TW202239965A - 用於生產γ-胺基丁酸的方法及其所製得的發酵培養物 - Google Patents

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何協勳
陳敬偉
黃玉芬
許宸泓
林文揚
郭易緯
蔡欣宇
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豐華生物科技股份有限公司
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本發明揭示一種用於生產γ-胺基丁酸的方法，其包括：將一具有γ-胺基丁酸生產能力的乳酸菌菌株培養於一含有麩胺酸或其鹽類的培養基中。本發明亦揭示使用該方法所製得的發酵培養物。

Description

用於生產γ-胺基丁酸的方法及其所製得的發酵培養物
本發明是有關於一種用於生產γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)的方法。本發明亦有關於使用該方法所製得之含有γ-胺基丁酸的發酵培養物。
γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一種廣泛地存在於微生物、植物以及哺乳動物中樞神經系統與周邊組織內的抑制性神經傳導物(inhibitory neurotransmitter)，可藉由麩胺酸脫羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化麩胺酸 (glutamic aicd)或其鹽類發生脫羧反應(decarboxylation)而被生成。
GABA已被發現對於人體有提升免疫力、促進血液循環、降血壓、穩定血糖、舒緩壓力以及抗焦慮等效用，而可供用於改善腦中風後遺症、高血壓(hypertension)、憂鬱症(depression)、失眠(insomnia)、更年期症候群(menopausal syndrome)以及腸躁症(irritable bowel syndrome, IBS)等。基於GABA在醫藥產業中的有益效用，本技術領域的研究人員致力於研發出能夠大量生產GABA的方法以滿足廣大的市場需求。微生物發酵(microbial fermentation)具有成本低、生產快速以及安全性高等優點，因此，已被廣泛地用來生產GABA。
益生菌(probiotics)是一種有益於健康之活的微生物食品成分(microbial food ingredient)，可選擇性地刺激腸道中的原生細菌(native bacteria)的生長，改變腸道微生物群(intestinal microflora)的組成、數量或性質，促進宿主的腸道健康，進而提升宿主的免疫反應(immune response)。目前已知可作為益生菌使用的微生物包括乳桿菌屬( Lactobacillus)、雙叉桿菌屬( Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬( Bacillus)、乳球菌屬( Lactococcus)、腸球菌屬( Enterococcus)、酵母菌屬( Saccharomyces)、鏈球菌屬( Streptococcus)等物種。
目前已有一些乳桿菌屬以及雙叉桿菌屬的菌株被發現具有GABA生產能力，例如短乳桿菌( L. brevis) 877G、短乳桿菌CGMCC 1306、布氏乳桿菌( L. buchneri) OPM-1、戴白氏乳桿菌保加利亞亞種( L. delbrueckiisubsp. bulgaricus) PR1、發酵乳桿菌( L. fermentum) YS2、副乾酪乳桿菌( L. paracasei) NFRI 7415，以及植物乳酸桿菌( L. plantarum) ATCC 14917等(Y.H. Cui et al.(2020), Int. J. Mol. Sci., 21(3): 995)。
雖然已有上述的先前研究，基於GABA在市場上有廣大的需求，本技藝中仍然存在有一需要去研發出一種能夠大量生產GABA的方法來以滿足產業界之所需。
發明概要
在開發可用於生產γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)的乳酸菌菌株上，申請人意外地發現到，短雙歧桿菌( Bifidobacterium breve) CCFM1025 (GDMCC No. 60386；BCRC 911057)、嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06 (BCRC 910813)、植物乳酸桿菌( Lactobacillus plantarum) LPL28 (BCRC 910536)、長雙歧桿菌嬰兒亞種( Bifidobacterium longumsubsp . infantis) BLI-02 (BCRC 910812)以及唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp. salicinius) AP-32 (BCRC 910437)不僅具有優異的GABA生產能力，並且在以特定比例進行組合下能夠產生協同效應(synergistic effect)，進一步提升該組合之整體的GABA生產能力。
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於生產γ-胺基丁酸的方法，其包括：將一具有γ-胺基丁酸生產能力的乳酸菌菌株培養於一含有麩胺酸或其鹽類的培養基中，其中該乳酸菌菌株是選自於由下列所構成的群組：短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32，以及它們的組合。
在第二個方面，本發明提供一種含有γ-胺基丁酸的發酵培養物，它是藉由一如上所述的方法而被製得。
在第三個方面，本發明提供一種藥學組成物，其包含有一如上所述的發酵培養物，以及選擇性地一藥學上可接受的載劑。
在第四個方面，本發明提供一種食品產品，其包含有一如上所述的發酵培養物。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種用於生產γ-胺基丁酸的方法，其包括：將一具有γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)生產能力的乳酸菌菌株培養於一含有麩胺酸或其鹽類(glutamic acid or salts thereof)的培養基中，其中該乳酸菌菌株是選自於由下列所構成的群組：短雙歧桿菌( Bifidobacterium breve) CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06、植物乳酸桿菌( Lactobacillus plantarum) LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種( Bifidobacterium longumsubsp . infantis) BLI-02以及唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp. salicinius) AP-32，以及它們的組合。
較佳地，該麩胺酸或其鹽類是L-麩胺酸(L-glutamic acid)、麩胺酸鈉(monosodium glutamate, MSG)，或者它們的組合。
依據本發明，該含有麩胺酸或其鹽類的培養基可藉由對一適於乳酸菌生長的基礎培養基添加麩胺酸或其鹽類而被製得。較佳地，該基礎培養基中添加有1-5%的MSG，更佳地，1-3%的MSG。在本發明的一個較佳具體例中，該基礎培養基中添加有3%的MSG。
適於乳酸菌生長的基礎培養基是熟習此項技藝者所熟知的，並且可以是自行配製的，或者是商業上可購得的產品，這包括，但不限於：MRS肉湯培養基(MRS broth)以及添加有半胱胺酸(cysteine)的MRS肉湯培養基。
依據本發明，適用於本發明的基礎培養基可包含有一選自於由下列所構成之群組中的碳源(carbon source)：葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、麥芽糖(maltose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、海藻糖(trehalose)、澱粉(starch)、馬鈴薯澱粉(potato starch)、麥芽萃取物(malt extract)、麥芽糊精(maltodextrin)，以及它們的組合。較佳地，該培養基包含有1-15%的葡萄糖，更佳地，1-5%的葡萄糖。在本發明的一個較佳具體例中，該培養基包含有5%的葡萄糖。
依據本發明，適用於本發明的基礎培養基可包含有一選自於由下列所構成之群組中的氮源(nitrogen source)：(NH 4) 2SO 4、(NH 4) 3PO 4、NH 4NO 3、NH 4Cl、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、蛋白腖(peptone)、聚蛋白腖(polypeptone)、胰化腖(tryptone)、肉類萃取物(meat extract)、酵母萃取物(yeast extract)、酵母粉(yeast powder)、牛奶、脫脂奶粉、大豆粉(soybean flour)、乳清，以及它們的組合。較佳地，該基礎培養基包含有0-25%的脫脂奶粉、0-15%的蛋白腖以及1-15%的酵母萃取物，更佳地，2-15%的脫脂奶粉、3-10%的蛋白腖以及1-5%的酵母萃取物。在本發明的一個較佳具體例中，該基礎培養基包含有12%的脫脂奶粉、7%的蛋白腖以及3%的酵母萃取物。
如本文中所使用的，術語“培養(culturing)”、“發酵(fermentation)”以及“培育(cultivation)”可被交換地使用。有關培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在此方面，可以參考，例如，Hsieh P.S. et al. (2013), New Microbiol., 36:167-179。
依據本發明，該培養可在一範圍落在25℃至40℃內的溫度下被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該培養是於37℃下被進行。
依據本發明，該培養可被進行歷時一段範圍落在20至40小時內的時間。在本發明的一個較佳具體例中，該培養被進行歷時24小時。
依據本發明，該乳酸菌菌株可以是一含有短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32中任三者的組合。
較佳地，該乳酸菌菌株是選自於：一含有短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及植物乳酸桿菌LPL28的組合；一含有短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合；一含有短雙歧桿菌CCFM1025、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合；一含有植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合；一含有嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的組合；一含有短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的組合；一含有短雙歧桿菌CCFM1025、植物乳酸桿菌LPL28以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合；一含有嗜酸乳酸桿菌TYCA06、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合；一含有短雙歧桿菌CCFM1025、植物乳酸桿菌LPL28以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的組合；以及一含有嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合。
在本發明的一個較佳具體例中，該乳酸菌菌株是一含有嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28，以及短雙歧桿菌CCFM1025的組合。
依據本發明，嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28，以及短雙歧桿菌CCFM1025的菌數比是落在1：0.2：0.2至1：5：1內的範圍內。在本發明的一個較佳具體例中，嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28，以及短雙歧桿菌CCFM1025的菌數比是1：4：2。
依據本發明，該乳酸菌菌株可以是一含有短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32中任四者的組合。
較佳地，該乳酸菌菌株是選自於：一含有嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合；一含有短雙歧桿菌CCFM1025、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合；一含有短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合；一含有短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合；以及一含有短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的組合。
在本發明的一個較佳具體例中，該乳酸菌菌株是一含有嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合。
依據本發明，嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的菌數比可落在1：0.067：0.067：0.067至1：4：4：4的範圍內。在本發明的一個較佳具體例中，嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02，以及唾液乳酸桿菌AP-32的菌數比是1：1：1：1。
本發明亦提供一種含有γ-胺基丁酸的發酵培養物，它是藉由一如上所述的方法而被製得。
基於γ-胺基丁酸的習知藥理活性，依據本發明之含有γ-胺基丁酸的發酵培養物被預期可供應用於製備一具有下列至少一種醫藥用途之醫藥品：用於提升免疫力、治療失眠症(insomnia)、憂鬱症(depression)、高血壓(hypertension)、改善睡眠障礙(sleep disorder)、焦慮(anxiety)、更年期症候群(menopausal syndrome)以及腸胃道疾病(gastrointestinal tract disorder)等。
於是，本發明提供一種藥學組成物，其包含有一如上所述的發酵培養物，以及選擇性地一藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥(oral administration)或局部投藥(topical administration)之劑型(dosage form)。
依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥的劑型，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、濃漿(slurry)以及類似之物。
此外，該含有γ-胺基丁酸的發酵培養物亦被預期可供應用於製備一具有下列至少一種保健用途之食品：在製備用於提升免疫力、治療失眠症、憂鬱症、高血壓、改善睡眠障礙、焦慮、更年期症候群以及腸胃道疾病等。
於是，本發明亦提供一種食品產品(food product)，其包含有一如上所述的發酵培養物。該發酵培養物可以被當作食品添加物(food additive)而藉由習知方法於原料製備時被添加，或是被配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
依據本發明，該食品產品的種類包括，但不限於：奶粉(milk powder)、飲料(beverages)、甜點(confectionery)、糖果(candies)、發酵食品(fermented foods)、動物飼料(animal feeds)、健康食品(health foods)、膳食補充品(dietary supplements)、果凍(jelly)、嬰兒配方(infant formulas)、沙拉醬(dressings)、蛋黃醬(mayonnaise)、塗醬(spreads)、鮮乳油(creams)、醬料(sauces)、布丁(puddings)、冰淇淋(ice-cream)以及蕃茄醬(ketchup)。 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1.     發酵培養基：
在下面的實施例中所使用之含有麩胺酸鈉(monosodium glutamate, MSG)的發酵培養基具有一如下面表1所示的配方。 表1. 發酵培養基的配方
成分 含量(%)
葡萄糖 1-5
脫脂奶粉 2-15
蛋白腖(peptone) 3-10
酵母萃取物(yeast extract) 1-5
磷酸氫二鉀(potassium hydrogen phosphate) 0.05-0.2
檸檬酸鈉(sodium citrate) 0-0.1
硫酸錳[Manganese(II) sulfate] 0-0.1
MSG 1-5
Tween 80 0.05-0.2
餘量為純水
2.  乳酸菌菌株：
在下面實施例中拿來進行功效評估的乳酸菌菌株短雙歧桿菌( Bifidobacterium breve) CCFM1025已被揭露於CN 108949640 B中，並且已被寄存於中國廣東省微生物菌種保藏中心(Guangdong Microbial Culture Collection Center, GDMCC)。另外，短雙歧桿菌CCFM1025亦有額外被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。其餘乳酸菌菌株則是被揭露於TW I709374 B中，並且已被寄存於台灣的食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心，以及中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)或中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)。為表清楚，各個乳酸菌菌株的相關資訊(包括：學名、寄存編號以及寄存日期等)已被整合於下面表2中。 表2. 各個乳酸菌菌株的寄存編號與寄存日期
乳酸菌菌株 寄存編號 寄存日期
短雙歧桿菌( Bifidobacterium breve) CCFM1025 BCRC 911057 2021/05/07
GDMCC No. 60386 2018/06/11
嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06 BCRC 910813 2018/01/18
CGMCC No. 15210 2018/01/15
植物乳酸桿菌( Lactobacillus plantarum) LPL28 BCRC 910536 2011/12/27
CGMCC No. 17954 2019/06/18
長雙歧桿菌嬰兒亞種( Bifidobacterium longumsubsp . infantis) BLI-02 BCRC 910812 2018/01/18
CGMCC No. 15212 2018/01/15
唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp. salicinius) AP-32 BCRC 910437 2009/07/30
CCTCC No: M 2011127 2011/04/10
註：短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及唾液乳酸桿菌AP-32已可自由分讓。
為供比較，亦有使用下列乳酸菌菌株：申請人自行分離出的短雙歧桿菌gL-57、嗜酸乳酸桿菌gL-6、植物乳酸桿菌gL-335、長雙歧桿菌嬰兒亞種gL-54以及唾液乳酸桿菌gL-301。 一般實驗方法： 1.   γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)的測定：
在下面的實施例中，待測樣品中所含有的GABA的濃度是藉由使用AccQ‧Tag化學套組(AccQ‧Tag Chemistry Package)(Waters, Cat. No. WAT052875)並依照製造商的操作指南來進行的胺基酸衍生化(amino acid derivatization)以及高效能液相層析(high performance liquid chromatography, HPLC)分析來進行測定。所使用的HPLC分析儀器如下：高效能液相層析系統(Alliance e2695 XE HPLC System)(Waters)以及Altus A-10 UV偵測器(Altus A-10 UV detector)(PerkinElmer, Inc.)，而有關HPLC的各項操作參數與條件，以及移動相的梯度洗提(gradient elution)設定分別顯示於下面的表3中。 表3. HPLC的操作參數與條件
分離管柱 AccQ•Tag胺基酸分析管柱(AccQ•Tag Amino Acid Analysis Column)(Waters, Cat. No. WAT052885)
管柱規格 150 mm × 3.9 mm
管柱溫度 25℃
樣品注射體積 10 μL
偵測波長 274 nm
移動相 ddH 2O/10% (v/v)的AccQ-Tag洗提液A (AccQ-Tag Eluent A)水溶液/乙腈(acetonitrile)
流速(mL/分鐘) 1.0
為供比對，使用添加有GABA (Sigma-Aldrich, Cat. No. 03835-250MG)的胺基酸標準品(amino acid standard)(購自於Waters)來作為對照標準品(control standard)並進行相同的胺基酸衍生化以及HPLC分析。 2.   統計學分析(statistical analysis)：
在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，所得到的實驗數據是以“平均值(mean)±標準偏差(standard deviation, SD)”來表示。 實施例 1. 乳酸菌菌株在生產 GABA 上的效用評估 A 、 乳酸菌菌株的發酵：
首先，將上面“一般實驗材料”的第2項當中所述的10種乳酸菌菌株分別接種至100 mL之發酵培養基中，並於37℃下進行培養歷時24小時，俾以活化菌株。接著，將所得到的經活化的乳酸菌菌株培養物(其具有一約為1×10 9CFU/mL的濃度)，繼而依據表4所示來分組且分別以一為3% (v/v)的接種量接種至5 L的發酵培養基中，並於一厭氧條件下以及37℃下進行發酵培養歷時隔夜，而得到單菌實驗組1至5以及單菌比較組1至5的發酵培養物。
此外，將短雙歧桿菌CCFM1025、短雙歧桿菌gL-57、嗜酸乳酸桿菌TYCA06、嗜酸乳酸桿菌gL-6、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32之經活化的菌株依據下面表5和表6所示的比例來進行混合，接著以一為3% (v/v)的接種量接種至5 L的發酵培養基中，並於一厭氧條件下以及37℃下進行發酵培養歷時隔夜，而得到三菌實驗組1至7、三菌比較組、四菌實驗組1至9，以及四菌比較組的發酵培養物。
之後，將各組發酵培養物以12,000 g來進行離心歷時10分鐘，接著各取10 μL的上清液來做為待測樣品。 表4.   單菌組所接種的乳酸菌菌株
組別 短雙歧桿菌 嗜酸乳酸桿菌 植物乳酸桿菌 長雙歧桿菌嬰兒亞種 唾液乳酸桿菌
單菌實驗組1 CCFM1025 － － － －
單菌實驗組2 － TYCA06 － － －
單菌實驗組3 － － LPL28 － －
單菌實驗組4 － － － BLI-02  
單菌實驗組5 － － － － AP-32
單俊比較組1 gL-57 － － － －
單菌比較組2 － gL-6 － － －
單菌比較組3 － － gL-335 － －
單菌比較組4 － － － gL-54 －
單菌比較組5 － － － － gL-301
表5.   三菌組所接種的乳酸菌菌株
組別 TYCA06：LPL28：CCFM1025
三菌實驗組1 1：0.067：0.067
三菌實驗組2 1：0.2：0.2
三菌實驗組3 1：1：1
三菌實驗組4 1：1：5
三菌實驗組5 1：4：2
三菌實驗組6 1：5：1
三菌實驗組7 1：15：1
組別 TYAC06:LPL28：gL-57
三菌比較組 1：1：1
表6.   四菌組所接種的乳酸菌菌株的混合比例
組別 TYCA06：LPL28：BLI-02：AP-32
四菌實驗組1 1：0.067：0.067：0.067
四菌實驗組2 1：0.25：0.25：0.25
四菌實驗組3 1：1：1：1
四菌實驗組4 1：1：1：4
四菌實驗組5 1：1：4：1
四菌實驗組6 1：4：1：1
四菌實驗組7 1：1：1：15
四菌實驗組8 1：1：15：1
四菌實驗組9 1：15：1：1
組別 gL-6：LPL28：BLI-02：AP-32
四菌比較組 1：1：1：1
B 、 生產 GABA 能力的測定：
將各組的待測樣品分別依據上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來進行GABA含量的測定。另外，申請人將未經接種乳酸菌的發酵培養基於37℃下予以培育隔夜，繼而拿來作為空白對照組的待測樣品，並進行相同的GABA含量測定。
各組乳酸菌菌株的相對GABA生產百分比(%)是藉由將各組所測得的GABA含量除以空白對照組所測得的GABA含量來予以標準化而得到。之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
所得到的結果被顯示於圖1以及圖2中。由圖1可見，單菌比較組1至5的相對GABA生產百分比皆小於100%，這表示單菌比較組1至5的乳酸菌菌株皆無法生產GABA。相對地，單菌實驗組1至5的相對GABA生產百分比皆大於100%，其中單菌實驗組1的相對GABA生產百分比幾乎可達至約300%。由此可見，相較於其他的短雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌、植物乳酸桿菌、長雙歧桿菌嬰兒亞種以及唾液乳酸桿菌菌株，短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TCYA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32皆具有優異的GABA生產能力，特別是短雙歧桿菌CCFM1025。
由圖2可見，三菌實驗組2至6的相對GABA生產百分比是顯著地高於單菌實驗組1至3所具者，甚至可達致400%以上。相對地，三菌實驗組1與7的相對GABA生產百分比則有明顯的降低，甚至低於單菌實驗組1或2所具者。由此可見，嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28以及短雙歧桿菌CCFM1025在以特定的比例範圍內進行組合使用下能夠產生協同效應(synergistic effect)，大幅提升整體的GABA生產能力，而以其他比例進行組合使用下則無法展現此效用，可能還會影響整體的GABA生產能力。
再者，三菌比較組的相對GABA生產百分比不僅顯著低於三菌實驗組2至6所具者，亦低於單菌實驗組1至3所具者。由此可見，將上述3種乳酸菌菌株替換其中一者則無法達到相同的協同效應，甚至會對整體的GABA生產能力產生顯著的負面影響。
另一方面，由圖3可見，四菌實驗組1至6的相對GABA生產百分比亦是顯著地高於單菌實驗組2至5所具者，甚至可達致400%以上。相對地，四菌實驗組7至9的相對GABA生產百分比則有明顯的降低，甚至低於單菌實驗組2所具者。由此可見，嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32在以特定的比例範圍內進行組合使用下能夠產生協同效應，大幅提升整體的GABA生產能力，而以其他比例進行組合使用下則無法展現此效用，可能還會影響整體的GABA生產能力。
此外，四菌比較組的相對GABA生產百分比不僅顯著低於四菌實驗組1至6所具者，亦低於單菌實驗組2至5所具者。由此可見，將上述4種乳酸菌菌株替換其中一者則無法達到相同的協同效應，甚至還會對整體的GABA生產能力產生顯著的負面影響。
另外，申請人有進一步將單菌實驗組2至5以及四菌實驗組1的發酵培養物予以離心，之後收集上清液來進行噴霧乾燥，將所得到的各組發酵培養物上清液的乾燥粉末溶於純水中，繼而分別依據上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來進行GABA含量的測定。結果顯示，該等組別(特別是四菌實驗組1)的發酵培養物上清液的乾燥粉末內仍可測得高量的GABA (數據未顯示)。
上面的實驗結果顯示：短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32各自皆具有優異的GABA生產能力，並且在組合使用下更能進一步提升此功效。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1顯示各組所測得的相對GABA生產百分比，其中單菌實驗組1至5分別表示短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的發酵培養物，單菌比較組1至5分別表示短雙歧桿菌gL-57、嗜酸乳酸桿菌gL-6、植物乳酸桿菌gL-335、長雙歧桿菌嬰兒亞種gL-54以及唾液乳酸桿菌gL-301的發酵培養物； 圖2顯示各組所測得的相對GABA生產百分比，其中單菌實驗組1至3分別表示短雙歧桿菌CCFM1025、嗜酸乳酸桿菌TYCA06，以及植物乳酸桿菌LPL28的發酵培養物；三菌實驗組1至7表示以下面表5所示之不同比例混合的嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28，以及短雙歧桿菌CCFM1025的發酵培養物；以及三菌比較組表示以下面表5所示之比例混合的嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28，以及短雙歧桿菌gL-57的發酵培養物；以及 圖3顯示各組所測得的相對GABA生產百分比，其中單菌實驗組2至5分別表示嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的發酵培養物；四菌實驗組1至9表示以下面表6所示之不同比例混合的嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的發酵培養物；以及四菌比較組表示以下面表6所示之比例混合的嗜酸乳酸桿菌gL-6、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的發酵培養物。
TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2011/12/27；BCRC 910536。
TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2018/01/18；BCRC 910812。
TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2021/05/07；BCRC 911057。

Claims (10)

  1. 一種用於生產γ-胺基丁酸的方法，其包括：將一具有γ-胺基丁酸生產能力的乳酸菌菌株培養於一含有麩胺酸或其鹽類的培養基中，其中該乳酸菌菌株是選自於由下列所構成的群組：短雙歧桿菌( Bifidobacterium breve) CCFM1025 (GDMCC No. 60386；BCRC 911057)、嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06 (BCRC 910813)、植物乳酸桿菌( Lactobacillus plantarum) LPL28 (BCRC 910536)、長雙歧桿菌嬰兒亞種( Bifidobacterium longumsubsp . infantis) BLI-02 (BCRC 910812)以及唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp. salicinius) AP-32 (BCRC 910437)，以及它們的組合。
  2. 如請求項1的方法，其中該乳酸菌菌株是一含有嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28，以及短雙歧桿菌CCFM1025的組合。
  3. 如請求項2的方法，其中嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28，以及短雙歧桿菌CCFM1025的菌數比是落在1：0.2：0.2至1：5：1內的範圍內。
  4. 如請求項3的方法，其中該菌數比是1：4：2。
  5. 如請求項1的方法，其中該乳酸菌菌株是一含有嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及唾液乳酸桿菌AP-32的組合。
  6. 如請求項5的方法，其中嗜酸乳酸桿菌TYCA06、植物乳酸桿菌LPL28、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02，以及唾液乳酸桿菌AP-32的菌數比是落在1：0.067：0.067：0.067至1：4：4：4內的範圍內。
  7. 如請求項6的方法，其中該菌數比是1：1：1：1。
  8. 一種含有γ-胺基丁酸的發酵培養物，它是藉由一如請求項1至7中任一項的方法而被製得。
  9. 一種藥學組成物，其包含有一如請求項8的發酵培養物，以及選擇性地一藥學上可接受的載劑。
  10. 一種食品產品，其包含有一如請求項8的發酵培養物。
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