CN112538439B - 一种植物乳杆菌及其制备植物性凝态酸奶、改善肠道菌相的用途 - Google Patents

一种植物乳杆菌及其制备植物性凝态酸奶、改善肠道菌相的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，尤其是关于一种植物乳杆菌及其制备植物性凝态酸奶、改善肠道菌相的用途。本发明中公开了一种新颖植物乳杆菌菌株，保藏编号为CGMCC17716。本发明公开了一种植物性凝态酸奶及其用于改善肠道菌群的用途，所述植物性凝态酸奶以植物浆加入益生菌制成，所述益生菌包含植物乳杆菌CGMCC17716；其中所述植物性凝态酸奶的离水性小于25％。植物性凝态酸奶中具有高含量伽玛胺基丁酸、去糖基异黄酮，该植物性凝态酸奶可以改善健康人与糖尿病患的肠道菌相，改善肠道菌相是指增加有益菌、伺机菌，尤其可以增加肠道中的艾克曼嗜黏蛋白菌。

Description

一种植物乳杆菌及其制备植物性凝态酸奶、改善肠道菌相的 用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是关于一种植物乳杆菌及其制备植物性凝态酸奶、改善肠道菌相的用途。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria；LAB)为泛指可将糖类转换成以乳酸为主要代谢物的微生物总称。乳酸菌被广泛的应用在全世界的传统食品中，被公认为安全(GeneralRecognized as Safe；GRAS)的微生物菌种。
乳酸菌可提供发酵食品的制造以及风味，主要通过三种代谢路径，包括:糖解反应(发酵糖类)、脂解反应(降解脂肪)、蛋白质分解反应(分解蛋白质为小分子胜肽或胺基酸)。乳酸是主要糖类代谢后的结果，但部分微生物菌株，会将中间代谢产物如丙酮酸，再转换成二乙酰基(diacetyl)、乙酰甲基甲醇(acetoin)、乙酸乙酯(acetaldehyde)或及醋酸(acetic acid)，成为常见乳制品乳酸发酵的酸味主要来源；但是蛋白质类的乳酸发酵食品，主要的风味，是来自蛋白质降解过程中所产生的挥发性气体，包括不同的醇类(alcohols)、醛类(aldehydes)、酯类(esters)等。
虽然市售乳酸菌食品中，以动物奶作为发酵主原料制作而成的酸奶(yogurt)或是酸奶饮(drink yogurt)较多。然而根据统计指出，全球乳糖不耐症人口数高达70％，其中亚洲人更高达95％。此外，因信仰而选择不使用乳制品的蔬食或素食人口，提供乳酸菌的蛋白质发酵食品，成为替代动物奶的酸奶食品的开发趋势。
乳酸菌培养于蛋白质溶液中，由乳酸菌释放出的有机酸，造成的pH值下降，同时会造成蛋白质分子间的凝集，而形成凝结状态。此状态出现于酸奶制品中，易受到pH、温度、外力等变化，而造成不同程度的离水现象，严重的离水现象，导致产品外观缺失以及质量变异等不同程度的影响。市售凝乳产品中，为减少凝结的离水现象，常透过额外添加固形物(利入乳清蛋白等)或是添加稳定剂(例如变性淀粉、果胶、洋菜胶等)加以改善。
部分乳酸菌，在特定的比例以及培养条件下，可以生产出细胞外多糖体(exopolysaccharides；EPS)结构可以减缓蛋白质凝结的离水现象，进而改善质地及口感。然而随着乳酸菌菌种以及培养条件的差异，这些胞外多糖体的产量、组成以及性质有极大的差异。部分菌种的胞外多糖，可协助菌株的抵抗肠胃道的酸碱值，而安全存活于肠胃道。
「脑肠轴线」(gut-brain axis)，是肠道与脑相互联络的重要途径，其中肠道中的微生物扮演重要的角色，包括，肠躁症、忧郁症、焦虑症、自闭症、慢性疲劳、第二型糖尿病等盛行率极高的疾病，都和脑肠轴线相关。人类肠道的细菌门，以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)占极高比例，其次是放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)以及疣微菌门(Verrucobacteria)等，随着居住地域以及饮食、健康状况不同，可被分析出多达50门的分类。
肠道微生物的动态与人体间的互动关系，常以有益菌、有害菌以及伺机性，其中伺机性的微生物，是随着有益菌和有害菌的比例改变，而有所改变，当有益菌比例高过有害菌时，伺机性微生物的比例随着提升；反之亦然。
肠道微生物中常被认为有益菌包括：双崎杆菌目(Bifidobacteriales)中的两叉双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、动物双崎杆菌(Bifidobacterium animalis)、热嗜酸性双崎杆菌(Bifidobacteriumthermacidophilum)、短双崎杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双崎杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、长双崎杆菌(Bifidobacterium longum)等；乳酸菌科(Lactobacillaceae)中的洛德乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)、短乳酸杆菌(Lactobacillusbrevis)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)、加氏乳酸杆菌(Lactobacillusgasseri)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)、詹氏乳酸杆菌(Lactobacillusjensenii)等；疣微菌门(Verrucobacteria)的艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansiamuciniphila)等。
肠道微生物中常被认为有害菌包括：困难梭状芽孢菌(Clostridiumdifficilie)、产气梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringes)、病原性大肠杆菌(Esxcherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、克雷白氏杆菌(Klebseilla)、沙门氏杆菌(Salmonella)、志贺氏杆菌(Shigella)、曲状杆菌(Campylobacter)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、仙人掌杆菌(Bacillus cereus)、细梭菌(Fusobacteria)、链球菌(Streptococcus)等。
因此，通过饮食或是药物，维持或是促进健康的肠道菌群，维持较高比例的益生菌是值得期待的。目前对于为何通过特定的膳食补充可以提升动物体内的有益菌的比例机制尚未了解，因此，对于何种益生菌、或是何种组合的益生菌，在何种的基质下进行发酵后的产物，对于提升动物肠道内有益菌的比例，仍需进行探讨。有鉴于此，本发明的目的，在于提供一种可以提升动物体内有益菌比例的植物性发酵产物及其应用。
在肠道中的有益菌群中，艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphila)为一个被认为重要的菌种。艾克曼嗜黏蛋白菌为绝对厌氧，且在动物体内以肠黏膜蛋白为唯一碳源及氮源的细菌，首次报道是在2004年由荷兰学者Willemde Vos实验室发现并且鉴定出来的。这个细菌在人体内的含量很丰富，可以高达1-3％。由于其可分解肠黏膜蛋白，因此对于影响紧生长于肠黏下的肠内皮细胞的生理性。自2007年开始，陆续的研究发现，艾克曼嗜黏蛋白菌可能是一个具有生理功能且值得应用开发的次世代益生菌菌种。目前已经知道艾克曼嗜黏蛋白菌与很多健康问题有负相关性，例如艾克曼嗜黏蛋白菌越少的个体，越容易发胖、出现发炎症状和第二型糖尿病等；肠道内的艾克曼嗜黏蛋白菌越多的动物个体，肥胖、发炎症状和2型糖尿病的比例相对减少糖尿病鼠粪便中艾克曼嗜黏蛋白菌，会较正常鼠降低到3000倍以下；肥胖鼠粪便中艾克曼嗜黏蛋白菌，会较正常鼠降低到100倍以下。艾克曼嗜黏蛋白菌在高脂饮食的小鼠肠道内生长，可保护小鼠免于因高脂饮食引起的代谢与免疫风险，艾克曼嗜黏蛋白菌在人体内存在的比例，对于增加癌症免疫治疗效果上有非常显著的作用。因此，提供适当的饮食提升肠胃道中艾克曼嗜黏蛋白菌的数量，预期对于维持身体健康状况有所帮助。
先前研究指出直接于膳食中添加Bifidobacterium animalis subsp.lactis菌种提供小鼠连续食用14天，可增加粪便中艾克曼嗜黏蛋白菌的数量，但是Lactobacillusrhamnosus则无此效果；此外，提供果寡糖给接受高脂饮食的小鼠，可有效提升粪便中艾克曼嗜黏蛋白菌的数量；补充蔓越莓或康考特葡萄萃取物，可以有效提升粪便中艾克曼嗜黏蛋白菌的数量，然而补充石榴萃取物、绿茶萃取物或加州葡萄萃取物，对于健康人或小鼠的艾克曼嗜黏蛋白菌的数量变化没有影响。
目前对于为何透过特定的膳食补充可以提升动物体内的艾克曼嗜黏蛋白菌数量机制尚未了解，因此，对于何种益生菌、或是何种组合的益生菌，在何种的基质下进行发酵后的产物，对于提升动物体内艾克曼嗜黏蛋白菌数量，仍需进行探讨。
有鉴于此，如何于提供一种可以提升动物体内或是体外艾克曼嗜黏蛋白菌数量的植物性发酵产物及其应用，即成为本发明在此欲解决的一重要课题。
发明内容
本发明的目的即在于提供一种新颖乳酸菌株，该菌为一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC17716。
本发明的另一目的即在于提供一种植物性凝态酸奶，是以植物浆加入益生菌制成，其中该益生菌包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，该植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC17716；其中该植物性凝态酸奶的离水性小于25％。
为达前述发明目的，其中该益生菌可进一步包含戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。
为达前述发明目的，其中该植物浆是水与五谷杂粮均质化所得。
为达前述发明目的，其中该五谷杂粮与核果选自于由小米、大米、麦、大豆、高粱、花生、薏仁、藜麦、杏仁、芝麻、红豆、绿豆、腰果所组成的群组。
为达前述发明目的，每100克该植物性凝态酸奶中的伽玛胺基丁酸含量超过15毫克。
为达前述发明目的，每100克该植物性凝态酸奶中的伽玛胺基丁酸含量超过25毫克。
为达前述发明目的，其中该植物性凝态酸奶中异黄酮的去糖基率超过80％。
为达前述发明目的，其中该植物性凝态酸奶，可做为培养艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphilia)的培养成分使用。
本发明的又一目的即在于提供一种前述植物性凝态酸奶用于改善肠道菌相的用途。
为达前述发明目的，其中该改善肠道菌相是改善糖尿病患者的肠道菌相。
为达前述发明目的，其中该改善肠道菌相是肠道中有益菌或伺机菌增加。
为达前述发明目的，其中该有益菌包括但不限定是艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphilia)。
综上所述，与现有技术相较。本发明由中国台湾高山茶叶植栽筛选出的植物乳杆菌菌株CGMCC17716具有以下优点：
(1)植物乳杆菌CGMCC17716具有良好的黏稠性多糖生产能力，单独使用或搭配其他益生菌都可以使豆类蛋白(豆浆)凝集成为不易离水的植物性凝态酸奶--豆浆乳酸菌发酵品。
(2)植物乳杆菌CGMCC17716制成的豆浆乳酸菌发酵品可以提升肠道中有益菌、伺机菌并有效促进Akkermansia muciniphila菌株在肠道菌群中的比例，可以改善肠道菌相，尤其可以改善糖尿病患者的肠道菌相。
(3)植物乳杆菌CGMCC17716制成的豆浆乳酸菌发酵品中的γ-氨基丁酸含量、去糖基异黄酮占总异黄酮量大量提升。
除豆类发酵品外，以植物乳杆菌CGMCC17716将燕麦、米、薏仁等制成的植物浆乳酸菌发酵品，亦可促进Akkermansia muciniphila菌株生长。
附图说明
图1为含有单独或混合植物乳杆菌CGMCC17716(A)、戊糖片球菌BCRC11064(B)及戊糖乳酸杆菌BCRC 11053(C)的豆浆乳酸菌发酵物，对于艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048T生长的影响图；
图2为含有混合植物乳杆菌CGMCC17716(A)、戊糖片球菌BCRC 11064(B)及戊糖乳酸杆菌BCRC 11053(C)以市售不同植物来源为基质发酵的产物，对于艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048T生长的影响图；
图3为STZ成功诱导的糖尿病模式小鼠，分别熟豆浆(比较组)以及L.CGMCC17716发酵的熟豆浆乳酸菌发酵物(实验组)喂食28天后的肠道菌相变化图；
图4是为STZ成功诱导的糖尿病模式小鼠，分别熟豆浆(比较组)以及CGMCC17716发酵的熟豆浆乳酸菌发酵物(实验组)喂食28天后的肠道中艾克曼嗜黏蛋白菌所占的比例图。
具体实施方式
本发明是以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
微生物及培养基：本实验特有的植物乳杆菌L.plantarum BIFT-LP-588，为自中国台湾高山茶叶植栽筛选出的菌株，依据布达佩斯条约，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏日期为2019年5月6日、保藏编号为CGMCC17716。其他使用乳酸菌购自中国台湾食品工业研究所生物资源保存及研究中心(BCRC)，包括植物乳杆菌L.plantarum BCRC 10069、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus BCRC 11064、戊糖乳酸杆菌Lactobacillus pentosus BCRC 11053。以上乳酸菌的冷冻菌液1mL加入50mL的MRS培养液，以37℃培养8-24小时，使菌液活化，使菌数达到1.0*108CFU/mL。
实施例1植物性凝态酸奶的制造方法
提供一植物蛋白混合物，其中该植物蛋白混合物是由五谷杂粮或核果及水所组成；进行一均质化步骤及一加热步骤，使该植物蛋白混合物形成一植物浆，其中该加热步骤是在高于90℃进行；以及进行一发酵步骤，该植物浆中加入一发酵菌种，在一发酵温度下进行一发酵时间，使该植物蛋白混浆之pH值达4.5时随即于4℃进行低温处理，藉此使该植物浆形成该植物性凝态酸奶；其中该五谷杂粮与核果包含小米、大米、麦、大豆、高粱、花生、薏仁、藜麦、杏仁、芝麻、红豆、绿豆、腰果，该植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC17716，该发酵时间是6-36小时，该发酵温度是27-45℃。
前述方法制得植物性凝态酸奶的离水性小于25％，具有良好口感，且每100克该植物性凝态酸奶中的伽玛胺基丁酸含量超过15毫克、异黄酮的去糖基率超过80％，营养价值高。
实施例2植物乳杆菌(L.plantarum)CGMCC17716特性
本实验特有的植物乳杆菌(L.plantarum)CGMCC17716，自中国台湾高山茶叶植栽筛选出植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716。经分子生物学鉴定16rDNA序列如附件。与目前公开的植物乳杆菌的16S核糖体RNA部分序列相似度未达100％，分别如下；植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌株JCM 114916S核糖体RNA(99.60598897％)、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌株NBRC 15891 16S核糖体RNA(99.52718676％)、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌株CIP 103151 16S核糖体RNA、(99.52718676％)、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌株JCM 1149 16S核糖体RNA(99.52718676％)、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌株NRRL B-14768 16S核糖体RNA(99.52718676％)、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌株NBRC 15891 16S核糖体RNA(99.52038369％)、及植物乳杆菌亚种Lactobacillus plantarum subsp.argentoratensis菌株DKO 22 16S核糖体lRNA(98.81982691％)等。
实施例3益生菌产生多糖能力的差异
表1结果显示益生菌产生多糖能力的差异，植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716于MRS培养基中，培养24小时，以苯酚硫酸法分析多糖含量，可得7380ppm，相较于植物乳杆菌(L.plantarum)BCRC 10069于同样培养条件下，所生产的3222ppm的多糖为高；相较于其他不同来源筛选到的植物乳杆菌，于相同培养条件下所得到的多糖也相对高。
表1
Figure GDA0003470648820000071
Figure GDA0003470648820000081
植物乳杆菌(L.plantarum)CGMCC17716于MRS平板培养基中，培养24小时后，以牙签垂直勾取菌落，丈量菌落黏丝延展长度可达300mm，相较于L.plantarum BCRC 10069于同样培养条件下，菌落黏丝延展长度为120mm；其他不同来源筛选到的植物乳杆菌，于相同培养条件下，丈量菌落黏丝延展长度为0-210mm不等，而其他的乳酸菌如鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus TS6)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis BCRC 12310)、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus BCRC 11064，于相同培养条件下，丈量菌落黏丝延展长度为0-95mm不等。
植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716于MRS培养基中所产出的多糖量相较于L.plantarum G30或P30的多糖含量为低，但是植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716所呈现的多糖延展特性远较L.plantarum G30或P30为佳，显示不同的植物乳杆菌仍有在多糖特性上的差异，而且多糖含量与多糖延展特性，并不一定有正相关关系。
实施例4乳酸菌发酵品
4-1乳酸菌发酵品制备
豆浆制作：豆浆包含熟豆浆与熟全豆豆浆；熟豆浆制作：黄豆浸泡于水中1:5的比例后，利用市售研磨设备，将黄豆磨浆均质化后，使用市售之过滤设备、滤布或滤网等去除豆渣后，所得的生豆浆，放入高压灭菌釜，进行阶段性热处理:以105℃加热5分钟，将大豆之脂肪氧化酵素的活性去除，温度降至90℃加热15分钟。待熟豆浆冷却后，置入4℃备用；熟全豆豆浆制作：黄豆浸泡于水中1:5的比例后，过滤，将过滤后的水秤重后记录，将沥干的黄豆置入放入高压灭菌釜，进行阶段性热处理:以121℃加热10分钟，温度降至105℃加热25-60分钟后，取出后置于市售湿式均质机，如果汁机等，并加入加热前纪录的过滤后水重后，进行均质。将均质后全豆豆浆于90℃加热15分钟，待全豆豆浆冷却后，置入4℃备用。
豆浆乳酸菌发酵：将冷藏的熟豆浆或全豆豆浆先于65℃加热30分钟，使其温度降温度至37℃以下，即可作为乳酸菌发酵用基质。取0.1-5％(v/v)之活化乳酸菌菌液加入发酵基质中，使各乳酸菌菌种于发酵基质中的起始菌数为每毫升至少有1.0*105CFU，于30-37℃培养8-24小时，当豆浆乳酸菌发酵品的pH值达4.6时，即达发酵终点，移入4℃进行低温熟成处理。将发酵品以冷冻干燥机进行冷冻干燥后，再以均质机打碎成粉末，得到粉状的豆浆乳酸菌发酵品，再以无菌水还原为豆浆乳酸菌发酵品溶液。
植物浆乳酸菌发酵：购买市售薏仁浆、杏仁浆、米浆、黎麦浆，加入植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716、L.plantarum BCRC 10069T、戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus BCRC 11064及戊糖乳酸杆菌Lactobacillus pentosus BCRC 11053T各1％，于30-37℃培养8-24小时，当植物浆乳酸菌发酵品的pH值达4.6时，即达发酵终点，移入4℃进行低温熟成处理。将发酵品以冷冻干燥机进行冷冻干燥后，再以均质机打碎成粉末，得到粉状的植物浆乳酸菌发酵品，再以无菌水还原为植物浆乳酸菌发酵品溶液。
前述低温熟成处理的乳酸菌发酵品以冷冻干燥机进行冷冻干燥后，再以均质机打碎成粉末，得到粉状的乳酸菌发酵品，再以无菌水还原为乳酸菌发酵品溶液。
4-2豆浆乳酸菌发酵品品质检测
豆浆乳酸菌发酵品特性
以不同益生菌完成的熟豆浆乳酸菌发酵品与熟全豆豆浆乳酸菌发酵品冷藏于4℃，定期取出测定乳酸菌菌数、酸度(相对乳酸含量)、离水量等特性，评估豆浆乳酸菌发酵品特性，结果如表2所示。
表2
Figure GDA0003470648820000101
Figure GDA0003470648820000111
离水率检测
取20克样品以1000xg离心10分钟，倒出上清液并秤重。豆浆乳酸菌发酵品于保存期间，由于乳酸菌仍持续产酸，使得蛋白质凝结的结构不断改变，将结构中的水分释出，而造成离水现象(syneresis)。此现象的产生过多，会造成整体组织与质量的不一致，对于产品口感会有所影响，因此离水程度越少越好。离水程度计算方式如下:
离水程度＝上清液重量/大豆乳酸菌发酵品原重(20g)x 100％
所有组合，于发酵24小时内，均可达到108CFU/mL以上的乳酸菌浓度。相较无添加植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716的组合，添加有植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716的组合中，发酵终点的pH略高，且于4℃冷藏后7天pH值下降幅度亦较小，也有较低的离水率。单独以植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716进行豆浆发酵，发酵24小时候，pH仍在4.5以上，呈现具半流动性的凝结状，因此未进行离水率的测试。
4-3伽玛胺基丁酸(γ-aminobutyric acid；GABA)分析
GABA在中枢神经系统中为一个主要抑制神经传导的物质，近年来透过研究已证实GABA不论以注射或口服的方式，均可透过生理机制对血压上升、提升睡眠质量及改善情绪沮丧的现象达到控制的目的。「日本健康营养食品协会」，已明确认定GABA为「特定保健用食品」中，对于高血压患者推荐使用的素材之一，此型态的食品中，GABA每日建议摄取10-20mg即具有降血压功能；而「日本机能性食品研究会」推荐认为GABA为具有成为机能性素材的潜力，许多研究已指出摄取GABA 26.4mg具有改善失眠及焦虑的效果。本研究使用不同乳酸菌加入豆浆中进行发酵，结果整理于表2:单独使用L.plantarum CGMCC17716，可使豆浆中的GABA含量自9.36±0.06mg/100g大幅提升至25.97±0.08mg/100g；加入乳酸菌包括L.plantarum CGMCC17716、L.plantarum BCRC 10069T、L.plantarum G30、Pediococcuspentosaceus BCRC11064以及Lactobacillus pentosus BCRC 11053T等于豆浆中发酵，则使发酵品中的GABA可提升至35.72±0.15mg/100g；若加入L.plantarum CGMCC17716、Pediococcus pentosaceus BCRC 11064以及Lactobacillus pentosus BCRC 11053T则发酵品中的GABA含量为26.34±0.13mg/100g；若上述的乳酸菌组合中，植物乳杆菌仅使用plantarum BCRC 10069以及自行筛选的植物乳杆菌L.plantarum G30搭配Pediococcuspentosaceus BCRC 11064以及Lactobacillus pentosus BCRC 11053T则发酵品中的GABA含量为20.46±0.07mg/100g；由实验结果显示植物乳杆菌L.plantarum与Pediococcuspentosaceus以及Lactobacillus pentosus在发酵豆浆的过程中，乳酸菌之间的彼此交互作用，也可以使发酵结果中的GABA含量提升；另一方面也发现，不同的植物乳杆菌在豆浆中发酵时，对于提升发酵豆浆的GABA含量，有所不同，在本研究中显示，L.plantarum BCRC10069T或自行筛选的植物乳杆菌L.plantarum G30亦会生产GABA，但仍以植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716的生产能力较佳。
4-4异黄酮(Isoflavones)去糖基分析
大豆异黄酮为大豆中含有的一种植物性雌激素(phytoestrogens)，已有需多科学文献指出大豆异黄酮对于乳癌、直肠癌、或是骨质疏松有预防的效果，长期食用含有大豆异黄酮的食品，对于更年期症候群的症状有减缓的现象。大豆异黄酮中，有许多结构相近的化合物，大致可以大豆异黄酮苷素(daidzein)、金雀异黄酮苷素(genistein)、黄豆黄苷素(glycitein)等三群去糖基异黄酮(aglycones)为主结构，再连接上不同糖基，而形成大豆异黄酮苷(daidzin)、金雀异黄酮苷(genistin)、黄豆黄苷(glycitin)、大豆异黄酮苷素(daidzein)、金雀异黄酮苷素(genistein)、黄豆黄苷素(glycitein)、乙酰大豆异黄酮苷(acetyldaidzin)、乙酰金雀异黄酮苷(acetylgenistin)、乙酰黄豆黄苷(acetylglycitin)、丙二酰大豆异黄酮苷(malonyldaidzin)、丙二酰金雀异黄酮苷(malonylgenistin)及丙二酰黄豆黄苷(malonylglycitin)等带糖基异黄酮安定存在于黄豆中。黄豆将摄食后，透过肠内微生物所生产的糖基水解酵素(glycosidases)水解成去糖基异黄酮，这些去糖基异黄酮可在体内进一步代谢形成equol等化合物；由于这些代谢物的化学结构与哺乳类动物的雌激素(estrogen)非常相似，因此能在体内表现出「选择性雌激素接受调节器(S.E.R.M.)」的特性。
然而，由于在人体肠道中所分布的微生物，不一定都具有良好的糖基水解酵素，因此可能影响大豆异黄酮的生物活性利用率。因此透过加工的制程，挑选适当的微生物对于大豆中的带糖基异黄酮进行转换，可有效提供具有生理活性的去糖基异黄酮的发酵食品。
本研究中所使用的植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716具有优秀的糖基水解酵素生产能力，单独使用时，可使豆浆中的去糖基异黄酮比例达88.62±0.13％；L.plantarumBCRC 10069T，可使豆浆中的去糖基异黄酮比例达61.62±0.13％，但自行筛选的L.plantarum G30，仅豆浆中的去糖基异黄酮比例达24.32±0.06％，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus BCRC 11064或戊糖乳酸杆菌Lactobacillus pentosus BCRC11053T等，虽可使豆浆中的去糖基异黄酮比例达50.62±0.13％，但若与植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716组合，则可使豆浆中的去糖基异黄酮比例达92.15±0.23％。
实施例5发酵品对于艾克曼嗜黏蛋白菌生长的影响
发酵品前处理：熟豆浆、熟全豆豆浆或植物浆等乳酸菌发酵品进行均质后，于65℃水浴30分钟后，离心得上清液，将上清液储存于4℃备用。
艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphila)BCRC 81048T(购自BCRC)，培养于GAM培养基，37℃，以N2:CO2(80:20ratio)置换空气的绝对厌氧培养箱中培养24小时，使600nm下的吸光值达2.0时离心，去除培养液，搜集菌体，加入新鲜配置的GAM培养基，调整吸光值至0.05。取经前处理后的发酵品上清液10％(v/v)，加入后，37℃，以N2:CO2(80:20ratio)置换空气的绝对厌氧培养箱中，培养24小时，以吸光值变化进行艾克曼嗜黏蛋白菌的生长检测。
相对生长量计算＝24小时吸光值-0小时吸光值/0小时吸光值
GAM培养基配方为每公升含有：
Figure GDA0003470648820000141
蛋白胨(Proteose Peptone)5.0g、消化血清(Digested Serum)10.0g、酵母提取物(Yeast Extract)2.5g、肉浸膏(Meat Extract)2.2g、肝浸膏(Liver Extract)1.2g、葡萄糖(Dextrose)0.5g、可溶性淀粉(Soluble Starch)5.0g、L-色氨酸0.2g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、巯基乙醇酸钠(Sodium Thioglycollate)0.3g、L-精氨酸1.0g、维生素K1 5mg、氯化血红素(Hemin)10mg、磷酸二氢钾(PotassiumDihydrogen Phosphate)2.5g、氯化钠3.0g、蛋白胨(Peptone)5.0g、大豆蛋白胨(SoyaPeptone)3.0g，调整pH值为7.1。
植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716与戊糖片球菌Pediococcus pentosaceusBCRC 11064或戊糖乳酸杆菌Lactobacillus pentosus BCRC 11053T以不同组合，分别添加入熟豆浆中进行发酵，于发酵终点后，经高速离心取得上清液，以10％比例加入GAM培养基中，观察各种乳酸菌组合的熟豆浆乳酸菌发酵品对艾克曼嗜黏蛋白菌Akkermansiamuciniphila BCRC 81048T生长的影响。
图1结果显示含有单独或混合植物乳杆菌CGMCC17716(A)、戊糖片球菌BCRC 11064(B)及戊糖乳酸杆菌BCRC 11053(C)的豆浆乳酸菌发酵物，对于艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC81048T生长的影响。由图1结果可得知，未经乳酸菌发酵过的豆浆的成分对于艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048T的生长刺激，帮助非常低。但是经过植物乳杆菌CGMCC17716与戊糖片球菌BCRC 11064或戊糖乳酸杆菌BCRC 11053T以不同组合发酵后的豆浆发酵物，对于艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048T的生长，均较原GAM培养基为佳。
植物乳杆菌CGMCC17716与戊糖片球菌BCRC 11064及戊糖乳酸杆菌BCRC 11053T共同添加于市售不同植物来源的基质中进行发酵，于发酵终点后，经高速离心取得上清液，以10％比例加入GAM培养基中，观察各种乳酸菌组合的植物浆乳酸菌发酵品对艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048T生长的影响。
图2是含有混合植物乳杆菌CGMCC17716(A)、戊糖片球菌BCRC 11064(B)及戊糖乳酸杆菌BCRC 11053T(C)以市售不同植物来源为基质发酵的产物，对于艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048T生长的影响。由图2结果可得知，未经乳酸菌发酵过的薏仁汁、燕麦饮以及米浆中的成分，相对于GAM培养基，对于艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048T的生长刺激，帮助。但是经过植物乳杆菌CGMCC17716与戊糖片球菌BCRC 11064或戊糖乳酸杆菌BCRC 11053T组合后的发酵物，对于艾克曼嗜黏蛋白菌BCRC 81048T的生长，均较原GAM培养基为佳。前述市售植物浆，以五谷杂粮或核果加水均质化的植物浆取代，也可以得到相似结果，五谷杂粮与核果包含小米、大米、麦、大豆、高粱、花生、薏仁、藜麦、杏仁、芝麻、红豆、绿豆、腰果。
通过本研究显示，不同植物来源的基质，透过乳酸菌的发酵所得的产物，有助于艾克曼嗜黏蛋白菌得生长，未来可以作为培养艾克曼嗜黏蛋白菌的使用。
实施例6豆浆益生菌发酵品对糖尿病小鼠肠道菌相的影响
中国台湾嘉义大学袁宏德硕士论文「高加价值发酵豆浆产品在Streptozotocin(STZ)诱导高血糖小鼠模式下的保护作用」教示L.plantarum发酵豆浆产品均对高血糖小鼠有显著的保护作用，论文结果显示链脲佐菌素(Streptozotocin；STZ)诱导为糖尿病鼠模式的小鼠，分别以无菌水(控制组)、豆浆(比较组)以及发酵豆浆乳酸菌产品(实验组)喂食28天期间血糖浓度变化，实验组小鼠的血糖自第7天起，就与控制组有显著的差异，而此现象也持续平稳持续到实验结束的第28天；实验组小鼠的平均血糖，也与仅喂食豆浆的组别有明显的差异；STZ糖尿病小鼠，在28天一般饮食饲养期间，血糖自220mg/dL不断上升至400mg/dL；而喂食豆浆的组别，血糖自220mg/dL缓慢上升至320mg/dL附近，但经过发酵豆浆产品喂食，STZ的糖尿病小鼠的血糖，在喂食期间，稳定维持在200-220mg/dL附近。由血糖的变化，可以明显看出经过发酵豆浆产品，可以有效的控制血糖的急遽上升。因此本发明进一步知道使用L.plantarum CGMCC17716制成的豆浆益生菌发酵品是否可以改善糖尿病患的肠道菌相。
使用30只6周龄的无特定病源(specifid Pathogen–Free；SPF)小鼠(品系:C57/BL6；来源:中国台湾实验动物中心)，C57/BL6小鼠禁食24小时后，腹腔注射(intraperitoneal injection)40mg/kg体重的链脲佐菌素(Streptozotocin或Streptozocin；简称STZ素；溶解于100mM柠檬酸钠，pH 4.5)。首七日内，每天给予链脲佐菌素一次，共给予7次，建立小鼠糖尿病模式。七天后，以葡糖氧化酶(glucose oxidase)法测定血糖，以确认是否成功诱发糖尿病。当实验期间无禁食的小鼠血糖质达250mg/dL时，则视为疾病模式建立成功。随后实验期间，每隔三天量测血糖一次，评估糖尿病小鼠的血糖浓度是利用市售的葡萄糖检测套组(Glucose Assay Kit)(Sigma,USA)评估血液中葡糖糖含量。其中血糖浓度测试是在小鼠禁食4小时候进行采血。
每组有3只雄性小鼠与3只雌性小鼠，随机分组。按小鼠体重计算每日管喂小鼠100μL无菌水，实验组的小鼠每日每公斤的熟豆浆乳酸菌发酵品摄取量为250mg/Kg体重/每天或100mg/Kg体重/每天。比较组的小鼠每日每公斤的熟豆浆摄取量为250mg/Kg bodyweight/day或100mg/Kg体重/每天。控制组则给予无菌水。自注射链脲佐菌素完成建立小鼠糖尿病动物模式试验起，每天投以一次，连续给予30天。C57/BL6小鼠饲养在无特定并源的正压环境中，控温保持在24℃，并维持于12小时切换的光暗循环场域。饲养期间不限制饲料及水的供应。C57/BL6小鼠的饲养条件均依循卫生研究部门公告的相关实验动物管理指南进行。所有组别中的小鼠均经诱导糖尿病模式处理。实验结束，牺牲小鼠，取得全小肠段，于-20℃冻存。
将冻存于-20℃的小鼠小肠，以灭菌过的剪刀剪开后，以灭菌后的刮勺，刮取肠黏膜，放置于PBS溶液中。利用涡旋充分将黏膜上的菌体震荡出，以12000rpm转速进行离心，将上清液除去后，再以PBS溶液，进行沉淀物清洗，重复三次后，得到的沉淀物，再以商用DNA萃取套组试剂QIAmp DNA Stool Mini kit(Qiagen)，进行DNA萃取。所得到的DNA萃取物，保存于-20℃备用。进行肠道菌相分析，是利用细菌通用核糖体的16S rRNA引物，针对V4区域，引物序列如表3，例如正向引物F1可以与R1、R2、R3、R4四个反向引物的组合，加入萃取出的DNA样品中，进行聚合酶连锁反应，利用次世代基因定序(Next General Sequencing)方式，进行分析。
表3
引物 序列 SEQ ID NO.
F1 5’-AYTGGGYDTAAAGNG-3’ 1
R1 5’-TACCRGGGTHTCTAATCC-3’ 2
R2 5’-TACCAGAGTATCTAATTC-3’ 3
R3 5’-CTACDSRGGTMTCTAATC-3’ 4
R4 5’-TACNVGGGTATCTAATC-3’ 5
A:腺嘌呤；C:胞嘧啶；G:鸟嘌呤；T:胸腺嘧啶；R:鸟嘌呤/腺嘌呤(嘌呤)；Y:胞嘧啶/胸腺嘧啶(嘧啶)；M:腺嘌呤/胸腺嘧啶；S:鸟嘌呤/胞嘧啶；D:鸟嘌呤/腺嘌呤/胸腺嘧啶；H:腺嘌呤/胞嘧啶/胸腺嘧啶；V:鸟嘌呤/胞嘧啶/腺嘌呤；N:腺嘌呤/鸟嘌呤/胞嘧啶/胸腺嘧啶。
将肠道菌群，依有益菌、有害菌以及伺机性菌等进行分类。图3结果显示STZ成功诱导的糖尿病模式小鼠，分别以熟豆浆(比较组)以及植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716发酵的熟豆浆乳酸菌发酵物(实验组)喂食28天后的肠道菌相变化:喂食经植物乳杆菌CGMCC17716发酵的熟豆浆乳酸菌发酵物组别中，小鼠肠道中有益菌的比例达到77.6％，伺机性菌的比例为20.0％；而喂食熟豆浆的组别，小鼠肠道中有益菌的比例只达3.8％，明显较有害菌所占的49.4％为低，伺机性菌的比例(46.8％)和有害菌的比例相当；STZ成功诱导的糖尿病模式小鼠，以含有植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716发酵的熟豆浆乳酸菌发酵物，喂食28天后的肠道菌中的有益菌会较仅喂食熟豆浆组的肠道有益菌提升15倍以上。图4结果显示STZ成功诱导的糖尿病模式小鼠，分别比较熟豆浆(比较组)以及利用植物乳杆菌L.plantarum CGMCC17716发酵的熟豆浆乳酸菌发酵物(实验组)喂食28天后的肠道中艾克曼嗜黏蛋白菌所占的比例，明显的发现，在喂食经过植物乳杆菌CGMCC17716发酵豆浆的实验组中的小鼠肠道中的艾克曼嗜黏蛋白菌的比例高于仅喂食豆浆组的小鼠400倍。
综上所述，本发明由中国台湾高山茶叶植栽筛选出的植物乳杆菌菌株CGMCC17716可以达成以下功效：
(1)植物乳杆菌CGMCC17716具有良好的黏稠性多糖生产能力，单独使用或搭配其他益生菌都可以使豆类蛋白(豆浆)凝集成为不易离水的植物性凝态酸奶--豆浆乳酸菌发酵品。
(2)植物乳杆菌CGMCC17716制成的豆浆乳酸菌发酵品可以有效促进艾克曼嗜黏蛋白菌株(Akkermansia muciniphila)在肠道菌群中的比例、提升肠道中乳酸菌含量以及优良菌相。
(3)植物乳杆菌CGMCC17716制成的豆浆乳酸菌发酵品中的γ-氨基丁酸含量可达20mg/100g以上、去糖基异黄酮占总异黄酮量可达92％。
(4)除豆类发酵品外，以植物乳杆菌CGMCC17716将燕麦、米、薏仁等制成的植物浆乳酸菌发酵品，亦可促进艾克曼嗜黏蛋白菌株(Akkermansia muciniphila)菌株生长。
上列详细说明是针对本发明之可行实施例之具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为之等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
【生物材料保藏】
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年5月6日，保藏编号为CGMCC17716。
Figure GDA0003470648820000191
Figure GDA0003470648820000201
Figure GDA0003470648820000211
Figure ISA0000189575020000011
Figure ISA0000189575020000021
Figure ISA0000189575020000031

Claims (13)

1.一种乳酸菌株，所述乳酸菌株为一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，是保藏编号为CGMCC17716。
2.一种植物性凝态酸奶，是以植物浆加入益生菌制成，其中所述益生菌包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC17716；其中所述植物性凝态酸奶的离水性小于25%。
3.根据权利要求2所述的植物性凝态酸奶，其特征在于，所述益生菌进一步包含戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。
4.根据权利要求2所述的植物性凝态酸奶，其特征在于，所述植物浆是水与五谷杂粮、核果均质化所得。
5.根据权利要求4所述的植物性凝态酸奶，其特征在于，所述五谷杂粮、核果选自于由小米、大米、麦、大豆、高粱、花生、薏仁、藜麦、杏仁、芝麻、红豆、绿豆和腰果所组成的群组。
6.根据权利要求2所述的植物性凝态酸奶，其特征在于，每100克所述植物性凝态酸奶中的伽玛胺基丁酸含量超过15毫克。
7.根据权利要求2所述的植物性凝态酸奶，其特征在于，每100克该植物性凝态酸奶中的伽玛胺基丁酸含量超过25毫克。
8.根据权利要求2所述的植物性凝态酸奶，其特征在于，所述植物性凝态酸奶中异黄酮的去糖基率超过80%。
9.根据权利要求2所述的植物性凝态酸奶，其特征在于，可用于培养艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphilia)。
10.一种权利要求2所述的植物性凝态酸奶用于制备改善肠道菌相食品的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述改善肠道菌相是改善糖尿病患者的肠道菌相。
12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述改善肠道菌相是肠道中有益菌增加。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述有益菌是艾克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphilia)。
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