ES2667469T3 - Métodos y composiciones para producir hidrocarburos - Google Patents

Métodos y composiciones para producir hidrocarburos Download PDF

Info

Publication number
ES2667469T3
ES2667469T3 ES09747776.4T ES09747776T ES2667469T3 ES 2667469 T3 ES2667469 T3 ES 2667469T3 ES 09747776 T ES09747776 T ES 09747776T ES 2667469 T3 ES2667469 T3 ES 2667469T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
alkane
cell
alkene
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09747776.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Andreas Schirmer
Mathew Rude
Shane Brubaker
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
REG Life Sciences LLC
Original Assignee
REG Life Sciences LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by REG Life Sciences LLC filed Critical REG Life Sciences LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2667469T3 publication Critical patent/ES2667469T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/0108—Long-chain acyl-[acyl-carrier-protein] reductase (1.2.1.80)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/99—Other Carbon-Carbon Lyases (1.4.99)
    • C12Y401/99005—Octadecanal decarbonylase (4.1.99.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2200/00—Components of fuel compositions
    • C10L2200/04—Organic compounds
    • C10L2200/0461—Fractions defined by their origin
    • C10L2200/0469—Renewables or materials of biological origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/26—Composting, fermenting or anaerobic digestion fuel components or materials from which fuels are prepared
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02T—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO TRANSPORTATION
    • Y02T50/00—Aeronautics or air transport
    • Y02T50/60—Efficient propulsion technologies, e.g. for aircraft
    • Y02T50/678—Aviation using fuels of non-fossil origin

Abstract

Método de producción de un alcano o alqueno a partir de una célula huésped modificada genéticamente, comprendiendo el método: (a) transformar una célula huésped para que exprese introduciendo (i) un polinucleótido de biosíntesis de aldehídos que codifica para un polipéptido de biosíntesis de aldehídos, y (ii) un polinucleótido de biosíntesis de alcanos o alquenos que codifica para un polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos; y (b) cultivar dicha célula huésped modificada genéticamente en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para producir un alcano o alqueno en el medio de cultivo, en el que dicho polipéptido de biosíntesis de aldehídos tiene actividad acil-ACP reductasa y procede de una cianobacteria, y en el que dicho polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Métodos y composiciones para producir hidrocarburos
La presente invención se refiere a métodos de producción de un alcano o alqueno a partir de una célula huésped modificada genéticamente.
Antecedentes de la invención
El petróleo es un recurso natural limitado que se encuentra en la Tierra en formas líquida, gaseosa o sólida. El petróleo está compuesto principalmente por hidrocarburos, que están compuestos principalmente de carbono e hidrógeno. También contiene cantidades significativas de otros elementos, tales como nitrógeno, oxígeno o azufre, en diferentes formas.
El petróleo es un recurso valioso, aunque los productos del petróleo se desarrollan a considerables costes, tanto financieros como medioambientales. En primer lugar, deben descubrirse fuentes de petróleo. La exploración de petróleo es una empresa cara y arriesgada. El coste de exploración de pozos de aguas profundas puede exceder los 100 millones de dólares. Además, no hay ninguna garantía de que estos pozos contengan petróleo. Se estima que sólo el 40% de los pozos perforados conducen a pozos productores que generan hidrocarburos comerciales. Además del coste económico, la exploración de petróleo conlleva un alto coste medioambiental. Por ejemplo, la exploración mar adentro altera los entornos marinos circundantes.
Tras descubrirse un pozo productor, el petróleo debe extraerse de la tierra con gran coste. Durante la recuperación primaria, la presión natural subterránea es suficiente para extraer aproximadamente el 20% del petróleo en el pozo. A medida que esta presión natural desciende, se emplean métodos de recuperación secundarios, si son económicos. Generalmente, la recuperación secundaria implica aumentar la presión del pozo mediante, por ejemplo, inyección de agua, inyección de gas natural o levantamiento por gas. Usando métodos de recuperación secundarios, se recupera de un 5% a un 15% adicional de petróleo. Una vez que se agotan los métodos de recuperación secundarios, pueden usarse métodos de recuperación terciarios, si son económicos. Los métodos terciarios implican reducir la viscosidad del petróleo para hacer que sea más fácil de extraer. Usando métodos de recuperación terciarios, se recupera de un 5% a un 15% adicional de petróleo. Por tanto, incluso en las mejoras circunstancias, sólo puede extraerse el 50% del petróleo en un pozo. La extracción de petróleo también conlleva un coste medioambiental. Por ejemplo, la extracción de petróleo puede dar como resultado grandes fugas de petróleo que emerge a la superficie. Además, la perforación mar adentro implica dragar el lecho marino, lo que altera o destruye el entorno marino circundante.
Puesto que los depósitos de petróleo no se encuentran uniformemente por toda la Tierra, el petróleo debe transportarse a lo largo de grandes distancias desde regiones productoras de petróleo hasta regiones consumidoras de petróleo. Además de los costes de transporte, existe también el riesgo medioambiental de derrames de petróleo devastadores.
En su forma natural, el petróleo crudo extraído de la Tierra tiene pocos usos comerciales. Es una mezcla de hidrocarburos (por ejemplo, parafinas (o alcanos), olefinas (o alquenos), alquinos, naftenos (o cicloalcanos), compuestos alifáticos, compuestos aromáticos, etc.) de longitud y complejidad variables. Además, el petróleo crudo contiene otros compuestos orgánicos (por ejemplo, compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, oxígeno, azufre, etc.) e impurezas (por ejemplo, azufre, sal, ácido, metales, etc.).
Por tanto, el petróleo crudo debe refinarse y purificarse antes de que pueda usarse comercialmente. Debido a su alta densidad de energía y su fácil transportabilidad, la mayoría del petróleo se refina en combustibles, tales como combustibles de transporte (por ejemplo, gasolina, diésel, combustible de aviación, etc.), gasóleo de calefacción, gas licuado de petróleo, etc.
El petróleo crudo es también una fuente primaria de materiales de partida para producir productos petroquímicos. Las dos clases principales de materiales de partida derivados del petróleo son olefinas de cadena corta (por ejemplo, etileno y propileno) y compuesto aromáticos (por ejemplo, isómeros de xileno y benceno). Estos materiales de partida se derivan de hidrocarburos de cadena más larga en petróleo crudo sometiéndolo a craqueo con un gasto considerable usando una variedad de métodos, tales como craqueo catalítico, craqueo con vapor o reformación catalítica. Estos materiales de partida se usan para producir productos petroquímicos, que no pueden refinarse directamente del petróleo crudo, tales como monómeros, disolventes, detergentes o adhesivos.
Un ejemplo de un material de partida derivado de petróleo crudo es etileno. Se usa etileno para producir productos petroquímicos, tales como polietileno, etanol, óxido de etileno, etilenglicol, poliéster, glicol éter, etoxilato, acetato de vinilo, 1,2-dicloroetano, tricloroetileno, tetracloroetileno, cloruro de vinilo y poli(cloruro de vinilo). Un ejemplo adicional de un material de partida es propileno, que se usa para producir alcohol isopropílico, acrilonitrilo, polipropileno, óxido de propileno, propilenglicol, glicol éteres, butileno, isobutileno, 1,3-butadieno, elastómeros sintéticos, poliolefinas, alfa-olefinas, alcoholes grasos, ácido acrílico, polímeros acrílicos, cloruro de alilo, epiclorohidrina y resinas epoxídicas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Estos productos petroquímicos pueden usarse entonces para producir productos químicos especializados, tales como plásticos, resinas, fibras, elastómeros, productos farmacéuticos, lubricantes o geles. Productos químicos especializados particulares que pueden producirse a partir de materiales de partida petroquímicos son: ácidos grasos, hidrocarburos (por ejemplo, de cadena larga, de cadena ramificada, saturados, insaturados, etc.), alcoholes grasos, ésteres, aldehídos grasos, cetonas, lubricantes, etc.
Los productos químicos especializados tienen muchos usos comerciales. Los ácidos grasos se usan comercialmente como tensioactivos, por ejemplo, en detergentes y jabones. También pueden usarse como aditivos en combustibles, aceites lubricantes, pinturas, lacas, velas, aceite para ensaladas, mantequilla, cosméticos y emulsionantes. Además, los ácidos grasos se usan como activadores aceleradores en productos de caucho. Los ácidos grasos también pueden usarse como materia prima para producir ésteres metílicos, amidas, aminas, cloruros de ácido, anhídridos, dímeros de ceteno, y peroxiácidos y ésteres.
Los hidrocarburos tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, se usan alcanos de cadena más corta como combustibles. El metano y el etano son los principales constituyentes del gas natural. Se usan alcanos de cadena más larga (por ejemplo, de desde cinco hasta dieciséis carbonos) como combustibles de transporte (por ejemplo, gasolina, diésel o combustible de aviación). Los alcanos que tienen más de dieciséis átomos de carbono son componentes importantes de gasóleos y aceites lubricantes. Pueden usarse alcanos incluso más largos, que son sólidos a temperatura ambiente, por ejemplo, como cera de parafina. Los alcanos que contienen aproximadamente treinta y cinco carbonos se encuentran en alquitrán, que se usa para la pavimentación de carreteras. Además, pueden someterse a craqueo alcanos de cadena más larga para producir hidrocarburos de cadena más corta útiles comercialmente.
Como los alcanos de cadena corta, los alquenos de cadena corta se usan en combustibles de transporte. Se usan alquenos de cadena más larga en plásticos, lubricantes y lubricantes sintéticos. Además, se usan alquenos como materia prima para producir alcoholes, ésteres, plastificantes, tensioactivos, aminas terciarias, agentes de recuperación de petróleo potenciada, ácidos grasos, tioles, anhídridos alquenilsuccínicos, epóxidos, alcanos clorados, alquenos clorados, ceras, aditivos para combustibles y reductores del flujo por arrastre.
Los alcoholes grasos tienen muchos usos comerciales. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias alimentaria y cosmética como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfífila, los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no iónicos, que son útiles como detergentes. Además, los alcoholes grasos se usan en ceras, gomas, resinas, lociones y bálsamos farmacéuticos, aditivos para aceites lubricantes, agentes de acabado y antiestáticos textiles, plastificantes, cosméticos, disolventes industriales y disolventes para grasas.
Los ésteres tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, el biodiésel, un combustible alternativo, está compuesto por ésteres (por ejemplo, éster metílico de ácidos grasos, ésteres etílicos de ácidos grasos, etc.). Algunos ésteres de bajo peso molecular son volátiles con un olor agradable que los hace útiles como fragancias o agentes saborizantes. Además, se usan ésteres como disolventes para lacas, pinturas y barnices. Además, algunas sustancias que se producen de manera natural, tales como ceras, grasas y aceites están compuestas por ésteres. También se usan ésteres como agentes de ablandamiento en resinas y plásticos, plastificantes, retardadores de la llama y aditivos en gasolina y gasoil. Además, pueden usarse ésteres en la fabricación de polímeros, películas, materiales textiles, colorantes y productos farmacéuticos.
Se usan aldehídos para producir muchos productos químicos especializados. Por ejemplo, se usan aldehídos para producir polímeros, resinas (por ejemplo, baquelita), colorantes, sabores, plastificantes, perfumes, productos farmacéuticos y otros productos químicos. Algunos se usan como disolventes, conservantes o desinfectantes. Algunos compuestos naturales y sintéticos, tales como vitaminas y hormonas, son aldehídos. Además, muchos azúcares contienen grupos aldehído.
Se usan cetonas comercialmente como disolventes. Por ejemplo, se usa frecuentemente acetona como disolvente, pero es también un material de partida para producir polímeros. También se usan cetonas en lacas, pinturas, explosivos, perfumes y procesamiento de materiales textiles. Además, se usan cetonas para producir alcoholes, alquenos, alcanos, iminas y enaminas.
Además, el petróleo crudo es una fuente de lubricantes. Los lubricantes derivados del petróleo están compuestos normalmente por olefinas, particularmente poliolefinas y alfa-olefinas. Los lubricantes o bien pueden refinarse del petróleo crudo o bien fabricarse usando materiales de partida refinados del petróleo crudo.
La obtención de estos productos químicos especializados a partir de petróleo crudo requiere una inversión financiera significativa así como un gran aporte de energía. También es un proceso ineficaz porque frecuentemente los hidrocarburos de cadena larga en petróleo crudo se someten a craqueo para producir monómeros más pequeños. Estos monómeros se usan entonces como material de partida para fabricar los productos químicos especializados más complejos.
Además de los problemas con la exploración, la extracción, el transporte y el refino del petróleo, el petróleo es un recurso cada vez más escaso y limitado. Una estimación del consumo de petróleo mundial es de 30000 millones de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
barriles al año. Según algunas estimaciones, se predice que a los niveles de producción actuales, las reservas de petróleo mundiales podrían agotarse antes del año 2050.
Finalmente, la combustión de combustibles a base de petróleo libera gases invernadero (por ejemplo, dióxido de carbono) y otras formas de contaminación del aire (por ejemplo, monóxido de carbono, dióxido de azufre, etc.). A medida que la demanda mundial de combustible aumenta, la emisión de gases invernadero y otras formas de contaminación del aire también aumenta. La acumulación de gases invernadero en la atmósfera conduce a un aumento del calentamiento global. Por tanto, además de dañar el medio ambiente localmente (por ejemplo, derrames de petróleo, dragado de entornos marinos, etc.), la combustión del petróleo también daña el medio ambiente globalmente.
Debido a los desafíos inherentes que plantea el petróleo, hay una necesidad de una fuente de petróleo renovable que no necesite explorarse, extraerse, transportarse a lo largo de grandes distancias o refinarse sustancialmente como el petróleo. Hay también una necesidad de una fuente de petróleo renovable que pueda producirse económicamente sin crear el tipo de daño medioambiental producido por la industria del petróleo y la combustión de combustibles a base de petróleo. Por motivos similares, hay también una necesidad de una fuente renovable de productos químicos que se derivan normalmente del petróleo. La entrada de la base de datos UniProt Q54764 da a conocer una secuencia polipeptídica idéntica en el 100% a la presente SEQ ID NO: 2. Fehler et al. (Biochemistry (1970), Vol. 9, n. ° 2, págs. 418-22) describen la biosíntesis de hidrocarburos, en particular alcanos, en Anabaena variabilis, y el análisis de espectrometría de masas de los mismos. El documento WO 2007/136762 se refiere a la producción de derivados de ácidos grasos, incluyendo la producción de alcanos y alquenos, en organismos modificados genéticamente, incluyendo E. coli modificado genéticamente. Phung et al. (Abstracts of the General Meeting of the American Society for Microbiology, 1 de enero de 1995, pág. 524, Abstract H-182-ISSN: 1060-2011) describen la identificación y secuenciación de cuatro polipéptidos implicados en las etapas iniciales de la biosíntesis de ácidos grasos en Synechococcus sp., concretamente la proteína transportadora de biotina carboxilo (BCCP), una biotina carboxilasa, la subunidad alfa de carboxiltransferasa, y una beta-cetoaciltransferasa. Ladygina et al. (Process Biochemistry (2006), Vol. 41, n. ° 5, págs. 1359-5113) están revisando la biosíntesis microbiana de hidrocarburos.
Sumario de la invención
La invención se basa, al menos en parte, en la identificación de genes de cianobacterias que codifican para polipéptidos de biosíntesis de hidrocarburos. La invención se define por las reivindicaciones. En particular, la invención proporciona un método de producción de un alcano o alqueno a partir de una célula huésped modificada genéticamente, comprendiendo el método: (a) transformar una célula huésped para que se exprese introduciendo (i) un polinucleótido de biosíntesis de aldehídos que codifica para un polipéptido de biosíntesis de aldehídos, y (ii) un polinucleótido de biosíntesis de alcanos y alquenos que codifica para un polipéptido de biosíntesis de alcanos y alquenos; y (b) cultivar dicha célula huésped modificada genéticamente en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para producir un alcano o alqueno en el medio de cultivo, en el que dicho polipéptido de biosíntesis de aldehídos tiene actividad acil-ACP reductasa y procede de una cianobacteria, y en el que dicho polipéptido de biosíntesis de alcanos y alquenos tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria. En algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende producir en una célula huésped un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36, o una variante del mismo, y aislar el hidrocarburo de la célula huésped.
En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36.
En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36 con una o más substituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácido. El polipéptido tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria. Todavía en otras realizaciones de la divulgación, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36, con una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el polipéptido comprende una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos conservativas: reemplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina por una treonina; reemplazo de una treonina por una serina; reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, por otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que lleva un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, por otro residuo que lleva un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, por otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, por otro residuo aromático. En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. El polipéptido tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En otras realizaciones de la divulgación, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de: (i) SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39; o (ii) SEQ ID NO: 40 y una cualquiera de (a) SEQ ID NO: 37, (b) SEQ ID NO: 38, y (c) SEQ ID NO: 39; o (iii) SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44. El polipéptido tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.
En algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende expresar en una célula huésped un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98% o al menos aproximadamente el 99% SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35. En algunas realizaciones de la divulgación, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35. En algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende además aislar el hidrocarburo de la célula huésped.
En otras realizaciones de la divulgación, la secuencia de nucleótidos hibrida con un complemento de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35, o con un fragmento del mismo, por ejemplo, en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad.
En otras realizaciones de la divulgación, la secuencia de nucleótidos codifica para un polipéptido que comprende: (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36; o (ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36 con una o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36 con una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. El polipéptido tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.
En otras realizaciones de la divulgación, la secuencia de nucleótidos codifica para un polipéptido que tiene la misma actividad biológica que un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35 o un fragmento de la misma. En otras realizaciones de la divulgación, la secuencia de nucleótidos hibrida con un complemento de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35 o con un fragmento del mismo, por ejemplo, en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad. La actividad biológica es actividad descarbonilasa y el polipéptido codificado procede de una cianobacteria.
En algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende transformar una célula huésped con un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos
aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos
aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos
aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos
aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% con SEQ ID nO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35. En algunas realizaciones de la divulgación, el vector recombinante comprende además un promotor operativamente unido a la secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones de la divulgación, el promotor es un promotor regulado por el desarrollo, uno específico de orgánulo, uno específico de tejido, uno inducible, uno constitutivo o uno específico de célula. En realizaciones particulares de la divulgación, el vector recombinante comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en (a) una secuencia reguladora acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos; (b) un marcador de selección acoplado operativamente a la secuencia de nucleótidos; (c) una secuencia de marcador acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos; (d) un resto de purificación acoplado operativamente a la secuencia de nucleótidos; (e) una secuencia de secreción acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos; y (f) una secuencia de direccionamiento acoplada operativamente a la secuencia de nucleótidos. En determinadas realizaciones de la divulgación, la secuencia de nucleótidos se incorpora de manera estable en el ADN genómico de la célula huésped, y la expresión de la secuencia de nucleótidos está bajo el control de una región promotora regulada.
En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la célula huésped puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula de mamífero, célula vegetal, célula de insecto, célula de levadura, célula de hongo, célula de hongos filamentosos y célula bacteriana.
En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana Gram-positiva. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana Gram-negativa.
En algunas realizaciones, la célula huésped se selecciona del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor,
Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces.
En realizaciones particulares, la célula huésped es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus licheniformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis o una célula de Bacillus amiloliquefaciens.
En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhodococcus opacus, una célula de Rhizomucor miehei o una célula de Mucor michei.
Aún en otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Streptomyces lividans o una célula de Streptomyces murinus. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Actinomycetes.
En algunas realizaciones de la divulgación, la célula huésped es una célula CHO, una célula COS, una célula VERO, una célula BHK, una célula HeLa, una célula Cv1, una célula MDCK, una célula 293, una célula 3T3 o una célula PC12.
En realizaciones particulares, la célula huésped es una célula de E. coli, tal como una célula de E. coli de cepa B, una de cepa C, una de cepa K o una de cepa W.
En otras realizaciones, la célula huésped es una célula huésped cianobacteriana. En realizaciones particulares, la célula huésped cianobacteriana es una célula enumerada en la tabla 1.
En algunas realizaciones, los alcanos y alquenos se secretan de la célula huésped.
En determinadas realizaciones de la divulgación, la célula huésped sobreexpresa un sustrato descrito en el presente documento. En algunas realizaciones de la divulgación, el método incluye además transformar la célula huésped con un ácido nucleico que codifica para una enzima descrita en el presente documento, y la célula huésped sobreexpresa un sustrato descrito en el presente documento. En otras realizaciones de la divulgación, el método incluye además cultivar la célula huésped en presencia de al menos un sustrato descrito en el presente documento. En algunas realizaciones de la divulgación, el sustrato es un derivado de ácido graso, una acil-ACP, un ácido graso, una acil-CoA, un aldehído graso, un alcohol graso o un éster graso.
En algunas realizaciones de la divulgación, el sustrato de derivado de ácido graso es un sustrato de derivado de ácido graso insaturado, un sustrato de derivado de ácido graso monoinsaturado o un sustrato de derivado de ácido graso saturado. En otras realizaciones, el sustrato de derivado de ácido graso es un sustrato de derivado de ácido graso de cadena lineal, un sustrato de derivado de ácido graso de cadena ramificada o un sustrato de derivado de ácido graso que incluye un resto cíclico.
En determinadas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, el hidrocarburo producido es un alcano. En algunas realizaciones, el alcano es un alcano C3-C25. Por ejemplo, el alcano es un alcano C3, C4, C5, C6,
C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24 o C25. En algunas realizaciones, el alcano es tridecano, metiltridecano, nonadecano, metilnonadecano, heptadecano, metilheptadecano, pentadecano o metilpentadecano.
En algunas realizaciones, el alcano es un alcano de cadena lineal, un alcano de cadena ramificada o un alcano cíclico.
En determinadas realizaciones, el método comprende además cultivar la célula huésped en presencia de un derivado de ácido graso saturado, y el hidrocarburo producido es un alcano. En determinadas realizaciones, el derivado de ácido graso saturado es un sustrato derivado de ácido graso C6-C26. Por ejemplo, el sustrato derivado de ácido graso es un sustrato derivado de ácido graso C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 o C26. En realizaciones particulares, el sustrato derivado de ácido graso es 2- metilicosanal, icosanal, octadecanal, tetradecanal, 2-metiloctadecanal, estearaldehído o palmitaldehído.
En algunas realizaciones, el método incluye además aislar el alcano de la célula huésped o del medio de cultivo. En otras realizaciones de la divulgación, el método incluye además someter el alcano a craqueo o refino.
En determinadas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, el hidrocarburo producido es un alqueno. En algunas realizaciones de la divulgación, el alqueno es un alqueno C3-C25. Por ejemplo, el alqueno es un alqueno C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24 o C25. En algunas realizaciones, el alqueno es pentadeceno, heptadeceno, metilpentadeceno o metilheptadeceno.
En algunas realizaciones, el alqueno es un alqueno de cadena lineal, un alqueno de cadena ramificada o un alqueno
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
cíclico.
En determinadas realizaciones, el método comprende además cultivar la célula huésped en presencia de un derivado de ácido graso insaturado, y el hidrocarburo producido es un alqueno. En determinadas realizaciones, el derivado de ácido graso insaturado es un sustrato derivado de ácido graso C6-C26. Por ejemplo, el sustrato derivado de ácido graso es un sustrato derivado de ácido graso insaturado Ce, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C11, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 o C26. En realizaciones particulares, el sustrato derivado de ácido graso es
octadecenal, hexadecenal, metilhexadecenal o metiloctadecenal.
En otro aspecto, en el presente documento se describe un microorganismo modificado genéticamente que comprende una secuencia de control exógena incorporada de manera estable en el ADN genómico del microorganismo. En una realización, la secuencia de control se integra en el sentido de 5' de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 70% con SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35. En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 75%, al menos
aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos
aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos
aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos
aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% con SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35. En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35.
En algunas realizaciones de la divulgación, el microorganismo expresa un nivel aumentado de un hidrocarburo en relación con una cianobacteria silvestre.
En otro aspecto, en el presente documento se describe un método de preparación de un hidrocarburo, comprendiendo el método cultivar un microorganismo modificado genéticamente descrito en el presente documento en condiciones adecuadas para la expresión génica, y aislar el hidrocarburo.
En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido (i) tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36, o una variante de la misma; (ii) se codifica por una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 70% con SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35, o una variante de la misma; (iii) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 38 ó 39; (iv) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y una cualquiera de (a) SEQ ID NO: 37, (b) SEQ ID NO: 38 y (c) SEQ ID NO: 39; o (v) es SEQ ID NO: 41, 42, 43 ó 44. El polipéptido tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.
En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido tiene una identidad de al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,
22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36. En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36.
En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido se codifica por una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos
aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos
aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos
aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos
aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% con SEQ ID nO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,
23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35. En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido se codifica por una secuencia de nucleótidos que tiene SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35.
En algunas realizaciones, el sustrato biológico es un derivado de ácido graso, una acil-ACP, un ácido graso, una acil-CoA, un aldehído graso, un alcohol graso, o un éster graso.
En algunas realizaciones, el sustrato es un derivado de ácido graso saturado, y el hidrocarburo es un alcano, por ejemplo, un alcano C3-C25. Por ejemplo, el alcano es un alcano C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24 o C25. En algunas realizaciones, el alcano es tridecano, metiltridecano,
nonadecano, metilnonadecano, heptadecano, metilheptadecano, pentadecano o metilpentadecano.
En algunas realizaciones, el alcano es un alcano de cadena lineal, un alcano de cadena ramificada o un alcano cíclico.
En algunas realizaciones, el derivado de ácido graso saturado es 2-metilicosanal, icosanal, octadecanal, tetradecanal, 2-metiloctadecanal, estearaldehído o palmitaldehído.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En otras realizaciones de la divulgación, el sustrato biológico es un derivado de ácido graso insaturado, y el hidrocarburo es un alqueno, por ejemplo, un alqueno C3-C25. Por ejemplo, el alqueno es un alqueno C3, C4, C5, Ce,
C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24 o C25. En algunas realizaciones, el
alqueno es pentadeceno, heptadeceno, metilpentadeceno o metilheptadeceno.
En algunas realizaciones, el alqueno es un alqueno de cadena lineal, un alqueno de cadena ramificada o un alqueno cíclico.
En algunas realizaciones, el derivado de ácido graso insaturado es octadecenal, hexadecenal, metilhexadecenal o metiloctadecenal.
En otro aspecto, en el presente documento se describe un hidrocarburo producido mediante cualquiera de los métodos o microorganismos descritos en el presente documento. El hidrocarburo puede ser un alcano o un alqueno que tiene una 813C de aproximadamente -15,4 o mayor. Por ejemplo, el alcano o alqueno tiene una 813C de aproximadamente -15,4 a aproximadamente -10,9, por ejemplo, de aproximadamente -13,92 a aproximadamente -13,84. El alcano o alqueno puede tener una fM14C de al menos aproximadamente 1,003. Por ejemplo, el alcano o alqueno tiene una fM14C de al menos aproximadamente 1,01 o al menos aproximadamente 1,5. El alcano o alqueno puede tener una fM14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.
En otro aspecto, en el presente documento se describe un biocombustible que incluye un hidrocarburo producido mediante cualquiera de los métodos o microorganismos descritos en el presente documento. El hidrocarburo puede ser un alcano o alqueno que tiene una 813C de aproximadamente -15,4 o mayor. Por ejemplo, el alcano o alqueno tiene una 813C de aproximadamente -15,4 a aproximadamente -10,9, por ejemplo, de aproximadamente -13,92 a aproximadamente -13,84. El alcano o alqueno puede tener una fM14C de al menos aproximadamente 1,003. Por ejemplo, el alcano o alqueno tiene una fM14C de al menos aproximadamente 1,01 o al menos aproximadamente 1,5. El alcano o alqueno tiene una fM14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124. El biocombustible es diésel, gasolina, o combustible para motores a reacción.
En otro aspecto, en el presente documento se describe un ácido nucleico aislado que consiste en no más de aproximadamente 500 nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35. El ácido nucleico puede consistir en no más de aproximadamente 300 nucleótidos, no más de aproximadamente 350 nucleótidos, no más de aproximadamente 400 nucleótidos, no más de aproximadamente 450 nucleótidos, no más de aproximadamente 550 nucleótidos, no más de aproximadamente 600 nucleótidos, o no más de aproximadamente 650 nucleótidos, de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35. El ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad descarbonilasa y que procede de una cianobacteria.
En otro aspecto, en el presente documento se describe un ácido nucleico aislado que consiste en no más de aproximadamente el 99%, no más de aproximadamente el 98%, no más de aproximadamente el 97%, no más de
aproximadamente el 96%, no más de aproximadamente el 95%, no más de aproximadamente el 94%, no más de
aproximadamente el 93%, no más de aproximadamente el 92%, no más de aproximadamente el 91%, no más de
aproximadamente el 90%, no más de aproximadamente el 85%, o no más de aproximadamente el 80% de los nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35. El ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad descarbonilasa y que procede de una cianobacteria.
En otro aspecto, en el presente documento se describe un polipéptido aislado que consiste en no más de aproximadamente 200, no más de aproximadamente 175, no más de aproximadamente 150, o no más de aproximadamente 100 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36. El polipéptido tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.

En otro aspecto, en el presente documento se describe un polipéptido aislado que consiste en no más de

aproximadamente el 99%, no más de aproximadamente el 98%, no más de aproximadamente el 97%, no más de

aproximadamente el 96%, no más de aproximadamente el 95%, no más de aproximadamente el 94%, no más de

aproximadamente el 93%, no más de aproximadamente el 92%, no más de aproximadamente el 91%, no más de
aproximadamente el 90%, no más de aproximadamente el 85%, o no más de aproximadamente el 80% de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36. El polipéptido tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.
Definiciones
A lo largo de toda la memoria descriptiva, puede hacerse referencia usando un nombre de polipéptido o nombre de gen abreviado, pero se entiende que tal nombre de polipéptido o nombre de gen abreviado representa el género de genes o polipéptidos. Tales nombres de gen incluyen todos los genes que codifican para el mismo polipéptido y polipéptidos homólogos que tienen la misma función fisiológica. Los nombres de polipéptido incluyen todos los polipéptidos que tienen la misma actividad (por ejemplo, que catalizan la misma reacción química fundamental).
Los números de registro a los que se hace referencia en el presente documento se derivan de la base de datos de NCBI (National Center for Biotechnology Information) mantenida por el National Institute of Health, EE.UU. A menos que se indique lo contrario, los números de registro son tal como se proporcionan en la base de datos de abril de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2009.
Los números EC se establecen por el Nomenclatura Committee de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) (disponible en
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). Los números EC a los que se hace referencia en el presente documento se derivan de la base de datos KEGG Ligand, mantenida por la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics, subvencionada en parte por la Universidad de Tokio. A menos que se indique lo contrario, los números EC son tal como se proporcionan en la base de datos en marzo de 2008.
Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.
El término “aproximadamente” se usa en el presente documento para significar un valor ± 20% de un valor numérico dado. Por tanto, “aproximadamente el 60%” significa un valor de entre 60 ± (20% de 60) (es decir, entre 48 y 70).
Tal como se usa en el presente documento, el término “aldehído” significa un hidrocarburo que tiene la fórmula RCHO caracterizado por un grupo carbonilo insaturado (C=O). En una realización preferida, el aldehído es cualquier aldehído compuesto por un ácido graso o derivado de ácido graso. En una realización, el grupo R tiene al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 carbonos de longitud.
Tal como se usa en el presente documento, un “gen de biosíntesis de aldehídos” o un “polinucleótido de biosíntesis de aldehídos” es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de biosíntesis de aldehídos.
Tal como se usa en el presente documento, un “polipéptido de biosíntesis de aldehídos” es un polipéptido que forma parte de la ruta de biosíntesis de un aldehído. Tales polipéptidos pueden actuar sobre un sustrato biológico para producir un aldehído. El polipéptido de biosíntesis de aldehídos tiene actividad reductasa y procede de una cianobacteria.
Tal como se usa en el presente documento, el término “alcano” significa un hidrocarburo que contiene sólo enlaces carbono-carbono sencillos.
Tal como se usa en el presente documento, un “gen de biosíntesis de alcanos” o un “polinucleótido de biosíntesis de alcanos” es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de biosíntesis de alcanos.
Tal como se usa en el presente documento, un “polipéptido de biosíntesis de alcanos” es un polipéptido que forma parte de la ruta de biosíntesis de un alcano. Tales polipéptidos pueden actuar sobre un sustrato biológico para producir un alcano. El polipéptido de biosíntesis de alcanos tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.
Tal como se usa en el presente documento, un “gen de biosíntesis de alquenos” o un “polinucleótido de biosíntesis de alquenos” es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de biosíntesis de alquenos.
Tal como se usa en el presente documento, un “polipéptido de biosíntesis de alquenos” es un polipéptido que forma parte de la ruta de biosíntesis de un alqueno. Tales polipéptidos pueden actuar sobre un sustrato biológico para producir un alqueno. El polipéptido de biosíntesis de alquenos tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.
Tal como se usa en el presente documento, el término “atenuar” significa debilitar, reducir o disminuir. Por ejemplo, un polipéptido puede atenuarse modificando el polipéptido para reducir su actividad (por ejemplo, modificando una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido).
Tal como se usa en el presente documento, el término “biodiésel” significa un biocombustible que puede ser un sustituto de diésel, que se deriva de petróleo. Puede usarse biodiésel en motores diésel de combustión interna o bien en forma pura, que se denomina biodiésel “no mezclado”, o bien como mezcla en cualquier concentración con diésel a base de petróleo. Biodiésel puede incluir ésteres o hidrocarburos, tales como aldehídos y alcanos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “biocombustible” se refiere a cualquier combustible derivado a partir de biomasa. Los combustibles a base de petróleo pueden sustituirse por biocombustibles. Por ejemplo, los biocombustibles incluyen combustibles de transporte (por ejemplo, gasolina, diésel, combustible para motores a reacción, etc.), combustibles para calefacción y combustibles para la generación de electricidad. Los biocombustibles son una fuente de energía renovable.
Tal como se usa en el presente documento, el término “biomasa” se refiere a una fuente de carbono derivada de material biológico. La biomasa puede convertirse en un biocombustible. Una fuente de biomasa a modo de ejemplo es materia vegetal. Por ejemplo puede usarse maíz, caña de azúcar o césped como biomasa. Otro ejemplo no limitativo de biomasa es materia animal, por ejemplo estiércol de vaca. La biomasa también incluye productos de desecho procedentes de la industria, agricultura, silvicultura y desechos domésticos. Ejemplos de tales productos de desecho que pueden usarse como biomasa son desechos de fermentación, paja, madera, aguas residuales, basura
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
y restos de comida. La biomasa también incluye fuentes de carbono, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos o polisacáridos).
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “fuente de carbono” se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para usarse como fuente de carbono para el crecimiento de células procariotas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden estar en diversas formas, incluyendo, pero sin limitarse a polímeros, hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos y gases (por ejemplo, CO y CO2). Estas incluyen, por ejemplo, diversos monosacáridos, tales como glucosa, fructosa, manosa y galactosa; oligosacáridos, tales como fructo-oligosacárido y galacto-oligosacárido; polisacáridos tales como xilosa y arabinosa; disacáridos, tales como sacarosa, maltosa y turanosa; material celulósico, tal como metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio; ésteres de ácidos grasos saturados o insaturados, tales como succinato, lactato y acetato; alcoholes, tales como etanol, o mezclas de los mismos. La fuente de carbono también puede ser un producto de fotosíntesis, incluyendo, pero sin limitarse a, glucosa. Una fuente de carbono preferida es biomasa. Otra fuente de carbono preferida es glucosa.
Tal como se usa en el presente documento, un “aditivo que reduce el punto de turbidez” es un aditivo añadido a una composición para disminuir o reducir el punto de turbidez de una disolución.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “punto de turbidez de un fluido” significa la temperatura a la que los sólidos disueltos ya no son completamente solubles. Por debajo de esta temperatura, los sólidos empiezan a precipitar como una segunda fase dando al fluido una apariencia turbia. En la industria petrolera, el punto de turbidez se refiere a la temperatura por debajo de la cual un material solidificado u otro hidrocarburo pesado cristaliza para dar un aceite crudo, aceite refinado o combustible para formar una apariencia turbia. La presencia de materiales solidificados influye en el comportamiento de flujo del fluido, la tendencia del fluido a obstruir los filtros de combustible, inyectores, etc., la acumulación de materiales solidificados sobre superficies frías (por ejemplo, incrustación de una tubería o un intercambiador de calor) y las características de emulsión del fluido con agua.
Una secuencia de nucleótidos es “complementaria” a otra secuencia de nucleótidos si cada una de las bases de las dos secuencias se aparea (es decir, puede formar pares de bases de Watson Crick). El término “hebra complementaria” se usa en el presente documento de manera intercambiable con el término “complemento”. El complemento de una hebra de ácido nucleico puede ser el complemento de una hebra codificante o el complemento de una hebra no codificante.
Tal como se usa en el presente documento, el término “condiciones suficientes para permitir la expresión” significa cualquier condición que permite a una célula huésped producir un producto deseado, tal como un polipéptido, aldehído o alcano descrito en el presente documento. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentación. Las condiciones de fermentación pueden comprender muchos parámetros, tales como intervalos de temperatura, niveles de aireación y composición de medios. Cada una de estas condiciones, individualmente y en combinación, permite que la célula huésped crezca. Los medios de cultivo a modo de ejemplo incluyen caldos o geles. Generalmente, el medio incluye una fuente de carbono, tal como glucosa, fructosa, celulosa, o similares, que puede metabolizarse por una célula huésped directamente. Además, pueden usarse enzimas en el medio para facilitar la movilización (por ejemplo, la despolimerización de almidón o celulosa para dar azúcares fermentables) y el metabolismo posterior de la fuente de carbono.
Para determinar si las condiciones son suficientes para permitir la expresión, puede cultivarse una célula huésped, por ejemplo, durante aproximadamente 4, 8, 12, 24, 36 ó 48 horas. Durante y/o tras el cultivo, pueden obtenerse muestras y analizarse para determinar si las condiciones permiten la expresión. Por ejemplo, las células huésped en la muestra o el medio en el que se hicieron crecer las células huésped pueden someterse a prueba para determinar la presencia de un producto deseado. Cuando se somete a prueba para determinar la presencia de un producto, pueden usarse ensayos, tales como, pero sin limitarse a, CCF, HPLC, CG/FID, CG/EM, CL/EM, EM.
Se entiende que los polipéptidos descritos en el presente documento pueden tener sustituciones de aminoácidos conservativas o no esenciales adicionales, que no tienen un efecto sustancial sobre las funciones del polipéptido. Puede determinarse si una sustitución particular se tolerará (es decir, no afectará de manera adversa a las propiedades biológicas deseadas, tales como actividad descarboxilasa) tal como se describe en Bowie et al. Science (1990) 247:1306 1310. Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que el residuo de aminoácido se remplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
Tal como se usa en el presente documento, “elemento de control” significa un elemento de control de la transcripción. Los elementos de control incluyen promotores y potenciadores. El término “elemento promotor”, “promotor” o “secuencia promotora” se refiere a una secuencia de ADN que funciona como interruptor que activa la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
expresión de un gen. Si se activa el gen, se dice que se transcribe o que participa en la transcripción. La transcripción implica la síntesis de ARNm a partir del gen. Por tanto, un promotor sirve como un elemento regulador de la transcripción y también proporciona un sitio para el inicio de la transcripción del gen para dar ARNm. Los elementos de control interaccionan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción (Maniatis et al, Science 236:1237, 1987).
Tal como se usa en el presente documento, el término “éster sintasa” significa un péptido que puede producir ésteres grasos. Más específicamente, una éster sintasa es un péptido que convierte un tioéster en un éster graso. En una realización preferida, la éster sintasa convierte un tioéster (por ejemplo, acil-CoA) en un éster graso.
En una realización alternativa, una éster sintasa usa un tioéster y un alcohol como sustratos para producir un éster graso. Las éster sintasas pueden usar tioésteres de cadena corta y larga como sustratos. Además, las éster sintasas pueden usar alcoholes de cadena corta y larga como sustratos.
Los ejemplos no limitativos de éster sintasas son cera sintasas, cera-éster sintasas, acil CoA:alcohol transacilasas, aciltransferasas y acil graso-coenzima A:alcohol graso aciltransferasas. Las éster sintasas a modo de ejemplo se clasifican en el número de clasificación de enzimas EC 2.3.1.75. En la figura 40 se proporcionan números de registro de GenBank a modo de ejemplo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “ácido graso” significa un ácido carboxílico que tiene la fórmula RCOOH. R representa un grupo alifático, preferiblemente un grupo alquilo. R puede comprender entre aproximadamente 4 y aproximadamente 22 átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden estar saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. En una realización preferida, el ácido graso se prepara a partir de una ruta de biosíntesis de ácidos grasos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “ruta de biosíntesis de ácidos grasos” significa una ruta de biosíntesis que produce ácidos grasos. La ruta de biosíntesis de ácidos grasos incluye enzimas de ácido graso que pueden modificarse por ingeniería genética, tal como se describe en el presente documento, para producir ácidos grasos, y en algunas realizaciones pueden expresarse con enzimas adicionales para producir ácidos grasos que tienen características de la cadena de carbono deseadas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “derivado de ácido graso” significa productos preparados en parte a partir de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos del microorganismo huésped de producción. “Derivado de ácido graso” también incluye productos preparados en parte a partir de acil-ACP o derivados de acil-ACP. La ruta de biosíntesis de ácidos grasos incluye enzimas ácido graso sintasa que pueden modificarse por ingeniería genética tal como se describe en el presente documento para producir derivados de ácido graso, y en algunos ejemplos pueden expresarse con enzimas adicionales para producir derivados de ácido graso que tienen características de cadena de carbono deseadas. Los derivados de ácido graso a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, ácidos grasos, acil-CoA, aldehído graso, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos, alcoholes grasos y ésteres (por ejemplo, ceras, ésteres de ácidos grasos o ésteres grasos).
Tal como se usa en el presente documento, el término “enzimas de derivado de ácido graso” significa todas las enzimas que pueden expresarse o sobreexpresarse en la producción de derivados de ácido graso. Estas enzimas se denominan colectivamente en el presente documento enzimas de derivado de ácido graso. Estas enzimas pueden ser parte de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. Los ejemplos no limitativos de enzimas de derivado de ácido graso incluyen ácido graso sintasas, tioesterasas, acil-CoA sintasas, acil-CoA reductasas, alcohol deshidrogenasas, alcohol aciltransferasas, acil-CoA reductasa que forma alcohol graso, éster sintasas, polipéptidos de biosíntesis de aldehídos y polipéptidos de biosíntesis de alcanos. Las enzimas de derivado de ácido graso convierten un sustrato en un derivado de ácido graso. En algunos ejemplos, el sustrato puede ser un derivado de ácido graso que la enzima de derivado de ácido graso convierte en un derivado de ácido graso diferente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “péptidos que forman alcohol graso” significa un péptido que puede catalizar la conversión de acil-CoA en alcohol graso, incluyendo acil-CoA reductasa que forma alcohol graso (FAR, EC 1.1.1.*), acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50) o alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos que forman alcohol graso catalizarán también otras reacciones. Por ejemplo, algunos péptidos de acil-CoA reductasa aceptarán otros sustratos además de ácidos grasos. Por tanto, también se incluyen tales péptidos no específicos. Se conocen en la técnica secuencias de ácido que codifican para péptidos que forman alcohol graso, y tales péptidos están disponibles públicamente. En la figura 40 se proporcionan números de registro de GenBank a modo de ejemplo.
Tal como se usa en el presente documento, “enzima de ácido graso” significa cualquier enzima implicada en la biosíntesis de ácidos grasos. Pueden expresarse o sobreexpresarse enzimas de ácido graso en células huésped para producir ácidos grasos. Los ejemplos no limitativos de enzimas de ácido graso incluyen ácido graso sintasas y tioesterasas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “éster graso” significa un éster. En una realización preferida, un éster graso es cualquier éster compuesto por un ácido graso, por ejemplo un éster de ácido graso. En una realización, un éster graso contiene un lado A (es decir, la cadena de carbono unida al oxígeno del carboxilato) y un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
lado B (es decir, la cadena de carbono que comprende el carboxilato original). En una realización preferida, cuando el éster graso se deriva de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos, al lado A contribuye un alcohol, y al lado B contribuye un ácido graso. Puede usarse cualquier alcohol para formar el lado A de los ésteres grasos. Por ejemplo, el alcohol puede derivarse de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. Alternativamente, el alcohol puede producirse a través de rutas de biosíntesis que no son de ácidos grasos. Además, el alcohol puede proporcionarse de manera exógena. Por ejemplo, el alcohol puede suministrarse en el caldo de fermentación en casos en los que el éster graso se produce por un microorganismo. Alternativamente, puede suministrarse de manera exógena un ácido carboxílico, tal como un ácido graso o ácido acético, en casos en los que el éster graso se produce por un microorganismo que también puede producir alcohol.
Las cadenas de carbono que comprenden el lado A o el lado B pueden ser de cualquier longitud. En una realización, el lado A del éster tiene al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 ó 18 carbonos de longitud. El lado B del éster tiene al menos aproximadamente 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ó 26 carbonos de longitud. El lado A y/o el lado B pueden ser de cadena lineal o ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener uno o más puntos de ramificación. Además, las cadenas ramificadas pueden incluir ramificaciones cíclicas. Además, el lado A y/o el lado B puede estar saturado o insaturado. Si está insaturado, el lado A y/o el lado B puede tener uno o más puntos de insaturación.
En una realización, el éster graso se produce de manera biosintética. En esta realización, en primer lugar el ácido graso se “activa”. Ejemplos no limitativos de ácidos grasos “activados” son acil-CoA, acil-ACP y fosfato de acilo. Acil- CoA puede ser un producto directo de la biosíntesis o degradación de ácidos grasos. Además, acil-CoA puede sintetizarse a partir de un ácido graso libre, una CoA o un trifosfato de nucleótido de adenosina (ATP). Un ejemplo de una enzima que produce acil-CoA es acil-CoA sintasa.
Tras activarse el ácido graso, puede transferirse fácilmente a un nucleófilo receptor. Nucleófilos a modo de ejemplo son alcoholes, tioles o fosfatos.
En una realización, el éster graso es una cera. La cera puede derivarse de un alcohol de cadena larga y un ácido graso de cadena larga. En otra realización, el éster graso puede derivarse de un acil graso-tioéster y un alcohol. En otra realización, el éster graso es un tioéster de ácido graso, por ejemplo acil graso-coenzima A (CoA). En otras realizaciones, el éster graso es un pantotenato de acilo graso, una proteína portadora de acilo (ACP) o un éster de fosfato graso. Los ésteres grasos tienen muchos usos. Por ejemplo, pueden usarse ésteres grasos como biocombustible.
Tal como se usa en el presente documento, “fracción de carbono moderno” o “fM” tiene el mismo significado que el definido por el National Institute of Standards and Technology (NIST), Standard Reference Materials (SRM) 4990B y 4990C, conocido como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se refiere a 0,95 veces la razón de isótopos 14C/12C de HOxI (en referencia a AD 1950). Esto es aproximadamente equivalente a madera anterior a la revolución industrial corregida para la descomposición. Para la biosfera viva actual (material vegetal), fM es de aproximadamente 1,1.
Pueden realizarse cálculos de “homología” entre dos secuencias tal como sigue. Las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en uno o ambos de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para el alineamiento óptimo y puede no tenerse en cuenta las secuencias no homólogas con fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia que se alinea con fines de comparación es de al menos aproximadamente el 30%, preferiblemente al menos aproximadamente del 40%, más preferiblemente al menos aproximadamente del 50%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente del 60%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente del 70%, al menos aproximadamente del 80%, al menos aproximadamente del 90% o aproximadamente del 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se comparan los residuos de aminoácido o nucleótidos en las posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se usa en el presente documento, “identidad” de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a “homología” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias pueden lograrse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970), J. MoI. Biol. 48:444 453, que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando o bien una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Aún en otra realización preferida, el porcentaje de homología entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un conjunto particularmente preferido de parámetros (y el que debería usarse si el técnico no está seguro de qué parámetros deben aplicarse para determinar si una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
molécula está dentro de una limitación de homología de las reivindicaciones) son la matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco de desplazamiento de marco de 5.
Tal como se usa en el presente documento, una “célula huésped” es una célula usada para producir un producto descrito en el presente documento (por ejemplo, un aldehído o alcano descrito en el presente documento). Una célula huésped puede modificarse para expresar o sobreexpresar genes seleccionados o para que tenga una expresión atenuada de genes seleccionados. Los ejemplos no limitativos de células huésped incluyen células vegetales, animales, humanas, de bacterias, levaduras u hongos filamentosos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “se hibrida en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad” describe condiciones para la hibridación y el lavado. Puede encontrarse orientación para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. En esta referencia se describen métodos acuosos y no acuosos y puede usarse cualquiera de los métodos. Condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en el presente documento son tal como siguen: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% al menos a 50°C (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55°C para las condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60°C; 3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y preferiblemente 4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65°C, seguido por uno o más lavados a 0,2X SSC, SDS al 1% a 65°C. Las condiciones de muy alta rigurosidad (4) son las condiciones preferidas a menos que se especifique lo contrario.
El término “aislado” tal como se usa en el presente documento con respecto a ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN, se refiere a moléculas separadas de otros ADN o ARN, respectivamente, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Además, un “ácido nucleico aislado” incluye fragmentos de ácido nucleico, tales como fragmentos que no se producen de manera natural. El término “aislado” también se usa en el presente documento para referirse a polipéptidos, que se aíslan de otras proteínas celulares y abarca tanto polipéptidos purificados endógenos como polipéptidos recombinantes. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente libre de material celular, material viral o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.
Tal como se usa en el presente documento, el “nivel de expresión de un gen en una célula” se refiere al nivel de ARNm, transcripto(s) incipiente(s) pre-ARNm, productos intermedios de procesamiento de transcriptos, ARNm maduro(s) y productos de degradación codificados por el gen en la célula.
Tal como se usa en el presente documento, el término “microorganismo” significa especies microbianas procariotas y eucariotas de los dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, incluyendo este último levaduras y hongos filamentosos, protozoos, algas o protistas superiores. El término “células microbianas”, tal como se usa en el presente documento, significa una célula de un microorganismo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “ácido nucleico” se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y, cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (ARN). El término también incluye análogos de cualquiera de ARN o ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos, y tal como puede aplicarse a la realización que está describiéndose, polinucleótidos mono (sentido o antisentido) y bicatenarios, EST, cromosomas, ADNc, ARNm y ARNr.
Tal como se usa en el presente documento, el término “operativamente unido” significa que una secuencia de nucleótidos seleccionada (por ejemplo, que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento) está en proximidad con un promotor para permitir que el promotor regule la expresión de la secuencia de nucleótidos seleccionada. Además, el promotor se localiza en el sentido de 5' de la secuencia de nucleótidos seleccionada en cuanto al sentido de transcripción y traducción. Por “operativamente unido” quiere decirse que una secuencia de nucleótidos y una(s) secuencia(s) reguladora(s) están conectadas de tal manera como para permitir la expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) se unen a la(s) secuencia(s) reguladora(s).
El término “o” se usa en el presente documento para significar, y se usa de manera intercambiable con, el término “y/o”, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Tal como se usa en el presente documento, “sobreexpresar” significa expresar o provocar que se exprese un ácido nucleico, polipéptido o hidrocarburo en una célula a una concentración superior a la que se expresa normalmente en una célula silvestre correspondiente. Por ejemplo, un polipéptido puede “sobreexpresarse” en una célula huésped recombinante cuando el polipéptido está presente en una concentración superior en la célula huésped recombinante
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
en comparación con su concentración en una célula huésped no recombinante de la misma especie.
Tal como se usa en el presente documento, “coeficiente de reparto” o “P”, se define como la concentración en equilibrio de un compuesto en una fase orgánica dividida entre la concentración en equilibrio en una fase acuosa (por ejemplo, caldo de fermentación). En una realización de un sistema bifásico descrita en el presente documento, la fase orgánica se forma mediante el aldehído o alcano durante el procedimiento de producción. Sin embargo, en algunos ejemplos, puede proporcionarse una fase orgánica, tal como proporcionando una fase de octano, para facilitar la separación del producto. Cuando se describe un sistema de dos fases, las características de reparto de un compuesto pueden describirse como logP. Por ejemplo, un compuesto con un logP de 1 se repartirá 10:1 en la fase orgánica. Un compuesto con un logP de -1 se repartirá 1:10 en la fase orgánica. Eligiendo un caldo de fermentación y una fase orgánica apropiados, un aldehído o alcano con un valor de logP alto puede separarse en la fase orgánica incluso a concentraciones muy bajas en el recipiente de fermentación.
Tal como se usa en el presente documento, el término “purificar”, “purificado” o “purificación” significa la retirada o el aislamiento de una molécula de su entorno mediante, por ejemplo, aislamiento o separación. Las moléculas “sustancialmente purificadas” están libres al menos aproximadamente al 60%, preferiblemente libres al menos aproximadamente al 75% y más preferiblemente libres al menos aproximadamente al 90% de otros componentes con los que están asociadas. Tal como se usa en el presente documento, estos términos también se refieren a la eliminación de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la eliminación de contaminantes puede dar como resultado un aumento en el porcentaje de aldehídos o alcanos en una muestra. Por ejemplo, cuando se producen aldehídos o alcanos en una célula huésped, los aldehídos o alcanos pueden purificarse mediante la eliminación de proteínas de la célula huésped. Tras la purificación, aumenta el porcentaje de aldehídos o alcanos en la muestra.
Los términos “purificar”, “purificado” y “purificación” no requieren pureza absoluta. Son términos relativos. Por tanto, por ejemplo, cuando se producen aldehídos o alcanos en células huésped, un aldehído purificado o alcano purificado es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos, hidratos de carbono u otros hidrocarburos). En otro ejemplo, una preparación de aldehído purificado o alcano purificado es una en la que el aldehído o alcano está sustancialmente libre de contaminantes, tales como los que pueden estar presentes tras la fermentación. En algunas realizaciones, un aldehído o un alcano está purificado cuando al menos aproximadamente el 50% en peso de una muestra está compuesto por el aldehído o alcano. En otras realizaciones, un aldehído o un alcano está purificado cuando al menos aproximadamente el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 92%, el 95%, el 98% o el 99% o más en peso de una muestra está compuesto por el aldehído o alcano.
Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido recombinante” se refiere a un polipéptido que se produce mediante técnicas de ADN recombinante, en las que de manera general se inserta ADN que codifica para la el ARN o polipéptido expresado en un vector de expresión adecuado y que a su vez se usa para transformar una célula huésped para producir el polipéptido o ARN.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente idéntico” (o “sustancialmente homólogo”) se usa para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contiene un número suficiente de residuos de aminoácido o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservadas) a una segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos de manera que la primera y la segunda secuencias de aminoácidos o de nucleótidos tienen actividades similares.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sintasa” significa una enzima que cataliza un proceso de síntesis. Tal como se usa en el presente documento, el término sintasa incluye sintasas, sintetasas y ligasas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “transfección” significa la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, mediante un vector de expresión) en una célula receptora mediante transferencia de genes mediada por ácido nucleico.
Tal como se usa en el presente documento, “transformación” se refiere a un proceso en el que se cambia el genotipo de una célula como resultado de la captación celular de ácido nucleico exógeno. Esto puede dar como resultado que la célula transformada exprese una forma recombinante de un ARN o polipéptido. En el caso de expresión antisentido a partir del gen transferido, se altera la expresión de una forma que se produce de manera natural del polipéptido.
Tal como se usa en el presente documento, una “proteína de transporte” es un polipéptido que facilita el movimiento de uno o más compuestos al interior y/o al exterior de un orgánulo celular y/o una célula.
Tal como se usa en el presente documento, una “variante” de polipéptido X se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de polipéptido X en la que uno o más residuos de aminoácido están alterados. La variante puede tener cambios conservativos o cambios no conservativos. Puede encontrarse orientación en la determinación de qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin afectar a la actividad biológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software LASERGENE (DNASTAR).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
El término “variante”, cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótido, puede abarcar una secuencia de polinucleótido relacionada con la de un gen o la secuencia codificante del mismo. Esta definición también puede incluir, por ejemplo, variantes “alélicas”, “de corte y empalme”, “de especies” o “polimórficas”. Una variante de corte y empalme puede tener identidad significativa con respecto a un polinucleótido de referencia, pero generalmente tendrá un número mayor o menor de polinucleótidos debido al corte y empalme alternativo de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipéptido correspondiente puede presentar dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especies son secuencias de polinucleótido que varían de una especie a otra. Los polipéptidos resultantes tendrán generalmente identidad de aminoácido significativa unos con respecto a otros. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótido de un gen particular entre individuos de una especie dada.
Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector útil es un episoma (es decir, un ácido nucleico que puede realizar replicación fuera de los cromosomas). Los vectores útiles son los que pueden realizar replicación y/o expresión autónoma de ácidos nucleicos a los que están unidos. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente unidos se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. En general, vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de “plásmidos”, que se refieren generalmente a bucles de ADN bicatenario circular que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” se usan de manera intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, también se incluyen otras formas de vectores de expresión que sirvan para funciones equivalentes y que lleguen a conocerse en la técnica posteriormente a esto.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o las pruebas de la presente invención, se describen a continuación métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos sólo son ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de Prochlorococcus marinus CCMP1986. La figura 1B es un patrón de fragmentación de masas del pico a 7,55 min de la figura 1A.
La figura 2A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de Nostoc punctiforme PCC73102. La figura 2B es un patrón de fragmentación de masas del pico a 8,73 min de la figura 2A.
La figura 3A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de Gloeobaceter violaceus ATCC29082. La figura 3B es un patrón de fragmentación de masas del pico a 8,72 min de la figura 3A.
La figura 4A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de Synechocystic sp. PCC6803. La figura 4B es un patrón de fragmentación de masas del pico a 7,36 min de la figura 4A.
La figura 5A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células silvestres de Synechocystis sp. PCC6803. La figura 5B es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de Synechocystis sp. PCC6803 con una deleción de los genes sll0208 y sll0209.
La figura 6A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células silvestres de E. coli MG1655. La figura 6B es un perfil de Cg/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65).
La figura 7 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli que expresan cce_1430 de Cyanothece sp. ATCC51142 (YP_001802846) (SEQ ID NO: 69).
La figura 8A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SeQ ID NO: 65) e YP_400610 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1593) (SEQ ID NO: 1). La figura 8B representa patrones de fragmentación de masas del pico a 6,98 min de la figura 8A y de pentadecano. La figura 8C representa patrones de fragmentación de masas del pico a 8,12 min de la figura 8A y de 8-heptadeceno.
La figura 9 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 5).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La figura 10 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803 (NP_442147) (SEQ ID NO: 3).
La figura 11 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y alr5283 de Nostoc sp. PCC7210 (NP_489323) (SEQ ID NO: 7).
La figura 12 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y AM1_4041 de Acaryochloris marina MBIC11017 con codones optimizados (Yp_001518340) (SEQ ID NO: 46).
La figura 13 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y tll1313 de Thermosynechococcus elongatus BP-1 con codones optimizados (NP_682103) (SEQ ID NO: 47).
La figura 14 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y CYA_0415 de Synechococcus sp. JA-3-3Ab con codones optimizados (Yp_473897) (SEQ ID NO: 48).
La figura 15 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y gll3146 de Gloeobacter violaceus PCC7421 (NP_926092) (SEQ ID NO: 15).
La figura 16 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y PMT1231 de Prochlorococcus marinus MIT9313 con codones optimizados (NP_895059) (SeQ ID NO: 49).
La figura 17 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y PMM0532 de Prochlorococcus marinus CCMP1986 (NP_892650) (SEQ iD No: 19).
La figura 18 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y PMN2A_1863 de Prochlorococcus marinus NATL2A con codones optimizados (YP_293054) (SEQ ID NO: 51).
La figura 19 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y RS9917_09941 de Synechococcus sp. RS9917 con codones optimizados (zP_01079772) (SEQ ID NO: 52).
La figura 20 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y RS9917_12945 de Synechococcus sp. RS9917 con codones optimizados (zP_01080370) (SEQ ID NO: 53).
La figura 21 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y cce_0778 de Cyanothece sp. ATCC51142 (YP_001802195) (SEQ ID NO: 27).
La figura 22 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Cyan7425_0398 de Cyanothece sp. PCC7425 (YP_002481151) (SEQ ID NO: 29).
La figura 23 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Cyan7425_2986 de Cyanothece sp. PCC7425 (YP_002483683) (SEQ ID NO: 31).
La figura 24A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan PMM0533 de Prochlorococcus marinus CCMP1986 (NP_892651) (SEQ ID NO: 71). La figura 24B es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan PMM0533 de Prochlorococcus marinus CCMP1986 (NP_892651) (SEQ ID NO: 71) y PMM0532 de Prochlorococcus marinus CCMP1986 (NP_892650) (SEQ ID NO: 19).
La figura 25A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc 'tesA-fadD. La figura 25B es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc 'tesA-fadD que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus pCc7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y AM1_4041 de Acaryochloris marina MBIC11017 (YP_001518340) (SEQ ID NO: 9).
La figura 26A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc ‘tesA-fadD que expresan sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803 (NP_442146) (SEQ ID NO: 67). La figura 26B es
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc 'tesA-fadD que expresan sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803 (NP_442146) (SEQ ID NO: 67) y sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803 (NP_442147) (SEQ ID NO: 3).
La figura 27A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc- ‘tesA que expresan MSMEG_5739 de M. smegmatis cepa MC2 155 (YP_889972) (SEQ ID NO: 85). La figura 27B es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc-'tesA que expresan MSMEG_5739 de M smegmatis cepa MC2 155 (YP_889972) (SEQ ID NO: 85) y Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 5).
La figura 28 es una representación gráfica de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc-'tesA que expresan MSMEG_5739 de M. smegmatis cepa MC2 155 (YP_889972) (SEQ ID NO: 85) o bien solas o bien en combinación con alr5283 de Nostoc sp. PCC7120 (SEQ iD NO: 7), Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (SEQ ID NO: 5), PMM0532 de P. marinus CCMP1986 (SEQ ID NO: 19), gll3146 de G. violaceus PCC7421 (SEQ ID NO: 15), RS9917_09941 de Synechococcus sp. (SEQ ID NO: 23), RS9917_12945 de Synechococcus sp. (SEQ ID NO: 25) o AM1_4041 de A. marina MBIC11017 (SEQ ID NO: 9).
La figura 29A es una representación de la estructura tridimensional de una proteína de subunidad p de ribonucleasa reductasa de clase I, RNRp. La figura 29B es una representación de la estructura tridimensional de PMT1231 de Prochlorococcus marinus MlT9313 (NP_895059) (SEQ ID NO: 17). La figura 29C es una representación de la estructura tridimensional del sitio activo de PMT1231 de Prochlorococcus marinus MIT9313 (NP_895059) (SEQ ID NO: 17).
La figura 30A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838) (SeQ ID NO: 5). La figura 30B es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan la variante Y123F de Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838). La figura 30C es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan la variante Y126F de Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838).
La figura 31 representa perfiles de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 6) y octadecanal (A); Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 6), octadecanal, ferredoxina reductasa de espinaca y NADPH (B); octadecanal, ferredoxina de espinaca, ferredoxina reductasa de espinaca y NADPH (C); o Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 6), ferredoxina de espinaca y ferredoxina de espinaca (D).
La figura 32 representa perfiles de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 6), NADPH, octadecanal y o bien (A) ferredoxina de espinaca y ferredoxina reductasa de espinaca; (B) Npun02003626 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00109192) (SEQ ID NO: 88) y Npun02001001 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00111633) (SEQ ID NO: 90); (C) Npun02003626 (ZP_00109192) (SEQ ID NO: 88) y Npun02003530 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00109422) (SEQ ID NO: 92); o bien (D) Npun02003626 (ZP_00109192) (SEQ ID NO: 88) y Npun02003123 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00109501) (SEQ ID NO: 94).
La figura 33A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66), NADH y Mg2+. La figura 33B es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66), NADPH y Mg2+. La figura 33C es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66) y NADPH.
La figura 34A es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, NADPH marcado, YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66) y NADPH no marcado. La figura 34B es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, NADPH marcado, YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66) y S-(4- 2H)NADPH. La figura 34C es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos in vitro usando octadecanoil-CoA, NADPH marcado, YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 66) y R-(4- 2H)NADPH.
La figura 35 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos en el sobrenadante libre de células producido por células de E. coli MG1655 AfadE en medios Che-9 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65).
La figura 36 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos en el sobrenadante libre de células producido por células de E. coli MG1655 AfadE en medios Che-9 que expresan YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) y Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838) (SEQ ID NO: 5).
5
10
15
20
25
30
35
40
La figura 37 es un perfil de CG/EM de hidrocarburos producidos por células de E. coli MG1655 que expresan alr5283 de Nostoc sp. PCC7120 (NP_489323) (SEQ ID NO: 7) y alr5284 de Nostoc sp. PCC7120 (NP_489324) (SEQ ID NO: 81).
La figura 38 es una lista de ejemplos de homólogos de YP_400610 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1593) (SEQ ID NO: 1) a partir de una base de datos metagenómica.
La figura 39 es una lista de ejemplos de homólogos de YP_400611 de Synechococcus elongatus PCC7942 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65) a partir de una base de datos metagenómica.
La figura 40 es una tabla que identifica diversos genes que pueden expresarse, sobreexpresarse o atenuarse para aumentar la producción de sustratos particulares.
Descripción detallada
La invención se refiere a composiciones y métodos de producción de aldehídos, alcoholes grasos e hidrocarburos (tales como alcanos, alquenos y alquinos) a partir de sustratos, por ejemplo, un sustrato de acil-ACP, uno de ácido graso, uno de acil-CoA, uno de aldehído graso o uno de alcohol graso (por ejemplo, tal como se describe en el documento PCT/US08/058788). Tales aldehídos, alcanos y alquenos son útiles como biocombustibles (por ejemplo, sustitutos para gasolina, diésel, combustible para motores a reacción, etc.), productos químicos especializados (por ejemplo, lubricantes, aditivos para combustibles, etc.) o materia prima para conversión química adicional (por ejemplo, combustibles, polímeros, plásticos, materiales textiles, disolventes, adhesivos, etc.). La invención se basa, en parte, en la identificación de genes que están implicados en la biosíntesis de aldehídos, alcanos y alquenos.
Tales genes de biosíntesis de alcanos y alquenos incluyen, por ejemplo, Synpcc7942_1593 de Synechococcus elongatus PCC7942 (SEQ ID NO: 1), sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803 (SEQ ID NO: 3), Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC 73102 (SEQ ID NO: 5), alr5283 de Nostoc sp. PCC 7120 (SEQ ID NO: 7), AM1_4041 de Acaryochloris marina MBIC11017 (SEQ ID NO: 9), tll1313 de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (SEQ ID NO: 11), CYA_0415 de Synechococcus sp. JA-3-3A (SEQ ID NO: 13), gll3146 de Gloeobacter violaceus PcC 7421 (SEQ ID NO: 15), PM123 de Prochlorococcus marinus MIT9313 (SEQ ID NO: 17), PMM0532 de Prochlorococcus marinus subesp. pastoris cepa CCMP1986 (SEQ ID NO: 19), PMN2A_1863 de Prochlorococcus marinus cepa NATL2A (SEQ ID NO: 21), RS9917_09941 de Synechococcus sp. RS9917 (SEQ ID NO: 23), RS9917_12945 de Synechococcus sp. RS9917 (SEQ ID NO: 25), cce_0778 de Cyanothece sp. ATCC51142 (SEQ ID NO: 27), Cyan7425DRAFT_1220 de Cyanothece sp. PCC7245 (SEQ ID NO: 29), cce_0778 de Cyanothece sp. PCC7245 (SEQ ID NO: 31), YP_323043 de Anabaena variabilis ATCC29413 (Ava_2533) (SEQ ID NO: 33) e YP_170760 de Synechococcus elongatus PCC6301 (syc0050_d) (SEQ ID NO: 35). En la tabla 1 y la figura 38 se enumeran otros genes de biosíntesis de alcanos y alquenos.
Los genes de biosíntesis de aldehídos incluyen, por ejemplo, Synpcc7942_1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 (SEQ ID NO: 65), sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803 (SeQ ID NO: 67), cce_1430 de Cyanothece sp. ATCC51142 (SEQ ID NO: 69), PMM0533 de Prochlorococcus marinus subesp. pastoris cepa CCMP1986 (SEQ ID NO: 71), NP_96091 de Gloeobacter violaceus PCC7421 (gll3145) (SEQ ID NO: 73), ZP_00108837 de Nostoc punctiforme PCC73102 (Npun02004176) (SEQ ID NO: 75), YP_323044 de Anabaena variabilis ATCC29413 (Ava2534) (SEQ ID NO: 77), YP_170761 de Synechococcus elongatus PCC6301 (syc0051_d) (SEQ ID NO: 79) y alr5284 de Nostoc sp. PcC 7120 (SEQ ID NO: 81). En la tabla 1 y la figura 39 se enumeran otros genes de biosíntesis de aldehídos.
Usando los métodos descritos en el presente documento, pueden prepararse aldehídos, alcoholes grasos, alcanos, y alquenos usando uno o más polipéptidos o genes de biosíntesis de aldehídos, alcanos y/o alquenos descritos en el presente documento, o variantes de los mismos, utilizando células huésped o métodos libres de células.
Tabla 1: Homólogos de genes de biosíntesis de aldehídos y alcanos en genomas de cianobacterias.
Cianobacteria
N.° de registro de gen de biosíntesis de alcanos % de ID N.° de registro de gen de biosíntesis de aldehídos % de ID
Synechococcus elongatus PCC 7942
YP 400610 100 YP 400611 100
Synechococcus elongatus PCC 6301
YP 170760 100 YP 170761 100
Microcoleus chthonoplastes PCC 7420
EDX75019 77 EDX74978 70
Arthrospira maxima CS-328
EDZ94963 78 EDZ94968 68
Lyngbya sp. PCC 8106
ZP 01619575 77 ZP 01619574 69
Nodularia spumigena CCY9414
ZP 01628096 77 ZP 01628095 70
Trichodesmium erythraeum IMS101
YP 721979 76 YP 721978 69
Microcystis aeruginosa NIES-843
YP 001660323 75 YP_001660322 68
Microcystis aeruginosa PCC 7806
CAO90780 74 CAO90781 67
Nostoc sp. PCC 7120
NP 489323 74 NP_489324 72
Nostoc azollae 0708
EEG05692 73 EEG05693 70
Anabaena variabilis ATCC 29413
YP 323043 74 YP_323044 73
Crocosphaera watsonii WH 8501
ZP 00514700 74 ZP 00516920 67
Synechocystis sp. PCC 6803
NP 442147 72 NP 442146 68
Synechococcus sp. PCC 7335
EDX86803 73 EDX87870 67
Cyanothece sp. ATCC 51142
YP 001802195 73 YP 001802846 67
Cyanothece sp. CCY0110
ZP 01728578 72 ZP 01728620 68
Nostoc punctiforme PCC 73102
ZP 00108838 72 ZP 00108837 71
Acarynchloris marina MBIC11017
YP 001518340 71 YP 001518341 66
Cyanothece sp. PCC 7425
YP 002481151 71 YP 002481152 70
Cyanolhece sp. PCC 8801
ZP 02941459 70 ZP_02942716 69
Thermosynechococcus elongatus BP-1
NP 682103 70 NP 682102 70
Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13)
YP 478639 68 YP 478638 63
Synechococcus sp.RCC307
YP 001227842 67 YP_001227841 64
Synechococcus sp. WH 7803
YP 001224377 68 YP_001224378 65
Synechococcus sp. WH 8102
NP 897829 70 NP_897828 65
Synechococcus sp. WH 7805
ZP 01123214 68 ZP 01123215 65
Synechococcus GOM 3012 tipo A marino no cultivado
ABD96376 70 ABD96375 65
Synechococcus sp. JA-3-3Ab
YP 473897 68 YP 473896 62
Synechococcus GOM 306 tipo A marino no cultivado
ABD96328 70 ABD96327 65
Synechococcus GOM 3M9 tipo A marino no cultivado
ABD96275 68 ABD96274 65
Synechococcus sp. CC9311
YP 731193 63 YP 731192 63
Synechococcus 5B2 tipo A marino no cultivado
ABB92250 69 ABB92249 64
Synechococcus sp. WH 5701
ZP 01085338 66 ZP 01085337 67
Gloeobacter violaceus PCC 7421
NP 926092 63 NP_926091 67
Synechococcus sp. RS9916
ZP 01472594 69 ZP_01472595 66
Synechococcus sp. RS9917
ZP 01079772 68 ZP 01079773 65
Synechococcus sp. CC9605
YP 381055 66 YP 381056 66
Cyanobium sp. PCC 7001
EDY39806 64 EDY38361 64
Prochlorococcus marinus cepa MIT 9303
YP 001016795 63 YP 001016797 66
Prochlorococcus marinus cepa MIT9313
NP 895059 63 NP 895058 65
Synechococcus sp. CC9902
YP 377637 66 YP_377636 65
Prochlorococcus marinus cepa MIT 9301
YP 001090782 62 YP 001090783 62
Synechococcus sp. BL107
ZP 01469468 65 ZP_01469469 65
Prochlorococcus marinus cepa AS9601
YP 001008981 62 YP 001008982 61
Prochlorococcus marinus cepa MIT9312
YP 397029 62 YP 397030 61
Prochlorococcus marinus subesp. pastoris cepa CCMP1986
NP 892650 60 NP_892651 63
Prochlorococcus marinus cepa MIT 9211
YP 001550420 61 YP 001550421 63
Cyanothece sp. PCC 7425
YP 002483683 59 -
Prochlorococcus marinus cepa NATL2A
YP 293054 59 YP 293055 62
Prochlorococcus marinus cepa NATL1A Prochlorococcus marinus subesp. marinus cepa
YP_001014415 59 YP_001014416 62
CCMP1375
NP_874925 59 NP_874926 64
Prochlorococcus marinus cepa MIT 9515 05961
YP 001010912 57 YP 001010913 63
Prochlorococcus marinus cepa MIT 9215 06131
YP_001483814 59 YP 001483815 62
Synechococcus sp. RS9917 Synechococcus GOM 5D20 tipo A marino no cultivado
ZP 01080370 43 ABD96480 65
Genes de biosíntesis de aldehidos, alcanos y alquenos y variantes
Los métodos y las composiciones descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, genes de biosíntesis de alcanos o alquenos que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1; 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35, así como variantes de polinucleótido de los mismos. En algunos casos, el gen de biosíntesis 5 de alcanos o alquenos codifica para uno o más de los motivos de aminoácido descritos en el presente documento. Por ejemplo, el gen de biosíntesis de alcanos o alquenos puede codificar para un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 37, 38, 39, 41, 42, 43 ó 44. El gen de biosíntesis de alcanos o alquenos también puede incluir un polipéptido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
que comprende SEQ ID NO: 40 y también uno cualquiera de SEQ ID NO: 37, 38 ó 39.
Los métodos y las composiciones descritos en el presente documento también incluyen, por ejemplo, genes de biosíntesis de aldehídos que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81, así como variantes de polinucleótido de los mismos. En algunos casos, el gen de biosíntesis de aldehídos codifica para uno o más de los motivos de aminoácido descritos en el presente documento. Por ejemplo, el gen de biosíntesis de aldehídos puede codificar para un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57; 58, 59, 60, 61, 62, 63 ó 64.
Las variantes pueden producirse de manera natural o crearse in vitro. En particular, tales variantes pueden crearse usando técnicas de ingeniería genética, tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química al azar, procedimientos de deleción con exonucleasa III y técnicas de clonación convencionales. Alternativamente, tales variantes, fragmentos, análogos o derivados pueden crearse usando procedimientos de síntesis química o modificación.
En la técnica se conocen bien métodos de preparación de variantes. Estos incluyen procedimientos en los que se modifican secuencias de ácido nucleico obtenidas a partir de aislados naturales para generar ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos que tienen características que potencian su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En tales procedimientos, se generan y caracterizan un gran número de secuencias de variantes que tienen una o más diferencias de nucleótido con respecto a la secuencia obtenida a partir del aislado natural. Normalmente, estas diferencias de nucleótido dan como resultado cambios de aminoácido con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos a partir de aislados naturales.
Por ejemplo, pueden crearse variantes usando PCR propensa a errores (véase, por ejemplo, Leung et al., Technique 1:11-15, 1989; y Caldwell et al., PCR Methods Applic. 2:28-33, 1992). En PCR propensa a errores, se realiza PCR en condiciones en las que la fidelidad de copiado de la ADN polimerasa es baja, de manera que se obtiene una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. En resumen, en tales procedimientos, se mezclan ácidos nucleicos que van a mutagenizarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido de biosíntesis de aldehídos o alcanos), con cebadores de PCR, tampón de reacción, MgCh, MnCh, Taq polimerasa y una concentración apropiada de dNTP para lograr una alta tasa de mutación puntual a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, puede realizarse la reacción usando 20 fmoles de ácido nucleico que va a mutarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido de biosíntesis de aldehídos o alcanos), 30 pmoles de cada cebador de PCR, un tampón de reacción que comprende KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,3) y gelatina al 0,01%, MgCl2 7 mM, MnCh 0,5 mM, 5 unidades de Taq polimerasa, dGTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 1 mM y dTTP 1 mM. Puede realizarse la PCR durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min y 72°C durante 1 min. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros pueden variarse según sea apropiado. Entonces se clonan los ácidos nucleicos mutagenizados en un vector apropiado y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutagenizados.
También pueden crearse variantes usando mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para generar mutaciones específicas de sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis de oligonucleótidos se describe, por ejemplo, en Reidhaar-Olson et al, Science 241:53-57, 1988. En resumen, en tales procedimientos se sintetizan una pluralidad de oligonucleótidos bicatenarios que portan una o más mutaciones que van a introducirse en el ADN clonado y se insertan en el ADN clonado que va a mutarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido de biosíntesis de aldehídos o alcanos). Se recuperan clones que contienen el ADN mutado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos para los que codifican.
Otro método para generar variantes es PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de PCR a partir de una mezcla de fragmentos de ADN pequeños. Un gran número de diferentes reacciones de PCR se producen en paralelo en el mismo vial, cebando los productos de una reacción a los productos de otra reacción. La PCR de ensamblaje se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.965.408.
Todavía otro método de generar variantes es mutagénesis mediante PCR sexual. En la mutagénesis mediante PCR sexual, se produce la recombinación homóloga forzada entre moléculas de ADN de secuencias de ADN diferentes, pero altamente relacionadas, in vitro como resultado de fragmentación al azar de la molécula de ADN basándose en la homología de secuencia. Esto va seguido por la fijación del cruzamiento mediante extensión del cebador en una reacción de PCR. La mutagénesis mediante PCR sexual se describe, por ejemplo, en Stemmer, PNAS, USA 91:10747-10751, 1994.
También pueden crearse variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunas realizaciones, se generan mutaciones al azar en una secuencia de ácido nucleico propagando la secuencia en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, que porta mutaciones en una o más de la rutas de reparación de ADN. Tales cepas “mutadoras” tienen una mayor tasa de mutación al azar que la de una cepa silvestre. La propagación de una secuencia de ADN (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido de biosíntesis de aldehídos o alcanos) en una de estas cepas generará finalmente mutaciones al azar dentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para su uso para la mutagénesis in vivo se describen, por ejemplo, en la publicación PCT n.° WO 91/16427.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
También pueden generarse variantes usando mutagénesis de casete. En la mutagénesis de casete, se remplaza una región pequeña de un molécula de ADN bicatenario por un “casete” de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido a menudo contiene una secuencia nativa completa y/o parcialmente al azar.
También puede usarse mutagénesis de conjunto recursivo para generar variantes. La mutagénesis de conjunto recursivo es un algoritmo para el diseño por ingeniería genética de proteínas (es decir, mutagénesis de proteínas) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes relacionados fenotípicamente cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método usa un mecanismo de retroalimentación para controlar las tandas sucesivas de mutagénesis de casete combinatoria. La mutagénesis de conjunto recursivo se describe, por ejemplo, en Arkin et al., PNAS, USA 89:7811-7815, 1992.
En algunas realizaciones, se crean variantes usando mutagénesis de conjunto exponencial. La mutagénesis de conjunto exponencial es un procedimiento para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en los que se aleatorizan pequeños grupos de residuos en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conducen a proteínas funcionales. La mutagénesis de conjunto exponencial se describe, por ejemplo, en Delegrave et al, Biotech. Res. 11: 1548-1552, 1993. La mutagénesis dirigida al sitio y al azar se describen, por ejemplo, en Arnold, Curr. Opin. Biotech. 4:450-455, 1993.
En algunas realizaciones, se crean variantes usando procedimientos de intercambio en los que se fusionan entre sí porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican para distintos polipéptidos para crear secuencias de ácido nucleico quiméricas que codifican para polipéptidos quiméricos tal como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.965.408 y 5.939.250.
Las variantes de polinucleótido también incluyen análogos de ácido nucleico. Los análogos de ácido nucleico pueden modificarse en el resto básico, resto azúcar o estructura principal de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad del ácido nucleico. Las modificaciones en el resto básico incluyen desoxiuridina para desoxitimidina y 5-metil-2'-desoxicitidina o 5-bromo-2'-doxicitidina para desoxicitidina. Las modificaciones del resto azúcar incluyen modificación del 2'-hidroxilo del azúcar ribosa para formar azúcares 2'-O-metilo o 2'-O-alilo. La estructura principal de fosfato de desoxirribosa puede modificarse para producir ácidos morfolino-nucleicos, en los que cada resto básico está unido a un anillo morfolino de seis miembros, o ácidos nucleicos peptídicos, en los que la estructura principal de desoxifosfato se reemplaza por una estructura principal de pseudopéptido y se mantienen las cuatro bases. (Véase, por ejemplo, Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:187-195; e Hyrup et al, Bioorgan. Med. Chem. (1996) 4:5-23). Además, la estructura principal de desoxifosfato puede remplazarse por, por ejemplo, una estructura principal de fosforotioato o fosforoditioato, una fosforoamidita o una estructura principal de fosfotriéster de alquilo.
Los polipéptidos de biosíntesis de aldehídos y alcanos Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 66) y Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO: 2) tienen homólogos en otras cianobacterias (en la tabla 1 se representan ejemplos no limitativos). Por tanto, puede usarse cualquier secuencia de polinucleótido que codifique para un homólogo enumerado en la tabla 1, o una variante del mismo, como polinucleótido de biosíntesis de aldehídos o alcanos en los métodos descritos en el presente documento. Cada cianobacteria enumerada en la tabla 1 tiene copias de ambos genes. El nivel de identidad de secuencia de los productos génicos oscila entre el 61% y el 73% para Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 66) y entre el 43% y el 78% para Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO: 2).
En la figura 39 se enumeran homólogos adicionales del polipéptido de biosíntesis de aldehídos Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 66), y puede usarse cualquier secuencia de polinucleótido que codifique para un homólogo enumerado en la figura 39, o una variante del mismo, como polinucleótido de biosíntesis de aldehídos en los métodos descritos en el presente documento. En la figura 38 se enumeran homólogos adicionales del polipéptido de biosíntesis de alcanos Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO: 2), y puede usarse cualquier secuencia de polinucleótido que codifique para un homólogo enumerado en la figura 38, o una variante del mismo, como polinucleótido de biosíntesis de alcanos en los métodos descritos en el presente documento.
En determinados casos, un gen de biosíntesis de aldehídos, alcanos y/o alquenos tiene los codones optimizados para su expresión en una célula huésped particular. Por ejemplo, para la expresión en E. coli, pueden optimizarse uno o más codones tal como se describe en, por ejemplo, Grosjean et al., Gene 18:199-209 (1982).
Polipéptidos de biosíntesis de aldehídos, alcanos y alquenos y variantes
Los métodos y las composiciones descritos en el presente documento también incluyen polipéptidos de biosíntesis de alcanos o alquenos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36, así como variantes de polipéptido de los mismos. En algunos casos, un polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos es uno que incluye uno o más de los motivos de aminoácido descritos en el presente documento. Por ejemplo, el polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 38, 39, 41, 42, 43 ó 44. El polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos también puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y también una cualquiera de SEQ ID NO: 37, 38 ó 39.
Los métodos y las composiciones descritos en el presente documento también incluyen polipéptidos de biosíntesis de aldehídos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82, así como
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
variantes de polipéptido de los mismos. En algunos casos, un polipéptido de biosíntesis de aldehidos es uno que incluye uno o más de los motivos de aminoácido descritos en el presente documento. Por ejemplo, el polipéptido de biosíntesis de aldehídos puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ó 64.
Las variantes de polipéptidos de biosíntesis de aldehídos, alcanos y alquenos pueden ser variantes en las que uno o más residuos de aminoácido se sustituyen por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado). Tal residuo de aminoácido sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético.
Las sustituciones conservativas son las que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Las sustituciones conservativas típicas son los siguientes remplazos: remplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro aminoácido alifático; remplazo de una serina por una treonina o viceversa; remplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, por otro residuo ácido; remplazo de un residuo que porta un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, por otro residuo que porta un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, por otro residuo básico; y remplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, por otro residuo aromático.
Otras variantes de polipéptido son aquellas en las que uno o más residuos de aminoácido incluyen un grupo sustituyente. Todavía otras variantes de polipéptido son aquellas en las que en el polipéptido está asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol).
Variantes de polipéptido adicionales son aquellas en las que aminoácidos adicionales están fusionados con el polipéptido, tal como una secuencia líder, una secuencia secretora, una secuencia de proproteína o una secuencia que facilita la purificación, el enriquecimiento o la estabilización del polipéptido.
En algunos casos, la variante de polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos conserva la misma función biológica que un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36 (por ejemplo, conserva actividad de biosíntesis de alcanos o alquenos) y tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica al mismo.
En otros casos, las variantes de polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos tienen una homología de al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos
aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos
aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos
aproximadamente el 95% o más de aproximadamente el 95% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36. En otra realización, las variantes de polipéptido incluyen un fragmento que comprende al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 ó 150 aminoácidos consecutivos de las mismas.
En algunos casos, una variante de polipéptido de biosíntesis de aldehídos conserva la misma función biológica que un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82 (por ejemplo, conserva actividad de biosíntesis de aldehídos) y tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica al mismo.
Aún en otros casos, las variantes de polipéptido de biosíntesis de aldehídos tienen una homología de al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos
aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos
aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos
aproximadamente el 95% o más de aproximadamente el 95% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66,
68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82. En otra realización, las variantes de polipéptido incluyen un fragmento que comprende al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 ó 150 aminoácidos consecutivos de las mismas.
Las variantes de polipéptido o fragmentos de las mismas pueden obtenerse aislando ácidos nucleicos que codifican para las mismas usando técnicas descritas en el presente documento o expresando ácidos nucleicos sintéticos que codifican para las mismas. Alternativamente, pueden obtenerse variantes de polipéptido o fragmentos de las mismas a través de procedimientos de enriquecimiento o purificación bioquímicos. La secuencia de variantes de polipéptido o fragmentos pueden determinarse mediante digestión proteolítica, electroforesis en gel y/o microsecuenciación. La secuencia de las variantes de polipéptido o fragmentos de biosíntesis de alcanos o alquenos puede compararse entonces con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36 usando cualquiera de los programas descritos en el presente documento. La secuencia de las variantes de polipéptido o fragmentos de biosíntesis de aldehídos puede compararse con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 u 82 usando cualquiera de los programas descritos en el presente documento.
Las variantes de polipéptido y fragmentos de las mismas pueden someterse a ensayo para determinar la actividad productora de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos usando métodos de rutina. Por ejemplo, las variantes de polipéptido o fragmento pueden ponerse en contacto con un sustrato (por ejemplo, un sustrato de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
derivado de ácido graso u otro sustrato descrito en el presente documento) en condiciones que permiten que la variante de polipéptido funcione. Puede medirse una disminución en el nivel del sustrato o un aumento en el nivel de un aldehído, alcano o alqueno para determinar la actividad productora de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos o alquenos, respectivamente.
Anticuerpos anti-polipéptido de biosíntesis de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos
Los polipéptidos de biosíntesis de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos descritos en el presente documento también pueden usarse para producir anticuerpos dirigidos frente a polipéptidos de biosíntesis de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos. Pueden usarse tales anticuerpos, por ejemplo, para detectar la expresión de un polipéptido de biosíntesis de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos o alquenos usando métodos conocidos en la técnica. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo; un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo quimérico, anticuerpo reconformado, anticuerpo humanizado, o fragmento de los mismos (por ejemplo, Fab', Fab, F(ab')2); o un anticuerpo biosintético, por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla, anticuerpo de un solo domino (DAB), Fv, Fv de cadena sencilla (scFv), o similares.
Se describen métodos de preparación y uso de anticuerpos policlonales y monoclonales, por ejemplo, en Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory (1 de diciembre de 1998). En la técnica se conocen métodos para preparar anticuerpos modificados y fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos reconformados, anticuerpos humanizados, o fragmentos de los mismos, por ejemplo, fragmentos Fab', Fab, F(ab')2); o anticuerpos biosintéticos (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de un solo dominio (DAB), Fv, Fv de cadena sencilla (scFv), y similares), y pueden encontrarse, por ejemplo, en Zola, Monoclonal Antiobodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag (15 de diciembre del 2000; 1a edición).
Sustratos
Las composiciones y los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos a partir de un sustrato apropiado. Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se cree que los polipéptidos de biosíntesis de alcanos o alquenos descritos en el presente documento producen alcanos o alquenos a partir de sustratos por medio de un mecanismo de descarbonilación. En algunos casos, el sustrato es un derivado de ácido graso, por ejemplo, un aldehído graso, y puede producirse un alcano que tiene patrones de ramificación y una longitud de la cadena de carbono particulares a partir de un derivado de ácido graso, por ejemplo, un aldehído graso, que tiene esas características particulares. En otros casos, el sustrato es un derivado de ácido graso insaturado, por ejemplo, un aldehído graso insaturado, y puede producirse un alqueno que tiene patrones de ramificación y una longitud de la cadena de carbono particulares a partir de un derivado de ácido graso insaturado, por ejemplo, un aldehído graso insaturado, que tiene esas características particulares.
Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se cree que los polipéptidos de biosíntesis de aldehídos descritos en el presente documento producen aldehídos a partir de sustratos por medio de un mecanismo de reducción. En determinados casos, el sustrato es una acil-ACP.
Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se cree que los alcoholes grasos descritos en el presente documento se producen a partir de sustratos por medio de un mecanismo de reducción. En determinados casos, el sustrato es un aldehído graso.
Por consiguiente, cada etapa dentro de una ruta de biosíntesis que conduce a la producción de estos sustratos puede modificarse para producir o sobreproducir el sustrato de interés. Por ejemplo, genes conocidos implicados en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos, la ruta de aldehídos grasos y la ruta de alcoholes grasos pueden expresarse, sobreexpresarse o atenuarse en células huésped para producir un sustrato deseado (véase, por ejemplo, el documento PCT/US08/058788. En la figura 40 se proporcionan genes a modo de ejemplo.
Síntesis de sustratos
Ácido graso sintasa (FAS) es un grupo de polipéptidos que catalizan el inicio y la elongación de cadenas de acilo (Marrakchi et al., Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002). La proteína portadora de acilo (ACP) junto con las enzimas en la ruta de FAS controlan la longitud, el grado de saturación y la ramificación de los derivados de ácidos grasos producidos. La ruta de biosíntesis de ácidos grasos implica los precursores acetil-CoA y malonil-CoA. Las etapas en esta ruta se catalizan por enzimas de las familias de genes de la biosíntesis de ácidos grasos (fab) y acetil-CoA carboxilasa (acc) (véase, por ejemplo, Heath et al., Prog. Lipid Res. 40(6):467-97 (2001)).
Pueden modificarse por ingeniería genética células huésped para expresar sustratos de derivados de ácidos grasos expresando o sobreexpresando de manera recombinante uno o más genes de acetil-CoA y/o malonil-CoA sintasa. Por ejemplo, para aumentar la producción de acetil-CoA, puede expresarse uno o más de los siguientes genes en una célula huésped: pdh, panK, aceEF (que codifica para el componente de deshidrogenasa E1p y el componente de dihidrolipoamida aciltransferasa E2p de los complejos de piruvato y 2-oxoglutarato deshidrogenasa), fabH, fabB, fabD, fabG, acpP y fabF. Números de registro de GenBank a modo de ejemplo para estos genes son: pdh
5
10
15
20
25
30
35
40
(BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (también conocido como coaA, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), fabD (AAC74176), fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), fabF (AAC74179). Adicionalmente, los niveles de expresión de fadE, gpsA, IdhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA y/o ackB pueden atenuarse o desactivarse en una célula huésped modificada por ingeniería genética mediante transformación con plásmidos condicionalmente replicativos o no replicativos que contienen mutaciones nulas o por deleción de los genes correspondientes o sustituyendo secuencias de promotor o potenciador. Números de registro de GenBank a modo de ejemplo para estos genes son: fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), IdhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356) y ackB (BAB81430). Las células huésped resultantes tendrán niveles de producción de acetil-CoA aumentados cuando se hacen crecer en un entorno apropiado.
La sobreexpresión de malonil-CoA puede realizarse introduciendo accABCD (por ejemplo, número de registro AAC73296, EC 6.4.1.2) en una célula huésped. Los ácidos grasos pueden sobreexpresarse adicionalmente en células huésped introduciendo en la célula huésped una secuencia de ADN que codifica para una lipasa (por ejemplo, números de registro CAA89087, CAA98876).
Además, inhibir PIsB puede conducir a un aumento en los niveles de acil-ACP de cadena larga, lo que inhibirá las etapas iniciales en la ruta (por ejemplo, accABCD, fabH y fabl). Puede usarse la mutación D311E de pIsB (por ejemplo, número de registro AAC77011) para aumentar la cantidad de acil-CoA disponible.
Además, puede modificarse por ingeniería genética una célula huésped para sobreexpresar un gen sfa (supresor de fabA, por ejemplo, número de registro AAN79592) para aumentar la producción de ácidos grasos monoinsaturados (Rock et al., J. Bacteriology 178:5382-5387, 1996).
En algunos casos, pueden modificarse por ingeniería genética células huésped para expresar, sobreexpresar o atenuar la expresión de una tioesterasa para aumentar la producción de sustrato de ácido graso. La longitud de cadena de un sustrato de ácido graso se controla por la tioesterasa. En algunos casos, puede sobreexpresarse un gen tes o fat. En otros casos, pueden producirse ácidos grasos C10 atenuando la tioesterasa C18 (por ejemplo, números de registro AAC73596 y P0ADA1), que usa C181-ACP, y expresando la tioesterasa C10 (por ejemplo, número de registro Q39513), que usa C10-ACP. Esto da como resultado una población de ácidos grasos relativamente homogénea que tienen una longitud de la cadena de carbono de 10. Aún en otros casos, pueden producirse ácidos grasos C14 atenuando tioesterasas endógenas que producen ácidos grasos distintos de C14 y expresando las tioesterasas, que usan C14-ACP (por ejemplo, número de registro Q39473). En algunas situaciones, pueden producirse ácidos grasos C12 expresando tioesterasas que usan C12-ACP (por ejemplo, número de registro Q41635) y atenuando tioesterasas que producen ácidos grasos distintos de C12. Puede verificarse la sobreproducción de acetil-CoA, malonil-CoA y ácido graso usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando precursores radiactivos, HPLC y cG-EM posteriormente a la lisis celular. En la tabla 2 se enumeran ejemplos no limitativos de tioesterasas que pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento.
Tabla 2: tioesterasas
Número de registro
Organismo fuente Gen Producto producido preferentemente
AAC73596
E. coli tesA sin secuencia líder C18:1
AAC73555
E. coli tesB
Q41635, AAA34215
Umbellularia california fatB C12:0
Q39513: AAC49269
Cuphea hookeriana fatB2 C80-C10:0
AAC49269: AAC72881
Cuphea hookeriana fatB3 C140-C16:0
Q39473, AAC49151
Cinnamonum camphorum fatB C14:0
CAA85388
Arabidopsis thaliana fatB ÍM141 TI* C16:1
NP 189147: NP 193041
Arabidoosis thaliana fatA C18:1
CAC39106
Bradvrhiizobium iaponicum fatA C18:1
AAC72883
Cuphea hookeriana fatA C18:1
AAL79361
Helianthus annus fatAI
* Mayer et al., BMC Plant Biology 7:1-11, 2007
Formación de aldehídos ramificados, alcoholes grasos, alcanos y alquenos
Pueden producirse aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos que contienen puntos de ramificación usando derivados de ácidos grasos ramificados como sustratos. Por ejemplo, aunque E. coli produce de manera natural derivados de ácidos grasos de cadena lineal (sFA), puede modificarse por ingeniería genética E. coli para que produzca derivados de ácidos grasos de cadena ramificada (brFA) introduciendo y expresando o sobeexpresando genes que proporcionan precursores ramificados en la E. coli (por ejemplo, familias de genes bkd, ilv, icm y fab). Adicionalmente, una célula huésped puede modificarse por ingeniería genética para expresar o sobreexpresar genes que codifican para proteínas para la elongación de brFA (por ejemplo, ACP, FabF, etc.) y/o para delecionar o
atenuar genes de células huésped correspondientes que conducen normalmente a sFA.
La primera etapa en la formación de brFA es la producción de los a-cetoácidos correspondientes mediante una aminoácido de cadena ramificada aminotransferasa. Las células huésped pueden incluir de manera endógena genes que codifican para tales enzimas o tales genes pueden introducirse de manera recombinante. E. coli, por ejemplo, 5 expresa de manera endógena una enzima de este tipo, IlvE (EC 2.6.1.42; registro de GenBank YP_026247). En algunas células huésped, puede no expresarse una aminoácido de cadena ramificada aminotransferasa heteróloga. Sin embargo, IlvE de E. coli o cualquier otra aminoácido de cadena ramificada aminotransferasa (por ejemplo, IlvE de Lactococcus lactis (registro de GenBank AAF34406), IlvE de Pseudomonas putida (registro de GenBank NP_745648) o IlvE de Streptomyces coelicolor (registro de GenBank NP_629657)), si no es endógena, puede 10 introducirse y expresarse de manera recombinante.
La segunda etapa es la descarboxilación oxidativa de los a-cetoácidos para dar la correspondiente acil-CoA de cadena ramificada. Esta reacción puede catalizarse por un complejo de a-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa (bkd; EC 1.2.4.4.) (Denoya et al., J. Bacteriol. 177:3504, 1995), que consiste en las subunidades E1a/p (descarboxilasa), E2 (dihidrolipoil transacilasa) y E3 (dihidrolipoil deshidrogenasa). Estos complejos de a- 15 cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa son similares a complejos de piruvato y a-cetoglutarato deshidrogenasa. Puede usarse cualquier microorganismo que presente brFA y/o crezca sobre aminoácidos de cadena ramificada como fuente para aislar genes bkd para su expresión en células huésped, por ejemplo, E. coli. Además, E. coli tiene el componente E3 como parte de su complejo de piruvato deshidrogenasa (lpd, EC 1.8.1.4, registro de GenBank NP_414658). Por tanto, puede ser suficiente expresar sólo los genes E1 a/p y E2 bkd. La tabla 20 3 enumera ejemplos no limitativos de genes bkd de varios microorganismos que pueden introducirse y expresarse
de manera recombinante en una célula huésped para proporcionar precursores de acil-CoA de cadena ramificada.
Tabla 3: Genes bkd de microorganismos seleccionados
Organismo
Gen N.° de registro de GenBank
Streptomyces coelicolor
bkdA1 (E1a) NP 628006
bkdB1(E1p) NP 628005
bkdC1 (E2) NP_638004
Streptomyces coelicolor
bkdA2(E1a) NP 733618
bkdB2(E1p) NP 628019
bkdC2 (E2) NP_628018
Streptomyces avermitilis
bkdA (E1a) BAC72074
bkdB (E1b) BAC72075
bkdC (E2) BAC72076
Streptomyces avermitilis
bkdF (E1a) BAC72088
bkdG (E1 p) BAC72089
bkdH (E2) BAC72090
Bacillus subtilis
bkdAA (E1a) NP 390288
bkdAB (E1 p) NP 390288
bkdB(E2) NP_390288
Pseudomonas putida
bkdA1(E1a) AAA65614
bkdA2(E1p) AAA65615
bkdC (E2) AAA65617
En otro ejemplo, puede prepararse isobutiril-CoA en una célula huésped, por ejemplo en E. coli, mediante la coexpresión de una crotonil-CoA reductasa (Ccr, EC 1.6.5.5, 1.1.1.1) e isobutiril-CoA mutasa (subunidad grande 25 IcmA, EC 5.4.99.2; subunidad pequeña IcmB, EC 5.4.99.2) (Han y Reynolds, J. Bacteriol. 179:5157, 1997). Crotonil- CoA es un producto intermedio en la biosíntesis de ácidos grasos en E. coli y otros microorganismos. En la tabla 4 se enumeran ejemplos no limitativos de genes ccr e icm de microorganismos seleccionados.
Tabla 4: Genes ccr e icm de microorganismos seleccionados
Organismo
Gen N.° de registro de GenBank
StreDtomvces coelicolor
ccr NP 630556
icmA NP 629554
icmB NP 630904
Streptomyces cinnamonensis
ccr AAD53915
icmA AAC08713
icmB AJ246005
Además de la expresión de los genes bkd, el inicio de la biosíntesis de brFA usa proteína portadora de p-cetoacil- 30 acilo sintasa III (FabH, EC 2.3.1.41) con especificidad por acil-CoA de cadena ramificada (Li et al., J. Bacteriol. 187:3795-3799, 2005). En la tabla 5 se enumeran ejemplos no limitativos de tales enzimas FabH. Pueden
5
10
15
20
25
30
expresarse en una célula huésped genes fabH que están implicados en la biosíntesis de ácidos grasos de cualquier microorganismo que contiene brFA. Las enzimas Bkd y FabH de células huésped que no preparan de manera natural brFA no pueden respaldar la producción de brFA. Por tanto, bkd y fabH pueden expresarse de manera recombinante. Pueden insertarse vectores que contienen los genes bkd y fabH en una célula huésped de este tipo. De manera similar, el nivel endógeno de la producción de Bkd y FabH puede no ser suficiente para producir brFA. En este caso, pueden sobreexpresarse. Adicionalmente, pueden expresarse o sobreexpresarse otros componentes de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos, tales como proteínas portadoras de acilo (ACP) y proteína portadora de p- cetoacil-acilo sintasa II (fabF, EC 2.3.1.41) (en la tabla 5 se indican ejemplos no limitativos de candidatos). Además de expresar estos genes, algunos genes en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos endógena pueden atenuarse en la célula huésped (por ejemplo, los genes de E. coli fabH (n.° de registro de GenBank NP_415609) y/o fabF (n.° de registro de GenBank NP_415613)).
Tabla 5: Genes fabH, ACP y fabF de microorganismos seleccionados con brFA
Organismo
Gen N.° de registro de GenBank
Streptomyces coelicolor
fabH1 NP 626634
ACP NP 626635
fabF NP 626636
Streptomyces avermitilis
fabH3 NP 823466
fabC3 (ACP) NP 823467
fabF NP 823468
Bacillus subtilis
fabH A NP 389015
fabH B NP 388898
ACP NP 389474
fabF NP 389016
Stenotrophomonas maltophilia
SmalDRAFT 0818 (fabH) ZP 01643059
SmalDRAFT 0821 (ACP) ZP 01643063
SmalDRAFT 0822 (fabF) ZP 01643064
Legionella pneumophila
fabH YP 123672
ACP YP 123675
fabF YP 123676
Formación de aldehídos cíclicos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos
Pueden producirse aldehídos cíclicos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos usando derivados de ácidos grasos cíclicos como sustratos. Para producir sustratos de derivados de ácidos grasos cíclicos, pueden introducirse genes que proporcionan precursores cíclicos (por ejemplo, las familias de genes ans, chc y plm) en la célula huésped y expresarse para permitir el inicio de la biosíntesis de ácidos grasos a partir de precursores cíclicos. Por ejemplo, para convertir una célula huésped, tal como E. coli, en una que puede sintetizar derivados de ácidos grasos ocíclicos (cyFA), puede introducirse un gen que proporciona el precursor cíclico ciclohexilcarbonil-CoA (CHC-CoA) (Cropp et al., Nature Biotech. 18:980-983, 2000) y expresarse en la célula huésped. Los ejemplos no limitativos de genes que proporcionan CHC-CoA en E. coli incluyen: ansJ, ansK, ansL, chcA y ansM de la agrupación de genes de ansatrienina de Streptomyces collinus (Chen et al., Eur. J. Biochem. 261: 98-107, 1999) o plmJ, plmK, plmL, chcA y plmM de la agrupación de genes de foslactomicina B de Streptomyces sp. HK803 (Palaniappan et al., J. Biol. Chem. 278:35552-35557, 2003) junto con el gen chcB (Patton et al., Biochem. 39:7595-7604, 2000) de S. collinus, S. avermitilis o S. coelicolor (véase la tabla 6). Los genes enumerados en la tabla 5 pueden expresarse entonces para permitir el inicio y la elongación de ácidos grasos o-cíclicos. Alternativamente, pueden aislarse los genes homólogos de microorganismos que fabrican cyFA y expresarse en una célula huésped (por ejemplo, E. coli).
Tabla 6: Genes para la síntesis de CHC-CoA
Organismo
Gen N.° de registro de GenBank
Streptomyces collinus
ansJK U72144*
ansL
chcA
ansM
chcB AF268489
Streptomyces sp. HK803
pmlJK AAQ84158
pmlL AAQ84159
chcA AAQ84160
pmlM AAQ84161
Streptomyces coelicolor
chcB/caiD NP 629292
Streptomyces avermitilis
chcB/caiD NP 629292
*Sólo se indica chcA como entrada en GenBank U72144, ansJKLM son según Chen et al. (Eur. J. Biochem. 261:98- 107, 1999).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Los genes enumerados en la tabla 5 (fabH, ACP y fabF) permiten el inicio y la elongación de derivados de ácidos grasos ro-cíclicos porque tienen una amplia especificidad de sustrato. Si la coexpresión de cualquiera de estos genes con los genes indicados en la tabla 5 no proporciona cyFA, entonces pueden aislarse homólogos de fabH, ACP y/o fabF de microorganismos que fabrican cyFA (por ejemplo, los indicados en la tabla 7) (por ejemplo, usando cebadores de PCR degenerados o sondas de secuencias de ADN heterólogas) y coexpresarse.
Tabla 7: Ejemplos no limitativos de microorganismos que contienen ácidos grasos ro-cíclicos
Organismo
Referencia
Curtobacterium pusillum
ATCC19096
Alicyclobacillus acidoterrestris
ATCC49025
Alicyclobacillus acidocaldarius
ATCC27009
Alicyclobacillus cycloheptanicus *
Moore, J. Org. Chem. 62: págs. 2173, 1997.
*Usa cicloheptilcarbonil-CoA y no ciclohexilcarbonil-CoA como precursor para la biosíntesis de cyFA.
Niveles de saturación de aldehídos, alcoholes grasos y alquenos
El grado de saturación en derivados de ácidos grasos puede controlarse regulando el grado de saturación de productos intermedios de derivados de ácidos grasos. Por ejemplo, las familias de genes sfa, gns y fab pueden expresarse o sobreexpresarse para controlar la saturación de ácidos grasos. La figura 40 enumera ejemplos no limitativos de genes en estas familias de genes que pueden usarse en los métodos y las células huésped descritos en el presente documento.
Pueden modificarse por ingeniería genética células huésped para producir ácidos grasos insaturados modificando por ingeniería genética la célula huésped para sobreexpresar fabB o haciendo crecer la célula huésped a bajas temperaturas (por ejemplo, inferiores a 37°C). FabB tiene preferencia por cis-83-decenoil-ACP y da como resultado la producción de ácidos grasos insaturados en E. coli. La sobreexpresión de fabB da como resultado la producción de un porcentaje significativo de ácidos grasos insaturados (de Mendoza et al., J. Biol. Chem. 258:2098-2101, 1983). El gen fabB puede insertarse y expresarse en células huésped que no tienen de manera natural el gen. Estos derivados de ácidos grasos insaturados pueden usarse entonces como productos intermedios en células huésped que se modifican por ingeniería genética para producir derivados de ácidos grasos, tales como aldehídos grasos, alcoholes grasos o alquenos.
En otros casos, puede delecionarse un represor de la biosíntesis de ácidos grasos, por ejemplo, fabR (registro de GenBank NP_418398), lo que también dará como resultado un aumento de la producción de ácidos grasos insaturados en E. coli (Zhang et al., J. Biol. Chem. 277:15558, 2002). Pueden realizarse deleciones similares en otras células huésped. Puede lograrse un aumento adicional de derivados de ácidos grasos insaturados, por ejemplo, sobreexpresando fabM (trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerasa, registro de GenBank DAA05501) y expresión controlada de fabK (trans-2-enoil-ACP reductasa II, registro de GenBank NP_357969) de Streptococcus pneumoniae (Marrakchi et al., J. Biol. Chem. 277: 44809, 2002), mientras se deleciona fabl de E. coli (trans-2-enoil- ACP reductasa, registro de GenBank NP_415804). En algunos ejemplos, puede atenuarse el gen fabF endógeno, aumentando así el porcentaje de palmitoleato (C16:1) producido.
Otros sustratos
Otros sustratos que pueden usarse para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos en los métodos descritos en el presente documento son acil-ACP, acil-CoA, un aldehído graso o un alcohol graso, que se describen en, por ejemplo, el documento PCT/US08/058788. En la figura 40 se enumeran genes a modo de ejemplo que pueden alterarse para expresar o sobreexpresar estos sustratos en células huésped. Otros genes a modo de ejemplo se describen en el documento PCT/US08/058788.
Modificación por ingeniería genética de células huésped para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos
Pueden usarse diversas células huésped para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos, tal como se describe en el presente documento. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido descrito en el presente documento puede expresarse en células bacterianas (tales como E. coli), células de insecto, células de levadura o de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células VERO, células BHK, células HeLa, células Cv1, células MDCK, células 293, células 3T3 o células PC 12). Otras células huésped a modo de ejemplo incluyen células de los miembros del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. Aún otras células huésped a modo de ejemplo pueden ser una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus licheniformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis, una célula de Bacillus amiloliquefaciens, una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhizomucor miehei, una célula de Mucor michei, una célula de Streptomyces lividans, una célula de Streptomyces murinus o una célula de Actinomycetes.
En la tabla 1 se enumeran otros ejemplos no limitativos de células huésped.
En una realización preferida, la célula huésped es una célula de E. coli. En una realización más preferida, la célula huésped es de las cepas de E. coli B, C, K o W. Los expertos en la técnica conocen otras células huésped adecuadas.
Pueden usarse diversos métodos bien conocidos en la técnica para modificar por ingeniería genética células huésped para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Los métodos incluyen el uso de vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de biosíntesis de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descrito en el presente documento, o una variante de polipéptido o fragmento de la misma. Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores pueden experimentar replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y de ese modo se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores, tales como vectores de expresión, pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente unidos. En general, vectores de expresión usados en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. Sin embargo, también pueden usarse otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados de replicación defectuosa).
Los vectores de expresión recombinante descritos en el presente documento incluyen un ácido nucleico descrito en el presente documento en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Los vectores de expresión recombinantes pueden incluir una o más secuencias de control, seleccionadas basándose en la célula huésped que va a usarse para la expresión. La secuencia de control está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse. Tales secuencias de control se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias de control incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden introducirse en células huésped para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificados por los ácidos nucleicos tal como se describe en el presente documento.
Pueden diseñarse vectores de expresión recombinante para la expresión de un gen que codifica para un polipéptido de biosíntesis de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos o variante en células procariotas o eucariotas (por ejemplo, células bacterianas, tales como E. coli, células de insecto (por ejemplo, usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero). Se comentan adicionalmente células huésped adecuadas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras de promotor de T7 y polimerasa de T7.
La expresión de polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se lleva a cabo con la mayor frecuencia con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos o bien de fusión o bien no de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, habitualmente en el extremo amino-terminal del polipéptido recombinante. Tales vectores de fusión sirven normalmente para tres fines: (1) aumentar la expresión del polipéptido recombinante; (2) aumentar la solubilidad del polipéptido recombinante; y (3) ayudar en la purificación del polipéptido recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. Con frecuencia, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante del resto de fusión tras la purificación del polipéptido de fusión. Los ejemplos de tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión a modo de ejemplo incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith et al., Gene (1988) 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRITS (Pharmacia, Piscataway, N.J.), que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, al polipéptido recombinante diana.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles, no de fusión, incluyen pTrc (Amann et al., Gene (1988) 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). La expresión génica diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción de ARN polimerasa del huésped a partir de un promotor de fusión de trp-lac híbrido. La expresión génica diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripción de un promotor de fusión de gn10-lac de T7 mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada (gn1 de T7). Esta polimerasa viral se suministra por cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3) a partir de un profago X residente que aloja un gen gn1 de T7 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.
Una estrategia para maximizar la expresión de polipéptido recombinante es expresar el polipéptido en una célula huésped con una capacidad alterada para escindir proteolíticamente el polipéptido recombinante (véase Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico que va a insertarse en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido son los usados preferiblemente en la célula huésped (Wada et al., Nucleic Acids Res. (1992) 20:2111-2118). Tal alteración de secuencias de ácido nucleico puede llevarse a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN convencionales.
En otra realización, la célula huésped es una célula de levadura. En esta realización, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.).
Alternativamente, puede expresarse un polipéptido descrito en el presente documento en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto en cultivo (por ejemplo, células Sf9) incluyen, por ejemplo, la serie pAc (Smith et al., Mol. Cell Biol. (1983) 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39).
En aún otra realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden expresarse en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. (1987) 6:187-195). Cuando se usan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión pueden proporcionarse por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus del simio 40. Otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas se describen en los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Pueden introducirse vectores en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal como se usan en el presente documento, los términos “transformación” y “transfección” se refieren a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped, por ejemplo, en Sambrook et al. (citado anteriormente).
Para la transformación estable de células bacterianas, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transformación usados, sólo una pequeña fracción de células captarán y replicarán el vector de expresión. Con el fin de identificar y seleccionar estos transformantes, puede introducirse un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican para un marcador seleccionable en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento o pueden introducirse en un vector separado. Pueden identificarse células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido mediante selección con fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).
Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usados, sólo una pequeña fracción de células pueden integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, puede introducirse un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican para un marcador seleccionable en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento o pueden introducirse en un vector separado. Pueden identificarse células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido mediante selección con fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).
En determinados métodos, se coexpresan un polipéptido de biosíntesis de aldehídos y un polipéptido de biosíntesis
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
de alcanos o alquenos en una única célula huésped. En métodos alternativos, se coexpresan un polipéptido de biosíntesis de aldehídos y un polipéptido de alcohol deshidrogenasa en una única célula huésped.
Proteínas de transporte
Las proteínas de transporte pueden exportar polipéptidos e hidrocarburos (por ejemplo, aldehídos, alcanos y/o alquenos) fuera de una célula huésped. Muchas proteínas de transporte y eflujo sirven para excretar una amplia variedad de compuestos y pueden modificarse de manera natural para ser selectivas para tipos particulares de hidrocarburos.
Ejemplos no limitativos de proteínas de transporte adecuadas son proteínas de transporte de casete de unión a ATP (ABC), proteínas de eflujo y proteínas transportadoras de ácidos grasos (FATP). Los ejemplos no limitativos adicionales de proteínas de transporte adecuadas incluyen las proteínas de transporte de ABC de microorganismos tales como Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thalania, Alkaligenes eutrophus y Rhodococcus erythropolis. En la figura 40 se indican proteínas de transporte de ABC a modo de ejemplo que pueden usarse (por ejemplo, CER5, AtMRP5, AmiS2 y AtPGP1). También pueden elegirse células huésped por su capacidad endógena para secretar hidrocarburos. La eficacia de la producción de hidrocarburos y secreción en el entorno de la célula huésped (por ejemplo, medio de cultivo, caldo de fermentación) puede expresarse como una razón de producto intracelular con respecto a producto extracelular. En algunos ejemplos, la razón puede ser de aproximadamente 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 ó 1:5.
Fermentación
La producción y el aislamiento de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos pueden potenciarse empleando técnicas de fermentación beneficiosas. Un método para maximizar la producción al tiempo que se reducen los costes es aumentar el porcentaje de la fuente de carbono que se convierte en productos hidrocarbonados.
Durante ciclos de vida celulares normales, se usa carbono en funciones celulares, tales como producción de lípidos, sacáridos, proteínas, ácidos orgánicos y ácidos nucleicos. Reducir la cantidad de carbono necesaria para actividades relacionadas con el crecimiento puede aumentar la eficacia de conversión de la fuente de carbono en producto. Esto puede lograrse, por ejemplo, haciendo crecer en primer lugar células huésped hasta una densidad deseada (por ejemplo, una densidad que se alcanza al máximo de la fase de crecimiento logarítmica). En tal punto, pueden emplearse genes de punto de control de la replicación para detener el crecimiento de células. Específicamente, pueden usarse mecanismos de percepción de quórum (revisado en Camilli et al., Science 311:1113, 2006; Venturi FEMS Microbio. Rev. 30:274-291, 2006; y Reading et al., FEMS Microbiol. Lett. 254:1-11, 2006) para activar genes de punto de control, tales como p53, p21 u otros genes de punto de control.
Los genes que pueden activarse para detener la replicación y el crecimiento celular en E. coli incluyen genes umuDC. La sobreexpresión de genes umuDC detiene la progresión desde la fase estacionaria hasta el crecimiento exponencial (Murli et al., J. of Bact. 182: 1127, 2000). UmuC es una ADN polimerasa que puede llevar a cabo la síntesis translesión sobre lesiones no codificantes (la base mecanística de la mayoría de las mutagénesis por UV y químicas). Los productos del gen umuDC están implicados en el proceso de síntesis translesión y también sirven como un punto de control de daño de la secuencia de ADN. Los productos del gen umuDC incluyen UmuC, UmuD, umuD', UmuD'2C, UmuD'2 y UmuD2. Simultáneamente, pueden activarse genes que producen productos, minimizando así la necesidad de usar rutas de replicación y mantenimiento mientras se prepara un aldehído, alcano y/o alqueno. También pueden modificarse por ingeniería células huésped para expresar umuC y umuD de E. coli en pBAD24 bajo el sistema del promotor prpBCDE mediante síntesis de novo de este gen con los genes de producción de producto final apropiados.
El porcentaje de carbonos introducidos convertidos en aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos puede ser un impulsor de coste. Cuanto más eficaz es el proceso (es decir, mayor es el porcentaje de carbonos introducidos convertidos en aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos), menos caro será el proceso. Para fuentes de carbono que contienen oxígeno (por ejemplo, fuentes a base de glucosa y otros hidratos de carbono), el oxígeno debe liberarse en forma de dióxido de carbono. Por cada 2 átomos de oxígeno liberados, también se libera un átomo de carbono conduciendo a una eficacia metabólica teórica máxima de aproximadamente el 34% (p/p) (para productos derivados de ácidos grasos). Sin embargo, esta cifra cambia para otros productos hidrocarbonados y fuentes de carbono. Las eficacias típicas en la bibliografía son aproximadamente inferiores al 5%. Las células huésped modificadas por ingeniería genética para producir aldehídos, alcanos y/o alquenos pueden tener una eficacia superior a aproximadamente el 1, el 3, el 5, el 10, el 15, el 20, el 25 y el 30%. En un ejemplo, las células huésped pueden mostrar una eficacia de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 25%. En otros ejemplos, tales células huésped pueden mostrar una eficacia de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 30%. En otros ejemplos, las células huésped pueden mostrar una eficacia superior al 30%.
La célula huésped puede modificarse por ingeniería genética adicionalmente para expresar celulosomas recombinantes, tales como los descritos en la solicitud de PCT número PCT/US2007/003736. Estos celulosomas pueden permitir que la célula huésped use material celulósico como fuente de carbono. Por ejemplo, la célula huésped puede modificarse por ingeniería genética adicionalmente para expresar invertasas (EC 3.2.1.26) de modo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
que puede usarse sacarosa como fuente de carbono. De manera similar, la célula huésped puede modificarse por ingeniería genética usando las enseñanzas descritas en las patentes estadounidenses n.os 5.000.000; 5.028.539; 5.424.202; 5.482.846 y 5.602.030; de modo que la célula huésped puede asimilar carbono eficazmente y usar materiales celulósicos como fuentes de carbono.
En un ejemplo, la cámara de fermentación puede encerrar una fermentación que está experimentando una reducción continua. En este caso, puede crearse un entorno reductor estable. El equilibrio electrónico puede mantenerse mediante la liberación de dióxido de carbono (en forma gaseosa). Esfuerzos para aumentar el equilibrio de NAD/H y NADP/H también pueden facilitar la estabilización del equilibrio electrónico. También puede potenciarse la disponibilidad de NADPH intracelular modificando por ingeniería genética la célula huésped para expresar una NADH:NADPH transhidrogenasa. La expresión de una o más NADH:NADPH transhidrogenasas convierte la NADH producida en la glicólisis en NADPH, lo que puede potenciar la producción de aldehídos, alcanos y/o alquenos.
Para la producción a pequeña escala, las células huésped modificadas por ingeniería genética pueden hacerse crecer en lotes de, por ejemplo, aproximadamente 100 ml, 500 ml, 1 l, 2 l, 5 l o 10 l; fermentarse; e inducirse para expresar aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos deseados basándose en los genes específicos codificados en los plásmidos apropiados. Por ejemplo, pueden incubarse durante la noche células de E. coli BL21(DE3) que albergan pBAD24 (con resistencia a ampicilina y la ruta de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos o alquenos) así como pUMVC1 (con resistencia a kanamicina y el sistema de sobreexpresión de acetil CoA/malonil CoA) en frascos de 2 l a 37°C agitados a > 200 rpm en 500 ml de medio LB complementado con ampicilina 75 |ig/ml y kanamicina 50 |ig/ml hasta que los cultivos alcanzan una DO600 > 0,8. Tras lograr una DO600 > 0,8, las células pueden complementarse con propionato de sodio 25 mM (pH 8,0) para activar los sistemas de genes modificados por ingeniería genética para la producción y para detener la proliferación celular activando las proteínas UmuC y UmuD. La inducción puede realizarse durante 6 h a 30°C. Tras la incubación, los medios pueden examinarse para detectar aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos usando CG-EM.
Para la producción a gran escala, las células huésped modificadas por ingeniería genética pueden hacerse crecer en lotes de aproximadamente 10 l, 100 l, 1000 l o más; fermentarse; e inducirse para expresar aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos deseados basándose en los genes específicos codificados en los plásmidos apropiados Por ejemplo, pueden incubarse células de E. coli BL21(DE3) que albergan pBAD24 (con resistencia a ampicilina y la ruta de síntesis de aldehídos y/o alcanos) así como pUMVC1 (con resistencia a kanamicina y el sistema de sobreexpresión de acetil-CoA/malonil-CoA) a partir de un cultivo simiente de 500 ml para fermentaciones de 10 l (5 l para fermentaciones de 100 l, etc.) en medios LB (libres de glicerol) con kanamicina 50 |ig/ml y ampicilina 75 |ig/ml a 37°C, y agitarse a > 200 rpm hasta que los cultivos alcanzan una DO600 > 0,8 (normalmente 16 h). Pueden complementarse de manera continua los medios para mantener propionato de sodio 25 mM (pH 8,0) para activar los sistemas de genes modificados por ingeniería genética para la producción y para detener la proliferación celular activando las proteínas umuC y umuD. Los medios pueden complementarse de manera continua con glucosa para mantener una concentración de 25 g/100 ml.
Tras la primera hora de inducción, pueden retirarse alícuotas de no más del 10% del volumen celular total cada hora y permitir que se asienten sin agitación para permitir que los aldehídos, alcanos y/o alquenos suban a la superficie y experimenten una separación de fases espontánea. El componente de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos puede recogerse entonces, y devolverse la fase acuosa a la cámara de reacción. La cámara de reacción puede hacerse funcionar de manera continua. Cuando la DO600 desciende por debajo de 0,6, las células pueden reemplazarse por un nuevo lote hecho crecer a partir de un cultivo simiente.
Producción de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y alquenos usando métodos libres de células
En algunos métodos descritos en el presente documento, pueden producirse un aldehído, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos usando un polipéptido purificado descrito en el presente documento y un sustrato descrito en el presente documento. Por ejemplo, una célula huésped puede modificarse por ingeniería genética para expresar un polipéptido de biosíntesis de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos o variante tal como se describe en el presente documento. La célula huésped puede cultivarse en condiciones adecuadas para permitir la expresión del polipéptido. Entonces pueden generarse extractos libres de células usando métodos conocidos. Por ejemplo, las células huésped pueden lisarse usando detergentes o mediante sonicación. Los polipéptidos expresados pueden purificarse usando métodos conocidos. Tras obtener los extractos libres de células, pueden añadirse los sustratos descritos en el presente documento a los extractos libres de células y mantenerse en condiciones que permiten la conversión de los sustratos en aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos pueden separarse entonces y purificarse usando técnicas conocidas.
Procesamiento tras la producción
Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos durante la fermentación pueden separarse de los medios de fermentación. Puede usarse cualquier técnica conocida para separar aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos de medios acuosos. Un procedimiento de separación a modo de ejemplo es un procedimiento de separación de dos fases (bifásico). Este procedimiento implica fermentar las células huésped modificadas por ingeniería genética en condiciones suficientes para producir aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
permitir que los aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos se recojan en una fase orgánica y separar la fase orgánica del caldo de fermentación acuoso. Este método puede ponerse en práctica en entornos de fermentación tanto continuos como discontinuos.
La separación bifásica usa la relativa inmiscibilidad de los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos para facilitar la separación. Inmiscible se refiere a la relativa incapacidad de un compuesto de disolverse en agua y se define por el coeficiente de reparto del compuesto. Un experto habitual en la técnica apreciará que eligiendo un caldo de fermentación y una fase orgánica, de tal manera que el aldehído, alcano y/o alqueno que está produciéndose tiene un valor de logP alto, el aldehído, alcano y/o alqueno puede separarse en la fase orgánica, incluso a concentraciones muy bajas, en el recipiente de fermentación.
Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos mediante los métodos descritos en el presente documento pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, así como en el citoplasma. Por tanto, los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos pueden recogerse en una fase orgánica o bien de manera intracelular o bien extracelular. La recogida de los productos en la fase orgánica puede reducir el impacto de los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos sobre la función celular y puede permitir que la célula huésped produzca más producto.
Los métodos descritos en el presente documento pueden dar como resultado la producción de compuestos homogéneos en los que al menos aproximadamente el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 95% de los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos tendrán longitudes de la cadena de carbono que varían en menos de aproximadamente 6 carbonos, menos de aproximadamente 4 carbonos o menos de aproximadamente 2 carbonos. Estos compuestos también pueden producirse con un grado de saturación relativamente uniforme. Estos compuestos pueden usarse directamente como combustibles, aditivos para combustibles, productos químicos especializados, materiales de partida para la producción de otros compuestos químicos (por ejemplo, polímeros, tensioactivos, plásticos, materiales textiles, disolventes, adhesivos, etc.), o aditivos de productos para el cuidado personal. Estos compuestos también pueden usarse como materia prima para reacciones posteriores, por ejemplo, hidrogenación, craqueo catalítico (por ejemplo, mediante hidrogenación, pirólisis o ambas), para preparar otros productos.
En algunas realizaciones, los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos usando métodos descritos en el presente documento pueden contener entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 90% de carbono; o entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 25% de hidrógeno. En otras realizaciones, los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos usando métodos descritos en el presente documento pueden contener entre aproximadamente el 65% y aproximadamente el 85% de carbono; o entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 15% de hidrógeno.
Composiciones de combustible y composiciones de productos químicos especializados
Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descritos en el presente documento pueden usarse como o convertirse en un combustible o como un producto químico especializado. Un experto habitual en la técnica apreciará que, dependiendo del fin previsto del combustible o producto químico especializado, pueden producirse y usarse diferentes aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Por ejemplo, un aldehído, alcohol graso, alcano y/o alqueno ramificado puede ser deseable para combustible de automóviles que está destinado a usarse en climas fríos. Además, cuando los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descritos en el presente documento se usan como materia prima para la producción de combustible o productos químicos especializados, un experto habitual en la técnica apreciará que las características de la materia prima de aldehído, alcohol graso, alcano y/o alqueno afectarán a las características del combustible o producto químico especializado producido. Por tanto, pueden seleccionarse las características del combustible o producto químico especializado para la producción de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos particulares para su uso como materia prima.
Usando los métodos descritos en el presente documento, pueden producirse biocombustibles que tienen calidades de combustible deseadas a partir de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos. Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos producidos de manera biológica representan una nueva fuente de biocombustibles, que pueden usarse como combustible para motores a reacción, diésel o gasolina. Algunos biocombustibles preparados usando aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos no se han producido a partir de fuentes renovables y son nuevas composiciones de materia. Estos nuevos combustibles o productos químicos especializados pueden distinguirse de los combustibles o productos químicos especializados derivados de carbono petroquímico basándose en la huella de carbono isotópico doble. Adicionalmente, la fuente específica de carbono de fuentes biológicas (por ejemplo, glucosa frente a glicerol) puede determinarse mediante la huella de carbono isotópico doble (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.169.588, en particular de la col. 4, línea 31, a la col. 6, línea 8).
Los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos y los biocombustibles, productos químicos especializados y mezclas asociados pueden distinguirse de sus homólogos derivados de manera petroquímica basándose en 14C (fM) y la huella de carbono isotópico doble. En algunos ejemplos, el aldehído, alcohol graso, alcano y/o alqueno en la composición de biocombustible pueden tener una fracción de carbono moderno (fM 14C) de, por ejemplo, al menos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
aproximadamente 1,003, 1,010 ó 1,5.
En algunos ejemplos, puede prepararse una composición de biocombustible que incluye aldehidos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos que tienen 813C de desde aproximadamente -15,4 hasta aproximadamente -10,9, en donde los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos representan al menos aproximadamente el 85% del material de fuentes biológicas (es decir, derivados de un recurso renovable, tal como biomasa, materiales celulósicos y azúcares) en la composición.
La capacidad para distinguir estos productos derivados de manera biológica es beneficiosa en el seguimiento de estos materiales en el comercio. Por ejemplo, pueden distinguirse combustibles o productos químicos especializados que comprenden perfiles de isótopos de carbono tanto derivados de manera biológica como a base de petróleo de combustibles y productos químicos especializados compuestos sólo por materiales a base de petróleo. Por tanto, los aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descritos en el presente documento pueden seguirse en el comercio o identificarse en el comercio como biocombustible basándose en su perfil único. Además, pueden identificarse otros materiales competidores como derivados de manera biológica o derivados de una fuente petroquímica.
Se usan aditivos para combustibles para potenciar el rendimiento de un combustible o motor. Por ejemplo, pueden usarse aditivos para combustibles para alterar el punto de congelación/gelificación, el punto de turbidez, la lubricidad, la viscosidad, la estabilidad oxidativa, la calidad de ignición, el nivel de octanos y/o el punto de inflamación. En los Estados Unidos, todos los aditivos para combustibles deben registrarse en la Environmental Protection Agency. Los nombres de aditivos para combustibles y las empresas que venden los aditivos para combustibles están disponibles públicamente poniéndose en contacto con la EPA o consultando la página web de la agencia. Un experto habitual en la técnica apreciará que los biocombustibles a base de aldehídos y/o alcanos descritos en el presente documento pueden mezclarse con uno o más aditivos para combustibles para conferir una calidad deseada.
Los biocombustibles a base de aldehídos, alcoholes grasos, alcanos y/o alquenos descritos en el presente documento pueden mezclarse con otros combustibles, tales como diversos alcoholes, tales como etanol y butanol, y productos derivados de petróleo, tales como gasolina, diésel o combustible para motores a reacción.
En algunos ejemplos, la mezcla puede incluir al menos aproximadamente el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50% o el 60% en peso del aldehído, alcoholes grasos, alcano o alqueno. En otros ejemplos, puede prepararse una composición de biocombustible que incluye al menos aproximadamente el 5%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de un aldehído, alcoholes grasos, alcano o alqueno que incluye una cadena de carbono que tiene 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 carbonos de longitud. Tales composiciones de biocombustible pueden incluir adicionalmente al menos un aditivo seleccionado de un aditivo que reduce el punto de turbidez que puede reducir el punto de turbidez hasta menos de aproximadamente 5°C o 0°C; un tensioactivo; una microemulsión; al menos aproximadamente el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de combustible diésel a partir de triglicéridos; gasolina derivada de petróleo; o combustible diésel a partir de petróleo.
Ejemplos
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrito en las reivindicaciones.
Ejemplo 1. Detección y verificación de biosíntesis de alcanos en cianobacterias seleccionadas
Se seleccionaron siete cianobacterias, cuyas secuencias genómicas completas están disponibles públicamente, para la verificación y/o la detección de biosíntesis de alcanos: Synechococcus elongatus PCC7942, Synechococcus elongatus PCC6301, Anabaena variabilis ATCC29413, Synechocystis sp. PCC6803, Nostoc punctiforme PCC73102, Gloeobacter violaceus ATCC 29082 y Prochlorococcus marinus CCMP 1986. Sólo se había notificado previamente que las primeras tres cepas de cianobacterias de esta lista contenían alcanos (Han et al., J. Am. Chem. Soc. 91:5156-5159 (1969); Fehler et al., Biochem. 9:418-422 (1970)). Se hicieron crecer las cepas de manera fotoautótrofa en frascos con agitación en 100 ml de los medios apropiados (enumerados en la tabla 8) durante 3-7 días a 30°C a una intensidad luminosa de aproximadamente 3.500 lux. Se extrajeron las células para la detección de alcanos tal como sigue: se centrifugaron células de un volumen de cultivo de 1 ml durante 1 min a 13.000 rpm, se resuspendieron los sedimentos celulares en metanol, se agitaron con vórtex durante 1 min y luego se sonicaron durante 30 min. Tras la centrifugación durante 3 min a 13.000 rpm, se transfirieron los sobrenadantes a viales nuevos y se analizaron mediante CG-EM. Se analizaron las muestras o bien en una columna capilar DP-5 de 30 m (diámetro interno de 0,25 mm) o bien en una columna capilar DP-5 de 30 m a alta temperatura (diámetro interno de 0,25 mm) usando el siguiente método.
Tras una inyección sin dividir de 1 |il (temperatura de entrada mantenida a 300°C) en la columna de CG/EM, se mantuvo el horno a 100°C durante 3 min. Se aumentó la temperatura hasta 320°C a una velocidad de 20°C/min. Se mantuvo el horno a 320°C durante 5 min adicionales. La velocidad de flujo del gas helio portador fue de 1,3 ml/min. La EM de cuadrupolo exploró desde 50 hasta 550 m/z. Se compararon los patrones de fragmentación y tiempos de
5
10
15
20
25
30
retención de los picos de producto con referencias auténticas para confirmar la identidad del pico.
De las siete cepas, seis producían principalmente heptadecano y una producía pentadecano (P. marinus CCMP1986); una de estas cepas producía metil-heptadecano además de heptadecano (A. variabilis ATCC29413) (véase la tabla 8). Por tanto, se verificó la biosíntesis de alcanos en tres cianobacterias notificadas anteriormente y se detectó la biosíntesis de alcanos en cuatro cianobacterias que no se sabía previamente que producían alcanos: P. marinus CCMP1986 (véase la figura 1), N. punctiforme PCC73102 (véase la figura 2), G. violaceus ATCC 29082 (véase la figura 3) y Synechocystis sp. PCC6803 (véase la figura 4).
La figura 1A representa el perfil de CG/EM de células de Prochlorococcus marinus CCMP1986 extraídas con metanol. El pico a los 7,55 min tenía el mismo tiempo de retención que el pentadecano (Sigma). En la figura 1B, se muestra el patrón de fragmentación de masas del pico de pentadecano. El pico en 212 corresponde al peso molecular del pentadecano.
La figura 2A representa el perfil de CG/EM de células de Nostoc punctiforme PCC73102 extraídas con metanol. El pico a los 8,73 min tiene el mismo tiempo de retención que el heptadecano (Sigma). En la figura 2B, se muestra el patrón de fragmentación de masas del pico de heptadecano. El pico en 240 corresponde al peso molecular del heptadecano.
La figura 3A representa el perfil de CG/EM de células de Gloeobaceter violaceus ATCC29082 extraídas con metanol. El pico a los 8,72 min tiene el mismo tiempo de retención que el heptadecano (Sigma). En la figura 3B, se muestra el patrón de fragmentación de masas del pico de heptadecano. El pico en 240 corresponde al peso molecular del heptadecano.
La figura 4A representa el perfil de CG/EM de células de Synechocystic sp. PCC6803 extraídas con metanol. El pico a los 7,36 min tiene el mismo tiempo de retención que el heptadecano (Sigma). En la figura 4B, se muestra el patrón de fragmentación de masas del pico de heptadecano. El pico en 240 corresponde al peso molecular del heptadecano.
Tabla 8: Hidrocarburos detectados en las cianobacterias seleccionadas
Cianobacteria
n.° de la ATCC Genoma Medio Alcanos
notificados verificados2
Synechococcus elongatus PCC7942
27144 2,7 Mb BG-11 C17:0 C17:0, C15:0
Synechococcus elongatus PCC6301
33912 2,7 Mb BG-11 C17:0 C17:0, C15:0
Anabaena variabilis
29413 6,4 Mb BG-11 C17:0. 7- u 8- Me-C17:0 C17:0, Me- C17:0
Synechocystis sp. PCC6803
27184 3,5 Mb BG-11 - C17:0, C15:0
Prochlorococcus marinus CCMP19861
- 1,7 Mb - - C15:0
Nostoc punctiforme PCC73102
29133 9,0 Mb ATCC819 - C17:0
Gloeobacter violaceus
29082 4,6 Mb BG11 - C17:0
1 las células para la extracción fueron un obsequio de Jacob Waldbauer (MIT)
2 el hidrocarburo principal está en negrita
Los análisis genómicos produjeron dos genes que estaban presentes en las cepas productoras de alcanos. En la tabla 9 se representan los homólogos de estos genes de Synechococcus elongatus PCC7942 y son Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO: 1) y Synpcc7942_1594 (SEQ ID NO: 65).
Tabla 9: Genes de cianobacterias productoras de alcanos
Id del gen objeto
Etiqueta de locus Registro de Genbank Nombre del gen Longitud COG Pfam InterPro Notas
637800026
Synpcc7942_1593 YP_400610 proteína hipotética 231 aa pfam02915 IPR009078 IPR003251 rubreritina de tipo ferritina/ribonucleótido reductasa
637800027
Synpcc7942_1594 YP_400611 proteína hipotética 341 aa COG5322 pfam00106 IPR000408 IPR016040 IPR002198 deshidrogenasa prevista deshidrogenasa de cadena corta de unión a NAD(P)
Ejemplo 2. La deleción de los genes sll0208 y sll0209 en Synechocystis sp. PCC6803 conduce a pérdida de biosíntesis de alcanos
Se delecionaron los genes que codifican para la supuesta descarbonilasa (sll0208; NP_442147) (SEQ ID NO: 3) y la enzima generadora de aldehídos (sll0209; NP_442146) (SEQ ID NO: 67) de Synechocystis sp. PCC6803 tal como sigue. Se amplificó aproximadamente 1 kb de ADN flanqueante en el sentido de 3' y de 5' usando el cebador
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
sll0208/9-KO1 (CGCGGATCCCTTGATTCTACTGCGGCGAGT) con el cebador sll0208/9-KO2 (CACGCACCTAGGTTCACACTCCCATGGTATAACAGGGGCGTTGGACTCCTGTG) y el cebador sll0208/9-KO3 (GTTATACCATGGGAGTGTGAACCTAGGTGCGTGGCCGACAGGATAGGGCGTGT) con el cebador sll0208/9-KO4 (CGCGGATCCAACGCATCCTCACTAGTCGGG), respectivamente. Se usaron los productos de PCR en una PCR cruzada con los cebadores sll0208/9-KO1 y sll0208/9-KO4 para amplificar el casete de deleción de aproximadamente 2 kb de sll0208/sll0209, que se clonó en el sitio BamHI del vector de clonación pUC19. Entonces se amplificó un casete de resistencia a kanamicina (aph, KanR) a partir del plásmido pRL27 (Larsen et al., Arch. Microbiol. 178:193 (2002)) usando los cebadores Kan-aph-F
(CATGCCATGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTG) y Kan-aph-R
(CTAGTCTAGAGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAA), que se cortó luego con NcoI y XbaI y se clonó en los sitios NcoI y ^wII del casete de deleción de sll0208/sll0209, creando un casete de deleción de sll0208/sll0209 con inserción de KanR en pUC19. El vector que contenía el casete, que no se replica en cianobacterias, se transformó en Synechocystis sp. PCC6803 (Zang et al., 2007, J. Microbiol., vol. 45, págs. 241) y se seleccionaron transformantes (por ejemplo, integrantes cromosómicos mediante recombinación homóloga doble) en placas de agar BG-11 que contenían kanamicina 100 |ig/ml en un incubador equipado con luz a 30°C. Las colonas resistentes a kanamicina volvieron a sembrarse en estrías una vez y luego se sometieron a análisis genotípico usando PCR con cebadores de diagnóstico.
Se cultivaron los mutantes de deleción-inserción confirmados en 12 ml de medio BG11 con kanamicina 50 |ig/ml durante 4 días a 30°C en un agitador-incubador equipado con luz. Entonces se centrifugó 1 ml de caldo (1 min a 13.000 g) y se extrajeron los sedimentos celulares con 0,1 ml de metanol. Tras la extracción, se centrifugaron de nuevos las muestras y se sometieron los sobrenadantes a análisis de CG-EM tal como se describe en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 5, las cepas de Synechocystis sp. PCC6803 en las que se delecionaron los genes sll0208 y sll0209 perdieron su capacidad para producir heptadeceno y octadecenal. Este resultado demuestra que los genes sll0208 y sll0209 en Synechocystis sp. PCC6803 y los genes ortólogos en otras cianobacterias (véase la tabla 1) son responsables de la biosíntesis de alcanos y aldehídos grasos en estos microorganismos.
Ejemplo 3. Producción de aldehidos grasos y alcoholes grasos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942
Se amplificó el ADN genómico que codifica para el orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 (YP_400611; supuesta enzima generadora de aldehidos) (SEQ ID NO: 65) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se transformó el constructo resultante (“OP80- PCC7942_1594”) en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 con glucosa al 1% (p/v) como fuente de carbono y complementado con espectinomicina 100 |ig/ml. Cuando el cultivo alcanzó una DO600 de 0,8-1,0, se indujo con IPTG 1 mM y se hicieron crecer las células durante 18-20 h adicionales a 37°C. Se extrajeron las células de 0,5 ml de cultivo con 0,5 ml de acetato de etilo. Tras la sonicación durante 60 min, se centrifugó la muestra a 15.000 rpm durante 5 min. Se analizó la capa de disolvente mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 6, las células de E. coli transformadas con el vector que portaba orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 produjeron los siguientes aldehidos grasos y alcoholes grasos: hexadecanal, octadecenal, tetradecenol, hexadecenol, hexadecanol y octadecenol. Este resultado indica que orf1594 de PCC7942 (i) genera aldehidos in vivo como posibles sustratos para la descarbonilación y (ii) puede reducir acil-ACP como sustratos, que son la forma más abundante de ácidos grasos activados en células de E. coli silvestres. Por tanto, la enzima se denominó acil-ACP reductasa. In vivo, los aldehidos grasos aparentemente se reducen adicionalmente para dar los correspondientes alcoholes grasos mediante una actividad aldehido reductasa endógena de E. coli.
Ejemplo 4. Producción de aldehidos grasos y alcoholes grasos en E. coli a través de la expresión heteróloga de cce 1430 de Cyanothece sp. ATCC51142
Se amplificó el ADN genómico que codifica para cce_1430 de Cyanothece sp. ATCC51142 (YP_001802846; supuesta enzima generadora de aldehidos) (SEQ ID NO: 69) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se transformó el constructo resultante en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio minimo M9 con glucosa al 1% (p/v) como fuente de carbono y complementado con espectinomicina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 7, las células de E. coli transformadas con el vector que portaba cce_1430 de Cyanothece sp. ATCC51142 produjeron los siguientes aldehidos grasos y alcoholes grasos: hexadecanal, octadecenal, tetradecenol, hexadecenol, hexadecanol y octadecenol. Este resultado indica que cce_1430 de ATCC51142 (i) genera aldehidos in vivo como posibles sustratos para la descarbonilación y (ii) puede reducir acil- ACP como sustratos, que son la forma más abundante de ácidos grasos activados en células de E. coli silvestres. Por tanto, esta enzima también es una acil-ACP reductasa.
Ejemplo 5. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Synechococcus elongatus PCC7942 y el orf1593 de Synechococcus elongatus PCC7942
Se amplificó el ADN genómico que codifica para el orf1593 de Synechococcus elongatus PCC7942 (YP_400610; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 1) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 8, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y PCC7942_1593 de S. elongatus produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PCC7942_1593 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 6. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102
Se amplificó el ADN genómico que codifica para Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 5) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 9, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y Npun02004178 de N. punctiforme PCC73102 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal, hexadecanal y octadecenal en tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 7. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803
Se amplificó el ADN genómico que codifica para sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803 (NP_442147; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 3) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG- EM tal como se describe en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 10, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 8. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y alr5283 de Nostoc sp. PCC7210
Se amplificó el ADN genómico que codifica para alr5283 de Nostoc sp. PCC7210 (NP_489323; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 7) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG- EM tal como se describe en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 11, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y alr5283 de Nostoc sp. PCC7210 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que alr5283 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 9. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y AM1 4041 de Acaryochloris marina MBIC11017
Se realizó la optimización de codones del ADN genómico que codifica para AM1_4041 de Acaryochloris marina
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
MBIC11017 (YP_001518340; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 9) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO:
46) , se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 12, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCR7942_1594 de S. elongatus y AM1_4041 de A. marina MBIC11017 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que AM1_4041 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal, hexadecanal y octadecenal en tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 10. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y tll1313 de Thermosynechococcus elongatus BP-1
Se realizó la optimización de codones del ADN genómico que codifica para tll1313 de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (NP_682103; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 11) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO:
47) , se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 13, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y tll1313 de T. elongatus BP-1 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que tll1313 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 11. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y CYA 0415 de Synechococcus sp. JA-3-3Ab
Se realizó la optimización de codones del ADN genómico que codifica para CYA_0415 de Synechococcus sp. JA-3- 3Ab (YP_473897; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 13) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 48), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 14, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y CYA_0415 de Synechococcus sp. JA-3-3Ab produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 12. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y gll3146 de Gloeobacter violaceus PCC7421
Se amplificó el ADN genómico que codifica para gll3146 de Gloeobacter violaceus PCC7421 (NP_926092; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 15) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG- EM tal como se describe en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 15, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y gll3146 de G. violaceus PCC7421 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que gll3146 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 13. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y PMT1231 de Prochlorococcus marinus
Se realizó la optimización de codones del ADN genómico que codifica para PMT1231 de Prochlorococcus marinus
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
MIT9313 (NP_895059; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 17) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 49), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 16, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y PMT1231 de P. marinus MIT9313 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PMT1231 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 14. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y PMM0532 de Prochlorococcus marinus CCMP1986
Se amplificó el ADN genómico que codifica para PMM0532 de Prochlorococcus marinus CCMP1986 (NP_892650; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 19) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 17, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y PMM0532 de P. marinus CCMP1986 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PMM0532 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 15. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y PMN2A 1863 de Prochlorococcus marinus NATL2A
Se realizó la optimización de codones del ADN genómico que codifica para PMN2A_1863 de Prochlorococcus marinus NATL2A (YP_293054; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 21) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 51), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 18, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y PMN2A_1863 de P. marinus NATL2A produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que PMN2A_1863 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 16. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y RS9917 09941 de Synechococcus sp. RS9917
Se realizó la optimización de codones del ADN genómico que codifica para RS9917_09941 de Synechococcus sp. RS9917 (ZP_01079772; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 23) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 52), se sintetizó y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 19, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y RS9917_09941 de Synechococcus sp. RS9917 produjeron los mismos aldehídos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que RS9917_09941 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 17. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y RS9917 12945 de Synechococcus sp. RS9917
Se realizó la optimización de codones del ADN genómico que codifica para RS9917_12945 de Synechococcus sp. RS9917 (ZP_01080370; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 25) para su expresión en E. coli (SEQ ID NO: 53),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
se sintetizó y se clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante cG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 20, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y RS9917_12945 de Synechococcus sp. RS9917 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que RS99l7_12945 en E. coli convierte hexadecanal y octadecenal en pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehído graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 18. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y cce 0778 de Cyanothece sp. ATCC51142
Se sintetizó el ADN genómico que codifica para cce_0778 de Cyanothece sp. ATCC51142 (YP_001802195; supuesta descarbonilasa) (SEQ iD NO: 27) y se clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 21, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y cce_0778 de Cyanothece sp. ATCC51142 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que ATCC51142 cce_0778 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal, hexadecanal y octadecenal en tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehido graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 19. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y Cyan7425 0398 de Cyanothece sp. PCC7425
Se sintetizó el ADN genómico que codifica para Cyan7425_0398 de Cyanothece sp. PCC7425 (YP_002481151; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 29) y se clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 22, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y Cyan7425_0398 de Cyanothece sp. PCC7425 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Cyan7425_0398 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal, hexadecanal y octadecenal en tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehido graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 20. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y Cyan7425 2986 de Cyanothece sp. PCC7425
Se sintetizó el ADN genómico que codifica para Cyan7425_2986 de Cyanothece sp. PCC7425 (YP_002483683; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 31) y se clonó en los sitios Ndel y Xhol del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante con OP80-PCC7942_1594 en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio minimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 23, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PCC7942_1594 de S. elongatus y Cyan7425_2986 de Cyanothece sp. PCC7425 produjeron los mismos aldehidos grasos y alcoholes grasos que en el ejemplo 3, pero también tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno. Este resultado indica que Cyan7425_2986 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal, hexadecanal y octadecenal en tridecano, pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, y por tanto es una aldehido graso descarbonilasa activa.
Ejemplo 21. Producción de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga de PMM0533 de Prochlorococcus marinus CCMP1986 y PMM0532 de Prochlorococcus marinus CCMP1986
Se amplificó el ADN genómico que codifica para PMM0533 de P. marinus CCMP1986 (NP_892651; supuesta enzima generadora de aldehidos) (SEQ lD NO: 71) y PMM0532 de Prochlorococcus marinus CCMP1986
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(NP_892650; supuesta descarbonilasa) (SEQ ID NO: 19) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-80 y en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183, respectivamente. Se transformaron y se contransformaron por separado los constructos resultantes en E. coli MG1655 y se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 24A, las células de E. coli transformadas sólo con el vector que portaba PMM0533 de P. marinus CCMP1986 no produjeron ningún aldehido graso ni alcohol graso. Sin embargo, las células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban PMM0533 y PMM0532 produjeron hexadecanol, pentadecano y heptadeceno (figura 24B). Este resultado indica que PMM0533 sólo proporciona sustratos de aldehidos grasos para la reacción de descarbonilación cuando interacciona con una descarbonilasa, tal como PMM0532.
Ejemplo 22. Producción de alcanos y alquenos en una cepa de E. coli productora de acil graso-CoA a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y AM1 4041 de Acaryochloris marina MBIC11017
Se sintetizó el ADN genómico que codifica para AM1_4041 de Acaryochloris marina MBIC11017 (YP_001518340; supuesta aldehido graso descarbonilasa) (SEQ ID NO: 9) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptre. Se contransformó el constructo resultante con OP80- PCC7942_1594 en E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc‘tesA-fadD. Esta cepa expresa una versión citoplasmática de la tioesterasa de E. coli, ‘TesA, y la acil-CoA sintetasa de E. coli, FadD, bajo el control del promotor Ptrc, y por tanto produce acil graso-CoA. Se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 25, estas células de E. coli cotransformadas con PCC7942_1594 de S. elongatus y AM1_4041 de A. marina MBIC11017 también produjeron alcanos y alcoholes grasos. Este resultado indica que PCC7942_1594 de S. elongatus puede usar acil-CoA como sustrato para producir hexadecenal, hexadecanal y octadecenal, que entonces se convierte en pentadeceno, pentadecano y heptadeceno, respectivamente, mediante AM1_4041 de A. marina MBIC11017.
Ejemplo 23. Producción de alcanos y alquenos en una cepa de E. coli productora de acil graso-CoA a través de la expresión heteróloga de sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803 y sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803
Se sintetizó el ADN genómico que codifica para sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803 (NP_442147; supuesta aldehido graso descarbonilasa) (SEQ ID NO: 3) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se sintetizó el ADN genómico que codifica para sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803 (NP_442146; acil-ACP reductasa) (SEQ ID NO: 67) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformaron los constructos resultantes en E. coli MG1655 AfadE lacZ::Ptrc‘tesA-fadD. Esta cepa expresa una versión citoplasmática de la tioesterasa de E. coli, ‘TesA, y la acil-CoA sintetasa de E. coli, FadD, bajo el control del promotor Ptrc, y por tanto produce acil graso-CoA. Se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG- EM tal como se describe en el ejemplo 26.
Tal como se muestra en la figura 26, estas células de E. coli transformadas con sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803 no produjeron ningún aldehído graso ni alcohol graso. Sin embargo, cuando se cotransformaron con sll0208 y sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803, produjeron alcanos, aldehidos grasos y alcoholes grasos. Este resultado indica que sll0209 de Synechocystis sp. PCC6803 puede usar acil-CoA como sustrato para producir aldehidos grasos tales como tetradecanal, hexadecanal y octadecenal, pero sólo cuando se coexpresa con una aldehido graso descarbonilasa. Los aldehidos grasos aparentemente se reducen adicionalmente para dar los correspondientes alcoholes grasos, tetradecanol, hexadecanol y octadecenol, mediante una actividad aldehido reductasa endógena de E. coli. En este experimento, se convirtió el octadecenal en heptadeceno mediante sll0208 de Synechocystis sp. PCC6803.
Ejemplo 24. Producción de alcanos y alquenos en una cepa de E. coli productora de aldehidos grasos a través de la expresión heteróloga de Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 y varios de sus homólogos
Se amplificó el ADN genómico que codifica para Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838; supuesta aldehido graso descarbonilasa) (SEQ ID NO: 5) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se amplificó el ADN genómico que codifica para el orf MSMEG_5739 de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 (YP_889972, supuesta ácido carboxilico reductasa) (SEQ ID NO: 85) y se clonó en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-180 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformaron los dos constructos resultantes en E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc-'tesA. En esta cepa, se proporcionaron aldehidos grasos por MSMEG_5739, que reduce los ácidos grasos libres (formados mediante la acción de ‘TesA) para dar aldehidos grasos. Se hicieron crecer las células a 37°C en medio minimo M9 complementado con espectinomicina 100 |ig/ml y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
como en el ejemplo 3 y se analizaron mediante CG-EM tal como se describe en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 27, estas células de E. coli cotransformadas con los vectores que portaban Npun02004178 de N. punctiforme PCC73102 y MSMEG_5739 de M. smegmatis cepa MC2 155 produjeron tridecano, pentadeceno y pentadecano. Este resultado indica que Npun02004178 en E. coli convierte tetradecanal, hexadecenal y hexadecanal proporcionados por la ácido carboxílico reductasa MSMEG_5739 en tridecano, pentadeceno y pentadecano. Tal como se muestra en la figura 28, en la misma configuración experimental, las siguientes aldehído graso descarbonilasas también convirtieron aldehídos grasos proporcionados por MSMEG_5739 en los alcanos correspondientes cuando se expresaban en E. coli MG1655 AfadD lacZ::Ptrc-'tesA: alr5283 de Nostoc sp. PCC7210 (SEQ ID NO: 7), PMM0532 de P. marinus CCMP1986 (SEQ ID NO: 19), gll3146 de G. violaceus PCC7421 (SEQ ID NO: 15), RS9917_09941 de Synechococcus sp. (SEQ ID NO: 23), RS9917_12945 de Synechococcus sp. (SEQ ID NO: 25) y AM1_4041 de A. marina MBIC11017 (SEQ ID NO: 9).
Ejemplo 25: Las aldehído graso descarbonilasas de cianobacterias pertenecen a la clase de proteínas de di-hierro no hemo. La mutagénesis dirigida al sitio de histidinas conservadas para dar fenilalaninas en Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 no suprime su función catalítica
Tal como se comenta en el ejemplo 13, la proteína hipotética PMT1231 de Prochlorococcus marinus MIT9313 (SEQ ID NO: 18) es una aldehído graso descarbonilasa activa. Basándose en la estructura tridimensional de PMT1231, que está disponible a una resolución de 1,8 A (pdb2OC5A) (véase la figura 29B), las aldehído graso descarbonilasas de cianobacterias tienen similitud estructural con proteínas de di-hierro no hemo, en particular con las proteínas de subunidad p de ribonucleasa reductasa de clase I, RNRp (Stubbe y Riggs-Gelasco, TIBS 1998, vol. 23., págs. 438) (véase la figura 29A). La RNRp de clase Ia e Ib contiene un radical tirosilo diférrico que media en la actividad catalítica de RNRa (reducción de ribonucleótidos para dar desoxirribonucleótidos). En RNRp de E. coli, esta tirosina está en la posición 122 y en proximidad estrecha a una de las moléculas de hierro del sitio activo. La alineación estructural mostró que PMT1231 contenía una fenilalanina en la misma posición que la tyr122 de RNRp, lo que sugiere un mecanismo catalítico diferente para las aldehído graso descarbonilasas de cianobacterias. Sin embargo, una alineación de todas las descarbonilasas mostró que dos residuos de tirosina estaban completamente conservados en todas las secuencias, tyr135 y tyr138 con respecto a PMT1231, estando tyr135 en proximidad estrecha (5,5 A) a una de las moléculas de hierro del sitio activo (véase la figura 29C). Para examinar si cualquiera de los dos residuos de tirosina conservados está implicado en el mecanismo catalítico de las aldehído graso descarbonilasas de cianobacterias, se reemplazaron estos residuos por fenilalanina en Npun02004178 (tyr123 y tyr126) tal como sigue.
Se clonó el ADN genómico que codifica para el ORF1594 de S. elongatus PCC7942 (SEQ ID NO: 65) en los sitios NcoI y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. También se clonó el ADN genómico que codifica para Npun02004178 de N. punctiforme PCC73102 (SEQ ID NO: 5) en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC177) bajo el control del promotor Ptrc. Se usó este último constructo como molde para introducir una mutación en las posiciones 123 y 126 de la proteína descarbonilasa, cambiando las tirosinas por fenilalaninas usando los cebadores gttttgcgatcgcagcatttaacatttacatccccgttgccgacg y gttttgcgatcgcagcatataacattttcatccccgttgccgacg, respectivamente. Entonces se transformaron los constructos resultantes en E. coli MG1655. Se hicieron crecer las células a 37°C en medio mínimo M9 complementado con glucosa al 1% (p/v) y espectinomicina y carbenicilina 100 |ig/ml. Se cultivaron las células y se extrajeron como en el ejemplo 3.
Tal como se muestra en la figura 30, las dos variantes de proteína Npun02004178 Tyr a Phe eran activas y produjeron alcanos cuando se coexpresaron con el ORF1594 de S. elongatus PCC7942. Este resultado indica que en contraposición a las proteínas RNRp de clase Ia e Ib, el mecanismo catalítico de las aldehído graso descarbonilasas no implica un radical tirosilo.
Ejemplo 26: Caracterización bioquímica de Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102
Se clonó el ADN genómico que codifica para Npun02004178 de N. punctiforme PCC73102 (SEQ ID NO: 5) en los sitios NdeI y XhoI del vector pET-15b bajo el control del promotor de T7. La proteína Npun02004178 resultante contenía una cola de His N-terminal. Se transformó una cepa de E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen) con el plásmido mediante técnicas de transformación química de rutina. Se llevó a cabo la expresión de proteínas inoculando en primer lugar una colonia de la cepa de E. coli en 5 ml de medios LB complementados con 100 mg/l de carbenicilina y se agitó durante la noche a 37°C para producir un cultivo inicial. Estos cultivos iniciales se usaron para inocular 0,5 l de medios LB complementados con 100 mg/l de carbenicilina. Se agitó el cultivo a 37°C hasta que se alcanzó un valor de DO600 de 0,8, y entonces se añadió IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Entonces se agitó el cultivo al 37°C durante aproximadamente 3 h adicionales. Entonces se centrifugó el cultivo a 3.700 rpm durante 20 min a 4°C. Entonces se resuspendió el sedimento en 10 ml de tampón que contenía tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2 complementado con Bacterial ProteaseArrest (GBiosciences). Entonces se sonicaron las células a 12 W en hielo durante 9 s con 1,5 s de sonicación seguido por 1,5 s de descanso. Se repitió este procedimiento 5 veces con intervalos de un min entre cada ciclo de sonicación. Se centrifugó el extracto libre de células a 10.000 rpm durante 30 min a 4°C. Se añadieron 5 ml de Ni-NTA (Qiagen) al sobrenadante y se agitó suavemente la mezcla a 4°C. Se hizo pasar la suspensión sobre una columna eliminando la resina del lisado. Entonces se lavó la resina con
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
30 ml de tampón que contenía tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2 más imidazol 30 mM. Finalmente, se eluyó la proteína con 10 ml de tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2 más imidazol 250 mM. Se dializó la disolución de proteína con 200 volúmenes de tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2 con glicerol al 20%. Se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford (Biorad). Se obtuvieron 5,6 mg/ml de la proteína Npun02004178.
Para sintetizar octadecanal para la reacción de la descarbonilasa, se disolvieron 500 mg de octadecanol (Sigma) en 25 ml de diclorometano. A continuación, se añadieron 200 mg de clorocromato de piridinio (TCI America) a la disolución y se agitó durante la noche. Se secó la mezcla de reacción a vacío para eliminar el diclorometano. Se resuspendieron los productos restantes en hexano y se filtraron a través de papel de filtro Whatman. Entonces se secó el filtrado a vacío y se resuspendió en 5 ml de hexano y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en sílice. Se cargó la mezcla en una columna alimentada por gravedad en hexano y luego se lavó con dos volúmenes de columna de hexano. Entonces se eluyó el octadecanal con una mezcla 8:1 de hexano y acetato de etilo. Se reunieron las fracciones que contenían octadecanal y se analizaron usando los métodos de CG/EM descritos a continuación. El producto final era puro en el 95% tal como se determinó mediante este método.
Para someter a prueba la proteína Npun02004178 para determinar la actividad de descarbonilación, se establecieron los siguientes ensayos enzimáticos. Se establecieron reacciones de 200 |il en tampón fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2 con los siguientes componentes en sus concentraciones finales respectivas: 30 |iM de proteína Npun02004178 purificada, octadecanal 200 |iM, ferredoxina de espinaca 0,11 |ig/ml (Sigma), ferredoxina reductasa de espinaca 0,05 unidades/ml (Sigma) y NADPH 1 mM (Sigma). Los controles negativos incluyeron la reacción anterior sin Npun02004178, la reacción anterior sin octadecanal y la reacción anterior sin ferredoxina de espinaca, ferredoxina reductasa y NADPH. Se incubó cada reacción a 37°C durante 2 h antes de extraerse con 100 |il de acetato de etilo. Se analizaron las muestras mediante CG/EM usando los siguientes parámetros: tiempo de ejecución: 13,13 min; columna: HP-5-EM n.° de parte 19091S-433E (longitud de 30 metros; D.I.: 0,25 mm de calibre estrecho; película: 0,25 |iM); inyección: 1 |il en la entrada de Agilent 6850; entrada: 300°C sin dividir; gas portador: helio; flujo: 1,3 ml/min; temperatura del horno: 75°C mantenidos 5 min, 320 a 40°C/min, 320 mantenidos 2 min; det.: Agilent 5975B VL MSD; temperatura de det.: 330°C; exploración: 50-550 M/Z. Se usó heptadecano de Sigma como referencia auténtica para determinar el patrón de fragmentación y el tiempo de retención del compuesto.
Tal como se muestra en la figura 31, se observó conversión in vitro de octadecanal en heptadecano en presencia de Npun02004178. La descarbonilación enzimática de octadecanal mediante Npun02004178 fue dependiente de la adición de ferredoxina reductasa de espinaca, ferredoxina y NADPH.
A continuación, se determinó si las ferredoxinas y las ferredoxina reductasas de cianobacterias pueden reemplazar a las proteínas de espinaca en el ensayo de aldehído graso descarbonilasa in vitro. Se clonaron los cuatro genes siguientes por separado en los sitios Ndel y Xhol de pET-15b: Npun02003626 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00109192, petH de ferredoxina oxidorreductasa sin el dominio de ligador de aloficocianina N-terminal) (SEQ ID NO: 87), Npun02001001 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00111633, ferredoxina 1) (SEQ ID NO: 89), Npun02003530 de N. punctiforme PCC73102 (ZP_00109422, ferredoxina 2) (SEQ ID NO: 91) y Npun02003123 de
N. punctiforme PCC73102 (ZP_00109501, ferredoxina 3) (SEQ ID NO: 93). Se expresaron las cuatro proteínas y se purificaron tal como se describió anteriormente. Se obtuvieron 1 mg/ml de cada ferredoxina y 4 mg/ml de la ferredoxina oxidorreductasa. Se sometieron a prueba las tres ferredoxinas de cianobacterias con la ferredoxina oxidorreductasa de cianobacterias usando la configuración enzimática descrita anteriormente con los siguientes cambios. La concentración final de la ferredoxina reductasa era de 60 |ig/ml y las ferredoxinas estaban a 50 |ig/ml. Las reacciones enzimáticas se extrajeron con CG/EM usando los siguientes parámetros: tiempo de ejecución: 6,33 min; columna: J&W 122-5711 DB-5ht (longitud de 15 metros; D.I.: 0,25 mm de calibre estrecho, película:
O, 10 |iM); inyección: 1 |il en la entrada de Agilent 6850; entrada: 300°C sin dividir; gas portador: helio; flujo: 1,3 ml/min; temperatura del horno: 100°C mantenidos 0,5 min, 260 a 30°C/min, 260 mantenidos 0,5 min; det: Agilent 5975B VL MSD; temperatura de det.: 230°C; exploración: 50-550 M/Z.
Tal como se muestra en la figura 32, se observó la conversión in vitro dependiente de Npun02004178 de octadecanal en heptadecano en presencia de NADPH y la ferredoxina oxidorreductasa de cianobacterias y cualquiera de las tres ferredoxinas de cianobacterias.
Ejemplo 27. Caracterización bioquímica de orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942
Se clonó el ADN genómico que codifica para el orf1594 de S. elongatus PCC7492 (SEQ ID NO: 65) en los sitios NcoI y XhoI del vector pET-28b bajo el control del promotor de T7. La proteína PCC7942_orf1594 resultante contenía una cola de His C-terminal. Se transformó una cepa de E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen) con el plásmido y se expresó la proteína PCC7942_orf1594 y se purificó tal como se describe en el ejemplo 22. Se almacenó la disolución de proteína en el siguiente tampón: fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, THP 1 mM, glicerol al 10%. Se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford (Biorad). Se obtuvieron 2 mg/ml de la proteína PCC7942_orf1594.
Para someter a prueba la proteína PCC7942_orf1594 para determinar la actividad acil-ACP o acil-CoA reductasa, se establecieron los siguientes ensayos enzimáticos. Se establecieron reacciones de 100 |il en tampón Tris-HCl 50 mM
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
a pH 7,5 con los siguientes componentes en sus concentraciones finales respectivas: 10 |iM de proteína PCC7942_orf1594 purificada, acil-CoA o acil-ACP 0,01-1 mM, MgCh 2 mM, NADPH 0,2-2 mM. Se incubaron las reacciones durante 1 h a 37°C y se detuvieron añadiendo 100 |il de acetato de etilo (que contenía 1-octadeceno 5 mg/l como patrón interno). Se agitaron con vórtex las muestras durante 15 min y se centrifugaron a la velocidad máxima durante 3 min para la separación de fases. Se transfirieron 80 |il de la capa superior a viales de vidrio para CG y se analizaron mediante cG/EM tal como se describe en el ejemplo 26. Se calculó la cantidad de aldehido formada basándose en el patrón interno.
Tal como se muestra en la figura 33, PCC7942_orf1594 pudo reducir octadecanoil-CoA para dar octadecanal. La actividad reductasa requirió cationes divalentes tales como Mg2+, Mn2+ o Fe2+ y NADPH como donador de electrones. El NADH no soportó la actividad reductasa. PCC7942_orf1594 también pudo reducir octadecenoil-CoA y octadecenoil-ACP para dar octadecenal. Se determinaron los valores de Km para la reducción de octadecanoil-CoA, octadecenoil-CoA y octadecenoil-ACP en presencia de NADPH 2 mM como 45 ± 20 |iM, 82 ± 22 |iM y 7,8 ± 2 |iM, respectivamente. Estos resultados demuestran que PCC7942_orf1594, in vitro, reduce tanto acil-CoA como acil-ACP y que la enzima tiene aparentemente una afinidad superior por acil-ACP en comparación con acil-CoA. Se determinó el valor de Km para NADPH en presencia de octadecanoil-CoA 0,5 mM para PCC7942_orf1594 como 400 ± 80 |iM.
A continuación, se examinó la transferencia de hidruro estereoespecífica desde el NADPH hasta un aldehido graso catalizada por PCC7942_orf1594. Se preparó deutero-NADPH según el siguiente protocolo. Se añadieron 5 mg de NADP+ y 3,6 mg de D-glucosa-1-d a 2,5 ml de tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0). Se inició la producción enzimática de NADPH marcado mediante la adición de 5 unidades de glucosa deshidrogenasa de o bien Bacillus megaterium (USB Corporation) para la producción de R-(4-2H)NADPH o bien Thermoplasma acidophilum (Sigma) para la producción de S-(4-2H)NADPH. Se incubó la reacción durante 15 min a 37°C, se filtró en centrífuga usando un filtro de centrífuga Amicon Ultra de 10 KDa de punto de corte de peso molecular (Millipore), se sometió a congelación ultrarrápida en hielo seco y se almacenó a -80°C.
La reacción de ensayo in vitro contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), 10 |iM de proteína PCC7942_orf1594 purificada, octadecanoil-CoA 1 mM, MgCh 2 mM y 50 |il de deutero-NADPH (preparado tal como se describió anteriormente) en un volumen total de 100 |il. Tras una incubación de 1 h, se extrajo el producto de la reacción enzimática y se analizó tal como se describió anteriormente. El aldehído graso resultante detectado mediante CG/EM era octadecanal (véase la figura 34). Puesto que la transferencia de hidruro desde el NADPH es estereoespecífica, se sintetizaron tanto R-(4-H)NAdPh como S-(4-2H)NADPH. Se observó octadecanal con una masa unitaria de más uno usando sólo el S-(4-2H)NADPH. El hecho de que el aldehído graso estuviera marcado indica que el hidrógeno deuterado se ha transferido desde el NADPH marcado hasta el aldehído graso marcado. Esto demuestra que se usa NADPH en esta reacción enzimática y que la transferencia de hidruro catalizada por PCC7942_orf1594 es estereoespecífica.
Ejemplo 28. Producción intracelular y extracelular de aldehídos grasos y alcoholes grasos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942
Se amplificó el ADN genómico que codifica para orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 (YP_400611; acil- ACP reductasa) (SEQ ID NO: 65) y se clonó en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se contransformó el constructo resultante en E. coli MG1655 AfadE y se hicieron crecer las células a 37°C en 15 ml de medios mínimos Che-9 con glucosa al 3% (p/v) como fuente de carbono y complementados con carbenicilina y espectinomicina 100 |ig/ml, respectivamente. Cuando el cultivo alcanzó una DO600 de 0,8-1,0, se indujo con IPTG 1 mM y se hicieron crecer las células durante 24-48 h adicionales a 37°C. El medio mínimo Che-9 se define como: Na2HPo4 6 g/l, KH2PO4 3 g/l, NaCl 0,5 g/l, NH4Cl 2 g/l, MgSO4 0,25 g/l x 7 H2O, CaCl2 11 mg/l, FeaCl 27 mg/l x 6 H2O, ZnCl 2 mg/l x 4 H2O, Na2MoO4 2 mg/l x 2 H2O, CuSO4 1,9 mg/l x 5 H2O, H3BO3 0,5 mg/l, tiamina 1 mg/l, Bis-Tris 200 mM (pH 7,25) y Triton-X100 al 0,1% (v/v). Cuando el cultivo alcanzó una DO600 de 1,0-1,2, se indujo con IPTG 1 mM y se permitió que las células crecieran durante 40 h adicionales a 37°C. Se extrajeron las células de 0,5 ml de cultivo con 0,5 ml de acetato de etilo para determinar la producción de hidrocarburos total tal como se describe en el ejemplo 26. Adicionalmente, se separaron las células y el sobrenadante mediante centrifugación (4.000 g a TA durante 10 min) y se extrajeron por separado.
El cultivo produjo aldehídos grasos 620 mg/l (tetradecanal, heptadecenal, heptadecanal y octadecenal) y alcoholes grasos 1670 mg/l (dodecanol, tetradecenol, tetradecanol, heptadecenol, heptadecanol y octadecenol). La figura 35 muestra el cromatograma del sobrenadante extraído. Se determinó que el 73% de los aldehídos grasos y los alcoholes grasos estaban en el sobrenadante libre de células.
Ejemplo 29. Producción intracelular y extracelular de alcanos y alquenos en E. coli a través de la expresión heteróloga del orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 y Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102
Se amplificó el ADN genómico que codifica para orf1594 de Synechococcus elongatus PCC7942 (YP_400611; acil- ACP reductasa) (SEQ ID NO: 65) y se clonó en los sitios Ncol y EcoRI del vector OP-80 (derivado de pCL1920) bajo el control del promotor Ptrc. Se amplificó el ADN genómico que codifica para Npun02004178 de Nostoc punctiforme PCC73102 (ZP_00108838; aldehído graso descarbonilasa) (SEQ ID NO: 5) y se clonó en los sitios NdeI y XhoI del vector OP-183 (derivado de pACYC) bajo el control del promotor Ptrc. Se cotransformaron los constructos resultantes en E. coli MG1655 AfadE y se hicieron crecer las células a 37°C en 15 ml de medios mínimos Che9 con glucosa al

Claims (14)

  1. 5
    10
  2. 2.
    15
  3. 3.
    20
  4. 4.
  5. 5.
    25 6.
  6. 7.
    30
  7. 8.
  8. 9.
    35
    40
    Método de producción de un alcano o alqueno a partir de una célula huésped modificada genéticamente, comprendiendo el método:
    (a) transformar una célula huésped para que exprese introduciendo
    (i) un polinucleótido de biosíntesis de aldehídos que codifica para un polipéptido de biosíntesis de aldehídos, y
    (ii) un polinucleótido de biosíntesis de alcanos o alquenos que codifica para un polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos; y
    (b) cultivar dicha célula huésped modificada genéticamente en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para producir un alcano o alqueno en el medio de cultivo,
    en el que dicho polipéptido de biosíntesis de aldehídos tiene actividad acil-ACP reductasa y procede de una cianobacteria, y en el que dicho polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.
    Método según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos comprende la secuencia de aminoácidos de
    (i) SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39, o
    (ii) SEQ ID NO: 40 y una cualquiera de (a) SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39, o
    (iii) SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44.
    Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula de levadura, célula de hongo, célula de hongos filamentosos, célula de algas y célula bacteriana.
    Método según la reivindicación 3, en el que la célula huésped es una célula de E. coli, preferiblemente una célula de E. coli de cepa B, una de cepa C, una de cepa K o una de cepa W.
    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el alcano o alqueno se secreta por la célula huésped.
    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el alcano o alqueno es un alcano o alqueno C13-C21.
    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el alcano o alqueno se selecciona del grupo que consiste en tridecano, metiltridecano, nonadecano, metilnonadecano, heptadecano, metilheptadecano, pentadecano, metilpentadecano, pentadeceno, heptadeceno, metilpentadeceno y metilheptadeceno.
    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además cultivar la célula huésped en presencia de al menos un sustrato biológico para el polipéptido o para un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos.
    Cultivo celular que comprende una célula huésped modificada genéticamente, en el que
    (a) un polinucleótido de biosíntesis de aldehídos que codifica para un polipéptido de biosíntesis de aldehídos; y
    (b) un polinucleótido de biosíntesis de alcanos o alquenos que codifica para un polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos
    se incorporan y se sobreexpresan en dicha célula huésped modificada genéticamente y se produce un alcano o alqueno en el cultivo celular cuando dicha célula huésped modificada genéticamente se cultiva en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar dicho polipéptido de biosíntesis de aldehídos y dicho polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos,
    en el que dicho polipéptido de biosíntesis de aldehídos tiene actividad acil-ACP reductasa y procede de una cianobacteria, y en el que dicho polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.
    Cultivo celular según la reivindicación 9, en el que dicho polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos comprende la secuencia de aminoácidos de
    5
    10
    15
    20
    25
    (i) SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39, o
    (ii) SEQ ID NO: 40 y una cualquiera de (a) SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39, o
    (iii) SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44.
  9. 11. Cultivo celular según la reivindicación 9 ó 10, en el que la célula huésped modificada genéticamente se selecciona del grupo que consiste en una célula de levadura, célula de hongo, célula de hongos filamentosos, célula de algas y célula bacteriana.
  10. 12. Cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el alcano o alqueno es un alcano o alqueno C13-C21.
  11. 13. Cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el alcano o alqueno se selecciona del grupo que consiste en tridecano, metiltridecano, nonadecano, metilnonadecano, heptadecano, metilheptadecano, pentadecano, metilpentadecano, pentadeceno, heptadeceno, metilpentadeceno y metilheptadeceno.
  12. 14. Cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende un alcano o alqueno que tiene un 813C de aproximadamente -15,4 o mayor.
  13. 15. Cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, que comprende un alcano o alqueno que tiene una fM 14C de al menos aproximadamente 1,003.
  14. 16. Célula huésped modificada genéticamente, en la que
    (a) un polinucleótido de biosíntesis de aldehídos que codifica para un polipéptido de biosíntesis de aldehídos; y
    (b) un polinucleótido de biosíntesis de alcanos o alquenos que codifica para un polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos
    se incorporan en dicha célula huésped modificada genéticamente y se produce un alcano o alqueno en la célula cuando dicha célula huésped modificada genéticamente se cultiva en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar dicho polipéptido de biosíntesis de aldehídos y dicho polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos,
    en la que dicho polipéptido de biosíntesis de aldehídos tiene actividad acil-ACP reductasa y procede de una cianobacteria, y en la que dicho polipéptido de biosíntesis de alcanos o alquenos tiene actividad descarbonilasa y procede de una cianobacteria.
ES09747776.4T 2008-05-16 2009-05-18 Métodos y composiciones para producir hidrocarburos Active ES2667469T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5395508P 2008-05-16 2008-05-16
US53955P 2008-05-16
PCT/US2009/044403 WO2009140695A1 (en) 2008-05-16 2009-05-18 Methods and compositions for producing hydrocarbons

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2667469T3 true ES2667469T3 (es) 2018-05-11

Family

ID=41056736

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15153942T Active ES2696773T3 (es) 2008-05-16 2009-05-18 Métodos y composiciones para producir ácidos grasos y alcoholes grasos
ES09747777.2T Active ES2536194T3 (es) 2008-05-16 2009-05-18 Métodos y composiciones para producir hidrocarburos
ES09747776.4T Active ES2667469T3 (es) 2008-05-16 2009-05-18 Métodos y composiciones para producir hidrocarburos
ES15179791.7T Active ES2667718T3 (es) 2008-05-16 2009-05-18 Métodos y composiciones para producir hidrocarburos

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15153942T Active ES2696773T3 (es) 2008-05-16 2009-05-18 Métodos y composiciones para producir ácidos grasos y alcoholes grasos
ES09747777.2T Active ES2536194T3 (es) 2008-05-16 2009-05-18 Métodos y composiciones para producir hidrocarburos

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15179791.7T Active ES2667718T3 (es) 2008-05-16 2009-05-18 Métodos y composiciones para producir hidrocarburos

Country Status (11)

Country Link
US (11) US8268599B2 (es)
EP (5) EP2288694B1 (es)
JP (2) JP2011520455A (es)
KR (2) KR101735549B1 (es)
CN (5) CN102027109B (es)
AU (2) AU2009246082A1 (es)
BR (2) BR122020013701B1 (es)
CA (3) CA2722441C (es)
ES (4) ES2696773T3 (es)
MX (3) MX350285B (es)
WO (2) WO2009140695A1 (es)

Families Citing this family (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8110670B2 (en) * 2006-05-19 2012-02-07 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
US20100242345A1 (en) 2006-05-19 2010-09-30 LS9, Inc Production of fatty acids & derivatives thereof
CA3081506A1 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Genomatica, Inc. Long chain alcohol-producing organisms
WO2009140695A1 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing hydrocarbons
US20110146142A1 (en) * 2008-08-18 2011-06-23 Ls9, Inc. Systems and methods for production of mixed fatty esters
JP2012504963A (ja) * 2008-10-07 2012-03-01 エルエス９・インコーポレイテッド 脂肪アルデヒドを生産するための方法および組成物
ES2701501T3 (es) 2008-10-28 2019-02-22 Reg Life Sciences Llc Célula microbiana para producir alcoholes grasos
WO2013082309A1 (en) * 2011-11-29 2013-06-06 Kiverdi, Inc. Process for growing natural or engineered high lipid accumulating strain on crude glycerol and/or other sources of waste carbon for the production of oils, fuels, oleochemicals, and other valuable organic compounds
US9879290B2 (en) * 2008-11-06 2018-01-30 Kiverdi, Inc. Industrial fatty acid engineering general system for modifying fatty acids
US20150017694A1 (en) * 2008-11-06 2015-01-15 Kiverdi, Inc. Engineered CO2-Fixing Chemotrophic Microorganisms Producing Carbon-Based Products and Methods of Using the Same
US9957534B2 (en) * 2008-11-06 2018-05-01 Kiverdi, Inc. Engineered CO2-fixing chemotrophic microorganisms producing carbon-based products and methods of using the same
US9175234B2 (en) 2008-12-23 2015-11-03 REG Life Sciences, LLC Methods and compositions related to thioesterase enzymes
WO2010118409A1 (en) * 2009-04-10 2010-10-14 Ls9, Inc. Production of commercial biodiesel from genetically modified microorganisms
CN111808892A (zh) 2009-04-27 2020-10-23 基因组股份公司 脂肪酸酯的产生
CN102471781B (zh) 2009-06-30 2015-03-18 科德克希思公司 以脂肪醇形成酰基CoA还原酶(FAR)产生脂肪醇
AU2011204785B2 (en) * 2009-07-09 2013-08-15 Joule Unlimited Technologies, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of N-alkanes
US7794969B1 (en) * 2009-07-09 2010-09-14 Joule Unlimited, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of n-alkanes
US7955820B1 (en) 2009-07-09 2011-06-07 Joule Unlimited, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of n-alkanes
AU2012200694B2 (en) * 2009-07-09 2012-11-01 Joule Unlimited Technologies, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of N-alkanes
US20110162259A1 (en) * 2009-09-25 2011-07-07 Ls9, Inc. Production of fatty acid derivatives
GB2473755B (en) 2009-09-27 2011-09-07 Opx Biotechnologies Inc Method for producing 3-hydroxypropionic acid and other products
US20110124071A1 (en) * 2009-11-17 2011-05-26 LS9, Inc Methods and compositions for producing hydrocarbons
US9217161B2 (en) 2009-12-04 2015-12-22 Richard Allen Kohn Process for producing fermentation products and fermentation medium compositions therefor
US8530221B2 (en) 2010-01-14 2013-09-10 Ls9, Inc. Production of branched chain fatty acids and derivatives thereof in recombinant microbial cells
US8859259B2 (en) 2010-02-14 2014-10-14 Ls9, Inc. Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols
AR084377A1 (es) * 2010-04-08 2013-05-15 Ls9 Inc Metodos y composiciones relacionados con enzimas de alcohol graso biosintetico
KR101334981B1 (ko) 2010-06-10 2013-12-02 한국과학기술원 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 탄화수소의 제조방법
BR112012033361A2 (pt) 2010-06-28 2020-10-20 Codexis, Inc. acul-redutases formadoras de álcoois graxos (fars) e seus modos de uso.
WO2012037285A2 (en) * 2010-09-14 2012-03-22 Joule Unlimited Technologies, Inc. Methods and compositions for targeting heterologous integral membrane proteins to the cyanobacterial plasma membrane
US8372610B2 (en) 2010-09-15 2013-02-12 Ls9, Inc. Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells
EP2655605A1 (en) * 2010-12-20 2013-10-30 Matrix Genetics, LLC Modified photosynthetic microorganisms for producing lipids
US20130035513A1 (en) * 2011-01-26 2013-02-07 Ls9, Inc. Methods and compositions for enhanced production of fatty aldehydes and fatty alcohols
CA2827658A1 (en) * 2011-02-17 2012-08-23 The Procter & Gamble Company Bio-based linear alkylphenyl sulfonates
EP2678410B1 (en) 2011-02-17 2017-09-13 The Procter and Gamble Company Composiitons comprising mixtures of c10-c13 alkylphenyl sulfonates
KR20140010126A (ko) 2011-03-03 2014-01-23 터서스 파마수티칼 엘엘씨 C16:1n7-팔미톨리에이트를 포함하는 조성물들 및 방법들
US9029124B2 (en) 2011-03-23 2015-05-12 Joule Unlimited Technologies, Inc. Photoalkanogens with increased productivity
US9040264B2 (en) 2011-03-31 2015-05-26 Exxonmobil Research And Engineering Company Recombinant cyanobacterium expressing a transcription factor domain protein
CN105969813A (zh) 2011-06-17 2016-09-28 英威达技术有限责任公司 使用水解酶来增加废物流中的单体含量
AU2012272856A1 (en) 2011-06-22 2013-05-02 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto
BR112013033672A2 (pt) 2011-06-30 2017-03-14 Invista Tech Sarl método para converter um composto, cultura substancialmente pura de células hospedeiras e cèlula isolada
DE102011110946A1 (de) 2011-08-15 2016-01-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von omegafunktionalisierten Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern aus einfachen Kohlenstoffquellen
DE102011110945A1 (de) 2011-08-15 2013-02-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von organischen Verbindungen mit alkIL-Genprodukt
BR112014003546A2 (pt) * 2011-08-15 2017-03-14 Toyota Motor Co Ltd método para a produção de alcano e micro-organismo recombinante capazes de sintetizar alcano
CN102952818B (zh) 2011-08-26 2016-03-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 用于在蓝细菌中提高脂肪醇产量的构建体和方法
US20140370563A1 (en) * 2011-08-26 2014-12-18 Brookhaven Science Associates, Llc Compositions and methods for the relief of inhibition of aldehyde decarbonylase
US8921090B2 (en) 2011-09-27 2014-12-30 Exxonmobil Research And Engineering Company Acyl-ACP wax ester synthases
WO2013063513A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 The Regents Of The University Of California Bacterial production of methyl ketones
US9102958B2 (en) 2011-12-16 2015-08-11 Invista North America S.á.r.l. Methods of producing 6-carbon chemicals via CoA-dependent carbon chain elongation associated with carbon storage
US9102960B2 (en) 2011-12-16 2015-08-11 Invista North America S.á.r.l. Methods of producing 6-carbon chemicals via CoA-dependent carbon chain elongation associated with carbon storage
CN103194418B (zh) * 2012-01-04 2014-09-03 武汉臻智生物科技有限公司 一种制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法
US20130224818A1 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Shell Oil Company Method for preparing a hydrocarbon
US9096834B2 (en) 2012-02-24 2015-08-04 Exxonmobil Research And Engineering Company Recombinant microorganisms comprising thioesterase and lysophosphatidic acid acyltransferase genes for fatty acid production
ES2795842T3 (es) 2012-02-24 2020-11-24 Exxonmobil Res & Eng Co Producción mejorada de ácidos grasos y derivados de ácidos grasos por microorganismos recombinantes
US9663799B2 (en) 2012-02-27 2017-05-30 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Hydrocarbon synthase gene and use thereof
EP3674400A1 (en) 2012-04-02 2020-07-01 Genomatica, Inc. Improved production of fatty acid derivatives
US9163267B2 (en) 2012-04-11 2015-10-20 REG Life Sciences, LLC Metathesis transformations of microbially-produced fatty acids and fatty acid derivatives
US9181568B2 (en) 2012-04-23 2015-11-10 Exxonmobil Research And Engineering Company Cell systems and methods for improving fatty acid synthesis by expression of dehydrogenases
DE102012207921A1 (de) 2012-05-11 2013-11-14 Evonik Industries Ag Mehrstufiges Syntheseverfahren mit Synthesegas
JP6291482B2 (ja) 2012-05-17 2018-03-14 シエル・インターナシヨネイル・リサーチ・マーチヤツピイ・ベー・ウイＳｈｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍａａｔｓｃｈａｐｐｉｊ Ｂｅｓｌｏｔｅｎ Ｖｅｎｎｏｏｔｓｈａｐ バイオマス材料を処理する方法およびシステム
CA2873298C (en) 2012-05-17 2016-04-26 Corey William RADTKE Process for producing volatile organic compounds from biomass material
KR20150036502A (ko) * 2012-07-13 2015-04-07 칼리스타, 인코포레이티드 바이오리파이너리 시스템, 이의 방법 및 조성물
CN109182238A (zh) 2012-08-10 2019-01-11 嘉吉有限公司 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
AU2013342143B2 (en) 2012-11-09 2017-08-10 Calysta, Inc. Compositions and methods for biological production of fatty acid derivatives
KR20150094741A (ko) 2012-12-12 2015-08-19 알이지 라이프 사이언시스, 엘엘씨 지방산 유도체의 ａｃｐ­매개 생성
BR112015013413A2 (pt) 2012-12-14 2017-11-14 Invista Tech Sarl método para biosintetizar um produto e hospedeiro recombinante
CN105026570A (zh) 2012-12-31 2015-11-04 英威达技术有限责任公司 通过氧化裂解从长链脂肪酸生产7-碳化学物的方法
CN105408487A (zh) 2012-12-31 2016-03-16 英威达技术有限责任公司 通过甲酯保护的碳链延伸生产7碳化学物的方法
EP2938731A2 (en) 2012-12-31 2015-11-04 Invista Technologies S.A R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via carbon chain elongation associated with cyclohexane carboxylate synthesis
CN105073214A (zh) 2012-12-31 2015-11-18 英威达技术有限责任公司 通过甲酯保护的碳链延伸生产6碳化学物的方法
WO2014105797A2 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via pyruvate and succinate semialdehyde aldol condensation
CN105008543A (zh) 2012-12-31 2015-10-28 英威达技术有限责任公司 通过芳香族化合物生产7-碳化学物的方法
WO2014105790A2 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via c1 carbon chain elongation associated with coenzyme b synthesis
AU2014207522B2 (en) 2013-01-16 2016-12-15 Genomatica, Inc. Acyl-ACP reductase with improved properties
US9034629B2 (en) 2013-01-25 2015-05-19 Joule Unlimited Technologies, Inc. Recombinant synthesis of medium chain-length alkanes
EP2964598B1 (en) * 2013-03-07 2020-08-26 Genomatica, Inc. Downstream processing of fatty alcohol compositions produced by recombinant host cells
US9267158B2 (en) 2013-03-14 2016-02-23 Intrexon Corporation Biological production of multi-carbon compounds from methane
WO2014146026A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Bioproduction of chemicals
EP2984490B1 (en) * 2013-06-14 2020-05-20 Genomatica, Inc. Methods of producing omega-hydroxylated fatty acid derivatives
WO2015010103A2 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Opx Biotechnologies, Inc. Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
MX357722B (es) 2013-08-19 2018-07-20 Reg Life Sciences Llc Produccion de glicerol proveniente de residuos parcialmente refinados.
US9469586B2 (en) 2013-08-19 2016-10-18 REG Life Sciences, LLC Production of partially refined waste glycerol
CN113493759A (zh) 2013-09-13 2021-10-12 基因组股份公司 改进的乙酰-coa羧化酶变体
ES2932529T3 (es) 2013-12-05 2023-01-20 Genomatica Inc Producción microbiana de aminas grasas
MX2016013240A (es) 2014-04-10 2017-05-03 Reg Life Sciences Llc Rutas semi-sinteticas para compuestos organicos.
US9745607B2 (en) 2014-05-15 2017-08-29 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 6-carbon chemicals using 2,6-diaminopimelate as precursor to 2-aminopimelate
JP6034332B2 (ja) 2014-05-30 2016-11-30 トヨタ自動車株式会社 組換え微生物及び当該組換え微生物を用いた物質製造方法
JP6189793B2 (ja) * 2014-05-30 2017-08-30 トヨタ自動車株式会社 組換え微生物及び当該組換え微生物を用いた物質製造方法
WO2015191434A2 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Stepan Company Detergents for cold-water cleaning
BR112016029382A2 (pt) 2014-06-16 2017-10-17 Invista Tech Sarl processo para a produção de glutarato e éster metílico de ácido glutárico
EP3155107A1 (en) 2014-06-16 2017-04-19 Invista Technologies S.à.r.l. Methods, reagents and cells for biosynthesizing compounds
BR112016029394A2 (pt) 2014-06-16 2017-10-17 Invista Tech Sarl métodos, reagentes e células para biossintetizar composto
EP3155108A1 (en) 2014-06-16 2017-04-19 Invista Technologies S.à.r.l. Methods, reagents and cells for biosynthesizing compounds
WO2015195697A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 REG Life Sciences, LLC Omega-hydroxylase-related fusion polypeptides with improved properties
US10676763B2 (en) 2014-07-18 2020-06-09 Genomatica, Inc. Microbial production of fatty diols
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
EP3376859B1 (en) 2015-11-18 2021-01-06 Provivi, Inc. Microorganisms for the production of insect pheromones and related compounds
WO2017101987A1 (en) 2015-12-15 2017-06-22 REG Life Sciences, LLC Omega-hydroxylase-related fusion polypeptide variants with improved properties
CN109890832B (zh) 2016-06-06 2022-08-12 普罗维维股份有限公司 脂肪醇和脂肪醛的半生物合成产生
MX2019002913A (es) 2016-09-14 2019-10-15 Reg Life Sciences Llc Compuestos de 1,3-dioles grasos y sus derivados.
JP6607204B2 (ja) * 2017-01-17 2019-11-20 トヨタ自動車株式会社 アルカン合成能を有する組換え微生物及びアルカンの製造方法
CN110494566A (zh) 2017-02-02 2019-11-22 嘉吉公司 产生c6-c10脂肪酸衍生物的经遗传修饰的细胞
JP2018143192A (ja) * 2017-03-08 2018-09-20 花王株式会社 脂肪族アルコールの生産方法
US11339384B2 (en) 2017-04-03 2022-05-24 Genomatica, Inc. Thioesterase variants having improved activity for the production of medium-chain fatty acid derivatives
MX2019013671A (es) 2017-05-17 2020-01-15 Provivi Inc Microorganismos para la produccion de feromonas de insectos y compuestos relacionados.
CN109207415B (zh) 2017-07-07 2022-09-16 苏州华赛生物工程技术有限公司 一种生产胞二磷胆碱的重组微生物及生产胞二磷胆碱的方法
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
JP2020080705A (ja) * 2018-11-22 2020-06-04 トヨタ自動車株式会社 変異型デカルボニラーゼ遺伝子、当該変異型デカルボニラーゼ遺伝子を有する組換え微生物及びアルカンの製造方法
CN109486835B (zh) * 2018-12-05 2022-02-11 中国科学院合肥物质科学研究院 一种源于蓝藻的产烷烃关键基因突变子及其应用
JP7131416B2 (ja) 2019-02-01 2022-09-06 トヨタ自動車株式会社 変異型デカルボニラーゼ遺伝子、当該変異型デカルボニラーゼ遺伝子を有する組換え微生物及びアルカンの製造方法
JP2020141560A (ja) 2019-03-04 2020-09-10 トヨタ自動車株式会社 新規アルデヒド合成酵素遺伝子、当該遺伝子を有する組換え微生物及びこれを用いたアルカンの製造方法
WO2023178193A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Genomatica, Inc. Acyl-acp thioesterase variants and uses thereof

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3149170A1 (de) 1980-12-15 1982-07-29 Institut Français du Pétrole, 92502 Rueil-Malmaison, Hauts-de-Seine Brennbare komposition, welche gasoel, methanol und einen fettsaeureester enthalten und als dieseltreibstoff brauchbar sind
US5000000A (en) 1988-08-31 1991-03-19 University Of Florida Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes
US5482846A (en) 1988-08-31 1996-01-09 University Of Florida Ethanol production in Gram-positive microbes
US5424202A (en) 1988-08-31 1995-06-13 The University Of Florida Ethanol production by recombinant hosts
US5028539A (en) 1988-08-31 1991-07-02 The University Of Florida Ethanol production using engineered mutant E. coli
US7053267B2 (en) 1990-03-16 2006-05-30 Calgene Llc Plant seed oils
EP0528881A4 (en) 1990-04-24 1993-05-26 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
DK0563191T4 (da) 1990-12-20 2000-07-17 Du Pont Nucleotidsekvenser af sojabønne-acyl-ACP-thioesterase-gener
CA2079113A1 (en) * 1991-02-22 1992-08-23 Calgene, Inc. Seed plant fatty acyl reductase proteins and genes
AU6859394A (en) 1993-05-25 1994-12-20 Auckland Uniservices Limited Nitrobenzyl mustard quaternary salts and their use as hypoxia-selective cytotoxic agents
US6583266B1 (en) 1993-08-19 2003-06-24 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to mycobacterium tuberculosis and leprae for diagnostics and therapeutics
US5807893A (en) 1993-11-18 1998-09-15 Voelker; Toni Alois Plant thioesterases and use for modification of fatty acid composition in plant seed oils
US5602030A (en) 1994-03-28 1997-02-11 University Of Florida Research Foundation Recombinant glucose uptake system
US6428767B1 (en) 1995-05-12 2002-08-06 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for identifying the source of carbon in 1,3-propanediol
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US20080178519A1 (en) 1996-11-18 2008-07-31 Bp Oil International Limited Fuel composition
DE69834246T2 (de) 1997-06-05 2007-02-01 Calgene Llc, Davis Fett acyl-coa: fettalkohol o-acyltransferasen
RU2212447C2 (ru) 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
AU2002236464B2 (en) * 2000-11-17 2005-09-15 Metabolix, Inc Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates from fatty acid biosynthetic pathways
US7538206B2 (en) 2001-02-22 2009-05-26 Institut Pasteur Comparative mycobacterial geneomics as a tool for identifying targets for the diagnosis, prophylaxis or treatment of mycobacterioses
US6686133B2 (en) 2001-03-29 2004-02-03 Agfa-Gevaert Photothermographic materials processable at lower temperatures and recording processes therefor
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
ATE448315T1 (de) 2002-03-01 2009-11-15 Monsanto Technology Llc Wachsestersynthase-dna-sequenz, protein und verwendungen davon
US7056714B2 (en) 2003-03-11 2006-06-06 University Of Iowa Research Foundation, Inc. Carboxylic acid reductase polypeptide, nucleotide sequence encoding same and methods of use
US7070958B2 (en) 2003-04-18 2006-07-04 Thrombolytic Science, Inc. Methods of making pro-urokinase mutants
US7608700B2 (en) 2004-03-08 2009-10-27 North Carolina State University Lactobacillus acidophilus nucleic acid sequences encoding stress-related proteins and uses therefor
CA2554948A1 (en) 2004-03-18 2005-09-22 Sca Hygiene Products Ab Method and device for producing a multi-ply web of flexible material, such as paper and nonwoven, and multi-ply material produced by the method
ES2379368T3 (es) * 2004-05-21 2012-04-25 The Regents Of The University Of California Método para aumentar la producción de compuestos isoprenoides
US7756833B2 (en) * 2004-09-22 2010-07-13 Microsoft Corporation Method and system for synthetic backup and restore
WO2006130529A1 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Pierce Biotechnology, Inc. Extraction of cellular components with fatty acid derivatives
FR2888034B1 (fr) 2005-06-29 2010-10-08 Philippe Magnier Dispositif de prevention contre l'explosion d'un transformateur electrique
MX2008002278A (es) 2005-08-15 2008-04-09 Arizona Chem Acido graso de aceite de bogol bajo en azufre.
US7482480B2 (en) * 2005-10-10 2009-01-27 Council Of Scientific & Industrial Research Process for the preparation of hydrocarbon fuel
US7998339B2 (en) * 2005-12-12 2011-08-16 Neste Oil Oyj Process for producing a hydrocarbon component
KR101090939B1 (ko) * 2005-12-12 2011-12-08 네스테 오일 오와이제이 베이스 오일
US8535916B2 (en) 2006-02-13 2013-09-17 Ls9, Inc. Modified microorganisms and uses therefor
ITTO20060239A1 (it) 2006-03-30 2007-09-30 Rotthapharm S P A Formulazione per somministrazione orale con effetti salutistici sull'apparato cardiovascolare
US20100242345A1 (en) 2006-05-19 2010-09-30 LS9, Inc Production of fatty acids & derivatives thereof
EP2157170B1 (en) * 2006-05-19 2014-01-15 LS9, Inc. Production of fatty acids and derivatives thereof
US8110670B2 (en) 2006-05-19 2012-02-07 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
CN101490241A (zh) * 2006-05-19 2009-07-22 Ls9公司 脂肪酸及其衍生物的制备
US7491854B2 (en) 2006-05-31 2009-02-17 Archer-Daniels-Midland Company Enzymatic method of making aldehydes from fatty acids
DE102006054324A1 (de) 2006-11-17 2008-05-21 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur bildbasierten Vermessung
US8110093B2 (en) 2007-03-14 2012-02-07 Ls9, Inc. Process for producing low molecular weight hydrocarbons from renewable resources
BRPI0809345A2 (pt) * 2007-03-28 2014-10-07 Ls9 Inc Células recombinantes, composições produzidas por estas, métodos para produzir derivados de ácidos graxos em uma célula recombinante, para aumentar a produção de derivados de ácidos graxos em uma célula recombinante, construto recombinante, vetores, métodos para aumentar a produção de derivados de ácidos graxos em uma célula hospedeira de produção, para produzir derivados de ácidos graxos, derivados de ácidos graxos, composições de biocombustível.
US20090061493A1 (en) 2007-06-01 2009-03-05 Solazyme, Inc. Lipid Pathway Modification in Oil-Bearing Microorganisms
US7897369B2 (en) 2007-08-27 2011-03-01 Regents Of The University Of Minnesota Isoprenoid wax ester synthases, isoprenoid acyl CoA-synthetases, and uses thereof
CA2692266C (en) 2007-09-27 2019-04-16 Ls9, Inc. Reduction of the toxic effect of impurities from raw materials by extractive fermentation
TWI351779B (en) 2007-12-03 2011-11-01 Advance Smart Ind Ltd Apparatus and method for correcting residual capac
WO2009085278A1 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing olefins
CA3081506A1 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Genomatica, Inc. Long chain alcohol-producing organisms
WO2009140695A1 (en) * 2008-05-16 2009-11-19 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing hydrocarbons
US8232924B2 (en) 2008-05-23 2012-07-31 Alliant Techsystems Inc. Broadband patch antenna and antenna system
WO2010022090A1 (en) 2008-08-18 2010-02-25 Ls9, Inc. Systems and methods for the production of mixed fatty esters
JP2012504963A (ja) 2008-10-07 2012-03-01 エルエス９・インコーポレイテッド 脂肪アルデヒドを生産するための方法および組成物
ES2701501T3 (es) 2008-10-28 2019-02-22 Reg Life Sciences Llc Célula microbiana para producir alcoholes grasos
US9175234B2 (en) 2008-12-23 2015-11-03 REG Life Sciences, LLC Methods and compositions related to thioesterase enzymes
WO2010118409A1 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Ls9, Inc. Production of commercial biodiesel from genetically modified microorganisms
WO2010118410A1 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Ls9, Inc. Production of fatty acid derivatives
CN111808892A (zh) 2009-04-27 2020-10-23 基因组股份公司 脂肪酸酯的产生
CN102482676A (zh) 2009-05-01 2012-05-30 加州大学评议会 来源于生物质聚合物的脂肪酸脂产物
US7955820B1 (en) * 2009-07-09 2011-06-07 Joule Unlimited, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of n-alkanes
US7794969B1 (en) * 2009-07-09 2010-09-14 Joule Unlimited, Inc. Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of n-alkanes
US20110162259A1 (en) 2009-09-25 2011-07-07 Ls9, Inc. Production of fatty acid derivatives
US20110124071A1 (en) 2009-11-17 2011-05-26 LS9, Inc Methods and compositions for producing hydrocarbons
US8530221B2 (en) 2010-01-14 2013-09-10 Ls9, Inc. Production of branched chain fatty acids and derivatives thereof in recombinant microbial cells
US8859259B2 (en) 2010-02-14 2014-10-14 Ls9, Inc. Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols
US8372610B2 (en) 2010-09-15 2013-02-12 Ls9, Inc. Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells
BR112014007719A2 (pt) 2011-09-30 2017-06-13 Codexis Inc proteases fúngicas

Also Published As

Publication number Publication date
US20180080053A1 (en) 2018-03-22
US10150975B2 (en) 2018-12-11
CN102027109B (zh) 2016-01-06
CA2722441C (en) 2021-01-26
JP2011520455A (ja) 2011-07-21
US8323924B2 (en) 2012-12-04
EP2288694B1 (en) 2018-03-07
CN105483068A (zh) 2016-04-13
BR122020013701B1 (pt) 2021-06-01
WO2009140696A3 (en) 2010-03-25
MX343063B (es) 2016-10-21
CN105112455B (zh) 2016-08-17
US20100221798A1 (en) 2010-09-02
US20190360009A1 (en) 2019-11-28
KR101739511B1 (ko) 2017-05-24
US20210040514A1 (en) 2021-02-11
US8658404B2 (en) 2014-02-25
MX2010012192A (es) 2011-04-26
ES2667718T3 (es) 2018-05-14
KR101735549B1 (ko) 2017-05-16
US20150315617A1 (en) 2015-11-05
US10563231B2 (en) 2020-02-18
US8268599B2 (en) 2012-09-18
JP2011522525A (ja) 2011-08-04
WO2009140695A1 (en) 2009-11-19
ES2696773T3 (es) 2019-01-17
CN105112454A (zh) 2015-12-02
BRPI0912690A2 (pt) 2012-04-17
WO2009140696A2 (en) 2009-11-19
EP2288694A1 (en) 2011-03-02
CA2722442C (en) 2019-02-12
US20170240927A1 (en) 2017-08-24
KR20110019745A (ko) 2011-02-28
US9670512B2 (en) 2017-06-06
WO2009140695A8 (en) 2011-04-07
EP2998393A1 (en) 2016-03-23
CN102027108A (zh) 2011-04-20
AU2009246082A1 (en) 2009-11-19
CA2722441A1 (en) 2009-11-19
CN102027109A (zh) 2011-04-20
MX350285B (es) 2017-09-04
EP2998393B1 (en) 2018-03-07
ES2536194T3 (es) 2015-05-21
CA3101888A1 (en) 2009-11-19
CN105112454B (zh) 2017-01-18
KR20110019744A (ko) 2011-02-28
BRPI0912684A2 (pt) 2019-09-10
EP3483265B1 (en) 2021-07-21
MX2010012197A (es) 2010-12-06
EP3483265A1 (en) 2019-05-15
AU2009246083A1 (en) 2009-11-19
US9481899B2 (en) 2016-11-01
US11186854B2 (en) 2021-11-30
CA2722442A1 (en) 2009-11-19
US20100249470A1 (en) 2010-09-30
US8846371B2 (en) 2014-09-30
US20150044749A1 (en) 2015-02-12
EP2927315B1 (en) 2018-09-19
CN105112455A (zh) 2015-12-02
EP2927315A1 (en) 2015-10-07
US20220259623A1 (en) 2022-08-18
US20120282663A1 (en) 2012-11-08
EP2283121A2 (en) 2011-02-16
EP2283121B1 (en) 2015-02-11
US20130029395A1 (en) 2013-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2667469T3 (es) Métodos y composiciones para producir hidrocarburos
BRPI0912684B1 (pt) Método para produzir um alcano ou alceno, célula hospedeira microbiana recombinante e cultura celular