JP2018506981A - 抗ｄｌｌ３キメラ抗原受容体および使用方法 - Google Patents

Abstract

本明細書では、新規の抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体および増殖性障害を処置するためにこれを使用する方法が本明細書に提供される。

Description

相互参照出願
本書は、２０１５年２月２３日に出願された米国仮出願第６２／１１９，７９３号、２０１５年１０月１４日に出願された米国仮出願第６２／２４１，６６２号および２０１６年２月１７日に出願された米国仮出願第６２／２９６，５６０号の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによるＡＳＣＩＩフォーマットにおいて提出された配列表を含み、その全体は参照によって本明細書により組み込まれる。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年２月１９日に作成され、Ｓ６９６９７＿１２５０ＷＯ＿ｓｃ１６０５ｐｃｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称で、サイズは６１２ＫＢ（６２６，６８８バイト）である。

本発明は一般に、ＤＬＬ３結合性ドメインを組み込んでいる新規のキメラ抗原受容体の使用を含む養子免疫療法に関する。好ましい実施形態では、開示されたキメラ抗原受容体は、増殖性障害およびこの任意の再発または転移を処置または予防するのに有用である。

幹細胞および前駆細胞の分化および増殖は、正常な進行中の過程であって、器官形成の間の組織の成長、細胞の修復、および細胞の置きかえを支援するように協調して作用する過程である。系は、適切なシグナルだけが、生物の必要に基づき発せられることを確実にするように、緊密に調節されている。細胞の増殖および分化は、損傷した細胞もしくは死滅しつつある細胞の置きかえ、または成長に必要な場合に限り正常に生じる。しかし、多様なシグナル伝達化学物質の過少もしくは過剰、微小環境の変化の存在、遺伝子の変異、またはこれらの組合せを含む多くの因子により、これらの過程の破壊が誘発される場合がある。正常な細胞の増殖および／または分化が破壊されると、がんのような増殖性疾患を含む、多様な障害がもたらされる可能性がある。

がんのための従来の治療的処置は、化学療法、放射線療法、および免疫療法を含む。これらの処置は、有効でないことが多く、手術による切除は、実行可能な臨床的代替法を提供しない場合がある。現行の標準治療の限界は、患者が、第一選択の処置を受け、その後、再発する症例において、特に明白である。このような症例では、侵襲性であり、治癒不可能であることが多い、難治性腫瘍が生じる頻度が高い。多くの充実性腫瘍についての全体的生存率は、再発、腫瘍の再発、および転移を防止する既存の治療の失敗に少なくとも部分的に起因して、大部分が何年もの間不変のままである。したがって、増殖性障害のための、よりターゲティングされ、強力な治療を開発する必要は依然として大きい。本発明は、この必要に応じるものである。

広範な態様では、本発明は、ヒトＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合するＤＬＬ３結合性ドメインを含む新規のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（ＤＬＬ３ ＣＡＲ）を提供する。特定の実施形態では、ＤＬＬ３タンパク質は腫瘍始原細胞上で発現される。遺伝子改変（例えば、形質導入）により、ＤＬＬ３ ＣＡＲは細胞傷害性リンパ球（好ましくは自己）上で発現されて、ＤＬＬ３陽性腫瘍細胞を標的とし、殺傷するために使用されるＤＬＬ３感作リンパ球を提供する。本明細書で広範に論じられている通り、本発明のＣＡＲは一般に、ＤＬＬ３結合性ドメインを含む細胞外ドメイン（これは抗ＤＬＬ３抗体に由来し得る。）、膜貫通ドメインおよびある特定のリンパ球を活性化し、ＤＬＬ３陽性腫瘍細胞に対して免疫反応を生じる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。本発明の選択された実施形態は、開示されたＣＡＲを発現する免疫活性宿主細胞ならびに本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする多様なポリヌクレオチド配列およびベクターを含む。さらに他の態様は、個体においてＴリンパ球細胞活性またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を増強し、ＤＬＬ３ ＣＡＲ分子を発現する宿主細胞を個体に導入することによってがんを患っている個体を処置する方法を含む。このような態様は具体的には、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、白血病、およびリンパ腫の処置を含む。

下記でより詳細に論じられている通り、本明細書で使用されている「抗体」という用語は、無傷抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）ならびに任意の免疫反応性断片（例えば、Ｆａｂ断片）もしくは免疫反応性構築物またはこれらの誘導体（例えば、ｓｃＦｖ）を意味するように理解されるものとする。特定の実施形態では、本発明のＤＬＬ３結合性ドメイン（およびＤＬＬ３ ＣＡＲ）はｓｃＦｖ構築物を含み、好ましい実施形態では、本明細書で開示された重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体と結合について競合するｓｃＦｖ構築物を含む。他の好ましい実施形態では、本発明のＤＬＬ３結合性ドメイン（およびＤＬＬ３ ＣＡＲ）は、本明細書で開示された重鎖可変領域および軽鎖可変領域またはこれらの断片を含むｓｃＦｖ構築物を含む。このように、本開示の目的では、「抗体」という用語は、一般に使用され、明示的には、文脈上、そうでないことが指示されない限り、免疫反応性断片、免疫反応性構築物またはこれらの誘導体を含むように理解されるものとする。

本発明の選択された態様では、ＣＡＲ結合性ドメインは、ｈＤＬＬ３に特異的に結合し、配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）および配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；または配列番号２５のＶＬおよび配列番号２７のＶＨ；または配列番号２９のＶＬおよび配列番号３１のＶＨ；または配列番号３３のＶＬおよび配列番号３５のＶＨ；または配列番号３７のＶＬおよび配列番号３９のＶＨ；または配列番号４１のＶＬおよび配列番号４３のＶＨ；または配列番号４５のＶＬおよび配列番号４７のＶＨ；または配列番号４９のＶＬおよび配列番号５１のＶＨ；または配列番号５３のＶＬおよび配列番号５５のＶＨ；または配列番号５７のＶＬおよび配列番号５９のＶＨ；または配列番号６１のＶＬおよび配列番号６３のＶＨ；または配列番号６５のＶＬおよび配列番号６７のＶＨ；または配列番号６９のＶＬおよび配列番号７１のＶＨ；または配列番号７３のＶＬおよび配列番号７５のＶＨ；または配列番号７７のＶＬおよび配列番号７９のＶＨ；または配列番号８１のＶＬおよび配列番号８３のＶＨ；または配列番号８５のＶＬおよび配列番号８７のＶＨ；または配列番号８９のＶＬおよび配列番号９１のＶＨ；または配列番号９３のＶＬおよび配列番号９５のＶＨ；または配列番号９７のＶＬおよび配列番号９９のＶＨ；または配列番号１０１のＶＬおよび配列番号１０３のＶＨ；または配列番号１０５のＶＬおよび配列番号１０７のＶＨ；または配列番号１０９のＶＬおよび配列番号１１１のＶＨ；または配列番号１１３のＶＬおよび配列番号１１５のＶＨ；または配列番号１１７のＶＬおよび配列番号１１９のＶＨ；または配列番号１２１のＶＬおよび配列番号１２３のＶＨ；または配列番号１２５のＶＬおよび配列番号１２７のＶＨ；または配列番号１２９のＶＬおよび配列番号１３１のＶＨ；または配列番号１３３のＶＬおよび配列番号１３５のＶＨ；または配列番号１３７のＶＬおよび配列番号１３９のＶＨ；または配列番号１４１のＶＬおよび配列番号１４３のＶＨ；または配列番号１４５のＶＬおよび配列番号１４７のＶＨ；または配列番号１４９のＶＬおよび配列番号１５１のＶＨ；または配列番号１５３のＶＬおよび配列番号１５５のＶＨ；または配列番号１５７のＶＬおよび配列番号１５９のＶＨ；または配列番号１６１のＶＬおよび配列番号１６３のＶＨ；または配列番号１６５のＶＬおよび配列番号１６７のＶＨ；または配列番号１６９のＶＬおよび配列番号１７１のＶＨ；または配列番号１７３のＶＬおよび配列番号１７５のＶＨ；または配列番号１７７のＶＬおよび配列番号１７９のＶＨ；または配列番号１８１のＶＬおよび配列番号１８３のＶＨ；または配列番号１８５のＶＬおよび配列番号１８７のＶＨ；または配列番号１８９のＶＬおよび配列番号１９１のＶＨ；または配列番号１９３のＶＬおよび配列番号１９５のＶＨ；または配列番号１９７のＶＬおよび配列番号１９９のＶＨ；または配列番号２０１のＶＬおよび配列番号２０３のＶＨ；または配列番号２０５のＶＬおよび配列番号２０７のＶＨ；または配列番号２０９のＶＬおよび配列番号２１１のＶＨ；または配列番号２１３のＶＬおよび配列番号２１５のＶＨ；または配列番号２１７のＶＬおよび配列番号２１９のＶＨ；または配列番号２２１のＶＬおよび配列番号２２３のＶＨ；または配列番号２２５のＶＬおよび配列番号２２７のＶＨ；または配列番号２２９のＶＬおよび配列番号２３１のＶＨ；または配列番号２３３のＶＬおよび配列番号２３５のＶＨ；または配列番号２３７のＶＬおよび配列番号２３９のＶＨ；または配列番号２４１のＶＬおよび配列番号２４３のＶＨ；または配列番号２４５のＶＬおよび配列番号２４７のＶＨ；または配列番号２４９のＶＬおよび配列番号２５１のＶＨ；または配列番号２５３のＶＬおよび配列番号２５５のＶＨ；または配列番号２５７のＶＬおよび配列番号２５９のＶＨ；または配列番号２６１のＶＬおよび配列番号２６３のＶＨ；または配列番号２６５のＶＬおよび配列番号２６７のＶＨ；または配列番号２６９のＶＬおよび配列番号２７１のＶＨ；または配列番号２７３のＶＬおよび配列番号２７５のＶＨ；または配列番号２７７のＶＬおよび配列番号２７９のＶＨ；または配列番号２８１のＶＬおよび配列番号２８３のＶＨ；または配列番号２８５のＶＬおよび配列番号２８７のＶＨ；または配列番号２８９のＶＬおよび配列番号２９１のＶＨ；または配列番号２９３のＶＬおよび配列番号２９５のＶＨ；または配列番号２９７のＶＬおよび配列番号２９９のＶＨ；または配列番号３０１のＶＬおよび配列番号３０３のＶＨ；または配列番号３０５のＶＬおよび配列番号３０７のＶＨ；または配列番号３０９のＶＬおよび配列番号３１１のＶＨ；または配列番号３１３のＶＬおよび配列番号３１５のＶＨ；または配列番号３１７のＶＬおよび配列番号３１９のＶＨ；または配列番号３２１のＶＬおよび配列番号３２３のＶＨ；または配列番号３２５のＶＬおよび配列番号３２７のＶＨ；または配列番号３２９のＶＬおよび配列番号３３１のＶＨ；または配列番号３３３のＶＬおよび配列番号３３５のＶＨ；または配列番号３３７のＶＬおよび配列番号３３９のＶＨ；または配列番号３４１のＶＬおよび配列番号３４３のＶＨ；または配列番号３４５のＶＬおよび配列番号３４７のＶＨ；または配列番号３４９のＶＬおよび配列番号３５１のＶＨ；または配列番号３５３のＶＬおよび配列番号３５５のＶＨ；または配列番号３５７のＶＬおよび配列番号３５９のＶＨ；または配列番号３６１のＶＬおよび配列番号３６３のＶＨ；または配列番号３６５のＶＬおよび配列番号３６７のＶＨ；または配列番号３６９のＶＬおよび配列番号３７１のＶＨ；または配列番号３７３のＶＬおよび配列番号３７５のＶＨ；または配列番号３７７のＶＬおよび配列番号３７９のＶＨ；または配列番号３８１のＶＬおよび配列番号３８３のＶＨ；または配列番号３８５のＶＬおよび配列番号３８７のＶＨ；または配列番号３８９のＶＬおよび配列番号３９１のＶＨ；または配列番号３９３のＶＬおよび配列番号３９５のＶＨ；または配列番号３９７のＶＬおよび配列番号３９９のＶＨ；または配列番号４０１のＶＬおよび配列番号４０３のＶＨ；または配列番号４０５のＶＬおよび配列番号４０７のＶＨを含む抗体または抗体断片に由来する、それを含む、またはそれと結合について競合する。特定の好ましい実施形態では、ＤＬＬ３結合性ドメインは、上述のＶＬ配列およびＶＨ配列またはこれらの断片を含むｓｃＦｖ構築物を含む。本発明の一部の態様では、ＣＡＲ結合性ドメインは、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体またはこれらの免疫反応性断片を含む。本発明の他の態様では、上述の配列を含むＣＡＲ結合性ドメインは内部移行抗体である。

本発明のさらに他の好ましいＤＬＬ３ ＣＡＲは、ＣＤＲがＫａｂａｔらに従って導出される、図１Ａまたは図１Ｂにおいて示された１つ以上の重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）または軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）ＣＤＲを含む、ＣＤＲグラフトもしくはヒト化抗体またはこの断片もしくは構築物を含む。

さらに他の適合性の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＤＲグラフトまたはヒト化ＤＬＬ３抗体であるｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４およびｈＳＣ１６．５６またはこれらの断片のうち１つに由来する結合性領域（例えば、ｓｃＦｖの形態の）を含む。

他の実施形態は、抗体もしくは抗体断片またはこれらの構築物を含むＣＡＲであって、前記抗体が、
配列番号４０８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４０９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号４１０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；ならびに
配列番号４１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号４１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体重鎖
を含むＣＡＲを対象とする。

別の実施形態では、本発明は、抗体もしくは抗体断片またはこれらの構築物を含むＣＡＲであって、前記抗体が、
配列番号４１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４１５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号４１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；ならびに
配列番号４１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号４１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体重鎖
を含むＣＡＲを対象とする。

別の実施形態では、本発明は、抗体もしくは抗体断片またはこれらの構築物を含むＣＡＲであって、前記抗体が、
配列番号４２０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号４２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；ならびに
配列番号４２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号４２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体重鎖
を含むＣＡＲを対象とする。

別の実施形態では、本発明は、抗体もしくは抗体断片またはこれらの構築物を含むＣＡＲであって、前記抗体が、
配列番号４２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号４２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；ならびに
配列番号４２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号４３１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体重鎖
を含むＣＡＲを対象とする。

別の実施形態では、本発明は、抗体もしくは抗体断片またはこれらの構築物を含むＣＡＲであって、前記抗体が、
配列番号４３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号４３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；ならびに
配列番号４３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４３６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号４３７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体重鎖
を含むＣＡＲを対象とする。

ある特定の好ましい実施形態では、上述の抗体のそれぞれは、ヒト化抗体を含む。さらに、本明細書に記載されている通り、このような例示的なマウスおよびヒト化重および軽鎖可変領域をコードする核酸配列が、添付の配列表に示されている。

他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１６．５、ＳＣ１６．７、ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２１、ＳＣ１６．２２、ＳＣ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２９、ＳＣ１６．３０、ＳＣ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３６、ＳＣ１６．３８、ＳＣ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４７、ＳＣ１６．４９、ＳＣ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５６、ＳＣ１６．５７、ＳＣ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６３、ＳＣ１６．６５、ＳＣ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７３、ＳＣ１６．７８、ＳＣ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８４、ＳＣ１６．８８、ＳＣ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１６．１０５、ＳＣ１６．１０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０９、ＳＣ１６．１１０、ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ１６．１１５、ＳＣ１６．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１２０、ＳＣ１６．１２１、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、ＳＣ１６．１２５、ＳＣ１６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．１３１、ＳＣ１６．１３２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、ＳＣ１６．１３６、ＳＣ１６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６．１４０、ＳＣ１６．１４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４、ＳＣ１６．１４７、ＳＣ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９およびＳＣ１６．１５０からなる群から選択される参照抗体によって定義されるビンに存在する抗体もしくは抗体断片またはこれらの構築物を含む。また他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ビンＡ由来の抗体（または抗体断片）、ビンＢ由来の抗体、ビンＣ由来の抗体、ビンＤ由来の抗体、ビンＥ由来の抗体、ビンＦ由来の抗体、ビンＧ由来の抗体、ビンＨ由来の抗体またはビンＩ由来の抗体を含む。さらに他の好ましい実施形態は、参照抗体および参照抗体と競合する任意の抗体を含む。

開示された結合性ドメインの文脈において使用される場合、「競合する」または「競合抗体」という用語は、基準抗体またはその免疫反応断片が、試験抗体の共通抗原への特異的結合を実質的に（例えば、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％超）防止または阻害するアッセイにより決定された抗体間の結合競合を意味する。このような競合を決定するための適合性の方法は、例えば、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、競合ＥＬＩＳＡなどのような当技術分野で公知の技法を含む。

ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書で開示された抗ＤＬＬ３結合性ドメインのうちいずれか１つの重鎖または軽鎖アミノ酸配列（またはこれらの構築物もしくは誘導体）をコードする核酸を対象とする。適合性の抗ＤＬＬ３重鎖および軽鎖可変領域核酸配列は、添付の配列表に示されている。好ましい実施形態では、結合性ドメインまたはＣＡＲをコードする核酸が、プラスミドまたはベクターに組み込まれる。さらに他の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターを含む。

別の実施形態では、本発明は、例えば、膵臓がん、結腸直腸がん、前立腺がん、小細胞および非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がんならびに胃がんのようながんを処置する方法であって、本明細書で開示された抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する宿主細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、がんを処置する方法であって、本明細書で開示された抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する宿主細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、さらに、被験体へと、少なくとも１つのさらなる治療用部分を投与するステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、宿主細胞は感作リンパ球を含む。

本発明はさらに、腫瘍細胞集団における腫瘍始原細胞を低減する方法であって、腫瘍始原細胞および腫瘍始原細胞以外の腫瘍細胞を含む腫瘍細胞集団を、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する宿主細胞と接触させ、これにより、腫瘍始原細胞の頻度を低減するステップを含む方法も提供する。

さらに他の好ましい実施形態では、本発明はまた、がんのようなＤＬＬ３関連障害の処置に有用であるキットまたはデバイスおよび関連する方法も提供する。この目的のために、本発明は、好ましくは、ＤＬＬ３関連障害を処置するためのＤＬＬ３感作リンパ球を生成するのに有用な製品であって、例えば、開示されたＣＡＲをコードするベクター（例えば、ウイルスベクター）を含有する容器またはレセプタクル、およびＤＬＬ３感作リンパ球を生成するための教材を含む製品を提供する。選択された実施形態では、キットは、リンパ球を効果的に形質導入するためのさらなる試薬およびレセプタクルを含む。他の選択された実施形態では、このようなキットは、所望の免疫反応を生じるように患者へと直接投与されてもよい同種異系ＤＬＬ３感作リンパ球を含む。また他の実施形態では、このような製品は、ＤＬＬ３感作リンパ球の液体製剤を含む容器またはレセプタクルを含む。このような実施形態では、ＤＬＬ３感作リンパ球は、同種異系間または自己宿主細胞を含むことができ、他の実施形態では、液体製剤は、医薬として許容される担体を含むことができる。

前出は概要であり、したがって、当然に、詳細の簡略化、一般化および省略を含み；その結果、当業者は、概要が例示のみであり、決して限定することを意図されるものではないことを十分に理解する。本明細書で記載された方法、組成物および／もしくはデバイスならびに／または他の主題の他の態様、特徴および利点は、本明細書で示された教示において明らかとなる。概要は、下記の詳細な説明においてさらに記載されている簡略化された形態の概念の選択を導入するために提供される。この概要は、請求された主題の重要な特徴または必須の特徴を同定することを意図されるものでもなく、請求された主題の範囲を決定する補助として使用されることを意図されるものでもない。

表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、多数のマウスＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、多数のマウスＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、多数のマウスＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、多数のマウスＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、多数のマウスＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、例示的なヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、多数のマウスＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、多数のマウスＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、多数のマウスＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、多数のマウスＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、多数のマウスＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 表形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性の、例示的なヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１−４０７、奇数）を提供する。 模式的な形式において、本明細書の実施例に記載されている通りに単離、クローニングおよび操作された、例示的なＤＬＬ３抗体のドメインレベルマッピング解析の結果を描写する。 例示的なＤＬＬ３ ＣＡＲ構築物の概略図を提供し、その種々の構成要素を例示する。 本発明と適合性の３種の例示的なＤＬＬ３ ＣＡＲのうち１種（ＳＣＴ１−ｈ１６．１５）の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。 本発明と適合性の３種の例示的なＤＬＬ３ ＣＡＲのうち１種（ＳＣＴ１−ｈ１６．１３）の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。 本発明と適合性の３種の例示的なＤＬＬ３ ＣＡＲのうち１種（ＳＣＴ１−ｈ１６．２５）の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。 ＤＬＬ３感作リンパ球を産生するためのプロセスおよびＤＬＬ３陽性腫瘍細胞に対する免疫応答を生じるためのこれらの後の使用を例示する概略図を提供する。 フローサイトメトリーを使用して測定した、形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞上での例示的なＤＬＬ３ ＣＡＲ（ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５およびＳＣＴ１−ｈ１６．２５）の発現を実証する。 フローサイトメトリーを使用して測定した、操作したＨＥＫ−２９３Ｔ対照細胞上でのｈＤＬＬ３の発現を実証する。 ＩＬ−２産生により測定した、標的細胞に対するリンパ球の種々の比での、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５を形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞における免疫応答の誘導を描写する。 同じリンパ球対標的細胞比で、３種の異なる例示的なＤＬＬ３ ＣＡＲ細胞を使用して生じた免疫応答（同様にＩＬ２レベルにより測定）の誘導を描写する。 ヒト初代リンパ球が、本明細書の教示に従って例示的な抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを有効に発現するように操作され得ることを実証する。 フローサイトメトリーによって証明された、ＤＬＬ３を発現するように操作された２９３Ｔ細胞株のＤＬＬ３表面発現プロファイルを提供する。 フローサイトメトリーによって証明された、小細胞肺がん患者由来の異種移植片（「ＰＤＸ」）細胞株のＤＬＬ３表面発現プロファイルを提供する。 ３種の異なるＤＬＬ３ ＣＡＲ（ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５およびＳＣＴ１−ｈ１６．２５）を含むＤＬＬ３感作初代リンパ球が、ＤＬＬ３を発現する操作された２９３Ｔ細胞を消失させる能力を示す。 ２人の個人由来の初代ヒトリンパ球が、本明細書の教示に従って抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを有効に発現するように操作され得ることを実証する。 操作した２９３Ｔ細胞に曝露したときの、２人の個体由来の宿主細胞を含むＤＬＬ３感作リンパ球が、免疫反応を引き起こす能力（ＴＮＦαの誘導により測定した）を実証する。 ＰＤＸ腫瘍細胞に曝露したときの、２人の個体由来の宿主細胞を含むＤＬＬ３感作リンパ球が、免疫反応を引き起こす能力（ＴＮＦαの誘導により測定した）を実証する。 操作した２９３Ｔ細胞に曝露したときの、２人の個体由来の宿主細胞を含むＤＬＬ３感作リンパ球が、免疫反応を引き起こす能力（ＩＮＦγの誘導により測定した）を実証する。 ＰＤＸ腫瘍細胞に曝露したときの、２人の個体由来の宿主細胞を含むＤＬＬ３感作リンパ球が、免疫反応を引き起こす能力（ＩＮＦγの誘導により測定した）を実証する。 曝露すると、２人の個人由来の宿主細胞を含むＤＬＬ３感作リンパ球が、操作した２９３Ｔ細胞を消失させる能力を示す。 曝露すると、２人の個人由来の宿主細胞を含むＤＬＬ３感作リンパ球が、ＰＤＸ腫瘍細胞を消失させる能力を示す。

本発明は、多くの異なる形態で実施され得る。本明細書では、本発明の原理について例示する、本発明の非限定的な例示的実施形態が開示される。本明細書で使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される内容を限定するとはみなさないものとする。本開示の目的では、全ての配列識別受託番号（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）は、そうでないことが言及されない限り、ＮＣＢＩ基準配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベース内および／またはＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースにおいて見出すことができる。

養子移入免疫療法における最近の進歩により、特に充実性腫瘍に関して、多様な新生物の処置のための有望な手法および患者の経験を改善するための機会が提供されている。これに関して、本発明は、デルタ様リガンド３（「ＤＬＬ３」）と会合または反応する細胞外結合性またはターゲティングドメインを含む新規のキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）の使用を対象とする。本明細書で広く論じられている通り、ＤＬＬ３は特に、多くの異なるがんで発現される有効な腫瘍マーカーであり、がん幹細胞と会合することが見出されていることは重要である。したがって、本発明の抗ＤＬＬ３結合性ドメインが、リンパ球上で発現されたキメラ抗原受容体に組み込まれる場合、結果として得られる「ＤＬＬ３感作リンパ球」（例えば、ＤＬＬ３決定基を免疫特異的に認識するナチュラルキラー細胞またはＴ細胞）は、がん幹細胞を含む異常なＤＬＬ３陽性細胞に対する免疫反応を効果的にマウントすることができる。腫瘍形成性「播種」細胞を効果的に消失させるこの能力は、腫瘍の再発または転移の可能性を低減するのに重要であることが多い。この目的のために、本発明の抗ＤＬＬ３ ＣＡＲリンパ球が、他の治療剤（抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを含む）と組み合わせてまたは標準治療による処置後の維持レジメンの一部として使用され得ることは十分に理解される。

より一般に、キメラ抗原受容体は、シグナル伝達ドメイン（例えば、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインまたはＴ細胞活性化ドメイン）に連結された抗体の抗原結合性ドメインを含有するまたは含む人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはハイブリッドポリペプチドである。本発明のＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用することにより、非ＭＨＣ制限様式でＤＬＬ３陽性標的細胞へと感作リンパ球（例えば、Ｔ細胞）の特異性および反応性を向け直す能力を有する。非ＭＨＣ拘束性抗原認識は、ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングから独立して腫瘍形成性ＤＬＬ３を認識する能力を与え、これにより腫瘍エスケープの主要な機構を回避する。さらに、Ｔ細胞において発現された場合、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖およびβ鎖と二量体化しないことが有利である。

したがって、本発明は一般に、標的細胞上でＤＬＬ３と免疫特異的に会合し、免疫反応を刺激するＤＬＬ３結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体を対象とする。好ましい実施形態では、ＣＡＲのＤＬＬ３結合性ドメインは、本明細書で開示された重鎖抗体可変領域および軽鎖抗体可変領域に由来するｓｃＦｖを含んでもよい。より具体的には、本発明の「抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ」または単に「ＤＬＬ３ ＣＡＲ」は、細胞外ＤＬＬ３結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを組み込んでいるキメラタンパク質を含むものとする（図３を参照されたい）。典型的に、所望のＤＬＬ３ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、合成されまたは操作され、発現ベクターまたは発現系（例えば、レンチウイルス、レトロウイルスなど）へと挿入される。好ましい実施形態では、患者またはドナーから得たＴリンパ球、ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）および樹状細胞を含むリンパ球は次いで、細胞外ＤＬＬ３結合性ドメインを有するＣＡＲタンパク質を発現する操作されたリンパ球（すなわち、「ＤＬＬ３感作リンパ球」）を提供するために、（例えば、形質導入された）選択されたＤＬＬ３ ＣＡＲベクターに曝露される。任意選択の増殖後、これらのＤＬＬ３感作リンパ球はＤＬＬ３陽性腫瘍細胞に対する免疫特異的反応をマウントするために患者へと注入され得る（概して図５を参照されたい）。これに関して、ＤＬＬ３感作リンパ球は、ＤＬＬ３決定基を発現する標的細胞と接触すると活性化される。「感作リンパ球（例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞）を活性化する」ことは、これらの生物学的状態の変化を誘導し、これによって細胞が活性化マーカーを発現し、サイトカインを産生し、増殖しおよび／または標的細胞に対して細胞傷害性になることを意味する。これらの変化の全ては、一次刺激シグナルによってもたらされ得る。共刺激シグナルは一次シグナルの大きさを増幅し、初期の刺激後に細胞死を抑制して、その結果としてより永続的な活性化状態、それによってより高い細胞傷害性能を生じる。

したがって、ＤＬＬ３結合性ドメインの他に、本発明のＣＡＲは、一次細胞質シグナル伝達配列（例えば、Ｔ細胞受容体複合体を介して抗原依存性一次活性化を開始するための配列）を開始する細胞内ドメインまたは細胞質ドメインを含むことは十分に理解される。適合性の細胞内ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来してもよい。他の好ましい実施形態では、本発明のＣＡＲは二次シグナルまたは共刺激シグナルを開始する細胞内ドメインを含む。適合性の共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、４−１ＢＢおよびグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体に由来する細胞内ドメインを含んでもよい（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．ＵＳ／２０１４／０２４２７０１を参照されたい）。さらに、好ましい実施形態では、開示されたＣＡＲは、細胞外ＤＬＬ３結合性ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に挿入された膜貫通（および任意選択的にスペーサー）ドメインを含む。下記により詳細に論じられている通り、膜貫通ドメインは、例えば、当技術分野で公知の抗体定常（Ｆｃ）領域、ヒトＣＤ８ａまたは人工的に産生されたスペーサーの一部を含んでもよい。本質的に、細胞膜中にＣＡＲを固定し、ＤＬＬ３結合性ドメインの有効な会合および細胞内ドメインからの適切なシグナル伝達の伝達を可能にする任意のアミノ酸配列は本発明に適合性がある。

本発明の新規のＤＬＬ３ ＣＡＲに関して、腫瘍標的としてのＤＬＬ３の選択は有効な抗腫瘍免疫反応を生じるのに不可欠であることは十分に理解される。より具体的には、ＤＬＬ３表現型決定基が、神経内分泌特色を示す新生物を含む種々の増殖性障害に臨床的に関連し、ＤＬＬ３タンパク質およびその変異体またはアイソフォームが、関連疾患の処置において活用され得る有用な腫瘍マーカーを提供することが判明した。これに関して、本発明は、任意のシグナル伝達構成要素に加えて抗ＤＬＬ３結合性ドメインを含む多くのキメラ抗原受容体を提供する。下記により詳細に論じられている通り、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲは腫瘍形成性細胞を消失させるのに特に有効であり、したがって特定の増殖性障害またはこの進行もしくは再発の処置および予防に有用である。

さらに、本出願に示された通り、細胞表面ＤＬＬ３タンパク質のようなＤＬＬ３マーカーまたは決定基は、がん幹細胞（腫瘍永続性細胞としても知られている）と治療的に関連し、これを消失またはサイレンシングさせるために効果的に利用され得ることが見出されている。本明細書で開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲの使用によりがん幹細胞を選択的に低減または消失させる能力は、このような細胞が一般に多くの従来の処置に対して耐性があることが知られている点で驚くべきことである。すなわち、従来およびより最近の標的化された処置方法の有効性は、多様な処置方法にもかかわらず腫瘍成長を永続化することができる耐性がん幹細胞の存在および／または出現によって制限されていることが多い。さらに、がん幹細胞と関連する決定基は、低い発現または一貫性のない発現、腫瘍形成性細胞と会合したままにできないことまたは細胞表面に存在することができないことに起因して不十分な治療標的を生じることが多い。従来技術の教示とはかなり対照的に、ここで開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲおよび関連方法は、このようながん幹細胞の分化を特異的に消失させる、枯渇させる、サイレンシングさせるまたは促進し、それによって根底的な腫瘍成長を維持するまたは顕著に再誘導するこれらの能力を無効にするためにこの固有の耐性を効果的に克服する。さらに、ＤＬＬ３タンパク質の発現は、ゴルジのような細胞内位置に主に関連したため、このような表現型決定基が、本明細書が教示する通り特異的ＤＬＬ３ ＣＡＲの治療標的としてうまく活用され得るかは不確かであった。

したがって、本明細書で開示されたもののようなＤＬＬ３ ＣＡＲは、選択された増殖性（例えば、新生物性）障害またはこの進行もしくは再発の処置および／または予防において有利に使用され得ることは特に注目に値する。本発明の好ましい実施形態は、特に例示的なシグナル伝達ドメインもしくは共刺激ドメインまたはシグナル伝達領域もしくは共刺激領域に関してまたは神経内分泌特色を含むがん幹細胞もしくは腫瘍および開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲとのこれらの相互作用の文脈において下記に広く論じられているが、当業者は、本発明の範囲がこのような例示的な実施形態に限定されないことを十分に理解することは十分に理解される。むしろ、本発明および添付の特許請求の範囲の最も広範な実施形態は、広くおよび明示的に、ＤＬＬ３と免疫特異的に会合または結合する結合性ドメインを含む任意のキメラ抗原受容体ならびに任意の特定の作用機構、ＣＡＲ構築物または特異的に標的化された腫瘍構成要素、細胞構成要素もしくは分子構成要素にも関わらず新生物性障害または細胞増殖性障害を含む、様々なＤＬＬ３関連障害またはＤＬＬ３媒介性障害の処置および／または予防におけるこれらの使用を対象とする。

この目的のために、および本出願において実証されている通り、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲは、増殖性細胞または腫瘍形成性細胞を標的とし、消失させるまたはそうでなければ無力化し、ＤＬＬ３関連障害（例えば、新生物）を処置するために効果的に使用され得ることが予想外に見出されている。本明細書で使用された「ＤＬＬ３関連障害」は、疾患または障害の過程または病因の間にＤＬＬ３遺伝子構成要素または発現（「ＤＬＬ３決定基」）の表現型異常によってマーク、診断、検出または同定される任意の障害または疾患（増殖性障害を含む）を意味すると理解されるものとする。これに関して、ＤＬＬ３表現型異常または決定基は、例えば、上昇したレベルまたは低下したレベルのＤＬＬ３タンパク質発現、特定の定義可能な細胞集団上での異常なＤＬＬ３タンパク質発現または細胞周期の不適切な局面もしくは段階における異常なＤＬＬ３タンパク質発現を含んでもよい。もちろん、ＤＬＬ３の遺伝子型決定基（例えば、ｍＲＮＡ転写レベル）の同様の発現パターンもまた、ＤＬＬ３障害を分類、検出または処置するために使用されてもよいことは十分に理解される。

Ｉ．ＤＬＬ３生理学
ＤＬＬ３表現型決定基は、神経内分泌特色を示す新生物を含む、多様な増殖性障害と臨床的に関連していることならびにＤＬＬ３タンパク質およびこの変異体またはアイソフォームは、関連疾患の処置に利用され得る有用な腫瘍マーカーを提供することが見出されている。これに関して、本発明は、リンパ球において免疫反応を誘導できる１つ以上のシグナル伝達ドメインと操作可能に会合している操作された抗ＤＬＬ３結合剤またはターゲティング剤を含む多くのＤＬＬ３ ＣＡＲ構築物を提供する。下記により詳細に論じられ、添付の実施例に示された通り、開示された抗ＤＬＬ３ ＣＡＲは腫瘍形成性細胞を消失させるのに特に有効であり、したがって特定の増殖性障害またはこの進行もしくは再発の処置および予防に有用である。

さらに、細胞表面ＤＬＬ３タンパク質のようなＤＬＬ３マーカーまたは決定基は、がん幹細胞（腫瘍永続性細胞としても知られている）と治療的に関連し、これを消失またはサイレンシングさせるために効果的に利用され得ることが見出されている。本明細書で開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲの使用によりがん幹細胞を選択的に低減または消失させる能力は、このような細胞が一般に多くの従来の処置に対して耐性があることが知られている点で驚くべきことである。すなわち、従来およびより最近の標的化された処置方法の有効性は、これらの多様な処置方法にもかかわらず腫瘍成長を永続化することができる耐性がん幹細胞の存在および／または出現によって制限されていることが多い。さらに、がん幹細胞と関連する決定基は、低い発現または一貫性のない発現、腫瘍形成性細胞と会合したままにできないことまたは細胞表面に存在することができないことに起因して不十分な治療標的を生じることが多い。従来技術の教示とはかなり対照的に、ここで開示されたＣＡＲおよび方法は、このようながん幹細胞の分化を特異的に消失させる、枯渇させる、サイレンシングさせるまたは促進し、それによって根底的な腫瘍成長を維持するまたは再誘導するこれらの能力を無効にするためにこの固有の耐性を効果的に克服する。

ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）では、ノッチシグナル伝達は、１種のノッチ受容体遺伝子ならびにセレートおよびデルタとして公知の２種のリガンド遺伝子によって主に媒介される（Ｗｈａｒｔｏｎら、１９８５年；Ｒｅｂａｙら、１９９１年）。ヒトでは、４種の公知ノッチ受容体および５種のＤＳＬ（デルタ−セレートＬＡＧ２）リガンド（うち２種が、ジャギド１およびジャギド２として公知のセレートホモログであり、３種が、デルタ様リガンドまたはＤＬＬ１、ＤＬＬ３およびＤＬＬ４と命名されたデルタホモログである。）が存在する。一般に、シグナル受信細胞の表面におけるノッチ受容体は、対向するシグナル送信細胞の表面において発現されたリガンドとの相互作用（トランス−相互作用と命名）によって活性化される。このようなトランス−相互作用は、ノッチ受容体の一連のプロテアーゼ媒介性切断をもたらす。結果として、ノッチ受容体細胞内ドメインは、膜から核へと自由に転位置し、核内で、転写因子のＣＳＬファミリー（ヒトにおけるＲＢＰＪ）とパートナーを組み、これをノッチ応答性遺伝子の転写リプレッサーからアクチベーターへと変換する。

ヒトノッチリガンドのうち、ＤＬＬ３は、トランス−相互作用によりノッチ受容体を活性化することができないと思われるという点において異なる（Ｌａｄｉら、２００５年）。ノッチリガンドは、シスで（同じ細胞において。）ノッチ受容体と相互作用して、ノッチシグナルの阻害をもたらすこともできるが、シス−阻害の正確な機構は、依然として不明であり、リガンドに応じて変動し得る（例えば、Ｋｌｅｉｎら、１９９７年；Ｌａｄｉら、２００５年；Ｇｌｉｔｔｅｎｂｅｒｇら、２００６年を参照）。２つの仮定される阻害機序として、トランス−相互作用を防止することによる細胞表面におけるノッチシグナル伝達のモジュレート、または受容体のプロセシングを撹乱することによるもしくは小胞体もしくはゴルジ内における受容体の保持を物理的に引き起こさせることによる、細胞表面におけるノッチ受容体の量の低減が挙げられる（Ｓａｋａｍｏｔｏら、２００２年；Ｄｕｎｗｏｏｄｉｅ、２００９年）。しかし、隣接する細胞におけるノッチ受容体およびリガンドの発現の確率差分が、転写および非転写プロセスの両方により増幅され得ること、また、シス−およびトランス−相互作用の微妙なバランスが、隣接する組織における多様な細胞運命のノッチ媒介性に関する描写の微調整をもたらし得ることが明らかである（Ｓｐｒｉｎｚａｋら、２０１０年）。

ＤＬＬ３は、ノッチＤＳＬリガンドのデルタ様ファミリーのメンバーである。代表的なＤＬＬ３タンパク質オルソログは、ヒト（受託番号ＮＰ＿０５８６３７およびＮＰ＿９８２３５３）、チンパンジー（受託番号ＸＰ＿００３３１６３９５）、マウス（受託番号ＮＰ＿０３１８９２）およびラット（受託番号ＮＰ＿４４６１１８）を含むがこれらに限定されない。ヒトでは、ＤＬＬ３遺伝子は、染色体１９ｑ１３に位置する９．５ｋＢｐに及ぶ８個のエクソンからなる。最後のエクソン内の選択的スプライシングは、２種のプロセシングされた転写物を生じ、うち一方は２３８９塩基（受託番号ＮＭ＿０１６９４１）であり、もう一方は２０５２塩基（受託番号ＮＭ＿２０３４８６）である。前者の転写物は、６１８アミノ酸のタンパク質（受託番号ＮＰ＿０５８６３７；配列番号１）をコードする一方、後者は、５８７アミノ酸のタンパク質（受託番号ＮＰ＿９８２３５３；配列番号２）をコードする。ＤＬＬ３のこれら２種のタンパク質アイソフォームは、これらの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインにわたって全体的な１００％同一性を共有し、より長い方のアイソフォームが、タンパク質のカルボキシ末端に３２個の追加的な残基を含有する伸長された細胞質テイルを含有するという点のみが異なる。アイソフォームの生物学的な関連性は不明であるが、両方のアイソフォームが腫瘍細胞において検出され得る。

図２に模式的に示す通り、ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域は、６個のＥＧＦ様ドメイン、単一のＤＳＬドメインおよびＮ末端ドメインを含む。一般に、ＥＧＦドメインは、ｈＤＬＬ３（配列番号１および２）の約アミノ酸残基２１６−２４９（ドメイン１）、２７４−３１０（ドメイン２）、３１２−３５１（ドメイン３）、３５３−３８９（ドメイン４）、３９１−４２７（ドメイン５）および４２９−４６５（ドメイン６）において発生すると認識され、ＤＳＬドメインは、約アミノ酸残基１７６−２１５に、Ｎ末端ドメインは、約アミノ酸残基２７−１７５において発生する。本明細書でより詳細に論じる通り、また、後述する実施例に示す通り、ＥＧＦ様ドメインのそれぞれ、ＤＳＬドメインおよびＮ末端ドメインは、別個のアミノ酸配列によって定義されるＤＬＬ３タンパク質の一部を含む。本開示の目的のため、それぞれのＥＧＦ様ドメインが、ＥＧＦ１からＥＧＦ６と命名され、ＥＧＦ１がタンパク質のＮ末端部分に最も近くなることができることに留意されたい。タンパク質の構造組成について、本発明の有意な一態様は、開示されているＤＬＬ３モジュレーターが、選択されたドメイン、モチーフまたはエピトープと反応することができるように、生成、製作、操作または選択され得ることである。ある場合において、このような部位特異的モジュレーターは、これらの主要な作用機序に応じて増強された反応性および／または有効性を提供することができる。特に好ましい実施形態では、ＤＬＬ３ ＣＡＲは、ＤＳＬドメインに結合し、さらにより好ましい実施形態では、ＤＳＬドメイン内のＧ２０３、Ｒ２０５、Ｐ２０６（配列番号４）を含むエピトープに結合する。

ＩＩ．がん幹細胞
上記に示された通り、驚くべきことに、異常なＤＬＬ３発現（遺伝子型および／または表現型）は多様な腫瘍形成性細胞亜集団と関連していることが発見されている。これに関して、本発明は、このような細胞（例えば、がん幹細胞）をターゲティングするのに特に有用であり得、それによって新生物性障害の処置、管理または予防を促進するＤＬＬ３ ＣＡＲ媒介性治療レジメンを提供する。したがって、好ましい実施形態では、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲは、本発明の教示に従って腫瘍始原細胞の頻度を低減させ、それによって増殖性障害の処置または管理を促進するために有利に使用され得る。

現行のモデルによれば、腫瘍は、非腫瘍形成性細胞と腫瘍形成性細胞とを含む。非腫瘍形成性細胞は、自己再生する能力を有さず、免疫不全状態のマウスへと、過剰細胞数で移植する場合でもなお、腫瘍を増殖可能な形で形成することが不可能である。本明細書では「腫瘍始原細胞」（ＴＩＣ）とも称されており、腫瘍の細胞集団のうちの０．１−４０％（より典型的には０．１−１０％）を占める腫瘍形成性細胞は、腫瘍を形成する能力を有する。腫瘍形成性細胞は、がん幹細胞（ＣＳＣ）および腫瘍前駆細胞（ＴＰｒｏｇ）として互換的に言及される、両方の腫瘍永続細胞（ＴＰＣ）を包含する。

ＣＳＣは、正常組織における細胞階層を支える正常幹細胞と同様に、多系列分化の能力を維持しながら、無際限に自己複製することが可能である。ＣＳＣは、腫瘍形成性子孫細胞および非腫瘍形成性子孫細胞の両方を発生させることが可能であり、継代単離と、単離された少数のＣＳＣの、免疫不全状態のマウスへの継代移植とにより裏付けられる通り、親腫瘍の異質性の細胞組成を完全に再現し得る。

Ｔｐｒｏｇは、ＣＳＣと同様に、初代移植片における腫瘍の成長を促進する能力を有する。しかし、Ｔｐｒｏｇは、ＣＳＣとは異なり、親腫瘍の細胞異質性を再現することが可能ではなく、少数の高度に精製されたＴｐｒｏｇの、免疫不全状態のマウスへの継代移植により裏付けられる通り、有限数の細胞分裂だけが可能なことが典型的であるため、後代の移植片における腫瘍形成の再開においてそれほど効率的でもない。Ｔｐｒｏｇはさらに、初期Ｔｐｒｏｇおよび後期Ｔｐｒｏｇへと分けることもでき、これらは、表現型（例えば、細胞表面マーカー）および腫瘍細胞アーキテクチャーを再現するそれらの異なる能力により識別することができる。いずれも、腫瘍を、ＣＳＣと同程度に再現することはできないが、初期Ｔｐｒｏｇは、親腫瘍の特徴を再現する能力が、後期Ｔｐｒｏｇより大きい。前出の差異にも拘らず、一部のＴｐｒｏｇ集団は、まれな機会には、通常はＣＳＣに帰せられる自己再生能を獲得し、それら自体がＣＳＣとなる場合があることが示されている。

ＣＳＣは、（ｉ）Ｔｐｒｏｇ（初期Ｔｐｒｏｇおよび後期Ｔｐｒｏｇの両方）；および（ｉｉ）腫瘍浸潤細胞、例えば、ＣＳＣに由来し得、バルクの腫瘍（ｔｈｅ ｂｕｌｋ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ）を含むことが典型的な、線維芽細胞／間質細胞、内皮細胞、および造血細胞のような非腫瘍形成性細胞よりも高い腫瘍形成性を呈示し、比較するとより静止状態である。従来の治療およびレジメンが、大部分、腫瘍を減量し、かつ、迅速に増殖している細胞を攻撃するようにデザインされていることを踏まえると、ＣＳＣは、従来の治療およびレジメンに対して、より速く増殖しているＴｐｒｏｇおよび、非腫瘍形成性細胞のような、他のバルク腫瘍細胞集団より抵抗性が大きい。ＣＳＣを従来の治療に対して比較的化学療法抵抗性とする他の特徴は、多剤抵抗性輸送体の発現の増加、ＤＮＡ修復機構の増強、および抗アポトーシス性遺伝子の発現である。標準的な化学療法では、持続的な腫瘍の成長および再発を実際に促進するＣＳＣを標的としないため、ＣＳＣにおけるこれらの特性は、進行期の新生物を伴う患者の大半には長期にわたる利益を確実にする、標準的な腫瘍処置レジメンの失敗の鍵となる原因を構成する。

驚くべきことに、ＤＬＬ３発現は、多様な腫瘍形成性細胞集団と関連することが発見されている。本発明は、腫瘍形成性細胞をターゲティングするために特に有用であり得、腫瘍形成性細胞をサイレンシングし、感受性にし、中和し、頻度を低減し、遮断し、抑止し、これに干渉し、これを減少させ、妨げ、抑制し、制御し、枯渇させ、和らげ、これに影響し（ｍｅｄｉａｔｅ）、減らし、再プログラム化し、消失させ、または他の形で阻害し（まとめて、「阻害し」）、これにより、増殖性障害（例えば、がん）の処置、管理、および／または防止を容易とするのに使用し得るＤＬＬ３ ＣＡＲを提供する。有利なことに、本発明の新規のＤＬＬ３ ＣＡＲは、好ましくは、被験体へと投与されると、ＤＬＬ３決定基の形態（例えば、アイソタイプａまたはｂ）に関わらず、腫瘍形成性細胞の頻度または腫瘍形成性を低減するように選択することができる。腫瘍形成性細胞頻度の低減は、（ｉ）腫瘍形成性細胞の阻害または根絶；（ｉｉ）腫瘍形成性細胞の成長、拡大、または再発を制御すること；（ｉｉｉ）腫瘍形成性細胞の開始、伝播、維持、または増殖を中断させることの結果として生じる場合もあり；（ｉｖ）腫瘍形成性細胞の生存、再生、および／または転移を他の形で妨げることにより生じる場合もある。一部の実施形態では、腫瘍形成性細胞の阻害は、１つ以上の生理学的経路の変化の結果として生じ得る。経路の変化は、腫瘍形成性細胞の阻害によるのであれ、それらの潜在力の修飾（例えば、分化の誘導またはニッチの破壊による）によるのであれ、腫瘍形成性細胞が、腫瘍環境または他の細胞に影響を及ぼす能力に他の形で干渉することによるのであれ、腫瘍形成、腫瘍の維持および／または転移ならびに再発を阻害することにより、ＤＬＬ３関連障害のより有効な処置を可能とする。

腫瘍形成性細胞の頻度の低減を評価するのに使用し得る方法は、サイトメトリー解析または免疫組織化学解析、好ましくは、インビトロまたはインビボにおける限界希釈解析を介する方法（Ｄｙｌｌａら、２００８年、ＰＭＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２；およびＨｏｅｙら、２００９年、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１）を含むがこれらに限定されない。

フローサイトメトリーおよび免疫組織化学検査はまた、腫瘍形成性細胞頻度を決定するのにも使用することができる。いずれの技法も、当技術分野で認知された細胞表面タンパク質または細胞表面マーカーであって、腫瘍形成性細胞について富化されることが公知の細胞表面タンパク質または細胞表面マーカーに結合する、１つ以上の抗体または試薬（ＷＯ２０１２／０３１２８０を参照されたい）を用いる。当技術分野で公知の通り、フローサイトメトリー（例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ））はまた、腫瘍形成性細胞を含む多様な細胞集団を特徴付ける、単離する、精製する、これらについて富化する、またはこれらについて分取するのにも使用することができる。フローサイトメトリーでは、混合された細胞集団を懸濁させた流体の流れを、１秒間当たり最大数千個の粒子の物理的特徴および／または化学的特徴を測定することが可能な電気的検出装置に通すことにより腫瘍形成性細胞レベルを測定する。免疫組織化学検査は、組織試料を、腫瘍形成性細胞マーカーに結合する、標識された抗体または試薬で染色することにより、インサイチュにおける（例えば、組織切片において）腫瘍形成性細胞の視覚化を可能とするという点で、さらなる情報をもたらす。

ＣＳＣ集団と関連し、ＣＳＣを単離するまたは特徴付けるのに使用されているマーカーを下記に列挙する：ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＧ２、ＤＬＬ３、ＡＤＣＹ９、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＦＰ、ＡＸＩＮ１、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＬ９、Ｂｍｉ−１、ＢＭＰ−４、Ｃ２０ｏｒｆ５２、Ｃ４．４Ａ、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３、ＣＤ３１、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７４、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＬＳＲ１、ＣＰＤ、ＣＲＩＭ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＲ４、ＤＡＦ、デコリン、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ＥＤＧ３、ｅｅｄ、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＦＬＪ１００５２、ＦＬＶＣＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＧＤ２、ＧＪＡ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ５４、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＪＡＭ３、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＬＲＰ３、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＰ、ｍｆ２、ｍｌｌｔ３、ＭＰＺＬ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、Ｎ３３、Ｎａｎｏｇ、ＮＢ８４、ネスチン、ＮＩＤ２、ＮＭＡ、ＮＰＣ１、オンコスタチンＭ、ＯＣＴ４、ＯＰＮ３、ＰＣＤＨ７、ＰＣＤＨＡ１０、ＰＣＤＨＢ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＴＰＮ３、ＰＴＳ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ８、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｓｍａｒｃＡ５、Ｓｏｘ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＥＡＰ、ＴＣＦ４、ＴＥＭ８、ＴＧＦＢＲ３、ＴＭＥＰＡＩ、ＴＭＰＲＳＳ４、トランスフェリン受容体、ＴｒｋＡ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＹＹ１、およびβ−カテニン。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０年、ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６３２，６７８、ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４、同２００８／０１７５８７０、同２０１０／０２７５２８０、同２０１０／０１６２４１６、および同２０１１／００２０２２１を参照されたい。

同様に、ある特定の腫瘍型のＣＳＣと関連する細胞表面表現型の非限定的な例は、ＣＤ４４^ｈｉＣＤ２４^ｌｏｗ、ＡＬＤＨ^＋、ＣＤ１３３^＋、ＣＤ１２３^＋、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻、ＣＤ４６^ｈｉＣＤ３２４^＋ＣＤ６６ｃ⁻、ＣＤ１３３^＋ＣＤ３４^＋ＣＤ１０⁻ＣＤ１９⁻、ＣＤ１３８⁻ＣＤ３４⁻ＣＤ１９^＋、ＣＤ１３３^＋ＲＣ２^＋、ＣＤ４４^＋α_２β_１ ^ｈｉＣＤ１３３^＋、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４^＋ＥＳＡ^＋、ＣＤ２７１^＋、ＡＢＣＢ５^＋のほか、当技術分野で公知の、他のＣＳＣ表面表現型を含む。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０年、前掲；Ｖｉｓｖａｄｅｒら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００８／０１３８３１３を参照されたい。本発明に関して特に興味深いのは、ＣＤ４６^ｈｉＣＤ３２４^＋表現型を含むＣＳＣ調製物である。

マーカーまたはマーカー表現型に適用される場合の「陽性」、「低（ｌｏｗ）」、および「陰性」という発現レベルについては、以下の通りに定義する。本明細書では、陰性の発現（すなわち、「−」）を伴う細胞を、さらなる蛍光発光のチャネル内で他の目的のタンパク質についても標識する、完全な抗体染色カクテルの存在下で、蛍光チャネルにおける発現が、アイソタイプ対照抗体により観察される発現の第９５百分位数未満である、またはこれと等しい細胞と定義する。当業者は、陰性イベントを定義するためのこの手順を、「ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ」染色または「ＦＭＯ」染色と称することを十分に理解する。本明細書では、上記で記載したＦＭＯ染色手順を使用する発現が、アイソタイプ対照抗体により観察される発現の第９５百分位数を超える細胞を、「陽性」（すなわち、「＋」）と定義する。本明細書で定義される通り、「陽性」と広く定義される細胞の多様な集団が存在する。上記で記載した通り、観察される抗原の平均発現が、ＦＭＯ染色を使用してアイソタイプ対照抗体により決定される第９５百分位数を上回るなら、細胞を、陽性と定義する。観察される平均発現が、ＦＭＯ染色により決定される第９５百分位数を上回り、かつ、第９５百分位数から１標準偏差以内にあれば、陽性細胞は、発現が低度な細胞（すなわち、「ｌｏ」）と称することができる。あるいは、観察される平均発現が、ＦＭＯ染色により決定される第９５百分位数を上回り、かつ、第９５百分位数を、１標準偏差を超えて上回るなら、陽性細胞は、発現が高度な細胞（すなわち、「ｈｉ」）と称することができる。他の実施形態では、第９９百分位数を、陰性ＦＭＯ染色と陽性ＦＭＯ染色との間の分界点として使用し得ると好ましく、特に好ましい実施形態では、百分位数は、９９％を超える場合もある。

ＣＤ４６^ｈｉＣＤ３２４^＋マーカー表現型およびすぐ上で例示されたマーカー表現型を、標準的なフローサイトメトリー解析および細胞分取法と共に使用して、ＴＩＣ細胞もしくはＴＩＣ細胞集団および／またはＴＰＣ細胞もしくはＴＰＣ細胞集団を、さらなる解析のために、特徴付ける、単離する、精製する、または富化することができる。

したがって、本発明のＣＡＲが腫瘍形成性細胞の頻度を低減する能力は、上記で記載した技法およびマーカーを使用して決定することができる。場合によって、ＤＬＬ３ ＣＡＲは、腫瘍形成性細胞の頻度を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、なおまたは３５％低減し得る。他の実施形態では、腫瘍形成性細胞の頻度の低減は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％のオーダーであり得る。ある特定の実施形態では、開示された養子免疫療法は、腫瘍形成性細胞の頻度を、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％なおまたは９５％低減させることができる。腫瘍形成性細胞の頻度の任意の低減は、新生物の腫瘍形成性、永続性、再発、および侵襲性の対応する低減を結果としてもたらす可能性があることが十分に理解される。

ＩＩＩ．キメラ抗原受容体療法
がん免疫療法は、細胞傷害性リンパ球（細胞傷害性Ｔ−リンパ球およびＮＫ細胞の両方を含む）の活性を介して腫瘍を根絶するためにヒト免疫系の力を利用することを目的とする。この細胞傷害性リンパ球媒介性免疫反応が残存腫瘍細胞の根絶を導くことができることは、多様な種類の移植を受けた白血病患者において再発率を比較した研究から推測された：再発率の有意な低減が、シンジェニックな移植を受容している患者に対して、ＨＬＡ同一同胞種からの同種移植において非Ｔ細胞欠失骨髄を受容している患者に関して観察され、この効果は移植片対宿主疾患反応以外の他のＴ細胞媒介性作用に起因し得る。しかしながら、抗腫瘍Ｔ細胞の臨床的に有効な養子移入は、ほとんどの腫瘍抗原が自己抗原であり、したがって免疫原性が低いという事実によって妨げられている。より具体的には、自己抗原を認識する高アフィニティーＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の負の選択は、発達中の胸腺で起こり、その結果として、中枢性トレランスおよび腫瘍／自己抗原の低親和性認識を有するＴ細胞についての選択を生じる。次いでこれらのより低い親和性のＴ細胞は抗腫瘍Ｔ細胞機能の弱い活性化および制限された持続性を結果として生じる。遺伝子操作された細胞傷害性リンパ球は、強い抗腫瘍Ｔ細胞活性化に対するこのトレランス／低親和性ブロックを回避するために２つの主要な手法において展開されている。第１の手法では、アフィニティーが増強されたＴＣＲ認識腫瘍抗原が、分子遺伝学的操作技法を使用してＴ細胞へと人工的に導入される。この手法は、野生型ＴＣＲ発現に近づくレベルでアフィニティーが増強されたＴＣＲを発現する際の困難性、さらなるセットのＴＣＲ遺伝子を天然Ｔ細胞へと導入するときに生じるＴＣＲ鎖の誤対合の可能性および腫瘍細胞がＭＨＣ分子を下方制御することによってＭＨＣ拘束性ＴＣＲ認識を回避する能力を含む、いくつかの要因によって制限される。

細胞傷害性リンパ球を遺伝子操作する第２の手法は、多様なリンパ球集団内への人工の非ＭＨＣ拘束性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の導入である。これは最も典型的には、ＣＡＲ分子をコードするレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを形質導入する前にエキソビボにおいて培養され、刺激され、増殖されるバルクリンパ球集団を採取することによって達成される。天然ＴＣＲと同様に、ＣＡＲは標的抗原を特異的および選択的に認識する能力を保有しなければならず、次いでこの抗原に結合すると、適切なシグナルをリンパ球に形質導入して、持続した抗腫瘍免疫反応に必要なエフェクター機能および／またはサイトカイン産生を刺激する。ＣＡＲにより改変されたＴ細胞の概念は、ＣＤ３ζ鎖の細胞質ＩＴＡＭドメインが、ＴＣＲ：ＣＤ３タンパク質複合体から独立して発現したとき、特にＣＤ３ζ ＩＴＡＭドメインが異種細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインに融合されたときにＴ細胞を活性化できることが観察された研究から生じた。第１世代のＣＤ４−ＣＤ３ζ ＣＡＲはＴ細胞へと形質導入され、ＨＩＶ患者において試験された。追跡研究により、これらの操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞が、操作された細胞のいくらかの増殖および持続を示したことにより、最大で注入後１０年の間持続されたことが示された。続いて、抗腫瘍ＣＡＲは、単一の組換え分子において、ｓｃＦｖドメインおよび膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζ鎖の細胞質ドメインとを組み合わせることによって構築され、これらの操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原認識がｓｃＦｖの特異性を反映するように変えられたことが示され得る（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，４４６，１７９）。これらの第１世代のｓｃＦｖ指向性（ｓｃＦｖ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＣＡＲ−Ｔ細胞は、非ＭＨＣ拘束性細胞傷害性リンパ球として作用でき、プロセシングされたペプチドよりむしろ天然腫瘍抗原を認識でき、天然抗原を発現する腫瘍細胞の溶解を促進できた。

第１世代のｓｃＦｖ指向性ＣＡＲ−Ｔ細胞の多くはインビトロにおいて予想された効果を示したが、がん患者におけるインビボ研究は、抗腫瘍効果のこれらの欠如およびＣＡＲ−Ｔ持続性の欠如のために期待を裏切った。Ｔ細胞生物学がより良く理解されるようになったので、Ｔ細胞集団は短い寿命のエフェクター細胞、長い寿命の中枢記憶Ｔ細胞および末梢記憶Ｔ細胞ならびに他のＴ細胞亜集団と相互作用する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）からなっていることが明らかになった。これらの集団の機能の中心は、サイトカイン産生を介して静止未感作Ｔ細胞または記憶Ｔ細胞の持続性活性化を誘導する際の共刺激シグナルの役割ならびに共刺激が、アネルギーを防ぐ際に、共刺激シグナルの非存在下で排他的なＴＣＲ：ＣＤ３ζシグナル伝達から潜在的に生じる可能性のあるＴ細胞非反応性の状態を提供する役割である。特に、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ５４およびＣＤ５８のようなタンパク質由来の多様な共刺激シグナルは、最適なレベルのサイトカイン産生、増殖およびクローン性増殖ならびに細胞溶解活性の誘導にとって有益であり得る。これらの中で、ＣＤ２８は恐らく最も良く理解された共刺激シグナルであり、ＣＤ２８共刺激は抗原活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞によってサイトカイン放出を増加させることが示されている。同様に、ＣＤ１３７／４−１ＢＢを介する共刺激シグナル伝達は天然Ｔ細胞増殖を増強し、インビボにおけるＣＡＲ−Ｔのより長い持続性に寄与し得ることが示されている。したがって、これらの分子由来の多様なさらなるシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζドメインにタンデムにおいて付加されている、いわゆる第２世代のＣＡＲ構築物が設計されている（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．ｓ．５，６８６，２８１および８，３９９，６４５）。３つ以上のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζおよび２つの共刺激シグナル伝達ドメイン）を含むいわゆる第３世代のＣＡＲ分子もまた、開発中であると報告されている。

ＣＤ１９抗原に対するいくつかの第２世代のＣＡＲ−Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍を有する患者において強い抗腫瘍効果および十分な持続性を有することが示されている。現在までに、固形腫瘍の処置に関するＣＡＲ−Ｔ療法の有効性は、依然として確証的に実証されている。本発明に関して、驚くべきことに、抗ＤＬＬ３結合性ドメインが、以前の制限のいくらかを克服する有効な抗新生物性処置を提供するために上述のキメラ抗原受容体および養子免疫療法の各々と有利に統合され得ることが発見されている。

ＩＶ．キメラ抗原受容体
上記に示された通り、本発明のＣＡＲは一般に、ＤＬＬ３結合性ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびある特定のリンパ球を活性化し、ＤＬＬ３陽性腫瘍細胞に対して免疫反応を生じる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。より一般に、開示されたキメラ抗原受容体は、各々宿主細胞壁によって定義されたエクトドメインおよびエンドドメインを含む。これに関して、「エクトドメイン」または「細胞外ドメイン」という用語は、細胞外または膜形成性脂質二重層に対して外側のＣＡＲポリペプチドの部分を指し、この部分は、抗原認識（例えば、ＤＬＬ３）結合性ドメイン、任意選択のヒンジ領域および物理的に膜にわたるアミノ酸残基に対して外側の任意のスペーサードメインを含んでもよい。反対に、「エンドドメイン」または「細胞内ドメイン」という用語は、細胞内または膜形成脂質二重層に対して内側のＣＡＲポリペプチドの部分を指し、この部分は、物理的に膜にわたるアミノ酸残基に対して内側の任意のスペーサードメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよい。

Ａ．ＤＬＬ３結合性ドメイン
１．結合性ドメイン構造
本開示全体にわたって広く論じられている通り、抗ＤＬＬ３結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体は、多様な増殖性障害に対する標的化療法を提供するために有利に使用され得る。適合性の抗ＤＬＬ３結合性ドメインは、抗ＤＬＬ３抗体または免疫反応性断片もしくは構築物またはこれらの誘導体を含んでもよいことは十分に理解される。ある特定の実施形態では、無傷抗体またはｆｃドメインもしくは定常ドメインの少なくともいくつかの部分を含む抗体はＤＬＬ３結合性ドメインを含む（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１５／０１３９９４３を参照されたい）。他の好ましい実施形態では、および本明細書に添付の実施例において実証されている通り、抗ＤＬＬ３結合性ドメインはＤＬＬ３に結合するモノクローナル抗体（ヒト化モノクローナル抗体またはＣＤＲグラフトモノクローナル抗体を含む）に由来するｓｃＦｖを含んでもよい。本発明と一致するＤＬＬ３結合性ドメインを提供するために使用され得る適合性の抗体は直後により詳細に論じられている。本出願の目的では、「結合性ドメイン」および「抗体」という用語は、文脈上、そうでないことが言及されない限り、交換可能に使用され得る。

許容された用語法および番号付けシステムを含む抗体および変異体ならびにこれらの誘導体については、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０年）、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」６版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；またはＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１年）、「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」、８版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて広範に記載されている。

「無傷抗体」とは、共有結合的ジスルフィド結合および非共有結合的相互作用により併せて保持された、２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチドおよび２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドを含む、Ｙ字型の四量体タンパク質を典型的に含む。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）からなる。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および定常領域を含み、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体の場合、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３と称する３つのドメインを含む（ＩｇＭおよびＩｇＥは、第４のドメインであるＣＨ４を有する）。ＩｇＧクラス、ＩｇＡクラス、およびＩｇＤクラスでは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとは、プロリンおよびシステインに富む、可変長（多様なＩｇＧのサブクラスでは、約１０−約６０アミノ酸）のセグメントである、可撓性のヒンジ領域により隔てられている。軽鎖および重鎖のいずれにおける可変ドメインも、約１２またはこれを超えるアミノ酸の「Ｊ」領域により定常ドメインへと結合されており、重鎖はまた、さらなる約１０アミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体の各クラスは、対合システイン残基により形成される、鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合をさらに含む。

上記に示された通り、「抗体」という用語は、一般に解釈されるべきであり、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および霊長動物化抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト抗体、組換え作製抗体、イントラボディー、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ムテインおよびこれらの変異体を含む合成抗体、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖断片（例えば、ｓｃＦｖおよびＳｃＦｖＦｃ）のような免疫特異性抗体断片ならびにＦｃ融合および他の改変を含むこれらの誘導体ならびにこれが、ＤＬＬ３決定基との優先的会合または結合を呈示する限りにおいて、任意の他の免疫反応性免疫グロブリン分子を含む。さらに、文脈上の制約によりそうでないことが指示されない限りにおいて、用語は、抗体の全てのクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）および全てのサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）ならびにこれらの全ての免疫反応性断片もさらに含む。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、対応する小文字のギリシャ文字α、δ、ε、γ、およびμにより表記されることが典型的である。任意の脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、明らかに識別可能な２つの種類のうちの１つへと割り当てることができる。要するに、ヒトＤＬＬ３と結合または会合する任意のこのような抗体は、本明細書の教示と適合性があり、開示されたキメラ抗原受容体に対する結合性ドメイン構成要素として使用され得る。

抗体の可変ドメインは、抗体によって、アミノ酸組成の大幅な変動を示し、主に、抗原の認識および抗原への結合に関与する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷のＩｇＧ抗体が、２つの結合性部位を有する（すなわち、ＩｇＧ抗体は、二価である）ように、抗体結合性部位を形成する。Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインは、可変性が極めて大きな３つの領域であって、超可変領域、またはより一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称し、４つのそれほど可変でない領域であり、フレームワーク領域（ＦＲ）として公知の領域により枠づけられ、隔てられた領域を含む。Ｖ_Ｈ領域とＶ_Ｌ領域との間の非共有結合的会合により、無傷抗体の２つの抗原結合性部位のうちの１つを含有するＦｖ断片（「可変断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）」を表わして）が形成される。下記により広く論じられている通り、遺伝子操作により得ることができるｓｃＦｖ構築物（単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）を表わして）がペプチドリンカーを介してＶＨ領域およびＶＬ領域（好ましくは同じ抗体由来）を結合することは特に興味深い。所望のコンフォメーションに応じて、ペプチドリンカーは多様な長さであってもよいことは十分に理解される。

本明細書で使用された、アミノ酸の、各ドメイン、各フレームワーク領域および各ＣＤＲへの割当は、そうでないことが言及されない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（５版）、ＵＳ Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ刊行物９１−３２４２号；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７年、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；またはＤｕｂｅｌ編（２００７年）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ ＣｏまたはＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）により提示されている番号付けスキームのうちの１つに準拠し得る。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｃｏｎｔａｃｔとしても知られている）およびＡｂＭスキームにより定義されたＣＤＲであって、Ａｂｙｓｉｓウェブサイトのデータベース（後掲）から得られるＣＤＲを含むアミノ酸残基を下記に示す。

抗体配列内の可変領域およびＣＤＲは、当技術分野で開発された一般的規則（例えば、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムなど、上記で示したような）に従い同定することもでき、配列を、公知の可変領域のデータベースに照らしてアライメントすることにより同定することもできる。これらの領域を同定するための方法については、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１年；およびＤｉｎａｒｅｌｌｏら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００年において記載されている。抗体配列の例示的なデータベースについては、Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３巻（データベース特集号）：Ｄ６７１−Ｄ６７４頁（２００５年）において記載されている通り、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＥｎｇｌａｎｄのＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎにより維持されている）における「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト、およびｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇにおけるＶＢＡＳＥ２ウェブサイトにおいて記載されており、これらを介してアクセスすることができる。抗体配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）による配列データを、ＰＤＢによる構造データと統合する、Ａｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析することが好ましい。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎによる著書の章である「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ」、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ」（ウェブサイトｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでもまた入手可能な、Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７）を参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトは、本明細書の教示に従い使用されうるＣＤＲを同定するために開発された一般的規則をさらに含む。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で示される全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに準拠するＡｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトに従い導出される。

本発明で論じられる重鎖定常領域のアミノ酸位置について、番号付けは、配列決定された最初のヒトＩｇＧ１であることが報告されている、骨髄腫タンパク質であるＥｕのアミノ酸配列について記載する、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６３巻（１号）：７８−８５頁において最初に記載された、Ｅｕインデックスに従う。ＥｄｅｌｍａｎによるＥｕインデックスはまた、Ｋａｂａｔら、１９９１年（前掲）においても示されている。したがって、重鎖の文脈における「Ｋａｂａｔにより示されるＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔによるＥＵインデックス」または「ＥＵインデックス」という用語は、Ｋａｂａｔら、１９９１年（前掲）で示される、ＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１であるＥｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域のアミノ酸配列に使用される番号付けシステムも、Ｋａｂａｔら（前掲）において同様に示されている。本発明に適合性の、例示的なカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を、すぐ下に示す。

同様に、本発明に適合性の、例示的なＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列も、すぐ下に示す。

開示された定常領域配列またはこれらの変異体（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）もしくは誘導体は、これ自体として使用される場合もありまたは本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲ（好ましくは膜貫通ドメインの一部として）へと組み込まれる場合もある、抗体（完全長または部分的ｆｃ領域を含む免疫反応性断片）をもたらすように、標準的な分子生物学的技法を使用して、開示された重鎖可変領域および軽鎖可変領域と作動可能に会合させることができる。

より一般に、適合性のＣＡＲの抗ＤＬＬ３結合性ドメイン構成要素は、ＤＬＬ３決定基と特異的に認識するまたはこれらと会合する、任意の抗体から作り出すことができる。本明細書で使用される「決定基」または「標的」とは、特定の細胞、細胞集団、または組織と同定可能な形で関連する、あるいは特定の細胞内もしくは細胞上、特定の細胞集団内もしくは細胞集団上、または特定の組織内もしくは組織上で特異的に見出される、任意の検出可能な形質、特性、マーカー、または因子を意味する。決定基または標的は、形態的性格の場合もあり、機能的性格の場合もあり、生化学的性格の場合もあり、表現型であることが好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、決定基は、特異的細胞型またはある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特異点における細胞または特定のニッチにおける細胞）が差次的に発現する（過剰発現または過少発現する）タンパク質である。本発明の目的では、決定基は、異常ながん細胞上で差次的に発現されることが好ましく、ＤＬＬ３タンパク質またはこのスプライス変異体、アイソフォーム、ホモログもしくはファミリーメンバーまたはこの特異的ドメイン、特異的領域もしくは特異的エピトープのうちのいずれかを含み得る。「抗原」、「免疫原性決定基」、「抗原決定基」、または「免疫原」とは、免疫応答性動物へと導入されると免疫応答を刺激することが可能であり、免疫応答により産生される抗体により認識される、任意のタンパク質またはこの任意の断片、領域、もしくはドメインを意味する。本明細書で想定されるＤＬＬ３決定基の存在または非存在を使用して、細胞、細胞亜集団、または組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性細胞、またはＣＳＣ）を同定することができる。

２．抗体の生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）および産生（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）
本発明と適合性の抗体は、当技術分野で公知の多様な方法を使用して産生されてもよく、任意のこのような抗体は、本発明の抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体の結合性ドメインを提供するようにさらに改変されてもよい。

ａ．宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成
当技術分野では、多様な宿主動物によるポリクローナル抗体の産生が周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、（１９８８年）、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＨａｒｌｏｗら（１９８９年）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＮＹ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。ポリクローナル抗体を作製するために、免疫応答性動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類など）は、抗原タンパク質または細胞または抗原タンパク質を含む調製物により免疫される。ある期間の後で、ポリクローナル抗体含有血清は、動物から採血する、またはこれを屠殺することにより得る。血清は、動物から得られた形態で使用することもでき、免疫グロブリン画分または単離抗体調製物をもたらすように、抗体を、部分的または完全に精製することもできる。

抗原の任意の形態、または抗原を含有する細胞もしくは調製物を使用して、決定基に特異的な抗体を生成することができる。「抗原」という用語は、広義で使用され、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一もしくは複数のドメイン、または細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の全体を含む、選択された標的の任意の免疫原性断片または決定基を含みうる。抗原は、単離全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、それらの表面上で抗原の少なくとも一部を発現する細胞による免疫）、または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質のＥＣＤ部分だけによる免疫）であり得る。抗原は、遺伝子改変細胞内で産生することができる。上述の抗原のうちのいずれかを、単独で使用することもでき、当技術分野で公知の、１つ以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用こともできる。抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの場合もあり、非ゲノムＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）の場合もあり、免疫原性応答を誘発するのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードしうる。アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド、および陽イオン性脂質のような非ウイルス性ベクターを含むがこれらに限定されない、任意のベクターを用いて、細胞を形質転換することができ、この細胞において抗原を発現する。

ｂ．モノクローナル抗体
選択された実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体の使用を想定する。「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、少量で存在しうる可能な変異（例えば、天然に存在する変異）を除き、集団を構成する個々の抗体は、同一である。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法、組換え技法、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））またはこれらのいくらかの組合せを含む、多種多様な技法を使用して調製することができる。例えば、好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編）、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１版、２００９年；Ｓｈｉｒｅら（編）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣ、１版、２０１０年；Ｈａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２版、１９８８年；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年）においてより詳細に記載されている、ハイブリドーマ技法および生化学的技法および遺伝子操作技法などの技法を使用して産生することができる。決定基に特異的に結合する、多数のモノクローナル抗体の生成後、特に適切な抗体は、例えば、決定基に対するアフィニティーまたは内部移行の速度に基づく、多様なスクリーニングプロセスにより選択することができる。特に好ましい実施形態では、本明細書で記載された通りに産生されたモノクローナル抗体は、「供給源」抗体として使用されてもよく、開示されたＣＡＲと会合し得る有効なＤＬＬ３結合性ドメインを提供するようにさらに改変されてもよい。例えば、供給源抗体は、ｓｃＦｖまたは他の断片を提供し、標的に対するアフィニティーを改善し、細胞培養物におけるこの産生を改善し、インビボにおける免疫原性を低減し、多重特異性構築物を創出するなどのように操作されてもよい。モノクローナル抗体の産生およびスクリーニングについてのより詳細な記載は、下記および付属の実施例で提示する。

ｃ．ヒト抗体
本発明と適合性の抗体は、完全ヒト抗体を含み得る。「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより産生された抗体および／または下記に記載されたヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を指す。

一実施形態では、組換えヒト抗体は、ファージディスプレイを使用して調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。一実施形態では、ライブラリーは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ ｃＤＮＡおよびヒトＶＨ ｃＤＮＡを使用して生成した、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーまたはｓｃＦｖ酵母ディスプレイライブラリーである。

ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したマウスへと導入することによっても作製することができる。チャレンジすると、遺伝子再配列、アセンブリー、および完全ヒト抗体レパートリーを含む全ての点で、ヒトにおいて認められるものと酷似する抗体の生成が観察される。この手法は、例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；同５，５４５，８０６；同５，５６９，８２５；同５，６２５，１２６；同５，６３３，４２５；同５，６６１，０１６；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１および同６，１５０，５８４；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５年、ＰＭＩＤ：７４９４１０９において記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球（このようなＢリンパ球は、新生物性障害を患う個体から回収することもでき、インビトロにおいて免疫することもできる）の不死化を介して調製することもできる。例えば、Ｃｏｌｅら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１年、ＰＭＩＤ：２０５１０３０；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照されたい。他のモノクローナル抗体と同様に、このようなヒト抗体は供給源抗体として使用され得る。

ｄ．抗体産生および操作
抗体およびその断片は、抗体産生細胞から得られる遺伝子材料および組換え技術を使用して、産生または改変することができる（例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（編）（２０００年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（３版）、ＮＹ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２年）、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１を参照されたい）。

下記により詳細に論じられている通り、本発明の別の態様は、本発明のＤＬＬ３結合性ドメインおよびＣＡＲをコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に存在する場合もあり、細胞溶解物中に存在する場合もあり、部分的に精製された形態または実質的に純粋な形態で存在する場合もある。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法により、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞内核酸または細胞内タンパク質から分離されるとき、「単離」される、または実質的に純粋とされる。本発明の核酸は、例えば、一本鎖であれ、二本鎖であれ、ＲＮＡ、ＲＮＡであれ、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、およびこれらの人工的変異体（例えば、ペプチド核酸）であることが可能であり、イントロンを含有する場合もあり、含有しない場合もある。好ましい実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。

本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技法を使用して、得られることができ、操作されることができる。ハイブリドーマ（例えば、下記の実施例で示される通りに調製されるハイブリドーマ）により発現する抗体では、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅法またはｃＤＮＡクローニング技法により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られる（例えば、ファージディスプレイ技法を使用して）抗体では、抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収することができる。

ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ技法によりさらに操作されて、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子または好ましくはＤＬＬ３特異的ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列へと転換されることができる。これらの操作では、ＶＬをコードするＤＮＡ断片またはＶＨをコードするＤＮＡ断片を、抗体定常領域または可撓性のリンカーのような、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片へと作動的に連結する。この文脈において使用された「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片によりコードされたアミノ酸配列が、インフレームにとどまるように、２つのＤＮＡ断片が結合されていることを意味する。

ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することにより、全長重鎖遺伝子へと転換することができる。当技術分野では、ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列が公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１年）（前掲）を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤの定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である。例示的なＩｇＧ１定常領域を、配列番号６に示す。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することができる。

ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）へと転換することができる。当技術分野では、ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列が公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１年）（前掲）を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域でありうるが、最も好ましくは、カッパ定常領域である。これに関して、例示的な適合性のカッパ軽鎖定常領域を、配列番号５に示す。

本明細書では、本発明のポリペプチドに対する「配列同一性」、「配列類似性」または「配列相同性」を呈示するある特定のポリペプチド（例えば、抗体可変領域）が想定されている。「相同な」ポリペプチドは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性を呈示しうる。他の実施形態では、「相同な」ポリペプチドは、９３％、９５％、または９８％の配列同一性を呈示しうる。本明細書で使用される場合の、２つのアミノ酸配列の間のパーセント相同性とは、２つの配列の間の同一性パーセントと同義である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、配列により共有される同一な位置の数の関数であり（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００）、２つの配列の最適なアライメントのために導入することが必要な、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較と、２つの配列の間の同一性パーセントの決定とは、下記の非限定的な例で記載される数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻：１１−１７頁（１９８８年））によるアルゴリズムを使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけのいずれかを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能である）におけるＧＡＰプログラムへと組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４４−４５３頁（１９７０年））によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。

加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列はさらに、公開データベースに照らした検索を実施する「クェリー配列」として使用して、例えば、類縁の配列を同定することもできる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３−１０頁によるＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して、本発明の抗体分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップ処理を施したアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻（１７号）：３３８９−３４０２頁において記載されている、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを活用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを活用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。

同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換で異なる場合もあり、非保存的アミノ酸置換で異なる場合もある。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、化学的特性（例えば、電荷または疎水性）が類似する側鎖を有する、別のアミノ酸残基で置換するアミノ酸置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換で互いと異なる場合には、配列同一性パーセントまたは類似度は、置換の保存的性格について補正するように、上方に調整することができる。非保存的アミノ酸を伴う置換が存在する場合も、好ましい実施形態では、配列同一性を呈示するポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）の所望の機能または活性を保持する。

本明細書ではまた、本発明の核酸に対する「配列同一性」、「配列類似性」、または「配列相同性」を呈示する核酸も想定される。「相同な配列」とは、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性を呈示する核酸分子の配列を意味する。他の実施形態では、核酸の「相同な配列」は、基準核酸細胞またはＣＳＣに照らして９３％、９５％、または９８％の配列同一性を呈示しうる。

３．ＤＬＬ３結合性ドメインとしての導出抗体
上記で記載した通りに、供給源抗体が生成され、選択され、単離されたら、これらはさらに変化されて、本明細書の教示と適合性の抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ結合性ドメイン構成要素をもたらすことができる。供給源抗体は、所望の治療特性を有する導出結合性ドメイン構成要素をもたらすように、公知の分子操作技法を使用して、改変または変化されることが好ましい。

ａ．キメラ抗体およびヒト化抗体
上記で論じられた通り、本発明の選択された実施形態は、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合し、本開示の目的では、ＤＬＬ３結合性ドメインについての「供給源」抗体と考えられ得るマウスモノクローナル抗体を含む。選択された実施形態では、本発明に適合性のＤＬＬ３結合性ドメインは、供給源抗体の定常領域および／または抗原結合性アミノ酸配列の任意選択の改変により、このような供給源抗体から導出され得る。ある特定の実施形態では、供給源抗体内の選択されたアミノ酸を、欠失、変異、置換、組込み、または組合せにより変化させる場合、抗体は、供給源抗体から導出される。別の実施形態では、「導出」抗体は、供給源抗体の断片（例えば、１つ以上のＣＤＲまたは重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全体）が、派生ＤＬＬ３結合性ドメイン（例えば、キメラ結合性ドメインまたはヒト化結合性ドメイン）をもたらすように、アクセプター結合性ドメイン構築物と組み合わせられるまたはアクセプター結合性ドメイン構築物へと組み込まれる抗体である。これらの導出結合性ドメインは、下記に記載された標準的な分子生物学的技法を使用して、例えば、ｓｃＦｖをもたらす；決定基に対するアフィニティーを改善する；抗体の安定性を改善する；発現を改善する；インビボにおける免疫原性を低減する；毒性を低減する；またはシグナルの伝達を容易とするように生成され得る。このような抗体はまた、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターンまたはＰＥＧ化）により、供給源抗体から導出することもできる。

一実施形態では、本発明のキメラ結合領域は、少なくとも２つの異なる種または抗体のクラスに由来するタンパク質セグメントであって、共有結合的に結合されたタンパク質セグメントから導出される。「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分は、別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体内、ならびにこのような抗体の断片における対応する配列と同一または相同である構築物を対象とする（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、ＰＭＩＤ：６４３６８２２）。一部の好ましい実施形態では、本発明のキメラ抗体は、ヒト軽鎖定常領域およびヒト重鎖定常領域の全てまたは一部に作動可能に連結された、選択されたマウス重鎖可変領域およびマウス軽鎖可変領域の全てまたは大半を含み得る。他の特に好ましい実施形態では、ＤＬＬ３結合性ドメインは、本明細書で開示されたマウス抗体から「導出」されてもよい。

他の実施形態では、本発明のキメラ結合性ドメインは、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍなどを使用して定義される）が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属するが、結合領域の残りの部分は、別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体に由来する「ＣＤＲグラフト」である。ヒトにおける使用のために、１つ以上の選択された齧歯動物ＣＤＲ（例えば、マウスＣＤＲ）は、ヒトアクセプター結合性ドメイン（すなわち、ヒトフレームワーク領域を有する）へとグラフトされ、ヒト抗体の天然に存在するＣＤＲのうちの１つ以上を置きかえることができる。これらの構築物は一般に、被験体による結合性ドメインに対する望ましくない免疫応答を低減しながら、効果的な結合をもたらす利点を有する。特に好ましい実施形態では、ＣＤＲグラフト結合性ドメインは、マウスから得られた１つ以上または複数のＣＤＲであって、ヒトフレームワーク配列に組み込まれたＣＤＲを含む。

「ヒト化」結合性ドメインは、ＣＤＲグラフト結合性ドメインと類似している。本明細書で使用された「ヒト化」結合性ドメインとは、１つ以上の非ヒト抗体（ドナー抗体または供給源抗体）から導出された１つ以上のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含むヒト結合性ドメイン（一般にヒトフレームワーク領域を含むアクセプタードメイン）である。ある特定の実施形態では、レシピエントヒト結合性ドメインの可変領域の１つ以上のＦＲ内の残基を、非ヒト種のドナー抗体に由来する、対応する残基で置きかえたヒト化結合性ドメインへと、「復帰変異」を導入することができる。このような復帰変異を使用して、グラフトされたＣＤＲの適切な三次元構造を維持し、これにより、アフィニティーおよび結合性ドメインの安定性を改善する一助とすることができる。限定せずに述べると、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長動物を含む、多様なドナー種に由来する抗体を使用することができる。さらに、ヒト化抗体または断片は、例えば、抗体の性能をさらに精緻化するように、レシピエント抗体またはドナー抗体で見出されない、新たな残基を含みうる。このために、本発明に適合性で、下記の実施例に示された供給源マウス抗体を含むＣＤＲグラフト抗体およびヒト化抗体（および関連したＤＬＬ３結合性ドメイン）は、本明細書で示された従来技術の技法を使用して過度の実験を行わずに容易に提供され得る。

当技術分野で認知された多様な技法をさらに使用して、本発明に従うヒト化構築物を提供するのに、どのヒト配列をアクセプター抗体として使用するのかを決定することができる。適合性のヒト生殖細胞系列配列の編集、およびそれらのアクセプター配列としての適性を決定する方法については、例えば、それらの各々がその全体において本明細書に組み込まれる、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら（１９９２年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７巻：７７６−７９８頁；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９５年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１６巻：２３７−２４２頁；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７巻：７９９−８１７頁；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５年）、ＥＭＢＯ Ｊ、１４巻：４６２８−４６３８頁において開示されている。また、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリーを提供する、Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリー（ＶＢＡＳＥ２：Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、３３巻；６７１−６７４頁、２００５年）（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編集されている）も、適合性のアクセプター配列を同定するのに使用することができる。加えて、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４において記載されている、ヒトコンセンサスフレームワーク配列もまた、本教示に従い使用され得る、適合性のアクセプター配列であることが判明し得る。一般に、ヒトフレームワークアクセプター配列は、供給源抗体およびアクセプター抗体のＣＤＲカノニカル構造についての解析と並び、マウス供給源フレームワーク配列との相同性に基づき選択される。次いで、当技術分野で認知された技法を使用して、導出抗体（または、結合性ドメイン）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の導出配列を合成することができる。

例を目的として述べると、ＣＤＲグラフト抗体およびヒト化抗体ならびに関連する方法については、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０および同５，６９３，７６２において記載されている。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、ＰＭＩＤ：３７１３８３１；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１および同７，０８７，４０９を参照されたい。

ＣＤＲグラフト抗体可変領域またはヒト化抗体可変領域の、ヒトアクセプター可変領域に照らした配列同一性または配列相同性は、本明細書で論じられる通りに決定することができ、そのようなものとして測定される場合、好ましくは、少なくとも６０％または６５％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９３％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有する。同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換で異なることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、化学的特性（例えば、電荷または疎水性）が類似する側鎖（Ｒ基）を有する、別のアミノ酸残基で置換するアミノ酸置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換で互いと異なる場合には、配列同一性パーセントまたは類似度を、置換の保存的性格について補正するように、上方に調整することができる。

付属の図１Ａおよび１Ｂで提示される、注釈を施されたＣＤＲ配列およびフレームワーク配列は、所有権のあるＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、Ｋａｂａｔらに準拠して定義されることが十分に理解される。しかし、本明細書で論じられている通り、当業者であれば、Ｃｈｏｔｈｉａら、ＡＢＭまたはＭａｃＣａｌｌｕｍらおよびＫａｂａｔらにより提示された定義に従い、ＣＤＲをたやすく同定し得る。このように、上述のシステムのいずれかに従い導出された１つ以上のＣＤＲを含む抗ＤＬＬ３ヒト化抗体は、明示的に本発明の範囲内であると理解される。

ｂ．抗体断片、誘導体または構築物
特に好ましい実施形態では、ＤＬＬ３結合性ドメインは、抗体断片、誘導体または構築物を含む。より具体的には、本発明を実施するのにどのような形態の抗体（例えば、キメラ、ヒト化など）が選択されるのかに関わらず、この抗体の免疫反応性断片が、ＤＬＬ３ ＣＡＲの一部として、本明細書の教示に従い使用され得ることが十分に理解される。広義の意味において、「抗体断片」は、無傷抗体の少なくとも免疫反応性部分を含む。すなわち、本明細書で使用された「抗体断片」という用語は、無傷抗体の少なくとも抗原結合性断片または無傷抗体の少なくとも一部を含み、「抗原結合性断片」という用語は、ＤＬＬ３の免疫原性決定基と免疫特異的に結合するもしくはこれと反応するまたは断片が由来する無傷抗体と、特異的抗原結合について競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を指す。さらに、本発明の目的では、「抗体構築物」または「抗体誘導体」は、抗体断片を含む任意の分子構造を意味すると理解されるものとする。好ましくは、このような誘導体または構築物は非天然であるものとし、抗体の免疫反応性（または免疫特異性）の性質を維持しながら有益な分子特性を与えるように製造される。

例示的な適合性の抗体断片、構築物または誘導体は、可変軽鎖断片（ＶＬ）、可変重鎖断片（ＶＨ）、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディー、直鎖状抗体、単鎖抗体分子および抗体断片から形成されたまたは抗体断片に由来する多重特異性抗体を含む。他の実施形態では、本発明のＤＬＬ３結合性ドメインは、無傷抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ構築物、ミニボディー、ダイアボディー、ｓｃＦｖ構築物、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ２構築物、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ構築物またはペプチボディーを含んでもよい。ある特定の態様では、ＤＬＬ３結合性ドメインは、（例えば、当技術分野で認知された遺伝子操作技法を使用することによって）ＣＡＲの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに共有結合される。他の実施形態では、ＤＬＬ３結合性ドメインは、（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１５／０１３９９４３に示された結合性ドメインのＦｃ部分を介して）ＣＡＲの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに非共有結合されてもよい。結合性ドメイン付加の各形態は、感作リンパ球が所望の免疫反応を誘導できる限り本発明に適合性がある。

特に好ましい実施形態では、および添付の実施例に示されている通り、ＤＬＬ３結合性ドメインはｓｃＦｖ構築物を含む。本明細書で使用された「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、抗原に結合する能力を保持している抗体に由来する単鎖ポリペプチドを意味する。ｓｃＦｖの例は、組換えＤＮＡ技法によって形成され、免疫グロブリン重鎖断片および免疫グロブリン軽鎖断片のＦｖ領域がスペーサー配列を介して連結されている抗体ポリペプチドを含む。ｓｃＦｖを調製するための多様な方法は公知であり、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６９４，７７８に記載された方法を含む。

他の実施形態では、ＤＬＬ３結合性ドメインとは、Ｆｃ領域を含み、無傷抗体内に存在する場合のＦｃ領域と通常関連する生物学的機能であって、ＦｃＲｎへの結合、抗体半減期のモジュレーション、ＡＤＣＣ機能および補体への結合のような機能のうちの少なくとも１つを保持するドメインである。一実施形態では、抗体断片とは、無傷抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような結合性ドメインは、インビボにおける安定性を断片へと付与することが可能な、少なくとも１つの遊離システインを含むＦｃ配列へと連結された、免疫反応性領域を含み得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、開示されたＣＡＲおよび感作リンパ球の薬物動態または薬力学を改変するために当技術分野で認識された技法を使用して改変され得る。

ＤＬＬ３結合性ドメインがＦｃ部分を含む場合、これは、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと作動可能に会合している細胞外Ｆｃ受容体または細胞外Ｆｃ結合性分子（「Ｆｃバインダー」）を介してＣＡＲの残存部分と非共有連結または非共有結合され得る。本明細書で使用された「Ｆｃバインダー」という用語は、抗体のＦｃ部分（例えば、Ｆｃ受容体）に結合するまたはこれと会合する任意の分子またはこの部分を意味すると理解される。このような構築物（すなわち、Ｆｃバインダー、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む「プロト−ＣＡＲ（ｐｒｏｔｏ−ＣＡＲ）」）は、標準的な分子生物学技法を使用して製造されることができ、本明細書で記載された選択されたリンパ球（自己または同種）と（例えば、形質導入により）会合して、「初回抗原刺激を受けたリンパ球」を生成することができる。患者への導入前のある時点において、初回抗原刺激を受けたリンパ球は次いで、ＤＬＬ３結合性ドメインのプロト−ＣＡＲとの会合を可能にする条件下で少なくともＦｃ部分を含む選択されたＤＬＬ３結合性ドメインに曝露され得る。結合性ドメインのプロト−ＣＡＲとの非共有会合は本発明のＤＬＬ３感作リンパ球を提供し、本明細書で記載された腫瘍形成性細胞増殖を阻害するために使用され得る（概してその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１５／０１３９９４３を参照されたい）。

プロト−ＣＡＲを含むこれらの実施形態では、Ｆｃバインダーは、Ｆｃ−ガンマ受容体、Ｆｃ−アルファ受容体またはＦｃ−イプシロン受容体のようなＦｃ受容体を含んでもよい。ある特定の選択された実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂ）、ＣＤ３２（例えば、ＣＤ３２ＡまたはＣＤ３２Ｂ）またはＣＤ６４（例えば、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４ＢまたはＣＤ６４Ｃ）のリガンド結合性ドメインを含んでもよい。ある特定の他の実施形態では、ＦｃバインダーはＦｃ受容体ではない。例えば、Ｆｃバインダーは、プロト−ＣＡＲがＤＬＬ３結合性ドメインと会合する能力を有する限り、プロテインＡまたはプロテインＧの全てまたは一部を含んでもよい。他の実施形態では、Ｆｃバインダーは、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する免疫反応性抗体またはこの断片もしくは構築物もしくは誘導体を含んでもよい。このような実施形態に関して、Ｆｃバインダーは、例えば、ｓｃＦｖ、ナノボディーまたはミニボディーを含んでもよい。同様にこのような実施形態に適合性のＤＬＬ３結合性ドメインは、Ｆｃバインダーによって結合されることができ、ＤＬＬ３と免疫特異的に反応することができる任意の分子を含む。一部の実施形態では、ＤＬＬ３結合性ドメインは、無傷ＤＬＬ３モノクローナル抗体または無傷ＤＬＬ３モノクローナル抗体の混合物を含む。他の実施形態では、ＤＬＬ３結合性ドメインは無傷ポリクローナルＤＬＬ３抗体（好ましくは完全にヒト）を含んでもよい。さらに他の実施形態では、ＤＬＬ３結合性ドメインはｓｃＦｖ−Ｆｃ構築物を含んでもよい。より一般に、当業者は、本開示の教示に基づいてプロト−ＣＡＲと適合性のＤＬＬ３結合性領域を容易に同定できる。

さらに、当業者により容易に認識されている通り、開示された断片、構築物または誘導体は、分子的操作により得られ得るまたは無傷抗体もしくは無傷抗体鎖または完全抗体もしくは完全抗体鎖の化学的処理または酵素的処理（パパインまたはペプシンのような）を介して得られ得るまたは組換え手段により得られ得る。抗体断片のより詳細な記載については、例えば、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９９年）を参照されたい。

ｃ．産生後の選択
どのようにして得られるにせよ、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は、例えば、ＤＬＬ３に対する高アフィニティーを含む所望の特徴について、選択し、クローニングし、さらに、スクリーニングすることができる。ハイブリドーマは、細胞培養で、インビトロで増やすこともでき、同系免疫不全状態の動物において、インビボで増やすこともできる。当業者には、ハイブリドーマおよび／またはコロニーを選択し、クローニングし、増やす方法が周知である。所望の抗体を同定したら、当技術分野で認知された、一般的な分子生物学的技法および生化学的技法を使用して、関与性の遺伝子材料を、単離し、操作し、発現させることができる。

ナイーブライブラリー（天然または合成のいずれか）により産生した抗体のアフィニティーは、中程度（約１０^６−１０^７Ｍ^−１のＫ_ａ）でありうる。アフィニティーを増強するには、抗体ライブラリーを構築し（例えば、エラープローンポリメラーゼを使用することにより、ランダム変異を、インビトロにおいて、導入することにより）、抗原に対して高アフィニティーの抗体を、これらの二次ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイを使用することにより）再選択することにより、アフィニティー成熟をインビトロで模倣することができる。ＷＯ９６０７７５４では、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ内で変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを作製するための方法について記載されている。

ヒトコンビナトリアル抗体またはｓｃＦｖ断片のライブラリーをファージ上または酵母上で合成し、ライブラリーを、目的の抗原またはその抗体結合性部分についてスクリーニングし、抗原に結合するファージまたは酵母を単離し、そこから抗体または免疫反応性断片を得る、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイを含むがこれらに限定されない、多様な技法を使用して、抗体を選択することができる（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６年、ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８年、ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒら、１９９７年、ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Ｐｅｐｐｅｒら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージディスプレイライブラリーまたは酵母ディスプレイライブラリーを作り出すためのキットは、市販されている。また、抗体ディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングするのに使用されうる他の方法および試薬も存在する（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；およびＢａｒｂａｓら、１９９１年、ＰＭＩＤ：１８９６４４５を参照されたい）。このような技法は、多数の候補抗体のスクリーニングを可能とし、配列の比較的容易な操作（例えば、組換えシャッフリングによる）をもたらすと有利である。

４．ＤＬＬ３結合性ドメインの特徴
選択された実施形態では、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマまたは酵母コロニー）を、例えば、頑健な成長、高い抗体産生、および、下記でより詳細に論じられる、所望の結合性ドメインの特徴を含む、好適な特性について選択し、クローニングし、さらにスクリーニングすることができる。他の場合、抗体の特徴は、特定の抗原（例えば、特異的ＤＬＬ３ドメイン）または標的抗原の免疫反応性断片を、動物への接種のために選択することにより、付与することができる。さらに他の実施形態では、選択された抗体は、上記に記載した通り、アフィニティーまたは薬物動態フラグメントなど、免疫化学的特徴を増強または精緻化するように操作することができる。

ａ．結合性ドメインアフィニティー
本明細書では、特異的決定基、例えば、ＤＬＬ３に対する結合アフィニティーが高い抗体が開示される。「免疫特異的に結合する」、「特異的な結合」、「選択的な結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」という用語は、所定の抗原上のエピトープに結合する抗体を指す。典型的には、抗体は、およそ１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍもしくは１０^−１０Ｍ未満またはさらにより低いような、およそ１０^−７Ｍ未満のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）で結合する。「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離定数を指すまたは特定の抗体−抗原間相互作用の見かけのアフィニティーを指す。

より具体的に述べると、本発明の抗体は、解離定数であるＫ_Ｄ（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）が、≦１０^−７Ｍである場合に、その標的抗原に免疫特異的に結合しうる。抗体は、Ｋ_Ｄが≦５×１０^−９Ｍである場合に、抗原に高アフィニティーで特異的に結合し、Ｋ_Ｄが≦５×１０^−１０Ｍである場合に、抗原に著しい高アフィニティーで特異的に結合する。本発明の一実施形態では、抗体のＫ_Ｄは、≦１０^−９Ｍであり、オフ速度は、約１×１０^−４／秒である。本発明の一実施形態では、オフ速度は、＜１×１０^−５／秒である。本発明の他の実施形態では、抗体は、決定基に、約１０^−７Ｍ−１０^−１０Ｍの間のＫ_Ｄで結合し、さらに別の実施形態では、≦２×１０^−１０ＭのＫ_Ｄで結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、Ｋ_Ｄ（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）が、１０^−６Ｍ未満、５×１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、５×１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、５×１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、５×１０^−９Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、５×１０^−１０Ｍ未満、１０^−１１Ｍ未満、５×１０^−１１Ｍ未満、１０^−１２Ｍ未満、５×１０^−１２Ｍ未満、１０^−１３Ｍ未満、５×１０^−１３Ｍ未満、１０^−１４Ｍ未満、５×１０^−１４Ｍ未満、１０^−１５Ｍ未満、または５×１０^−１５Ｍ未満である抗体を含む。

ある特定の実施形態では、決定基、例えば、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する、本発明の抗体の会合速度定数またはｋ_ｏｎ（またはｋ_ａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）^ｋ _ｏｎ←抗体−Ａｇ）は、少なくとも１０^５Ｍ^−ｌ秒^−ｌ、少なくとも２×１０^５Ｍ^−ｌ秒^−ｌ、少なくとも５×１０^５Ｍ^−ｌ秒^−ｌ、少なくとも１０^６Ｍ^−ｌ秒^−ｌ、少なくとも５×１０^６Ｍ^−ｌ秒^−ｌ、少なくとも１０^７Ｍ^−ｌ秒^−ｌ、少なくとも５×１０^７Ｍ^−ｌ秒^−ｌ、または少なくとも１０^８Ｍ^−ｌ秒^−ｌであり得る。

別の実施形態では、決定基、例えば、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体の解離速度定数またはｋ_ｏｆｆ（またはｋ_ｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）^ｋ _ｏｆｆ←抗体−Ａｇ）は、１０^−ｌ秒^−ｌ未満、５×１０^−ｌ秒^−ｌ未満、１０^−２秒^−ｌ未満、５×１０^−２秒^−ｌ未満、１０^−３秒^−ｌ未満、５×１０^−３秒^−ｌ未満、１０^−４秒^−ｌ未満、５×１０^４秒^−ｌ未満、１０^−５秒^−ｌ未満、５×１０^−５秒^−ｌ未満、１０^−６秒^−ｌ未満、５×１０^−６秒^−ｌ未満、１０^−７秒^−ｌ未満、５×１０^−７秒^−ｌ未満、１０^−８秒^−ｌ未満、５×１０^−８秒^−ｌ未満、１０^−９秒^−ｌ未満、５×１０^−９秒^−ｌ未満、または１０^−１０秒^−ｌ未満であり得る。

結合アフィニティーは、当技術分野で公知の多様な技法、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二重分極干渉法、静的光散乱、動的光散乱、等温滴定熱量測定、ＥＬＩＳＡ、分析超遠心分離、およびフローサイトメトリーを使用して決定することができる。

ｂ．ビニングおよびエピトープマッピング
本明細書で使用される「ビニング」という用語は、それらの抗原結合特徴と、それらが互いと競合するのかどうかとに基づき、抗体（または、結合性ドメイン）を「ビン」へと群分けするのに使用される方法を指す。ビンについての初期決定は、エピトープマッピングおよび本明細書で記載される他の技法により、さらに精緻化および確認することができる。しかし、抗体の、個々のビンへの経験的な割当てにより、開示される抗体の治療的な潜在力を示しうる情報がもたらされることが十分に理解される。

より具体的に述べると、当技術分野で公知であり、本明細書の実施例で示される方法を使用することにより、選択された基準抗体（またはその断片）が、第２の被験抗体（すなわち、同じビン内にある）と結合について競合するのかどうかを決定することができる。一実施形態では、基準抗体を、ＤＬＬ３抗原と、飽和条件下で会合させ、次いで、二次抗体または被験抗体がＤＬＬ３に結合する能力を、標準的な免疫化学的技法を使用して決定する。被験抗体が、ＤＬＬ３に、基準抗ＤＬＬ３抗体と同時に、実質的に結合することが可能であれば、二次抗体または被験抗体は、一次抗体または基準抗体とは異なるエピトープに結合する。しかし、被験抗体が、ＤＬＬ３に、同時に、実質的に結合することが可能でないなら、被験抗体は、同じエピトープ、重複エピトープ、または一次抗体が結合するエピトープと近接する（少なくとも立体的に）エピトープに結合する。すなわち、被験抗体は、抗原結合について競合し、基準抗体と同じビン内にある。

開示される抗体の文脈で使用される場合の「競合する」または「競合抗体」という用語は、抗体間の競合であって、試験される被験抗体または免疫機能的断片が、基準抗体の共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイにより決定される競合を意味する。このようなアッセイは、固体表面または細胞へと結合する精製抗原（例えば、ＤＬＬ３またはそのドメインもしくは断片）、標識されていない被験抗体、および標識された基準抗体の使用を伴うことが典型的である。競合的阻害は、被験抗体の存在下において、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通例では、被験抗体を過剰に存在させ、かつ／または最初に結合させる。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例で提示される。通例では、競合抗体が過剰に存在する場合、競合抗体は、基準抗体の共通抗原への特異的結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害する。場合によって、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９７％、またはこれを超えて阻害される。

逆に、基準抗体を結合させる場合、基準抗体は、続いて添加される被験抗体（すなわち、ＤＬＬ３抗体）の結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害することが好ましい。場合によって、被験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９７％、またはこれを超えて阻害される。

一般に、ビニングまたは競合的結合は、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、プレシピチン反応（ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイのようなイムノアッセイのような、当技術分野で認知された多様な技法を使用して決定することができる。当技術分野では、このようなイムノアッセイは、ルーチンであり、周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９４年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。加えて、交差遮断アッセイも使用することができる（例えば、ＷＯ２００３／４８７３１；ならびにＨａｒｌｏｗら（１９８８年）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅを参照されたい）。

競合的阻害（および、それゆえに、「ビン」）を決定するのに使用される他の技術は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴；例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用するバイオレイヤー干渉法；または例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはマルチプレックス型ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用するフローサイトメトリービーズアレイを含む。

Ｌｕｍｉｎｅｘとは、大スケールのマルチプレックス化された抗体の対合を可能とする、ビーズベースのイムノアッセイプラットフォームである。アッセイでは、抗体対の、標的抗原への同時的な結合パターンを比較する。対の一方の抗体（捕捉ｍＡｂ）は、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズに結合するが、この場合、各捕捉ｍＡｂは、異なる色のビーズに結合する。他方の抗体（検出ｍＡｂ）は、蛍光シグナル（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ））に結合する。アッセイでは、抗体の、抗原への同時的な結合（対合）について解析し、対合プロファイルが類似する抗体をまとめて群分けする。検出ｍＡｂのプロファイルと、捕捉ｍＡｂのプロファイルとが類似すれば、２つの抗体は、同じエピトープまたは近縁のエピトープに結合することが指し示される。一実施形態では、試験される抗体のパネルにおける任意の特定の抗体と最も緊密に相関する抗体を同定するように、ピアソン相関係数を使用して、対合プロファイルを決定することができる。好ましい実施形態では、抗体対についてのピアソンの相関係数が、少なくとも０．９であれば、被験／検出ｍＡｂは、基準／捕捉ｍＡｂと同じビン内にあることが決定される。他の実施形態では、ピアソンの相関係数は、少なくとも０．８、０．８５、０．８７、または０．８９である。さらなる実施形態では、ピアソンの相関係数は、少なくとも０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、または１である。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイから得られたデータを解析する他の方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，５６８，９９２において記載されている。１００の（またはこれを超える）異なる種類のビーズを同時に解析するＬｕｍｉｎｅｘの能力により、ほぼ無制限の抗原表面および／または抗体表面がもたらされる結果として、抗体エピトーププロファイリングのスループットおよび分解能の、バイオセンサーアッセイを凌駕する改善がもたらされる（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１年、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。

「表面プラズモン共鳴」とは、バイオセンサーマトリックス中のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの特異的相互作用の解析を可能とする光学現象を指す。

他の実施形態では、被験抗体が、基準抗体と結合について「競合する」のかどうかを決定するのに使用しうる技法は、２つの表面：バイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層と、内部基準層とから反射された白色光の干渉パターンを解析する光学的解析法である、「バイオレイヤー干渉法」である。バイオセンサーチップへと結合した分子の数の任意の変化により、リアルタイムで測定されうる、干渉パターンのシフトが引き起こされる。このようなバイオレイヤー干渉アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤマシンを使用して、以下の通りに実行することができる。基準抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップへと捕捉し、次いで、高濃度の非結合抗体を使用して、チップをブロッキングし、ベースラインを収集する。次いで、単量体の組換え標的タンパク質を、特異的抗体（Ａｂ１）で捕捉し、チップを、対照としての同じ抗体（Ａｂ１）を伴うウェル内、または異なる被験抗体（Ａｂ２）を伴うウェル内に浸漬する。対照のＡｂ１との結合レベルを比較することにより決定される、さらなる結合が生じなければ、Ａｂ１とＡｂ２とは、「競合」抗体であると決定する。Ａｂ２とのさらなる結合が観察されたら、Ａｂ１とＡｂ２とは、互いと競合しないと決定する。このプロセスは、９６ウェルプレートにおける固有のビンを表す抗体の全ての行（ｆｕｌｌ ｒｏｗ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を使用して、固有の抗体の大規模なライブラリーをスクリーニングするように拡張することもできる。好ましい実施形態では、基準抗体が、被験抗体の、共通の抗原への特異的結合を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害すれば、被験抗体は、基準抗体と競合する。他の実施形態では、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％、またはこれを超えて阻害される。

競合抗体群を包含するビンを定義したら、さらなる特徴付けを実行して、ビンにおける抗体が結合する抗原上の特異的なドメインまたはエピトープを決定することができる。ドメインレベルのエピトープマッピングは、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４年、ＰＭＩＤ：１５０９９７６３により記載されているプロトコールの変法を使用して実施することができる。ファインエピトープマッピングとは、抗体が結合する決定基のエピトープを含む抗原上の特異的なアミノ酸を決定するプロセスである。「エピトープ」という用語は、その一般的な生化学的意味で使用され、特定の抗体により認識され、これが特異的に結合することが可能な標的抗原の部分を指す。ある特定の実施形態では、エピトープまたは免疫原性決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基のような、化学的に活性の表面分子団を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴、および／または特異的な電荷特徴を有しうる。ある特定の実施形態では、抗体は、それがタンパク質および／または高分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するという。

抗原が、ＤＬＬ３のようなポリペプチドである場合、エピトープは一般に、連続アミノ酸およびタンパク質の三次フォールディングにより並置される非連続アミノ酸（「コンフォメーションエピトープ」）の両方から形成され得る。このようなコンフォメーションエピトープでは、相互作用点は、直鎖としては互いから隔てられたタンパク質上のアミノ酸残基にわたり生じる。連続アミノ酸から形成されるエピトープ（場合によって、「直鎖状」エピトープまたは「連続」エピトープと称する）は、タンパク質が変性しても保持されることが典型的であるのに対し、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、タンパク質が変性すると失われることが典型的である。抗体エピトープは、固有の空間的コンフォメーションにおいて、少なくとも３つ、より通例では、少なくとも５つまたは８−１０個のアミノ酸を含むことが典型的である。当技術分野では、エピトープ決定法または「エピトープマッピング」法が周知であり、本開示と共に、開示される抗体が結合するＤＬＬ３上のエピトープを同定するのに使用することができる。

適合性のエピトープマッピング技法は、アラニン走査変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２４８巻：４４３−６３頁）、またはペプチド切断解析を含む。加えて、エピトープの切出し、エピトープの抽出、および抗原の化学修飾のような方法（Ｔｏｍｅｒ（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、９巻：４８７−４９６頁）も用いることができる。他の適合性の方法は酵母ディスプレイ法を含む。他の実施形態では、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としてもまた公知の、改変支援プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＭＡＰ）により、各抗体の、化学的または酵素的に改変された抗原表面に対する結合プロファイルの類似性に従い、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体を類別する方法（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）がもたらされる。この技術は、特徴付けにより、遺伝子的に識別可能な抗体に焦点を当てうるように、遺伝子的に同一な抗体の迅速なフィルタリングを可能とする。ＭＡＰを使用して、本発明のＤＬＬ３抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群へと分取しうることが十分に理解される。

抗原上の所望されるエピトープを決定したら、例えば、本発明に記載される技法を使用して、エピトープを含むペプチドで免疫することにより、そのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。あるいは、発見プロセスにおいて、抗体を生成および特徴付けすることにより、特異的ドメイン内または特異的モチーフ内に配置された所望のエピトープについての情報を解明することもできる。次いで、この情報から、抗体を、同じエピトープへの結合について、競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成する手法は、抗原への結合について競合する抗体を見い出す競合研究を実施することである。それらの交差競合に基づき、抗体をビニングするためのハイスループットプロセスについては、ＷＯ０３／４８７３１において記載されている。当技術分野では、ビニング法またはドメインレベルの方法またはエピトープマッピング法であって、酵母上における抗体の競合または抗原断片の発現を含む他の方法が周知である。

Ｂ．任意選択のヒンジ領域
本明細書で使用された「ヒンジ領域」という用語は、隣接ポリペプチド領域に構造的可撓性を与える、ＣＡＲエクトドメイン（または細胞外ドメイン）内に含まれ得る可撓性のポリペプチド連結領域（本明細書で「ヒンジ」とも称されている）を指す。ヒンジ領域は天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドからなり得る。ヒンジ領域は、ＤＬＬ３結合ドメインにより認識された抗原の部分と関連したＤＬＬ３結合ドメインの最適な配置を促進することによってＣＡＲの機能を改善し得ることは当業者により十分に理解される。一部の実施形態では、ヒンジ領域は最適なＣＡＲ活性に必要でなくてもよいことは十分に理解される。他の実施形態では、アミノ酸の短い配列を含む有益なヒンジ領域は、抗原結合性ドメインまたは抗体の可撓性を容易にすることによってＣＡＲ活性を促進する。ヒンジ領域をコードする配列は抗原認識部分（例えば、抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に配置され得る。ヒンジ配列は任意の適切な分子に由来するまたは任意の適切な分子から得られた任意の部分または配列であってもよい。一実施形態では、例えば、ヒンジ配列はヒトＣＤ８α分子に由来するまたはＣＤ２８分子に由来する。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧｌ）に由来する「ヒンジ領域」は一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの伸長と定義されている。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、最初のシステイン残基および最後のシステイン残基を配置することによってＩｇＧ１配列とアライメントされ、同じ位置において重鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成することができる。他の実施形態では、ヒンジ領域は、天然の存在であってもよいまたはＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，６７７，４２５に記載された変化されたヒンジ領域を含むが、これに限定されない、非天然の存在であってもよい。もちろん、（Ｆａｂ’）_２のようなある特定の結合性ドメインまたは無傷抗体がＣＡＲにおいて使用される場合、対応するヒンジ領域が含まれることになるのは当然である。

他の選択された実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのヒンジ領域とは異なるクラスまたはサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含んでもよい。「ヒンジ領域」という用語はまた、ヒトＣＤ８α（ａｋａ ＣＤ８ａ）分子またはヒトＣＤ２８分子に由来する領域を含んでもよく、可撓性を隣接領域にもたらす際に同様の機能をもたらす任意の他の受容体に由来する領域を含んでもよい。ヒンジ領域は、約４アミノ酸から約５０アミノ酸、例えば約４ａａから約１０ａａ、約１０ａａから約１５ａａ、約１５ａａから約２０ａａ、約２０ａａから約２５ａａ、約２５ａａから約３０ａａ、約３０ａａから約４０ａａまたは約４０ａａから約５５ａの長さを有してもよい。適切なヒンジ領域は、容易に選択されることができ、４アミノ酸から１０アミノ酸、５アミノ酸から９アミノ酸、６アミノ酸から８アミノ酸または７アミノ酸から８アミノ酸を含む、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）から２０アミノ酸、２アミノ酸から１５アミノ酸、３アミノ酸から１２アミノ酸のような多くの適切な長さのうちのいずれであってもよく、１、２、３、４、５、６または７アミノ酸であってもよい。

当業者は、適合性のヒンジ領域が周知であり、これ自体で、作動可能な実施形態が容易に選択され、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲに組み込まれ得ることは十分に理解する。

Ｃ．膜貫通ドメイン／スペーサードメイン
上記に示された通り、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲは好ましくは、細胞外ＤＬＬ３結合性ドメインおよび／またはヒンジ領域と、細胞内シグナル伝達ドメインもしくは細胞質シグナル伝達ドメインとの間に挿入された膜貫通ドメインを含む。本議論の目的では、「膜貫通ドメイン」という用語は、これが、細胞膜の脂質二重層に物理的に埋め込まれたアミノ酸残基を常に含むが、これは、支持体を含んでもよいまたは細胞膜のいずれかの側を超えて伸長できる「スペーサードメイン」を含んでもよいという理解で使用されている。当業者は、ＣＡＲ構成要素の機能的態様を容易に区別でき、本開示を考慮して何が適合性の膜貫通ドメインを構成しているかを容易に決定できる。

膜貫通ドメインは、天然ポリペプチドに由来してもよいまたは人工的に設計されてもよいことは十分に理解される。適合性の膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質に由来してもよいまたは任意の膜貫通タンパク質に由来してもよく、これらは必要に応じて改変されてもよいまたは切断されてもよい。例えば、Ｔ細胞受容体α鎖またはＴ細胞受容体β鎖、ＩｇＧ（ＩｇＧ４のような）のＦｃ領域、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８ａ ａｋａ ＣＤ８α）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４またはＧＩＴＲに由来する膜貫通ドメインは、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲ構築物の多様な実施形態に全て適合性である。ある特定の実施形態では、受容体複合体の他の膜との物理的会合を保持するために、ＣＤ８ζ、ＦｃＲη、ＦｃεＲ１−γおよびＦｃεＲ１−β、ＭＢ１（Ｉｇα）、Ｂ２９またはＣＤ３−γ、ＣＤ３−ζもしくはＣＤ３−εの膜貫通ドメインを利用することが好ましい。適合性の人工膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンのような高レベルの疎水性残基を組み込んでいる多様なポリペプチド配列を含んでもよい。他の好ましい実施形態では、膜貫通ドメインは、合成膜貫通ドメインの各末端に位置しているフェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットを含んでもよい。

本発明のある特定の実施形態はスペーサーを有する膜貫通ドメインを含む。本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲでは、「スペーサードメイン」または「スペーサー領域」は、細胞外機能的ドメイン（例えば、抗原結合性ドメインまたは含まれる場合ヒンジ領域）と膜貫通ドメインとの間に配置され得るアミノ酸配列または細胞内シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインとの間に配置され得るアミノ酸配列である。スペーサードメインは、これらのエレメントを有効なＣＡＲ機能のためのＣＡＲポリペプチド内に最適に配置する目的で、膜貫通ドメインを細胞外ドメインと連結するおよび／または膜貫通ドメインを細胞内ドメインと連結するのに役立つ任意のオリゴペプチドまたは任意のポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０から１００アミノ酸、より好ましくは２５から５０アミノ酸を含む。スペーサードメインは好ましくは、ＤＬＬ３ ＣＡＲのＤＬＬ３との結合を促進する配列を有し、細胞内への膜貫通シグナル伝達を増強する配列を有する。結合を促進することが予想されるアミノ酸の例は、潜在的なグリコシル化部位におけるシステイン、荷電アミノ酸およびセリンおよびトレオニンを含み、これらのアミノ酸は、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用され得る。好ましい実施形態では、スペーサーは、任意選択的に二量化してもよい抗体定常領域（例えば、ＩｇＧ１ ＣＨまたはＩｇＧ１ ＣＬ）の全てまたは一部を含んでもよい。

他の適合性のスペーサーは、グリシンポリマー（Ｇ）_ｎ、グリシン−セリンポリマー、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマーおよび当技術分野において公知の他の可撓性スペーサーを含む。グリシンポリマーおよびグリシン−セリンポリマーが使用されてもよく、ＧｌｙおよびＳｅｒの両方は比較的構造化されておらず、したがって構成要素間の中間のテザー（ｔｅｔｈｅｒ）として役立ち得る。グリシンポリマーが使用されてもよく、グリシンは、アラニンより顕著に多くのファイ−プサイ空間に接近し、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限されない。

当業者は、適合性の膜貫通ドメインが当技術分野において周知であり、これ自体で、作動可能な実施形態が容易に選択され、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲに組み込まれ得ることを十分に理解する。

Ｄ．細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞外ＤＬＬ３結合性ドメインおよび膜貫通ドメインに加えて、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲは、少なくとも１つのシグナル伝達部分および／またはＴ細胞活性化部分を含む細胞内ドメインまたは細胞質ドメインを組み込む。本発明に使用された細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインがＤＬＬ３に結合する（と相互作用する）同じ分子内に存在する（または同じ分子と非共有会合している）場合、１つ以上のシグナルを細胞へと伝達できる分子である。ＤＬＬ３の結合は、ＣＡＲに沿って通り、細胞内へと伝達されるシグナルを誘発して感作リンパ球を活性化する。このリンパ球活性化は標的細胞の消失をもたらす所望の免疫反応を誘発する。

Ｔ−リンパ球活性化の２つのシグナル理論は、２つのシグナルがＴ細胞を効果的に活性化させるのに必要とされることを提案している：第１に、ＭＨＣ分子の文脈において提示された抗原ペプチドは、ＴＣＲのアルファ鎖：ベータ鎖ヘテロ二量体と相互作用し、コンフォメーションの変化をもたらし、その結果として、ＴＣＲ複合体のタンパク質成分中に見出された細胞質ドメインからのシグナルの活性化を生じる；第２に、単一の共刺激分子または複数の共刺激分子はペプチド：ＭＨＣ複合体を提示している細胞上でこれらの同種リガンドと相互作用するので、単一の共刺激分子または複数の共刺激分子の細胞質ドメインからシグナルを伝達する。より具体的には、ＴＣＲ複合体を介してのみ生成されたシグナルはＴ細胞を活性化するのに不十分である場合があり、二次シグナルまたは共刺激シグナルも、アネルギーとして知られているＴ細胞不活性の状態を回避するのに必要とされることが知られている。天然Ｔ細胞活性化は２つの異なる種類の細胞質シグナル伝達配列、すなわち、ＴＣＲ複合体を介する始原抗原依存性一次活性化のための配列（一次細胞質シグナル伝達配列）および二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすように抗原非依存的に作用するための配列（二次細胞質シグナル伝達配列）によって伝達される。好ましい態様では、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲは、ＣＡＲエンドドメインとして一次細胞質シグナル伝達配列および／または二次細胞質シグナル伝達配列を含む。

一般に、免疫系受容体の細胞質ドメインに見出されたシグナル伝達モチーフは、活性化または阻害され得る。活性化を刺激する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られているシグナル変換モチーフを含み得る［Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．３３８、３８３−３８４頁（１９８９年）］。他方で、阻害的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）として知られているシグナル伝達モチーフを含む。本発明では、ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭを有する細胞内ドメインが使用され得る。

天然のＴＣＲ複合物からのＴ細胞活性化についての第１の刺激シグナルを伝達する一次細胞質シグナル伝達配列はＣＤ３ζ鎖において見出されているＩＴＡＭであるが、他のＩＴＡＭもまた、陽性一次活性化シグナルを伝達するために利用され得ることは知られている。本発明において使用され得るＩＴＡＭを有する細胞内ドメインの例は、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭを有する細胞内ドメインを含む。具体的には、ＩＴＡＭの例は、ＣＤ３ζのアミノ酸番号５１から１６４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）、ＦｃεＲＩγのアミノ酸番号４５から８６（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４０９７．１）、ＦｃεＲＩβのアミノ酸番号２０１から２４４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００１３０．１）、ＣＤ３γのアミノ酸番号１３９から１８２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００００６４．１）、ＣＤ３δのアミノ酸番号１２８から１７１（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２３．１）、ＣＤ３εのアミノ酸番号１５３から２０７（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２４．１）、ＣＤ５のアミノ酸番号４０２から４９５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）、００２２のアミノ酸番号７０７から８４７（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７６２．２）、ＣＤ７９ａのアミノ酸番号１６６から２２６（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７７４．１）、ＣＤ７９ｂのアミノ酸番号１８２から２２９（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６１７．１）、ＣＤ６６ｄのアミノ酸番号１７７から２５２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１８０６．２）の配列を有するペプチドを含み、これらのペプチドが有するものと同じ機能を有するこれらの変異体を含む。本明細書で記載されたＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づいたアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）の完全長に基づいて番号付けされている。

二次共刺激シグナルは多様な共刺激分子の細胞質ドメインに由来し得、この細胞質ドメインの最も特徴的なものはＣＤ２８である。ＣＤ２８はＴ細胞上で発現され、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）についての受容体である。しかしながら、他の共刺激分子は、ＣＤ２７分子、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ分子、ＣＤ１３４／ＯＸ４０分子および当技術分野において公知の他の細胞内シグナル伝達分子を含むが、これらに限定されない。ＣＤ１３４／ＯＸ４０は、おそらくアポトーシスを抑制することによってＴ細胞クローン性増殖を増強することが知られており、記憶細胞の樹立において役割を果たし得る。ＣＤ１３７としても知られている４−１ＢＢは、有効な共刺激シグナルをＴ細胞に伝達し、Ｔリンパ球の分化を促進し、長期間の生存を高める。これらの共刺激分子の各々は異なる細胞内シグナル伝達経路を活性化し、Ｔリンパ球の異なる集団において異なる効果を有し得るので、１つ、複数または各々由来のドメインは、Ｔ細胞活性化およびＣＡＲの他の所望の特性を最大化するためにＣＡＲのエンドドメイン内に含まれ得る。好ましい実施形態では、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢおよびＯＸ４０分子はヒトである。本発明において使用され得る二次細胞質シグナル伝達配列を含む細胞内ドメインの例は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＩＣＯＳおよびＣＤ１５４に由来する配列を含む。この特定の例は、ＣＤ２のアミノ酸番号２３６から３５１（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ−００１７５８．２）、ＣＤ４のアミノ酸番号４２１から４５８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ−０００６０７．１）、ＣＤ５のアミノ酸番号４０２から４９５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ−０５５０２２．２）、ＣＤ８αのアミノ酸番号２０７から２３５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ−００１７５９．３）、ＣＤ８３のアミノ酸番号１９６から２１０（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）、ＣＤ２８のアミノ酸番号１８１から２２０（配列番号２５）（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ−００６１３０．１）、ＣＤ１３７のアミノ酸番号２１４から２５５（４−１ＢＢ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ−００１５５２．２）、ＣＤ１３４のアミノ酸番号２４１から２７７（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ−００３３１８．１）およびＩＣＯＳのアミノ酸番号１６６から１９９（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ−０３６２２４．１）の配列を有するペプチドを含み、これらのペプチドが有するものと同じ機能を有するこれらの変異体を含む。

開示された核酸配列によってコードされるＤＬＬ３ ＣＡＲのシグナル伝達／活性化ドメインは、上述のシグナル伝達ドメインのいずれか１つを含んでもよく、任意の組合せにおいて上述の細胞内Ｔ細胞活性化ドメインのいずれか１つ以上を含んでもよい。例えば、本発明の核酸配列は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインならびにＣＤ２８およびＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞活性化ドメインを含むＣＡＲをコードできる。あるいは、例えば、本発明の核酸配列は、ＣＤ８αシグナル伝達ドメインならびにＣＤ２８、ＣＤ３ζ、Ｆｃ受容体ガンマ（ＦｃＲγ）鎖および／または４−１ＢＢのＴ細胞シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードできる。後述する実施例に示す通り、選択された実施形態は、ＣＤ３ζ細胞質領域またはその変異体と共に、４−１ＢＢ共刺激領域を含むことができる。

当業者は、上述のシグナル伝達／共刺激ドメインの各々が、本発明に適合性があり、（単独または好ましくは組み合わせて）開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲと共に効果的に使用され得ることを十分に理解する。したがって、任意の組み合わせまたは構成において上述の部分の各々は、細胞内／細胞質ドメインの構成要素として本発明の範囲内であると明確に想定される。

Ｖ．ＣＡＲ核酸およびベクター
本発明は、抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体をコードする単離または精製された核酸配列であって、ＣＡＲが好ましくは、細胞外ＤＬＬ３結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、Ｔ細胞活性化部分）を含む、単離または精製された核酸配列を提供する。本明細書で使用された「核酸配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマー、すなわち、単鎖であってもよくまたは二本鎖であってもよく、非天然ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含有してもよいポリヌクレオチドを包含することを意図する。本明細書で使用された「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は分子の一次構造を指し、したがって二本鎖ＤＮＡおよび単鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび単鎖ＲＮＡを含む。この用語は、等価物として、メチル化ポリヌクレオチドおよび／またはキャップドポリヌクレオチドのようなヌクレオチド類似体および改変されたポリヌクレオチドから作製されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を含むが、これらに限定されない。

「単離された」とは、この天然環境からの核酸の除去を意味する。「精製された」とは、所与の核酸が、天然（ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）から除去されているまたは実験室条件下で合成され（ｃＤＮＡを含む）および／または増幅されているかに関わらず、純粋に増加していることを意味し、ここで「純粋」とは、「絶対的な純粋」ではなく、相対的な用語である。しかしながら、核酸およびタンパク質は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化されてもよく、さらに実用的目的のために単離されてもよいことが理解される。例えば、核酸は、典型的に、細胞へと導入するために使用される場合、許容される担体または希釈剤と混合される。

本明細書に記載され、添付の実施例に示されている通り、本発明に適合性の核酸配列は、当技術分野において公知の方法を使用して生成され得る。例えば、核酸配列、ポリペプチドおよびタンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して組換えによって産生され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．２００１年を参照されたい）。さらに、ＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする合成的に産生された核酸配列は、ＣＨＯ細胞、植物、細菌、昆虫または哺乳動物、例えば、ラット、ヒトなどのような供給源から単離されてもよくおよび／または精製されてもよい。単離方法および精製方法は当技術分野において周知である。あるいは、本明細書で記載された核酸配列は商業的に合成され得る。これに関して、本発明の核酸配列は、合成であってもよく、組換えであってもよく、単離されてもよくおよび／または精製されてもよい。

本発明の核酸配列は任意の長さのＤＬＬ３ ＣＡＲをコードでき、すなわち、ＣＡＲがこの生物活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力および哺乳動物における疾患を治療する能力または予防する能力などを保持するという条件で、ＣＡＲは任意の数のアミノ酸を含んでもよい。例えば、ＣＡＲは、５０以上、６０以上、１００以上、２５０以上または５００以上のアミノ酸を含んでもよい。好ましくは、ＣＡＲは、約５０から約７００アミノ酸（例えば、約７０、約８０、約９０、約１５０、約２００、約３００、約４００、約５５０または約６５０アミノ酸）、約１００から約５００アミノ酸（例えば、約１２５、約１７５、約２２５、約２５０、約２７５、約３２５、約３５０、約３７５、約４２５、約４５０または約４７５アミノ酸）または前出の値の任意の２つにより定義された範囲である。

本明細書で記載されたＤＬＬ３ ＣＡＲの機能的部分をコードする核酸配列は本発明の範囲に含まれる。「機能的部分」という用語は、ＣＡＲを参照して使用された場合、本発明のＣＡＲの任意の部分または断片を指し、この部分または断片は、これが一部（親ＣＡＲ）であるＣＡＲの生物活性を保持する。機能的部分は、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、これと同じ程度またはこれより高い程度で、標的細胞を認識する能力または免疫調節シグナルを提供する能力または疾患を処置する能力を保持するＣＡＲのこれらの部分を包含する。親ＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする核酸配列を参照すると、ＣＡＲの機能的部分をコードする核酸配列は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％またはこれ以上を含むタンパク質をコードできる。これに関して、適合性の核酸配列は、ＣＡＲの機能的部分のアミノ末端もしくはカルボキシ末端においてまたはさらなるアミノ酸が親ＣＡＲのアミノ酸配列に見出されない両方の末端においてさらなるアミノ酸を含有するＣＡＲの機能的部分をコードできる。望ましくは、さらなるアミノ酸は、機能的部分の生物学的機能、例えば、標的細胞を認識する、がんを検出する、がんを処置するまたは予防することなどを妨げない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は親ＣＡＲの生物活性と比較してＣＡＲの生物活性を増強する。

本発明はまた、ＤＬＬ３ ＣＡＲの機能的変異体をコードする核酸配列を提供する。本明細書で使用された「機能的変異体」という用語は、開示された核酸配列によってコードされたＣＡＲに対して実質的な配列同一性もしくは実質的な配列類似性または有意な配列同一性もしくは有意な配列類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチドまたはタンパク質を指し、この機能的変異体は、これが変異体であるＣＡＲのＤＬＬ３結合能力を保持する。機能的変異体は、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、これと同じ程度またはこれより高い程度で、ＤＬＬ３陽性標的細胞を認識する能力を保持する本明細書で記載されたＣＡＲ（親ＣＡＲ）のこれらの変異体を包含する。親ＣＡＲをコードする核酸配列を参照すると、ＣＡＲの機能的変異体をコードする核酸配列は、例えば、親ＣＡＲをコードする核酸配列と約１０％同一であってもよく、約２５％同一であってもよく、約３０％同一であってもよく、約５０％同一であってもよく、約６５％同一であってもよく、約８０％同一であってもよく、約９０％同一であってもよく、約９５％同一であってもよくまたは約９９％同一であってもよい。

ＤＬＬ３ ＣＡＲの正確な形態と関係なく、本発明の核酸は、選択された宿主細胞（例えば、リンパ球）のエキソビボでの形質転換のために使用されてもよいまたはインビボ遺伝子療法のために被験体へと直接導入されてもよいことは十分に理解される。各場合、開示された核酸は、本明細書で開示された他の賦形剤に加えて、核酸の細胞への転移を促進する物質、例えば、リポソームまたは陽イオン性脂質のような核酸を導入するための試薬と組み合わされてもよい。ある特定の好ましい実施形態では、本発明の核酸は、インビボ遺伝子療法に適したベクターと組み合わされてもよく、これへ組み込まれてもよい。

したがって、前出と共に、本発明は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ核酸を含む組成物であって、医薬として許容される担体と一緒に、有効成分として（例えば、インビボ遺伝子療法で）使用され得るまたは感作リンパ球を生成するために使用され得る、組成物を提供する。適切な医薬として許容される添加剤は当業者に周知である。医薬として許容される添加剤または賦形剤の例は、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、０．０１Ｍリン酸塩、０．１３８Ｍ ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩のような鉱酸塩を含有する水溶液、生理食塩水、グリコール溶液またはエタノール溶液および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩のような有機酸の塩を含む。湿潤剤または乳化剤のようなアジュバントおよびｐＨ緩衝剤もまた、使用されてもよい。本発明の組成物は、非経口投与、例えば、注射または注入に適した公知の形態に製剤化されてもよい。さらに、このような組成物は、懸濁化剤、防腐剤、安定剤および／または分散剤のような製剤補助剤ならびに保存の間の有効期間を延長するための防腐剤を含んでもよい。さらに、組成物は使用前に適切な滅菌液と再構成するための乾燥形態であってもよい。

ＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする核酸配列に加えて、適合性のベクターは、好ましくは、
プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などのような発現制御配列を含み、この発現制御配列は宿主細胞における核酸配列の発現をもたらす。これに関して、多様な異なる供給源由来の構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび抑制プロモーターを含む、多数のプロモーターが当技術分野において周知である。プロモーターの代表的な供給源は、例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母および細菌を含み、これらの供給源由来の適切なプロモーターは、容易に利用可能であるまたは例えば、ＡＴＣＣのような寄託機関からの公衆に利用可能な配列ならびに他の商業的供給源または個人的供給源に基づいて合成により作製され得る。プロモーターは、一方向（すなわち、一方向に転写を開始する）であってもよいまたは双方向（すなわち、３’方向または５’方向のいずれかに転写を開始する）であってもよい。プロモーターの非限定的な例は、例えば、Ｔ７細菌発現系、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）細菌発現系、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーターおよびＲＳＶプロモーターを含む。誘導プロモーターは、例えば、Ｔｅｔ系、エクダイソン誘導系、Ｔ−ＲＥＸ（商標）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、ＬＡＣＳＷＩＴＣＨ（商標）系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびＣｒｅ−ＥＲＴタモキシフェン誘導リコンビナーゼ系を含む。さらに、ＤＬＬ３ ＣＡＲは核酸の発現を確認するためのマーカーであり得る遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子または蛍光タンパク質をコードする遺伝子）と会合されてもよい。

ある特定の実施形態では、任意の制御エレメントと共にＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする核酸は、好ましくは、開示されたＤＬＬ３感作リンパ球をもたらすように、選択された細胞へ後で導入され得るベクターへ挿入されてもよい。好ましい実施形態では、ベクターは、例えば、プラスミド、トランスポゾン、コスミドまたはウイルスベクター（例えば、ファージ、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルス）であってもよい。例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびシュードタイプベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）ベクターおよびＨＳＶベクターのようなウイルスベクターが使用されてもよい。

より一般には、「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（例えば、ＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする外来遺伝子）が、宿主を形質転換し、導入配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するように宿主細胞へ導入され得るビヒクルを意味する。導入遺伝子または導入配列は、開始配列、終止配列、プロモーター配列、シグナル配列、分泌配列または細胞の遺伝機構によって使用されている他の配列のような調節配列または制御配列を含み得ることは十分に理解される。本明細書で記載された通り、適合性のベクターは当技術分野において周知であり、プラスミド、トランスポゾン、ファージ、ウイルスなどを含む。次いでベクターは、開示された感作リンパ球をもたらすように選択されたリンパ球（自己または同種）を形質転換するように使用され得る。本開示の目的では、「転換」または「形質転換」という用語は、この最も一般的な意味において使用され、宿主細胞が、所望の物質、典型的に、導入遺伝子または導入配列によってコードされたタンパク質または酵素を産生するように導入遺伝子または導入配列を発現するように、異種遺伝子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の宿主細胞（原核生物または真核生物）への導入を意味すると理解されるものとする。本発明に適合性の細胞形質転換の例示的な方法は、トランスフェクションおよび形質導入を含む。本明細書で使用された「トランスフェクション」という用語は、物理的手段または化学的手段を使用した外来核酸または外来遺伝子の細胞（原核生物または真核生物）への導入を意味し、一方で、「形質導入」という用語は、ウイルスベクターの使用による外来核酸または外来遺伝子の細胞（真核生物または原核生物）への導入を意味する。

形質導入に関して、ファージまたはウイルスベクターは、好ましくは、適切なパッケージング細胞内での感染粒子の増殖後、宿主細胞へ導入されてもよく、これらのパッケージング細胞の多くは市販されている。適合性の形質導入法およびパッケージング細胞は下記の実施例に示され、本開示を考慮して当業者に容易に認識される。

例として、レトロウイルスベクターが使用される場合、本明細書の教示と適合性の組成物は、ＬＴＲ配列に基づいた適切なパッケージング細胞およびベクターが保有しているパッケージングシグナル配列を選択し、パッケージング細胞を使用してレトロウイルス粒子を調製することによって生成され得る。パッケージング細胞の例は、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２およびＰｓｉ−Ｃｒｉｐを含む。レトロウイルス粒子はまた、高いトランスフェクション効率を有する２９３細胞または２９３Ｔ細胞を使用して調製され得る。レトロウイルス基づいて産生された多くの種類のレトロウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターのパッケージングのために使用され得るパッケージング細胞には、多くの会社から広範に市販されている。同様の系もまた、本明細書の教示に従う適合性のレンチウイルスベクターの製造用に市販されている。このようなベクターは、所望のＤＬＬ３感作リンパ球をもたらすように選択されたリンパ球集団を形質導入するために使用され得る。

加えて、非ウイルスパッケージングベクター系もまた、リポソームならびにＷＯ９６／１００３８、ＷＯ９７／１８１８５、ＷＯ９７／２５３２９、ＷＯ９７／３０１７０およびＷＯ９７／３１９３４（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている陽イオン性脂質のような縮合剤と組み合わせて本発明において使用されてもよい。

同様に、トランスフェクションの多くの方法は本発明に適合性があり、所望の組成物をもたらすように本明細書の教示と組み合わせて使用されてもよい。論じられている通り、トランスフェクションは、典型的に、物理的方法または化学的方法を使用することによる１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞内への導入を指す。多くのトランスフェクション技法は当技術分野において公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、タングステン粒子によって促進された微粒子射出（ｔｕｎｇｓｔｅｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈を含む。さらに、エレクトロポレーション、ソノポレーション、インパルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学トランスフェクションおよびハイドロダイナミック送達（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）は、本発明に適合性の一部の非化学系の遺伝子トランスフェクション法を含む。

どの方法が形質転換をもたらすために選択されるかに関わらず、ＤＬＬ３ ＣＡＲ核酸構築物およびベクターが、開示された感作リンパ球を生成するために使用され得ることは十分に理解される。

ＶＩ．宿主細胞
ＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、任意の適切な原核細胞または真核細胞を含む、ＣＡＲタンパク質を保有するおよび／または発現することができる任意の宿主細胞へ導入され得る。特に形質転換の適合性の方法は、トランスポゾンおよび裸のＲＮＡと共にレンチウイルス系およびレトロウイルス系の使用を含む。好ましい宿主細胞は、容易に増殖でき、確実に増殖でき、合理的に速い増殖率を有し、十分に特徴付けられた発現系を有し、容易および効果的に形質転換され得るまたはトランスフェクトされ得る宿主細胞である。

本明細書で使用された「宿主細胞」という用語は、発現ベクターを含有し得る任意の種類の細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞（例えば、植物、動物、真菌または藻類）であってもよく、原核細胞（例えば、細菌または原生動物）であってもよくまたはウイルスベクターもしくはレトロウイルスベクターであってもよい。宿主細胞は培養されてもよくまたは「既製品」の細胞であってもよくまたは初代細胞（すなわち、被験体から直接単離された）であってもよい。宿主細胞は、接着細胞であってもよいまたは懸濁細胞、すなわち懸濁液中で増殖する細胞であってもよい。適切な宿主細胞は当技術分野において公知であり、例えば、ＤＨ５αイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などを含む。組換え発現ベクターを増殖させるまたは複製する目的のために、宿主細胞は原核細胞、例えば、ＤＨ５α細胞であってもよい。組換えＣＡＲを産生する目的のために、宿主細胞は哺乳動物細胞であってもよい。宿主細胞は、好ましくは、ヒト細胞である。宿主細胞は任意の細胞種類であってもよく、任意の種類の組織に由来してもよく、任意の発生段階であってもよい。例えば、血液（末梢血、臍帯血など）または骨髄のような体液、組織または器官から回収され、単離され、精製されまたは誘導された細胞が使用されてもよい。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、免疫細胞［樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞または造血細胞（好中球、好塩基球）］、臍帯血単核細胞、線維芽細胞、前駆体脂肪細胞、肝細胞、皮膚ケラチノサイト、間葉幹細胞、脂肪幹細胞、多様ながん細胞株または神経幹細胞が使用されてもよい。特に好ましい実施形態では、宿主細胞は、末梢血リンパ球細胞（ＰＢＬ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であってもよい。選択された実施形態では、宿主細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。他の好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞である。適切な哺乳動物宿主細胞を選択するための方法ならびに細胞の形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび精製のための方法は当技術分野において公知である。

本発明は、本明細書で記載されたＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする核酸配列を発現する単離された宿主細胞またはこの宿主細胞の組成物を提供する。特に好ましい実施形態では、宿主細胞は、開示されたＣＡＲを発現すると、ＤＬＬ３感作リンパ球へ形質転換されるリンパ球を含む。一実施形態では、宿主細胞はＴ細胞である。本発明のＴ細胞は、培養されたＴ細胞（例えば、初代Ｔ細胞または培養されたＴ細胞株由来のＴ細胞または哺乳動物から得られたＴ細胞）のような任意のＴ細胞であってもよい。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液を含むが、これらに限定されない、多数の供給源から得られてもよい。Ｔ細胞はまた、濃縮されてもよいまたは精製されてもよい。Ｔ細胞は、好ましくは、ヒトＴ細胞（例えば、ヒトから単離された）である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、未感作Ｔ細胞などを含むが、これらに限定されない、任意の発生段階であってもよい。一実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｔ細胞株は商業的供給源（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションならびにドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ））から利用可能であり、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、Ｓｕｐ−Ｔ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９４２）、ＲＰＭＩ ８４０２細胞（ＤＳＭＺ ＡＣＣ−２９０）、Ｋａｒｐａｓ ４５細胞（ＤＳＭＺ ＡＣＣ−５４５）およびこれらの誘導体を含む。

別の実施形態では、宿主細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＮＫ細胞は自然免疫系における役割を果たす細胞傷害性リンパ球の種類である。ＮＫ細胞は大型顆粒リンパ球と定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球も発生させる一般的なリンパ前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｊａｎｅｗａｙら編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（２００１）を参照されたい）。ＮＫ細胞は骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺および胸腺において分化し、成熟する。成熟後、ＮＫ細胞は特徴的な細胞傷害性顆粒を有する大型リンパ球として循環に入る。ＮＫ細胞は、例えば、一部の腫瘍細胞およびウイルス感染細胞のような一部の異常細胞を認識でき、殺傷でき、細胞内病原体に対する自然免疫防御において重要であると考えられる。Ｔ細胞に関して上記で記載された通り、ＮＫ細胞は、培養されたＮＫ細胞、例えば、初代ＮＫ細胞または培養されたＮＫ細胞株由来のＮＫ細胞または哺乳動物から得られたＮＫ細胞のような任意のＮＫ細胞であってもよい。哺乳動物から得られる場合、ＮＫ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液を含むが、これらに限定されない、多数の供給源から得られてもよい。ＮＫ細胞はまた、濃縮されてもよいまたは精製されてもよい。ＮＫ細胞は、好ましくは、ヒトＮＫ細胞（例えば、ヒトから単離された）である。ＮＫ細胞株は、商業的供給源（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション）から利用可能であり、例えば、ＮＫ−９２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４０７）、ＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４０８）およびこれらの誘導体を含む。

自己養子免疫療法において、患者の循環リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球は、（例えば、アフェレーシスによって）インビトロにおいて単離され、好ましくは、ＩＬ−２のようなリンホカインによって活性化または刺激され、次いでＤＬＬ３ ＣＡＲ構築物をコードする核酸を形質導入される。形質導入後、自己感作リンパ球は、好ましくは、当技術分野において公知のサイトカイン補助を使用して増殖され、患者に再投与される。これを達成するために、本明細書で記載されたＤＬＬ３ ＣＡＲ遺伝子を発現するように遺伝子改変された活性化されたリンパ球の免疫学的に有効な量を動物またはヒト患者に投与する。このような自己手順において、活性化されたリンパ球（すなわち、ＤＬＬ３感作リンパ球）は、最も好ましくは、血液試料および腫瘍試料から以前に単離され、インビトロにおいて活性化され、増殖された患者独自の細胞である。本発明の一部の態様では、がんを有する患者由来のＴリンパ球またはＮＫ細胞が、単離され、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５ポリヌクレオチド（例えば、下記の実施例１０を参照されたい）により形質導入され、これによりＤＬＬ３ ＣＡＲがＴ細胞またはＮＫ細胞の細胞表面上で発現される。次いで改変された細胞は、腫瘍細胞を標的とし、殺傷するように患者へ再投与される（概して図５を参照されたい）。

本発明の他の好ましい態様はＤＬＬ３感作リンパ球の同種移植を含む。このような実施形態では、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲは、処置される被験体以外の供給源から得られたリンパ球へ（例えば、形質導入により）導入され得る。本発明の一部の態様は、拒絶の可能性を低減させるためにレシピエントと免疫学的に適合しているドナーから得られた同種リンパ球の使用を含む。他の態様では、開示されたＣＡＲは、標的細胞と接触すると、移植を容易にし、適切な免疫反応を生じるように改変されている「既製品」の同種リンパ球（参照により本明細書に組み込まれるＰＭＩＤ：２６１８３９２７を参照されたい）へ導入される。このような既製の同種リンパ球調製物の使用は、医薬として活性な感作リンパ球の調製および患者の拒絶の可能性の低減に関するいくつかの利点を提供できることは十分に理解される。

選択された宿主細胞は、ＤＬＬ３ ＣＡＲによる形質転換の前または後にインビトロにおいて増殖され得ることもまた、十分に理解される。選択された細胞集団を増殖させる方法は当技術分野において周知であり、本発明に適合性のいくつかの市販のキットが利用可能である。これに関して、Ｔ細胞およびまたはＮＫ細胞は、より安定した投薬選択肢を提供するようにインビトロにおいて増殖され得る。例えば、本発明によれば、ＮＫ細胞は、優先的に、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ分子および／または主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ分子を欠いているまたはこれを十分に発現せず、膜結合型ＩＬ−１５リガンドおよび膜結合型４−１ＢＢリガンド（ＣＤＩ３７Ｌ）を発現するように遺伝子改変されている細胞に曝露することによって増殖され得る。このような細胞株は、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２４３）およびウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞がん細胞株Ｌｕ−１３０およびＬｕ−１３４−Ａ、神経芽腫細胞株ＮＢ１９およびＮ１３６９、精巣ＮＥＣ１４由来の胚性がん細胞株、頸がん細胞株ＴＣＯ−２ならびに骨髄転移性神経芽細胞腫細胞株ＴＮＢ１を含むが、必ずしもこれらに限定されない。好ましくは、使用される細胞株は、Ｋ５６２細胞株およびＨＦＷＴ細胞株のようなＭＨＣＩ分子およびＭＨＣＩＩ分子の両方を欠いているまたはこれらを十分に発現しない。同様の技法により、選択されたＴ細胞集団の増殖が可能となる。これに関して、一部のプロセスは、抗ＣＤ３に加えて自己支持細胞または同種支持細胞および高用量のＩＬ−２を利用する。他のプロセスは、Ｔ細胞の増殖および刺激のためにＩＬ−７、Ｉｌ−１５、ＩＬ−２１またはこれらの組合せを使用する。所望の数のＤＬＬ３感作リンパ球をもたらす任意のプロセスと共に上述のプロセスの各々は本発明に適合性があることは十分に理解される。

ＶＩＩ．ＤＬＬ３感作リンパ球の製剤化および投与
本明細書に示す通り、選択された宿主細胞は、自己または同種異系間ＤＬＬ３感作リンパ球を含む養子細胞免疫療法における使用のためにインビトロで増やされてよい。これに関して、本発明の組成物および方法は、好ましくは、がんの処置、例として、小細胞肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、白血病およびリンパ腫を含む肺がんの処置において使用するための一次シグナルおよび共刺激シグナルの両方を送達する感作リンパ球の集団を生成するために使用され得る。本発明に記載された組成物および方法は、化学療法、手術、放射線、遺伝子療法などのようながんのための他の種類の療法と共に使用されてもよい。

ＤＬＬ３感作リンパ球または宿主細胞は、好ましくは、１種以上の医薬として許容される担体を含む医薬組成物の形態で被験体へ投与される。特に好ましい実施形態では、開示された医薬組成物は、ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞（自己または同種）の集団を含む。このような宿主細胞以外に、本発明の医薬組成物は、化学療法剤（例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなど）または免疫反応をさらに刺激するアジュバント療法剤のような他の医薬として活性な薬剤または薬物を含んでもよい。好ましい実施形態では、医薬組成物は、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する単離されたＴ細胞またはＮＫ細胞、より好ましくは、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する感作Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団を含む。さらにこのような組成物は、当技術分野において周知であるような医薬として許容される緩衝剤、防腐剤、賦形剤などを含んでもよい。

あるいは、ＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする核酸配列またはＤＬＬ３ ＣＡＲコード核酸配列を含むベクターは、医薬組成物に製剤化されてもよく、患者へ直接投与するために使用されてもよい。このような実施形態では、ウイルスベクター宿主細胞を含むベクター系（例えば、レンチウイルス系またはレトロウイルス系）または誘導された人工的なウイルスエンベロープが好ましい。このようなベクターは、所望の抗腫瘍免疫反応を後で誘導できるＤＬＬ３感作リンパ球のインビボでの生成を可能にする。

任意の事象において、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲ宿主細胞および任意の共試薬は、当技術分野で認知された技法を使用して、多様な方法において製剤化され得る。一部の実施形態では、本発明の治療用組成物は、さらなる成分を伴わずに投与することもでき、最小限のさらなる成分を伴って投与することもできるが、他のものは、任意選択的に、適切な、医薬として許容される担体を含有するように製剤化することもできる。本明細書で使用される「医薬として許容される担体」は、当技術分野で周知の賦形剤、ビヒクル、アジュバント、および希釈剤を含み、医薬調製物における使用のための商業的供給元から入手可能でありうる（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（２００３年）、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ Ｐｌｕｓ」、２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ａｎｓｅｌら（２００４年）、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｋｉｂｂｅら（２０００年）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、３版、Ｐｈａｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。

適切な医薬として許容される担体は、典型的に、比較的不活性であり、感作リンパ球または宿主細胞の投与を容易とし得る物質またはこれらを作用部位へと送達するのに医薬として最適化された調製物へと加工する一助となり得る物質を含む。このような医薬として許容される担体は、製剤の形態、粘稠度、粘度、ｐＨ、等張性、安定性、容量オスモル濃度、薬物動態、タンパク質の凝集、または溶解度を変化させうる薬剤を含み、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、封入剤、および皮膚浸透増強剤を含む。担体のある特定の非限定的な例は、食塩液、緩衝食塩液、デキストロース、アルギニン、スクロース、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびこれらの組合せを含む。全身投与用の感作リンパ球は、経腸投与用に製剤化されてもよく、非経口投与用に製剤化されてもよくまたは局所投与用に製剤化されてもよい。実際、３種類の製剤全てを同時に使用して、有効成分の全身投与を達成することができる。非経口薬物送達用および経口薬物送達用の賦形剤ならびに製剤は当技術分野において周知である。

ＤＬＬ３感作リンパ球の非経口投与（例えば、注射または注入による）に適する製剤は、水性または非水性で、等張性で、発熱物質非含有で、滅菌の液体（例えば、液剤、懸濁剤）であって、有効成分を、溶解する、懸濁するまたは他の形で提供した（例えば、リポソーム内または他の微粒子内に）液体を含む。このような液体は、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液（または他の関与性の体液）と等張性とする溶質のような、他の医薬として許容される担体をさらに含有しうる。賦形剤の例は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などを含む。このような製剤における使用に適する、等張性の、医薬として許容される担体の例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸加リンゲル注射液を含む。

細胞構成要素を導入する方法もまた、当技術分野において公知であり、Ｕ．Ｓ．Ｐ Ｎｓ．４，８４４，８９３および４，６９０，９１５に例示された手順のような手順を含む。使用されるＤＬＬ３感作リンパ球（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の量は、インビトロでの使用とインビボでの使用との間で変化してもよく、標的細胞の量および種類により変化してもよい。投与される量はまた、患者の状態に応じて変化し、全ての適切な要因を考慮した後に医師により決定されるべきである。

ＤＬＬ３感作リンパ球の特定の投与レジメン、すなわち、用量、投与時期および投与回数は、特定の個体に依存するほか、薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）のような経験的な検討事項にも依存する。例えば、個体は、本明細書で記載された通りに産生された感作リンパ球の増分投与量を与えられてもよい。選択された実施形態では、投与量は、経験的に決定された副作用もしくは観察された副作用または毒性にそれぞれ基づいて徐々に増加または低減または減衰させてもよい。投与頻度の決定は、主治医などの当業者が、処置される状態および状態の重症度、処置される被験体の年齢および全般的健康状態などの検討に基づき下すことができる。投与頻度は、治療コースにわたり、選択された組成物および投与レジメンの有効性についての評価に基づき調整することができる。このような評価は、特異的な疾患、障害、または状態についてのマーカーに基づき行うことができる。個体ががんを有する実施形態では、これらは、触診もしくは目視観察を介する腫瘍サイズの直接的な測定；ｘ線もしくは他のイメージング技法による腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍の生検および腫瘍試料の顕微鏡検査により評価される改善；本明細書に記載されている方法に従って同定される間接的腫瘍マーカー（例えば、ＳＣＬＣに対するＤＬＬ３）または抗原の測定；増殖性細胞もしくは腫瘍形成性細胞の数の低減、このような新生物性細胞の低減の維持；新生物性細胞の増殖の低減；または転移の発症の遅延を含む。

本開示を考慮して、ＤＬＬ３ ＣＡＲは具体的なスケジュールで投与され得る。一般に、有効用量の感作リンパ球は被験体へと１回以上投与される。より特定すると、有効用量のＤＬＬ３ ＣＡＲは、被験体へと、１カ月に１回、１カ月に１回を超えて、または１カ月に１回未満投与する。ある特定の実施形態では、有効用量のＤＬＬ３感作リンパ球は、少なくとも１カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間または数年間を含む期間にわたって、複数回投与され得る。さらに他の実施形態では、ＤＬＬ３感作リンパ球の投与の間に、数日間（２、３、４、５、６または７日間）が経過する場合もあり、数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）が経過する場合もあり、数カ月間（１、２、３、４、５、６、７または８カ月間）が経過する場合もありなおまたは１年間もしくは数年間が経過する場合もある。

ある特定の好ましい実施形態では、ＤＬＬ３ ＣＡＲ伴う処置コースは、選択された感作リンパ球の、数週間または数カ月間の期間にわたる、複数回の投与を含む。より具体的には、本発明のＤＬＬ３感作リンパ球は、毎日１回、隔日１回、４日ごとに１回、毎週１回、１０日ごとに１回、隔週１回、３週間ごとに１回、毎月１回、６週間ごとに１回、２カ月ごとに１回、１０週間ごとに１回または３カ月ごとに１回投与されてもよい。これに関して、患者の応答および臨床的慣行に基づき、投与量は変化されてもよいまたは投与間隔は調整されてもよいことが十分に理解される。

哺乳動物（例えば、ヒト）へと投与される宿主細胞の典型的な量は、例えば、１００万個から１０００億個の範囲の細胞であってもよいが、この例示的な範囲未満の量またはこれを超える量は本発明の範囲内である。例えば、本発明の宿主細胞の１日用量は、約１００万個から約５００億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞または前出の値のいずれか２つによって定義された範囲）、好ましくは約１０００万個から約１０００億個の細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞または前出の値のいずれか２つによって定義された範囲）、より好ましくは約１億個の細胞から約５００億個の細胞（例えば、約１億２０００万個の細胞、約２億５０００万個の細胞、約３億５０００万個の細胞、約４億５０００万個の細胞、約６億５０００万個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞または前出の値のいずれか２つによって定義された範囲）であってもよい。好ましい実施形態では、約５億個、１０億個、１５億個、２０億個、２５億個、３０億個、３５億個、４０億個、４５億個、５０億個、５５億個、６０億個、６５億個、７０億個、７５億個、８０億個、８５億個、９０億個、９５億個または１００億個の細胞が１回以上の用量において患者へと投与される。

治療効果または予防効果は、処置された患者の定期評価によってモニターされ得る。数日間またはこれより長い期間にわたる反復投与では、状態に応じて、処置は疾患症状の所望の抑制が起こるまで反復される。しかしながら、他の投与レジメンが有用であってもよく、本発明の範囲内である。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与によって送達されてもよく、組成物の複数回ボーラス投与によって送達されてもよくまたは組成物の持続注入投与によって送達されてもよい。

上記に論じられている通り、ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する感作宿主細胞を含む組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内または鼻腔内を含む、標準的な投与技法を使用して哺乳動物へと投与され得る。組成物は、好ましくは、非経口投与に適している。本明細書で使用された「非経口」という用語は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、膣投与および腹腔内投与を含む。より好ましくは、組成物は、静脈内注射、腹腔内注射または皮下注射による末梢全身送達を使用して哺乳動物へと投与される。

さらに、ＤＬＬ３ ＣＡＲ核酸配列を発現する宿主細胞またはＣＡＲコード核酸配列を含むベクターは、哺乳動物へと共投与され得る１種以上のさらなる治療剤と共に投与されてもよい。「共投与する」とは、ＤＬＬ３ ＣＡＲが１種以上のさらなる治療剤の効果を増強できるようにまたはこの逆も同様であるように十分に近い時間内に１種以上のさらなる治療剤および本発明の宿主細胞または本発明のベクターを含む組成物を投与することを意味する。これに関して、感作リンパ球を含む組成物が最初に投与されてもよく、１種以上のさらなる治療剤が２番目に投与されてもよいまたはこの逆も同様である。あるいは、ＤＬＬ３感作リンパ球を含む組成物および１種以上のさらなる治療剤は同時に投与されてもよい。

選択された好ましい実施形態では、ＤＬＬ３感作リンパ球は、Ｔ細胞増殖を補助するために恒常性サイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５など）の利用可能性を増加させるためにリンパ球毒性療法と併せて投与される。このようなプロトコールでは、リンパ球毒性療法は、好ましくは、感作リンパ球の投与の前に行われる。より具体的には、リンパ球枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）調製レジメンは、内因性リンパ球を低減させ、これによって投与された感作リンパ球の増殖および持続性を補助する恒常性サイトカインの蓄積をもたらすことによって養子細胞療法の有効性を増強させ得ると考えられる。さらに、このような調製処理はＴｒｅｇの数および頻度の一時的な低減をもたらすことができ、これによって自然免疫系を活性化させる細菌副産物（例えば、リポ多糖）の全身放出をもたらし得るリンパ球抑制および消化管損傷の誘導を減少させる。まとめると、このような機構は、移植されたＤＬＬ３感作リンパ球の免疫環境の受容を実質的に増強させることができ、これによってこのＤＬＬ３感作リンパ球の増殖および持続性を促進する。

ＶＩＩＩ．適応
本発明は、好ましくは、新生物性障害、炎症性障害、血管新生性障害および免疫ＤＬＬ３関連障害を含む、多様な障害の処置、維持および／または予防のためのＤＬＬ３感作リンパ球の使用を提供する。処置のための好ましい標的は、充実性腫瘍および血液悪性腫瘍を含む新生物性状態である。ある特定の実施形態では、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲ処置は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍または腫瘍形成性細胞を阻害する、低減させるまたは消失させるために使用される。選択された態様では、開示された組成物は、腫瘍細胞増殖の阻害に使用され得る。処置される「被験体」または「患者」は、ヒトであることが好ましいが、本明細書で使用される通り、その用語は明示的には、任意の哺乳動物種を含むものとする。

本発明に従う処置にかけられる新生物性状態は、良性の場合もありまたは悪性の場合もあり；充実性腫瘍の場合もありまたは他の血液新生物の場合もあり；副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連がん、胞巣状軟部肉腫、星状細胞腫瘍、自律神経節腫瘍（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｇａｎｇｌｉａ ｔｕｍｏｒ）、膀胱がん（扁平上皮癌および移行上皮癌）、胞胚腔障害、骨がん（アダマンチノーマ、脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳脊髄がん、転移性脳腫瘍、トリプルネガティブ乳がんを含む乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頸がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、明細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮障害、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成症、胆嚢胆管がん、胃がん、消化器疾患、妊娠性絨毛疾患、生殖細胞腫瘍、腺障害、頭頸部がん、視床下部がん、腸がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺がん（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌など）、マクロファージ障害、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭癌、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後ブドウ膜黒色腫、まれな血液障害、腎転移がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、間質細胞障害、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移がんおよび子宮がん（子宮頸癌、子宮内膜癌および平滑筋腫）を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。

ある特定の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、最先端の治療法として使用され、がん性状態について以前に処置されていない対象に投与される。他の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、以前に処置されたが（本発明の組成物でまたは他の抗がん剤で）再発した、または以前の処置に対し難治性であることが決定された対象の処置に使用される。選択された実施形態では、本発明の化合物および組成物は、反復性腫瘍を有する対象の処置に使用され得る。

選択された態様では、増殖性障害は、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞および非小細胞の両方）、甲状腺の癌、肉腫、神経膠芽腫および種々の頭頸部腫瘍を含むがこれらに限定されない、固形腫瘍を含む。

他の好ましい実施形態では、化合物または組成物は、黒色腫を患う対象に投与される。より一般には、本明細書で開示された組成物および方法は、黒色腫の診断、モニター、処置または防止に使用され得る。本明細書で使用されている「黒色腫」という用語は、原発性黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、真皮外黒色腫、表在拡大型黒色腫、ポリープ状黒色腫、黒色癌腫（ｍｅｌａｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色上皮腫、黒色肉腫（ｍｅｌａｎｏｓａｒｃｏｍａ）、表皮内黒色腫、結節性悪性黒色腫、悪性黒子由来黒色腫、黒子型黒色腫、黒子型悪性黒色腫、粘膜黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、末端黒子型黒色腫、軟部組織黒色腫、眼性黒色腫、浸潤性黒色腫、家族性非定型黒子および黒色腫（ＦＡＭ−Ｍ）症候群、線維形成性悪性黒色腫またはぶどう膜黒色腫を含むがこれらに限定されない、あらゆる種類の黒色腫を含む。

選択された態様では、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲ処置は、次のサブタイプを含む肺がんの処置において特に有効である：小細胞肺がん、非小細胞肺がん（例えば、扁平細胞非小細胞肺がんまたは扁平細胞小細胞肺がん。）および大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）。選択された実施形態では、ＤＬＬ３感受性リンパ球は、限定的なステージの疾患または広範なステージの疾患を示す患者に投与され得る。他の好ましい実施形態では、開示されたコンジュゲート抗体は、難治性患者（すなわち、初期治療法の経過の間にまたはその完了直後にその疾患が再発した患者）；感受性患者（すなわち、その再発が一次治療法後２−３カ月間よりも長い患者）；または白金に基づく薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）および／またはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル（ｌａｒｏｔａｘｅｌ）またはカバジタキセル）に対する抵抗性を示す患者に投与される。

別の特に好ましい実施形態では、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲ処置は、卵巣漿液性癌および卵巣乳頭漿液性癌を含む卵巣がんの処置において有効である。

開示された組成物は、神経内分泌腫瘍を含む神経内分泌特色または表現型を有する腫瘍の防止、処置または診断にさらに使用され得る。分散した内分泌系から生じる真性または正準神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は、相対的に珍しく、１００，０００人につき２−５人の発生率であるが、高悪性度である。神経内分泌腫瘍は、腎臓、尿生殖器（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部および子宮内膜）、胃腸管（結腸、胃）、甲状腺（髄様甲状腺がん）および肺（小細胞肺癌および大細胞神経内分泌癌）において発生する。これらの腫瘍は、カルチノイド症候群として公知の衰弱性症状を引き起こし得る、セロトニンおよび／またはクロモグラニンＡを含むいくつかのホルモンを分泌することができる。このような腫瘍は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、ガンマエノラーゼとしても公知、遺伝子記号＝ＥＮＯ２）、ＣＤ５６（またはＮＣＡＭ１）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）およびシナプトフィジン（ＳＹＰ）のような陽性免疫組織化学的マーカーによってまたはＡＳＣＬ１のような発現上昇を示すことが公知の遺伝子によって表示され得る。残念ながら、伝統的な化学療法は、ＮＥＴの処置において特に有効ではなく、肝臓転移は共通の転帰である。

開示された組成物は、神経内分泌腫瘍の処置に有利に使用され得るが、正準神経内分泌腫瘍と共通の形質を遺伝子型的にまたは表現型的に模倣する、似ているまたは示す、偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）の処置、防止または診断にも使用され得る。偽性神経内分泌腫瘍または神経内分泌特色を有する腫瘍は、拡散神経内分泌系の細胞または発癌過程において神経内分泌分化カスケードが異常に再活性化された細胞から生じる腫瘍である。このようなｐＮＥＴは一般的に、生物学的活性アミン、神経伝達物質およびペプチドホルモンのサブセットを産生する能力を含む、ある特定の表現型または生化学的特徴を、伝統的に定義される神経内分泌腫瘍と共有する。組織学的には、このような腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴ）は、共通の外観を共有し、多くの場合、穏やかな細胞病理を有する最小の細胞質および円形から卵円形の斑点状の核を有する高密度に連結した小細胞を示す。本発明の目的のため、神経内分泌および偽性神経内分泌腫瘍の定義に使用され得る共通に発現される組織学的マーカーまたは遺伝的マーカーは、クロモグラニンＡ、ＣＤ５６、シナプトフィジン、ＰＧＰ９．５、ＡＳＣＬ１およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）を含むがこれらに限定されない。

したがって、本発明の感作リンパ球は、偽性神経内分泌腫瘍および正準神経内分泌腫瘍の両方の処置に有益に使用され得る。これに関して、ＡＤＣは、本明細書に記載されている通り、腎臓、尿生殖器（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部および子宮内膜）、胃腸管（結腸、胃）、甲状腺（髄様甲状腺がん）および肺（小細胞肺癌および大細胞神経内分泌癌）において生じる神経内分泌腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴの両方）の処置に使用され得る。さらに、本発明の組成物（ｃｏｍｐｓｏｓｉｔｉｏｎ）は、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィジン、クロモグラニンＡ、ＡＳＣＬ１およびＰＧＰ９．５（ＵＣＨＬ１）からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する腫瘍の処置に使用され得る。すなわち、本発明は、ＮＳＥ^＋もしくはＣＤ５６^＋もしくはＰＧＰ９．５^＋もしくはＡＳＣＬ１^＋もしくはＳＹＰ^＋もしくはＣＨＧＡ^＋またはこれらのいくつかの組合せである腫瘍を患う対象の処置に使用され得る。

別の好ましい実施形態では、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲ処置は、疾患の最初の発現後、腫瘍再発の機会を低減または消失させるために維持療法において使用され得る。好ましくは、障害は処置され、初期腫瘍塊は、患者が無症状になるまたは寛解期になるように消失される、低減されるまたは別様で改善される。このようなときに、被験体は、たとえ標準的な診断手順を使用して疾患の症状がほとんどないまたは全くなくても、医薬として有効な量の開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲ処置を１回以上投与されてもよい。一部の実施形態では、調節因子が、毎週１回、隔週１回、毎月１回、６週間ごとに１回、２カ月ごとに１回、３カ月ごとに１回、６カ月ごと１回または毎年１回のような期間にわたって、通常のスケジュールで投与される。本明細書の教示を考慮して、当業者は、疾患再発の可能性を低減させるために有益な投与量および投与レジメンを容易に決定できる。さらに、このような処置は、患者の反応ならびに臨床パラメーターおよび診断パラメーターに応じて、数週間、数カ月間、数年間なおまたは無期限の期間にわたって、継続されてもよい。

さらに別の好ましい実施形態では、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲ処置は、減量術手順後、腫瘍転移の可能性を予防するもしくは低減させるために、予防的に使用されてもよいまたはアジュバント療法として使用されてもよい。本開示で使用された「減量術手順」とは、広範に定義され、腫瘍または腫瘍増殖を消失させる、低減させる、処置するまたは改善する任意の手順、技法または方法を意味するものとする。例示的な減量術手順は、手術、放射線治療（すなわち、ビーム放射）、化学療法、免疫療法またはアブレーションを含むが、これらに限定されない。本開示を考慮して当業者により容易に決定された適切な時期に、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲ処置が、腫瘍転移を低減させるために、臨床手順、診断手順または治療診断（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｔｉｃ）手順によって提案された通り投与され得る。ＤＬＬ３感作リンパ球は、標準的な技法を使用して決定された通りに医薬として有効な投与量で１回以上投与されてもよい。好ましくは、投与レジメンは、これを改変できる適切な診断技法またはモニタリング技法を伴う。

本発明のさらに他の実施形態は、無症状であるが、増殖性障害を発生するリスクがある被験体へと、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲ処置を投与するステップを含む。すなわち、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲ処置は、真に予防の意味において使用されてもよく、検査されまたは試験され、１つ以上の顕著なリスク要因（例えば、ゲノムの指標、家族歴、インビボ試験結果またはインビトロ試験結果など）を有するが、新生物を発生していない患者に与えられてもよい。このような場合、当業者は、経験的観察によりまたは認められている臨床診療により有効な投与レジメンを決定できる。

ＩＸ．組合せ療法
以前に論じられている通り、本明細書で記載されたＤＬＬ３ ＣＡＲ処置は、他の臨床腫瘍処置と組み合わせて使用されてもよいことは十分に理解される。一般に、本発明の処置は、治療用部分または細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、血管新生阻害剤、デバルキング剤（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、化学療法剤、放射線治療剤、標的化抗がん剤、生物反応修飾物質、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤および免疫療法剤を含むが、これらに限定されない抗がん剤のような薬物と共に使用されてもよい。

組合せ療法は、がんを予防するまたは処置するのに有用であり得、がんの転移または再発を予防するのに有用であり得る。本明細書で使用された「組合せ療法」は、少なくとも１つのＤＬＬ３ ＣＡＲ処置および少なくとも１つの治療用部分（例えば、抗がん剤）を含む組合せであって、好ましくは、がんの処置において、（ｉ）単独で使用されるＤＬＬ３ ＣＡＲ処置もしくは（ｉｉ）単独で使用される治療用部分もしくは（ｉｉｉ）ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置を追加せずに別の治療用部分と組み合わせた治療用部分の使用を凌駕する治療的相乗作用を有するかまたは測定可能な治療効果を改善する組合せの投与を意味する。本明細書で使用された「治療的相乗作用」または「相乗作用」という用語は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置と１つ以上の治療用部分との組合せであって、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置と１つ以上の治療用部分との組合せの相加効果を超える治療効果を有する組合せを意味する。

開示される組合せによる所望の転帰は、対照またはベースラインの測定値との比較により定量される。本明細書で使用された「改善する」「増加させる」または「低減する」のような相対的な用語は、本明細書で記載された処置の開始前の同じ個体における測定値または本明細書で記載されたＤＬＬ３ ＣＡＲ処置の非存在下であるが、標準治療による処置のような他の治療用部分の存在下の対照個体（または複数の対照個体）における測定値のような、対照と比べた値を指し示す。代表的な対照個体は、処置される個体と同じ形態のがんに罹患する個体であって、処置される個体とほぼ同じ年齢の個体である（処置される個体における病期と、対照個体における病期とが同等であることを確保するように）。

治療への応答の変化または改善は一般に、統計学的に有意である。本明細書で使用される「有意性」または「有意」という用語は、２つ以上の実体の間にランダムでない関連が存在する確率についての統計学的解析に関する。関係が「有意」であるのかないのか、または「有意性」があるのかないのかを決定するために、「ｐ値」を計算することができる。使用者により定義されたカットオフ点を下回るｐ値は、有意であるとみなされる。０．１未満であるもしくはこれと等しいｐ値、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、または０．００１未満のｐ値は、有意であるとみなすことができる。

相乗作用的治療効果は、単一の治療用部分もしくはＤＬＬ３ ＣＡＲ処置により引き出される治療効果または所与の組合せのＤＬＬ３ ＣＡＲ処置もしくは単一の治療用部分により引き出される治療効果の総和の少なくとも約２倍大きい効果の場合もありまたは少なくとも約５倍大きいまたは少なくとも約１０倍大きいまたは少なくとも約２０倍大きいまたは少なくとも約５０倍大きいまたは少なくとも約１００倍大きい効果の場合もある。相乗作用的治療効果はまた、単一の治療用部分もしくはＤＬＬ３ ＣＡＲ処置により引き出される治療効果または所与の組合せのＤＬＬ３ ＣＡＲ処置もしくは単一の治療用部分により引き出される治療効果の総和と比較して、少なくとも１０％の治療効果の増加として観察される場合もありまたは少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％またはこれを超える治療効果の増加として観察される場合もある。相乗効果はまた、治療剤を組み合わせて使用する場合に、それらの投与の低減を可能とする効果でもある。

組合せ療法を実施するには、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置および治療用部分は、被験体へと、単一の組成物により同時に投与されてもよいまたは２つ以上の別個の組成物として、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して、同時に投与されてもよい。あるいは、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置による処置は、治療用部分による処置に、例えば、数分間から数週間の範囲の間隔で先行する場合もありまたは後続する場合もある。一実施形態では、このＣＡＲ治療用部分および抗体もしくはＡＤＣの両方は、互いから約５分間から約２週間以内に投与される。さらに他の実施形態では、抗体の投与と、上記治療用部分の投与との間に、数日間（２、３、４、５、６、または７日間）が経過する場合もあり、数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する場合もあり、数カ月間（１、２、３、４、５、６、７、または８カ月間）が経過する場合もある。

組合せ療法は、毎日１回、２回、または３回、隔日１回、３日ごとに１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回、隔月１回、３カ月ごとに１回、６カ月ごとに１回のような多様なスケジュールで、状態が処置される、緩和される、または治癒するまで投与することもでき、持続的に投与することもできる。抗体および治療用部分は、隔日または隔週で投与することもでき、ＤＬＬ３ ＣＡＲによる一連の処置を施すのに続き、さらなる治療用部分による１つ以上の処置を施すこともできる。一実施形態では、ＤＬＬ３ ＣＡＲは、１つ以上の治療用部分と組み合わせて、短い処置サイクルにわたり投与する。他の実施形態では、組合せ処置は、長い処置サイクルにわたり投与する。組合せ療法は、任意の経路を介して投与することができる。

選択された実施形態では、本発明の化合物および組成物は、ＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−Ｌ１阻害剤のようなチェックポイント阻害剤と併せて使用され得る。ＰＤ−１は、そのリガンドＰＤ−Ｌ１と共に、抗腫瘍Ｔリンパ球応答の負の調節因子である。一実施形態では、併用療法は、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ）および任意選択的に１つ以上の他の治療部分（複数可）と共に、ＤＬＬ３感作リンパ球の投与を含むことができる。別の実施形態では、併用療法は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）および任意選択的に１つ以上の他の治療部分（複数可）と共に、ＤＬＬ３感作リンパ球の投与を含むことができる。さらに別の実施形態では、併用療法は、チェックポイント阻害剤および／またはターゲティングＢＲＡＦ併用療法（例えば、イピリムマブおよびベムラフェニブまたはダブラフェニブ（ｄａｂｒａｆｉｎｉｂ））による処置後に進行を続ける患者に投与される、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１と共に、ＤＬＬ３感作リンパ球の投与を含むことができる。

一部の実施形態では、感作リンパ球は、種々の第一選択がん処置と組み合わせて使用され得る。一実施形態では、併用療法は、本発明の組成物、ならびにイホスファミド、マイトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ、ビンデシン、ビンブラスチン、エトポシド、イリノテカン（ｉｒｏｎｉｔｅｃａｎ）、ゲムシタビン、タキサン、ビノレルビン、メトトレキセートおよびペメトレキセド）のような細胞傷害性薬剤ならびに任意選択的に１つ以上の他の治療部分（複数可）の使用を含む。

別の実施形態では、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置および白金ベースの薬物（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）および任意選択的に１つ以上の他の治療用部分（例えば、ビノレルビン；ゲムシタビン；例えば、ドセタキセルまたはパクリタキセルのようなタキサン；イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｉｃａｎ）；またはペメトレキセド）の使用を含む。

一実施形態では、例えば、ＢＲ−ＥＲＰＲ、ＢＲ−ＥＲまたはＢＲ−ＰＲがんの処置において、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置および「ホルモン療法」として記載された１つ以上の治療部分の使用を含む。本明細書で使用された「ホルモン療法」とは、例えば、タモキシフェン；ゴナドトロピンまたは黄体形成放出ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）（ＧｎＲＨまたはＬＨＲＨ）；エベロリムスおよびエキセメスタン；トレミフェン；またはアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタンまたはフルベストラント）を指す。

別の実施形態では、例えば、ＢＲ−ＨＥＲ２の処置において、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびトラスツズマブまたはアドゥ−トラスツズマブエムタンシンおよび任意選択的に１つ以上の他の治療部分（例えば、ペルツズマブおよび／またはドセタキセル）の使用を含む。

一部の実施形態では、例えば、転移性乳がんの処置において、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびタキサン（例えば、ドセタキセルまたはパクリタキセル）および任意選択的に追加の治療部分、例えば、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシンまたはエピルビシン）および／またはエリブリンの使用を含む。

別の実施形態では、例えば、転移性乳がんもしくは再発性乳がんまたはＢＲＣＡ変異乳がんの処置において、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびメゲストロールおよび任意選択的に追加の治療部分の使用を含む。

さらなる実施形態では、例えば、ＢＲ−ＴＮＢＣの処置において、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（例えば、ＢＭＮ−６７３、オラパリブ、ラキャパリブ（ｒｕｃａｐａｒｉｂ）およびベリパリブ）および任意選択的に追加の治療部分の使用を含む。

別の実施形態では、例えば、乳がんの処置において、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびシクロホスファミドおよび任意選択的に追加の治療部分（例えば、ドキソルビシン、タキサン、エピルビシン、５−ＦＵおよび／またはメトトレキサートの使用を含む。

別の実施形態では、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣを処置するための組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびアファチニブおよび任意選択的に１つ以上の他の治療用部分（例えば、エルロチニブおよび／またはベバシズマブ）の使用を含む。

別の実施形態では、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣを処置するための組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびエルロチニブおよび任意選択的に１つ以上の他の治療用部分（例えば、ベバシズマブ）の使用を含む。

別の実施形態では、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣを処置するための組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびセリチニブおよび任意選択的に１つ以上の他の治療用部分の使用を含む。

別の実施形態では、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣを処置するための組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびクリゾチニブおよび任意選択的に１つ以上の他の治療用部分の使用を含む。

別の実施形態では、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびベバシズマブおよび任意選択的に１つ以上の他の治療用部分（例えば、例えばドセタキセルもしくはパクリタキセルのようなタキサン；および／または白金類似体）の使用を含む。

別の実施形態では、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびベバシズマブおよび任意選択的に１つ以上の他の治療用部分（例えば、ゲムシタビンおよび／または白金類似体）の使用を含む。

一実施形態では、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置および白金ベースの薬物（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）類似体および任意選択的に１つ以上の他の治療用部分（例えば、例えばドセタキセルおよびパクリタキセルのようなタキサン）の使用を含む。

一実施形態では、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置および白金ベースの薬物（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）類似体および任意選択的に１つ以上の他の治療用部分（例えば、例えばドセタキセルおよびパクリタキセルのようなタキサンならびに／またはゲムシタビンおよび／もしくはドキソルビシン）の使用を含む。

特定の実施形態では、白金抵抗性腫瘍を処置するための組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置ならびにドキソルビシンおよび／またはエトポシドおよび／またはゲムシタビンおよび／またはビノレルビンおよび／またはイホスファミドおよび／またはロイコボリン調整（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）５−フルオロウラシルおよび／またはベバシズマブおよび／またはタモキシフェンならびに任意選択的に１つ以上の他の治療用部分の使用を含む。

別の実施形態では、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびＰＡＲＰ阻害剤および任意選択的に１つ以上の他の治療用部分の使用を含む。

別の実施形態では、組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置およびベバシズマブおよび任意選択的にシクロホスファミドの使用を含む。

組合せ療法は、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置および変異遺伝子もしくは異常発現遺伝子または変異タンパク質もしくは異常発現タンパク質（例えば、ＢＲＣＡ１）を含む腫瘍に対して有効である化学療法部分を含んでもよい。

より一般には、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲ処置は、複数の抗がん剤と組み合わせて使用されてもよい。本明細書で使用される「抗がん剤」または「化学療法剤」という用語は、「治療用部分」の１つのサブセットであり、「治療用部分」とは、「医薬としての活性部分」として記載される薬剤のサブセットである。より特定すると、「抗がん剤」とは、がんなどの細胞増殖性障害を処置するのに使用しうる任意の薬剤を意味し、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、ターゲティング抗がん剤、生物学的応答調節物質、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤、および免疫療法剤を含むがこれらに限定されない。上記で論じた、選択された実施形態では、このような抗がん剤は、抗体薬物コンジュゲートを含むことが可能であり、投与の前に抗体と会合させうることが十分に理解される。

また、抗がん剤でもありうる「細胞傷害剤」という用語は、細胞に対して毒性であり、細胞の機能を低下させるもしくは阻害し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。その物質は、生物に由来する天然に存在する分子（または合成により調製される天然生成物）であることが典型的である。細胞傷害剤の例は、細菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属内毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、アブリン、リシン、モデクシン、ビスクミン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、オオムギ毒素、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａによる阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓによる阻害剤、ミトゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン）、または動物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、それらの断片および／または変異体を含む、細胞外膵臓ＲＮアーゼのような細胞傷害性ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ）を含むがこれらに限定されない。

抗がん剤は、がん性細胞、またはがん性となる可能性がある細胞もしくは腫瘍形成性の後代を発生させる可能性がある細胞（例えば、腫瘍形成性細胞）を阻害する、または阻害するようにデザインされた、任意の化学的薬剤を含みうる。このような化学的薬剤は、細胞成長または細胞分裂に必要な細胞内プロセスを対象とすることが多く、したがって、一般に成長および分裂が迅速ながん性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合化し、これにより、細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。このような薬剤は、組合せで、例えば、ＣＨＯＰ製剤において投与されることが多く、最も有効であることが多い。

本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲ処置と組み合わせて使用しうる抗がん剤の例は、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アナストロゾール、アマニチン、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、アセトゲニン、カンプトテシン、ＢＥＺ−２３５、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、セリチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エレウテロビン、エルロチニブ、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジインであるジネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カンホスファミド、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、イダルビシン、ラパチニブ、レトロゾール、ロナファルニブ、マルセロマイシン、酢酸メゲストロール、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、パゾパニブ、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ラパマイシン、ロドルビシン、ソラフェニブ、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タモキシフェンクエン酸塩、テモゾロミド、テパディナ（ｔｅｐｏｄｉｎａ）、チピファルニブ、ツベルシジン、ウベニメクス、バンデタニブ、ボロゾール、ＸＬ−１４７、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、フロリン酸のような葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、多糖複合体、ラゾキサン；リゾキシン；ＳＦ−１１２６、シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン、トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＸＬ５１８、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤であって、細胞増殖を低減する阻害剤、ならびに上記のうちのいずれかの医薬として許容される塩もしくは溶媒和物、酸、または誘導体を含むがこれらに限定されない。この定義にはまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤であって、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体抗体、副腎におけるエストロゲンの産生を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、ならびに抗アンドロゲン剤などの抗ホルモン剤のほか；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤のようなリボザイム；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン、およびエスペラミシン、ならびに上記のうちのいずれかの医薬として許容される塩もしくは溶媒和物、酸、または誘導体も含まれる。

特に好ましい抗がん剤は、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号：５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号：３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号：１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号：４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号：８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））のような、市販の化合物または臨床で利用可能な化合物を含む。さらなる市販の抗がん剤、または臨床で利用可能なさらなる抗がん剤は、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロイコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、ロナファルニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、チピファルニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有）、アルブミンで操作されたパクリタキセルのナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｍｂｕｃｉｌ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンホスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ、およびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；カペシタビン（ＸＥＲＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（タモキシフェンクエン酸塩であるＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）を含む）、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（トレミフェンクエン酸塩）ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含む。

「医薬として許容される塩」または「塩」という用語は、分子または高分子の有機塩または無機塩を意味する。酸付加塩は、アミノ基と共に形成されうる。例示的な塩は、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩（ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレンビス−（２−ヒドロキシ３−ナフトエート））を含むがこれらに限定されない。医薬として許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン、または他の対イオンのような、別の分子の包接を伴いうる。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化する、任意の有機部分または無機部分でありうる。さらに、医薬として許容される塩は、その構造内に１つを超える帯電原子を有しうる。複数の帯電原子が、医薬として許容される塩の部分である場合、塩は、複数の対イオンを有しうる。よって、医薬として許容される塩は、１つ以上の帯電原子および／または１つ以上の対イオンを有しうる。

「医薬として許容される溶媒和物」または「溶媒和物」とは、１つ以上の溶媒分子と、分子または高分子との会合を指す。医薬として許容される溶媒和物を形成する溶媒の例は、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、およびエタノールアミンを含むがこれらに限定されない。

他の実施形態では、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲ処置を、現在臨床試験中であるまたは市販されている、多数の抗体（または免疫療法剤）のうちのいずれか１つと組み合わせて使用することができる。開示された抗体は、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、アテゾリゾズマブ、アベルマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シキスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、ズリゴツマブ、デュシギツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デュルバルマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オラパリブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムブロリズマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、セルメチニブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、ＭＤＸ−１１０５およびこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用されてもよい。

他の特に好ましい実施形態は、がん治療について承認された抗体であって、リツキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パチツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ、およびブレンツキシマブベドチンを含むがこれらに限定されない抗体を有する開示された組成物の使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合性のさらなる抗がん剤をたやすく同定することが可能である。

本発明はまた、ＤＬＬ３ ＣＡＲ処置の、放射線療法（すなわち、ＤＮＡ損傷を腫瘍細胞内に局所的に誘導するための任意の機構であって、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放射などのような機構）との組合せも提供する。また、放射性同位元素の、腫瘍細胞への指向性送達を使用する組合せ療法も想定され、開示されたＤＬＬ３ ＣＡＲ処置は、標的化抗がん剤または他のターゲティング手段との関連で使用されてもよい。放射線療法は、パルスで、約１−約２週間の期間にわたり投与することが典型的である。放射線療法は、頭頸部がんを有する被験体には、約６−７週間にわたり投与することができる。任意選択的に、放射線療法は、単回投与として投与することもでき、複数回にわたる逐次投与として投与することもできる。

Ｘ．診断
本発明は、任意のリンパ球形質導入の有効性または腫瘍形成性細胞を含む腫瘍細胞に対する任意のＤＬＬ３感作リンパ球の効果を検出、診断またはモニタリングするためのインビトロおよびインビボでの方法を提供する。このような方法は、ＤＬＬ３感作リンパ球による処置の前、間または後に本明細書で記載された抗体を有する患者または患者から得られた試料（インビボまたはインビトロのいずれかで）を調べるステップおよび試料中の抗体と結合した標的分子または遊離標的分子の存在もしくは非存在またはこれらの会合のレベルを検出するステップを含む、がんの進行を処置またはモニタリングするためのがん（例えば、ＤＬＬ３陽性腫瘍）を有する個体を同定するステップを含む。一部の実施形態では、ＤＬＬ３抗体は本明細書で記載された検出可能な標識またはレポーター分子を含む。さらに他の実施形態（例えば、インサイチュハイブリダイゼーションまたはＩＳＨ）では、ゲノムＤＬＬ３決定基と反応する核酸プローブは、増殖性障害の検出、診断またはモニタリングにおいて使用される。

より一般に、ＤＬＬ３決定基の存在および／またはレベルは、タンパク質分析または核酸分析、例えば、直接物理学的測定（例えば、質量分析）、結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ、凝集アッセイおよび免疫クロマトグラフィーアッセイ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ；ＲＴ−ｑＰＣＲ）技法、分枝オリゴヌクレオチド技法、ノーザンブロット技法、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技法およびインサイチュハイブリダイゼーション技法に関する当業者に利用可能な複数の技法のうちのいずれかを使用して測定され得る。方法はまた、化学反応から生じるシグナル、例えば、光学的吸光度の変化、蛍光の変化、化学発光または電気化学発光の発生、反射率、屈折率または光散乱の変化、表面からの検出可能な標識の蓄積または放出、酸化種または還元種または酸化還元種、電流または電位、磁場の変化などを測定するステップを含んでもよい。適切な検出技法は、標識した結合試薬のフォトルミネセンス（例えば、蛍光、時間分解蛍光、エバネセント波蛍光、アップコンバートした蛍光体、多光子蛍光などの測定による）、化学発光、電気化学発光、光散乱、光学的吸光度、放射能、磁場、酵素活性（例えば、光学的吸光度もしくは蛍光の変化を引き起こすまたは化学発光の発光を引き起こす酵素反応を介して酵素活性を測定することによる）による標識の測定を介してこれらの標識した結合試薬の関与を測定することによって結合事象を検出できる。あるいは、標識の使用を必要としない検出技法、例えば、検体の質量の測定（例えば、表面弾性波測定）、屈折率の測定（例えば、表面プラズモン共鳴測定）または固有の発光の測定に基づいた技法が使用されてもよい。

一部の実施形態では、試料中での検出剤の特定の細胞または細胞構成要素との会合は、試料が腫瘍形成性細胞を含有する可能性があることを示し、これによりがんを有する個体が本明細書で記載された組成物により効果的に処置され得ることが表される。

ある特定の好ましい実施形態では、アッセイは、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイもしくはこの改変（例えば、蛍光、発色、標準ＡＢＣ、標準ＬＳＡＢなど）、免疫細胞化学もしくはこの改変（例えば、直接、間接、蛍光、発色など）またはインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）もしくはこの改変（例えば、発色インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）または蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＤＮＡ−ＦＩＳＨまたはＲＮＡ−ＦＩＳＨ］））を含んでもよい。

これに関して、本発明のある特定の態様は、免疫組織化学（ＩＨＣ）について標識されたＤＬＬ３の使用を含む。より特に、ＤＬＬ３ ＩＨＣは、多様な増殖性障害の診断の一助となり、ＤＬＬ３抗体療法を含む処置に対して起こり得る反応をモニタリングするための診断手段として使用されてもよい。本明細書に論じられ、下記の実施例に示されている通り、適合性の診断アッセイは、化学的に固定されている（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、酢酸、アルコール、亜鉛塩、塩化第二水銀、四酸化クロムおよびピクリン酸を含むが、これらに限定されない）、埋め込まれている（メタクリル酸グリコール、パラフィンおよび樹脂を含むが、これらに限定されない）または凍結により保存されている組織上で実施されてもよい。このようなアッセイは、処置の決定を誘導し、投与レジメンおよび投与時期を決定するために使用されてもよい。

本発明の他の特に適合性の態様は、ＤＬＬ３決定基を検出またはモニタリングするためにインサイチュハイブリダイゼーションの使用を含む。インサイチュハイブリダイゼーション技法またはＩＳＨは当業者に周知である。略述すると、細胞は固定され、特定のヌクレオチド配列を含有する検出可能なプローブが固定細胞に加えられる。細胞が相補的ヌクレオチド配列を含有する場合、検出され得るプローブはこれらとハイブリダイズする。本明細書で示された配列情報を使用して、プローブは遺伝子型ＤＬＬ３決定基を発現する細胞を同定するために設計され得る。プローブは、好ましくは、このような決定基に対応するヌクレオチド配列とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は、不完全な相補的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンドシグナルを最小化するように慣例的に最適化されてもよいが、好ましくは、プローブは、好ましくは、選択されたＤＬＬ３決定基と完全に相補的である。選択された実施形態では、プローブは、標準的な蛍光法によって容易に検出可能であるプローブに結合した蛍光色素により標識される。

適合性のインビボにおける治療診断アッセイまたは診断アッセイは、当業者により公知である、磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影（例えば、ＣＡＴスキャン）、ポジトロン断層撮影（例えば、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影、超音波などのような当技術分野で認知されたイメージング技法またはモニタリング技法を含んでもよい。

特に好ましい実施形態では、本明細書で開示された抗体は、患者試料（例えば、血漿または血液）中の特定の決定基（例えば、ＤＬＬ３）のレベルを検出し、定量するために使用されてもよく、次にこれらの患者試料は、ＤＬＬ３感作リンパ球による処置の前および後の両方に増殖性障害を検出、診断またはモニタリングするために使用されてもよい。関連する実施形態では、本明細書で開示された抗体は、ＤＬＬ３感作リンパ球による開示された処置と組み合わせてインビボまたはインビトロのいずれかで循環腫瘍細胞を検出、モニタリングおよび／または定量するために使用されてもよい（ＷＯ２０１２／０１２８８０１）。さらに他の実施形態では、循環腫瘍細胞は腫瘍形成性細胞を含んでもよい。

本発明のある特定の実施形態では、被験体または被験体由来の試料中の腫瘍形成性細胞は、ベースラインを確立するためにＤＬＬ３ ＣＡＲ療法またはレジメン前に開示された抗体を使用して評価されてもよいまたは特徴付けられてもよい。他の実施例では、腫瘍形成性細胞は、処置した被験体に由来する試料から評価されてもよい。

ＸＩ．製品
本発明は、１つ以上の容器またはレセプタクルを含む、医薬パックおよび医薬キットをさらに含み、この場合、容器は、本発明のＤＬＬ３ ＣＡＲプラスミドまたはベクターの１回以上の形質転換用量を含んでもよい。ある特定の実施形態では、パックまたはキットは、１種以上のさらなる試薬および任意選択的に形質導入をもたらす手段を有するまたは有さない、ＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクター調製物（例えば、レンチウイルスまたはレトロウイルス）を含有する。好ましくは、キットは、投与前にＤＬＬ３感作リンパ球の調製物をモニタリングし、特徴付けるための手段をさらに含む。

ある特定の他の実施形態は、ＤＬＬ３感作リンパ球の液体製剤（分散、懸濁液または溶液）を組み込む、含有するまたは保持する容器またはレセプタクルを含む。選択された実施形態では、ＤＬＬ３感作リンパ球は、同種異系間である。他の実施形態では、ＤＬＬ３感作リンパ球は、自己宿主細胞を含む。ある特定の他の実施形態では、液体製剤は、医薬として許容される担体を含む。

選択された態様では、本発明に適合性のキットは、使用者が、ＤＬＬ３感作リンパ球を産生し、形質導入率をモニタリングし、得られたＤＬＬ３感作リンパ球集団を特徴付けて、投与前に品質を保証することを可能にする。したがって、本発明のキットは一般に、同じまたは異なる容器中にＣＡＲ核酸（またはベクター）の医薬として許容される製剤および任意選択的に１種以上の試薬を含有し得る。好ましい実施形態では、ＤＬＬ３ ＣＡＲベクターは、開示された感作リンパ球を提供するために選択された宿主細胞の形質導入を可能にするウイルスベクター（例えば、レンチウイルスまたはレトロウイルス）を含む。ある特定の実施形態では、選択された宿主細胞は自己であり、一方で他の実施形態では、選択された宿主細胞は同種である。本発明の一部の態様はＤＬＬ３ ＣＡＲベクターと共に同種細胞を含むキットを対象とする。さらに他の実施形態は、同種ＤＬＬ３感作リンパ球を含む医薬組成物を組み込んでいるキットまたは容器もしくはレセプタクルを含む。さらに他の製品は、医薬として許容される担体における自己ＤＬＬ３感作リンパ球の液体製剤を組み込むまたは保持する容器を含む。あらゆるこのようなキットでは、容器は、ＤＬＬ３感作リンパ球を患者に直接的に投与させることができる、輸液バッグ、バイアル、シリンジまたはボトルを含むことができる。

キットはまた、診断または組合せ療法のための、他の医薬として許容される製剤またはデバイスも含有しうる。診断用デバイスまたは診断用計器の例は、ＤＬＬ３感作リンパ球、形質転換効率または処置される増殖性障害と関連する細胞またはマーカーを検出、モニタリング、定量、またはプロファイリングするのに使用され得るデバイスまたは計器を含む。特に好ましい実施形態では、デバイスを使用して、インビボまたはインビトロにおいて、循環腫瘍細胞を検出、モニタリング、および／または定量することができる。さらに他の好ましい実施形態では、循環腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含みうる。

キットの選択された構成要素（例えば、ＤＬＬ３感作リンパ球）が１つ以上の溶液中に提供される場合、溶液は、非水性溶液の場合もあるが、水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キットの製剤（例えば、ウイルスベクター）はまた、適切な液体を添加すると再構成され得る、乾燥粉末または凍結乾燥形態として提供されてもよい。再構成のために使用される液体は、別個の容器内に含有されうる。このような液体は、注射用の静菌水、リン酸緩衝食塩液、リンゲル液、またはデキストロース溶液のような、滅菌の、医薬として許容される緩衝剤または他の希釈剤を含みうる。キットが、さらなる試薬と組み合わせて本発明のＣＡＲプラスミドまたはベクターを含む場合、溶液はモル等量の組合せにおいてあらかじめ混合されてもよいまたは１つの構成要素を他の構成要素に対して過剰としてあらかじめ混合されてもよい。あるいは、本発明のプラスミドおよび任意選択的による任意の共試薬は、リンパ球の形質転換前に、区別可能な容器内に、個別に維持されてもよい。他の好ましい実施形態では、キットの容器は同種ＤＬＬ３感作リンパ球の液体製剤を含んでもよい。

開示されたキットは、１個または複数個の容器と、封入された組成物が、増殖性障害の処置にまたは選択された疾患を処置するための細胞の調製に有用であることを示す、容器（複数可）の中に入れた、これに貼ったまたはこれに添えたラベルまたは添付文書を含むことができる。適切な容器またはレセプタクルは、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成することができる。容器は、滅菌アクセスポートを含みうる、例えば、容器は、静脈内注射用溶液バッグの場合もあり、皮下注射用注射針で穿刺可能な止栓を有するバイアルの場合もある。

一部の実施形態では、キットは、ＤＬＬ３感作リンパ球および任意選択的による任意の構成要素を患者に投与するための手段、例えば、１つ以上の注射針もしくはシリンジ（あらかじめ充填されるまたは空の）、点眼器、ピペットまたは他のこのような器具であって、これにより製剤が被験体へと注入もしくは導入され得るまたは身体の疾患領域へと適用され得る器具を含有してもよい。本発明のキットはまた、バイアルなどおよび他の構成要素を、市販用の密閉容器（ｃｌｏｓｅ ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）であって、例えば、ブロー成形されたプラスチック容器であり、所望のバイアルおよび他の器具を入れるプラスチック容器のような密閉容器に収納するための手段および保持される方法も含むことが典型的である。

ＸＩＩ．その他
本明細書でそうでないことが定義されない限り、本発明との関連で使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によりそうでないことが要請されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲で提示される範囲は、端点および端点の間の全ての点の両方を含む。したがって、２．０−３．０の範囲は、２．０、３．０、および２．０と３．０との間の全ての点を含む。

当技術分野では一般に、本明細書で記載される、細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、および化学の技法が周知であり、一般に使用されている。本明細書で、このような技法との関連で使用される用語法はまた、当技術分野でも一般に使用されている。そうでないことが示されない限り、本発明の方法および技法は一般に、当技術分野において周知であり、本明細書を通して引用される、多様な参考文献において記載されている、従来の方法に従い実施される。

ＸＩＩＩ．参考文献
本明細書で引用される、全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に入手可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける、ヌクレオチド配列の寄託、ならびに、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤにおけるアミノ酸配列の寄託、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける、注釈を施されたコード領域からの翻訳を、例えば、含む）についての完全な開示は、特定の参考文献との関連で「参照により組み込まれた」という語句が使用されているのかいないのかに関わらず、参照により組み込まれる。前出の詳細な記載および後続の実施例は、理解の明確さのためだけに与えられる。そこから不要な限定がなされるわけではないものと理解されたい。本発明は、示され、記載される、正確な詳細に限定されるわけではない。特許請求の範囲により定義される本発明には、当業者に明白な変化も含まれる。本明細書で使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載された主題の方法を限定するとはみなさないものとする。

ＸＩＶ．配列
本出願には、多数の核酸配列およびアミノ酸配列を含む図および配列表が添付されている。以下の表２は、含まれる配列についての概要を提示する。

下記の実施例２に論じられている通り、上記の表２はさらに、図１Ａおよび図１Ｂにおいて記述した例示的なＫａｂａｔ ＣＤＲについての配列番号を指定するために使用され得る。より特に、図１Ａおよび図１Ｂは、重鎖可変領域配列（ＣＤＲＨ）および軽鎖可変領域配列（ＣＤＲＬ）の各々の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲを示し、上記の表２は、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の各々ならびに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の各々に適用され得る配列番号指定の割り当てを提供する。この方法を使用して、図１Ａおよび図１Ｂに示される各々の固有のＣＤＲは一連の配列番号を割り当てられ得、本発明の導出抗体を提供するために使用され得る。

ＸＶ．腫瘍リスト
ＰＤＸ腫瘍細胞型は、略号に続く数で表示され、特定の腫瘍細胞株を指し示す。被験試料の継代数は、試料表示に添付されるｐ０−ｐ＃［表示中、ｐ０は、患者の腫瘍から直接得られた非継代試料を示し、ｐ＃は、試験の前に腫瘍をマウスを通して継代した回数を示す］で指し示す。本明細書で使用される、腫瘍型および亜型の略号は、以下の表３に示す。

このように一般的に記載された本発明は、例示を目的として提示されるものであり、本発明を限定することを意図されるものではない、以下の実施例を参照することにより、よりたやすく理解される。実施例は、下記の実験が、実施される全ての実験または唯一の実験であることを表すように意図されるものではない。そうでないことが指し示されない限りにおいて、部分は、重量による部分であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧または大気圧近傍の圧力である。

［実施例１］
マウス抗ＤＬＬ３抗体の生成
抗ＤＬＬ３マウス抗体を次の通りに産生した。第１の免疫化キャンペーンにおいて、３匹のマウス（次の系統のそれぞれから１匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に、等容量のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）または明礬アジュバントにより乳化したヒトＤＬＬ３−ｆｃタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ）を接種した。ｈＤＬＬ３−Ｆｃ融合構築物は、Ａｄｉｐｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した（カタログ番号ＡＧ−４０Ａ−０１１３）。初回免疫化は、ＴｉｔｅｒＭａｘにおけるマウス１匹当たり１０μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃのエマルションにより行った。次に、明礬アジュバントにおけるマウス１匹当たり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃにより隔週でマウスを追加免疫した。融合に先立つ最終注射は、ＰＢＳにおけるマウス１匹当たり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃにより行った。

第２の免疫化キャンペーンにおいて、６匹のマウス（次の系統のそれぞれにつき２匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に、等容量のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）または明礬アジュバントにより乳化したヒトＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ）を接種した。組換えｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質は、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓを過剰発現するように操作されたＣＨＯ−Ｓ細胞の上清から精製された。初回免疫化は、ＴｉｔｅｒＭａｘにおけるマウス１匹につき１０μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓのエマルションにより行った。次に、明礬アジュバントにおけるマウス１匹につき５μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓにより隔週でマウスを追加免疫した。最終注射は、ｈＤＬＬ３を過剰発現するように操作された２×１０^５個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞により行った。

固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトＤＬＬ３に特異的なマウスＩｇＧ抗体に関してマウス血清をスクリーニングした。バックグラウンドを上回る陽性シグナルは、ＤＬＬ３に特異的な抗体を示した。簡潔に説明すると、９６ウェルプレート（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号６１０７４４）を、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液における０．５μｇ／ｍｌの組換えＤＬＬ３−Ｈｉｓで一晩コーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳによる洗浄後に、２００μＬ／ウェルのＰＢＳに溶解した３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで、ウェルを１時間室温（ＲＴ）にてブロッキングした。マウス血清を滴定（１：１００、１：２００、１：４００および１：８００）し、５０μＬ／ウェルにて、ＤＬＬ３コーティングしたプレートに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、続いて３％ＢＳＡ−ＰＢＳまたはＰＢＳ中の２％ＦＣＳに１：１０，０００希釈した５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧと共に１時間ＲＴでインキュベートした。再度プレートを洗浄し、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３４０２８）を１５分間ＲＴで添加した。発色後に、等容量の２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加して、基質発色を停止させ、分光光度計によってＯＤ４５０でプレートを解析した。

血清陽性免疫化マウスを屠殺し、流入領域リンパ節（膝窩、鼠径部および内側腸骨）を解剖し、抗体産生細胞の供給源として使用した。モデルＢＴＸ Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用した電気細胞融合によって、Ｂ細胞（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫化マウスからおよそ２２９×１０^６個の細胞およびｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫化マウスから５１０×１０^６個の細胞）の細胞懸濁液を、非分泌型Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と１：１の比で融合させた。アザセリン、１５％胎仔クローンＩ血清、１０％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵペニシリン−ストレプトマイシンおよび５０μＭ ２−メルカプトエタノールを補充したＤＭＥＭ培地からなるハイブリドーマ選択培地に細胞を再懸濁し、４個のＴ２２５フラスコ内で、フラスコ１個当たり１００ｍＬの選択培地において培養した。５％ＣＯ_２および９５％空気を含有する加湿３７℃インキュベーター内にフラスコを６から７日間置いた。

融合後６または７日目に、ハイブリドーマライブラリー細胞をフラスコから収集し、２００μＬの補充済みハイブリドーマ選択培地（上述の通り。）においてウェル当たり１個の細胞となるよう（ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｉ細胞選別機を使用して。）、６４枚のＦａｌｃｏｎ ９６ウェルプレートに蒔き、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫化キャンペーンに関しては４８枚の９６ウェルプレートにまいた。ライブラリーの残りは液体窒素中に貯蔵した。

ハイブリドーマを１０日間培養し、次の通りにフローサイトメトリーを使用して、ｈＤＬＬ３に特異的な抗体に関して上清をスクリーニングした。ヒトＤＬＬ３、マウスＤＬＬ３（色素で予め染色）またはカニクイザルＤＬＬ３（Ｄｙｌｉｇｈｔ８００で予め染色）を過剰発現するように操作された、ウェル当たり１×１０^５個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、２５μＬハイブリドーマ上清と共に３０分間インキュベートした。ＰＢＳ／２％ＦＣＳで細胞を洗浄し、続いてＰＢＳ／２％ＦＣＳに１：３００希釈した試料当たり２５μＬのＤｙｅＬｉｇｈｔ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次と共にインキュベートした。１５分間のインキュベーション後に、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩ入りのＰＢＳ／２％ＦＣＳに再懸濁し、アイソタイプ対照抗体で染色した細胞の蛍光を超える蛍光に関してフローサイトメトリーによって解析した。残る未使用のハイブリドーマライブラリー細胞を、将来のライブラリー検査およびスクリーニングのために液体窒素中に凍結した。

ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫化キャンペーンは、およそ５０種のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体を生じ、ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫化キャンペーンは、およそ９０種のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体を生じた。

［実施例２］
抗ＤＬＬ３抗体の配列決定
前述に基づき、見かけ上高アフィニティーで、固定化されたヒトＤＬＬ３またはｈ２９３−ｈＤＬＬ３細胞に結合する多数の例示的な別個のモノクローナル抗体を、配列決定およびさらなる解析のために選択した。実施例１において生成された選択されたモノクローナル抗体由来の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列解析は、その多くが、新規の相補性決定領域を有し、多くの場合、新規のＶＤＪ配置を表示したことを確認した。

所望の抗体を発現する最初に選択されたハイブリドーマ細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解して、抗体をコードするＲＮＡを調製した。１０^４から１０^５個の間の細胞を１ｍＬのＴｒｉｚｏｌに再懸濁し、２００μＬのクロロホルムを添加した後に激しく振盪した。次に、試料を４℃で１０分間遠心分離し、水相を新しい微量遠心チューブに移し、等容量の７０％エタノールを添加した。試料を、２ｍＬ収集チューブ内に置いたＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムにロードし、製造業者の指示書に従って処理した。全ＲＮＡを、１００μＬのＲＮａｓｅ不含水により直接スピンカラム膜から溶出することによって抽出した。使用まで−８０℃で貯蔵する前に、１％アガロースゲルで３μＬを分画することにより、ＲＮＡ調製物の品質を決定した。

全マウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーと組み合わせた、完全マウスＶＨレパートリーをターゲティングするように設計された３２種のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む５’プライマーミックスを使用して、各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を増幅した。同様に、カッパ軽鎖を増幅し配列決定するために、Ｖκマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計された３２種の５’Ｖκリーダー配列を含有するプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に特異的な単一リバースプライマーと組み合わせて使用した。ラムダ軽鎖を含有する抗体のため、マウスラムダ定常領域に特異的な１種のリバースプライマーと組み合わせた３種の５’ＶＬリーダー配列を使用して増幅を行った。次の通りにＱｉａｇｅｎ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して、１００ｎｇの全ＲＮＡからＶＨおよびＶＬ転写物を増幅した。ハイブリドーマ毎に総計８回のＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、うち４回はＶκ軽鎖、４回はＶγ重鎖について行った。ＰＣＲ反応混合物は、３μＬのＲＮＡ、０．５μＬの１００μＭの重鎖またはカッパ軽鎖いずれかのプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄａｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりカスタム合成）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１μＬのｄＮＴＰ、１μＬの逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含有する酵素ミックスならびに０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１ユニット）を含んだ。サーマルサイクラープログラムは、ＲＴステップの５０℃で３０分間、９５℃で１５分間と、続く３０サイクルの（９５℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で１分間）であった。続いて、７２℃で１０分間の最終インキュベーションを行った。

可変領域の増幅のための上述の通りの同じ特異的可変領域プライマーを使用して、抽出されたＰＣＲ産物を配列決定した。直接的ＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ産物を調製するために、製造業者のプロトコールに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ産物を精製した。５０μＬの滅菌水を使用してスピンカラムからＤＮＡを溶出させ、続いて両方の鎖から直接的に配列決定した（ＭＣＬＡＢ）。

ＩＭＧＴ配列解析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用して、選択されたヌクレオチド配列を解析して、最高の配列相同性を有する生殖系列Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子メンバーを同定した。専用の抗体配列データベースを使用したマウス生殖系列データベースに対するＶＨおよびＶＬ遺伝子の整列によって、これらの派生した配列を、Ｉｇ ＶおよびＪ領域の公知生殖系列ＤＮＡ配列と比較した。

図１Ａは、抗ＤＬＬ３抗体由来の多数の新規のマウス軽鎖可変領域、および代表的なマウス抗ＤＬＬ３抗体の可変軽鎖に由来する例示的なヒト化軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を描写する（後述する実施例３の通り。）。図１Ｂは、同じ抗ＤＬＬ３抗体由来の新規のマウス重鎖可変領域、およびヒト化軽鎖を提供する同じマウス抗体に由来するヒト化重鎖可変領域の連続アミノ酸配列を描写する（後述する実施例３の通り。）。マウス軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２１−３８７、奇数に提示されているが、ヒト化軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号３８９−４０７、奇数に提示されている。

よって、まとめると、図１Ａおよび図１Ｂは、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１６．５、ＳＣ１６．７、ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２１、ＳＣ１６．２２、ＳＣ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２９、ＳＣ１６．３０、ＳＣ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３６、ＳＣ１６．３８、ＳＣ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４７、ＳＣ１６．４９、ＳＣ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５６、ＳＣ１６．５７、ＳＣ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６３、ＳＣ１６．６５、ＳＣ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７３、ＳＣ１６．７８、ＳＣ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８４、ＳＣ１６．８８、ＳＣ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１６．１０５、ＳＣ１６．１０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０９、ＳＣ１６．１１０、ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ１６．１１５、ＳＣ１６．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１２０、ＳＣ１６．１２１、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、ＳＣ１６．１２５、ＳＣ１６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．１３１、ＳＣ１６．１３２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、ＳＣ１６．１３６、ＳＣ１６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６．１４０、ＳＣ１６．１４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４、ＳＣ１６．１４７、ＳＣ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９およびＳＣ１６．１５０と命名された多数のマウス抗ＤＬＬ３結合性またはターゲティングドメイン、ならびにｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４およびｈＳＣ１６．５６と命名されたヒト化抗体の注釈を施された配列を提示する。

本発明の特定の態様では、ＣＡＲ結合性ドメインは、ｈＤＬＬ３に特異的に結合し、配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）および配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；または配列番号２５のＶＬおよび配列番号２７のＶＨ；または配列番号２９のＶＬおよび配列番号３１のＶＨ；または配列番号３３のＶＬおよび配列番号３５のＶＨ；または配列番号３７のＶＬおよび配列番号３９のＶＨ；または配列番号４１のＶＬおよび配列番号４３のＶＨ；または配列番号４５のＶＬおよび配列番号４７のＶＨ；または配列番号４９のＶＬおよび配列番号５１のＶＨ；または配列番号５３のＶＬおよび配列番号５５のＶＨ；または配列番号５７のＶＬおよび配列番号５９のＶＨ；または配列番号６１のＶＬおよび配列番号６３のＶＨ；または配列番号６５のＶＬおよび配列番号６７のＶＨ；または配列番号６９のＶＬおよび配列番号７１のＶＨ；または配列番号７３のＶＬおよび配列番号７５のＶＨ；または配列番号７７のＶＬおよび配列番号７９のＶＨ；または配列番号８１のＶＬおよび配列番号８３のＶＨ；または配列番号８５のＶＬおよび配列番号８７のＶＨ；または配列番号８９のＶＬおよび配列番号９１のＶＨ；または配列番号９３のＶＬおよび配列番号９５のＶＨ；または配列番号９７のＶＬおよび配列番号９９のＶＨ；または配列番号１０１のＶＬおよび配列番号１０３のＶＨ；または配列番号１０５のＶＬおよび配列番号１０７のＶＨ；または配列番号１０９のＶＬおよび配列番号１１１のＶＨ；または配列番号１１３のＶＬおよび配列番号１１５のＶＨ；または配列番号１１７のＶＬおよび配列番号１１９のＶＨ；または配列番号１２１のＶＬおよび配列番号１２３のＶＨ；または配列番号１２５のＶＬおよび配列番号１２７のＶＨ；または配列番号１２９のＶＬおよび配列番号１３１のＶＨ；または配列番号１３３のＶＬおよび配列番号１３５のＶＨ；または配列番号１３７のＶＬおよび配列番号１３９のＶＨ；または配列番号１４１のＶＬおよび配列番号１４３のＶＨ；または配列番号１４５のＶＬおよび配列番号１４７のＶＨ；または配列番号１４９のＶＬおよび配列番号１５１のＶＨ；または配列番号１５３のＶＬおよび配列番号１５５のＶＨ；または配列番号１５７のＶＬおよび配列番号１５９のＶＨ；または配列番号１６１のＶＬおよび配列番号１６３のＶＨ；または配列番号１６５のＶＬおよび配列番号１６７のＶＨ；または配列番号１６９のＶＬおよび配列番号１７１のＶＨ；または配列番号１７３のＶＬおよび配列番号１７５のＶＨ；または配列番号１７７のＶＬおよび配列番号１７９のＶＨ；または配列番号１８１のＶＬおよび配列番号１８３のＶＨ；または配列番号１８５のＶＬおよび配列番号１８７のＶＨ；または配列番号１８９のＶＬおよび配列番号１９１のＶＨ；または配列番号１９３のＶＬおよび配列番号１９５のＶＨ；または配列番号１９７のＶＬおよび配列番号１９９のＶＨ；または配列番号２０１のＶＬおよび配列番号２０３のＶＨ；または配列番号２０５のＶＬおよび配列番号２０７のＶＨ；または配列番号２０９のＶＬおよび配列番号２１１のＶＨ；または配列番号２１３のＶＬおよび配列番号２１５のＶＨ；または配列番号２１７のＶＬおよび配列番号２１９のＶＨ；または配列番号２２１のＶＬおよび配列番号２２３のＶＨ；または配列番号２２５のＶＬおよび配列番号２２７のＶＨ；または配列番号２２９のＶＬおよび配列番号２３１のＶＨ；または配列番号２３３のＶＬおよび配列番号２３５のＶＨ；または配列番号２３７のＶＬおよび配列番号２３９のＶＨ；または配列番号２４１のＶＬおよび配列番号２４３のＶＨ；または配列番号２４５のＶＬおよび配列番号２４７のＶＨ；または配列番号２４９のＶＬおよび配列番号２５１のＶＨ；または配列番号２５３のＶＬおよび配列番号２５５のＶＨ；または配列番号２５７のＶＬおよび配列番号２５９のＶＨ；または配列番号２６１のＶＬおよび配列番号２６３のＶＨ；または配列番号２６５のＶＬおよび配列番号２６７のＶＨ；または配列番号２６９のＶＬおよび配列番号２７１のＶＨ；または配列番号２７３のＶＬおよび配列番号２７５のＶＨ；または配列番号２７７のＶＬおよび配列番号２７９のＶＨ；または配列番号２８１のＶＬおよび配列番号２８３のＶＨ；または配列番号２８５のＶＬおよび配列番号２８７のＶＨ；または配列番号２８９のＶＬおよび配列番号２９１のＶＨ；または配列番号２９３のＶＬおよび配列番号２９５のＶＨ；または配列番号２９７のＶＬおよび配列番号２９９のＶＨ；または配列番号３０１のＶＬおよび配列番号３０３のＶＨ；または配列番号３０５のＶＬおよび配列番号３０７のＶＨ；または配列番号３０９のＶＬおよび配列番号３１１のＶＨ；または配列番号３１３のＶＬおよび配列番号３１５のＶＨ；または配列番号３１７のＶＬおよび配列番号３１９のＶＨ；または配列番号３２１のＶＬおよび配列番号３２３のＶＨ；または配列番号３２５のＶＬおよび配列番号３２７のＶＨ；または配列番号３２９のＶＬおよび配列番号３３１のＶＨ；または配列番号３３３のＶＬおよび配列番号３３５のＶＨ；または配列番号３３７のＶＬおよび配列番号３３９のＶＨ；または配列番号３４１のＶＬおよび配列番号３４３のＶＨ；または配列番号３４５のＶＬおよび配列番号３４７のＶＨ；または配列番号３４９のＶＬおよび配列番号３５１のＶＨ；または配列番号３５３のＶＬおよび配列番号３５５のＶＨ；または配列番号３５７のＶＬおよび配列番号３５９のＶＨ；または配列番号３６１のＶＬおよび配列番号３６３のＶＨ；または配列番号３６５のＶＬおよび配列番号３６７のＶＨ；または配列番号３６９のＶＬおよび配列番号３７１のＶＨ；または配列番号３７３のＶＬおよび配列番号３７５のＶＨ；または配列番号３７７のＶＬおよび配列番号３７９のＶＨ；または配列番号３８１のＶＬおよび配列番号３８３のＶＨ；または配列番号３８５のＶＬおよび配列番号３８７のＶＨ；または配列番号３８９のＶＬおよび配列番号３９１のＶＨ；または配列番号３９３のＶＬおよび配列番号３９５のＶＨ；または配列番号３９７のＶＬおよび配列番号３９９のＶＨ；または配列番号４０１のＶＬおよび配列番号４０３のＶＨ；または配列番号４０５のＶＬおよび配列番号４０７のＶＨを含む抗体に由来する、それを含む、またはそれと結合について競合する。

本願の目的のため、各特定の抗体の配列番号は、連続した奇数である。よって、モノクローナル抗ＤＬＬ３抗体のＳＣ１６．３は、それぞれ軽鎖および重鎖可変領域に関してアミノ酸配列番号２１および２３を含む；ＳＣ１６．４は、配列番号２５および２７を含む；ＳＣ１６．５は、配列番号２９および３１を含む、等々。各抗体アミノ酸配列をコードする対応する核酸配列は、添付の配列表に含まれ、対応するアミノ酸配列番号の直前の配列番号を有する。よって、例えば、ＳＣ１６．３抗体のＶＬおよびＶＨの配列番号は、それぞれ２１および２３であり、ＳＣ１６．３抗体のＶＬおよびＶＨをコードする核酸配列の配列番号は、それぞれ配列番号２０および２２である。

配列決定の際の異常により、ある特定の重鎖および軽鎖可変領域配列が、配列決定プロセスにおいて中途でトランケートされたことに留意されたい。これは、報告されたＦＲ４配列における１つ以上のアミノ酸の省略をもたらした。このような場合、適合性のアミノ酸（他の抗体クローン由来の対応する配列の審査によって決定）が供給されて、可変領域配列を基本的に完了した。例えば、残基「ＩＫ」を、図１ＡにおけるＳＣ１６．２２軽鎖配列（配列番号７３）の末端に付加して、完全フレームワーク４を有する操作可能な軽鎖可変領域を提供した。付加されたアミノ酸をコードする塩基を、対応する核酸配列（配列番号７２）に同様に付加して、一貫性を確実にした。図１Ａおよび図１Ｂ中のこのような場合のそれぞれにおいて（添付の配列表は除く。）、容易に同定することができるように、付加されたアミノ酸に下線を引き太字にする。図１Ａおよび図１ＢのＣＤＲは、所有権のあるバージョンのＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、Ｋａｂａｔら（上記参照）の通りに定義されている。

［実施例３］
キメラおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の生成
本発明と適合性のヒト化結合性ドメインのベンチマークを提供するために、次の通りに本技術分野で認識されている技法を使用して、５種の（例えば、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．３４およびＳＣ１６．５６）例示的なキメラ抗ＤＬＬ３抗体を生成した。実施例１に示される通りに、ハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出し、増幅した。派生した核酸配列から、マウス抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントに関するデータを得た。次の制限部位を使用して、抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のリーダー配列に特異的なプライマーセットを設計した：ＶＨ断片はＡｇｅＩおよびＸｈｏＩならびにＶＬ断片はＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりＰＣＲ産物を精製し、続いて、ＶＨ断片は制限酵素ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩならびにＶＬ断片はＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。ＶＬおよびＶＨ消化されたＰＣＲ産物を精製し、それぞれカッパＣＬ（配列番号５）ヒト軽鎖定常領域発現ベクターまたはＩｇＧ１（配列番号６）ヒト重鎖定常領域発現ベクターにライゲーションした。

２００Ｕ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化および精製された遺伝子特異的ＰＣＲ産物ならびに２５ｎｇ直鎖化ベクターＤＮＡを有する１０μＬの総容量でライゲーション反応を行った。コンピテントのイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ菌株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３μＬライゲーション産物で４２℃の熱ショックにより形質転換し、１００μｇ／ｍＬの濃度のアンピシリンを有するプレートにまいた。増幅されたライゲーション産物の精製および消化後に、ＶＨ断片をｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にクローニングし、ＶＬ断片をｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローニングした。

ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクターによるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の共トランスフェクションによって、キメラ抗体を発現させた。トランスフェクションに先立ち、標準条件下で、１０％熱不活化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、１５０ｍｍプレート内でＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を培養した。一過性トランスフェクションのため、８０％のコンフルエンシーまで細胞を成長させた。各１２．５μｇのｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパベクターＤＮＡを、１．５ｍＬ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭにおける５０μＬ ＨＥＫ−２９３Ｔトランスフェクション試薬に添加した。このミックスを３０分間室温でインキュベートし、まいた。トランスフェクションの３から６日後に上清を回収した。８００×ｇで１０分間の遠心分離によって、組換えキメラ抗体を含有する培養上清を細胞残屑から除去し、４℃で貯蔵した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって組換えキメラ抗体を精製した。

同じマウス抗ＤＬＬ３抗体（例えば、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．３４およびＳＣ１６．５６）は、ＣＤＲグラフトまたはヒト化結合性ドメインの派生にも使用された。所有権のある、コンピュータ支援型ＣＤＲグラフティング法（Ａｂｙｓｉｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）および標準的な分子操作技法を使用して、次のようにマウス抗体をヒト化した。可変領域のヒトフレームワーク領域は、フレームワーク配列およびヒト生殖細胞系列抗体配列のＣＤＲカノニカル構造と、フレームワーク配列および関与性のマウス抗体のＣＤＲとの間の最高度の相同性に基づきデザインした。解析の目的では、アミノ酸の、ＣＤＲドメインの各々への割当ては、Ｋａｂａｔらに従って行った。可変領域を選択したら、それらを、合成遺伝子セグメント（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から生成した。ヒト化抗体は、キメラ抗体について上記で記載した分子法を使用して、クローニングし、発現させた。

選択されたヒトアクセプター可変領域の遺伝的組成は、ヒト化抗体のそれぞれに関して直ぐ下の表４に示されている。表４に描写された配列は、図１Ａおよび図１Ｂの配列番号３８９および３９１（ｈＳＣ１６．１３）、配列番号３９３および３９５（ｈＳＣ１６．１５）、配列番号３９７および３９９（ｈＳＣ１６．２５）、配列番号４０１および４０３（ｈＳＣ１６．３４）ならびに配列番号４０５および４０７（ｈＳＣ１６．５６）に示す連続可変領域アミノ酸配列に対応する。表４は、フレームワーク変化または復帰変異が、選択された抗体の都合よい結合特性の維持に必要とされなかったことを示す。

フレームワーク領域における残基は変更されなかったが、ヒト化クローンの１つ（ｈＳＣ１６．１３）において、安定性に関する懸念に取り組むために、変異が重鎖ＣＤＲ２に導入された。改変されたＣＤＲを有する抗体の結合アフィニティーをチェックして、これが、対応するキメラまたはマウス抗体のいずれとも等しいことを確実にした。

選択された抗体のヒト化後に、その結果得られたＶＬおよびＶＨ鎖アミノ酸配列を解析して、マウスドナーおよびヒトアクセプター軽鎖および重鎖可変領域に関するそれらの相同性を決定した。直ぐ下の表５に示す結果は、ヒト化構築物が、マウスドナー配列によるものよりも高い、ヒトアクセプター配列に関する相同性を一貫して示したことを明らかにする。マウス重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト化抗体およびドナーハイブリドーマタンパク質配列の相同性（７４％−８３％）と比較して、ヒト生殖系列遺伝子の最も近いマッチに対し同様の全体的パーセンテージ相同性（８５％−９３％）を示す。

表面プラズモン共鳴を使用して派生したヒト化構築物のそれぞれを解析して、ＣＤＲグラフト化プロセスが、ＤＬＬ３タンパク質に対するその見かけ上のアフィニティーを認識できるほどに変更したか決定した。ヒト化構築物を、ヒト化構築物に使用されるものと実質的に等しいマウス親（またはドナー）重鎖および軽鎖可変ドメインならびにヒト定常領域を含むキメラ抗体と比較した。ヒト化抗ＤＬＬ３抗体は、キメラ親抗体によって示されるものに大まかに匹敵する結合特徴を示した（データ図示せず。）。

［実施例４］
抗ＤＬＬ３抗体のドメインおよびエピトープマッピング
開示された抗ＤＬＬ３抗体が結合するエピトープを特徴付けおよび位置付けるために、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４年（上記参照）によって記載されたプロトコールの改変を使用して、ドメインレベルのエピトープマッピングを行った。特異的アミノ酸配列を含むＤＬＬ３の個々のドメインを酵母表面に発現させ、各抗ＤＬＬ３抗体による結合をフローサイトメトリーにより決定した。

次の構築物の発現のために、酵母ディスプレイプラスミド構築物を作製した：ＤＬＬ３細胞外ドメイン（アミノ酸２７−４６６）；ＤＬＬ３のＥＧＦ様ドメイン１から６（アミノ酸２２０−４６６）に融合されたＤＬＬ１のＮ末端領域およびＤＳＬドメイン（アミノ酸２２−２２５）からなるＤＬＬ１−ＤＬＬ３キメラ；ＤＬＬ１のＥＧＦ様ドメイン１から８（アミノ酸２２２−５１８）に融合されたＤＬＬ３のＮ末端領域およびＤＳＬドメイン（アミノ酸２７−２１４）からなるＤＬＬ３−ＤＬＬ１キメラ；ＥＧＦ１（アミノ酸２１５−２４９）；ＥＧＦ２（アミノ酸２７４−３１０）；ＥＧＦ１およびＥＧＦ２（アミノ酸２１５−３１０）；ＥＧＦ３（アミノ酸３１２−３５１）；ＥＧＦ４（アミノ酸３５３−３８９）；ＥＧＦ５（アミノ酸３９１−４２７）；ならびにＥＧＦ６（アミノ酸４２９−４６５）。ドメイン情報については、一般に、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＹＪ７を参照されたい。アミノ酸ナンバリングが、配列番号１に示す配列中に含まれるリーダー配列を有するプロセシングされていないＤＬＬ３タンパク質を参照することに留意されたい。全体としてのＮ末端領域またはＥＧＦドメインの解析のため、タンパク質フォールディングに伴う潜在的な問題を最小化するための断片とは対照的に、ファミリーメンバーＤＬＬ１を有するキメラ（ＤＬＬ１−ＤＬＬ３およびＤＬＬ３−ＤＬＬ１）を使用した。ドメインマッピングされた抗体は、ＤＬＬ１と交差反応しないことが以前に示され、これらの構築物への任意の結合が、構築物のＤＬＬ３部分との会合により発生していたことを示す。Ｃｏｃｈｒａｎらに記載されている通り、これらのプラスミドを酵母に形質転換し、続いて酵母を成長させ誘導した。

特定の構築物への結合に関して検査するために、所望の構築物を発現する２００，０００個の誘導された酵母細胞をＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）で２回洗浄し、５０μＬのＰＢＳＡにおいて０．１μｇ／ｍＬのビオチン化抗ＨＡクローン３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および５０ｎＭの精製した抗体または７日間培養したハイブリドーマ由来の未精製上清の１：２希釈物のいずれかと共にインキュベートした。細胞を９０分間氷上でインキュベートし、続いてＰＢＳＡにおいて２回洗浄した。次に、５０μＬ ＰＢＳＡにおいて、適切な二次抗体と共に細胞をインキュベートした：マウス抗体に対しては、Ａｌｅｘａ ４８８コンジュゲートストレプトアビジンおよびＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲートヤギ抗マウス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各１μｇ／ｍＬで添加し；ヒト化またはキメラ抗体に対しては、Ａｌｅｘａ ６４７コンジュゲートストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＲ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を各１μｇ／ｍＬで添加した。氷上で２０分間のインキュベーション後に、細胞をＰＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで解析した。ＤＬＬ３−ＤＬＬ１キメラに結合した抗体は、Ｎ末端領域＋ＤＳＬへの結合と命名した。特定のＥＧＦ様ドメインに存在するエピトープに特異的に結合した抗体は、それぞれのドメインへの結合と命名した（図２）。

立体構造（例えば、非連続的）または線形としてエピトープを分類するために、ＤＬＬ３ ＥＣＤを表示する酵母を３０分間８０℃で熱処理してＤＬＬ３ ＥＣＤを変性し、続いて氷冷ＰＢＳＡにおいて２回洗浄した。上述と同じ染色プロトコールを使用したＦＡＣＳによって、変性した酵母に結合する抗ＤＬＬ３抗体の能力を検査した。変性および未変性酵母の両方に結合した抗体は、線形エピトープへの結合として分類された一方、未変性酵母に結合したが、変性酵母には結合しなかった抗体は、立体構造的に特異的として分類された。

検査した抗体のドメインレベルのエピトープマッピングデータの模式的概要は、図２に提示されており、線形エピトープに結合する抗体に下線を引き、決定された場合、対応するビンを括弧内に記す。図２の審査は、抗ＤＬＬ３抗体の大部分が、ＤＬＬ３またはＥＧＦ２のＮ末端／ＤＳＬ領域のいずれかに存在するエピトープにマッピングする傾向があったことを示す。

２つの方法のうち一方を使用して、選択された抗体における微細エピトープマッピングをさらに行った。第１の方法は、製造業者の指示書に従って使用された、Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた。Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐチューブ（Ｎｕｎｃ）において、３ｍＬの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液、ｐＨ８に溶解した５０μｇ／ｍＬのエピトープマッピングのための抗体を一晩コーティングした。炭酸水素塩溶液中の３％ＢＳＡ溶液でチューブをブロッキングした。次に、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の１０^１１個のインプットファージを結合させ、続いて０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回の連続した洗浄を行って、非結合ファージを洗い流した。穏やかに撹拌しつつ１ｍＬの０．２Ｍグリシンで１０分間室温にて、残るファージを溶出し、続いて１５０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９で中和した。選択ストリンジェンシーを増加させるために洗浄ステップにおいて０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を使用して、溶出されたファージを増幅し、再度１０^１１個のインプットファージでパニングした。第２ラウンド由来の溶出されたファージの２４個のプラーク由来のＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｍ１３スピンキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、配列決定した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、クローナルファージの結合を確認し、このアッセイにおいて、マッピングされた抗体または対照抗体が、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングされ、ブロッキングされ、各ファージクローンに曝露された。西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および１−Ｓｔｅｐ Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ファージ結合を検出した。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、特異的に結合するファージ由来のファージペプチド配列を、抗原ＥＣＤペプチド配列に対して整列して、結合のエピトープを決定した。

あるいは、酵母ディスプレイ方法（Ｃｈａｏら、２００７年、ＰＭＩＤ：１７４０６３０５）を使用して、選択された抗体のエピトープをマッピングした。クローン当たり１アミノ酸変異の標的変異誘発率のためにヌクレオチドアナログの８−オキソ−２’デオキシグアノシン−５’−三リン酸および２’−デオキシ−ｐ−ヌクレオシド−５’三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏ）を使用したエラープローンＰＣＲにより、ＤＬＬ３ ＥＣＤ変異体のライブラリーを生成した。これらを酵母ディスプレイフォーマットへと形質転換した。ドメインレベルマッピングのための上述の技法を使用して、ＨＡおよび５０ｎＭで結合する抗体に関してライブラリーを染色した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を使用して、野生型ＤＬＬ３ ＥＣＤと比較して結合の損失を示したクローンを選別した。これらのクローンを再度成長させ、標的抗体への結合の損失を選別するＦＡＣＳのさらなるラウンドに付した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、個々のＥＣＤクローンを単離し、配列決定した。必要な場合、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、変異を単一変異体ＥＣＤクローンとして再フォーマットした。

個々のＥＣＤクローンを次にスクリーニングして、結合の損失が、エピトープにおける変異によるものであるか、ミスフォールディングを引き起こした変異によるものであるか決定した。ミスフォールディング変異の高い見込みのため、システイン、プロリンおよび終止コドンが関与した変異を自動的に廃棄した。次に、残るＥＣＤクローンを、非競合の立体構造的に特異的な抗体への結合に関してスクリーニングした。非競合の立体構造的に特異的な抗体への結合を失ったＥＣＤクローンは、ミスフォールディング変異を含有すると結論付けされた一方、野生型ＤＬＬ３ ＥＣＤと等しい結合を保持したＥＣＤクローンは、適切にフォールディングされたと結論付けされた。後者の群のＥＣＤクローンにおける変異は、エピトープに存在すると結論付けされた。

抗体結合に関与するアミノ酸残基を含むその派生したエピトープを有する選択された抗体の概要は、下表６に収載されている。抗体ＳＣ１６．３４およびＳＣ１６．５６は、図２に示すビニング情報およびドメインマッピング結果と一貫した共通アミノ酸残基と相互作用する。さらに、ＳＣ１６．２３は、別個の連続エピトープと相互作用することが判明し、ＳＣ１６．３４またはＳＣ１６．５６によりビニングしないことが判明した。添付の配列表の目的のため、配列番号４が、位置２０４にプレースホルダーアミノ酸を含むことに留意されたい。

［実施例５］
抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体の生成
抗ＣＤ１９ ＣＡＲの製造
陽性対照ＣＡＲ構築物を生成するために、ヒトＣＤ１９に対する第２世代ＣＡＲをコードする合成オープンリーディングフレーム（ＵＳ２０１４／０２７１６３５を参照されたい）を合成し（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レンチウイルス発現ベクターであるｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＧＦＰ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ）の多重クローニング部位（ＭＣＳ）へとサブクローニングした。この抗ＣＤ１９ ＣＡＲオープンリーディングフレームは、５’から３’へ、ヒトＣＤ８アルファ鎖由来のシグナルリーダー配列（アミノ酸１−２１、ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｐ０１７３２−１）、ヒトＣＤ１９を認識するマウスモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９７；ＰＭＩＤ ９５６６７６３）、ヒトＣＤ８アルファヒンジ、膜貫通ドメインおよび近接領域（アミノ酸１３８−２０６、ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｐ０１７３２−１）、ヒト４−１ＢＢタンパク質由来の細胞内共刺激シグナル伝達領域（アミノ酸２１４−２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ０７０１１−１）およびヒトＣＤ３_ζ鎖細胞内シグナル伝達領域（アミノ酸５２−１６４、Ｑ６５Ｋ改変を有するＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｐ２０９６３−１）をコードするヌクレオチドを含む。リンパ球上で発現されると、その結果得られるＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔは、予想される免疫刺激活性を示した。

陽性対照を提供すること以外に、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ／レンチウイルス発現ベクターを、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ構成要素が容易に除去され、任意の選択された決定基（例えば、ＤＬＬ３）を対象とする代替の結合性領域構成要素と置換され得るように制限部位を用いて設計した。下記に記載された通り、このカセット系（命名されたＳＣＴ１−ＸＸ、ここでＸＸは特定のＤＬＬ３結合性ドメイン構成要素を示す）を使用して、本発明の多様な実施形態を検証した。ＳＣＴ命名は、文脈に応じて、発現した抗ＤＬＬ３ ＣＡＲタンパク質、ＣＡＲタンパク質を発現する細胞傷害性リンパ球、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ ＯＲＦまたは文脈に応じて同じＯＲＦを含む発現ベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、プラスミドなど）を指す場合があることに留意されたい。

ＳＣＴ１−ｈ１６．１５の製造
新規の抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ構築物（ＳＣＴ１−ｈ１６．１５）を生成するために、ペンタマーの多量体ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（Ｇ_４Ｓ）_３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号７）リンカーをコードする核酸配列を介して、抗ｈＳＣ１６．１５ ＶＬ（配列番号３９４）およびＶＨ（配列番号３９６）ヌクレオチド配列を共に作動可能に連結して、ｈＳＣ１６．１５−ｓｃＦｖタンパク質をコードするｈＳＣ１６．１５−ｓｃＦｖポリヌクレオチド（配列番号１５）をもたらすことにより、ｓｃＦｖ断片をコードするヌクレオチド配列を先ず合成した。例示的な核酸およびアミノ酸配列の両方を直ぐ下に示す：

および：

続いて標準的な分子操作技法を使用して、ｈＳＣ１６．１５−ｓｃＦｖヌクレオチド配列をＳＣＴ１カセットへとクローニングして、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを含むＳＣＴ１−ｈ１６．１５レンチウイルス発現ベクターを得た。これに関して、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５ ＣＡＲは、５’から３’へ以下のエレメント：ＣＤ８アルファ鎖リーダー領域（アミノ酸１−２１、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１７３２−１）、ｈ２７．１０８ＶＬドメイン（実施例５の通り）、（Ｇ_４Ｓ）_３合成リンカー配列（アミノ酸１−１５、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８）、ｈ１６．１５ＶＨドメイン（実施例３の通り）、ヒトＣＤ８アルファヒンジおよび膜貫通ドメイン（アミノ酸１３８−２０６、ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｐ０１７３２−１）、ヒト４−１ＢＢタンパク質由来の細胞内共刺激シグナル伝達領域（アミノ酸２１４−２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ０７０１１−１）およびヒトＣＤ３_ζ鎖細胞内シグナル伝達領域（アミノ酸５２−１６４、Ｑ６５Ｋ改変を有するＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｐ２０９６３−１）をコードするオープンリーディングフレームを含む。ＣＡＲオープンリーディングフレームは確認した配列であった。ＳＣＴ１−ｈ１６．１５ＣＡＲオープンリーディングフレームの概略図は図４Ａに示した対応する核酸配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）と共に図３に示す。図４Ａにおいて、組み込まれたｓｃ１６．１５ ｓｃＦｖ結合性ドメインに下線が引かれている（配列番号８に対応）ことに留意されたい。

［実施例６］
追加的な例示的な抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体の生成
本発明の範囲および適応性をさらに実証するために、実質的に上に示す通りに、開示されているＤＬＬ３ ＣＡＲと適合性のｓｃＦｖ構築物の形態の２種のＤＬＬ３結合性ドメインを製作し、ＳＣＴ１−１６ ＣＡＲに組み込んだ。より具体的には、本開示に従って新規の抗ＤＬＬ３結合性ドメイン構築物を生成するために、ペンタマーの多量体ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（Ｇ_４Ｓ）_３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号７）リンカーをコードする核酸配列を介して、選択されたＶＬおよびＶＨヌクレオチド配列を共に作動可能に連結することにより、ｓｃＦｖ断片をコードするヌクレオチド配列を合成した。第１の事例において、ｓｃＦｖポリヌクレオチド（ｓｃＦｖ−ｈＳＣ１６．１３）は、ｈＳＣ１６．１３由来の可変軽鎖および重鎖配列（配列番号３８８および３９０）を含むが、第２の事例において、ｓｃＦｖポリヌクレオチド（ｓｃＦｖ−ｈＳＣ１６．２５）は、ｈＳＣ１６．２５由来の可変軽鎖および重鎖配列（配列番号３９６および３９８）を含む。次に、ｓｃＦｖ−ｈＳＣ１６．１３（配列番号１１）およびｓｃＦｖ−ｈＳＣ１６．２５（配列番号１３）をコードするその結果得られる核酸構築物を、操作された制限部位を使用してＳＣＴ１カセットに挿入して、ＳＣＴ１−ｈＳＣ１６．１３およびＳＣＴ１−ｈＳＣ１６．２５をもたらした。ＳＣＴ１−ｈＳＣ１６．１３の核酸（配列番号１６）およびアミノ酸（配列番号１７）配列は、図４Ｂに示されているが、ＳＣＴ１−ｈＳＣ１６．２５の核酸（配列番号１８）およびアミノ酸（配列番号１９）配列は、図４Ｃに示されている。それぞれ配列番号１２（ｈ１６．１３ ｓｃＦｖ）および配列番号１４（ｈ１６．２５ ｓｃＦｖ）に示される通り、両方の図において、ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ結合性ドメインに対応するアミノ酸配列に下線が引かれていることに留意されたい。

開示されたＳＣＴ１カセット系を使用した、これらのＣＡＲの製作の容易さは、種々のＤＬＬ３結合性ドメインの選択および組込みに関する本発明の多用途性を例示し、より一般には、構築物のモジュラー的性質を実証する。そのようなものとして、その結果得られるＤＬＬ３感作リンパ球が、ＤＬＬ３発現細胞（例えば、腫瘍細胞）への曝露によって免疫刺激性であるまたは活性化される限り、本明細書に示すＤＬＬ３ ＣＡＲＳの概念が、いずれか特定のＤＬＬ３結合性ドメインに、または他のいずれか特定の構成要素（例えば、特異的な膜貫通またはシグナル伝達ドメイン）の選択によって限定されないことが認められる。

［実施例７］
レンチウイルスベクター粒子の生成および特徴付け
実施例５および６の例示的なＤＬＬ３ ＣＡＲであるＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５およびＳＣＴ１−ｈ１６．２５のレンチウイルスベクターパッケージングを次の通りに行った：１０ｕｇの選択されたＳＣＴ１−ｈ１６プラスミド、７ｕｇのｐΔＲ８．７４および４ｕｇのｐＭＤ２．Ｇを、１：４のＤＮＡ：ＰＥＩ比のポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｍｉｎｅ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下、１０００万個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）に共トランスフェクトした。共トランスフェクトした細胞を３７℃（５％ＣＯ_２）にて一晩インキュベートし、続いて翌日に培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後、レンチウイルス粒子を含有する培養培地を採取し、４℃にて５分間１２００ｒｐｍでの遠心分離によって清澄化して細胞残屑を除去した。レンチウイルスベクター粒子をペレットにするために、清澄化した培養培地を４℃にて２時間１９５００ｒｐｍで超遠心分離した。超遠心分離後、上清を捨て、ウイルスペレットを滅菌ＰＢＳ中に再懸濁し、−８０℃にて保存した。回復させたレンチウイルスベクターストックの定量はｐ２４ ＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって評価し、遺伝子導入効率（機能的力価）は標準的なレンチウイルスベクター滴定法によって評価した。レンチウイルスベクターストックの典型的な収量は７−１５ｕｇ／ｍｌの範囲のｐ２４抗原であり、機能的力価は１−３×１０ｅ８ ＴＵ／ｍｌの範囲であった。ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５およびＳＣＴ１−ｈ１６．２５レンチウイルスベクターストックは凍結させ、使用するまで保存した。

後の実施例に示した通り、ベクターストックを使用して、本出願全体にわたって詳細に論じられ、本明細書に添付の図５に概略的に示された所望の免疫反応を誘導することができる。さらに、ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５およびＳＣＴ１−ｈ１６．２５は、本発明の種々の様相を実証するための例示的な構築物として使用される（および図面においてコールアウトされ得る。）が、本発明の真の範囲は、いずれか特定のＤＬＬ３結合性ドメインもしくは特定のシグナル伝達ドメインまたはこれらのいずれか例示的な構築物に限定されないが、むしろＤＬＬ３発現腫瘍細胞への曝露後に所望の免疫応答をもたらす任意のＤＬＬ３ ＣＡＲを包含することが認められる。

［実施例８］
ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５またはＳＣＴ１−ｈ１６．２５ ＣＡＲタンパク質を発現する不死化Ｔリンパ球の生成
ＳＣＴ１−ｈ１６．１５、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５またはＳＣＴ１−ｈ１６．２５のいずれかを発現するＤＬＬ３標的特異的Ｊｕｒｋａｔリンパ球は、有効なウイルス形質導入を保証するために１０ｕｇ／ｍｌのポリブレン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下で約４の感染多重度（ＭＯＩ）にて、以前の実施例からの被験体ＳＣＴ１−ｈ１６レンチウイルスベクターを１００万個のＪｕｒｋａｔ Ｅ６−１（ＡＴＣＣ）Ｔリンパ球細胞に形質導入することによって生成した。細胞は３７℃（５％ＣＯ_２）にて７２時間レンチウイルス粒子の存在下でインキュベートした。その後、使用済みの培地は２ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する新鮮な培地と交換して、ＳＣＴ１−ｈ１６ＣＡＲを発現する細胞を陽性選択した。フローサイトメトリーによる抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ表面発現の評価に先立ち、細胞をピューロマイシンの存在下でさらに５日間インキュベートした（図６Ａ）。フローサイトメトリーを使用して、本発明のＣＡＲ構築物の特徴付けに使用される、ｈＤＬＬ３を過剰発現する操作されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株の表面におけるｈＤＬＬ３タンパク質の存在も検出した（図６Ｂ）。

ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５またはＳＣＴ１−ｈ１６．２５のいずれかを発現する形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞および非形質導入Ｊｕｒｋａｔ対照細胞のフローサイトメトリー解析を次の通りに行った：各細胞株の１０^６個の細胞を回収し、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間の遠心分離によってペレットにした；上清を除去し、ペレットを冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄した。最終洗浄の上清を除去した後に、１マイクログラムのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含有する１００マイクロリットルのＰＢＳ／２％ＦＣＳに細胞ペレットを再懸濁し、暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳにおいて３回洗浄し、その後、ＤＡＰＩ入りのＰＢＳ／２％ＦＣＳに再懸濁した（生細胞を検出するために）。次に、製造業者の指示書に従ってＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで細胞を解析して、図６Ａに示すデータをもたらした。

同様に、ＨＥＫ−２９３Ｔ親細胞またはｈＤＬＬ３を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する単一細胞懸濁液へと単離した。単離した細胞を上記の通りに洗浄し、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で３回洗浄する前に１マイクログラムの抗ＤＬＬ３抗体と共に暗所において４℃にて３０分間インキュベートした。次いで細胞を、１つの試料当たりＰＢＳ／２％ＦＣＳ中の１：２００希釈した５０μＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩ（生存細胞を検出するため）を有するＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁した。次いで細胞を製造業者の指示書に従ってＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで分析して図６Ｂに示したデータを得た。

図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれ、被験体ＳＣＴ１−ｈ１６ＣＡＲが、形質導入したＪｕｒｋａｔ Ｔリンパ球で発現されるが、形質導入されていないＪｕｒｋａｔ細胞で発現されないことおよびヒトＤＬＬ３タンパク質が、操作したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で発現されるが、ＨＥＫ−２９３Ｔ未感作細胞で発現されないことを実証している。

［実施例９］
Ｊｕｒｋａｔ−ＳＣＴ１−ｈ１６．１５Ｔリンパ球は、ｈＤＬＬ３発現細胞と接触すると、ＩＬ−２産生を誘導する

形質導入したＪｕｒｋａｔ−ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、Ｊｕｒｋａｔ−ＳＣＴ１−ｈ１６．１５、およびＪｕｒｋａｔ−ＳＣＴ１−ｈ１６．２５リンパ球は、ＣＡＲ媒介性Ｔ細胞活性化を示す、ＩＬ−２誘導を測定することによって標的特異的活性化について評価した。より具体的には、形質導入したＪｕｒｋａｔリンパ球および以前の実施例からのｈＤＬＬ３を発現する操作した２９３Ｔ細胞を使用して、ＣＡＲを発現するリンパ球が活性化され、ｈＤＬＬ３を発現する細胞と接触すると、免疫反応をマウントすることを実証するために、ＩＬ２レベルをモニタリングした。

これに関して、実施例８からのＪｕｒｋａｔ−ＳＣＴ１−ｈ１６．１５リンパ球を、フローサイトメトリーによって証明された通り（再び実施例８からの）細胞表面上でｈＤＬＬ３抗原を過剰発現するように操作したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞と共培養した。標的ＨＥＫ−２９３Ｔ−ｈＤＬＬ３細胞とのリンパ球の共培養は、図７Ａに示した記載した４つの異なるリンパ球：標的（Ｌ：Ｔ）比にて実施して、用量反応を評価し、最大ＩＬ−２産生条件を決定した。共培養物は３７℃（５％ＣＯ_２）にて４８時間インキュベートし、この時に培地を採取し、５分間１２００ｒｐｍでの遠心分離によって細胞残屑を清澄化した。次いで清澄化した上清を、製造業者の指示書に従ってＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってＩＬ−２産生について評価した。バックグラウンドＩＬ−２産生を評価するために、形質導入していないＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ−Ｎａｉｖｅ）をＨＥＫ−２９３Ｔ−ｈＤＬＬ３細胞と共培養した。ＩＬ２誘導の観点からの結果は、図７Ａに示されている。

同様に、実質的に直ぐ上に示す通りに、実施例８の３種の異なるＳＣＴ１−ｈ１６リンパ球（Ｊｕｒｋａｔ−ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、Ｊｕｒｋａｔ−ＳＣＴ１−ｈ１６．１５およびＪｕｒｋａｔ−ＳＣＴ１−ｈ１６．２５）を、操作したｈＤＬＬ３＋ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞と共に３：１のＬ：Ｔ比で共培養した。再度ＩＬ２誘導の観点からの結果は、図７Ｂに示されている。

図７Ａに示すデータによって証明される通り、Ｊｕｒｋａｔ−ＳＣＴ１−ｈ１６．１５リンパ球を、ｈＤＬＬ３を発現する細胞への曝露後に濃度依存性様式でＩＬ−２を産生するように促した。その上、図７Ｂに示すデータは、抗原提示細胞に曝露されると、ＩＬ２の産生を一貫して誘導する種々のＤＬＬ３ ＣＡＲ構築物の能力を実証する。より詳細には、このようなＩＬ−２産生が、ｈＤＬＬ３発現細胞（ｈＤＬＬ３発現腫瘍原性細胞を含む。）におけるＤＬＬ３抗原の認識後にＳＣＴ１ ＣＡＲによりＴ細胞活性化を示すことが認められる。図７Ａおよび図７Ｂの両方に関して、Ｊｕｒｋａｔ細胞の標的特異的ＣＡＲ媒介性活性化は、ＨＥＫ−２９３Ｔ−ＤＬＬ３および非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を含有する共培養物の間の観察可能なＩＬ−２産生の欠如によってさらに解明される。

［実施例１０］
ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５またはＳＣＴ１−ｈ１６．２５ ＣＡＲタンパク質を発現する初代Ｔリンパ球の生成
開示されたＣＡＲが感作リンパ球を提供するために使用できることを実証するために、初代ヒトＣＤ３＋Ｔリンパ球は、ヒトＣＤ３陽性選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して市販の末梢血単核細胞調製物（ＰＢＭＣ：ＡｌｌＣｅｌｌｓ）から単離した。

単一ドナーからの単離後に、１０％熱不活性ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１％ｌ−グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有するＲＰＭＩ培地においてＣＤ３＋Ｔ細胞を培養した。Ｔリンパ球は、活性化のために１：５の比でＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）の存在下で３７℃（５％ＣＯ_２）にてインキュベートした。ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を５０ＩＵ／ｍｌの最終濃度で一日おきに加えた。活性化開始から２４時間後、ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５、またはＳＣＴ１−ｈ１６．２５を発現するＤＬＬ３標的特異的Ｔリンパ球を、有効なウイルス形質導入を保証するために１０ｕｇ／ｍｌのポリブレン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下で約５の感染多重度（ＭＯＩ）にて、実質的に実施例７に示したように生成したＣＡＲレンチウイルスベクターを１００万個のＴ細胞に形質導入することによって生成した。細胞は、フローサイトメトリーによって抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ表面発現を評価する前に、３７℃（５％ＣＯ_２）にて７２時間、レンチウイルス粒子の存在下でインキュベートした。

ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５またはＳＣＴ１−ｈ１６．２５およびＣＡＲを有さないＴリンパ球対照細胞を発現する形質導入したＴリンパ球のフローサイトメトリー分析は以下の通りに実施した：各試料の１０^６個の細胞を採取し、５分間４℃にて１２００ｒｐｍでの遠心分離によってペレットにし、上清を除去し、ペレットを冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で２回洗浄した。最後の洗浄から上清を除去した後、細胞ペレットを、１マイクログラムのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７がコンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含有する１００マイクロリットルのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁し、４℃にて３０分間暗所においてインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で３回洗浄し、その後、ＤＡＰＩ（生存細胞を検出するため）を有するＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁した。次いで細胞を、製造業者の指示書に従ってＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメトリーにおいて分析して図８に示したデータを得た。

図８は、ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５およびＳＣＴ１−ｈ１６．２５が、形質導入した初代Ｔリンパ球（すなわち、感作リンパ球）で発現するが、形質導入していないリンパ球で発現しないことを明確に示す。

［実施例１１］
ＤＬＬ３標的抗原を発現する細胞の生成および特徴付け
実施例８に示された通り、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＤＬＬ３を過剰発現する操作したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株の表面上にＤＬＬ３タンパク質の存在を検出した。同様に、フローサイトメトリーを使用して、患者由来の異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ）（ＰＤＸ）腫瘍細胞株（ＬＵ６４）上のヒトＤＬＬ３の発現を確認した。人工的に操作した２９３Ｔ細胞株および誘導された小細胞がん細胞株の両方を使用して、本発明の感作リンパ球を特徴付けた。

より特に、ヒトＤＬＬ３（２９３Ｔ−ＤＬＬ３）を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を採取し、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する単一細胞懸濁液内に単離した。同様に、新たに採取したＬＵ６４ＰＤＸ腫瘍を、腫瘍解離キット（Ｍｙｌｔｅｎｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単一細胞懸濁液内で処理した。単離した細胞を本明細書に記載した通りに洗浄し、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で３回洗浄する前に１マイクログラムの抗ＤＬＬ３抗体またはアイソタイプ対照と共に暗所において４℃にて３０分間インキュベートした。次いで細胞を、１つの試料当たりＰＢＳ／２％ＦＣＳ中の１：２００希釈した５０マイクロリットルのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩ（生存細胞を検出するため）を有するＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁した。次いで細胞を製造業者の指示書に従ってＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターにおいて分析して図９Ａおよび図９Ｂに示したデータを得た。

得られた図は、ヒトＤＬＬ３タンパク質が、操作したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（図９Ａ）およびＬＵ６４ＰＤＸ腫瘍細胞（図９Ｂ）の両方で発現することを示す。

［実施例１２］
ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５およびＳＣＴ１−ｈ１６．２５初代リンパ球は、曝露後にＤＬＬ３発現細胞を消失させる
標的特異的様式で細胞を死滅させるＤＬＬ３感作初代リンパ球の能力を実証するために、本発明のＣＡＲ形質導入細胞（実質的に実施例１０に示される通りに調製）を、ＤＬＬ３を発現する操作された２９３細胞に曝露した（適切な対照と共に）。曝露後に、図１０に示されている結果により、残存している生存標的細胞の数を計算した。

より具体的には、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する初代Ｔリンパ球（ＳＣＴ１−ｈ１６．１３、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５およびＳＣＴ１−ｈ１６．２５）を、２９３Ｔ−ＤＬＬ３細胞と３：１のリンパ球対標的（Ｌ：Ｔ）比で共培養した。残る生存可能なＤＬＬ３を有する細胞のパーセンテージの決定に先立ち、共培養物を３７℃（５％ＣＯ_２）で４８時間インキュベートした。

生存細胞の百分率は以下のように算出した：共培養物を採取し、本明細書に示した通りに洗浄し、その後、暗所において４℃にて３０分間、１マイクログラムの抗ＤＬＬ３抗体またはアイソタイプ対照とインキュベートし、続いてＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で３回洗浄した。次いで細胞を、１つの試料当たりＰＢＳ／２％ＦＣＳ中の１：２００希釈した５０マイクロリットルのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳにより３回洗浄し、続いて細胞生存を識別するためのＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および細胞計数を正規化するための１００００個の絶対計数ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する２００マイクロリットルのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁した。残存している生存ＤＬＬ３保有標的細胞の分析および列挙は、回収した７５００個の絶対計数ビーズ当たりの生存ＤＬＬ３保有細胞のそれぞれの数を定量することによってＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターにおいて実施した。ＣＡＲを保有していないＴリンパ球の存在下で残存している生存標的細胞は、ＤＬＬ３感作リンパ球によるＤＬＬ３保有細胞の標的特異的殺傷を比較するためのベンチマークとして使用した。

図１０に示す通り、ＳＣＴ１−１６．１５は、有意な標的特異的死滅を示したが、ＳＣＴ１−ｈ１６．１３およびＳＣＴ１−ｈ１６．２５は、より中庸な標的特異的死滅を示した。感作リンパ球によって媒介される死滅の免疫特異性は、ＤＬＬ３＋標的細胞と共培養された非形質導入初代Ｔリンパ球によって示される活性の欠如によって証明される（図１０）。これらのデータは、種々の抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する感作リンパ球の間の標的特異的活性を実証する。

［実施例１３］
ＳＣＴ１−ｈ１６．１５初代Ｔリンパ球は、ＤＬＬ３発現細胞の接触後にサイトカイン産生を誘導する
開示されたＣＡＲが、種々のドナー由来の感作リンパ球の提供に使用され得ることを実証するために、ヒトＣＤ３正の選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、市販の末梢血単核細胞調製物（ＰＢＭＣ：ＡｌｌＣｅｌｌｓ）から初代ヒトＣＤ３＋Ｔリンパ球を単離し、形質導入した。ＳＣＴ１−ｈ１６．１５および２名の異なるドナー（ドナー１およびドナー２）から得たＰＢＭＣを含むその結果得られる感作リンパ球組成物を、ＤＬＬ３発現標的細胞との接触後にＴＮＦαおよびＩＦＮγ誘導を測定することにより、ＣＡＲ発現（図１１）および標的特異的活性化に関して評価した。サイトカイン産生（例えば、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ誘導）が、抗腫瘍免疫応答を誘導することができる活性キメラ抗原受容体を示すことが認められる。

より詳細には、実質的に実施例１０に示される通り、２名の異なるドナー（ドナー１およびドナー２）由来のＰＭＢＣ調製物を使用して、ＣＤ３＋Ｔリンパ球調製物をもたらした。次に、それぞれのリンパ球調製物をＳＣＴ１−ｈ１６．１５により形質導入して（再度実施例１０に示される通り。）、ドナー１およびドナー２のＤＬＬ３感作リンパ球調製物（対照として非形質導入リンパ球と共に）をもたらした。図１１は、上に示す通りに行ったフローサイトメトリーによって決定される通り、リンパ球調製物のそれぞれが、ＤＬＬ３ ＣＡＲを有効に発現することを示す。

２名の異なるドナー由来の宿主細胞を含むその結果得られる感作リンパ球を、ＤＬＬ３＋２９３Ｔ細胞およびＤＬＬ３を発現する小細胞肺がん細胞（どちらも実施例１１由来）に曝露した。これに関して、次に、感作リンパ球調製物（と対照）のそれぞれを、２９３Ｔ−ＤＬＬ３またはＬＵ６４ ＰＤＸ標的細胞のいずれかと、３：１のリンパ球対標的（Ｌ：Ｔ）比で共培養した。共培養物を３７℃（５％ＣＯ_２）で４８時間インキュベートし、この時点で培地を回収し、１２００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞残屑を清澄化した。次に、製造業者の指示書に従って、清澄化した上清を、ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によってＴＮＦα産生に関して、ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＩＦＮｇに関して評価した。ＴＮＦαおよびＩＦＮγのレベルに関するその結果得られる測定値は、それぞれ図１２Ａおよび図１２Ｂ（ＴＮＦα）ならびに図１３Ａおよび図１３Ｂ（ＩＦＮγ）に示されており、それによると、より高いサイトカイン産生は、ＣＡＲからのより頑強なシグナル伝達を示す。

図１２Ａ（２９３細胞）および図１２Ｂ（腫瘍細胞）ならびに図１３Ａ（２９３細胞）および図１３Ｂ（腫瘍細胞）に示すデータによって証明される通り、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５を有するＴリンパ球の両方の調製物は、ヒトＤＬＬ３を発現する細胞（操作されたおよび腫瘍）への曝露後にＴＮＦαおよびＩＦＮγを産生するように促された一方、ＣＡＲを持たないＴリンパ球は、同じ標的細胞と共培養されたときに、最小のＴＮＦαおよびＩＦＮγ誘導を示した。この結果は、異なるドナー由来のＤＬＬ３感作リンパ球が、活性を有し、ＤＬＬ３＋腫瘍細胞への曝露後に免疫刺激性シグナルを生成することができることを確認する。

［実施例１４］
ＳＣＴ１−ｈ１６．１５−Ｔリンパ球によるインビトロにおけるＤＬＬ３発現細胞のターゲティングされた死滅
標的特異的様式で細胞を死滅するＤＬＬ３感作リンパ球の能力を実証するために、本発明のＣＡＲ形質導入細胞を、ＤＬＬ３を発現する操作された２９３細胞および腫瘍細胞（再度実施例１１由来）に曝露した。曝露後に、図１４Ａ（２９３細胞）および図１４Ｂ（腫瘍細胞）に示されている結果により、残存している生存標的細胞の数を計算した。

より詳細には、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５感作リンパ球（２名のドナー由来の宿主細胞により実施例１３に従って調製）を、２９３Ｔ−ＤＬＬ３またはＬＵ６４ ＰＤＸ細胞のいずれかと、３：１のリンパ球対標的（Ｌ：Ｔ）比で共培養した。残る生存可能なＤＬＬ３を有する細胞の決定に先立ち、共培養物を３７℃（５％ＣＯ_２）で４８時間インキュベートした。

生存細胞の百分率は以下のように算出した：共培養物を採取し、本明細書に示した通りに洗浄し、その後、暗所において４℃にて３０分間、１マイクログラムの抗ＤＬＬ３抗体またはアイソタイプ対照とインキュベートし、続いてＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で３回洗浄した。次いで細胞を、１つの試料当たりＰＢＳ／２％ＦＣＳ中の１：２００希釈した５０マイクロリットルのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳにより３回洗浄し、続いて細胞生存を識別するためのＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および細胞計数を正規化するための１００００個の絶対計数ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する２００マイクロリットルのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁した。残存している生存ＤＬＬ３保有標的細胞の分析および列挙は、回収した７５００個の絶対計数ビーズ当たりの生存ＤＬＬ３保有細胞のそれぞれの数を定量することによってＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターにおいて実施した。ＣＡＲを保有していないＴリンパ球の存在下で残存している生存標的細胞は、ＳＣＴ１−ｈ１６．１５感作リンパ球によるＤＬＬ３保有細胞の標的特異的殺傷を比較するためのベンチマークとして使用した。

図１４Ａ（２９３細胞）および図１４Ｂ（腫瘍細胞）に示す通り、ＤＬＬ３＋細胞は、両方のドナーに由来する感作リンパ球による細胞溶解に対し有意な感受性を示し、標的細胞のおよそ９９％が消失された。ＤＬＬ３感作リンパ球は、ＬＵ６４ ＰＤＸ小細胞肺がん細胞の実質的に大部分（およそ７０％から８０％）を消失させることもできた。全体的に見て、これらのデータは、開示されたＤＬＬ３感作リンパ球が、標的特異的様式で、ＤＬＬ３＋腫瘍細胞を含むＤＬＬ３＋細胞を有効に消失させることができることを実証する。

当業者はさらに、本発明が、この趣旨または中心的な特性から逸脱せずに他の特定の態様に組み込まれてもよいことを十分に理解する。本発明の前出の記載がこの例示的な実施形態のみを開示しているという点において、他の変形が本発明の範囲内であることを意図されることが理解される。したがって、本発明は、本明細書に詳細に記載されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、参照は、本発明の範囲および内容の指標として添付の特許請求の範囲に対してなされるべきである。

Claims (30)

1. 抗ＤＬＬ３結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体。
2. 抗ＤＬＬ３結合性ドメインが、ｓｃＦｖ抗ＤＬＬ３結合性ドメインを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
3. ｓｃＦｖ抗ＤＬＬ３結合性ドメインが、
   配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）および配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；または配列番号２５のＶＬおよび配列番号２７のＶＨ；または配列番号２９のＶＬおよび配列番号３１のＶＨ；または配列番号３３のＶＬおよび配列番号３５のＶＨ；または配列番号３７のＶＬおよび配列番号３９のＶＨ；または配列番号４１のＶＬおよび配列番号４３のＶＨ；または配列番号４５のＶＬおよび配列番号４７のＶＨ；または配列番号４９のＶＬおよび配列番号５１のＶＨ；または配列番号５３のＶＬおよび配列番号５５のＶＨ；または配列番号５７のＶＬおよび配列番号５９のＶＨ；または配列番号６１のＶＬおよび配列番号６３のＶＨ；または配列番号６５のＶＬおよび配列番号６７のＶＨ；または配列番号６９のＶＬおよび配列番号７１のＶＨ；または配列番号７３のＶＬおよび配列番号７５のＶＨ；または配列番号７７のＶＬおよび配列番号７９のＶＨ；または配列番号８１のＶＬおよび配列番号８３のＶＨ；または配列番号８５のＶＬおよび配列番号８７のＶＨ；または配列番号８９のＶＬおよび配列番号９１のＶＨ；または配列番号９３のＶＬおよび配列番号９５のＶＨ；または配列番号９７のＶＬおよび配列番号９９のＶＨ；または配列番号１０１のＶＬおよび配列番号１０３のＶＨ；または配列番号１０５のＶＬおよび配列番号１０７のＶＨ；または配列番号１０９のＶＬおよび配列番号１１１のＶＨ；または配列番号１１３のＶＬおよび配列番号１１５のＶＨ；または配列番号１１７のＶＬおよび配列番号１１９のＶＨ；または配列番号１２１のＶＬおよび配列番号１２３のＶＨ；または配列番号１２５のＶＬおよび配列番号１２７のＶＨ；または配列番号１２９のＶＬおよび配列番号１３１のＶＨ；または配列番号１３３のＶＬおよび配列番号１３５のＶＨ；または配列番号１３７のＶＬおよび配列番号１３９のＶＨ；または配列番号１４１のＶＬおよび配列番号１４３のＶＨ；または配列番号１４５のＶＬおよび配列番号１４７のＶＨ；または配列番号１４９のＶＬおよび配列番号１５１のＶＨ；または配列番号１５３のＶＬおよび配列番号１５５のＶＨ；または配列番号１５７のＶＬおよび配列番号１５９のＶＨ；または配列番号１６１のＶＬおよび配列番号１６３のＶＨ；または配列番号１６５のＶＬおよび配列番号１６７のＶＨ；または配列番号１６９のＶＬおよび配列番号１７１のＶＨ；または配列番号１７３のＶＬおよび配列番号１７５のＶＨ；または配列番号１７７のＶＬおよび配列番号１７９のＶＨ；または配列番号１８１のＶＬおよび配列番号１８３のＶＨ；または配列番号１８５のＶＬおよび配列番号１８７のＶＨ；または配列番号１８９のＶＬおよび配列番号１９１のＶＨ；または配列番号１９３のＶＬおよび配列番号１９５のＶＨ；または配列番号１９７のＶＬおよび配列番号１９９のＶＨ；または配列番号２０１のＶＬおよび配列番号２０３のＶＨ；または配列番号２０５のＶＬおよび配列番号２０７のＶＨ；または配列番号２０９のＶＬおよび配列番号２１１のＶＨ；または配列番号２１３のＶＬおよび配列番号２１５のＶＨ；または配列番号２１７のＶＬおよび配列番号２１９のＶＨ；または配列番号２２１のＶＬおよび配列番号２２３のＶＨ；または配列番号２２５のＶＬおよび配列番号２２７のＶＨ；または配列番号２２９のＶＬおよび配列番号２３１のＶＨ；または配列番号２３３のＶＬおよび配列番号２３５のＶＨ；または配列番号２３７のＶＬおよび配列番号２３９のＶＨ；または配列番号２４１のＶＬおよび配列番号２４３のＶＨ；または配列番号２４５のＶＬおよび配列番号２４７のＶＨ；または配列番号２４９のＶＬおよび配列番号２５１のＶＨ；または配列番号２５３のＶＬおよび配列番号２５５のＶＨ；または配列番号２５７のＶＬおよび配列番号２５９のＶＨ；または配列番号２６１のＶＬおよび配列番号２６３のＶＨ；または配列番号２６５のＶＬおよび配列番号２６７のＶＨ；または配列番号２６９のＶＬおよび配列番号２７１のＶＨ；または配列番号２７３のＶＬおよび配列番号２７５のＶＨ；または配列番号２７７のＶＬおよび配列番号２７９のＶＨ；または配列番号２８１のＶＬおよび配列番号２８３のＶＨ；または配列番号２８５のＶＬおよび配列番号２８７のＶＨ；または配列番号２８９のＶＬおよび配列番号２９１のＶＨ；または配列番号２９３のＶＬおよび配列番号２９５のＶＨ；または配列番号２９７のＶＬおよび配列番号２９９のＶＨ；または配列番号３０１のＶＬおよび配列番号３０３のＶＨ；または配列番号３０５のＶＬおよび配列番号３０７のＶＨ；または配列番号３０９のＶＬおよび配列番号３１１のＶＨ；または配列番号３１３のＶＬおよび配列番号３１５のＶＨ；または配列番号３１７のＶＬおよび配列番号３１９のＶＨ；または配列番号３２１のＶＬおよび配列番号３２３のＶＨ；または配列番号３２５のＶＬおよび配列番号３２７のＶＨ；または配列番号３２９のＶＬおよび配列番号３３１のＶＨ；または配列番号３３３のＶＬおよび配列番号３３５のＶＨ；または配列番号３３７のＶＬおよび配列番号３３９のＶＨ；または配列番号３４１のＶＬおよび配列番号３４３のＶＨ；または配列番号３４５のＶＬおよび配列番号３４７のＶＨ；または配列番号３４９のＶＬおよび配列番号３５１のＶＨ；または配列番号３５３のＶＬおよび配列番号３５５のＶＨ；または配列番号３５７のＶＬおよび配列番号３５９のＶＨ；または配列番号３６１のＶＬおよび配列番号３６３のＶＨ；または配列番号３６５のＶＬおよび配列番号３６７のＶＨ；または配列番号３６９のＶＬおよび配列番号３７１のＶＨ；または配列番号３７３のＶＬおよび配列番号３７５のＶＨ；または配列番号３７７のＶＬおよび配列番号３７９のＶＨ；または配列番号３８１のＶＬおよび配列番号３８３のＶＨ；または配列番号３８５のＶＬおよび配列番号３８７のＶＨ；または配列番号３８９のＶＬおよび配列番号３９１のＶＨ；または配列番号３９３のＶＬおよび配列番号３９５のＶＨ；または配列番号３９７のＶＬおよび配列番号３９９のＶＨ；または配列番号４０１のＶＬおよび配列番号４０３のＶＨ；または配列番号４０５のＶＬおよび配列番号４０７のＶＨを含む抗体に由来する、それを含む、またはそれと結合について競合する、請求項１または２に記載のキメラ抗原受容体。
4. ４−１ＢＢシグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
5. ヒトＣＤ８ａヒンジを含む膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
6. 請求項１から５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
7. 請求項１から５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
9. ウイルスベクターを含む、請求項８に記載のベクター。
10. ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを含む、請求項９に記載のベクター。
11. 請求項７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項８から１０のいずれか一項に記載のベクターを含む医薬組成物。
12. 請求項１から５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む単離された宿主細胞。
13. 宿主細胞が、ＤＬＬ３感作リンパ球を含む、請求項１２に記載の単離された宿主細胞。
14. ＤＬＬ３感作リンパ球が、患者から得られる自己細胞を含む、請求項１３に記載の単離された宿主細胞。
15. ＤＬＬ３感作リンパ球が、同種異系細胞を含む、請求項１３に記載の単離された宿主細胞。
16. ＤＬＬ３感作リンパ球が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む、請求項１３に記載の単離された宿主細胞。
17. Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１６に記載の単離された宿主細胞。
18. ＤＬＬ３感作リンパ球が、ＮＫ細胞を含む、請求項１６に記載の単離された宿主細胞。
19. 請求項１２から１８のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。
20. がんを患っている患者を処置する方法であって、請求項１９に記載の医薬組成物を患者へと投与するステップを含む、方法。
21. 患者が、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、白血病およびリンパ腫からなる群から選択されるがんを患っている、請求項２０に記載の方法。
22. がんが肺がんであり、肺がんが小細胞肺がんである、請求項２１に記載の方法。
23. ＤＬＬ３感作リンパ球を産生する方法であって、ＤＬＬ３ ＣＡＲによりリンパ球を形質転換するステップを含む、方法。
24. ＤＬＬ３感作リンパ球を産生する方法であって、ＤＬＬ３ ＣＡＲによりリンパ球を形質導入するステップを含む、方法。
25. ＤＬＬ３感作リンパ球を産生する方法であって、ＤＬＬ３ ＣＡＲによりリンパ球をトランスフェクトするステップを含む、方法。
26. ＤＬＬ３感作リンパ球および医薬として許容される担体を含有するレセプタクルを含む製品。
27. 請求項１１に記載の医薬組成物を含有するレセプタクルを含む製品。
28. 医薬組成物が、ウイルスベクターを含む、請求項２７に記載の製品。
29. 請求項１９に記載の医薬組成物を含有するレセプタクルを含む製品。
30. レセプタクルが、シリンジ、輸液バッグまたはバイアルを含む、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の製品。

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