞菌属物种菌株MED121、未命名的γ蛋白菌菌株HTCC2207和海杆菌属物种菌株ELB17。在一些特定的实施方案中，FAR酶来源于海洋杆菌属物种，或对于海洋杆菌属物种是内源性的，所述海洋杆菌属物种选自但不限于Oceanobacter kriegii和海洋杆菌菌株WH099。

在各种实施方案中，通过本文描述的方法产生的组合物包括饱和的脂肪醇和不饱和脂肪醇。在某些实施方案中，不饱和的脂肪醇是单不饱和脂肪醇。在一些实施方案中，脂肪醇组合物包括饱和的脂肪醇和不饱和的脂肪醇二者，且不饱和的脂肪醇的量是组合物中存在的脂肪醇的约30％以下、比如约20％以下、比如约10％以下、比如约5％以下、比如约1％以下。在另外的实施方案中，脂肪醇组合物包括饱和脂肪醇和不饱和脂肪醇二者，且饱和脂肪醇的量是组合物中存在的脂肪醇的约30％以下、比如约20％以下、比如约10％以下、比如约5％以下、比如约1％以下。

在一些典型的实施方案中，通过本文描述的方法产生的脂肪醇组合物包括一种或多种选自由以下组成的组的醇：1-辛醇(C8:0)、1-癸醇(C10:0)、1-十二烷醇(C12:0)、1-十四烷醇(C14:0)、1-十六醇(C16:0)、1-十八醇(C18:0)、1-二十烷醇(C20:0)、1-二十二烷醇、1-二十四醇、顺Δ⁹-1-十六醇和顺Δ¹¹-1-十八醇。

在典型的实施方案中，C8至C20脂肪醇构成按分离的总脂肪醇重量计的至少约80％、比如至少约85％、比如至少约90％、比如至少约92％、比如至少约95％、比如至少约97％、比如至少约99％。在某些实施方案中，C10至C18脂肪醇构成按分离的总脂肪醇重量计的约80％、比如至少约85％、比如至少约90％、比如至少约92％、比如至少约95％、比如至少约97％、比如至少约99％。在某些实施方案中，C14至C18脂肪醇构成按分离的总脂肪醇重量计的约80％、比如至少约85％、比如至少约90％、比如至少约92％、比如至少约95％、比如至少约97％、比如至少约99％。应理解的是，提及“Cx脂肪醇”包括具有“x”个碳原子的饱和脂肪醇和不饱和脂肪醇二者。

在各种实施方案中，C16至C18脂肪醇构成按分离的总脂肪醇重量计的至少约80％、比如至少约85％、比如至少约90％、比如至少约91％、比如至少约92％、比如至少约93％、比如至少约94％、比如至少约95％、比如至少约96％、比如至少约97％、比如至少约98％、比如至少约99％。在某些实施方案中，C16至C18脂肪醇是饱和的。在另外的实施方案中，C16至C18脂肪醇是饱和的脂肪醇和不饱和脂肪醇的混合物。

在某些实施方案中，通过对培养条件的常规修饰，通过本文描述的方法产生的脂肪醇的量包括由包括编码如本文描述的FAR的异源基因的重组宿主细胞产生的饱和的C8至C24醇和/或不饱和的C8至C24醇，其在约10mg/L至约50g/L含水营养培养基的范围内，比如在约10mg/L至约5g/L培养基的范围内、比如在约10mg/L至约2g/L培养基的范围内。在特定的实施方案中，通过本文描述的方法产生的脂肪醇的量为至少约0.5g/L培养基，比如至少约1g/L、比如至少约1.5g/L、比如至少约2.0g/L、比如至少约2.5g/L、比如至少约3g/L、比如至少约3.5g/L、比如至少约4g/L、比如至少约4.5g/L、比如至少约5g/L、比如至少约10g/L。在各种实施方案中，通过本文描述的方法产生的脂肪醇的量为至少约20g/L培养基，比如至少约30g/L、比如至少约40g/L、比如至少约50g/L。在特定的实施方案中，包括编码本发明涵盖的FAR酶的基因的重组微生物是大肠杆菌、解脂耶罗威亚酵母或酿酒酵母，且产生的脂肪醇的量为至少1.0g/L培养基、至少5.0g/L、至少10g/L、至少15g/L、至少20g/L、至少25g/L和至少30g/L。

在一些实施方案中，通过本文描述的方法产生的脂肪醇的量在约100mg/g至约5g/g细胞干重的范围内。在另外的实施方案中，通过对培养条件的常规改变，通过本文描述的方法产生的脂肪醇的量在约1g/g至约4g/g细胞干重的范围内，比如约2g/g至约3g/g细胞干重的范围内。

在某些实施方案中，通过对培养条件的常规改变，通过本文描述的方法产生的脂肪醇的量在约10％至约20％细胞干重的范围内，比如在约20％至约30％细胞干重的范围内、比如在约30％至约40％细胞干重的范围内、比如在约40％至约50％细胞干重的范围内、比如在约50％至约60％细胞干重的范围内、比如在约60％至约70％细胞干重的范围内、比如在约70％至约80％细胞干重的范围内。通过本文描述的方法产生的脂肪醇组合物还可包括脂肪酸衍生组分，比如但不限于酯(例如，乙酸酯和蜡)和脂肪酸。

产生烷烃和/或烯烃组合物的方法：

在各种实施方案中，将通过本文描述的方法产生的脂肪醇组合物进行还原以产生具有与脂肪醇起始材料相同碳链长度的烷烃和/或烯烃。不受任何特定理论束缚地，醇的羟基是差的离去基团，且因此，可使用原则上与羟基的氧原子结合而使其成为更好的离去基团的化学基团来还原本文描述的脂肪醇。

可使用本领域中已知的任何方法来还原本文描述的组合物中存在的脂肪醇。在一些实施方案中，可用化学方法进行脂肪醇的还原，例如，通过Barton脱氧作用(或Barton-McCombie脱氧作用)，其为两步骤反应，其中首先将醇转化为黄原酸甲酯或氨基甲酸巯基咪唑酯，并在自由基条件下用氢化锡或三烷基硅烷试剂还原黄原酸甲酯或氨基甲酸巯基咪唑酯以产生烷烃和/或烯烃。参见J.J.Li，C.Limberakis，D.A.Pflum Modern OrganicSynthesis in the Laboratory(实验室中的现代有机合成)(Oxford UniversityPress，2007)第81-83页。

在一些实施方案中，将脂肪醇还原为对应的烷烃和/或烯烃可利用具有还原脂肪醇的生物合成途径的微生物来实现。在某些实施方案中，微生物是细菌。在特定的实施方案中，细菌是弗氏弧菌(Vibrio furnissii)菌株M1。在一些实施方案中，将通过本文描述的方法产生的脂肪醇组合物与适当的微生物相接触以还原为烷烃和/或烯烃。在另外的实施方案中，将通过本文描述的方法产生的脂肪醇组合物与来自适当的微生物的膜碎片相接触从而在无细胞系统中进行还原。参见，例如，Park(2005)J.Bacteriol.187(4)：1426-1429。

在某些实施方案中，将通过还原本文描述的脂肪醇产生的烷烃和/或烯烃从反应混合物和未还原的脂肪醇起始材料分离以产生包括基本上完全为烷烃和/或烯烃的组合物。在一些实施方案中，将通过还原本文描述的脂肪醇产生的烷烃和/或烯烃和未反应的脂肪醇起始材料从反应混合物分离以产生包括烷烃和/或烯烃和脂肪醇的组合物。

在某些实施方案中，还原之后所得的组合物包括按组合物的重量计至少约60％烷烃和/或烯烃、比如至少约70％烷烃和/或烯烃、比如至少约80％烷烃和/或烯烃、比如至少约85％烷烃和/或烯烃、比如至少约90％烷烃和/或烯烃、比如至少约92％烷烃和/或烯烃、比如至少约95％烷烃和/或烯烃、比如至少约96％烷烃和/或烯烃、比如至少约97％烷烃和/或烯烃、比如至少约98％烷烃和/或烯烃、比如至少约99％烷烃和/或烯烃。

在另外的实施方案中，还原之后所得的组合物包括按组合物的重量计至少约10％烷烃和/或烯烃、比如至少约20％烷烃和/或烯烃、比如至少约30％烷烃和/或烯烃、比如至少约40％烷烃和/或烯烃、比如至少约50％烷烃和/或烯烃。

在一些典型的实施方案中，通过本文描述的方法产生的组合物包括选自由辛烷、癸烷、十二烷、十四烷、十六烷、十八烷、二十碳烷、二十二烷和二十四烷组成的组的一种或多种烷烃。在其他典型的实施方案中，通过本文描述的方法产生的组合物包括选自由辛烷、癸烯、十二烯、十四烯、十六烯、十八烯、二十烯、二十二烯和二十四烯组成的组的一种或多种烯烃。

在典型的实施方案中，C8至C20的烷烃和/或烯烃构成按组合物中的总烷烃和/或烯烃重量计的至少约80％、比如至少约85％、比如至少约90％、比如至少约92％、比如至少约95％、比如至少约97％、比如至少约99％。在某些实施方案中，C10至C18烷烃和/或烯烃构成按组合物中的总烷烃和/或烯烃重量计的约80％、比如至少约85％、比如至少约90％、比如至少约92％、比如至少约95％、比如至少约97％、比如至少约99％。

在某些实施方案中，可例如通过HPLC将具有特定碳链长度的烷烃/或烯烃与更长的烷烃和/或烯烃和/或更短的烷烃和/或烯烃分离。在某些实施方案中，适宜例如用于喷气燃料中的烷烃和/或烯烃组合物包括C10至C14烷烃和/或烯烃。在另外的实施方案中，适宜例如用于柴油燃料中的烷烃和/或烯烃组合物包括具有16个或更多的碳的烷烃和/或烯烃(例如，C16或更长的链的烷烃和/或烯烃)。

燃料组合物：

在某些实施方案中，本文描述的脂肪醇组合物和从其衍生的化合物可用作燃料组合物的组分。在某些实施方案中，通过以上描述的方法产生的脂肪醇组合物可直接用于燃料组合物。在各种实施方案中，可将脂肪醇与羧酸反应以产生酸酯。在特定的实施方案中，酸酯被用作生物柴油燃料组合物的组分。在另外的实施方案中，可将脂肪醇与还原剂反应以产生烷烃和/或烯烃。在一些实施方案中，来源于脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃被用作喷气燃料组合物的组分。在另外的实施方案中，来源于脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃被用作火箭燃料的组分。在另一些另外的实施方案中，来源于脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃被用作类石油柴油燃料组合物中的组分。

在一些实施方案中，燃料组合物包括来源于本文描述的脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃。在某些实施方案中，烷烃和/或烯烃具有从6个至16个碳且燃料组合物是类煤油燃料组合物。在各种实施方案中，类煤油燃料组合物包括于喷气燃料组合物中。在特定的实施方案中，类煤油燃料组合物包括于不同等级的喷气燃料中，所述喷气燃料包括但不限于，Avtur、Jet A、Jet A-1、Jet B、JP-4、JP-5、JP-7和JP-8等级。在另外的实施方案中，类煤油燃料组合物包括于用于供暖的燃料组合物中。在又一些另外的实施方案中，来源于上述脂肪醇组合物的类煤油燃料组合物利用液态氧燃烧以提供火箭燃料。在特定的实施方案中，类煤油燃料组合物被用于RP-1火箭燃料中。

在一些实施方案中，来源于本文描述的脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃被用于与石油柴油燃料组合物相似的燃料组合物中，例如，包含饱和烃和芳香烃的石油柴油燃料组合物。在某些实施方案中，燃料组合物仅包括来源于本文描述的脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃。在另外的实施方案中，燃料组合物包括与另外的组分诸如石油柴油燃料相混合的来源于本文描述的脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃。

在某些实施方案中，用羧酸进一步处理脂肪醇以形成酸酯。脂肪醇的酯化反应是本领域中熟知的。在某些实施方案中，在强催化剂存在下进行酯交换反应，所述强催化剂例如，诸如氢氧化钠的强碱。在另外的实施方案中，利用催化脂肪醇转化为酸酯的酶例如脂蛋白脂酶用酶促方法进行反应。参见，例如，Tsujita等人(1999)J.Biochem.126(6)：1074-1079。在各种实施方案中，酸酯被用作生物柴油燃料而不与另外的组分相混合。在某些实施方案中，将脂肪醇的酸酯(fatty acid ester)与另外的组分诸如石油柴油燃料相混合。

在某些实施方案中，将脂肪醇或从其衍生的酸酯或烷烃和/或烯烃与另外的燃料或燃料添加剂相组合以产生具有为其预期用途所期望的性质的组合物。用于特定应用的示例性的燃料和燃料添加剂是本领域中熟知的。可与本文描述的组合物相组合的示例性的燃料包括，但不限于，传统燃料诸如乙醇燃料和石油基燃料。可与本文描述的组合物相组合的示例性的燃料添加剂包括但不限于，浊点降低添加剂、表面活性剂、抗氧化剂、金属钝化剂、缓蚀剂、防冻添加剂、抗磨添加剂、沉积物改性添加剂(deposit-modifying additive)和辛烷值助剂。

实施例

以下意在例证而非限制性的代表性实施例中提供了本公开内容的各种特征和实施方案。

实施例1-基因获得

基于已报道的氨基酸序列(家蚕FAR：Moto等人(2003)Proc.Nat’l Acad.Sci.100：9156-61；Reiser(1997)GenBank登录号BAC79425.1；栖藻海杆菌DG893 FAR：GenBank基因组登录号NZ_ABCP01000001.1；和海洋杆菌属物种RED65 FAR：GenBank基因组登录号NZ_AAQH010000011.1)设计野生型家蚕、栖藻海杆菌DG893和海洋杆菌属物种RED65脂肪酰还原酶(FAR)基因以用于在大肠杆菌、酿酒酵母和解脂耶罗威亚酵母中表达。将具有GenBank登录号YP_959486的水油海杆菌FAR基因为在大肠杆菌中表达进行密码子优化。密码子优化利用WO2008/042876的实施例1中描述的算法来进行，其以其整体通过引用并入本文。算法的输入密码子使用信息是大肠杆菌、酿酒酵母和解脂耶罗威亚酵母的密码子使用的杂合，或单独的生物体的密码子使用。通过Genscript(Piscataway，NJ)合成基因，带有为了克隆到美国专利公布第2006/0195947号中描述的大肠杆菌载体pCK 110900中的侧翼限制位点。将SfiI限制位点的核苷酸序列添加到基因的5’端和3’端，以及添加到ATG起始密码子前的t7g10 RBS。

5’ACAATCTGGATCCGGCCAGCCTGGCCATAAGGAGATATACAT(SEQID NO：15)和3’TAATGAGGCCAAACTGGCCGTCGACACCAGTATG(SEQ ID NO：16)。

通过Genscript(Piscataway，NJ)在载体pUC57中提供基因，并通过DNA测序来验证序列。对于栖藻海杆菌DG893 FAR、水油海杆菌、海洋杆菌属物种RED65的FAR和家蚕FAR，为重组宿主细胞密码子优化的基因的序列分别在以下中列出：对应于FAR_Maa的SEQ ID NO：1和3、对应于FAR_Maq的SEQ ID NO：13、对应于FAR_Osc的SEQ ID NO：5和7、和对应于家蚕的SEQ ID NO：11，且对应的多肽序列分别在以下中列出：对应于FAR_Maa的SEQ ID NO：2和4、对应于FAR_Maq的SEQ ID NO：14、对应于FAR_Osc的SEQ ID NO：6和8和对应于家蚕的SEQ ID NO：12。

实施例2-FAR在大肠杆菌中的表达和活性

a.构建载体以在大肠杆菌中表达FAR

利用Sfi I限制位点将FAR基因克隆到载体pCK110900(在美国专利公布第2006/0195947号的图3中示出)中在lac启动子的控制下。表达载体还含有P15a复制起点和氯霉素抗性基因。利用常规转化方法将所得的质粒导入到大肠杆菌BW25113(ΔfadE)(Baba等人，Molecular SystemsBiology，2006 doi：10，1038/msb4100050，文章号：2006.0008)中。

b.利用摇瓶，FAR在重组大肠杆菌中的体内活性

将包括含有编码家蚕、栖藻海杆菌DG893、水油海杆菌或海洋杆菌属物种RED65脂肪酰CoA还原酶的异源基因的质粒的重组大肠杆菌宿主菌株培养于补充有1％葡萄糖和30μg/mL氯霉素(CAM)的Luria Bertani肉汤(LB)培养基中，在30℃、200rpm下持续大约16-18小时(过夜)。利用5％的接种物来起始补充有30μg/mL CAM和0-0.4％葡萄糖的新鲜的50mL 2×YT肉汤培养基。在30℃和200rpm下在摇床上孵育培养物2.5小时至OD₆₀₀约0.6至约0.8，在此时用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度1mM)来诱导异源FAR的表达。在相同的条件下继续孵育约16小时(过夜)。通过在F15B-8x50C转子中在6000rpm下离心10分钟来收集细胞。将细胞沉淀物重悬于0.5mL的6.7％的Na₂SO₄中且然后用1mL的异丙醇∶甲基叔丁基醚(4/6比率)进行萃取，持续2小时。离心萃取物并通过GC-FID或GC-MS进行直接分析或在分析之前用BSTFA对萃取物进行衍生化。为进行衍生化，从上部有机层移去400μL样品，在氮气流下使其蒸发，并用100μL的N，O-双(三甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)对剩余物进行衍生化，在37℃下持续1小时，且然后在通过GC-FID或GC-MS分析之前用100μL的庚烷进行稀释。用1mL的甲基叔丁基醚对0.5mL的培养基(通过离心去除细胞之后)进行萃取，持续1小时。通过GC-FID或GC-MS直接分析有机相或在分析之前如本文以上描述的用BSTFA进行衍生化。此外，用1mL的异丙醇∶庚烷(4∶6比率)直接萃取0.5mL的细胞培养物(通过离心去除细胞之前)，持续2小时。通过GC-FID或GC-MS对有机相直接进行分析或在分析之前如本文以上描述的用BSTFA进行衍生化。

利用以下的条件通过分流比1∶10的GC-FID来分析1μL样品：来自Agilent Technologies的GC-6890N，装备有FID检测器和HP-5柱子(长度30m、内径0.32mm、薄膜0.25μm)。GC方法：起始于100℃，以25℃/分钟的速度提高温度至246℃，并保持1.96分钟。总运行时间，7.8分钟。在以上的GC条件下，产生的脂肪醇和脂肪酸的近似保留时间(分钟)如下：5.08，C14:0-OH；5.40；C14:0-OOH；5.74，C16:1-OH；5.93，C16:0-OH；6.11，C16:0-OOMe(内标)；6.16，C16:1-OOH；6.29，C16:0-OOH；6.80，C18:1-OH；6.90，C18:0-OH；7.3，C18:0-OOH和C18:1-OOH。在所检验的条件下，家蚕FAR、栖藻海杆菌DG893FAR和海洋杆菌属物种RED65FAR在大肠杆菌BW25113ΔfadE中的表达导致脂肪醇的产生(参见表2)。通过与商业标准(Sigma Chemical Company，6050 Spruce St.Louis，MO63103)对比进行了单个脂肪醇的鉴定。并且，通过FAR_Maq的脂肪醇总产生与从FAR_Maa(栖藻海杆菌DG893)获得的相似，且产生的脂肪醇包括C14:0(2.5％)、C16:1(10％)、C16:0(34％)、C18:1(53％)和C18:0(0.5％)。

表2

由过表达异源FAR基因的重组大肠杆菌BW25113ΔfadE宿主细胞显示出的脂肪醇谱(profile)

a：每种脂肪醇组分的相对量表示为经由GC-FID检测的总脂肪醇的％。脂肪醇包括：C12:0(1-十二烷醇)、未检测到C12:1(1-十二烯醇)、C14:0(1-十四烷醇)、未检测到C14:1(1-十四烯醇)、C16:1(顺Δ⁹-1-十六烯醇)、C16:0(1-十六醇)、C18:1(顺Δ¹¹-1-十八烯醇)、18:0(1-十八醇)。ND：未检测到。

b：利用内标和外标两者评估酶生产率。

c.利用发酵罐，FAR在重组大肠杆菌中的体内活性

在充气、搅动搅拌的釜发酵罐中，使含有11.28g/L 5×M9低盐(BD，Franklin Lakes，NJ)；2g/L酵母提取物(BD，Franklin Lakes，NJ)；3g/L葡萄糖(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；2mM MgSO₄(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)；0.1mM CaCl₂(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；和30μg/ml氯霉素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的1.0L培养基达30℃的温度。用具备含有栖藻海杆菌DG893(如实施例2b中描述的)的质粒的大肠杆菌BW25113ΔfadE的晚期指数培养物接种发酵罐，至起始的600nm光密度(OD₆₀₀)为0.8至1.0。在30℃和250rpm下将接种物培养于含有TB(BD，Franklin Lakes，NJ)；0.4％甘油(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)和30μg/ml氯霉素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的摇瓶中，直到OD600达到约5.0。以400-1000rpm搅拌发酵罐，并以1.0L/分钟来供给空气以维持30％饱和的最低溶解氧水平。最初通过添加14％v/v氢氧化铵和10％w/v氢氧化钠的混合物将培养物的pH控制在7.0。当肉汤中的铵浓度达1.5-2.0g/L时，将用于pH控制的碱转变为20％w/v氢氧化钠。培养物达5.0的OD₆₀₀之后，通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO)至1mM的终浓度来诱导栖藻海杆菌DG893FAR的表达。通过添加含有500g/L葡萄糖的进料溶液(feedsolution)来维持培养物的生长和脂肪醇的产生。当pH一达7.2即开始添加葡萄糖(6g/L每次)。然后在30℃下再培养培养物135-140小时。在55小时和95小时时添加3g/L的酵母提取物细粒(shot)。在不同的时间点取样以进行分析。如实施例2b中描述的进行脂肪醇的萃取和定量。在所检验的条件下，评估脂肪醇总产生和脂肪醇分泌分别为～12-15g/L和9-13g/L。

实施例3-FAR酶在不同大肠杆菌菌株中的表达和活性

a.构建载体以在不同大肠杆菌菌株中表达FAR

如以上描述的将FAR基因克隆到载体pCK110900-I(在美国专利公布第2006/0195947号的图3中示出)中在lac启动子的控制下。通过常规转化方法将所得的质粒导入到大肠杆菌BW25113亲代的菌株和来源于大肠杆菌BW25113的敲除的菌株(ΔfadE和ΔfadD、ΔfadK)(Baba等人，Molecular Systems Biology(2006)doi：10.1038/msb4100050，文章号2006.0008；Morgan-Kiss等人，J.Biol.Chem.(2004)，279：37324-37333和Campbell等人，Molecular Microbiology(2003)，47(3)：793-805)中。

b.利用摇瓶，FAR在不同重组大肠杆菌菌株中的体内活性

将包括含有编码栖藻海杆菌DG893脂肪酰还原酶(FAR)或海洋杆菌属物种RED65脂肪酰还原酶的异源基因的质粒的重组大肠杆菌BW25113(亲代的、ΔfadE、ΔfadD和ΔfadK敲除的)菌株培养于补充有1％葡萄糖和30μg/ml氯霉素(CAM)的Luria Bertani(LB)培养基中，在30℃、200rpm下持续约16-18小时(过夜)。利用5％的接种物来起始补充有30μg/mL CAM的新鲜的50mL LB培养基。在30℃和200rpm下孵育培养物2.5小时，至0.6至0.8的OD600，在此时用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度1mM)来诱导异源FAR基因的表达。在相同的条件下继续孵育约24小时。如实施例2b中描述的进行脂肪醇的萃取和定量，不同的是使用以下的GC方法：起始于80℃持续3分钟，以50℃/分钟的速度提高温度至200℃，然后以10℃/分钟的速度提高温度至270℃，和最终，以20℃/分钟提高至300℃，并保持5分钟(总运行时间18.8分钟)。在以上的GC条件下，产生的脂肪醇和脂肪酸的近似保留时间(分钟)如下：6.90，C12:0-OH；8.04，C14:0-OH；8.42，d27-C14:0-OOH(内标)；8.53，C14:0-OOH；9.11，C16:1-OH；9.23，C16:0-OH；9.68，C16:1-OOH；9.80，C16:0-OOH；10；46，C18:1-OH；10.57，C18:0-OH；11.10，C18:1-OOH，和11.25，C18:0-OOH。通过与商业标准(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO63103)对比进行了单个脂肪醇的鉴定。在所检验的条件下，栖藻海杆菌DG893和海洋杆菌属物种RED65的FAR在大肠杆菌BW25113和对应的ΔfadD、ΔfadE和ΔfadK菌株中的表达导致了脂肪醇的产生(表3a和3b)。用于表达栖藻海杆菌DG893FAR和海洋杆菌属物种RED65FAR的大肠杆菌BW25113的典型摇瓶滴度为100-200mg/L。因为两种FAR均能够在fadD和fadK酰基CoA合成酶不存在时在大肠杆菌中产生大量的脂肪醇，所以这些FAR能够还原非酰基CoA底物。

表3A

由表达异源栖藻海杆菌FAR基因的重组大肠杆菌宿主细胞显示出的脂肪醇谱

a：脂肪醇包括：15-17％C14:0(1-十四烷醇)、约38％C16:1(顺Δ⁹-1-十六烯醇)、23-24％C16:0(1-十六醇)、21-22％C18:1(顺Δ¹¹-1-十八烯醇)、0-1％C18:0(1-十八醇)。

b：获自微量滴定板中的菌株的评估的数据。

表3B

由表达异源海洋杆菌属物种RED65FAR的重组大肠杆菌宿主细胞显示出的脂肪醇谱

重组大肠杆菌细胞	缺失的蛋白	脂肪醇的相对产生a
			BW25113	-	1.0
BW25113ΔfadE	酰基CoA脱氢酶	0.78
			BW25113ΔfadD	酰基CoA合成酶	0.60

a：脂肪醇包括：0-2％C14:0(1-十四烷醇)、2-10％C16:1(顺Δ⁹-1-十六烯醇)、32-36％C16:0(1-十六醇)、56-62％C18:1(顺Δ¹¹-1-十八烯醇)、0-1％C18:0(1-十八醇)。

c.从大肠杆菌菌株中萃取酰基CoA并定量

如以上实施例3b中描述的培养菌株。将10单位OD₆₀₀的细胞重悬于0.6ml的冰冷的新鲜制备的萃取缓冲液(100mM KH₂PO4，pH 4.9∶异丙醇，1∶1)中，其含有200ng/mL的C17:0-CoA(十七烷酰基CoA)作为内标，和0.6ml的乙腈。涡旋细胞悬浮液5分钟并在4℃和14,000rpm下离心20分钟。收集上清液并在氮气流下蒸发。将干燥的残余物重悬于200μl的异丙醇/1mM乙酸(4∶1)中并如以上描述的进行离心。将上清液转移到玻璃小瓶中，并将10μl注入到装备有Zorbax Extend C18、4.6mm×50mm、18μm分析柱的LC-MS系统(AB Sciex 5500 QTRAP)中。利用含有0.1％NH₄OH的10％乙腈/90％水(A)和含有0.1％NH₄OH的乙腈(B)的二元梯度(binary gradient)以0.5mL/分钟流速进行HPLC分离。色谱条件如下：0-1分钟5％溶剂B，1-7分钟线性梯度至95％溶剂B，7-9分钟95％溶剂B。后平衡时间为2.5分钟。总运行时间为11.5分钟。利用如表4中描述的参数以负模式进行LC-MS/MS。所有的脂肪酰CoA标准获自Sigma(St.Louis，MO)。

表4

用于确定脂肪酰CoA的MS参数

表5中显示不同的大肠杆菌菌株的相对的脂肪酰CoA浓度。结果指示ΔfadD的破坏显著降低了酰基CoA的胞内浓度。在本实施例中，在含有栖藻海杆菌DG893FAR的大肠杆菌BW25113ΔfadD中酰基CoA的水平与不含缺失的菌株相对比降低了～8倍。然而，如上所述，脂肪醇产生基本上不受影响。因此，栖藻海杆菌DG893FAR表现出能够将非CoA底物，最可能地为酰基ACP，还原为脂肪醇。

表5

由表达异源栖藻海杆菌DG893FAR和不表达异源起栖藻海杆菌DG893FAR的重组大肠杆菌细胞显示出的脂肪酰CoA谱

a：利用内标和外标评估脂肪酰CoA的产生。通过LC-MS/MS检测的脂肪酰CoA包括：11-16％C14:0(十四酰基CoA)、2-11％C14:1(十四烯酰基CoA)、28-31％C16:1(顺Δ⁹-1-十六烯酰基CoA)、14-26％C16:0(十六酰基CoA)、14-20％C18:1(顺Δ¹¹-十八烯酰基CoA)、9-15％C18:0(十八酰基CoA)。

实施例4-FAR在酿酒酵母中的表达和活性

a.构建载体以在酿酒酵母中表达FAR

对FAR基因进行PCR扩增并利用BamHI和SalI位点将其克隆到pCEN318中TEF1启动子的下游以构建pCEN319(家蚕FAR)、pCEN328(栖藻海杆菌DG896FAR)和pCEN333(海洋杆菌属物种RED65FAR)。通过用潮霉素抗性基因替代p427-TEF(Sunrise Science Products，San Diego，CA)的KanMX基因来构建pCEN318。通过常规转化方法将所有FAR质粒转化到酿酒酵母FL100中。

b.利用摇瓶，FAR在重组酿酒酵母中的体内活性

将包括含有编码家蚕、栖藻海杆菌DG893或海洋杆菌属物种RED65的FAR的异源基因的质粒的重组酿酒酵母菌株接种到含200μg/mL潮霉素的5mL的YPD中，在30℃下培养48小时(OD～8-10)。将约2.5ml传代培养至含有200μg/mL潮霉素的50ml的YPD培养基(20×稀释)中并在30℃和250rpm下在摇床上培养96小时。以～3000-4000rpm(F15B-8X50C转子)离心细胞培养物10分钟，将上清液与细胞分离。用20ml的50mM Tris-HCl pH 7.5洗涤沉淀物。如实施例2b中描述的进行脂肪醇的萃取和分析。在所检验的条件下，家蚕、栖藻海杆菌DG893和海洋杆菌属物种RED65的FAR基因在酿酒酵母FL100中的表达导致了脂肪醇的产生，如表6所示。

表6

由过表达异源FAR酶基因的重组酿酒酵母FL100宿主细胞显示出的脂肪醇谱

a：每种脂肪醇组分的相对量被表示为利用经由GC-FID或GC-MS检测的总脂肪醇的％。内源脂肪醇包括：C14:0(1-十四烷醇)、C16:0(1-十六醇)和18:0(1-十八醇)。未检测到不饱和脂肪醇。

b：利用内标和外标评估酶生产率。

实施例5-FAR酶在解脂耶罗威亚酵母中的表达和活性

a.构建载体以在解脂耶罗威亚酵母中表达FAR

用于在解脂耶罗威亚酵母中表达基因的自主复制型质粒被工程化而带有用于潮霉素抗性和腐草霉素抗性的两个抗生素选择标记盒(分别为HygB(R)或Ble(R))(称为质粒pCEN354)。每个盒的表达受分离自解脂耶罗威亚酵母的强组成型启动子的独立调控：用于Ble(R)表达的pTEF1和用于HygB(R)表达的pRPS7。质粒pCEN354用来组装解脂耶罗威亚酵母表达质粒。利用“无限制克隆(restriction feee cloning)”方法，将FAR基因插入到pCEN354中以提供质粒pCEN411(图1)。在pCEN411中，异源基因表达在组成型TEF1启动子的控制之下。HygB^R基因允许在含有潮霉素的培养基中进行选择。Ars18是分离自解脂耶罗威亚酵母基因组DNA的自主复制序列。利用常规转化方法[(Madzak，C.等人(2003)Yarrowia lipolytica(解脂耶罗威亚酵母).于G.Gellissen(编辑)，Production of RecombinantProteins Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems(重组蛋白的产生.新颖微生物和真核表达系统)(第163-189页)中.]将所得的质粒转化到获自德国生物材料资源中心(DSMZ)的解脂耶罗威亚酵母1345中。

b.利用摇瓶，异源栖藻海杆菌FAR在重组解脂耶罗威亚酵母中的体内活性

将包括含有编码栖藻海杆菌DG893FAR的异源基因的质粒的重组解脂耶罗威亚酵母菌株接种到含有8％葡萄糖和500μg/mL潮霉素的200mLYPD培养基中。在30℃下培养培养物至4-7的OD600。然后通过离心收获细胞并用20ml的50mM Tris-HCl pH 7.5进行洗涤。如实施例2b中描述的进行细胞内和细胞外脂肪醇的萃取和鉴定。在所检验的条件下，检测到了14mg/L的1-十六醇。未检测到分泌的脂肪醇。利用8％的甘油作为碳源，评估脂肪醇总产生和脂肪醇分泌分别为～0.8g/L和0.2g/L。脂肪醇包括：30％C16:0(1-十六醇)、56％18:0(1-十八醇)和12％C18:1(顺Δ⁹-1-十八烯醇)。

c.利用96孔微量滴定板，整合于解脂耶罗威亚酵母基因组中的栖藻海杆菌FAR的体内活性

从对在利用十六烷作为单一碳源的培养基上生长具有缺陷的UV-诱变的菌株文库中鉴定用于产生脂肪醇的改良的解脂耶罗威亚酵母菌株(YL1415)。在含有8％葡萄糖和500μg/mL潮霉素的YPD培养基中，当用pCEN411进行转化时，YL1415菌株显示了与从解脂耶罗威亚酵母1345中检测的相对比脂肪醇滴度的7-10倍增加和外源的1-十六醇的降解速率的显著降低。通过非同源重组将栖藻海杆菌DG893FAR基因整合于基因组中的随机位置而提高了YL1415菌株中栖藻海杆菌DG893FAR的表达。利用引物411-F1(AGAGACCGGGTTGGCGG)(SEQ ID NO：17)和411-R1(CATTTGCCATTCGTAACGCTG)(SEQ ID NO：18)从pCEN411中扩增由TEF启动子控制之下的栖藻海杆菌FAR和RPS启动子控制之下的HygBR基因组成的整合盒。

利用该整合盒转化YL1415产生了潮霉素抗性菌株的文库，其中FAR整合于解脂耶罗威亚酵母基因组中的不同位置[(Madzak，C.等人(2003)Yarrowia lipolytica(解脂耶罗威亚酵母).于G.Gellissen(编辑)，Productionof Recombinant Proteins Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems(重组蛋白的产生.新颖微生物和真核表达系统)(第163-189页)中]。将在YL1415UV突变体菌株中具有整合的栖藻海杆菌DG893FAR的菌株的此集合培养于含补充有总共2％葡萄糖和500μg/mL潮霉素的250μL YPD的96-孔Axygen 96-孔培养板中。在30℃、200rpm和85％相对湿度下在Kuhner摇床上孵育培养板约40-48小时。通过将50μL的过夜生长培养物转移到含补充有总共2％葡萄糖和500μg/mL潮霉素的250μL YPD的Axygen 96-孔培养板中而稀释细胞培养物。在相似的条件下在Kuhner摇床中孵育培养板约24-28小时。然后将20μL的细胞培养物转移到含补充有总共8％葡萄糖和500μg/mL潮霉素的380μL YPD的深96-孔培养板中。在相似的条件下孵育培养板约22-26小时。通过以3500rpm离心10分钟而收集细胞。然后将细胞沉淀物重悬于含有500μg/mL潮霉素的400μL的氮限制培养基(1.7g/L酵母氮源、1.4g/L(NH₄)₂SO₄、30g/L葡萄糖)中，且在30℃、200rpm和85％相对湿度下在Kuhner摇床上孵育培养板22-26小时。然后用1mL的异丙醇∶己烷(4∶6比率)萃取细胞培养物，持续2小时。离心萃取物并将上部有机相转移到聚丙烯96-孔培养板中。然后利用如实施例2b中描述的GC-FID方法分析样品。在所检验的条件下，鉴定了与基于质粒的表达相比具有高达～5×改良的脂肪醇总产生(～0.5-1g/L)的栖藻海杆菌FAR整合菌株。脂肪醇包括：70-80％C16:0(1-十六醇)、10-15％18:0(1-十八醇)和10-15％C18:1(顺Δ⁹-1-十八烯醇)。

本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献以其整体通过引用并入本文，以用于所有目的，视作与每个单独的出版物、专利、专利申请和其他文献被单独地表示为通过引用被并入以用于所有目的相同的程度。

虽然示出和描述了各种特定的实施方案，将理解的是，可进行各种改变而不脱离本发明的精神和范围。

Claims (51)

1.一种产生脂肪醇组合物的方法，所述方法包括：

a)在适宜的培养基中培养重组微生物，其中所述重组微生物包括编码SEQ ID NO:2的异源脂肪酰还原酶(FAR)酶的基因，并

b)允许所述基因的表达，其中所述表达导致脂肪醇组合物的产生。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所产生的脂肪醇包括C12-C18脂肪醇。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所产生的脂肪醇包括C14:0脂肪醇、C16:0脂肪醇、C18:0脂肪醇、C16:1脂肪醇和C18:1脂肪醇中的至少两种的混合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所产生的脂肪醇的至少25％是被分泌的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所产生的脂肪醇的至少50％是被分泌的。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物产生至少0.5g/L的脂肪醇。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述重组微生物产生至少0.5g/L的脂肪醇。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组微生物产生至少5g/L的脂肪醇。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述重组微生物产生至少5g/L的脂肪醇。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述重组微生物产生至少15g/L的脂肪醇。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物是细菌、酵母、丝状真菌或藻类。

12.根据权利要求2所述的方法，其中所述重组微生物是细菌、酵母、丝状真菌或藻类。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组微生物是大肠杆菌(E.coli)。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述重组微生物是大肠杆菌。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述重组大肠杆菌还包括失活的或沉默的内源脂肪酰ACP硫酯酶基因、失活的或沉默的内源脂肪酰CoA合成酶基因或二者均包括。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述酵母是耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)或酵母属(Saccharomyces)的菌株。

17.根据权利要求12所述的方法，其中所述酵母是耶罗威亚酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属或酵母属的菌株。

18.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括分离所述脂肪醇组合物。

19.根据权利要求2所述的方法，所述方法还包括分离所述脂肪醇组合物。

20.根据权利要求1所述的方法，其中编码FAR的所述基因包括密码子优化的核酸序列。

21.根据权利要求2所述的方法，其中编码FAR的所述基因包括密码子优化的核酸序列。

22.根据权利要求11所述的方法，其中编码FAR的所述基因包括密码子优化的核酸序列。

23.根据权利要求12所述的方法，其中编码FAR的所述基因包括密码子优化的核酸序列。

24.根据权利要求20所述的方法，其中所述核酸序列是与SEQ ID NO:1或3相同的序列。

25.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸序列是与SEQ ID NO:1或3相同的序列。

26.根据权利要求22所述的方法，其中所述核酸序列是与SEQ ID NO:1或3相同的序列。

27.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸序列是与SEQ ID NO:1或3相同的序列。

28.根据权利要求20所述的方法，其中所述核酸序列被整合到所述重组微生物的染色体中。

29.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸序列被整合到所述重组微生物的染色体中。

30.根据权利要求22所述的方法，其中所述核酸序列被整合到所述重组微生物的染色体中。

31.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸序列被整合到所述重组微生物的染色体中。

32.根据权利要求20所述的方法，其中所述核酸存在于载体中。

33.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸存在于载体中。

34.根据权利要求22所述的方法，其中所述核酸存在于载体中。

35.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸存在于载体中。

36.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养条件包括20℃至45℃的范围内的温度；5至7的范围内的pH，16小时至144小时的范围内的时间段；和可同化碳源，所述可同化碳源包括获自纤维素原料的可发酵糖类。

37.根据权利要求2所述的方法，其中所述培养条件包括20℃至45℃的范围内的温度；5至7的范围内的pH，16小时至144小时的范围内的时间段；和可同化碳源，所述可同化碳源包括获自纤维素原料的可发酵糖类。

38.根据权利要求11所述的方法，其中所述培养条件包括20℃至45℃的范围内的温度；5至7的范围内的pH，16小时至144小时的范围内的时间段；和可同化碳源，所述可同化碳源包括获自纤维素原料的可发酵糖类。

39.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养条件包括20℃至45℃的范围内的温度；5至7的范围内的pH，16小时至144小时的范围内的时间段；和可同化碳源，所述可同化碳源包括获自纤维素原料的可发酵糖类。

40.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪醇通过酰基CoA非依赖途径产生。

41.根据权利要求2所述的方法，其中所述脂肪醇通过酰基CoA非依赖途径产生。

42.根据权利要求11所述的方法，其中所述脂肪醇通过酰基CoA非依赖途径产生。

43.根据权利要求12所述的方法，其中所述脂肪醇通过酰基CoA非依赖途径产生。

44.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括还原所述脂肪醇组合物以生成烷烃组合物。

45.根据权利要求2所述的方法，所述方法还包括还原所述脂肪醇组合物以生成烷烃组合物。

46.根据权利要求11所述的方法，所述方法还包括还原所述脂肪醇组合物以生成烷烃组合物。

47.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括还原所述脂肪醇组合物以生成烷烃组合物。

48.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括酯化所述脂肪醇组合物以产生脂肪醇酯。

49.根据权利要求2所述的方法，所述方法还包括酯化所述脂肪醇组合物以产生脂肪醇酯。

50.根据权利要求11所述的方法，所述方法还包括酯化所述脂肪醇组合物以产生脂肪醇酯。

51.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括酯化所述脂肪醇组合物以产生脂肪醇酯。