CN110225922B - 用于促进血管生成的剂及其方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及式(I)的化合物，所述式(I)的化合物是单体结合肽的多聚体形式，所述单体结合肽与PEG部分线性键合以形成多聚体。所述多聚体形式刺激血管生成并促进创伤愈合。本公开还包括包含所述多聚体的药物组合物，包括适用于局部或全身施用的组合物。

Description

用于促进血管生成的剂及其方法和用途
相关申请
该非临时申请要求2017年1月13日提交的美国临时申请号62/446,030的优先权，该临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及与血管肽(vasculotide)相比具有改善的活性的剂，及其方法和用途。具体地，本公开涉及用于刺激血管生成以治疗糖尿病创伤愈合和其他心血管适应症，用于治疗变应性疾病、哮喘和特应性皮炎以及用于治疗流感的方法和用途。
背景技术
已经鉴定出几种用于调节血管稳态的维持的关键的分子参与物。其中最广为人知的一种是Tie2/血管生成素(Ang)信号传导轴。该受体酪氨酸激酶(Tie2)和蛋白质生长因子(Ang)系统在一定程度上是独特的，因为两种主要生长因子Ang1和Ang2分别通过位于血管内皮上的相同受体传播抗炎或促炎应答。与大多数受体酪氨酸激酶不同，Tie2通过Ang1的作用在正常的健康内皮细胞中维持组成型活性状态。已经发现，该受体激活许多调节增殖和内皮细胞存活(MAPK和AKT)、通透性(VE-钙粘蛋白)和细胞-细胞相互作用(ICAM和VCAM)的细胞内途径，所有这些细胞内途径在正常的生理机能期间共同起作用，以维持内皮细胞静息。由Tie2受体磷酸化标记的该途径的激活充当反式显性(transdominant)信号；从而抵抗在暴露于无数炎症因子后诱导血管渗漏，这些炎症因子包括VEGF、血清素、缓激肽、组胺、PAF、凝血酶、LPS、脓毒症血清和炭疽毒素(Parikh SM,Virulence 2013)。已经反复证实，在多次不同的病损之后，Ang2水平的急剧上升导致血管渗漏、发病率和死亡率。研究已证明，决定血管激活的主要潜在状态的是Ang1和Ang2的循环水平之间的平衡。由于这一事实，目的在于调控该途径的方法可能具有治疗应用。
迄今为止，由于Angs的性质复杂，所以已经排除了纯化应用和治疗应用。因此，已经广泛检验了调控该途径的替代方法。迄今为止已经描述了两种主要方法。第一种方法，到目前为止更常见的是，重点关注阻断拮抗配体Ang2。该类别中的治疗剂可以粗略定义为阻断针对Ang2的抗体或肽体。第二类Tie2靶向调节剂借鉴了Ang1的已阐明的结构特征。也就是说，该生物活性Ang1作为不少于四个亚基的多聚体天然存在。假设Ang1亚基与Tie2受体结合，在这种情况下使相邻受体聚簇；从而有效地使受体以促进转磷酸化的构型并置。为了模拟Ang1对Tie2受体的激动作用，已经设计了几种大的重组蛋白，它们与相邻受体结合并使相邻受体聚簇(Zhang等人，2002；Cho等人，2004；Han等人，2016；美国专利号8,957,022)。
血管肽(也称为亲本血管肽)是一种合理设计、完全合成的化合物，用于模拟Ang1的作用。血管肽的中央核心由10kDa的窄分散性4臂聚乙二醇组成。通过激活的马来酰亚胺基团和氨基末端半胱氨酸的反应促进高亲和力Tie2结合肽，特别是(-CHHHRHSF-，SEQ IDNO:6)的共价连接。该结构已经被定义为结合并激活Tie2受体的最佳构型。用亲本血管肽直接激活Tie2已经证实在几个不同的体外研究和体内研究(包括特应性疾病和流感的临床前模型)中提供了显著的抗血管渗漏信号(Bourdeau A等人，BMC Res Notes 2016，以及Sugiyama MG等人，Sci Rep 2015)。
流感引起的急性肺损伤或更严重和相关的诊断—急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)，每年都让公众遭受重大损失，对年轻人和老年人造成不成比例的影响。病原体介导的ALI/ARDS的常见保守特征是诱导血管渗漏。治疗宿主对感染的应答(特别是血管渗漏)的治疗方法不应当充分体现使用特异性地针对不断变异的病原体的治疗剂时所看到的迅速出现耐药性。目前还没有经批准用于治疗肺损伤的有疗效的靶向方法。使用Tie2激动剂(诸如血管肽)来治疗流感诱导的ALI/ARDS可以提供优于使用疫苗和/或抗病毒剂的某些差异化概念点。例如，目前的流感疫苗接种计划需要与株系身份有关的先验知识，而对抗病毒药物的耐药性在近代史中已有大量文件证明。此外，不断出现的病原性株系或武器化生物所代表的威胁可能潜在地使得可用的治疗剂完全无效。因此，迫切需要治疗宿主对病原体的应答的新型方法。
发明内容
对亲本血管肽的化学分析揭示，所得的肽PEG缀合物含有5元环产物和6元环产物的混合物(图1A)。示出的5元琥珀酰亚胺环是由马来酰亚胺被半胱氨酸上的硫醇基团直接烷基化而产生的，还示出的6元噻嗪环是由该初始产物通过半胱氨酸接头上的游离胺基团重排而产生的。这些发现已促使开发出更简单的血管肽类似物(Mpa-Br)，其中肽通过线性硫烷部分与PEG连接，以形成活化的PEG四聚体。在一个实施方案中，通过将具有3-巯基丙酸的T7肽(半胱氨酸的非手性类似物，在N末端没有胺侧链)连接到含有溴乙酰亚胺的活化的PEG四聚体来制备Mpa-Br(图1B)。所得的肽PEG缀合物提供不含易于重排的不稳定环结构的单一产物。
因此，本公开提供一种式(I)的化合物，
或其药学上可接受的盐，
其中
n是从约25至约100的整数，
每个X独立地或同时地为(C1-C20)-亚烷基或(C2-C20)-亚烯基，它们中的每一者任选地被卤代、氨基、羟基、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、(C6-C10)-芳基或(C5-C10)-杂芳基中的一个或多个取代；
每个Y独立地或同时地为(C1-C20)-亚烷基或(C2-C20)-亚烯基，它们中的每一者任选地被卤代、氨基、羟基、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、(C6-C10)-芳基或(C5-C10)-杂芳基中的一个或多个取代；并且
R是T7肽(SEQ ID NO:1)、GA3肽(SEQ ID NO:2)、T4肽(SEQ ID NO:3)、T6肽(SEQ IDNO:4)和/或T8肽(SEQ ID NO:5)或它们的逆反式肽(retro-inverso pepetide)。
在一个实施方案中，所述化合物刺激Tie 2磷酸化；MAPK、AKT和/或eNOS的磷酸化；刺激内皮细胞迁移；刺激从内皮细胞释放MMP2、保护内皮细胞免于发生血清撤除诱导的细胞凋亡；在基质胶(Matrigel)测定中体内刺激血管生成应答；当局部施用于受试者的创伤时，刺激受试者的创伤愈合；减轻血管渗漏；治疗变应性疾病和/或治疗流感。
在一个实施方案中，R是如以SEQ ID NO:1示出的T7肽。
在一个实施方案中，本文提供了包含本文所公开的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，药学上可接受的载体适用于局部施用。在另一个实施方案中，药学上可接受的载体适用于全身施用。在又一个实施方案中，药学上可接受的载体适用于鼻内施用、吸入或作为灌注液的组分。
本文还提供了制备本文所公开的式(I)的化合物的方法，包括
(i)使肽与下式(II)的硫醇化合物反应，所述肽是T7肽(SEQ ID NO:1)、GA3肽(SEQID NO:2)、T4肽(SEQ ID NO:3)、T6肽(SEQ ID NO:4)和/或T8肽(SEQ ID NO:5)或它们的逆反式肽：
以获得式(III)的化合物
(ii)使所述式(III)的化合物与下式(IV)的PEG-四聚体反应：
以获得式(I)的化合物，
其中变量n、X和Y如上所定义，LG是合适的离去基团，并且PG是H或合适的保护基团。
本文还提供了激活Tie 2受体的方法，包括使Tie 2受体与本文所公开的化合物接触，使得所述Tie 2受体被激活。在一个实施方案中，Tie 2受体的激活由Tie 2受体的酪氨酸残基(诸如人体内的酪氨酸992(Y992)和小鼠的Y990)的磷酸化来证明，或者由MAPK、AKT或eNOS的磷酸化来证明。
甚至还提供了刺激受试者体内的血管生成的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者。
在另一个实施方案中，由所述化合物刺激的血管生成的特征在于以下特性中的至少一种：
a)血管周围支持细胞的募集；
b)原本会渗漏的血管的非渗漏性；
c)界限清楚的树状分支；以及
d)对内皮细胞凋亡的抑制。
在另一个实施方案中，所述方法还包括同时地或相继地施用第二血管生成剂。在一个实施方案中，第二血管生成剂是VEGF。在另一个实施方案中，第二血管生成剂选自PDGF、G-CSF、重组人促红细胞生成素、bFGF、Ang2抑制剂和胎盘生长因子(PLGF)。
在又一个实施方案中，有需要的受试者具有选自以下的临床病症：再生组织的血管形成、缺血性肢体疾病、脑缺血、血管炎症、动脉硬化、缺血性坏死、毛发生长的刺激和勃起功能障碍。
本文还提供了降低渗漏血管部位处的血管通透性的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者体内的所述部位。在一个实施方案中，受试者患有或曾经患有中风、黄斑变性、黄斑水肿、淋巴水肿、血-视网膜屏障破坏、血脑屏障破坏、细菌诱导的血管渗漏或需要肿瘤血管系统正常化。
本文还提供了保护内皮细胞的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者。在一个实施方案中，受试者患有或曾经患有肾损伤或肾纤维化、中风、血管性痴呆、黄斑变性或糖尿病并发症。在另一个实施方案中，受试者患有或曾经患有肺损伤。
甚至还提供了刺激创伤愈合的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者的创伤。在一个实施方案中，所述化合物局部或全身施用。在一个实施方案中，创伤是糖尿病性溃疡。在另一个实施方案中，创伤是褥疮性溃疡、压迫性溃疡、手术切口、创伤性组织损伤、烧伤或皮肤移植。
本文还提供了抑制CFU-G细胞的扩增的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者。在一个实施方案中，所述方法用于减少有需要的受试者体内的嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞，用于治疗特应性皮炎、哮喘或变应性鼻炎，或用于治疗有需要的受试者体内与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症。
在一个实施方案中，与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症是嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞起源的白血病。在另一个实施方案中，与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症是炎性肠病。在又一个实施方案中，与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症是寄生虫感染。
在另一个实施方案中，抑制CFU-G细胞的扩增的方法用于降低炎性细胞因子和/或趋化因子水平，这些炎性细胞因子和/或趋化因子包括以下中的至少一种：IL-17、MIG、IL12/IL23(p40)、IL-9、MIP-1a、MIP-1b、RANTES、TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-13和MCP-1。在一个实施方案中，炎性细胞因子和/或趋化因子包括嗜酸性粒细胞趋化因子。
在另一个实施方案中，所述方法抑制组胺诱导的血管渗漏。
本文甚至还提供了治疗感染流感或感染与流感相关联的细菌重叠感染的受试者的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者。
在一个实施方案中，所述方法还包括同时地或相继地施用抗病毒剂。在一个实施方案中，抗病毒剂是金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、帕拉米韦(peramivir)、维拉米定(viramidine)、利巴韦林或奥司他韦(oseltamivir)。在另一个实施方案中，受试者是人，并且流感是人流感。
在一个实施方案中，所述化合物局部施用、全身施用、鼻内施用、通过吸入施用或作为灌注液施用。
还提供了包含(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂的组合物。甚至还提供了包含(a)本文所公开的化合物和(b)血管生成剂的组合物。
还提供了试剂盒，所述试剂盒包括：(a)本文所公开的化合物、(b)第二血管生成剂和(c)使用本文所公开的试剂盒来激活Tie2和/或刺激血管生成的说明。
还提供了试剂盒，所述试剂盒包括：(a)本文所公开的化合物、(b)抗病毒剂和(c)使用所述试剂盒来治疗感染流感的受试者和/或治疗感染流感的受试者体内的细菌重叠感染的说明。
甚至还提供了生物材料，所述生物材料中掺入有本文所公开的化合物。在一个实施方案中，所述生物材料是基质胶、皮肤替代物或交联的糖胺聚糖水凝胶。在另一个实施方案中，将第二剂掺入到所述生物材料中，所述第二剂诸如VEGF、PDGF、G-CSF、重组人促红细胞生成素、bFGF和胎盘生长因子(PLGF)。
通过以下的详细描述，本公开的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，该详细描述和具体实施例尽管指出了本申请的实施方案，却是仅仅通过举例说明的方式给出的，并且权利要求的范围不应当受这些实施方案的限制，而是应当被给予同作为整体的描述相符的最宽泛的诠释。
附图说明
下文描述了与附图有关的实施方案，其中：
图1A示出了亲本血管肽的示意图，该亲本血管肽是经由将在N末端处具有半胱氨酸的T7肽连接到含有马来酰亚胺的活化的PEG四聚体而制备的。所得的肽PEG缀合物含有5元环产物和6元环产物的混合物。示出的5元琥珀酰亚胺环是由马来酰亚胺被半胱氨酸上的硫醇基团直接烷基化而产生的，还示出的6元噻嗪环是由该初始产物通过半胱氨酸接头上的游离胺基团重排而产生的。图1B示出了Mpa-Br的示意图，在一个实施方案中，通过将具有3-巯基丙酸的T7肽(半胱氨酸的非手性类似物，在N末端没有胺侧链)连接到含有溴乙酰亚胺的活化的PEG四聚体来制备Mpa-Br。
图2A示出了使用色氨酸荧光光谱法来检测亲本血管肽与均质重组受体群体即溶液中的人Tie2Fc的结合。图2C示出了使用色氨酸荧光光谱法来检测MPA-Br与均质重组受体群体即溶液中的人Tie2Fc的结合。在将人Tie2Fc受体与浓度不断增加的配体(A,C)(○)或单独的配体(□)一起温育时，内在荧光强度的增加和所得的结合曲线。样品在295nm的波长下激发。图2B示出了亲本血管肽与人Tie2Fc的特异性饱和结合曲线。图2D示出了Mpa-Br与人Tie2Fc的特异性饱和结合曲线。对于非线性回归单位点(one site)特异性结合，从总结合中减去单独的亲本血管肽或单独的MPABr的内在荧光强度。亲本血管肽和MPA-Br与人Tie2Fc的归一化特异性结合的所得Kd值分别为102.9nM和2.623nM。图2E示出了亲本血管肽与人IgGFc的结合曲线。图2F示出了MPA-Br与人IgGFc的结合曲线。使用人IgGFc和亲本血管肽或人IgGFc和MPA-Br时未观察到结合饱和。图2G示出的表格描绘了亲本血管肽和MPA-Br对各种物种的重组Tie2FC的结合常数。使用色氨酸扫描荧光光谱法来确定亲本血管肽和MPA-Br对指定物种的重组Tie2Fc受体的结合常数。
图3A示出，亲本血管肽和MPA-Br激活Tie2受体。用递增剂量的亲本血管肽和MPA-Br处理的HUVEC细胞中的磷酸化Tie-2。数据表示为归一化平均值±SEM，相对于未处理(NT)进行单因素ANOVA事后Holm-Sidak多重比较，*p<0.05，**p<0.01。为便于观察，用剖面线将亲本血管肽处理和MPA-Br处理分开。图3B示出，亲本血管肽和MPA-Br激活了丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)。用亲本血管肽和MPA-Br处理的HUVEC细胞中的MAPK(Erk2)的磷酸化。数据表示为归一化平均值±SEM，相对于未处理(NT)进行单因素ANOVA事后Holm-Sidak多重比较，*p<0.05，****p<0.0001。
图4A示出了用指定浓度的亲本血管肽和MPA-Br处理的HMVECtert细胞(用端粒酶永生化)中的磷酸化Tie-2(数据表示为平均值±SEM，学生t检验，*p<0.05，**p<0.01，处理组相对于内皮细胞基础培养基(EBM)处理组)。图4B示出了用指定浓度的亲本血管肽和MPA-Br处理的原代小鼠肺微血管内皮细胞中的磷酸化Tie-2(数据表示为平均值±SEM，单因素ANOVA事后Holm-Sidak，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p＝0.06处理组相对于未处理(NT)。
图5A示出了源自大鼠肾小球的原代培养内皮细胞，图5B示出了源自犬主动脉的原代培养内皮细胞，图5C则示出了源自食蟹猴肾小球的原代培养内皮细胞。用指定浓度的MPA-Br(mBr)刺激细胞15分钟。经由ELISA对磷酸化Tie2进行定量，示出的数据代表归一化为总Tie2蛋白水平时Tie2(pTie2)的相对激活。包括人重组血管生成素1(Ang1)作为阳性对照。数据表示为平均值±SEM，学生t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001处理组相对于未处理(NT)。大鼠的n＝3，犬的n＝4，食蟹猴的n＝3。
图6A至图6I示出，在接种X31(H3N2)流感后，亲本血管肽和MPA-Br对小鼠产生了保护。在第0天，用64HAU X31鼻内感染小鼠。在研究持续期间，从感染后48小时开始，每24小时腹膜内(I.P.)给予指定剂量的亲本血管肽或MPA-Br。每天监测存活率分数(图6A)，直到第12天。在感染后5天(图6B)和6天(图6C)测量初始体重分数。感染后第5天(图6D)和第6天(图6E)的动脉血氧饱和度。在感染后5天(图6F)或6天(图6G)测量体温。在感染后第5天(图6H)和第6天(图6I)测量活跃度评分。通过Mantel Cox Log Rank分析进行存活率统计，其中***p<0.001。所有其他统计学度量如下：#p<0.05相对于使用PBS的Flu，经由单因素ANOVA与Fisher事后检验；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p,0.0001相对于使用PBS的Flu，经由单因素ANOVA与Dunnett事后检验。
图7A和图7B示出，Sprague Dawley大鼠在时间零点经由尾静脉注射被给予指定剂量的亲本血管肽或MPA-Br。在指定的时间点收集血浆，以便于经由ELISA对测试剂的循环水平进行定量。图表描绘了随时间推移，循环的MPA-Br(图7A)和亲本血管肽(图7B)从全身循环中损耗的情况。表格详细说明了120ug/kg剂量的计算清除率、分布容积和终末半衰期值。该研究的一组治疗群规定，MPA-Br每24小时给药一次，连续递送三天(多剂量MD 120ug/kg)。
图8示出，在皮肤组胺挑战前1小时，给予背部剃毛的雄性FVB小鼠指定量的亲本血管肽或MPA-Br(经由IP)。在组胺暴露后，立即施用经由尾静脉递送的伊文思蓝(EB)染料。在组胺挑战后30分钟，从心脏灌注的小鼠除去标准化的皮肤活组织切片。使用620nm处的吸光度计算所有处理组的EB染料外渗量。数据表示为EB的平均量±SEM，相对于PBS媒介物对照进行单因素ANOVA事后Dunnette多重比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
定义
如本文所用的术语“(C1-Cp)-烷基”，是指含有从1至“p”个碳原子的直链和/或支链饱和烷基，包括(取决于p的大小)甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、2,2-二甲基丁基、正戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、正己基等，其中变量p是表示该烷基基团中的碳原子最大数量的整数。
如本文所用的术语“(C2-Cp)-烯基”，是指含有从2至“p”个碳原子且包括至少一个碳-碳双键的直链和/或支链不饱和烷基部分，包括(取决于p的大小)乙烯基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、叔丁烯基、1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、1-己烯基、2-己烯基等，其中变量p是表示该烯基基团中的碳原子最大数量的整数。
术语“(C1-Cp)-烷氧基”是指具有与其附接的氧原子的如上所定义的烷基基团。如本文所用，该术语是指具有与其附接的氧原子并含有从1至“p”个碳原子的直链和/或支链的饱和烷基，包括(取决于p的大小)甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、正戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、正己氧基等，其中变量p是表示该烷氧基基团中的碳原子最大数量的整数。
如本文所用的术语“芳基”，是指含有至少一个芳环的环状基团，其中芳环例如单环(例如苯基)或多个稠环(例如萘基)。在本公开的一个实施方案中，芳基基团含有6、9或10个原子，诸如苯基、萘基、茚满基、蒽基、1,2-二氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基、芴基、茚满基、茚基等。
如本文所用的术语“杂芳基”，是指具有至少一个选自N、O和S的杂原子和至少一个芳环的芳族环状或多环状环系。杂芳基基团的实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、异吲哚基、三唑基、吡咯基、四唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、咔唑基、苯并噁唑基、嘧啶基、苯并咪唑基、喹喔啉基、苯并噻唑基、萘啶基、异噁唑基、异噻唑基、嘌呤基和喹唑啉基等。
如本文所用的术语“卤代”是指卤素原子，包括氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
添加到上述基团中任一者上的后缀“亚”表示该基团是二价的，即，插入两个其他基团之间。
如本文所用的逆反式肽是指其中d-氨基酸以相反顺序被取代的肽。侧链拓扑结构将模拟原始分子(一级结构)，从而为结合作准备。
本公开的化合物
在一个实施方案中，本发明的发明人提供了一类活性相比血管肽(VT)改善的新型剂，并且在实施例部分中将所述新型剂中的一种称为“Mpa-Br”。
因此，本公开提供一种式(I)的化合物，
和/或其药学上可接受的盐，
其中
n是从约25至约100的整数，
每个X独立地或同时地为(C1-C20)-亚烷基或(C2-C20)-亚烯基，它们中的每一者任选地被卤代、氨基、羟基、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、(C6-C10)-芳基或(C5-C10)-杂芳基中的一个或多个取代；
每个Y独立地或同时地为(C1-C20)-亚烷基或(C2-C20)-亚烯基，它们中的每一者任选地被卤代、氨基、羟基、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、(C6-C10)-芳基或(C5-C10)-杂芳基中的一个或多个取代；并且
R是T7肽(SEQ ID NO:1)、GA3肽(SEQ ID NO:2)、T4肽(SEQ ID NO:3)、T6肽(SEQ IDNO:4)或T8肽(SEQ ID NO:5)或它们的逆反式肽。
在一个实施方案中，R是T7肽，该T7肽包含氨基酸序列：His-His-His-Arg-His-Ser-Phe(SEQ ID NO:1)。在另一个实施方案中，R是GA3肽，该GA3肽包含氨基酸序列：Trp-Thr-Ile-Ile-Gln-Arg-Arg-Glu-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-Arg-Thr-Trp-Lys-Glu-Tyr-Lys(SE Q ID NO:2)。在另一个实施方案中，R是T4肽，该T4肽包含氨基酸序列：Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser(SEQ ID NO:3)。在又一个实施方案中，R是T6肽，该T6肽包含氨基酸序列：Lys-Leu-Trp-Va l-Ile-Pro-Lys(SEQ ID NO:4)。在又一个实施方案中，R是T8肽，该T8肽包含氨基酸序列：His-Pro-Trp-Leu-Thr-Arg-His(SEQ ID NO:5)。
T4、T6、T7和T8是Tie 2结合肽T4、T6、T7和T8，在Tour naire,R.等人，(2004)EMBOReports 5:262-267中有所描述。GA3也是Tie 2结合肽，在Wu,X.等人，(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun.315:1004-1010中有所描述。
在一个实施方案中，n是从约40至约70、或约48至约65、或约55的整数。
在另一个实施方案中，X独立地或同时地为(C1-C10)-亚烷基或(C2-C10)-亚烯基。在另一个实施方案中，X独立地或同时地为(C1-C6)-亚烷基或(C2-C6)-亚烯基。在另一个实施方案中，X独立地或同时地为(C1-C3)-亚烷基。在另一个实施方案中，X为亚甲基(-CH2-)。在另一个实施方案中，任选的取代基是卤代或(C1-C3)-烷基或CH3中的一个或多个。
在另一个实施方案中，Y独立地或同时地为(C1-C10)-亚烷基或(C2-C10)-亚烯基。在另一个实施方案中，Y独立地或同时地为(C1-C6)-亚烷基或(C2-C6)-亚烯基。在另一个实施方案中，Y独立地或同时地为(C1-C3)-亚烷基。在另一个实施方案中，Y为亚乙基(-CH2CH2-)。在另一个实施方案中，Y衍生自巯基乙酸、2-巯基丙酸、4-巯基丁酸、6-巯基己酸、8-巯基辛酸、11-巯基十一烷酸、12-巯基十二烷酸或16-巯基十六烷酸。
在一个实施方案中，式(I)的化合物是
或其药学上可接受的盐，
其中
n是介于约50至60之间或约55的整数；并且
R是His-His-His-Arg-His-Ser-Phe(SEQ ID NO:1)。
在另一个实施方案中，药学上可接受的盐是酸加成盐，诸如乙酸盐、三氟乙酸盐或HCl盐形式。在另一个实施方案中，式(I)的化合物是乙酸盐或盐酸盐。
在其他实施方案中，除了式(I)的化合物的四聚体之外，本公开还包括二聚体和三聚体。在一个实施方案中，本公开包括具有下式的二聚体化合物、三聚体化合物和四聚体化合物
其中
W独立地或同时地为羟基取代的(C1-C20)-烷基或羟基取代的(C2-C20)-烯基，它们中的每一者任选地被卤代、氨基、羟基、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、(C6-C10)-芳基或(C5-C10)-杂芳基中的一个或多个取代；或
W是X-S-Y-C(O)-R，
其中n、X、Y和R如上所定义。
在一个实施方案中，W是羟基取代的(C1-C10)-烷基或羟基取代的(C2-C10)-烯基。在另一个实施方案中，W是羟基取代的(C1-C6)-烷基或羟基取代的(C2-C6)-烯基。在另一个实施方案中，W是–CH2-OH。
在一个实施方案中，二聚体具有以下结构
其中W独立地或同时地为羟基取代的(C1-C20)-烷基或羟基取代的(C2-C20)-烯基，它们中的每一者任选地被卤代、氨基、羟基、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、(C6-C10)-芳基或(C5-C10)-杂芳基中的一个或多个取代，并且
n、X、Y和R如上所定义。
在另一个实施方案中，三聚体具有以下结构
/>
其中W独立地或同时地为羟基取代的(C1-C20)-烷基或羟基取代的(C2-C20)-烯基，它们中的每一者任选地被卤代、氨基、羟基、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、(C6-C10)-芳基或(C5-C10)-杂芳基中的一个或多个取代，并且
n、X、Y和R如上所定义。
在另一个实施方案中，四聚体是式(I)的化合物。
在一个实施方案中，本文所公开的化合物表现出Tie 2激动剂活性。可以使用本领域公认的Tie 2激活指示剂检测该Tie 2激动剂活性。例如，本文所公开的化合物可以刺激Tie 2磷酸化(例如，酪氨酸残基(诸如人Tie 2的氨基酸残基Y992)处的磷酸化)。
因此，在一个实施方案中，所述化合物刺激Tie 2磷酸化。
另外，本文所公开的化合物可以刺激Tie 2的下游信号传导途径中的分子的磷酸化，诸如以下各项的磷酸化：MAPK、AKT(例如，人AKT的氨基酸残基S473处的磷酸化)和/或eNOS(例如，eNOS的氨基酸残基S1177处的磷酸化)。化合物刺激特定蛋白质磷酸化的能力可以使用本领域熟知的标准技术(诸如对用所述化合物处理的细胞裂解物的免疫印迹测定法)来测定。
因此，在一个实施方案中，所述化合物刺激MAPK、AKT和eNOS的磷酸化。
在另一个实施方案中，本文所公开的化合物对内皮细胞具有明显的作用。例如，本文所公开的化合物可以对内皮细胞具有选自以下的至少一种作用：刺激内皮细胞迁移、刺激从内皮细胞释放MMP2和保护内皮细胞免于发生血清撤除诱导的细胞凋亡。任选地，本文所公开的化合物对内皮细胞具有这些作用中的至少两种作用，或对内皮细胞具有所有这三种作用。化合物对内皮细胞具有这些作用中的任一种的能力可以使用本领域已知的测定法来测定，诸如用于评估细胞迁移的Boyden室测定法、用于评估MMP2释放的酶谱测定法，或者用于评估血清撤除诱导的细胞凋亡的细胞死亡ELISA测定法。
因此，在一个实施方案中，所述化合物刺激内皮细胞迁移；刺激从内皮细胞释放MMP2和/或保护内皮细胞免于发生血清撤除诱导的细胞凋亡。
在一个实施方案中，如在体外或体内血管生成测定中测量的，本文所公开的化合物对血管生成具有明显的作用。一种这样的测定法是体内基质胶测定法，其中用所述化合物浸渍生长因子减少的基质胶，然后皮下注射到测试动物中。一段时间(例如，14天)之后，可以用促进血管识别和定量的剂(例如，FITC-凝集素)处理该测试动物，然后可以除去基质胶塞并检查血管生成应答。
因此，在一个实施方案中，本文所公开的化合物在基质胶测定中体内刺激血管生成应答。
在另一个实施方案中，当局部施用于受试者的创伤时，本文所公开的化合物可以刺激受试者的创伤愈合。可以在动物模型中评估所述化合物刺激创伤愈合的能力，所述动物模型诸如小鼠的B6.Cg-m(+/+)Lepr(db)/J(db/db)品系，即呈现出创伤愈合受损的糖尿病小鼠品系。可以在小鼠上制造切除性创伤，可以将掺入到局部制剂中的所述化合物施用于该创伤，然后可以评估创伤愈合。在一个实施方案中，本文所公开的化合物可以加速创伤闭合时间和/或可以促进胶原沉积增加和新血管形成增加。
因此，在一个实施方案中，当局部施用于受试者的创伤时，所述化合物刺激受试者的创伤愈合。
在一个实施方案中，本文所公开的化合物中的PEG分子的数目任选地为导致分子量小于约21,500道尔顿，导致分子量在约8,000道尔顿至约21,500道尔顿范围内，导致分子量为约12,500道尔顿、约15,500道尔顿或约14,000道尔顿的数目。
本文还提供了包含本文所公开的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何及所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。任选地，该载体适用于局部施用或适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，可以将该活性化合物用材料包衣，以保护所述化合物免受酸和其他可能使所述化合物失活的天然条件的作用。
可以选择药学上可接受的载体，以适合期望的施用途径。例如，在一个实施方案中，药学上可接受的载体适用于局部施用。用于局部施用的合适载体的非限制性实例是IntraSite凝胶(可从Smith&Nephew商购获得)。在另一个实施方案中，药学上可接受的载体适用于全身施用。用于全身(例如，静脉内)施用的合适载体的非限制性实例是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在又一个实施方案中，药学上可接受的载体适用于鼻内施用。在又一个实施方案中，药学上可接受的载体适用于吸入。在另一个实施方案中，药学上可接受的载体适合作为灌注液的组分。
该药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留原始化合物的期望生物活性并且不会赋予任何不期望的毒理效应的盐(参见例如Berge,S.M.等人，(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)的那些，以及衍生自无毒有机酸(诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等(诸如乙酸))的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属(诸如钠、钾、镁、钙等)的那些，以及衍生自无毒有机胺(诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可以在该药物组合物中采用的合适的水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可以维持适当的流动性，例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂。
这些组合物还可以含有例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和/或分散剂。通过灭菌程序和包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)这两种手段，可以确保防止微生物存在。还可能期望在这些组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射药物形式的吸收。
这些治疗组合物典型地在制造条件和储存条件下必须是无菌和稳定的。无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与上面列举的成分中的一种或组合(如果需要)一起掺入适当的溶剂中，然后进行灭菌微滤来制备。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的分散介质，以及它们的合适混合物。可以维持适当的流动性，例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，将优选的是在该组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇诸如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。
可以与载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量将根据正在治疗的受试者和具体的施用方式而变化。可以与载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是该组合物的产生治疗效果的量。通常，在100％中，该量将在活性成分与药学上可接受的载体结合的量的从约0.01％至约99％、优选地从约0.1％至约70％、最优选地从约1％至约30％的范围内。
调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单次推注，可以随时间推移施用几个分开的剂量，或者可以如治疗情况的紧急程度所指出的按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可以以剂量单位形式配制，以便于施用和剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单元剂量的物理上离散的单位；每个单位都含有预定量的活性化合物，该活性化合物经计算可与所需的药物载体联合产生期望的治疗效果。该剂量单位的规格由以下两方面决定，并直接取决于这两方面：(a)活性化合物的独有特征和要达到的具体治疗效果，以及(b)配混这样的活性化合物用于治疗个体敏感性的领域中固有的限制。
对于本文所公开化合物的全身施用，剂量典型地在从约0.00001至100mg/kg宿主体重、更通常地0.1至100μg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可以是0.1μg/kg、0.5μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、30μg/kg体重、0.1mg/kg体重、0.3mg/kg体重、0.5mg/kg体重或1mg/kg体重。对于局部施用，示例性剂量浓度为从约1ng/ml至约10ng/ml。
药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得对于特定的患者、组合物和施用方式能够有效地实现期望的治疗应答又不会对患者产生毒性的活性成分量。所选择的剂量水平将取决于多种药动学因素，包括所采用的特定组合物或者其酯、盐或酰胺的活性，施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间，与所采用的特定组合物结合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和所选择的特定组合物或施用途径等因素来确定此类量。
制备方法
本文还提供了制备本文所公开的式(I)的化合物的方法，包括
(i)使肽与下式(II)的硫醇化合物反应，所述肽是T7肽(SEQ ID NO:1)、GA3肽(SEQID NO:2)、T4肽(SEQ ID NO:3)、T6肽(SEQ ID NO:4)和/或T8肽(SEQ ID NO:5)或它们的逆反式肽：
以获得式(III)的化合物或其盐
(ii)使所述式(III)的化合物与下式(IV)的PEG-四聚体反应：
以获得式(I)的化合物或其药学上可接受的盐；
其中变量n、X和Y如上所定义，LG是合适的离去基团，并且PG是H或合适的保护基团。
在一个实施方案中，合适的离去基团是卤代、甲苯磺酸根或甲磺酸根。在另一个实施方案中，离去基团是溴代。
在一个实施方案中，合适的保护基团是三苯甲基。
在一个实施方案中，式(III)的化合物是酸加成盐，诸如三氟乙酸盐、乙酸盐或盐酸盐。
在一些实施方案中，肽(R)首先与聚苯乙烯树脂键合。在另一个实施方案中，然后使与聚苯乙烯树脂键合的肽与下式(II)的硫醇化合物反应。在另一个实施方案中，式(III)的化合物与聚苯乙烯树脂键合，该聚苯乙烯树脂在与式(IV)的化合物反应之前被切割。
在一个实施方案中，式(III)的化合物与式(IV)的化合物之间的反应在介于约5至约8之间、或介于约6至约8之间、或介于约6至约7之间，或6.5的pH下进行。
在其他实施方案中，式(III)的硫醇化合物在与如上所述并且还包含不饱和部分的四聚体PEG分子的迈克尔加成反应(Michael addition reaction)中用作亲核试剂。例如，式(III)的化合物与诸如以下的四聚体PEG分子反应：
其中
T是不饱和部分，诸如丙烯酸酯部分、或乙烯砜部分。
在另一个实施方案中，丙烯酸酯部分是
在另一个实施方案中，乙烯砜部分是
在一个实施方案中，式(III)的化合物中的硫醇部分在迈克尔加成反应中充当亲核试剂，以形成本公开的另外的化合物，诸如
其中R和Y如上所定义。
方法和用途
Tie2激活并刺激血管生成
另一个方面涉及本文所公开化合物的使用方法和用途。如本文所讨论的，本文所公开的化合物可以用于体外或体内激活Tie 2受体。因此，在一个实施方案中，提供了激活Tie 2受体的方法，包括使Tie 2受体与本文所公开的化合物接触，使得所述Tie 2受体被激活。还提供了本文所公开的化合物用于激活Tie 2受体的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于激活Tie 2受体的药物中的用途。甚至还提供了用于激活Tie 2受体的本文所公开化合物。
Tie 2受体的激活可以通过本领域公认的Tie 2激活的许多可能指标中的任一种来证明，包括但不限于各种体外测定和体内测定。在一个实施方案中，例如，Tie 2受体的激活通过Tie 2受体的酪氨酸残基(例如，人Tie 2的酪氨酸992(Y992))的磷酸化来证明。在另一个实施方案中，例如，Tie 2受体的激活由MAPK、AKT或eNOS的磷酸化来证明。
由于已经证实本文所公开的化合物具有相比血管肽增加的应答幅度和更宽的剂量范围，其中已经证实该血管肽具有血管生成活性(参见例如图3A、图3B、图4A、图4B、图5A至图5C，以及图8A)，所以还提供了刺激受试者体内的血管生成的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者。还提供了本文所公开的化合物用于刺激有需要的受试者体内的血管生成的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于刺激有需要的受试者体内的血管生成的药物中的用途。甚至还提供了用于刺激有需要的受试者体内的血管生成的本文所公开化合物。
在一个实施方案中，由所述化合物刺激的血管生成的特征在于以下特性中的至少一种：
a)血管周围支持细胞的募集；
b)原本会渗漏的血管的非渗漏性；
c)界限清楚的树状分支；以及
d)对内皮细胞凋亡的抑制。
血管周围支持细胞的募集可以通过检测平滑肌细胞的标志物(例如通过用抗平滑肌肌动蛋白1(Sma 1)、NG2或结蛋白的抗体进行免疫染色)来证明。可以使用本领域建立的血管通透性测定(包括体外测定和/或体内测定)来评估血管的非渗漏性。体内血管通透性测定的非限制性实例是使用伊文思蓝或FITC白蛋白的Miles测定。如本文所用，在以下情况下认为血管是“非渗漏的”：血管的通透性程度小于通过VEGF治疗或用其他血管炎性介质(诸如血清素或组胺)治疗来刺激其生长的血管的通透性程度。界限清楚的树状分支可以例如通过对新形成的血管成像以及对特定像场中的血管数量和结节数量进行定量来证明。界限清楚的树状分支由例如血管的明显且有组织的分支(诸如其中血管数量与结节数量的比率为1.0:0.5、任选地1.0:0.7或甚至1.0:1.0的血管生成)来指示。另外，可以使用微多普勒超声来评估新生血管的流动力学。
在用于刺激血管生成的方法中，该部位可以与单独的本文所公开的化合物接触，或者作为替代，该部位可以与一种或多种另外的血管生成剂接触。因此，在另一个实施方案中，该血管生成方法还包括使受试者体内的部位与第二血管生成剂接触。可以与本文所公开的化合物结合使用的另外的血管生成剂的非限制性实例包括VEGF、PDGF、G-CSF、重组人促红细胞生成素、bFGF和胎盘生长因子(PLGF)。因此，在一个实施方案中，第二血管生成剂是VEGF。在另一个实施方案中，第二血管生成剂选自PDGF、G-CSF、重组人促红细胞生成素、bFGF、Ang2抑制剂和胎盘生长因子(PLGF)。
考虑到本文所公开的化合物刺激血管生成的能力，本文所公开的化合物可以用于期望促进血管生成的多种临床情况。此类适应症的非限制性实例包括再生组织的血管形成、缺血性肢体疾病、脑缺血、血管炎症，包括动脉硬化、缺血性坏死、毛发生长的刺激和勃起功能障碍。
本文还提供了降低渗漏血管部位处的血管通透性的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者体内的所述部位。还提供了本文所公开的化合物用于降低有需要的受试者体内的渗漏血管部位处的血管通透性的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于降低有需要的受试者体内的渗漏血管部位处的血管通透性的药物中的用途。甚至还提供了用于降低有需要的受试者体内的渗漏血管部位处的血管通透性的本文所公开化合物。
在一个实施方案中，受试者患有或曾经患有中风、黄斑变性、黄斑水肿、淋巴水肿、血-视网膜屏障破坏、血脑屏障破坏、细菌诱导的血管渗漏，或需要肿瘤血管系统正常化。
先前已经证实，血管肽例如通过抑制内皮细胞的细胞凋亡而对内皮细胞具有保护作用。已经报道过，Tie 2激动剂在肾血管系统中保护内皮细胞的能力在实验模型中改善了肾纤维化(Kim,W.等人，(2006)J.Am.Soc.Nephrol.17:2474-2483)。本文已经证实，MPA-Br在HUVEC、HMVEC中以及原代大鼠、犬和食蟹猴的内皮细胞中诱导Tie2磷酸化。最近，Thamm K等人(2016)证实，血管肽能够改善移植后的急性肾损伤(在小鼠中)。这也转化为接受血管肽的那些小鼠中的移植相关肾纤维化减轻。Rubig E等人(2016)证实，血管肽降低了缺血-再灌注后的急性肾损伤的程度。损伤降低的特征在于存活率提高、受损肾脏内的血流量改善，以及血管渗漏减轻。
因此，本文提供了保护内皮细胞的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者。还提供了本文所公开的化合物用于保护有需要的受试者体内的内皮细胞的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于保护有需要的受试者体内的内皮细胞的药物中的用途。甚至还提供了用于保护有需要的受试者体内的内皮细胞的本文所公开化合物。
这种方法或用途可以用于多种临床情况，其非限制性实例包括肺损伤、肾损伤、肾纤维化、中风、血管性痴呆、黄斑变性和糖尿病并发症(例如，肾脏、眼睛、皮肤和/或四肢中)。
甚至还提供了刺激创伤愈合的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者的创伤。还提供了本文所公开的化合物用于刺激有需要的受试者的创伤愈合的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于刺激有需要的受试者的创伤愈合的药物中的用途。甚至还提供了用于刺激有需要的受试者的创伤愈合的本文所公开化合物。
刺激创伤愈合可以通过例如与不存在所述化合物时的创伤愈合相比创伤闭合时间加速、与未治疗相比创伤部位处的肉芽组织增加和/或与未治疗相比创伤的新血管形成增强来证明。
在一个实施方案中，刺激创伤愈合的方法或用途用于治疗糖尿病性溃疡。
在其他实施方案中，用于刺激创伤愈合的方法或用途可以用于涉及创伤的多种临床情况，包括但不限于褥疮性溃疡、压迫性溃疡、手术切口、创伤性组织损伤、烧伤和皮肤移植。
与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症
MPA-Br是与血管肽相比具有改善的靶标结合和药动学的化合物，先前已经证实其抑制CFU-G细胞的扩增。
因此，本文提供了抑制CFU-G细胞的扩增的方法，包括将本文所公开的化合物施用于有需要的受试者。本公开还提供了本文所公开的化合物用于抑制有需要的动物或细胞中的CFU-G细胞的扩增的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于抑制有需要的动物或细胞中的CFU-G细胞的扩增的药物中的用途。还提供了用于抑制有需要的动物或细胞中的CFU-G细胞的扩增的本文所公开化合物。
如本文所用的术语“CFU-G”，是指集落形成单位—粒细胞，它是一种类型的产生粒细胞(诸如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和中性粒细胞)的血液形成细胞。如本文所用，“扩增抑制”是指与未经处理的对照相比，粒细胞集落形成细胞的数量减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
MPA-Br是与血管肽相比具有改善的结合和药动学的化合物，先前已经证实其导致特应性疾病减轻、循环嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞减少，又不会造成对T细胞、B细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞的更普遍的免疫阻抑。因此，本公开还提供了减少有需要的动物或细胞中的嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞的方法，包括施用本文所公开的化合物。本公开还提供了本文所公开的化合物用于减少有需要的动物或细胞中的嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于减少有需要的动物或细胞中的嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞的药物中的用途。还提供了用于减少有需要的动物或细胞中的嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞的本文所公开化合物。
如本文所用的短语“减少嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞”是指减少循环的嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞的数量，其中与对照相比，循环的嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞至少减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。另外，嗜碱性粒细胞减少导致肥大细胞减少，因此嗜碱性粒细胞减少包括肥大细胞减少。
嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞与变应性应答有关。另外，本文已经证实，MPA-Br在皮肤组胺暴露后减弱血管渗漏。
因此，本公开还提供了治疗有需要的动物或细胞中的变应性疾病或应答的方法，包括施用本文所公开的化合物。本公开还提供了本文所公开的化合物用于治疗有需要的动物或细胞中的变应性疾病或应答的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于治疗有需要的动物或细胞中的变应性疾病或应答的药物中的用途。还提供了用于治疗有需要的动物或细胞中的变应性疾病或应答的本文所公开化合物。
如本文所用的术语“治疗”，是指用于获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益或期望的临床结果可以包括但不限于：无论是可检测的还是不可检测的，减轻或改善一种或多种症状或病症、减轻疾病程度、疾病状态稳定(即不恶化)、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态，以及缓解(无论是部分还是全部)。
在一个实施方案中，变应性疾病或应答是特应性疾病。如本文所用的术语“特应性疾病”，是指影响不与变应原直接接触的身体部分的变应性敏感性，并且由动物血清中的IgE水平的增加限定。在一个实施方案中，特应性疾病是特应性皮炎/湿疹、哮喘、结膜炎、慢性鼻窦炎、嗜酸性粒细胞性食管炎、食物变态反应或变应性鼻炎/花粉热。哮喘、变应性鼻炎和特应性皮炎通常被称为特应性三联症，其中在许多情况下，特应性皮炎首先显现出来(Eichenfield等人，2003)，并且通常随后发展为哮喘和/或变应性鼻炎。因此，在一个实施方案中，特应性疾病是特应性皮炎。在另一个实施方案中，特应性疾病是哮喘。
在另一个实施方案中，本公开还提供了治疗有需要的动物或细胞中与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症的方法，包括施用本文所公开的化合物。本公开还提供了本文所公开的化合物用于治疗有需要的动物或细胞中与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于治疗有需要的动物或细胞中与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症的药物中的用途。还提供了用于治疗与有需要的动物或细胞中的嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症的本文所公开化合物。在一个实施方案中，与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症是骨髓增生异常综合征。在另一个实施方案中，与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症是嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞起源的白血病，诸如慢性髓性白血病、急性髓性白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、急性嗜酸性粒细胞白血病、嗜酸性粒细胞增多的慢性骨髓单核细胞性白血病和急性嗜碱性粒细胞白血病。在另一个实施方案中，与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症是炎性肠病。在又一个实施方案中，与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症是寄生虫感染。在又一个实施方案中，与嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞相关联的病症是特发性嗜酸性粒细胞增多症(HES)。
本公开还提供了降低有需要的动物或细胞中的炎性细胞因子和/或趋化因子水平的方法，包括施用本文所公开的化合物。本公开还提供了本文所公开的化合物用于降低有需要的动物或细胞中的炎性细胞因子和/或趋化因子水平的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于降低有需要的动物或细胞中的炎性细胞因子和/或趋化因子水平的药物中的用途。还提供了用于降低有需要的动物或细胞中的炎性细胞因子和/或趋化因子水平的本文所公开化合物。在一个实施方案中，炎性细胞因子和/或趋化因子水平是血清炎性细胞因子和/或趋化因子水平。在一个实施方案中，炎性细胞因子和/或趋化因子包括以下中的至少一种：嗜酸性粒细胞趋化因子、IL-17、MIG、IL12/IL23(p40)、IL-9、MIP-1a、MIP-1b、RANTES、TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-13和MCP-1。在另一个实施方案中，炎性细胞因子和趋化因子包括IL-17、MIG、IL12/IL23(p40)、IL-9、MIP-1a、MIP-1b、RANTES、TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-13和MCP-1。在又一个实施方案中，炎性细胞因子和/或趋化因子包括嗜酸性粒细胞趋化因子。此类方法和用途在治疗与炎性细胞因子和/或趋化因子增加相关联的疾病和病症中具有治疗应用。
在一个实施方案中，所述方法和用途还包括与本文所公开的化合物组合施用或使用免疫调节剂或皮质类固醇。
流感
MPA-Br与血管肽类似，已被证实可以改善流感小鼠模型的发病率和死亡率，不过在较低剂量下才有效。
因此，本文提供了治疗感染流感的受试者的方法，包括向有需要的受试者施用本文所公开的化合物。还提供了本文所公开的化合物用于治疗感染流感的受试者的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于治疗感染流感的受试者的药物中的用途。甚至还提供了用于治疗感染流感的受试者的本文所公开化合物。
本公开还提供了减轻感染流感的动物或细胞中的肺内皮渗漏的方法，包括施用本文所公开的化合物。本公开还提供了本文所公开的化合物用于减轻感染流感的动物或细胞中的内皮渗漏的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于减轻感染流感的动物或细胞中的内皮渗漏的药物中的用途。还提供了用于减轻感染流感的动物或细胞中的内皮渗漏的本文所公开化合物。
如本文所用，术语“流感”是指由正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的RNA病毒引起的感染性疾病。术语“流感”也指原发性病毒性肺炎。在一个实施方案中，流感是由人流感病毒引起的疾病。人流感病毒可以通过其血凝素分子中缺乏某些碱性氨基酸来区别于禽流感病毒(例如，H5N1禽流感)；这限制了对呼吸道内所包含的胰蛋白酶样蛋白酶的切割。因此，人流感主要感染呼吸道上皮细胞，从而导致上皮损伤、细胞凋亡和细胞脱落(Kuiken andTaubenberger,2008)。相比之下，禽流感病毒可以在呼吸道外复制并且靶向内皮细胞。人流感病毒还可以在以下基础上与禽流感病毒区别开：人流感病毒可以人传人，禽流感病毒却不可以人传人。人流感病毒的非限制性实例包括以下病毒：H1N1、H3N2、H2N2和H1N2。
如本文所用，术语“肺内皮渗漏”是指肺微血管内皮的屏障完整性丧失或通透性增加。术语“减轻肺内皮渗漏”是指与未通过本文所述的方法和用途处理的对照相比，肺内皮渗漏至少减少5％、10％、15％、25％、50％、75％或100％。在一个实施方案中，通过跨内皮电阻(TEER)或荧光素标记化合物(诸如葡聚糖)的荧光来测量肺内皮渗漏。术语“减轻肺内皮渗漏”还指与未通过本文所述的方法和用途处理的对照相比，肺微血管内皮的通透性至少增加5％、10％、15％、25％、50％、75％或100％。
低剂量感染流感使肺内皮在随后暴露于细菌时易于增加渗漏，这种现象称为致敏，先前已经证实，血管肽能够消除这种致敏引起的渗漏。预期在流感小鼠模型中具有改善的Tie 2受体结合和所需的较低剂量的MPA-Br在相同或较低的剂量下提供相似或改善的活性。
因此，本公开还提供了治疗有需要的动物或细胞中与流感相关联的细菌重叠感染的方法，包括施用本文所公开的化合物。本公开还提供了本文所公开的化合物用于治疗有需要的动物或细胞中与流感相关联的细菌重叠感染的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于治疗有需要的动物或细胞中与流感相关联的细菌重叠感染的药物中的用途。还提供了用于治疗有需要的动物或细胞中与流感相关联的细菌重叠感染的本文所公开化合物。
本公开还提供了增加具有与流感相关联的细菌重叠感染的动物或细胞的存活率和/或降低其死亡率的方法，包括施用本文所公开的化合物。本公开还提供了本文所公开的化合物用于增加具有与流感相关联的细菌重叠感染的动物或细胞的存活率和/或降低其死亡率的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于增加具有与流感相关联的细菌重叠感染的动物或细胞的存活率和/或降低其死亡率的药物中的用途。还提供了用于增加具有与流感相关联的细菌重叠感染的动物或细胞的存活率和/或降低其死亡率的本文所公开化合物。
本公开还提供了减轻具有与流感相关联的细菌重叠感染的动物或细胞中的肺内皮渗漏的方法，包括施用本文所公开的化合物。本公开还提供了本文所公开的化合物用于减轻具有与流感相关联的细菌重叠感染的动物或细胞中的肺内皮渗漏的用途。还提供了本文所公开的化合物在制备用于减轻具有与流感相关联的细菌重叠感染的动物或细胞中的肺内皮渗漏的药物中的用途。还提供了用于减轻具有与流感相关联的细菌重叠感染的动物或细胞中的肺内皮渗漏的本文所公开化合物。
如本文所用，术语“细菌重叠感染”是指继发于原发性流感感染(包括低剂量流感感染)或典型地在原发性流感感染后出现的细菌感染。细菌重叠感染还可以被定义为与流感感染同时发生或在流感感染后发生的肺炎。在一个实施方案中，导致细菌重叠感染的细菌是革兰氏阳性细菌，诸如金黄色葡萄球菌(S.aureus)或肺炎葡萄球菌(S.pneumonia)。不受理论束缚，据信流感使肺内皮致敏，从而使其在发生继发性细菌感染时更容易渗漏。因此，在原本常规感染流感之后，细菌重叠感染可能导致严重的肺损伤。
如本文所用，表述“与流感相关联的细菌重叠感染”在一个实施方案中是指与流感感染同时发生的细菌重叠感染。在另一个实施方案中，表述“与流感相关联的细菌重叠感染”是指继发于流感感染或在流感感染后发生的细菌重叠感染。
目前用抗病毒剂进行的治疗不如初次发生感染之后过一段时间治疗有效，这是有问题的，因为患者在出现症状后并不总会立即接受治疗。与抗病毒治疗的功效下降相比，血管肽先前被证明即便以延迟方式给予也是有效的，并且MPA-Br在感染后延迟48小时施用时也显示出有效性。
因此，在一个实施方案中，本文所公开的化合物在感染后约24小时或至少24小时使用或施用。在另一个实施方案中，本文所公开的化合物在感染后约48小时或至少48小时使用或施用。在又一个实施方案中，本文所公开的化合物在感染后约72小时或至少72小时使用或施用。
先前还证实，使用血管肽治疗不会降低抗病毒治疗的功效，并且可以增加原发性病毒性肺炎和因流感而引起急性肺损伤的小鼠模型的存活率。预期MPA-Br在相同或更低的剂量下将具有相似或改善的活性。因此，本公开还提供了治疗感染流感的动物或细胞的方法，包括向有需要的动物或细胞施用(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂。本公开还提供了(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂用于治疗感染流感的动物或细胞的用途。还提供了(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂在制备用于治疗感染流感的动物或细胞的药物中的用途。还提供了用于治疗感染流感的动物或细胞的(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂。
本公开还提供了增加感染流感的动物或细胞的存活率和/或降低其死亡率的方法，包括施用(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂。本公开还提供了(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂用于增加感染流感的动物或细胞的存活率和/或降低其死亡率的用途。还提供了(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂在制备用于增加感染流感的动物或细胞的存活率和/或降低其死亡率的药物中的用途。还提供了用于增加感染流感的动物或细胞的存活率和/或降低其死亡率的(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂。
本公开还提供了减轻感染流感的动物或细胞中的肺内皮渗漏的方法，包括施用(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂。本公开还提供了(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂用于减轻感染流感的动物或细胞中的肺内皮渗漏的用途。还提供了(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂在制备用于减轻感染流感的动物或细胞中的肺内皮渗漏的药物中的用途。还提供了用于减轻感染流感的动物或细胞中的肺内皮渗漏的(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂。
如本文所用的术语“抗病毒剂”是指用于治疗病毒感染诸如流感病毒感染的药物。在一个实施方案中，抗病毒剂是阻抑病毒繁殖能力的剂。抗病毒剂的实例包括但不限于金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、帕拉米韦、维拉米定、利巴韦林和奥司他韦(也称为)。
如本文所用的术语“治疗”，是指用于获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益或期望的临床结果可以包括但不限于：无论是可检测的还是不可检测的，减轻或改善一种或多种症状或病症、减轻疾病程度、疾病状态稳定(即不恶化)、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态，以及缓解(无论是部分还是全部)。如本文所用，术语“治疗”还包括预防或延缓继发于流感病毒感染的细菌重叠感染。流感治疗的有益结果的实例包括增加存活率、降低死亡率、减轻肺内皮渗漏、减少体重减轻和/或预防体温过低和改善动脉氧合作用。
如本文所用，术语“增加存活率”是指增加动物在感染流感和/或与流感相关联的细菌重叠感染后存活的时间长度。在一个实施方案中，术语“增加存活率”是指与未使用本文所述的方法和用途治疗的动物相比，动物在感染流感后存活的时间长度增加至少5％、10％、25％、50％、75％、100％、200％。
如本文所用的术语“降低死亡率”，是指当与未使用本文所述的方法和用途治疗的动物相比时，降低患有流感和/或与流感相关联的细菌重叠感染的动物或细胞的死亡率。在一个实施方案中，当与未使用本文所述的方法和用途治疗的动物相比时，死亡率降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。
术语“施用”包括将本文所述的剂体外或体内施用于动物或细胞。
如本文所用的术语“受试者”或“动物”，包括动物界的所有成员，包括人。
术语“细胞”包括单个细胞，以及多个细胞或细胞群体。施用于细胞包括体外(或离体)施用，以及体内施用。
本文所公开的化合物可以通过任何合适的方法来施用，包括局部施用、全身施用、口服施用、鼻内施用或通过吸入施用。
抗病毒剂也可以采用任何合适的方式来施用，包括但不限于局部施用、全身施用、口服施用、鼻内施用或通过吸入施用。
本文所公开的化合物和抗病毒剂可以同时施用。在另一个实施方案中，本文所公开的化合物和抗病毒剂可以相继施用。本文所公开的化合物可以在抗病毒剂之前施用，或者抗病毒剂可以在本文所公开的化合物之前施用。在一个实施方案中，本文所公开的化合物在抗病毒剂之后约24小时或至少24小时使用或施用。在另一个实施方案中，本文所公开的化合物在抗病毒剂之后约48小时或至少48小时使用或施用。在又一个实施方案中，本文所公开的化合物在抗病毒剂之后约72小时或至少72小时使用或施用。
施用本文所述剂的“有效量”被定义为在达到期望结果所必需的剂量下、并且在达到期望结果所必需的时间段内有效的量。本文所公开的化合物的有效量可以根据诸如动物的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。抗病毒剂的有效量也可以根据诸如动物的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。
可以调整剂量方案来提供最佳治疗应答。例如，可以每天施用几个分开的剂量，或者可以如治疗情况的紧急程度所指出的按比例减少剂量。施用方式(例如，通过注射或局部应用而体内施用，或者在培养中离体施用)也将影响剂量方案。
本文所述的方法和用途包括单独地或作为包含本文所公开化合物的药物组合物的一部分施用或使用本文所公开的化合物。
在一个实施方案中，包含本文所公开的化合物且用于本文的方法和用途的药物组合物还包含抗病毒剂和/或本文所公开的第二血管生成剂。任选地，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
此类药物组合物可以按以下途径使用：病灶内、静脉内、局部、直肠、肠胃外、局部、吸入、鼻内或皮下、皮内、肌肉内、鞘内、经腹膜、口腔和脑内。该组合物可以是液体、固体或半固体形式，例如丸剂、片剂、霜剂、明胶胶囊、胶囊、栓剂、软明胶胶囊、凝胶、膜、小管、溶液剂或混悬剂。所述组合物还可以是灌注液的形式。
所述药物组合物可以通过本身已知的用于制备可以施用于患者的药学上可接受的组合物的方法，使得有效量的活性物质与药学上可接受的媒介物混合成混合物来制备。合适的媒介物描述于例如以下文献中：Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,USA2003–第20版)和1999年出版的The United States Pharmacopeia:The NationalFormulary(USP 24 NF19)。
在此基础上，用于本文所述的方法和/或用途的药物组合物包括但不限于与一种或多种药学上可接受的媒介物或稀释剂联合、并且包含在具有合适pH且与生理流体等渗的缓冲溶液中的活性化合物或物质-。这些药物组合物可以另外含有其他剂，诸如皮质类固醇和免疫调节剂。
还提供了包含(a)本文所公开的化合物和(b)抗病毒剂和/或本文所公开的第二血管生成剂的组合物。任选地，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
还提供了包含(a)本文所公开的化合物和(b)本文所公开的第二血管生成剂的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括容器。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含使用所述试剂盒来刺激有需要的动物或细胞中的血管生成和/或实施本文所公开的方法和用途的说明。
还提供了包含(a)本文所公开的化合物和(b)如本文所述的抗病毒剂的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括容器。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含使用所述试剂盒来治疗有需要的动物或细胞中的流感和/或增加患有流感的动物的存活率和/或降低其死亡率的说明。在其他实施方案中，所述试剂盒包含使用所述试剂盒来治疗与有需要的动物或细胞中的流感相关联的细菌重叠感染的说明。在另外的实施方案中，所述试剂盒提供了使用所述试剂盒来减轻患有流感的动物中的肺内皮渗漏的说明。
本文所公开的化合物和所述试剂盒的抗病毒剂或第二血管生成剂任选地同时使用或相继使用。本文所公开的化合物可以在抗病毒剂/第二血管生成剂之前使用，或者抗病毒剂/第二血管生成剂可以在本文所公开的化合物之前使用。
生物材料
本文所公开的化合物还可以掺入到生物材料中，然后可以将所述生物材料植入受试者体内的某个部位，从而在该部位提供所述化合物的作用。提供基质或支架的生物材料适合使用。所述化合物可以单独掺入或与一种或多种另外的剂结合掺入，所述另外的剂诸如VEGF、PDGF、G-CSF、重组人促红细胞生成素、bFGF和胎盘生长因子(PLGF)。合适的生物材料的非限制性实例包括基质胶、皮肤替代物和交联的糖胺聚糖水凝胶(例如，如Riley,C.M.等人，(2006)J.Biomaterials 27:5935-5943中所述)。因此，另一个方面涉及向其中单独掺入或与一种或多种另外的剂结合掺入本文所公开化合物的生物材料组合物。还涵盖包含所述生物材料的包装材料。可以标记该包装材料使用了生物材料。
以上公开内容大体描述了本申请。通过参考以下具体实施例，可以获得更完整的理解。这些实施例仅出于举例说明的目的加以描述，而并不旨在限制本申请的范围。设想了形式的变化和用等同物替代，因为情况可能建议或提出使用权宜之计。尽管本文已经采用特定的术语，但这些术语旨在具有描述性意义，而并非出于限制的目的。
以下非限制性实施例用于对本公开进行说明：
实施例
结果
使用色氨酸荧光光谱法来检测亲本血管肽和MPA-Br与均匀的种特异性重组受体群体的结合。
色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸这三种氨基酸当在280nm波长处(特别是对于色氨酸，在295nm处)激发时显示内在荧光特性。该发射光谱高度依赖于蛋白质的结构构象及其溶剂。关于结构构象，由于配体与其受体结合而发生的光谱变化已经被用作表征剂量依赖性结合的内在标记。为此，在亲本血管肽或MPA-Br存在下，利用种特异性Tie2Fc蛋白的内在荧光特性和发射光谱的变化来表征结合动力学。
通过对重组人Tie2Fc受体和配体亲本血管肽或MPA-Br进行温育，观察到内在荧光强度的剂量依赖性增加(图2A、图2C)。在这两种情况下，发现荧光强度都是可饱和的。通过从受体和配体的复合物产生的荧光强度减去单独的配体产生的荧光强度，得到特异性信号。使用非线性回归单位点特异性结合，亲本血管肽和MPA-Br与人Tie2Fc的归一化特异性结合的所得Kd为102.9nM和2.623nM(图2B、图2D)。对于亲本血管肽和MPA-Br与重组小鼠Tie2Fc的结合，以及单独的MPA-Br与重组大鼠和食蟹猴Tie2Fc的结合进行相同的研究(原始数据未示出)。确定的解离常数(Kd)在图2G中详述。
鉴于重组Tie2受体是与人IgG Fc的融合蛋白，测定了重组人IgG Fc与亲本血管肽或MPA-Br结合的能力。值得注意的是，对于任一配体均未观察到荧光强度的剂量依赖性增加(图2E、图2F)。
亲本血管肽和MPA-Br在HUVEC中诱导Tie2和MAPK磷酸化。
在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中评估亲本血管肽和MPA-Br的Tie2激活潜力。用不同剂量的这两种配体处理过的HUVEC显示Tie2和下游信号传导分子MAPK的激活增加(图3A、图3B)。一般来讲，MPA-Br在从更低的浓度起始时，显示比亲本血管肽增加的应答幅度和更宽的剂量范围；从而在从10ng至100ng的剂量下显著激活Tie2，与之相比，亲本血管肽仅在1000ng/ml下才有单个显著的应答。用亲本血管肽和MPA-Br处理均显示Tie2受体的特征性钟形剂量应答。对Tie2配体的这种类型的剂量应答先前已经被注意到，并且似乎是与激活该受体酪氨酸激酶相关联的共同特征(Brkovic A等人，2007；Sturn DH等人，2005；MurdochC等人，2007；Gruber BL等人，1995；以及Maliba R等人，2008)。用亲本血管肽或MPA-Br刺激HUVEC导致MAPK的下游激活。将人重组Ang1用作Tie2和MAPK激活研究的阳性对照。
亲本血管肽和MPA-Br在HMVECtert中诱导Tie2磷酸化。
类似于上文针对HUVEC所详述的那些研究的Tie2激活研究在用端粒酶永生化的人微血管内皮细胞(真皮来源)(HMVECtert)中完成。被广泛接受的是，来自不同血管床的内皮细胞、或血管的相对管径表现不同，因而利用HMVECtert的研究促进了对不同来源的人内皮细胞的比较。用指定浓度的亲本血管肽或MPA-Br刺激HMVECtert导致Tie2受体的剂量依赖性激活(图3A)。同样，剂量应答是钟形的，且MPA-Br在从0.2ng/ml至10ng/ml范围内的浓度下显示统计上显著的激动活性。亲本血管肽刺激后的激活在5倍高(从1ng/ml至100ng/ml范围内)的浓度下变得明显。与亲本血管肽(约2.6倍)或人重组Ang1(800ng/ml)相比，MPA-Br的Tie2激活相对幅度较大(约3.3倍)。当与亲本血管肽在HUVEC和HMVECtert这两者中的激动效力相比时，MPA-Br的增加的激动效力可能随人Tie2受体所显示的改善的结合特性而变(参见图2G)。
亲本血管肽和MPA-Br在MLMVEC中诱导Tie2磷酸化。
本文详述的几种临床前功效研究利用小鼠作为测试物种。因此，为了特异性评估亲本血管肽和MPA-Br的Tie2激动效力，使用了体外细胞培养系统，该系统使用原代小鼠肺微血管内皮细胞(MLMVEC)。亲本血管肽和MPA-Br显示浓度特异性的钟形剂量应答。MPA-Br介导的Tie2激活在从10ng/ml至5000ng/ml范围内的浓度下是明显的，而亲本血管肽在从100ng/ml至5000ng/ml范围内的浓度下促进Tie2激活。亲本血管肽和MPA-Br对Tie2受体的相对诱导幅度没有差异，尽管对于MPA-Br，在其浓度为亲本血管肽浓度的十分之一时发生Tie2的统计上显著的激活。
亲本血管肽和MPA-Br在原代大鼠、犬和食蟹猴的内皮细胞中诱导Tie2磷酸化
用不同浓度的MPA-Br刺激大鼠肾小球内皮细胞、犬主动脉内皮细胞和食蟹猴肾小球内皮细胞的原代细胞培养物。在所有情况下，这些细胞培养测定都显示Tie2激活的MPA-Br依赖性增加。剂量应答类似于人和小鼠内皮细胞研究中注意到的特征性钟形，且Tie2受体磷酸化的统计上显著的增加集中在0.2ng/ml与50ng/ml之间。在所有情况下，人重组Ang1都提供了基线Tie2磷酸化的显著增加(与未处理(NT)相比)。
亲本血管肽和MPA-Br改善暴露于X31(H3N2)流感后的发病率和死亡率
感染流感(H3N2，64HAU/小鼠)的C57Bl/6J小鼠出现体重减轻(图6B、图6C)，并且在感染后5至7天开始死于致死效应。先前检查了以100ng/小鼠/天施用的亲本血管肽的功效(Sugiyama MG等人，2015)，发现在用X31流感感染C57Bl/6J小鼠后对增强存活率无效。施用亲本血管肽(500ng，每日腹膜内施用--先前定义为最佳方式)或MPA-Br(31.25ng或200ng，每日腹膜内施用)显著改善了受感染小鼠的总体存活率(p<0.001)(图6A)。此外，亲本血管肽和MPA-Br显著改善了肺氧合作用(SpO2)、热调节和活性评分(图6D至图6I)。有几项MPA-Br显示出优于亲本血管肽的度量。这些实例具体包括防止浪费(第6天，MPA-Br 200ng/天，图6C)和动脉氧合作用(第6天，MPA-Br 200ng/天，图6E)。以31.25ng/小鼠/天递送的MPA-Br代表16倍的剂量减少。在所有研究的终点，以31.25ng/小鼠/天递送的MPA-Br表现得与亲本血管肽相同或比后者更好。这也是MPA-Br 200ng/小鼠/天的情况；代表与亲本血管肽相比2.5倍的剂量减少。
亲本血管肽和MPA-Br在雄性Sprague Dawley大鼠中的药动学分析
经由向雄性Sprague Dawley大鼠弹丸式注射而静脉内施用指示量(ug/kg)的亲本血管肽和MPA-Br。进行连续的定时抽血，将血浆制备物应用于专门设计用于对亲本血管肽或MPA-Br定量的专有酶联免疫吸附测定。随时间推移对测试剂进行定量有助于计算药动学(PK)度量，包括分布容积、清除率和终末半衰期(图7A、图7B)。在这些研究中，120ug/kg剂量提供了最大的检测灵敏度，因此，所呈现的PK度量涉及该特定剂量水平。亲本血管肽(图7B)和MPA-Br(图7A)显示相似的分布容积和清除率，然而MPA-Br的循环明显长于亲本血管肽(t1/2 68min对34min)。以120ug/kg的多剂量(MD)静脉内设置评估MPA-Br PK，每24小时评估一次，连续评估三天。这种特定的给药方法与单个120ug/kg IV剂量没有区别，表明在每天施用的情况下没有药物蓄积。
亲本血管肽和MPA-Br减弱皮肤组胺暴露后的血管渗漏
先前的研究已经突出了Tie2对抗暴露于组胺后诱导血管渗漏的强制作用。具体地讲，遗传上缺乏血管生成素2(Tie2的天然拮抗剂)的小鼠在组胺挑战时完全不能产生血管渗漏应答(Benest AV等人，Plos One,2013)。因此，假设施用Tie2的特异性激动剂(诸如亲本血管肽和MPA-Br)来抑制组胺诱导的血管渗漏。在皮肤组胺挑战前1小时给予预防剂量的亲本血管肽或MPA-Br的雄性FVB小鼠显示比用媒介物处理的小鼠明显更少的血管渗漏；如通过伊文思蓝染料示踪剂的外渗所评估的(图8A)。值得注意的是，以500ng/小鼠的最佳剂量递送的亲本血管肽治疗，相比以相同剂量或1/4剂量(125ng/小鼠)递送的MPA-Br，在减少组胺诱导的血管渗漏方面表现得较差。
方法和材料：
经由3-巯基丙酸(Mpa)接头制备四聚体Tie 2结合肽(T7)，从而提供血管肽类似物Mpa-Br。
概述：执行的Mpa-Br制造过程需要几个步骤。在第一阶段，使用FMOC固相肽合成技术来制备T7肽和3-巯基丙酸(Mpa)精制肽。这提供了Mpa-His-His-His-Arg-His-Ser-Phe-OH，包括在N末端上具有3-巯基丙酰基接头的T7肽(SEQ ID NO:7)。之后进行切割和去保护、RP-HPLC纯化，然后经由对最终产物进行冻干而冷冻干燥，以分离Mpa-T7肽，作为TFA盐。在第二阶段，进行Mpa-肽与(溴乙酰亚胺)4-PEG10K的缀合，然后对该PEG缀合物进行两级纯化。第一纯化步骤包括RP-HPLC色谱法，得到Mpa-Br缀合物TFA盐。可以在该阶段经由冻干分离该产物，或者可以经由离子交换色谱法，在不分离TFA盐中间体的情况下将TFA抗衡离子直接交换为乙酸盐形式。将该初始产物冷冻干燥，以分离Mpa-Br乙酸盐，为自由流动的固体。
制造Mpa T7-肽
步骤1：树脂上组装
使用CS Bio肽合成仪，在具有40g树脂输入的Wang聚苯乙烯树脂(初始官能度为1.2mmol/g)上组装T7肽序列。使用8当量氨基酸和4当量DIC，在DMF中让Wang树脂加载Fmoc-Phe-OH，该过程持续4小时。Fmoc加载测试表明，对应于45.4mmol规模的合成，实现了0.8mmol/g负载。使用DIC/Oxyma化学物(3当量，136.2mmol)单独偶联所有氨基酸，使用0.5MAc2O/DMF进行加帽，并使用20％哌啶/DMF进行Fmoc去保护。在T7肽序列完成时进行试验切割，RP-HPLC分析表明序列已成功组装，粗纯度为77.5％。
Mpa(Sigma-Aldrich,USA)与结合树脂的T7肽的偶联在DMF中，在3当量DIC/Oxyma存在下，使用3当量Trt-Mpa-OH进行4小时。在洗涤树脂(DMF、MeOH和MTBE)并在真空干燥器中干燥过夜之后，获得124.5g最终树脂(重量增加84.5g)，与合成收率89.1％对应。试验切割分析表明，已形成的Mpa-T7肽的粗纯度为78.5％。ESI-MS分析证实，已形成了Mpa肽(观察到的MS＝1044.4)。
步骤2：切割和去保护
用包含TFA/TIS/水/EDT(92.5:2.5:2.5:2.5)的切割溶液将结合树脂的Mpa-T7肽处理3小时。用抗溶剂(iPr2O)将肽沉淀，然后过滤分离肽，得到粗产物。将结合树脂的Mpa-T7肽切割，得到31.5g粗肽，与总回收率38％和收率91.8％对应。粗产物的RP-HPLC分析表明粗纯度为70.5％。
第3步：净化
将粗Mpa-T7肽(24g)在缓冲液A(15mM TEAP)中稀释，然后使用RP-HPLC，采用5％至10％梯度的缓冲液B(20％MeCN/水)和88mL/min的流速，在Luna C18(3)PREP 250×50mmPhenomenex柱上纯化。合并来自TEAP纯化的产物池，用0.5％TFA/水稀释，稀释比为1/5。将一半肽溶液加载回到纯化柱上，最初用含有0.5％TFA的水/MeCN(10％)洗脱，来柱上洗涤产物，然后用0.1％TFA的MeCN溶液替换缓冲液B，通过应用20％至60％梯度的B来洗脱产物。用剩余的肽溶液重复该步骤，合并产物池并冻干，得到11.4g Mpa-T7肽，为TFA盐，与树脂加载步骤的总收率43.7％对应。最终分析表明，肽含量为61％、RP-HPLC纯度为96.2％，与6.7g净肽(收率25.8％)对应。
制造Mpa-Br缀合物
第1步：缀合
通过将Mpa-T7肽TFA盐(2mmol)和(溴乙酰亚胺)4-PEG10K(JenKem,USA)(0.48mmol)溶解于含有0.13M NaCl(120ml)的100mM磷酸钠(二元)缓冲液(pH 8)中，来进行缀合反应。确认反应溶液的pH为pH 6.5，将反应混合物在30℃下搅拌22小时。通过RP-HPLC监测反应进展，使4臂取代的四聚体溴乙酰亚胺以约58％的转化率继续转化为完全缀合的产物。反应完成时，粗混合物分别含有约30％的3臂中间体和约7％的2臂中间体。获得少量单臂产物。
步骤2：纯化Mpa-Br TFA盐
将反应混合物用缓冲液A(水+0.1％TFA)1:1稀释，然后采用Luna C18(3)PREP 250×30mm柱，以10％至75％梯度的缓冲液B(MeCN:水(60:40)+0.1％TFA)和42mL/min的流速进行纯化，收集10mL级分。在该阶段通过冻干分离的产物提供Mpa-Br TFA盐，通过RP-HPLC确定收率为约45％，纯度大于99％。
步骤3：Mpa-Br抗衡离子交换
具有TFA抗衡离子的Mpa-Br缀合物产生具有蜡质/发粘的稠度的无定形材料。为了研究物理特性，直接从如步骤2中所述获得的经RP-HPLC纯化的Mpa-Br TFA盐级分进行盐交换。在冻干之前，将级分合并(约500mL)并用水1:1稀释，将溶液加载到RP-HPLC柱上，使用Luna C18(3)PREP 250×30mm柱，利用42mL/min的流速进行乙酸盐交换过程，按照以下几个步骤收集10mL级分；初始柱平衡，含有1％AcOH的0.5M NH4OAc)；加载样品，然后进行交换过程(含有1％AcOH的0.5M NH4OAc)，乙酸铵去除步骤(1％AcOH(缓冲液A)和MeCN(缓冲液B)，10％B)和洗脱过程(1％AcOH(缓冲液A)和MeCN(缓冲液B)，10％至50％B)。合并产物并冻干，得到Mpa-Br乙酸盐，为自由流动的结晶固体。分析表明，RP-HPLC的100％纯度对应于完全取代的肽缀合物Mpa-Br，总收率为42.1％。经由离子色谱法分析残余溴(Br)的缀合物证实，Br小于0.1％表明4臂溴乙酰亚胺-PEG四聚体被完全取代。还通过SCX色谱法对Mpa-Br乙酸盐进行了另外的分析，其中发现Mpa-Br乙酸盐的纯度为90.0％。
色氨酸荧光光谱法：
配体和受体的相互作用。制备25μL的2x浓度的每种配体(亲本血管肽和MPA-Br)，然后与25μL的2x浓度Tie2Fc受体混合，以产生1x浓度的配体和受体，最终体积为50μL。配体的浓度应当足够高，以便达到受体的结合饱和度。通过SpectraMaxM2读板机在环境温度下读取样品的读数，该读板机将激发波长设定至295nm，将起始发射波长扫描设定在360nm，将最终发射波长扫描设定在450nm且设定读取间隔为10nm，并且在读取之前自动混合5秒。使用SoftMax编译数据，并使用Prism进行分析。
受体和配体。重组受体购自R&D Systems(重组人Tie-2Fc(R&D Systems)、重组小鼠Tie-2Fc(R&D Systems)、重组大鼠Tie2-FC(R&D Systems)和重组食蟹猴Tie2-FC(SinoBiological)。配体由Bachem制造(亲本血管肽和MPA-Br)。阴性IgG-FC对照来源于R&DSystems。将受体和配体都重悬于DPBS(GE Life Sciences-HyClone)中。
Tie2磷酸化--HUVEC：
根据制造商的建议，在20％O2、5％CO2和37℃的加湿室中，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种在100mm组织培养板上，处于补充有“EGM single quots”(Lonza)的完全内皮基础培养基(EBM)(Lonza)中。在完全EBM培养基中，用指定浓度的亲本血管肽、MPA-Br或血管生成素-1(R&D Systems)将已达到90％融合的细胞刺激15分钟。刺激15分钟后，将细胞置于冰上并在冰冷的PBS中洗涤两次。在IC12裂解缓冲液中制备细胞裂解物以供使用(1％NP-40、20mM Tris(pH 8.0)、137mM NaCl、10％甘油、2mM EDTA、1mM活化的原钒酸钠)。使用BCA蛋白质浓度试剂盒，按照制造商的说明(Thermo Scientific)测量每种裂解物的蛋白质浓度。根据制造商的方案，对样品进行ELISA，测量磷酸化Tie2水平和总Tie2水平。将来自每个样品的20μg或5μg蛋白质一式两份地加载，分别用于读取磷酸化Tie2和总Tie2读数。测定每个样品的磷酸化Tie2:总Tie2的比率。然后在每个实验中将所有处理组的Tie2磷酸化水平归一化为未处理组(NT，仅有完全EBM)的水平。
MAPK磷酸化--HUVEC：
如上所述培养HUVEC。在(1mM EDTA、0.5％Triton X-100、6M尿素、5mM NaF、100uMPMSF、25mM焦磷酸钠、1mM原钒酸钠、pH 7.2-7.4、1x cOmpleteTM微型无EDTA蛋白酶抑制剂)中制备裂解物。使用BCA蛋白质浓度试剂盒，按照制造商的说明(Thermo Scientific)测量每种裂解物的蛋白质浓度。根据制造商的方案(R&D Systems)，对样品进行ELISA，测量磷酸化MAPK水平和总MAPK水平。将来自每个样品的20μg或10μg蛋白质一式两份地加载，分别用于读取磷酸化MAPK和总MAPK读数。测定每个样品的磷酸化MAPK:总MAPK的比率。然后在每个实验中将所有处理组的MAPK磷酸化水平归一化为未处理组(NT，仅有EBM)的水平。
Tie2磷酸化--HMVECtert：
将用人端粒酶逆转录酶/催化亚基(tert)永生化的人微血管内皮细胞(真皮来源)(Shao和Guo(2004))接种在100mm组织培养板上，处于完全内皮基础培养基-2(EBM-2)(Lonza)中，然后置于20％O2、5％CO2和37℃的加湿室中培养。生长培养基由EBM-2组成，补充有10％胎牛血清、1X青霉素/链霉素、1ug/ml氢化可的松和100ng/ml EGF。在完全EBM-2培养基中，用指定浓度的亲本血管肽、MPA-Br或血管生成素-1将已达到90％融合的细胞刺激15分钟。刺激15分钟后，将细胞置于冰上并在冰冷的PBS中洗涤两次。在IC12裂解缓冲液中制备细胞裂解物以供使用(1％NP-40、20mM Tris(pH 8.0)、137mM NaCl、10％甘油、2mM EDTA、1mM活化的原钒酸钠)。使用BCA蛋白质浓度试剂盒测量每种裂解物的蛋白质浓度。对样品进行ELISA，测量pYTie2浓度和总Tie2浓度。将来自每个样品的20μg蛋白质加载到每个孔中，每个样品一式两份地操作。测定每个样品的pTie2相对于总Tie2的比率。在每个实验中将每个处理组中的Tie-2磷酸化水平归一化为EBM处理组的水平。
Tie2磷酸化--原代小鼠肺微血管内皮细胞
将原代小鼠肺内皮细胞(Cell Biologics)接种在100mm组织培养板上，处于补充有“EGM single quots”(Lonza)的完全内皮基础培养基(EBM)(Lonza)中。在完全EBM培养基中，用指定浓度的亲本血管肽、MPA-Br或血管生成素-1(R&D systems)将已达到90％融合的细胞刺激15分钟。刺激15分钟后，将细胞置于冰上并在冰冷的PBS中洗涤两次。在IC12裂解缓冲液中制备细胞裂解物以供使用(1％NP-40、20mM Tris(pH 8.0)、137mM NaCl、10％甘油、2mM EDTA、1mM活化的原钒酸钠)。使用BCA蛋白质浓度试剂盒，按照制造商的说明(Thermo Scientific)测量每种裂解物的蛋白质浓度。根据制造商的方案(小鼠Tie2，R&DSystems)，对样品进行ELISA，测量磷酸化Tie2水平和总Tie2水平。将来自每个样品的50μg或5μg蛋白质一式三份地加载，分别用于读取磷酸化Tie2和总Tie2读数。测定每个样品的磷酸化Tie2:总Tie2的比率。然后在每个实验中将所有处理组的Tie2磷酸化水平归一化为未处理组(NT，仅有完全EBM)的水平。
Tie2磷酸化--原代大鼠肾小球内皮细胞：
将大鼠原代肾小球内皮细胞(Cell Biologics)置于20％O2、5％CO2和37℃的加湿室中的完全大鼠内皮细胞培养基/w试剂盒(Cell Biologics)中培养，一旦达到80％至90％融合，就以1:3分开。为了检查MPA-Br在大鼠肾小球内皮细胞中激活Tie2的情况，在含有血清的培养基中用指定浓度的测试剂将95％至100％融合细胞刺激15分钟。将人Ang-1(R&DSystems)用作阳性对照。使用人磷酸化Tie-2 ELISA试剂盒(R&D Systems)中推荐的裂解缓冲液IC12(上文详述)收集细胞裂解物，然后使用ELISA(人磷酸化Tie2 ELISA试剂盒和总Tie2 ELISA试剂盒，R&D Systems)测量酪氨酸磷酸化Tie2和总Tie2，其中用验证的捕获抗体替换大鼠Tie2。将小鼠抗Tie2抗体(BD PharmingenTM)和兔TEK多克隆抗体(MyBioSource)分别用作pTie2 ELISA和总Tie2 ELISA中的捕获抗体。然后在每个实验中将所有处理组的Tie2磷酸化水平归一化为未处理组(NT，完全大鼠内皮细胞培养基)的水平。
Tie2磷酸化--原代犬主动脉内皮细胞：
将犬原代主动脉内皮细胞(Cell Biologics)置于20％O2、5％CO2和37℃的加湿室中的完全犬内皮细胞培养基/w试剂盒(Cell Biologics)中培养，一旦达到80％至90％融合，就以1:3分开。根据上文针对大鼠原代肾小球内皮细胞研究详述的方法，对原代食蟹猴肾小球内皮细胞进行Tie2激活研究。
Tie2磷酸化--原代食蟹猴肾小球内皮细胞：
根据上文针对HMVECtert提供的细节来培养原代食蟹猴肾小球内皮细胞(CellBiologics)。根据上文针对大鼠原代肾小球内皮细胞研究详述的方法，对原代食蟹猴肾小球内皮细胞进行Tie2激活研究。
皮肤组胺挑战：
从Jackson Laboratories购得10周龄雄性FVB小鼠。将小鼠饲养在具有标准的光照:黑暗循环的饲养箱(Vivarium)中，使其能够自由地获取食物和水。在第0天，用异氟烷麻醉小鼠，并用电动剃毛器剃去整个背部区域的毛发。涂抹脱毛膏，除去残留的毛发。用无菌纱布和水除去残留的脱毛膏。在第4天，以腹膜内注射的方式让小鼠接受200ul的媒介物对照(无菌PBS)、亲本血管肽或MPA-Br。递送PBS/亲本血管肽/MPA-Br后1小时，对小鼠进行异氟烷麻醉，此时经由尾静脉静脉内递送100ul的1％伊文思蓝染料(包含在无菌PBS中)。在施用伊文思蓝染料后，在小鼠仍处于麻醉状态时，施加单次PBS注射(背侧，皮内，50ul)和三次等间隔组胺注射(背侧，皮内，50ul中包含1.25ug)。一旦皮内注射完成，就对小鼠解除麻醉，然后放回饲笼中并保持25分钟。
心脏转移灌注(transperfusion)在暴露于组胺25分钟之后，用适当体积的2.5％阿佛丁(经由腹膜内注射，100ul/10g体重)对小鼠进行麻醉。一旦产生深麻醉平面，就将小鼠放置为仰卧位并固定，通过外科手术打开胸腔，暴露心脏，接着将末端为23号针头的导管插入左心室中。一旦导管牢固就位，就在右心房中切口，经由该导管以100mmHg递送25ml冷PBS，以冲洗掉血管内的所有伊文思蓝染料。一旦对小鼠进行了有效灌注，就通过外科手术切除背部皮肤。使用标准化皮肤打孔器，针对每只小鼠收集4个12mm的皮肤活检样品(1个PBS处理样品，3个组胺处理样品)。在所有情况下，接受PBS的活检样品都充当该小鼠个体的基线对照。
伊文思蓝染料外渗的定量将皮肤活检样品置于带标记的管中，然后放入60摄氏度的烘箱中保持16小时，以除去所有水分。将脱水的皮肤活检样品称重，置于装有1.5ml甲酰胺的管中，然后放入60摄氏度的水浴中保持72小时。72小时之后，将管以500RCF离心，然后将100ul样品移至平底的96孔微量滴定板中，用于在620nm和405nm下测量。构建包含高和低实验数据点的伊文思蓝染料标准曲线，使得可以计算伊文思蓝染料外渗的量(ug/g皮肤)。
流感研究：
实验设计.购得14周龄的C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratories)。将小鼠饲养在具有标准的光照:黑暗循环的饲养箱中，使其能够自由地获取食物和水。对于所有实验，将小鼠用5％异氟烷镇静，并且用在PBS中稀释为80uL最终体积的流感病毒(参见下文的病毒部分)进行鼻内感染。感染后，将小鼠分成重量匹配的对照组和治疗组；每个实验治疗群在每组中使用10只小鼠，并且用64HAU流感病毒感染小鼠，该病毒在截止第7天引起100％死亡率。包括以下各组：接受单独的流感病毒的小鼠(Flu)，还接受亲本血管肽(通过腹膜内注射，在0.1mL PBS中有500ng)或MPA-Br(通过腹膜内注射，在0.1mL PBS中有200ng或31.25ng)的感染小鼠。在感染后48小时开始用亲本血管肽或MPA-Br治疗，并且在研究持续期间每24小时给予一次。在研究持续期间，对照小鼠(Flu)从感染后48小时开始，接受每天腹膜内注射0.1mL PBS。
病毒.甲型流感病毒HKx31(H3N2)最初从Tania Watts博士获得，并且根据Szretter,K.J.,Balish,A.L.&Katz,J.M.,2006进行繁殖。通过在MDCK(Madin-Darby犬肾)细胞中进行标准噬斑形成测定或通过测量绵羊红细胞(血凝素单位，HAU)的凝集，来确定来自培养物上清液的病毒滴度。
脉搏血氧仪测量.对于C57BL/6J，使用Mouse Ox Plus装置和软件(Starr LifeSciences,Oakmont,PA)、利用小颈圈夹测量清醒(非麻醉)小鼠的动脉血氧饱和度。对于C57BL/6J小鼠，在感染前几天使用化学脱毛膏除去颈根周围的毛发。对于SO2测量，让小鼠在其饲笼中适应颈圈夹几分钟，然后记录最大SO2测量值。
活跃度评分指南
每天观察小鼠两次，每天称重一次，并分配从1至5的活跃度评分。要获得5分，小鼠必须表现出正常的活跃且好奇的行为。小鼠围绕饲笼的四侧移动并站立。就4分而言，小鼠不那么活跃。小鼠不像往常那样站立，并且更喜欢呆在饲笼的角落里。就3分而言，小鼠更不活跃，在移动时经常停住并蹲下。小鼠呆在饲笼的角落里。就2分而言，小鼠仅在被触摸时才移动，并且仅移动较短的距离。小鼠宁愿躲藏在饲笼的角落里。最后，就1分而言，小鼠处于濒死状态。活跃度评分为5至3被认为是可接受的。密切监测活跃度评分为2的小鼠，如果活跃度评分降到低于2，则将它们处死。此外，体重减轻超过30％的小鼠，不管活跃度评分原本是否可接受，都对其进行安乐死。
迈克尔加成的通用反应方法
将活化的PEG四聚体(诸如乙烯砜或丙烯酸酯)(117至118mg,，1当量)和Mpa-肽(100mg，1.5当量)添加到避光的50ml圆底烧瓶中，并且添加PBS(pH 6.5*，20ml)，使最终肽浓度为5mg/ml。在室温下搅拌反应，使用pH计验证pH，并通过HPLC以各种时间间隔监测反应进展。将反应混合物酸化至pH 3.5，然后使用以下步骤进行纯化：
步骤1闪蒸液相色谱法(Flash LC)：
柱：反相C18，Fuji，40g柱30μm(定制包装)。
梯度分布：63分钟内，B从10％变为100％
洗脱剂：洗脱剂A＝0.1％TFA的水溶液
洗脱剂B＝0.1％TFA在60％乙腈和40％水中的溶液
检测：UV(λ＝210nm/254nm)
柱温：室温
流速：40mL/min
步骤2制备型HPLC：
柱：反相C18，Daiso Bio C18，10μm 25mm×250mm
(定制包装)。
梯度分布：77分钟内，B从45％变为100％
洗脱剂：洗脱剂A＝0.1％HFBA在3％乙腈水溶液中的溶
液
洗脱剂B＝0.1％HFBA在60％乙腈和40％水中的溶液
检测：UV(λ＝210nm)
柱温：室温
流速：30mL/min
步骤3制备型HPLC：
柱：反相C18，Daiso Bio C18，10μm 25mm×25mm
(定制包装)。
梯度分布：84分钟内，B从40％变为100％
洗脱剂：洗脱剂A＝0.1％TFA的水溶液
洗脱剂B＝0.1％TFA在60％乙腈和40％水中的溶液。
乙烯砜-PEG缀合物的收率为48mg，并且丙烯酸酯-PEG缀合物的收率为15.2mg，两者都是TFA盐。
虽然已经参考目前被认为是实施例的内容描述了本公开，但是应当理解，本公开并不限于所公开的实施例。与之相反，本公开旨在覆盖包含在所附权利要求的精神和范围内的各种修改和等同布置。
所有出版物、专利和专利申请均全文以引用方式并入本文，其程度如同明确和单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请以引用方式整体并入。
参考文献
Berge SM，Bighley LD，Monkhouse DC，″Pharmaceutical salts″J PharmSci.1977 Jan；66(1)：1-19.
Bourdeau A，Van Slyke P，Kim H，Cruz M，Smith T，Dumont DJ，″Vasculotide，anAngiopoietin-1 mimetic，ameliorates several features of experimental atopicdermatitis-like disease″BMC Res Notes.2016 May 28；9：289.
Brkovic A，Pelletier M，Girard D，Sirois MG，″Angiopoietin chemotacticactivities on neutrophils are regulated by PI-3K activation″J LeukocBiol.2007 Apr；81(4)：1093-101.
Cho CH，Kammerer RA，Lee HJ，Steinmetz MO，Ryu YS，Lee SH，Yasunaga K，KimKT，Kim I，Choi HH，Kim W，Kim SH，Park SK，Lee GM，Koh GY，″COMP-Ang1：a designedangiopoietin-1 variant with nonleaky angiogenic activity″Proc Natl Acad Sci US A.2004 Apr 13；101(15)：5547-52.
Eichenfield LF，Hanifin JM，Beck LA，Lemanske RF Jr，Sampson HA，Weiss ST，Leung DY，″Atopic dermatitis and asthma：parallels in the evolution oftreatment″Pediatrics.2003 Mar；111(3)：608-16.
Gruber BL，Marchese MJ，Kew R，″Angiogenic factors stimulate mast-cellmigration″Blood.1995 Oct 1；86(7)：2488-93.
Kim W，Moon SO，Lee SY，Jang KY，Cho CH，Koh GY，Choi KS，Yoon KH，Sung MJ，Kim DH，Lee S，Kang KP，Park SK，″COMP-angiopoietin-1 ameliorates renal fibrosisin a unilateral ureteral obstruction model″J Am Soc Nephrol.2006 Sep；17(9)：2474-83.
Kuiken T，Taubenberger JK，″Pathology of human influenza revisited″Vaccine.2008 Sep 12；26 Suppl 4：D59-66.
Maliba R，Brkovic A，Neagoe PE，Villeneuve LR，Sirois MG，″Angiopoietin-mediated endothelial P-selectin translocation：cell signaling mechanisms″JLeukoc Biol.2008 Feb；83(2)：352-60.
Murdoch C，Tazzyman S，Webster S，Lewis CE，″Expression of Tie-2 by humanmonocytes and their responses to angiopoietin-2″J Immunol.2007 Jun 1；178(11)：7405-11.
Parikh SM，″Dysregulation of the angiopoietin-Tie-2 axis in sepsis andARDS″Virulence.2013 Aug 15；4(6)：517-24.
Riley CM，Fuegy PW，Firpo MA，Shu XZ，Prestwich GD，Peattie RA″Stimulationof in vivo angiogenesis using dual growth factor-loaded crosslinkedglycosaminoglycan hydrogels″Biomaterials.2006 Dec；27(35)：5935-43.
Rübig E，Stypmann J，Van Slyke P，Dumont DJ，Spieker T，Buscher K，ReuterS，Goerge T，H1，Kümpers P，″The Synthetic Tie2 Agonist PeptideVasculotide Protects Renal Vascular Barrier Function In Experimental AcuteKidney Injury″Sci Rep.2016 Feb 25；6：22111.
Shao R，Guo X，″Human microvascular endothelial cells immortalized withhuman telomerase catalytic protein：a model for the study of in vitroangiogenesis″Biochem Biophys Res Commun.2004 Sep 3；321(4)：788-94.
Sturn DH，Feistritzer C，Mosheimer BA，Djanani A，Bijuklic K，Patsch JR，Wiedermann CJ，″Angiopoietin affects neutrophil migration″Microcirculation.2005 Jul-Aug；12(5)：393-403.
Sugiyama MG，Armstrong SM，Wang C，Hwang D，Leong-Poi H，Advani A，AdvaniS，Zhang H，Szaszi K，Tabuchi A，Kuebler WM，Van Slyke P，Dumont DJ，Lee WL，″TheTie2-agonist Vasculotide rescues mice from influenza virus infection″SciRep.2015 Jun 5；5：11030.
Szretter KJ，Balish AL，Katz JM，″Influenza：propagation，quantification，and storage″Curr Protoc Microbiol.2006 Dec；Chapter 15：Unit 15G.1.
Thamm K，Njau F，Van Slyke P，Dumont DJ，Park JK，Haller H，David S，″Pharmacological Tie2 activation in kidney transplantation″World JTransplant.2016 Sep 24；6(3)：573-82.
Toumaire R，Simon MP，le Noble F，Eichmann A，England P，Pouysségur J，″Ashort synthetic peptide inhibits signal transduction，migration andangiogenesis mediated by Tie2 receptor″EMBO Rep.2004 Mar；5(3)：262-7.
Van Slyke P，Alami J，Martin D，Kuliszewski M，Leong-Poi H，Sefton MV，Dumont D″Acceleration of diabetic wound healing by an angiopoietin peptidemimetic″Tissue Eng Part A.2009 Jun；15(6)：1269-80.
Wu X，Zhao R，Li Z，Yao M，Wang H，Han J，Qu S，Chen X，Qian L，Sun Y，Xu Y，GuJ，″A novel small peptide as a targeting ligand for receptor tyrosine kinaseTie2″Biochem Biophys Res Commun.2004 Mar 19；315(4)：1004-10.
Zhang ZG，Zhang L，Croll SD，Chopp M，″Angiopoietin-1 reduces cerebralblood vessel leakage and ischemic lesion volume after focal cerebral embolicischemia in mice″Neuroscience.2002；113(3)：683-7.
序列表
<110> 万索木治疗有限公司(Vasomune Therapeutics Inc.)
桑尼布鲁克研究所(Sunnybrook Research Institute)
<120> 用于促进血管生成的剂及其方法和用途
<130> 23632-P52201PC00
<150> 62/446,030
<151> 2017-01-13
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
His His His Arg His Ser Phe
1 5
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln Arg
1 5 10 15
Thr Trp Lys Glu Tyr Lys
20
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Asn Leu Leu Met Ala Ala Ser
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Lys Leu Trp Val Ile Pro Lys
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
His Pro Trp Leu Thr Arg His
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Cys His His His Arg His Ser Phe
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> N末端具有MpA
<400> 7
His His His Arg His Ser Phe
1 5

Claims (47)

1.一种式(I)的化合物，
或其药学上可接受的盐，
其中
n是从25至100的整数，
每个X独立地或同时地为(C1-C20)-亚烷基或(C2-C20)-亚烯基，它们中的每一者任选地被卤代、氨基、羟基、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、(C6-C10)-芳基或(C5-C10)-杂芳基中的一个或多个取代；
每个Y独立地或同时地为(C1-C20)-亚烷基或(C2-C20)-亚烯基，它们中的每一者任选地被卤代、氨基、羟基、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、(C6-C10)-芳基或(C5-C10)-杂芳基中的一个或多个取代；并且
R是SEQ ID NO:1所示的T7肽、SEQ ID NO:2所示的GA3肽、SEQ ID NO:3所示的T4肽、SEQID NO:4所示的T6肽或SEQ ID NO:5所示的T8肽。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R是SEQ ID NO:1所示的T7肽。
3.如权利要求1所述的化合物，其中n是从40至70的整数。
4.如权利要求3所述的化合物，其中n是从48至65的整数。
5.如权利要求4所述的化合物，其中n是55。
6.如权利要求1所述的化合物，其中X独立地或同时地为(C1-C6)-亚烷基或(C2-C6)-亚烯基。
7.如权利要求1所述的化合物，其中Y独立地或同时地为(C1-C6)-亚烷基或(C2-C6)-亚烯基。
8.如权利要求1所述的化合物，其中Y衍生自巯基乙酸、2-巯基丙酸、4-巯基丁酸、6-巯基己酸、8-巯基辛酸、11-巯基十一烷酸、12-巯基十二烷酸或16-巯基十六烷酸。
9.如权利要求1所述的化合物，其中所述式(I)的化合物是
或其药学上可接受的盐，
其中
n是介于50至60之间的整数；并且
R是His-His-His-Arg-His-Ser-Phe。
10.如权利要求1所述的化合物，其中所述式(I)的化合物是
或其药学上可接受的盐，
其中
n是55的整数；并且
R是His-His-His-Arg-His-Ser-Phe。
11.一种药物组合物，其包含如权利要求1至10中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于吸入施用和/或局部施用、全身施用、口服施用、鼻内施用或肠胃外施用。
13.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于全身施用。
14.一种制备如权利要求1至10中任一项所述的式(I)的化合物的方法，所述方法包括
(i)使肽与下式(II)的硫醇化合物反应，所述肽是SEQ ID NO:1所示的T7肽、SEQ IDNO:2所示的GA3肽、SEQ ID NO:3所示的T4肽、SEQ ID NO:4所示的T6肽和/或SEQ ID NO:5所示的T8肽：
以获得式(III)的化合物或其盐
(ii)使所述式(III)的化合物与下式(IV)的PEG-四聚体反应：
以获得如权利要求1至10中任一项所定义的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐；
其中变量n、X和Y如权利要求1中所述，LG是选自卤代、甲苯磺酸根或甲磺酸根的合适的离去基团，并且PG是H或合适的保护基团，其中合适的保护基团是三苯甲基。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述合适的离去基团是卤代、甲苯磺酸根或甲磺酸根。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述卤代是溴代。
17.如权利要求15所述的方法，其中合适的保护基团是三苯甲基。
18.权利要求1至10中任一项所述的化合物在制备用于刺激有需要的受试者体内某个部位的血管生成的药物中的用途。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述化合物被配制用于吸入施用和/或局部施用、全身施用、口服施用、鼻内施用或肠胃外施用。
20.如权利要求18所述的用途，其中所述化合物被配制用于全身施用。
21.如权利要求18所述的用途，其中由所述化合物刺激的血管生成的特征在于以下特性中的至少一种：
a)血管周围支持细胞的募集；
b)原本会渗漏的血管的非渗漏性；
c)界限清楚的树状分支；以及
d)对内皮细胞凋亡的抑制。
22.如权利要求18至21中任一项所述的用途，其还包括使用第二血管生成剂。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述第二血管生成剂是VEGF。
24.如权利要求22所述的用途，其中所述第二血管生成剂选自PDGF、G-CSF、重组人促红细胞生成素、bFGF、Ang2抑制剂和胎盘生长因子(PLGF)。
25.如权利要求18所述的用途，其中在选自以下的临床情况下刺激血管生成：再生组织的血管形成、缺血性肢体疾病、脑缺血、血管炎症、动脉硬化、缺血性坏死、毛发生长的刺激和勃起功能障碍。
26.权利要求1至10中任一项所述的化合物在制备用于降低有需要的受试者体内的渗漏血管部位处的血管通透性的药物中的用途，其中有需要的受试者患有选自由中风、黄斑变性、黄斑水肿、淋巴水肿、血-视网膜屏障破坏、血脑屏障破坏、细菌诱导的血管渗漏和肿瘤血管系统正常化组成的组的临床病症。
27.权利要求1至10中任一项所述的化合物在制备用于保护有需要的受试者体内的内皮细胞的药物中的用途，其中，有需要的受试者患有由肾损伤、肾纤维化、中风、黄斑变性、血管性痴呆、糖尿病并发症和肺损伤组成的组的临床病症。
28.如权利要求27所述的用途，其中有需要的受试者患有肺损伤。
29.权利要求1至10中任一项所述的化合物在制备用于刺激有需要的受试者的创伤愈合的药物中的用途。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述化合物被配制用于吸入施用和/或局部施用、全身施用、口服施用、鼻内施用或肠胃外施用。
31.如权利要求29所述的用途，其中所述化合物被配制用于全身施用。
32.如权利要求29至31中任一项所述的用途，其中所述创伤是糖尿病性溃疡。
33.如权利要求29至31中任一项所述的用途，其中所述创伤选自褥疮性溃疡、压迫性溃疡、手术切口、创伤性组织损伤、烧伤和皮肤移植。
34.权利要求1至10中任一项所述的化合物在制备用于减少有需要的受试者体内的嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞用于治疗特应性皮炎、哮喘、变应性鼻炎、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞起源的白血病、炎性肠病或寄生虫感染的药物中的用途。
35.如权利要求34所述的用途，其用于治疗特应性皮炎。
36.如权利要求34所述的用途，其中所述化合物局部使用、全身使用、鼻内使用或通过吸入使用。
37.如权利要求18所述的用途，其中所述受试者是人。
38.如权利要求1至10中任一项所述的化合物在制备用于治疗感染原发性病毒性肺炎和/或与流感感染同时发生或在流感感染后发生的细菌性肺炎的动物的药物中的用途。
39.如权利要求38所述的用途，其还包括同时地或相继地使用抗病毒剂。
40.如权利要求39所述的用途，其中所述抗病毒剂是金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、帕拉米韦、维拉米定、利巴韦林或奥司他韦。
41.如权利要求38至40中任一项所述的用途，其中所述动物是人，并且所述流感是人流感。
42.一种组合物，其包含(a)如权利要求1至10中任一项所述的化合物和(b)抗病毒剂。
43.一种用于治疗流感的试剂盒，其包括：(a)如权利要求1至10中任一项所述的化合物、(b)抗病毒剂和(c)使用所述试剂盒来治疗感染流感的动物或细胞的说明。
44.如权利要求42所述的组合物或权利要求43所述的试剂盒，其中所述抗病毒剂是金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、帕拉米韦、维拉米定、利巴韦林或奥司他韦。
45.一种生物材料，所述生物材料中掺入有如权利要求1至10中任一项所述的化合物。
46.如权利要求45所述的生物材料，所述生物材料选自基质胶、皮肤替代物和交联的糖胺聚糖水凝胶。
47.如权利要求45或权利要求46所述的生物材料，所述生物材料中掺入有选自VEGF、PDGF、G-CSF、重组人促红细胞生成素、bFGF、Ang2抑制剂和胎盘生长因子(PLGF)的第二剂。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2021251096B2 (en) * 2020-04-06 2023-09-21 Douglas A. HAMILTON Coronavirus therapeutics and treatment methods

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008049227A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-02 Sunnybrook Health Sciences Center Multimeric tie 2 agonists and uses thereof in stimulating angiogenesis
WO2008076815A2 (en) * 2006-12-13 2008-06-26 Susavion Biosciences, Inc. Pro-angiogenic peptides
CN102307902A (zh) * 2008-12-10 2012-01-04 埃博灵克斯股份有限公司 用于治疗与血管发生相关的疾病和病症的针对血管生成素/Tie系统的氨基酸序列和包括其的多肽
WO2014165963A1 (en) * 2013-04-11 2014-10-16 Sunnybrook Research Institute Methods, uses and compositions of tie2 agonists
CN105848667A (zh) * 2013-11-22 2016-08-10 杰姆维克斯&凯尔有限公司 具有血管生成抑制活性的肽和包含所述肽的组合物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2701612A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Neuromedin u derivative
WO2011134056A1 (en) 2010-04-28 2011-11-03 Sunnybrook Health Sciences Centre Methods and uses of tie2 binding and/or activating agents
WO2014099984A1 (en) * 2012-12-20 2014-06-26 Amgen Inc. Apj receptor agonists and uses thereof
PE20160870A1 (es) * 2013-11-06 2016-09-09 Abbvie Stemcentrx Llc Anticuerpos anti-claudina novedosos y metodos de uso

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008049227A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-02 Sunnybrook Health Sciences Center Multimeric tie 2 agonists and uses thereof in stimulating angiogenesis
WO2008076815A2 (en) * 2006-12-13 2008-06-26 Susavion Biosciences, Inc. Pro-angiogenic peptides
CN102307902A (zh) * 2008-12-10 2012-01-04 埃博灵克斯股份有限公司 用于治疗与血管发生相关的疾病和病症的针对血管生成素/Tie系统的氨基酸序列和包括其的多肽
WO2014165963A1 (en) * 2013-04-11 2014-10-16 Sunnybrook Research Institute Methods, uses and compositions of tie2 agonists
CN105848667A (zh) * 2013-11-22 2016-08-10 杰姆维克斯&凯尔有限公司 具有血管生成抑制活性的肽和包含所述肽的组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Vasculotide, an Angiopoietin-1 mimetic, ameliorates several features of experimental atopic dermatitis-like disease";Annie Bourdeau 等;《BMC Res Notes》;20160528;第9卷;doi: 10.1186/s13104-015-1817-1 *

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