TW202111112A - 一種植物乳桿菌及其製備植物性凝態優格、改善腸道菌相的用途 - Google Patents

Abstract

一種新穎植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其係寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910891，及寄存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，寄存編號為CGMCC17716，該植物乳桿菌加入植物漿可以製備口感佳、營養價值高的植物性凝態優格，植物性凝態優格中具有高含量伽瑪胺基丁酸、去醣基異黃酮，該植物性凝態優格可以改善健康人與糖尿病患的腸道菌相，改善腸道菌相是指增加有益菌、伺機菌，尤其可以增加腸道中的艾克曼嗜黏蛋白菌。

Description

一種植物乳桿菌及其製備植物性凝態優格、改善腸道菌相的用途

本發明係關於一種植物乳桿菌可以用於製備植物性凝態優格，具有改善腸道菌相的功效。

乳酸菌(Lactic acid bacteria；LAB)為泛指可將醣類轉換成以乳酸為主要代謝物的微生物總稱。乳酸菌被廣泛的應用在全世界的傳統食品中，被公認為安全(General Recognized as Safe；GRAS)的微生物菌種。

乳酸菌可提供發酵食品的製造以及風味，主要透過三種代謝路徑，包括：糖解反應(發酵醣類)、脂解反應(降解脂肪)、蛋白質分解反應(分解蛋白質為小分子胜肽或胺基酸)。乳酸是主要醣類代謝後的結果，但部分微生物菌株，會將中間代謝產物如丙酮酸，再轉換成二乙醯基(diacetyl)、乙醯甲基甲醇(acetoin)、乙酸乙酯(acetaldehyde)或及醋酸(acetic acid)，成為常見乳製品乳酸發酵的酸味主要來源；但是蛋白質類的乳酸發酵食品，主要的風味，是來自蛋白質降解過程中所產生的揮發性氣體，包括不同的醇類(alcohols)、醛類(aldehydes)、酯類(esters)等。

雖然市售乳酸菌食品中，以動物奶作為發酵主原料製作而成的優格(yogurt)或是優格飲(drink yogurt)為大宗。然而根據統計指出，全球乳糖不耐症人口數高達70%，其中亞洲人更高達95%。此外，因信仰而選擇不使用乳製品的蔬食或素食人口，提供乳酸菌的蛋白質發酵食品，成為替 代動物奶的優格食品的開發趨勢。

乳酸菌培養於蛋白質溶液中，由乳酸菌釋放出的有機酸，造成的pH值下降，同時會造成蛋白質分子間的凝集，而形成凝結狀態。此狀態出現於優格製品中，易受到pH、溫度、外力等變化，而造成不同程度的離水現象，嚴重的離水現象，導致產品外觀缺失以及品質變異等不同程度的影響。市售凝乳產品中，為減少凝結的離水現象，常透過額外添加固形物(利入乳清蛋白等)或是添加穩定劑(例如變性澱粉、果膠、洋菜膠等)加以改善。

部分乳酸菌，在特定的比例以及培養條件下，可以生產出細胞外多醣體(exopolysaccharides；EPS)結構可以減緩蛋白質凝結的離水現象，進而改善質地及口感。然而隨著乳酸菌菌種以及培養條件的差異，這些胞外多醣體的產量、組成以及性質有極大的差異。部分菌種的胞外多醣，可協助菌株的抵抗腸胃道的酸鹼值，而安全存活於腸胃道。

「腦腸軸線」(gut-brain axis)，是腸道與腦相互聯絡的重要途徑，其中腸道中的微生物扮演重要的角色，包括，腸躁症、憂鬱症、焦慮症、自閉症、慢性疲勞、第二型糖尿病等盛行率極高的疾病，都和腦腸軸線相關。人類腸道的細菌門，以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)佔極高比例，其次是放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)以及疣微菌門(Verrucobacteria)等，隨著居住地域以及飲食、健康狀況不同，可被分析出多達50門的分類。

腸道微生物的動態與人體間的互動關係，常以有益菌、有害菌以及伺機性，其中伺機性的微生物，是隨著有益菌和有害菌的比例改變， 而有所改變，當有益菌比例高過有害菌時，伺機性微生物的比例隨著提升；反之亦然。

腸道微生物中常被認為有益菌包括：雙崎桿菌目(Bifidobacteriales)中的兩叉雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、假長雙歧桿菌(Bifidobacterium pseudolongum)、動物雙崎桿菌(Bifidobacterium animalis)、熱嗜酸性雙崎桿菌(Bifidobacterium thermacidophilum)、短雙崎桿菌(Bifidobacterium breve)、青春雙崎桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、長雙崎桿菌(Bifidobacterium longum)等；乳酸菌科(Lactobacillaceae)中的洛德乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)、類植物乳桿菌(Lactobacillus paraplantarum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)、短乳酸桿菌(Lactobacillus brevis)、乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus)、詹氏乳酸桿菌(Lactobacillus jensenii)等；疣微菌門(Verrucobacteria)的艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphila)等。

腸道微生物中常被認為有害菌包括：困難梭狀芽孢菌(Clostridium difficilie)、產氣梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringes)、病原性大腸桿菌(Esxcherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、克雷白氏桿菌(Klebseilla)、沙門氏桿菌(Salmonella)、志賀氏桿菌(Shigella)、曲狀桿菌(Campylobacter)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、仙人掌桿菌(Bacillus cereus)、細梭菌(Fusobacteria)、鏈球 菌(Streptococcus)等。

因此，透過飲食或是藥物，維持或是促進健康的腸道菌群，維持較高比例的益生菌是值得期待的。目前對於為何透過特定的膳食補充可以提昇動物體內的有益菌的比例機制尚未了解，因此，對於何種益生菌、或是何種組合的益生菌，在何種的基質下進行發酵後的產物，對於提昇動物腸道內有益菌的比例，仍需進行探討。有鑑於此，本發明的目的，在於提供一種可以提昇動物體內有益菌比例的植物性發酵產物及其應用。

在腸道中的有益菌群中，艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphila)為一個被認為重要的菌種。艾克曼嗜黏蛋白菌為絕對厭氧，且在動物體內以腸黏膜蛋白為唯一碳源及氮源的細菌，首次報導是在2004年由荷蘭學者Willemde Vos實驗室發現並且鑑定出來的。這個細菌在人體內的含量很豐富，可以高達1-3%。由於其可分解腸黏膜蛋白，因此對於影響緊生長於腸黏下的腸內皮細胞的生理性。自2007年開始，陸續的研究發現，艾克曼嗜黏蛋白菌可能是一個具有生理功能且值得應用開發的次世代益生菌菌種。目前已經知道艾克曼嗜黏蛋白菌與很多健康問題有負相關性，例如艾克曼嗜黏蛋白菌越少的個體，越容易發胖、出現發炎症狀和第二型糖尿病等；腸道內的艾克曼嗜黏蛋白菌越多的動物個體，肥胖、發炎症狀和2型糖尿病的比例相對減少糖尿病鼠糞便中艾克曼嗜黏蛋白菌，會較正常鼠降低到3000倍以下；肥胖鼠糞便中艾克曼嗜黏蛋白菌，會較正常鼠降低到100倍以下。艾克曼嗜黏蛋白菌在高脂飲食的小鼠腸道內生長，可保護小鼠免於因高脂飲食引起的代謝與免疫風險，艾克曼嗜黏蛋白菌在人體內存在的比例，對於增加癌症免疫治療效果上有非常顯著的作用。因此，提供適 當的飲食提昇腸胃道中艾克曼嗜黏蛋白菌的數量，預期對於維持身體健康狀況有所助益。

先前研究指出直接於膳食中添加Bifidobacterium animalis subsp.lactis菌種提供小鼠連續食用14天，可增加糞便中艾克曼嗜黏蛋白菌的數量，但是Lactobacillus rhamnosus則無此效果；此外，提供果寡糖給接受高脂飲食的小鼠，可有效提昇糞便中艾克曼嗜黏蛋白菌的數量；補充蔓越莓或康考特葡萄萃取物，可以有效提昇糞便中艾克曼嗜黏蛋白菌的數量，然而補充石榴萃取物、綠茶萃取物或加州葡萄萃取物，對於健康人或小鼠的艾克曼嗜黏蛋白菌的數量變化沒有影響。

目前對於為何透過特定的膳食補充可以提昇動物體內的艾克曼嗜黏蛋白菌數量機制尚未了解，因此，對於何種益生菌、或是何種組合的益生菌，在何種的基質下進行發酵後的產物，對於提昇動物體內艾克曼嗜黏蛋白菌數量，仍需進行探討。

有鑑於此，如何於提供一種可以提昇動物體內或是體外艾克曼嗜黏蛋白菌數量的植物性發酵產物及其應用，即成為本發明在此欲解決的一重要課題。

本發明的目的即在於提供一種新穎乳酸菌株，該菌為一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，其係寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910891，及寄存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，寄存編號為CGMCC17716。

本發明的另一目的即在於提供一種植物性凝態優格，是以植 物漿加入益生菌製成，其中該益生菌是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，其係寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910891，及寄存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，寄存編號為CGMCC17716；其中該植物性凝態優格的離水性小於25%。

為達前述發明目的，其中該益生菌可進一步包含戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。

為達前述發明目的，其中該植物漿是水與五穀雜糧均質化所得。

為達前述發明目的，其中該五穀雜糧與核果選自於由小米、大米、麥、大豆、高粱、花生、薏仁、藜麥、薏仁、杏仁、芝麻、紅豆、綠豆、腰果所組成的群組。

為達前述發明目的，每100克該植物性凝態優格中的伽瑪胺基丁酸含量超過15毫克。

為達前述發明目的，每100克該植物性凝態優格中的伽瑪胺基丁酸含量超過25毫克。

為達前述發明目的，其中該植物性凝態優格中異黃酮的去醣基率超過80%。

為達前述發明目的，其中該植物性凝態優格，可做為培養艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphilia)的培養成分使用。

本發明的又一目的即在於提供一種前述植物性凝態優格用於改善腸道菌相的用途。

為達前述發明目的，其中該改善腸道菌相是改善糖尿病患者 的腸道菌相。

為達前述發明目的，其中該改善腸道菌相是腸道中有益菌或伺機菌增加。

為達前述發明目的，其中該有益菌包括但不限定是艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphilia)。

綜上所述，與現有技術相較。本發明由台灣高山茶葉植栽篩選出的植物乳桿菌菌株BCRC 910891具有以下優點：

(1)BCRC 910891具有良好的黏稠性多醣生產能力，單獨使用或搭配其他益生菌都可以使豆類蛋白(豆漿)凝集成為不易離水的植物性凝態優格--豆漿乳酸菌發酵品。

(2)BCRC 910891製成的豆漿乳酸菌發酵品可以提升腸道中有益菌、伺機菌並有效促進Akkermansia muciniphila菌株在腸道菌群中的比例，可以改善腸道菌相，尤其可以改善糖尿病患者的腸道菌相。

(3)BCRC 910891製成的豆漿乳酸菌發酵品中的γ-氨基丁酸含量、去醣基異黃酮佔總異黃酮量大量提升。

除豆類發酵品外，以BCRC 910891將燕麥、米、薏仁等製成的植物漿乳酸菌發酵品，亦可促進Akkermansia muciniphila菌株生長。

圖1係為含有單獨或混合植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891(A)、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus BCRC 11064(B)及戊醣乳酸桿菌Lactobacillus pentosus BCRC 11053(C)的豆漿乳酸菌發酵物，對於艾克曼嗜黏蛋白菌Akkermansia muciniphila BCRC 81048^T生長的影響。

圖2係為含有混合植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891(A)、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus BCRC 11064(B)及戊醣乳酸桿菌Lactobacillus pentosus BCRC 11053(C)以市售不同植物來源為基質發酵的產物，對於艾克曼嗜黏蛋白菌Akkermansia muciniphila BCRC 81048^T生長的影響。

圖3係為STZ成功誘導的糖尿病模式小鼠，分別熟豆漿(比較組)以及L.plantarum BCRC 910891發酵的熟豆漿乳酸菌發酵物(實驗組)餵食28天後的腸道菌相變化。

圖4係為STZ成功誘導的糖尿病模式小鼠，分別熟豆漿(比較組)以及L.plantarum BCRC 910891發酵的熟豆漿乳酸菌發酵物(實驗組)餵食28天後的腸道中艾克曼嗜黏蛋白菌所佔的比例。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

微生物及培養基：本實驗特有的植物乳桿菌L.plantarum BIFT-LP-588，為自台灣高山茶葉植栽篩選出的菌株，寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存日期為2019年5月3日、寄存編號為BCRC 910891；且依據布達佩斯條約，寄存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心、寄存日期為2019年5月6日、寄存編號為CGMCC17716。其他使用乳酸菌購自台灣食品工業研究所生物資源保存及研究中心(BCRC)，包括植物乳桿菌L.plantarum BCRC 10069、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus BCRC 11064、戊醣乳酸桿菌Lactobacillus pentosus BCRC 11053。以上乳酸 菌的冷凍菌液1mL加入50mL的MRS培養液，以37℃培養8-24小時，使菌液活化，使菌數達到1.0* 10⁸CFU/mL。

實施例1 植物性凝態優格之製造方法

提供一植物蛋白混合物，其中該植物蛋白混合物是由五穀雜糧或核果及水所組成；進行一均質化步驟及一加熱步驟，使該植物蛋白混合物形成一植物漿，其中該加熱步驟係在高於90℃進行；以及進行一醱酵步驟，該植物漿中加入一醱酵菌種，在一醱酵溫度下進行一醱酵時間，使該植物蛋白混漿之pH值達4.5時隨即於4℃進行低溫處理，藉此使該植物漿形成該植物性凝態優格；其中該五穀雜糧與核果包含小米、大米、麥、大豆、高粱、花生、薏仁、藜麥、薏仁、杏仁、芝麻、紅豆、綠豆、腰果，該植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910891，及寄存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該醱酵時間是6-36小時，該醱酵溫度是27-45℃。

前述方法製得植物性凝態優格的離水性小於25%，具有良好口感，且每100克該植物性凝態優格中的伽瑪胺基丁酸含量超過15毫克、異黃酮的去醣基率超過80%，營養價值高。

實施例2 植物乳桿菌(L.plantarum)BCRC 910891特性

本實驗特有的植物乳桿菌(L.plantarum)BCRC 910891，自台灣高山茶葉植栽篩選出植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891。經分子生物學鑑定16rDNA序列如附件。與目前公開的植物乳桿菌的16S ribosomal RNA部分序列相似度未達100%，分別如下；Lactobacillus plantarum strain JCM 1149 16S ribosomal RNA(99.60598897%)、Lactobacillus plantarum strain NBRC 15891 16S ribosomal RNA(99.52718676%)、Lactobacillus plantarum strain CIP 103151 16S ribosomal RNA、(99.52718676%)、Lactobacillus plantarum strain JCM 1149 16S ribosomal RNA(99.52718676%)、Lactobacillus plantarum strain NRRL B-14768 16S ribosomal RNA(99.52718676%)、Lactobacillus plantarum strain NBRC 15891 16S ribosomal RNA(99.52038369%)、及Lactobacillus plantarum subsp.argentoratensis strain DKO 22 16S ribosomal RNA(98.81982691%)等。

實施例3 益生菌產生多醣能力的差異

表1結果顯示益生菌產生多醣能力的差異，植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891於MRS培養基中，培養24小時，以苯酚硫酸法分析多醣含量，可得7380ppm，相較於植物乳桿菌(L.plantarum)BCRC 10069於同樣培養條件下，所生產的3222ppm的多醣為高；相較於其他不同來源篩選到的植物乳桿菌，於相同培養條件下所得到的多醣也相對高。

植物乳桿菌(L.plantarum)BCRC 910891於MRS平板培養基 中，培養24小時後，以牙籤垂直勾取菌落，丈量菌落黏絲延展長度可達300mm，相較於L.plantarum BCRC 10069於同樣培養條件下，菌落黏絲延展長度為120mm；其他不同來源篩選到的植物乳桿菌，於相同培養條件下，丈量菌落黏絲延展長度為0-210mm不等，而其他的乳酸菌如鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus TS6)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis BCRC 12310)、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus BCRC 11064，於相同培養條件下，丈量菌落黏絲延展長度為0-95mm不等。

植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891於MRS培養基中所產出的多醣量相較於L.plantarum G30或P30的多醣含量為低，但是植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891所呈現的多醣延展特性遠較L.plantarum G30或P30為佳，顯示不同的植物乳桿菌仍有在多醣特性上的差異，而且多醣含量與多醣延展特性，並不一定有正相關關係。

實施例4 乳酸菌發酵品

4-1 乳酸菌發酵品製備

豆漿製作：豆漿包含熟豆漿與熟全豆豆漿；熟豆漿製作：黃豆浸泡於水中1：5的比例後，利用市售研磨設備，將黃豆磨漿均質化後，使用市售之過濾設備、濾布或濾網等去除豆渣後，所得的生豆漿，放入高壓滅菌釜，進行階段性熱處理：以105℃加熱5分鐘，將大豆之脂肪氧化酵素的活性去除，溫度降至90℃加熱15分鐘。待熟豆漿冷卻後，置入4℃備用；熟全豆豆漿製作：黃豆浸泡於水中1：5的比例後，過濾，將過濾後的水秤重後記錄，將瀝乾的黃豆置入放入高壓滅菌釜，進行階段性熱處理：以121℃加熱10分鐘，溫度降至105℃加熱25-60分鐘後，取出後置於市售濕式均質 機，如果汁機等，並加入加熱前紀錄的過濾後水重後，進行均質。將均質後全豆豆漿於90℃加熱15分鐘，待全豆豆漿冷卻後，置入4℃備用。

豆漿乳酸菌發酵：將冷藏的熟豆漿或全豆豆漿先於65℃加熱30分鐘，使其溫度降溫度至37℃以下，即可作為乳酸菌發酵用基質。取0.1-5%(v/v)之活化乳酸菌菌液加入發酵基質中，使各乳酸菌菌種於發酵基質中的起始菌數為每毫升至少有1.0*10⁵CFU，於30-37℃培養8-24小時，當豆漿乳酸菌發酵品的pH值達4.6時，即達發酵終點，移入4℃進行低溫熟成處理。將發酵品以冷凍乾燥機進行冷凍乾燥後，再以均質機打碎成粉末，得到粉狀的豆漿乳酸菌發酵品，再以無菌水還原為豆漿乳酸菌發酵品溶液。

植物漿乳酸菌發酵：購買市售薏仁漿、杏仁漿、米漿、黎麥漿，加入植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891、L.plantarum BCRC 10069^T、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus BCRC 11064及戊醣乳酸桿菌Lactobacillus pentosus BCRC 11053^T各1%，於30-37℃培養8-24小時，當植物漿乳酸菌發酵品的pH值達4.6時，即達發酵終點，移入4℃進行低溫熟成處理。將發酵品以冷凍乾燥機進行冷凍乾燥後，再以均質機打碎成粉末，得到粉狀的植物漿乳酸菌發酵品，再以無菌水還原為植物漿乳酸菌發酵品溶液。

前述低溫熟成處理的乳酸菌發酵品以冷凍乾燥機進行冷凍乾燥後，再以均質機打碎成粉末，得到粉狀的乳酸菌發酵品，再以無菌水還原為乳酸菌發酵品溶液。

4-2 豆漿乳酸菌發酵品品質檢測

豆漿乳酸菌發酵品特性

以不同益生菌完成的熟豆漿乳酸菌發酵品與熟全豆豆漿乳酸菌發酵品冷藏於4℃，定期取出測定乳酸菌菌數、酸度(相對乳酸含量)、離水量等特性，評估豆漿乳酸菌發酵品特性，結果如表2所示。

離水率檢測

取20克樣品以1000 xg離心10分鐘，倒出上清液並秤重。豆漿乳酸菌發酵品於保存期間，由於乳酸菌仍持續產酸，使得蛋白質凝結的結構不斷改變，將結構中的水分釋出，而造成離水現象(syneresis)。此現象的產生過多，會造成整體組織與品質的不一致，對於產品口感會有所影響，因此離水程度越少越好。離水程度計算方式如下：離水程度=上清液重量/大豆乳酸菌發酵品原重(20g)x 100%

所有組合，於發酵24小時內，均可達到10⁸CFU/mL以上的乳酸菌濃度。相較無添加植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891的組合，添加有植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891的組合中，發酵終點的pH略高，且於4℃冷藏後7天pH值下降幅度亦較小，也有較低的離水率。單獨以植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891進行豆漿發酵，發酵24小時候，pH仍在4.5以上，呈現具半流動性的凝結狀，因此未進行離水率的測試。

4-3 伽瑪胺基丁酸(γ-aminobutyric acid；GABA)分析

GABA在中樞神經系統中為一個主要抑制神經傳導的物質，近年來透過研究已證實GABA不論以注射或口服的方式，均可透過生理機制對血壓上升、提升睡眠品質及改善情緒沮喪的現象達到控制的目的。「日本健康營養食品協會」，已明確認定GABA為「特定保健用食品」中，對於高血壓患者推薦使用的素材之一，此型態的食品中，GABA每日建議攝取10-20mg即具有降血壓功能；而「日本機能性食品研究會」推薦認為 GABA為具有成為機能性素材的潛力，許多研究已指出攝取GABA 26.4mg具有改善失眠及焦慮的效果。本研究使用不同乳酸菌加入豆漿中進行發酵，結果整理於表2：單獨使用L.plantarum BCRC 910891，可使豆漿中的GABA含量自9.36±0.06mg/100g大幅提升至25.97±0.08mg/100g；加入乳酸菌包括L.plantarum BCRC 910891、L.plantarum BCRC 10069^T、L.plantarum G30、Pediococcus pentosaceus BCRC 11064以及Lactobacillus pentosus BCRC 11053^T等於豆漿中發酵，則使發酵品中的GABA可提升至35.72±0.15mg/100g；若加入L.plantarum BCRC 910891、Pediococcus pentosaceus BCRC 11064以及Lactobacillus pentosus BCRC 11053^T則發酵品中的GABA含量為26.34±0.13mg/100g；若上述的乳酸菌組合中，植物乳桿菌僅使用plantarum BCRC 10069以及自行篩選的植物乳桿菌L.plantarum G30搭配Pediococcus pentosaceus BCRC 11064以及Lactobacillus pentosus BCRC 11053^T則發酵品中的GABA含量為20.46±0.07mg/100g；由實驗結果顯示植物乳桿菌L.plantarum與Pediococcus pentosaceus以及Lactobacillus pentosus在發酵豆漿的過程中，乳酸菌之間的彼此交互作用，也可以使發酵結果中的GABA含量提升；另一方面也發現，不同的植物乳桿菌在豆漿中發酵時，對於提升發酵豆漿的GABA含量，有所不同，在本研究中顯示，L.plantarum BCRC 10069^T或自行篩選的植物乳桿菌L.plantarum G30亦會生產GABA，但仍以植物乳桿菌L.plantarum BCRC910891的生產能力較佳。

4-4 異黃酮(Isoflavones)去醣基分析

大豆異黃酮為大豆中含有的一種植物性雌激素(phytoestrogens)，已有需多科學文獻指出大豆異黃酮對於乳癌、直腸癌、或 是骨質疏鬆有預防的效果，長期食用含有大豆異黃酮的食品，對於更年期症候群的症狀有減緩的現象。大豆異黃酮中，有許多結構相近的化合物，大致可以大豆異黃酮苷素(daidzein)、金雀異黃酮苷素(genistein)、黃豆黃苷素(glycitein)等三群去醣基異黃酮(aglycones)為主結構，再連接上不同糖基，而形成大豆異黃酮苷(daidzin)、金雀異黃酮苷(genistin)、黃豆黃苷(glycitin)、大豆異黃酮苷素(daidzein)、金雀異黃酮苷素(genistein)、黃豆黃苷素(glycitein)、乙醯大豆異黃酮苷(acetyldaidzin)、乙醯金雀異黃酮苷(acetylgenistin)、乙醯黃豆黃苷(acetylglycitin)、丙二醯大豆異黃酮苷(malonyldaidzin)、丙二醯金雀異黃酮苷(malonylgenistin)及丙二醯黃豆黃苷(malonylglycitin)等帶醣基異黃酮安定存在於黃豆中。黃豆將攝食後，透過腸內微生物所生產的糖基水解酵素(glycosidases)水解成去醣基異黃酮，這些去醣基異黃酮可在體內進一步代謝形成equol等化合物；由於這些代謝物的化學結構與哺乳類動物的雌激素(estrogen)非常相似，因此能在體內表現出「選擇性雌激素接受調節器(S.E.R.M.)」的特性。

然而，由於在人體腸道中所分布的微生物，不一定都具有良好的醣基水解酵素，因此可能影響大豆異黃酮的生物活性利用率。因此透過加工的製程，挑選適當的微生物對於大豆中的帶醣基異黃酮進行轉換，可有效提供具有生理活性的去醣基異黃酮的發酵食品。

本研究中所使用的植物乳桿菌L.plantarum BCRC910891具有優秀的醣基水解酵素生產能力，單獨使用時，可使豆漿中的去醣基異黃酮比例達88.62±0.13%；L.plantarum BCRC 10069^T，可使豆漿中的去醣基異黃酮比例達61.62±0.13%，但自行篩選的L.plantarum G30，僅豆漿中的去醣 基異黃酮比例達24.32±0.06%，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus BCRC 11064或戊醣乳酸桿菌Lactobacillus pentosus BCRC 11053^T等，雖可使豆漿中的去醣基異黃酮比例達50.62±0.13%，但若與植物乳桿菌L.plantarum BCRC910891組合，則可使豆漿中的去醣基異黃酮比例達92.15±0.23%。

實施例5 發酵品對於艾克曼嗜黏蛋白菌生長的影響

發酵品前處理：熟豆漿、熟全豆豆漿或植物漿等乳酸菌發酵品進行均質後，於65℃水浴30分鐘後，離心得上清液，將上清液儲存於4℃備用。

艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphila)BCRC 81048^T(購自BCRC)，培養於GAM培養基，37℃，以N₂：CO₂(80：20 ratio)置換空氣的絕對厭氧培養箱中培養24小時，使600nm下的吸光值達2.0時離心，去除培養液，蒐集菌體，加入新鮮配置的GAM培養基，調整吸光值至0.05。取經前處理後的發酵品上清液10%(v/v)，加入後，37℃，以N₂：CO₂(80：20 ratio)置換空氣的絕對厭氧培養箱中，培養24小時，以吸光值變化進行艾克曼嗜黏蛋白菌的生長檢測。

相對生長量計算=24小時吸光值-0小時吸光值/0小時吸光值

GAM培養基配方為每公升含有：Proteose Peptone 5.0g、Digested Serum 10.0g、Yeast Extract 2.5g、Meat Extract2.2g、Liver Extract 1.2g、Dextrose 0.5g、Soluble Starch 5.0g、L-Tryptophan 0.2g、L-Cysteine Hydrochloride 0.3g、Sodium Thioglycollate 0.3g、L-Arginine 1.0g、Vitamin K1 5mg、Hemin 10mg、Potassium Dihydrogen Phosphate 2.5g、Sodium Chloride 3.0g、Peptone 5.0g、Soya Peptone 3.0g，調整pH值為7.1。

植物乳桿菌L.plantarum BCRC 910891與戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus BCRC 11064或戊醣乳酸桿菌Lactobacillus pentosus BCRC 11053^T以不同組合，分別添加入熟豆漿中進行發酵，於發酵終點後，經高速離心取得上清液，以10%比例加入GAM培養基中，觀察各種乳酸菌組合的熟豆漿乳酸菌發酵品對艾克曼嗜黏蛋白菌Akkermansia muciniphila BCRC 81048^T生長的影響。

圖1結果顯示含有單獨或混合植物乳桿菌BCRC 910891(A)、戊糖片球菌BCRC 11064(B)及戊醣乳酸桿菌BCRC 11053(C)的豆漿乳酸菌發酵物，對於艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048^T生長的影響。由圖1結果可得知，未經乳酸菌發酵過的豆漿的成分對於艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048^T的生長刺激，助益非常低。但是經過植物乳桿菌BCRC 910891與戊糖片球菌BCRC 11064或戊醣乳酸桿菌BCRC 11053^T以不同組合發酵後的豆漿發酵物，對於艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048^T的生長，均較原GAM培養基為佳。

植物乳桿菌BCRC 910891與戊糖片球菌BCRC 11064及戊醣乳酸桿菌BCRC 11053^T共同添加於市售不同植物來源的基質中進行發酵，於發酵終點後，經高速離心取得上清液，以10%比例加入GAM培養基中，觀察各種乳酸菌組合的植物漿乳酸菌發酵品對艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048^T生長的影響。

圖2是含有混合植物乳桿菌BCRC 910891(A)、戊糖片球菌BCRC 11064(B)及戊醣乳酸桿菌BCRC 11053^T(C)以市售不同植物來源為基質發酵的產物，對於艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048^T生長的影響。由圖2結 果可得知，未經乳酸菌發酵過的薏仁汁、燕麥飲以及米漿中的成分，相對於GAM培養基，對於艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048^T的生長刺激，助益。但是經過植物乳桿菌BCRC 910891與戊糖片球菌BCRC 11064或戊醣乳酸桿菌BCRC 11053^T組合後的發酵物，對於艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048^T的生長，均較原GAM培養基為佳。前述市售植物漿，以五穀雜糧或核果加水均質化的植物漿取代，也可以得到相似結果，五穀雜糧與核果包含小米、大米、麥、大豆、高粱、花生、薏仁、藜麥、薏仁、杏仁、芝麻、紅豆、綠豆、腰果。

透過本研究顯示，不同植物來源的基質，透過乳酸菌的發酵所得的產物，有助於艾克曼嗜黏蛋白菌得生長，未來可以作為培養艾克曼嗜黏蛋白菌的使用。

實施例6 豆漿益生菌發酵品對糖尿病小鼠腸道菌相的影響

國立嘉義大學袁宏德碩士論文「高加價值發酵豆漿產品在Streptozotocin(STZ)誘導高血糖小鼠模式下的保護作用」教示L.plantarum發酵豆漿產品均對高血糖小鼠有顯著的保護作用，論文結果顯示鏈脲佐菌素(Streptozotocin；STZ)誘導為糖尿病鼠模式的小鼠，分別以無菌水(控制組)、豆漿(比較組)以及發酵豆漿乳酸菌產品(實驗組)餵食28天期間血糖濃度變化，實驗組小鼠的血糖自第7天起，就與控制組有顯著的差異，而此現象也持續平穩持續到實驗結束的第28天；實驗組小鼠的平均血糖，也與僅餵食豆漿的組別有明顯的差異；STZ糖尿病小鼠，在28天一般飲食飼養期間，血糖自220mg/dL不斷上升至400mg/dL；而餵食豆漿的組別，血糖自220mg/dL緩慢上升至320mg/dL附近，但經過發酵豆漿產品餵食，STZ的糖尿病 小鼠的血糖，在餵食期間，穩定維持在200-220mg/dL附近。由血糖的變化，可以明顯看出經過發酵豆漿產品，可以有效的控制血糖的急遽上升。因此本發明進一步知道使用L.plantarum BCRC 910891製成的豆漿益生菌發酵品是否可以改善糖尿病患的腸道菌相。

使用30隻6週齡的無特定病源(specifid Pathogen-Free；SPF)小鼠(品系：C57/BL6；來源：國家實驗動物中心)，C57/BL6小鼠禁食24小時後，腹腔注射(intraperitoneal injection)40mg/kg體重的鏈脲佐菌素(Streptozotocin或Streptozocin；簡稱STZ素；溶解於100mM檸檬酸鈉，pH 4.5)。首七日內，每天給予鏈脲佐菌素一次，共給予7次，建立小鼠糖尿病模式。七天後，以葡糖氧化酶(glucose oxidase)法測定血糖，以確認是否成功誘發糖尿病。當實驗期間無禁食的小鼠血糖質達250mg/dL時，則視為疾病模式建立成功。隨後實驗期間，每隔三天量測血糖一次，評估糖尿病小鼠的血糖濃度是利用市售的葡萄糖檢測套組(Glucose Assay Kit)(Sigma,USA)評估血液中葡糖糖含量。其中血糖濃度測試是在小鼠禁食4小時候進行採血。

每組有3隻雄性小鼠與3隻雌性小鼠，隨機分組。按小鼠體重計算每日管餵小鼠100μL無菌水，實驗組的小鼠每日每公斤的熟豆漿乳酸菌發酵品攝取量為250mg/Kg body weight/day或100mg/Kg body weight/day。比較組的小鼠每日每公斤的熟豆漿攝取量為250mg/Kg body weight/day或100mg/Kg body weight/day。控制組則給予無菌水。自注射鏈脲佐菌素完成建立小鼠糖尿病動物模式試驗起，每天投以一次，連續給予30天。C57/BL6小鼠飼養在無特定並源的正壓環境中，控溫保持在24℃，並 維持於12小時切換的光暗循環場域。飼養期間不限制飼料及水的供應。C57/BL6小鼠的飼養條件均依循國家衛生研究院公告的相關實驗動物管理指南進行。所有組別中的小鼠均經誘導糖尿病模式處理。實驗結束，犧牲小鼠，取得全小腸段，於-20℃凍存。

將凍存於-20℃的小鼠小腸，以滅菌過的剪刀剪開後，以滅菌後的刮勺，刮取腸黏膜，放置於PBS溶液中。利用vortex充分將黏膜上的菌體震盪出，以12000rpm轉速進行離心，將上清液除去後，再以PBS溶液，進行沉澱物清洗，重複三次後，得到的沉澱物，再以商用DNA萃取套組試劑QIAmp DNA Stool Mini kit(Qiagen)，進行DNA萃取。所得到的DNA萃取物，保存於-20℃備用。進行腸道菌相分析，是利用細菌通用核醣體的16S rRNA引子，針對V4區域，引子序列如表3，例如正向引子F1可以與R1、R2、R3、R4四個反向引子的組合，加入萃取出的DNA樣品中，進行聚合酶連鎖反應，利用次世代基因定序(Next General Sequencing)方式，進行分析。

A：Adenine；C：Cytosine；G：Guanine；T：Thymine；R：Guanine/Adenine(purine)；Y：Cytosine/Thymine(pyrimidine)；M：Adenine/Cytosine；S：Guanine/Cytosine D：Guanine/Adenine/Thymine；H：Adenine/Cytosine/Thymine；V：Guanine/Cytosine/ Adenine；N：Adenine/Guanine/Cytosine/Thymine。

將腸道菌群，依有益菌、有害菌以及伺機性菌等進行分類。圖3結果顯示STZ成功誘導的糖尿病模式小鼠，分別以熟豆漿(比較組)以及L.plantarum BCRC 910891發酵的熟豆漿乳酸菌發酵物(實驗組)餵食28天後的腸道菌相變化：餵食經BCRC 910891發酵的熟豆漿乳酸菌發酵物組別中，小鼠腸道中有益菌的比例達到77.6%，伺機性菌的比例為20.0%；而餵食熟豆漿的組別，小鼠腸道中有益菌的比例只達3.8%，明顯較有害菌所佔的49.4%為低，伺機性菌的比例(46.8%)和有害菌的比例相當；STZ成功誘導的糖尿病模式小鼠，以含有L.plantarum BCRC 910891發酵的熟豆漿乳酸菌發酵物，餵食28天後的腸道菌中的有益菌會較僅餵食熟豆漿組的腸道有益菌提升15倍以上。圖4結果顯示STZ成功誘導的糖尿病模式小鼠，分別比較熟豆漿(比較組)以及利用L.plantarum BCRC 910891發酵的熟豆漿乳酸菌發酵物(實驗組)餵食28天後的腸道中艾克曼嗜黏蛋白菌所佔的比例，明顯的發現，在餵食經過BCRC 910891發酵豆漿的實驗組中的小鼠腸道中的艾克曼嗜黏蛋白菌的比例高於僅餵食豆漿組的小鼠400倍。

綜上所述，本發明由台灣高山茶葉植栽篩選出的植物乳桿菌菌株BCRC 910891可以達成以下功效：

(1)BCRC 910891具有良好的黏稠性多醣生產能力，單獨使用或搭配其他益生菌都可以使豆類蛋白(豆漿)凝集成為不易離水的植物性凝態優格--豆漿乳酸菌發酵品。

(2)BCRC 910891製成的豆漿乳酸菌發酵品可以有效促進艾克曼嗜黏蛋白菌株(Akkermansia muciniphila)在腸道菌群中的比例、提升腸道中乳 酸菌含量以及優良菌相。

(3)BCRC 910891製成的豆漿乳酸菌發酵品中的γ-氨基丁酸含量可達20mg/100g以上、去醣基異黃酮佔總異黃酮量可達92%。

(4)除豆類發酵品外，以BCRC 910891將燕麥、米、薏仁等製成的植物漿乳酸菌發酵品，亦可促進艾克曼嗜黏蛋白菌株(Akkermansia muciniphila)菌株生長。

上列詳細說明係針對本發明之可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

1.財團法人食品工業發展研究所，寄存日期為2019年5月3日、寄存編號為BCRC 910891

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

1.中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心、寄存日期為2019年5月6日、寄存編號為CGMCC17716

<110> 歐斐生

<120> 一種植物乳桿菌及其製備植物性凝態優格、改善腸道菌相的用途

<130> PA20190394

<160> 5

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 2

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 4

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 5

Claims (13)

1. 一種新穎乳酸菌株，該菌為一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，其係寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910891，及寄存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，寄存編號為CGMCC17716。
2. 一種植物性凝態優格，是以植物漿加入益生菌製成，其中該益生菌包含植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，其係寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910891，及寄存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，寄存編號為CGMCC17716；其中該植物性凝態優格的離水性小於25%。
3. 如申請專利範圍第2項所述的植物性凝態優格，其中該益生菌可進一步包含戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。
4. 如申請專利範圍第2項所述的植物性凝態優格，其中該植物漿是水與五穀雜糧、核果均質化所得。
5. 如申請專利範圍第3項所述的植物性凝態優格，其中該五穀雜糧、核果選自於由小米、大米、麥、大豆、高粱、花生、薏仁、藜麥、薏仁、杏仁、芝麻、紅豆、綠豆和腰果所組成的群組。
6. 如申請專利範圍第2項所述的植物性凝態優格，其中每100克該植物性凝態優格中的伽瑪胺基丁酸含量超過15毫克。
7. 如申請專利範圍第2項所述的植物性凝態優格，其中每100克該植物性凝態優格中的伽瑪胺基丁酸含量超過25毫克。
8. 如申請專利範圍第2項所述的植物性凝態優格，其中該植物性凝態優格中 異黃酮的去醣基率超過80%。
9. 如申請專利範圍第2項所述的植物性凝態優格，可用於培養艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphilia)。
10. 一種如申請專利範圍第2項所述的植物性凝態優格用於改善腸道菌相的用途。
11. 如申請專利範圍第10項所述的用途，其中該改善腸道菌相是改善糖尿病患者的腸道菌相。
12. 如申請專利範圍第10項所述的用途，其中該改善腸道菌相是腸道中有益菌增加。
13. 如申請專利範圍第12項所述的用途，其中該有益菌是艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphilia)。

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