JP6995411B2 - 新規ビフィドバクテリウム属細菌及びそれを含む組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、新規ビフィドバクテリウム属細菌及びこのビフィドバクテリウム属細菌を含む組成物、より詳細には、アスリートの腸内から単離された、ソルビトール資化能を有する新規ビフィドバクテリウム属細菌及びこの新規ビフィドバクテリウム属細菌を含有する飲食品、プロバイオティクス組成物等に関する。
従来から、腸内環境を整えることにより、健康状態を改善又は向上できることが知られている。また、近年、糞便検体を分子生物学的手法で解析することにより、多数の腸内細菌から構成される腸内フローラについて把握することができるようになった。そこで、腸内フローラの構成と健康状態との関連性を解明するべく、様々な観点からの研究が進められている。
このうち、アスリートの腸内フローラに関する研究が着目されている。アスリートは身体能力に優れると共に日常的に高度な身体運動を行っていることから、エネルギーの吸収・消費、免疫等に係る機能が、一般の人とは異なっている可能性を有する。そこで、これらの機能改善や健康状態の向上に有用な知見を得るため、アスリートを対象に、エネルギー吸収及び腸管免疫系の場である腸内の腸内細菌叢を解析することが行われている。例えば、非特許文献１では、女子マラソン選手１３名を対象として腸内細菌叢の解析を行った結果、Prevotella属の腸内細菌を保有する選手が一定割合（１３名中６名）存在したこと等が報告されている。
他方、我々が経口摂取する食品や飲料には様々な糖類が含まれている。糖類には、ブドウ糖やショ糖などのいわゆる糖のほか、ソルビトールやキシリトール等の糖アルコール、アスパルテーム等の合成甘味料が存在する。このうち、糖アルコールは、主に植物由来の天然化合物であるため安全性が高く、消化吸収され難いためカロリーも低いことから、甘味料や食品添加物等として広く使用されている。
松生香里、外７名、「マラソン選手における腸内細菌叢の特徴とＢＭＩの関連」、川崎医療福祉学会誌、Vol.29、No.1、2019年, p.99-105
このような背景技術下において、腸内環境を整えて健康状態を改善等するために使用され得る、新たな微生物が求められている。特に、アスリートの腸内フローラを構成している微生物から、新たなプロバイオティクスとして使用され得る、特別な機能を有する乳酸菌が単離されることが期待されている。しかしながら、上述した非特許文献１によれば、アスリートの腸内細菌叢を解析した結果、どのような属の微生物がどの程度の割合で存在しているかについての知見が得られているのみであり、アスリートの腸内フローラを構成する個々の微生物についての検討や単離はなされていない。
他方、上述した糖類のうち、オリゴ糖やポリデキストロースは、消化管で分解・吸収され難く、健康状態の向上に有益な腸内細菌の選択的な栄養源となって増殖を促進することから、プレバイオティクスとして用いられている。そこで、飲食品の構成成分として広く使用されている糖アルコールがプレバイオティクスとして活用されることが期待されている。
したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、アスリートの腸内フローラから、有益な機能を有する新たな乳酸菌を単離し、提供することにある。
また、本発明の他の目的としては、ソルビトール等の糖アルコールを利用して生育することができる糖アルコール資化能を有し、糖アルコールをプレバイオティクスとして用いることができる、新たな乳酸菌を提供することにある。
また、本発明の他の目的としては、上述した新たな乳酸菌を含有する飲食品やプロバイオティクス組成物等の組成物を提供することにある。
本発明者らは、アスリート５００名以上から１０００検体以上を取得し、アスリートの腸内フローラを解析すると共に、新たなプロバイオティクスとして有用な新規乳酸菌を単離することを目的として鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
上記課題を解決する、本発明の新規乳酸菌は、ビフィズス菌（ビフィドバクテリウム属細菌）のビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５）である。
本発明に係るビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５）は、ソルビトール資化能を有する新規ビフィドバクテリウム属細菌である。この新規ビフィドバクテリウム属細菌はロンガム種であることから、プロバイオティクスとして使用され得る。また、この新規ビフィドバクテリウム属細菌はソルビトールの資化能を有することから、様々な食品や飲料に配合されているソルビトールや、果実等にも天然に含まれているソルビトールを、プレバイオティクスとして有効活用することができる。さらに、この新規ビフィドバクテリウム属細菌は、基準株（Bifidobacterium longum ＡＴＣＣ１５７０７株）と比べて耐酸性にも優れた性質を有する。
また、本発明の新規ビフィドバクテリウム属細菌を含む組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５）を含有する組成物である。
また、本発明の組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５）及びソルビトールを含有することも好ましい。これにより、有益な微生物とその栄養源、すなわち、プロバイオティクスとプレバイオティクスが配合された組成物が得られる。
また、本発明の組成物は、飲食品であることも好ましい。これにより、好適な組成物の態様が選択される。なお、本発明における飲食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、栄養補助食品及び特定保健用食品等も当然に含まれる。
また、本発明の組成物は、プロバイオティクス組成物であることも好ましい。これにより、好適な組成物の一態様が選択される。
本発明によれば、以下のような優れた効果を有する新規ビフィドバクテリウム属細菌及び新規ビフィドバクテリウム属細菌を含む組成物を提供することができる。
（１）プロバイオティクスとして使用され得る新たなビフィドバクテリウム属細菌であり、食品や飲料、医薬品等の組成物に配合して使用することができる。
（２）様々な食品や飲料に広く配合され、天然果実等にも多く含まれるソルビトールの資化能を有するビフィドバクテリウム属細菌であるため、ソルビトールをプレバイオティクスとして有効活用することができる。
（３）基準株（Bifidobacterium longum ＡＴＣＣ１５７０７株）と比べて耐酸性に優れるため、経口摂取した場合でも生きた状態で腸内に到達され易い。
（１）プロバイオティクスとして使用され得る新たなビフィドバクテリウム属細菌であり、食品や飲料、医薬品等の組成物に配合して使用することができる。
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（３）基準株（Bifidobacterium longum ＡＴＣＣ１５７０７株）と比べて耐酸性に優れるため、経口摂取した場合でも生きた状態で腸内に到達され易い。
本発明の新規乳酸菌は、ソルビトールの資化能を有するビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５）である。ソルビトール資化能を有するビフィドバクテリウム属細菌は、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ及びＢ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍの一部の菌以外には、これまでほとんど確認されておらず、ビフィドバクテリウム・ロンガム種においては、今回、発明者らによって初めて確認され、単離されたものである。
この本発明の新規ビフィドバクテリウム属細菌は、アスリート（男性、競技種目:陸上競技、元五輪日本代表）の腸内フローラから単離されたものである。この新規ビフィドバクテリウム属細菌、すなわち、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、以下のとおり特許微生物の寄託機関に国際寄託がなされている。
（１）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５
（２）原寄託日：２０１９年１２月２５日
（３）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）
（１）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５
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（３）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）
アスリートの腸内フローラから単離されたビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の菌学的性質を、以下表１及び表２に示す。以下表１に示す各試験は、光学顕微鏡（オリンパス株式会社製品、型番：ＢＸ５０Ｆ４）による形態観察及びBarrow & Felthamらの方法（Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria, 3rd edition, Cambridge: University Press, 1993）に基づき、行われたものである。また、表２に示す各基質に対する反応試験は、嫌気性菌生化学的同定キット（アピケンキ（ＡＰＩ２０Ａ）、ビオメリュー・ジャパン株式会社製品）を用いて行われたものである。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、培養により増殖させることができる。ＡｕＢ－００１株の培養温度は２０℃～４０℃が好ましく、２５℃～４０℃がより好ましく、３０℃～４０℃が特に好ましい。また、ビフィドバクテリウム属細菌は偏性嫌気性細菌であるので、嫌気環境下で培養を行うことが好ましく、例えば、炭酸ガスや窒素ガスを通気しながら培養することが好ましい。また、培地としては、ビフィドバクテリウム属細菌の培養に一般的に用いられる培地を用いることができ、特に限定されないが、ＧＡＭブイヨン「ニッスイ」（日水製薬株式会社）やＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社）などが挙げられる。また、この培地中には、ＡｕＢ－００１株が資化能を有するソルビトール等の糖類を配合させてもよい。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、培養液の状態、培養液を濃縮又は希釈した状態、及び培養液等から回収した菌体の状態で用いることが可能である。また、本発明の効果を失わない範囲において、培養液及び回収菌体に対し、洗浄処理、凍結乾燥やＬ－乾燥、スプレードライ等の乾燥処理又は加熱処理等の種々の追加処理を施すことも可能である。なお、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、生菌として用いることが好ましいが、死菌であってもよく、生菌と死菌とが混合された状態のものを用いてもよい。
本発明に係るビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、有益な新規ビフィズス菌として菌単独でも用いることができるが、他成分と組み合わせて得られる種々の組成物として用いることができる。本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム ＡｕＢ－００１株を含有する組成物としては、経口摂取される飲食品、プロバイオティクス組成物、整腸用組成物、医薬部外品又は医薬品等が好適に挙げられる。また、飲食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、栄養補助食品及び特定保健用食品等が含まれる。組成物中のＡｕＢ－００１株の含有量としては、組成物の用途や使用態様等によって異なるが、一例として、１×１０６～１×１０１２ｃｅｌｌｓ／ｇであることが好ましく、１×１０７～１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｇであることがより好ましい。
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム ＡｕＢ－００１株を含有する組成物には、ソルビトールを含有させることができる。ＡｕＢ－００１株はソルビトール資化能を有するため、組成物中の構成成分であるソルビトールがＡｕＢ－００１株の選択的な栄養源となり、ＡｕＢ－００１株の増殖及び活動を活性化させることができる。組成物中のソルビトールの配合割合としては、特に限定されないが、一例として、０．０１～２０重量％が好ましく、０．１～１０重量％がより好ましく、０．５～５重量％が特に好ましい。
本発明に係る組成物の用途としては、飲食品が好適である。この場合、錠剤やカプセル剤、粉末剤、顆粒剤、ゲル状剤などのサプリメント形態、発酵乳や乳酸菌飲料、清涼飲料水、スポーツ飲料などの飲料、ヨーグルトやアイスクリーム等の乳製品、アメやガム、チョコレート等の菓子、パン、粥、シリアル、麺類、ゼリー、スープ、調味料等のあらゆる態様の飲食品組成物として用いることができる。また、この組成物には、飲食品組成物を構成する原料の他に、他の機能性成分、他の微生物、糖類、ビタミン、ミネラル、アミノ酸若しくはタンパク質等の栄養素等を種々組み合わせることも可能である。
これらの飲食品組成物は、飲食品の原料に、例えば、粉末形態又は懸濁液形態のビフィドバクテリウム・ロンガム ＡｕＢ－００１株を添加し、混合等することにより製造することができる。その一方で、牛乳等の発酵原料に、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＡｕＢ－００１株を添加し、培養又は発酵させて、発酵食品として製造することも可能である。
また、本発明に係る組成物の用途としては、腸内環境を整えるためのプロバイオティクス組成物とすることも好ましい。プロバイオティクス組成物の形態としては、上述した飲食品と同様の形態を取ることができる。また、プロバイオティクス組成物とした場合、ＡｕＢ－００１株の増殖及び活性化を促すプレバイオティクス成分を組み合わせた組成物とすることが好ましい。プレバイオティクス成分としては、上述したソルビトールの他、特に限定されないが、ガラクトオリゴ糖やフラクトオリゴ糖等のオリゴ糖、ポリデキストロースやイヌリン等の食物繊維を挙げることができ、１種又は２種以上の成分を選択して組成物中に配合することができる。さらに、ＡｕＢ－００１株以外のビフィドバクテリウム・ロンガム株、ビフィズス菌株又はラクトバチルス属株等のプロバイオティクスを１種又は２種以上を選択して組成物中に配合することも可能である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に特に限定されるものではない。
［実施例１］
１．乳酸菌の単離
多数のアスリートから糞便サンプルを採集し、乳酸菌の単離を行った。具体的には、次の方法にて行った。糞便サンプルを滅菌したＰＢＳに懸濁し、この懸濁液をさらにＰＢＳで希釈して系列希釈液を調製し、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社製品）に塗布した。この平板培地を嫌気ジャー内で脱酸素・炭酸ガス発生剤（三菱ガス化学株式会社製品、アネロパック（登録商標）・ケンキ）を用いて３７℃で２～３日間嫌気培養した。平板培地上でコロニー形成した細菌分離株を釣菌し、以下表３に示す培地組成の液体培地（ＧＡＭブイヨン「ニッスイ」、日水製薬株式会社製品）に接種し、嫌気性条件下で３７℃にて培養した。そして、以下実施例２で詳述するように、各培養液から分離株のＤＮＡをそれぞれ抽出し、抽出されたＤＮＡについてリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）塩基配列解析を行い、分離株の菌種を推定した。ビフィドバクテリウム属と推定された分離株の培養液は、純粋培養のためにＴＯＳプロピオン酸寒天培地を用いて単一集落分離した後、表３に示すＧＡＭブイヨン「ニッスイ」液体培地において嫌気性条件下で３７℃にて培養し、２０％グリセロールストックにして－８０℃で保管した。
１．乳酸菌の単離
多数のアスリートから糞便サンプルを採集し、乳酸菌の単離を行った。具体的には、次の方法にて行った。糞便サンプルを滅菌したＰＢＳに懸濁し、この懸濁液をさらにＰＢＳで希釈して系列希釈液を調製し、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社製品）に塗布した。この平板培地を嫌気ジャー内で脱酸素・炭酸ガス発生剤（三菱ガス化学株式会社製品、アネロパック（登録商標）・ケンキ）を用いて３７℃で２～３日間嫌気培養した。平板培地上でコロニー形成した細菌分離株を釣菌し、以下表３に示す培地組成の液体培地（ＧＡＭブイヨン「ニッスイ」、日水製薬株式会社製品）に接種し、嫌気性条件下で３７℃にて培養した。そして、以下実施例２で詳述するように、各培養液から分離株のＤＮＡをそれぞれ抽出し、抽出されたＤＮＡについてリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）塩基配列解析を行い、分離株の菌種を推定した。ビフィドバクテリウム属と推定された分離株の培養液は、純粋培養のためにＴＯＳプロピオン酸寒天培地を用いて単一集落分離した後、表３に示すＧＡＭブイヨン「ニッスイ」液体培地において嫌気性条件下で３７℃にて培養し、２０％グリセロールストックにして－８０℃で保管した。
［実施例２］
２．分離株の同定（１）
実施例１において、コロニー形成した細菌分離株の菌種を推定するために、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）塩基配列解析を行った。まず、培養液から分離株のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡについて、ＰＣＲにて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーセットの配列は、「２７Ｆ：５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’（配列番号１）」及び「１４９２Ｒ：５’－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’（配列番号２）」とした。各ＰＣＲ産物の塩基配列決定を行い、各分離株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列を得た。この１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の配列について、ＮＣＢＩの国際塩基配列データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）上で、ＢＬＡＳＴプログラム（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による相同性検索を行った。
２．分離株の同定（１）
実施例１において、コロニー形成した細菌分離株の菌種を推定するために、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）塩基配列解析を行った。まず、培養液から分離株のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡについて、ＰＣＲにて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーセットの配列は、「２７Ｆ：５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’（配列番号１）」及び「１４９２Ｒ：５’－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’（配列番号２）」とした。各ＰＣＲ産物の塩基配列決定を行い、各分離株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列を得た。この１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の配列について、ＮＣＢＩの国際塩基配列データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）上で、ＢＬＡＳＴプログラム（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による相同性検索を行った。
この結果、ある男性アスリート（競技種目:陸上競技、元五輪日本代表）の糞便サンプルから単離された細菌分離株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列が、「Bifidobacterium longum subsp. suillum strain Su 851 16S ribosomal RNA, partial sequence」と９９．３％もの高い相同性を示すことが見出された。それゆえ、この分離株の菌種を、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）と推定し、ＡｕＢ－００１株と名付けた。この分離株（ＡｕＢ－００１株）の塩基配列決定された１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列（配列番号３）を以下表４に示す。
［実施例３］
３．分離株の同定（２）
実施例２において、ビフィドバクテリウム・ロンガムと推定されたＡｕＢ－００１株について、ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）解析を行った。ＡＮＩ解析とは、調査対象株及び既存株の全ゲノム配列をコンピュータ上で約１０００塩基程度の断片に分け、両者のゲノム配列の各断片の類似度を配列検索アルゴリズムで計算することにより行われるものであり、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド形成試験における７０％の一致度は、ＡＮＩ値では９５％に相当するとされている。それゆえ、ＡＮＩ値が９５％以上であれば同種と判定され、ＡＮＩ値が９５％未満であれば別種と判定される。ＡｕＢ－００１株の全ゲノム配列をシーケンサーにより決定し、２，５４８，７１８ｂｐの塩基配列を得た。ＡＮＩ解析はＡＮＩｔｏｏｌｓ Ｏｎｌｉｎｅ（http://ani.mypathogen.cn/）ウェブサイトのプログラムにより行った。結果を以下表５に示す。
３．分離株の同定（２）
実施例２において、ビフィドバクテリウム・ロンガムと推定されたＡｕＢ－００１株について、ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）解析を行った。ＡＮＩ解析とは、調査対象株及び既存株の全ゲノム配列をコンピュータ上で約１０００塩基程度の断片に分け、両者のゲノム配列の各断片の類似度を配列検索アルゴリズムで計算することにより行われるものであり、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド形成試験における７０％の一致度は、ＡＮＩ値では９５％に相当するとされている。それゆえ、ＡＮＩ値が９５％以上であれば同種と判定され、ＡＮＩ値が９５％未満であれば別種と判定される。ＡｕＢ－００１株の全ゲノム配列をシーケンサーにより決定し、２，５４８，７１８ｂｐの塩基配列を得た。ＡＮＩ解析はＡＮＩｔｏｏｌｓ Ｏｎｌｉｎｅ（http://ani.mypathogen.cn/）ウェブサイトのプログラムにより行った。結果を以下表５に示す。
表５に示す通り、ＡｕＢ－００１株は、ビフィドバクテリウム・ロンガム種の複数の株に対し、９５％以上のＡＮＩ値を示した。したがって、本発明のＡｕＢ－００１株の菌種を、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）と同定した。また、近縁株とのＡＮＩ値が１００％未満であることから、ＡｕＢ－００１株はビフィドバクテリウム・ロンガムの新規菌株であることが明らかとなった。このビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、特許微生物寄託センターにＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５として寄託された。
［実施例４］
４．糖資化能の検討
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）種に同定されたＡｕＢ－００１株の糖資化能を調べるため、各糖類を基質とした反応試験を行った。試験は嫌気性菌生化学的同定キット（アピケンキ（ＡＰＩ２０Ａ）、ビオメリュー・ジャパン株式会社製品）を用いて行い、比較対照として、ビフィドバクテリウム・ロンガムの基準株であるBifidobacterium longum ＡＴＣＣ１５７０７株についても同様の試験を行った。結果を以下表６に示す。
４．糖資化能の検討
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）種に同定されたＡｕＢ－００１株の糖資化能を調べるため、各糖類を基質とした反応試験を行った。試験は嫌気性菌生化学的同定キット（アピケンキ（ＡＰＩ２０Ａ）、ビオメリュー・ジャパン株式会社製品）を用いて行い、比較対照として、ビフィドバクテリウム・ロンガムの基準株であるBifidobacterium longum ＡＴＣＣ１５７０７株についても同様の試験を行った。結果を以下表６に示す。
この結果によれば、本発明に係るＡｕＢ－００１株は、基準株であるＢ．ｌｏｎｇｕｍ ＡＴＣＣ１５７０７株とは異なり、糖アルコールであるソルビトールの資化能を有することが明らかとなった。ソルビトール資化能を有するビフィドバクテリウム属細菌は、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ及びＢ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍの一部の菌以外には、これまでほとんど確認されておらず、今回、本発明者らによって、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ種におけるソルビトール資化能が確認された。このように、今回、アスリートの腸内フローラからソルビトール資化能を備えるビフィドバクテリウム・ロンガムが発見されたことは、アスリートの腸内フローラの多様性・機能性を裏付けるものである。
［実施例５］
５．有機酸産生量の分析
有機酸は腸管内を酸性に保ち、腸の蠕動運動や腸管からの水の分泌を促進するほか、感染防御、腐敗産物の生産抑制、便性・便通の改善効果を有する作用を有する。そのため、有機酸を産生する菌を腸内に保有することにより、腸内環境が整い、健康に寄与することが知られている。そこで、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の有機酸産生能を調べるため、培養液中における有機酸産生量を分析した。なお、培養液として、（１）ソルビトールを含まない培養液Ａ、（２）ソルビトールを含有する培養液Ｂ、の２種類の培養液を用い、各培養液中における有機酸産生量を測定した。（１）ソルビトールを含まない培養液Ａとしては、上記表３に示したＧＡＭブイヨン「ニッスイ」液体培地を用い、（２）ソルビトールを含有する培養液Ｂとしては、下記表７に示すＧＡＭブイヨン「ニッスイ」液体培地にソルビトールを０．５％となるように配合したものを使用した。試験は次のようにして行った。ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社）で３７℃、７２時間、嫌気培養により生育させたＡｕＢ－００１株のコロニーを取り、滅菌生理食塩水に懸濁してマックファーランド濁度Ｎｏ．０．５に調製した。この菌液０．１ｍＬを各培養液５ｍＬにそれぞれ接種し、３７℃で２０時間、脱酸素・炭酸ガス発生剤（三菱ガス化学株式会社製品、アネロパウチ（登録商標）・ケンキ）を用いて嫌気培養した。各培養液を孔径０．２０μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ろ液を試料液として、高速液体クロマトグラフ装置（株式会社島津製作所製品、有機酸分析システム）にて、各有機酸の濃度を測定した。詳細な測定条件は次の通りである。
・カラム：Shim-pack SCR-102(H)、300mm×8mm ID、２本直列で使用
・ガードカラム：Shim-pack SCR-102(H)、50mm×6mm ID
・溶離液：５ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ－トルエンスルホン酸
・反応液：５ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ－トルエンスルホン酸、１００μｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ
・流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
・オーブン温度：４５℃
・検出器：電気伝導度検出器 ＣＤＤ－１０Ａ
５．有機酸産生量の分析
有機酸は腸管内を酸性に保ち、腸の蠕動運動や腸管からの水の分泌を促進するほか、感染防御、腐敗産物の生産抑制、便性・便通の改善効果を有する作用を有する。そのため、有機酸を産生する菌を腸内に保有することにより、腸内環境が整い、健康に寄与することが知られている。そこで、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の有機酸産生能を調べるため、培養液中における有機酸産生量を分析した。なお、培養液として、（１）ソルビトールを含まない培養液Ａ、（２）ソルビトールを含有する培養液Ｂ、の２種類の培養液を用い、各培養液中における有機酸産生量を測定した。（１）ソルビトールを含まない培養液Ａとしては、上記表３に示したＧＡＭブイヨン「ニッスイ」液体培地を用い、（２）ソルビトールを含有する培養液Ｂとしては、下記表７に示すＧＡＭブイヨン「ニッスイ」液体培地にソルビトールを０．５％となるように配合したものを使用した。試験は次のようにして行った。ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社）で３７℃、７２時間、嫌気培養により生育させたＡｕＢ－００１株のコロニーを取り、滅菌生理食塩水に懸濁してマックファーランド濁度Ｎｏ．０．５に調製した。この菌液０．１ｍＬを各培養液５ｍＬにそれぞれ接種し、３７℃で２０時間、脱酸素・炭酸ガス発生剤（三菱ガス化学株式会社製品、アネロパウチ（登録商標）・ケンキ）を用いて嫌気培養した。各培養液を孔径０．２０μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ろ液を試料液として、高速液体クロマトグラフ装置（株式会社島津製作所製品、有機酸分析システム）にて、各有機酸の濃度を測定した。詳細な測定条件は次の通りである。
・カラム：Shim-pack SCR-102(H)、300mm×8mm ID、２本直列で使用
・ガードカラム：Shim-pack SCR-102(H)、50mm×6mm ID
・溶離液：５ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ－トルエンスルホン酸
・反応液：５ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ－トルエンスルホン酸、１００μｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ
・流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
・オーブン温度：４５℃
・検出器：電気伝導度検出器 ＣＤＤ－１０Ａ
さらに、比較対照として、ＡｕＢ－００１株に替えて、基準株であるBifidobacterium longum ＡＴＣＣ１５７０７株を用い、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地で３７℃、７２時間、嫌気培養により生育させたＡＴＣＣ１５７０７株のコロニーを滅菌生理食塩水で懸濁し、マックファーランド濁度Ｎｏ．０．５に調製した。この基準株の菌液０．１ｍＬを各培養液５ｍＬに接種し、３７℃で２０時間嫌気培養した培養液（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＡＴＣＣ１５７０７株）、及び菌を接種していない培養液（Ｂｌａｎｋ）についても、上述と同様に試験を行い、有機酸の濃度を測定した。結果を以下表８、９及び図１、２に示す。
なお、培養液Ａ（表３）を用いた嫌気培養後のＡｕＢ－００１株の培養液Ａ中における全細菌数は１．５×１０１０（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、ＡＴＣＣ１５７０７株の培養液Ａ中における全細菌数は８．９×１０９（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）であった。また、培養液Ｂ（表７）を用いた嫌気培養後のＡｕＢ－００１株の培養液Ｂ中における全細菌数は１．２×１０１０（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）であり、ＡＴＣＣ１５７０７株の培養液Ｂ中における全細菌数は４．９×１０９（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）であった。
これらの結果によれば、培養液Ａ（ソルビトール添加なし）においては、ＡｕＢ－００１株は基準株であるＡＴＣＣ１５７０７株と同様の有機酸産生能を有しており、いずれも乳酸、酢酸及びギ酸を多量に産生することが認められた。そして、ソルビトールが添加された培養液Ｂにおいても、ＡｕＢ－００１株は乳酸、ギ酸及び酢酸の高い産生能を有することが分かった。このことから、ＡｕＢ－００１株は、ソルビトール存在下において活発に増殖し、有機酸を産生できることが明らかとなった。
［実施例６］
６．糖資化能及び有機酸産生量の分析
次に、実施例５で用いたグルコースを含有する培養液に替えて、炭水化物を含有しないＰＹ培地にグルコース又はソルビトールを炭水化物源としてそれぞれ添加した培養液を用い、ＡｕＢ－００１株及び基準株（Bifidobacterium longum ＡＴＣＣ１５７０７株）の各培養液中における糖資化能、すなわち、増殖能と有機酸産生量を分析した。
６．糖資化能及び有機酸産生量の分析
次に、実施例５で用いたグルコースを含有する培養液に替えて、炭水化物を含有しないＰＹ培地にグルコース又はソルビトールを炭水化物源としてそれぞれ添加した培養液を用い、ＡｕＢ－００１株及び基準株（Bifidobacterium longum ＡＴＣＣ１５７０７株）の各培養液中における糖資化能、すなわち、増殖能と有機酸産生量を分析した。
本実施例で用いたＰＹ培地の組成を以下表１０及び表１１に示す。ＰＹ培地は表１０に示す溶液１を加温溶解後、溶液２を添加し、１２１℃、１５分間オートクレーブ処理して得た。これを急冷後、Ｄ（－）－ソルビトールを０．５重量％濃度になるように添加した培養液を「ＰＹ培地＋０．５％ソルビトール」とし、Ｄ（＋）－グルコースを０．５重量％濃度になるように添加した培養液を「ＰＹ培地＋０．５％グルコース」とした。なお、表１０中のレサズリン液（※１）は２５ｍｇを１００ｍＬの蒸留水で溶解させたものを用い、塩類溶液（※２）は表１１に示す成分により調製した溶液を用い、ヘミン液（※３）は５０ｍｇのヘミンを１ＮのＮａＯＨで溶解し、蒸留水で１００ｍＬにメスアップしたものを用い、ビタミンＫ１液（※４）は０．１５ｍＬのビタミンＫ１を３０ｍＬの９５％エタノールで溶解させたものを用いた。
試験は次のようにして行った。ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社）で３７℃、７２時間、嫌気培養により生育させたＡｕＢ－００１株のコロニーを取り、滅菌生理食塩水に懸濁してマックファーランド濁度Ｎｏ．０．５に調製した。このＡｕＢ－００１株の菌液０．１ｍＬを「ＰＹ培地＋０．５％ソルビトール」及び「ＰＹ培地＋０．５％グルコース」の各培養液１０ｍＬにそれぞれ接種し、３７℃で２０時間、滅菌加圧試験管を用いて嫌気培養した。培養後、各培養液から培養液を一部取り、原液～１０４倍に段階希釈し、血球計算盤を用いて細菌数を計数して各培養液１ｍＬ当たりの全細菌数を求めた。また、残りの各培養液を孔径０．２０μｍのメンブレンフィルターでそれぞれろ過し、ろ液を試料液として、上述した実施例５と同様の測定方法及び条件にて各有機酸の濃度を測定した。
また、ＡｕＢ－００１株に替えて、基準株であるBifidobacterium longum ＡＴＣＣ１５７０７株を用い、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地で３７℃、７２時間、嫌気培養により生育させたＡＴＣＣ１５７０７株のコロニーを滅菌生理食塩水で懸濁し、マックファーランド濁度Ｎｏ．０．５に調製した。この基準株の菌液０．１ｍＬを各培養液１０ｍＬにそれぞれ接種し、３７℃で２０時間嫌気培養した培養液（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＡＴＣＣ１５７０７株）、及び菌を接種していない培養液（Ｂｌａｎｋ）についても、同様に試験を行い、各培養液１ｍＬ当たりの全細菌数と各有機酸の濃度を測定した。結果を以下表１２、１３及び図３、４に示す。
これらの結果によれば、炭水化物源としてグルコースを含有する「ＰＹ培地＋０．５％グルコース」培養液においては、ＡｕＢ－００１株および基準株であるＡＴＣＣ１５７０７株のいずれも、１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬのオーダーにまで増殖し、乳酸及び酢酸を大量に産生することがわかった。他方、炭水化物源としてソルビトールを含有する「ＰＹ培地＋０．５％ソルビトール」培養液においては、ＡｕＢ－００１株は４．８×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬにまで活発に増殖し、乳酸及び酢酸を大量に産生したのに対し、基準株であるＡＴＣＣ１５７０７株は、全細菌数が５．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬと増殖せず、乳酸及び酢酸をほとんど産生しないことが示された。
これらのことから、ＡｕＢ－００１株はビフィドバクテリウム・ロンガム種でありながらソルビトールを利用して増殖し、最終代謝産物として乳酸及び酢酸を産生できることが明らかとなった。
［実施例７］
７．耐酸性の検討
一般的にビフィドバクテリウム属細菌は低いｐＨ環境に弱いため、経口摂取した場合には胃液の影響を受けて死滅しやすく、生きたまま腸に到達し難いという問題がある。そこで、胃液を模したｐＨ２．０に調整した試験液を用い、本発明に係るビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の耐酸性について調べた。
７．耐酸性の検討
一般的にビフィドバクテリウム属細菌は低いｐＨ環境に弱いため、経口摂取した場合には胃液の影響を受けて死滅しやすく、生きたまま腸に到達し難いという問題がある。そこで、胃液を模したｐＨ２．０に調整した試験液を用い、本発明に係るビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の耐酸性について調べた。
まず、ＡｕＢ－００１株を、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社）と脱酸素・炭酸ガス発生剤（三菱ガス化学株式会社製品、アネロパウチ（登録商標）・ケンキ）を用いて３７℃で２４時間、嫌気培養した。この新鮮培養菌株を滅菌生理食塩水で懸濁し、１ｍＬ当たりの菌数が１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように菌液を調製した。この菌液０．１ｍＬを、滅菌中型試験管に収容した１０ｍＬの人工胃液又は１０ｍＬの滅菌生理食塩水（コントロール）に添加し、３７℃で所定時間（人工胃液：１０分・２０分・３０分・４０分・５０分・６０分、滅菌生理食塩水：０分・６０分）反応させた。なお、人工胃液の組成を以下表１４に示す。人工胃液はｐＨ２．０に調整し、０．４５μｍのフィルターでろ過滅菌したものを使用した。また、人工胃液を構成する成分のうち、ペプシンは、「ペプシン １：１００００、ブタ胃粘膜由来」（富士フイルム和光純薬株式会社製品）を用いた。
各反応時間経過後、菌液が添加された人工胃液又は滅菌生理食塩水を１ｍＬ取り、これを原液として希釈平板法により、菌数を測定した。各希釈率につき、３枚の寒天平板培地に原液又は希釈液を０．１ｍＬ塗抹して培養を行った。なお、寒天平板培地はＴＯＳプロピオン酸寒天培地を用い、培養は脱酸素・炭酸ガス発生剤を用いて３７℃で７２時間、嫌気培養することにより行った。結果を下記表１５に示す。
また、ＡｕＢ－００１株に替えて、基準株であるBifidobacterium longum ＡＴＣＣ１５７０７株についても、上述と同様の試験を行った。結果を下記表１６に示す。
これらの結果によれば、ＡｕＢ－００１株は基準株であるＡＴＣＣ１５７０７株よりも耐酸性に優れていることがわかった。具体的には、ｐＨ２．０の人工胃液に３０分接触させた際において、ＡｕＢ－００１株は２．３×１０３ＣＦＵ／ｍＬ生残したが、ＡＴＣＣ１５７０７株の生残菌数は３．３ＣＦＵ／ｍＬであった。
これらのことから、本発明に係るビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、ソルビトールを利用して活発に増殖し、最終代謝産物として乳酸及び酢酸を産生できるソルビトール資化能を有すると共に、耐酸性にも優れていることがわかった。それゆえ、ＡｕＢ－００１株は、基準株をはじめとした公知のビフィドバクテリウム・ロンガム種とは異なる性質を有していることが示された。
本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含まれるものである。
本発明の新規ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５）及びそれを含む組成物は、新たなプロバイオティクスとして有用なビフィズス菌であり、腸内環境の改善等に有効に利用され、食品（サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等も含む）や医療の分野において幅広く役立つものである。
受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＡｕＢ－００１株、原寄託日：２０１９年１２月２５日、寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）
配列番号１：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域のＰＣＲ増幅のためのフォワードプライマー
配列番号２：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域のＰＣＲ増幅のためのリバースプライマー
配列番号３：新規ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列
配列番号２：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域のＰＣＲ増幅のためのリバースプライマー
配列番号３：新規ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列
Claims (5)
- ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５）。
- ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５）を含有することを特徴とする組成物。
- ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９５）及びソルビトールを含有することを特徴とする組成物。
- 前記組成物は飲食品であることを特徴とする請求項２又は３に記載の組成物。
- 前記組成物がプロバイオティクス組成物であることを特徴とする請求項２～４のいずれか１項に記載の組成物。
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