KR20110052809A

KR20110052809A - 균체외 다당을 생성하고 건강기능성 효과를 갖는 신규한 페디오코커스 펜토사세우스

Info

Publication number: KR20110052809A
Application number: KR1020090109482A
Authority: KR
Inventors: 윤향식; 김기식; 노재관; 송인규; 한남수; 조승기; 김지은; 최혜선
Original assignee: 충청북도 (관리부서:충청북도 농업기술원); 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2011-05-19
Also published as: KR101109746B1

Abstract

본 발명은 신규한 페디오코커스 속 미생물에 관한 것으로서 본 발명의 균주는 다당(polysaccharide)생성, 면역증강, 항암(유방암, 폐암), 항고혈압, 항균활성을 나타내기 때문에, 우수한 발효식품 스타터 뿐만 아니라, 면역증강제, 식품첨가제, 생균제 등 건강기능소재 및 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다.

페디오코커스 펜토사세우스, 엑소폴리사카라이드, 균체외 다당, 면역증강, 항암, 항고혈압, 항균

Description

균체외 다당을 생성하고 건강기능성 효과를 갖는 신규한 페디오코커스 펜토사세우스{A Polysaccharide producing Pediococcus pentosacues and a use thereof}

본 발명은 신규한 페디오코커스 속 미생물에 관한 것으로서, 본 발명의 미생물은 다당(polysaccharide)생성, 면역증강, 항암(유방암, 폐암), 항고혈압, 항균활성을 나타내기 때문에, 우수한 발효식품 스타터 뿐만 아니라, 면역증강제, 식품첨가제, 생균제 등 건강기능소재 및 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다.

유산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 분해를 하고, 이를 이용하여 유산을 만들며, 통성 혐기성균 또는 편성 혐기성균이다. 유산균은 5개 속으로 구분되며, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스탁(Leuconostoc), 비피도박테리아 (Bifidobacteria), 그리고 페디오코커스(Pediococcus)로 나뉜다. 유계(밀크)의 유산균으로는 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb . acidophilus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis 등이 있다. 이들은 이미 유럽을 통해 많은 연구가 되어져 왔다. 식물계 유산균은 Lb. plantarum, Lb. brevis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus이 알려져 있으며 한국을 포함한 동아시아 지역의 채소발효식품의 주된 유산균으로 알려져 있다.

유산균은 유산을 생성하여 장내 pH를 산성으로 유지시켜 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐 아니라, 비타민 합성, 항암작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 한다. 특히, 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특정한 단백질을 가지고 있어서 유해 세균의 성장을 막아서, 정장 작용에 많은 도움을 준다. 또한, 유산균은 면역증강 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며, 대식세포의 증식을 촉진하여 대식세포의 장내 유해 세균에 대한 인지능력, 살균능력 등을 강화시키는 역할을 한다. (Saavedra, J. M. 2001. Am . J. Clin . Nutr. 73: 1147S-1151S: Sashihara, T., Sueki,N. and Ikegami, S. 2006. J Dairy Sci . 89: 2846-55.) 또한 유산균의 대사물질 중 펩타이드성 항균물질을 만들어 내는데 이를 bacteriocin이라고 하며, 장내 건강 및 식품의 보존성 향상에 이용하는 연구가 이루어지고 있다. 또한 유산균의 다양한 당전이 효소에 의해 만들어 지는 올리고당 및 균체외 다당은 난소화성 탄수화물로서 장내 유익세균의 성장을 도울 뿐 아니라 그 자체가 면역활성 및 항암 활성이 있는 것으로 보고되고 있다.

최근에는 사람의 장내에 소수 존재하는 유산균을 장내에 정착시키기 위해, 유산균을 분리하고, 상기 유산균을 생균제, 식품첨가제, 정장제 등으로 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 대한민국 특허 제264295호에는 "한국인에 적합한 생리활성을 보유한 신규 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) MK-G7 비피더스 균주 및 이의 용도"에 대하여 개시되어 있고, 대한민국 특허 제158049호 에는 "보습성이 우수한 다량의 점질다당류를 생산하는 비피도박테리움 롱검HS90"에 대하여 개시되어 있다. 또한, 대한민국 특허 제2000-316517호에는 "산생성능력 및 내산성이 우수한 신규 락토바실러스 애시도필러스 YD9904 균주 및 이를 함유하는 제품"에 대해 개시되어 있고, 대한민국 특허 제2001-70689호에는 "내산성 및 내담즙성이 우수하고, 병원성 미생물과 부패성 미생물의 생육을 억제시키는 항균 능력이 있는 락토바실러스 애시도필러스 30SC"에 대해 개시되어 있으며, 대한민국 특허출원 제2001-11797호에는 "로타바이러스 및 유해 미생물 억제 활성을 갖는 신규 내산성 락토바실러스 루테리 프로바이오-16 및 이를 함유하는 생균 활성제"에 대해 개시되어 있다.

한편 유산균이 생성하는 다당류는 각종 식품에서 물성에 관여하여 요거트 경우는 점도를 증가시키고 식용시 입에서 느끼는 교질감에 크게 작용한다. 본 다당류는 유산균과 함께 섭취시 장에 정착하는 과정을 촉진하는 효과가 대표적으로 알려진 반면, 최근에 항암효과 (Kitazawa, H. et al. (1998) Int. J. Food Microbiol. 40, 169-175), 면역증강효과(Hosono, A. et al. (1997) Biosci. Biotechnol. Biochem. 61, 312-316), 콜레스테롤 저하효과 (Nakajima, H. et al. (1992) J. Food Sci. 57, 1327-1329), 대식세포 활성강화 등의 다양한 생리활성 기능이 보고되고 있다.

또한, 다당류를 분석하여 다당생성 유산균을 분리하는 전통적인 방법은 페놀황산법 (phenol sulfuric acid method)(Masuko T, Minami A, Iwasaki N, Majima T, Nishimura S, Lee YC, (2005) .Anal Biochem. 339, 69-72)이 있으나 배지중에 함유 된 단당류, 이당류, 올리고당류를 완전히 제거하는 과정이 복잡하여 시간이 많이 소모되며 정확성도 떨어져 미생물 선발실험에는 비효율적인 방법이었다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 균체외 다당을 생성하고 건강기능성을 갖는 신규 유산균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 이를 이용한 산업적 응용을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 균체외 다당생성능을 갖는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosacues) MJK7 (기탁번호 KACC91505P)를 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 면역활성 강화 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 암세포 증식 억제용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 암세포 증식 억제용 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 항고혈압용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 정장용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물 을 함유하는 생균제 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 사료용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 식품첨가용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 발효제품을 제공한다.

또 본 발명은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7을 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7의 배양방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 배양 조건은 30-45℃, 10-40시간 동안 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

앞에서 지적한 기존의 균주 선발의 한계점을 극복하고자, 본 발명에서는 본 발명자들에 의해 처음 시도된 박막크로마토그래피 대량선발방법(TLC High-through put screening)을 이용하여 다당을 대량으로 생성하는 균주를 1차로 선발하고 선발된 균주에 대해 다양한 건강기능성을 2차로 분석하여 우수균주를 선발하였다.

본 발명에 이용한 박막크로마토그래피를 이용한 다당생성 미생물 선발방법은 박막에 20개 시료를 점적하여 단시간에 전개하여 이미지분석하는 방법으로 단당, 이당을 포함한 올리고당이 전개과정에서 분리되어 원점에 잔류한 다당을 선택적으 로 검출가능하여, 기존에 이용되던 페놀황산을 이용한 다당분석법에 비해서 high-through put 방법으로 1차 선발하기에 적합한 장점이 있었다.

본 발명에서 생균제는 동물 및 인간 숙주에게 유리한 영향을 미치는 생균 유기체로서 정의되는 미생물 군이다. 유리한 영향으로는 장 미생물총의 미생물 균형의 개선이나 고유 미생물총의 성질 개선 등이 있다. 생균제의 유리한 영향은 수를 감소시키는 특정 유기체 그룹에 대한 직접적인 길항성 효과, 그 대사에 영향을 미치는 효과 또는 면역성의 자극을 통해 일어날 수 있다. 생균제는 항균성 화합물을 생산하거나 영양분이나 부착 부위에 대한 경쟁작용을 통해 바람직하지 않은 유기체의 생균수를 억제할 수 있다. 또한, 효소 활성을 증가 또는 감소시켜 미생물 대사를 변화시키거나 항체 수준을 증가시키거나 대식세포 활성을 증가시켜 면역계를 자극할 수도 있다.

본 발명의 조성물을 첨가시킬 수 있는 식품은 우유와 일상 산업 생산품(우유, 유제품, 우유 유도체)과 식물제품(특히 과일)을 기초로 한(또는 유도된) 제품이다.

상기 식품 첨가물로 사용될 본 발명의 조성물은 식품 100 g당 0.1∼3.0 g의 비율로, 더 바람직하게는 식품 100 g당 0.2∼1.0 g의 비율로, 가장 바람직하게는 식품 100 g당 0.4∼0.7 g의 비율이 되게 식품에 첨가시키는 것이 바람직하다.

예를 들어 본 발명의 조성물은 우유형태, 요구르트(천연형태 또는 과일첨가된) 또는 기타 발효우유 형태, 우유 기초 디저트(예를 들면 쵸코렛, 코피 또는 바닐라), 우유 기초 음료, 우유 유장 음료, 또는 과일 농축액 첨가음료, 과일주스(과 일은 예를 들어 살구, 복숭아, 서양배, 사과, 월귤, 열대과일), 토마토 주스, 당근주스, 차(천연차 또는 복숭아 차) 또는 식물 추출액 기초음료 등에 첨가시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 혼합시킬 수 있는 식품과 분리해서 상업화시킬 수 있다.

본 명세서에서 "항암 "이라 함은, 암의 예방, 치료, 증상의 경감 및 완화 등을 모두 포괄하는 최광의의 의미이다.

또 본 명세서에서 "암 예방"이라 함은, 암의 개시단계, 촉진단계, 진행단계 및 전이단계 중 어느 하나 이상을 억제하는 것을 포함하는 최광의의 의미이다. 그 중 특히 암의 개시단계 및 촉진단계에서 암 발생을 억제하는 것을 가리킨다. 또한, 발암물질이 세포 내 표적물과 반응하거나 목적물에 도달하는 것을 억제하는 블록킹

(blocking) 기전을 통해 암을 예방하는 것을 포함한다. 또한, 발암물질에 노출된 세포가 신생물(neoplasia)로 나타나는 과정을 억제하는 서프레싱(suppressing) 기전을 통해 암을 예방하는 것도 포함한다. 또한, 발암성 또는 전발암성 물질의 체외 배출을 촉진시킴으로써 암을 예방하는 것을 포함한다. 또한 전발암성 물질을 대사하여 암을 예방하는 것도 포함한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 본 발명의 균주 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 균주 조성물은 1일 0.001 내지 10 g/kg 체중으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 그 투여량은 연령, 성별, 체중, 질병의 정도, 투여경로 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은, 심각한 독성 및 부작용은 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

한편, 경구 투여의 목적으로 본 발명의 균주를 정제, 캡슐, 츄잉정, 작은 봉지, 과립, 분말, 액체 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 시럽 등의 제제로 제형화하는 경우에 있어서는, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세 결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산 이칼슘 또는 락토오즈와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 슈크로오즈 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있으며, 투여 단위 형이 캡슐제인 경우에는 상기 성분 외에도 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방유와 같은 액상 담체가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 균주 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 유제품, 츄잉껌, 캔디류, 빙과류,과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.

이 때, 상기 식품 중의 상기 본 발명의 균주의 양은 전체 식품 중량의 0.001 내지 99.9 중량%로 가할 수 있으며, 음료 중에는 100 ㎖를 기준으로 0.001 내지 0.1 g, 더 바람직하게는 0.05 내지 0.1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 균주를 함유하는 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 균주를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등 을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택 되는 것이 일반적이다.

본 발명의 균주의 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

상기의 기재 및 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 미생물 은 다당(polysaccharide)생성, 면역증강, 항암(유방암, 폐암), 항고혈압, 항균활성을 나타내기 때문에, 우수한 발효식품 스타터 뿐만 아니라, 면역증강제, 식품첨가제, 생균제 등 건강기능소재 및 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포외 다당 다량 생성 유산균 선발

<1-1> 세포외다당 생성 유산균 분리

다양한 과실 및 채소로 이루어진 발효액을 제조하여 시료로 사용하였다. 이를 멸균 생리 식염수(0.85% (w/v))에 10^-1,-3,-5,- ⁷로 희석한 후, BL agar, MRS agar에 도말하여 37℃에서 호기 및 혐기 배양하였다. 자란 콜로니를 대상으로 아래와 같이 세포외다당 생성균을 1차 선발하였다.

세포외다당류(exopolysaccharides) 생성 분석은 Casamino acid, glucose, sucrose 및 lactose 등이 첨가된 Chemically defined medium [CDM, 1리터 당 25 g casamino acid, 2 g K₂HPO₄, 1g Tween 80, 2g ammonium citrate, 5g sodium acetate, 0.1 g MgSO₄·H₂O, 0.05 g MnSO₄·H₂O, 0.5 g L-cysteine·HCl과 함께 20 g glucose (G medium), 또는 20 g lactose (S medium) 또는 20 g sucrose (S medium) 함유]을 이용하여 측정하였다. 분리균을 CDM에 접종하여 37℃, 48시간 동안 배양 한 후, 원심분리로 세포와 배지를 분리하고 배지분획에서는 세포외 자유-세포외다당류를, 침전된 세포분획에서는 세포결합-세포외다당류 함량을 분석하였다. 세포결합-세포외다당류는 침전세포를 초음파 파쇄 후 생리식염수에 재차 용해시켜 박막크로마토그래피법으로 다당함량을 상대적으로 분석하였다.

<1-2>박막크로마토그래피를 이용한 세포외 다당생성능 분석

위에서 얻은 자유-세포외다당류 분획과 세포결합-세포외다당류 분획은 박막크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 각각의 분획(1㎕)을 박막크로마토그래피(Whatman K6F)에 점적하고 아세토니트릴(acetonitrile)/물 (85:15) 용액으로 전개 후 발색용액 (into 0.3% (w/v) N-(1-naphthyl)-ethylenediamine, 5% (v/v) H₂SO₄ in MeOH)을 이용하여 당을 발색하여 점적 원점에 잔류한 다당류의 함량을 Multi gauge 프로그램을 이용하여 진한정도를 이미지 분석하였다. TLC 분석을 통해 high-through put 선발된 균체외다당류 다량생성 우수균주는 다시 동일한 배양방법으로 다당분획을 분리한 후 에탄올 침전으로 다당을 침전시키고 건조 후 그 생성량을 측정하였다. 본 발명에 이용한 박막크로마토그래피를 이용한 다당생성 미생물 선발방법은 박막에 20개 시료를 점적하고 수십개의 박막을 동시에 챔버에서 단시간에 전개하여 이미지분석하는 방법으로 단당, 이당을 포함한 올리고당이 전개과정에서 분리되어 원점에 잔류한 다당을 선택적으로 검출가능하여, 기존에 이용되던 페놀황산을 이용한 다당분석법에 비해서 high-through put 방법으로 1차 선발하기에 적합한 장점이 있었다.

그 결과, MJK7 균주가 우수균주로 선발되었다. 본 균주는 도면 1과 같이 포도당 배지에서 배양시 세포결합-세포외다당류를 44.7 mg/L, 자유-세포외다당류를 159.6 mg/L 생성하여 총 240.3mg/L를 생성하였으며, 설탕 첨가 배지에서 각각 65.8, 374.1, 440.1 mg/L의 균체외 다당을 생성하였고, 유당배지에서 배양한 결과 각각 14.8, 84.8, 99.6 mg/L의 세포외다당을 생성하였다.(도 1)

<1-3> 세포외다당 조성 분석

앞에서와 같이 분리한 세포외다당에 대해 에탄올 침전 및 투석으로 정제된 다당분획을 얻은 후 2M trifluoroacetic acid (TFA)를 첨가하고 121에서 1.5시간 가열하여 가수분해 후 가스크로마토그래피를 이용하여 alditol acetate method(Jones and Albersheim, 1972)로 조성당을 분석하였다. 그 결과 KB28생성 균체외다당의 구성당은 Glc (76.82 mol.%), Gal (11.56 mol.%), Man (4.27 mol.%), Rha (3.05 mol.%), Ara (2.44 mol.%) 와 Xyl (1.86 mol.%)로 구성되어져 있다.

실시예 2: 페디오코커스 속 미생물의 분리 및 동정

(1) 선택배지를 이용한 유산균 분리

다양한 과실 및 채소로 이루어진 발효액을 제조하여 시료로 사용하였다. 이를 멸균 생리 식염수(0.85% (w/v))에 10^-1,-3,-5,- ⁷로 희석한 후, BL agar, MRS agar에 도말하여 37℃에서 호기 및 혐기 배양하였다. 배양된 colony의 형태적 관찰을 하고, 광학 현미경 관찰(×1000)을 통해 cell 형태를 구분하였다. 또한 catalase, oxidase test, 15℃, 45℃배양, gram staining test를 거쳐 생화학적 특징을 확인 하였다.

(2) SDS-PAGE 분석을 이용한 분류

선택배지로부터 분리된 순수 균주에 2 X sample dye buffer를 가한 후, sonicator(homogenizer/Stirrer-Sonicator GE 130PB, Sonics and Materials Inc., Newtown,CT,USA)를 2분동안 처리하여 단백질을 용출시킨다. 단백질 변성을 위해 100℃에서 5분동안 가열 하고 13,000rpm에서 5분동안 원심분리 한다. 상등액은 10% polyacrylamide separating gel (Dongin Bio., Korea)을 이용한 전기영동 장치(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 140V, 90분 동안 분석되었다. 0.25% Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma, St.Louis,MO,USA)로 30분 동안 염색한 후, destaining 용액으로 탈색하여 high-performance camera (Olympus, Tokyo,Japan)로 스캔하여 Whole cell protein 패턴분석하였다. 단백질 패턴 분석은 육안으로 밴드의 선명도, 넓이, 위치 및 숫자 관찰을 통해 실시하였다. Broad range protein molecular marker (Promega, Madison,WI,USA)와 상업균주를 Reference로 하여 비교 분석하였다.

(3) 16S rRNA Sequencing 분석

16S rRNA 유전자(ca. 1500 bp product)의 PCR 증폭을 위하여 Universal 박테리아 프라이머 쌍; 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(서열번호 1) 및 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT -3’(서열번호 2)를 사용하였다. 16s rRNA 유전자 분석은 SolGent Co. Ltd. (Daejon,Korea)에 의뢰하여 실시하였다. 그 결과는 DNA Data Bank of Japan(.ddbj.nig.ac.jp)을 사용하여 해석하였다.

그 결과, 상기 선발된 균주는 페디오코커스 펜토사세우스와 99.9% 상동성을 보였다. 따라서 본 균주는 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7로 명명하였으며, 대한민국 수원 소재 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2009년 11월 09일에 Pediococcus pentosacues MJK7 (기탁번호 KACC91505P)로 기탁하였다.

특 성	내 용
생육온도	15℃, 37℃, 45℃
Gram stainning	양성
Catalase test	음성
Oxidase test	음성

표 1은 본 발명의 균주의 특성을 나타낸 표이다.

실시예 3: MJK7 의 효소활성능 측정

<3-1> 효소활성능 측정

β-galactosidase, α-amylase, Pullulanase, Dextransucrase, Levansucrase 효소 활성 유무는 각각 선택배지를 이용하여 측정하였다. β-galactosidase는 X-gal이 첨가된 MRS에 접종하여 키운 후, Blue colony로 나타나는 것을 효소분비 균으로 선택하였고 α-amylase와 Pullulanase는 각각 Starch와 pullulan이 첨가된 MRS 배지에 접종 한 후, Iodine test를 실시하여 colony 주위에 투명한 halo가 생기는 것을 효소 분비 균으로 선택하였다.

그 결과, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 균주는 β-galactosidase에만 활성을 나타내었다.

실시예 4: MJK7 의 면역활성능

1) 실험 동물 준비

실험 동물은 (주)오리언트(대한민국)에서 분양받은 8주령의 BALB/c 수컷 마우스를 대조군 및 실험군으로 나누어 사용하였다. 고형 사료와 물은 제한 없이 공급하면서 12시간씩 낮과 밤의 생활리듬을 주었으며 항온항습상태에서 1주간 적응시켰다.

2) 유산균의 준비

유산균을 MRS 배지에 접종하여 37℃ 48시간 동안 배양한다. 이를 멸균생리 식염수로 2회 세척한다. 이에 증류수를 가한 후, autoclave를 이용하여 100℃ 30분 동안 열처리하고 동결건조 한다. 열처리 하기 전 일부 시료를 채취하여 생균수를 측정하여 g당 유산균 수를 측정한다.

3) IFN-γ측정을 위한 비장세포 부유액의 준비 및 비장세포의 배양

마우스의 비장을 적출하여 우태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS) 10%가 함유된 RPMI-1640 (Invitrogen사, 미국)으로 세척하였다. 마이크로 슬라이드 글래스(Micro slide glass)로 비장을 잘게 으깬 뒤 0.40㎛ 나일론 세포 여과기(nylon cell strainer)로 여과하였다. 1000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 적혈구 용해 완충액으로 적혈구를 파괴하였다. 2회 원심분리한 후 10% FBS RPMI-1640에 비장세포를 재부유 하였다. 위상차 현미경 관찰을 통해 spleen cell의 농도를 측정한다. 48 well plate에 상기 재부유한 비장세포를 1×10⁶ 세포/㎖의 농도 500uL시딩(seeding)한 후, 유산균을 접종하여 48시간 동안 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 상층액은 1000 rpm에서 10분간 원심분리 하였고 분석 때까지 -20℃에 보관하면서 시료로 사용하였다.

*500uL 시딩액: 예를 들면 (300uL: Spleen cell 부유액 + 200uL: 유산균 현탁액)각각 준비하여 섞어서 500 uL이 되게 준비한다.

*유산균 농도: 1 웰 당 Spleen cell과 동일 농도(1×10⁶)와 10배 적은 농도(1×10⁵), 10배 많은 농도(1×10⁷) 3포인트로 준비한다.

4) Cytokine 측정방법(ELISA법 및 Quantative real time RT-PCR)

인터페론-γ(IFN-γ)의 측정은 OPT EIA 세트(Pharmingen)를 이용하였다. 96 웰 플레이트(96 well plate)의 각 웰에 포획 항체(capture antibody)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 10% FBS가 함유된 PBS를 200㎕/well씩 넣고 1시간 상온에 둔 채 블로킹 (blocking) 하였다. 3회 세척하여 블로킹 버퍼를 완전히 제거한 후 표준 IFN-γ 및 샘플을 적절히 희석하여 100㎕씩 분주하고 2시간 동안 상온에서 방치하였다. 5회 세척 후 IFN-γ에 대한 비오틴화된 검출 항체(biotinylated detection antibody, Pharmingen사, 미국)와 아비딘(avidin)을 100 ㎕씩 분주한 후 1시간 동안 상온에 두었다. 7회 세 척 후 TMB 기질 시약(TMB substrate reagent) 100 ㎕를 가하고 30분 후에 1M H₂SO₄ 50 ㎕를 첨가하였다. Microplate reader로 450-570 ㎚에서 광학 밀도(optical density, OD)를 측정하였다. TNF-α, IL-6, IL-12의 Cytokine은 Quantative real time RT-PCR로 측정하였으며 GAPDH 발현양과 상대비교하여 나타내었다.

그 결과 INF-γ의 경우, 유산균체만은 250 pg/mL, 유산균체와 균체외 다당복합물은 2500 pg/mL의 높은 분비능을 보였다.

INF-γ는 Th2(세포성면역반응)를 활성화 시키는 cytokine으로 길항적으로 Th1(항체성 면역반응)을 감소시켜 균형을 이루게 하여 IgE 생성을 억제시키는 역할을 한다. 또한, 다양한 염증성 cytokine의 활성을 검토해본 결과 대부분 농도의존적으로 증가하는 경향을 보였다.

실시예 5: MJK7 의 항암활성능

2% sucrose, glucose, lactose를 첨가한 MRS agar plate에서 배양한 균과 균체외 다당을 열처리 한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 파괴한 후, 동결건조하여 -80℃에서 보관하면서 시료로 사용하였다. H460(폐암세포주), MCF-7(유방암세포주)의 암세포주에 대하여 유산균의 cytoplasmic fraction의 항암효과를 MTT 방법으로 측정하였다.

그 결과, 농도 의존적으로 높은 항암 활성을 나타내었으며 두 암세포에 대해 40 ug/mL의 농도에서 90% 이상의 항암활성을 나타내었다.

실시예 6: MJK7 의 항고혈압능

ACE 저해도 측정은 Hman과 Cheng의 방법으로 측정하였다.

2%sucrose, glucose, lactose를 첨가한 MRS agar plate에서 배양한 균과 균체외 다당을 열처리 한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 파괴한 후, 동결건조하여 -80℃에서 보관하면서 시료로 사용하였다.

0.3M NaCl을 포함한 0.1M potassium phosphate buffer(pH 8.3)에 기질 5mM hippuryl-histidyl-leucine용액 100㎕와 ACE(0.2 unit/㎖)용액 80㎕ 및 저해용액 100㎕를 혼합하였고, 대조구는 저해용액 대신 100㎕의 증류수를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시키고, 1N HCl 250㎕를 첨가하여 반응을 중지시킨 다음 1.25㎖의 에틸아세테이트(Ethylacetate)를 첨가하였다.

이를 보텍싱(Vortexing)한 후 원심분리하여 에틸아세테이트층 1㎖를 취하고 이를 휘발시킨 후, 증류수 1㎖를 첨가하여 효소에 의해 기질로부터 분리된 히프르산(Hippruic acid)를 280㎚에서 흡광도를 측정하고, 다음과 같은 식에 의해 ACE저해도를 계산하였다.

ACE 저해(%)=(1-샘플의 흡광도/대조군의 흡광도)×100

그결과, 대조구(배지)는 10%의 저해도를 보인 반면에 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7의 경우, 62%의 저해율을 나타내었다.

실시예 7: MJK7 의 항균효과

Escherichia coli KCTC1476, Salmonella typhimurium KCTC2515, Listeria monocytogenes ATCC19115 and Staphylococcus aureus KCTC1916의 식중독 유발균에 대한 항균효과를 Agar spot assay 방법으로 측정하였다.

그 결과. 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 균주가 4종의 식중독 균에서 대해 항균효과를 보였다.

도 1은 세포외 다당생성능을 측정한 표이다. EPS 생성 분석은 glucose, sucrose 및 lactose 등이 첨가된 Chemically defined medium을 이용하여 측정하였다.

도 2는 마우스 마크로파지에서 P. pentosaceus에 의한 TNF-a, IL-6 및 IL-12의 mRNA 발현을 나타낸 그래프이다. 그 mRNA 발현은 실시간 RT-PCR에 의하여 측정되었다. 각각 (A)는 TNF-a, (B)는 IL-6, (C)는 IL-12의 mRNA 발현을 나타낸다. 데이터는 세번의 독자적인 실험의 평균±표준편차 값이다.

도 3은 본 발명의 P. pentosaceus로 자극된 마우스 매크로파지의 IL-6 생성을 나타낸 그래프이다. 마우스 매크로파지들을 풀링하여서 그 세포들을 2 ug/mL, 20 ug/mL 및 200 ug/mL의 미리처리된 P. pentosaceus로 배양하였다. IL-6 레벨은 미리 처리된 세포들을 48시간 배양한 후 ELISA에 의하여 측정하였다. (A)는 미처리, (B)는 열처리, 소니케이트 및 UV-처리된 세포들. 데이터는 세번의 독자적인 실험의 평균±표준편차 값이다.

도 4는 본 발명의 P. pentosaceus로 자극된 마우스 비장세포의 IL-12 생성을 나타낸 그래프이다. 마우스 비장세포를 풀링하여서 그 세포들을 2 ug/mL, 20 ug/mL 및 200 ug/mL의 미리처리된 P. pentosaceus로 배양하였다. IL-12 레벨은 미리 처리된 세포들을 48시간 배양한 후 ELISA에 의하여 측정하였다. (A)는 미처리, (B)는 열처리, 소니케이트 및 UV-처리된 세포들. 데이터는 세 번의 독자적인 실험의 평균±표준편차 값이다.

도 5의 a는 폐암, b는 유방암에 대한 항암활성을 나타내는 그래프이다.

도 6은 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7균주가 4종의 식중독 균에서 대해 항균효과가 있음을 나타내는 표이다.

<110> CHUNGBUK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION Chungcheongbuk-do <120> A Polysaccharide producing Pediococcus pentosacues and a use thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

균체외 다당생성능을 갖는 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 (기탁번호: KACC91505P).
제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 면역활성 강화 조성물.
제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 암세포 증식 억제용 기능성 식품 조성물.
제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 암세포 증식 억제용 약학 조성물.
제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 항고혈압용 조성물.
제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 정장용 조성물.
제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 생균제 조성물.
제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 사료용 조성물.
제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 식품첨가용 조성물.
제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7 또는 이의 배양물을 함유하는 발효제품.
제1항의 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7을 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7의 배양방법.
제11항에 있어서, 상기 배양 조건은 30-45℃, 또는 10-40시간 또는 이들의 조합 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 페디오코커스 펜토사세우스 MJK7의 배양방법.