KR101509530B1 - 아연 농화된 바이오매스, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 프로바이오틱 제품, 화장품, 식이성 제품 및 식품의약 제품 - Google Patents

아연 농화된 바이오매스, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 프로바이오틱 제품, 화장품, 식이성 제품 및 식품의약 제품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스트렙토코쿠스 써모필루스 및 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 및 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 살아 있거나 이후에 사멸된 미생물을 포함하는 아연 농화된 바이오매스, 상기 아연 농화된 바이오매스의 제조 방법, 뿐만 아니라 상기 바이오매스를 포함하는 식품 제조물, 식품의약 제품, 기능성 식품, 화장품 및 약용화장품 및 식품 보충물에 관한 것이다. 또한, 본 발명에는 매우 많은 양으로 세포 내에 아연을 농축할 수 있고, 따라서 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 적합한 신규한 미생물 균주가 기재되어 있다.

Description

아연 농화된 바이오매스, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 프로바이오틱 제품, 화장품, 식이성 제품 및 식품의약 제품{ZINC-ENRICHED BIOMASS, METHOD FOR THE PREPARATION THEREOF AND PRO-BIOTIC, COSMETIC, DIETARY AND NUTRACEUTIC PRODUCTS COMPRISING THE SAME}
본 발명은 아연 농화된 바이오매스, 이의 제조 방법, 뿐만 아니라 이를 포함하는 식료품(foodstuff), 프로바이오틱(pro-biotic) 제품, 식이성(dietary) 제품, 식품의약(nutraceutic) 제품 및 화장품(cosmetic)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용되기에 적합한 박테리아 균주에 관한 것이다.
아연은 철을 제외하고는 임의의 다른 미량원소(oligoelement)보다 많은 양으로 유기체에 존재하는 필수적인 무기질이다. 이는 비타민 및 이의 활성, 특히 B-복합 비타민의 일반적인 흡수와 관련된다. 이는 조직 호흡에 필요한 탈산탈수효소를 포함하는 소화 및 대사에서 역할을 하는 매우 많은 수의 효소의 구성 요소이다. 인체에서, 아연은 특히 뼈, 치아, 피부, 간, 근육 및 모발에서 발견된다. 아연은 소장의 보다 높은 부분으로 신속히 흡수된다. 아연은 또한 특정 안구 구조, 전립선, 정자, 피부, 모발, 손톱에 침전되고, 백혈구 세포에서 또한 발견된다. 이러한 공급물은 용이하게 이용가능하지 않고, 따라서 식품은 유기체의 요구를 충족시키기 위해 충분한 양의 아연을 함유해야 한다. 이는 신체 성장, 조직 복구, 및 정상적인 면역 반응에 필요하다. 이는 또한 탄수화물 소화 및 인 대사에 중요하다. 이는 세포에서 다양한 단백질의 생성을 조절하는 핵산의 합성에 관여하고, 비타민 흡수에 중요하고, 치유 과정에 유용하고, 박테리아, 효모 및 피부 부패균 리파아제를 억제한다. 매우 많은 효소는 아연이 활성화되는 것이 필요하며, 이는 단백질 합성, 호르몬 기능의 특정 양태, 뇌 기능, 시각 및 미각에 필요하다. 또한, 알코올 분해와 관련된 알코올 데히드로게나아제 효소가 아연을 함유하며, 따라서 알코올은 아연의 손실을 야기시킨다. 여드름 및 지루 피부염에 대한 요법에서 내부 및 외부 상처에 대한 치유 과정에서 지방 분비를 감소(이는 상처의 치유를 가속화시킴)시키기 위해 아연이 사용된다. 이러한 금속은 전두성 원형탈모증(alopecia aerata totalis)으로부터 고통받는 사람에서 모발 재성장을 촉진할 수 있고, 이는 혈액 인슐린에 대한 조절 효과로 인해 당뇨병 요법에 사용될 수 있다. 인슐린에 아연을 첨가하는 것은 혈당 수준에 대한 호르몬의 효과를 확대시키는 것으로 밝혀졌다.
아연 결핍은 모든 살아있는 생명체에서 심각한 장애를 야기시킨다. 특정 약물, 특히 항-MAO (항-모노아민 옥시다아제), 코르티코스테로이드, 이뇨제가 아연 결핍을 유도할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 아연 결핍은 성장 지연, 성적 미 성숙, 및 보다 긴 상처 치유 시간을 야기시킬 수 있다. 아연 결핍은 또한 죽상경화증을 야기시킬 수 있고, 감염에 대한 민감성을 증가시킬 수 있다. 튼살(Stretch mark) 및 손톱의 흰 반점이 아연 결핍의 증상일 수 있다. 아연 결핍의 다른 증상은 손톱 및 모발 취약, 모발 색소의 결핍, 사춘기 소녀에서의 불규칙한 월경 주기, 젊은 남성에서의 발기불능, 및 청년에서의 무릎 및 엉덩이 관절 동통이다. 만성 아연 고갈은 체세포가 암에 걸리기 쉽게 만들 수 있다. 적은 아연 결핍이라도 유기체에 해로울 수 있고, 예를 들어, 이는 정자 농도의 감소 및 발기불능을 결정할 수 있다. 또한, 아연 결핍은 피로, 보다 높은 감염에 걸리거나 상처를 입을 가능성, 및 감소된 심리 능력을 야기시킨다. 사실, 아연 결핍은 에너지 생성, 단백질 합성, 콜라겐 형성 및 알코올 내성을 방해한다.
프로바이오틱 작용제와 조합된 아연을 함유하는 식품 또는 식이성 조성물은 종래 개시된 바 있다.
예를 들어, 미국 특허 출원 20070009502 A호에는 프로바이오틱 작용제(예를 들어, 효모 및/또는 박테리아, 예를 들어, 비피도박테리움(Bifidobacterium), 엔테로코쿠스(Enterococcus) 또는 락토바실루스(Lactobacillus)), 프레바이오틱(pre-biotic) 작용제, 글루타민 또는 이의 유사체, 글루코오스, 글리신, 전해질, 비타민 및 무기질, 예를 들어, 무기질 아연(100-200 mg/kg)을 포함하는, 위장 미생물총(microflora)의 개선 또는 유지를 위해 계획된 동물 사료에 대한 영양 조성이 기재되어 있다.
특허 출원 WO 2006/112998호에는 다수의 성분, 특히 프로바이오틱(예를 들어, 락토바실루스 및/또는 비피도박테리움) 및 무기질, 예를 들어, 아연을 포함하는, 성장지연으로 고통받는 모유 수유한 유아의 성장을 촉진하기 위해 계획된, 인간 모유와 조합되어 사용되는 액체 영양 보충물이 기재되어 있다.
특허 출원 CA 2525342 A호에는 추가의 보조 성분, 결합제 및 활력 성분, 예를 들어, 아연과 조합된, 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 퍼먼툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 카세이 sbp . 슈도플란타룸(Lactobacillus casei sbp . pseudoplantarum), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei)의 특정 박테리아 균주를 포함하는, 예를 들어, 질병에 대한 면역 반응을 개선시키기 위한, 식품 보충물에 유용한 광범위한 프로바이오틱 식품 제조물이 기재되어 있다.
상기 언급된 종래 문헌에는 인간 또는 동물 체내의 아연 전달에 적합한 조성물이 기재되어 있으며, 아연은 무기 아연의 형태로 존재하고, 프로바이오틱 미생물을 포함하는 많은 다른 성분과 조합되어 있다.
이러한 조성물은 유기 아연보다 인체에 흡수되기에 더욱 어려운 무기 형태로만 아연을 함유하는 불이익을 가진다.
본 발명자들은 이제 비피도박테리움 및 스트렙토코쿠스 속, 특히 비피도박테리움 아니말리스 및 스트렙토코쿠스 써모필루스 종에 속하는 특정 박테리아 종이 무기 아연을 함유하는 배양 배지에서 성장하는 경우 세포 내에 극도로 많은 양의 아연을 축적하는 예기치 않은 이로운 능력을 나타내지만 이러한 많은 양의 세포내 아연이 바이오매스 자체의 생존에 유해하지 않는 것을 발견하였다. 이러한 세포내에 아연을 축적하는 능력은 상기 언급한 박테리아 종이, 자명한 일로서 살아있는 바이오매스를 함유해야 하는 프로바이오틱 제품의 제조에 특히 유용한, 인간 또는 동물 체내에서의 아연 전달 수단으로 사용하기에 특히 적합하도록 만든다. 본 발명의 아연 농화된 바이오매스는 또한 특히 화장품 또는 약용화장품(cosmeceutic)의 제조를 위해 화장품 적용분야에 사용될 수 있다. 화장품의 제조를 위해, 바이오매스는 죽은 미생물로 구성되는 것이 필요한 반면, 약용화장품의 제조를 위해, 바이오매스는 살아 있는 미생물로 구성되는 것이 필요하다.
따라서, 본 발명의 한 목적은, (ⅰ) 아연 염을 포함하는 영양 배양 배지 중에서 비피도박테리움 아니말리스, 스트렙토코쿠스 써모필루스 및 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 배양하여, 이러한 미생물이 세포내 수준으로 아연을 축적하는 단계; 및 (ⅱ) 배양 배지로부터 아연 농화된 미생물을 분리하는 단계에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는, 아연 농화된 바이오매스를 제조하는 방법이다.
세포 내에 축적된 많은 양의 아연을 함유하는 살아 있는 미생물을 포함하는 바이오매스는 본 발명의 방법에 의해 달성되며, 이는 이후에 보고되는 연구로부터 명백하다.
본 발명의 아연 농화된 바이오매스를 제조하는 방법은 첫번째 발효 단계를 제공하며, 여기서 상기 미생물은 아연 염, 바람직하게는 아연 술페이트(ZnSO4)가 보충된, 비피도박테리움 및 스트렙토코쿠스 속으로부터의 성장 미생물(growing micro-organism)에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 영양 배지는 바람직하게는 탄소원, 예를 들어, 글루코오스 및/또는 락토오스; 질소원, 예를 들어, 펩톤, 카세인 가수분해물, 효모 추출물; 무기염; 미량원소 및 비타민원을 함유하는 액체 배지이다.
배양 배지 내의 아연 염의 농도는 바람직하게는 5 내지 50 mM, 더욱 바람직하게는 10 내지 40 mM이다.
아연 술페이트가 바람직하다.
발효는 바람직하게는 25℃ 내지 48℃, 더욱 바람직하게는 35℃ 내지 45℃의 온도에서 수행된다. 액체 배지의 pH 값은 바람직하게는 2.5 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 3.5 내지 7.5이다. 발효 기간은 바람직하게는 6 내지 40시간, 더욱 바람직하게는 8 내지 36시간이다. 발효는 호기성, 미세호기성, 및/또는 혐기성 조건하에서 수행될 수 있다.
발효 단계 후, 바이오매스 성장 및 박테리아 세포 내에서의 아연 축적이 발생하는 동안, 수득된 바이오매스는 임의의 적합한 자체(per se) 공지된 방법, 예를 들어, 원심분리 또는 미세여과에 의해 세포 생활력을 손상시키지 않는 방식으로 배양 배지로부터 분리된다. 따라서, 본 발명의 방법은 아연 농화된 미생물 바이오매스가 살아있는 미생물을 포함하여 수득되는 것을 가능케 한다. 요망시, 수득된 바이오매스는 이후에 통상적인 절차에 따라 수행되는 동결 건조, 건조, 미세피막화 및/또는 동결에 적용될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 또한 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 이로운 것으로 입증된 스트렙토코쿠스 써모필루스 및 비피도박테리움 아니말리스 종으로부터 2개의 미생물 균주를 선택하였는데, 이는 이들이 세포 내에서 아연을 축적하는 특히 높은 능력을 갖기 때문이다. 이러한 균주는 스트렙토코쿠스 써모필루스 ST 16 BM 및 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM으로 명명되었고, 부다페스트 조약 하에 DSMZ (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany)에 스트렙토코쿠스 써모필루스 ST 16 BM은 2007년 7월 13일에 수탁 번호 DSM 19526으로, 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM은 2005년 12월 23일에 수탁 번호 DSM 17850으로 각각 기탁하였다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 아연 농화된 바이오매스는 프로바이오틱 작용제로서 사용하기에 특히 적합하고, 이는 유기 형태로 높은 아연 농도를 함유한다.
이를 위해, 살아있는 미생물을 포함하고, 그에 따라 프로바이오틱 활성을 갖는 바이오매스가 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 이는 프로바이오틱 활성을 갖는 식품 제조물을 수득하기 위해 식품, 바람직하게는 밀크 또는 유제품, 예를 들어, 요구르트에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 이는 적합한 비히클 및/또는 부형제와 조합된 프로바이오틱 활성을 갖는 조성물, 예를 들어, 식품 보충물, 식이성 제품, 기능성 식품의 제조, 또는 경구 투여용의 비-식품 제조물, 예를 들어, 식품의약 제품의 제조에 사용될 수 있다. 이를 위해, 바이오매스는 바람직하게는 동결건조 또는 건조된 조성물 자체 및/또는 미세피막화된 조성물의 형태로 사용된다.
프로바이오틱 활성을 갖는 조성물에 이후에 사용되는 동결 건조되거나 건조된 생성물의 박테리아 적재량(load)은 적어도 1010 - 1011 CFU/g의 생성물이다.
동결건조되거나 건조된 생성물의 제조를 위해, 습윤 바이오매스가 보호제, 예를 들어, 탈지유, 락토오스, 글루코오스, 효모 추출물, 감자 전분, 소듐 글루타메이트, 이노시톨, 소듐 시트레이트, 젤라틴, 말토덱스트린, 마그네슘 스테아레이트, 아스코르브산, 스테아르산 및 이의 조합물을 포함하는, 액체 배지, 예를 들어, 물 또는 멸균 생리 용액에 현탁된다.
이후, 동결건조되거나 건조된 생성물은, 예를 들어, 바람직하게는 109 CFU/g 이상의 생성물의 박테리아 적재량을 수득하기 위해, 동결 건조를 위한, 예를 들어, 상기 기재된 것으로부터 선택된 비활성 물질을 갖는 프로바이오틱의 제조를 위해 희석된다. 동결 건조된 생성물은 실온에서의 안정성을 증가시키기 위해 미세피막화될 수 있다(18-24개월).
바이오매스가 죽어있어야 되는 제품(예를 들어, 화장품 또는 일부 식품, 예를 들어, 제과 제품)의 제조를 위해, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 아연 농화된 바이오매스는 죽은 세포를 수득하기 위해 자체로 공지된 방법, 예를 들어, 건조에 적용된다.
하기 실험 섹션은 예시에 의해서만 제공되나, 이는 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
세포내 아연 흡수 시험
전체 세포내 아연 함량을 비교하고, 세포질 또는 막 수준에서의 금속의 축적 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 아연 술페이트를 포함하거나 불포함하는 배지에서 성장한 프로바이오틱 미생물 균주에 대한 스크리닝을 수행하였다.
MRS 인피젼(MRS infission)에 보관된 비피도박테리움 배양물을 액체 MRS에 접종하고, 37℃에서 혐기적으로 인큐베이션하였다. 24시간의 성장 기간 후, 120 ml(10% v/v)의 액체 MRS 단독 및 10 mM ZnSO4가 보충된 120 ml(10% v/v)의 액체 MRS에 각각 접종하였다. 이러한 배양물을 48시간 동안 37℃에서 혐기 조건하에서 인큐베이션하였다. 스트렙토코쿠스에서의 세포내 흡수 시험을 설정하기 위해 동일한 실험 과정을 후속시켰다. 이러한 경우, 액체 M17 배지를 사용하였고, 배양물을 48시간 동안 42℃에서 혐기 조건하에서 인큐베이션하였다.
건조 중량의 결정을 위해 적은 분취량을 유지시킨 성장의 종료 후, 본 발명자는 원심분리에 의해 배양 배지로부터 바이오매스를 분리하고, 수거된 바이오매스를 무기질침착시켰다.
바이오매스 무기질침착( mineralization )
전체 세포내 아연을 결정하기 위해, 박테리아 세포를 완전히 파열시킨 후, 바이오매스를 이후에 보고되는 프로토콜에 따라 무기질침착시켰다.
세포를 수거하기 위해 100 ml의 성장 배양물을 4500 rpm(4℃로 냉각된 원심분리기 중, Beckman GS-15R centrifuge)에서 30분 동안 원심분리하였다. 이후, 펠렛을 각각 140 ml의 증류수로 4회 세척하여 상층액으로부터 잔여 아연을 배출시켰다. 4번째 물 세척액을 ICP 기술에 의해 아연 함량을 분석하기 위해 유지시켰다.
바이오매스를 질산 HNO3 용액을 이용하여 1:1 비(w/v)로 펠렛을 재현탁시킴으로써 무기질침착시켰다. 무기질침착 과정의 최적화 동안, 세포내 아연의 전체 회수를 달성하기 위해, 본 발명자들은 질산 용액의 농도를 각각 0.65%, 6.5% 및 20%로 증가시켜 사용하였다.
각각의 상기 수득된 세포 현탁액을 스크류-캡(screw-cap) 튜브로 옮기고, 2시간 이상 동안 -20℃에 저장하였다. 이후, 스크류-캡 튜브를 튜브 내에서의 과도한 증발 및 압력을 피하기 위해 화학 후드(chemical hood) 하에 30분 동안 100℃에서 온도조절기 배쓰(thermostat bath)에서 해동시키고, 이를 벤트 니들(vent needle)이 장착된 마개로 밀봉시켰다. 용액을 실온에서 냉각시켰고, 이는 반응 증기가 방출되는 것을 가능케 하였다. 무기질침착 과정의 종료시, 세포 현탁액을 4℃에서 30분 동안 13000 rpm에서 원심분리하여 무기질침착된 추출물을 수거하고 세포 부스러기를 제거하였다.
ICP 에 의한 전체 아연 분석
ICP에 의한 분석을 위해, 샘플을 65% 농축된 HNO3를 이용하여 2%로 산성화시킨 후, 이중 증류수를 이용하여 5 ml의 최종 부피로 희석시켰다. 이러한 작업을 화학 후드 하에서 수행하였다. 이에 따라 수득된 용액을 완전히 투명해질때까지 0.8 μm 셀룰로오스 아세테이트 필터(Millex-AA, Millipore)를 이용하여 여과시켰다.
시험 진행중의 균주에 의해 축적된 세포내 아연의 정량화를 ICP - AES 기술(OES - OPTIMA 4200 DV, Perkin Elmer)에 의해 수행하였다.
상기 시스템은 40 MHz의 주파수를 이용한다. 플라스마 주사를 자동화시키고, 컴퓨터 연결된 전자 시스템에 의해 제어하였다.
사용된 아르곤은 99.99% 순도이어야 하고, 이의 유량은 항상 1 리터/분의 가변 증가량을 갖는, 0 내지 20 리터/분의 범위이어야 한다. 분무된 샘플 유량은 1 리터/분의 가변 증가량을 갖는, 0 내지 0.01 리터/분의 질량 유량 값 내에서 발생하여야 한다.
분무기는 부식 내성 물질로 구성되며, 따라서 상기 시스템은 50%(v/v) 농도의 HCl, HNO3, H2SO4, H3PO4, 30%(v/v) 농도의 NaOH 및 20%(v/v) 농도의 HF를 갖는 용액에 견딜수 있다.
분광광도계는 38℃에서 온도조절기 구획 내에 놓여진 폴리크로마토(polycromator)로 구성된다. 사용된 검출 방법은 CCD이고, 판독은 UV장에서 수행한다.
사용된 분석 파라미터:
분해능: 높음
퍼지( Purge ) 가스 유량: 정상
판독 지연 시간 (초): 45
반복( Replicates ): 3
판독 시간: 자동
최소 시간: 1.000초 - 최대 시간: 10.000 초
광원 평형 지연( Source equilibration delay ): 15초
플라스마 에어로졸 타입: 습식
분무기 개시 조건: 즉시
공지되지 않은 아연 농도를 수득하기 위해, 본 발명자들은 HNO3로 2% 산성화된 하기 표준 용액을 이용하여 구성된 검량선(calibration line)을 사용하였다: 0.5 ppm, 1 ppm, 2 ppm 및 10 ppm 아연.
전체 세포 아연을 건조 바이오매스의 그램 당 금속의 mg으로 나타내었다.
축적된 금속의 전체 세포내 농도를 HNO3를 이용하여 수득된 샘플을 2%로 산성화시킴으로써 상기 기재된 ICP - AES 기술에 의해 규정하였다.
도 1은 비피도박테리움의 다양한 종의 균주에 대해 수행된 흡수 시험에서 측정된 세포내 아연 농도(건조 세포 중량의 그램당 세포내 아연의 mg로 나타냄)를 나타낸다. 특히, 시험을 B. 인펀티스(B. infantis), B. 브레베(B. breve), B. 비피둠(B. bifidum), B. 아니말리스(B. animalis), B. 롱굼(B. longum)의 균주에 대해 수행하였다. 모든 분석된 균주는 아연 비함유 MRS 배지에서 성장하는 경우 매우 낮은 세포내 아연 농도를 나타내며, 이는 0.01 내지 0.20 mg/gDW 사이에 놓인 값을 갖는다. MRS 배양 배지로의 10 mM 아연 술페이트의 첨가는 세포내 아연 농도의 증가를 유도한다. 그러나, 도 1로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 내화된 금속의 농도는 다소 낮고, 이는 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM 균주(수탁 번호 DSM 17850; 기탁일 2005년 12월 23일)를 제외하고는 모든 종의 균주에서 0.72 mg/gDW 내지 2.12 mg/gDW에 놓여있으며, 여기서 세포내 아연 농도는 53.32 mg/gDW로 증가한다(기본 농도의 1,000배 만큼의 증가).
도 2로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 10 mM 아연 술페이트로 농화된 M17 배지(세포내 아연 농도 = 59.31 mg/gDW)(시리즈(Series) 1)에서 성장한 스트렙토코쿠스 써모필루스 ST 16 BM 균주(수탁 번호 DSM 19526; 기탁일 2007년 7월 13일)를 이용하여 동등한 세포내 아연 값이 달성되었다. 도 2는 다른 스트렙토코쿠스 종에 속하는 균주, 예를 들어, S. 살리바리우스(S. salivarius), S. 파에슘(S. faecium) 및 S. 락티스(S. lactis)가 동일한 배지에서 성장하는 경우 훨씬 낮은 세포내 아연을 축적하는 능력을 입증하는 것을 추가로 나타낸다. 또한, 상기 도는 상기 균주가 아연 술페이트가 첨가되지 않은 동일한 M17 배지(시리즈 2)에서 성장하는 경우에 검출된 세포내 아연 농도와의 비교를 나타낸다.
실시예 1
10 mM 아연 술페이트가 첨가된 200 ml의 M17 배지(Merck)를 500 ml 플라스크에서 멸균시켰다. 혐기 조건하에서 42℃에서 24시간 동안 미리 성장한 스트렙토코쿠스 써모필루스 ST 16 BM(수탁 번호 DSM 19526; 기탁일 2007년 7월 13일)의 시드(seed) 배양물을 10%(v/v)의 양으로 플라스크에 접종시켰다. 이후, 배양물을 혐기 조건하에서 42℃에서 40시간 동안 성장하도록 두었다. 배양 종료시에 2.73 x 109 CFU/ml이 수득되었다. 원심분리에 의해 바이오매스를 수거하고, 상기 기재된 방법에 따라 처리하고 분석하였다. 세포에 의해 축적된 전체 아연은 59.31 mg/gDW였다. D.W. = 건조 중량.
실시예 2
실시예 1에서와 같이, SBF31 배지 + 15 mM Zn2 +를 여과에 의해 별개로 멸균하였다. SBF31 배지: 트립톤 23 g/ℓ; 콩 펩톤 16 g/ℓ; 효모 추출물 12 g/ℓ; MgSO4 0.25 g/ℓ; K2HPO4 2.5 g/ℓ; 아스코르브산 0.5 g/ℓ; 글루코오스 45 g/ℓ; Na 디글리세로포스페이트 19 g/ℓ.
발효 시간: 21시간; 살아있는 세포의 생성: 5.3 x 1010 CFU/ml; 축적된 아연: 51.67 mg/gDW.
실시예 3
실시예 1에서와 같이, SBF32 배지 + 30 mM Zn2 +를 여과에 의해 별개로 멸균하였다. 21시간 후, 3.15 x 1010 CFU/ml의 생활력을 갖는 2.1 g/리터의 건조 바이오매스를 수득하였다; 축적된 아연: 63.42 mg/gDW. SBF32 배지: 트립톤 23 g/ℓ; 콩 펩톤 16 g/ℓ; 효모 추출물 12 g/ℓ; MgSO4 0.25 g/ℓ; K2HPO4 2.5 g/ℓ; 아스코르브산 0.5 g/ℓ; 락토오스 45 g/ℓ; 글리세린 19 g/ℓ.
실시예 4
10 mM 아연 술페이트가 첨가된 71 ml의 M17 배지(여과에 의해 별개로 멸균됨)에 스트렙토코쿠스 써모필루스 ST 16 BM(수탁 번호 DSM 19526; 기탁일 2007년 7월 13일)이 혐기 조건하에서 42℃에서 24시간 동안 미리 성장된 동일한 M17 배지 + 10 mM 아연 술페이트로부터의 500 ml의 시드 배양액을 접종시켰다. 발효기 조건: 150 rpm; 0.5 ℓ 공기/ℓ/분; 온도: 42℃; 10% NaOH를 이용하여 4.8 (± 0.2)로 조정된 pH; 발효 시간: 21시간. 2.75 x 1010 CFU/ml를 수득하였다. 세포에 의해 축적된 전체 아연은 57.2 mg/gDW이었다.
실시예 5
log12 및 log18에서 발효 동안 15 mM Zn2 +를 2회 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 4와 같다. 발효 시간: 24시간. 발효 종료시의 세포 생활력: 2.25 x 1010 CFU/ml. 세포에 의해 축적된 전체 아연은 91.3 mg/gDW이었다.
실시예 6
필터 멸균된 10 mM 아연 술페이트가 첨가된, 30분 동안 120℃에서 멸균된 300 ml의 MRS 배지(Merck) + 시스테인을 호기 환경하에서 24시간 이상 동안 예비 환원 상태로 유지시켰다. 37℃에서 혐기 조건하에서 동일한 배지 중에서 24시간 동안 미리 성장한 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM(수탁 번호 DSM 17850; 기탁일 2005년 12월 23일) 시드 배양액을 상기 언급된 300 ml에 10%(v/v)로 접종시키고, 37℃에서 24시간 동안 혐기 조건하에서 성장시켰다. 배양 종료시에 1 x 1011 CFU/ml를 수득하였다. 세포에 의해 축적된 전체 아연은 53.32 mg/gDW이었다.
실시예 7
샤프트(shaft) 대신 진탕기 플레이트가 장착된 15 리터 혐기 발효기를 10리터의 배지와 함께 준비하였고, 조건은 실시예 6과 동일하였다. 아연 술페이트를 15 mM로 조정하였다. 발효기에 24시간의 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM(수탁 번호 DSM 17850; 기탁일 2005년 12월 23일) 시드 배양액 10% v/v를 접종하고, 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 살아있는 세포의 양은 1 x 1011 CFU/ml이었다. 세포에 의해 축적된 전체 아연은 67.1 mg/gDW이었다.
실시예 8
10 mM 아연 술페이트가 첨가된, 0.05% 시스테인을 함유하는 90 ml의 MRS 배지를 100 ml 플라스크에서 멸균시켰다. 동일 배지에서 혐기 조건하에서 37℃에서 24시간 동안 미리 성장한 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM 시드 배양물을 10% v/v의 양으로 플라스크에 접종시켰다. 이후, 배양물을 혐기 조건하에서 37℃에서 40시간 동안 성장하도록 두었다. 배양 종료시에 3.12 x 109 CFU/ml를 수득하였다. 원심분리에 의해 바이오매스를 수거하고, 기재된 방법에 따라 처리하고 분석하였다. 세포에 의해 축적된 전체 Zn은 54.36 mg/g p.s.이었다.
실시예 9
90 ml의 최소 기본 배지(리터당 그램)를 다음과 같이 제조하였다: 카사미노산(Difco Laboratories, Sparks, Md.), 15; 효모 질소 염기(Difco Laboratories), 6.7; 아스코르브산, 10; 아세트산 나트륨, 10; (NH4)2SO4, 5; 우레아, 2; MgSO4·7H2O, 0.2; FeSO4·7H2O, 0.01; MnSO4·7H2O, 0.007; NaCl, 0.01; Tween 80, 1; 시스테인, 0.5 (7.0으로 pH 조정되고, 110℃에서 30분 동안 가압멸균됨). 하기 탄수화물(글루코오스, 프룩토-올리고당류, 이눌린, 라피노오스, 락토오스, 갈락토-올리고당류, 프룩토오스, 갈락토오스 또는 자일로-올리고당류) 중 하나를 별개로 가압멸균시키고, 기본 배지에 첨가하여 10 g/ℓ 농도를 달성하였다. 10 mM 아연 술페이트를 추가로 첨가하였다. 동일 배지에서 혐기 조건하에서 37℃에서 24시간 동안 미리 성장한 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM 시드 배양물을 10% v/v의 양으로 플라스크에 접종시켰다. 이후, 배양물을 혐기 조건하에서 37℃에서 40시간 동안 성장하도록 두었다. 1.5 x 108 CFU/ml 내지 3.2 x 109 CFU/ml 범위의 바이오매스 농도를 배양 종료시에 수득하였다. 원심분리에 의해 바이오매스를 수거하고, 기재된 방법에 따라 처리하고 분석하였다. 세포로 축적된 전체 아연은 48.12 내지 54.37 mg/g p.s.의 범위였다.
실시예 10
0.05% 시스테인을 함유하고, 10 mM 아연 술페이트가 첨가된 2리터의 MRS 배지를 3.6리터의 생물반응기(bioreactor)에서 멸균시키고, 동일 배지에서 24시간 동안 성장한 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM 배양물을 10%로 접종시켰다. 생물반응기를 그대로(in situ) 멸균시키고, 질소로 가압하였다. 반응 조건은 다음과 같았다: 0.01에서의 일정한 질소 주입, 150 rpm, 37℃, 0.1M NaOH를 이용하여 6.2에서 유지된 pH. 48시간 후, 바이오매스는 3.6 x 109 CFU/ml의 농도를 가졌다. 바이오매스를 수거하고, 아연의 양에 대해 분석하였다. 세포에 축적된 전체 아연은 53.81 mg/g p.s.이었다.
실시예 11
0.05% 시스테인을 함유하는 2리터의 MRS 배지를 3.6 리터의 생물반응기에서 멸균시키고, 동일 배지에서 24시간 동안 성장한 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM 배양물을 10%로 접종시켰다. 생물반응기를 그대로 멸균시키고, 질소를 이용하여 가압하였다. 반응 조건은 다음과 같았다: 0.01에서의 일정한 질소 주입, 150 rpm, 37℃, 0.1M NaOH를 이용하여 6.2에서 유지된 pH. 24시간의 성장 기간 후, 아연 술페이트를 배양물에 첨가하여 10 mM 최종 농도를 달성하였다. 금속 첨가 24시간 후, 바이오매스는 3.6 x 109 CFU/ml의 농도를 가졌다. 바이오매스를 수거하고, 아연의 양에 대해 분석하였다. 세포에 축적된 전체 아연은 53.81 mg/g p.s.이었다.
실시예 12
10 mM 아연 술페이트가 첨가된, 0.05% 시스테인을 함유하는 10리터의 MRS 배지를 3.6리터의 생물반응기에서 멸균시키고, 동일 배지에서 24시간 동안 성장한 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM 배양물을 10%로 접종시켰다. 생물반응기를 그대로 멸균시키고, 질소를 이용하여 가압하였다. 반응 조건은 다음과 같았다: 0.01에서의 일정한 질소 주입, 150 rpm, 37℃, 0.1M NaOH를 이용하여 6.2로 유지된 pH. NaOH 인력의 종료에 의해 나타나는 바와 같이 배양이 산성으로 종료된 후, 배양물을 30% 글루코오스 및 10 mM 아연 술페이트 용액과 함께 유가배양(fed-batch) 방식으로 공급하였다. 15리터 부피에 도달한 후, 바이오매스는 1.2 x 1010 CFU/ml의 농도를 가졌고, 수거하고, 아연의 양에 대해 분석하였다. 세포에 축적된 전체 아연은 52.15 mg/g p.s.이었다.
독일미생물보존센터(DSMZ) DSM17850 20051223 독일미생물보존센터(DSMZ) DSM19526 20070713

Claims (36)

  1. (ⅰ) 2007년 7월 13일에 수탁 번호 DSM 19526으로 독일 브라운슈바이크 DSMZ(DSMZ, Braunschweig, Germany)에 부다페스트 조약하에 기탁된 스트렙토코쿠스 써모필루스 ST 16 BM(Streptococcus thermophilus ST 16 BM), 및 2005년 12월 23일에 수탁 번호 DSM 17850으로 독일 브라운슈바이크 DSMZ에 부다페스트 조약하에 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM(Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB 1 BM) 및 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 아연 염을 포함하는 영양 배양 배지 중에서 배양하여, 상기 미생물이 아연을 축적하는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 배양 배지로부터 아연 농화된 미생물을 분리하는 단계에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는, 아연 농화된 바이오매스(biomass)를 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 배양 배지로부터 분리된 상기 미생물이 동결 건조, 건조, 미세피막화(micro-encapsulation) 및 동결로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상에 적용되는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 아연 염이 아연 술페이트인 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 영양 배양 배지가 5 내지 50 mM 범위의 아연 술페이트 양을 포함하는 방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 배양 배지가 액체 배지인 방법.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 배양 배지가 무기염, 탄소, 질소, 비타민 및 미세-영양소 공급원, 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된, 상기 미생물의 성장을 위한 통상적인 영양소를 포함하는 방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 배양 배지가 2.5 내지 8.0의 범위의 pH를 갖는 방법.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미생물이 25℃ 내지 48℃ 범위의 온도에서 상기 배양 배지에서 배양되는 방법.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미생물이 6 내지 40시간 동안 상기 배양 배지에서 배양되는 방법.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미생물이 원심분리 또는 미세여과에 의해 배양 배지로부터 분리되는 방법.
  12. 제 1항 또는 제 2항에 따른 방법에 의해 수득가능한 아연 농화된 바이오매스.
  13. 삭제
  14. 제 12항에 있어서, 살아 있는 미생물을 포함하는 바이오매스.
  15. 제 14항에 있어서, 프로바이오틱(pro-biotic) 작용제로서의 바이오매스.
  16. 프로바이오틱 활성을 갖는 조성물의 제조에 사용하기 위한, 제 14항에 따른 바이오매스.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 프로바이오틱 활성을 갖는 조성물이 음식 보충물, 식이성 제품, 기능성 식료품, 식품의약 제품 및 식품 제조물로 구성된 군으로부터 선택되는 바이오매스.
  18. 제 12항에 있어서, 죽은 미생물을 포함하는 바이오매스.
  19. 화장품 또는 식품의 제조에 사용하기 위한, 제 18항에 따른 바이오매스.
  20. 비히클, 부형제 또는 비히클 및 부형제와 조합된 제 14항에 따른 아연 농화된 살아 있는 바이오매스를 포함하는 프로바이오틱 활성을 갖는 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 109 CFU/g 이상의 박테리아 적재량(load)을 갖는 조성물.
  22. 제 20항에 따른 조성물을 포함하는 식품 제조물(food preparation).
  23. 제 21항에 따른 조성물을 포함하는 식품 제조물.
  24. 제 20항에 따른 조성물을 포함하는 식품 보충물(food supplement).
  25. 제 21항에 따른 조성물을 포함하는 식품 보충물.
  26. 제 20항에 따른 조성물을 포함하는 식이성 제품(dietary product).
  27. 제 21항에 따른 조성물을 포함하는 식이성 제품.
  28. 제 20항에 따른 조성물을 포함하는 기능성 식품(functional food).
  29. 제 21항에 따른 조성물을 포함하는 기능성 식품.
  30. 제 20항에 따른 조성물을 포함하는 식품의약 제품(nutraceutic product).
  31. 제 21항에 따른 조성물을 포함하는 식품의약 제품.
  32. 제 20항에 따른 조성물을 포함하는 약용화장품(cosmeceutic product).
  33. 제 21항에 따른 조성물을 포함하는 약용화장품.
  34. 제 18항에 따른 바이오매스를 포함하는 화장품.
  35. 제 18항에 따른 바이오매스를 포함하는 식품.
  36. 2007년 7월 13일에 수탁 번호 DSM 19526으로 독일 브라운슈바이크 DSMZ에 부다페스트 조약하에 기탁된 스트렙토코쿠스 써모필루스 ST 16 BM 균주, 및 2005년 12월 23일에 수탁 번호 DSM 17850으로 독일 브라운슈바이크 DSMZ에 부다페스트 조약하에 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB 1 BM 균주로부터 선택된 미생물.


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