CN116270408A - 一种具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液及其制备方法与应用，属于化妆品技术领域。本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液为采用复合菌对红茶粉进行发酵得到，所述复合菌为动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌；所述发酵的结束标志为：红茶发酵液的pH降至3.5‑4.5。本发明通过采用特定复合菌配合发酵红茶粉，并优化发酵过程中的条件，使制备得到的红茶发酵液具有优异的抗氧化、提亮、紧致和舒缓的功效。

Description

一种具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液及其制备方法与应用。
背景技术
红茶属于全发酵茶，是以适宜的茶树新芽叶为原料，经萎凋、揉捻、发酵、干燥等一系列工艺精制而成的茶。其具有暖胃养生、提神益思、消除疲劳、消除水肿、止泻、抗菌和增强免疫等功效。目前，在化妆品中加入红茶提取物以实现红茶提取物在化妆品中的美容、护肤功效得到了广泛的研究。
然而，由于红茶在加工过程中会发生以茶多酚酶促氧化为中心的化学反应，其提取过程中鲜叶成分等活性物质的变化较大，尤其是具有抗氧化作用的茶多酚会减少90％以上，导致红茶提取物的抗氧化效果大大降低，使红茶提取物在化妆品中的护肤功效较差。CN114586865A采用发酵的方式提取红茶提取物，减小了红茶中活性物质的浪费，但是这种方法采用的发酵菌种较为单一，得到的红茶提取物仍然无法满足目前化妆品类消费者的护肤需求。
针对上述红茶提取物在提取过程中存在的缺陷，开发一种可使红茶在提取过程中活性物质损失较小，使红茶提取物充分发挥功效的红茶提取方法是目前研究的重点。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液及其制备方法与应用，所述红茶发酵液具有优异的抗氧化、提亮、紧致和舒缓的功效。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法，所述方法包含以下步骤：
S1、将活化的复合菌种子液加入含有红茶粉的发酵基质中发酵至pH降至3.5-4.5时停止发酵，得到粗发酵液；
S2、对步骤S1所述的粗发酵液进行灭菌和过滤处理，即得所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液；
其中，所述步骤S1中，复合菌为动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌。
本发明采用动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌对红茶粉进行发酵，可使制备得到的红茶发酵液具有优异的抗氧化、提亮、紧致和舒缓的功效。
将本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液作为活性成分加入化妆品中，可使化妆品的抗氧化、提亮、紧致和舒缓作用大幅度提高，且所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液在所应用的产品中也可表现出优异的稳定性。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的优选实施方式，所述步骤S1中，动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌的接种量均为2％-5％，且所述动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌的接种量之比为动物双歧杆菌乳亚种：植物乳杆菌＝1-2:1-2；发明人通过大量实验发现，当复合菌种子液中动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌的接种量及接种量比例在上述范围内时，可使最终红茶发酵液的抗氧化效果、提亮效果、紧致和舒缓效果更明显。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的更优选实施方式，所述动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌的接种量均为3％，所述动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌的接种量之比为动物双歧杆菌乳亚种：植物乳杆菌＝1:1；发明人通过大量实验发现，当复合菌种子液中动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌的接种量为上述值时，可使最终红茶发酵液的抗氧化效果、提亮效果、紧致和舒缓效果达到最好。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的优选实施方式，所述步骤S1中，红茶粉的细度为60-100目；发明人通过大量实验发现，所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液中红茶粉的细度对最终红茶发酵液的发酵效果具有重大的影响，红茶的活性物质通常分布于细胞内，红茶粉经粉碎后，细胞壁被破碎，细胞内的有效成分得以暴露，因此，红茶粉研磨得越细，越有利于红茶粉内活性物质的溶出，但是，由于静电及吸附作用，红茶粉研磨得越细，在发酵基质中均匀分散就比较困难，红茶粉容易出现团聚、结块的情况，使发酵的效果较差；因此，在本发明中，只有红茶粉的细度在上述范围内时，才可使红茶发酵的效果较好。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的更优选实施方式，所述红茶粉的细度为80目；发明人通过大量实验发现，所述红茶粉的细度为80目时，可使发酵液的发酵效果最好。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的优选实施方式，所述复合菌均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的优选实施方式，所述复合菌种子液的制备方法包括以下步骤：将动物双歧杆菌乳亚种菌落或植物乳杆菌菌落加入液体培养基中培养，即得所述动物双歧杆菌乳亚种种子液或植物乳杆菌种子液。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的更优选实施方式，所述复合菌种子液培养过程的参数为：培养温度为35-40℃，培养时间为24-72h，培养时的转速为100-300rpm，所述复合菌中动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌的菌浓度均为1x107-1x109 cfu/ml。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的最优选实施方式，所述复合菌种子液培养过程的参数为：培养温度为37℃，培养时间为48h，培养时的转速为150rpm，所述复合菌中动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌的菌浓度均为1x108 cfu/ml。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的优选实施方式，所述复合菌种子液制备过程的培养基为本领域常用的培养基，本发明采用MRS液体培养基。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的更优选实施方式，所述MRS液体培养基的制备方法为：将各原料混合后，加入蒸馏水，在120℃下灭菌20min后贮存备用。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的最优选实施方式，所述MRS液体培养基中，每升培养基包括以下含量的原料：蛋白陈10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、葡萄糖2g、吐温80 1mL、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的优选实施方式，所述发酵基质包括红茶粉、碳源、氮源和水。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的更优选实施方式，所述发酵基质包括以下重量百分比的组分：红茶粉1％-5％，碳源1％-4％，氮源1％-4％和余量水。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的最优选实施方式，所述发酵基质包括以下重量百分比的组分：红茶粉2％，碳源2％，氮源2％和余量水。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的优选实施方式，采用如下(1)-(4)中的至少一项：
(1)所述碳源包括玉米淀粉、土豆淀粉、环糊精、果葡糖浆、麦芽糖中的至少一种；
(2)所述氮源包括铵盐、蛋白胨、酵母膏中的至少两种；
(3)所述发酵的条件为：温度为35-40℃，时间为50-80h；
(4)所述灭菌的条件为：温度为85-115℃，时间为15-30min。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的更优选实施方式，采用如下(5)-(8)中的至少一项：
(5)所述碳源为玉米淀粉；
(6)所述氮源包括氯化铵和大豆蛋白胨，且氯化铵和大豆蛋白胨的重量比为1:1-3；
(7)所述发酵的条件为：温度为37℃；
(8)所述灭菌的条件为：温度为90℃，时间为20min。
作为本发明所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的最优选实施方式，所述氮源包括以下重量份组分：氯化铵和大豆蛋白胨的重量比为1:1。
需要说明的是，本发明发酵结束的标志为发酵液的pH降至3.5-4.5。
第二方面，本发明提供了一种具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液，所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液采用如第一方面所述的方法制备而成。
第三方面，本发明提供了一种化妆品，所述化妆品包含如第二方面所述的具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液。
作为本发明化妆品的优选实施方式，所述红茶发酵液的添加量为所述化妆品总质量的1-30％。
作为本发明化妆品的优选实施方式，所述化妆品可为柔肤水类、乳液类、膏霜类、面贴膜类、啫喱类、粉类、喷雾类、精华类、洗护类和彩妆类。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明采用动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌对特定细度的红茶叶粉进行发酵，并对红茶发酵液制备过程发酵条件进行了优化，制备得到的红茶发酵液具有优异的抗氧化、提亮、紧致和舒缓的功效。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明中所用菌种均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，所述动物双歧杆菌乳亚种为CICC 21710、CICC 21718或CICC 21712，所述植物乳杆菌为JYLP-326、CICC 22219或CICC 23132。
实施例1
本实施例所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法中，红茶粉的制备方法为：选取干燥的红茶叶，用磨样机打粉，过80目的筛，除去上层杂质，取下层茶叶粉作为发酵原料备用。
本实施例采用的动物双歧杆菌乳亚种为CICC 21710，植物乳杆菌为JYLP-326；复合菌种子液的制备方法为：用接种环分别挑取动物双歧杆菌乳亚种菌落和植物乳杆菌菌落至MRS液体培养基中，分别于37℃，150rpm条件下培养48h，得到动物双歧杆菌乳亚种种子液和植物乳杆菌种子液；其中，动物双歧杆菌乳亚种种子液和植物乳杆菌种子液的菌浓度均约为1x108 cfu/ml。
发酵基质包括以下重量百分比的组分：红茶粉2％、玉米淀粉2％、大豆蛋白胨1％、氯化铵1％和余量水；发酵基质的制备方法为：将各组分在发酵罐中混合均匀，将发酵罐密闭，升温至121℃，保持30min，随后进行灭菌处理，即得到发酵基质。
本实施例所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法包括以下步骤：
S1、将上述活化的复合菌种子液加入发酵基质中，在37℃下静置发酵，待发酵至pH值为4.2时停止发酵，得到粗红茶发酵液；
S2、利用巴氏灭菌法在95℃下对步骤S1所述粗红茶发酵液进行灭菌处理15min，随后将灭菌后的粗红茶发酵液经过硅藻土过滤器除去杂质，即得到所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液；
其中，所述步骤S1中，动物双歧杆菌乳亚种种子液和植物乳杆菌种子液的接种量均为3％。
实施例2-11
实施例2-11所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法与实施例1所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的区别见下表1，除表1中的区别外，实施例2-11所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的其余部分均与实施例1保持一致。
表1
Figure BDA0004128966200000061
Figure BDA0004128966200000071
Figure BDA0004128966200000081
Figure BDA0004128966200000091
实施例12
本实施例所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法中，红茶粉的制备方法为：选取干燥的红茶叶，用磨样机打粉，过70目的筛，除去上层杂质，取下层茶叶粉作为发酵原料备用。
本实施例采用的动物双歧杆菌乳亚种为CICC 21718，植物乳杆菌为CICC 22219；复合菌种子液的制备方法为：用接种环分别挑取动物双歧杆菌乳亚种菌落和植物乳杆菌菌落至MRS液体培养基中，分别于40℃，100rpm条件下培养24h，得到动物双歧杆菌乳亚种种子液和植物乳杆菌种子液；其中，动物双歧杆菌乳亚种种子液和植物乳杆菌种子液的菌浓度均约为1x107cfu/ml。
发酵基质包括以下重量百分比的组分：红茶粉1％、玉米淀粉4％、大豆蛋白胨2％、氯化铵2％和余量水；发酵基质的制备方法为：将各组分在发酵罐中混合均匀，将发酵罐密闭，升温至121℃，保持30min，随后进行灭菌处理，即得到发酵基质。
本实施例所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法包括以下步骤：
S1、将上述活化的复合菌种子液加入发酵基质中，在35℃下静置发酵，待发酵至pH值为4.3时停止发酵，得到粗红茶发酵液；
S2、利用巴氏灭菌法在115℃下对步骤S1所述粗红茶发酵液进行灭菌处理15min，随后将灭菌后的粗红茶发酵液经过硅藻土过滤器除去杂质，即得到所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液；
其中，所述步骤S1中，动物双歧杆菌乳亚种种子液和植物乳杆菌种子液的接种量均为5％。
实施例13
本实施例所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法中，红茶粉的制备方法为：选取干燥的红茶叶，用磨样机打粉，过90目的筛，除去上层杂质，取下层茶叶粉作为发酵原料备用。
本实施例采用的动物双歧杆菌乳亚种为CICC 21712，植物乳杆菌为CICC23132；所述复合菌种子液的制备方法为：用接种环分别挑取动物双歧杆菌乳亚种菌落和植物乳杆菌菌落至MRS液体培养基中，分别于35℃，300rpm条件下培养72h，得到动物双歧杆菌乳亚种种子液和植物乳杆菌种子液；其中，动物双歧杆菌乳亚种种子液和植物乳杆菌种子液的菌浓度均约为1x109 cfu/ml。
所述发酵基质包括以下重量百分比的组分：红茶粉5％、玉米淀粉1％、大豆蛋白胨0.5％、硫酸铵2％和余量水；所述发酵基质的制备方法为：将各组分在发酵罐中混合均匀，将发酵罐密闭，升温至121℃，保持30min，随后进行灭菌处理，即得到发酵基质。
本实施例所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法包括以下步骤：
S1、将上述活化的复合菌种子液加入发酵基质中，在40℃下静置发酵，待发酵至pH值为4.0时停止发酵，得到粗红茶发酵液；
S2、利用巴氏灭菌法在85℃下对步骤S1所述粗红茶发酵液进行灭菌处理30min，随后将灭菌后的粗红茶发酵液经过硅藻土过滤器除去杂质，即得到所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液；
其中，所述步骤S1中，动物双歧杆菌乳亚种种子液和植物乳杆菌种子液的接种量均为2％。
对比例1-11
对比例1-11所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法与实施例1所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的区别见下表2，除表2中的区别外，对比例1-10所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法的其余部分均与实施例1一致。对比例11与实施例1的区别在于，所述步骤S1为在150rpm的转速下发酵。
表2
Figure BDA0004128966200000111
Figure BDA0004128966200000121
/>
Figure BDA0004128966200000131
测试例
1、抗氧化性测试——细胞活性氧(ROS)抑制测试
测试方法：将人皮肤角质形成细胞(Hacat)制成细胞悬液后，接种于96孔板，每孔10000-20000个细胞，应用DMEM培养基进行培养，培养24h后，换液，加入实施例1-13和对比例1-11所述的具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液(红茶发酵液的添加量为细胞培养基量的2％)后，继续培养24h，随后给予对照组和实验组UVA光照，光剂量为6-10J/cm2，光照结束后去除细胞培养液，用PBS清洗3次，每孔加入100μL 10μmol/L的DCFH-DA，放置于CO2培养箱中孵育20min，孵育结束后，再采用PBS清洗3次，再重新加入无血清的DMEM培养液，采用488nm激发波长，525nm发射波长，使用荧光酶标仪检测ROS含量；细胞活性氧(ROS)相对水平＝实验组OD值或对照组OD值/空白组OD值。空白组：加PBS缓冲液，不光照；对照组：加PBS缓冲液。结果如下表3所示。
表3
Figure BDA0004128966200000141
/>
Figure BDA0004128966200000151
根据表3中的数据可知，本发明实施例1-13所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的细胞活性氧相对水平(％)均低于对照组，说明本发明制得的红茶发酵液具有抗氧化性能。
将实施例和对比例对比发现，实施例1-3所述红茶发酵液的细胞活性氧相对水平(％)低于对比例1，可见，在本发明中，发酵基质中碳源的选择会影响发酵的效果，从而影响最终红茶发酵液的抗氧化性能；本发明适合使用玉米淀粉、土豆淀粉、环糊精、果葡糖浆、麦芽糖中的至少一种作为碳源；同时，实施例1的细胞活性氧相对水平(％)低于实施例2、3，说明本发明最适合采用玉米淀粉作为碳源。
实施例1、4、5所述红茶发酵液的细胞活性氧相对水平(％)低于对比例2、3，可见，在本发明中，发酵基质中氮源的选择会影响发酵的效果，从而影响最终红茶发酵液的抗氧化性能；本发明适合使用铵盐、蛋白胨、酵母膏中的至少两种作为氮源；同时，实施例1的细胞活性氧相对水平(％)低于实施例4、5，说明本发明最适合采用氯化铵和大豆蛋白胨作为氮源，实施例1的细胞活性氧相对水平(％)低于实施例6，也说明本发明所述氮源中氯化铵和大豆蛋白胨的质量比为1:1时，最终红茶发酵液的抗氧化性能最好。
实施例1、9所述红茶发酵液的细胞活性氧相对水平(％)低于对比例4-6，可见，在本发明中，发酵菌种的种类选择会影响最终红茶发酵液的抗氧化性能，本发明适合采用动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌共生发酵；同时，实施例1的细胞活性氧相对水平(％)低于实施例9，说明动物双歧杆菌乳亚种种子液、植物乳杆菌种子液的接种量为1：1时，所述红茶发酵液的抗氧化性能最好。
实施例1、7、8所述红茶发酵液的细胞活性氧相对水平(％)低于对比例7、8，可见，在本发明中，发酵结束时的pH影响最终红茶发酵液的抗氧化性能，本发明发酵结束时的pH在3.5-4.5时可使最终红茶发酵液的抗氧化性能较好；同时，实施例1的细胞活性氧相对水平(％)低于实施例7、8，说明本发明发酵结束时的pH在4.2时可使最终红茶发酵液的抗氧化性能最好。
实施例1、10、11所述红茶发酵液的细胞活性氧相对水平(％)低于对比例10、11，可见，在本发明中，红茶粉的细度影响最终红茶发酵液的抗氧化性能，本发明适合采用细度为60-100目的红茶粉作为原料；同时，实施例1的细胞活性氧相对水平(％)低于实施例10、11，说明本发明采用细度为80目的红茶粉作为原料时可使最终红茶发酵液的抗氧化性能最好。
实施例1所述红茶发酵液的细胞活性氧相对水平(％)低于对比例11，可见，在本发明中，发酵方式影响最终红茶发酵液的抗氧化性能；在静置条件下发酵和在搅拌条件下发酵，最终制备得到的红茶发酵液的抗氧化性能也有差别，本发明适合采用静置发酵的方式进行发酵。
2、氧化性测试——羟基自由基-Fenton比色法
测试方法：步骤1、配制水杨酸-乙醇溶液(9.1mmol/L)：精确称取水杨酸0.13g，用95％的乙醇溶解后将溶液定容至100mL，摇匀得9.1mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，置于棕色瓶中备用；
步骤2、配制Fe2+溶液(9mmol/L)：精确称取硫酸亚铁铵0.35g，用煮沸后的去离子水定容至100mL，摇匀得9mmol/L的含Fe2+溶液，置于棕色瓶中备用；
步骤3、配制H2O2溶液(88mmol/L)：精确称取30％ H2O2 2g，用去离子水定容至200mL，摇匀得88mmol/L的H2O2溶液，置于棕色瓶中备用；
步骤4、将本发明实施例1-13、对比例1-11所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液才用去离子水稀释至浓度为0.5％、1％，得到样品溶液；
按照下表4分别在样品管中加入上述样品，摇匀静置5min，再加入H2O2溶液，发生芬顿反应后避光静置10min，在510nm波长下测定各样品溶液的吸光度，并计算羟基自由基的清除率，记录数据如下表5所示：
羟基自由基清除率计算公式为：
Figure BDA0004128966200000171
P—清除率；
A1—加入样品的水杨酸-乙醇溶液、Fe2+溶液待测液的吸光值；
A2—加入样品的水杨酸-乙醇溶液待测液后的吸光值；
A3—未加入样品的水杨酸-乙醇溶液、Fe2+溶液待测液的吸光值。
表4
Figure BDA0004128966200000172
表5
Figure BDA0004128966200000181
/>
Figure BDA0004128966200000191
根据表5中的数据可知，本发明实施例1-13所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的羟基自由基清除率均高于对比例，说明本发明制得的红茶发酵液具有抗氧化性能。
将实施例和对比例对比发现，实施例1-3所述红茶发酵液的羟基自由基清除率高于对比例1，可见，在本发明中，发酵基质中碳源的选择会影响发酵的效果，从而影响最终红茶发酵液的抗氧化性能；本发明适合使用玉米淀粉、土豆淀粉、环糊精、果葡糖浆、麦芽糖中的至少一种作为碳源；同时，实施例1的吸光度高于实施例2、3，说明本发明最适合采用玉米淀粉作为碳源。
实施例1、4、5所述红茶发酵液的羟基自由基清除率高于对比例2、3，可见，在本发明中，发酵基质中氮源的选择会影响发酵的效果，从而影响最终红茶发酵液的抗氧化性能；本发明适合使用铵盐、蛋白胨、酵母膏中的至少两种作为氮源；同时，实施例1的羟基自由基清除率高于实施例4、5，说明本发明最适合采用氯化铵和大豆蛋白胨作为氮源，实施例1的羟基自由基清除率高于实施例6，也说明本发明所述氮源中氯化铵和大豆蛋白胨的质量比为1:1时，最终红茶发酵液的抗氧化性能最好。
实施例1、9所述红茶发酵液的羟基自由基清除率高于对比例4-6，可见，在本发明中，发酵菌种的种类选择会影响最终红茶发酵液的抗氧化性能，本发明适合采用动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌共生发酵；同时，实施例1的羟基自由基清除率高于实施例9，说明动物双歧杆菌乳亚种种子液、植物乳杆菌种子液的接种量为1：1时，所述红茶发酵液的抗氧化性能最好。
实施例1、7、8所述红茶发酵液的羟基自由基清除率高于对比例7、8，可见，在本发明中，发酵结束时的pH影响最终红茶发酵液的抗氧化性能，本发明发酵结束时的pH在3.5-4.5时可使最终红茶发酵液的抗氧化性能较好；同时，实施例1的羟基自由基清除率高于实施例7、8，说明本发明发酵结束时的pH在4.2时可使最终红茶发酵液的抗氧化性能最好。
实施例1、10、11所述红茶发酵液的羟基自由基清除率高于对比例10、11，可见，在本发明中，红茶粉的细度影响最终红茶发酵液的抗氧化性能，本发明适合采用细度为60-100目的红茶粉作为原料；同时，实施例1的羟基自由基清除率高于实施例10、11，说明本发明采用细度为80目的红茶粉作为原料时可使最终红茶发酵液的抗氧化性能最好。
实施例1所述红茶发酵液的羟基自由基清除率高于对比例11，可见，在本发明中，发酵方式影响最终红茶发酵液的抗氧化性能；在静置条件下发酵和在搅拌条件下发酵，最终制备得到的红茶发酵液的抗氧化性能也有差别，本发明适合采用静置发酵的方式进行发酵。
3、提亮测试
测试样品：将本发明实施例1-13、对比例1-11所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液配制成10wt％的水溶液，去离子水作为空白对照组。
测试仪器：皮肤光泽度测试仪Glossymeter(GL200，Courage and Khazaka，德国)。
受试者选择：年龄18-45岁健康志愿者250人，分为25组，每组10人。
测试方法：清洁受试者面部区域后，取1-2mL上述样品随机涂抹在半脸区域，另一半脸区域作为空白对照组，涂抹去离子水；每天早、晚各使用一次，在使用样品前、使用样品7天、14天后，通过活性表面分析软件SELS测试受试者标记部位的皮肤光泽度，结果取平均值，并依据如下公式计算皮肤光泽度改善率，下表6为受试者使用后的皮肤光泽度改善率。
皮肤光泽度改善率(％)＝(使用后的平均值-使用前的平均值)/使用前的平均值×100％。
表6
Figure BDA0004128966200000211
/>
Figure BDA0004128966200000221
根据表6中的数据可知，本发明实施例1-13所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率均高于对比例，说明本发明制得的红茶发酵液具有提亮的功效。
将实施例和对比例对比发现，实施例1-3所述红茶发酵液对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率均高于对比例1，可见，在本发明中，发酵基质中碳源的选择会影响发酵的效果，从而影响最终红茶发酵液的提亮效果；本发明适合使用玉米淀粉、土豆淀粉、环糊精、果葡糖浆、麦芽糖中的至少一种作为碳源；同时，实施例1对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于实施例2、3，说明本发明最适合采用玉米淀粉作为碳源。
实施例1、4、5所述红茶发酵液对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于对比例2、3，可见，在本发明中，发酵基质中氮源的选择会影响发酵的效果，从而影响最终红茶发酵液的提亮效果；本发明适合使用铵盐、蛋白胨、酵母膏中的至少两种作为氮源；同时，实施例1对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于实施例4、5，说明本发明最适合采用氯化铵和大豆蛋白胨作为氮源，实施例1对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于实施例6，也说明本发明所述氮源中氯化铵和大豆蛋白胨的质量比为1:1时，最终红茶发酵液的提亮效果最好。
实施例1、9所述红茶发酵液对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于对比例4-6，可见，在本发明中，发酵菌种的种类选择会影响最终红茶发酵液的提亮效果，本发明适合采用动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌共生发酵；同时，实施例1对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于实施例9，说明动物双歧杆菌乳亚种种子液、植物乳杆菌种子液的接种量为1：1时，所述红茶发酵液的提亮效果最好。
实施例1、7、8所述红茶发酵液对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于对比例7、8，可见，在本发明中，发酵结束时的pH影响最终红茶发酵液的提亮功效，本发明发酵结束时的pH在3.5-4.5时可使最终红茶发酵液的提亮效果较好；同时，实施例1对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于实施例7、8，说明本发明发酵结束时的pH在4.2时可使最终红茶发酵液的提亮效果最好。
实施例1、10、11所述红茶发酵液对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于对比例10、11，可见，在本发明中，红茶粉的细度影响最终红茶发酵液的提亮效果，本发明适合采用细度为60-100目的红茶粉作为原料；同时，实施例1对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于实施例10、11，说明本发明采用细度为80目的红茶粉作为原料时可使最终红茶发酵液的提亮效果最好。
实施例1所述红茶发酵液对受试者使用7天、14天后皮肤光泽度的改善率高于对比例11，可见，在本发明中，发酵方式影响最终红茶发酵液的提亮效果，静置条件下发酵和在搅拌条件下发酵，最终制备得到的红茶发酵液的提亮效果也有差别，本发明适合采用静置发酵的方式进行发酵。
4、抗皱紧致测试-斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进测试
测试原理：胶原蛋白是人体的细胞外基质蛋白中含量最高的，其中I型胶原蛋白是皮肤中丰富的蛋白质，斑马鱼的I型胶原蛋白分布与人体相同，且显示出与人类的高度保守性，他们的先天表达在受精后6天大时显著下降，并在受精后10-12天之间变得非常低，测试斑马鱼I型胶原蛋白基因(collala)表达，比较实验组和空白对照组斑马鱼I型胶原蛋白基因相对表达量变化，通过计算I型胶原蛋白基因表达促进率，可评价产品的抗皱和紧致功效。
测试方法：空白对照组为随机挑选36尾健康的受精后6天大的斑马鱼，转移至24-孔板中，每孔含12尾斑马鱼和2.5mL鱼胚胎培养液；实验组为将实施例1-13，对比例1-11的红茶发酵液分别溶于鱼胚胎培养液中，配制得到质量百分比为5％的样品溶液，随机挑选36尾健康的受精后6天大的斑马鱼，转移至24-孔板中，每孔含12尾斑马鱼和2.5mL 5wt％的样品溶液。
培养过程：将上述空白对照组和实验组分别置于28℃的恒温箱中培养24h，收集每孔中的12尾斑马鱼于1.5mL试管中，除去溶液，加入0.5mL RNAlater溶液(Invitrogen；AM7020)，冰冻储存。
RNA提取过程：除去试管中RNAlater溶液，用PBS溶液冲洗3次，置于冰浴中，除去PBS溶液，加入500μL TRIzol试剂(Invitrogen；15596018)，用颗粒杵对胚胎进行均质化，置于冰浴10min，加入100μL三氯甲烷，涡旋1min，置于冰浴5min，离心样品20min，转移上层溶液至1.5mL离心管，加入250μL异丙醇，涡旋1min，置于冰浴10min，离心样本20min，除去所有上清液，加入500μL乙醇，涡旋1min，离心样本5min，置于冰浴10min；重复此步骤3次。除去乙醇，离心样本5min，在通风橱中打开盖子风干样品10min，加入10μL无DNase/RNase(DNA酶/RNA酶)超纯蒸馏水，55℃加热15min。
cDNA合成过程：用无DNase/RNase超纯蒸馏水将上述RNA样本稀释至1000ng/7μL，用含gDNA Eraser的PrimerScript RT试剂盒(Takara；Cat no.RR047A)将RNA合成为cDNA，冰冻储存。
实时RT-PCR过程：为每个引物准备引物混合物及实时PCR主混合物，用无DNase/RNase超纯蒸馏水将cDNA样本稀释10倍，每孔PCR用96孔板加入9μL PCR主混合物及1μL稀释的cDNA样本，用光学胶膜密封PCR用96孔板，离心孔板5min，进行实时PCR扩增，市售PCR试剂盒采用SYBR Premix Ex Taq(Takara；Cat no.RR420A)。
数据和结果计算：收集实时PCR数据，并计算每个基因(collala)的相对表达量作为测试结果，通过下式计算胶原蛋白基因表达促进率，所述实施例1-13、对比例1-11对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达的促进测试结果如下表7所示。
Figure BDA0004128966200000241
其中，T表示实验组斑马鱼胶原蛋白基因相对表达量；C表示空白对照组斑马鱼胶原蛋白基因相对表达量。
表7
斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)
实施例1 64±2
实施例2 60±3
实施例3 62±2
实施例4 62±1
实施例5 61±4
实施例6 60±2
实施例7 59±3
实施例8 61±2
实施例9 61±3
实施例10 59±1
实施例11 62±2
实施例12 58±2
实施例13 63±1
对比例1 39±4
对比例2 43±3
对比例3 48±2
对比例4 47±3
对比例5 43±3
对比例6 27±2
对比例7 48±1
对比例8 50±1
对比例9 46±2
对比例10 48±2
对比例11 42±4
根据表7中的数据可知，本发明实施例1-13所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)均高于对比例，说明本发明制得的红茶发酵液具有抗皱紧致的功效。
将实施例和对比例对比发现，实施例1-3所述红茶发酵液对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)均高于对比例1，可见，在本发明中，发酵基质中碳源的选择会影响发酵的效果，从而影响最终红茶发酵液的抗皱、紧致的效果；本发明适合使用玉米淀粉、土豆淀粉、环糊精、果葡糖浆、麦芽糖中的至少一种作为碳源；同时，实施例1对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于实施例2、3，说明本发明最适合采用玉米淀粉作为碳源。
实施例1、4、5所述红茶发酵液对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于对比例2、3，可见，在本发明中，发酵基质中氮源的选择会影响发酵的效果，从而影响最终红茶发酵液抗皱、紧致的效果；本发明适合使用铵盐、蛋白胨、酵母膏中的至少两种作为氮源；同时，实施例1对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于实施例4、5，说明本发明最适合采用氯化铵和大豆蛋白胨作为氮源，实施例1对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于实施例6，也说明本发明所述氮源中氯化铵和大豆蛋白胨的质量比为1:1时，最终红茶发酵液抗皱、紧致的效果最好。
实施例1、9所述红茶发酵液对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于对比例4-6，可见，在本发明中，发酵菌种的种类选择会影响最终红茶发酵液抗皱、紧致的效果，本发明适合采用动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌共生发酵；同时，实施例1对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于实施例9，说明动物双歧杆菌乳亚种种子液、植物乳杆菌种子液的接种量为1：1时，所述红茶发酵液抗皱、紧致的效果最好。
实施例1、7、8所述红茶发酵液对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于对比例7、8，可见，在本发明中，发酵结束时的pH影响最终红茶发酵液抗皱、紧致的效果，本发明发酵结束时的pH在3.5-4.5时可使最终红茶发酵液的抗皱、紧致的效果较好；同时，实施例1对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于实施例7、8，说明本发明发酵结束时的pH在4.2时可使最终红茶发酵液的抗皱、紧致的效果最好。
实施例1、10、11所述红茶发酵液对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于对比例10、11，可见，在本发明中，红茶粉的细度影响最终红茶发酵液抗皱、紧致的效果，本发明适合采用细度为60-100目的红茶粉作为原料；同时，实施例1对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于实施例10、11，说明本发明采用细度为80目的红茶粉作为原料时可使最终红茶发酵液抗皱、紧致的效果最好。
实施例1所述红茶发酵液对斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进率(％)高于对比例11，可见，在本发明中，发酵方式影响最终红茶发酵液抗皱、紧致的效果，本发明适合采用静置发酵的方式进行发酵。
5、舒缓测试-中性粒细胞聚集抑制测试
测试原理：斑马鱼胚胎的中性粒细胞和人体中性粒细胞在形态、生化和生理功能上高度相似，中性粒细胞是在损伤或病菌入侵部位第一批出现的白细胞，作用于清除感染或有害物质，应用硫酸铜诱导斑马鱼胚胎侧线区域神经丘细胞损伤而引起中性粒细胞聚集的模型进行测试，比较受试物处理组和模型对照组的鱼胚胎侧线区域的中性粒细胞的数量变化，计算中性粒细胞抑制率以评价样品的舒缓功效。
空白对照组：随机挑选24尾健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)的鱼胚胎培养液；阳性对照组：随机挑选24尾健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)和0.0036mg/L吲哚美辛的鱼胚胎培养液(吲哚美辛具有舒缓作用，可以抑制中性粒细胞聚集，阳性对照用于判断实验的有效性。)。
实验组：将实施例1-13、对比例1-11的红茶发酵液溶于鱼胚胎培养液中，配制成质量百分比为5wt％的样品溶液，随机挑选24尾健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)和待测样品的鱼胚胎培养液。
测试方法：将上述空白对照组、阳性对照组和实验组置于28℃恒温箱中培养40min，将每测试组鱼胚胎于多聚甲醛溶液(4％)中固定至少1h后，用PBST(Triton X-100的质量百分数为0.04％的PBS溶液)处理鱼胚胎3次，每次5min，然后用50％乙醇处理3min，用苏丹黑(0.4％)染色溶液对鱼胚胎进行室温染色1h后，用70％乙醇浸洗4次，每次5min，然后用PBST处理2次，每次5min，用漂白溶液(H2O2和KOH的质量百分数分别为3％和1％的混合水溶液)处理鱼胚胎10min，然后用70％乙醇溶液处理5min，PBST处理1min，用清澈液1(甘油和KOH的质量百分数分别为20％和0.25％的混合水溶液)处理15min，清澈液2(甘油和KOH的质量百分数分别为50％和0.25％的混合水溶液)处理10min，再用PBST处理3min，将鱼胚胎侧身摆放，置于体式显微镜，计数每尾鱼胚胎从肝门起四分之三尾部侧线区域的中性粒细胞数目，通过下式计算中性粒细胞聚集抑制率，所述实施例1-13、对比例1-11的样品对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制结果如下表8。
Figure BDA0004128966200000281
其中，T表示实验组斑马鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值；C表示空白对照组斑马鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值。
表8
Figure BDA0004128966200000282
/>
Figure BDA0004128966200000291
根据表8中的数据可知，本发明实施例1-13所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液中性粒细胞数目少于对比例，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率均高于对比例，说明本发明制得的红茶发酵液具有舒缓的功效。
将实施例和对比例对比发现，实施例1-3所述红茶发酵液中性粒细胞数目少于对比例1，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率均高于对比例1，可见，在本发明中，发酵基质中碳源的选择会影响发酵的效果，从而影响最终红茶发酵液的舒缓功效；本发明适合使用玉米淀粉、土豆淀粉、环糊精、果葡糖浆、麦芽糖中的至少一种作为碳源；同时，实施例1-3相比，实施例1中性粒细胞数目最少，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率最高，说明本发明最适合采用玉米淀粉作为碳源。
实施例1、4、5所述红茶发酵液中性粒细胞数目少于对比例2、3，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率均高于对比例2、3，可见，在本发明中，发酵基质中氮源的选择会影响发酵的效果，从而影响最终红茶发酵液的舒缓功效；本发明适合使用铵盐、蛋白胨、酵母膏中的至少两种作为氮源；同时，实施例1、4、5、6相比，实施例1中性粒细胞数目最少，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率最高，说明本发明最适合采用氯化铵和大豆蛋白胨作为氮源，且所述氮源中氯化铵和大豆蛋白胨的质量比为1:1时，最终红茶发酵液舒缓功效最好。
实施例1、9所述红茶发酵液中性粒细胞数目少于对比例4-6，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率均高于对比例4-6，可见，在本发明中，发酵菌种的种类选择会影响最终红茶发酵液舒缓的效果，本发明适合采用动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌共生发酵；同时，实施例1、9相比，实施例1中性粒细胞数目最少，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率最高，说明动物双歧杆菌乳亚种种子液、植物乳杆菌种子液的接种量为1：1时，所述红茶发酵液舒缓效果最好。
实施例1、7、8所述红茶发酵液中性粒细胞数目少于对比例7、8，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率均高于对比例7、8，可见，在本发明中，发酵结束时的pH影响最终红茶发酵液舒缓功效，本发明发酵结束时的pH在3.5-4.5时可使最终红茶发酵液的舒缓功效较好；同时，实施例1、7、8相比，实施例1中性粒细胞数目最少，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率最高，说明本发明发酵结束时的pH在4.2时可使最终红茶发酵液的舒缓效果最好。
实施例1、10、11所述红茶发酵液中性粒细胞数目少于对比例10、11，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率均高于对比例10、11，可见，在本发明中，红茶粉的细度影响最终红茶发酵液的舒缓功效，本发明适合采用细度为60-100目的红茶粉作为原料；同时，实施例1、10、11相比，实施例1中性粒细胞数目最少，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率最高，说明本发明采用细度为80目的红茶粉作为原料时可使最终红茶发酵液的舒缓效果最好。
实施例1所述红茶发酵液中性粒细胞数目少于对比例11，对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率高于对比例11，可见，在本发明中，发酵方式也会影响最终红茶发酵液舒缓效果，本发明适合采用静置发酵的方式进行发酵。
综上，本发明红茶发酵液制备过程中发酵基质中的碳源种类的选择、氮源种类及含量的选择、发酵菌种及接种量、发酵结束时的pH、红茶粉的细度及发酵方式对最终所述红茶发酵液的抗氧化效果、提亮效果、抗皱紧致效果和舒缓效果均有较明显的影响；当本发明在红茶粉的细度为80目、碳源为2％的玉米淀粉、氮源为大豆蛋白胨和氯化铵以1:1的质量比复配、发酵结束时的pH为4.2、复合菌采用动物双歧杆菌乳亚种种子液和植物乳杆菌种子液以1:1的接种量接种、以静置发酵的方式发酵的条件下，最终所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的抗氧化效果、提亮效果、紧致效果和舒缓效果最优异。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将活化的复合菌种子液加入含有红茶粉的发酵基质中发酵至pH降至3.5-4.5时停止发酵，得到粗发酵液；
S2、对步骤S1所述的粗发酵液进行灭菌和过滤处理，即得所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液；
其中，所述步骤S1中，复合菌为动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌。
2.如权利要求1所述的具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌的接种量均为2％-5％，且所述动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌的接种量的比为动物双歧杆菌乳亚种：植物乳杆菌＝1-2:1-2。
3.如权利要求1所述的具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，红茶粉的细度为60-100目。
4.如权利要求1所述的具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法，其特征在于，所述发酵基质包括以下重量百分比的组分：红茶粉1％-5％，碳源1％-4％，氮源1％-4％和余量水。
5.如权利要求4所述的具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法，其特征在于，所述发酵基质包括以下重量百分比的组分：红茶粉2％，碳源2％，氮源2％和余量水。
6.如权利要求4所述的具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法，其特征在于，采用如下(1)-(4)中的至少一项：
(1)所述碳源包括玉米淀粉、土豆淀粉、环糊精、果葡糖浆、麦芽糖中的至少一种；
(2)所述氮源包括铵盐、蛋白胨、酵母膏中的至少两种；
(3)所述发酵的条件为：温度为35-40℃，时间为50-80h；
(4)所述灭菌的条件为：温度为85-115℃，时间为15-30min。
7.如权利要求4所述的具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的制备方法，其特征在于，采用如下(5)-(8)中的至少一项：
(5)所述碳源为玉米淀粉；
(6)所述氮源包括氯化铵和大豆蛋白胨，且氯化铵和大豆蛋白胨的重量比为1:1～3；
(7)所述发酵的条件为：温度为37℃；
(8)所述灭菌的条件为：温度为90℃，时间为20min。
8.一种具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液，其特征在于，所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液采用如权利要求1-7任一项所述的方法制备而成。
9.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品包括如权利要求8所述的具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液。
10.如权利要求9所述的化妆品，其特征在于，所述具有抗氧化和提亮功效的红茶发酵液的添加量为所述化妆品总质量的1-30％。
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CN116904346A (zh) * 2023-06-06 2023-10-20 石河子大学 动物双歧杆菌乳亚种hn-3在沙枣果汁发酵中的应用
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