JP2016536020A - 新規の抗クローディン抗体および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年11月6日に出願された米国仮出願第61/900,916号の利益を請求し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、EFS−WebによるASCIIフォーマットにおいて提出された配列表を含み、その全体は参照によって本明細書により組み込まれる。上記ASCIIコピーは、2014年11月5日に作成され、sc2701pct_S69697_1040WO_SEQL_110514.txtという名称で、サイズは229,316バイトである。
クローディン(Claudin)とは、上皮細胞シートまたは内皮細胞シートにおいて見出されるものなど、極性細胞型における最頂端部の細胞間接着結合である密着結合の主要な構造タンパク質を含む、内在性膜タンパク質である。密着結合は、細胞周辺で連続的シールを形成して、傍細胞空間における溶質および水の輸送に対する、物理的であるが、モジュレート可能な障壁をもたらす、ネットワーク状のタンパク質の鎖からなる。ヒトにおけるタンパク質のクローディンファミリーは、22〜34kDaの範囲にわたるサイズの、少なくとも23メンバーを構成する。全てのクローディンは、両方のタンパク質末端が、膜の細胞内表面上に配置される結果として、2つの細胞外(EC)ループであるEC1およびEC2の形成をもたらす、テトラスパニントポロジーを保有する。ECループは、一対一の同種親和性相互作用を媒介し、クローディンのある特定の組合せについては、密着結合の形成をもたらす異種親和性相互作用を媒介する。特異的なクローディン間相互作用およびクローディンのEC配列は、イオン選択性および密着結合強度の鍵となる決定基(例えば、Nakanoら、2009年、PMID:19696885を参照されたい)である。EC1は、約50〜60アミノ酸のサイズであり、大型のW−X(17〜22)−W−X(2)−C−X(8〜10)−Cモチーフ内の保存的ジスルフィド結合と、イオンチャネルの形成に関与する多数の帯電残基とを含有することが典型的である(TurksenおよびTroy、2004年、PMID:15159449)。EC2は、EC1より小型であり、約25アミノ酸である。そのヘリックス−ターン−ヘリックスコンフォメーションのために、EC2は、向かい側の細胞膜上のクローディンの二量体形成または多量体形成に寄与することが示唆されているが、両方のループ内の変異は、複合体の形成を攪乱する場合もある。in vitroにおけるクローディン間複合体は、関与する具体的なクローディンに応じて、二量体〜六量体の範囲のサイズにわたりうる(Krauseら、2008年、PMID:18036336)。個々のクローディンは、PCR解析により決定される通り、ある範囲にわたる組織特異的発現パターンのほか、発生的に調節された発現も示す(Krauseら、2008年、PMID:18036336;Turksen、2011年、PMID:21526417)。
現行のモデルによれば、腫瘍は、非腫瘍形成性細胞と腫瘍形成性細胞とを含む。非腫瘍形成性細胞は、自己再生する能力を有さず、免疫不全状態のマウスへと、過剰細胞数で移植する場合でもなお、腫瘍を増殖可能な形で形成することが不可能である。本明細書ではまた「腫瘍始原細胞」(TIC)とも称し、腫瘍の細胞集団のうちの0.1〜40%を占める腫瘍形成性細胞は、腫瘍を形成する能力を有する。腫瘍形成性細胞は、がん幹細胞(CSC)および腫瘍前駆細胞(TProg)として互換的に言及される、両方の腫瘍永続細胞(TPC)を包含する。
A.抗体の構造
許容された用語法および番号付けシステムを含む抗体および変異体ならびにこれらの誘導体については、例えば、Abbasら(2010年)、「Cellular and Molecular Immunology」6版、W.B. Saunders Company;またはMurpheyら(2011年)、「Janeway's Immunobiology」、8版、Garland Scienceにおいて広範に記載されている。
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:1)。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号:2)。
本発明の抗体は、当技術分野で公知の様々な方法を使用して産生することができる。
当技術分野では、多様な宿主動物によるポリクローナル抗体の産生が周知である(例えば、HarlowおよびLane(編)、「Antibodies: A Laboratory Manual」、(1988年)、CSH Press;ならびにHarlowら(1989年)、「Antibodies」、NY、Cold Spring Harbor Pressを参照されたい)。ポリクローナル抗体を作製するために、免疫応答性動物を抗原タンパク質または細胞または抗原タンパク質を含む調製物で免疫する。ある期間の後で、ポリクローナル抗体含有血清は、動物から採血するか、またはこれを屠殺することにより得る。血清は、動物から得られた形態で使用することもでき、免疫グロブリン画分または単離抗体調製物をもたらすように、抗体を、部分的または完全に精製することもできる。
選択された実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体の使用を想定する。「モノクローナル抗体」または「mAb」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、少量で存在しうる可能な変異(例えば、天然に存在する変異)を除き、集団を構成する個々の抗体は、同一である。
抗体は、完全ヒト抗体を含みうる。「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより産生される抗体および/または下記で記載されるヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体(好ましくは、モノクローナル抗体)を指す。
上記で記載した通りに、供給源抗体を生成し、選択し、単離したら、それらをさらに変化させて、薬学的特徴(pharmaceutical characteristic)が改善された抗CLDN抗体をもたらすことができる。供給源抗体は、所望の治療特性を有する導出抗体(derived antibody)をもたらすように、公知の分子操作技法を使用して、改変するか、または変化させることが好ましい。
本発明の選択された実施形態は、CLDNに免疫特異的に結合し、本開示の目的では、「供給源」抗体と考えられうる、マウス抗体を含む。選択された実施形態では、本発明に適合性の抗体は、供給源抗体の定常領域および/または抗原結合性アミノ酸配列の任意選択の改変により、このような「供給源」抗体から導出することができる。ある特定の実施形態では、供給源抗体内の選択されたアミノ酸を、欠失、変異、置換、組込み、または組合せにより変化させる場合、抗体は、供給源抗体から「導出」される。別の実施形態では、「導出」抗体は、供給源抗体の断片(例えば、1もしくは複数のCDRまたは重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全体)を、派生抗体(例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体)をもたらすように、アクセプター抗体配列と組み合わせるか、またはアクセプター抗体配列へと組み込んだ抗体である。これらの「導出」抗体は、下記で記載される標準的な分子生物学的技法を使用して、例えば、決定基に対するアフィニティーを改善するか;抗体の安定性を改善するか;細胞培養における産生および収率を改善するか; in vivoにおける免疫原性を低減するか;毒性を低減するか;活性部分のコンジュゲーションを容易とするか;または多重特異性抗体を創出するなどの目的で生成することができる。このような抗体はまた、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾(例えば、グリコシル化パターンまたはPEG化)により、供給源抗体から導出することもできる。
本発明の抗体は、細胞毒素または他の抗がん剤とのコンジュゲーションを容易とするように操作することができる(下記でより詳細に論じられる)。抗体薬物コンジュゲート(ADC)調製物は、細胞毒素の抗体上の位置および薬物対抗体比(DAR)に照らしたADC分子の均質な集団を含むと有利である。本開示に基づけば、当業者は、本明細書で記載される部位特異的に操作された構築物をたやすく作り出すことができる。本明細書で使用される「部位特異的抗体」または「部位特異的構築物」とは、重鎖内または軽鎖における少なくとも1つのアミノ酸を、少なくとも1つの遊離システインをもたらすように、欠失させるか、変化させるか、または置換した(好ましくは別のアミノ酸で)、抗体またはその免疫反応性断片を意味する。同様に、「部位特異的コンジュゲート」とは、部位特異的抗体と、不対合システイン(複数可)へとコンジュゲートさせた少なくとも1つの細胞毒素または他の化合物とを含むADCを意味するように理解するものとする。ある特定の実施形態では、不対合システイン残基は、不対合鎖内残基を含む。他の好ましい実施形態では、遊離システイン残基は、不対合鎖間システイン残基を含む。操作抗体は、多様なアイソタイプ、例えば、IgG、IgE、IgA、またはIgDの抗体であることが可能であり、これらのクラス内で、抗体は、多様なサブクラス、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4の抗体でありうる。IgG構築物について、抗体の軽鎖は、各々が、好ましい実施形態では、IgG1重鎖内のC220残基の欠如に起因して不対合でありうる、C214を組み込んでいるカッパアイソタイプまたはラムダアイソタイプのいずれかを含みうる。
本発明の選択された実施形態はまた、定常領域(すなわち、Fc領域)の置換または改変であって、限定せずに述べると、薬物動態の変化、血清中半減期の延長、結合アフィニティーの増加、免疫原性の低減、産生の増加、FcリガンドのFc受容体(FcR)への結合の変化、ADCCまたはCDCの増強または低減、グリコシル化および/またはジスルフィド結合の変化、ならびに結合特異性の改変を含むがこれらに限定されない、好ましい特徴を伴う化合物を結果としてもたらす、アミノ酸残基の置換、変異、および/または改変を含む、置換または改変も含みうる。
本発明を実施するのにどのような形態の抗体(例えば、キメラ、ヒト化など)を選択するのかに関わらず、その抗体の免疫反応性断片を、それら自体で、または抗体薬物コンジュゲートの一部として、本明細書の教示に従い使用しうることが十分に理解される。「抗体断片」は、無傷抗体の少なくとも一部を含む。本明細書で使用される抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合性断片を含み、「抗原結合性断片」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片であって、選択された抗原もしくはその免疫原性決定基に免疫特異的に結合するか、もしくはこれと反応するか、または断片が由来する無傷抗体と、特異的抗原結合について競合するポリペプチド断片を指す。
他の実施形態では、本発明の抗体およびコンジュゲートは、一価の場合もあり、多価(例えば、二価、三価など)の場合もある。本明細書で使用される「価数」という用語は、抗体に関連する、潜在的な標的結合性部位の数を指す。各標的結合性部位は、1つの標的分子または標的分子上の特異的位置もしくは特異的遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価である場合、分子の各結合性部位は、単一の抗原上の位置またはエピトープに特異的に結合する。抗体が、1つを超える標的結合性部位を含む(多価の)場合、各標的結合性部位は、同じ分子に特異的に結合する場合もあり、異なる分子に特異的に結合する場合もある(例えば、異なるリガンドに結合する場合もあり、異なる抗原に結合する場合もあり、同じ抗原上の異なるエピトープもしくは位置に結合する場合もある)。例えば、U.S.P.N.2009/0130105を参照されたい。
抗体およびその断片は、抗体産生細胞から得られる遺伝子材料および組換え技術を使用して、産生または改変することができる(例えば、BergerおよびKimmel、「Guide to Molecular Cloning Techniques」、「Methods in Enzymology」、152巻、Academic Press, Inc.、San Diego、CA;SambrookおよびRussell(編)(2000年)、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(3版)、NY、Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubelら(2002年)、「Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology」、Wiley, John & Sons, Inc.;U.S.P.N.7,709,611を参照されたい)。
どのようにして得られるにせよ、抗体産生細胞(例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど)は、例えば、頑健な成長、高い抗体産生、および目的の抗原に対する高アフィニティーなど、所望の抗体特徴を含む所望の特徴について、選択し、クローニングし、さらに、スクリーニングすることができる。ハイブリドーマは、細胞培養で、in vitroで増やすこともでき、同系免疫不全状態の動物において、in vivoで増やすこともできる。当業者には、ハイブリドーマおよび/またはコロニーを選択し、クローニングし、増やす方法が周知である。所望の抗体を同定したら、当技術分野で認知された、一般的な分子生物学的技法および生化学的技法を使用して、関与性の遺伝子材料を、単離し、操作し、発現させることができる。
選択された実施形態では、抗体産生細胞(例えば、ハイブリドーマまたは酵母コロニー)を、例えば、頑健な成長、高い抗体産生、および、下記でより詳細に論じられる、所望の部位特異的抗体の特徴を含む、好適な特性について選択し、クローニングし、さらにスクリーニングすることができる。他の場合、抗体の特徴は、特定の抗原(例えば、特異的CLDNアイソフォーム)または標的抗原の免疫反応性断片を、動物への接種のために選択することにより、付与することができる。さらに他の実施形態では、選択された抗体は、上記に記載した通り、アフィニティーまたは薬物動態など、免疫化学的特徴を増強または精緻化するように操作することができる。
選択された実施形態では、本発明の抗体は、「アンタゴニスト」または「中和」抗体でありうるが、これは、抗体は、決定基と会合し、直接、またはリガンドもしくは受容体など、決定基の結合性パートナーとの会合を防止し、これにより、そうでなければ、分子の相互作用から生じる、生物学的応答を中断させることにより、前記決定基の活性を遮断または阻害しうることを意味する。例えば、標的分子の活性により、またはin vitroにおける競合的結合アッセイにおいて測定される通り、過剰な抗体により、決定基へと結合した結合パートナーの量が、少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、またはこれを超えて低減される場合、中和抗体またはアンタゴニスト抗体は、決定基の、そのリガンドまたは基質への結合を実質的に阻害する。活性の改変は、当技術分野で認知された技法を使用して直接測定することもでき、変化した活性が下流に及ぼす影響(例えば、腫瘍形成または細胞の生存)により測定することもできることが十分に理解される。
発現したCLDNタンパク質の実質的な部分は、腫瘍形成性細胞表面との会合を維持し、これにより、開示される抗体またはADCの局在化および内部移行を可能とするという証拠が存在する。好ましい実施形態では、このような抗体を、内部移行すると細胞を死滅させる、1または複数の薬物へと、会合またはコンジュゲートさせる。特に好ましい実施形態では、本発明のADCは、内部移行部位特異的ADCを含む。
他の実施形態では、本発明の抗体は、枯渇化抗体である。「枯渇化」抗体という用語は、好ましくは、細胞表面上または細胞表面近傍において、抗原に結合し、細胞の死滅を誘導するか、促進するか、または引き起こす(例えば、CDC、ADCCまたは細胞傷害剤の導入によって)抗体を指す。好ましい実施形態では、選択された枯渇化抗体を、細胞毒素へとコンジュゲートさせる。枯渇化抗体は、定義された細胞集団におけるCLDN発現細胞のうちの少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、または99%を死滅させうることが好ましい。本明細書で使用される「見かけのIC50」という用語は、毒素へと連結された一次抗体が、一次抗体により認識される抗原(複数可)を発現する細胞のうちの50パーセントを死滅させる濃度を指す。毒素は、一次抗体へと直接コンジュゲートさせることもでき、一次抗体を認識する二次抗体または抗体断片を介して一次抗体と会合させ、これにより、二次抗体または抗体断片を、毒素へと直接コンジュゲートさせることもできる。枯渇化抗体のIC50は、5μM未満、1μM未満、100nM未満、50nM未満、30nM未満、20nM未満、10nM未満、5nM未満、2nM未満、または1nM未満であることが好ましい。一部の実施形態では、細胞集団は、富化、区分、精製、または単離された腫瘍形成性細胞であって、がん幹細胞を含む腫瘍形成性細胞を含みうる。他の実施形態では、細胞集団は、がん幹細胞を含む、全腫瘍試料を含む場合もあり、異質性の腫瘍抽出物を含む場合もある。本明細書の教示に従い、標準的な生化学的技法を使用して、腫瘍形成性細胞の枯渇をモニタリングおよび定量することができる。
本明細書では、特異的決定基、例えば、CLDNに対する結合アフィニティーが高い抗体が開示される。「KD」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離定数を指す。本発明の抗体は、解離定数であるKD(koff/kon)が、≦10−7Mである場合に、その標的抗原に免疫特異的に結合しうる。抗体は、KDが≦5×10−9Mである場合に、抗原に高アフィニティーで特異的に結合し、KDが≦5×10−10Mである場合に、抗原に著しい高アフィニティーで特異的に結合する。本発明の一実施形態では、抗体のKDは、≦10−9Mであり、オフ速度は、約1×10−4/秒である。本発明の一実施形態では、オフ速度は、<1×10−5/秒である。本発明の他の実施形態では、抗体は、決定基に、約10−7M〜10−10Mの間のKDで結合し、さらに別の実施形態では、≦2×10−10MのKDで結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、KD(koff/kon)が、10−6M未満、5×10−6M未満、10−7M未満、5×10−7M未満、10−8M未満、5×10−8M未満、10−9M未満、5×10−9M未満、10−10M未満、5×10−10M未満、10−11M未満、5×10−11M未満、10−12M未満、5×10−12M未満、10−13M未満、5×10−13M未満、10−14M未満、5×10−14M未満、10−15M未満、または5×10−15M未満である抗体を含む。
本明細書で使用される「ビニング」という用語は、それらの抗原結合特徴と、それらが互いと競合するのかどうかとに基づき、抗体を「ビン」へと群分けするのに使用される方法を指す。ビンについての初期決定は、エピトープマッピングおよび本明細書で記載される他の技法により、さらに精緻化および確認することができる。しかし、抗体の、個々のビンへの経験的な割当てにより、開示される抗体の治療的な潜在力を示しうる情報がもたらされることが十分に理解される。
ある特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体を、薬学的活性部分または診断用部分とコンジュゲートさせて、「抗体薬物コンジュゲート」(ADC)または「抗体コンジュゲート」を形成することができる。「コンジュゲート」という用語は、広義で使用され、会合法に関わらず、任意の薬学的活性部分または診断用部分の、本発明の抗体との共有結合的会合または非共有結合的会合を意味する。ある特定の実施形態では、会合は、抗体のリシン残基またはシステイン残基を介してなされる。特に好ましい実施形態では、薬学的活性部分または診断用部分は、1または複数の部位特異的遊離システイン(複数可)を介して、抗体へとコンジュゲートさせることができる。開示されるADCは、治療目的および診断的目的で使用することができる。
Ab−[L−D]nまたは薬学的に許容されるその塩[式中、
a)Abは、抗CLDN抗体を含み;
b)Lは、任意選択のリンカーを含み;
c)Dは、薬物を含み;
d)nは、約1〜約20の整数である]
により表すことができる。
本発明の抗体は、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、減量剤(debulking agent)、化学療法剤、放射線療法剤、ターゲティング抗がん剤、生物学的応答調節物質、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤、および免疫療法剤を含むがこれらに限定されない、抗がん剤などの治療用部分または薬物である、薬学的活性部分へとコンジュゲートさせるか、連結するか、融合させるか、または他の形で会合させることができる。
他の好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその断片もしくは誘導体は、例えば、生物学的分子(例えば、ペプチドまたはヌクレオチド)、低分子、フルオロフォア、または放射性同位元素でありうる、診断剤または検出剤、マーカーまたはレポーターへとコンジュゲートさせる。標識された抗体は、過剰増殖性障害の発症または進行をモニタリングするのに有用な場合もあり、開示される抗体を含む特定の治療の有効性を決定する(すなわち、治療診断)か、または将来の処置コースを決定する、臨床試験手順の一部として有用な場合もある。このようなマーカーまたはレポーターはまた、選択された抗体の精製、抗体アナリティックス(例えば、エピトープへの結合または抗体のビニング)、腫瘍形成性細胞の分離もしくは単離、または前臨床手順もしくは毒性研究において有用な場合もある。
選択された実施形態では、本発明の抗体を、抗体特徴を、所望の通りに、調整するか、変化させるか、改善するか、または緩和するのに使用されうる、生体適合性の修飾剤とコンジュゲートさせることができる。例えば、in vivoにおける半減期を延長した抗体または融合構築物は、市販のポリエチレングリコール(PEG)または類似する生体適合性のポリマーなど、比較的高分子量のポリマー分子に結合させることにより生成することができる。当業者は、PEGを、抗体に特異の特性(例えば、半減期を調整しうる)を付与するように選択しうる、多くの異なる分子量および分子立体配置(molecular configuration)で得られ得ることを十分に理解する。PEGは、多官能性リンカーを伴うかまたは伴わずに、PEGの、前記抗体または抗体断片のN末端またはC末端へのコンジュゲーションにより、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、抗体または抗体の断片もしくは誘導体へと結合させることができる。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化であって、結果としてもたらされる生物学的活性の喪失が最小限の誘導体化を使用することができる。コンジュゲーションの程度は、PEG分子の、抗体分子への最適なコンジュゲーションを確保するように、SDS−PAGEおよび質量分析で緊密にモニタリングすることができる。反応しなかったPEGは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−PEGコンジュゲートから分離することができる。同様にして、開示される抗体は、抗体または抗体断片を、in vivoにおいてより安定にするか、またはin vivoにおけるそれらの半減期を長くするように、アルブミンへとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、その技法が周知であり、例えば、WO93/15199、同WO93/15200、およびWO01/77137;ならびにEP0413,622を参照されたい。当業者には、他の生体適合性のコンジュゲートも明らかであり、本明細書の教示に従い、たやすく同定することができる。
多数のリンカー化合物を使用して、本発明の抗体を、関与性の薬物へとコンジュゲートさせることができる。リンカーは、反応性の残基(好ましくは、システインまたはリシン)および選択された薬物化合物と共有結合的に結合することが好ましい。したがって、選択された抗体の残基と反応し、本発明の比較的安定なコンジュゲート(部位特異的または他の形の)をもたらすのに使用しうる、任意のリンカーが、本明細書の教示に適合性である。
を含む。
−Phe−Lys−、−Val−Ala−、−Val−Lys−、−Ala−Lys−、−Val−Cit−、−Phe−Cit−、−Leu−Cit−、−Ile−Cit−、−Phe−Arg−、および−Trp−Cit−[式中、Citは、シトルリンである]
から選択される。
−Phe−Lys−、−Val−Ala−、−Val−Lys−、−Ala−Lys−、および−Val−Cit−
から選択されることが好ましい。
に例示される、−NH−Val−Ala−CO−NH−PABC−基を形成する。酵素によるジペプチドの切断の際に、自壊型リンカーは、下記:
に示される線に沿って進行する、遠隔部位の活性化がなされると、保護された化合物(すなわち、細胞毒素)の完全な放出を可能とする。薬物の完全な放出により、所望の毒性活性の維持が確保される。
である。この実施形態では、S原子は、部位特異的遊離システインに由来することが好ましい。他の適合性のリンカーに関して述べると、結合性部分は、活性化残基と反応させて、所望のコンジュゲートをもたらしうる、末端ヨードアセトアミドを含む。いずれにせよ、当業者であれば、開示される薬物−リンカー化合物の各々を、本開示の観点で適合性の抗CLDN部位特異的抗体とたやすくコンジュゲートさせうる。
多数の周知の異なる反応を使用して、薬物部分および/またはリンカーを、選択された抗体へと結合させうることが十分に理解される。例えば、システインのスルフヒドリル基を利用する多様な反応を用いて、所望の部分をコンジュゲートさせることができる。特に好ましい実施形態は、下記で詳細に論じられる1または複数の遊離システインを含む抗体のコンジュゲーションを含む。他の実施形態では、本発明のADCは、選択された抗体に存在するリシン残基の、溶媒へと曝露されたアミノ基への薬物のコンジュゲーションにより生成することができる。さらに他の実施形態は、N末端のトレオニン残基およびセリン残基の活性化であって、次いで、開示されるペイロードを抗体へと結合させるのに使用されうる活性化を含む。選択されたコンジュゲーション法は、抗体へと結合させた薬物の数を最適化し、比較的高い治療指数をもたらすように調整することが好ましい。
本発明の部位特異的抗体とのコンジュゲーションの利点のうちの1つは、狭いDAR分布を含む、比較的均質なADC調製物を作り出す能力である。これに関して、開示される構築物および/または選択的なコンジュゲーションは、薬物と操作抗体との間の化学量論比についての、試料中のADC種の均質性をもたらす。上記で簡略に論じた通り、「薬物対抗体比」または「DAR」という用語は、薬物の抗体に対するモル比を指す。一部の実施形態では、コンジュゲート調製物は、そのDAR分布に関して、実質的に均質でありうるが、これは、調製物中に、特定のDAR(例えば、2または4のDAR)を伴う部位特異的ADCの主要な種であって、ローディングの部位(すなわち、遊離システイン上)に関してもまた一様な種が存在することを意味する。本発明のある特定の実施形態では、部位特異的抗体または選択的な組合せの使用により、所望の均質性を達成することが可能である。他の好ましい実施形態では、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた、部位特異的構築物の使用により達成することができる。さらに他の特に好ましい実施形態では、調製物は、解析用クロマトグラフィー技法または調製用クロマトグラフィー技法を使用して、さらに精製することができる。これらの実施形態の各々では、ADC試料の均質性を、SDS−PAGE、HPLC(例えば、サイズ排除HPLC、RP−HPLC、HIC−HPLCなど)、またはキャピラリー電気泳動を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の多様な技法を使用して解析することができる。
A.診断法
本発明は、増殖性障害を検出、診断、またはモニタリングするためのin vitro法またはin vivo法、および患者に由来する細胞をスクリーニングして、腫瘍形成性細胞を含む腫瘍細胞を同定する方法を提供する。このような方法は、がんを処置するか、またはその進行をモニタリングするために、がんを有する個体を同定するステップであって、患者または患者から得られた試料(in vivo試料またはin vitro試料のいずれか)を、本明細書で記載される抗体と接触させることと、抗体の、試料中の結合した標的分子もしくは遊離標的分子との会合の存在もしくは非存在またはレベルを検出することとを含むステップを含む。一部の実施形態では、抗体は、本明細書で記載される検出可能な標識またはレポーター分子を含む。
ある特定の実施形態では、抗体は、決定基と相互作用することにより、腫瘍細胞の機能または活性を変化させる化合物または薬剤(例えば、抗体またはADC)を同定するために、試料をスクリーニングするのに使用することができる。一実施形態では、腫瘍細胞を、抗体またはADCと接触させ、抗体またはADCを、診断目的を含むがこれらに限定されない目的でこのような細胞を同定するか、このような細胞をモニタリングして、処置の有効性を決定するか、または細胞集団をこのような標的発現細胞について富化するために、腫瘍を、ある特定の標的(例えば、CLDN)を発現する細胞についてスクリーニングするのに使用することができる。
A.製剤および投与経路
本発明の抗体またはADCは、当技術分野で認知された技法を使用して、多様な方法で製剤化することができる。一部の実施形態では、本発明の治療用組成物は、さらなる成分を伴わずに投与することもでき、最小限のさらなる成分を伴って投与することもできるが、他のものは、任意選択で、適切な、薬学的に許容される担体を含有するように製剤化することもできる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、当技術分野で周知の賦形剤、ビヒクル、アジュバント、および希釈剤を含み、医薬調製物における使用のための商業的供給元から入手可能でありうる(例えば、Gennaro(2003年)、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus」、20版、Mack Publishing; Anselら(2004年)、「Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems」、7版、Lippencott Williams and Wilkins; Kibbeら(2000年)、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」、3版、Pharamaceutical Pressを参照されたい)。
特定の投与レジメン、すなわち、用量、投与時期、および投与回数は、特定の個体に依存するほか、薬物動態(例えば、半減期、クリアランス速度など)などの経験的な検討事項にも依存する。投与頻度の決定は、主治医などの当業者が、処置される状態および状態の重症度、処置される被験体の年齢および全般的健康状態などの検討に基づき下すことができる。投与頻度は、治療コースにわたり、選択された組成物および投与レジメンの有効性についての評価に基づき調整することができる。このような評価は、特異的な疾患、障害、または状態についてのマーカーに基づき行うことができる。個体ががんを有する実施形態では、これらは、触診もしくは目視観察を介する腫瘍サイズの直接的な測定;x線もしくは他のイメージング技法による腫瘍サイズの間接的な測定;直接的な腫瘍の生検および腫瘍試料の顕微鏡検査により評価される改善;本明細書で記載される方法に従い同定される、間接的な腫瘍マーカー(例えば、前立腺がんについてのPSA)もしくは抗原についての測定;増殖性細胞もしくは腫瘍形成性細胞の数の低減、このような新生物性細胞の低減の維持;新生物性細胞の増殖の低減;または転移の発症の遅延を含む。
CLDNタンパク質は、上皮細胞の密着結合において発現し、そこで、上皮細胞間の細胞間空間における分子の流動を制御する傍細胞障壁を確立すると考えられている。抗CLDN抗体の使用により、上皮細胞の密着結合の破壊を結果としてもたらすことができ、これにより、そうしなければ、がん細胞に浸透することが可能でない、治療剤の接近を改善することができる。したがって、本発明の抗CLDN抗体およびADCと組み合わせた多様な療法の使用は、がんを防止または処置するのに有用であり、がんの転移または再発を防止するのにも有用である。本明細書で使用される「組合せ療法」は、少なくとも1つの抗CLDN抗体またはADC、および少なくとも1つの治療用部分(例えば、抗がん剤)を含む組合せであって、好ましくは、がんの処置において、(i)単独で使用される抗CLDN抗体またはADC、もしくは(ii)単独で使用される治療用部分、もしくは(iii)抗CLDN抗体またはADCを追加せずに別の治療用部分と組み合わせた治療用部分の使用を凌駕する治療的相乗作用を有するか、または測定可能な治療効果を改善する組合せの投与を意味する。本明細書で使用される「治療的相乗作用」という用語は、抗CLDN抗体またはADCと1または複数の治療用部分との組合せであって、抗CLDN抗体またはADCと1または複数の治療用部分との組合せの相加効果を超える治療効果を有する組合せを意味する。
本明細書で使用される「抗がん剤」または「化学療法剤」という用語は、「治療用部分」の1つのサブセットであり、「治療用部分」とは、「薬学的活性部分」として記載される薬剤のサブセットである。より特定すると、「抗がん剤」とは、がんなどの細胞増殖性障害を処置するのに使用しうる任意の薬剤を意味し、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、ターゲティング抗がん剤、生物学的応答調節物質、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤、および免疫療法剤を含むがこれらに限定されない。上記で論じた、選択された実施形態では、このような抗がん剤は、コンジュゲートを含むことが可能であり、投与の前に抗体と会合させうることが十分に理解される。ある特定の実施形態では、開示される抗がん剤を、抗体へと連結して、本明細書で開示されるADCをもたらす。
本発明はまた、抗体またはADCの、放射線療法(すなわち、DNA損傷を腫瘍細胞内に局所的に誘導するための任意の機構であって、ガンマ線照射、X線、UV照射、マイクロ波、電子放射などの機構)との組合せも提供する。また、放射性同位元素を、腫瘍細胞への指向性送達を使用する組合せ療法も想定され、開示される抗体またはADCを、ターゲティング抗がん剤または他のターゲティング手段との関連で使用することもできる。放射線療法は、パルスで、約1〜約2週間の期間にわたり投与することが典型的である。放射線療法は、頭頸部がんを有する被験体には、約6〜7週間にわたり投与することができる。任意選択で、放射線療法は、単回投与として投与することもでき、複数回にわたる逐次投与として投与することもできる。
本発明は、本発明の抗体およびADCの使用であって、新生物性障害、炎症性障害、血管新生性障害、および免疫障害、ならびに病原体により引き起こされる障害を含む多様な障害の診断、治療診断、処置、および/または予防のための使用を提供する。特に、処置の鍵となる標的は、充実性腫瘍を含む新生物性状態であるが、血液悪性腫瘍も、本発明の範囲内にある。ある特定の実施形態では、本発明の抗体を使用して、特定の決定基(例えば、CLDN)を発現する腫瘍または腫瘍形成性細胞を処置する。処置される「被験体」または「患者」は、ヒトであることが好ましいが、本明細書で使用される通り、その用語は明示的には、任意の哺乳動物種を含むものとする。
本発明は、1または複数の容器を含む、医薬パックおよび医薬キットを含み、この場合、容器は、1回または複数回の投与分の、本発明の抗体またはADCを含みうる。ある特定の実施形態では、パックまたはキットは、単位投与量を含有するが、これは、所定量の組成物であって、例えば、1または複数のさらなる薬剤、および、任意選択で、1または複数の抗がん剤を伴うかまたは伴わずに、本発明の抗体またはADCを含む組成物を意味する。
本明細書でそうでないことが定義されない限り、本発明との関連で使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によりそうでないことが要請されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲で提示される範囲は、端点および端点の間の全ての点の両方を含む。したがって、2.0〜3.0の範囲は、2.0、3.0、および2.0と3.0との間の全ての点を含む。
本明細書で引用される、全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に入手可能な材料(例えば、GenBankおよびRefSeqにおける、ヌクレオチド配列の寄託、ならびに、例えば、SwissProt、PIR、PRF、PBDにおけるアミノ酸配列の寄託、ならびにGenBankおよびRefSeqにおける、注釈を施されたコード領域からの翻訳を、例えば、含む)についての完全な開示は、特定の参考文献との関連で「参照により組み込まれた」という語句が使用されているのかいないのかに関わらず、参照により組み込まれる。前出の詳細な記載および後続の実施例は、理解の明確さのためだけに与えられる。そこから不要な限定がなされるわけではないものと理解されたい。本発明は、示され、記載される、正確な詳細に限定されるわけではない。特許請求の範囲により定義される本発明には、当業者に明白な変化も含まれる。本明細書で使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される内容を限定するとはみなさないものとする。
このように一般的に記載された本発明は、例示を目的として提示されるものであり、本発明を限定することを意図されるものではない、以下の実施例を参照することにより、よりたやすく理解される。実施例は、下記の実験が、実施される全ての実験または唯一の実験であることを表すように意図されるものではない。そうでないことが指し示されない限りにおいて、部分は、重量による部分であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧または大気圧近傍の圧力である。
全トランスクリプトームシーケンシングを使用する、CLDN4、CLDN6、およびCLDN9の発現の同定
がん患者において存在するときの、充実性腫瘍の細胞異質性を特徴付け、特定の表現型マーカーを使用するCSCの同定の一助とし、臨床的に関与性の治療標的を同定するために、当技術分野で認知された技法を使用して、大規模なPDX腫瘍バンクを開発および維持した。PDX腫瘍バンクは、多数の個別の腫瘍細胞系を含み、元は、様々な悪性の充実性腫瘍に罹患する多数のがん患者から得られた異質性の腫瘍細胞の、複数回の継代により、免疫不全状態のマウスにおいて増殖させた。PDX腫瘍により、CSCの再現可能で反復的な特徴づけが可能となるので、十分に定義された系統を有する、多数の個別の早期継代PDX腫瘍細胞系の持続的な利用可能性により、CSCの同定および単離が大幅に容易となる。最小限に継代されたPDX腫瘍細胞系の使用により、in vivo実験が簡略化され、たやすく検証可能な結果がもたらされる。さらに、早期継代のPDX腫瘍は、イリノテカン(すなわち、Camptosar(登録商標))などの治療剤に応答することから、腫瘍の成長、現行の治療に対する抵抗性、および腫瘍の再発を駆動する根底的な機構に対する、臨床的に関与性の洞察がもたらされる。
qRT−PCRを使用する、腫瘍におけるCLDN4 mRNA、CLDN6 mRNA、およびCLDN9 mRNAの発現
腫瘍細胞亜集団において、CLDN4、CLDN6の発現を確認し、CLDN9の発現をさらに画定するために、qRT−PCRを、多様なPDXモデルに由来する、分取されたCSC集団およびNTG集団(実施例1で記載した)から得られたRNA試料に対して施した。業界の標準的なプロトコールに従い、Fluidigm BioMark(商標)HD Systemを使用して、qRT−PCRを実施した。製造業者の指示に従い、High Capacity cDNA Archiveキット(Life Technologies)を使用して、実施例1で記載した通りに調製された1ngのRNAを、cDNAへと転換した。CLDN4、CLDN6、およびCLDN9に特異的なTaqmanアッセイを使用して、cDNA材料をあらかじめ増幅し、次いで、後続のqRT−PCR実験のために使用した。
がんゲノムアトラスによる、原発性腫瘍におけるCLDNの発現プロファイル
Cancer Genome Atlas(TCGA、National Cancer Institute)として公知の、腫瘍試料および正常試料の大規模な公開されて利用可能なデータセットを使用して、多様な腫瘍におけるCLDN6ファミリーメンバーおよびCLDN9ファミリーメンバーのmRNA過剰発現が確認された。IlluminaHiSeq_RNASeqV2プラットフォームによるエクソンレベル3の発現データは、TCGA Data Portal(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp)からダウンロードし、解析し、各単一の遺伝子の個別のエクソンに由来するリードを統合して、各試料における各遺伝子について、マッピングされたリード100万当たりエクソン1キロ塩基当たりの単一値のリード(RPKM)を生成した。次いで、Tableauソフトウェアを使用して、ロールアップされたデータを表示した。CLDN6およびCLDN9について解析されたデータを、それぞれ、図3Aおよび3Bに示し、ここで、各試料は、単一のドットとして表示され、水平方向の黒線は、所与の正常組織または腫瘍亜型において、区切られたデータ点についての四分位数の境界を表す。図3Aは、CLDN6の発現が、卵巣漿液性嚢胞腺癌として亜型化されたOV腫瘍において、他の全ての正常組織と比較して上昇することを示す。加えて、CLDN6は、多数のLU−Ad試料においても、正常肺試料、および実質的な数の侵襲性乳癌腫瘍(BRCA)と比較して上昇する。CLDN6について観察された過剰発現パターンと同様な過剰発現パターンは、CLDN9についても見ることができる(図3B)。ここでもまた、これらのデータにより、CLDN6およびCLDN9の発現レベルは、多様な腫瘍内の腫瘍形成を示し、潜在的な治療標的としてのそれらの選択を確固とすることが指し示される。
組換えCLDNタンパク質のクローニングおよび発現、ならびに細胞表面CLDNタンパク質を過剰発現する細胞系の操作
クローディンタンパク質配列間の関係を推定するために、Vector NTIソフトウェアパッケージのAlignXプログラムを使用して、23のヒトCLDN遺伝子に由来する30のクローディンタンパク質配列をアライメントした。このアライメントの結果を、図4A内のデンドログラムとして描示する。図を調べることにより、CLDN6とCLDN9とは、配列が極めて近縁であり、デンドログラムの同じ分枝上で互いと隣接して出現することが示される。図4Aはまた、CLDN4が、CLDN6に対して、次にすこぶる近縁のファミリーメンバーであることも示す。データをより詳細に調べることにより、ヒトCLDN6タンパク質は、細胞外ドメイン(ECD)において、ヒトCLDN9タンパク質配列と極めて近縁であり、ECD1における同一性は>98%であり、ECD2における同一性は>91%であることが示される(図4B)。また、ヒトCLDN4も、ECD配列において、ヒトCLDN6と近縁であり、ECD1における同一性は>84%であり、ECD2における同一性は>78%であることが見出された(図4B)。これらのタンパク質配列の関係に基づき、ヒトCLDN6抗原で免疫すれば、ヒトCLDN6を認識する抗体であって、また、ヒトCLDN9とも交差反応性であり、おそらくまた、ヒトCLDN4とも交差反応性の抗体がもたらされることを仮定した。
ヒトCLDN6(hCLDN6)タンパク質に関して、本発明で要請される、全ての分子材料および細胞材料を作り出すために、NCBIタンパク質受託番号NP_067018と同一なタンパク質をコードするコドン最適化DNA断片を合成した(IDT)。このDNAクローンを、成熟hCLDN6タンパク質またはその断片を発現する構築物に対する全ての後続の操作のために使用した。同様に、ヒトCLDN4(hCLDN4)についての、NCBIタンパク質受託番号NP_001296と同一なタンパク質をコードするコドン最適化DNA断片、またはヒトCLDN9(hCLDN9)についての、NCBIタンパク質受託番号NP_066192と同一なタンパク質をコードするコドン最適化DNA断片を購入し、hCLDN4タンパク質もしくはhCLDN9タンパク質またはこれらの断片を発現する構築物に対する全ての後続の操作のために使用した。
マウスCLDN6(mCLDN6)タンパク質に関して、本発明で要請される、全ての分子材料および細胞材料を作り出すために、NCBIタンパク質受託番号NP_061247と同一なタンパク質をコードするコドン最適化DNA断片を合成した(IDT)。このDNAクローンを、成熟mCLDN6タンパク質またはその断片を発現する構築物に対する全ての後続の操作のために使用した。同様に、マウスCLDN4(mCLDN4)についての、NCBIタンパク質受託番号NP_034033と同一なタンパク質をコードするコドン最適化DNA断片を購入し、成熟mCLDN4タンパク質またはこれらの断片を発現する構築物に対する全ての後続の操作のために使用した。
ラットCLDN6(rCLDN6)タンパク質に関して、本発明で要請される、全ての分子材料および細胞材料を作り出すために、NCBIタンパク質受託番号NP_001095834と同一なタンパク質をコードするコドン最適化DNA断片を合成した(IDT)。このDNAクローンを、成熟rCLDN6タンパク質またはその断片を発現する構築物に対する全ての後続の操作のために使用した。同様に、ラットCLDN4(rCLDN4)についての、NCBIタンパク質受託番号NP_001012022と同一なタンパク質をコードするコドン最適化DNA断片を購入し、成熟rCLDN4タンパク質またはこれらの断片を発現する構築物に対する全ての後続の操作のために使用した。
当技術分野で認知された技法を使用して、HEK−293T細胞系または3T3細胞系に形質導入するようにレンチウイルスベクターを使用して、上記で列挙された多様なCLDNタンパク質を過剰発現する、操作された細胞系を構築した。まず、上記で鋳型として記載した、市販品の合成DNA断片を使用して目的のタンパク質(例えば、hCLDN6、mCLDN6、rCLDN6、hCLDN9、hCLDN4、mCLDN4、またはrCLDN4)をコードするDNA断片を増幅するのに、PCRを使用した。次いで、個別のPCR生成物を、レンチウイルス発現ベクターであるpCDH−EF1−MCS−T2A−GFP(System Biosciences)の多重クローニング部位(MCS)へとサブクローニングして、一連のレンチウイルスベクターを作り出した。結果として得られるpCDH−EF1−CLDN−T2A−GFPベクター内のT2A配列は、ペプチド結合の縮合部に対するリボソームスキッピングを促進する結果として、2つの独立のタンパク質:T2Aペプチドの下流でコードされるGFPマーカータンパク質の共発現を伴う、T2Aペプチドの上流でコードされる、特異的なCLDNタンパク質の高レベル発現をもたらす。この一連のレンチウイルスベクターは、当業者に周知の標準的なレンチウイルス形質導入技法を使用して、個別のCLDNタンパク質を過剰発現する、別個の安定的なHEK−293T細胞系または3T3細胞系を作製するのに使用した。CLDN陽性細胞は、GFPについてもまた強く陽性の高発現HEK−293Tサブクローンを使用して、FACSにより選択した。
抗CLDN抗体の作製
CLDN6は、CLDN4およびCLDN9と最も相同である(図4Aおよび上記の実施例4で記載した解析を参照されたい)ため、CLDN6を、多重反応性の抗CLDN抗体を生成するための免疫原として使用した。抗体生成するハイブリドーマを産生するために、マウスに、hCLDN6を過剰発現するHEK−293T細胞または3T3細胞(実施例4で記載した通りに作り出された)を接種した。6匹のマウス(以下の系統:Balb/c、CD−1、FVBの各々2匹ずつ)に、等体積のTiterMax(登録商標)アジュバントで乳化させたhCLDN6−HEK−293T細胞100万個を接種した。6匹のマウス(以下の系統:Balb/c、CD−1、FVBの各々2匹ずつ)への、2回目の別個の接種は、CLDN6を過剰発現する3T3細胞を使用して実施した。初回の接種に続き、マウスに、毎週2回ずつ4週間にわたり、等体積のアラムアジュバントで乳化させた、CLDN6を過剰発現する細胞を注射した。
抗CLDN抗体のシーケンシング
抗CLDN抗体は、上記で記載した通りに生成し、次いで、以下の通りに配列決定した。全RNAは、製造業者の指示に従い、RNeasy Miniprepキット(Qiagen)を使用して、選択されたハイブリドーマ細胞から精製した。試料当たり104〜105個の間の細胞を使用した。単離されたRNA試料は、使用するまで−80℃で保存した。各ハイブリドーマのIg重鎖の可変領域を、全てのマウスIgアイソタイプに特異的な、3’マウスCγプライマーと組み合わせて、完全なマウスVHレパートリーをターゲティングするようにデザインされた、86のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む、2つの5’プライマーミックスを使用して増幅した。同様に、カッパ軽鎖を増幅および配列決定するために、VKマウスファミリーの各々を増幅するようにデザインされた、64の5’VKリーダー配列を含有する2つのプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に対して特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて使用した。VH転写物およびVL転写物は、100ngの全RNAから、Qiagen One Step RT−PCRキットを使用して、以下の通りに増幅した。各ハイブリドーマについて、2回はVK軽鎖についてであり、2回はVH重鎖についてである、のべ4回にわたるRT−PCR反応を施した。PCR反応混合物は、1.5μLのRNA、100μMの重鎖プライマーまたはカッパ軽鎖プライマー0.4μL(IDTにより特注で合成された)、5倍濃度のRT−PCR緩衝液5μL、1μLのdNTP、ならびに逆転写酵素およびDNAポリメラーゼを含有する酵素ミックス0.6μLを含んだ。サーマルサイクラープログラムは、以下のステップ:50℃で60分間、95℃で15分間のRTステップに続く、(94.5℃で30秒間、57℃で30秒間、72℃で1分間)による35サイクル、および72℃で10分間にわたる最終インキュベーションを含んだ。抽出されたPCR生成物は、上記で記載した、同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。PCR生成物は、PCR精製およびシーケンシングサービスのためのシーケンシング提供業者(MCLAB)へと送付した。
キメラ抗CLDN抗体およびヒト化抗CLDN抗体の作製
キメラ抗CLDN抗体は、当技術分野で認知された技法を使用して、以下の通りに作製した。全RNAは、実施例6で記載した方法を使用して、抗CLDN抗体産生ハイブリドーマから抽出し、RNAはPCR増幅した。マウス抗体のVH鎖およびVL鎖のV遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント、およびJ遺伝子セグメントに関するデータは、本発明の抗CLDN抗体の核酸配列(核酸配列については、図5Cを参照されたい)から得た。以下の制限部位:VH断片のためのAgeIおよびXhoI、ならびにVL断片のためのXmaIおよびDraIIIを使用して、抗体のVH鎖およびVL鎖のフレームワーク配列に対して特異的なプライマーセットをデザインした。PCR産物を、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)で精製した後、VH断片のための制限酵素AgeIおよびXhoI、ならびにVL断片のための制限酵素XmaIおよびDraIIIで消化した。消化されたVHおよびVLのPCR産物を精製し、それぞれ、IgH発現ベクターまたはIgK発現ベクターへとライゲーションした。ライゲーション反応は、200UのT4−DNA Ligase(New England Biolabs)、7.5μLの消化および精製された遺伝子特異的PCR産物、ならびに25ngの直鎖化ベクターDNAを有する10μLの総体積で実施した。コンピテントのE.coli DH10B菌株(Life Technologies)を、42℃の熱ショックを介して、3μLのライゲーション産物で形質転換し、アンピシリンプレートへと、100μg/mLの濃度でまいた。増幅されたライゲーション産物の精製および消化に続き、VH断片を、HuIgG1を含むpEE6.4発現ベクター(Lonza)(pEE6.4HuIgG1)のAgeI−XhoI制限部位へとクローニングし、VL断片を、ヒトカッパ軽鎖定常領域を含むpEE12.4発現ベクター(Lonza)(pEE12.4Hu−Kappa)のXmaI−DraIII制限部位へとクローニングした。
部位特異的抗CLDN抗体の作製
操作ヒトIgG1/カッパ抗CLDN部位特異的抗体であって、天然の軽鎖(LC)定常領域と、変異させた重鎖(HC)定常領域とを含み、LC内のシステイン214(C214)と鎖間ジスルフィド結合を形成する、HCの上部ヒンジ領域内のシステイン220(C220)を、セリンで置換した(C220S)抗体を構築した。アセンブルされると、HCとLCとは、治療剤へのコンジュゲーションに適する、2つの遊離システインを含む抗体を形成する。そうでないことが注記されない限りにおいて、定常領域残基の全ての番号付けは、Kabatらにおいて示されるEU番号付けスキームに従う。
を作製した。
抗CLDN抗体の特異性
実施例5で記載した通りに作り出されたマウス抗体を特徴づけして、それらが、CLDNファミリーメンバーおよびCLDNファミリーメンバーのオルソログと交差反応するのかどうかを決定した。
フローサイトメトリーを使用する、PDX腫瘍上のCLDNタンパク質の発現の検出
フローサイトメトリーを使用して、2つの代表的なhCLDN6結合性抗体である、hSC27.1およびhSC27.22が、PDX腫瘍細胞の表面上のhCLDNタンパク質の存在を特異的に検出する能力を評価した。アイソタイプ染色対照およびfluorescence minus one(FMO)対照を用いて、染色特異性を確認した。
がん幹細胞集団におけるCLDN発現の富化
腫瘍細胞は、2つの種類の細胞亜集団:非腫瘍形成性細胞(NTG)および腫瘍始原細胞または腫瘍形成性細胞へと大きく分けることができる。腫瘍形成性細胞は、免疫不全状態のマウスへと植え込まれると、腫瘍を形成する能力を有するのに対し、非腫瘍形成性細胞は、腫瘍を形成する能力を有さない。がん幹細胞(CSC)は、腫瘍形成性細胞のサブセットであり、多重系列分化能を維持しながら、無際限に自己複製することが可能である。
抗CLDN抗体は、in vitroにおける細胞傷害剤の送達を容易とする
抗CLDN抗体は、内部移行し、細胞傷害剤の、腫瘍生細胞への送達を媒介しうるのかどうかを決定するため、選択された抗CLDN抗体と、抗マウス二次抗体FAB断片へと連結されたサポリンとを使用して、in vitroにおける細胞殺滅アッセイを実施した。サポリンとは、リボソームを不活化させ、これにより、タンパク質の合成を阻害し、結果として細胞死をもたらす、植物毒素である。サポリンが細胞傷害性であるのは、それがリボソームへ到達した細胞内に限るが、それ自体で内部移行することは不可能である。したがって、これらのアッセイにおける、サポリン媒介型細胞性細胞傷害作用(saporin-mediated cellular cytotoxicity)は、抗CLDN抗体が標的細胞に結合して内部移行したときのみ、抗マウスFAB−サポリンコンジュゲートが標的細胞へと内部移行する能力を示す。
免疫組織化学検査を使用する、腫瘍表面上のCLDN6の検出
腫瘍におけるCLDN6タンパク質発現の程度を評価するため、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)PDX腫瘍についての免疫組織化学検査(IHC)および原発性卵巣腫瘍(Oklahoma University)についての組織マイクロアレイ(TMA)を実施した。
抗CLDN6抗体−薬物コンジュゲートの調製
Ab−[L−D]構造[式中、Abは、抗CLDN抗体を指し、Lは、任意選択のリンカー(例えば、遊離スルフヒドリル基を伴う末端マレイミド部分を含むリンカー)を指し、Dは、薬物または細胞毒素(例えば、オーリスタチン、カリケアマイシンなど)を指す]を有する、抗CLDN抗体薬物コンジュゲート(ADC)を調製する。各ADCは、リンカー−薬物へと共有結合的に連結された抗CLDN抗体を含む。ADCは、当技術分野で公知の技法を使用して、例えば、本質的には以下の通りに合成および精製する。抗CLDN抗体のシスチン結合を、5mMのEDTAを伴うリン酸緩衝食塩液(PBS)中に、抗体1モル当たり所定のモル添加量であるモル数のトリス(2−カルボキシエチル)−ホスフィン(TCEP)により、20℃で90分間にわたり部分的に還元する。ジメチルアセトアミド(DMA)に溶解したリンカー−薬物を、抗CLDN抗体1モル当たり3モルの比で添加する。水中で調製されたN−アセチルシステイン(NAC)の10mM原液を使用して、反応を30分間にわたり進行させ、過剰量のNACの、リンカー−薬物への添加によりクエンチする。最小限のクエンチ時間である20分後、0.5Mの酢酸を添加することにより、pHを6.0へと調整し、30kDaの膜を使用するダイアフィルトレーションにより、ダイアフィルトレーション緩衝液へと緩衝液交換した。次いで、ダイアフィルトレーションされた抗CLDN ADCを、スクロースおよびポリソルベート20により、標的の最終濃度へと製剤化する。結果として得られる抗CLDN ADCを、タンパク質濃度(UVを測定することにより)、凝集(SEC)、逆相HPLC(RP−HPLC)による薬物対抗体比(DAR)、およびin vitroにおける細胞傷害作用について解析する。
選択的還元プロセスを使用する、部位特異的抗CLDN抗体のコンジュゲーション
上記の実施例14で記載した通りに、Ab−[L−D]構造を有する抗CLDN抗体薬物コンジュゲート(ADC)であって、Ab部分が、上記の実施例8で示したように作り出した部位特異的抗体、例えば、hSC27.22ss1であるADCを調製する。所望の生成物は、各LC定常領域上の不対合システイン(IgG1部位特異的抗体の場合のC214、またはIgG4部位特異的抗体上のC127)上に最大限にコンジュゲートし、薬物対抗体比(DAR)が2を超える(DAR>2)か、または2未満(DAR<2)であるADCを最小化しながら、DARが2(DAR=2)であるADCを最大化するADCである。
ヒト化抗CLDN抗体薬物コンジュゲートは、in vivoにおける腫瘍の成長を抑制する
例えば、上記の実施例14および15で記載した通りに作り出された抗CLDN ADCについて、下記で本質的に記載する通りに、当技術分野で認知された技法を使用して調べて、免疫不全マウスにおける卵巣腫瘍の成長を抑制するそれらの能力を裏付ける。
抗CLDN抗体−薬物コンジュゲートによるがん幹細胞頻度の低減
実施例11で裏付けた通り、CLDNの発現は、がん幹細胞と関連する。したがって、抗CLDN ADCによる処置により、薬物抵抗性であり、腫瘍の再発および転移を促進することが公知である、がん幹細胞(CSC)の頻度が低減されることを裏付けるために、例えば、下記で本質的に記載する通りに、in vivoにおける限界希釈アッセイ(LDA)を実施する。
Claims (32)
- CLDNファミリーの少なくとも1つのタンパク質を発現するがん幹細胞に結合する抗体。
- CLND6に特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。
- CLDN6およびCLDN9に特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。
- CLDN6およびCLDN9に、実質的に同じ見かけの結合アフィニティーで、特異的に結合する、請求項3に記載の抗体。
- CLDN6およびCLDN9に、実質的に同じ見かけの結合アフィニティーで、特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。
- 内部移行抗体である、請求項1から5に記載の抗体。
- CLDNファミリーの少なくとも1つのメンバーに結合し、結合について、
配列番号21の軽鎖可変領域(VL)および配列番号23の重鎖可変領域(VH);または
配列番号25のVLおよび配列番号27のVH;または
配列番号29のVLおよび配列番号31のVH;または
配列番号33のVLおよび配列番号35のVH;または
配列番号37のVLおよび配列番号39のVH;または
配列番号41のVLおよび配列番号43のVH;または
配列番号45のVLおよび配列番号47のVH;または
配列番号49のVLおよび配列番号51のVH;または
配列番号53のVLおよび配列番号55のVH;または
配列番号57のVLおよび配列番号59のVH
を含む抗体と競合する抗体。 - CLND6に特異的に結合する、請求項7に記載の抗体。
- CLDN6およびCLDN9に特異的に結合する、請求項7に記載の抗体。
- キメラ抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、または組換え抗体、またはこれらの断片である、請求項7に記載の抗体。
- 内部移行抗体である、請求項7に記載の抗体。
- CLDNファミリーの少なくとも1つのタンパク質に結合し、結合について、配列番号61に示される3つの可変軽鎖CDR(CDRL)および配列番号63に示される3つの可変重鎖CDR(CDRH);または配列番号65に示される3つのCDRLおよび配列番号67に示される3つのCDRH;または配列番号69に示される3つのCDRLおよび配列番号71に示される3つのCDRH;配列番号73に示される3つのCDRLおよび配列番号75に示される3つのCDRHを含む抗体と競合するヒト化抗体。
- VHおよびVLを含み、該VLが、配列番号151のCDRL1、配列番号152のCDRL2、および配列番号153のCDRL3を含む3つのCDRLを有するか;またはVLが、配列番号157のCDRL1、配列番号158のCDRL2、および配列番号159のCDRL3を含む3つのCDRLを有するか;またはVLが、配列番号163のCDRL1、配列番号164のCDRL2、および配列番号165のCDRL3を含む3つのCDRLを有するか;またはVLが、配列番号169のCDRL1、配列番号170のCDRL2、および配列番号171のCDRL3を含む3つのCDRLを有する、請求項12に記載のヒト化抗体。
- VLおよびVHを含み、該VHが、配列番号154のCDRH1、配列番号155のCDRH2、および配列番号156のCDRH3を含む3つのCDR(CDRH)を有するか;または該VHが、配列番号160のCDRH1、配列番号161のCDRH2、および配列番号162のCDRH3を含む3つのCDRHを有するか;または該VHが、配列番号166のCDRH1、配列番号167のCDRH2、および配列番号168のCDRH3を含む3つのCDRHを有するか;または該VHが、配列番号172のCDRH1、配列番号173のCDRH2、および配列番号174のCDRH3を含む3つのCDRHを有する、請求項12に記載のヒト化抗体。
- VLおよびVHを含み、該VLが、配列番号151のCDRL1、配列番号152のCDRL2、および配列番号153のCDRL3を含む3つのCDRLを有し、かつ、該VHが、配列番号154のCDRH1、配列番号155のCDRH2、および配列番号156のCDRH3を含む3つのCDRHを有する、請求項12に記載のヒト化抗体;またはVLおよびVHを含み、該VLが、配列番号157のCDRL1、配列番号158のCDRL2、および配列番号159のCDRL3を含む3つのCDRLを有し、かつ、該VHが、配列番号160のCDRH1、配列番号161のCDRH2、および配列番号162のCDRH3を含む3つのCDRHを有する抗体;またはVLおよびVHを含み、該VLが、配列番号163のCDRL1、配列番号164のCDRL2、および配列番号165のCDRL3を含む3つのCDRLを有し、かつ、該VHが、配列番号166のCDRH1、配列番号167のCDRH2、および配列番号168のCDRH3を含む3つのCDRHを有する抗体;またはVLおよびVHを含み、該VLが、配列番号169のCDRL1、配列番号170のCDRL2、および配列番号171のCDRL3を含む3つのCDRLを有し、かつ、該VHが、配列番号172のCDRH1、配列番号173のCDRH2、および配列番号174のCDRH3を含む3つのCDRHを有する抗体。
- CLDNファミリーの少なくとも1つのタンパク質に結合するヒト化抗体であって、配列番号114に示される全長軽鎖および配列番号115に示される全長重鎖;または配列番号116に示される全長軽鎖および配列番号117に示される全長重鎖;または配列番号118に示される全長軽鎖および配列番号119に示される全長重鎖;または配列番号120に示される全長軽鎖および配列番号121に示される全長重鎖を含むヒト化抗体。
- ペイロードへとコンジュゲートさせた、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
- ベクター内に含有された、請求項17に記載の核酸。
- 宿主細胞において発現する、請求項18に記載の核酸。
- CLDNファミリーの少なくとも1つのタンパク質を発現するがん幹細胞に結合する、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、または組換えヒト抗体、またはこれらの断片を含む抗体薬物コンジュゲート(ADC)であって、該抗体を細胞傷害剤へとコンジュゲートさせたADC。
- 式Ab−[L−D]n[式中、Abは、請求項1から16に記載の抗体であり;Lは、任意選択のリンカーであり;Dは、薬物であり;nは、約1〜約20の整数である]のADC。
- 請求項22に記載のADCを含む医薬組成物。
- がんを処置する方法であって、請求項23に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体へと投与するステップを含む方法。
- 前記がんが、卵巣がん、肺がん、乳がん、および膵臓がんから選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記がんが、肺腺癌である、請求項25に記載の方法。
- 前記がんが、卵巣がんである、請求項26に記載の方法。
- 前記被験体へと、少なくとも1つのさらなる治療用部分を投与するステップをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 腫瘍細胞集団におけるがん幹細胞を低減する方法であって、がん幹細胞と、がん幹細胞以外の腫瘍細胞とを含む腫瘍細胞集団を、抗CLDN ADCと接触させるステップを含み、これにより、がん幹細胞の頻度を低減する方法。
- 前記接触させるステップを、in vivoで実施する、請求項29に記載の方法。
- 前記接触させるステップを、in vitroで実施する、請求項29に記載の方法。
- 細胞毒素を細胞へと送達する方法であって、該細胞を、請求項22に記載のADCと接触させるステップを含む方法。
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