KR20220119721A - 신규 비피도박테리움 속 세균 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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KR20220119721A
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게이타 스즈키
린타로 후지카와
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오브 가부시키가이샤
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Abstract

건강에 유익한 새로운 유산균을 단리하고, 이러한 신규 유산균을 함유하는 음식품이나 프로바이오틱스 조성물 등의 조성물을 제공한다.
운동 선수의 장내 플로라로부터 단리된, 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주(NITE BP-03095) 및 이를 함유하는 음식품이나 프로바이오틱스 조성물 등의 조성물을 제공한다.

Description

신규 비피도박테리움 속 세균 및 이를 포함하는 조성물
본 발명은, 신규 비피도박테리움(bifidobacterium) 속(屬) 세균 및 이 비피도박테리움 속 세균을 포함하는 조성물, 보다 상세하게는 운동 선수(athlete)의 장(腸)내로부터 단리(單離)된 소르비톨(sorbitol) 자화능을 가진 신규 비피도박테리움 속 세균 및 이 신규 비피도박테리움 속 세균을 함유하는 음식품, 프로바이오틱스(probiotics) 조성물 등에 관한 것이다.
종래로부터, 장내 환경을 조정하는 것으로써, 건강 상태를 개선 또는 향상 가능한 것이 알려져 있다. 또한, 최근, 분변 검체(糞便檢體)를 분자 생물학적 기법으로 해석하는 것으로써, 다수의 장내 세균으로 구성되는 장내 플로라(flora)에 대해서 파악하는 것이 가능하게 되었다. 따라서 장내 플로라의 구성과 건강 상태의 관련성을 해명하기 위하여, 다양한 관점에서의 연구가 진행되고 있다.
이 가운데, 운동 선수의 장내 플로라에 관한 연구가 주목되고 있다. 운동 선수는 신체 능력이 우수함과 동시에 일상적으로 고도의 신체 운동을 행하고 있기 때문에, 에너지의 흡수·소비, 면역 등에 관한 기능이 일반인과는 다를 가능성이 있다. 따라서, 이러한 기능 개선이나 건강 상태의 향상에 유용한 식견을 얻기 위하여, 운동 선수를 대상으로 에너지 흡수 및 장관 면역계의 장(場)인 장내의 장내 세균총(細菌叢)을 해석하는 것이 행해지고 있다. 예를 들면, 비특허문헌 1에는, 여자 마라톤 선수 13명을 대상으로 하여 장내 세균총의 해석을 행한 결과, 프레보텔라(Prevotella) 속의 장내 세균을 보유하는 선수가 일정 비율(13명 중 6명) 존재한 것 등이 보고되고 있다.
한편, 우리가 경구(經口) 섭취하는 식품이나 음료에는 다양한 당류(糖類)가 포함되어 있다. 당류에는, 포도당(葡萄糖)이나 자당(蔗糖) 등의 소위 당 외에, 소르비톨이나 자일리톨(xylitol) 등의 당 알코올, 아스파탐(aspartame) 등의 합성 감미료가 존재한다. 이 가운데, 당 알코올은, 주로 식물로부터의 천연 화합물이기 때문에 안전성이 높고, 소화 흡수되기 어렵기 때문에 칼로리도 낮은 것으로써, 감미료나 식품 첨가물 등으로서 널리 사용되고 있다.
마츠오카오리(松生香里), 외 7명, 「마라톤 선수에 있어서 장내 세균총의 특징과 BMI의 관련」, 가와사키 의료 복지 학회지, Vol.29, No.1, 2019년, p.99-105
이와 같은 배경 기술 하에 있어서, 장내 환경을 조정하고 건강 상태를 개선 등을 하기 위하여 사용 가능한, 새로운 미생물이 요구되고 있다. 특히, 운동 선수의 장내 플로라를 구성하고 있는 미생물로부터 새로운 프로바이오틱스로서 사용 가능한 특별한 기능을 가진 유산균이 단리될 것으로 기대되고 있다. 그러나, 상술한 비특허문헌 1에 따르면, 운동 선수의 장내 세균총을 해석한 결과, 어떠한 속의 미생물이 어느 정도의 비율로 존재하고 있는지에 대한 식견이 얻어지고 있을 뿐이고, 운동 선수의 장내 플로라를 구성하는 개개의 미생물에 대한 검토나 단리는 이루어지지 않았다.
한편, 상술한 당류 가운데, 올리고(oligo)당이나 폴리덱스트로스(polydextrose)는, 소화관에서 분해·흡수되기 어렵고, 건강 상태의 향상에 유익한 장내 세균의 선택적인 영양원이 되어 증식을 촉진하는 것으로써, 프리바이오틱스(prebiotics)로서 이용되고 있다. 따라서, 음식품의 구성 성분으로서 널리 사용되고 있는 당 알코올이 프리바이오틱스로서 활용될 것으로 기대되고 있다.
따라서, 본 발명은 상술한 점에 착안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 운동 선수의 장내 플로라로부터 유익한 기능을 가진 새로운 유산균을 단리하고 제공하는 것에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적으로는, 소르비톨 등의 당 알코올을 이용하여 생육하는 것이 가능한 당 알코올 자화능을 가지며, 당 알코올을 프리바이오틱스로서 이용하는 것이 가능한 새로운 유산균을 제공하는 것에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적으로는, 상술한 새로운 유산균을 함유하는 음식품이나 프로바이오틱스 조성물 등의 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 운동 선수 500명 이상으로부터 1000 검체 이상을 취득하고, 운동 선수의 장내 플로라를 해석함과 동시에, 새로운 프로바이오틱스로서 유용한 신규 유산균을 단리하는 것을 목적으로 하여 예의 검토한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
상기 과제를 해결하는, 본 발명의 신규 유산균은 비피더스(bifidus)균(비피도박테리움 속 세균)의 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주(株)(NITE BP-03095)이다.
본 발명에 따른 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주(NITE BP-03095)는 소르비톨 자화능을 가진 신규 비피도박테리움 속 세균이다. 이러한 신규 비피도박테리움 속 세균은 롱검 종(種)인 것으로써, 프로바이오틱스로서 사용될 수 있다. 또한, 이러한 신규 비피도박테리움 속 세균은 소르비톨의 자화능을 가지는 것으로써, 다양한 식품이나 음료에 배합되고 있는 소르비톨이나, 과실 등에도 천연으로 포함되어 있는 소르비톨을 프리바이오틱스로서 유효하게 활용하는 것이 가능하다. 게다가, 이러한 신규 비피도박테리움 속 세균은, 기준주(基準株)(Bifidobacterium longum ATCC15707주)에 비해 내산성에도 우수한 성질을 가진다.
또한, 본 발명의 신규 비피도박테리움 속 세균을 포함하는 조성물은, 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주(NITE BP-03095)를 함유하는 조성물이다.
또한, 본 발명의 조성물은, 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주(NITE BP-03095) 및 소르비톨을 함유하는 것도 바람직하다. 이에 따라, 유익한 미생물과 그 영양원, 즉 프로바이오틱스와 프리바이오틱스가 배합된 조성물이 얻어진다.
또한, 본 발명의 조성물은, 음식품인 것도 바람직하다. 이에 따라, 바람직한 조성물의 형태가 선택된다. 또한, 본 발명에 있어서 음식품에는, 보충제(supplement), 건강 식품, 기능성 식품, 영양 보조 식품 및 특정 보건용 식품 등도 당연히 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물은, 프로바이오틱스 조성물인 것도 바람직하다. 이에 따라, 바람직한 조성물의 한 형태가 선택된다.
본 발명에 따르면, 아래와 같은 우수한 효과를 가진 신규 비피도박테리움 속 세균 및 신규 비피도박테리움 속 세균을 포함하는 조성물을 제공하는 것이 가능하다.
(1) 프로바이오틱스로서 사용될 수 있는 새로운 비피도박테리움 속 세균으로, 식품이나 음료, 의약품 등의 조성물에 배합하여 사용하는 것이 가능하다.
(2) 다양한 식품이나 음료에 널리 배합되며, 천연 과실 등에도 많이 포함되는 소르비톨의 자화능을 가진 비피도박테리움 속 세균이기 때문에, 소르비톨을 프리바이오틱스로서 유효하게 활용하는 것이 가능하다.
(3) 기준주(Bifidobacterium longum ATCC15707주)와 비교하여 내산성에 우수하기 때문에, 경구 섭취한 경우에도 살아 있는 상태로 장내에 도달하기 쉽다.
도 1은 실시예 5에 있어서 본 발명의 신규 비피도박테리움 속 세균을 배양한 배양액 A(소르비톨 없음) 내의 유기산 농도를 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 5에 있어서 본 발명의 신규 비피도박테리움 속 세균을 배양한 배양액 B(소르비톨 함유) 내의 유기산 농도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 6에 있어서 본 발명의 신규 비피도박테리움 속 세균을 배양한 「PY 배지+0.5％ 소르비톨」 배양액 내의 유기산 농도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 6에 있어서 본 발명의 신규 비피도박테리움 속 세균을 배양한 「PY 배지+0.5％ 글루코오스(glucose)」 배양액 내의 유기산 농도를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 신규 유산균은, 소르비톨의 자화능을 가진 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주(NITE BP-03095)이다. 소르비톨 자화능을 가진 비피도박테리움 속 세균은, B. adolescentis, B. breve 및 B. catenulatum 일부의 균 이외에는 지금까지 거의 확인되지 않았으나, 비피도박테리움·롱검종에 있어서는 이번에 발명자들에 의해 처음으로 확인되어 단리된 것이다.
이러한 본 발명의 신규 비피도박테리움 속 세균은, 운동 선수(남성, 경기 종목 : 육상 경기, 전 올림픽 일본 대표)의 장내 플로라로부터 단리된 것이다. 이러한 신규 비피도박테리움 속 세균, 다시 말해 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주는, 이하와 같이 특허 미생물의 기탁 기관에 국제 기탁이 이루어지고 있다.
(1) 수탁번호 : NITE BP-03095
(2) 원 기탁일 : 2019년 12월 25일
(3) 기탁기관 : 일본 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(우편번호 292-0818 치바현 기사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8 122호실)
운동 선수의 장내 플로라로부터 단리된 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주의 균학적 성질을 아래 표 1 및 표 2에 나타낸다. 아래 표 1에 나타낸 각 시험은, 광학 현미경(올림푸스 주식회사 제품, 형번 : BX50F4)에 의한 형태 관찰 및 Barrow & Feltham 등의 방법(Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria, 3rd edition, Cambridge : University Press, 1993)에 기초하여 행해진 것이다. 또한, 표 2에 나타낸 각 기질에 대한 반응 시험은, 혐기성균 생화학적 동정(同定) 키트(아피켄키(API20A), 비오멜류·재팬 주식회사 제품)를 이용하여 행해진 것이다.
[표 1]
Figure pct00001
[표 2]
Figure pct00002
비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주는 배양에 의해 증식되는 것이 가능하다. AuB-001주의 배양 온도는 20℃~40℃가 바람직하며, 25℃~40℃가 보다 바람직하고, 30℃~40℃가 특히 바람직하다. 또한, 비피도박테리움 속 세균은 편성(偏性) 혐기성 세균이기 때문에, 혐기 환경하에서 배양을 행하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 탄산가스나 질소가스를 통기하면서 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 배지(培地)로서는, 비피도박테리움 속 세균의 배양에 일반적으로 이용되는 배지를 이용하는 것이 가능하고, 특히 한정되지 않지만, GAM 부용(bouillon) 「닛스이」(닛스이(日水) 제약 주식회사)나 TOS 프로피온산(propionic酸) 한천(寒天) 배지(야쿠르트 약품 공업 주식회사) 등을 들 수 있다. 또한, 이러한 배지 내에는 AuB-001주가 자화능을 가진 소르비톨 등의 당류를 배합시켜도 좋다.
비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주는 배양액의 상태, 배양액을 농축 또는 희석한 상태, 및 배양액 등으로부터 회수한 균체의 상태로 이용하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 효과를 잃어버리지 않는 범위에 있어서, 배양액 및 회수 균체에 대하여, 세정 처리, 동결 건조나 L-건조, 스프레이 드라이 등의 건조 처리 또는 가열 처리 등의 다양한 추가 처리를 실시하는 것도 가능하다. 또한, 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주는 생균(生菌)으로서 이용하는 것이 바람직하지만, 사균(死菌)이어도 좋고, 생균과 사균이 혼합된 상태의 것을 이용하여도 좋다.
본 발명에 따른 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주는 유익한 신규 비피더스균으로서 균 단독으로도 이용하는 것이 가능하지만, 다른 성분과 조합시켜서 얻어지는 다양한 조성물로서 이용하는 것이 가능하다. 본 발명의 비피도박테리움·롱검 AuB-001주를 함유하는 조성물로서는, 경구 섭취되는 음식품, 프로바이오틱스 조성물, 정장용(整腸用) 조성물, 의약부외품 또는 의약품 등을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 음식품에는 보충제, 건강 식품, 기능성 식품, 영양 보조 식품 및 특정 보건용 식품 등이 포함된다. 조성물 내의 AuB-001주의 함유량으로서는, 조성물의 용도나 사용 형태 등에 따라 다르지만, 일 예로서, 1×106~1×1012 cells/g인 것이 바람직하고, 1×107~1×1011 cells/g인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 비피도박테리움·롱검 AuB-001주를 함유하는 조성물에는, 소르비톨을 함유시키는 것이 가능하다. AuB-001주는 소르비톨 자화능을 가지기 때문에, 조성물 내의 구성 성분인 소르비톨이 AuB-001주의 선택적인 영양원으로 되어, AuB-001주의 증식 및 활동을 활성화 시키는 것이 가능하다. 조성물 내의 소르비톨의 배합 비율로서는, 특히 한정되지 않지만, 일 예로서, 0.01~20 중량%가 바람직하며, 0.1~10 중량%가 보다 바람직하고, 0.5~5 중량%가 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 조성물의 용도로서는, 음식품이 바람직하다. 이러한 경우, 정제나 캡슐제, 분말제, 과립제, 겔상제(gell狀劑) 등의 보충제 형태, 발효유나 유산균 음료, 청량 음료수, 스포츠 음료 등의 음료, 요구르트나 아이스크림 등의 유제품, 사탕이나 껌, 초콜릿 등의 과자, 빵, 죽, 시리얼, 면류, 젤리, 스프, 조미료 등의 모든 형태의 음식품 조성물로서 이용하는 것이 가능하다. 또한, 이러한 조성물에는, 음식품 조성물을 구성하는 원료 외에, 기타 기능성 성분, 기타 미생물, 당류, 비타민, 미네랄, 아미노산 혹은 단백질 등의 영양소 등을 다양하게 조합시키는 것도 가능하다.
이들 음식품 조성물은, 음식품의 원료에 예를 들면, 분말 형태 또는 현탁액 형태의 비피도박테리움·롱검 AuB-001주를 첨가하고, 혼합 등을 하는 것으로써 제조하는 것이 가능하다. 그 한편으로, 우유 등의 발효 원료에, 비피도박테리움·롱검 AuB-001주를 첨가하고, 배양 또는 발효시켜, 발효 식품으로서 제조하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 조성물의 용도로서는, 장내 환경을 조정하기 위한 프로바이오틱스 조성물로 하는 것도 바람직하다. 프로바이오틱스 조성물의 형태로서는, 상술한 음식품과 마찬가지의 형태를 취하는 것이 가능하다. 또한, 프로바이오틱스 조성물로 하는 경우, AuB-001주의 증식 및 활성화를 촉진하는 프리바이오틱스 성분을 조합시킨 조성물로 하는 것이 바람직하다. 프리바이오틱스 성분으로서는, 상술한 소르비톨 외에, 특히 한정되지 않지만, 갈락토올리고(galacto-oligo)당이나 프락토올리고(fructo-oligo)당 등의 올리고당, 폴리덱스트로스나 이눌린(inulin) 등의 식물 섬유를 드는 것이 가능하고, 1종 또는 2종 이상의 성분을 선택하여 조성물 내에 배합하는 것이 가능하다. 게다가, AuB-001주 이외의 비피도박테리움·롱검주, 비피더스균주 또는 락토바실러스(Lactobacillus) 속주 등의 프로바이오틱스를 1종 또는 2종 이상을 선택하여 조성물 내에 배합하는 것도 가능하다 .
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 따라 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 특히 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
1. 유산균의 단리
다수의 운동 선수로부터 분변 샘플을 채집하고, 유산균의 단리를 행하였다. 구체적으로는, 다음의 방법으로 행하였다. 분변 샘플을 멸균한 PBS에 현탁하며, 이 현탁액을 추가로 PBS로 희석하여 계열 희석액을 조제하고, TOS 프로피온산 한천 배지(야쿠르트 약품 공업 주식회사 제품)에 도포하였다. 이러한 평판 배지를 혐기병(嫌氣 jar) 내에서 탈산소·탄산가스 발생제(미쓰비시 가스화학 주식회사 제품, 아네로팩(등록상표)·켄키)를 이용하여 37℃에서 2~3일간 혐기 배양하였다. 평판 배지 상에서 콜로니(colony) 형성한 세균 분리주(分離株)를 조균(釣菌)하며, 아래 표 3에 나타낸 배지 조성의 액체 배지(GAM 부용 「니스이」, 닛스이 제약 주식회사 제품)에 접종하고, 혐기성 조건하에서 37℃에서 배양하였다. 그리고, 이하 실시예 2에서 상세히 설명하는 바와 같이, 각 배양액으로부터 분리주의 DNA를 각각 추출하고, 추출된 DNA에 대해 리보솜(ribosome) RNA 유전자(rDNA) 염기서열 해석을 행하여, 분리주의 균종을 추정하였다. 비피도박테리움 속으로 추정된 분리주의 배양액은, 순수 배양을 위해 TOS 프로피온산 한천 배지를 이용하여 단일 집락(集落) 분리한 후, 표 3에 나타낸 GAM 부용 「니스이」액체 배지에 있어서 혐기성 조건하에서 37℃에서 배양하고, 20% 글리세롤 스톡(glycerol stock)으로 하여 -80℃에서 보관하였다.
[표 3]
Figure pct00003
[실시예 2]
2. 분리주의 동정(1)
실시예 1에 있어서, 콜로니 형성한 세균 분리주의 균종을 추정하기 위하여, 16S 리보솜 RNA 유전자(rDNA) 염기서열 해석을 행하였다. 우선, 배양액으로부터 분리주의 DNA를 추출하고, 추출된 DNA에 대하여, PCR로 16S　rRNA 유전자를 증폭하였다. PCR에 이용한 프라이머 세트(primer set)의 서열은, 「27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(서열번호 1)」 및 「1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 2)」로 하였다. 각 PCR 산물의 염기서열 결정을 행하여, 각 분리주의 16S rRNA 유전자 영역의 염기서열을 얻었다. 이러한 16S rRNA 유전자 영역의 서열에 대하여, NCBI의 국제 염기서열 데이터베이스(Genbank) 상에서, BLAST 프로그램(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에 따른 상동성(相同性) 검색을 행하였다.
그 결과, 한 남성 운동 선수(경기 종목 : 육상 경기, 전 올림픽 일본 대표)의 분변 샘플로부터 단리된 세균 분리주의 16S rRNA 유전자 영역의 염기서열이 「Bifidobacterium longum subsp. suillum strain Su 851 16S ribosomal RNA, partial sequence」와 99.3%의 높은 상동성을 나타내는 것이 발견되었다. 따라서, 이러한 분리주의 균종을 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum)으로 추정하고, AuB-001주라고 이름 붙였다. 이러한 분리주(AuB-001주)의 염기서열 결정된 16S rRNA 유전자 영역의 염기서열(서열번호 3)을 아래 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00004
[실시예 3]
3. 분리주의 동정(2)
실시예 2에 있어서, 비피도박테리움·롱검으로 추정된 AuB-001주에 대하여, ANI(Average nucleotide identity) 해석을 행하였다. ANI 해석이란, 조사 대상주 및 기존주의 전체 게놈(Genom) 서열을 컴퓨터 상에서 약 1000 염기 정도의 단편(斷片)으로 나누고, 둘 모두의 게놈 서열의 각 단편의 유사도를 서열 검색 알고리즘으로 계산하는 것으로써 행해지는 것으로, DNA-DNA 하이브리드(hybrid) 형성 시험에 있어서 70%의 일치도는, ANI 값으로는 95%에 상당한다고 되어 있다. 따라서, ANI 값이 95% 이상이라면 동종(同種)으로 판정되고, ANI 값이 95% 미만이라면 별종(別種)으로 판정된다. AuB-001주의 전체 게놈 서열을 시퀀서(sequencer)에 의해 결정하여 2,548,718 bp의 염기서열을 얻었다. ANI 해석은 ANI tools Online(http://ani.mypathogen.cn/) 웹사이트의 프로그램에 의해 행하였다. 결과를 아래 표 5에 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00005
표 5에 나타낸 바와 같이, AuB-001주는 비피도박테리움·롱검 종의 복수의 주에 대하여 95% 이상의 ANI 값을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 AuB-001주의 균종을 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum)으로 동정하였다. 또한, 근연주(近緣株)와의 ANI 값이 100% 미만이기 때문에, AuB-001주는 비피도박테리움·롱검의 신규 균주인 것이 밝혀지게 되었다. 이러한 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주는 특허 미생물 기탁 센터에 NITE BP-03095로서 기탁되었다.
[실시예 4]
4. 당 자화능의 검토
비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) 종으로 동정된 AuB-001주의 당 자화능을 조사하기 위하여 각 당류를 기질로 하는 반응 시험을 행하였다. 시험은 혐기성 균 생화학적 동정 키트(아피켄키(API20A), 비오멜류·재팬 주식회사 제품)를 이용하여 행하고, 비교 대조로서, 비피도박테리움·롱검의 기준주인 Bifidobacterium longum ATCC15707주에 대해서도 마찬가지의 시험을 행하였다. 결과를 아래 표 6에 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00006
이러한 결과에 따르면, 본 발명에 따른 AuB-001주는 기준주인 B. longum ATCC15707주와는 다르게, 당 알코올인 소르비톨의 자화능을 가진 것이 분명하게 되었다. 소르비톨 자화능을 가진 비피도박테리움 속 세균은, B. adolescentis, B. breve 및 B. catenulatum의 일부 균 이외에는 지금까지 거의 확인되지 않았으나, 이번에 본 발명자들에 의하여 B. longum종에 있어서 소르비톨 자화능이 확인되었다. 이와 같이, 이번에, 운동 선수의 장내 플로라로부터 소르비톨 자화능을 구비한 비피도박테리움·롱검이 발견된 것은, 운동 선수의 장내 플로라의 다양성·기능성을 뒷받침 하는 것이다.
[실시예 5]
5. 유기산 생산량의 분석
유기산은 장관 내를 산성으로 유지하여, 장의 연동운동이나 장관으로부터 물의 분비를 촉진하는 것 외에, 감염 방어, 부패산물의 생산 억제, 변성·변통(便通)의 개선 효과를 지닌 작용을 가진다. 그 때문에, 유기산을 생산하는 균을 장내에 보유하는 것으로써, 장내 환경이 조정되어 건강에 기여하는 것이 알려져 있다. 그래서, 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주의 유기산 생산 능력을 조사하기 위하여, 배양액 내에 있어서 유기산 생산량을 분석하였다. 또한, 배양액으로서, (1) 소르비톨을 포함하지 않는 배양액 A, (2) 소르비톨을 함유하는 배양액 B의 2종류의 배양액을 사용하여, 각 배양액 내에 있어서 유기산 생산량을 측정하였다. (1) 소르비톨을 포함하지 않는 배양액 A로서는, 상기 표 3에 나타낸 GAM 부용 「니스이」액체 배지를 이용하고, (2) 소르비톨을 함유하는 배양액 B로서는, 아래 표 7에 나타낸 GAM 부용 「니스이」 액체 배지에 소르비톨을 0.5%가 되도록 배합한 것을 사용하였다. 시험은 다음과 같이 행하였다. TOS 프로피온산 한천 배지(야쿠르트 약품 공업 주식회사)에서 37℃, 72시간, 혐기 배양에 의해 생육시킨 AuB-001주의 콜로니를 얻고, 멸균 생리 식염수에 현탁하여 맥팔랜드(McFarland) 탁도 No. 0.5로 조제하였다. 이러한 균액 0.1mL를 각 배양액 5mL에 각각 접종하고, 37℃에서 20시간, 탈산소·탄산가스 발생제(미쓰비시 가스 화학 주식회사 제품, 아네로파우치(Anaero pouch)(등록 상표)·켄키)를 이용하여 혐기 배양하였다. 각 배양액을 구멍 직경 0.20㎛의 멤브레인 필터(membrane filter)로 여과하고, 여과액을 시료액으로 하여, 고속 액체 크로마토그래프(chromatograph) 장치(주식회사 시마즈 제작소 제품, 유기산 분석 시스템)에서, 각 유기산의 농도를 측정하였다. 상세한 측정 조건은 다음과 같다.
·컬럼：Shim-pack SCR-102(H), 300mm×8mm ID, 2개 직렬로 사용
·가드 컬럼 : Shim-pack SCR-102(H), 50mm×6mm ID
·용리액(熔離液) : 5mmol/L p-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid)
·반응액 : 5mmol/L p-톨루엔설폰산, 100μmol/L EDTA, 20mmol/L Bis-Tris
·유속 : 0.8mL/min
·오븐 온도 : 45℃
·검출기 : 전기 전도도 검출기 CDD-10A
[표 7]
Figure pct00007
추가로, 비교 대조로서, AuB-001주를 대신하여, 기준주인 Bifidobacterium longum ATCC15707주를 이용하고, TOS 프로피온산 한천 배지에서 37℃, 72시간, 혐기 배양에 의해 생육시킨 ATCC15707주의 콜로니를 멸균 생리 식염수로 현탁하고, 맥팔랜드 탁도 No. 0.5로 조제하였다. 이러한 기준주의 균액 0.1mL를 각 배양액 5mL에 접종하고, 37℃에서 20시간 혐기 배양한 배양액(B. longum ATCC15707주) 및 균을 접종하지 않은 배양액(Blank)에 대해서도, 상술한 것과 마찬가지로 시험을 행하여, 유기산의 농도를 측정하였다. 결과를 아래 표 8, 9 및 도 1, 2에 나타낸다.
또한, 배양액 A(표 3)를 이용한 혐기 배양 후의 AuB-001주의 배양액 A 내에 있어서 전체 세균 수는 1.5×1010(cells/mL), ATCC15707주의 배양액 A 내에 있어서 전체 세균 수는 8.9×109(cells/mL)이었다. 또한, 배양액 B(표 7)를 이용한 혐기 배양 후의 AuB-001주의 배양액 B 내에 있어서 전체 세균 수는 1.2×1010(cells/mL)이며, ATCC15707주의 배양액 B 내에 있어서 전체 세균 수는 4.9×109(cells/mL)이었다.
[표 8]
Figure pct00008
[표 9]
Figure pct00009
이러한 결과에 따르면, 배양액 A(소르비톨 첨가 없음)에 있어서는, AuB-001주는 기준주인 ATCC15707주와 동일한 유기산 생산 능력을 가지고 있어, 모든 젖산, 아세트산 및 포름산을 다량으로 생산하는 것이 확인되었다. 그리고, 소르비톨이 첨가된 배양액 B에 있어서도, AuB-001주는 젖산, 포름산 및 아세트산의 높은 생산 능력을 가진 것이 분명하였다. 이로부터 AuB-001주는 소르비톨 존재 하에 있어서 활발하게 증식하여 유기산을 생산 가능한 것이 명확해졌다.
[실시예 6]
6. 당 자화능 및 유기산 생산량의 분석
다음으로, 실시예 5에서 이용한 글루코오스를 함유하는 배양액을 대신하여, 탄수화물을 함유하지 않은 PY 배지에 글루코오스 또는 소르비톨을 탄수화물원으로서 각각 첨가한 배양액을 이용하여, AuB-001주 및 기준주(Bifidobacterium longum ATCC15707주)의 각 배양액 내에 있어서 당 자화능, 다시 말해 증식 능력과 유기산 생산량을 분석하였다.
본 실시예에서 이용한 PY 배지의 조성을 아래 표 10 및 표 11에 나타낸다. PY 배지는 표 10에 나타낸 용액 1을 가온(加溫) 용해 후, 용액 2를 첨가하고, 121℃, 15분간 오토클레이브(autoclave) 처리하여 얻었다. 이를 급냉 후, D(-)-소르비톨을 0.5 중량% 농도가 되도록 첨가한 배양액을 「PY 배지+0.5% 소르비톨」로 하고, D(+)-글루코오스를 0.5 중량% 농도가 되도록 첨가한 배양액을 「PY 배지+0.5％ 글루코오스」로 하였다. 또한, 표 10 내의 레자주린(resazurin)액(※1)은 25mg을 100mL의 증류수에 용해시킨 것을 이용하고, 염류 용액(※2)은 표 11에 나타낸 성분에 따라 조제한 용액을 이용하며, 헤민(hemin)액(※3)은 50mg의 헤민을 1N의 NaOH로 용해하고, 증류수에 100mL로 메스업(mess up)한 것을 이용하며, 비타민 K1액(※4)은 0.15mL의 비타민 K1을 30mL의 95% 에탄올에 용해시킨 것을 사용하였다.
[표 10]
Figure pct00010
[표 11]
Figure pct00011
시험은 다음과 같이 하여 행하였다. TOS 프로피온산 한천 배지(야쿠르트 약품 공업 주식회사)에서 37℃, 72시간, 혐기 배양에 의해 생육시킨 AuB-001주의 콜로니를 취하고, 멸균 생리 식염수에 현탁하여 맥팔랜드 탁도 No. 0.5로 조제하였다. 이러한 AuB-001주의 균액 0.1mL를 「PY 배지+0.5％ 소르비톨」 및 「PY 배지+0.5％ 글루코오스」의 각 배양액 10mL에 각각 접종하고, 37℃에서 20시간, 멸균 가압 시험관을 이용하여 혐기 배양하였다. 배양 후, 각 배양액으로부터 배양액을 일부 취하고, 원액~104배로 단계 희석하며, 혈구 계산반(計算盤)을 이용하여 세균 수를 계수하여 각 배양액 1mL당 전체 세균 수를 구하였다. 또한, 남은 각 배양액을 구멍 직경 0.20㎛의 멤브레인 필터로 각각 여과하고, 여과액을 시료액으로서, 상술한 실시예 5와 마찬가지의 측정 방법 및 조건으로 각 유기산의 농도를 측정하였다.
또한, AuB-001주에 대신하여, 기준주인 Bifidobacterium longum ATCC15707주를 이용하고, TOS 프로피온산 한천 배지에서 37℃, 72시간, 혐기 배양에 의해 생육시킨 ATCC15707주의 콜로니를 멸균 생리 식염수로 현탁하고, 맥팔랜드 탁도 No. 0.5로 조제하였다. 이러한 기준주의 균액 0.1mL를 각 배양액 10mL에 각각 접종하고, 37℃에서 20시간 혐기 배양한 배양액(B.longum ATCC15707주) 및 균을 접종하지 않은 배양액(Blank)에 대해서도, 마찬가지로 시험을 행하여, 각 배양액 1mL당 전체 세균 수와 각 유기산의 농도를 측정하였다. 결과를 아래 표 12, 13 및 도 3, 4에 나타낸다.
[표 12]
Figure pct00012
[표 13]
Figure pct00013
이러한 결과에 따르면, 탄수화물원으로서 글루코오스를 함유하는 「PY 배지+0.5％ 글루코오스」배양액에 있어서는, AuB-001주 및 기준주인 ATCC15707주 모두, 109 cells/mL의 수준에까지 증식하고, 젖산 및 아세트산을 대량으로 생산하는 것으로 확인되었다. 한편, 탄수화물원으로서 소르비톨을 함유하는 「PY 배지+0.5％ 소르비톨」배양액에 있어서는, AuB-001주는 4.8×109 cells/mL에까지 활발하게 증식하여, 젖산 및 아세트산을 대량으로 생산했다는 것에 대조적으로, 기준주인 ATCC15707주는 전체 세균 수가 5.6×106 cells/mL로 증식하지 않고, 젖산 및 아세트산을 거의 생산하지 않는 것으로 나타났다.
이러한 것으로부터, AuB-001주는 비피도박테리움·롱검종이면서 소르비톨을 이용하여 증식하고, 최종 대사 산물로서 젖산 및 아세트산을 생산 가능한 것이 명확해졌다.
[실시예 7]
7. 내산성의 검토
일반적으로 비피도박테리움 속 세균은 낮은 pH 환경에 약하기 때문에, 경구 섭취할 경우에는 위액의 영향을 받아 사멸(死滅)하기 쉽고, 살아있는 채로 장에 도달하기 어렵다는 문제가 있다. 그래서, 위액을 모방한 pH 2.0으로 조정한 시험액을 이용하여, 본 발명에 따른 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주의 내산성에 대하여 조사하였다.
우선, AuB-001주를, TOS 프로피온산 한천 배지(야쿠르트 약품 공업 주식회사)와 탈산소·탄산가스 발생제(미쓰비시 가스 화학 주식회사 제품, 아네로파우치(등록 상표)·켄키)를 이용하여 37℃에서 24시간, 혐기 배양하였다. 이러한 신선 배양 균주를 멸균 생리 식염수로 현탁하고, 1mL당 균 수가 108 cells/mL가 되도록 균액을 조제하였다. 이러한 균액 0.1mL를 멸균 중형 시험관에 수용한 10mL의 인공 위액 또는 10mL의 멸균 생리 식염수(대조군)에 첨가하고, 37℃에서 소정 시간(인공 위액: 10분·20분·30분·40분·50분·60분, 멸균 생리 식염수: 0분·60분) 반응시켰다. 또한, 인공 위액의 조성을 아래 표 14에 나타낸다. 인공 위액은 pH 2.0으로 조정하고, 0.45㎛의 필터로 여과 멸균한 것을 사용하였다. 또한, 인공 위액을 구성하는 성분 중, 펩신(pepsin)은, 「펩신 1:10000, 돼지 위 점막으로부터」(후지 필름 와코 순약 주식회사 제품)의 것을 이용하였다.
[표 14]
Figure pct00014
각 반응 시간 경과 후, 균액이 첨가된 인공 위액 또는 멸균 생리 식염수를 1mL 취하고, 이를 원액으로서 희석평판법(稀釋平板法)에 따라, 균 수를 측정하였다. 각 희석율에 대해, 3장의 한천 평판 배지에 원액 또는 희석액을 0.1mL 도말(塗抹)하여 배양을 행하였다. 또한, 한천 평판 배지는 TOS 프로피온산 한천 배지를 이용하고, 배양은 탈산소·탄산가스 발생제를 이용하여 37℃에서 72시간, 혐기 배양하는 것으로써 행하였다. 결과를 아래 표 15에 나타낸다.
또한, AuB-001주를 대신하여, 기준주인 Bifidobacterium longum ATCC15707주에 대해서도, 상술한 것과 마찬가지의 시험을 행하였다. 결과를 아래 표 16에 나타낸다.
[표 15]
Figure pct00015
[표 16]
Figure pct00016
이러한 결과에 따르면, AuB-001주는 기준주인 ATCC15707주 보다도 내산성에 우수하다는 것이 밝혀졌다. 구체적으로는, pH 2.0의 인공 위액에 30분 접촉시켰을 때에 있어서, AuB-001주는 2.3×103 CFU/mL 살아남았지만, ATCC15707주의 살아남은 균 수는 3.3 CFU/mL 이었다.
이러한 것으로부터, 본 발명에 따른 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주는, 소르비톨을 이용하여 활발하게 증식하고, 최종 대사 산물로서 젖산 및 아세트산을 생산 가능한 소르비톨 자화능을 가지는 동시에, 내산성에도 우수하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, AuB-001주는 기준주를 비롯한 공지의 비피도박테리움·롱검 종과는 다른 성질을 가지고 있는 것으로 나타났다.
본 발명은, 상기한 실시 형태 또는 실시예로 한정되는 것이 아니며, 특허 청구범위에 기재된 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 설계 변경한 형태도 기술적 범위에 포함되는 것이다.
본 발명의 신규 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주(NITE BP-03095) 및 이를 포함하는 조성물은, 새로운 프로바이오틱스로서 유용한 비피더스균이며, 장내 환경의 개선 등에 유효하게 이용되어, 식품(보충제, 건강 식품, 기능성 식품, 특정 보건용 식품 등도 포함)이나 의료 분야에 있어서 폭 넓게 도움이 되는 것이다.
일본 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(우편번호 292-0818 치바현 기사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8 122호실) NITEBP-03095 20191215
서열번호 1 : 16S rRNA 유전자 영역의 PCR 증폭을 위한 포워드 프라이머
서열번호 2 : 16S rRNA 유전자 영역의 PCR 증폭을 위한 리버스 프라이머
서열번호 3 : 신규 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주의 16S rRNA 유전자 영역의 염기서열
SEQUENCE LISTING <110> AuB, Inc. <120> Novel Bifidobacterium bacteria and composition containing the same <130> PCT20-003 <150> JP 2020-025001 <151> 2020-02-18 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1448 <212> DNA <213> Bifidobacterium longum AuB-001 <400> 3 gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gggatccacc gggctttgct 60 tggtggtgag agtggcgaac gggtgagtaa tgcgtgaccg acctgcccca tacaccggaa 120 tagctcctgg aaacgggtgg taatgccgga tgctccagtt gatcgcatgg tcttctggga 180 aagctttcgc ggtatgggat ggggtcgcgt cctatcagct tgacggcggg gtaacggccc 240 accgtggctt cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacattgg gactgaggta 300 cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga 360 tgcagcgacg cagcgtgagg gatggaggcc ttcgggttgt aaacctcttt tatcggggag 420 caagcgagag tgagtttacc cgttgaataa gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg 480 gtaatacgta gggtgcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagggct cgtaggcggt 540 tcgtcgcgtc cggtgtgaaa gtccatcgct taacggtgga tccgcgccgg gtacgggcgg 600 gcttgagtgc ggtaggggag actggaattc ccggtgtaac ggtggaatgt gtagatatcg 660 ggaagaacac caatggcgaa ggcaggtctc tgggccgtta ctgacgctga ggagcgaaag 720 cgtggggagc gaacaggatt agataccctg atagtccacg tcgtaaacgg tggatgctgg 780 atgtggggcc cgttccacgg gttccgtgtc ggagctaacg cgttaagcat cccgcctggg 840 gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaaga aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag 900 catgcggatt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg ggcttgacat gttcccgacg 960 gtcgtagaga tacggcttcc cttcggggcg ggttcacagg tggtgcatgg tcgtcgtcag 1020 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caaccctcgc cccgtgttgc 1080 cagcggatta tgccgggaac tcacggggga ccgccggggt taactcggag gaaggtgggg 1140 atgacgtcag atcatcatgc cccttacgtc cagggcttca cgcatgctac aatggccggt 1200 acaacgggat gcgacgcggc gacgcggagc ggatccctga aaaccggtct cagttcggat 1260 cgcagtctgc aactcgactg cgtgaaggcg gagtcgctag taatcgcgaa tcagcaacgt 1320 cgcggtgaat gcgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt caagtcatga aagtgggcag 1380 cacccgaagc cggtggccta accccttgtg ggatggagcc gtctaaggtg aggctcgtga 1440 ttgggact 1448

Claims (5)

  1. 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주(NITE BP-03095).
  2. 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주(NITE BP-03095)를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 비피도박테리움·롱검(Bifidobacterium longum) AuB-001주(NITE BP-03095) 및 소르비톨(sorbitol)을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 음식품인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 프로바이오틱스(probiotics) 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020227025966A 2020-02-18 2020-08-12 신규 비피도박테리움 속 세균 및 이를 포함하는 조성물 KR20220119721A (ko)

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