JP7107968B2 - 血管新生を促進する薬剤ならびにその方法および使用 - Google Patents
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Description
本非仮出願は、2017年1月13日に出願の米国仮出願第62/446,030号の優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
nは約25~約100の整数であり、
各Xは独立してまたは同時に(C1-C20)アルキレンまたは(C2-C20)アルケニレンであり、各々は所望により1個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C6-C10)アリールまたは(C5-C10)ヘテロアリールにより置換され;
各Yは独立してまたは同時に(C1-C20)アルキレンまたは(C2-C20)アルケニレンであり、各々は所望により1個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C6-C10)アリールまたは(C5-C10)ヘテロアリールにより置換され;および、
RはT7ペプチド(配列番号1)、GA3ペプチド(配列番号2)、T4ペプチド(配列番号3)、T6ペプチド(配列番号4)および/もしくはT8ペプチド(配列番号5)またはこれらのレトロインベルソペプチドである]の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
(i)T7ペプチド(配列番号1)、GA3ペプチド(配列番号2)、T4ペプチド(配列番号3)、T6ペプチド(配列番号4)および/もしくはT8ペプチド(配列番号5)またはこれらのレトロインベルソペプチドであるペプチドを式(II)
(ii)式(III)の化合物を式(IV)
を含む、本明細書で開示される式(I)の化合物の製造方法もまた提供される(ここで、変数n、XおよびYは上で定義されるようであり、LGは好適な脱離基であり、PGはHまたは好適な保護基である)。
a)血管周囲支持細胞のリクルートメント;
b)さもなければ漏出性であろう血管の非漏出性;
c)明瞭な分枝;および、
d)内皮細胞アポトーシスの阻害。
本明細書で使用する場合、用語「(C1-Cp)アルキル」は、1~「p」個の炭素原子を含有する直鎖および/または分枝鎖の飽和アルキル基を意味し、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、s-ブチル、イソブチル、t-ブチル、2,2-ジメチルブチル、n-ペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、n-ヘキシルなどを含み(pの同一性に応じて)、ここで変数pはアルキル基の炭素原子の最大数を表わす整数である。
一実施形態では、本発明の発明者らは、バスキュロチド(VT)を超える改善された活性を有する新規薬剤の部類を提供し、実施例における「Mpa-Br」としての1つの新規薬剤に言及する。
nは約25~約100の整数であり、
各Xは独立してまたは同時に(C1-C20)アルキレンまたは(C2-C20)アルケニレンであり、各々は所望により1個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C6-C10)アリールまたは(C5-C10)ヘテロアリールにより置換され;
各Yは独立してまたは同時に(C1-C20)アルキレンまたは(C2-C20)アルケニレンであり、各々は所望により1個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C6-C10)アリールまたは(C5-C10)ヘテロアリールにより置換され;および、
RはT7ペプチド(配列番号1)、GA3ペプチド(配列番号2)、T4ペプチド(配列番号3)、T6ペプチド(配列番号4)またはT8ペプチド(配列番号5)またはこれらのレトロインベルソペプチドである];
の化合物および/またはその薬学的に許容される塩を提供する。
nは約50~60の間の整数または約55であり;
RはHis-His-His-Arg-His-Ser-Phe(配列番号1)である]またはその薬学的に許容される塩である。
Wは独立してまたは同時にヒドロキシ置換(C1-C20)アルキルまたはヒドロキシ置換(C2-C20)アルケニルであり、各々は所望により1個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C6-C10)アリールまたは(C5-C10)ヘテロアリールにより置換され;または
WはX-S-Y-C(O)-Rである(ここでn、X、YおよびRは上に定義されるようである)]を有する二量体、三量体および四量体化合物を含む。
また、
(i)T7ペプチド(配列番号1)、GA3ペプチド(配列番号2)、T4ペプチド(配列番号3)、T6ペプチド(配列番号4)および/またはT8ペプチド(配列番号5)またはこれらのレトロインベルソペプチドであるペプチドを式(II)
(ii)式(III)の化合物を式(IV)
を含む本明細書で開示される式(I)の化合物の製造方法も本明細書において提供される(ここで、変数n、XおよびYは上に定義されるようであり、LGは好適な脱離基であり、PGはHまたは好適な保護基である)。
Tie2活性化および血管新生の刺激
別の態様は、本明細書で開示される化合物の使用方法および使用に関する。本明細書において述べるように、本明細書で開示される化合物を使用して、インビトロまたはインビボのいずれかでTie2受容体を活性化できる。したがって、一実施形態において、Tie2受容体を活性化するようにTie2受容体を本明細書で開示される化合物と接触させることを含むTie2受容体を活性化する方法が提供される。Tie2受容体を活性化するための本明細書で開示される化合物の使用もまた提供される。更に、Tie2受容体を活性化するための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用が提供される。また更に、Tie2受容体を活性化するのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
a)血管周囲支持細胞のリクルートメント;
b)さもなければ漏出性であろう血管の非漏出性;
c)明瞭な分枝;および、
d)内皮細胞アポトーシスの阻害。
MPA-Brは、バスキュロチドと比較して改善した標的結合および薬物動態を有する化合物であり、これは以前にCFU-G細胞の増殖を阻害することが示されている。
MPA-Brは、バスキュロチドのように、インフルエンザのマウスモデルでの病的状態および死亡率を改善することが示されているが、より低用量で効果がある。
本明細書で開示される化合物は、生体材料に組み込まれてよく、それは次いで対象における部位に移植されて、これにより、その部位で本発明の化合物の効果を提供する。マトリックスまたは足場を提供する生体材料が使用に好適である。本発明の化合物は、単独で、または1種以上の追加の薬剤、例えばVEGF、PDGF、G-CSF、組換えヒトエリスロポイエチン、bFGFおよび胎盤増殖因子(PLGF)と組み合わせて組み込むことができる。好適な生体材料の非限定的な例としては、マトリゲル、代用皮膚および架橋グリコサミノグリカンヒドロゲル(例えば、Riley,C.M.et al.(2006) J.Biomaterials 27:5935-5943に記載されているように)が挙げられる。したがって、別の態様は、その中に本明細書で開示される化合物が単独でまたは1種以上の追加の薬剤と組み合わせて組み込まれる、生体材料組成物に関する。生体材料を含むパッケージ化された材料も包含される。パッケージ化された材料を、生体材料の使用のために標識できる。
結果
トリプトファン蛍光分光法を使用する均一な種特異的組換え受容体集団への親化合物バスキュロチドおよびMPA-Brの結合の検出。
アミノ酸のトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンは、280nmの波長で、および特にトリプトファンについては295nmの波長で励起された場合に内部蛍光特性を示す。この発光スペクトルは、タンパク質構造の立体配座およびその溶媒に高度に依存する。構造的立体配座に関して、リガンドのその受容体への結合により生じるスペクトルの変化が、用量依存的結合を特徴付ける内在性マーカーとして使用されてきた。この目的のために、種特異的なTie2Fcタンパク質の内部蛍光特性および、親化合物バスキュロチドまたはMPA-Brが存在する場合の発光スペクトルの変化を利用して結合動態を特徴付けた。
親化合物バスキュロチドおよびMPA-BrのTie2活性化能をヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)で評価した。異なる用量の両方のリガンドで処理されたHUVECは、Tie2および下流のシグナル伝達分子であるMAPKの活性化の増加を示した(図3A、B)。一般に、MPA-Brは、親化合物バスキュロチドが示すよりも増加した応答の大きさおよびより低い濃度で始まるより広い用量範囲を示し、親化合物バスキュロチドの1000ng/mlでの単一の有意な応答のみと比較して10~100ngの用量でTie2を有意に活性化した。親化合物バスキュロチドおよびMPA-Brによる処理は、両方ともTie2受容体に対する特徴的なベル型の用量応答を示した。この種の用量応答は、Tie2リガンドについて以前に記述されており、この受容体型チロシンキナーゼの活性化に関連する一般的な特徴であるように思われる(Brkovic A,et al 2007,Sturn DH,et al 2005,Murdoch C,et al 2007,Gruber BL,et al 1995 and Maliba R,et al 2008)。親化合物バスキュロチドまたはMPA-BrいずれかによるHUVECの刺激は、MAPKの下流の活性化をもたらした。ヒト組換えAng1をTie2およびMAPK活性化研究のための陽性対照として使用した。
HUVECについて上で詳述したものと類似のTie2活性化研究を、テロメラーゼによって不死化されたヒト微小血管内皮細胞(皮膚由来)(HMVECtert)で完了した。異なる血管床に由来する内皮細胞または相対的な内径の血管は異なる振る舞いをすることが広く受け入れられており、したがって、HMVECtertを利用した研究は異なる由来のヒト内皮細胞の比較を容易にした。示された濃度の親化合物バスキュロチドまたはMPA-BrによるHMVECtertの刺激は、Tie2受容体の用量依存的活性化をもたらした(図3A)。この場合もまた、用量応答はベル型であり、MPA-Brは0.2ng/ml~10ng/mlの範囲の濃度で統計的に有意なアゴニスト活性を示した。親化合物バスキュロチドによる刺激後の活性化は、5倍高い濃度で明白になり、1ng/ml~100ng/mlの範囲であった。Tie2活性化の相対的な大きさは、親化合物バスキュロチド(~2.6倍)またはヒト組換えAng1(800ng/ml)と比較して、MPA-Br(~3.3倍)でより大きかった。HUVECおよびHMVECtertの両方における親化合物バスキュロチドと比較したMPA-Brのアゴニスト力価の増加は、ヒトTie2受容体に対して示される改善した結合特性の作用である可能性がある(図2Gを参照のこと)。
本明細書において詳述されるいくつかの前臨床有効性研究は、試験種としてマウスを利用する。したがって、親化合物バスキュロチドおよびMPA-BrのTie2アゴニスト力価を詳細に評価するために、マウス初代肺微小血管内皮細胞(MLMVEC)を使用するインビトロ細胞培養系を使用した。親化合物バスキュロチドおよびMPA-Brは、濃度特異的なベル型の用量応答を示した。MPA-Brにより媒介されるTie2の活性化は、10ng/ml~5000ng/mlの範囲の濃度で明らかであり、一方、親化合物バスキュロチドは、100ng/ml~5000ng/mlの範囲の濃度でTie2の活性化を促進した。Tie2受容体の誘導の相対的な大きさは、親化合物バスキュロチドおよびMPA-Brで差が無かったが、Tie2の統計的に有意な活性化は、MPA-Brについて親化合物バスキュロチドの場合より10倍低い濃度で生じた。
ラット糸球体内皮細胞、イヌ大動脈内皮細胞およびカニクイザル糸球体内皮細胞の初代細胞培養物を、異なる濃度のMPA-Brにより刺激した。全ての場合で、これらの細胞培養アッセイはMPA-Br依存的なTie2活性化の増加を示した。用量応答は、ヒトおよびマウス内皮細胞の研究で認められた特徴的なベル型に似ており、0.2ng/mlと50ng/mlの間に集中したTie2受容体のリン酸化の統計的に有意な増加が見られた。全ての場合で、ヒト組換えAng1は、ベースラインTie2リン酸化の有意な増加(無処理(NT)と比較して)をもたらした。
インフルエンザに感染させた(H3N2、64HAU/マウス)C57Bl/6Jマウスは、感染後の5~7日間で体重減少を呈し致死効果で死に始めた(図6B、C)。100ng/マウス/日で投与された親化合物バスキュロチドの有効性が以前に調べられ(Sugiyama MG et al,2015) 、C57Bl/6JマウスのX31インフルエンザ感染後の生存率を向上する効果がないと分かった。親化合物バスキュロチド(500ng、腹腔内に毎日(以前に最適であるとが明らかにされた))またはMPA-Br(腹腔内に毎日、31.25ngまたは200ng)の投与は、感染マウスの全生存率を大幅に向上させた(p<0.001)(図6A)。加えて、親化合物バスキュロチドおよびMPA-Brは、肺酸素化(SpO2)、体温調整および活動性スコア(図6D~I)を有意に改善した。MPA-Brが親化合物バスキュロチドに対する優位性を示したいくつかの尺度が存在した。その例としては具体的に、消耗からの保護(6日目、200ng/日のMPA-Br、図6C)および動脈血酸素化(6日目、200ng/日のMPA-Br、図6E)が挙げられる。31.25ng/マウス/日で送達されたMPA-Brは、16倍の用量の減少を示した。全ての研究エンドポイントにおいて、31.25ng/マウス/日で送達されたMPA-Brは、親化合物バスキュロチドと同等の、またはより良好な効果を発揮した。これは、200ng/マウス/日のMPA-Brの場合でも同様であり、親化合物バスキュロチドと比較して用量の2.5倍の減少を示した。
示された量(ug/kg)の親化合物バスキュロチドおよびMPA-Brを、ボーラス注射により雄性スプラーグドーリーラットに静脈内投与した。連続的、経時的採血を実行し、血漿調整物を、親化合物バスキュロチドまたはMPA-Brを定量化するように専用に設計された登録商標の酵素結合免疫吸着測定法に供した。経時的な被検物質の定量化は、分布容積、クリアランス、および終末相半減期を含む薬物動態学的(PK)指標の算出を容易にした(図7A、B)。120ug/kgの投与量はこれらの研究において最大の検出感度を提供し、したがって、掲示されるPK指標はこの特定の投与量レベルに関する。親化合物バスキュロチド(図7B)およびMPA-Br(図7A)は同程度の分布容積およびクリアランス率を示したが、MPA-Brは親化合物バスキュロチドより顕著に長く循環した(34分に対して68分のt1/2)。MPA-BrのPKを、3日間連続して24時間毎に1回、120ug/kgの反復静脈内投与(MD)の設定で評価した。この特定の投与手法は単回の120ug/kgのIV投与と差が無く、毎日投与した場合に薬剤蓄積がないことを示唆した。
以前の研究は、ヒスタミンへの曝露後の血管漏出の誘導への対抗におけるTie2の必須の役割を強調した。具体的には、Tie2の天然のアンタゴニストであるアンギオポエチン2を遺伝的に欠損するマウスは、ヒスタミン曝露の際の血管漏出応答を全く開始できない(Benest AV et al,Plos One,2013)。したがって、親化合物バスキュロチドおよびMPA-BrなどのTie2の特異的なアゴニストの投与は、ヒスタミンにより誘発された血管漏出を阻害すると仮定された。皮膚へのヒスタミン曝露の1時間前に親化合物バスキュロチドまたはMPA-Brの予防用量を与えられた雄性FVBマウスは、トレーサー色素エバンスブルーの血管外漏出により評価されるように、媒体で処置されたマウスより有意に少ない血管漏出を示した(図8A)。重要なことに、500ng/マウスの最適用量で送達された親化合物バスキュロチド投与は、等しい用量または4倍少ない用量(125ng/マウス)でのMPA-Brと比べてヒスタミンにより誘発された血管漏出の低減においてあまり効果がなかった。
バスキュロチド類縁体Mpa-Brを提供する3-メルカプトプロピオン酸(Mpa)リンカーによる四量体Tie2結合ペプチド(T7)の調製
概要:Mpa-Brのために実行される製造プロセスは、いくつかの工程を必要とした。第1段階において、T7ペプチドおよび3-メルカプトプロピオン酸(Mpa)により合成されるペプチドは、FMOC固相ペプチド合成法を使用して調製された。これは、N末端に3-メルカプトプロピオニルリンカーを有するT7ペプチドを含む、Mpa-His-His-His-Arg-His-Ser-Phe-OHを提供した(配列番号7)。これに続いて、終末産物の切断および脱保護、RP-HPLC精製ならびに凍結乾燥法による凍結乾燥を行いTFA塩としてMpa-T7ペプチドを単離した。第2の段階において、Mpa-ペプチドの(ブロモアセトアミド)4-PEG10Kとの結合を行い、続いて2段階のPEGコンジュゲートの精製を行った。第1の精製工程は、RP-HPLCクロマトグラフィーを含み、これによりMpa-BrコンジュゲートのTFA塩を得た。この産物を、この段階で凍結乾燥法により単離するか、またはTFA対イオンを、イTFA塩中間体を単離することなくオン交換クロマトグラフ法により酢酸塩の形態に直接的に交換してもよい。この初期生成物を凍結乾燥して、Mpa-Br酢酸塩を遊離流動固体として単離した。
ステップ1:樹脂上構築
T7ペプチド配列を、CS Bioペプチド合成機を使用して40gの樹脂投入しWangポリスチレン樹脂(最初の官能基化は1.2mmol/g)上で構築した。Wang樹脂に、DMF中の8eqのアミノ酸および4eqのDICを使用してFmoc-Phe-OHを4時間ローディングした。Fmocローディング試験は、45.4mmolスケールの合成に対応して0.8mmol/gのローディングが達成されたことを示した。全てのアミノ酸はDIC/Oxyma化学反応(3eq、136.2mmol)を使用して単一カップリングされ、0.5MのAc2O/DMFをキャップ形成に、20%のピペリジン/DMFをFmoc脱保護に使用した。試験切断を、T7ペプチド配列の完了後に実施し、RP-HPLC分析は、配列が77.5%の組成物純度でうまく構築されたことを示した。
樹脂に結合されたMpa-T7ペプチドを、TFA/TIS/水/EDT(92.5:2.5:2.5:2.5)を含む切断溶液で3時間処理した。ペプチドを抗溶剤(iPr2O)で沈殿させ、ペプチドを濾過によって単離して粗生成物を得た。樹脂に結合されたMpa-T7ペプチドを切断して38%の全体回収率および91.8%の収率に相当する31.5gの粗ペプチドを得た。粗生成物のRP-HPLC分析は、粗製物純度が70.5%であることを示した。
粗製Mpa-T7ペプチド(24g)を緩衝液A(15mMのTEAP)で希釈し、Luna C18(3) PREP 250×50mm Phenomenexカラム上でのRP-HPLCを使用して5~10%の緩衝液B(20%MeCN/水)の勾配および88mL/分の流速で精製した。TEAP精製からの産物プールを合わせ、0.5%TFA/水で5倍に希釈した。ペプチド溶液の半分を精製カラムに再ロードし、産物を0.5%のTFAを含有する水/MeCN(10%)で最初にオンカラム洗浄した後、緩衝液BをMeCN中の0.1%TFAと置き換え、産物を、20~60%のBの勾配を適用することによって溶出した。この工程を残りのペプチド溶液で繰り返し、産物プールを合わせ、凍結乾燥して樹脂ローディング工程からの43.7%の全体回収率に相当する11.4gのMpa-T7ペプチドをTFA塩として得た。最終分析は、6.7gの純ペプチド(25.8%の収率)に相当する61%のペプチド含量および96.2%のRP-HPLC純度を示した。
ステップ1:コンジュゲーション
コンジュゲーション反応を、Mpa-T7ペプチドのTFA塩(2mmol)および(ブロモアセトアミド)4-PEG10K(JenKem、米国)(0.48mmol)を0.13MのNaClを含有するpH8の100mMリン酸ナトリウム(二塩基性)緩衝液(120ml)中に溶解することによって実行した。反応溶液のpHがpH6.5であることを確認し、反応混合物を30℃にて22時間撹拌した。反応の進行をRP-HPLCによりモニタリングし、完全にコンジュゲートされた産物への4アーム置換された四量体ブロモアセトアミドの約58%の転換まで進行させた。反応の完了時に、粗製混合物は、それぞれ~30%の3アーム中間体および~7%の2アーム中間体を含有した。少量の単一アーム産物が得られた。
反応混合物を、緩衝液A(水+0.1%TFA)で1:1に希釈し、精製を、10~75%の緩衝液B(MeCN:水(60:40)+0.1%のTFA)の勾配および42mL/分の流速でLuna C18(3) PREP 250×30mmのカラムを用い10mL画分を収集して実施した。この段階で凍結乾燥によって単離された産物は、RP-HPLCによる約45%の収率および>99%の純度でMpa-Br TFA塩を提供した。
TFA対イオンを有するMpa-Brコンジュゲートは、ろう状/粘着性の粘度を有する非晶質物質を生じる。物理的特性に取り組むために、塩交換を、ステップ2に記載されるように得られた、RP-HPLC精製されたMpa-Br TFA塩画分から直接実行した。凍結乾燥の前に画分を合わせ(~500 mL)、水で1:1に希釈し、溶液をRP-HPLCカラム上へロードし、最初のカラム平衡化(1%AcOHを含有する0.5MのNH4OAc)、試料のロードに続く交換プロセス(1%のAcOHを含有する0.5MのNH4OAc)、酢酸アンモニウム除去プロセス(1%のAcOH(緩衝液A)およびMeCN(緩衝液B)、10%B)、および溶出プロセス(1%のAcOH(緩衝液A)およびMeCN(緩衝液B)、10~50%B)を含むいくつかのプロセス後に10mL画分を収集する、42mL/分の流速でLuna C18(3) PREP 250×30mmのカラムを使用する酢酸塩交換プロセスに供した。産物をプールし、凍結乾燥してMpa-Br酢酸塩を自由流動結晶性固体として得た。分析はRP-HPLCによる100%の純度を示し、42.1%の全収率の完全に置換されたペプチドコンジュゲートであるMpa-Brに相当した。イオンクロマトグラフィーによる残留臭素(Br)コンジュゲートの分析は、4アームブロモアセトアミド-PEG四量体の完全な置換を示す<0.1%のBrを確認した。Mpa-Br酢酸塩の更なる分析をSCXクロマトグラフィーにより行い、Mpa-Br酢酸塩の純度が90.0%であることが分かった。
リガンドおよび受容体相互作用。2倍濃度の各リガンド(親化合物バスキュロチドおよびMPA-Br)を25μLで調製し、25μLの2倍濃度のTie2Fc受容体と混合して50μLの最終容量で1倍濃度のリガンドおよび受容体を作製した。リガンドの濃度は、受容体の結合飽和に達するのに十分なほど高くなければならない。試料を、10nmの規定読み取り間隔および読み取り前の5秒間の自動混合で励起波長295nm、360nmでの開始発光波長スキャン、450nmでの終了発光波長スキャンに設定したSpectraMaxM2プレートリーダーにより室温にて読み取った。データを、SoftMaxを使用してコンパイルし、Prismを使用して分析した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、製造者の推奨に従い20%O2、5%CO2および37℃の加湿したチャンバー内で「EGM Single Quots」(Lonza)を補足した完全内皮基本培地(EBM)(Lonza)中にて100mm組織培養プレートに播種した。90%のコンフルエンスに到達した細胞を、完全EBM培地中で特定の濃度の親化合物バスキュロチド、MPA-Brまたはアンギオポエチン-1(R&D Systems)で15分間刺激した。15分の刺激後、細胞を氷上に置き、氷冷PBSで二回洗浄した。細胞可溶化物を、IC12溶解緩衝液(1%のNP-40、20mMのTris(pH 8.0)、137mMのNaCl、10%のGlycerol、2mMのEDTA、1mMの活性化オルトバナジウム酸ナトリウム)中で使用のために調製した。BCAタンパク質濃度測定キットを製造者の使用説明書(Thermo Scientific)にしたがって使用して、各々の可溶化液のタンパク質濃度を測定した。試料を、製造者プロトコールにしたがいリン酸化されたTie2および総Tie2レベルを測定するELISAに供した。各々の試料からの20μgまたは5μgのタンパク質を、それぞれリン酸化されたTie2および総Tie2の読み取りのため2重にロードした。リン酸化されたTie2:総Tie2の比率を、各々の試料について測定した。各々の実験において全ての処理群のTie2リン酸化のレベルを次いで、無処置群(NT、完全EBMのみ)のTie2リン酸化のレベルに正規化した。
HUVECを上記のように培養した。可溶化液を調製した(1mMのEDTA、0.5%のTriton X-100、6Mの尿素、5mMのNaF、100uMのPMSF、25mMのピロリン酸ナトリウム、1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、pH7.2~7.4、1xcOmpleteTM mini EDTA-freeプロテアーゼ阻害剤)。BCAタンパク質濃度測定キットを製造者の使用説明書(Thermo Scientific)にしたがって使用して、各々の可溶化液のタンパク質濃度を測定した。試料を、製造者プロトコール(R&D Systems) にしたがいリン酸化されたMAPKおよび総MAPKレベルを測定するELISAに供した。各々の試料からの20μgまたは10μgのタンパク質を、それぞれリン酸化されたMAPKおよび総MAPKの読み取りのため2重にロードした。リン酸化されたMAPK:総MAPKの比率を、各々の試料について測定した。各々の実験において全ての処理群のMAPKリン酸化のレベルを次いで、無処置群(NT、完全EBMのみ)のMAPKリン酸化のレベルに正規化した。
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素/触媒サブユニット(tert)によって不死化されたヒト微小血管内皮細胞(皮膚由来)(Shao and Guo(2004))を、完全内皮基本培地-2(EBM-2)(Lonza)中で100mmの組織培養プレートに播種し、20%のO2、5%のCO2および37℃の加湿したチャンバー内で培養した。増殖培地は、10%のウシ胎児血清、1Xペニシリン/ストレプトマイシン、1ug/mlヒドロコルチゾンおよび100ng/mlのEGFを補足したEBM-2から構成された。90%のコンフルエンスに到達した細胞を、完全EBM-2培地中で特定の濃度の親化合物バスキュロチド、MPA-Brまたはアンギオポエチン-1で15分間刺激した。15分の刺激後、細胞を氷上に置き、氷冷PBSで二回洗浄した。細胞可溶化物を、IC12溶解緩衝液(1%のNP-40、20mMのTris(pH 8.0)、137mMのNaCl、10%のGlycerol、2mMのEDTA、1mMの活性化オルトバナジウム酸ナトリウム)中で使用のために調製した。BCAタンパク質濃度測定キットを使用して、各々の可溶化液のタンパク質濃度を測定した。試料を、pYTie2および総Tie2レベルを測定するELISAに供した。各々の試料からの20μgのタンパク質を、各ウェルにロードし、各試料を2重に試験した。総Tie2に対する相対的なpTie2の比率を、各々の試料について測定した。各々の実験において各処理群のTie2リン酸化のレベルを、EBM処理群のTie2リン酸化のレベルに正規化した。
マウス初代肺内皮細胞(Cell Biologics)を、「EGM Single Quots」(Lonza)を補足した完全内皮基本培地(EBM)(Lonza)中で100mm組織培養プレートに播種した。90%のコンフルエンスに到達した細胞を、完全EBM培地中で特定の濃度の親化合物バスキュロチド、MPA-Brまたはアンギオポエチン-1(R&D Systems)で15分間刺激した。15分の刺激後、細胞を氷上に置き、氷冷PBSで二回洗浄した。細胞可溶化物を、IC12溶解緩衝液(1%のNP-40、20mMのTris(pH 8.0)、137mMのNaCl、10%のGlycerol、2mMのEDTA、1mMの活性化オルトバナジウム酸ナトリウム)中で使用のために調製した。BCAタンパク質濃度測定キットを製造者の使用説明書(Thermo Scientific)にしたがって使用して、各々の可溶化液のタンパク質濃度を測定した。試料を、製造者のプロトコールにしたがいリン酸化されたTie2および総Tie2レベルを測定するELISAに供した(マウスTie2、R&D Systems)。各々の試料からの50μgまたは5μgのタンパク質を、それぞれリン酸化されたTie2および総Tie2の読み取りのため3重にロードした。リン酸化されたTie2:総Tie2の比率を、各々の試料について測定した。各々の実験において全ての処理群のTie2リン酸化のレベルを次いで、無処理群(NT、完全EBMのみ)のTie2リン酸化のレベルに正規化した。
ラット初代糸球体内皮細胞(Cell Biologics)を、20%のO2、5%のCO2および37℃で加湿したチャンバー内にてComplete Rat Endothelial Cell Medium /w Kit(Cell Biologics)中で増殖させ、80~90%の培養密度に達したら1:3で継代した。ラット腎臓糸球体内皮細胞におけるMPA-BrによるTie2の活性化を調べるために、95~100%コンフルエントの細胞を、示された濃度の被検物質で15分間血清添加培地中にて刺激した。ヒトAng-1(R&D Systems)を陽性対照として使用した。細胞可溶化物を、Human phospho-Tie-2 ELISA kit(R&D Systems)において推奨される溶解緩衝液IC12(上記で詳述)を使用して収集し、チロシンがリン酸化されたTie2および総Tie2を、ラットTie2への適用が確認された捕捉抗体を代用するELISA(Human phospho-Tie2 and total-Tie2 ELISA kits(R&D Systems))を使用して測定した。マウス抗Tie2抗体(BD PharmingenTM)およびウサギTEKポリクローナル抗体(MyBioSource)を、それぞれpTie2および総Tie2のELISAで捕捉抗体として使用した。各々の実験において全ての処理群のTie2リン酸化のレベルを次いで、無処理群(NT、完全ラット内皮細胞媒体)のTie2リン酸化のレベルに正規化した。
イヌ初代大動脈内皮細胞(CellBiologics)を、20%のO2、5%のCO2および37℃で加湿したチャンバー内でComplete canine endothelial cell medium /w kit(Cell Biologics)中で増殖させ、80~90%の培養密度に達したら1:3で継代した。カニクイザル初代糸球体内皮細胞に対し実行したTie2活性化研究を、ラット初代糸球体内皮細胞の研究について上で詳述された手法にしたがって実行した。
カニクイザル初代糸球体内皮細胞(Cell Biologics)を、HMVECtertについて上に掲示の詳細にしたがって培養した。カニクイザル初代糸球体内皮細胞に対し実行したTie2活性化研究を、ラット初代糸球体内皮細胞の研究について上で詳述された手法にしたがって実行した。
10週齢の雄性FVBマウスをJackson Laboratoriesから購入した。マウスは、標準的な明暗周期の動物施設で飼育され、餌料および水を自由に摂取した。0日目にマウスをイソフルランで麻酔し、背部領域全体を電気カミソリで剃毛した。残りの体毛は、脱毛クリームの適用により除去した。残ったクリームを滅菌ガーゼおよび水で除去した。4日目に、マウスに200ulの腹腔内注射として媒体対照(滅菌PBS)、親化合物バスキュロチドまたはMPA-Brのいずれかを投与した。PBS/親化合物バスキュロチド/MPA-Brの送達の1時間後に、マウスをイソフルラン麻酔下に置き、その時点で100ulの(滅菌PBS中に含有される)1%エバンスブルー色素を、尾静脈を介して静脈内に送達した。エバンスブルー色素の投与直後、かつまだ麻酔下にある間に単回のPBS注射(背側、皮内、50ul)および3回の等間隔のヒスタミン注射(背側、皮内、50ul中に含有される1.25ug)を適用した。皮内注射が完了したら、マウスを麻酔から回復させ、それらの収容ケージに25分間戻した。
実験計画。14週齢のC57BL/6Jマウスを購入した(Jackson Laboratories)。マウスは、標準的な明暗周期の動物施設で飼育され、餌料および水を自由に摂取した。全ての実験について、マウスを5%イソフルランで鎮静させ、PBSで80uLの最終容量に希釈されたインフルエンザウイルス(下記のウイルスのセクションを参照のこと)を鼻腔内感染させた。感染後に、マウスを体重が一致する対照群および投与群へと分離した;各々の実験処置群は、群あたり10匹のマウスを使用し、マウスを64HAUのインフルエンザウイルスに感染させ、これは7日目に100%の死亡率を引き起こした。以下の群が含まれた:インフルエンザウイルスのみを投与されたマウス(Flu)、親化合物バスキュロチド(腹腔内注射による0.1mLのPBS中の500ng)またはMPA-Br(腹腔内注射による0.1mLのPBS中の200ngまたは31.25ng)も投与された感染マウス。親化合物バスキュロチドまたはMPA-Brによる処置は感染の48時間後に開始され、研究の間24時間毎に1回与えられた。対照のマウス(Flu)は、感染の48時間後から開始して研究の間、毎日0.1mLのPBSの腹腔内注射が与えられた。
マウスを1日2回観察し、1日1回体重を量り、1~5の活動性スコアを割り当てた。5のスコアが与えられるには、マウスは正常な活発かつ奇妙な行動を示す必要がある。すなわち、マウスは動き回り、ケージの端で直立する。4のスコアでは、マウスは活発というほどではない。すなわち、マウスは頻繁には立ち上がらず、ケージの隅にとどまるのを好む。3のスコアでは、マウスはより活発でなく、移動する時はしばしば止まって座る。すなわち、マウスは巣の隅にとどまる。2のスコアでは、マウスは触られた場合にだけ、短い距離のみ移動する。すなわち、マウスは好んで巣の隅に隠れる。最後に、1のスコアでは、マウスは瀕死である。5~3の活動性スコアは、許容できるとみなされる。2の活動性スコアを有するマウスは綿密にモニタリングされ、活動性が2のスコアより減少した場合、それらは屠殺された。更に、30%を超える体重減少を経験したマウスは、許容できる活動性スコアに関係なく安楽死させた。
活性化PEG四量体(例えばビニルスルホンまたはアクリレート)(117~118mg、1equiv.)およびMpa-ペプチド(100mg、1.5equiv.)を光から保護された50ml丸底フラスコに添加し、PBS(pH 6.5*、20ml)を5mg/mlの最終ペプチド濃度となるように添加した。反応物を室温にて撹拌し、pHを、pHメーターを使用して確認し、反応の経過を種々の時間間隔でHPLCによりモニタリングした。反応混合物を、精製前に以下の工程を使用してpH3.5に酸性化した:
ステップ1 フラッシュLC:
カラム:Reverse Phase C18、Fuji、200Å、40gカラム30μm(カスタム包装)。
勾配プロフィール:63分で10~100%B
溶出剤:溶出剤A=水中の0.1%TFA
溶出剤B=60%アセトニトリル、40%水中の0.1%TFA
検出:UV(λ=210nm/254nm)
カラム温度:室温
流速:40ml/min
ステップ2 分取HPLC:
カラム:Reverse Phase C18、Daiso Bio C18、200Å、10μm 25mm×250mm(カスタム包装)
勾配プロフィール:77分で45~100%B
溶出剤:溶出剤A=水中の3%アセトニトリル中の0.1%HFBA
溶出剤B=60%アセトニトリル、40%水中の0.1%HFBA
検出:UV(λ=210nm)
カラム温度:室温
流速:30ml/min
ステップ3 分取HPLC:
カラム:Reverse Phase C18、Daiso Bio C18、200Å、10μm 25mm×25mm(カスタム包装)
勾配プロフィール:84分で40~100%B
溶出剤:溶出剤A=水中の0.1%TFA
溶出剤B=60%アセトニトリル、40%水中の0.1%TFA
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Claims (22)
- 式(I)
nは40~70の整数であり、
各Xは独立してまたは同時に(C 1 -C 6 )アルキレンまたは(C 2 -C 6 )アルケニレンであり、その各々は所望により1個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C6-C10)アリールまたは(C5-C10)ヘテロアリールにより置換され;
各Yは独立してまたは同時に(C 1 -C 6 )アルキレンまたは(C 2 -C 6 )アルケニレンであり、その各々は所望により1個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C6-C10)アリールまたは(C5-C10)ヘテロアリールにより置換され;および
Rは配列番号1のT7ペプチド、配列番号2のGA3ペプチド、配列番号3のT4ペプチド、配列番号4のT6ペプチドまたは配列番号5のT8ペプチドである]
の化合物またはその薬学的に許容される塩。 - Rが配列番号1のT7ペプチドである、請求項1に記載の化合物。
- nが55である、請求項1に記載の化合物。
- Yがチオグリコール酸、2-メルカプトプロピオン酸、4-メルカプトブタン酸、6-メルカプトヘキサン酸、8-メルカプトオクタン酸、11-メルカプトウンデカン酸、12-メルカプトドデカン酸、または16-メルカプトヘキサデカン酸から誘導される、請求項1~3のいずれか一項に記載の化合物。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の化合物および薬理学的に許容される担体を含み、任意に抗ウイルス剤および/または第2の血管新生剤をさらに含む、医薬組成物であって、吸入および/または局所、全身、経口、鼻腔内または非経口投与に好適である、医薬組成物。
- 前記好適な脱離基がハロ、トシラートまたはメシラートであり、および/または前記好適な保護基がトリチルである、請求項7に記載の方法。
- その必要がある対象における部位で血管新生を刺激するのに使用するための、任意にPDGF、G-CSF、組換えヒトエリスロポイエチン、bFGF、Ang2阻害剤および胎盤増殖因子(PLGF)から任意に選択される第2の血管新生剤と組み合わせる、血管新生を刺激するのに使用するための、であるか、
その必要がある対象における漏出性血管の部位で血管透過性を減少させるのに使用するための、任意に前記血管透過性が脳卒中、黄斑部変性、黄斑浮腫、リンパ浮腫、血液網膜関門の破壊、血液脳関門の破壊、細菌により誘発された血管漏出および腫瘍血管系の正常化からなる群から選択される臨床的状況において減少される、血管透過性を減少させるのに使用するための、であるか、または
その必要がある対象において内皮細胞を保護するのに使用するための、任意に前記内皮細胞が肺損傷、腎臓損傷、腎臓線維症、脳卒中、黄斑部変性、血管性認知症および糖尿病合併症の臨床的状況において保護される、内皮細胞を保護するのに使用するための、請求項6に記載の医薬組成物。 - 前記医薬組成物が吸入および/または局所、全身、経口、鼻腔内または非経口投与用に製剤化される、請求項9に記載の医薬組成物。
- その必要がある対象において創傷の治癒を刺激するのに使用するための、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が吸入および/または局所、全身、経口、鼻腔内または非経口投与用に製剤化される、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記創傷が糖尿病性潰瘍であるか、または前記創傷が褥瘡性潰瘍、圧迫潰瘍、外科切開、外傷性組織損傷、火傷および皮膚移植部位からなる群より選択される、請求項11または12に記載の医薬組成物。
- アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、好酸球および/または好塩基球起源の白血病、炎症性腸疾患または寄生虫感染を処置するのに使用するための、医薬組成物。
- その必要がある対象においてインフルエンザ感染と同時にまたはその後に発生する原発性ウイルス肺炎または細菌性肺炎を処置するのに使用するための、医薬組成物。
- 抗ウイルス剤と同時にまたは順次投与用の、請求項15に記載の医薬組成物であって、前記抗ウイルス剤がアマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、リバビリンまたはオセルタミビルから任意に選択される、医薬組成物。
- 前記対象がヒトである、請求項15または16に記載の医薬組成物。
- インフルエンザに感染した動物または細胞を処置するためのおよび/またはインフルエンザに感染した細胞または動物において細菌重複感染を処置するためのキットであって、(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の化合物、(b)抗ウイルス剤および(c)前記キットを使用するための使用説明書を含む、キット。
- 前記抗ウイルス剤がアマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、リバビリンまたはオセルタミビルである、請求項18に記載のキット。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の化合物が組み込まれる生体材料。
- マトリゲル、代用皮膚および架橋グリコサミノグリカンヒドロゲルからなる群より選択される、請求項20に記載の生体材料。
- VEGF、PDGF、G-CSF、組換えヒトエリスロポイエチン、bFGF、Ang2阻害剤、および胎盤増殖因子(PLGF)からなる群より選択される第2の薬剤が組み込まれる、請求項20または21に記載の生体材料。
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