KR20190104352A - 혈관신생을 촉진하는 물질 및 이의 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 다합체를 형성하도록 PEG 모이어티에 선형 결합된 단량체 결합 펩타이드의 다합체 형태인 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다. 다합체 형태는 혈관신생을 자극하고 상처 치유를 촉진한다. 본 개시내용은 또한 국소 또는 전신 투여에 적합한 조성물을 포함하는 다합체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.

Description

혈관신생을 촉진하는 물질 및 이의 방법 및 용도
관련 출원
본 정규 출원은 2017년 1월 13일자로 출원된 미국 가출원 제62/446,030호(본 명세서에서 그 전문이 참고로 포함됨)로부터의 우선권을 주장한다.
기술분야
본 개시내용은 바스큘로타이드와 비교하여 개선된 활성을 갖는 물질, 및 이의 방법 및 용도에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 당뇨병성 상처 치유 및 다른 심혈관 적응증을 치료하기 위해 혈관신생을 자극하기 위한, 알레르기 질환, 천식 및 아토피성 피부염을 치료하기 위한, 그리고 인플루엔자를 치료하기 위한 방법 및 용도에 관한 것이다.
몇몇 중요한 분자 플레이어는 혈관 항상성의 유지를 조절하도록 확인되었다. 이들 중 가장 잘 공지된 것 중 하나는 Tie2/안지오포이에틴(Ang) 신호전달 축이다. 이 수용체 타이로신 키나제(Tie2) 및 단백질 성장 인자(Ang) 시스템은 Ang1 및 Ang2인 2개의 주요 성장 인자가 각각 혈관 내피에 위치한 동일한 수용체를 통해 항염증성 또는 전염증성 반응을 전파시킨다는 점에서 다소 고유하다. 대부분의 수용체 타이로신 키나제와 달리, Tie2는 Ang1의 작용을 통해 정상인 건강한 내피 세포에서 구성적으로 활성인 상태에서 유지된다. 이 수용체는 증식 및 내피 세포 생존율(MAPK 및 AKT), 투과성(VE-Cadherin) 및 세포-세포 상호작용(ICAM 및 VCAM)을 조절하는 다수의 세포내 경로를 활성화하는 것으로 밝혀졌고, 이들 모두는 정상 생리학 동안에 내피 세포 활동정지를 유지시키도록 조합하여 작용한다. Tie2 수용체 인산화에 의해 표시된 이 경로의 활성화는 트랜스우성(transdominant) 신호로서 작용하여서; VEGF, 세로토닌, 브래디키닌, 히스타민, PAF, 트롬빈, LPS, 패혈성 혈청 및 탄저병 독소를 포함하는 무수한 염증성 인자에 대한 노출 이후에 혈관 누수의 유도를 반대한다(Parikh SM, Virulence 2013). Ang2 수준의 급작스런 증가는 다수의 상이한 손상(insult) 이후에 혈관 누수, 이환율 및 사망률을 생성시키는 것으로 반복적으로 나타났다. 연구는 이것이 혈관 활성화의 우성 기초 상태를 한정하는 Ang1 및 Ang2의 순환 수준 사이의 균형이라는 것을 입증하다. 이 사실로 인해, 이 경로를 조정하는 것을 목표로 한 접근법은 치료학적 분야를 가질 수 있다.
Ang의 복잡한 성질은 이제까지 정제 및 치료학적 적용을 방해하였다. 그러므로, 이 경로를 조정하기 위한 대안적인 접근법은 광범위하게 조사되었다. 2개의 주요 접근법이 이제까지 기재되어 있다. 제1 접근법, 및 훨씬 더 흔한 것은 Ang2인 길항제 리간드를 차단하는 것에 초점을 둔다. 이 클래스에서의 치료제는 Ang2에 대한 차단 항체 또는 펩티바디로서 대략 한정될 수 있다. Tie2 표적화된 조정제의 제2 클래스는 Ang1의 설명된 구조 특징에서 빌린다. 즉, 생물활성 Ang1은 4개 이상의 아단위의 다합체로서 천연에 존재한다. Ang1 아단위가 Tie2 수용체에 결합하고 그렇게 해서 인접한 수용체를 클러스터링하여서, 트랜스인산화를 수월하게 하는 구성에서 수용체를 효과적으로 병치시킨다고 가정된다. Tie2 수용체에 대한 Ang1의 작용제 작용을 모방하기 위해, 인접한 수용체에 결합하고 클러스터링하는, 몇몇 큰 재조합 단백질이 조작된다(Zhang et al. 2002; Cho et al. 2004; Han et al. 2016; 미국 특허 제8,957,022호).
바스큘로타이드(모 바스큘로타이드라 칭함)는 Ang1의 작용을 모방하는 이성적으로 설계된 완전 합성 화합물이다. 바스큘로타이드의 중앙 코어는 10kDa의 좁은 분산성의 4-아암 폴리에틸렌 글라이콜로 이루어진다. 고친화도 Tie2 결합 펩타이드, 특히 (-CHHHRHSF-, 서열 번호 6)의 공유 부착은 활성화된 말레이미드기 및 아미노 말단 시스테인의 반응을 통해 수월해진다. 이 구조는 Tie2 수용체에 결합하고 이를 활성화하는 최적 구성으로서 정의된다. 모 바스큘로타이드에 의한 Tie2의 직접적인 활성화는 아토피성 질환 및 인플루엔자의 전임상 모델을 포함하는 몇몇 명확한 시험관내 및 생체내 연구에서 우성 항혈관 누수 신호를 제공하는 것으로 나타났다(Bourdeau A, et al BMC Res Notes 2016 및 Sugiyama MG, et al Sci Rep 2015).
인플루엔자 유도된 급성 폐 손상 또는 더 중증의 관련된 진단, 급성 호흡 곤란 증후군(ALI/ARDS)은 매년 공중에 막대한 희생을 일으켜서, 불균형적으로 청년 및 노인에게 영향을 미친다. 병원균 매개된 ALI/ARDS의 흔한 보존된 특징은 혈관 누수의 유도이다. 감염, 구체적으로 혈관 누수에 대한 숙주의 반응을 치료하는 데 있어서 치료학적 접근법은 구체적으로 이전에 돌연변이되는 병원균을 목표로 하는 치료제에 의해 보인 신속한 내성 발생에 의해 문제투성이가 아니어야 한다. 폐 손상의 치료에 허가된 치료학적으로 표적화된 접근법이 현재 없다. 인플루엔자 유도된 ALI/ARDS를 치료하기 위한 Tie2 작용제, 예컨대 바스큘로타이드의 사용은 백신 및/또는 항바이러스제의 사용에 비해 분화의 소정의 개념 포인트를 제공할 수 있다. 예를 들어, 현재의 인플루엔자 백신접종 프로그램은 균주 동일성과 관련된 선험적인 지식을 요하는 한편, 항바이러스 약제에 대한 내성은 최근의 역사에서 잘 기록되어 있다. 또한, 출현하는 병원균 균주 또는 무기화된 유기체로부터 나타나는 위협은 잠재적으로 이용 가능한 치료제가 완전히 비효과적이게 할 수 있다. 그러므로, 병원균에 대한 숙주의 반응을 치료하기 위한 신규한 접근법은 시급히 필요하다.
모 바스큘로타이드의 화학 분석은 생성된 펩타이드 PEG 접합체가 5원 및 6원 고리 생성물의 혼합물을 함유한다는 것을 밝혀냈다(도 1a). 5원 숙신이미드 고리는 시스테인에서 티올기에 의한 말레이미드의 직접적인 알킬화로부터의 결과를 보여주었고, 6원 티아진 고리는 또한 시스테인 링커에서 유리 아민기를 통한 이 초기 생성물의 재배열로부터의 결과를 보여주었다. 이 발견은 더 단순한 바스큘로타이드 유사체(Mpa-Br)를 발생시키고, 여기서 펩타이드는 활성화된 PEG 사합체를 형성하기 위해 선형 설판 모이어티를 통해 PEG에 연결된다. 일 실시형태에서, Mpa-Br은 브로모아세트이미드를 함유하는 활성화된 PEG 사합체에 대한 N 말단에서의 아민 측쇄 없이 시스테인의 비키랄 유사체인 3-머캅토프로피온산과의 T7 펩타이드의 연결에 의해 제조된다(도 1b). 생성된 펩타이드 PEG 접합체는 재배열에 민감한 불안정한 고리 구조가 없는 단일 생성물을 제공한다.
따라서, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00001
식 중,
n은 약 25 내지 약 100의 정수이고,
X는 각각 독립적으로 또는 동시에 (C1-C20)-알킬렌 또는 (C2-C20)-알켄일렌이고, 이들은 각각 하나 이상의 할로, 아미노, 하이드록시, (C1-C6)-알킬, (C1-C6)-알콕시, (C6-C10)-아릴 또는 (C5-C10)-헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환되고;
Y는 각각 독립적으로 또는 동시에 (C1-C20)-알킬렌 또는 (C2-C20)-알켄일렌이고, 이들은 각각 하나 이상의 할로, 아미노, 하이드록시, (C1-C6)-알킬, (C1-C6)-알콕시, (C6-C10)-아릴 또는 (C5-C10)-헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환되고;
R은 T7 펩타이드(서열 번호 1), GA3 펩타이드(서열 번호 2), T4 펩타이드(서열 번호 3), T6 펩타이드(서열 번호 4) 및/또는 T8 펩타이드(서열 번호 5) 또는 이의 레트로-인베르소 펩타이드(retro-inverso peptide)이다.
실시형태에서, 화합물은 Tie 2 인산화; MAPK, AKT 및/또는 eNOS의 인산화를 자극하고/하거나; 내피 세포 이동을 자극하고/하거나; 내피 세포로부터의 MMP2 방출 및 혈청 배출 유도된 아폽토시스로부터의 내피 세포의 보호를 자극하고/하거나; 마트리겔(Matrigen) 검정에서 생체내 혈관신생 반응을 자극하고/하거나; 대상체의 상처에 국소로 적용될 때 대상체에서의 상처 치유를 자극하고/하거나; 혈관 누수를 감소시키거나/시키고; 알레르기 질환을 치료하고/하거나, 인플루엔자를 치료한다.
실시형태에서, R은 서열 번호 1에 기재된 바와 같은 T7 펩타이드이다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 국소 투여에 적합하다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 전신 투여에 적합하다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 비강내 투여, 흡입에 또는 관류액의 성분으로서 적합하다.
(i) T7 펩타이드(서열 번호 1), GA3 펩타이드(서열 번호 2), T4 펩타이드(서열 번호 3), T6 펩타이드(서열 번호 4) 및/또는 T8 펩타이드(서열 번호 5) 또는 이의 레트로-인베르소 펩타이드인 펩타이드를 하기 화학식 (II)의 티올 화합물과 반응시켜, 하기 화학식 (III)의 화합물을 얻는 단계; 및
[화학식 II]
Figure pct00002
[화학식 III]
Figure pct00003
(ii) 화학식 (III)의 화합물을 하기 화학식 (IV)의 PEG-사합체와 반응시켜, 화학식 (I)의 화합물을 얻는 단계를 포함하는, 본 명세서에 개시된 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다:
[화학식 IV]
Figure pct00004
식 중, 변수 n, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같고, LG는 적합한 이탈기이고, PG는 H 또는 적합한 보호기이다.
Tie 2 수용체를 본 명세서에 개시된 화합물과 접촉시켜서, Tie 2 수용체가 활성화되는 단계를 포함하는, Tie 2 수용체를 활성화하는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다. 실시형태에서, Tie 2 수용체의 활성화는 Tie 2 수용체의 타이로신 잔기, 예컨대 인간에서의 992번 타이로신(Y992) 및 마우스에 대해 Y990의 인산화에 의해 또는 MAPK, AKT 또는 eNOS의 인산화에 의해 입증된다.
본 명세서에 개시된 화합물을 혈관신생의 자극을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관신생을 자극하는 방법이 더욱 추가로 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 화합물에 의해 자극된 혈관신생은
a) 혈관주위 지지 세포의 동원;
b) 혈관의 비누수성(non-leakiness)(그렇지 않으면 누설할 것임);
c) 잘 한정된 수상돌기분지(arborization); 및
d) 내피 세포 아폽토시스의 저해의 특성 중 적어도 하나를 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 제2 혈관신생제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 제2 혈관신생제는 VEGF이다. 또 다른 실시형태에서, 제2 혈관신생제는 PDGF, G-CSF, 재조합 인간 에리쓰로포이에틴, bFGF, Ang2 저해제 및 태반 성장 인자(placental growth factor: PLGF)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 추가의 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 재생 조직의 혈관화, 허혈성 사지 질환, 뇌 허혈, 혈관성 염증의 병태, 동맥경화증, 무혈관성 괴사, 모발 성장의 자극 및 발기 부전으로부터 선택된 임상 상태를 갖는다.
본 명세서에 개시된 화합물을 혈관 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서의 부위에 투여하는 단계를 포함하는 누수 혈관의 부위에서의 혈관 투과성을 감소시키는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다. 실시형태에서, 대상체는 뇌졸중, 황반 변성, 황반 부종, 림프 부종, 혈액-망막 장벽의 파괴, 혈액-뇌 장벽의 파괴, 박테리아 유도된 혈관 누수 또는 종양 맥관구조의 정상화를 가지거나 가졌다.
본 명세서에 개시된 화합물을 내피 세포의 보호를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 내피 세포를 보호하는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다. 일 실시형태에서, 대상체는 신장 손상 또는 신장 섬유증, 뇌졸중, 혈관성 치매, 황반 변성 또는 당뇨병성 합병증을 가지거나 가졌다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 폐 손상을 가지거나 가졌다.
본 명세서에 개시된 화합물을 상처의 치유의 자극을 필요로 하는 대상체에서의 상처에 투여하는 단계를 포함하는 상처의 치유를 자극하는 방법이 훨씬 추가로 제공된다. 실시형태에서, 화합물은 국소로 또는 전신으로 투여된다. 일 실시형태에서, 상처는 당뇨병성 궤양이다. 또 다른 실시형태에서, 상처는 욕창성 궤양, 압박 궤양, 수술 절제, 외상성 조직 손상, 화상 또는 피부 이식이다.
본 명세서에 개시된 화합물을 CFU-G 세포의 증식의 저해를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 CFU-G 세포의 증식을 저해하는 방법이 본 명세서에 더욱 추가로 제공된다. 실시형태에서, 상기 방법은 호산구 및/또는 호염구의 감소를 필요로 하는 대상체에서 호산구 및/또는 호염구를 감소시키기 위한, 아토피성 피부염, 천식 또는 알레르기 비염을 치료하기 위한, 또는 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태를 치료하기 위한 것이다.
일 실시형태에서, 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 호산구 및/또는 호염구 기원의 백혈병이다. 또 다른 실시형태에서, 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 염증성 장 질환이다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 기생충 감염이다.
또 다른 실시형태에서, CFU-G 세포의 증식을 저해하는 방법은 에오탁신, IL-17, MIG, IL12/IL23(p40), IL-9, MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-13 및 MCP-1 중 적어도 하나를 포함하는 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준을 감소시키기 위한 것이다. 일 실시형태에서, 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인은 에오탁신을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 히스타민 유도된 혈관 누수를 저해한다.
본 명세서에 개시된 화합물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 또는 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염에 의해 감염된 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 훨씬 추가로 제공된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 동시에 또는 순차적으로 항바이러스제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 항바이러스제는 아만타딘, 리만타딘, 나자미버, 페라미버, 비라미딘, 리바비린 또는 오셀타미버이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 인간이고, 인플루엔자는 인간 인플루엔자이다.
실시형태에서, 화합물은 국소로, 전신으로, 비강내로, 흡입에 의해 또는 관류액으로서 투여된다.
(a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 혈관신생제를 포함하는 조성물이 훨씬 추가로 제공된다.
(a) 본 명세서에 개시된 화합물, (b) 제2 혈관신생제 및 (c) 본 명세서에 개시된 바와 같이 Tie2를 활성화하기 위한 및/또는 혈관신생을 자극하기 위한 키트의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트가 추가로 제공된다.
(a) 본 명세서에 개시된 화합물, (b) 항바이러스제 및 (c) 인플루엔자에 의해 감염된 대상체를 치료하기 위한 그리고/또는 인플루엔자에 의해 감염된 대상체에서 박테리아 중복감염을 치료하기 위한 키트의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트가 추가로 제공된다.
본 명세서에 개시된 화합물이 도입된 바이오재료가 훨씬 추가로 제공된다. 일 실시형태에서, 바이오재료는 마트리겔, 피부 대체물 또는 가교결합된 글라이코사미노글라이칸 하이드로겔이다. 또 다른 실시형태에서, 제2 물질은 바이오재료, 예컨대 VEGF, PDGF, G-CSF, 재조합 인간 에리쓰로포이에틴, bFGF 및 태반 성장 인자(PLGF)로 도입된다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 예는, 본 출원의 실시형태를 나타내면서, 오직 예시의 방식으로 주어지고, 청구항의 범위가 이 실시형태에 의해 제한되지 않아야 하지만, 전체로서 설명과 일치하여 가장 넓은 해석이 주어져야 한다고 이해되어야 한다.
실시형태는 도면과 관련하여 하기 기재되어 있고, 여기서
도 1a는 말레이미드를 함유하는 활성화된 PEG 사합체에 대한 N 말단에서 T7 펩타이드와 시스테인의 연결을 통해 제조된 모 바스큘로타이드의 도식적 다이어그램을 보여준다. 생성된 펩타이드 PEG 접합체는 5원 및 6원 고리 생성물의 혼합물을 함유한다. 5원 숙신이미드 고리는 시스테인에서 티올기에 의한 말레이미드의 직접적인 알킬화로부터의 결과를 보여주었고, 6원 티아진 고리는 또한 시스테인 링커에서 유리 아민기를 통한 이 초기 생성물의 재배열로부터의 결과를 보여주었다. 도 1b는, 일 실시형태에서, 브로모아세트이미드를 함유하는 활성화된 PEG 사합체에 대한 N 말단에서의 아민 측쇄 없이 시스테인의 비키랄 유사체인 3-머캅토프로피온산과의 T7 펩타이드의 연결에 의해 제조된, Mpa-Br의 도식적 다이어그램을 보여준다.
도 2a는 트립토판 형광 분광법을 이용하여 용액 중의 인간 Tie2Fc인 균일한 재조합 수용체 집단에 결합하는 모 바스큘로타이드의 검출을 보여준다. 도 2c는 트립토판 형광 분광법을 이용하여 용액 중의 인간 Tie2Fc인 균일한 재조합 수용체 집단에 결합하는 MPA-Br의 검출을 보여준다. 고유 형광 강도의 증가 및 인간 Tie2Fc 수용체와 증가하는 농도의 리간드(a, c)(○) 또는 리간드 단독(□)의 항온처리 시 생성된 결합 곡선. 샘플은 295㎚의 파장에서 여기되었다. 도 2b는 인간 Tie2Fc에 대한 모 바스큘로타이드의 특이적 포화 결합 곡선을 보여준다. 도 2d는 인간 Tie2Fc에 대한 Mpa-Br의 특이적 포화 결합 곡선을 보여준다. 비선형 회귀 일 부위 특이적 결합에 대해 모 바스큘로타이드 단독 또는 MPABr 단독의 고유 형광 강도는 전체 결합으로부터 공제되었다. 인간 Tie2Fc에 대한 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br의 정규화된 특이적 결합에 대한 생성된 Kd 값은 각각 102.9nM 및 2.623nM이었다. 도 2e는 인간 IgGFc에 의한 모 바스큘로타이드의 결합 곡선을 보여준다. 도 2f는 인간 IgGFc에 의한 MPA-Br의 결합 곡선을 보여준다. 결합의 포화는 인간 IgGFc 및 모 바스큘로타이드 또는 인간 IgGFc 및 MPA-Br에 의해 관찰되지 않았다. 도 2g는 재조합 Tie2FC의 다양한 종에 대한 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br의 결합 상수를 도시하는 표를 보여준다. 트립토판 스캐닝 형광 분광법은 재조합 Tie2Fc 수용체의 표시된 종에 대해 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br의 결합 상수를 결정하도록 사용되었다.
도 3a는 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br이 Tie2 수용체를 활성화시킨다는 것을 보여준다. 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br의 상승 용량에 의해 치료된 HUVEC 세포에서의 인산화된 Tie-2. 데이터는 치료 무(NT)에 대해 정규화된 평균±SEM으로서 표시된다, 1방향 ANOVA 사후 Holm-Sidak 다중 비교, * p<0.05, ** p<0.01. 시각 용이를 위해, 빗금 선은 MPA-Br 치료로부터 모 바스큘로타이드 치료를 분리한다. 도 3b는 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br이 미토겐 활성화된 단백질 키나제(MAPK)를 활성화한다는 것을 보여준다. 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br에 의해 치료된 HUVEC 세포에서의 MAPK(Erk2)의 인산화. 데이터는 치료 무(NT)에 대해 정규화된 평균±SEM으로 표시된다, 1방향 ANOVA 사후 Holm-Sidak 다중 비교, * p<0.05, **** p<0.0001.
도 4a는 표시된 농도에서 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br에 의해 치료된 (텔로머라제에 의해 부동화된) HMVEC tert 세포에서의 인산화된 Tie-2를 보여준다(데이터는 평균±SEM으로 표시된다, 스튜던트 t 시험, * p< 0.05, ** p<0.01, 치료 그룹 대 내피 기본 배지(EBM)-치료 그룹. 도 4b는 표시된 농도에서 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br에 의해 치료된 1차 마우스 폐 미세혈관 내피 세포에서의 인산화된 Tie-2를 보여준다(데이터는 평균±SEM으로 표시된다, 1방향 ANOVA 사후 Holm-Sidak, * p< 0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, # p=0.06 치료 그룹 대 치료 무(NT).
도 5a는 래트 사구체로부터 유래된 1차 배양된 내피 세포를 보여주고, 도 5b는 개과 대동맥으로부터 유래된 1차 배양된 내피 세포를 보여주고, 도 5c는 사이노몰거스 원숭이 사구체로부터 유래된 1차 배양된 내피 세포를 보여준다. 세포를 15분 동안 표시된 농도의 MPA-Br(mBr)에 의해 자극하였다. 인산화된 Tie2를 ELISA를 통해 정량화하고, 도시된 데이터는 전체 Tie2 단백질 수준으로 정규화될 때 Tie2의 상대 활성화(pTie2)를 나타낸다. 인간 재조합 안지오포이에틴 1(Ang1)은 양성 대조군으로서 포함되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다, 스튜던트 t 시험, * p< 0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 치료 그룹 대 치료 무(NT). 래트에 대해 n = 3, 개과에 대해 n = 4 및 사이노몰거스에 대해 n = 3.
도 6a 내지 도 6i는 모 VT 및 MPA-Br이 X31(H3N2) 인플루엔자에 의한 접종 이후에 마우스를 보호한다는 것을 보여준다. 마우스를 0일에 64HAU X31에 의해 비강내 감염시켰다. 표시된 용량의 모 VT 또는 MPA-Br은 연구의 기간 동안 감염 후 48시간에 시작하여 24시간마다 복강내(I.P.) 주어졌다. 생존 분획은 12일까지 매일 모니터링되었다(도 6a). 초기 체중의 분획은 감염 후 5일(도 6b) 및 6일(도 6c)에 측정되었다. 감염 후 5일(도 6d) 및 6일(도 6e)에 동맥 산소 포화. 체온은 감염 후 5일(도 6f) 또는 6일(도 6g)에 측정되었다. 활동 점수는 감염 이후에 5일(도 6h) 및 6일(도 6i)에 측정되었다. 생존율 통계는 Mantel Cox Log Rank 분석에 의해 수행되었고, 여기서 *** p<0.001이다. 모든 다른 통계 측정치는 하기와 같았다: 피셔(Fisher) 사후 시험에 의해 1방향 ANOVA를 통해 PBS에 의한 Flu에 대해 # p < 0.05, 던넷(Dunnett) 사후 시험에 의해 1방향 ANOVA를 통해 PBS에 의한 Flu에 대해 * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 및 **** p,0.0001.
도 7a, 도 7b는 스프라그 다울리 래트에 0시간에 고리 정맥 주사를 통해 모 표시된 용량의 VT 또는 MPA-Br이 주어진다는 것을 나타낸다. 혈장을 ELISA를 통해 시험 물질의 순환 수준의 정량화를 수월하게 하도록 표시된 시점에서 수집하였다. 그래프는 시간에 걸친 전신 순환으로부터의 순환 MPA-Br(도 7a) 및 모 VT(도 7b)의 손실을 도시한다. 표는 120㎍/㎏ 용량에 대한 계산된 청소율, 분포의 용적 및 말단 반감기 값을 기재한다. 연구의 하나의 아암은 연속 3일(다용량 MD 120㎍/㎏) 동안 24시간마다 1회 용량으로 전달되는 MPA-Br을 제공하였다.
도 8은 등이 면도된 수컷 FVB 마우스에 피부 히스타민 시험감염 전 1시간에 (IP를 통해) 표시된 양의 모 바스큘로타이드 또는 MPA-Br이 주어진다는 것을 보여준다. 꼬리 정맥을 통해 전달된 에반스 블루(Evans blue: EB) 염료는 히스타민 노출 직후 투여되었다. 표준화된 피내 피부 생검은 히스타민 시험감염 후 30분에 심장 관류된 마우스로부터 제거되었다. 620㎚에서의 흡광도는 모든 치료 그룹에 대해 EB 염료 혈관외유출의 분량을 계산하도록 사용되었다. 데이터는 EB ± SEM의 평균 분량으로 표시된다, PBS 비히클 대조군에 대한 1방향 ANOVA 사후 던넷 다중 비교, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.
정의
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "(C1-Cp)-알킬"은 1개 내지 "p"개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 및/또는 분지쇄 포화 알킬 라디칼을 의미하고, (p의 동일성에 따라) 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, s-뷰틸, 아이소뷰틸, t-뷰틸, 2,2-다이메틸뷰틸, n-펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, n-헥실 등을 포함하고, 여기서 변수 p는 알킬 라디칼 내의 탄소 원자의 가장 큰 수를 나타내는 정수이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "(C2-Cp)-알켄일"은 2개 내지 "p"개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 및/또는 분지쇄 불포화 알킬 모이어티를 의미하고, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하고, (p의 동일성에 따라) 에텐일, 1-프로펜일, 아이소프로펜일, 1-뷰텐일, 2-뷰텐일, t-뷰텐일, 1-펜텐일, 2-메틸-1-펜텐일, 3-메틸-1-펜틸, 4-메틸-1-펜틸, 1-헥센일, 2-헥센일 등을 포함하고, 여기서 변수 p는 알켄일 라디칼 내의 탄소 원자의 가장 큰 수를 나타내는 정수이다.
용어 "(C1-Cp)-알콕시"는 산소 원자가 부착된 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바대로, 상기 용어는 산소 원자가 부착되고 1개 내지 "p"개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 및/또는 분지쇄 포화 알킬 라디칼을 의미하고, (p의 동일성에 따라) 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소프로폭시, n-뷰톡시, s-뷰톡시, 아이소뷰톡시, t-뷰톡시, 2,2-다이메틸뷰톡시, n-펜톡시, 2-메틸펜톡시, 3-메틸펜톡시, 4-메틸펜톡시, n-헥속시 등을 포함하고, 여기서 변수 p는 알콕시 라디칼 내의 탄소 원자의 가장 큰 수를 나타내는 정수이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "아릴"은 적어도 하나의 방향족 고리, 예를 들어 단일 고리(예를 들어 페닐) 또는 다중 축합 고리(예를 들어 나프틸)를 함유하는 환식 기를 의미한다. 본 개시내용의 실시형태에서, 아릴기는 6개, 9개 또는 10개의 원자, 예컨대 페닐, 나프틸, 인단일, 안트라센일, 1,2-다이하이드로나프틸, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸, 플루오렌일, 인단일, 인덴일 등을 함유한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택된 적어도 하나의 이종원자 및 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 방향족 환식 또는 다중환식 고리 시스템을 의미한다. 헤테로아릴기의 예는 무엇보다도, 제한 없이, 퓨릴, 티엔일, 피리딜, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 인돌릴, 아이소인돌릴, 트라이아졸릴, 피롤릴, 테트라졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 벤조퓨란일, 벤조티오페닐, 카바졸릴, 벤족사졸릴, 피리미딘일, 벤즈이미다졸릴, 퀴녹살린일, 벤조티아졸릴, 나프티리딘일, 아이속사졸릴, 아이소티아졸릴, 퓨린일 및 퀴나졸리닐을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "할로"는 할로겐 원자를 의미하고, 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br) 및 요오드(I)를 포함한다.
임의의 상기 기에 추가된 접미사 "엔"은 기가 2가라는, 즉 2개의 다른 기 사이에 삽입된다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로 레트로-인베르소 펩타이드는 d-아미노산이 역순서로 치환된 펩타이드를 의미한다. 측쇄 위상기하학은 원래의 분자(1차 구조)를 모방하고 이에 따라 결합을 제공한다.
본 개시내용의 화합물
일 실시형태에서, 본 발명자들은 바스큘로타이드(VT)에 비해 개선된 활성을 갖는 신규한 물질의 종류를 제공하고, 예에서 "Mpa-Br"로서 신규한 물질 중 하나를 의미한다.
따라서, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 화합물, 및/또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00005
식 중,
n은 약 25 내지 약 100의 정수이고,
X는 각각 독립적으로 또는 동시에 (C1-C20)-알킬렌 또는 (C2-C20)-알켄일렌이고, 이들은 각각 하나 이상의 할로, 아미노, 하이드록시, (C1-C6)-알킬, (C1-C6)-알콕시, (C6-C10)-아릴 또는 (C5-C10)-헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환되고;
Y는 각각 독립적으로 또는 동시에 (C1-C20)-알킬렌 또는 (C2-C20)-알켄일렌이고, 이들은 각각 하나 이상의 할로, 아미노, 하이드록시, (C1-C6)-알킬, (C1-C6)-알콕시, (C6-C10)-아릴 또는 (C5-C10)-헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환되고;
R은 T7 펩타이드(서열 번호 1), GA3 펩타이드(서열 번호 2), T4 펩타이드(서열 번호 3), T6 펩타이드(서열 번호 4) 또는 T8 펩타이드(서열 번호 5) 또는 이의 레트로-인베르소 펩타이드이다.
일 실시형태에서, R은 T7 펩타이드이고, T7 펩타이드는 His-His-His-Arg-His-Ser-Phe(서열 번호 1)의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, R은 GA3 펩타이드이고, GA3 펩타이드는 Trp-Thr-Ile-Ile-Gln-Arg-Arg-Glu-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-Arg-Thr-Trp-Lys-Glu-Tyr-Lys(서열 번호 2)의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, R은 T4 펩타이드이고, T4 펩타이드는 Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser(서열 번호 3)의 아미노산 서열을 포함한다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, R은 T6 펩타이드이고, T6 펩타이드는 Lys-Leu-Trp-Val-Ile-Pro-Lys(서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함한다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, R은 T8 펩타이드이고, T8 펩타이드는 His-Pro-Trp-Leu-Thr-Arg-His(서열 번호 5)의 아미노산 서열을 포함한다.
T4, T6, T7 및 T8은 문헌[Tournaire, R. et al. (2004) EMBO Reports 5:262-267]에 기재된 Tie 2 결합 펩타이드 T4, T6, T7 및 T8이다. GA3은 또한 문헌[Wu, X. et al. (2004) Biochem . Biophys . Res. Commun. 315:1004-1010]에 기재된 Tie 2 결합 펩타이드이다.
일 실시형태에서, n은 약 40 내지 약 70, 또는 약 48 내지 약 65, 또는 약 55의 정수이다.
또 다른 실시형태에서, X는 독립적으로 또는 동시에 (C1-C10)-알킬렌 또는 (C2-C10)-알켄일렌이다. 또 다른 실시형태에서, X는 독립적으로 또는 동시에 (C1-C6)-알킬렌 또는 (C2-C6)-알켄일렌이다. 또 다른 실시형태에서, X는 독립적으로 또는 동시에 (C1-C3)-알킬렌이다. 또 다른 실시형태에서, X는 메틸렌(-CH2-)이다. 또 다른 실시형태에서, 선택적인 치환기는 하나 이상의 할로 또는 (C1-C3)-알킬 또는 CH3이다.
또 다른 실시형태에서, Y는 독립적으로 또는 동시에 (C1-C10)-알킬렌 또는 (C2-C10)-알켄일렌이다. 또 다른 실시형태에서, Y는 독립적으로 또는 동시에 (C1-C6)-알킬렌 또는 (C2-C6)-알켄일렌이다. 또 다른 실시형태에서, Y는 독립적으로 또는 동시에 (C1-C3)-알킬렌이다. 또 다른 실시형태에서, Y는 에틸렌(-CH2CH2-)이다. 또 다른 실시형태에서, Y는 티오글라이콜산, 2-머캅토프로피온산, 4-머캅토뷰티르산, 6-머캅토헥산산, 8-머캅토옥탄산, 11-머캅토운데칸산, 12-머캅토도데칸산 또는 16-머캅토헥사데칸산으로부터 유래된다.
일 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00006
식 중,
n은 약 50 내지 60 또는 약 55의 정수이고;
R은 His-His-His-Arg-His-Ser-Phe(서열 번호 1)이다.
또 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 산 부가염, 예컨대 아세테이트, 트라이플루오로아세테이트 또는 HCl 염 형태이다. 또 다른 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 아세테이트 또는 하이드로클로라이드 염인 염이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 또한 화학식 (I)의 화합물의 사합체 이외에 이합체 및 삼합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 개시내용은 하기 화학식을 갖는 이합체, 삼합체 및 사합체 화합물을 포함한다:
Figure pct00007
식 중,
W는 독립적으로 또는 동시에 하이드록시 치환된 (C1-C20)-알킬 또는 하이드록시 치환된 (C2-C20)-알켄일이고, 이들은 각각 하나 이상의 할로, 아미노, 하이드록시, (C1-C6)-알킬, (C1-C6)-알콕시, (C6-C10)-아릴 또는 (C5-C10)-헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환되거나;
W는 X-S-Y-C(O)-R이고,
n, X, Y 및 R은 상기 정의된 바와 같다.
일 실시형태에서, W는 하이드록시 치환된 (C1-C10)-알킬 또는 하이드록시 치환된 (C2-C10)-알켄일이다. 또 다른 실시형태에서, W는 하이드록시 치환된 (C1-C6)-알킬 또는 하이드록시 치환된 (C2-C6)-알켄일이다. 또 다른 실시형태에서, W는 -CH2-OH이다.
일 실시형태에서, 이합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00008
식 중, W는 독립적으로 또는 동시에 하이드록시 치환된 (C1-C20)-알킬 또는 하이드록시 치환된 (C2-C20)-알켄일이고, 이들은 각각 하나 이상의 할로, 아미노, 하이드록시, (C1-C6)-알킬, (C1-C6)-알콕시, (C6-C10)-아릴 또는 (C5-C10)-헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환되고,
n, X, Y 및 R은 상기 정의된 바와 같다.
또 다른 실시형태에서, 삼합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00009
식 중, W는 독립적으로 또는 동시에 하이드록시 치환된 (C1-C20)-알킬 또는 하이드록시 치환된 (C2-C20)-알켄일이고, 이들은 각각 하나 이상의 할로, 아미노, 하이드록시, (C1-C6)-알킬, (C1-C6)-알콕시, (C6-C10)-아릴 또는 (C5-C10)-헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환되고,
n, X, Y 및 R은 상기 정의된 바와 같다.
또 다른 실시형태에서, 사합체는 화학식 (I)의 화합물이다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 Tie 2 작용제 활성을 나타낸다. 이 Tie 2 작용제 활성은 당해 분야에서 널리 확립된 Tie 2 활성화의 표시자를 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 화합물은 Tie 2 인산화(예를 들어, 타이로신 잔기, 예컨대 인간 Tie 2의 아미노산 잔기 Y992에서의 인산화)를 자극할 수 있다.
따라서, 실시형태에서, 화합물은 Tie 2 인산화를 자극한다.
더욱이, 본 명세서에 개시된 화합물은 Tie 2의 하류 신호전달 경로에서의 분자의 인산화, 예컨대 MAPK, AKT의 인산화(예를 들어, 인간 AKT의 아미노산 잔기 S473에서의 인산화) 및/또는 eNOS의 인산화(예를 들어, eNOS의 아미노산 잔기 S1177에서의 인산화)를 자극할 수 있다. 특정한 단백질의 인산화를 자극하는 화합물의 능력은 당해 분야에 널리 공지된 표준 기법, 예컨대 화합물에 의해 치료된 세포 용해물의 면역블롯 검정을 이용하여 결정될 수 있다.
따라서, 실시형태에서, 화합물은 MAPK, AKT 및 eNOS의 인산화를 자극한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 내피 세포에 대한 입증 가능한 효과를 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 화합물은 내피 세포 이동의 자극, 내피 세포로부터의 MMP2 방출 및 혈청 배출 유도된 아폽토시스로부터의 내피 세포의 보호의 자극으로 이루어진 군으로부터 선택된 내피 세포에 대한 적어도 하나의 효과를 가질 수 있다. 선택적으로, 본 명세서에 개시된 화합물은 내피 세포에 대한 이들 효과 중 적어도 2개를 갖거나, 내피 세포에 대한 이들 효과 중 모든 3개를 갖는다. 내피 세포에 대한 임의의 이러한 효과를 갖는 화합물의 능력은 당해 분야에 공지된 검정, 예컨대 세포 이동을 평가하기 위한 보이든(Boyden) 챔버 검정, MMP2 방출을 평가하기 위한 지모그래피 검정 또는 혈청 배출 유도된 아폽토시스를 평가하기 위한 세포사 ELISA 검정을 이용하여 결정될 수 있다.
따라서, 실시형태에서, 화합물은 내피 세포 이동을 자극하고/하거나; 내피 세포로부터의 MMP2 방출 및/또는 혈청 배출 유도된 아폽토시스로부터의 내피 세포의 보호를 자극한다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 시험관내 또는 생체내 혈관신생 검정에서 측정된 바대로 혈관신생에서 입증 가능한 효과를 갖는다. 하나의 이러한 검정은 생체내 마트리겔 검정이고, 여기서 성장 인자 감소된 마트리겔은 화합물에 의해 함침되고, 시험 동물로 피하로 주사된다. 시간의 기간(예를 들어, 14일) 후, 시험 동물은 용기 식별 및 정량화를 수월하게 하는 물질(예를 들어, FITC-렉틴)에 의해 치료될 수 있고, 마트리겔 플러그는 제거되고 혈관신생 반응에 조사될 수 있다.
따라서, 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 마트리겔 검정에서 생체내 혈관신생 반응을 자극한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 대상체의 상처에 국소로 적용될 때 대상체에서 상처 치유를 자극할 수 있다. 상처 치유를 자극하는 화합물의 능력은 동물 모델, 예컨대 손상된 상처 치유를 제시하는 마우스의 당뇨병성 균주인 마우스의 B6.Cg-m(+/+)Lepr(db)/J(db/db) 균주에서 평가될 수 있다. 절제 상처는 마우스에서 이루어질 수 있고, 국소 제제로 도입된 화합물은 상처에 적용될 수 있고, 상처 치유가 평가될 수 있다. 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 상처 봉합 시간을 가속시킬 수 있고/있거나, 콜라겐 침착 및 신생혈관화의 증가를 촉진할 수 있다.
따라서, 실시형태에서, 화합물은 대상체의 상처에 국소로 적용될 때 대상체에서 상처 치유를 자극한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물에서의 PEG 분자의 수는 선택적으로 약 21,500달톤 미만의 분자량, 약 8,000달톤 내지 약 21,500달톤의 분자량 범위, 약 12,500달톤, 약 15,500달톤 또는 약 14,000달톤의 분자량을 발생시키는 수이다.
본 명세서에 개시된 화합물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 또한 제공된다.
본 명세서에 사용된 바대로, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 선택적으로, 담체는 (예를 들어, 주사 또는 점적주사에 의해) 국소 투여에 또는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다. 투여의 경로에 따라, 활성 화합물은 산의 작용으로부터 화합물을 보호하는 재료 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건에서 코팅될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 원하는 투여 경로에 적합하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 국소 투여에 적합하다. 국소 투여에 적합한 담체의 비제한적인 예는 (Smith & Nephew로부터 상업적으로 구입 가능한) IntraSite Gel이다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 전신 투여에 적합하다. 전신(예를 들어, 정맥내) 투여에 적합한 담체의 비제한적인 예는 인산염 완충 식염수(PBS)이다.
훨씬 또 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 비강내 투여에 적합하다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 흡입에 적합하다. 추가의 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 관류액의 성분으로서 적합하다.
약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한 염"은 원래의 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 임의의 원치 않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다(예를 들어, 문헌[Berge, S. M. et al. (1977) J. Pharm . Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염화수소산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 인 등, 및 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노카복실산 및 다이카복실산, 페닐 치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등(예컨대, 아세트산)으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등, 및 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 아황산수소나트륨, 메타아황산수소나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 뷰틸화 하이드록시아니솔(BHA), 뷰틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
약제학적 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유 및 주사용 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅 재료, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이 조성물은 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및/또는 분산제를 또한 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 예방은 무균화 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 조성물에 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 발생할 수 있다.
치료학적 조성물은 통상적으로 제조 및 저장의 조건 하에 무균이고 안정해야 한다. 무균 주사용 용액은 적절한 용매 중의 필요한 양의 활성 화합물을 필요한 바대로 상기 열거된 성분의 하나 또는 조합에 의해 도입한 후, 무균화 정밀여과에 의해 제조될 수 있다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포솜 또는 높은 약물 농도로 적합한 다른 순서화된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등)을 함유하는 용매 또는 분산 매질, 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물에서 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
단일 투여형을 제조하기 위해 담체 재료와 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체 및 특정한 투여 방식에 따라 변할 것이다. 단일 투여형을 제조하기 위해 담체 재료와 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료학적 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이 양은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합되어 활성 성분의 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 활성 성분의 약 1% 내지 약 30%의 범위일 것이다.
투약량 섭생은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료학적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스는 투여될 수 있거나, 몇몇 분할 용량은 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료학적 상황의 응급성에 의해 표시된 바대로 비례하여 감소하거나 증가할 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 투약량 단위 형태에서 제제화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 투약량 단위 형태는 치료되는 대상체에 대한 단일의 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 의미하고; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 회합되어 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 분량을 함유한다. 투약량 단위 형태에 대한 사양은 (a) 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성되는 특정한 치료학적 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 것의 당해 분야에서 고유한 제한에 의해 그리고 직접적으로 이에 따라 기재된다.
본 명세서에 개시된 화합물의 전신 투여를 위해, 투약량은 통상적으로 약 0.00001 내지 100㎎/㎏, 더 보통 0.1 내지 100㎍/㎏(숙주 체중)의 범위이다. 예를 들어, 투약량은 0.1㎍/㎏, 0.5㎍/㎏, 5㎍/㎏, 10㎍/㎏, 30㎍/㎏(체중), 0.1㎎/㎏(체중), 0.3㎎/㎏(체중), 0.5㎎/㎏(체중) 또는 1㎎/㎏(체중)일 수 있다. 국소 투여를 위해, 예시적인 투약량 농도는 약 1ng/㎖ 내지 약 10ng/㎖이다.
약제학적 조성물 내의 활성 성분의 실제 투약량 수준은 환자에 독성 없이 특정한 환자에 대한 원하는 치료학적 반응, 조성물 및 투여 방식을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 변할 수 있다. 선택된 투약량 수준은 다양한 약동학적 인자, 예를 들어 사용되는 특정한 조성물, 또는 이의 에스터, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배설률, 치료의 기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 컨디션, 일반 건강 및 이전의 의학 병력 및 의학 분야에 널리 공지된 유사한 인자에 따라 달라질 것이다. 당업자는 대상체의 몸집, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 투여 경로 또는 특정한 조성물과 같은 인자에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
제조 방법
(i) T7 펩타이드(서열 번호 1), GA3 펩타이드(서열 번호 2), T4 펩타이드(서열 번호 3), T6 펩타이드(서열 번호 4) 및/또는 T8 펩타이드(서열 번호 5) 또는 이의 레트로-인베르소 펩타이드인 펩타이드를 하기 화학식 (II)의 티올 화합물과 반응시켜, 하기 화학식 (III)의 화합물 또는 이의 염을 얻는 단계; 및
[화학식 II]
Figure pct00010
[화학식 III]
Figure pct00011
(ii) 화학식 (III)의 화합물을 하기 화학식 (IV)의 PEG-사합체와 반응시켜, 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 얻는 단계를 포함하는, 본 명세서에 개시된 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다:
[화학식 IV]
Figure pct00012
식 중, 변수 n, X 및 Y는 상기 정의된 바와 같고, LG는 적합한 이탈기이고, PG는 H 또는 적합한 보호기이다.
일 실시형태에서, 적합한 이탈기는 할로, 토실레이트 또는 메실레이트이다. 추가의 실시형태에서, 이탈기는 브로모이다.
일 실시형태에서, 적합한 보호기는 트라이틸이다.
일 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물은 산 부가염, 예컨대 트라이플루오로아세테이트 염, 아세테이트 염 또는 하이드로클로라이드 염이다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드(R)은 폴리스타이렌 수지에 처음에 결합된다. 또 다른 실시형태에서, 폴리스타이렌 수지에 결합된 펩타이드는 이후 화학식 (II)의 티올 화합물과 반응한다. 추가의 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물은 폴리스타이렌 수지에 결합되고, 이것은 화학식 (IV)의 화합물과 반응되기 전에 절단된다.
일 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물과 화학식 (IV)의 화합물 사이의 반응은 약 5 내지 약 8, 또는 약 6 내지 약 8, 또는 약 6 내지 약 7, 또는 6.5의 pH에서 수행된다.
다른 실시형태에서, 화학식 (III)의 티올 화합물은 상기 기재된 바와 같고 추가로 불포화 모이어티를 함유하는 사합체 PEG 분자와의 마이클(Michael) 부가 반응에서 친핵체로서 사용된다. 예를 들어, 화학식 (III)의 화합물은 사합체 PEG 분자, 예컨대 하기와 반응하고;
Figure pct00013
식 중,
T는 불포화 모이어티, 예컨대 아크릴레이트 모이어티 또는 비닐 설폰 모이어티이다.
또 다른 실시형태에서, 아크릴레이트 모이어티는
Figure pct00014
이다.
또 다른 실시형태에서, 비닐 설폰 모이어티는
Figure pct00015
이다.
일 실시형태에서, 화학식 (III)의 화합물 내의 티올 모이어티는 본 개시내용의 추가적인 화합물, 예컨대
Figure pct00016
또는
Figure pct00017
(식 중, R 및 Y는 상기 정의된 바와 같음)
을 형성하기 위해 마이클 부가 반응에서 친핵체로서 작용한다.
방법 및 용도
Tie2 활성화 및 혈관신생의 자극
또 다른 양태는 본 명세서에 개시된 화합물을 사용하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 바대로, 본 명세서에 개시된 화합물은 시험관내 또는 생체내 Tie 2 수용체를 활성화하도록 사용될 수 있다. 따라서, 실시형태에서, Tie 2 수용체를 본 명세서에 개시된 화합물과 접촉시키는 단계(이에 의해 Tie 2 수용체가 활성화됨)를 포함하는 Tie 2 수용체를 활성화하는 방법이 제공된다. Tie 2 수용체를 활성화하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. Tie 2 수용체를 활성화하기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 추가로 제공된다. Tie 2 수용체를 활성화하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 훨씬 추가로 제공된다.
Tie 2 수용체의 활성화는 다양한 시험관내 및 생체내 검정(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 당해 분야에서 널리 확립된 Tie 2 활성화의 임의의 많은 가능한 표시자에 의해 입증될 수 있다. 일 실시형태에서, 예를 들어 Tie 2 수용체의 활성화는 Tie 2 수용체의 타이로신 잔기, 예를 들어 인간 Tie 2의 992번 타이로신(Y992)의 인산화에 의해 입증된다. 또 다른 실시형태에서, 예를 들어 Tie 2 수용체의 활성화는 MAPK, AKT 또는 eNOS의 인산화에 의해 입증된다.
본 명세서에 개시된 화합물이 혈관신생 활성을 갖는 것으로 나타난 바스큘로타이드보다 증가된 규모의 반응 및 더 넓은 용량 범위를 갖는 것으로 나타났으므로(예를 들어, 도 3a, 도 3b, 도 4a, 도 4b, 도 5a 내지 도 5c 및 도 8a 참조), 본 명세서에 개시된 화합물을 혈관신생의 자극을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 혈관신생을 자극하는 방법이 또한 제공된다. 혈관신생의 자극을 필요로 하는 대상체에서 혈관신생을 자극하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 혈관신생의 자극을 필요로 하는 대상체에서 혈관신생을 자극하기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 추가로 제공된다. 혈관신생의 자극을 필요로 하는 대상체에서 혈관신생을 자극하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 훨씬 추가로 제공된다.
실시형태에서, 화합물에 의해 자극된 혈관신생은
a) 혈관주위 지지 세포의 동원;
b) 혈관의 비누수성(그렇지 않으면 누설할 것임);
c) 잘 한정된 수상돌기분지; 및
d) 내피 세포 아폽토시스의 저해의 특성 중 적어도 하나를 특징으로 한다.
혈관주위 지지 세포의 동원은 평활근 세포의 마커의 검출에 의해, 예를 들어 평활근 액틴 1(Sma 1), NG2 또는 데스민에 대한 항체에 의한 면역염색에 의해 입증될 수 있다. 혈관의 비누수성은 시험관내 및/또는 생체내 검정을 포함하는 당해 분야에서 확립된 혈관 투과성 검정에 의해 평가될 수 있다. 생체내 혈관 투과성 검정의 비제한적인 예는 에반스 블루 또는 FITC 알부민을 사용한 Miles 검정이다. 본 명세서에 사용된 바대로, 혈관은 혈관의 투과성의 정도가 VEGF 치료 또는 다른 혈관성 염증성 매개자, 예컨대 세로토닌 또는 히스타민에 의한 치료에 의해 성장이 자극되는 혈관의 투과성의 정도보다 작은 경우 "비누수"로 생각되어야 한다. 잘 한정된 수상돌기분지는 예를 들어 새로 형성된 혈관의 영상화 및 특정한 시야 상에서 혈관의 수 및 결절의 수의 정량화에 의해 입증될 수 있다. 잘 한정된 수상돌기분지는 예를 들어 혈관의 유의미하고 조직화된 분지, 예컨대 혈관의 수 대 결절의 수의 비율이 1.0:0.5, 선택적으로 1.0:0.7 또는 더욱 1.0:1.0인 혈관신생에 의해 표시된다. 더욱이, 신생혈관의 유동 역학은 마이크로 도플러 초음파를 사용하여 평가될 수 있다.
혈관신생을 자극하는 방법에서, 그 부위는 본 명세서에 개시된 화합물 단독과 접촉할 수 있거나, 대안적으로, 그 부위는 하나 이상의 추가적인 혈관신생제와 접촉할 수 있다. 따라서, 또 다른 실시형태에서, 혈관신생 방법은 대상체에서의 부위를 제2 혈관신생제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 본 명세서에 개시된 화합물과 조합되어 사용될 수 있는 추가적인 혈관신생제의 비제한적인 예는 VEGF, PDGF, G-CSF, 재조합 인간 에리쓰로포이에틴, bFGF 및 태반 성장 인자(PLGF)를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 제2 혈관신생제는 VEGF이다. 또 다른 실시형태에서, 제2 혈관신생제는 PDGF, G-CSF, 재조합 인간 에리쓰로포이에틴, bFGF, Ang2 저해제 및 태반 성장 인자(PLGF)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 개시된 화합물이 혈관신생을 자극하는 능력을 고려하여, 본 명세서에 개시된 화합물은 혈관신생의 촉진이 바람직한 다양한 임상 상황에서 사용될 수 있다. 이러한 적응증의 비제한적인 예는 재생 조직의 혈관화, 허혈성 사지 질환, 뇌 허혈, 혈관성 염증의 병태, 예를 들어 동맥경화증, 비혈관성 괴사, 모발 성장의 자극 및 발기 부전을 포함한다.
본 명세서에 개시된 화합물을 혈관 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서의 부위에 투여하는 단계를 포함하는 누수 혈관의 부위에서 혈관 투과성을 감소시키는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다. 혈관 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 누수 혈관의 부위에서 혈관 투과성을 감소시키기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 혈관 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 누수 혈관의 부위에서 혈관 투과성을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 추가로 제공된다. 혈관 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 누수 혈관의 부위에서 혈관 투과성을 감소시키는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 훨씬 추가로 제공된다.
실시형태에서, 대상체는 뇌졸중, 황반 변성, 황반 부종, 림프 부종, 혈액-망막 장벽의 파괴, 혈액-뇌 장벽의 파괴, 박테리아 유도된 혈관 누수를 가지거나 가졌거나, 종양 맥관구조의 정상화를 요한다.
바스큘로타이드는 예를 들어 내피 세포의 아폽토시스를 저해함으로써 내피 세포에서 보호 효과를 갖는 것으로 이전에 나타났다. 신장 맥관구조에서 내피 세포를 보호하는 Tie 2 작용제의 능력은 실험 모델에서 신장 섬유증을 개선하는 것으로 보고되었다(Kim, W. et al.(2006) J. Am. Soc . Nephrol . 17:2474-2483). MPA-Br은 HUVEC, HMVEC에서 및 1차 래트, 개과 및 사이노몰거스 원숭이 내피 세포에서 Tie2 인산화를 유도하는 것으로 본 명세서에서 나타났다. VT는 (마우스에서의) 이식 이후에 급성 신장 손상을 개선하도록 Thamm K 등의 문헌(2016)에 의해 더 최근에 나타났다. 이것은 또한 VT를 받는 마우스에서 감소된 이식 연관된 신장 섬유증으로 번역되었다. Rubig E 등의 문헌(2016)은 VT가 허혈-재관류 이후에 급성 신장 손상의 정도를 감소시킨다는 것을 나타냈다. 손상의 감소는 증가된 생존율, 손상된 신장 내의 개선된 혈류 및 감소된 혈관 누수에 의해 표시되었다.
따라서, 본 명세서에 개시된 화합물을 내피 세포의 보호를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 내피 세포를 보호하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 내피 세포의 보호를 필요로 하는 대상체에서 내피 세포를 보호하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 내피 세포의 보호를 필요로 하는 대상체에서 내피 세포를 보호하기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 추가로 제공된다. 내피 세포의 보호를 필요로 하는 대상체에서 내피 세포를 보호하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 훨씬 추가로 제공된다.
이러한 방법 또는 용도는 다양한 임상 상황에서 사용될 수 있고, 이의 비제한적인 예는 폐 손상, 신장 손상, 신장 섬유증, 뇌졸중, 혈관성 치매, 황반 변성 및 (예를 들어, 신장, 눈, 피부 및/또는 사지에서의) 당뇨병성 합병증을 포함한다.
상처의 치유의 자극을 필요로 하는 대상체에서의 상처에 본 명세서에 개시된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 상처의 치유를 자극하는 방법이 훨씬 추가로 제공된다. 상처의 치유의 자극을 필요로 하는 대상체에서 상처의 치유를 자극하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 상처의 치유의 자극을 필요로 하는 대상체에서 상처의 치유를 자극하기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 추가로 제공된다. 상처의 치유의 자극을 필요로 하는 대상체에서 상처의 치유를 자극하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 훨씬 추가로 제공된다.
상처 치유의 자극은 예를 들어 화합물의 부재 하의 상처 치유와 비교하여 가속된 상처 봉합 시간, 치료 무와 비교하여 상처 부위에서의 증가된 과립화 조직 및/또는 치료 무와 비교하여 상처의 증대된 신생혈관화에 의해 입증될 수 있다.
일 실시형태에서, 상처의 치유를 자극하기 위한 방법 또는 용도는 당뇨병성 궤양의 치료에 사용된다.
다른 실시형태에서, 상처의 치유를 자극하기 위한 방법 또는 용도는 욕창성 궤양, 압박 궤양, 수술 절제, 외상성 조직 손상, 화상 및 피부 이식(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 상처를 포함하는 다양한 임상 상황에서 사용될 수 있다.
호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태
MPA-Br은 CFU-G 세포의 증식을 저해하는 것으로 이전에 밝혀진 바스큘로타이드에 비해 개선된 표적 결합 및 약동학을 갖는 화합물이다.
따라서, 본 명세서에 개시된 화합물을 CFU-G 세포의 증식의 저해를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 CFU-G 세포의 증식을 저해하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 본 개시내용은 또한 CFU-G 세포의 증식의 저해를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 CFU-G 세포의 증식을 저해하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도를 제공한다. CFU-G 세포의 증식의 저해를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 CFU-G 세포의 증식을 저해하기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. CFU-G 세포의 증식의 저해를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 CFU-G 세포의 증식을 저해하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 추가로 제공된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "CFU-G"는 과립구, 예컨대 호산구, 호염구 및 호중구를 생성하는 혈액 형성 세포의 유형인 콜로니 형성 단위-과립구 세포를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바대로 "증식의 저해"는 비치료된 대조군과 비교하여 과립구 콜로니 형성 세포의 수의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 이것 초과의 감소를 의미한다.
MPA-Br은 T 세포, B 세포, 단핵구 또는 호중구의 더 일반적인 면역억제 없이 순환 호산구 및 호염구에서 아토피성 질환을 감소시키는 것으로 이전에 밝혀진 바스큘로타이드에 비해 개선된 결합 및 약동학을 갖는 화합물이다. 따라서, 본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 호산구 및/또는 호염구의 감소를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 호산구 및/또는 호염구를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 호산구 및/또는 호염구의 감소를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 호산구 및/또는 호염구를 감소시키기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도를 제공한다. 호산구 및/또는 호염구의 감소를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 호산구 및/또는 호염구를 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 호산구 및/또는 호염구의 감소를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 호산구 및/또는 호염구를 감소시키는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 추가로 제공된다.
본 명세서에 사용된 바대로 구절 "호산구 및/또는 호염구를 감소시키는"은 순환 호산구 및/또는 호염구의 수의 감소를 의미하고, 여기서 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 미만의 호산구 및/또는 호염구는 대조군과 비교하여 순환하고 있다. 추가로, 호염구의 감소는 비만 세포를 감소시키고, 이로써 호염구의 감소는 비만 세포의 감소를 포함한다.
호산구 및 호염구는 알레르기 반응에 관여된다. 추가로, MPA-Br은 피부 히스타민 노출 이후에 혈관 누수를 약화시키도록 본 명세서에 기재되어 있다.
따라서, 본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 화합물을 투여하는 것을 포함하는 알레르기 질환 또는 반응의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 알레르기 질환 또는 반응을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 알레르기 질환 또는 반응의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 알레르기 질환 또는 반응을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도를 제공한다. 알레르기 질환 또는 반응의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 알레르기 질환 또는 반응을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 알레르기 질환 또는 반응의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 알레르기 질환 또는 반응을 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 추가로 제공된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "치료 또는 치료하는"은 임상 결과를 포함하는 유리하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 의미한다. 유리하거나 원하는 임상 결과는, 검출 가능하든 또는 검출 불가능하든, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 개선, 질병의 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화하지 않는) 질병 상태, 질병의 확산의 예방, 질병 진행의 지연 또는 느려짐, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 관해(부분 또는 전부이든)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
실시형태에서, 알레르기 질환 또는 반응은 아토피성 질환이다. 용어 "아토피성 질환"은 본 명세서에 사용된 바대로 알레르겐과 직접적인 접촉하지 않는 신체 부분에 영향을 미치는 알레르기 민감성을 의미하고, 동물의 혈청에서의 IgE의 수준의 증가에 의해 정의된다. 일 실시형태에서, 아토피성 질환은 아토피성 피부염/습진, 천식, 결막염, 만성 부비동염, 호산구 식도염, 식품 알레르기 또는 알레르기 비염/고초열이다. 천식, 알레르기 비염 및 아토피성 피부염은 흔히 아토피성 트리아드라 불리고, 여기서 많은 경우에 아토피성 피부염은 자체를 나타내는 처음이고(Eichenfield et al. 2003), 흔히 천식 및/또는 알레르기 비염의 발생이 후행한다. 따라서, 일 실시형태에서, 아토피성 질환은 아토피성 피부염이다. 또 다른 실시형태에서, 아토피성 질환은 천식이다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태를 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도를 제공한다. 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 추가로 제공된다. 일 실시형태에서, 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 골수이형성 증후군이다. 또 다른 실시형태에서, 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 호산구 및/또는 호염구 기원의 백혈병, 예컨대 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 호산구 백혈병, 급성 호산구 백혈병, 호산구증가증을 동반한 만성 골수단핵구성 백혈병 및 급성 호염구 백혈병이다. 또 다른 실시형태에서, 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 염증성 장 질환이다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 기생충 감염이다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 특발성 과다호산구 증후군(hypereosinophilic syndrome: HES)이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준의 감소를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준의 감소를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준을 감소시키기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도를 제공한다. 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준의 감소를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준의 감소를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준을 감소시키는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 추가로 제공된다. 일 실시형태에서, 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준은 혈청 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준이다. 일 실시형태에서, 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인은 에오탁신, IL-17, MIG, IL12/IL23(p40), IL-9, MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-13, 및 MCP-1 중 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 염증성 사이토카인 및 케모카인은 IL-17, MIG, IL12/IL23(p40), IL-9, MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-13 및 MCP-1을 포함한다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인은 에오탁신을 포함한다. 이러한 방법 및 용도는 증가된 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인과 연관된 질환 및 병태를 치료하는 데에서 치료학적 분야를 갖는다.
실시형태에서, 방법 및 용도는 추가로 본 명세서에 개시된 화합물과 조합된 면역조정제 또는 코르티코스테로이드의 투여 또는 용도를 포함한다.
인플루엔자
바스큘로타이드와 같은 MPA-Br은 인플루엔자의 마우스 모델에서 이환율 및 사망률을 개선하는 것으로 나타났지만, 더 낮은 투약량에서 효과적이다.
따라서, 본 명세서에 개시된 화합물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자에 의해 감염된 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 인플루엔자에 의해 감염된 대상체를 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 인플루엔자에 의해 감염된 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 추가로 제공된다. 인플루엔자에 의해 감염된 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 훨씬 추가로 제공된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 폐 내피 누수를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 내피 누수를 감소시키기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도를 제고한다. 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 내피 누수를 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 내피 누수를 감소시키는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 추가로 제공된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "인플루엔자"는 오르쏘믹소비리다에(Orthomyxoviridae) 과의 RNA 바이러스에 의해 생긴 감염성 질환을 의미한다. 용어 인플루엔자는 또한 1차 바이러스 폐렴을 의미한다. 일 실시형태에서, 인플루엔자는 인간 인플루엔자 바이러스에 의해 생긴 질환이다. 인간 인플루엔자 바이러스는 혈구응집소 분자에서의 소정의 염기성 아미노산의 결여에 의해 조류 인플루엔자 바이러스(예를 들어, H5N1 조류 인플루엔자)로부터 구별될 수 있고; 이는 기도 내에 함유된 트립신 유사 프로테아제로의 절단을 제한한다. 따라서, 인간 인플루엔자는 상피 손상, 아폽토시스 및 낙설을 야기하는 호흡 상피를 주로 감염시킨다(Kuiken and Taubenberger, 2008). 반대로, 조류 인플루엔자 바이러스는 기도 및 표적 내피 세포 밖에서 복제할 수 있다. 인간 인플루엔자 바이러스는 인간 인플루엔자 바이러스가 인간으로부터 인간으로 전파할 수 있지만, 조류 인플루엔자 바이러스가 인간으로부터 인간으로 전파할 수 없다는 것에 기초하여 조류 인플루엔자 바이러스로부터 또한 구별될 수 있다. 인간 인플루엔자 바이러스의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: H1N1, H3N2, H2N2 및 H1N2.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폐 내피 누수"는 장벽 통합성의 손실 또는 폐 미세혈관 내피의 증가된 투과성을 의미한다. 용어 "폐 내피 누수의 감소"는 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 의해 치료되지 않은 대조군과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 25%, 50%, 75% 또는 100%의 폐 내피 누수의 감소를 의미한다. 일 실시형태에서, 폐 내피 누수는 내피통과 전기 저항(transendothelial electrical resistance: TEER) 또는 플루오레세인 태그화 화합물, 예컨대 덱스트란의 형광에 의해 측정된다. 용어 "폐 내피 누수의 감소"는 또한 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 의해 치료되지 않은 대조군과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 25%, 50%, 75% 또는 100%의 폐 미세혈관 내피의 투과성의 증가를 의미한다.
인플루엔자에 의한 저용량 감염은 프라이밍으로 공지된 현상인 박테리아에 대한 후속하는 노출 시 폐 내피가 누수가 증가하게 하고, 바스큘로타이드가 이 프라이밍 유도된 누수를 무효화할 수 있다는 것이 이전에 밝혀졌다. Tie 2 수용체의 개선된 결합을 갖는 MPA-Br 및 인플루엔자의 마우스 모델에서 필요한 더 낮은 투약량은 동일한 또는 더 낮은 투약량에서 유사한 또는 개선된 활성을 제공하는 것으로 예상된다.
따라서, 본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도를 제공한다. 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 추가로 제공된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 갖는 동물 또는 세포에서 생존율을 증가시키고/시키거나 사망률을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 갖는 동물 또는 세포에서 생존율을 증가시키고/시키거나 사망률을 감소시키기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도를 제공한다. 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 갖는 동물 또는 세포에서 생존율을 증가시키고/시키거나 사망률을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 갖는 동물 또는 세포에서 생존율을 증가시키고/시키거나 사망률을 감소시키는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 추가로 제공된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 갖는 동물 또는 세포에서 폐 내피 누수를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 갖는 동물 또는 세포에서 폐 내피 누수를 감소시키기 위한 본 명세서에 개시된 화합물의 용도를 제공한다. 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 갖는 동물 또는 세포에서 폐 내피 누수를 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 개시된 화합물의 용도가 또한 제공된다. 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 갖는 동물 또는 세포에서 폐 내피 누수를 감소시키는 데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물이 추가로 제공된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "박테리아 중복감염"은 저용량 인플루엔자 감염을 포함하는 1차 인플루엔자 감염에 속발하여 또는 통상적으로 이후에 생기는 박테리아 감염을 의미한다. 박테리아 중복감염은 또한 인플루엔자 감염과 동시에 또는 이후에 생기는 폐렴으로 정의될 수 있다. 일 실시형태에서, 박테리아 중복감염을 책임지는 박테리아는 그람 음성 박테리아, 예컨대 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(에스. 아우레우스) 또는 스타필로코커스 뉴모니아(Staphylococcus pneumonia)(에스. 뉴모니아)이다. 이론에 의해 구속되지 않으면서, 인플루엔자가 폐 내피를 프라이밍하여서, 속발성 박테리아 감염이 생길 때 이것이 누수에 더 민감하게 만든다고 생각된다. 그 결과, 박테리아 중복감염은 달리 인플루엔자에 의한 일상적인 감염 후 중증 폐 손상을 야기할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 표현 "인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염"은 일 실시형태에서 인플루엔자 감염과 동일한 시간에 또는 동시에 생기는 박테리아 중복감염을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, 표현 "인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염"은 인플루엔자 감염에 후속하여 또는 이후에 생기는 박테리아 중복감염을 의미한다.
항바이러스제에 의한 현재의 치료는 감염의 초기 발병과 치료 사이에 시간이 지나면서 효과적이지 않고, 이는 증상이 생긴 직후 환자가 항상 치료에 존재하지 않으므로 문제가 된다. 항바이러스제 치료의 감소하는 효율과 반대로, 바스큘로타이드는 지연된 방식으로 주어지더라도 효과적인 것으로 이전에 입증되었고, MPA-Br은 또한 감염 후 48시간 동안 투여가 지연될 때 유효성을 나타냈다.
따라서, 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 감염 후 약 24시간에 또는 적어도 24시간에 사용되거나 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 감염 후 약 48시간에 또는 적어도 48시간에 사용되거나 투여된다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 감염 후 약 72시간에 또는 적어도 72시간에 사용되거나 투여된다.
바스큘로타이드에 의한 치료는 인플루엔자로 인한 1차 바이러스 폐렴 및 급성 폐 손상의 마우스 모델에서 항바이러스제 치료의 효율을 감소시키지 않고 생존율을 증가시키는 것으로 또한 이전에 밝혀졌다. MPA-Br이 동일한 또는 더 낮은 투약량에서 유사한 또는 개선된 활성을 가질 것으로 예상된다. 따라서, 본 개시내용은 또한 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제를 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에게 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포를 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포를 치료하기 위한 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제의 용도를 제공한다. 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제의 용도가 또한 제공된다. 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제가 추가로 제공된다.
본 개시내용은 또한 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제를 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 생존율을 증가시키고/시키거나 사망률을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 생존율을 증가시키고/시키거나 사망률을 감소시키기 위한 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제의 용도를 제공한다. 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 생존율을 증가시키고/시키거나 사망률을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제의 용도가 또한 제공된다. 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 생존율을 증가시키고/시키거나 사망률을 감소시키는 데 사용하기 위한 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제가 추가로 제공된다.
본 개시내용은 또한 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제를 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 폐 내피 누수를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 폐 내피 누수를 감소시키기 위한 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제의 용도를 제공한다. 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 폐 내피 누수를 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제의 용도가 또한 제공된다. 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 폐 내피 누수를 감소시키는 데 사용하기 위한 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제가 추가로 제공된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "항바이러스제"는 바이러스 감염, 예컨대 인플루엔자 바이러스에 의한 감염을 치료하기 위해 사용된 약물을 의미한다. 일 실시형태에서, 항바이러스제는 재생하는 바이러스의 능력을 억제하는 물질이다. 항바이러스제의 예는 아만타딘, 리만타딘, 나자미버, 페라미버, 비라미딘, 리바비린 및 오셀타미버(Tamiflu(등록상표)로도 공지됨)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "치료 또는 치료하는"은 임상 결과를 포함하는 유리하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 의미한다. 유리하거나 원하는 임상 결과는, 검출 가능하든 또는 검출 불가능하든, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 개선, 질병의 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화하지 않는) 질병 상태, 질병의 확산의 예방, 질병 진행의 지연 또는 느려짐, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 관해(부분 또는 전부이든)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료 또는 치료하는"은 또한 인플루엔자에 의한 바이러스 감염에 속발성인 박테리아 중복감염의 예방 또는 억제를 포함한다. 독감 치료의 유리한 결과의 예는 생존율의 증가, 사망률의 감소, 폐 내피 누수의 감소, 체중의 감소 및/또는 저체온증의 예방 및 동맥 산소공급의 개선을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "생존율의 증가"는 인플루엔자에 의한 감염 및/또는 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염에 이후에 동물이 생존하는 시간의 길이의 증가를 의미한다. 일 실시형태에서, 용어 "생존율의 증가"는 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 의해 치료되지 않은 동물과 비교하여 인플루엔자에 의한 감염 이후에 동물이 생존하는 시간의 길이의 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% 증가를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "사망률의 감소"는 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 의해 치료되지 않은 동물과 비교할 때 인플루엔자 및/또는 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 갖는 동물 또는 세포의 사망률의 감소를 의미한다. 일 실시형태에서, 사망률은 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 의해 치료되지 않은 동물과 비교할 때 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 감소한다.
용어 "투여하는"은 시험관내 또는 생체내 동물 또는 세포에 대한 본 명세서에 기재된 물질의 투여를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "대상체" 또는 "동물"은 인간을 포함하는 동물 계의 모든 구성원을 포함한다.
용어 "세포"는 단일 세포, 및 세포의 복수 또는 집단을 포함한다. 세포에 대한 투여는 시험관내(또는 생체외) 및 생체내 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에 개시된 화합물은 국소, 전신, 경구, 비강내를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.
항바이러스제는, 제한 없이, 국소, 전신, 경구, 비강내를 포함하는 임의의 적합한 방식으로 또는 흡입에 의해 또한 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물 및 항바이러스제는 동시에(동일한 시간에) 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물 및 항바이러스제는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 개시된 화합물은 항바이러스제 전에 투여될 수 있거나, 항바이러스제는 본 명세서에 개시된 화합물 전에 투여될 수 있다. 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 항바이러스제 후 약 24시간에 또는 적어도 24시간에 사용되거나 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 항바이러스제 후 약 48시간에 또는 적어도 48시간에 사용되거나 투여된다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 항바이러스제 후 약 72시간에 또는 적어도 72시간에 사용되거나 투여된다.
본 명세서에 기재된 물질의 "유효량"의 투여는 원하는 결과를 달성하는 데 필요한 시간의 기간 동안 투약량에서 효과적인 양으로서 정의된다. 본 명세서에 개시된 화합물의 유효량은 동물의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 항바이러스제의 유효량은 동물의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자에 따라 또한 변할 수 있다.
투약량 섭생은 최적 치료학적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 분할 용량은 매일 투여될 수 있거나, 용량은 치료학적 상황의 응급성에 의해 표시된 바대로 비례하여 감소할 수 있다. 투여 방식(예를 들어, 생체내 주사에 의해 또는 국소 적용 또는 생체외 배양 중의)은 투약량 섭생에 또한 영향을 미칠 것이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 용도는 단독의 또는 본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 일부로서의 본 명세서에 개시된 화합물의 투여 또는 용도를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 방법 및 용도에서 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 항바이러스제 및/또는 제2 혈관신생제를 추가로 포함한다. 선택적으로, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
이러한 약제학적 조성물은 병변내, 정맥내, 국소, 직장, 비경구, 국소, 흡입제, 비강내 또는 피하, 피내, 근육내, 척추강내, 복막경유, 경구 및 뇌내 사용을 위한 것일 수 있다. 조성물은 액체, 고체 또는 반고체 형태, 예를 들어 환제, 정제, 크림, 젤라틴 캡슐, 캡슐, 좌제, 연질 젤라틴 캡슐, 겔, 막, 투벨렛(tubelet), 용액제 또는 현탁제일 수 있다. 조성물은 또한 관류액의 형태일 수 있다.
약제학적 조성물은 환자에게 투여될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 조성물의 제조를 위해 특히 공지된 방법에 의해 제조될 수 있고, 그래서 활성 물질의 유효 분량은 약제학적으로 허용 가능한 비히클과 혼합물로 조합된다. 적합한 비히클은 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 2003 - 20th Edition)] 및 1999년에 공개된 미국 약전: 국민의약품집(USP 24 NF19)에 기재되어 있다.
이에 기초하여, 본 명세서에 기재된 방법 및/또는 용도에서 사용하기 위한 약제학적 조성물은, 배타적은 아니지만, 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 비히클 또는 희석제와 회합되고, 적합한 pH 및 생리학적 유체와 등삼투압인 완충 용액에 함유된 활성 화합물 또는 물질을 포함한다. 약제학적 조성물은 다른 물질, 예컨대 코르티코스테로이드 및 면역 조정제를 추가적으로 함유할 수 있다.
본 명세서에 개시된 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제 및/또는 제2 혈관신생제를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 선택적으로, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
본 명세서에 개시된 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 제2 혈관신생제를 포함하는 키트가 추가로 제공된다. 일 실시형태에서, 키트는 용기를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 혈관신생의 자극을 필요로 하는 동물 또는 세포에서 혈관신생을 자극하기 위한 그리고/또는 본 명세서에 개시된 방법 및 용도를 수행하기 위한 키트의 사용을 위한 설명서를 함유한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 (a) 본 명세서에 개시된 화합물 및 (b) 항바이러스제를 포함하는 키트가 추가로 제공된다. 일 실시형태에서, 키트는 용기를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 인플루엔자의 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 인플루엔자를 치료하기 위한 및/또는 인플루엔자를 갖는 동물에서 생존율을 증가시키고/시키거나 사망률을 감소시키기 위한 키트의 사용을 위한 설명서를 함유한다. 다른 실시형태에서, 키트는 치료를 필요로 하는 동물 또는 세포에서 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염을 치료하기 위한 키트의 사용을 위한 설명서를 함유한다. 추가의 실시형태에서, 키트는 인플루엔자를 갖는 동물에서 폐 내피 누수를 감소시키기 위한 키트의 사용을 위한 설명서를 함유한다.
키트의 본 명세서에 개시된 화합물 및 항바이러스제 또는 제2 혈관신생제는 선택적으로 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 것이다. 본 명세서에 개시된 화합물은 항바이러스제/제2 혈관신생제 전에 사용하기 위한 것일 수 있거나, 항바이러스제/제2 혈관신생제는 본 명세서에 개시된 화합물 전에 사용하기 위한 것일 수 있다.
바이오재료
본 명세서에 개시된 화합물은 바이오재료로 또한 도입될 수 있고, 이는 이후 대상체에서의 부위에 이식될 수 있고, 이로써 그 부위에서의 화합물의 효과를 제공한다. 매트릭스 또는 스캐폴드를 제공하는 바이오재료는 사용하기에 적합하다. 화합물은 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 물질, 예컨대 VEGF, PDGF, G-CSF, 재조합 인간 에리쓰로포이에틴, bFGF 및 태반 성장 인자(PLGF)와 조합되어 도입될 수 있다. 적합한 바이오재료의 비제한적인 예는 마트리겔, 피부 대체물 및 가교결합된 글라이코사미노글라이칸 하이드로겔(예를 들어, 문헌[Riley, C.M. et al. (2006) J. Biomaterials 27:5935-5943]에서 기재된 바와 같음)을 포함한다. 따라서, 또 다른 양태는, 단독의 또는 하나 이상의 추가적인 물질과 조합된, 본 명세서에 개시된 화합물로 도입된 바이오재료 조성물에 관한 것이다. 바이오재료를 포함하는 포장된 재료가 또한 포함된다. 포장된 재료는 바이오재료의 사용을 위해 표지될 수 있다.
상기 개시내용은 일반적으로 본 출원을 기재한다. 더 완전한 이해는 하기 구체적인 실시예를 참조하여 얻어질 수 있다. 이 실시예는 오로지 예시의 목적을 위해 기재되고, 본 출원의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 형태의 변화 및 균등물의 치환은 상황이 제시하거나 편리하게 만드는 것처럼 고려된다. 구체적인 용어가 본 명세서에 사용되지만, 이러한 용어는 제한의 목적을 위해서가 아니라 설명 의미로 의도된다.
하기 비제한적인 실시예는 본 개시내용을 예시한다:
실시예
결과
트립토판 형광 분광법을 이용한 균일한, 종 특이적 재조합 수용체 집단에 결합하는 모 바스큘로타이드 및 MPA -Br의 검출.
아미노산 트립토판, 타이로신 및 페닐알라닌은 280㎚의 파장에서 여기될 때 고유 형광 특성을 나타내고, 구체적으로 트립토판에 대해서는 295㎚에서 여기될 때 그러했다. 이 방출 스펙트럼은 단백질의 구조 입체형태 및 이의 용매에 고도로 의존적이다. 구조 입체형태와 관련하여, 수용체에 대한 리간드의 결합으로 인해 생긴 스펙트럼의 변화는 용량 의존적 결합을 규명하기 위한 고유 마커로서 사용된다. 이를 위해, 종 특이적 Tie2Fc 단백질의 고유 형광 특성 및 방출 스펙트럼의 변화는 모 바스큘로타이드 또는 MPA-Br의 존재 하일 때 결합 동역학을 규명하도록 이용되었다.
고유 형광 강도의 용량 의존적 증가는 재조합 인간 Tie2Fc 수용체 및 모 바스큘로타이드 또는 MPA-Br인 리간드의 항온처리에 의해 관찰되었다(도 2a, 도 2c). 경우 둘 다에서, 형광 강도는 포화 가능한 것으로 발견되었다. 특이적 신호는 수용체 및 리간드 복합체로부터 리간드 단독에 의해 생성된 형광 강도의 공제에 의해 유도되었다. 인간 Tie2Fc에 대한 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br의 정규화된 특이적 결합에 생성된 Kd는 비선형 회귀 일 부위 특이적 결합을 이용하여 102.9nM 및 2.623nM이다(도 2b, 도 2d). 동일한 연구는 재조합 마우스 Tie2Fc에 대해 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br 그리고 재조합 래트 및 사이노몰거스 원숭이 Tie2Fc에 의해 MPA-Br 단독에 대해 수행되었다(원 데이터 비기재). 결정된 해리 상수(Kd)는 도 2g에 기재되어 있다.
재조합 Tie2 수용체가 인간 IgG Fc와의 융합 단백질이라는 것을 고려하여, 모 바스큘로타이드 또는 MPA-Br에 결합하는 재조합 인간 IgG Fc의 능력은 결정되었다. 유의미하게, 형광 강도의 용량 의존적 증가가 리간드 중 어느 하나에 대해 관찰되지 않았다(도 2e, 도 2f).
모 바스큘로타이드 및 MPA -Br은 HUVEC에서 Tie2 및 MAPK 인산화를 유도한다.
모 바스큘로타이드 및 MPA-Br의 Tie2 활성화 가능성은 인간 탯줄 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)에서 평가되었다. 다양한 용량의 리간드 둘 다에 의해 치료된 HUVEC는 Tie2의 활성화의 증가 및 MAPK인 하류 신호전달 분자를 나타냈다(도 3a, 도 3b). 일반적으로, MPA-Br은 모 바스큘로타이드보다 더 낮은 농도에서 시작하여 증가된 반응 규모 및 더 넓은 용량 범위를 나타내어서; 모 바스큘로타이드에 대해 1000ng/㎖에서 오직 단일 유의미한 반응과 비교하여 10 내지 100ng의 용량에서 Tie2를 유의미하게 활성화한다. 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br 치료는 둘 다 Tie2 수용체에 대해 특징적인 벨 형상의 용량 반응을 나타냈다. 용량 반응의 이 유형은 Tie2 리간드에 대해 이전에 주목되고, 이 수용체 타이로신 키나제를 활성화하는 것과 연관된 흔한 특징인 것으로 보인다(Brkovic A, et al 2007, Sturn DH, et al 2005, Murdoch C, et al 2007, Gruber BL, et al 1995 및 Maliba R, et al 2008). 모 바스큘로타이드 또는 MPA-Br 중 어느 하나에 의한 HUVEC의 자극은 MAPK의 하류 활성화를 발생시켰다. 인간 재조합 Ang1은 Tie2 및 MAPK 활성화 연구에 대한 양성 대조군으로서 사용되었다.
모 바스큘로타이드 및 MPA-Br은 HMVEC tert 에서 Tie2 인산화를 유도한다.
HUVEC에 대해 기재된 것과 유사한 Tie2 활성화 연구는 텔로머라제(HMVEC tert )에 의해 부동화된 인간 미세혈관 내피 세포(진피 기원)에서 완료되었다. 상이한 혈관성 층으로부터의 내피 세포, 또는 혈관의 상대 역량이 다르게 거동하고, 그래서 HMVEC tert 를 사용하는 연구가 상이한 기원의 인간 내피 세포에서의 비교를 수월하게 한다는 것이 널리 인정된다. 표시된 농도의 모 바스큘로타이드 또는 MPA-Br에 의한 HMVEC tert 의 자극은 Tie2 수용체의 용량 의존적 활성화를 발생시켰다(도 3a). 다시, 용량 반응은 벨 형상이고, MPA-Br은 0.2ng/㎖ 내지 10ng/㎖의 범위의 농도에서 통계학적으로 유의미한 작용제 활성을 나타낸다. 모 바스큘로타이드 자극 이후에 활성화는 5배 더 높은 농도에서 명확해지고, 1ng/㎖ 내지 100ng/㎖의 범위였다. Tie2 활성화의 상대 규모는 모 바스큘로타이드(약 2.6배) 또는 인간 재조합 Ang1(800ng/㎖)과 비교할 때 MPA-Br(약 3.3배)에 대해 더 높았다. HUVEC 및 HMVEC tert 둘 다에서의 모 바스큘로타이드와 비교될 때 MPA-Br의 증가된 작용제 효력은 인간 Tie2 수용체에 대해 나타난 개선된 결합 특성의 기능일 것이다(도 2g 참조).
모 바스큘로타이드 및 MPA-Br은 MLMVEC에서 Tie2 인산화를 유도한다.
본 명세서에 기재된 몇몇 전임상 효율 연구는 시험 종으로서 마우스를 사용한다. 그러므로, 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br의 Tie2 작용제 효력을 구체적으로 평가하기 위해 시험관내 1차 마우스 폐 미세혈관 내피 세포(MLMVEC)를 사용하는 세포 배양 시스템을 사용하였다. 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br은 농도 특이적인 벨 형상의 용량 반응을 나타냈다. Tie2의 MPA-Br 매개된 활성화는 10ng/㎖ 내지 5000ng/㎖의 범위의 농도에서 명확한 한편, 모 바스큘로타이드는 100ng/㎖ 내지 5000ng/㎖의 범위인 농도에서 Tie2의 활성화를 촉진하였다. Tie2 수용체에 대한 유도의 상대 규모는 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br에 대해 상이하지 않지만, Tie2의 통계학적으로 유의미한 활성화는 모 바스큘로타이드에 대한 경우보다 MPA-Br에 대해 10배 더 낮은 농도에서 생겼다.
모 바스큘로타이드 및 MPA -Br은 1차 래트 , 개과 및 사이노몰거스 원숭이 내피 세포에서 Tie2 인산화를 유도한다
래트 사구체 내피 세포, 개과 대동맥 내피 세포 및 사이노몰거스 사구체 내피 세포의 1차 세포 배양물을 다양한 농도의 MPA-Br에 의해 자극하였다. 모든 경우에, 이 세포 배양 검정은 Tie2 활성화에서 MPA-Br 의존적 증가를 나타냈다. 용량 반응은 인간 및 마우스 내피 세포 연구에 주목된 특징적인 벨 형상을 닮고, Tie2 수용체 인산화의 통계학적으로 유의미한 증가는 0.2ng/㎖ 내지 50ng/㎖에 집중되었다. 모든 경우에, 인간 재조합 Ang1은 (치료 무(NT)와 비교하여) 기준치 Tie2 인산화의 유의미한 증가를 제공하였다.
모 바스큘로타이드 및 MPA -Br은 X31( H3N2 ) 인플루엔자에 대한 노출 이후에 이환율 및 사망률을 개선한다
인플루엔자에 의해 감염된 C57Bl/6J 마우스(H3N2, 64HAU/마우스)는 체중 감소(도 6b, 도 6c)를 발생시키고, 감염 후 5일 내지 7일에 치사 효과에 걸리기 시작하였다. 100ng/마우스/일에서 투여된 모 바스큘로타이드의 효율은 이전에 조사되었고(Sugiyama MG et al, 2015), X31 인플루엔자에 의한 C57Bl/6J 마우스의 감염 이후에 생존율을 증대시키는 데 비효과적인 것으로 발견되었다. 모 바스큘로타이드(500ng, 복강내 매일 - 최적인 것으로 이전에 정의됨) 또는 MPA-Br(31.25ng 또는 200ng, 복강내 매일)의 투여는 감염된 마우스의 전체 생존율을 유의미하게 개선하였다(p<0.001)(도 6a). 또한, 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br은 폐 산소공급(SpO2), 열 조절 및 활동 점수를 유의미하게 개선하였다(도 6d 내지 도 6i). MPA-Br이 모 바스큘로타이드보다 우수성을 나타내는 여러 측정치가 존재하였다. 이 실시예는 구체적으로 소모로부터의 보호(6일, MPA-Br 200ng/일, 도 6c) 및 동맥 산소공급(6일, MPA-Br 200ng/일, 도 6e)을 포함한다. 31.25ng/마우스/일에서 전달된 MPA-Br은 16배의 용량 감소를 나타낸다. 모든 연구 종점에서, MPA-Br은 모 바스큘로타이드와 동일하거나 이보다 양호하게 수행된 31.25ng/마우스/일에서 전달되었다. 이것은 또한 MPA-Br 200ng/마우스/일에 대한 경우여서; 모 바스큘로타이드와 비교하여 2.5배의 용량 감소를 나타낸다.
수컷 스프라그 다울리 래트에서의 모 바스큘로타이드 및 MPA -Br의 약동학적 분석
표시된 양(㎍/㎏)의 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br을 수컷 스프라그 다울리 랫트에게 볼루스 주사를 통해 정맥내 투여하였다. 연속 제때의 채혈을 수행하고, 혈장 제제를 모 바스큘로타이드 또는 MPA-Br을 정량화하도록 구체적으로 설계된 독점적 효소 결합된 면역흡착 검정에 적용하였다. 시간에 걸친 시험 물질의 정량화는 분포 용적, 청소율 및 말단 반감기를 포함하는 약동학적(PK) 측정치의 계산을 수월하게 하였다(도 7a, 도 7b). 120㎍/㎏ 용량은 이 연구에서 검출의 가장 큰 민감도를 제공하고, 그러므로, 제시된 PK 측정치는 이 특정한 용량 수준에 속한다. 모 바스큘로타이드(도 7b) 및 MPA-Br(도 7a)은 유사한 분포 용적 및 청소율을 나타냈지만, MPA-Br은 모 바스큘로타이드보다 현저히 더 길게 순환하였다(t1/ 2 68분 대 34분). MPA-Br PK는 연속 3일 동안 24시간마다 1회 120㎍/㎏에서 다중 용량(MD) 정맥내 환경에서 평가되었다. 이 특정한 투약 접근법은 단일 120㎍/㎏ IV 용량과 다르지 않아서, 매일 투여될 때 약물 축적이 없다는 것을 제안한다.
모 바스큘로타이드 및 MPA -Br은 피부 히스타민 노출 이후에 혈관 누수를 약화시킨다
이전의 연구는 히스타민에 대한 노출 이후에 혈관 누수의 유도에 반대로 Tie2에 대한 의무적인 역할을 강조하였다. 구체적으로, Tie2의 천연 길항제인 안지오포이에틴 2에서 유전적으로 결핍된 마우스는 전부 히스타민 시험감염 시 혈관 누수 반응을 시작하지 못했다(Benest AV et al, Plos One, 2013). 그러므로, 모 바스큘로타이드 및 MPA-Br과 같은 Tie2의 특이적 작용제의 투여는 히스타민 유도된 혈관 누수를 저해하는 것으로 가정되었다. 피부 히스타민 시험감염 전 1시간에 모 바스큘로타이드 또는 MPA-Br의 예방적 용량이 주어진 수컷 FVB 마우스는 에반스 블루 염료 트레이서의 혈관외유출에 의해 평가된 바대로 비히클 치료된 마우스보다 유의미하게 덜한 혈관 누수를 나타냈다(도 8a). 유의미하게, 500ng/마우스의 최적 용량에서 전달된 모 바스큘로타이드 치료는 동일한 용량, 또는 4배 미만(125ng/마우스)에서 MPA-Br보다 히스타민 유도된 혈관 누수를 감소시키는 데 덜 잘 수행하였다.
방법 및 재료:
바스큘로타이드 유사체 Mpa -Br을 제공하는 3-머캅토프로피온산( Mpa ) 링커를 통한 사합체 Tie 2 결합 펩타이드(T7)의 제조.
개관: Mpa-Br에 대해 수행된 제조 공정은 몇몇 단계를 필요로 했다. 제1 단계에서, T7 펩타이드 및 3-머캅토프로피온산(Mpa) 제한된 펩타이드를 FMOC 고상 펩타이드 합성 기법을 이용하여 제조하였다. 이는 N-말단에서 3-머캅토프로피오닐 링커를 갖는 T7 펩타이드(서열 번호 7)를 포함하는 Mpa-His-His-His-Arg-His-Ser-Phe-OH를 제공하였다. 이것에 Mpa-T7펩타이드를 TFA 염으로서 단리하기 위해 절단 및 탈보호, RP-HPLC 정제 및 최종 생성물의 동결건조를 통한 냉동 건조가 후행하였다. 제2 단계에서, Mpa-펩타이드와 (브로모아세트이미드)4-PEG10K의 접합은 수행되고, PEG 접합체의 정제의 2개의 수준이 이어졌다. 제1 정제 단계는 Mpa-Br 접합체 TFA 염을 제공하는 RP-HPLC 크로마토그래피를 포함한다. 이 생성물은 동결건조를 통해 이 단계에서 단리되거나, TFA 반대 이온은 TFA 염 중간체를 단리시키지 않으면서 이온 교환 크로마토그래피를 통해 아세테이트 염으로 직접적으로 교환되었다. 이 초기 생성물은 유동하는 유리 고체로서 Mpa-Br 아세테이트를 단리시키도록 냉동 건조되었다.
Mpa T7- 펩타이드 제조
단계 1: 온 수지 어셈블리
T7 펩타이드 서열을 CS Bio 펩타이드 합성장치를 사용하여 40g 수지 유입에 의해 Wang 폴리스타이렌 수지(초기 작용기화 1.2m㏖/g)에서 어셈블링하였다. Wang 수지를 4시간 동안 DMF 중의 8당량의 아미노산 및 4당량의 DIC를 사용하여 Fmoc-Phe-OH에 의해 로딩하였다. Fmoc 로딩 시험은 0.8m㏖/g 로딩이 45.4mmol 규모 합성에 상응하여 달성된다는 것을 나타낸다. 모든 아미노산을 DIC/Oxyma 화학물질(3당량, 136.2m㏖)을 사용하여 단일 커플링하고, 0.5M Ac2-O/DMF를 캡핑에 사용하고, 20% 피페리딘/DMF를 Fmoc 탈보호에 사용하였다. 실험 절단을 T7 펩타이드 서열의 완료 시 수행하고, RP-HPLC 분석은 서열이 77.5%의 미정제물 순도에 의해 성공적으로 어셈블링된다는 것을 나타낸다.
수지 결합된 T7 펩타이드에 대한 Mpa(Sigma-Aldrich(미국))의 커플링을 4시간 동안 DMF 중의 3당량의 DIC/Oxyma의 존재 하에 3당량의 Trt-Mpa-OH를 사용하여 수행하였다. 수지(DMF, MeOH 및 MTBE)에 의해 세척하고 진공 건조기에서 밤새 건조시킨 후, 89.1%의 합성 수율에 상응하는 124.5g의 최종 수지(84.5g 중량 이득)를 얻었다. 실험 절단 분석은 Mpa-T7 펩타이드가 78.5%의 미정제물 순도로 형성된다는 것을 나타낸다. ESI-MS 분석은 Mpa 펩타이드가 형성된다는 것을 확인시켜주었다(관찰된 MS = 1044.4).
단계 2: 절단 및 탈보호
수지 결합된 Mpa-T7 펩타이드를 3시간 동안 TFA/TIS/물/EDT(92.5:2.5:2.5:2.5)를 포함하는 절단 용액에 의해 처리하였다. 펩타이드를 항-용매(iPr2O)에 의해 침전시키고, 펩타이드를 여과에 의해 단리하여 미정제 생성물을 제공하였다. 수지 결합된 Mpa-T7 펩타이드를 절단하여 전체 38% 회수 및 91.8% 수율에 상응하는 31.5g의 미정제 펩타이드를 얻었다. 미정제 생성물의 RP-HPLC 분석은 미정제물 순도가 70.5%라는 것을 나타낸다.
단계 3: 정제
미정제 Mpa-T7 펩타이드(24g)를 완충제 A(15mM TEAP) 중에 희석하고, 5% 내지 10% 완충제 B(20% MeCN/물)의 구배 및 88㎖/분의 유속으로 Luna C18(3) PREP 250 x 50㎜ Phenomenex 칼럼에서 RP-HPLC를 사용하여 정제하였다. TEAP 정제로부터의 생성물 풀을 합하고, 0.5% TFA/물에 의해 5 중 1부로 희석하였다. 펩타이드 용액의 반을 정제 칼럼으로 다시 로딩하고, 생성물을 초기에 0.5% TFA를 함유하는 물/MeCN(10%)에 의해 온-칼럼 세척한 후, 완충제 B를 MeCN 중의 0.1% TFA에 의해 대체하고, 생성물을 20% 내지 60% B의 구배를 인가하여 용리시켰다. 이 단계를 남은 펩타이드 용액에 의해 반복하고, 생성물 풀을 합하고 동결건조시켜, 수지 로딩 단계로부터 전체 43.7% 수율에 상응하는, TFA 염으로부터의 11.4g Mpa-T7 펩타이드를 얻었다. 최종 분석은, 6.7g의 순 펩타이드(25.8% 수율)에 상응하는, 61%의 펩타이드 함량 및 96.2%의 RP-HPLC 순도를 나타낸다.
Mpa-Br 접합체 제조
단계 1: 접합
접합 반응을 0.13M NaCl(120㎖)을 함유하는 100mM 나트륨 포스페이트(이염기성) 완충제(pH 8) 중에 Mpa-T7 펩타이드 TFA 염(2m㏖) 및 (브로모아세트이미드)4-PEG10K(JenKem, USA)(0.48m㏖)를 용해시킴으로써 수행하였다. 반응 용액의 pH는 pH 6.5인 것으로 확인되었고, 반응 혼합물을 30℃에서 22시간 동안 교반하였다. 반응 진행은 RP-HPLC에 의해 모니터링되고, 완전히 접합된 생성물로의 4 아암 치환된 사합체 브로모아세트이미드의 대략 58% 전환으로 진행되었다. 반응 완료 시, 미정제 혼합물은 각각 약 30%의 3 아암 및 약 7%의 2 아암 중간체의 순서로 함유되었다. 소량의 단일 아암 생성물을 얻었다.
단계 2: Mpa-Br TFA 염의 정제
반응 혼합물을 완충제 A(물 + 0.1% TFA)에 의해 1:1 희석하고, 정제를 수행하여, 10% 내지 75% 완충제 B(MeCN:물(60:40) + 0.1% TFA)의 구배 및 42㎖/분의 유속에 의해 Luna C18(3) PREP 250 x 30㎜ 칼럼을 사용하여 10㎖의 분획을 수집하였다. 이 단계에서 동결건조에 의해 단리된 생성물은 RP-HPLC에 의해 약 45%의 수율 및 99% 초과의 순도로 Mpa-Br TFA 염을 제공하였다.
단계 3: Mpa-Br 반대 이온 교환
TFA 반대 이온과의 Mpa-Br 접합체는 왁스질/점착성의 점조도를 갖는 무정형 재료를 생성시킨다. 물리적 특징을 알아내기 위해, 염 교환은 단계 2에 기재된 바와 같이 얻은 RP-HPLC 정제된 Mpa-Br TFA 염 분획으로부터 직접적으로 수행하였다. 동결건조 전에, 분획을 합하고(약 500㎖), 물에 의해 1:1 희석하고, 용액을 RP-HPLC 칼럼에 로딩하고, 42㎖/분의 유속으로 Luna C18(3) PREP 250 x 30㎜ 칼럼을 사용하여 아세테이트 교환 공정을 통해 취하여, 몇몇 단계 이후에 10㎖의 분획을 수집하였다; 초기 칼럼 평형(1% AcOH를 함유하는 0.5M NH4OAc), 샘플 로딩, 이어서 교환 공정(1% AcOH를 함유하는 0.5M NH4OAc), 아세트산암모늄 제거 단계(1% AcOH(완충제 A) 및 MeCN(완충제 B), 10%B) 및 용리 공정(1% AcOH(완충제 A) 및 MeCN(완충제 B), 10% 내지 50% B). 생성물을 혼주하고 동결건조시켜 유동하는 유리 결정질 고체로서 Mpa-Br 아세테이트 염을 제공하였다. 분석은 42.1%의 전체 수율에서 완전히 치환된 펩타이드 접합체 Mpa-Br에 상응하는 RP-HPLC에 의해 100% 순도를 표시한다. 이온 크로마토그래피를 통한 잔류 브롬(Br)에 대한 접합체의 분석은 0.1% 미만의 Br을 확인시켜주어서, 4 아암 브로모아세트이미드-PEG 사합체의 완전 치환을 나타낸다. Mpa-Br 아세테이트 염의 추가적인 분석은 SCX 크로마토그래피에 의해 또한 수행되고, 여기서 Mpa-Br 아세테이트 염의 순도는 90.0%인 것으로 발견되었다.
트립토판 형광 분광법:
리간드 및 수용체 상호작용. 각각의 리간드(모 바스큘로타이드 및 MPA-Br)의 2x 농도를 25㎕ 중에 제조하고, 25㎕의 2x 농도의 Tie2Fc 수용체와 혼합하여 50㎕의 최종 용적에서 1x 농도의 리간드 및 수용체를 생성하였다. 리간드의 농도는 수용체의 결합 포화에 도달하기에 충분히 높아야 한다. 샘플을, 10㎚의 설정된 판독 간격으로, 295㎚으로의 여기 파장, 360㎚에서의 출발 방출 파장 스캔, 450㎚에서의 종료 방출 파장 스캔이 설정된 SpectraMaxM2 플레이트 판독기에 의해 상온에서 판독하고, 판독 전에 5초 동안 자동 혼합하였다. 데이터를 SoftMax를 사용하여 파일화하고, Prism을 사용하여 분석하였다.
수용체 및 리간드. 재조합 수용체를 R&D Systems(재조합 인간 Tie-2Fc(R&D Systems)로부터, 재조합 마우스 Tie-2Fc를 R&D Systems로부터, 재조합 래트 Tie2-FC를 R&D Systems로부터, 그리고 재조합 사이노몰거스 원숭이 Tie2-FC를 SinoBiological로부터 구입하였다. 리간드를 Bachem(모 바스큘로타이드 및 MPA-Br)에 의해 제조하였다. 음성 IgG-FC 대조군은 R&D Systems로부터 기원하였다. 수용체 및 리간드 둘 라를 DPBS(GE Life Sciences-HyClone) 중에 재현탁시켰다.
Tie2 인산화 - HUVEC :
인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)를 제조사의 추천에 따라 20% O2, 5% CO2 및 37℃ 습윤 챔버에서 'EGM 단일 쿼트'(Lonza)가 보충된 완전한 내피 기본 배지(EBM)(Lonza)에서 100㎜ 조직 배양 플레이트에서 시딩하였다. 90% 포화상태에 도달한 세포를 완전 EBM 배지에서 기재된 농도의 모 바스큘로타이드, MPA-Br 또는 안지오포이에틴-1(R&D Systems)에 의해 15분 동안 자극하였다. 15분 자극 이후에, 세포를 얼음에 배치하고 아주 차가운 PBS 중에 2회 세척하였다. 세포 용해물을 IC12 용해 완충제(1% NP-40, 20mM Tris(pH 8.0), 137mM NaCl, 10% 글라이세롤, 2mM EDTA, 1mM 활성화된 나트륨 오르토바나데이트) 중에 사용하도록 준비하였다. BCA 단백질 농도 키트를 사용하여 제조사의 지시(Thermo Scientific)에 따라 각각의 용해물의 단백질 농도를 측정하였다. 샘플을 제조사의 프로토콜에 따라 인산화된 Tie2 및 전체 Tie2 수준을 측정하는 ELISA로 처리하였다. 각각의 샘플로부터의 20㎍ 또는 5㎍의 단백질을 각각 인산화된 Tie2 및 전체 Tie2 판독에 대해 2회 반복 로딩하였다. 인산화된 Tie2:전체 Tie2 비율은 각각의 샘플에 대해 결정되었다. 이후, 모든 치료 그룹에 대한 Tie2 인산화의 수준은 각각의 실험에서 치료 무 그룹(NT, 완전 EBM 단독)의 것으로 정규화되었다.
MAPK 인산화 - HUVEC :
HUVEC를 상기한 바대로 배양하였다. 용해물을 (1mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 6M 유레아, 5mM NaF, 100μM PMSF, 25mM 나트륨 피로포스페이트, 1mM 나트륨 오르토바나데이트, pH 7.2 내지 7.4, 1x cOmplete(상표명) 미니 EDTA-유리 프로테아제 저해제) 중에 준비하였다. BCA 단백질 농도 키트를 사용하여 제조사의 지시(Thermo Scientific)에 따라 각각의 용해물의 단백질 농도를 측정하였다. 샘플을 제조사의 프로토콜(R&D Systems)에 따라 인산화된 MAPK 및 전체 MAPK 수준을 측정하는 ELISA로 처리하였다. 각각의 샘플로부터의 20㎍ 또는 10㎍의 단백질을 각각 인산화된 MAPK 및 전체 MAPK 판독에 대해 2회 반복 로딩하였다. 인산화된 MAPK:전체 MAPK 비율은 각각의 샘플에 대해 결정되었다. 이후, 모든 치료 그룹에 대한 MAPK 인산화의 수준은 각각의 실험에서 치료 무 그룹(NT, EBM 단독)의 것으로 정규화되었다.
Tie2 인산화 - HMVEC tert :
인간 텔로머라제 역전사효소/촉매 아단위(tert)에 의해 부동화된 인간 미세혈관 내피 세포(진피 기원)(Shao and Guo (2004))를 완전 내피 기본 배지-2(EBM-2)(Lonza)에서 100㎜ 조직 배양 플레이트에 시딩하고, 20% O2, 5% CO2 및 37℃ 습윤 챔버에서 배양하였다. 성장 배지는 10% 태아 소 혈청, 1X pen/strep, 1㎍/㎖의 하이드로코티손 및 100ng/㎖의 EGF가 보충된 EBM-2로 이루어졌다. 90% 포화상태에 도달한 세포를 완전 EBM-2 배지 중에 기재된 농도의 모 바스큘로타이드, MPA-Br 또는 안지오포이에틴-1에 의해 15분 동안 자극하였다. 15분 자극 이후에, 세포를 얼음에 배치하고 아주 차가운 PBS 중에 2회 세척하였다. 세포 용해물을 IC12 용해 완충제(1% NP-40, 20mM Tris(pH 8.0), 137mM NaCl, 10% 글라이세롤, 2mM EDTA, 1mM 활성화된 나트륨 오르토바나데이트) 중에 사용하도록 준비하였다. BCA 단백질 농도 키트를 사용하여 각각의 용해물의 단백질 농도를 측정하였다. 샘플을 pYTie2 및 전체 Tie2 농도를 측정하는 ELISA로 처리하였다. 각각의 샘플로부터의 20㎍의 단백질을 각각의 웰에 로딩하고, 각각의 샘플을 2회 반복 실행하였다. 상대 pTie2 대 전체 Tie2 비율은 각각의 샘플에 대해 결정되었다. 각각의 치료 그룹에서의 Tie-2 인산화의 수준은 각각의 실험에서 EBM-치료 그룹의 것으로 정규화되었다.
Tie2 인산화 - 1차 마우스 폐 미세혈관 내피 세포
1차 마우스 폐 내피 세포(Cell Biologics)를 'EGM 단일 쿼트'(Lonza)가 보충된 완전 내피 기본 배지(EBM)(Lonza)에서 100㎜ 조직 배양 플레이트에서 시딩하였다. 90% 포화상태에 도달한 세포를 완전 EBM 배지에서 기재된 농도의 모 바스큘로타이드, MPA-Br 또는 안지오포이에틴-1(R&D Systems)에 의해 15분 동안 자극하였다. 15분 자극 이후에, 세포를 얼음에 배치하고 아주 차가운 PBS 중에 2회 세척하였다. 세포 용해물을 IC12 용해 완충제(1% NP-40, 20mM Tris(pH 8.0), 137mM NaCl, 10% 글라이세롤, 2mM EDTA, 1mM 활성화된 나트륨 오르토바나데이트) 중에 사용하도록 준비하였다. BCA 단백질 농도 키트를 사용하여 제조사의 지시(Thermo Scientific)에 따라 각각의 용해물의 단백질 농도를 측정하였다. 샘플을 제조사의 프로토콜(마우스 Tie2, R&D Systems)에 따라 인산화된 Tie2 및 전체 Tie2 수준을 측정하는 ELISA로 처리하였다. 각각의 샘플로부터의 50㎍ 또는 5㎍의 단백질을 각각 인산화된 Tie2 및 전체 Tie2 판독에 대해 3회 반복 로딩하였다. 인산화된 Tie2:전체 Tie2 비율은 각각의 샘플에 대해 결정되었다. 이후, 모든 치료 그룹에 대한 Tie2 인산화의 수준은 각각의 실험에서 치료 무 그룹(NT, 완전 EBM 단독)의 것으로 정규화되었다.
Tie2 인산화 - 1차 래트 사구체 내피 세포 :
래트 1차 사구체 내피 세포(Cell Biologics)를 20% O2, 5% CO2 및 37℃ 습윤 챔버에서 키트를 갖는 완전 래트 내피 세포 배지(Cell Biologics)에서 성장시키고, 80% 내지 90% 포화상태에 도달하면 1:3 분할하였다. 래트 신장 사구체 내피 세포에서 MPA-Br에 의한 Tie2의 활성화를 조사하기 위해, 95% 내지 100% 포화상태 세포를 15분 동안 혈청 함유 배지에서 표시된 농도의 시험 물질에 의해 자극하였다. 인간 Ang-1(R&D Systems)은 양성 대조군으로서 사용되었다. 세포 용해물을 인간 포스포-Tie-2 ELISA 키트(R&D Systems)에서 추천된 (상기 기재된) 용해 완충제 IC12를 사용하여 수집하고, 타이로신-인산화된 Tie2 및 전체 Tie2를 래트 Tie2에 대해 검증된 포획 항체의 치환에 의해 ELISA(인간 포스포-Tie2 및 전체-Tie2 ELISA 키트, R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 마우스 항-Tie2 항체(BD Pharmingen(상표명)) 및 토끼 TEK 다중클론 항체(MyBioSource)는 각각 pTie2 및 전체 Tie2 ELISA에서 포획 항체로서 사용되었다. 이후, 모든 치료 그룹에 대한 Tie2 인산화의 수준은 각각의 실험에서 치료 무 그룹(NT, 완전 래트 내피 세포 배지)의 것으로 정규화되었다.
Tie2 인산화 - 1차 개과 대동맥 내피 세포 :
개과 1차 대동맥 내피 세포(Cell Biologics)를 20% O2, 5% CO2 및 37℃ 습윤 챔버에서 키트를 갖는 완전 개과 내피 세포 배지(Cell Biologics)에서 성장시키고, 80% 내지 90% 포화상태에 도달하면 1:3 분할하였다. 1차 사이노몰거스 원숭이 사구체 내피 세포에서 수행된 Tie2 활성화 연구는 래트 1차 사구체 내피 세포 연구에 대해 상기 기재된 접근법에 따라 수행되었다.
Tie2 인산화 - 1차 사이노몰거스 원숭이 사구체 내피 세포:
1차 사이노몰거스 원숭이 사구체 내피 세포(Cell Biologics)를 HMVEC tert 에 대해 상기 제공된 상세내용에 따라 배양하였다. 1차 사이노몰거스 원숭이 사구체 내피 세포에서 수행된 Tie2 활성화 연구는 래트 1차 사구체 내피 세포 연구에 대해 상기 기재된 접근법에 따라 수행되었다.
피부 히스타민 시험감염:
10주령 수컷 FVB 마우스를 Jackson Laboratories로부터 구입하였다. 마우스를 사육장(Vivarium)에서 표준 광:암 사이클에서 수용하고, 음식 및 물에 자유롭게 접근하게 하였다. 0일에, 마우스를 아이소플루란에 의해 마취시키고, 전체 등 부위를 전기 면도기에 의해 면도하였다. 남은 털을 제모 크림을 도포함으로써 제거하였다. 남은 크림을 무균 거즈 및 물에 의해 제거하였다. 4일에, 마우스는 200㎕의 복강내 주사로서 비히클 대조군(무균 PBS), 모 바스큘로타이드, 또는 MPA-Br을 받았다. PBS/모 바스큘로타이드/MPA-Br의 전달 후 1시간에 마우스를 (무균 PBS 중에 함유된) 100㎕의 1% 에반스 블루 염료가 꼬리 정맥을 통해 정맥내 전달되는 때에 아이소플루란 마취제 하에 배치하였다. 에반스 블루 염료 투여 직후에, 그리고 여전히 마취 하에 있으면서, 단일 PBS 주사(등, 피내, 50㎕) 및 3개의 동등하게 이격된 히스타민 주사(등, 피내, 50㎕ 중에 함유된 1.25㎍)를 적용하였다. 피내 주사가 완료되면, 마우스를 마취로부터 제거하고, 25분 동안 감금 우리에 다시 배치하였다.
심장 관류 히스타민에 대한 노출 25분 후, 마우스를 2.5% 아버틴의 적절한 용적(복강내 주사를 통해 100㎕/10g(체중))에 의한 마취 하에 배치하였다. 마취의 심부가 생성되면, 마우스를 앙와위에 놓고 고정시키고, 흉부를 수술로 개방시키고, 심장을 노출시키고, 23 게이지 주사바늘로 끝나는 카테터를 좌심실로 삽입하였다. 카테터가 제자리에 고정되면, 우심방 절단을 수행하고, 25㎖의 차가운 PBS를 100mmHg에서 카테터를 통해 전달하여서, 모든 혈관내 에반스 블루 염료를 플러싱 처리하였다. 마우스를 효과적으로 관류시킨 후, 등 피부를 수술로 제거하였다. 표준화된 피부 펀치를 사용하여 각각의 마우스에 대해 4개의 12㎜ 피부 생검을 수집하였다(1PBS, 3 히스타민). 모든 경우에, PBS를 받은 생검은 그 개별 마우스에 대해 기준치 대조군으로서 작용하였다.
에반스 블루 염료 혈관외유출의 정량화 피부 생검을 표지된 관에 배치하고, 16시간 동안 60℃ 오븐에 배치하여 모든 수분을 제거하였다. 건조해진 피부 생검을 무게를 재고, 1.5㎖의 폼아미드를 함유하는 관에 배치하고, 이후 72시간 동안 60℃ 물 욕에 배치하였다. 72시간 후, 관을 500 RCF에서 원심분리하고, 100㎕의 샘플을 620㎚ 및 405㎚에서의 측정을 위해 평평 바닥 96웰 미량역가 플레이트로 제거하였다. 높은 및 낮은 실험 데이터 점을 포괄하는 에반스 블루 염료 표준 곡선을 그려서, 에반스 블루 염료 혈관외유출의 양(㎍/g(피부))을 계산하였다.
인플루엔자 연구:
실험 설계. 14주령 C57BL/6J 마우스를 구입하였다(Jackson Laboratories). 마우스를 사육장에서 표준 광:암 사이클에서 수용하고, 음식 및 물에 자유롭게 접근하게 하였다. 모든 실험을 위해, 마우스를 5% 아이소플루란에 의해 진정시키고, 80㎕의 최종 용적으로 PBS 중에 희석된 인플루엔자 바이러스(하기 바이러스 부문 참조)에 의해 비강내 감염시켰다. 감염 후, 마우스를 체중 일치된 대조군 및 치료 그룹으로 분리하고; 각각의 실험 치료 아암은 그룹마다 10마리의 마우스를 사용하고, 마우스를 인플루엔자 바이러스의 64 HAU에 의해 감염시키고, 이는 7일에 100% 사망률을 발생시켰다. 하기 그룹이 포함되었다: 인플루엔자 바이러스 단독을 받는 마우스(Flu), 모 바스큘로타이드(복강내 주사에 의해 0.1㎖의 PBS 중의 500ng) 또는 MPA-Br(복강내 주사에 의해 0.1㎖의 PBS 중의 200ng 또는 31.25ng)을 또한 받는 감염된 마우스. 모 바스큘로타이드 또는 MPA-Br에 의한 치료는 감염 후 48시간에 시작하고, 연구의 기간 동안 24시간마다 1회 주어졌다. 대조군 마우스(Flu)는 연구의 기간 동안 감염 후 48시간에 시작하여 0.1㎖의 PBS의 매일의 복강내 주사를 받았다.
바이러스. 인플루엔자 A 바이러스 HKx31(H3N2)을 원래 Dr. Tania Watts로부터 얻고, 문헌[Szretter, K. J., Balish, A. L. & Katz, J. M., 2006]에 따라 증식시켰다. 배양 상청액으로부터의 바이러스 역가를 MDCK(마딘-다비 개과 신장) 세포에서 표준 플라크 형성 검정을 수행함으로써 또는 양 적혈구의 응집반응(혈구응집소 단위, HAU)을 측정함으로써 결정하였다.
맥박 산소측정법 측정. C57BL/6J에 대해 작은 칼라 핀을 사용하여 깨어 있는(마취되지 않은) 마우스에서 마우스 Ox Plus 장치 및 소프트웨어(Starr Life Sciences(펜실베니아주 오크몬트))를 사용하여 동맥 산소 포화를 측정하였다. C57BL/6J 마우스에 대해, 화학 제모 크림을 사용하여 감염 전 몇 일에 목의 아래 주위의 털을 제거하였다. SO2 측정을 위해, 마우스는 최대 SO2 측정의 기록 전에 홈 우리에서 몇 분 동안 칼라 핀에 적응하도록 허용되었다.
활동 스코어링 가이드라인
마우스를 1일 2회 관찰하고, 1일 1회 체중을 재고, 1 내지 5의 활동 점수를 배정하였다. 5의 점수를 받기 위해, 마우스는 일반 활동 및 호기심 많은 행동을 나타내야 한다. 이들은 우리의 측 주위를 이동하고 반듯이 선다. 4의 점수에 대해, 마우스는 꽤 활동적이지 않다. 마우스는 자주 서있지 않고, 우리의 코너에 머무를 것을 선호한다. 3의 점수에 대해, 마우스는 덜 활동적이고, 이동할 때, 마우스는 대개 멈추고 앉는다. 마우스는 둥지 코너에 머문다. 2의 점수에 대해, 마우스는 움직일 때만 그리고 오직 짧은 거리에 움직인다. 마우스는 바람직하게는 둥지 코너에서 숨는다. 마지막으로, 1의 점수에 대해, 마우스는 빈사상태이다. 5 내지 3의 활동 점수는 허용 가능하다고 생각된다. 2의 활동 점수를 갖는 마우스는 면밀히 모니터링되고, 활동이 2의 점수 아래로 감소하는 경우, 마우스를 희생하였다. 추가적으로, 30% 초과의 체중 감소를 경험한 마우스는, 달리 허용 가능한 활동 점수와 무관하게, 안락사시켰다.
마이클 부가에 대한 포괄적인 반응 방법
활성화된 PEG 사합체(예컨대, 비닐 설폰 또는 아크릴레이트)(117 내지 118㎎, 1당량) 및 Mpa-펩타이드(100㎎, 1.5당량)를 광으로부터 보호된 50㎖ 환저 플라스크에 첨가하고, PBS(pH 6.5*, 20㎖)를 5㎎/㎖의 최종 펩타이드 농도에 대해 첨가하였다. 반응물을 RT에서 교반하고, pH를 pH 미터에 의해 검증하고, 반응의 진행을 다양한 시간 간격에서 HPLC에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 하기 단계를 이용하여 정제 전에 pH 3.5로 산성화하였다:
단계 1 플래시 LC:
칼럼: 역상 C18, Fuji, 200Å, 40g 칼럼 30㎛(주문 포장).
구배 프로필: 63분에 10% 내지 100% B
용리제: 용리제 A = 물 중의 0.1% TFA
용리제 B = 60% 아세토나이트릴, 40% 물 중의 0.1% TFA
검출: UV(λ = 210㎚/254㎚)
칼럼 온도: RT
유속: 40㎖/분
단계 2 분취용 HPLC:
칼럼: 역상 C18, Daiso Bio C18, 200Å, 10㎛ 25㎜ x 250㎜(주문 포장).
구배 프로필: 77분에 45% 내지 100% B
용리제: 용리제 A = 물 중의 3% 아세토나이트릴 중의 0.1% HFBA
용리제 B = 60% 아세토나이트릴, 40% 물 중의 0.1% HFBA
검출: UV(λ = 210㎚)
칼럼 온도: RT
유속: 30㎖/분
단계 3 분취용 HPLC:
칼럼: 역상 C18, Daiso Bio C18, 200Å, 10㎛ 25㎜ x 25㎜(주문 포장).
구배 프로필: 84분에 40% 내지 100%
용리제: 용리제 A = 물 중의 0.1% TFA
용리제 B = 60% 아세토나이트릴, 40% 물 중의 0.1% TFA.
비닐 설폰의 수율 - 둘 다 TFA 염으로서, PEG 접합체는 48㎎이고, 아크릴레이트-PEG 접합체는 15.2㎎이었다.
본 개시내용이 예인 것으로 현재 생각되는 것을 참조하여 기재되어 있지만, 본 개시내용이 개시된 예로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 반대로, 본 개시내용은 첨부된 청구항의 사상 및 범위 내에 포함된 다양한 변형 및 균등한 배열을 포괄하도록 의도된다.
모든 공보, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 그 전문이 참고로 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로, 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
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Figure pct00018
Figure pct00019
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Claims (62)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    Figure pct00020

    식 중,
    n은 약 25 내지 약 100의 정수이고,
    X는 각각 독립적으로 또는 동시에 (C1-C20)-알킬렌 또는 (C2-C20)-알켄일렌이고, 이들은 각각 하나 이상의 할로, 아미노, 하이드록시, (C1-C6)-알킬, (C1-C6)-알콕시, (C6-C10)-아릴 또는 (C5-C10)-헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환되고;
    Y는 각각 독립적으로 또는 동시에 (C1-C20)-알킬렌 또는 (C2-C20)-알켄일렌이고, 이들은 각각 하나 이상의 할로, 아미노, 하이드록시, (C1-C6)-알킬, (C1-C6)-알콕시, (C6-C10)-아릴 또는 (C5-C10)-헤테로아릴에 의해 선택적으로 치환되고;
    R은 T7 펩타이드(서열 번호 1), GA3 펩타이드(서열 번호 2), T4 펩타이드(서열 번호 3), T6 펩타이드(서열 번호 4) 또는 T8 펩타이드(서열 번호 5)이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 Tie 2 인산화를 자극하는, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 MAPK, AKT 및 eNOS의 인산화를 자극하는, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 대상체의 상처에 국소로 적용될 때 대상체에서 상처 치유를 자극하는, 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R은 T7 펩타이드(서열 번호 1)인, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, n은 약 40 내지 약 70의 정수인, 화합물.
  7. 제6항에 있어서, n은 약 48 내지 약 65의 정수인, 화합물.
  8. 제7항에 있어서, n은 약 55인, 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X는 독립적으로 또는 동시에 (C1-C6)-알킬렌 또는 (C2-C6)-알켄일렌인, 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 독립적으로 또는 동시에 (C1-C6)-알킬렌 또는 (C2-C6)-알켄일렌인, 화합물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 티오글라이콜산, 2-머캅토프로피온산, 4-머캅토뷰티르산, 6-머캅토헥산산, 8-머캅토옥탄산, 11-머캅토운데칸산, 12-머캅토도데칸산 또는 16-머캅토헥사데칸산으로부터 유래된, 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 화합물:
    Figure pct00021

    식 중,
    n은 약 50 내지 60 또는 약 55의 정수이고;
    R은 His-His-His-Arg-His-Ser-Phe(서열 번호 1)이다.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 국소 투여에 적합한, 약제학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 전신 투여에 적합한, 약제학적 조성물.
  16. 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법으로서,
    (i) T7 펩타이드(서열 번호 1), GA3 펩타이드(서열 번호 2), T4 펩타이드(서열 번호 3), T6 펩타이드(서열 번호 4) 및/또는 T8 펩타이드(서열 번호 5) 또는 이의 레트로-인베르소 펩타이드(retro-inverso peptide)인 펩타이드를 하기 화학식 (II)의 티올 화합물과 반응시켜, 하기 화학식 (III)의 화합물 또는 이의 염을 얻는 단계; 및
    [화학식 II]
    Figure pct00022

    [화학식 III]
    Figure pct00023

    (ii) 상기 화학식 (III)의 화합물을 하기 화학식 (IV)의 PEG-사합체와 반응시켜, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 얻는 단계를 포함하는, 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법:
    [화학식 IV]
    Figure pct00024

    식 중, 변수 n, X 및 Y는 제1항에서와 같고, LG는 적합한 이탈기이고, PG는 H 또는 적합한 보호기이다.
  17. 제16항에 있어서, 상기 적합한 이탈기는 할로, 토실레이트 또는 메실레이트인, 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 할로는 브로모인, 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 적합한 보호기는 트라이틸인, 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법.
  20. Tie 2 수용체를 필요로 하는 대상체에서 Tie 2 수용체를 접촉시키고 활성화하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 상기 Tie 2 수용체의 활성화는 상기 Tie 2 수용체의 타이로신 잔기의 인산화에 의해 입증된, 용도.
  22. 제20항에 있어서, 상기 Tie 2 수용체의 활성화는 MAPK, AKT 또는 eNOS의 인산화에 의해 입증된, 용도.
  23. Tie 2 수용체를 필요로 하는 대상체에서 일정한 부위에서 혈관신생을 자극하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  24. 제23항에 있어서, 상기 화합물은 국소 투여를 위해 제제화된, 용도.
  25. 제23항에 있어서, 상기 화합물은 전신 투여를 위해 제제화된, 용도.
  26. 제23항에 있어서, 상기 화합물에 의해 자극된 혈관신생은
    a) 혈관주위 지지 세포의 동원;
    b) 혈관의 비누수성(그렇지 않으면 누설할 것임);
    c) 잘 한정된 수상돌기분지(arborization); 및
    d) 내피 세포 아폽토시스의 저해
    의 특성 중 적어도 하나를 특징으로 하는, 용도.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 혈관신생제의 사용을 추가로 포함하는, 용도.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제2 혈관신생제는 VEGF인, 용도.
  29. 제27항에 있어서, 제2 혈관신생제는 PDGF, G-CSF, 재조합 인간 에리쓰로포이에틴, bFGF, Ang2 저해제 및 태반 성장 인자(placental growth factor: PLGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관신생은 재생 조직의 혈관화, 허혈성 사지 질환, 뇌 허혈, 혈관성 염증의 병태, 동맥경화증, 무혈관성 괴사, 모발 성장의 자극 및 발기 부전으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 상황에서 자극되는, 용도.
  31. 혈관 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 누수 혈관의 부위에서의 혈관 투과성을 감소시키기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  32. 제31항에 있어서, 혈관 투과성은 뇌졸중, 황반 변성, 황반 부종, 림프 부종, 혈액-망막 장벽의 파괴, 혈액-뇌 장벽의 파괴, 박테리아 유도된 혈관 누수 및 종양 맥관구조의 정상화로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 상황에서 감소된, 용도.
  33. 내피 세포의 보호를 필요로 하는 대상체에서 내피 세포를 보호하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  34. 제33항에 있어서, 내피 세포는 신장 손상, 예컨대 급성 신장 손상, 신장 섬유증, 뇌졸중, 황반 변성, 혈관성 치매 및 당뇨병성 합병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 상황에서 보호된, 용도.
  35. 제33항에 있어서, 상기 내피 세포는 폐 손상의 임상 상황에서 보호된, 용도.
  36. 상처의 치유의 자극을 필요로 하는 대상체에서 상처의 치유를 자극하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  37. 제36항에 있어서, 상기 화합물은 국소 투여를 위해 제제화된, 용도.
  38. 제36항에 있어서, 상기 화합물은 전신 투여를 위해 제제화된, 용도.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상처는 당뇨병성 궤양인, 용도.
  40. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상처는 욕창성 궤양, 압박 궤양, 수술 절제, 외상성 조직 손상, 화상 및 피부 이식으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  41. CFU-G 세포의 증식의 저해를 필요로 하는 대상체에서 CFU-G 세포의 증식을 저해하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  42. 제41항에 있어서, 호산구 및/또는 호염구의 감소를 필요로 하는 대상체에서 호산구 및/또는 호염구를 감소시키기 위한, 용도.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 아토피성 피부염, 천식 또는 알레르기 비염을 치료하기 위한, 용도.
  44. 제43항에 있어서, 아토피성 피부염을 치료하기 위한, 용도.
  45. 제41항에 있어서, 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태를 치료하기 위한, 용도.
  46. 제45항에 있어서, 상기 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 호산구 및/또는 호염구 기원의 백혈병인, 용도.
  47. 제45항에 있어서, 상기 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 염증성 장 질환인, 용도.
  48. 제45항에 있어서, 상기 호산구 및/또는 호염구와 연관된 병태는 기생충 감염인, 용도.
  49. 제41항에 있어서, 에오탁신, IL-17, MIG, IL12/IL23(p40), IL-9, MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-13 및 MCP-1 중 적어도 하나를 포함하는 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인 수준을 감소시키기 위한, 용도.
  50. 제49항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인은 에오탁신을 포함하는, 용도.
  51. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질은 국소로, 전신으로, 비강내로 또는 흡입에 의해 사용되는, 용도.
  52. 제23항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 용도.
  53. 인플루엔자 또는 인플루엔자와 연관된 박테리아 중복감염에 의해 감염된 동물을 치료하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  54. 제53항에 있어서, 동시에 또는 순차적으로 항바이러스의 사용을 추가로 포함하는, 용도.
  55. 제54항에 있어서, 상기 항바이러스제는 아만타딘, 리만타딘, 나자미버, 페라미버, 비라미딘, 리바비린 또는 오셀타미버인, 용도.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 인간이고, 상기 인플루엔자는 인간 인플루엔자인, 용도.
  57. (a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물 및 (b) 항바이러스제를 포함하는, 조성물.
  58. 키트로서, (a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물, (b) 항바이러스제 및 (c) 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포를 치료하기 위한 그리고/또는 인플루엔자에 의해 감염된 동물 또는 세포에서 박테리아 중복감염을 치료하기 위한 상기 키트의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 항바이러스제는 아만타딘, 리만타딘, 나자미버, 페라미버, 비라미딘, 리바비린 또는 오셀타미버인, 조성물 또는 키트.
  60. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물로 도입된 바이오재료.
  61. 제60항에 있어서, 마트리겔(Matrigel), 피부 대체물 및 가교결합된 글라이코사미노글라이칸 하이드로겔로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바이오재료.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 제2 물질이 VEGF, PDGF, G-CSF, 재조합 인간 에리쓰로포이에틴, bFGF, Ang2 저해제 및 태반 성장 인자(PLGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 물질로 도입된, 바이오재료.
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