CN116904346A - 动物双歧杆菌乳亚种hn-3在沙枣果汁发酵中的应用 - Google Patents

动物双歧杆菌乳亚种hn-3在沙枣果汁发酵中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及动物双歧杆菌乳亚种HN‑3在沙枣果汁发酵中的应用。所述动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)HN‑3，于2022年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221023。本发明所述的菌株HN‑3具有较强的抗氧化活性和产酸能力，能够显著提高沙枣果汁中多酚含量；所述菌株HN‑3用于发酵沙枣果汁，使果汁中的多酚的含量升高，并且使抗氧化活性增强；发酵后的沙枣果汁的功能活性物质增多，并且具有宜人的香味，具有广阔的市场前景。

Description

动物双歧杆菌乳亚种HN-3在沙枣果汁发酵中的应用
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及动物双歧杆菌乳亚种HN-3在沙枣果汁发酵中的应用。
背景技术
近几年来使用益生菌发酵果汁的研究越来越多。比如Ya-nan Xu等人，用两歧双歧杆菌，植物乳植杆菌和异鼠李乳杆菌发酵铁皮石斛香蕉果汁，Pasquale Filannino等人用不同的乳酸杆菌种的菌株发酵樱桃汁和西蓝花酱，除此之外还有Ratchadaporn Kaprasob等人用植物乳植杆菌，干酪乳酪杆菌和嗜酸乳杆菌，以单菌分别发酵腰果苹果果汁进行菌株之间比较后，对比不同菌种对果汁发酵的影响研究。通过双歧杆菌发酵之后的果汁可以改善其货架期和安全性，提升营养价值和感官品质以及产生相关活性物质。
沙枣为胡颓子科植物，沙枣果实味道鲜美，略带酸甜，在西北地区的种植面积较为广泛。果实中含有大量的矿物元素、糖类、蛋白质、黄酮、鞣质等营养物质。具有清热解毒、镇静、安神、止泻、健胃等作用。目前沙枣加工食品包括果酱、果丹皮、保健品及饮料，也有利用沙枣磨粉制作挂面、面包，酒、醋、酱油、糖等。沙枣具有很强的开发利用前景，但目前将其制作成食品的例子较少，现阶段主要用作家畜的饲料，利用率极低，造成沙枣这类宝贵资源的极大浪费。所以我们想要促进沙枣的加工应用，充分发挥它的营养价值。
本发明首先筛选获得了一种动物双歧杆菌乳亚种HN-3，所述菌株HN-3在沙枣果汁中稳定生长，而且具有较强的抗氧化活性和产酸能力；其次将所述菌株HN-3用于发酵沙枣果汁，使沙枣果汁中的多酚的含量显著升高，并且获得的沙枣果汁的抗氧化活性显著增强；发酵后的沙枣果汁的功能活性物质增多，并且具有宜人的香味，具有广阔的市场前景。
发明内容
首先，本发明的目的在于提供一种动物双歧杆菌乳亚种HN-3，所述菌株HN-3在沙枣果汁中稳定生长，而且具有较强的抗氧化活性和一定的产酸能力；其次，本发明将所述菌株HN-3用于沙枣果汁的发酵，使沙枣果汁中的多酚的含量升高，抗氧化活性增强，功能活性物质增多，并且具有宜人的香味，具有广阔的市场前景。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lacti s)HN-3，所述动物双歧杆菌乳亚种HN-3于2022年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221023。
第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3具有如下任一所述的用途：
(1)在制备食品中的应用；
(2)在制备食品添加剂中的应用；
(3)在制备食品发酵剂中的应用；
(4)在果汁发酵中的应用。
优选地，所述果汁为沙枣果汁。
第三方面，本发明提供了一种沙枣果汁的制备方法，所述方法为：将沙枣果汁与上述第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3混合发酵。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)制备沙枣果汁；
(2)将步骤(1)制备的沙枣果汁的pH调至中性；
(3)灭菌；
(4)取上述第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3，活化后接种于步骤(3)灭菌后的沙枣果汁中进行发酵。
优选地，所述步骤(1)为：将沙枣去皮去核后粉碎，将沙枣粉与水按照1：4混合，搅拌均匀后，于沸水浴加热5min；过滤，获得沙枣果汁。
优选地，所述步骤(3)为：95℃，灭菌5min。
优选地，所述步骤(4)为：取活化的上述第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3，以2％(v:v)接种于步骤(3)灭菌后的沙枣果汁中，37℃恒温厌氧箱中培养72h，进行发酵。
第四方面，本发明提供了上述第三方面所述方法制备获得的沙枣果汁。
第五方面，本发明提供了上述第四方面所述沙枣果汁在制备食品或食品添加剂中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明经过大量实验筛选，提供了一种能够在沙枣果汁中稳定生长，且具有抗氧化和产酸活性的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)HN-3；
(2)本发明将动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)HN-3与沙枣果汁共同发酵后制备的沙枣果汁的抗氧化性和抗氧化活性物质都显著增加，多酚含量显著提高；并且代谢组学分析的结果表明，代谢上调的物质中还含有很多其他的功能性物质；表明本发明所述的沙枣发酵产品有很好的应用前景；同时在这些物质中大部分的酚类和黄酮类物质均含有抗癌，抗肿瘤，抗高血压，抗糖尿病，抗菌，增强免疫等防御疾病的作用，这表明沙枣发酵果汁在后期可以研发成药用功能型饮料来食用。
(3)综合新疆沙枣种植面积广泛，且加工简单，成本较低等因素，沙枣发酵果汁具有很好的商业价值和市场潜力，其更具有较高的开发价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1 6株双歧杆菌在果汁中的生长情况图，其中B.ad1为青春双歧杆菌HN-1；B.ad2为青春双歧杆菌HN-2；B.lo1为长双歧杆菌HN-1；B.an2为动物双歧杆菌乳亚种HN-2；B.an1为动物双歧杆菌乳亚种HN-1；B.an3为动物双歧杆菌乳亚种HN-3；
图2 6株双歧杆菌发酵果汁pH，其中B.ad1为青春双歧杆菌HN-1；B.ad2为青春双歧杆菌HN-2；B.lo1为长双歧杆菌HN-1；B.an2为动物双歧杆菌乳亚种HN-2；B.an1为动物双歧杆菌乳亚种HN-1；B.an3为动物双歧杆菌乳亚种HN-3；
图3 3株双歧杆菌发酵沙枣果汁72h的总酚含量变化，其中B.ad1为青春双歧杆菌HN-1；B.ad2为青春双歧杆菌HN-2；B.an3为动物双歧杆菌乳亚种HN-3；
图4动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵果汁ABTS自由基清除率图；
图5动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵果汁DPPH自由基清除率图；
图6 60h发酵果汁的多酚含量与抗氧化活性图；
图7动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵果汁的主成分分析图；
图8动物双歧杆菌乳亚种HN-发酵果汁的发泡图；其中，fermented为动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣果汁，control为未发酵沙枣果汁；
图9动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣果汁主要代谢通路。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例所述MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，K2HPO4 2g，葡萄糖20g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4 0.25g，吐温80 1mL，酵母膏2g，琼脂20g，水1000mL，半胱氨酸0.5g(1mL无菌水)，莫匹罗星0.05g(500μL无水乙醇)在121℃下灭菌15min。
其他实验材料和仪器如无特殊说明，均可通过商业途径购买。
实施例1动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)HN-3的分离鉴定1.1菌株分离
双歧杆菌菌种：长双歧杆菌HN-1(HNb2D13-1),青春双歧杆菌HN-1(HNb2D11-4)，青春双歧杆菌HN-2(HNb42D5)，动物双岐杆菌乳亚种HN-1(HNb24X10-3)，动物双歧杆菌乳亚种HN-2(HNb24X1-1)，动物双歧杆菌乳亚种HN-3(HNb24X1-2)，以上6株菌株均由石河子大学食品学院微生物实验室从海南粪便样品中获得。
1.2菌株筛选
将活化后的菌株，在倒置显微镜下进行镜检。当观察全是双歧的杆状后，分别将OD600达到0.8的菌株，以2％(v：v)接种于调配好的沙枣果汁中，在37℃恒温厌氧箱中培养48h。间隔12h取样，并于分光光度计中在600nm下检测吸光值。并将各时间点的菌液分别稀释10-1，10-3，10-5，分别吸取100μL的菌液涂布与MRS固体培养基上进行活菌计数。同时使用pH计测定各时间段的pH。根据双歧杆菌活菌总数，OD值和pH，绘制生长曲线和pH值曲线，筛选出6株菌株中最优的发酵双歧杆菌。每组实验平行三次。
共筛选出6株双歧杆菌；分别提取上述6株菌株的总DNA，将PCR扩增产物进行测序，并提交NCBI进行同源比对，分别鉴定并命名为青春双歧杆菌HN-1、青春双歧杆菌HN-2、长双歧杆菌HN-1、动物双歧杆菌乳亚种HN-1、动物双歧杆菌乳亚种HN-2以及动物双歧杆菌乳亚种HN-3。
菌株的活化：取已纯化的上述6株实验菌株；配置50mL MRS液体培养基(加入半胱氨酸和莫匹罗星)在121℃下灭菌15min；用移液枪吸取900μL培养基于1.5mL EP管中，再分别加入100μL上述6株菌的菌液，37℃恒温厌氧箱中培养48h。
菌株的保藏：首先配制好75％甘油和MRS液体培养基(加入半胱氨酸和莫匹罗星)在121℃下杀菌15min。将活化48h的菌体，在8000rmp离心5min；弃去上清液，再加入1mL的MRS液体培养基，并将剩余部分菌液摇匀，再将混合好的菌液重悬于装有500μL 75％甘油的1.5mL的保藏管中，置于-20℃的冰箱冻藏。
所述6株菌株纯化后保存于-20℃冰箱。
1.3 6株双歧杆菌在沙枣果汁中的性能
(1)沙枣果汁的制备
本发明所用的沙枣是从新疆喀什地区获取。此食用沙枣果实多表现为表皮干缩，含水量较少，果肉呈粉末状，颜色淡黄。将沙枣去皮，去核，将沙枣粉与水按照1：4混合，搅拌均匀后，于沸水浴加热5min。加热完成后，过滤(400目的纱网过滤)获得沙枣果汁，所述沙枣果汁最终呈现微黄色且含有少量沉淀物。
使用食用碱将果汁的pH调至7，再均匀的分装至试管中。接着使用灭菌锅，在95℃下灭菌5min。
(2)发酵工艺
取活化的上述6株菌株，以2％(v：v)接种于步骤(1)制备的沙枣果汁中，37℃恒温厌氧箱中培养72h，进行发酵。
(3)6株双歧杆菌在沙枣果汁中生长性能检测
方法：将活化后的菌株，在倒置显微镜下进行镜检。当观察全是双歧的杆状后，分别将OD600达到0.8的菌株，以2％(v：v)接种于调配好的沙枣果汁中，在37℃恒温厌氧箱中培养48h。间隔12h取样，并于分光光度计中在600nm下检测吸光值。并将各时间点的菌液分别稀释10-1，10-3，10-5，分别吸取10 0μl的菌液涂布与MRS固体培养基上进行活菌计数。
结果：6株双歧杆菌在沙枣果汁中生长变化如图1所示，由青春双歧杆菌HN-1，青春双歧杆菌HN-2，长双歧杆菌HN-1，动物双歧杆菌乳亚种HN-2，动物双歧杆菌乳亚种HN-1，动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵的沙枣果汁在37℃培养48h的细菌总量总体呈现上升趋势；通过结合活菌计数可发现，除动物双歧杆菌乳亚种HN-2的细胞变化就相对比较平稳外，其余的5株菌株的生长趋势较为相似，其中动物双歧杆菌乳亚种HN-3的生长情况较好，从最初的1.56×108CFU/mL增长到2.35×108CFU/mL，数量增加了50％；在发酵的前12h内，6株双歧杆菌的生长较为缓慢，初始pH和营养物质的差异可能会对微生物产生胁迫，从而降低发酵早期微生物的生长。从12h开始，6株菌的生长情况有了区别性的变化。不同的菌株对底物的利用程度不同，而导致自身生长情况的差异。除此之外，因为细胞生长情况是设计功能性食品的一个重要指标，所以发酵菌株需要具备在果汁中生长的能力达108CFU/mL，才具备开发产品的价值。表明能申请所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3在沙枣果汁中具有稳定生长的优势。
(4)6株双歧杆菌发酵沙枣果汁pH检测
方法：将活化后的菌株，在倒置显微镜下进行镜检。当观察全是双歧的杆状后，分别将OD600达到0.8的菌株，以2％(v：v)接种于调配好的沙枣果汁中，在37℃恒温厌氧箱中培养48h。间隔12h取样，并使用pH计测定各时间段的pH，绘制pH值曲线，
结果：6株菌株的pH如图2所示，6株菌株的pH总体呈现下降的趋势；在发酵初期，这些细菌能够显著降低产物的pH值，产生适量的CO2，从而抑制非乳酸菌群或芽孢菌群的生长，其中动物双歧杆菌乳亚种HN-2的产酸能力相比较其他菌种较弱。从2h开始，除了动物双歧杆菌乳亚种HN-2，其余菌株的pH变化开始趋于稳定，且均在4-5之间。结合细胞生长的变化和pH的变化可以看出，动物双歧杆菌乳亚种HN-3适合沙枣果汁的发酵，且均能在强酸的环境下生长。
(5)3株双歧杆菌发酵沙枣果汁72h的总酚含量变化
方法：
(1)没食子酸标准曲线的制作
精确称取干燥没食子酸标准品0.070g，用蒸馏水溶解并定容于100mL的容量瓶中，配成浓度为700mg/L的没食子酸溶液。然后分别精密吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6和0.8mL没食子酸标准溶液定容于50mL容量瓶内，配成浓度为0-560mg/L的系列标准溶液。再从各系列标准溶液中吸取200μL于5mL比色管内，加2mL蒸馏水，摇匀，再加0.3mL Folin-Ciocalteu试剂，充分摇匀，立即加入1.2mL 10％Na2CO3溶液，混匀，加水定容，再混匀，然后在30℃下避光放置反应2h，以试剂样为空白，在波长765nm处用酶标仪测定吸光值，以吸光度值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
(2)果汁总酚含量的测定
取1mL提取稀释液于25mL比色管内，加10mL蒸馏水，摇匀，再加1.5mL Folin-Ciocalteu试剂，充分摇匀，立即加入6mL 10％Na2CO3溶液，混匀后加水定容，再进行混匀，然后在30℃下无光条件下放置反应2h，以试剂样为空白，在波长765nm处用酶标仪测定吸光值，根据绘制的标准曲线方程计算提取液中多酚含量(以没食子酸计，mg(GAE)/L)，经进一步计算即得多酚含量。
结果：3株双歧杆菌发酵沙枣果汁72h的总酚含量变化结果如图3所示，其中多酚的标准曲线回归方程为：y＝-0.03528+0.00858x(R2＝0.99305)。表明拟合程度较好。结果表明，沙枣果汁中总酚含量在发酵期间在逐渐上升。其中，本申请所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3(B.an3)在发酵期间，沙枣果汁中总酚含量始终高于青春双歧杆菌HN-1(B.ad1)和青春双歧杆菌HN-2(B.ad2)，表明本申请所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3能够显著增加发酵沙枣果汁中的多酚含量。
综上所述，在本发明筛选的所有发酵菌株中只有动物双歧杆菌乳亚种HN-3在沙枣果汁中稳定生长，其具有耐酸和产酸性能，同时能够显著增加发酵沙枣果汁中的多酚含量，适用于沙枣果汁的发酵。
1.4动物双歧杆菌乳亚种HN-3的鉴定和保藏
动物双歧杆菌乳亚种HN-3鉴定结果为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)HN-3，于2022年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTC C NO：M 20221023；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072，联系电话为(027)68754052。
实施例2动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣果汁
1.沙枣果汁的发酵
沙枣果汁的制备：本发明所用的沙枣是从新疆喀什地区获取。此食用沙枣果实多表现为表皮干缩，含水量较少，果肉呈粉末状，颜色淡黄。将沙枣去皮，去核，将沙枣粉与水按照1：4混合，搅拌均匀后，于沸水浴加热5min。加热完成后，过滤(400目的纱网过滤)获得沙枣果汁，所述沙枣果汁最终呈现微黄色且含有少量沉淀物。
使用食用碱将果汁的pH调至7，再均匀的分装至试管中。接着使用灭菌锅，在95℃下灭菌5min。
发酵工艺：取活化的动物双歧杆菌乳亚种HN-3，以2％(v：v)接种于上述制备的沙枣果汁中，37℃恒温厌氧箱中培养72h，进行发酵。
2.动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵对沙枣果汁抗氧化性的影响
(1)ABTS自由基清除率结果
方法：首先配置7mmol/L ABTS工作液，既准确称取0.003g ABTS，用蒸馏水定容至0.8mL，再称取0.001g过硫酸钾溶于1.5mL蒸馏水中，置成2mmol/L过硫酸钾水溶液，再按照1(0.8mL)：1(0.8mL)的比例将其混合至1.6ml，室温避光放置12-16h，用蒸馏水稀释将吸光值调整至0.700±0.005后备用。将200μL样品加到800μL ABTS工作液中，静置6min，在734nm下用酶标仪测定吸光值。结果以每100g果汁中Trolox当量(μmol TE/100g果汁)表示。
式中：A0-蒸馏水和ABTS工作液在734nm下的吸光值；Aj-发酵液和ABTS工作液在734nm下的吸光值
ABTS自由基清除率结果如图4所示，动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣果汁的整体ABTS自由基清楚率是大于对照组的沙枣果汁，说明本发明所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣果汁，在一定程度上提高了果汁本身的自由基清除率，进而表明了发酵沙枣果汁有成为很好的抗氧化活性产品的潜能。在发酵过程中出现了两个拐点，第一个拐点出现在12h，第二个拐点出现在60h，其中第一个拐点的增高可能是因为沙枣中本身含有的抗氧化活性物质，通过发酵被释放出来，但是发生了一些转化之后，抗氧化活性在减少，而第二次拐点的出现并在60h时相对差值最大，就可能与总酚含量的升高有关；而且动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣果汁ABTS自由基清除率在48h后与总酚含量的变化趋势相同，但是对照组的沙枣果汁ABTS自由基清除率较为稳定，在发酵结束时略有减少。
(2)DPPH自由基清除率结果
方法：称取39.4mg的DPPH，然后用95％的乙醇溶解并定容至100mL容量瓶中，得到1mmol/mL的DPPH溶液，放置0-4℃下避光保存。取2mL样品液分别与0.5mL DPP H溶液和0.5mL无水甲醇混合，常温下避光放置30min，在517nm条件下测定其吸光度Ai和Aj；再取2mL无水甲醇与0.5mL DPPH溶液混合，常温避光放置30min，在517nm条件下用酶标仪测定其吸光度Ac，均以无水甲醇做空白。按照公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率结果如图5所示，本申请所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣果汁DPPH自由基清除率在发酵前42h内均大于对照组的沙枣果汁，且在24h时相对差值最大。但是在发酵48h时，对照组沙枣果汁的DPPH自由基清除率开始大于实验组的值，这可能与沙枣和动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣后的抗氧化活性物质与DPPH自由基的结合情况有关；发酵沙枣果汁从24h之后DPPH自由基清除率整体呈现下降的趋势。
ABTS自由基清除率的趋势与DPPH自由基清除率的趋势，在前42h是相同的，但在42h之后就有所不同，这可能是因为ABTS对抗氧化活性物质的敏感性强于DPPH，或者因为沙枣果汁和发酵沙枣果汁中与ABTS和DPPH发生反应的物质含量不同而引起变化的差异。
3.最佳发酵时间多酚含量与抗氧化活性相关性分析
方法：对发酵沙枣果汁的ABTS，DPPH和总酚进行相关性计算，然后通过数据开始分析。
结果：根据实施例1所示，本发明所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3在60h时发酵的沙枣果汁的总酚含量，DPPH和ABTS自由基清除能力达到最大值。60h发酵果汁的多酚含量与抗氧化活性如图6所示：对比发酵前的沙枣果汁，发酵60h后沙枣果汁的总酚含量增加了183mg GAE/L；因为总酚含量的增加，沙枣果汁中的抗氧化性物质也在增加，从而使DPP H和ABTS自由基清除能力增加，ABTS自由基清除率由最初的34.1％增加到67.5％。DP PH自由基清除率则从83.4％减少到79％。
通过相关性计算后发现，在发酵过程中，对于发酵沙枣果汁多酚与ABTS和DPPH的相关系数分别为0.51407和-0.0746。根据相关系数可知，多酚的含量与ABTS自由基清除率成正相关，而与DPPH自由基清除率成负相关。这与Koba Fatou Traore等人对来自科特迪区的乌梅果实和果皮的酚类抗氧化性研究的结果一致，但与其他由乳酸菌发酵的果汁的多酚和DPPH的相关性不同。
4.代谢学分析
方法：根据各指标筛选出最佳时间点，将该时间点的发酵液(包括对照组)，平行10组，将10组发酵液，再从10组发酵液中筛选指标较好的6组，进行代谢组学分析。
样本在冰上解冻；涡旋30s，将样本4℃，12000rpm离心15min；取上清1000μL于EP管中，氮吹干燥；加入500μL 50％甲醇复溶(含内标)；涡旋30s，冰水浴超声15min；4℃，12000rpm离心15min；小心地取上清经0.22微孔滤膜过滤，用提取液稀释上清液10倍，涡旋30s，取至2mL进样瓶，每个样本各取50μL混合成QC样本；-80℃储存直到上机检测。
使用EXION LC System(SCIEX)超高效液相色谱仪，通过Waters UPLC液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为含0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈。柱温箱温度为40℃，自动进样器温度为4℃，进样体积为2μL。再使用装备IonDrive Turbo V ESI离子源的SCIEX6500QTRAP+三重四极杆质谱仪，以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。离子源参数如下：IonSpray Voltage:+5500/-4500V,Curtain Gas:35psi,Temperature:400℃,IonSource Gas 1:60psi,Ion Source Gas 2:60psi,DP:±100V。
质谱数据采集及目标化合物定量分析工作，均通过SCIEX Analyst Work StationSoftwa re(Version1.6.3)来完成。使用MSconventer软件将质谱原始数据转成TXT格式。再使用自撰写R程序包结合自建数据库完成提峰、注释等工作。结合功能活性的改变对差异代谢物进行综合分析，绘制物质代谢网络，解析出与感官品质和功能活性相关的物质转化。
结果：动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵果汁的主成分分析图如图7所示，利用超高效液相色谱＝质谱联用技术对每个沙枣发酵果汁的代谢产物进行分析，共鉴定出955种物质，包括氨基酸及其衍生物、有机酸及其酚羧酸、黄酮类、酚类、植物激素、苯丙素、查尔酮、香豆素等。其中动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣果汁中的主要成分与未发酵的沙枣果汁的主要成分存在较大的差异，并且我们的实验的可重复性较强。
动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵果汁的发泡图如图8所示，从气泡图中可以看出代谢过程中的上下调物质较多。上下调的物质的数量几乎相等。其中气泡图中上下调物质的总数为126种，上调的物质有75种(红色点)，下调的物质有51种(蓝色的点)。与未发酵果汁相比，发酵果汁中羧酸、氨基酸、甾体、吡啶、苯甲酸等代谢产物及其衍生物的含量均呈下调趋势。此外，黄酮类、生物碱、苯丙素、酚类、香豆素和萜类等次生代谢产物在发酵后显著上调。
沙枣果汁中主要代谢通路物质如表1所示，在总的代谢物质中筛选出主要的代谢物质，即本实验所需研究的物质共308种，这些主要次生代谢产物可分为9类：酚类、酚酰胺类、黄酮类、黄酮类、苯丙类、氨基酸类、查尔酮类、香豆素类和木脂素类。本发明首次总结了东方沙枣汁中成分较高的代谢物(VIP>1)包括酚类(34个代谢物)、酚酰胺类(1个代谢物)、类黄酮类(14个代谢物)、黄酮类(32个代谢物)、苯丙素类(8个代谢物)、氨基酸(2个代谢物)、查尔酮类(1个代谢物)、香豆素类(8个代谢物)和木脂素类(6个代谢物)。根据其VIP和FC(fold change)筛选出本发明所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣果汁的抗氧化活性测定和酚类物质分析显著变化的物质。
表1沙枣果汁中主要代谢通路物质
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动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵沙枣果汁主要代谢通路如图9所示，在所有的代谢通路中与本发明研究相关的主要的代谢通路分别是黄酮和黄酮醇代谢通路和类黄酮代谢通路(表2所示)。在参与发酵过程的代谢途径中，涉及最多的类黄酮生物合成途径是主要的代谢途径。发酵后，皮质素是生物转化产物的中心代谢产物，对抗氧化性能有积极作用；8种物质与柚皮素之间存在直接和间接的转化；异牡荆素、牡荆素、樱皮素、橙皮素7-O-葡萄糖苷含量的降低导致柚皮素含量的增加；此外，其他黄酮类化合物，如查耳酮素、山奈酚、槲皮素、染料木素、表儿茶素、芹菜素、没食子儿茶素等也参与了类黄酮的生物合成途径。这些物质还具有许多功能活性，如山奈酚具有抗氧化、抗癌和抗炎活性，槲皮素具有提高抗炎活性。
其次是黄酮和黄酮醇的生物合成途径，在代谢转化中起重要作用。发酵后，许多具有较高功能活性的黄酮和黄酮醇物质增加。其中山奈酚含量的增加伴随着紫云英苷含量的减少，说明在发酵过程中发生了3-O-葡萄糖基转移酶的脱糖化作用。山奈酚具有较高的抗氧化和抗炎活性。同时，根据KEGG数据库中代谢途径的物质代谢转化分析，异槲皮苷上调的同时槲皮素和花翠素下调，槲皮素和花翠素可能通过脱糖化转化。
与类黄酮、黄酮醇和黄酮生物合成相比，异黄酮生物合成途径不同。发酵后除紫铆素含量增加外，紫铆因、3,4',7-三羟基黄烷酮、4′，7-二羟基黄酮和6,7,4′-三羟基异黄酮含量降低，且这些代谢产物与其他两条代谢途径的代谢产物无相关性。
通过KEGG找到这些物质与其他次级代谢产物的转化关系发现，柚皮素是主要的转化物质且转化的物质大部分均在上调。这样的结果揭示，双歧发酵沙枣是有潜在价值的。
通过动物双歧杆菌乳亚种HN-3发酵东方沙枣果汁中的酚酸，黄酮类等次生植物代谢物的代谢分析，同时结合KEGG数据库中对代谢物质在代谢通路中代谢转化的分析。在发酵过程中次生代谢物共涉及23个加氢反应，8个去甲基化反应，7个糖苷水解反应，13个氧化反应。
表2主要代谢通路物质
上面对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)HN-3，所述动物双歧杆菌乳亚种HN-3于2022年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 20221023。
2.如权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3具有如下任一所述的用途：
(1)在制备食品中的应用；
(2)在制备食品添加剂中的应用；
(3)在制备食品发酵剂中的应用；
(4)在果汁发酵中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述果汁为沙枣果汁。
4.一种沙枣果汁的制备方法，其特征在于，所述方法为：将沙枣果汁与权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3混合发酵。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备沙枣果汁；
(2)将步骤(1)制备的沙枣果汁的pH调至7；
(3)在95℃下灭菌5min；
(4)取权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3，活化后接种于步骤(3)灭菌后的沙枣果汁中进行发酵。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)为：将沙枣去皮去核后粉碎，将沙枣粉与水按照1：4(m:v)混合，搅拌均匀后，于沸水浴加热5min；过滤，获得沙枣果汁。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)为：95℃，灭菌5min。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)为：取活化的权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种HN-3，以2％(v：v)的接种量接种于步骤(3)灭菌后的沙枣果汁中，37℃恒温厌氧箱中培养72h，进行发酵。
9.如权利要求4-8任一所述方法制备获得的沙枣果汁。
10.如权利要求9所述的沙枣果汁在制备食品或食品添加剂中的应用。
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