CN117529502A - Cd38嵌合共刺激受体及其用途 - Google Patents

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CN117529502A CN202280036774.2A CN202280036774A CN117529502A CN 117529502 A CN117529502 A CN 117529502A CN 202280036774 A CN202280036774 A CN 202280036774A CN 117529502 A CN117529502 A CN 117529502A
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米歇尔·萨德兰
玛丽亚·特赫梅利
玛丽亚·惠斯特兰
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Cancer And Related Disease Memorial Hospital
Stichting VU VUmc
Sloan Kettering Institute for Cancer Research
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
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Abstract

本公开的主题提供了靶向CD38的嵌合共刺激受体(CCR)的用途，包括CD38CCR和抗原识别受体的细胞，以及该细胞的用途。

Description

CD38嵌合共刺激受体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年11月3日提交的美国临时申请号63/275,327、于2021年11月1日提交的美国临时申请号63/274,250和于2021年3月22日提交的美国临时申请号63/164,355中每一篇的优先权，每一篇的内容通过引用整体并入于本文中。
序列表
本申请包含序列表，该序列表是通过EFS-Web以ASCⅡ格式提交的，在此通过引用整体并入于本文中。ASCⅡ副本创建于2022年3月22日，命名为“0727341333.txt”，大小为103875字节。
技术领域
本公开的主题提供了靶向CD38(CD38 CCR)的嵌合共刺激受体(CCR)的用途，例如用于减少和/或防止CD38的表达，以及减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗。还提供了包含CD38 CCR和抗原识别受体(例如，嵌合抗原受体、T细胞受体(TCR)或TCR样融合分子)的细胞，包含所述细胞的组合物，以及所述细胞或组合物用于治疗和/或预防肿瘤和/或病原体感染的用途。
背景技术
基于细胞的免疫疗法是一种对癌症治疗具有治愈潜力的疗法。可通过引入编码抗原识别受体(如嵌合抗原受体(CAR)或TCR样融合分子)的遗传物质，来对T细胞和其他免疫细胞进行修饰以靶向肿瘤抗原。患者工程化的CAR T细胞对一系列液体和实体恶性肿瘤显示出显著的效力。然而，大部分患者出现治疗失败和复发。因此，仍然需要改进免疫疗法。
发明内容
本公开的主题提供了CD38 CCR在各种方法中的用途，例如，用于减少和/或消除CD38表达，减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗。举例来说，本公开的主题提供了减少和/或消除细胞中CD38表达的方法。在某些实施方式中，该方法包括将细胞转导成包含与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)。在某些实施方式中，该方法包括将编码与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)的核酸分子引入细胞中。
在某些实施方式中，CD38表达是细胞表面上CD38的表达水平。在某些实施方式中，细胞包括与抗原结合的抗原识别受体。
此外，本公开的主题提供了减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗的方法。在某些实施方式中，该方法包括将细胞转导成包含与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)。在某些实施方式中，该方法包括将编码与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)的核酸分子引入细胞中。
在某些实施方式中，NK细胞包括与抗原结合的抗原识别受体。
本公开的主题进一步提供了治疗和/或预防受试者中与CD38相关和/或表达CD38的疾病的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用(a)CD38药物和(b)细胞，所述细胞包含(i)与疾病组织或细胞上表达的抗原结合的抗原识别受体和(ii)与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)。
在某些实施方式中，疾病是肿瘤。在某些实施方式中，肿瘤选自由血液癌症、胶质母细胞瘤和实体瘤组成的组。在某些实施方式中，肿瘤是血液癌症。在某些实施方式中，血液癌症选自由多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、华氏巨球蛋白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、淋巴瘤和急性髓系白血病(AML)组成的组。在某些实施方式中，肿瘤是多发性骨髓瘤。在某些实施方式中，所述抗原是磷酸化抗原。在某些实施方式中，所述抗原选自由BCMA、GPRC5D、FcRL5、CD41、CD48、P2RY10、CD44v6、CD70、CD123、κ轻链、NYESO-1、BOB1、ADGRE2、CLEC12A、CCR1、LILRB2、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD56、BCMA、CS-1、CD138、Lewis抗原(LeY)、WT-1和ITGB7组成的组。
在某些实施方式中，肿瘤是实体瘤。在某些实施方式中，实体瘤选自由乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌和胰腺癌、肝细胞癌(HCC)和纤维板层样癌(fibrolamellar carcinoma)组成的组。在某些实施方式中，CD38药物是抗CD38抗体。在某些实施方式中，抗CD38抗体是艾萨妥昔单抗(isatuximab)或达雷木单抗(daratumumab)。
在某些实施方式中，细胞是免疫应答性细胞。在某些实施方式中，细胞是淋巴系细胞或髓系细胞。在某些实施方式中，细胞选自由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞组成的组。在某些实施方式中，细胞是T细胞。在某些实施方式中，T细胞选自由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞组成的组。在某些实施方式中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在某些实施方式中，抗原识别受体选自由T细胞受体(TCR)、TCR样融合分子或嵌合抗原受体(CAR)组成的组。在某些实施方式中，TCR样融合分子是包括抗原结合链的重组T细胞受体(TCR)，所述抗原结合链包括：(a)以HLA独立方式与抗原结合的免疫球蛋白可变区的抗原结合片段；和(b)能与CD3ζ多肽关联的恒定结构域。在某些实施方式中，恒定结构域包括天然或经修饰的T细胞受体α恒定(TRAC)多肽，或者天然或经修饰的T细胞受体β恒定(TRBC)多肽。在某些实施方式中，CD3ζ多肽融合到共刺激分子的胞内结构域或其部分。
在某些实施方式中，抗原识别受体是CAR。在某些实施方式中，CAR包括细胞内结构域和与抗原结合的细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域包括CD3ζ多肽。在某些实施方式中，CD3ζ多肽是天然或经修饰的CD3ζ多肽。在某些实施方式中，经修饰的CD3ζ多肽包括天然ITAM1、由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体和由两个功能丧失突变组成的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域进一步包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原。在某些实施方式中，抗原是磷酸化抗原。在某些实施方式中，肿瘤抗原选自由CD19，碳酸酐酶IX(CAIX)，癌胚抗原(CEA)，CD8，CD7，CD10，CD20，CD22，CD30，CD33，CLL1，CD34，CD41，CD44，CD49f，CD56，CD74，CD133，CD138，CD123，CD44V6，感染巨细胞病毒(CMV)的细胞的抗原，ENPP3，上皮糖蛋白-2(EGP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶Erb-B2、Erb-B3、Erb-B4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-α，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人表皮生长因子受体2(HER-2)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)，κ-轻链，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis Y(LeY)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)，粘蛋白16(MUC16)，粘蛋白1(MUC1)，间皮素(MSLN)，ERBB2，MAGEA3，p53，MART1，GP100，蛋白酶3(PR1)，酪氨酸酶，存活素，hTERT，EphA2，NKG2D配体，癌睾丸抗原NY-ESO-1，癌胎抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，ROR1，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，Wilms肿瘤蛋白(WT-1)，BCMA，GPRC5D，FcRL5，ITGB7，NKCS1，EGF1R，EGFR-VIII，CD99，CD70，ADGRE2，CCR1，LILRB2，PRAME，CD48，P2RY10，CD70，BOB1，CLEC12A，CCR1，LILRB2，CD5，CD38和CS-1组成的组。
在某些实施方式中，CCR包括与CD38结合的细胞外抗原结合结构域和能够向细胞传递共刺激信号但不单独向细胞传递激活信号的细胞内结构域。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括共刺激分子细胞内结构域或其部分的。在某些实施方式中，共刺激分子选自由CD28、4-1BB、OX40、CD17、CD40、CD154、CD97、CD11a/CD18、ICOS、DAP-10、CD2、CD244、CD27和NKG2D组成的组。在某些实施方式中，共刺激分子是4-1BB。在某些实施方式中，共刺激分子是CD28。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括CD28共刺激分子的细胞内结构域和41-BB共刺激分子的细胞内结构域。
此外，本公开的主题提供了一种细胞，其包括(a)与抗原结合的抗原识别受体；和(b)与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)。在某些实施方式中，细胞对抗原单一阳性的细胞表现出实质(substantial)的细胞溶解活性。
在某些实施方式中，抗原识别受体与以1×10-8M或更小的解离常数(Kd)与抗原结合。在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。在某些实施方式中，抗原是磷酸化抗原。在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原。在某些实施方式中，肿瘤抗原选自由CD19，碳酸酐酶IX(CAIX)，癌胚抗原(CEA)，CD8，CD7，CD10，CD20，CD22，CD30，CD33，CLL1，CD34，CD41，CD44，CD49f，CD56，CD74，CD133，CD138，CD123，CD44V6，感染巨细胞病毒(CMV)的细胞的抗原，ENPP3，上皮糖蛋白-2(EGP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶Erb-B2、Erb-B3、Erb-B4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-α，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人表皮生长因子受体2(HER-2)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)，κ-轻链，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis Y(LeY)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)，粘蛋白16(MUC16)，粘蛋白1(MUC1)，间皮素(MSLN)，ERBB2，MAGEA3，p53，MART1，GP100，蛋白酶3(PR1)，酪氨酸酶，存活素，hTERT，EphA2，NKG2D配体，癌睾丸抗原NY-ESO-1，癌胎抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，ROR1，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，Wilms肿瘤蛋白(WT-1)，BCMA，GPRC5D，FcRL5，ITGB7，NKCS1，EGF1R，EGFR-VIII，CD99，CD70，ADGRE2，CCR1，LILRB2，PRAME，CD48，P2RY10，CD70，BOB1，CLEC12A，CCR1，LILRB2，CD5，CD38和CS-1组成的组。
在某些实施方式中，抗原识别受体选自由T细胞受体(TCR)、TCR样融合分子或嵌合抗原受体(CAR)组成的组。在某些实施方式中，TCR样融合分子是包括抗原结合链的重组T细胞受体(TCR)，所述抗原结合链包括：(a)以HLA独立方式与抗原结合的免疫球蛋白可变区的抗原结合片段；和(b)能与CD3ζ多肽关联的恒定结构域。在某些实施方式中，恒定结构域包括天然或经修饰的TRAC多肽，或者天然或经修饰的TRBC多肽。在某些实施方式中，CD3ζ多肽被融合到共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
在某些实施方式中，抗原识别受体是CAR。在某些实施方式中，CAR包括细胞内结构域和与抗原结合的细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域包括CD3ζ多肽。在某些实施方式中，CD3ζ多肽是天然或经修饰的CD3ζ多肽。在某些实施方式中，经修饰的CD3ζ多肽包括天然ITAM1、由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体和由两个功能丧失突变组成的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域进一步包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
在某些实施方式中，CCR包括与CD38结合的细胞外抗原结合结构域和能够向细胞传递共刺激信号但不单独向细胞传递激活信号的细胞内结构域。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，共刺激分子选自由CD28、4-1BB、OX40、CD17、CD40、CD154、CD97、CD11a/CD18、ICOS、DAP-10、CD2、NKG2D、CD244和CD27组成的组。在某些实施方式中，共刺激分子是4-1BB。在某些实施方式中，共刺激分子是CD28。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括CD28共刺激分子的细胞内结构域和41-BB共刺激分子的细胞内结构域。
在某些实施方式中，细胞是免疫应答性细胞。在某些实施方式中，细胞选自由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞组成的组。在某些实施方式中，细胞是T细胞。在某些实施方式中，T细胞选自由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞组成的组。在某些实施方式中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。
本公开的主题还提供了含有本文公开的细胞的组合物。在某些实施方式中，组合物是包含有药学上可接受载体的药物组合物。
此外，本公开的主题提供了核酸组合物，其包括(a)编码与抗原结合的抗原识别受体的第一多核苷酸；和(b)编码与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)的第二多核苷酸。在某些实施方式中，包含所述组合物的细胞对抗原单一阳性的细胞表现出实质的细胞溶解活性。本公开的主题还提供了核酸组合物，其包括(a)编码与CD38结合的抗原识别受体的第一多核苷酸；和(b)编码与抗原结合的嵌合共刺激受体(CCR)的第二多核苷酸。
本公开的主题还提供了包括本文公开的核酸组合物的载体。
此外，本公开的主题提供了包括本文公开的核酸组合物的细胞。在某些实施方式中，细胞是免疫应答性细胞。在某些实施方式中，细胞选自由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞组成的组。在某些实施方式中，细胞是T细胞。在某些实施方式中，T细胞选自由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞组成的组。在某些实施方式中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。
本公开的主题提供了治疗和/或预防受试者中肿瘤和/或病原体感染的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用本文公开的细胞或组合物。在某些实施方式中，肿瘤或病原体感染与CD38相关和/或表达CD38。在某些实施方式中，该方法进一步包括给受试者施用CD38药物。在某些实施方式中，CD38药物是抗CD38抗体。
本公开的主题进一步提供了免疫细胞，例如T细胞或NK细胞，其表达嵌合抗原受体(CAR)和嵌合共刺激受体(CCR)，其中CAR包括：细胞内CD3ζ信号传导结构域，共刺激CD28细胞内结构域，CD28跨膜结构域和与第一抗原结合的抗原特异性结合结构域；其中CCR包括：共刺激CD28细胞内结构域和共刺激4-1BB细胞内结构域，CD28跨膜结构域和与第二抗原结合的抗原特异性结合结构域；其中抗原特异性结合结构域存在于所述免疫细胞的表面，并且其中所述第一抗原与所述第二抗原不同。
在某些实施方式中，所述第一抗原和第二抗原选自由CD41、CD48、P2RY10、CD44v6、CD70、CD123、κ轻链、NYESO-1、BOB1、ADGRE2、CLEC12A、CCR1、LILRB2、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD56、BCMA、CS-1、CD138、Lewis抗原(LeY)和WT-1组成的组。所述第一抗原和第二抗原可以选自由CD41、CD48、P2RY10、CD44v6、CD70、CD123、κ轻链、NYESO-1、BOB1、ADGRE2、CLEC12A、CCR1、LILRB2、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD56、BCMA、CS-1、CD138、Lewis抗原(LeY)和WT-1组成的组。
所述第一抗原可以是CD19。所述第二抗原可以是CD38。
CAR的细胞内信号传导结构域可包括人CD3ζ的细胞内结构域或其变体。细胞内结构域包括人共刺激CD28细胞内结构域和人共刺激4-1BB细胞内结构域，或它们的变体。
CAR的抗原特异性结合结构域可以是单链结合结构域，例如单链Fv片段。CCR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段。在某些实施方式中，CAR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段，并且CCR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段。
在某些实施方式中，CAR和CCR的共刺激CD28细胞内结构域大致是相同的。
本公开的主题还提供了一种核酸分子，其使如上文所限定的嵌合抗原受体(CAR)和嵌合共刺激受体(CCR)能在合适的免疫细胞，例如人T细胞或人NK细胞中表达。所述核酸分子可以存在于载体中，例如病毒载体中。
本公开的主题还提供了药物组合物，其包括根据本发明的免疫细胞或根据本发明的核酸分子。
本公开的主题还提供了产生根据本发明的免疫细胞的方法，包括：提供免疫细胞，例如人免疫细胞，如人T细胞或人NK细胞，；和通过使上文所限定的CAR和CCR在免疫细胞中表达来修饰免疫细胞。
本公开的主题还提供了治疗患者中恶性肿瘤，例如血液恶性肿瘤的方法，该方法包括：分离免疫细胞，例如T细胞或NK细胞，由此所述免疫细胞从患者中分离出来；通过使上文所限定的CAR和CCR能在免疫细胞中表达来修饰免疫细胞；和向患者施用经修饰的免疫细胞。
在治疗患者中恶性肿瘤(例如血液恶性肿瘤)的某些方法中，该方法包括施用包含根据本发明的免疫细胞或根据本发明的核酸分子的药物组合物。
在治疗患者中恶性肿瘤(例如血液恶性肿瘤)的某些实施方式中，该方法进一步包括施用检查点抑制剂。
附图说明
可以结合附图来理解下面的详细说明，其以示例的方式给出，但并不旨在将本公开限制在所描述的具体实施方式中。
图1描绘了表达靶向CD38的CAR的T细胞中CD38的表达水平。
图2描绘了表达CD38 CCR的T细胞是CD38阴性的。
图3A和图3B描绘了根据本公开主题的某些实施方式中本文公开的构建体的两个代表性示例。图3A描绘了使用同源定向修复在TRAC基因座中插入靶向BCMA的CAR和CD38CCR。CRISPR/Cas9用于诱导双链断裂。靶向BCMA的CAR和CD38 CCR均在TRAC启动子下表达。图3B描绘了靶向BCMA的CAR在TRAC启动子下的表达以及CD38 CCR在TRAC基因座中另一种启动子(如EF1a启动子)下的表达。
图4A至图4D表示了将CAR和CD38 CCR递送至细胞的各种方法。图4A描绘了靶向BCMA的CAR和CD38 CCR在TRAC基因座处的整合(敲入(KI))，从而敲除TRAC基因座。此外，使用包含gRNA分子的CRISPR方法引入B2M敲除。图4B描绘了靶向BCMA的CAR在TRAC基因座处的整合(敲入(KI))，从而敲除TRAC基因座。CD38 CCR整合在B2M基因座的外显子1处，从而引入B2M敲除。图4C描绘了靶向BCMA的CAR和CD38CCR在TRAC基因座处的整合(敲入(KI))，从而敲除TRAC基因座。此外，使用包含gRNA分子的CRISPR方法引入B2M敲除。此外，使用包含gRNA分子的CRISPR方法引入CIITA敲除。图4D描绘了靶向BCMA为CAR在TRAC基因座处的整合(敲入(KI))，从而敲除了TRAC基因座。CD38 CCR整合在CIITA基因座的外显子3处，从而引入B2MCIITA敲除。此外，使用包含gRNA分子的CRISPR方法引入B2M敲除。
图5A至图5E表示了使用CAR和CCR的组合肿瘤靶向策略，导致增强的细胞毒性。图5A示出了双重靶向CAR+CCR策略的示意图。CD38 CCR可以与靶向恶性肿瘤相关抗原靶标的任何CAR结合，并且a)通过增加结合亲和力，b)通过递送完全共刺激来增强其功能。该图描绘了不同的组合策略，包括：1.第一代CAR和CD38-CD28 CCR，2.第一代CAR和CD38-28BBCCR，3.28z CAR和CD38-BB CCR，或4.28z CAR和CD38-28BB CCR。图5B示出了用于CARs和CCR的载体的示意图。SP，信号肽；P2A，“自我切割”2A肽；IC，细胞内结构域；跨膜结构域。图5C示出了通过流式细胞术评估的未刺激的CAR T细胞中AKT1磷酸化(磷酸化-AKT1)。示出了来自一个供体的代表性结果。图5D示出了表达MM1.S细胞(BCMA+CD38+)的荧光素酶的裂解。MM1.S与空白对照(mock)、CD38-28BB、CD38-BB或CD38ΔT细胞以不同比例共培养。在16小时BLI测定中测量肿瘤细胞杀伤(每组n＝4)。数据以平均值±SEM表示。图5E示出了肿瘤细胞杀伤分析。将经转导以表达CD38的负载钙黄绿素的3T3细胞与双靶向BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞或单靶向CD38-28ζCAR T细胞以所示的E:T比例共培养。4小时后测量肿瘤细胞杀伤(每组n＝4)。(D)和(E)中的统计分析通过双因素ANOVA和随后的多重比较进行，并通过Turkey检验进行校正。*p<0.05，***p<0.0001。
图6A至图6E描绘了CD38-CCR衔接(engagement)通过增加功能亲和力而导致CAR T细胞的细胞毒性增强。图6A示出了与缺乏细胞内共刺激尾(tail)的CD38Δ构建体结合的第一代BCMA-CAR的裂解(在16小时BLI测定中确定)。BCMA-ζ+CD38ΔT细胞和BCMA-ζ+CD38-28BB T细胞与MM1.S细胞并且以所示的E:T比例一起孵育(n＝4)。统计分析通过双因素ANOVA和随后的多重比较进行，并通过Turkey检验进行校正。****p<0.0001。图6B示出了通过流式细胞术评估的用UM9细胞刺激15分钟而活化的BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞中AKT1磷酸化(pAKT1)的MFI(每组n＝4)。统计分析通过单因素ANOVA和随后的多重比较进行，并通过Turkey检验进行校正。*p<0.05，**p<0.01。图6C示出了在1000pN下保持与MM1.S靶标细胞结合的CAR T细胞的百分比；数据以6次合并测量的平均值±SEM来示出；p值使用配对t检验来计算。**p<0.01，***p<0.001。图6D示出了用于产生scFvs的抗CD38抗体的亲和力特征。表面等离子体共振确定在CHO-CD38细胞(μg/mL)上滴定时的解离常数(KD值，nmol/L)和半有效浓度(EC50)，记载于(Drent et al.,2017.Mol Ther25:1946-195829)。图6E示出了在BLI测定中测量的肿瘤细胞裂解。MM1.S细胞与共表达CD38-CCR的BCMA-CAR T细胞以1:1的比例共培养，CD38-CCR对CD38或CD38Δ的亲和力逐渐降低(每组n＝4)。统计分析用配对t检验进行。
图7A至图7D描绘了CAR和CCR组合恢复T细胞针对低抗原表达肿瘤变体的细胞毒性能力。图7A示出了具有不同BCMA表达并且与与第一代、第二代或第三代BCMA-CAR T细胞和双BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞(BCMA-ζ+CD38-28BB或BCMA-28ζ+CD38-BB)以1∶1的效应子与靶细胞比例共培养的K562细胞的细胞裂解(在16小时通过BLI确定)(每组n＝3)。统计分析采用双因素ANOVA和随后的多重比较进行，并通过Turkey检验进行校正。**p<0.01，***p<0.0001。图7B示出了NALM6急性淋巴细胞白血病细胞系(WT)和两个NALM6克隆(克隆12.4和克隆2)上的CD19和CD38表达的直方图。直方图示出了未染色的对照。图7C示出了当与CD19-ζ、双CD19-ζ+CD38-28或双CD19-ζ+CD38-28BB T细胞(左)或者与CD19-28ζ或双CD19-28ζ+CD38-BB T细胞(右)共培养时，NALM6克隆2的特异性裂解。空心方块代表当用CD19-28ζCART细胞处理时，CD19野生型NALM6细胞系的裂解活性。统计分析使用双因素ANOVA和随后的多重比较进行，并通过Turkey检验进行校正。*p<0.05。图7D示出了当细胞与CD19-28ζ或双CD19-28ζ+CD38-28BB T细胞以所示的E:T比率共培养时，NALM6克隆12-4(每细胞200分子)和NALM6克隆2(每细胞20分子)的特异性细胞溶解。空心方块代表用CD19-28ζCAR T细胞处理时CD19 WT NALM6细胞系的裂解活性。统计分析使用双向ANOVA和随后的多重比较进行，并通过Turkey检验进行校正。****p<0.0001。
图8描绘了CCR的共表达增强CAR T细胞的扩增。示出了从与MM1.S(E:T比例1:1)共培养16小时收集的上清液中的细胞因子分泌(每组n＝4)。统计分析通过配对t检验进行。*p<0.05。
图9A至图9C 5.CD38-CCR可以通过辅佐细胞上表达的抗原的反式(in-trans)结合发出信号，而没有肿瘤外毒性(off-tumor toxicity)。图9A示出了U266细胞与负载钙黄绿素的3T3-CD38细胞共孵育下，通过BLI(4小时后)和钙黄绿素-AM释放测定测量的细胞裂解(每组n＝4)，该负载钙黄绿素的3T3-CD38细胞与空白对照、BCMA-ζ、BCMA-ζ+CD38Δ、BCMA-ζ+CD38-28、BCMA-28ζ、BCMA-28ζ+CD38-BB或BCMA-ζ+CD38-28BB CAR T细胞以3∶1的E∶T比例共培养。统计分析通过配对t检验进行。*p<0.05，**p<0.01。图9B示出了基于流式细胞术的测定法收获并测量的图9A的细胞上清液的细胞因子分泌(每组n＝4)。统计分析通过配对t检验进行。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图9C示出了在经辐照的BCMA+CD38-U266细胞和经辐照的3T3-38+细胞的共培养中加入的空白对照、BCMA-ζ、BCMA-ζ+CD38Δ、BCMA-ζ+CD38-28、BCMA-28ζ、BCMA-28ζ+CD38-BB或BCMA-ζ+CD38-28BB CAR T细胞的扩增。7天后测量细胞扩增。统计分析采用单因素ANOVA和随后的多重比较进行，并通过Turkey检验进行校正。****p<0.0001。
图10A至图10E描绘了BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞，其显示了增强的体内抗肿瘤功能、改善的持久性和减少的衰竭标志物表达。图10A示出了通过BLI定量并且以每球面度每平方厘米每秒的光子为单位(ph/sec/cm2/sr)描绘的小鼠平均肿瘤负荷(每组n＝4只小鼠)。统计分析采用双因素ANOVA和随后的多重比较进行，并通过Turkey检验进行校正。*p<0.05。图10B示出了支架中UM9肿瘤细胞(GFP+/CD38+)的绝对数量。每个点代表一个支架。图10C示出了支架中CAR T细胞的绝对数量。每个点代表一个支架。图10D示出了CAR T细胞上BCMA的MFI。每个点代表一个支架。图10E示出了CAR T细胞上BCMA的MFI，其与同一支架内的共存相关。每个点代表一个支架。统计分析通过非配对t检验进行；**p<0.01。
图11A至图11F示出了CD19-CAR+CD38-CCR组合引发了针对具有非常低抗原密度的肿瘤变体的改善的体内抗肿瘤功能。图11A示出了注射FFLuc-GFP NALM6克隆12.4细胞的小鼠随时间的平均肿瘤负荷。肿瘤负荷被描绘以每球面度每平方厘米每秒的光子为单位(ph/sec/cm2/sr)(每组n＝5只小鼠)。图11B示出了注射NALM6克隆12-4的小鼠的存活率。图11C示出了注射FFLuc-GFP NALM6克隆2细胞的小鼠随时间的平均肿瘤负荷。肿瘤负荷被描绘为每球面度每平方厘米每秒的光子为单位(ph/sec/cm2/sr)；每组n＝5只小鼠。图11D示出了注射NALM6克隆2的小鼠的存活率。肿瘤负荷(A和C)的统计分析采用双因素ANOVA和随后的多重比较进行，并通过Turkey检验进行校正。*p<0.05。存活率(B和D)的统计分析通过对数秩检验进行。***p<0.001，***p<0.0001。
图12A和图12B描绘了体内急性淋巴细胞白血病(ALL)模型中的肿瘤负荷。图12A示出了注射NALM6克隆12.4并用空白对照、CD38-28BB、CD19-BBζ、CD19-28ζ、CD19-ζ+CD38-28BB、CD19-28ζ+CD38-BB或CD19-28ζ+CD38-BB处理的个体小鼠的肿瘤负荷，通过肿瘤的发光来定量(ph/sec/cm2/sr)。图12B示出了用空白对照、CD38-28BB、CD19-BBζ、CD19-28ζ、CD19-ζ+CD38-28BB、CD19-28ζ+CD38-BB或CD19-28ζ+CD38-28BB处理的注射Nalm6克隆2的个体小鼠的肿瘤负荷，通过肿瘤的发光来定量(ph/sec/cm2/sr)。
图13描绘了用空白对照载体、单独的CD38-28ζ、单独的BCMA-28ζ或BCMA-28ζ+CD38-28BB的组合转导的T细胞对表达CD38的小鼠NIH 3T3细胞的裂解。E:T表示效应子/靶比例。
具体实施方式
本公开的主题提供了靶向CD38的嵌合共刺激受体(CCR)(称为“CD38 CCR”)的用途，例如用于减少和/或消除CD38的表达，减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗。还提供了包含CD38 CCR和抗原识别受体(例如，嵌合抗原受体、T细胞受体(TCR)或TCR样融合分子)的细胞，包含所述细胞的组合物，以及所述细胞或组合物用于治疗和/或预防肿瘤和/或病原体感染的用途。本公开的主题至少部分基于CD38 CCR可以消除T细胞，例如工程化的T细胞，如表达CAR的T细胞上CD38表达的发现。因此，CD38 CCR可以用来敲除CD38。参见实施例1。如实施例1所示，表达不靶向CD38的CAR的T细胞具有高表达的CD38，这导致在CAR-T细胞与CD38药物(如抗CD38抗体)组合使用时，CAR-T细胞的自相残杀。因此，可将进一步表达CD38CCR的CAR-T细胞与抗CD38抗体(如达雷木单抗)组合使用，用于治疗与CD38相关的疾病。
本公开的主题进一步旨在通过共表达靶向不同抗原的两种工程化受体，即CAR和CCR受体，提高CAR免疫疗法对恶性肿瘤，尤其是血液系统恶性肿瘤的效果。令人惊奇地发现，如果两种受体都含有CD28的跨膜结构域和共刺激细胞内结构域，就能获得更好的抗肿瘤功能。两种受体在免疫细胞上的共同表达是提高所述细胞的细胞毒性、根除低抗原肿瘤变体和提供最佳共刺激增强免疫细胞持久性的成功策略。
通过本说明书和实施例描述本发明的非限制性实施方式。
为了明确本公开的目的而非出于限制，详细的描述分为以下子节：
5.1.定义；
5.2.CD38 CCR
5.3.细胞；
5.4.核酸组合物和载体；
5.5.制剂和施用；
5.6.方法；
5.7.套件；和
5.8.示例性实施方式。
5.1定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用定义：Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nded.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。
如本文中使用的，单数形式的“一种/个(a)”、“一种/个(an)”和“该/所述(the)”，也旨在包括复数形式。
如本文中使用的，术语“或”包括一个或多个相关列出的项的任何和所有组合，除非上下文另有明确说明(例如，如果使用了“要么……要么(either…or)”结构)。
如本文中使用的，术语“约(about)”或“大约(approximately)”指在本领域一般技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这部分取决于测量或确定值的方式，即测量系统的局限性。举例来说，根据本领域的惯例，“约(about)”可以指3个或大于3个的标准差以内。可替代地，“约(about)”可以指在给定值的最多20％以内，例如最多10％以内、最多5％以内或最多1％以内。可替代地，特别是在生物系统或过程方面，该术语可以指在数值的一个数量级内，例如5倍或2倍以内。
如本文中使用的，“共刺激分子”是指除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其可以提供淋巴细胞对抗原的有效应答。在某些实施方式中，共刺激分子可以提供最佳的淋巴细胞激活。在某些实施方式中，共刺激分子包含共刺激结构域。如本文中使用的，术语“共刺激结构域”是指CAR和/或CCR的刺激结构域，其通过初级特异性信号的传播提供次级非特异性激活机制。
如本文中使用的，“共刺激配体”是指在与其受体(例如，共刺激分子)结合后产生共刺激应答(例如，抗原识别受体(例如嵌合抗原受体(CAR))结合其靶抗原时所提供刺激的胞内应答)的分子。
如本文中使用的，术语“过继性免疫疗法”，也称为“过继性细胞转移”和“细胞过继性免疫疗法”，是指施用供体或自体免疫细胞，例如T细胞或NK细胞，用于治疗疾病或病症，其中所述疾病或病症的特征在于免疫应答不足或不充分。过继性免疫疗法可以是对任何疾病或病症的适当治疗，其中已经证明通过免疫细胞如T细胞和NK细胞实现了感染或转化细胞的消除。例如，疾病或病症包括但不限于恶性肿瘤，例如黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、喉癌和颈癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、骨癌、白血病和肺癌；病毒感染，例如乙型肝炎、丙型肝炎和免疫缺陷病毒感染；细菌感染，例如结核病、麻风病和李氏杆菌病；以及寄生虫感染，例如疟疾。过继性细胞疗法的类型包括嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)疗法。
“免疫应答性细胞”或“免疫细胞”是指在免疫应答中发挥作用和/或在免疫应答中起作用的造血来源的细胞或其祖细胞或子代细胞。在某些实施方式中，免疫应答性细胞是淋巴系细胞。在某些实施方式中，免疫应答性细胞是淋巴细胞。淋巴系细胞的非限制性示例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞和可从中分化出淋巴细胞的干细胞。在某些实施方式中，所述免疫应答性细胞是髓系的细胞。在某些实施方式中，免疫应答性细胞是骨髓细胞。骨髓细胞的非限制性示例包括单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
如本文中使用的，术语“T细胞”是指CD4 T细胞或CD8 T细胞。术语T细胞涵盖T辅助(TH)细胞，如TH1细胞、TH2细胞和TH17细胞。
如本文中使用的，术语“自然杀伤(NK)细胞”是指外周血淋巴细胞的亚群，其由表达CD56或CD16且缺乏T细胞受体来定义。
“激活免疫应答性细胞”是指细胞中信号转导的诱导或蛋白表达的变化引起免疫应答的开始。例如，当CD3链响应配体结合和免疫受体酪氨酸抑制基序(ITAM)而聚集时，就会产生信号转导级联。在某些实施方式中，当抗原识别受体(例如TCR或CAR)与抗原结合时，发生免疫突触的形成，包括许多分子在结合受体附近聚集(例如CD4或CD8、CD3γ/δ/ε/ζ等)。这种膜结合信号传导分子的聚集使得包含在CD3链中的ITAM基序被磷酸化。这种磷酸化进而启动T细胞激活途径，最终激活转录因子，如NF-κB和AP-1。这些转录因子诱导T细胞的整体基因表达，以增加IL-2的产生，用于调节因子T细胞蛋白的增值和表达，从而启动T细胞介导的免疫应答。
“刺激免疫应答性细胞”是指产生强大且持续的免疫应答的信号。在各种实施方式中，这发生在免疫细胞(例如，T细胞)激活或同时通过受体(包括但不限于CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD40和ICOS)介导后。接收多个刺激信号对于建立强大且长期的T细胞介导的免疫应答是重要的。T细胞会迅速受到抑制并对抗原无应答。虽然这些共刺激信号的效果可能会有所不同，但它们通常会导致基因表达增加以产生长寿、增殖和抗凋亡的T细胞，这些T细胞对抗原有强烈应答，从而实现彻底和持续的根除。
如本文中使用的，术语“抗原识别受体”是指响应其与抗原的结合能够激活免疫或免疫应答细胞(例如T细胞)的受体。
术语“嵌合共刺激受体”、“嵌合共刺激受体(CCR)”或“CCR”是指与抗原(例如CD38)结合并提供共刺激信号，但不向包含CCR的细胞提供激活信号的嵌合受体。例如但不限于，CCR可以是介导共刺激，但自身不提供免疫细胞激活的一类嵌合抗原受体(CAR)。US20020018783中描述了各种CCR，其内容通过引用整体并入本文。CCR模拟共刺激信号，但与CAR不同，其不提供激活信号。在某些实施方式中，CCR缺乏CD3ζ多肽。在某些实施方式中，当与抗原识别受体(例如，激活细胞的CAR或TCR)结合在免疫细胞上表达时，CCR靶向第二抗原。在某些实施方式中，CCR包含两个或多个共刺激结构域，例如CD28共刺激结构域和共刺激4-1BB细胞内结构域。
如本文中使用的，术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，还指保留免疫原结合能力的抗体分子的片段。此类片段在本领域中也是众所周知的，并且在体外和体内都被经常使用。因此，如本文中使用的，术语“抗体”不仅指完整的免疫球蛋白分子，还指众所周知的活性片段F(ab')2和Fab。F(ab')2和缺乏完整抗体的Fe片段的Fab片段，从循环中清除得更快，并且具有较少完整抗体的非特异性组织结合(Wahl et al.,J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。如本文中使用的，抗体包括全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab'、单链可变区片段(scFv)，融合多肽和非常规抗体。在某些实施方式中，抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定(CH)区组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区CL组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为超变区，称为互补性决定区(CDR)，中间散布有更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1 q))的结合。
如本文中使用的，“CDR”被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其为免疫球蛋白重链和轻链的超变区。参见See,e.g.,Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,4th U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。通常，抗体包含可变区中的三条重链和三条轻链CDR或CDR区。CDR为抗体与抗原或表位的结合提供了大部分接触残基。在某些实施方式中，使用Kabat系统划定CDR区(Kabat,E.A.,etal.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)。在某些实施方式中，根据Kabat系统统识别CDR。在某些实施方式中，使用在http://www.abysis.org/abysis/index.html.可访问的Kabat编号系统来识别CDR。在某些实施方式中，根据IMGT系统来识别CDR。在某些实施方式中，使用在http://www.abysis.org/abysis/index.html.可访问的IMGT编号系统来识别CDR。
如本文所使用的，术语“单链可变片段”或“单链可变片段(scFv)”或“scFv”是免疫球蛋白重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)共价连接形成VH::VL异二聚体的融合蛋白。VH和VL直接连接或由肽编码的接头连接(例如，10、15、20、25个氨基酸)，连接VH的N端与VL的C端，或VH的C端与VL的N端。接头通常富含甘氨酸以获得柔韧性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性。尽管去除恒定区并引入接头，但scFv蛋白仍保留原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可从包括VH和VL编码序列的核酸中表达，如Huston,et al.(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)所述。另见美国专利号5,091,513,5,132,405和4,956,778；以及美国专利公布号20050196754和20050196754。具有抑制活性的拮抗性scFv已经被描述(参见，例如Zhao et al.,Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6):455-51；Peter et al.,JCachexiaSarcopenia Muscle 2012August 12；Shieh et al.,J Imunol2009 183(4):2277-85；Giomarelli et al.,Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fife eta.,J Clin Invst2006 116(8):2252-61；Brocks et al.,Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayeret al.,Ther Immunol 19952(10:31-40))。具有刺激活性的激动性scFv已经被描述(参见，例如，Peter et al.,J Bioi Chern2003 25278(38):36740-7；Xie et al.,Nat Biotech1997 15(8):768-71；Ledbetter et al.,Crit Rev Immunol1997 17(5-6):427-55；Ho etal.,BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66)。
如本文所使用的，术语“亲和力”或“结合亲和力”是指结合强度的量度。亲和力取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间的立体化学配合的紧密程度、它们之间接触区域的大小，和/或带电和疏水性基团的分布。例如，亲和力是指表观结合亲和力，其表示为结合结构域与其在靶分子上的表位之间的平衡解离常数(Kd)。所述结合亲和力是在结合结构域及其表位之间起作用的吸引力和排斥力的总和。如本文所使用的，术语“亲和力(affinity)”还包括“亲合力(avidity)”，其是指形成可逆复合物后抗原-抗体键的强度。计算抗体对抗原的亲和力的方法是本领域已知的，包括但不限于各种抗原结合实验，例如功能测定(例如流式细胞术测定)。
本文所使用的，术语“嵌合抗原受体(CAR)”、“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的分子，所述细胞外抗原结合结构域与能够激活或刺激免疫或免疫应答性细胞的细胞内信号传导结构域融合。例如，但不限于，CAR可以是人工跨膜蛋白受体，最少包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，能够激活或刺激免疫细胞。在某些实施方式中，CAR的胞外抗原结合结构域包含scFv。scFv可来源于抗体的可变重链和轻链区的融合。可替代或附加地，scFv可来源于Fab’s(而不是来自抗体，例如从Fab文库获得)。在某些实施方式中，scFv融合到跨膜结构域，然后融合到细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，选择对抗原具有高结合亲和力或亲合力的CAR。
如本文所使用的，术语“T细胞受体(TCR)”是指存在于T细胞表面的分子，其负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的肽。
本文所使用的，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的细胞内结构域。术语“效应子功能”是指细胞的特定功能。在某些实施方式中，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域是CD3ζ细胞内信号传导结构域或者包含CD3ζ细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域是人CD3ζ细胞内信号传导结构域或其变体，或者包含人CD3ζ细胞内信号传导结构域或其变体。
如本文所使用的，术语“分化簇3(CD3)”是指由CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链组成的蛋白质复合物。这些链与TCR和CD3-ζ(ζ链)结合，在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR、CD3-ζ和其他CD3链一起构成TCR复合物。
如本文所使用的，术语“CD3ζ”或“CD3-ζ”是指人类白细胞分化抗原3ζ。在某些实施方式中，人CD3ζ由UniProt条目P20963或NCBI参考号NP_932170识别。在某些实施方式中，人CD3ζ的细胞内结构域对应于、包含或由UniProt条目P20963的氨基酸残基52-164组成。在某些实施方式中，人CD3ζ的细胞内结构域对应于、包含或由NCBI参考号:NP_932170的氨基酸残基52-164组成。CD3ζ包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。这些基序的磷酸化引起下游信号传导通路的激活。
如本文所使用的，术语“CD28”是指T细胞特异性表面糖蛋白CD28，其提供T细胞激活和存活所需的共刺激信号。在某些实施方式中，跨膜结构域对应于、包含或由Uniprot条目P10747的氨基酸残基153-179组成。在某些实施方式中，跨膜结构域对应于、包含或由NCBI参考号:NP_006130的氨基酸残基153-179组成。在某些实施方式中，共刺激结构域对应于、包含或由CD28的细胞质部分组成。在某些实施方式中，CD28的细胞质部分对应于、包含或由Uniprot条目P10747的氨基酸残基180-220组成。在某些实施方式中，CD28的细胞质部分对应于、包含或由NCBI参考号:NP_006130的氨基酸残基180-220组成。这部分包含称为YMNM基序，起始于酪氨酸191，对含SH2结构域的蛋白质的募集是重要的。
如本文所使用的，术语“OX40或CD134”是指肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。在某些实施方式中，共刺激信号传导结构域对应于、包含或由CD 134的细胞质部分组成。在某些实施方式中，CD134的细胞质部分对应于、包含或由Uniprot条目P43489的氨基酸残基236-277组成。
如本文所使用的，术语“ICOS或CD278”是指在经激活的T细胞上表达的CD28相关的共刺激分子。在某些实施方式中，共刺激信号传导结构域对应于、包含或由CD278的细胞质部分组成。在某些实施方式中，CD278的细胞质部分对应于、包含或由Uniprot条目Q9Y6W8的氨基酸残基162-199组成。
如本文使用的，术语“2B4或CD244”是指在自然杀伤细胞和一些T细胞上表达的细胞表面受体。在某些实施方式中，共刺激信号传导结构域对应于、包含或由CD244的细胞质部分组成。在某些实施方式中，CD244的细胞质部分对应于、包含或由Uniprot条目Q9BZW8的氨基酸残基251-370组成。
如本文使用的，术语“CD27多肽”是指TNF-受体超家族的成员。该受体在调节B细胞激活和免疫球蛋白合成中发挥关键作用。在某些实施方式中，共刺激信号传导结构域对应于、包含或由CD27的细胞质部分组成。在某些实施方式中，CD27的细胞质部分对应于、包含或由Uniprot条目P26842的氨基酸残基213-260组成。
如本文使用的，术语“CD40多肽”指TNF-受体超家族的成员。该受体在B细胞免疫球蛋白分泌的诱导中发挥关键作用。在某些实施方式中，共刺激信号传导结构域对应于、包含或由CD40的细胞质部分组成。在某些实施方式中，CD40的细胞质部分对应于、包含或由Uniprot条目P25942的氨基酸残基216-277组成。
如本文使用的，术语“NKG2D”是指属于C型凝集素样受体CD94/NKG2家族的跨膜蛋白。所有NK细胞、大多数NKT细胞和γδ+ T细胞亚群都表达NKG2D(Wu et al.,1999.Science285:730-732；Jamieson et al.,2002.Immunity 17:19-29)。此外，NKG2D存在于所有人类CD8+ T细胞的细胞表面。NKG2D与10kDa的DNAX激活蛋白(DAP10)形成复合物(Wu et al.,1999.Science 285:730-732)。在某些实施方式中，共刺激信号传导结构域对应于、包含或由NKG2D的细胞质部分组成。在某些实施方式中，NKG2D的细胞质部分对应于、包含或由Uniprot条目P26718的氨基酸残基1-51组成。
如本文使用的，术语“4-1BB，或CD137”是指肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，其氨基酸序列由UniProt条目Q07011或NCBI参考号：NP_001552提供。在某些实施方式中，人4-1BB的共刺激细胞内信号传导结构域对应于、包含或由Uniprot条目Q07011的氨基酸残基214-255组成。在某些实施方式中，人4-1BB的共刺激细胞内信号传导结构域对应于、包含或由NCBI参考号：NP_001552的氨基酸残基214-255组成。
如本文使用的，术语“基本一致”或“基本同源”是指与参考氨基酸序列(例如本文所述的任意氨基酸序列)或参考核酸序列(例如本文所述的任意核酸序列)表现出至少约50％一致或同源的多肽或核酸分子。在某些实施方式中，该序列与用于比较的氨基酸序列或核酸序列在整个长度上至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％一致或同源。
序列一致性可以通过使用序列分析软件来测量(例如，遗传学计算机组的序列分析软件包，University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705,BLAST,BESTFIT,GAP，或PILEUP/PRETTYBOX程序)。这种软件通过对各种取代、缺失和/或其它修饰赋予同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组中的取代:甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定一致性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率分数表示密切相关的序列。
两个氨基酸序列之间的同源性百分比可以使用已被纳入ALIGN程序(2.0版)E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))，使用PAM120重量残基表，空位长度罚值为12，空位罚值为4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的同源性百分比可以使用已被纳入GCG软件包(可从www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。可附加或可替代地，本公开的主题的氨基酸序列还可以用作“查询序列(query sequence)”，以对公共数据库执行搜索，例如用于识别相关序列。可以使用Altschul,et al(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版)执行此类搜索。可以使用XBLAST程序执行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本文公开的特定序列(例如，scFv703的重链和轻链可变区序列)。为了获得用于对比的空位联配，可以使用Gapped BLAST，如Altschul et al.,(1997)Nucleic Acid Res.25(17):3389-3402所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
如本文使用的，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变包含氨基酸序列的参考抗体或其抗原结合片段的结合特性的氨基酸修饰。保守修饰可以包括氨基酸取代、添加和缺失。通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，可以将修饰引入本公开的CAR的胞外抗原结合结构域。根据氨基酸的物理化学性质，如电荷和极性，可以将氨基酸分类。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被同组内的氨基酸取代。例如，氨基酸可以通过电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，带中性电荷的氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。另外，氨基酸可以通过极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自同组的其他氨基酸残基所取代，并且可以使用本文所述的功能测定来测试改变的抗体的保留功能。在某些实施方式中，特定序列或CDR区内不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基被改变。
“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官正常功能的任何症状、疾病或失调，例如瘤(neoplasm)和细胞病原体感染。
“有效量”是指足以具有治疗效果的量。在某些实施方式中，“有效量”是足以阻止、改善或抑制瘤的持续增殖、生长或转移(例如，侵袭或迁移)的量。
“内源性”是指通常在细胞或组织中正常表达的核酸分子或多肽。
“外源性”是指细胞内非内源性存在的核酸分子或多肽。因此，术语“外源性”将包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外源、异源和过表达的核酸分子和多肽。“外源性”核酸是指天然野生型细胞中不存在的核酸；例如，外源性核酸可能在序列、位置/定位或两者上均有与内源性对应物不同。为清楚起见，外源核酸相对于其天然内源性对应物可能具有相同或不同的序列；可通过基因工程将其引入细胞本身或其祖细胞中，且可任选地与可替代的控制序列(例如非天然启动子或分泌序列)连接。
“增加”是指正改变至少约5％。改变可能是约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、约100％或更多。
“减少”是指负改变至少约5％。改变可能是约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、或甚至约100％。
术语“经分离的”、“经纯化的”或“生物纯的”是指物质在不同程度上不含通常在其天然状态下伴随其存在的组分。“分离(isolate)”表示与原始来源或环境的分离程度。“纯化”表示比分离更高的分离程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质充分不含其他物质，因此任何杂质都不会对蛋白质的生物学特性产生实质性影响或导致其他不利后果。也就是说，核酸或肽如果基本上不含细胞物质、病毒物质或通过重组DNA技术进行生产时的培养基，或化学前体或化学合成时的其他化学物质，那么它就是“经纯化的”。纯度和均一性通常使用分析化学技术确定，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可进行修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可产生不同的经分离的蛋白质，其可分别被纯化。
“经分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞成分分离的细胞。
如本文使用的，术语“抗原结合结构域”或“抗原特异性结合结构域”是指能够特异性结合细胞上存在的特定抗原决定簇或抗原决定簇组的结构域。例如，抗原结合结构域可以是特异性结合特定抗原的CAR和/或CRR的结构域。在某些实施方式中，所述结合结构域仅与指定的靶结合。虽然在某些实施方式中，不能排除与其他靶的结合，但是这种与另一靶的结合将以较低的亲和力发生，例如，比与特定靶的结合亲和力低至少10倍。例如，当CD38特异性结合结构域以5μM的Kd与CD38结合时，在某些实施方式中，这种CD38特异性结合结构域可以以超过10μM，例如超过50μM的Kd与另一靶结合。在某些实施方式中，“抗原特异性结合结构域”包含单链结合结构域。单链结合结构域可以包括单链可变结构域(scFv)、骆驼科(camelid)VHH分子、鲨鱼免疫球蛋白衍生的可变新抗原受体、串联scFv、scFab、改进的scFab(Koerber et al.,2015.J Mol Biol 427:576-86)或抗体模拟物，例如设计的锚蛋白重复蛋白、基于蛋白A的Z结构域的结合蛋白、基于纤连蛋白III型结构域的结合蛋白、工程化的脂质运载蛋白和基于人Fyn SH3结构域的结合蛋白(Skerra,2007.Current OpinionBiotechnol 18:295-304；et al.,2015.Trends Biotechnol 33:408-418)。在某些实施方式中，抗原特异性结合结构域是人的或人源化的。去免疫和/或人源化通常用于降低非人分子的免疫原性。去免疫涉及使用生物信息学识别感兴趣的结合结构域中的线性T细胞表位，以及随后通过定点突变将其替换为非免疫原性序列。用于去免疫的方法是本领域已知的，例如WO098/52976。在规避应用于或可能应用于人类的非人结合结构域的免疫原性的某些方法中，涉及人源化。已经建立了各种基于重组DNA的方法，旨在增加也出现在人类结合结构域中相同或相似位置的结合结构域中氨基酸残基的含量，同时保留亲代非人结合结构域的特异性和亲和力。在某些实施方式中，氨基酸残基是那些出现在由基因组种系序列编码的结合结构域，例如基于免疫球蛋白的结合结构域中的残基。人源化抗体的方法是本领域技术人员已知的，包括CDR的移植(Queen et al.,1989.PNAS 86:10029；Carter etal.,1992.PNAS 89:4285)，表面重建(Padlan et.al.,1991.Mol Immunol 28:489；超人源化(Tan et.al.,2002.JImmunol 169:1119),human string content优化(Lazar et al.,2007.Mol Immunol 44:1986)和人类工程化(Almagro et al.,2008.Frontiers Biosci13:1619)。在公开的国际申请WO2011080350；WO2014033252和WO2009004065；以及Qu etal.,1999.Clin.Cancer Res.5:3095-3100；Ono et al.,1999.Mol.Immunol.36:387-395中描述了某些有用的方法。这些方法依赖于抗体结构的分析和非人和人抗体的序列比较，以评估人源化过程对最终产品免疫原性的影响。人源化可以包括嵌合结合体(例如抗体)的构建，其中非人结合结构域例如通过氨基酸键合连接到人蛋白质上。
如果需要，抗原特异性结合结构域可以通过提供构象灵活性的连接基团与跨膜结构域、共刺激细胞内结构域和细胞内信号结构域融合，使得抗原特异性结合结构域可以与其表位结合。在某些实施方式中，接头基团是包含1至约60个氨基酸残基，例如5至约40个氨基酸残基，例如约15个氨基酸残基，如10个氨基酸残基、11个氨基酸残基、12个氨基酸残基、13个氨基酸残基、14个氨基酸残基、15个氨基酸残基、16个氨基酸残基、17个氨基酸残基、18个氨基酸残基、19个氨基酸残基或20个氨基酸残基的接头多肽。这种氨基酸序列的非限制性示例包括Gly-Ser接头，例如(Glyx Sery)z型接头，如(Gly4 Ser)3、(Gly4 Ser)7或(Gly3Ser2)3，如WO 99/42077中所描述的；以及例如WO 06/040153和WO 06/122825中描述的GS30、GS15、GS9和GS7接头；以及铰链样区，如天然存在的重链抗体或类似序列的铰链区(如WO94/04678中所述)。示例性接头是(Gly4 Ser)3接头。在某些实施方式中，接头基团也可以存在于跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间，和/或细胞内信号传导结构域和共刺激结构域之间，和/或两个或多个细胞内信号传导结构域之间。
在某些实施方式中，接头是G4S接头。在某些实施方式中，接头包括或由SEQ IDNO:85所示的氨基酸序列组成，该序列提供如下：
GGGGSGGGGSGGGSGGGGS[SEQ ID NO:85]
在某些实施方式中，接头包括或由SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列组成，该序列提供如下：
GGGGSGGGGSGGGGS[SEQ ID NO:86]
在某些实施方式中，接头包括或由SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列组成，该序列提供如下：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGGS[SEQ ID NO:87]
在某些实施方式中，接头包括或由SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列组成，该序列提供如下：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGGS[SEQ ID NO:88]
在某些实施方式中，接头包括或由SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列组成，该序列提供如下：
GGGGS[SEQ ID NO:89]
在某些实施方式中，接头包括或由SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列组成，该序列提供如下：
GGGGSGGGGS[SEQ ID NO:90]
在某些实施方式中，接头包括或由SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列组成，该序列提供如下：
GGSGG[SEQ ID NO:91]
如本文使用的，术语“瘤(neplasm)”、“恶性肿瘤”、“肿瘤(tumor)”和“癌症”是指特征在于失控的或不受控制的细胞生长或细胞或组织的病理性增殖及其随后向其它组织或器官的迁移或侵袭的疾病。例如，瘤生长通常是不受控制的和进行性的，并且发生在不会引发或将导致正常细胞增殖停止的条件下。瘤可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、骨、脑、乳腺、软骨、神经胶质、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道的器官，或其组织或细胞类型。瘤包括癌症，如肉瘤(sarcomas)、癌(carcinomas)或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。在某些实施方式中，瘤是癌症。
如本文使用的，术语“血液恶性肿瘤”是指影响血细胞和/或骨髓细胞的恶性肿瘤，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或其他淋巴恶性肿瘤，如浆细胞瘤和华氏巨球蛋白血症，以及脾和淋巴结的癌症。
“特异性结合”是指识别并结合感兴趣的生物分子(例如多肽)，而基本上不会识别并结合样品中的其它分子的多肽或其片段，所述样品例如生物样品，天然包括本文公开的多肽。
如本文使用的，术语“肿瘤抗原”是指与正常或非肿瘤细胞相比，在肿瘤细胞上独特或差异表达的抗原(例如，多肽)。在某些实施方式中，肿瘤抗原包括由肿瘤表达的任何多肽，其能够通过抗原识别受体激活或诱导免疫应答，或者能够通过受体-配体结合抑制免疫应答。
如本文使用的，术语“CD19”是指属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白。CD19被归类为I型跨膜蛋白，具有单一跨膜结构域、细胞质C端和细胞外N端。人CD19的氨基酸序列可在UniProt条目P15391中找到。CD19是B细胞淋巴瘤和白血病的标志物。CD19在大多数B谱系恶性肿瘤中表达，包括例如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。
术语“包括”、“包含”旨在具有美国专利法赋予它们的广义含义，并且可以表示“包括”、“包含”等。术语“包括”和“包含”及其变形是开放式语言，并且指定所述特征的存在，但是不排除一个或多个其他特征的存在或添加。应当理解的是，当方法的具体步骤被称为在另一步骤之后时，它可以直接在所述另一步骤之后，或者在进行该具体步骤之前可进行一个或多个中间步骤，除非另有说明。
如本文使用的，治疗”是指试图改变所治疗的个体或细胞的病程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的疗效包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或减轻疾病状态，缓解或改善预后。通过预防疾病或失调的进展，治疗可防止因受影响或被诊断的受试者或被怀疑患有这种疾病的受试者的病症而病情恶化，但是，治疗也可以防止有患该疾病风险的受试者或怀疑患有该疾病的受试者出现该失调或该失调的症状。
本文中的“个体”或“受试者”是脊椎动物，例如人类或非人类动物(例如哺乳动物)。哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、家畜、运动动物、啮齿动物和宠物。非人类动物受试者的非限制性示例包括啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；以及非人灵长类动物，如猿和猴子。本文所用的术语“免疫受损”是指具有免疫缺陷的受试者。受试者极易受到机会性感染，即由通常不会导致免疫系统健康的人类患病的生物体引起的感染，但会影响免疫系统功能不良或受到抑制的人类。
如本文使用的，分子或多肽的“功能片段”包括保留分子或多肽主要(primary)功能的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约100％的分子或多肽的片段。
如本文使用的，术语“核酸分子”是指由通过糖/磷酸酯骨架的磷酸二酯键彼此共价连接的核苷酸组成的分子。在某些实施方式中，核酸分子是DNA或RNA分子。术语“核酸分子”还包括经修饰的核酸分子，如碱基修饰、糖修饰或骨架修饰的DNA或RNA分子。
如本文使用的，术语“载体”是指经分离的核酸分子，其可用于将本文公开主题的核酸递送至细胞内部。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。
如本文使用的，术语“病毒载体”是包括来源于病毒的核酸元件的载体。病毒载体的实例包括但不限于腺相关病毒载体、甲病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体及其衍生物，例如痘病毒/逆转录病毒嵌合载体(Falkner and Holzer,2004.Curr Gene Ther 4:417-26)。所述病毒载体可以被包装到包含所述病毒核酸元件和本公开主题的核酸的病毒颗粒中，并且能够转导编码CAR和CCR受体的本公开主题的所述核酸。
如本文使用的，术语“自体的”是指来自同一个体的任何材料，该材料随后将被重新引入该个体。
如本文使用的，术语“同种异体”是指来自与该材料所引入的个体相同物种的不同成员的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不相同时，两个或两个以上的个体被认为是彼此同种异体的。
本公开的主题的其他方面在下述公开中描述，并且在本公开的主题的范围内。
5.2.CD38 CCR
CD38是一种II型45kDa糖蛋白，通常存在于细胞表面膜中。此外，CD38是一种细胞内信号传导蛋白。NK细胞主要以组成型方式表达CD38(Nagler et al.,J.Immunol.(1989)；143:3183-3191)，而CD34前体T和B淋巴细胞表现出的表达模式使得CD38分子在激活或不同功能状态下上调(Snoeck et al.,Exp.Hematol(1993)；21:1480-1486)。CD38与用于淋巴细胞功能的某些分子(例如，TCR、BCR、CD19，以及在NK细胞中与FcγRIII/CD16)的接触是信号转导和下游过程产生，例如，特异性转录程序的启动、细胞因子的分泌和淋巴细胞效应子功能的激活所必需的(Funaro et al.,Eur.J.Immunol.(1993)；23:2407-2411；Kitanaka etal.,J.Immunol.(1997)；159:184-192)。
如本文使用的，术语“CD38”是指非谱系限制的、单程II型跨膜糖蛋白，其合成并水解环腺苷5’-二磷酸-核糖(一种细胞内钙离子移动信使)。CD38在几乎所有的恶性血液肿瘤中都有强烈表达。这种蛋白质的别名是ADP-核糖基环化酶和2-磷酸-环-ADP-核糖转移酶。编码人CD38的基因位于细胞遗传学带4p15上。在某些实施方式中，人CD38由UniProt登记号P28907识别。
本公开的主题提供了CD38 CCR在各种方法中的用途，例如用于减少和/或消除细胞中CD38的表达，以及用于减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗。在某些实施方式中，CD38CCR降低和/或消除细胞的细胞表面上CD38的表达水平。
在某些实施方式中，CCR包含与CD38结合的细胞外抗原结合结构域和能够向细胞递送共刺激信号但不单独向包含CCR的细胞递送激活信号的细胞内结构域。在某些实施方式中，CCR结合人CD38多肽。在某些实施方式中，人CD38多肽包含具有UniProt登录号P28907的氨基酸序列。在某些实施方式中，人CD38多肽包含具有NCBI参考号NP_001766(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列或其片段。SEQ ID NO:1提供如下:
MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVVVLAVVVPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI[SEQ ID NO:1]
在某些实施方式中，CCR结合CD38(例如，人CD38)的细胞外部分。在某些实施方式中，CCR结合CD38(例如，人CD38)的C-端细胞外部分。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含或者是scFv。该scFv可以是人scFv、人源化scFv或鼠scFv。在某些实施方式中，scFv是鼠scFv。在某些实施方式中，scFv是人scFv。scFv可来源于融合抗体的可变重链和轻链区。在某些实施方式中，scFv来源于Fab’s(而不是来自抗体，例如从Fab文库获得)。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含或者是Fab。在某些实施方式中，Fab是交联的。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含或者是F(ab)2。
在某些实施方式中，根据本公开的主题，在免疫细胞上表达的CCR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域。在某些实施方式中，单链结合结构域是单链Fv片段。合适的CD38结合结构域记载于De Luca et al.,2018.Protein Engineering,Design andSelection 31:173-179和Drent et al.,2016.Haematologica 101:616-625中。
任何前述分子可以包含在具有异源序列的融合蛋白中，以形成CCR的细胞外抗原结合结构域。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含重链可变区(VH),其包含：包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含VH，其包含：包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ IDNO:51所示的氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含轻链可变区(VL)，其包含：包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域包含VL，其包含：包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含VH和VL，该VH包含：包含SEQID NO:49所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3；该VL包含：包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含VH和VL，该VH包含：具有SEQID NO:49所示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的CDR3；该VL包含：1包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括与SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列在其全长上至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源或一致的氨基酸序列。举例来说，第一抗原识别受体的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括与SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源或一致的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括与SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列在其全长上至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源或一致的氨基酸序列。举例来说，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括与SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源或一致的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH和VL，该VH包括与SEQ IDNO:55所示的氨基酸序列至少约80％(例如，至少约85％，至少约90％或至少约95％)一致或同源的氨基酸序列，该VL包括与SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列至少约80％(例如，至少约85％，至少约90％或至少约95％)一致或同源的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括SEQID NO:56所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括：包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列的VL。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域是包括或由SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列组成的scFv。SEQ ID NO:49-57在下表1中提供。
表1
在某些实施方式中，VH和VL通过接头连接。在某些实施方式中，接头包括SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90或SEQID NO:91所示的序列。在某些实施方式中，接头包括或由SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含重链可变区(VH)，其包括：包括SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含VH，其包括：包括SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含轻链可变区(VL),其包括：包括SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ IDNO:62所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CAR的胞外抗原结合结构域包括VL，其包括：包括SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含VH和VL，该VH包括：包括SEQID NO:58所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3，该VL包括：包括SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH和VL，该VH包括：包括SEQID NO:58所示的氨基酸序列的CDR1，包括SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列的CDR3，该VL包括：包括SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列的CDR1，包括SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括与SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列在其全长上至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源或一致的氨基酸序列。举例来说，第一抗原识别受体的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括与SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源或一致的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括与SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列在其全长上至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源或一致的氨基酸序列。举例来说，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括与SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源或一致的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH和VL，该VH包括与SEQ IDNO:64所示的氨基酸序列至少约80％(例如，至少约85％，至少约90％或至少约95％)一致或同源的氨基酸序列，该VL包括与SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列至少约80％(例如，至少约85％，至少约90％或至少约95％)一致或同源的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括SEQID NO:65所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括：包括SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列的VL。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域是包括或由SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列组成的scFv。SEQ ID NO:58-66在下表2中提供。
表2
在某些实施方式中，VH和VL通过接头连接。在某些实施方式中，接头包括SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90或SEQID NO:91所示的序列。在某些实施方式中，接头包括或由SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列组成。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含重链可变区(VH)，其包括：包括SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含VH，其包括：包括SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ IDNO:69所示的氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含轻链可变区(VL),其包括：包括SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CAR的胞外抗原结合结构域包括VL，其包括：包括SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含VH和VL，该VH包括：包括SEQID NO:67所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3，该VL包括：包括SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH和VL，该VH包括：包括SEQID NO:68所示的氨基酸序列的CDR1，包括SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR3，该VL包括：包括SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR1，包括SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括与SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列在其全长上至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源或一致的氨基酸序列。举例来说，第一抗原识别受体的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括与SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源或一致的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括与SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列在其全长上至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源或一致的氨基酸序列。举例来说，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括与SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源或一致的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH和VL，该VH包括与SEQ IDNO:73所示的氨基酸序列至少约80％(例如，至少约85％，至少约90％或至少约95％)一致或同源的氨基酸序列，该VL包括与SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列至少约80％(例如，至少约85％，至少约90％或至少约95％)一致或同源的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括SEQID NO:74所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括：包括SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列的VL。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域是包括或由SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列组成的scFv。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域是包括或由SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列组成的scFv。SEQ ID NO:67-75和103在下表3中提供。
表3
在某些实施方式中，VH和VL通过接头连接。在某些实施方式中，接头包括SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90或SEQID NO:91所示的序列。在某些实施方式中，接头包括或由SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列组成。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含重链可变区(VH)，其包括：包括SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含VH，其包括：包括SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ IDNO:78所示的氨基酸序列的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含轻链可变区(VL)，其包括：包括SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CAR的胞外抗原结合结构域包括VL，其包括：包括SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包含VH和VL，该VH包括：包括SEQID NO:76所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3，该VL包括：包括SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR1，包括SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR2，以及包括SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列或其保守修饰的CDR3。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH和VL，该VH包括：具有SEQID NO:76所示的氨基酸序列的CDR1，包括SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列的CDR3，该VL包括：包括SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列的CDR1，包括SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列的CDR2，以及包括SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括与SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列在其全长上至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源或一致的氨基酸序列。举例来说，第一抗原识别受体的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括与SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源或一致的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括与SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列在其全长上至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源或一致的氨基酸序列。举例来说，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括与SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源或一致的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH和VL，该VH包括与SEQ IDNO:82所示的氨基酸序列至少约80％(例如，至少约85％，至少约90％或至少约95％)一致或同源的氨基酸序列，该VL包括与SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列至少约80％(例如，至少约85％，至少约90％或至少约95％)一致或同源的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VH，该VH包括SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括VL，该VL包括SEQID NO:83所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域包括：包括SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列的VL。
在某些实施方式中，CCR的细胞外抗原结合结构域是包括或由SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列组成的scFv。SEQ ID NO:76-84在下表4中提供。
表4
在某些实施方式中，VH和VL通过接头连接。在某些实施方式中，接头包括SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90或SEQID NO:91所示的序列。在某些实施方式中，接头包括或由SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列组成。
与特定序列(例如SEQ ID NO:55、56、64、65、73、74、82和83)具有至少约80％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％(例如，约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)同源性或一致性的VH和/或VL氨基酸序列可包括相对于特定序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留结合靶抗原(例如，CD38)的能力。在某些实施方式中，在特定序列(例如，SEQ ID NO:55、56、64、65、73、74、82和83)中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方式中，取代、插入或缺失发生在细胞外抗原结合结构域的CDR之外的区域(例如，在FR中)。在某些实施方式中，第一抗原识别受体的胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:55、56、64、65、73、74、82和83的VH和/或VL序列，包括该序列的翻译后修饰(SEQ ID NO:55、56、64、65、73、74、82和83)。
在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域至少包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，共刺激分子选自由CD28、4-1BB、OX40、CD27、CD40、CD154、CD97、CD11a/CD18、ICOS、DAP-10、CD2、CD244、CD27和NKG2D组成的组。
在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括CD28多肽，例如CD28的细胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包含人CD28多肽(例如，人CD28的细胞内结构域或其部分)。在某些实施方式中，CD28多肽包括或者由以下氨基酸序列组成：与SEQID NO:2所示的氨基酸序列或其片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％一致或同源，和/或可任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，CD28多肽包括或者由以下组成：具有UniProt登录号P10747或NCBI参考号:NP_006130的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少约20、或至少约25、或至少约30、和/或至多约220个氨基酸。在某些实施方式中，CD28多肽包括或由SEQ ID NO:2的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200、180至220或200至220的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括CD28多肽，该CD28多肽包括或由SEQ IDNO:2的氨基酸180至220组成。SEQ ID NO:2提供如下。MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVY SKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVV VGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS[SEQ ID NO:2]
在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括CD28多肽，该CD28多肽包括或由SEQID NO:92所示的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:92提供如下。RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS[SEQ ID NO:92]
编码SEQ ID NO:2的氨基酸180-220的氨基酸序列的示例性核酸序列在SEQ IDNO:3中示出。SEQ ID NO:3提供如下。
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC[SEQ ID NO:3]
在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包含小鼠CD28的细胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CD28多肽包括或者由以下氨基酸序列组成：与具有NCBI参考号:NP_031668.3(或SEQ ID NO:4)的氨基酸序列或其片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％一致或同源，和/或可任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，CD28多肽包括或者由以下组成：SEQ ID NO:4的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、以及至多218个氨基酸。在某些实施方式中，包含在共刺激信号传导区中的CD28多肽包括或由SEQ ID NO:4的氨基酸1至218、1至50、50至100、100至150、150至218、178至218或200至218的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括CD28多肽，该CD28多肽包括或由SEQ ID NO:4的氨基酸178至218的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:4提供如下。
在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括4-1BB多肽，例如4-1BB的细胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CCR包括人4-1BB多肽(例如，细胞内结构域人4-1BB或其部分)。在某些实施方式中，4-1BB多肽包括或者由以下氨基酸序列组成：包含UniProt登录号Q07011或NCBI参考号：NP_001552的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)或其片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％一致或同源，和/或可任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，4-1BB多肽包括或由SEQ ID NO:5的连续部分的氨基酸序列组成，其长度为至少约20，或至少约30，或至少约40，或至少约50，和/或至多约50，至多约60，至多约70，至多约80，至多约90，至多约100，至多约200，或至多约255个氨基酸。在某些实施方式中，4-1BB多肽包括或由SEQ ID NO:5的氨基酸1至255、1至50、50至100、100至150、150至200、200至255或214至255的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括4-1BB多肽，该4-1BB多肽包括或由SEQ ID NO:5的氨基酸214至255的氨基酸序列组成。SEQID NO:5提供如下。
在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括4-1BB多肽，该4-1BB多肽包括或由SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:93提供如下。
RGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL[SEQ ID NO:93]
编码SEQ ID NO:5的氨基酸214-255的氨基酸序列的示例性核酸序列在SEQ IDNO:95中示出。SEQ ID NO:95提供如下。
CGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG[SEQ ID NO:95]
在某些实施方式中，CCR包括鼠4-1BB多肽(例如，细胞内结构域小鼠4-1BB或其部分)。在某些实施方式中，4-1BB多肽包括或者由以下氨基酸序列组成：与具有NCBI参考号:NP_035742的序列(SEQ ID NO:48)或其片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％一致或同源，和/或可任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，4-1BB多肽包括或者由以下组成：SEQ ID NO:48的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、和/或至多约50、至多约60、至多约70、至多约80、至多约90、至多约100、至多约200、或至多约256个氨基酸。在某些实施方式中，4-1BB多肽包括或由SEQ ID NO:48的氨基酸1至255、1至50、50至100、100至150、150至200、200至256或209至256的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括4-1BB多肽，该4-1BB多肽包括或由SEQ ID NO:48的氨基酸209至256的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:48提供如下。
在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括CD28的细胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括4-1BB的细胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CCR的细胞内结构域包括CD28的细胞内结构域或其部分，以及4-1BB的细胞内结构域或其部分。
在某些实施方式中，CCR进一步包括跨膜结构域。在某些实施方式中，CCR的跨膜结构域包括CD28多肽(例如，CD28的跨膜结构域或其部分)。在某些实施方式中，CCR的跨膜结构域包括人CD28多肽(例如，人CD28的跨膜结构域或其部分)。在某些实施方式中，CD28多肽包括或由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其片段的连续部分的氨基酸序列组成，其长度为至少约20、或至少约25、或至少约30、和/或至多约220个氨基酸。在某些实施方式中，CD28多肽包括或由SEQ ID NO:2的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200、153至179或200至220的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CCR的跨膜结构域包括CD28多肽，该CD28多肽包括或由SEQ ID NO:2的氨基酸153至179组成。
在某些实施方式中，CCR的跨膜结构域包括CD28多肽，该CD28多肽包括或由SEQ IDNO:94所示的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:94提供如下。
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV[SEQ ID NO:94]
编码SEQ ID NO:94的氨基酸序列的示例性核酸序列在SEQ ID NO:96中示出。SEQID NO:96提供如下。
ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg[SEQ ID NO:96]
在某些实施方式中，CCR的跨膜结构域包含鼠CD28多肽(例如，鼠CD28的跨膜结构域或其部分)。在某些实施方式中，CD28多肽包含或由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其片段的连续部分的氨基酸序列组成，其长度为至少约20、或至少约25、或至少约30、或至少约40、或至少约50、和/或至多约218个氨基酸。在某些实施方式中，CD28多肽包括或者由SEQID NO:4的氨基酸1至218、1至50、50至100、100至150、150至218、151至177或200至218的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CCR的跨膜结构域包括CD28多肽，该CD28多肽包括或由SEQ ID NO:4的氨基酸151至177组成。
在某些实施方式中，CCR的跨膜结构域包括4-1BB多肽(例如，4-1BB的跨膜结构域或其部分)。在某些实施方式中，CCR的跨膜结构域包括人4-1BB多肽(例如，人4-1BB的跨膜结构域或其部分)。在某些实施方式中，4-1BB多肽包括或由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的连续部分的氨基酸序列组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、和/或至多约50、至多约60、至多约70、至多约80、至多约90、至多约100、至多约200、或至多约255个氨基酸。在某些实施方式中，4-1BB多肽包括或由SEQ ID NO:5的氨基酸1至255、1至50、50至100、100至150、150至200、187至213或200至255的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CCR的跨膜结构域包括4-1BB多肽，该4-1BB多肽包括或由SEQ ID NO:5的氨基酸187至213的氨基酸序列组成。
在某些实施方式中，CCR包括：a)与CD38(例如人CD38)结合的细胞外抗原结合结构域，和b)包括4-1BB多肽(例如人4-1BB多肽，如4-1BB(例如人4-1BB)的细胞内结构域或其部分)的细胞内结构域。在某些实施方式中，CCR进一步包括跨膜结构域，其包括4-1BB多肽(例如，人4-1BB多肽，例如，4-1BB(例如，人4-1BB)的跨膜结构域或其部分)。
在某些实施方式中，CCR包含a)与CD38(例如人CD38)结合的胞外抗原结合结构域，和b)包含CD28多肽(例如人CD28多肽，如CD28(例如人CD28)的细胞内结构域或其部分)的细胞内结构域。在某些实施方式中，CCR进一步包含跨膜结构域，其包括CD28多肽(例如，人CD28多肽，例如，CD28(例如，人CD28)的跨膜结构域或其部分)。
在某些实施方式中，CCR包含a)与CD38(例如人CD38)结合的胞外抗原结合结构域，和b)包含CD28多肽(例如人CD28多肽，如CD28(例如人CD28)的细胞内结构域或其部分)和4-1BB多肽(例如人4-1BB多肽，如4-1BB(例如人4-1BB)的细胞内结构域或其部分)的细胞内结构域。在某些实施方式中，CCR进一步包含跨膜结构域，其包括CD28多肽(例如，人CD28多肽，如CD28的跨膜结构域(例如人CD28)或其部分)和4-1BB多肽(例如，人4-1BB多肽，如4-1BB(例如，人4-1BB)的跨膜结构域或其部分)。
在某些实施方式中，CCR包含a)与CD38(例如人CD38)结合的胞外抗原结合结构域，和b)包含CD28多肽(例如人CD28多肽，如CD28(例如人CD28)的细胞内结构域或其部分)和4-1BB多肽(例如人4-1BB多肽，如4-1BB(例如人4-1BB)的细胞内结构域或其部分)的细胞内结构域。在某些实施方式中，CCR进一步包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含CD28多肽(例如，人CD28多肽，如CD28的跨膜结构域(例如人CD28)或其部分)。
在某些实施方式中，CCR包含a)与CD38(例如人CD38)结合的胞外抗原结合结构域，和b)包含CD28多肽(例如人CD28多肽，如CD28(例如人CD28)的细胞内结构域或其部分)和4-1BB多肽(例如人4-1BB多肽，如4-1BB(例如人4-1BB)的细胞内结构域或其部分)的细胞内结构域。在某些实施方式中，CCR进一步包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含4-1BB多肽(例如，人4-1BB多肽，如4-1BB(例如，人4-1BB)的跨膜结构域或其部分)。
在某些实施方式中，CCR的细胞内共刺激信号传导结构域在通过CAR的CD3ζ结构域与抗原结合时，刺激或增强包含所述CCR的免疫细胞的有效应答。所述细胞内共刺激信号传导结构域可以包括CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40、2B4、NKG2D的细胞内部分或其相关部分。所述细胞内共刺激信号传导结构域可包括人CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40、2B4、NKG2D的细胞内部分或其相关部分。作为可替代或可附加地，所述细胞内共刺激信号传导结构域可以包含来自非人物种，例如鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同蛋白质。作为可替代或可附加地，所述细胞内共刺激信号传导结构域可以包括与人CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40、2B4、NKG2D的细胞内部分至少80％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致的结构域。
在某些实施方式中，CCR包含人4-1BB的细胞内共刺激结构域和CD28的共刺激结构域。在某些实施方式中，CCR包含人4-1BB的细胞内共刺激结构域和人CD28的共刺激结构域。
在某些实施方式中，本文公开的方法提供了包含CD38 CCR和CD38表达减少和/或消除的细胞及其组合物。在某些实施方式中，包含抗原识别受体和CD-38CCR的细胞对抗原单一阳性的细胞表现出实质的细胞溶解活性。在某些实施方式中，与针对第一抗原单一阳性的细胞相比，包含抗原识别受体和CD-38CCR的细胞针对第一抗原和第二抗原均阳性的细胞表现出更高程度的细胞溶解活性。在某些实施方式中，包含第一抗原识别受体和CD38CCR的细胞对第一抗原单一阳性的细胞基本上不表现或表现出可忽略的细胞溶解活性。
5.3.细胞
本文公开的主题提供了细胞，其包括：a)CD38 CCR(例如，5.2节中公开的CD38CCR)和b)与抗原结合的抗原识别受体。在某些实施方式中，抗原识别受体结合不是CD38的抗原。在某些实施方式中，该细胞表现出对抗原单一阳性细胞的实质的细胞溶解活性。
在某些实施方式中，细胞选自淋巴系细胞和髓系细胞。在某些实施方式中，细胞是免疫应答性细胞。在某些实施方式中，免疫应答性细胞是淋巴系的细胞。
在某些实施方式中，细胞是淋巴系的细胞。淋巴系的细胞可提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来物的检测、宿主中外来细胞的检测等。淋巴系的细胞的非限制性示例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、树突状细胞、可从中分化出淋巴细胞的干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞(例如，胚胎干细胞)。
在某些实施方式中，细胞是T细胞。T细胞可以是胸腺中成熟的淋巴细胞，主要负责细胞介导的免疫。T细胞参与适应性免疫系统。本公开主题的T细胞可以是任何类型的T细胞，包括但不限于：辅助性T细胞；细胞毒性T细胞；记忆T细胞(包括中枢记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)；以及两种效应性记忆T细胞：例如，TEM细胞和TEMRA细胞；调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)；肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；自然杀伤T细胞；粘膜相关恒定T细胞和γδT细胞。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤T细胞)是能够诱导受感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞亚群。患者自身的T细胞可以通过引入抗原识别受体(例如CAR或TCR)进行基因修饰，以靶向特定抗原。T细胞可以是CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。在某些实施方式中，T细胞是CD4+ T细胞。在某些实施方式中，T细胞是CD8+ T细胞。在某些实施方式中，CD8+ T细胞不依赖于CD4。在某些实施方式中，T细胞衍生自诱导性多能干细胞(iPSC)。在某些实施方式中，T细胞是不依赖于CD4的CD8+ T细胞，并且CD8+T细胞衍生自iPSC。
在某些实施方式中，细胞是NK细胞。自然杀伤(NK)细胞可以是淋巴细胞，是细胞介导免疫的一部分，并且在先天性免疫应答中发挥作用。NK细胞不需要事先激活，就可以对靶细胞产生细胞毒性效果。
本公开主题的人类淋巴细胞类型包括但不限于外周供者淋巴细胞，例如在Sadelain,M.,et al.2003Nat Rev Cancer 3:35-45(公开了经基因改造以表达CAR的外周供者淋巴细胞)、Morgan,R.A.,et al.2006Science 314:126-129(公开了经基因改造以表达全长的肿瘤抗原识别T细胞受体复合物(包括α和β异二聚体))、Panelli,M.C.,etal.2000J Immunol164:495-504；Panelli,M.C.,et al.2000J Immunol 164:4382-4392(公开了肿瘤活检中衍生自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物)、以及Dupont,J.,etal.2005Cancer Res65:5417-5427；Papanicolaou,G.A.,et al.2003Blood 102:2498-2505(公开了使用人工抗原呈递细胞(AAPC)或脉冲树突状细胞的选择性体外扩增抗原特异性外周血白细胞)中所公开那些。
在某些实施方式中，细胞(如T细胞)是自体的。在某些实施方案中，细胞(如T细胞)为非自体的。在某些实施方式中，细胞(如T细胞)是异体的。在某些实施方案中，细胞(如T细胞)在体外来源于工程化的祖细胞或干细胞。
在某些实施方式中，细胞是髓系的细胞。髓系的细胞的非限制性示例包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞和可从中分化骨髓细胞的干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。
本公开主题还提供了表达本文公开的CAR和CCR的遗传修饰的免疫细胞。在某些实施方式中，免疫细胞可以是能够表达本文公开的CAR和CCR的任何造血来源的细胞。在某些实施方式中，细胞是T细胞或NK细胞，当通过CAR和CCR与它们各自的靶标结合而被激活时，其变成细胞毒性细胞，杀死表达CAR和CCR靶标的细胞。在某些实施方式中，表达CAR和CCR靶标的细胞是癌细胞、被例如病毒感染的细胞或以其他方式受损的细胞。
在某些实施方式中，由免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)表达的CAR包括抗原特异性结合结构域、CD28跨膜结构域、共刺激CD28细胞内结构域和细胞内CD3ζ信号传导结构域。在某些实施方式中，由免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)表达的CCR包括抗原特异性结合结构域、CD28跨膜结构域、共刺激CD28细胞内结构域和共刺激4-1BB细胞内结构域。
5.3.1.抗原识别受体
抗原识别受体与抗原结合。抗原可以是肿瘤抗原或病原体抗原。在某些实施方式中，抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方式中，抗原识别受体是TCR样融合分子。在某些实施方式中，抗原识别受体是T细胞受体(TCR)。
在某些实施方式中，包含与抗原结合的抗原识别受体和CD38 CCR的细胞对抗原单一阳性的细胞表现出实质的细胞溶解活性。
在某些实施方式中，抗原识别受体以高结合亲和力与抗原结合。在某些实施方式中，抗原识别受体以约1×10-8M或更小、或约1×10-9M或更小、或约1×10-10M或更小的解离常数(Kd)与抗原结合。
在某些实施方式中，抗原识别受体以低结合亲和力与抗原结合。在某些实施方式中，抗原识别受体以约1×10-8M或更高、或约1×10-7μM或更高、或约1×10-6M或更高，或约1×10-5M或更高的解离常数(Kd)与抗原结合。
5.3.1.1.抗原
在某些实施方式中，抗原与肿瘤抗原结合。任何肿瘤抗原(抗原肽)均可用于本文所述的肿瘤相关实施方式中。抗原来源包括但不限于癌蛋白。抗原可表达为肽或完整蛋白质或其部分。完整蛋白质或其部分可以是天然的或诱变的。在某些非限制性实施方式中，抗原是磷酸化抗原。肿瘤抗原的非限制性示例包括CD19、碳酸酐酶IX(CAIX)、癌胚抗原(CEA)、CD8、CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CLL1、CD34、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、CD123、CD44V6、巨细胞病毒(CMV)感染细胞的抗原(例如细胞表面抗原)、ENPP3、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、受体酪氨酸蛋白激酶Erb-B2、Erb-B3、Erb-B4、叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-α，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人表皮生长因子受体2(HER-2)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)，κ-轻链，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis Y(LeY)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)，粘蛋白16(MUC16)，粘蛋白1(MUC1)，间皮素(MSLN)，ERBB2，MAGEA3，p53，MART1，GP100，蛋白酶3(PR1)，酪氨酸酶，存活素，hTERT，EphA2，NKG2D配体，癌睾丸抗原NY-ESO-1，癌胎抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，ROR1，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，Wilms肿瘤蛋白(WT-1)，BCMA，GPRC5D，FcRL5，ITGB7，NKCS1，EGF1R，EGFR-VIII，CD99，CD70，ADGRE2，CCR1，LILRB2，PRAME，CD48，P2RY10，CD70，BOB1，CLEC12A，CCR1，LILRB2，CD5，CD38，CS-1，Lewis抗原(LeY)和ERBB。在某些实施方式中，本文公开的由免疫细胞表达的CAR和/或CCR的抗原特异性结合结构域可以靶向在肿瘤细胞表面表达的任何肿瘤抗原。在某些实施方式中，肿瘤是血液肿瘤。
在某些实施方式中，抗原在肿瘤组织或肿瘤细胞上表达。在某些实施方式中，肿瘤是血液癌症。在某些实施方式中，血液癌症选自多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、华氏巨球蛋白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、淋巴瘤和急性髓系白血病(AML)组成的组。在某些实施方式中，肿瘤是多发性骨髓瘤。在某些实施方式中，抗原是磷酸化抗原。在某些实施方式中，所述抗原选自由BCMA、GPRC5D、FcRL5、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD48、P2RY10、CD44v6、CD56、CD70、CD123、BCMA、CS-1、CD138、BCMA、κ轻链、Lewis-Y(LeY)、NY-ESO-1、BOB1、ADGRE2、CLEC12A、CCR1、LILRB2、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD56、BCMA、CS-1、CD138、Lewis抗原(LeY)、WT-1、Wilms’肿瘤抗原和ITGB7组成的组。在某些实施方式中，抗原是BCMA。在某些实施方式中，抗原在多发性骨髓瘤(MM)组织上表达。
在某些实施方式中，抗原在实体肿瘤组织或实体肿瘤细胞上表达。实体瘤包括肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
在某些实施方式中，实体瘤是表达CD38的实体瘤。在某些实施方式中，实体瘤与CD38的过度表达有关。在某些实施方式中，实体瘤选自由乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌和胰腺癌，肝细胞癌(HCC)和纤维板层样癌组成的组。
在某些实施方式中，抗原在非肿瘤细胞中不表达或以不可检测的水平表达。
在某些实施方式中，抗原特异性结合结构域靶向CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD48、P2RY10、CD44v6、CD56、CD70、CD123、BCMA、CS-1、CD138、κ轻链、Lewis-Y(LeY)、NY-ESO-1、BOB1、ADGRE2、CLEC12A、CCR1、LILRB2和Wilms肿瘤基因中的一个或多个。
CD5编码富含半胱氨酸的清道夫受体超家族成员，是一种I型跨膜糖蛋白，存在于胸腺细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群的表面。CD5是B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、恶性T细胞和胸腺癌的标志物。CD5也可能在淋巴瘤上表达，包括非典型胸腺瘤、伯基特淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和脾淋巴瘤。
CD7是一种细胞表面糖蛋白，存在于胸腺细胞和成熟T细胞上。CD7是T细胞急性淋巴细胞白血病和其他恶性未成熟T细胞、干细胞淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病、唐氏综合征相关的短暂骨髓增生性疾病和急性髓细胞白血病的标志物。
CD10是一种具有中性金属内肽酶活性的细胞表面酶。CD10也被称为CALLA(常见的急性淋巴细胞白血病抗原)。CD10是常见急性淋巴细胞白血病以及伯基特淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和滤泡生发中心淋巴瘤的标志物。
CD19是一种95kd的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。CD19被归类为I型跨膜蛋白，具有单一跨膜结构域、细胞质C端和细胞外N端。CD19是B细胞淋巴瘤和白血病的标志物。
CD20是一种嵌入膜的表面分子，在B细胞发育和分化为浆细胞中发挥作用。CD20是B细胞淋巴瘤、pre B急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤、梭形细胞胸腺瘤和结节性淋巴细胞为主的霍奇金氏淋巴瘤的标志物。
CD22是免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白成员，可结合α2,6-连接的唾液酸携带配体。CD22是毛细胞白血病、pre B急性淋巴细胞白血病、母细胞浆细胞样树突细胞肿瘤的标志物。
CD30是肿瘤坏死因子受体家族的细胞膜蛋白。CD30是间变性大细胞淋巴瘤、经典型霍奇金氏淋巴瘤和原发性纵隔大B细胞淋巴瘤的标志物。
CD33或唾液酸结合Ig样凝集素3(Siglec-3)是包含跨膜受体的免疫球蛋白结构域。CD33在骨髓细胞和一些淋巴细胞上表达。CD33是急性髓系白血病、间变性大细胞淋巴瘤、慢性髓系白血病、慢性髓单核细胞白血病、髓系/粒细胞肉瘤和伯基特淋巴瘤的标志物。
CD34是一种可作为细胞间粘附因子的跨膜磷酸糖蛋白。CD34是急性髓系细胞白血病的标志物。
CD41是一种整合素α链IIb蛋白，在人类中由ITGA2B基因编码。α链2b与整联蛋白β3一起形成在血小板中表达的纤维蛋白原受体。CD41是急性巨核细胞白血病(AML-M7)的标志物。
CD48是一种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-AP)，发现于免疫细胞如NK细胞、T细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞的表面，并参与这些细胞中的粘附和激活途径。已知CD48在多发性骨髓瘤细胞和B细胞源的其他癌症(例如非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、华氏巨球蛋白血症、原发性/系统性淀粉样变性和滤泡性淋巴瘤)上表达。
P2RY10或P2Y受体家族成员10是一种嘌呤能G蛋白偶联受体，优先被腺苷和尿苷核苷酸激活。据报道，P2RY10是一种肿瘤微环境相关的基因和转移性黑色素瘤的生物标志物。
CD38是一种46-kDa的II型跨膜糖蛋白。CD38在包括MM、CLL、all、AML和淋巴瘤在内的几乎所有血液恶性肿瘤中均高度表达，因此可用作广泛的血液恶性肿瘤相关靶点。
CD44，也称为归巢细胞粘附分子(HCAM)或淋巴细胞归巢受体，是一种细胞表面糖蛋白，参与细胞间相互作用、细胞粘附和迁移。CD44的剪接变体，称为CD44v6，是非霍奇金氏淋巴瘤的标志物。
CD56，也称为神经细胞粘附分子(NCAM)，是一种在神经元、神经胶质细胞和骨骼肌细胞表面上表达的嗜同性(homophilic)结合糖蛋白。CD56是NK淋巴瘤的标志物。
CD70是一种细胞因子，属于肿瘤坏死因子(TNF)配体家族，并且是TNFRSF27/CD27的配体。CD70在激活的T和B淋巴细胞表面上表达。CD70是皮肤T细胞淋巴瘤的标志物。
CD123或白细胞介素(IL)-3受体，是一种糖蛋白，它与β共同亚基(Commonsubunit)一起形成异二聚体IL3受体。CD123在浆细胞样单核细胞上表达。CD123是白血病干细胞的标志物。
B细胞成熟抗原(BCMA)是一种TNF受体超家族的细胞表面受体，识别B细胞激活因子(BAFF)。BCMA是B细胞白血病、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的标志物。
CS-1，细胞表面受体CD2家族的成员，在NK细胞和激活的B细胞上表达。CS-1，也称为CD319或SLAMF7，是恶性浆细胞，尤其是恶性骨髓瘤浆细胞的标志物。
κ轻链由2号染色体上的免疫球蛋白κ基因座编码，并在B细胞中表达。κ轻链是B细胞淋巴瘤和肿瘤性浆细胞如多发性骨髓瘤的标志物。CD138也称为多配体蛋白聚糖，是一种跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。CD138是角化棘皮瘤、骨髓瘤、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤和脓胸相关淋巴瘤的标志物。
LeY是一种寡糖，在许多上皮癌和血液恶性肿瘤(包括AML)中过度表达，但在正常健康组织中表达有限。
NY-ESO-1，或癌症/睾丸抗原1B，是一种与任何已知蛋白质都没有同源性的蛋白质。NY-ESO-1属于一个不断扩大的免疫原性睾丸抗原家族，在人类癌症中以谱系非特异性方式异常表达。NY-ESO-1是多发性骨髓瘤的标志物。
BOB1是一种定位于细胞内的转录因子，但呈递HLA的Bob1衍生多肽可接近T细胞受体(TCR)的细胞表面，因此可以被T细胞识别。BOB1是多种血液恶性肿瘤如ALL、CLL、MCL和MM的标志物。
ADGRE2，也称为粘附G蛋白偶联受体E2或含Egf样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)是一种人髓系限制性粘附G蛋白偶联受体。ADGRE2是急性髓系白血病的标志物。
CLEC12A，或C型凝集素结构域家族12成员，是C型凝集素/C型凝集素样结构域(CTL/CTLD)超家族的成员。该家族成员共享共同的蛋白质折叠，并具有不同的功能，如细胞粘附、细胞间信号传导、糖蛋白周转以及在炎症和免疫应答中的作用。CLEC12A是急性髓系白血病的标志物。
CCR1或CD191是β趋化因子受体家族的成员，属于G蛋白偶联的7跨膜受体家族。CCR1是多发性骨髓瘤的标志物。
LILRB2也称为白细胞免疫球蛋白样受体B2或CD85d，是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员。这种受体在免疫细胞上表达。LILRB2在NK细胞、T细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞和嗜酸性粒细胞上表达。LILRB2是急性髓系白血病的标志物。
Wilms肿瘤基因(WT1)编码包含DNA结合蛋白的锌指结构域。WT1在大多数急性髓细胞、急性淋巴细胞和慢性髓细胞白血病中高水平表达。
磷酸抗原包括但不限于异戊烯焦磷酸(IPP)。由于甲羟戊酸途径失调，IPP在癌细胞中过量产生(Gober et al.,2003.J Exp Med 197:163-168)。
在某些实施方式中，靶向两种抗原而不是一种抗原可以解决抗原逃逸和/或抗原丢失复发。因此，本公开的主题提供了表达CAR和CCR的免疫细胞，其中CAR包含与第一抗原结合的抗原特异性结合结构域，CCR包含与第二抗原结合的抗原特异性结合结构域，其中第一抗原不同于第二抗原。应当理解，第一抗原和第二抗原是不同的蛋白质，而不是同一蛋白质的不同表位。在某些实施方式中，第一抗原是CD19，第二抗原是CD38。
在某些实施方式中，抗原是病原体抗原。在某些实施方式中，抗原是在病毒上表达的病原体抗原。病毒的非限制性示例包括逆转录病毒科(Retroviridae)(如人类免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称为HDTV-III、LAVE或HTLV-III/LAV或HIV-III；以及其他分离物，例如HIV-LP；微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(如引起胃肠炎的病毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正黏病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒和Naira病毒)；沙状病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；呼肠病毒科(Reoviridae)(如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如丁型肝炎的病原体(被认为是乙肝病毒的缺损卫星病毒)、非甲、非乙型肝炎的病原体(1类＝肠道传播；2类＝非肠道传播(即丙型肝炎)；诺沃克病毒和相关病毒，以及星状病毒)。
在某些实施方式中，抗原是在细菌上表达的抗原。细菌的非限制性示例包括巴氏杆菌属(Pasteurella)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌种(Pseudomonas species)和沙门氏菌种(Salmonellaspecies)。传染性细菌的具体示例包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、军团菌属(Legionella)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophilia)、分枝杆菌属sps.(Mycobacteria sps.)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、麻风分枝杆菌(M.leprae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、产单核细胞李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)、链球菌属(Streptococcus)(viridans组)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属(厌氧sps.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病弯曲杆菌属sp.(Campylobacter sp.)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、肠球菌属sp.(Enterococcussp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus antracis)、白喉杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌属sp.(corynebacterium sp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、梭菌属spp.(Clostridium spp.)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德杆菌病(Pasturella multocida)、拟杆菌sp.(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白螺旋体(Treponemapalladium)、细弱螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)、立克次氏体(Rickettsia)和以色列放线菌(Actinomyces israelii)。支原体(Mycoplasma)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、白喉棒状杆菌(Corynobacteria diphtheriae)、汉氏巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴通体(Bartonella quintana)、贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)、衣原体(chlamydia)、贺氏菌(shigella)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、产单核细胞李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、支原体属spp.(Mycoplasma spp.)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、疏螺旋体属(Borrelia)、弗兰西氏菌属(Francisella)、马尔他布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)和变形杆菌(Proteus)。
在某些实施方式中，抗原是在真菌上表达的病原体抗原。真菌的非限制性示例包括伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、Acremoniumfalciforme、基利枝顶孢(A.kiliense)、瑞塞菲枝顶孢(A.recifei)、Ajellomyces dermatitidis、A.capsulata、曲霉菌属spp.(Aspergillus spp.)(如黄曲霉菌(A.flavus)、烟曲霉(A.fumigatus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉菌(A.niger)和土曲霉菌(A.terreus))、念珠菌属spp.(Candidaspp.)(如白念珠菌(C.albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、季也蒙念珠菌(C.guillermondii)、克柔念珠菌(C.krusei)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、C.ke yr,C.tropicalis)、新型隐球菌(C.neoformans)、雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)、伊蒙微小菌(Emmonsia parva)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、皮炎外瓶霉(Exophialia dermitidis)、威尼克外瓶霉(E.werneckii)、甄氏外瓶霉(E.jeanselmei)、棘状外瓶霉(E.spinifera)、E.richardsiae、新型线黑粉菌(Filobasidiella neoformans)、紧密着色真菌(Fonsecaea compacta)、裴氏着色霉(F.pedrosoi)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、Leptoshaeriasenegarlensis、足马杜拉分枝菌(Madurella mycetomatis)、稻瘟病菌(M.grisea)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、微孢子菌属spp.(Microsporum spp.)、罗萨梯新龟甲形菌(Neotestudina rosatii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、疣状瓶霉(Phialophora verrucosa)、何德毛结节菌(Piedraia hortae)、卡氏肺孢菌(Pneumocystis carinii)、波氏假性阿利什霉(Pseudallescheria boydii)、罗麦卢棘壳孢(Pyrenochaeta romeroi)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、发癣菌属spp.(Trichophyton spp.)、白吉利毛孢子菌(Trichosporon beigelii)和斑替木丝霉(Xylohypha bantiana)。
在某些实施方式中，病原体抗原是存在于巨细胞病毒(CMV)中的病毒抗原、存在于爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)中的病毒抗原、存在于人类免疫缺陷病毒(HIV)中的病毒抗原、存在于流感病毒中的病毒抗原或存在于SARS冠状病毒中的病毒抗原。
5.3.1.2.嵌合抗原受体(CAR)
在某些实施方式中，抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)。CAR是工程化受体，其将感兴趣的特异性移植或赋予免疫效应细胞。CAR可用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上；通过例如逆转录病毒载体转移它们的编码序列。
CAR有3代。“第一代”CAR通常由与靶抗原结合的细胞外抗原结合结构域(例如scFv)组以及胞内信号传导结构域组成。在某些实施方式中，CAR进一步包括跨膜结构域。“第一代”CAR可以提供新的(de novo)抗原识别，并通过单个融合分子中的CD3ζ链信号传导结构域激活CD4+和CD8+ T细胞，不依赖HLA介导的抗原呈递。在某些实施方式中，“第一代CAR”是指含CAR的单一细胞信号传导结构域。“第二代”CAR包括共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD27、CD40和NKG2D)的信号传导结构域至CAR的细胞内信号传导结构域，以向T细胞提供共刺激信号。“第二代”CAR包括提供共刺激(如CD28或4-1BB)和激活(CD3ζ)的那些CAR。在某些实施方式中，“第二代CAR”是指包括细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域的CAR。“第三代”CAR包括提供多重共刺激(例如CD28和4-1BB)和激活(CD3ζ)的CAR。在某些实施方式中，第三代CAR”是指包括细胞内信号传导结构域和两个共刺激信号传导结构域的CAR。在某些实施方式中，CAR包含CD3ζ细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，CAR包含人CD3ζ细胞内信号传导结构域或其变体。
在某些实施方式中，抗原识别受体是CAR，其包含与抗原结合的细胞外抗原结合结构域(例如，5.3.1.1部分公开的那些或表5中公开的那些)和胞内信号结构域。在某些实施方式中，CAR进一步包含跨膜结构域。在某些实施方式中，CAR进一步包括铰链/间隔区。
在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域以高结合亲和力与抗原结合。在某些实施方式中，CAR的胞外抗原结合结构域以约1×10-8M或更低、或约1×10-9M或更低或约1×10-10M或更低解离常数(Kd)与抗原结合。
在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域以低结合亲和力与抗原结合。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域以约1×10-8M或更高、或约1×10-7M或更高、约1×10-6M或更高或约1×10-6M或更高的解离常数(Kd)与抗原结合。
细胞外抗原结合结构域(例如，在scFv中)的结合可通过例如酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、FACS分析法、生物测定(例如，生长抑制)、或Western Blot测定法来确认。这些测定法中的每一种通常通过使用感兴趣的复合物特异性的标记试剂(例如，抗体或scFv)来检测具体感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，scFv可被放射性标记并用于放射免疫分析法(RIA)(参见，例如，Weintraub,B.PrinciplesofRadioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,TheEndocrine Society,March,1986，其通过引用并入本文)。放射性同位素可以通过使用γ计数器或闪烁计数器或放射自显影等手段进行检测。在某些实施方式中，用荧光标记物标记CAR的细胞外抗原结合结构域。荧光标记物的非限制性示例包括绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite和mKalama1)、青色荧光蛋白(例如，ECFP、Cerulean和CyPet)和黄色荧光蛋白(例如，YFP、Citrine、Venus和YPet)。
细胞外抗原结合结构域可以包含或者是scFv、Fab(可任地，是交联的)或F(ab)2。在某些实施方式中，任何前述分子可以被包含在具有异源序列的融合蛋白中，以形成细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含或者是scFv。在某些实施方式中，scFv是人scFv。在某些实施方式中，scFv是人源化scFv。在某些实施方式中，scFv是鼠scFv。
在某些实施方式中，免疫细胞上表达的CAR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段。在某些实施方式中，免疫细胞上表达的CAR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域(例如，单链Fv片段)，免疫细胞上表达的CCR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域(例如，单链Fv片段)。表5提供了单链结合结构域的非限制性示例。
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在某些实施方式中，单链结合结构域是靶向CD19的结合结构域。靶向CD19的结合结构域的示例来自于CD19的小鼠杂交瘤FMC-63(Kochenderfer et al.,2010.Blood 116:4099-4102)。其他合适的CD19结合结构域记载于Alabanza et al.,2017.Mol Therapy 25:2452-2465和Bejcek et al.,1995.Cancer Res 55:2346-2351中。
在某些实施方式中，抗原识别受体是包含与BCMA结合的细胞外抗原结合结构域的CAR。在某些实施方式中，CAR是在国际专利公开号WO16/090320中公开的以BCMA为靶标的CAR，该文件通过引用整体并入本文中。
在某些实施方式中，抗原识别受体是包含与CD38结合的细胞外抗原结合结构域的CAR。
在某些实施方式中，CAR包含跨膜结构域。不同的跨膜结构域产生不同的受体稳定性。抗原识别后，受体聚集，信号传递至细胞。根据本公开的主题，第一抗原识别受体的跨膜结构域可包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD40多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD84多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40多肽、NKG2D多肽、合成多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合的天然或经修饰的跨膜结构域。
在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CD28多肽。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CD8多肽。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含4-1BB多肽。
在某些实施方式中，CAR进一步包含将细胞外抗原结合结构域连接至跨膜结构域的铰链/间隔区。铰链/间隔区可以足够柔性，以允许抗原结合结构域在不同方向定向，从而促进抗原识别。在某些实施方式中，CAR的铰链/间隔区包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD40多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD84多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40多肽、NKG2D多肽、合成多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合的的天然或经修饰的铰链区。铰链区/间隔区可以是来自IgG1的铰链区，或免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分，CD28多肽的一部分(例如，SEQ ID NO:2的一部分)，CD8多肽的一部分，与任何前述至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％同源或一致的变体，或合成的间隔子序列。
在某些实施方式中，CAR包含铰链/间隔区，该铰链/间隔区包含CD28多肽的天然或经修饰的铰链区。
在某些实施方式中，铰链/间隔区位于细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40多肽、NKG2D多肽、合成多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合。在某些实施方式中，跨膜结构域包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40多肽、NKG2D多肽、合成多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合。
在某些实施方式中，跨膜结构域和铰链/间隔区源自于相同的分子。在某些实施方式中，跨膜结构域和铰链/间隔区源自于不同的分子。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD28多肽，跨膜结构域包含CD28多肽。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD28多肽，跨膜结构域包含CD28多肽。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD84多肽，跨膜结构域包含CD84多肽。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD166多肽，跨膜结构域包含CD166多肽。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD8a多肽，跨膜结构域包含CD8a多肽。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD8b多肽，跨膜结构域包含CD8b多肽。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD28多肽，跨膜结构域包含ICOS多肽。
在某些实施方式中，CAR包含细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ多肽。CD3ζ可以激活或刺激细胞(例如淋巴谱系的细胞，如T细胞)。野生型(“天然”)CD3ζ包含三个功能性免疫受体基于酪氨酸的激活基序(ITAM)、三个功能性富含碱性富集段(basic-rich stretch，BRS)区域(BRS1、BRS2和BRS3)。抗原结合后，CD3ζ向细胞(例如淋巴谱系的细胞，如T细胞)传递激活信号。CD3ζ链的细胞内信号传导结构域是内源性TCR信号的初级传递者。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含天然CD3ζ。在某些实施方式中，天然CD3ζ包含或由以下氨基酸序列组成：与具有NCBI参考号：NP_932170(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％一致或同源，和/或可任选包含至多一个或至多两个或至少三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，CD3ζ多肽包含或由SEQ ID NO:6的连续部分的氨基酸序列组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、以及至多约164个氨基酸。在某些实施方式中，天然CD3ζ包含或由SEQ ID NO:6的氨基酸1至164、1至50、50至100、52至164、100至150或150至164组成。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含天然CD3ζ，其包含或由SEQ ID NO:6的氨基酸52至164组成。SEQ ID NO:6提供如下：
在某些实施方式中，天然CD3ζ包含或由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％一致或同源的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:7提供如下：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR[SEQ ID NO:7]
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含经修饰的CD3ζ多肽。在某些实施方式中，经修饰的CD3ζ多肽包含一个、两个或三个ITAM。在某些实施方式中，经修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1。在某些实施方式中，天然ITAM1包含或由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成。
QNQLYNELNLGRREEYDVLDKR[SEQ ID NO:8]
编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的示例性核酸序列在下文提供的SEQ ID NO:9中示出。
CAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGA[SEQ ID NO:9]
在某些实施方式中，经修饰的CD3ζ多肽包含含有一个或多个功能缺失突变的ITAM1变体。在某些实施方式中，ITAM1变体包含或由两个功能缺失突变组成。在某些实施方式中，一个或多个(例如，两个)功能缺失突变中的每一个包括ITAM1中酪氨酸残基的突变。在某些实施方式中，ITAM1变体由两个功能缺失突变组成。在某些实施方式中，ITAM1变体包含或由下文提供的SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成。
QNQLFNELNLGRREEFDVLDKR[SEQ ID NO:10]
编码SEQ ID NO:10的氨基酸序列的示例性核酸序列在下文提供的SEQ ID NO:11中示出。
CAGAACCAGCTCTTTAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTTCGATGTTTTGGACAAGAGA[SEQ ID NO:11]
在某些实施方式中，经修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM2。在某些实施方式中，天然ITAM2包含或由下文提供的SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成。
QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK[SEQ ID NO:12]
编码SEQ ID NO:12的氨基酸序列的示例性核酸序列在下文提供的SEQ ID NO:13中示出。
CAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAA[SEQ ID NO:13]
在某些实施方式中，经修饰的CD3ζ多肽包含ITAM2变体。在某些实施方式中，ITAM2变体包含或由一个或多个功能缺失突变组成。在某些实施方式中，ITAM2变体包含或由两个功能缺失突变组成。在某些实施方式中，一个或多个(例如两个)功能缺失突变中的每一个包括ITAM2中酪氨酸残基的突变。在某些实施方式中，ITAM1变体由两个功能缺失突变组成。在某些实施方式中，ITAM2变体包含或由下文提供的SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列组成。
QEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMK[SEQ ID NO:14]
编码SEQ ID NO:14的氨基酸序列的示例性核酸序列在下文提供的SEQ ID NO:15中示出。
CAGGAAGGCCTGTTCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTTCAGTGAGATTGGGATGAAA[SEQ ID NO:15]
在某些实施方式中，经修饰的CD3ζ多肽包含天然的ITAM3。在某些实施方式中，天然ITAM3包含或由下文提供的SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成。
HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ[SEQ ID NO:16]
编码SEQ ID NO:16的氨基酸序列的示例性核酸序列在下文提供的SEQ ID NO:17中示出。
CACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAG[SEQ ID NO:17]
在某些实施方式中，经修饰的CD3ζ多肽包含ITAM3变体。在某些实施方式中，ITAM3变体包含或由两个功能缺失突变组成。在某些实施方式中，一个或多个(例如，两个)功能缺失突变中的每一个包含ITAM3中酪氨酸残基的突变。在某些实施方式中，ITAM3变体包含或由两个功能缺失突变组成。在某些实施方式中，ITAM3变体包含或由下文提供的SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成。
HDGLFQGLSTATKDTFDALHMQ[SEQ ID NO:18]
编码SEQ ID NO:18的氨基酸序列的示例性核酸序列在下文提供的SEQ ID NO:19中示出。
CACGATGGCCTTTTCCAGGGGCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTTCGACGCCCTTCACATGCAG[SEQ ID NO:19]
国际专利申请公开号WO2019/133969中公开了各种经修饰的CD3ζ多肽和包含经修饰的CD3ζ多肽的CAR，该文件通过引用整体并入本文。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含经修饰的CD3ζ多肽，该经修饰的CD3ζ多肽包含：天然的ITAM1、包含或由一个或多个(例如两个)功能丧失突变组成的ITAM2变体、以及包含或由一个或多个(例如两个)功能丧失突变组成的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含经修饰的CD3ζ多肽，该经修饰的CD3ζ多肽包含：天然的ITAM1、由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体和由两个功能丧失突变组成的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含经修饰的CD3ζ多肽，该经修饰的CD3ζ多肽包含由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成的天然ITAM1、由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列组成的ITAM2变体和由SEQ ID NO:18所示氨基酸序列组成的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR被指定为“1XX”。在某些实施方式中，经修饰的CD3ζ多肽包含或由SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:20提供如下：
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含经修饰的CD3ζ多肽，该经修饰的CD3ζ多肽包含或由与SEQ ID NO:20或其片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％一致，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代的氨基酸序列组成。
编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的示例性核酸序列在下文提供的SEQ ID NO:21中示出。
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAG
GACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAA
CCCTCAGGAAGGCCTGTTCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTTCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAG
CGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTTCCAGGGGCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTTCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC[SEQ ID NO:21]
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域进一步包含至少一个共刺激信号传导区。在某些实施方式中，至少一个共刺激区域包含共刺激分子或其部分。在某些实施方式中，至少一个共刺激区域包含至少一个共刺激分子的至少一个胞内结构域或其部分。共刺激分子的非限制性示例包括CD28、4-1BB、OX40、CD27、CD40、CD154、CD97、CD11a/CD18、ICOS、DAP-10、CD2和NKG2D。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含CD28多肽的共刺激信号传导区，例如CD28的细胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区域，该共刺激信号传导区包含包含人CD28的胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含CD28多肽，该CD28多肽包含或由SEQID NO:2的氨基酸180至220组成。在某些实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含小鼠CD28的胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域，该共刺激信号传导结构域包含CD28多肽，该CD28多肽包含或由SEQ ID NO:4的氨基酸178至218的氨基酸序列组成。
在某些实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含4-1BB多肽，例如4-1BB的胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含人4-1BB的胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含4-1BB多肽，该4-1BB多肽包含或由SEQ ID NO:5的氨基酸214至255组成。在某些实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区域，该共刺激信号传导区包含小鼠4-1BB的胞内结构域或其部分。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含4-1BB多肽，该4-1BB多肽包含或由SEQ ID NO:48的氨基酸209至256的氨基酸序列组成。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导区包含两个共刺激信号传导区，其中第一共刺激信号传导区包含第一个共刺激分子的细胞内信号传导区或其部分，第二个共刺激信号传导区包含第二共刺激分子的细胞内信号传导区或其部分。第一和第二共刺激分子独立地选自由CD28、4-1BB、OX40、CD27、CD40、CD154、CD97、CD11a/CD18、ICOS、DAP-10、CD2和NKG2D组成的组。在某些实施方式中，抗原识别受体的胞内信号传导区包含两个共刺激信号传导区，其中第一共刺激信号传导区包含CD28的胞内结构域或其部分，第二共刺激信号传导区包含4-1BB的胞内结构域或其部分。
在某些实施方式中，当通过CAR的CD3ζ结构域与抗原结合时，CAR的细胞内共刺激信号传导结构域刺激或增强包含所述CAR的免疫细胞的有效应答。所述细胞内共刺激信号传导结构域可以包括CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40、2B4、NKG2D的细胞内部分或其相关部分。所述细胞内共刺激信号传导结构域可包括人CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40、2B4、NKG2D的细胞内部分或其相关部分。作为可替代或可附加地，所述细胞内共刺激信号传导结构域可以包含来自非人物种，例如鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同蛋白质。作为可替代或可附加地，所述细胞内共刺激信号传导结构域可以包括与人CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40、2B4、NKG2D的细胞内部分至少80％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致的结构域。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ的细胞内结构域。在某些实施方式中，CAR包含细胞内信号传导结构域和共刺激细胞内结构域。在某些实施方式中，CAR包含CD3ζ信号结构域和CD28共刺激结构域，例如人CD3ζ信号结构域和人CD28共刺激结构域。
在某些实施方式中，由本公开的免疫细胞表达的CAR和CCR各自包含CD28跨膜结构域和共刺激CD28胞内结构域。所述CD28跨膜结构域与抗原特异性结合结构域融合。所述胞内结构域可对应于人CD28的细胞质部分，对应于UniProt条目P10747的氨基酸残基180-220。跨膜结构域可以对应于人CD28的跨膜结构域，对应于UniProt条目P10747的氨基酸残基153-179。
在某些实施方式中，由本公开主题的免疫细胞表达的CAR和CCR的共刺激CD28胞内结构域基本一致。所述共刺激CD28细胞内结构域至少80％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少99％一致或100％一致。
在某些实施方式中，CAR包含与BCMA(例如，人BCMA)结合的细胞外抗原结合结构域、包含CD28多肽(例如，人CD28多肽，如CD28(例如，人CD28)的跨膜结构域)的跨膜结构域或其部分、源自CD28多肽(例如，人CD28)的铰链/间隔区、包含经修饰的CD3ζ多肽(例如，经修饰的人CD3ζ多肽)的胞内信号传导结构域，以及包含CD28多肽(例如，人CD28多肽，如CD28(例如，人CD28)细胞内结构域或其部分)的共刺激信号传导结构域，其中所述经修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、ITAM2变体和由两个功能缺失突变组成的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR被指定为“BCMA-28z1XX”。
在某些实施方式中，CAR包含与BCMA(例如，人BCMA)结合的细胞外抗原结合结构域、铰链/间隔区、包含CD28多肽的跨膜结构域(例如人CD28多肽，如CD28(例如，人CD28)的跨膜结构域或其部分)、包含CD28多肽(例如人CD28，如CD28(例如，人CD28)的细胞内结构域或其部分)的共刺激信号传导区和包含经修饰的CD3ζ多肽(例如，经修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域，该经修饰的CD3ζ多肽包含天然的ITAM1、由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体和由两个功能丧失突变组成的ITAM3变体。
此外，细胞外抗原结合结构域可以包含引导新生蛋白进入内质网的前导肽或信号肽。如果CAR被糖基化并锚定在细胞膜中，则信号肽或前导肽可能是必不可少的。信号序列或前导序列可以是存在于新合成蛋白质的N-端的肽序列(长约5、约10、约15、约20、约25或约30个氨基酸)，指导这些新合成蛋白进入分泌途径。在某些实施方式中，信号肽共价连接到CAR的细胞外抗原结合结构域的5’端(N-端)。示例性的前导序列包括但不限于人IL-2信号序列(例如，MYRMQLLSCIALSLALVTNS[SEQ ID NO:22])，小鼠IL-2信号序列(例如，MYSMQLASCVTLTLVLLVNS[SEQ ID NO:23])；人κ前导序列(例如，METPAQLLFLLLLWLPDTTG[SEQID NO:24])，小鼠κ前导序列(例如，METDTLLLWVLLLWVPGSTG[SEQ ID NO:25])；人CD8前导序列(例如，MALPVTALLLPLALLLHAARP[SEQ ID NO:26])；截短的人CD8信号肽(例如，MALPVTALLLPLALLLHA[SEQ ID NO:27])；人白蛋白信号序列(例如，MKWVTFISLLFSSAYS[SEQID NO:28])；和人催乳素信号序列(例如，MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLCQGVVS[SEQ ID NO:29])。
在某些实施方式中，信号肽包含CD8多肽，例如，CAR包含截短的CD8信号肽。在某些实施方式中，信号肽包含或由SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列组成。
5.3.1.3.T细胞受体(TCR)
在某些实施方式中，抗原识别受体是TCR。TCR是一种二硫键连接的异二聚体蛋白质，由两条表达为具有恒定CD3链分子的复合物的一部分的可变链组成。TCR存在于T细胞表面，负责将抗原识别为与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的肽。在某些实施方式中，TCR包含α链和β链(分别由TRA和TRB编码)。在某些实施方式中，TCR包含γ链和δ链(分别由TRG和TRD编码)。
TCR的每条链由两个细胞外结构域组成：可变(V)区和恒定(C)区。恒定区靠近细胞膜，随后是跨膜区和短胞质尾。可变区与肽/MHC复合物结合。两条链的可变结构域都有三个互补性决定区(CDR)。
在某些实施方式中，TCR可与三聚体信号传导模块CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247ζ/ζ或ζ/η形成受体复合物。当TCR复合物与其抗原和MHC(肽/MHC)接合时，表达TCR复合物的T细胞被激活。
在某些实施方式中，抗原识别受体是内源性TCR。在某些实施方式中，抗原识别受体是天然存在的TCR。
在某些实施方式中，抗原识别受体是外源性TCR。在某些实施方式中，抗原识别受体是重组TCR。在某些实施方式中，抗原识别受体是非天然存在的TCR。在某些实施方式中，非天然存在的TCR与任何天然存在的TCR有至少一个氨基酸残基的差异。在某些实施方式中，非天然存在的TCR与任何天然存在的TCR有至少约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100个或更多的氨基酸残基的差异。在某些实施方式中，非天然存在的TCR由天然存在的TCR经至少一个氨基酸残基修饰而成。在某些实施方式中，将非天然存在的TCR由天然存在的TCR经至少约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100个或更多的氨基酸残基修饰而成。
5.3.1.4.TCR样融合分子
在某些实施方式中，所述抗原识别受体是TCR样融合分子。TCR融合分子的非限制性示例包括基于HLA非依赖性TCR的嵌合抗原受体(也被称为“HIT-CAR”，例如，国际专利申请号PCT/US19/017525中公开的那些，其通过引用整体并入本文)和T细胞受体融合构建(TRuC)(例如，在Baeuerle et al.,“Synthetic TRuC receptors engaging the completeT cell receptor for potent anti-tumor response,”Nature Communications volume10,Article number:2087(2019)中公开的那些，其通过引用整体并入本文)。
在某些实施方式中，TCR样融合分子是重组T细胞受体(TCR)。在某些实施方式中，TCR样融合分子包含抗原结合链，该抗原结合链包含细胞外抗原结合结构域和恒定结构域，其中TCR样融合分子以HLA非依赖性方式与第一抗原结合。因此，在某些实施方式中，TCR样融合分子是HLA非依赖性(或非HLA限制性)TCR(称为“HIT-CAR”或“HIT”)。在某些实施方式中，恒定结构域包含TCR恒定结构域，其选自由天然或经修饰的TRAC多肽、天然或经修饰的TRBC多肽、天然或经修饰的TRDC多肽、天然或经修饰的TRGC多肽，及其任何变体或功能片段组成的组。在某些实施方式中，恒定结构域包含天然或经修饰的TRAC多肽。在某些实施方式中，恒定结构域包含天然或经修饰的TRBC多肽。在某些实施方式中，恒定结构域能够与另一个恒定结构域形成同源二聚体或异源二聚体。在某些实施方式中，抗原结合链能够与CD3ζ多肽相关联。在某些实施方式中，抗原结合链在与抗原结合后，能够激活与抗原结合链相关联的CD3ζ多肽。在某些实施方式中，CD3ζ多肽的激活能够激活免疫应答性细胞。在某些实施方式中，TCR样融合分子能够与CD3复合物整合，并提供HLA非依赖性抗原识别。在某些实施方式中，TCR样融合分子取代CD3/TCR复合物中的内源性TCR。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域能够与另一个细胞外抗原结合结构域二聚化。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含细胞表面受体的配体、细胞表面配体的受体、抗体的抗原结合部分或其片段或者TCR的抗原结合部分。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含抗体的抗原结合部分。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含scFv。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含一个或两个免疫球蛋白可变区。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含抗体的重链可变区(VH)。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含抗体的轻链可变区(VL)。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域能够与另一个细胞外抗原结合结构域二聚化。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含抗体的VH，其中VH能够与另一包含抗体VL的细胞外抗原结合结构域二聚化，并形成可变区片段(Fv)，例如scFv。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含抗体的VL，其中VL能够与另一包含抗体VH的细胞外抗原结合结构域二聚化，并形成可变区片段(Fv)，例如scFv。
在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含TCR的抗原结合部分。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含抗体的抗原结合部分或其片段。在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含抗体的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含纯重链抗体(VHH)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含Fab，其任选是交联的。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含F(ab)2。在某些实施方式中，任何前述分子可以被包含在具有异源序列的融合蛋白中，以形成细胞外抗原结合结构域。
在某些实施方式中，TCR样融合分子的细胞外抗原结合结构域包含抗体的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中VH或VL能够与另一包含VL或VH的细胞外抗原结合结构域二聚化(例如，形成可变片段(Fv))。在某些实施方式中，Fv是人Fv。在某些实施方式中，Fv是人源化Fv。在某些实施方式中，Fv是鼠Fv。在某些实施方式中，Fv通过用抗原-Fc融合蛋白筛选Fv噬菌体文库来鉴定。靶向感兴趣抗原的额外细胞外抗原结合结构域可以通过对靶向相同抗原的现有scFv或现有抗体的Fab区进行测序来获得。
在某些实施方式中，VH和VL通过接头连接。
在某些实施方式中，TCR样融合分子的抗原结合链还包含恒定结构域。在某些实施方式中，恒定结构域包含铰链/间隔区和跨膜结构域。在某些实施方式中，恒定结构域能够与另一恒定结构域形成同源二聚体或异源二聚体。在某些实施方式中，恒定结构域通过一个或多个二硫键二聚化。在某些实施方式中，TCR样融合分子的抗原结合链能够形成具有一个或多个相同或不同恒定结构域的三聚体或寡聚体。
在某些实施方式中，恒定结构域包括TCR恒定区例如T细胞受体α恒定区(TRAC)、T细胞受体β恒定区(TRBC，如TRBC1或TRBC2)、T细胞受体γ恒定区(TRGC，例如TRGC1或TRGC2)、T细胞受体δ恒定区(TRDC)或其任何变体或功能片段。
在某些实施方式中，TCR样融合分子的恒定结构域包含天然或经修饰的TRAC多肽。在某些实施方式中，TRAC多肽包含与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源或一致，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代的氨基酸序列。SEQ ID NO:30提供如下。
IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS[SEQID NO:30]
在某些实施方式中，TRAC多肽包含或由以下氨基酸序列组成：与NCBI GenbankID:28755，NG_001332.3范围925603至930229的基因(SEQ ID NO:31)表达的转录物编码的氨基酸序列或其片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源或一致，和/或可任选包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。SEQ ID NO:31提供如下。
/>
在某些实施方式中，TCR样融合分子的恒定结构域包含天然或经修饰的TRBC多肽。在某些实施方式中，TCR样融合分子的恒定结构域包含天然或经修饰的TRBC2多肽。在某些实施方式中，TRBC2多肽包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源或一致，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。SEQ ID NO:32提供如下。
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGF3YPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG[SEQ ID NO:32]
在某些实施方式中，TCR样融合分子的恒定结构域包含天然或经修饰的TRBC1多肽。在某些实施方式中，TRBC1多肽包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源或一致，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。SEQ ID NO:33提供如下。
在某些实施方式中，TRBC多肽包含或由以下氨基酸序列组成：与NCBI GenbankID:28639，NG_001333.2，范围645749至647196(TRBC1，SEQ ID NO:34)、NCBI Genbank ID:28638，NG_001333.2，范围655095至656583(TRBC2，SEQ ID NO:35)的基因表达的转录物编码的氨基酸序列或其片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源或一致，和/或可任选包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。SEQ ID NO:34和35提供如下。
在某些实施方式中，TCR样融合分子的恒定结构域包含天然或经修饰的TRGC多肽。在某些实施方式中，TCR样融合分子的恒定结构域包含天然或经修饰的TRGC1多肽。在某些实施方式中，TRGC1多肽包含与由SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源或一致的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:36提供如下。
在某些实施方式中，TCR样融合分子的恒定结构域包含天然或经修饰的TRGC2多肽。在某些实施方式中，TRGC2多肽包含或由SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源或一致的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:37提供如下。
在某些实施方式中，TRGC多肽包含由以下氨基酸序列组成：与NCBI Genbank ID:6966，NG_001336.2，范围108270至113860(TRGC1，SEQ ID:38)，NCBI Genbank ID:6967，NG_001336.2，范围108270至113860(TRGC2，SEQ ID NO:39)的基因表达的转录物编码的氨基酸序列或其片段至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源或一致，和/或可任选包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。SEQ ID NO:38和39提供如下。
/>
/>
/>
/>
在某些实施方式中，TCR样融合分子的恒定结构域包含天然或经修饰的TRDC多肽。在某些实施方式中，TRDC多肽包含或由与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源或一致的氨基酸序列组成。SEQID NO:40提供如下。
在某些实施方式中，TCR样融合分子包含将胞外抗原结合结构域连接至恒定结构域的铰链/间隔区。铰链/间隔区可以足够灵活，以允许抗原结合结构域在不同方向定向，从而促进抗原识别。在某些实施方式中，铰链/间隔区可以是来自IgG1的铰链区，或免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的一部分，CD28多肽的一部分，CD8多肽的一部分，与前述各项至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％同源或一致的变体，或合成的间隔区序列。在某些非限制性实施方式中，CAR的铰链/间隔区可包含CD3ζ多肽、CD40多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD166多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、合成多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合的天然或经修饰的铰链区。
在某些实施方式中，TCR样融合分子包含抗原结合链，其不包含细胞内结构域。在某些实施方式中，抗原结合链能够与CD3ζ多肽相关联。在某些实施方式中，抗原结合链包含恒定结构域，其能够与CD3ζ多肽相关联。在某些实施方式中，CD3ζ多肽是内源性的。在某些实施方式中，CD3ζ多肽是外源性的。在某些实施方式中，抗原结合链与抗原的结合能够激活与抗原结合链相关联的CD3ζ多肽。在某些实施方式中，外源性CD3ζ多肽与本文公开的共刺激分子融合或整合。
在某些实施方式中，TCR样融合分子包含：包含细胞内结构域的抗原结合链。在某些实施方式中，细胞内结构域包含CD3ζ多肽。在某些实施方式中，抗原结合链与抗原的结合能够激活抗原结合链的CD3ζ多肽。
在某些实施方式中，CD3ζ多肽包含或由与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CD3ζ多肽包含或由SEQ ID NO:6的连续部分的氨基酸序列组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、以及至多约164个氨基酸。在某些实施方式中，CD3ζ包含或由SEQ ID NO:6的氨基酸1至164、1至50、50至100、52至164、100至150或150至164的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CD3ζ多肽包含或由SEQ ID NO:6的氨基酸52至164的氨基酸序列组成。
在某些实施方式中，CD3ζ多肽包含或由与SEQ ID NO:7或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或一致，和/或可任选包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，CD3ζ多肽包含或由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成。
在某些实施方式中，TCR样融合分子包含抗原结合链，该抗原结合链包含细胞内结构域，其中该细胞内结构域包含共刺激信号传导区。在某些实施方式中，细胞内结构域包含共刺激信号传导区和CD3ζ多肽。在某些实施方式中，细胞内结构域包含共刺激信号传导区，并且不包含CD3ζ多肽。在某些实施方式中，共刺激信号传导区至少包含本文公开的共刺激分子的细胞内结构域。
在某些实施方式中，TCR样融合分子能够与CD3复合物(也称为“T细胞共受体”)相关联。在某些实施方式中，TCR样融合分子和CD3复合物形成与天然TCR/CD3复合物相似的抗原识别受体复合物。在某些实施方式中，CD3复合物是内源性的。在某些实施方式中，CD3复合物是外源性的。在某些实施方式中，TCR样融合分子取代CD3/TCR复合物中的天然和/或内源性TCR。在某些实施方式中，CD3复合物包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。
在某些实施方式中，CD3γ链包含或由与具有NCBI参考号NP_000064.1的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或一致，和/或可任选包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:41提供如下。
在某些实施方式中，CD3δ链包含或由与具有NCBI参考号:NP_000723.1的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)或其片段或与具有NCBI参考号:NP_001035741.1的氨基酸序列(SEQ IDNO:43)或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或一致的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:42和43提供如下。
在某些实施方式中，CD3ε链包含或由与具有NCBI参考号NP_000724.1的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或一致，和/或可任选包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:44提供如下。
在某些实施方式中，TCR样融合分子表现出比靶向相同抗原的CAR更高的抗原敏感性。在某些实施方式中，当与肿瘤细胞表面上低密度的抗原结合时，TCR样融合分子能够诱导免疫应答。在某些实施方式中，包含TCR样融合分子的细胞可用于治疗其中肿瘤细胞具有表面抗原低表达水平的受试者，例如来自疾病复发的受试者，其中受试者接受针对残余肿瘤细胞的治疗。在某些实施方式中，肿瘤细胞具有在肿瘤细胞表面上的低密度的靶标分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶标分子的密度小于约5000分子/细胞、小于约4000分子/细胞、小于约3000分子/细胞、小于约2000分子/细胞、小于约1500分子/细胞、小于约1000分子/细胞、小于约500分子/细胞、小于约200分子/细胞或小于约100分子/细胞。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度小于约2000分子/细胞。在某些实施方式中，细胞表面上具有低密度的靶分子的密度小于约1500分子/细胞。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度小于每个细胞约1000分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度介于约4000分子/细胞和约2000个分子/细胞之间，介于约2000分子/细胞和约1000分子/细胞之间，介于约1500分子/细胞和约1000分子/细胞之间，介于约1000分子/细胞和约200个分子/细胞之间，或介于约1000分子/细胞之间。
国际专利申请公开号WO2019/133969中公开了各种TCR样融合分子，该文件通过引用整体并入本文。
5.3.2.B2M基因座的基因破坏
在某些实施方式中，本公开的细胞进一步包含B2M基因座的基因破坏。在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏导致无功能的β2-微球蛋白。在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏导致B2M基因表达的敲除。
在某些实施方式中，使用非病毒方法产生B2M基因座的基因破坏(例如，敲除B2M基因座)。非病毒方法也可用于细胞的遗传修饰。例如，可以通过在脂转染(Feigner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono et al.,Neuroscience Letters 17:259,1990；Brigham etal.,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger et al.,Methods inEnzymology 101:512,1983)、脱唾液酸类粘蛋白-多聚赖氨酸缀合(Wu et al.,Journal ofBiological Chemistry 263:14621,1988；Wu et al.,Journal of Biological Chemistry264:16985,1989)的存在下施用核酸，或者通过在外科手术条件下通过微量注射(Wolff etal.,Science 247:1465,1990)来将核酸分子引入细胞中。用于基因转移的其它非病毒手段包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合进行体外转染。脂质体也可潜在地有利于将DNA递送到细胞中。将正常基因移植到受试者的受影响组织中也可以通过以下来完成：将正常核酸离体转移到可培养的细胞类型(例如自体或异源原代细胞或其子代)中，之后将该细胞(或其后代)注射到靶组织中或进行全身注射。还可使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶、大范围核酸酶(meganucleases)或TALE核酸酶，CRISPR)衍生或获得重组受体。瞬时表达可以通过RNA电穿孔获得。
还可使用任何靶向基因组编辑方法来产生B2M基因座的基因破坏。在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏通过包括同源重组、锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统或其组合的方法来产生。
在某些实施方式中，使用CRISPR系统来产生B2M基因座的基因破坏。
成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统是在原核细胞中发现的基因组编辑工具。当用于基因组编辑时，该系统包括Cas9(能够利用crRNA作为其引导来修饰DNA的蛋白质)、CRISPR RNA(crRNA，含有由Cas9使用以将其引导至宿主DNA的正确区段的RNA，连同与tracrRNA结合的区域(一般为发夹环形式)，与Cas9形成活性复合物)，反式激活crRNA(TRAC RNA，与crRNA结合并与Cas9形成活性复合物)以及DNA修复模板的任选区段(引导细胞修复过程的DNA，允许插入特异性DNA序列)。CRISPR/Cas9通常使用质粒来转染靶细胞。crRNA需要针对每个应用进行设计，因为这是Cas9用来识别并直接结合细胞中靶DNA的序列。还需要针对每个应用设计携带CAR表达盒的修复模板，因为它必须与切口的任一侧的序列重叠，并编码插入序列。多重crRNA和tracrRNA可以包装在一起形成单引导RNA(sgRNA)。该sgRNA可以与Cas9基因连接在一起，并制成质粒，以便转染到细胞中。
在某些实施方式中，使用gRNA敲除B2M的表达来破坏B2M基因座。
在某些实施方式中，使用锌指核酸酶来产生B2M基因座的基因破坏。锌指核酸酶(ZFN)是人工限制性酶，其通过使锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域结合来产生。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的DNA序列，这允许锌指核酸酶靶向基因组内的所需序列。各个ZFN的DNA结合结构域通常包含多个单独的锌指重复序列，并且每个都可以识别多个碱基对。产生新的锌指结构域最常用的方法是将已知特异性的较小锌指“模块”进行结合。ZFN中最常见的切割结构域是来自IIs型限制性核酸内切酶FokI的非特异性切割结构域。使用内源性同源重组(HR)机制和携带CAR表达盒的同源DNA模板，ZFN可用于将CAR表达盒插入基因组中。当靶向序列被ZFN切割时，HR机制寻找受损染色体和同源DNA模板之间的同源性，然后将模版序列复制到染色体的两个断裂端之间，由此同源DNA模板被整合到基因组中。
在某些实施方式中，使用TALEN系统来产生B2M基因座的基因破坏。转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是限制性酶，其可以被工程化以切割特定的DNA序列。TALEN系统的工作原理与ZFN几乎相同。它们是通过将转录激活因子样效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域结合而产生的。转录激活因子样效应物(TALEs)由33至34个氨基酸重复基序组成，具有两个可变位置，对特定核苷酸具有强识别能力。通过组装这些TALE的阵列，可以将TALEDNA结合结构域工程化，以结合所需的DNA序列，从而引导核酸酶在基因组的特定位置切割。用于多核苷酸治疗方法的cDNA表达可由任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)指导，并受任何合适的哺乳动物调控元件或内含子(例如，延伸因子1a增强子/启动子/内含子结构)调控。例如，如果需要，已知优先指导特定细胞类型中的基因表达的增强子可用于指导核酸的表达。所用的增强子可包括但不限于被表征为组织或细胞特异性增强子的那些增强子。可替代地，如果基因组克隆用作治疗构建体，则调控可以由同源调节序列介导，或者如果需要，由源自异源来源的调控序列(包括任何上述启动子或调控元件)介导。
用于递送基因组编辑试剂/系统的方法可以根据需要而变化。在某些实施方式中，作为在一种或多种质粒中的DNA构建体递送所选基因组编辑方法的组分。在某些实施方式中，经由病毒载体递送组分。常见的递送方法包括但不限于电穿孔、显微注射、基因枪、穿刺感染(impalefection)、静水压力、连续输注、超声处理、磁性转染(magnetofection)、腺相关病毒、病毒载体的包膜蛋白假型化、复制型载体顺式和反式作用元件、单纯疱疹病毒和化学媒介物(vehicle)(例如，寡核苷酸、脂复合物、聚合物囊泡(polymersome)、聚复合物(polyplexe)、树枝状聚合物、无机纳米颗粒和细胞穿透肽)。
在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏可以是B2M基因座编码区的破坏和/或CD70基因座非编码区的破坏。在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏包括B2M基因座编码区的破坏。在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏包括在B2M基因座编码区的插入。人B2M蛋白包含两个外显子：外显子1和外显子2。在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏包括B2M基因座的外显子1和外显子2中的一处或多处的破坏。在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏包括B2M基因座的外显子1处的破坏。在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏包括在B2M基因座的外显子1处的插入。
在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏在细胞中表达第一抗原识别受体之前产生。
干细胞的免疫排斥是由于这些细胞表面表达人类白细胞抗原I类分子(HLA-I)(Zhang etal.,J Cell Mol Med.(2020)；24:695-710)。HLA-I向CD8+ T细胞呈递“非自身”抗原，该CD8+ T细胞通过直接的细胞毒作用清除移植细胞(Zhang 2020)。由于HLA-I基因的多态性，通常难以在移植前鉴定供体和受体之间的完全匹配(Zhang 2020)。HLA-I包括重链和轻链，也称为β2-微球蛋白(B2M)。当缺失B2M基因时，HLA-I结构被破坏且是无功能的(Zhang2020)。在某些实施方式中，B2M基因座的基因破坏可以减少干细胞诱导的免疫排斥，从而使细胞更适合同种异体环境。
5.3.3.CIITA基因座的基因破坏
在某些实施方式中，本公开的细胞进一步包含II类反式激活因子(CIITA)基因座的基因破坏。在某些实施方式中，CIITA基因座的基因破坏导致无功能的MHC II类反式激活因子。在某些实施方式中，CIITA基因座的基因破坏导致CIITA基因表达的敲除。
如第5.3.6节所公开的产生B2M基因座的基因破坏的任何方法可用于产生CIITA基因座的基因破坏。在某些实施方式中，CIITA基因座的基因破坏通过包括基因编辑方法的方法来产生，该基因编辑方法包括同源重组、锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统或其组合。
在某些实施方式中，CIITA基因座的基因破坏可以是CIITA基因座编码区的破坏和/或CIITA基因座非编码区的破坏。在某些实施方式中，CIITA基因座的基因破坏包括CIITA基因座编码区的破坏。在某些实施方式中，CIITA基因座的基因破坏包括在CIITA基因座的编码区处的插入。人CIITA蛋白包含22个外显子：外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21和外显子22。在某些实施方式中，CIITA基因座的基因破坏包括CIITA基因座的外显子1至外显子22中的一处或多处的破坏。在某些实施方式中，CIITA基因座的基因破坏包括CIITA基因座的外显子3处的破坏。在某些实施方式中，CIITA基因座的基因破坏包括在CIITA基因座的外显子3处的插入。
CIITA是一种转录共激活因子，调控主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类基因的γ-干扰素激活的转录(Devaiah et al.,Frontiers in Immunology(2013)；Vol.4；Article 476:1-6)。因此，CIITA在免疫应答中起着关键作用：CIITA缺乏导致MHC基因表达异常，从而导致自身免疫性疾病，如II型裸淋巴细胞综合征(Devaiah 2013)。尽管CIITA不直接与DNA结合，但它以两种不同的方式调控MHC转录—作为转录激活因子和作为一般转录因子(Devaiah 2013)。CIITA是MHC基因表达的主要调节者(Devaiah 2013)。CIITA诱导MHCII类基因的重新转录，并增强组成型MHC I类基因的表达(Devaiah 2013)。MHC II的表达由CIITA调控。在某些实施方式中，CIITA基因座的基因破坏可以减少免疫排斥，并提高同种异体骨髓干细胞的存活率，从而使细胞更适合同种异体环境。
5.3.4.生产方法
本公开的主题进一步提供了产生本文公开的免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞(例如，人免疫细胞、人T细胞、人NK细胞)，以及使该免疫细胞能表达CAR和CCR。
在某些实施方式中，所述方法包括：将编码嵌合抗原受体和共刺激嵌合受体的核酸序列引入至免疫细胞。在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含与细胞内信号传导结构域偶联的抗原结合结构域。在某些实施方式中，CAR包含与第一抗原结合的抗原特异性结合结构域；CD28跨膜结构域，细胞内CD3ζ信号传导结构域；和共刺激CD28细胞内结构域。在某些实施方式中，所述共刺激嵌合受体包含与共刺激信号传导结构域偶联的抗原结合结构域。在某些实施方式中，CCR包含与第二抗原结合的抗原特异性结合结构域；CD28跨膜结构域；和细胞内信号传导结构域；以及共刺激CD28细胞内结构域和共刺激4-1BB细胞内结构域；其中第一抗原不同于第二抗原。
在某些实施方式中，所述免疫细胞是T细胞。在某些实施方式中，所述免疫细胞是细胞毒性T细胞。在某些实施方式中，所述免疫细胞是NK细胞。
5.4.核酸组合物和载体
本公开的主题提供了核酸分子和/或核酸组合物，其包含编码CD38 CCR(例如，5.2节中公开的CD38 CCR)的第一多核苷酸。在某些实施方式中，核酸分子和/或核酸组合物进一步包含编码抗原识别受体(例如，5.3.1节中公开的抗原识别受体)的第二多核苷酸。还提供了包含本文公开的核酸分子和/或核酸组合物的细胞。
本公开的主题进一步提供了能在免疫细胞(例如，人T细胞或NK细胞)中表达CAR和CCR的核酸分子。所述核酸分子包含一个或多个核酸序列，其编码细胞内信号传导结构域(例如，人CD3ζ结构域)、共刺激CD28细胞内结构域、CD28跨膜结构域和抗原结合结构域。在某些实施方式中，所述核酸分子编码细胞内信号传导结构域、共刺激CD28细胞内结构域、CD28跨膜结构域和CAR的抗原结合结构域；以及CCR的细胞内信号结构域、共刺激4-1BB结构域、共刺激CD28结构域、CD28跨膜结构域和抗原结合结构域。
在某些实施方式中，核酸分子和/或核酸组合物包含调控元件，例如在许多细胞类型中提供CAR和CCR组成型表达的元件，或者在某些细胞类型中(例如在T细胞和/或NK细胞中)指导CAR和CCR表达的元件(即，组织特异性调控序列)。调控元件包括启动子、增强子和转录终止序列，如聚(A)信号。
在某些实施方式中，核酸分子和/或核酸组合物进一步包含与第一多核苷酸可操作连接的第一启动子。在某些实施方式中，核酸分子和/或核酸组合物进一步包含与第二多核苷酸可操作连接的第二启动子。在某些实施方式中，第一和第二启动子之一或两者是内源或外源的。
在某些实施方式中，外源启动子选自延伸因子(EF)-1启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK启动子和金属硫蛋白启动子。在某些实施方式中，第一和第二启动子之一或两者是诱导型启动子。在某些实施方式中，诱导型启动子选自NFAT转录应答元件(TRE)启动子、CD69启动子、CD25启动子和IL-2启动子。
在某些实施方式中，第一和第二启动子之一或两者是pol II启动子。合适的polII启动子的示例包括但不限于逆转录病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选带有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选带有CMV增强子)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子。
在某些实施方式中，核酸分子和/或核酸组合物进一步包含与第一多核苷酸可操作连接的第一增强子。在某些实施方式中，核酸分子和/或核酸组合物还包含与第二多核苷酸可操作连接的第二增强子。增强子的非限制性示例包括CMV增强子；HTLV-I的LTR中的R-U5’区段；SV40增强子；和兔β-珠蛋白的外显子2和3之间的内含子序列。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如所选的待转化宿主细胞、所需的表达水平等因素。所述调控元件如启动子序列可以是自体序列或异体序列。
在某些实施方式中，CD38 CCR和/或抗原识别受体被整合在T细胞基因组内的基因座，例如TRAC基因座、TRBC基因座、TRDC基因座、TRGC基因座、B2m基因座、AAVS1基因座或PD-1基因座处。在某些实施方式中，基因座是TRAC基因座。在某些实施方式中，CD38 CCR和/或抗原识别受体的表达在内源启动子的控制下。内源启动子的非限制性示例包括内源TRAC启动子、内源TRBC启动子、内源TRDC启动子和内源TRGC启动子。在某些实施方式中，内源启动子是内源TRAC启动子。
在某些实施方式中，CD38 CCR和抗原识别受体均被整合在T细胞基因组内的基因座处。在某些实施方式中，CD38 CCR和抗原识别受体均被整合在TRAC基因座处。参见图4A和图4C。TRAC基因座处的整合引起TRAC基因座的敲除。
在某些实施方式中，抗原识别受体被整合至T细胞基因组内的基因座中，并且CD38CCR被整合在B2M基因座处。在某些实施方式中，抗原识别受体被整合在TRAC基因座处。参见图4B。TRAC基因座处的整合引起TRAC基因座的敲除。B2M基因座处的整合引起B2M基因座的敲除。
在某些实施方式中，抗原识别受体被整合到T细胞基因组内的基因座中，并且CD38CCR被整合在CIITA基因座处。在某些实施方式中，抗原识别受体被整合在TRAC基因座处。参见图4D。TRAC基因座处的整合引起TRAC基因座的敲除。并且在CIITA基因座处的整合引起CIITA基因座的敲除。
本公开的主题还提供了包含本文公开的核酸组合物的载体。在某些实施方式中，载体是逆转录病毒载体(例如，γ逆转录病毒载体或慢病毒载体)。在某些实施方式中，病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒、牛乳头瘤病毒和疱疹病毒(例如，如爱泼斯坦-巴尔病毒)。
在某些实施方式中，能在免疫细胞中表达CAR和CCR的核酸分子存在于载体中。在某些实施方式中，所述载体额外地包含用于高表达水平的工具，例如强启动子，例如病毒(例如人巨细胞病毒)来源的，或源自于在细胞(如哺乳动物细胞)中高表达的基因的启动子(Running Deer and Allison,2004.Biotechnol Prog 20:880-889；US patent No:5888809)。在某些实施方式中，载体包含选择系统，例如谷氨酰胺合成酶的表达或二氢叶酸还原酶的表达，用于在合适的受体细胞中扩增载体，如技术人员所已知的。可以通过本领域已知的方法或如本文所述，将核酸组合物施用于受试者或/和递送至细胞中。可以通过用重组DNA构建体转导基本上同质的细胞组合物来完成细胞(例如T细胞或NK细胞)的遗传修饰。在某些实施方式中，使用逆转录病毒载体(γ逆转录病毒或慢病毒)将核酸组合物引入细胞。例如，可以将第一多核苷酸和第二多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中，并且可以由其内源启动子、逆转录病毒长末端重复或对感兴趣的靶细胞类型特异性的启动子驱动表达。也可以使用非病毒载体。
在某些实施方式中，载体是病毒载体。在某些实施方式中，病毒载体能够转导免疫细胞(例如，T细胞和NK细胞)。在某些实施方式中，所述病毒载体是重组腺相关病毒载体、基于单纯疱疹病毒的载体或基于慢病毒的载体，例如基于人类免疫缺陷病毒的载体。在某些实施方式中，所述病毒载体是基于逆转录病毒的载体，如基于慢病毒的载体，如基于人类免疫缺陷病毒的载体，或基于γ-逆转录病毒的载体，如基于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)或鼠干细胞病毒(MSCV)的载体。在某些实施方式中，逆转录病毒载体是SFGγ逆转录病毒载体(Rivière et al.,1995.PNAS 92:6733-6737)。
逆转录病毒，包括基于γ-逆转录病毒的载体，可以包装在合适的互补细胞中，所述互补细胞提供组抗原多蛋白(Gag)-聚合酶(Pol)和/或包膜(Env)蛋白。合适的包装细胞是人胚胎肾衍生的293T细胞，充质干细胞(Phoenix cell)(Swift et al.,2001.CurrProtoc Immunol,Chapter 10:Unit 10 17C)，PG13细胞(Loew et al.,2010.Gene Therapy17:272-280)和Flp293A细胞(Schucht et al.,2006.Mol Ther 14:285-92)。
在某些实施方式中，所述载体进一步包含编码共刺激配体的核酸，其中所述共刺激配体作为单独的蛋白质表达。在某些实施方式中，所述共刺激配体选自由CD80、CD86、CD70、OX40L和/或4-1BBL组成的组。
作为替代，非病毒基因疗法可用于产生本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞。非病毒载体包括裸DNA、脂质体、聚合剂(polymerizer)和分子缀合物。不含质粒细菌DNA序列的小环DNA载体可在细菌中产生，并可在体内高水平表达编码细胞内信号传导结构域、共刺激CD28细胞内结构域、CD28跨膜结构域和抗原结合结构域的核酸。作为替代，本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞可以通过基因编辑技术(包括CRISPR/Cas、锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶-TALEN)提供，以便在存在或不存在外源启动子的情况下，将受体转基因插入至特定基因座(Eyquem et al.,2017.Nature 543:113-117)。示例性的基因组基因座包括TRAC基因基因座(t细胞受体α链的恒定区)、b2m基因基因座、AAVS1基因座和PD-1基因座，如技术人员已知的。
可以在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或者多个载体中构建核酸组合物。创建多顺反子表达盒的元件的示例包括但不限于各种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES，例如FGF-1IRES、FGF-2IRES、VEGF IRES、IGF-II IRES、NF-κB IRES、RUNX1IRES、p53 IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病病毒IRES、口疮病毒属(aphthovirus)IRES、小核糖核酸病毒IRES、脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可切割接头(例如2A肽，例如P2A、T2A、E2A和F2A肽)。逆转录病毒载体和适当包装系(line)的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人类细胞的功能。已知各种产生双嗜性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller,et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5:431-437)；PA317(Miller,et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6:2895-2902)和CRIP(Danos,et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464)。非双嗜性颗粒也是合适的，例如，具有VSVG、RD114或GALV包络的假型颗粒和本领域已知的任何其他颗粒。
可能的转导方法进一步包括细胞与生产者细胞的直接共培养，例如通过Bregni,et al.(1992)Blood 80:1418-1422的方法，或者使用单独的病毒上清液或含有或不含适当生长因子和聚阳离子的浓缩载体原液培养，例如通过Xu,et al.(1994)Exp.Hemat.22:223-230；和Hughes,et al.(1992)J.Clin.Invest.89:1817的方法。
其他转导病毒载体可用于修饰细胞。在某些实施方式中，所选择的载体表现出高感染效率和稳定的整合和表达(参见，例如Cayouette et al.,Human Gene Therapy 8:423-430,1997；Kido et al.,Current Eye Research 15:833-844,1996；Bloomer et al.,Journal ofVirology71:6641-6649,1997；Naldini et al.,Science 272:263-267,1996；and Miyoshi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997)。可以使用的其他病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、痘苗病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒，如爱泼斯坦-巴尔病毒(例如，另见如下的载体Miller,Human Gene Therapy 15-14,1990；Friedman,Science 244:1275-1281,1989；Eglitis et al.,BioTechniques 6:608-614,1988；Tolstoshev et al.,Current Opinion in Biotechnology1:55-61,1990；Sharp,TheLancet 337:1277-1278,1991；Cornetta et al.,Nucleic Acid Research and MolecularBiology 36:311-322,1987；Anderson,Science 226:401-409,1984；Moen,Blood Cells17:407-416,1991；Miller et al.,Biotechnology 7:980-990,1989；LeGal La Salle etal.,Science 259:988-990,1993；and Johnson,Chest 107:77S-83S,1995)。逆转录病毒载体开发得特别好，并已用于临床(Rosenberg et al.,N.Engl.J.Med 323:370,1990；Anderson et al.,U.S.Pat.No.5,399,346)。
非病毒方法也可用于细胞的遗传修饰。例如，可以通过在存在脂质转染(Feigneret al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono et al.,Neuroscience Letters17:259,1990；Brigham et al.,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger et al.,Methods in Enzymology101:512,1983)，脱唾液酸粘蛋白-多聚赖氨酸缀合(Wu et al.,Journal of Biological Chemistry263:14621,1988；Wu et al.,Journal of BiologicalChemistry 264:16985,1989)，或在外科手术条件下通过微量注射(Wolff et al.,Science247:1465,1990)的情况下来将核酸分子递送到细胞中。用于基因转移的其他非病毒手段包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合进行体外转染。脂质体也可潜在地有利于将DNA递送到细胞中。将正常基因移植到受试者的受影响组织中也可以通过以下来完成：将正常核酸离体转移到可培养的细胞类型(例如自体或异源原代细胞或其子代)中，之后将该细胞(或其后代)注射到靶组织中或进行全身注射。瞬时表达可以通过RNA电穿孔获得。
也可使用任何靶向基因组编辑方法将本文公开的CD38 CCR和/或抗原识别受体递送至细胞。在某些实施方式中，使用CRISPR系统将本文公开的CD38 CCR和/或抗原识别受体递送至细胞。在某些实施方式中，使用锌指核酸酶将本文公开的CD38 CCR和/或抗原识别受体递送至细胞。在某些实施方式中，使用TALEN系统将本文公开的CD38 CCR和/或抗原识别受体递送至细胞。
成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统是在原核细胞中发现的基因组编辑工具。当用于基因组编辑时，该系统包括Cas9(能够利用crRNA作为其引导来修饰DNA的蛋白质)、CRISPR RNA(crRNA，含有由Cas9使用以将其引导至宿主DNA的正确区段的RNA，连同与tracrRNA结合的区域(一般为发夹环形式)，与Cas9形成活性复合物)，反式激活crRNA(TRAC RNA，与crRNA结合并与Cas9形成活性复合物)以及DNA修复模板的任选区段(引导细胞修复过程的DNA，允许插入特异性DNA序列)。CRISPR/Cas9通常使用质粒来转染靶细胞。crRNA需要针对每个应用进行设计，因为这是Cas9用来识别并直接结合细胞中靶DNA的序列。还需要针对每个应用设计携带CAR表达盒的修复模板，因为它必须与切口的任一侧的序列重叠，并编码插入序列。多重crRNA和tracrRNA可以包装在一起形成单引导RNA(sgRNA)。该sgRNA可以与Cas9基因连接在一起，并制成质粒，以便转染到细胞中。
锌指核酸酶(ZFN)是人工限制性酶，其通过使锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域结合来产生。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的DNA序列，这允许锌指核酸酶靶向基因组内的所需序列。各个ZFN的DNA结合结构域通常包含多个单独的锌指重复序列，并且每个都可以识别多个碱基对。产生新的锌指结构域最常用的方法是将已知特异性的较小锌指“模块”进行结合。ZFN中最常见的切割结构域是来自IIs型限制性核酸内切酶FokI的非特异性切割结构域。使用内源性同源重组(HR)机制和携带CAR表达盒的同源DNA模板，ZFN可用于将CAR表达盒插入基因组中。当靶向序列被ZFN切割时，HR机制寻找受损染色体和同源DNA模板之间的同源性，然后将模版序列复制到染色体的两个断裂端之间，由此同源DNA模板被整合到基因组中。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是限制性酶，其可以被工程化以切割特定的DNA序列。TALEN系统的工作原理与ZFN几乎相同。它们是通过将转录激活因子样效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域结合而产生的。转录激活因子样效应物(TALE)由33至34个氨基酸重复基序组成，具有两个可变位置，对特定核苷酸具有强识别能力。通过组装这些TALE的阵列，可以将TALE DNA结合结构域工程化，以结合所需的DNA序列，从而引导核酸酶在基因组的特定位置切割。用于多核苷酸治疗方法的cDNA表达可由任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)指导，并受任何合适的哺乳动物调控元件或内含子(例如，延伸因子1a增强子/启动子/内含子结构)调控。例如，如果需要，已知优先指导特定细胞类型中的基因表达的增强子可用于指导核酸的表达。所用的增强子可包括但不限于被表征为组织或细胞特异性增强子的那些增强子。可替代地，如果基因组克隆用作治疗构建体，则调控可以由同源调节序列介导，或者如果需要，由源自异源来源的调控序列(包括任何上述启动子或调控元件)介导。
递送基因组编辑试剂/系统的方法可以根据需要而变化。在某些实施方式中，作为在一种或多种质粒中的DNA构建体递送所选基因组编辑方法的组分。在某些实施方式中，经由病毒载体递送组分。常见的递送方法包括但不限于电穿孔、显微注射、基因枪、穿刺感染(impalefection)、静水压力、连续输注、超声处理、磁性转染(magnetofection)、腺相关病毒、病毒载体的包膜蛋白假型化、复制型载体顺式和反式作用元件、单纯疱疹病毒和化学媒介物(vehicle)(例如，寡核苷酸、脂复合物、聚合物囊泡(polymersome)、聚复合物(polyplexe)、树枝状聚合物、无机纳米颗粒和细胞穿透肽)。
5.5.制剂和施用
本公开的主题提供了包含本公开的细胞(例如，5.3节中公开的那些细胞)的组合物。在某些实施方式中，组合物是进一步包含药学上可接受的赋形剂/载体的药物组合物。
包含本公开细胞的组合物可方便地以无菌液体制剂(例如等渗水性溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物)来提供，其可缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物更便于施用，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可为包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适当混合物的溶剂或分散介质。
包含本公开细胞的组合物可全身地或直接提供给受试者，用于诱导和/或增强对抗原的免疫应答和/或治疗和/或预防瘤。在某些实施方式中，将本公开的细胞或包含其的组合物直接注射到感兴趣的器官(例如，受瘤影响的器官)中。可替代地，本公开的细胞或包含其的组合物例如通过施用于循环系统(例如肿瘤脉管系统)而间接提供给感兴趣的器官。在施用细胞或组合物之前、期间或之后，可提供扩增剂和分化剂，以增加细胞在体外或体内的产生。
待施用的细胞数量因待治疗的受试者而变化。在某些实施方式中，将约104至约1010个、约104至约107个、约105至约107个、约105至约109个，或约106至约108个本公开的细胞施用于受试者。在某些实施方式中，将约105至约107个本公开的细胞施用于受试者。更有效的细胞可以以更少的数量施用。通常至少将施用约l×105个细胞，最终达到约l×1010或更高。在某些实施方式中，向受试者施用至少约1×105、约5×105、约1×106、约5×106、约1×107、约5×107、约1×108或约5×108个本公开的细胞。在某些实施方式中，将约1×105个本公开的细胞施用于受试者。在某些实施方式中，将约5×105个本公开的细胞施用于受试者。在某些实施方式中，将约1×106个本公开的细胞施用于受试者。将被认为是有效剂量的精确确定可以基于每个受试者的个体因素，包括他们的大小、年龄、性别、体重和具体受试者的状况。本领域技术人员从本公开和本领域的知识中可以容易地确定剂量。
本公开的细胞和组合物可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉内施用、皮下施用、结内施用、瘤内施用、鞘内施用(intrathecal administration)、胸膜内施用、骨内施用、腹膜内施用、胸膜施用，并且直接施用至受试者。本公开的细胞可以在任何生理上可接受的媒介物中给药，通常是血管内给药，尽管它们也可以被引入骨或其中细胞可以找到合适的再生和分化位点的其它方便部位(例如胸腺)。可以通过注射、导管等方式引入细胞。
包含本文公开的细胞的组合物可以全身地或直接提供给受试者，用于诱导和/或增强对抗原的免疫应答和/或治疗和/或预防瘤(例如，癌症)、病原体感染或感染性疾病。在某些实施方式中，将本公开的细胞、组合物或核酸组合物直接注射入感兴趣的器官(例如，受瘤影响的器官)。可替代地，将本公开的细胞、组合物或核酸组合物间接提供至感兴趣的器官，例如，通过施用到循环系统(例如，肿瘤脉管系统)中。在施用细胞、组合物或核酸组合物之前、期间或之后，可提供扩增剂和分化剂，以在体外或体内增加细胞(例如，T细胞(例如，CTL细胞)或NK细胞)的产生。
本公开的组合物可以是包含本公开的细胞或其祖细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。施用可以是自体或异体的。例如，可以从一个受试者获得细胞或祖细胞，并施用于同一受试者或不同的相容受试者。外周血来源的细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生)可通过局部注射进行施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉注射或肠外施用。当施用本公开主题的治疗组合物(例如，包含本公开细胞的药物组合物)时，其可配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
在某些实施方式中，本公开的主题进一步提供了包含本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或核酸分子的药物组合物。在某些实施方式中，药物组合物包含药学上可接受的载体。如本文使用的，载体是指不干扰活性成分生物活性有效性的无毒物质。术语“生理上可接受的”是指与生物系统如细胞、细胞培养物、组织或有机体相容的无毒物质。载体的特性将取决于施用途径。生理学和药学上可接受的载体包括稀释剂、填充剂、盐缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域熟知的其他物质。
5.6.方法
本公开的主题提供了使用CD38 CCR、本公开的细胞、本公开的药物组合物或本公开的核酸组合物的多种方法。
如实施例1所示，CD38 CCR能够消除CD38在T细胞，如工程化T细胞，如表达CAR的T细胞上的表达。因此，CD38 CCR能够用于敲除CD38。本公开的主题提供了减少和/或消除CD38在细胞中表达的方法。在某些实施方式中，该方法包括转导细胞以包含CD38 CCR(如在5.2节中公开的CD38 CCR)，如细胞由此表达CD38 CCR。在某些实施方式中，该方法包含将编码CD38 CCR(如在5.2节公开的CD38 CCR)的核酸分子引入细胞中，如细胞由此表达CD38CCR。在某些实施方式中，CD38 CCR减少和/或消除CD38的细胞表面表达水平(如CD38在细胞表面的表达)。众所周知，在用抗CD38抗体达雷木单抗抗体治疗的患者的体外和体内出现CD38高NK细胞损耗(Wang et al.,Clin.Cancer Res.(2018)；24:4006–4017)。另一方面，残留的CD38低/-NK细胞可以表现出高增殖潜力和全功能活性，因此，此类NK细胞能够用于治疗(Wang(2018))。本公开的主题进一步提供了减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗的方法。在某些实施方式中，该方法包括转导NK细胞以包含CD38 CCR(如在5.2节公开的CD38 CCR)，如NK细胞由此表达CD38 CCR。在某些实施方式中，该方法包括将编码CD38 CCR的核酸分子(如在5.2节中公开的CD38 CCR)引入NK细胞，如NK细胞由此表达CD38 CCR。
如实施例1所示，表达不靶向CD38的CAR的T细胞具有CD38的高表达，从而能够在CAR-T细胞与CD38药物，如抗-CD38抗体组合使用时，引起CAR-T细胞的自相残杀。因此，可将进一步表达CD38 CCR的CAR-T细胞与CD38药物，如抗CD38抗体(如达雷木单抗)组合使用以治疗与CD38相关和/或表达CD38的疾病。因此，本公开的主题提供了用于治疗和/或预防受试者中的与CD38相关和/或表达CD38的疾病的方法。在某些实施方式中，该方法包括将(a)CD38药物和(b)细胞施用至受试者，其中该细胞包含(i)与该疾病的组织或细胞上表达的抗原结合的抗原识别受体和(ii)CD38 CCR。在某些实施方式中，该疾病是肿瘤。在某些实施方式中，减少了受试者的肿瘤负荷，如减少受试者中的肿瘤细胞的数量，减小肿瘤的尺寸和/或根除肿瘤。在某些实施方式中，该CD38药物是抗CD38抗体。抗CD38抗体的非限制性示例包括艾萨妥昔单抗和达雷木单抗。在某些实施方式中，抗CD38抗体是达雷木单抗。
与CD38相关和/或表达CD38的肿瘤的非限制性示例包括血液癌症、脑胶质瘤和实体瘤。在某些实施方式中，该肿瘤是血液癌症。血液癌症的非限制性示例包括多发性骨髓瘤(MM)，非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，华氏巨球蛋白血症，急性淋巴细胞白血病(ALL)，淋巴瘤和急性髓系白血病(AML)。在某些实施方式中，该肿瘤是多发性骨髓瘤。
在肿瘤的组织和/或细胞上表达的抗原的非限制性示例包括BCMA，GPRC5D，FcRL5，CD41，CD48，P2RY10，CD44v6，CD70，CD123，κ轻链，NYESO-1，BOB1，ADGRE2，CLEC12A，CCR1，LILRB2，CD5，CD7，CD10，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD34，CD38，CD56，BCMA，CS-1，CD138，Lewis抗原(LeY)，WT-1和ITGB7。在某些实施方式中，该抗原是BCMA。在某些实施方式中，与CD38相关和/或表达CD38的肿瘤是实体瘤。实体瘤包括肉瘤和癌(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌，乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原癌、胚胎癌、肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤，听神经瘤、少腺胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。在某些实施方式中，该实体瘤选自由乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌和胰腺癌、肝细胞癌(HCC)和纤维板层样癌组成的组。
此外，本公开的主题提供了治疗和/或预防受试者的肿瘤、病原体感染、感染性疾病和/或自身免疫性疾病的方法。在某些实施方式中，该方法包括将本文中公开的细胞(如在5.3节中公开的细胞)或包含它们的组合物(如在5.5节中公开的组合物)施用至受试者。在某些实施方式中，该肿瘤和/或病原体感染与CD38相关和/或表达CD38。在某些实施方式中，该方法进一步包括施用CD38药物，如抗CD38抗体。
对于治疗，施用的量是有效产生预期效果的量。有效量可在一次或一系列施用中提供。有效量能够以通过间断(bolus)或通过持续灌注提供。
本公开的主题进一步提供了本文公开的表达CAR和CCR或本文公开的核酸分子的免疫细胞，用作药物。在某些实施方式中，该药物是用于治疗恶性肿瘤的药物。在某些实施方式中，该恶性肿瘤是血液恶性肿瘤。在某些实施方式中，本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或本文公开的核酸分子被用于预防性施用或治疗性施用至患有恶性肿瘤的人。在某些实施方式中，该恶性肿瘤是血液恶性肿瘤。因此，可将本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或本文公开的核酸分子施用至怀疑患有恶性肿瘤的个体，或施用至已经证实患有恶性肿瘤的个体，以减轻所述恶性肿瘤的体征和症状。
在某些实施方式中，本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或公开的核酸分子的施用以有效量提供给有需要的个体。在某些实施方式中，本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或核酸分子的有效量是足够大以产生其中恶性肿瘤的症状得到改善，或恶性肿瘤的可能性降低的预期效果的剂量。在某些实施方式中，该治疗有效量不会引起不良的副作用。通常，治疗有效量可因个体的年龄、状况和性别以及疾病的程度而变化，并且能够由本领域技术人员确定。在存在任何并发症的情况下，剂量能够由私人医生调整。在某些实施方式中，治疗有效量可在约0.01mg/kg至约500mg/kg之间、约0.1mg/kg至约200mg/kg之间、约0.2mg/kg至约20mg/kg之间变化，每天一剂或多剂给药，持续一天或几天。在某些实施方式中，治疗有效量可在约0.2mg/kg至约20mg/kg之间变化，每天一剂或多剂给药，持续一天或几天。在某些实施方式中，本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或核酸分子的施用进行2天至5天或连续更多天以有效治疗恶性肿瘤。
在某些实施方式中，本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或核酸分子可通过注射或随着时间推移逐渐输注的方式施用。在某些实施方式中，本文公开的表达CAR和CCR或核酸分子的免疫细胞的施用是肠胃外的(如静脉内的)、腹腔内的、鼻内的、或肌肉内的。在某些实施方式中，用于肠胃外施用的制剂包括无菌水或非水性溶液悬浮液和乳液。非水性溶剂的非限制性示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括但不限于水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外溶媒包括但不限于氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内溶媒包括但不限于流体和营养补充剂、电解液补充剂(如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如但不限于抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
在某些实施方式中，本公开的主题还提供了本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或核酸分子，用在治疗恶性肿瘤和/或感染的方法中。
在某些实施方式中，本公开的主题还提供了用于治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括将本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或核酸分子提供至有需要的个体中以由此治疗该个体。
在某些实施方式中，本公开的主题进一步提供了通过施用根据本公开的主题的药物组合物来治疗患者中恶性肿瘤的方法。在某些实施方式中，该恶性肿瘤是血液恶性肿瘤。在某些实施方式中，所述方法可进一步包括施用免疫检查点抑制剂。
免疫检查点抑制剂是指阻断免疫细胞和其他细胞或细胞因子之间的抑制性相互作用并可以由此增加细胞(如癌细胞或被感染的细胞)的杀伤的分子。检查点相互作用分子的非限制性示例是PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/B7-2。
在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂是阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的分子。在某些实施方式中，阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的所述分子是针对PD1的抗体和/或针对PDL1的抗体。免疫检查点抑制剂包括，例如但不限于，PD1或PD-L1阻断剂，如帕博利珠单抗(Merck)、纳武利尤单抗(Bristol-Myers Squibb)、匹地利珠单抗(Medivation/Pfizer)、MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca)和PDR001(Novartis)；融合蛋白，如PD-L2 Fc融合蛋白(AMP-224；GlaxoSmithKline)；阿特珠单抗(Roche/Genentech)，阿维单抗(Merck/Serono和Pfizer)，德瓦鲁单抗(AstraZeneca)，西米普利单抗(Regeneron/Sanofi/Genzyme)；BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)；和小分子抑制剂，如PD-1/PD-L1抑制剂1(WO2015034820；(2S)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基-3-苯基苯基)甲氧基]苯基]甲基]吡啶-2-羧酸)，BMS202(PD-1/PD-L1抑制剂2；WO2015034820；N-[2-[[[2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1'-联苯基]-3-基)-甲氧基]-3-吡啶基]甲基]氨基]乙基]-乙酰胺)和PD-1/PD-L1抑制剂3(WO/2014/151634；(3S,6S,12S,15S,18S,21S,24S,27S,30R,39S,42S,47aS)-3-((1H-咪唑-5-基)甲基)-12,18-双((1H-吲哚-3-基)甲基)-N,42-双(2-氨基-2-氧代乙基)-36-苄基-21,24-二丁基-27-(3-胍基丙基)-15-(羟甲基)-6-异丁基-8,20,23,38,39-五甲基-1,4,7,10,13,)。此外，抗-PD1分子包括纬拉妥珠单抗(Seattle Genetics)。
在某些实施方式中，阻断CTLA4的免疫检查点抑制剂包括伊匹单抗(Bristol-Myers-Squibb)。
在某些实施方式中，本公开的主题进一步提供了本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或核酸分子在制备用于治疗患有恶性肿瘤或怀疑患有恶性肿瘤的个体的药物中的用途。在某些实施方式中，治疗恶性肿瘤的方法包括从患者分离免疫细胞(如T细胞或NK细胞)；通过使本文公开的CAR和CCR能够表达(例如，通过在所述经分离的免疫细胞中引入本文公开的载体)来修饰免疫细胞；并将经修饰的免疫细胞施用至患者。在某些实施方式中，该恶性肿瘤是血液恶性肿瘤。
本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或核酸分子将附着于癌细胞，如上文所指出的，并偶联T细胞和/或NK细胞，从而阐明针对癌细胞的免疫应答，这将减少甚至消除所述细胞。本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或核酸分子的小尺寸使得本文公开的表达CAR和CCR的所述免疫细胞或所述核酸分子成为癌症的治疗工具。本文公开的表达CAR和CCR的免疫细胞或核酸分子为癌症的治疗提供了巨大的希望。
在某些实施方式中，该病原体感染是病毒感染。病毒感染的非限制性示例包括由巨细胞病毒(CMV)，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、己型或庚型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒(HIV)，腺病毒，BK多瘤病毒，冠状病毒，柯萨奇病毒，脊髓灰质炎病毒，单纯疱疹病毒1型，单纯疱疹病毒2型，人类巨细胞病毒，人类疱疹病毒8型，水痘-带状疱疹病毒，流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，副流感病毒，呼吸道合胞体病毒，乳头瘤病毒，狂犬病毒和风疹病毒引起的那些病毒性感染。其他的病毒靶标包括副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(如肺炎病毒、麻疹病毒、偏肺病毒、呼吸道病毒属(respirovirus)或腮腺炎病毒属(rubulavirus))、腺病毒科(Adenoviridae)(如腺病毒)、沙粒病毒科(Arenaviridae)(如沙粒病毒，如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)、动脉病毒科(Arteriviridae)(如猪呼吸与繁殖综合征病毒或马动脉炎病毒)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(如白蛉病毒或汉坦病毒)、杯状病毒科(Caliciviridae)(如诺瓦克病毒)、冠状病毒科(Coronaviridae)(如冠状病毒或环曲病毒)、丝状病毒科(Filoviridae)(如埃博拉样病毒)、黄病毒科(Flaviviridae)(如肝炎病毒或黄病毒)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(如单纯疱疹病毒属(simplexvirus)、水痘疱疹病毒属(varicellovirus)、巨细胞病毒、玫瑰疹病毒(roseolovirus)或淋巴潜隐病毒(lymphocryptovirus))、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(如流感病毒或托高土病毒属(thogotovirus))、细小病毒科(Parvoviridae)(如细小病毒)、小核糖核酸病毒科(Picomaviridae)(如肠病毒属(enterovirus)或肝病毒属(hepatovirus))、痘病毒科(Poxviridae)(如正痘病毒属(orthopoxvirus)、禽痘病毒属(avipoxvirus)或兔痘病毒属(leporipoxvirus))、逆转录病毒科(Retroviridae)(如慢病毒属(lentivirus)或泡沫病毒属(spumavirus))、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(如轮状病毒)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(如狂犬病病毒属(lyssavirus)、粒外弹状病毒属(novirhabdovirus)或水疱病毒属(vesiculovirus))和披膜病毒科(Togaviridae)(如甲病毒属(alphavirus)或风疹病毒属(rubivirus))。在某些实施方式中，该病毒感染包括人呼吸道冠状病毒、甲型-丙型流感病毒、甲型至庚型肝炎病毒和单纯疱疹病毒1-9。在某些实施方式中，该受试者具有免疫缺陷。
在某些实施方式中，该病原体感染是细菌感染。细菌感染的非限制性示例包括分枝杆菌(Mycobacteria)、立克次氏菌(Rickettsia)、支原体(Mycoplasma)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)、奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrheoeae)、军团杆菌(Legionella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、链球菌(Streptococci)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、白喉棒状杆菌(Corynobacteria diphtheriae)、梭菌属spp.(Clostridium spp.)、肠产毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Eschericia coli)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、立克次氏菌(Rickettsia)、汉氏巴尔通体(Bartonellahenselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、贝纳柯克斯体(Coxiellaburnetii)、衣原体(chlamydia)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、沙门菌(Salmonella)、贺氏菌(shigella)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)；嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；产单核细胞李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；支原体属spp.(Mycoplasma spp.)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、钩端螺旋体(Leptospira)、疏螺旋体属(Borrelia)、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、马耳他布氏杆菌(Brucella melitensis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肠杆菌属(Enterobacter)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、变形杆菌(Proteus)和肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)。
在某些实施方式中，该病原体感染是真菌感染。真菌感染的非限制性示例包括伞枝犁头霉、Acremoniumfalciforme、基利枝顶孢、瑞塞菲枝顶孢、Ajellomycesdermatitidis、A.capsulata、曲霉菌属spp.(如黄曲霉菌、烟曲霉、构巢曲霉、黑曲霉菌和土曲霉菌)、念珠菌属spp.(如白念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、C.ke yr,C.tropicalis)、新型隐球菌、雅致小克银汉霉、伊蒙微小菌、絮状表皮癣菌、皮炎外瓶霉、威尼克外瓶霉、甄氏外瓶霉、棘状外瓶霉、E.richardsiae、新型线黑粉菌、紧密着色真菌、裴氏着色霉、荚膜组织胞浆菌、Leptoshaeria senegarlensis、足马杜拉分枝菌、稻瘟病菌、糠秕马拉色菌、微孢子菌属spp.、罗萨梯新龟甲形菌、巴西副球孢子菌、马尔尼菲青霉菌、疣状瓶霉、何德毛结节菌、卡氏肺孢菌、波氏假性阿利什霉、罗麦卢棘壳孢、微小根毛霉、申克氏孢子丝菌、发癣菌属spp.、白吉利毛孢子菌和斑替木丝霉。
自身免疫性疾病和炎症性疾病或它们的病症的非限制性示例包括关节炎，如风湿性关节炎(RA)、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、银屑病、银屑病性关节炎、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫病、克罗恩病、多发性硬化症、系统性硬化症、哮喘、器官移植排斥应答、与移植相关的疾病或病症、大动脉炎、巨细胞动脉炎、川崎病、结节性多动脉炎、白塞氏综合征、韦格纳肉芽肿病、ANCA血管炎、丘尔格-施特劳斯综合征、显微镜下多血管炎、结缔组织病血管炎、Hennoch-Schonlein紫癜、冷球蛋白血症性血管炎、皮肤白细胞破碎性血管炎、肉样瘤病、科干综合征、Wiskott-Aldrich综合征、原发性中枢神经系统血管炎、血栓闭塞性脉管炎、副肿瘤动脉炎、骨髓增生异常综合征、持久性隆起性红斑、淀粉样变性、自身免疫性肌炎、格林巴利综合症、组织细胞增生症、特应性皮炎、肺纤维化、血管球性肾炎、惠普尔病、斯蒂尔病、干燥综合征、骨髓纤维化、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、木村病、系统性硬化症、慢性主动脉周围炎、慢性前列腺炎、特发性肺纤维化、慢性肉芽肿病、特发性的博莱霉素诱导的肺炎、阿糖胞苷诱导的肺炎、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性淋巴细胞减少症、慢性自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性肝炎、桥本氏甲状腺炎、特应性甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性多腺体综合征、自身免疫性艾迪生综合征和/或重症肌无力。根据本公开的主题，上述各种方法可包括向受试者施用检查点免疫阻断剂。
受试者可患有晚期疾病，在这种情况下，治疗目的可包括缓解或逆转疾病进展和/或改善副作用。受试者可具有已经接受过治疗的病史，在这种情况下，治疗目的通常包括降低或延迟复发风险。
可对本公开的主题引入进一步的修饰以避免或最小化免疫并发症(称为“恶性T细胞转化”)的风险，如移植物抗宿主病(GvHD)或当健康组织表达与肿瘤细胞相同的靶抗原时，导致类似GvHD的结果。该问题的潜在解决方案是将自杀基因工程化到本公开的细胞中。合适的自杀基因包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、诱导型Caspase 9自杀基因(iCasp-9)和截短的人类表皮生长因子受体(EGFRt)多肽。在某些实施方式中，该自杀基因是EGFRt多肽。该EGFRt多肽可通过施用抗EGFR单克隆抗体(如西妥昔单抗)消除T细胞。EGFRt可以共价连接到靶向CD19的CAR的上游。自杀基因可包括在包含编码例如但不限于本公开的靶向BCMA的CAR的核酸的载体中。以这种方式，在恶性T细胞转化(如GVHD)过程中，施用旨在激活自杀基因的前药(例如，可激活iCasp-9的前药(例如，AP1903)触发自杀基因激活的表达靶向BCMA的CAR的T细胞的凋亡。将自杀基因引入到本公开的靶向BCMA的CAR中增加了安全性，能够在非常短的时间内消除大多数受体表达细胞。本公开的引入了自杀基因的细胞可以在细胞输注后的给定时间点被预先消除，或者在出现毒性的早期迹象时被根除。
5.7.试剂盒
本公开的主题提供了减少和/或消除细胞中CD38表达、减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗、治疗和/或预防受试者中肿瘤或病原体感染(如自身免疫性疾病或传染病)、和/或治疗和/或预防受试者中与CD38相关的肿瘤的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包括有效量的本公开细胞、本公开的组合物或本公开的核酸组合物。在某些实施方式中，试剂盒包括无菌容器，这种容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、吸塑包装(blister-pack)或本领域已知的其他合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合盛放药物的材料制成。在某些非限制性实施方式中，试剂盒包括编码针对感兴趣抗原的抗原识别受体(例如，CAR或TCR)的分离的核酸分子和编码可表达形式的CD38 CCR的分离的核酸分子，其可选地包括在相同或不同的载体中。
如果需要，提供细胞、组合物或核酸组合物以及用于将所述细胞、组合物或核酸组合物施用至患有或由可能发展肿瘤(如癌症)或病原体感染(如传染病)或免疫紊乱(如自身免疫性疾病)的受试者的说明书。说明书中通常包括关于使用细胞、组合物或核酸组合物用于减少和/或消除细胞中CD38表达、减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗、治疗和/或预防受试者中肿瘤或病原体感染(如自身免疫性疾病或传染病)、和/或治疗和/或预防受试者中与CD38相关的肿瘤的信息。在某些实施方式中，说明书包括以下至少一项：治疗剂的描述，用于减少和/或消除细胞中CD38表达、减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗、治疗和/或预防受试者中肿瘤或病原体感染(如自身免疫性疾病或传染病)、和/或治疗和/或预防受试者中与CD38相关的肿瘤的用药方案和施用，注意事项，警告，适应症，禁忌症，超剂量信息，不良反应，动物药理学，临床研究，和/或参考文献。说明书可以直接印在容器上(当存在时)，或作为标签贴在容器上，或作为活页、小册子、卡片或传单随容器提供。
5.8.示例性实施方式
A1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种减少和/或消除细胞中CD38表达的方法，包括将细胞转导成包含与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)。
A2.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种减少和/或消除细胞中CD38表达的方法，包括将编码与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)的核酸分子引入细胞中。
A3.前述A1或A2的方法，其中CD38表达是细胞的细胞表面上的CD38表达水平。
A4.前述A1至A3中任一项的方法，其中细胞包括与抗原结合的抗原识别受体。
A5.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗的方法，包括将细胞转导成包含与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)。
A6.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗的方法，包括将编码与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)的核酸分子引入NK细胞中。
A7.前述A5或A6的方法，其中NK细胞包括与抗原结合的抗原识别受体。
A8.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种治疗和/或预防受试者中与CD38相关和/或表达CD38的疾病的方法，包括向受试者施用(a)CD38药物和(b)细胞；所述细胞包括(i)与疾病的组织或细胞上表达的抗原结合的抗原识别受体，和(ii)与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)。
A9.前述A8的方法，其中疾病是肿瘤。
A10.前述A9的方法，其中肿瘤选自由血液癌、胶质母细胞瘤和实体瘤组成的组。
A11.前述A10的方法，其中肿瘤是血液癌。
A12.前述A10或A11的方法，其中血液癌选自由多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、华氏巨球蛋白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、淋巴瘤和急性髓系白血病(AML)组成的组。
A13.前述A12的方法，其中肿瘤是多发性骨髓瘤。
A14.前述A8至A13中任一项的方法，其中抗原选自由BCMA、GPRC5D、FcRL5、CD41、CD48、P2RY10、CD44v6、CD70、CD123、κ轻链、NYESO-1、BOB1、ADGRE2、CLEC12A、CCR1、LILRB2、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD56、BCMA、CS-1、CD138、Lewis抗原(LeY)、WT-1和ITGB7组成的组。
A15.前述A10的方法，其中肿瘤是实体瘤。
A16.前述A10或A15的方法，其中实体瘤选自乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌和胰腺癌，肝细胞癌(HCC)和纤维板层样癌。
A17.前述A8至A16中任一项的方法，其中CD38药物是抗CD38抗体。
A18.前述A17的方法，其中抗CD38抗体是艾萨妥昔单抗或达雷木单抗。
A19.前述A1至A4和A8至A18中任一项的方法，其中细胞是免疫应答性细胞。
A20.前述A1至A4和A8至A19中任一项的方法，其中细胞是淋巴系细胞或髓系细胞。
A21.前述A1至A4和A8至A20中任一项的方法，其中细胞选自由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞组成的组。
A22.前述A1至A4和A8至A21中任一项的方法，其中细胞是T细胞。
A23.前述A22的方法，其中T细胞选自由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞组成的组。
A24.前述A1至A4和A8至A21中任一项的方法，其中细胞是自然杀伤(NK)细胞。
A25.前述A4和A7至A24中任一项的方法，其中抗原识别受体选自由T细胞受体(TCR)、TCR样融合分子或嵌合抗原受体(CAR)组成的组。
A26.前述A25的方法，其中TCR样融合分子是包括抗原结合链的重组T细胞受体(TCR)，该抗原结合链包括：(a)以HLA非依赖性方式与抗原结合的免疫球蛋白可变区的抗原结合片段；和(b)能与CD3ζ多肽关联的恒定结构域。
A27.前述A26的方法，其中恒定结构域包括天然或经修饰的TRAC多肽，或者天然或经修饰的TRBC多肽。
A28.前述A26或A27的方法，其中将CD3ζ多肽融合到共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
A29.前述A25方法，其中抗原识别受体是CAR。
A30.前述A29的方法，其中CAR包括细胞内结构域和与抗原结合的细胞外抗原结合结构域。
A31.前述A30的方法，其中CAR的细胞内结构域包括CD3ζ多肽。
A32.前述A26至A28和A31中任一项的方法，其中CD3ζ多肽是天然或经修饰的CD3ζ多肽。
A33.前述A32的方法，其中经修饰的CD3ζ多肽包括天然ITAM1、由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体和由两个功能丧失突变组成的ITAM3变体。
A34.前述A30至A33中任一项的方法，其中CAR的细胞内结构域进一步包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
A35.前述A4或A17的方法，其中抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。
A36.前述A35的方法，其中抗原是肿瘤抗原。
A37.前述A35的方法，其中抗原是磷酸化抗原。
A38.前述A35或A36的方法，其中肿瘤抗原选自由CD19，碳酸酐酶IX(CAIX)，癌胚抗原(CEA)，CD8，CD7，CD10，CD20，CD22，CD30，CD33，CLL1，CD34，CD41，CD44，CD49f，CD56，CD74，CD133，CD138，CD123，CD44V6，感染巨细胞病毒(CMV)的细胞的抗原，ENPP3，上皮糖蛋白-2(EGP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶Erb-B2、Erb-B3、Erb-B4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-α，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人表皮生长因子受体2(HER-2)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)，κ-轻链，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis Y(LeY)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)，粘蛋白16(MUC16)，粘蛋白1(MUC1)，间皮素(MSLN)，ERBB2，MAGEA3，p53，MART1，GP100，蛋白酶3(PR1)，酪氨酸酶，存活素，hTERT，EphA2，NKG2D配体，癌睾丸抗原NY-ESO-1，癌胎抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，ROR1，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，Wilms肿瘤蛋白(WT-1)，BCMA，GPRC5D，FcRL5，ITGB7，NKCS1，EGF1R，EGFR-VIII，CD99，CD70，ADGRE2，CCR1，LILRB2，PRAME，CD48，P2RY10，CD70，BOB1，CLEC12A，CCR1，LILRB2，CD5，CD38，CS-1，Lewis抗原(LeY)和ERBB组成的组。
A39.前述A1至A38中任一项的方法，其中CCR包括与CD38结合的细胞外抗原结合结构域和能够向细胞传递共刺激信号但不单独向细胞传递激活信号的细胞内结构域。
A40.前述A39的方法，其中CCR的细胞内结构域包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
A41.前述A28、A34和A40中任一项的方法，其中共刺激分子选自由CD28、4-1BB、OX40、CD17、CD40、CD154、CD97、CD11a/CD18、ICOS、DAP-10、CD2、CD244、CD27和NKG2D组成的组。
A42.前述A41的方法，其中共刺激分子是4-1BB。
A43.前述A41的方法，其中共刺激分子是CD28。
A44.前述A40的方法，其中CCR的细胞内结构域包括CD28共刺激分子的细胞内结构域和41-BB共刺激分子的细胞内结构域。
B1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种细胞，包括：
(a)与抗原结合的抗原识别受体；和
(b)与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)，
其中细胞对抗原单一阳性的细胞表现出实质的细胞溶解活性。
B2.前述B1的细胞，其中抗原识别受体以1×10-8M或更低的解离常数(Kd)与抗原结合。
B3.前述B1或B2的细胞，其中抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。
B4.前述B3的细胞，其中抗原是肿瘤抗原。
B5.前述B3的细胞，其中抗原是磷酸化抗原。
B6.前述B4或B5的细胞，其中肿瘤抗原选自由CD19，碳酸酐酶IX(CAIX)，癌胚抗原(CEA)，CD8，CD7，CD10，CD20，CD22，CD30，CD33，CLL1，CD34，CD41，CD44，CD49f，CD56，CD74，CD133，CD138，CD123，CD44V6，感染巨细胞病毒(CMV)的细胞的抗原，ENPP3，上皮糖蛋白-2(EGP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶Erb-B2、Erb-B3、Erb-B4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-α，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人表皮生长因子受体2(HER-2)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)，κ-轻链，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis Y(LeY)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)，粘蛋白16(MUC16)，粘蛋白1(MUC1)，间皮素(MSLN)，ERBB2，MAGEA3，p53，MART1，GP100，蛋白酶3(PR1)，酪氨酸酶，存活素，hTERT，EphA2，NKG2D配体，癌睾丸抗原NY-ESO-1，癌胎抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，ROR1，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，Wilms肿瘤蛋白(WT-1)，BCMA，GPRC5D，FcRL5，ITGB7，NKCS1，EGF1R，EGFR-VIII，CD99，CD70，ADGRE2，CCR1，LILRB2，PRAME，CD48，P2RY10，CD70，BOB1，CLEC12A，CCR1，LILRB2，CD5，CD38，CS-1，Lewis抗原(LeY)和ERBB组成的组。
B7.前述B1至B6中任一项的细胞，其中抗原识别受体选自由T细胞受体(TCR)、TCR样融合分子或嵌合抗原受体(CAR)组成的组。
B8.前述B7的细胞，其中TCR样融合分子是包括抗原结合链的重组T细胞受体(TCR)，所述抗原结合链包括：(a)以HLA非依赖性方式与抗原结合的免疫球蛋白可变区的抗原结合片段；和(b)能与CD3ζ多肽关联的恒定结构域。
B9.前述B8的细胞，其中恒定结构域包括天然或经修饰的TRAC多肽，或者天然或经修饰的TRBC多肽。
B10.前述B8或B9的细胞，其中CD3ζ多肽被融合到共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
B11.前述B8的细胞，其中抗原识别受体是CAR。
B12.前述B11的细胞，其中CAR包括细胞内结构域和与抗原结合的细胞外抗原结合结构域。
B13.前述B11的细胞，其中CAR的细胞内结构域包括CD3ζ多肽。
B14.前述B8至B10和B13中任一项的细胞，其中CD3ζ多肽是天然或经修饰的CD3ζ多肽。
B15.前述B14的细胞，其中经修饰的CD3ζ多肽包括天然ITAM1、由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体和由两个功能丧失突变组成的ITAM3变体。
B16.前述B10至B15中任一项的细胞，其中CAR的细胞内结构域进一步包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
B17.前述B1至B16中任一项的细胞，其中CCR包括与CD38结合的细胞外抗原结合结构域和能够向细胞传递共刺激信号但不单独向细胞传递激活信号的细胞内结构域。
B18.前述B17的细胞，其中CCR的细胞内结构域包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
B19.前述B16至B18中任一项的细胞，其中共刺激分子选自由CD28、4-1BB、OX40、CD17、CD40、CD154、CD97、CD11a/CD18、ICOS、DAP-10、CD2、CD244、CD27和NKG2D组成的组。
B20.前述B19的细胞，其中共刺激分子是4-1BB。
B21.前述B19的细胞，其中共刺激分子是CD28。
B22.前述B18的细胞，其中CCR的细胞内结构域包括CD28共刺激分子的细胞内结构域和41-BB共刺激分子的细胞内结构域。
B23.前述B1至B22中任一项的细胞，其中细胞是免疫应答性细胞。
B24.前述B1至B23中任一项的细胞，其中细胞选自由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞组成的组。
B25.前述B1至B24中任一项的细胞，其中细胞是T细胞。
B26.前述B25的细胞，其中T细胞选自由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞组成的组。
B27.前述B1至B24中任一项的细胞，其中细胞是自然杀伤(NK)细胞。
C1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种含有B1至B27中任一项的细胞的组合物。
C2.前述C1的组合物，是包含有药学上可接受载体的药物组合物。
D1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种核酸组合物，包括：(a)编码与抗原结合的抗原识别受体的第一多核苷酸；和(b)编码与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)的第二多核苷酸，其中包含组合物的细胞对抗原单一阳性的细胞表现出实质的细胞溶解活性。
E1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种包括D1的核酸组合物的载体。
F1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种包括D1的核酸组合物的细胞。
F2.前述F1的细胞，其中细胞是免疫应答性细胞。
F3.前述F1或F2的细胞，其中细胞选自由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞组成的组。
F4.前述F1至F3中任一项的细胞，其中细胞是T细胞。
F5.前述F4的细胞，其中T细胞选自由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞组成的组。
F6.前述F1至F3中任一项的细胞，其中细胞是自然杀伤(NK)细胞。
G1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种治疗和/或预防受试者中肿瘤和/或病原体感染的方法，包括向受试者施用B1至B27和F1至F6中任一项的细胞或者C1或C2的组合物。
G2.前述G1的方法，其中肿瘤或病原体感染与CD38相关，和/或表达CD38。
G3.前述G1或G2的方法，进一步包括向受试者施用CD38药物。
G4.前述G3的方法，其中CD38药物是抗CD38抗体。
H1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种表达嵌合抗原受体(CAR)和嵌合共刺激受体(CCR)的免疫细胞，例如T细胞或NK细胞，
a)其中CAR包括：
i.细胞内CD3ζ信号传导结构域；
ii.共刺激CD28细胞内结构域；
iii.CD28跨膜结构域；和
iv.与第一抗原结合的抗原特异性结合结构域；
b)其中CCR包括：
i.共刺激CD28细胞内结构域和共刺激4-1BB细胞内结构域；
ii.CD28跨膜结构域；和
iii.与第二抗原结合的抗原特异性结合结构域；
其中抗原特异性结合结构域存在于免疫细胞的表面，并且其中第一抗原与第二抗原不同。
H2.前述H1的免疫细胞，其中第一抗原和第二抗原选自由CD41、CD48、P2RY10、CD44v6、CD70、CD123、κ轻链、NYESO-1、BOB1、ADGRE2、CLEC12A、CCR1、LILRB2、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD56、BCMA、CS-1、CD138、Lewis抗原(LeY)和WT-1组成的组。
H3.前述H1或H2的免疫细胞，其中第一抗原是CD19。
H4.前述H1至H3中任一项的免疫细胞，其中第二抗原是CD38。
H5.前述H1至H4中任一项的免疫细胞，其中CAR的细胞内信号传导结构域包括人CD3ζ的细胞内结构域或其变体。
H6.前述H1至H5中任一项的免疫细胞，其中CCR的细胞内结构域包括人共刺激CD28细胞内结构域和人共刺激4-1BB细胞内结构域，或它们的变体。
H7.前述H1至H6中任一项的免疫细胞，其中：
a)CAR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段；
b)CCR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段；或
c)CAR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段，并且CCR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段。
H8.前述H1至H7中任一项的免疫细胞，其中CAR和CCR的共刺激CD28细胞内结构域大致是相同的。
J1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种使H1至H8中任一项所限定的嵌合抗原受体(CAR)和嵌合共刺激受体(CCR)能在合适的免疫细胞，例如人T细胞或人NK细胞中表达的核酸分子。
J2.前述J1的核酸分子，存在于载体中，例如存在于病毒载体中。
K1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种药物组合物，包括H1至H8中任一项的免疫细胞，或者J1或J2的核酸分子。
I1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种生产H1至H8中任一项的免疫细胞的方法，包括：
a)提供免疫细胞，例如人免疫细胞，例如人T细胞或人NK细胞，和
b)通过使H1至H8中任一项所限定的CAR和CCR能在免疫细胞中表达来修饰免疫细胞。
L1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种治疗患者中恶性肿瘤，例如血液恶性肿瘤的方法，包括：
a)分离免疫细胞，例如T细胞或NK细胞，由此所述免疫细胞从所述患者分离出来；
b)通过使H1至H8中任一项所限定的CAR和CCR能在免疫细胞中表达来修饰免疫细胞；和
c)向患者施用经修饰的免疫细胞。
M1.在某些非限制性实施方式中，本公开的主题提供了一种治疗患者中恶性肿瘤，例如血液恶性肿瘤的方法，包括施用K1的药物组合物。
M2.前述M1的方法，进一步包括施用检查点抑制剂。
6.实施例
除非另有说明，否则本公开的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术完全在本领域技术人员的能力范围内。这些技术在文献中有充分的解释，例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，second edition(Sambrook，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait，1984)；“AnimalCell Culture”(Freshney，1987)；“Methods in Enzymology”“Handbook of ExperimentalImmunology”(Weir，1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller andCalos，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel，1987)；“PCR：ThePolymerase Chain Reaction”，(Mullis，1994)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan，1991)。这些技术适用于本文中公开的多核苷酸和多肽的生产，因此在制造和实践本公开时可考虑这些技术。对特定实施方式特别有用的技术将在下面的部分讨论。
提出下列实施例是为了向本领域的普通技术人员提供关于如何制造和使用本公开的细胞和组合物的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为他们的发明的范围。
实施例1——通过CD38 CCR敲除CD38
首先，测量表达靶向CD38的CAR的T细胞和未转导的T细胞上的CD38的表达水平。如图1所示，未转导的T细胞表达高水平的CD38，而表达靶向CD38的CAR的T细胞失去CD38表达，这表明靶向CD38的CAR引起CD38的自相残杀和/或内化。
接下来，在表达靶向CD19的CAR的T细胞的细胞表面表达CD38 CCR。如图2所示，表达靶向CD19的CAR和CD38 CCR的T细胞表面上消除了CD38表达，这表明CD38被CD38-CCR内化。因此，表达CAR和CD38 CCR的T细胞是CD38阴性的，而没有对CD38基因座进行任何遗传操作。
总之，CD38被CD38 CCR内化，引起CAR-T细胞上CD38表达被消除。因此，CD38 CCR可用于减少和/或消除T细胞，如工程化的T细胞(如表达CAR的T细胞)上的CD38表达(如敲除)。在存在CD38 CCR的情况下，不需要敲除T细胞上的CD38来产生CAR-T细胞。CD38 CCR还能避免CD38药物(如抗CD38抗体)引起的CAR-T细胞的自相残杀。因此，进一步表达CD38 CCR的CAR-T细胞可与CD38药物(如抗CD38抗体(如达雷木单抗))组合使用，用于治疗与CD38相关和/或表达CD38的疾病。
实施例2—BCMA-CAR+CD38-CCR的TRAC靶向构建体设计
使用CRISPR-Cas9来诱导双键断裂，并且使用同源定向修复将靶向BCMA的CAR和CD38 CCR插入到TRAC基因座。参见图3A。靶向BCMA的CAR和CD38 CCR都在TRAC启动子下表达。参见图3A。使用相同的方法，靶向BCMA的CAR在TRAC启动子下表达；而CD38-CCR在TRAC基因座中在另一选择的启动子(如EF1a启动子)下表达。参见图3B。
实施例3—CAR和CD38 CCR的递送
图4A至图4D展示了将CAR和CD38 CCR递送到细胞的各种方法。如图4A所示，将靶向BCMA的CAR和CD38 CCR整合到TRAC基因座(敲入(KI))，从而敲除TRAC基因座。此外，使用包括gRNA分子的CRISPR方法引入B2M敲除。
如图4B所示，将靶向BCMA的CAR整合到TRAC基因座(敲入(KI))，从而敲除TRAC基因座。CD38 CCR被整合到B2M基因座的外显子1处，从而引入B2M敲除。
如图4C所示，将靶向BCMA的CAR和CD38 CCR整合到TRAC基因座(敲入(KI))，从而敲除TRAC基因座。此外，使用包括gRNA分子的CRISPR方法引入B2M敲除。此外，使用包括gRNA分子的CRISPR方法引入CIITA敲除。
如图4D所示，将靶向BCMA的CAR整合到TRAC基因座(敲入(KI))，从而敲除TRAC基因座。CD38 CCR被整合到CIITA基因座的外显子3处，从而引入B2M CIITA敲除。此外，使用包括gRNA分子的CRISPR方法引入B2M敲除。
实施例4—CAR和CCR的结合同时增强T细胞对低抗原密度的敏感性和持久性研究 设计
该实施例的目的是研究用CAR和CCR双重靶向肿瘤将会改善工程化T细胞的治疗结果的假设。为了在MM和ALL的血液肿瘤模型中测试这个策略，选择CD38作为CCR靶，一种在各种血液肿瘤中表达的分子。首先，研究与常规单一靶向BCMA-CAR T或CD19-CAR T细胞相比，CAR+CCR T细胞的细胞毒性潜力。研究了观察到的细胞溶解能力增加的机制和CCR的细胞外和细胞内部分的贡献。接下来，使用低BCMA和CD19密度的MM和ALL肿瘤细胞系研究与CAR T细胞相比CAR+CCR T细胞的识别敏感性。第二个目的是评估CAR+CCR T细胞的细胞因子产生、扩增潜力和分化，以及CCR的细胞外和细胞内部分的贡献。
对于体内模型，将小鼠(每组最少n＝4)随机分为治疗组。进一步，分析CAR+CCR T细胞的抗肿瘤效力和持久性以及它们对低靶抗原密度肿瘤变体的效力。动物实验是在动物科学程序中央机构(CCD)的批准下进行的。所有原始样品(健康供体和患者材料)均经在知情同意和机构医学伦理委员会批准后获得。每个实验使用来自至少四个不同供体的T细胞进行多次并且我们展示了汇总数据。实验数据中没有异常值。
材料和方法
细胞系在具有10％ HyClone Fetal Clone I(Fisher Scientific)和抗生素(青霉素；100U/mL，链霉素；100mg/mL)的RPMI1640(Thermo Fisher Scientific)中培养人细胞系MM1.S、Um9、K562、U266和NALM6(未修饰的或表达荧光素酶)。K562细胞被慢病毒转导成表达人CD38和人BCMA，并针对逐渐增加的BCMA表达水平进行分选。将小鼠纤维原细胞NIH/3T3细胞系(ATCC)和Phoenix Ampho细胞保持在DMEM GlutaMAX+10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen)+抗生素(青霉素10.000U/ml，链霉素10.000μg/ml)中。NIH/3T3细胞被转导成表达人CD38(3T3-CD38)。用短串联重复(STR)分析来检查所有细胞系的库并定期测试支原体。
来自MM患者和健康个体的原代细胞通过Ficoll-Paque(GE Healthcare LifeSciences)密度离心分离来自血沉棕黄层(Sanquin血库)的健康供体外周血单核细胞(PBMC)或来自MM患者骨髓抽吸物[～10-40％恶性细胞，通过流式细胞术检测(CD138+/CD38+)确定]的骨髓单核细胞(BM-MNC)。经分离的细胞直接用于细胞毒性测定或在液氮中冷冻保存直至使用。所有原始样品均经知情同意和机构医学伦理委员会批准后获得。
CAR和CCR载体构建体使用标准分子生物学技术将CAR和CCR构建体克隆到SFGγ-逆转录载体中(Rivière et al.，1995.PNAS19：6733)。BCMA-CAR构建体使用WO2016/094304A2(BCMA02，药品名称bb2121)中公布和描述的细胞外单链可变片段(scFv)。scFv跟随在CD8α跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域(BCMA-ζ)之后，或者跟随CD8α跨膜结构域和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域(BCMA-BBζ)之后，或者跟随在融合到CD3ζ细胞内结构域的CD28跨膜和细胞内序列(BCMA-28ζ)之后。CAR序列通过P2A序列连接到dsRed荧光表达标记物或截断的LNGFR序列。CD19 CAR构建体使用SJ25C1 scFv并且此前已经有过描述(van derStegen et al.，2015.Nat Rev Drug Discov 14：499-509)。对于CCR构建体，CD38特异性scFvs，此前我们组已经描述过(Drent et al.，2016.Haematologica 101：616)，之后是CD28跨膜和细胞内序列和4-1BB细胞内结构域，或者之后是CD8α跨膜结构域和4-1BB信号传导结构域。CCR序列通过P2A元件连接到截断的LNGFR序列。
逆转录病毒颗粒的产生和T细胞的转导用10μg CAR构建体磷酸钙转染Phoenix-Ampho包装细胞。转染16小时后，更新完全培养基(DMEM+10％ FBS)。转染2和3天后，收集含有逆转录病毒颗粒的无细胞上清液并直接用于转导。在6孔板(Greiner Bio-One)中用培养基(RPMI-1640，10％ FBS，青霉素；100U/ml，链霉素；100μg/ml)中的凝集素样植物凝集素(PHA-L)刺激来自健康供体(3×106/孔)的外周血单核细胞(PBMC)。48小时后，将3×106/ml细胞转移到包被有纤维连接蛋白(15μg/ml)(Takara)的6孔板(Falcon)上。在4μg/ml溴化己二甲四胺(Polybrene)的存在下，通过每孔加入2ml病毒，然后旋转接种(spinoculation)(1500g，室温下1小时)进行逆转录病毒转导。16小时后进行第二次转导，将2/3的细胞上清替换为新获得的病毒(2ml)。第二次转导后6-8小时，将一半细胞上清替换为新鲜培养基RPMI-1640+10％胎牛血清(FBS)和50IU/ml rhIL-2(Novartis)。72小时后通过流式细胞术检测LNGFR(CD271)或dsRed表达来确定转导效率。为了分离经双重转导的CAR+CCR T细胞，使用EasySepTMAPC阳性选择试剂盒II(Stemcell Technologies)，通过阳性选择分离用CD271(NGFR)-APC抗体(Biolegend)标记的T细胞。在测定中进一步使用经分选的携带CD38CCR(双重CAR+CCR转导和CCR转导的混合)的T细胞，假设经CD38CCR转导的T细胞在抗原联合后保持无功能。
基于生物发光成像的细胞毒性的测定转导后7至10天，将CAR T细胞的系列稀释液(效应：靶2：1，1：1，1：2)与荧光素酶表达细胞系一起孵育。在16-24小时后，在添加125μg/mL甲虫荧光素(Promega)后15分钟内，用96微孔板发光计(Promega)确定存活细胞产生的荧光素酶信号。％裂解细胞＝1-(处理孔的BLI信号/未处理孔的BLI信号)×100％。
钙黄绿素-AM释放测定将靶细胞(3T3-CD38)以终浓度为106/ml悬浮完全培养基中，并用购自Molecular Probes(Eugene，Oreg.)的钙黄绿素-AM进行标记。CAR T细胞与经标记的靶细胞以2：1至0.5：1范围的E：T比例孵育4小时。对照包括自发(来自相同供体的空白对照转导T细胞)和最大释放(仅将靶细胞置于加有2％ Triton X-100的培养基中)的孔。孵育后，从澄清的上清取样，用SpectraMax Gemini双重扫描微孔板荧光光谱仪(MolecularDevices，Sunnyvale，Calif.)检测钙黄绿素-AM(激发滤光片：485±9nm；带通滤波器：530±9nm)。数据以任意荧光单位(AFU)表示。裂解百分比通过比裂解(Specific Lysis)(％)＝(处理孔的AFU-自发释放的AFU)/(最大释放的AFU-自发释放的AFU)x 100％来计算。
基于流式细胞术的细胞毒性测定CAR T细胞与经BM-MNC标记的Violet示踪剂(Thermo Fisher Scientific)在系列稀释液(效应子：靶2：1、1：1或0.5：1)中孵育16h。用不同的CD标志物(CD3、CD14、CD19、CD38、BCMA、CD56和CD138)(BD Biosciences)染色后鉴定不同的细胞亚群。添加流式计数荧光球(Beckman 7547053)，并通过流式计数均衡测量对细胞进行定量分析。细胞裂解百分比通过％裂解细胞＝1-((#处理孔中活的靶细胞/珠子#)/(#未处理孔中活的靶细胞/珠子#))×100％来计算。
亲合力测量研究单或双靶向CAR T细胞对MM1.S肿瘤细胞的细胞亲合力，如前所述(Kamsma et al.，2018.Cell Rep 24：3008-3016；Sitters et al.，2015.Nat Methods 12：47-50)。简而言之，使MM1.S细胞附着在温控微流芯片(LUMICKS CA B.V.)的表面上共计2.5小时。将芯片放入z-Movi细胞亲合力分析仪(LUMICKS)中，在37℃下进行实验。随后使经标识的CAR T细胞流入微流体芯片并与MM1.S单层细胞相互作用5分钟，此后施加声力(acoustic force ramp)(1000pN相对力，超过150秒)。所有实验一式三份地进行。
增殖试验对BCMA-CAR T细胞进行技术并每周用经照射的(60Gy)BCMA+CD38+MM1.S细胞进行刺激。从转导后7天开始，将0.5×106个CAR T细胞接种于含有0.25×106MM1.S的24孔板中，至终体积为1mL。不添加额外的细胞因子。
细胞内磷酸化-AKT1评估在5mL圆底聚苯乙烯FACS管中对细胞进行刺激和染色。CAR T细胞(0.5×106)与UM9细胞(0.5×106)一起在具有推荐量的APC-缀合的CD271抗体(CD271；克隆ME20.4，BioLegend)的完全RPMI-1640培养基中于室温下共培养15分钟。在孵育时间结束时，将管转移到冰上，并用FACs缓冲液(含0.5至1％牛血清白蛋白或5至10％FBS和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液)洗涤细胞两次。根据制造商的方案使用eBioscienceIntracellular Fixation&Permeabilization Buffer Set。在渗透化且不洗涤后，添加推荐量的磷酸化-AKT11(Ser473)单克隆抗体(克隆SDRNR，eBioscience)并在室温下避光孵育细胞30分钟。用渗透化缓冲液洗涤细胞2次，并在BD LSR Fortessa上进行流式细胞术。
单核细胞激活通过阳性选择从PBMC中分离CD14+单核细胞。将经分离的单核细胞(10000个细胞)铺设在96孔平底培养皿中。24小时后，每孔中添加10000个CAR T细胞和10000个肿瘤细胞(MM1.S)并孵育24小时。孵育后，细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤2次，并用胰蛋白酶/EDTA溶液(Lonza)与孔分离20分钟。单核细胞用CD3(克隆SK7，BD Biosciences)、CD14(克隆HCD14，biolgend)、HLA-DR(克隆G46-6，BD Biosciences)、CD86(克隆HA5.2B7，Beckman Coulter)和CD80(克隆16-10A1，biolgend)(每mL样品用1μg染色，在4℃下于具有1％ BSA、10％ FBS和0.1％ NaN3叠氮化钠的PBS中孵育30分钟)染色。在BD LSR Fortessa上进行流式细胞术。
流式细胞术在BD LSR Fortessa上进行流式细胞术。对于CCR，用针对NGFR的APC-缀合抗体(CD271；克隆ME20.4，BioLegend)和蛋白质L测量转导效率，而对于CAR，则在PE通道中测量以检测dsRed和AffiniPure F(ab')2片段化山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)。下列抗体用于FACS染色：抗人CD3(克隆UCHT1，BD bioscience)、抗人CD4(克隆L200，BD bioscience)、抗小鼠CD45(克隆30-F11，BD bioscience)、抗人CD8(克隆SK1，BD bioscience)、抗人CD45(克隆HI30，BD bioscience)、抗人CD366(TIM-3)(克隆F38-2E2，Biolegend或克隆F38-2E2，ThermoFisher)、抗人CD279(PD-1)(克隆EH12.2H7，Biolegend或克隆eBioJ105，ThermoFisher)、抗人CD62L(克隆DREG-56，Biolegend)、抗人CD269(克隆19F2，Biolegend)、CD45RA(克隆HI100，ThermoFisher)、LAG-3(CD223；克隆3DS223H，ThermoFisher)。用FCS Express 6flow软件进行流式细胞术数据分析。
细胞因子和颗粒酶B测量为了确定细胞因子生产，在与靶细胞共培养16小时后收获细胞上清。根据制造商的方案使用细胞因子珠阵列(CBA)人Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒(BD Biosciences)。根据制造商的指南通过人颗粒酶B ELISA开发试剂盒(Mabtech，3485-1H-6)定量确定人颗粒酶B。
体内异种移植研究对于MM体内模型，RAG-2-/-γc-/-雌性小鼠在阿姆斯特丹动物研究中心(Universitair proefdiercentrum，AARC-UPC)饲养并维持。动物实验在动物科学程序中央机构的批准下进行(协议号AVD114002015345)。监测动物状态，并严格根据荷兰动物实验法案诱导安乐死。基于支架的异种移植小鼠模型按照此前的描述准备(Groen et al.，2012.Blood 120：e9-e16)。小鼠皮下植入混合支架，每个支架由三个2至3mm3的双相磷酸钙颗粒组成，体外包被人骨髓间充质基质细胞(BM-MSC；2×105个细胞/支架)。植入后8至12周，小鼠腹腔注射双硫威(bisulvex)(18mg/kg，在500μl中)。第二天，静脉注射荧光素酶转导的多发性骨髓瘤细胞(10×106UM9或2.5×106MM1S)。注射肿瘤细胞7天后，小鼠静脉接收经转导的T细胞(2.5×106个细胞/小鼠)。用PhotonIMAGER(Biospace Lab)(腹腔注射100μlD-荧光素)通过每周生物发光(BLI)测量来监测肿瘤生长。从每只小鼠收获死后的BM和支架，解离(支架)并通过70μm过滤器过滤。用流式细胞术对单细胞悬液进行计数、染色和测量。对于ALL体内模型，使用雌性8至12周龄的NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtmWjl/SzJ(NSG)小鼠(Jackson Laboratory)。静脉施用共计0.5×106个FFLuc-GFP NALM6细胞。6天后施用0.2×106CAR或CAR+CCR T细胞。用Xenogen IVIS成像系统(Xenogen)通过生物发光成像测量肿瘤负荷
统计分析使用GraphPad Prism 8.2.1(GraphPad Prism，RRID：SCR_002798)软件进行数据分析和可视化。没有预先规定的效应大小用来确定样品大小。图展示了体外和体内实验的单个值±SEM。用于计算p值的统计检验在相关图例中有所描述。差异在p<0.05时被认为是显著的，且p值用星号表示如下：p>0.5，不显著(ns)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
结果
CCR的共表达改善CAR工程化T细胞的细胞毒性为了测试CAR和CCR组合肿瘤靶向的构思(图5A)，本实施例专注于血液系统恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤(MM)和B细胞白血病和淋巴瘤。产生了靶向BCMA的第一代和第二代CAR(图5B)。选择CD38作为CCR靶向的第二抗原，这是因为CD38几乎在所有血液系统恶性肿瘤中强烈表达(Naik et al.，2019.Haematologica104：e100-e103；Krejcik et al.，2016.Blood 128：384-394)且因此CD38-CCR可以适用于多种疾病。将CD38-CCR构建体设计成要么包含两种最流行的共刺激结构域CD28或4-1BB中的一种(CD38-28或CD38-BB)，要么将它们组合(CD38-28BB)(图5A和图5B)。将CAR和CCR构建体与功能无关的标志物(分别为dsRed和低亲和力神经生长因子受体(LNGFR))连接(图5B)。
用CAR+CD38-CCR组合转导的外周血T细胞在其表面上表达出与单CAR转导的T细胞等量的CAR丰度(数据未显示)。CAR+CD38-CCR T在其表面上显示出CD38的表达降低，表明CCR结合(顺式或反式)。然而，没有观察到对产生的表达CAR-、CCR-和CAR+CCR的T细胞的分化有任何影响(数据未显示)，也没有观察到在用CD38-CCR转导的T细胞的制造中的自相残杀(数据未显示)。此外，与空白对照转导的T细胞相比，表达CD38-28BB CCR、BCMA-ζ+CD38-28和BCMA-ζ+CD38-28BB的T细胞没有显示出通过CCR介导的强直信号(tonic signaling)，这由AKT1丝氨酸/苏氨酸激酶1(或AKT1)的类似磷酸化所证明，其反映了CD3ζ和CD28的激活(图5C)。
有趣的是，在第一代(BCMA-ζ)中添加CD38-28和CD38-28BB CCR和在第二代BCMA-CAR T细胞(BCMA-28ζ)中添加CD38-BB CCR(图5A)，引起它们对MM细胞系和原代CD138+CD38+患者来源的MM细胞的细胞毒性能力显著增加(数据未显示)。CD28跨膜(TM)和细胞内(IC)结构域的存在与改善的CAR细胞毒性和对较低抗原表达的更好响应有关(Majzner et al.，2020.Cancer Discov 10：702-723；Hamieh et al.，2019.Nature 568：112-116)。研究了CD28 TM/IC在BCMA-CAR而不是CD38-CCR中的定位效应。在BCMA-28ζ+38-BB和BCMA-ζ+38-28BB T细胞之间没有观察到细胞毒性能力的差异(数据未显示)。总的来说，与通过两种共刺激设计的单靶向第二代BCMA-CAR T细胞(BCMA-28ζ或BCMA-BBζ)的裂解相比(P<0.0001)或者与通过第三代BCMA-CAR T细胞(BCMA-28BBζ)裂解相比，通过BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞对MM肿瘤细胞的裂解在低效应物：靶比例(E：T)下显著更高。这些最新的发现表明BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞的细胞毒性潜力的增加不仅仅是CD28/4-1BB共刺激组合的结果。此外，单独携带CD38-CCR的T细胞并不诱导表达CD38的靶的细胞裂解(图5D)并且BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞不能诱导转导成表达CD38但不表达BCMA的NIH-3T3细胞(3T3-38+细胞)的裂解(图5E)。因此，CD38-CCR表达不足以自身诱导肿瘤裂解或与BCMA-CAR组合诱导肿瘤外裂解。值得注意的是，当使用U266细胞(BCMA+CD38-)作为靶细胞时，在靶细胞上没有CD38表达的情况下，细胞毒性的增加完全消失(数据未显示)。总之，这些结果证明，共表达的CD38-CCR与CD38的结合引起CAR T细胞对肿瘤靶的细胞毒性增强。
高亲和力CCR结合增加CAR T细胞的功能亲合力本实施例进一步旨在阐明在CCR共表达下观察到的细胞毒性增加是CCR与靶结合的结果还是下游共刺激信号启动的结果。为了研究这一点，我们构建了CD38结合受体，它缺乏细胞内共刺激尾部(CD38Δ)并且因此能够以与CD38-CCR相同的亲和力和CD38抗原结合，但它不能诱导T细胞的激活，也不能诱导共刺激(图5B)。令人惊讶的是，双靶向BCMA-ζ+CD38ΔT细胞与BCMA-CAR+CD38-28BB T细胞一样有效地裂解MM肿瘤细胞(图6A)。因此，似乎CCR(这种情况下为CD38)与第二靶标抗原的结合本身就可以增加双靶向CAR+CCR T细胞的裂解能力，而不依赖于共刺激信号传导的添加。实际上，当测量靶细胞相遇后T细胞中AKT1的磷酸化时，发现与BCMA-ζ单结合相比，BCMA-ζ+CD38Δ双重结合引起pAKT1平均荧光强度(MFI)增加(图6B)，表明多价结合增强了CAR T细胞激活的下游信号传导。AKT1的磷酸化在BCMA-ζ+CD38-28BB T细胞中进一步增加(图6C)，尽管在这个系统中并没有转变为更好的肿瘤细胞裂解。此外，发现，与BCMA-ζ和BCMA-28ζCAR T细胞相比，BCMA-ζ+CD38Δ的颗粒酶B的分泌显著增加(分别P＝0.0004和P<0.0001)。此外，与BCMA-28ζCAR T细胞相比，BCMA-ζ+CD38-28 T细胞的颗粒酶B分泌更高(数据未显示)，再次证明了除了CD28共刺激外，多价肿瘤结合的作用。此外，BCMA-ζ+CD38-28BB和BCMA-28ζ+CD38-BB T细胞的双靶向和组合共刺激也显示出更高的分泌颗粒酶B浓度(数据未显示)。
假设细胞毒性效力的提高是由于通过BCMA-CAR和高亲和力CD38-CCR的多价结合而增加功能亲合力并形成更强的T细胞结合的结果。我们通过确定在有或没有CCR共表达下，肿瘤细胞与CAR T细胞之间的实际结合强度来验证这一假设。将MM1.S细胞接种在z-Movi细胞亲合力分析仪微流控芯片中，随后依次冲入单靶向和双靶向CAR T细胞，并使其与靶细胞结合。肿瘤细胞和T细胞之间的结合亲合力通过施加增加幅度的声力(超声波)(pN)来定量。发现，与BCMA-ζ与肿瘤细胞的相互作用相比，BCMA-ζ+CD38ΔT细胞与肿瘤细胞的相互作用能够承受更高施加的声力，因为与BCMA-ζ细胞相比，附着显著更多的BCMA-ζ+CD38ΔT细胞(P＝0.0082，图6C)。共刺激结构域的添加引起BCMA-ζ+CD38-28BB T细胞的功能亲合力进一步轻微增加，与BCMA-ζ和BCMA-28ζCAR T细胞相比，总体上显示出显著更高的结合强度(P＝0.0002和P＝0.0274，图6C)。
进一步审核引起细胞毒性增加的CD38结合的特定亲和力要求。为此，使用以逐渐降低的亲和力与相同CD38表位结合的4个单链可变片段(scFv)(Drent et al.，2017.MolTher 25：1946-1958)(图6D)。仅CD38-CCR的高亲和力(scFv 028，KD＝1.8nM)结合引起BCMA-CAR+CD38-28BB T细胞比单靶向BCMA-CAR T细胞具有更高的细胞毒性(图6E)。亲和力降低约10倍(scFv 38A1，KD＝16.5nM)降低了这种效应(图6E)并导致颗粒酶B分泌和功能亲合力降低(数据未显示)。降低肿瘤细胞上CD38的表达也降低了BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞的细胞毒性益处(数据未显示)，表明需要靶向CCR的二级抗原的高表达。总的来说，这些数据证明，为了增加功能亲合力和增强BCMA-CAR T细胞的细胞毒性能力，高表达的二级抗原(如CD38)的高亲和力结合是必要的。
CAR+CCR组合能够裂解低抗原表达的肿瘤变体靶抗原密度降低是CAR T细胞过继治疗后肿瘤逃逸和复发的主要机制之一。鉴于双靶向CAR+CCR T细胞的更高的细胞毒性能力，检查了它们对低抗原密度肿瘤变体的效力。对K562细胞系(CD38+)进行转导和分选，以表达不同浓度的BCMA。在定量比较MM细胞系和原代MM细胞的BCMA表达后，经分选的细胞系进一步表征为阴性(K562-BCMAneg)、低(K562-BCMAl低)、中(K562-BCMAmed)和高(K562-BCMA高)(Frerichs et al.，2020.Clin Cancer Res 26：2203-2215)。与BCMA-ζ、BCMA-28ζ和BCMA-28BBζCAR T细胞相比，BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞(BCMA-ζ+CD38-28，BCMA-ζ+CD38-28BB或BCMA-28ζ+CD38-BB)表现出所有K562-BCMA系的裂解增加(图7A)。值得注意的是，K562-BCMA低细胞是原代MM中位BCMA表达的代表，对单靶向BCMA-CAR T细胞的裂解具有抗性，但对BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞仍然敏感(图7A)。更重要的是，BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞对K562-BCMA低和K562-BCMAmed K562细胞的裂解与BCMA-28ζCAR T细胞对K562-BCMAhigh的裂解相当(图7A)。
这一观察在工程化和亚克隆化以表达低CD19抗原密度的急性淋巴细胞白血病NALM6细胞的模型中被进一步证实(Hamieh et al.，2019.Nature 568：112-116)。NALM6克隆12.4是在Cd19基因的双等位基因破坏和连续慢病毒转导以在使得低浓度表达CD19之后来产生的。通过基于流式细胞术的定量确定NALM6克隆12.4每个细胞携带约200个分子(图7B)。NALM6克隆2仅通过Cd19基因的单等位基因破坏来产生(Hamieh et al.，2019.Nature568：112-116)并展示出超低的CD19表面表达(每个细胞约20个分子)，其通过常规流式细胞术分析是阴性的，并且只有在信号放大后才能通过流式细胞术检测到(图7B)。此外，在这个系统中，CD19-CAR+CCR T细胞特异性识别表达CD19的NALM6靶细胞，而不识别CD19敲除层NALM6细胞(数据未显示)。有趣的是，在野生型(WT)和CD19-低NALM6的模型中，添加CD38Δ并没有引起细胞毒性的增加(数据未显示)。这可能归因于NALM6上CD38的表达比MM细胞系低10倍的事实。克隆12.4仍然对CD19-ζ和CD19-28ζCAR T细胞的杀伤敏感(数据未显示)。CD38-28或CD38-28BB CCR的添加同样增强了CD19-ζ的体外细胞毒性，而在CD19-28ζ和CD19-28ζ+CD38-BB之间没有观察到裂解能力差异(数据未显示)。因此，添加CD28结构域对实现克隆12.4的最大裂解是必要的。CD19的超低密度使NALM6克隆2不易被CD19-ζ和第二代CD19-28ζCAR T细胞裂解。在这种情况下，提供双重CD28和4-1BB共刺激的CD19-CAR和CD38-CCR的组合是恢复裂解必要的(图7C)。CD19-ζ+CD38-28组合未能增加裂解，而CD19-ζ+CD38-28BB和CD19-28ζ+CD38-BB T细胞引发了针对NALM6克隆2细胞的显著更高的裂解(P＝0.0125，图7C)，表明在这个系统中共刺激设计，而不是CD38结合，有利于细胞毒性结果。由于CD28内结构域的存在对于克隆12.4的最佳裂解是重要的，因此进一步核实第二CD28结构域的添加是否有累加效应。有趣的是，尽管CD19-28ζ+CD38-28BB T细胞并没有引发更高的克隆12.4的裂解，但这些细胞显著增加了克隆2的裂解(P<0.0001)，这几乎类似于通过常规CD19-28ζCAR T细胞靶向CD19高野生型NALM6细胞系时观察到的裂解活性(图7D)。总之，我们的结果表明，CD38-CCR的添加能够提高不同血液系统肿瘤模型对抗原识别的敏感性。
CCR的共表达增加了CAR T细胞的增殖能力此前的研究已经很好地证明了CD28和4-1BB细胞内共刺激信号传导结构域为CAR T细胞提供不同的动力学和功能(Kawalekaretal.，2016.Immunity 44：712；Zhao et al.，2015.Cancer Cell 28：415-428)，其可被整合以提高T细胞的潜力。假设通过CCR的共表达递送的CD28和4-1BB共刺激信号的组合不仅可以增强CAR T细胞的细胞溶解潜力，还可以增强CAR T细胞的细胞因子分泌和增殖潜力。实际上，当面对MM细胞攻击时，与BCMA-ζ、BCMA-28ζ和BCMA-BBζCAR T细胞相比，BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞产生了显著更高浓度的干扰素(IFN)-γ(P＝0.0216)和白细胞介素(IL)-2(P＝0.0433)，并且与BCMA-ζ和BCMA-28ζCAR T细胞相比，产生了更高浓度的肿瘤坏死因子(TNF)-α(图8)。这是CCR介导的共刺激信号传导与CAR介导的激活组合的结果，而不仅仅是CCR结合的结果，因为与BCMA-ζ相比，没有观察到BCMA-ζ+CD38Δ细胞因子分泌增加(图8)。当降低CD38-CCR的亲和力时，细胞因子的分泌相应降低(数据未显示)。此外，在长期增殖测定中，双靶向BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞(BCMA-ζ+CD38-28，BCMA-ζ+CD38-28BB和BCMA-28ζ+CD38-BB)表现出高的扩增潜力，优于它们各自的单靶CAR(BCMA-ζ和BCMA-28ζ)(数据未显示)。尽管事实是BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞与第3代BCMA-28BBζ细胞相比，细胞因子分泌没有表现出差异，但它们在体外的扩增显著更好。值得注意的是，双靶向BCMA-CAR+CD38-CCRT细胞的增殖能力增强与BCMA-BBζT细胞类似并且被证实与BCMA-ζ、BCMA-28ζ和BCMA-28BBζCAR T细胞相比，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的表面表达较低(数据未显示)。仅携带CD38-BB或CD38-28BB CCR的T细胞表现出在响应于抗原结合时没有分泌IFN-γ和TNF-α，并且我们观察到与空白对照T细胞类似的IL-2的分泌(图8)和扩增(数据未显示)。然而，相当的IL-2分泌是由CD38ΔT细胞分泌的，表明它不是通过CCR的共刺激结构域介导；相反，它是由CD38的结合诱导并归因于增强的同种异体应答性。有趣的是，高度增殖的BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞并没有像BCMA-BBζT细胞一样观察到中枢记忆表型保留的特征，因为大多数BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞分化为CD45RA-CD62L-效应记忆表型(数据未显示)。
由于CD38-CCR结合是一种向CAR T细胞提供共刺激的成功策略，因此验证CCR靶标在肿瘤细胞上表达是否是强制的，或者CCR介导的共刺激信号传导是否可能在与辅助细胞上表达的抗原反式结合后启动。为了研究这一点，我们建立了共培养细胞毒性测定，其中将荧光素酶阳性的BCMA+CD38-U266细胞与负载钙黄绿素的3T3-38+细胞共培养。当BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞被添加至共培养时，它们保留了对U266细胞的细胞毒性，同时3T3-38+细胞保持完整(图9A)。虽然，CD38-CCR与3T3细胞上表达的CD38结合并没有诱导肿瘤外毒性，但与各自的单靶向BCMA-CAR T细胞相比，其足以诱导共刺激信号传导，引起细胞因子分泌改善和BCMA-CAR+CD38-CCR T细胞的扩增(图9B和图9C)。结合CD28和4-1BB共刺激的BCMA-CAR+CD38-CCR策略表现出更高的细胞因子分泌和BCMA-28ζ+CD38-BB T细胞的IFN-γ和TNF-α分泌优于BCMA-ζ+CD38-28BB的扩增(图9B和图9C)。因此，CD38-CCR的共表达能够增强CAR T细胞的扩增潜力，不仅通过与表达肿瘤的靶标抗原结合，还通过与没有肿瘤外毒性辅助细胞上表达的抗原的反式结合。当在共培养中使用野生型(CD38阴性)3T3细胞时，U266的裂解得以保留并且3T3细胞保持完整(数据未显示)，但没有观察到细胞因子和增殖的增加(数据未显示)，表明在CAR T细胞上表达的CD38的顺式或反式结合并没有促进扩增改善。由于表达CD38的单核细胞及它们的激活与毒性有关，因此将原代CD14+单核细胞用作相同共培养系统中的辅助细胞并测量它们的激活指标。CD38-CCR的结合仍诱导CAR+CCR T细胞分泌细胞因子，但没有诱导通过CD80、CD86、人白细胞抗原-DR同型(HLA-DR)和IL-6的分泌测量的单核细胞过度活化(数据未显示)。
CCR共表达增加CAR T细胞体内抗肿瘤的效力并改善低抗原变体的消除体外研究显示BCMA-28ζ+CD38-BB的组合在细胞因子分泌(通过顺式和反式结合)和增殖潜力中略优于BCMA-ζ+CD38-28BB。因此，在低T细胞剂量的挑战性条件下，使用此前描述的异种移植MM小鼠模型在体内评估用BCMA-28ζ+CD38-BB共靶向肿瘤的累积益处(Drent et al.，2019.Clin Cancer Res 25：4014-4025；Groen et al.，2012.Blood 120：e9-e16)。将携带人源化骨髓(BM)样支架生态位(niches)的小鼠植入表达MM细胞的荧光素酶，并在肿瘤后7天用CD38-28BB、BCMA-28ζ、BCMA-BBζ、BCMA-28ζ+CD38-BB或空白对照T细胞进行治疗。生物发光成像(BLI)进行的输注后监测显示，单独使用CD38-28BB治疗对肿瘤进展没有影响，证实了CD38-CCR在没有激活信号的情况下不发挥功能的体外发现(数据未显示)。用BCMA-BBζ和BCMA-28ζCAR T细胞治疗也未能控制这个系统中的肿瘤生长(图10A)。然而，用双靶向BCMA-CAR/CD38-CCR T细胞(BCMA-28ζ+CD38-BB)治疗的小鼠显示出令人印象深刻的肿瘤生长延缓(图10A)。T细胞注射后7周，支架的尸检分析显示，与所有其他治疗组相比，BCMA-28ζ+CD38-BB组的UM9[绿色荧光蛋白(GFP)+/CD38+]肿瘤细胞数量较低(图10B)。在可评估的治疗组之间，没有观察到剩余UM9肿瘤细胞上BCMA表达的变化(数据未显示)。
与BCMA-28ζT细胞相比，BCMA-28ζ+CD38-BB和BCMA-BBζT细胞表现出显著更好的持久性(P＝0.0016，图10C)。有趣的是，尽管肿瘤负荷不同，BCMA-28ζ+CD38-BB组和BCMA-BBζ组的支架中剩余的绝对T细胞数量没有差异(图10C)，表明BCMA-28ζ+CD38-BB细胞的抗肿瘤细胞毒性潜力改善。此外，在BCMA-28ζ+CD38-BB组的剩余CAR T细胞中，CD4：CD8比例几乎保持1：1的平衡，而在BCMA-28ζ和BCMA-BBζ组中，持续存在的细胞在不同程度上富集了CD4+ T细胞(数据未显示)。对CAR T细胞上与衰竭相关的表面标志物的表达的进一步评估表明，与BCMA-28ζCAR T细胞相比，BCMA-28ζ+CD38-BB细胞表达显著较低浓度的PD-1(P＝0.0142)并且与BCMA-BBζ相比，表达显著较低浓度的淋巴细胞活化基因3(LAG-3)(P＝0.0015)。T细胞免疫球蛋白结构域(TIM-3)的丰度在组间没有差异(数据未显示)。总的来说，与BCMA-28ζ和BCMA-BBζ相比，BCMA-28ζ+CD38-BB组具有较低百分比的三重阳性(PD-1+LAG-3+TIM-3+)细胞(数据未显示)。这些数据证明与第二代靶向BCMA的CAR相比，BCMA-CAR和CD38-CCR的组合不仅增强细胞毒性抗肿瘤功能，而且增加治疗性T细胞的持久性并防止损耗。有趣的是，与持续存在的BCMA-28ζ+CD38-BB细胞相比，剩余的BCMA-BBζCAR T细胞显示出更高的BCMA表达MFI(图10D)，这与剩余肿瘤细胞的共存相关(图10E)。
接下来，核实CCR共表达对CAR T细胞提供的功能增强是否也会引起低抗原表达的肿瘤克隆的根除。为了研究这一点，采用体内“应激测试”，其中对植入NALM6克隆12.4(每个细胞200mol CD19)或NALM6克隆2(每个细胞约20mol)的小鼠进行处理。与CD19-28ζ和CD19-BBζCAR T细胞相比，CD19-CAR+CD38-CCR组合延迟两种CD19低NALM6克隆的肿瘤生长并提高小鼠的存活率。更具体地说，尽管观察到CD19-28ζ和不同CAR+CCR组合之间NALM6克隆12.4的体外裂解差异，但这些体内研究显示，与CD19-28ζ、CD19-BBζ或CD19-ζ+CD38-28BB T细胞处理的小鼠相比，CD19-28ζ+CD38-BB和CD19-28ζ+CD38-28BB T细胞治疗的小鼠肿瘤负荷显著降低并且存活时间更长(P＝0.0283，图11A和图11B)。最值得注意的是，CD19-28ζ+CD38-28BB T细胞通过诱导长期肿瘤缓解而优于所有其他处理(图11B至图11D和图12A)。
重要的是，超低CD19抗原密度NALM6克隆2对CD19-28ζ和CD19-BBζCAR T细胞以及CD19-ζ+CD38-28BB和CD19-28ζ+CD38-BB的杀伤均具有抗性(图11B至图11D和图12B)。
然而，在CD19-28ζ+CD38-28BB细胞中添加第二CD28结构域有效地延迟了肿瘤进展并显著延长了小鼠的存活时间(P<0.0001，图11B，图11E，图11F和图12B)。
实施例5—CAR28ζ+CCR28BB T细胞的肿瘤外毒性
此前使用包括CD8α跨膜结构域的CAR28ζ+CCR28BB T细胞的研究表明，在CD8α跨膜结构域二聚化后，CCR的结合仅介导T细胞的激活和随后的靶细胞裂解(Hirabayashi etal.，2021.Nature Cancer 2：904-918)。CD28在细胞膜中以二聚体形式表达。然而，如图13所示，当使用BCMA-28ζ(包括细胞外单链可变片段(参见BCMA02，WO2016/094304A)，随后融合到CD3ζ细胞内结构域的CD28跨膜和细胞内序列的BCMA-CAR构建体)，和CD38-28BB(包括CD38特异性scFv(Drent et al.，2016.Haematologica 101：616)、CD28跨膜和细胞内序列和4-1BB细胞内结构域的CCR构建体)，与阴性对照相比，没有观察到表达CD38的靶细胞的裂解显著增加。因此，预期的是，CAR28ζ+CCR28BB T细胞没有肿瘤外毒性。
本公开的主题的实施方式
从前文的描述中，明显的是，可以对本公开的主题进行变动和修改以使其适应各种用途和条件。这些实施方式也在以下权利要求的范围内。
本文对任何变量定义中的要素列表的表述包括该变量作为所列要素的任何单个要素或组合(或子组合)的定义。本文实施方式的表述包括作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或它们的部分的组合的实施方式。
本说明书中提及的所有专利和出版物均通过引用的方式并入本说明书，其程度等同于每项独立专利和出版物明确且独立表示通过引用并入的程度。
序列表
<110> 纪念斯隆-凯特琳癌症中心
斯隆-凯特琳癌症研究所
癌症及相关疾病纪念医院
阿姆斯特丹自由大学医学中心基金会
<120> CD38嵌合共刺激受体及其用途
<130> 072734.1333
<150> US 63/164,355
<151> 2021-03-22
<150> US 63/274,250
<151> 2021-11-01
<150> US 63/275,327
<151> 2021-11-03
<160> 103
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 300
<212> PRT
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<400> 1
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<212> PRT
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tcc 123
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<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Gln Asn Gln Leu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Phe
1 5 10 15
Asp Val Leu Asp Lys Arg
20
<210> 11
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
cagaaccagc tctttaacga gctcaatcta ggacgaagag aggagttcga tgttttggac 60
aagaga 66
<210> 12
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
20
<210> 13
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 60
gggatgaaa 69
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
1 5 10 15
Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys
20
<210> 15
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
caggaaggcc tgttcaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggcctt cagtgagatt 60
gggatgaaa 69
<210> 16
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
1 5 10 15
Asp Ala Leu His Met Gln
20
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 60
atgcag 66
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe
1 5 10 15
Asp Ala Leu His Met Gln
20
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
cacgatggcc ttttccaggg gctcagtaca gccaccaagg acaccttcga cgcccttcac 60
atgcag 66
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgttcaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc ttcagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggccttttc caggggctca gtacagccac caaggacacc 300
ttcgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Val Asn Ser
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 27
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser
20 25 30
<210> 30
<211> 140
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
20 25 30
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
35 40 45
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
50 55 60
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
65 70 75 80
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
85 90 95
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
100 105 110
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
115 120 125
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 31
<211> 4627
<212> DNA
<213> 智人
<400> 31
atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt 60
ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg 120
atgtgtatat cacagacaaa actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca 180
gtgctgtggc ctggagcaac aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca 240
ttattccaga agacaccttc ttccccagcc caggtaaggg cagctttggt gccttcgcag 300
gctgtttcct tgcttcagga atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta 360
aaactcctct gattggtggt ctcggcctta tccattgcca ccaaaaccct ctttttacta 420
agaaacagtg agccttgttc tggcagtcca gagaatgaca cgggaaaaaa gcagatgaag 480
agaaggtggc aggagagggc acgtggccca gcctcagtct ctccaactga gttcctgcct 540
gcctgccttt gctcagactg tttgcccctt actgctcttc taggcctcat tctaagcccc 600
ttctccaagt tgcctctcct tatttctccc tgtctgccaa aaaatctttc ccagctcact 660
aagtcagtct cacgcagtca ctcattaacc caccaatcac tgattgtgcc ggcacatgaa 720
tgcaccaggt gttgaagtgg aggaattaaa aagtcagatg aggggtgtgc ccagaggaag 780
caccattcta gttgggggag cccatctgtc agctgggaaa agtccaaata acttcagatt 840
ggaatgtgtt ttaactcagg gttgagaaaa cagctacctt caggacaaaa gtcagggaag 900
ggctctctga agaaatgcta cttgaagata ccagccctac caagggcagg gagaggaccc 960
tatagaggcc tgggacagga gctcaatgag aaaggagaag agcagcaggc atgagttgaa 1020
tgaaggaggc agggccgggt cacagggcct tctaggccat gagagggtag acagtattct 1080
aaggacgcca gaaagctgtt gatcggcttc aagcagggga gggacaccta atttgctttt 1140
cttttttttt tttttttttt tttttttttt tgagatggag ttttgctctt gttgcccagg 1200
ctggagtgca atggtgcatc ttggctcact gcaacctccg cctcccaggt tcaagtgatt 1260
ctcctgcctc agcctcccga gtagctgaga ttacaggcac ccgccaccat gcctggctaa 1320
ttttttgtat ttttagtaga gacagggttt cactatgttg gccaggctgg tctcgaactc 1380
ctgacctcag gtgatccacc cgcttcagcc tcccaaagtg ctgggattac aggcgtgagc 1440
caccacaccc ggcctgcttt tcttaaagat caatctgagt gctgtacgga gagtgggttg 1500
taagccaaga gtagaagcag aaagggagca gttgcagcag agagatgatg gaggcctggg 1560
cagggtggtg gcagggaggt aaccaacacc attcaggttt caaaggtaga accatgcagg 1620
gatgagaaag caaagagggg atcaaggaag gcagctggat tttggcctga gcagctgagt 1680
caatgatagt gccgtttact aagaagaaac caaggaaaaa atttggggtg cagggatcaa 1740
aactttttgg aacatatgaa agtacgtgtt tatactcttt atggcccttg tcactatgta 1800
tgcctcgctg cctccattgg actctagaat gaagccaggc aagagcaggg tctatgtgtg 1860
atggcacatg tggccagggt catgcaacat gtactttgta caaacagtgt atattgagta 1920
aatagaaatg gtgtccagga gccgaggtat cggtcctgcc agggccaggg gctctcccta 1980
gcaggtgctc atatgctgta agttccctcc agatctctcc acaaggaggc atggaaaggc 2040
tgtagttgtt cacctgccca agaactagga ggtctggggt gggagagtca gcctgctctg 2100
gatgctgaaa gaatgtctgt ttttcctttt agaaagttcc tgtgatgtca agctggtcga 2160
gaaaagcttt gaaacaggta agacaggggt ctagcctggg tttgcacagg attgcggaag 2220
tgatgaaccc gcaataaccc tgcctggatg agggagtggg aagaaattag tagatgtggg 2280
aatgaatgat gaggaatgga aacagcggtt caagacctgc ccagagctgg gtggggtctc 2340
tcctgaatcc ctctcaccat ctctgacttt ccattctaag cactttgagg atgagtttct 2400
agcttcaata gaccaaggac tctctcctag gcctctgtat tcctttcaac agctccactg 2460
tcaagagagc cagagagagc ttctgggtgg cccagctgtg aaatttctga gtcccttagg 2520
gatagcccta aacgaaccag atcatcctga ggacagccaa gaggttttgc cttctttcaa 2580
gacaagcaac agtactcaca taggctgtgg gcaatggtcc tgtctctcaa gaatcccctg 2640
ccactcctca cacccaccct gggcccatat tcatttccat ttgagttgtt cttattgagt 2700
catccttcct gtggtagcgg aactcactaa ggggcccatc tggacccgag gtattgtgat 2760
gataaattct gagcacctac cccatcccca gaagggctca gaaataaaat aagagccaag 2820
tctagtcggt gtttcctgtc ttgaaacaca atactgttgg ccctggaaga atgcacagaa 2880
tctgtttgta aggggatatg cacagaagct gcaagggaca ggaggtgcag gagctgcagg 2940
cctcccccac ccagcctgct ctgccttggg gaaaaccgtg ggtgtgtcct gcaggccatg 3000
caggcctggg acatgcaagc ccataaccgc tgtggcctct tggttttaca gatacgaacc 3060
taaactttca aaacctgtca gtgattgggt tccgaatcct cctcctgaaa gtggccgggt 3120
ttaatctgct catgacgctg cggctgtggt ccagctgagg tgaggggcct tgaagctggg 3180
agtggggttt agggacgcgg gtctctgggt gcatcctaag ctctgagagc aaacctccct 3240
gcagggtctt gcttttaagt ccaaagcctg agcccaccaa actctcctac ttcttcctgt 3300
tacaaattcc tcttgtgcaa taataatggc ctgaaacgct gtaaaatatc ctcatttcag 3360
ccgcctcagt tgcacttctc ccctatgagg taggaagaac agttgtttag aaacgaagaa 3420
actgaggccc cacagctaat gagtggagga agagagacac ttgtgtacac cacatgcctt 3480
gtgttgtact tctctcaccg tgtaacctcc tcatgtcctc tctccccagt acggctctct 3540
tagctcagta gaaagaagac attacactca tattacaccc caatcctggc tagagtctcc 3600
gcaccctcct cccccagggt ccccagtcgt cttgctgaca actgcatcct gttccatcac 3660
catcaaaaaa aaactccagg ctgggtgcgg gggctcacac ctgtaatccc agcactttgg 3720
gaggcagagg caggaggagc acaggagctg gagaccagcc tgggcaacac agggagaccc 3780
cgcctctaca aaaagtgaaa aaattaacca ggtgtggtgc tgcacacctg tagtcccagc 3840
tacttaagag gctgagatgg gaggatcgct tgagccctgg aatgttgagg ctacaatgag 3900
ctgtgattgc gtcactgcac tccagcctgg aagacaaagc aagatcctgt ctcaaataat 3960
aaaaaaaata agaactccag ggtacatttg ctcctagaac tctaccacat agccccaaac 4020
agagccatca ccatcacatc cctaacagtc ctgggtcttc ctcagtgtcc agcctgactt 4080
ctgttcttcc tcattccaga tctgcaagat tgtaagacag cctgtgctcc ctcgctcctt 4140
cctctgcatt gcccctcttc tccctctcca aacagaggga actctcctac ccccaaggag 4200
gtgaaagctg ctaccacctc tgtgcccccc cggcaatgcc accaactgga tcctacccga 4260
atttatgatt aagattgctg aagagctgcc aaacactgct gccaccccct ctgttccctt 4320
attgctgctt gtcactgcct gacattcacg gcagaggcaa ggctgctgca gcctcccctg 4380
gctgtgcaca ttccctcctg ctccccagag actgcctccg ccatcccaca gatgatggat 4440
cttcagtggg ttctcttggg ctctaggtcc tgcagaatgt tgtgaggggt ttattttttt 4500
ttaatagtgt tcataaagaa atacatagta ttcttcttct caagacgtgg ggggaaatta 4560
tctcattatc gaggccctgc tatgctgtgt atctgggcgt gttgtatgtc ctgctgccga 4620
tgccttc 4627
<210> 32
<211> 178
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
165 170 175
Arg Gly
<210> 33
<211> 175
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu
1 5 10 15
Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr
20 25 30
Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys
35 40 45
Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln
50 55 60
Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val
65 70 75 80
Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val
85 90 95
Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala
100 105 110
Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
115 120 125
Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr
130 135 140
Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu
145 150 155 160
Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
165 170 175
<210> 34
<211> 1448
<212> DNA
<213> 智人
<400> 34
aggacctgaa caaggtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga 60
tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttcttc cccgaccacg 120
tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc 180
agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga 240
gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct 300
acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg 360
tcagcgccga ggcctggggt agagcaggtg agtggggcct ggggagatgc ctggaggaga 420
ttaggtgaga ccagctacca gggaaaatgg aaagatccag gtagcagaca agactagatc 480
caaaaagaaa ggaaccagcg cacaccatga aggagaattg ggcacctgtg gttcattctt 540
ctcccagatt ctcagcccaa cagagccaag cagctgggtc ccctttctat gtggcctgtg 600
taactctcat ctgggtggtg ccccccatcc ccctcagtgc tgccacatgc catggattgc 660
aaggacaatg tggctgacat ctgcatggca gaagaaagga ggtgctgggc tgtcagagga 720
agctggtctg ggcctgggag tctgtgccaa ctgcaaatct gactttactt ttaattgcct 780
atgaaaataa ggtctctcat ttattttcct ctccctgctt tctttcagac tgtggcttta 840
cctcgggtaa gtaagccctt ccttttcctc tccctctctc atggttcttg acctagaacc 900
aaggcatgaa gaactcacag acactggagg gtggagggtg ggagagacca gagctacctg 960
tgcacaggta cccacctgtc cttcctccgt gccaacagtg tcctaccagc aaggggtcct 1020
gtctgccacc atcctctatg agatcctgct agggaaggcc accctgtatg ctgtgctggt 1080
cagcgccctt gtgttgatgg ccatggtaag caggagggca ggatggggcc agcaggctgg 1140
aggtgacaca ctgacaccaa gcacccagaa gtatagagtc cctgccagga ttggagctgg 1200
gcagtaggga gggaagagat ttcattcagg tgcctcagaa gataacttgc acctctgtag 1260
gatcacagtg gaagggtcat gctgggaagg agaagctgga gtcaccagaa aacccaatgg 1320
atgttgtgat gagccttact atttgtgtgg tcaatgggcc ctactacttt ctctcaatcc 1380
tcacaactcc tggctcttaa taacccccaa aactttctct tctgcaggtc aagagaaagg 1440
atttctga 1448
<210> 35
<211> 1489
<212> DNA
<213> 智人
<400> 35
aggacctgaa aaacgtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga 60
tctcccacac ccaaaaggcc acactggtat gcctggccac aggcttctac cccgaccacg 120
tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc 180
agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga 240
gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct 300
acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg 360
tcagcgccga ggcctggggt agagcaggtg agtggggcct ggggagatgc ctggaggaga 420
ttaggtgaga ccagctacca gggaaaatgg aaagatccag gtagcggaca agactagatc 480
cagaagaaag ccagagtgga caaggtggga tgatcaaggt tcacagggtc agcaaagcac 540
ggtgtgcact tcccccacca agaagcatag aggctgaatg gagcacctca agctcattct 600
tccttcagat cctgacacct tagagctaag ctttcaagtc tccctgagga ccagccatac 660
agctcagcat ctgagtggtg tgcatcccat tctcttctgg ggtcctggtt tcctaagatc 720
atagtgacca cttcgctggc actggagcag catgagggag acagaaccag ggctatcaaa 780
ggaggctgac tttgtactat ctgatatgca tgtgtttgtg gcctgtgagt ctgtgatgta 840
aggctcaatg tccttacaaa gcagcattct ctcatccatt tttcttcccc tgttttcttt 900
cagactgtgg cttcacctcc ggtaagtgag tctctccttt ttctctctat ctttcgccgt 960
ctctgctctc gaaccagggc atggagaatc cacggacaca ggggcgtgag ggaggccaga 1020
gccacctgtg cacaggtgcc tacatgctct gttcttgtca acagagtctt accagcaagg 1080
ggtcctgtct gccaccatcc tctatgagat cttgctaggg aaggccacct tgtatgccgt 1140
gctggtcagt gccctcgtgc tgatggccat ggtaaggagg agggtgggat agggcagatg 1200
atgggggcag gggatggaac atcacacatg ggcataaagg aatctcagag ccagagcaca 1260
gcctaatata tcctatcacc tcaatgaaac cataatgaag ccagactggg gagaaaatgc 1320
agggaatatc acagaatgca tcatgggagg atggagacaa ccagcgagcc ctactcaaat 1380
taggcctcag agcccgcctc ccctgcccta ctcctgctgt gccatagccc ctgaaaccct 1440
gaaaatgttc tctcttccac aggtcaagag aaaggattcc agaggctag 1489
<210> 36
<211> 173
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu
1 5 10 15
Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys
20 25 30
Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Gln Glu
35 40 45
Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys
50 55 60
Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys
65 70 75 80
Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys
85 90 95
Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val
100 105 110
Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr
115 120 125
Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu
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Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
165 170
<210> 37
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<212> PRT
<213> 智人
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Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu
1 5 10 15
Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys
20 25 30
Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Ile Ile Lys Ile His Trp Gln Glu
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Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys
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Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Glu
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Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys
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Asn Gly Ile Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val
100 105 110
Thr Thr Val Asp Pro Lys Tyr Asn Tyr Ser Lys Asp Ala Asn Asp Val
115 120 125
Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Trp Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr
130 135 140
Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Thr Tyr Leu Leu
145 150 155 160
Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu
165 170 175
Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
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tctgccccct cgggctccca aacttctggg attataggcg tgagccactg tgcccggcct 8040
tctgtctttt gttataatga ctggggaaaa catgatacca tgttgcttct tgagttgttt 8100
tgttttagtc tttggtcttt gctagtagct aataacacga actagtgttt atcaagtgct 8160
ttttacacag aagggcttgt tctgcatttt ctagtttaat catcttaata ctcctataaa 8220
gtagtacaat atattttctc ccattttaca gtccctttaa agtaaataac tataaaaatc 8280
ccttatacat gtcacacagc taggtctggc atttcaaatc aggacatcaa acaaagaatt 8340
cgtgcagtta ctaagtcctc tattttttct acaatagaaa aaatagcaag aattacagat 8400
agcaagacat tacaaggcag gaatctgaaa cgaaagggac ataatgtggg gctgggtggg 8460
tgcatgagct ttgcagacta gactttcatt ccagctcttt taatgattag gtgtaagtga 8520
cctacatttt gtgagtaaca gttttctcat cagccaacta agaataatta caccagattc 8580
acagttattg aagagataag ggcatgaatg tgagatgtct ggcgtagggt atctcattta 8640
gcagacacag aatgaatact tgtttctggc tttttctctc tacatatgca caaagaatgt 8700
gactagaagc attggctcta gccctgctca actttcctct atttccaata ccaaggggct 8760
ctgacttagg ctgccacacc aggcaaggag gggcagtacc acctcacttg accaagggca 8820
gggagtcacg gacacatcac ttcctgagat ccttttccac accaaggact gatgtttctg 8880
gaattctcac tttatgaaga caaaacatat aaatggaaat ttctgcagga agagactcac 8940
tcttgtagct cattgagtag gcactagtgg tccaccccca ctgtctttac ttattccttg 9000
acatcacata tctcttgtaa aacctcaaat aatgttaaat gcaatcaccc aataatagca 9060
tagccataat tagaggcatt taggaaagac aggtgagtgt gccacaacta cctaacacat 9120
cagcaaatct ggattaacca ctttctttga ttttccacaa tgcaacctta ctttttaata 9180
gttgggaatg ttctaagtga atttagcaga ggttgttaat caacttgaaa gctgaattct 9240
gacttgtctg actcttggtg gtgctggtag cagtagatgt ttacttttag gttttggtgg 9300
tggtggaata tcacttcaac gtaaatcatc agaaataagt atttgtgaac ccctctcgca 9360
ttaatatatc ttattctgta aaaagaacat gtgcaatttc tcttagatac actactgctg 9420
cagctcacaa acacctctgc atattacacg tacctcctcc tgctcctcaa gagtgtggtc 9480
tattttgcca tcatcacctg ctgtctgctt agaagaacgg ctttctgctg caatggagag 9540
aaatcataa 9549
<210> 40
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr
1 5 10 15
Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile
20 25 30
Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val
35 40 45
Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu
50 55 60
Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val
65 70 75 80
His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys
85 90 95
Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys
100 105 110
Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr
115 120 125
Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe
130 135 140
Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu
145 150
<210> 41
<211> 182
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
20 25 30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
35 40 45
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
85 90 95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130 135 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
165 170 175
Asn Gln Leu Arg Arg Asn
180
<210> 42
<211> 171
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
165 170
<210> 43
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Thr Ala Asp Thr Gln
85 90 95
Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp
100 105 110
Asp Ala Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
115 120 125
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<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 45
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 46
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala
1 5 10 15
Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu
20 25 30
Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys
35 40 45
Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln
50 55 60
Glu Arg Gln
65
<210> 47
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser
1 5 10 15
Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr
20 25 30
Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu
35 40 45
Asn Ala Ser
50
<210> 48
<211> 256
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 48
Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln
20 25 30
Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro
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Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn
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Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg
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Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro
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Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu
165 170 175
Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe
195 200 205
Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Arg Ile Ile Arg Phe Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 51
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Glu Pro Gly Glu Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp Ile Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Arg Phe Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Ile Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Gly Glu Pro Gly Glu Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Ile Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Arg Phe Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Ile Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Glu Pro Gly Glu Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
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Ser Ser Ile Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
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Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
Ile Ile Val Phe Leu Gly Lys Val Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Gln
1 5 10 15
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
Glu Pro Gly Ala Arg Asp Pro Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 62
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 63
Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 64
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Pro Ser Gly Gly Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Arg Ile Ile Val Phe Leu Gly Lys Val Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Gln
50 55 60
Gly Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu
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Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly
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Glu Pro Gly Ala Arg Asp Pro Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Val Leu
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<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Pro Ser Gly Gly Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Arg Ile Ile Val Phe Leu Gly Lys Val Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Gln
50 55 60
Gly Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly
85 90 95
Glu Pro Gly Ala Arg Asp Pro Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
Arg Ile Ile Arg Phe Leu Gly Lys Thr Asn His Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
Glu Pro Gly Asp Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp Leu Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Glu Pro Gly Asp Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 75
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Arg Phe Leu Gly Lys Thr Asn His Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Glu Pro Gly Asp Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ile
115 120 125
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
130 135 140
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp Leu Ala
145 150 155 160
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
195 200 205
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
210 215 220
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Ser Phe Ala Met Ser
1 5
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 78
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 84
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu
115 120 125
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu
130 135 140
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu
145 150 155 160
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
165 170 175
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
195 200 205
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr
210 215 220
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230
<210> 85
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 87
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 88
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 89
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 90
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 91
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 92
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 92
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 93
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
1 5 10 15
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 94
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120
ctg 123
<210> 95
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 96
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 97
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 98
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
180 185 190
Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala
210 215 220
Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Ser
245 250
<210> 99
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
50 55 60
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
65 70 75 80
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
85 90 95
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
100 105 110
Pro Arg
<210> 100
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 100
Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu
1 5 10 15
Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro
20 25 30
Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
35 40 45
<210> 101
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 102
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Val Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys
1 5 10 15
Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr
35 40 45
Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala
50 55 60
Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg
65 70 75 80
Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile
85 90 95
Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys
100 105 110
Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
115 120
<210> 103
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Ile Arg Phe
165 170 175
Leu Gly Lys Thr Asn His Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Glu Pro Gly Asp
210 215 220
Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser

Claims (100)

1.一种减少和/或消除细胞中CD38表达的方法，包括将所述细胞转导成包含与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)。
2.一种减少和/或消除细胞中CD38表达的方法，包括将编码与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)的核酸分子引入所述细胞中。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述CD38表达是所述细胞的细胞表面上的CD38表达水平。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述细胞包括与抗原结合的抗原识别受体。
5.一种减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗的方法，包括将所述细胞转导成包含与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)。
6.一种减少和/或防止自然杀伤(NK)细胞损耗的方法，包括将编码与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)的核酸分子引入所述NK细胞中。
7.权利要求5或6所述的方法，其中所述NK细胞包括与抗原结合的抗原识别受体。
8.一种治疗和/或预防受试者中与CD38相关和/或表达CD38的疾病的方法，包括向所述受试者施用(a)CD38药物和(b)细胞；所述细胞包括(i)与所述疾病的组织或细胞上表达的抗原结合的抗原识别受体，和(ii)与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)。
9.权利要求8所述的方法，其中所述疾病是肿瘤。
10.权利要求9所述的方法，其中所述肿瘤选自由血液癌、胶质母细胞瘤和实体瘤组成的组。
11.权利要求10所述的方法，其中所述肿瘤是血液癌。
12.权利要求10或11所述的方法，其中所述血液癌选自由多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、华氏巨球蛋白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、淋巴瘤和急性髓系白血病(AML)组成的组。
13.权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤是多发性骨髓瘤。
14.权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述抗原选自由BCMA、GPRC5D、FcRL5、CD41、CD48、P2RY10、CD44v6、CD70、CD123、κ轻链、NYESO-1、BOB1、ADGRE2、CLEC12A、CCR1、LILRB2、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD56、BCMA、CS-1、CD138、Lewis抗原(LeY)、WT-1和ITGB7组成的组。
15.权利要求10所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。
16.权利要求10或15所述的方法，其中所述实体瘤选自乳腺癌，结肠癌，非小细胞肺癌，前列腺癌，胃癌、食道癌和胰腺癌，肝细胞癌(HCC)和纤维板层样癌。
17.权利要求8至16中任一项所述的方法，其中所述CD38药物是抗CD38抗体。
18.权利要求17所述的方法，其中所述抗CD38抗体是艾萨妥昔单抗或达雷木单抗。
19.权利要求1至4和8至18中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫应答性细胞。
20.权利要求1至4和8至19中任一项所述的方法，其中所述细胞是淋巴系细胞或髓系细胞。
21.权利要求1至4和8至20中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞组成的组。
22.权利要求1至4和8至21中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
23.权利要求22所述的方法，其中所述T细胞选自由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞组成的组。
24.权利要求1至4和8至21中任一项所述的方法，其中所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。
25.权利要求4和7至24中任一项所述的方法，其中所述抗原识别受体选自由T细胞受体(TCR)、TCR样融合分子或嵌合抗原受体(CAR)组成的组。
26.权利要求25所述的方法，其中所述TCR样融合分子是包括抗原结合链的重组T细胞受体(TCR)，所述抗原结合链包括：(a)以HLA非依赖性方式与抗原结合的免疫球蛋白可变区的抗原结合片段；和(b)能与CD3ζ多肽关联的恒定结构域。
27.权利要求26所述的方法，其中所述恒定结构域包括天然或经修饰的TRAC多肽，或者天然或经修饰的TRBC多肽。
28.权利要求26或27所述的方法，其中将所述CD3ζ多肽融合到共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
29.权利要求25所述的方法，其中所述抗原识别受体是CAR。
30.权利要求29所述的方法，其中所述CAR包括细胞内结构域和与抗原结合的细胞外抗原结合结构域。
31.权利要求30所述的方法，其中所述CAR的细胞内结构域包括CD3ζ多肽。
32.权利要求26至28和31中任一项所述的方法，其中所述CD3ζ多肽是天然或经修饰的CD3ζ多肽。
33.权利要求32所述的方法，其中所述经修饰的CD3ζ多肽包括天然ITAM1、由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体和由两个功能丧失突变组成的ITAM3变体。
34.权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述CAR的细胞内结构域进一步包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
35.权利要求4或7所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。
36.权利要求35所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
37.权利要求35所述的方法，其中所述抗原是磷酸化抗原。
38.权利要求35或36所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自由CD19，碳酸酐酶IX(CAIX)，癌胚抗原(CEA)，CD8，CD7，CD10，CD20，CD22，CD30，CD33，CLL1，CD34，CD41，CD44，CD49f，CD56，CD74，CD133，CD138，CD123，CD44V6，感染巨细胞病毒(CMV)的细胞的抗原，ENPP3，上皮糖蛋白-2(EGP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶Erb-B2、Erb-B3、Erb-B4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-α，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人表皮生长因子受体2(HER-2)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)，κ-轻链，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis Y(LeY)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)，粘蛋白16(MUC16)，粘蛋白1(MUC1)，间皮素(MSLN)，ERBB2，MAGEA3，p53，MART1，GP100，蛋白酶3(PR1)，酪氨酸酶，存活素，hTERT，EphA2，NKG2D配体，癌睾丸抗原NY-ESO-1，癌胎抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，ROR1，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，Wilms肿瘤蛋白(WT-1)，BCMA，GPRC5D，FcRL5，ITGB7，NKCS1，EGF1R，EGFR-VIII，CD99，CD70，ADGRE2，CCR1，LILRB2，PRAME，CD48，P2RY10，CD70，BOB1，CLEC12A，CCR1，LILRB2，CD5，CD38，CS-1，Lewis抗原(LeY)和ERBB组成的组。
39.权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述CCR包括与CD38结合的细胞外抗原结合结构域和能够向所述细胞传递共刺激信号但不单独向所述细胞传递激活信号的细胞内结构域。
40.权利要求39所述的方法，其中所述CCR的细胞内结构域包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
41.权利要求28、34和40中任一项所述的方法，其中所述共刺激分子选自由CD28、4-1BB、OX40、CD17、CD40、CD154、CD97、CD11a/CD18、ICOS、DAP-10、CD2、CD244、CD27和NKG2D组成的组。
42.权利要求41所述的方法，其中所述共刺激分子是4-1BB。
43.权利要求41所述的方法，其中所述共刺激分子是CD28。
44.权利要求40所述的方法，其中所述CCR的细胞内结构域包括CD28共刺激分子的细胞内结构域和41-BB共刺激分子的细胞内结构域。
45.一种细胞，包括：
(a)与抗原结合的抗原识别受体；和
(b)与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)；
其中所述细胞对抗原单一阳性的细胞表现出实质的细胞溶解活性。
46.权利要求45所述的细胞，其中所述抗原识别受体以1×10-8M或更低的解离常数(Kd)与抗原结合。
47.权利要求45或46所述的细胞，其中所述抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。
48.权利要求47所述的细胞，其中所述抗原是肿瘤抗原。
49.权利要求47所述的细胞，其中所述抗原是磷酸化抗原。
50.权利要求47或48所述的细胞，其中所述肿瘤抗原选自由CD19，碳酸酐酶IX(CAIX)，癌胚抗原(CEA)，CD8，CD7，CD10，CD20，CD22，CD30，CD33，CLL1，CD34，CD41，CD44，CD49f，CD56，CD74，CD133，CD138，CD123，CD44V6，感染巨细胞病毒(CMV)的细胞的抗原，ENPP3，上皮糖蛋白-2(EGP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶Erb-B2、Erb-B3、Erb-B4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-α，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人表皮生长因子受体2(HER-2)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)，κ-轻链，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis Y(LeY)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)，粘蛋白16(MUC16)，粘蛋白1(MUC1)，间皮素(MSLN)，ERBB2，MAGEA3，p53，MART1，GP100，蛋白酶3(PR1)，酪氨酸酶，存活素，hTERT，EphA2，NKG2D配体，癌睾丸抗原NY-ESO-1，癌胎抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，ROR1，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，Wilms肿瘤蛋白(WT-1)，BCMA，GPRC5D，FcRL5，ITGB7，NKCS1，EGF1R，EGFR-VIII，CD99，CD70，ADGRE2，CCR1，LILRB2，PRAME，CD48，P2RY10，CD70，BOB1，CLEC12A，CCR1，LILRB2，CD5，CD38，CS-1，Lewis抗原(LeY)和ERBB组成的组。
51.权利要求45至50中任一项所述的细胞，其中所述抗原识别受体选自由T细胞受体(TCR)、TCR样融合分子或嵌合抗原受体(CAR)组成的组。
52.权利要求51所述的细胞，其中所述TCR样融合分子是包括抗原结合链的重组T细胞受体(TCR)，所述抗原结合链包括：(a)以HLA非依赖性方式与抗原结合的免疫球蛋白可变区的抗原结合片段；和(b)能与CD3ζ多肽关联的恒定结构域。
53.权利要求52所述的细胞，其中所述恒定结构域包括天然或经修饰的TRAC多肽，或者天然或经修饰的TRBC多肽。
54.权利要求52或53所述的细胞，其中所述CD3ζ多肽被融合到共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
55.权利要求51所述的细胞，其中所述抗原识别受体是CAR。
56.权利要求55所述的细胞，其中所述CAR包括细胞内结构域和与抗原结合的细胞外抗原结合结构域。
57.权利要求56所述的细胞，其中所述CAR的细胞内结构域包括CD3ζ多肽。
58.权利要求52至54和57中任一项所述的细胞，其中所述CD3ζ多肽是天然或经修饰的CD3ζ多肽。
59.权利要求58所述的细胞，其中所述经修饰的CD3ζ多肽包括天然ITAM1、由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体和由两个功能丧失突变组成的ITAM3变体。
60.权利要求55至59中任一项所述的细胞，其中所述CAR的细胞内结构域进一步包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
61.权利要求45至60中任一项所述的细胞，其中所述CCR包括与CD38结合的细胞外抗原结合结构域和能够向所述细胞传递共刺激信号但不单独向所述细胞传递激活信号的细胞内结构域。
62.权利要求61所述的细胞，其中所述CCR的细胞内结构域包括共刺激分子的细胞内结构域或其部分。
63.权利要求60至62中任一项所述的细胞，其中所述共刺激分子选自由CD28、4-1BB、OX40、CD17、CD40、CD154、CD97、CD11a/CD18、ICOS、DAP-10、CD2、CD244、CD27和NKG2D组成的组。
64.权利要求63所述的细胞，其中所述共刺激分子是4-1BB。
65.权利要求63所述的细胞，其中所述共刺激分子是CD28。
66.权利要求62所述的细胞，其中所述CCR的细胞内结构域包括CD28共刺激分子的细胞内结构域和41-BB共刺激分子的细胞内结构域。
67.权利要求45至66中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫应答性细胞。
68.权利要求45至57中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞组成的组。
69.权利要求45至68中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
70.权利要求69所述的细胞，其中所述T细胞选自由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞组成的组。
71.权利要求45至68中任一项所述的细胞，其中所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。
72.一种含有权利要求45至71中任一项所述的细胞的组合物。
73.权利要求72所述的组合物，所述组合物是包含有药学上可接受载体的药物组合物。
74.一种核酸组合物，包括：(a)编码与抗原结合的抗原识别受体的第一多核苷酸；和(b)编码与CD38结合的嵌合共刺激受体(CCR)的第二多核苷酸，其中包含所述组合物的细胞对抗原单一阳性的细胞表现出实质的细胞溶解活性。
75.一种包括权利要求74所述的核酸组合物的载体。
76.一种包括权利要求74所述的核酸组合物的细胞。
77.权利要求76所述的细胞，其中所述细胞是免疫应答性细胞。
78.权利要求76或77所述的细胞，其中所述细胞选自由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞组成的组。
79.权利要求76至78中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
80.权利要求79所述的细胞，其中所述T细胞选自由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞组成的组。
81.权利要求74至78中任一项所述的细胞，其中所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。
82.一种治疗和/或预防受试者中肿瘤和/或病原体感染的方法，包括向所述受试者施用权利要求45至69和76至81中任一项所述的细胞或者权利要求72或73所述的组合物。
83.权利要求82所述的方法，其中所述肿瘤或病原体感染与CD38相关，和/或表达CD38。
84.权利要求82或83所述的方法，进一步包括向所述受试者施用CD38药物。
85.权利要求84所述的方法，其中所述CD38药物是抗CD38抗体。
86.一种表达嵌合抗原受体(CAR)和嵌合共刺激受体(CCR)的免疫细胞，例如T细胞或NK细胞，
a)其中所述CAR包括：
i.细胞内CD3ζ信号传导结构域；
ii.共刺激CD28细胞内结构域；
iii.CD28跨膜结构域；和
iv.与第一抗原结合的抗原特异性结合结构域；
b)其中所述CCR包括：
i.共刺激CD28细胞内结构域和共刺激4-1BB细胞内结构域；
ii.CD28跨膜结构域；和
iii.与第二抗原结合的抗原特异性结合结构域；
其中所述抗原特异性结合结构域存在于所述免疫细胞的表面，并且其中所述第一抗原与所述第二抗原不同。
87.权利要求86所述的免疫细胞，其中所述第一抗原和第二抗原选自由CD41、CD48、P2RY10、CD44v6、CD70、CD123、κ轻链、NYESO-1、BOB1、ADGRE2、CLEC12A、CCR1、LILRB2、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD56、BCMA、CS-1、CD138、Lewis抗原(LeY)和WT-1组成的组。
88.权利要求86或87所述的免疫细胞，其中所述第一抗原是CD19。
89.权利要求86至88中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二抗原是CD38。
90.权利要求86至89中任一项所述的免疫细胞，其中所述CAR的细胞内信号传导结构域包括人CD3ζ的细胞内结构域或其变体。
91.权利要求86至90中任一项所述的免疫细胞，其中所述CCR的细胞内结构域包括人共刺激CD28细胞内结构域和人共刺激4-1BB细胞内结构域，或它们的变体。
92.权利要求86至91中任一项所述的免疫细胞，其中：
a)所述CAR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段；
b)所述CCR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段；或
c)所述CAR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段，并且所述CCR的抗原特异性结合结构域是单链结合结构域，例如单链Fv片段。
93.权利要求86至92中任一项所述的免疫细胞，其中所述CAR和CCR的共刺激CD28细胞内结构域大致是相同的。
94.一种使权利要求86至93中任一项所定义的嵌合抗原受体(CAR)和嵌合共刺激受体(CCR)能在合适的免疫细胞，例如人T细胞或人NK细胞中表达的核酸分子。
95.权利要求94所述的核酸分子，所述核酸分子存在于载体中，例如存在于病毒载体中。
96.一种药物组合物，包括权利要求86至93中任一项所述的免疫细胞，或者权利要求94或95所述的核酸分子。
97.一种生产权利要求86至93中任一项所述的免疫细胞的方法，包括：
a)提供免疫细胞，例如人免疫细胞，如人T细胞或人NK细胞，和
b)通过使权利要求82至89中任一项所定义的CAR和CCR能在免疫细胞中表达来修饰所述免疫细胞。
98.一种治疗患者中恶性肿瘤，例如血液恶性肿瘤的方法，所述方法包括：
a)分离免疫细胞，例如T细胞或NK细胞，由此所述免疫细胞从所述患者分离出来；
b)通过使权利要求86至93中任一项所定义的CAR和CCR能在免疫细胞中表达来修饰所述免疫细胞；和
c)向所述患者施用经修饰的免疫细胞。
99.一种治疗患者中恶性肿瘤，例如血液恶性肿瘤的方法，所述方法包括施用权利要求98的药物组合物。
100.权利要求99所述的方法，进一步包括施用检查点抑制剂。
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