JPWO2002078738A1 - 血液レオロジー改善剤 - Google Patents

Abstract

ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、血液レオロジー改善剤。

Description

発明の分野
本発明は血液レオロジー改善剤に関する。
背景技術
近年増加傾向にある肺血栓症や深部静脈血栓症などの発症には安静時や臥床時の血流低下による血栓形成が最大要因であると考えられている。従って、これらの疾患の予防や治療のために、血流の低下を防止する血液流動性改善剤、すなわち血液レオロジー改善剤が求められている。しかしながら、効果的に血液レオロジーを改善する活性を有する医薬は知られていない。
このため、血液レオロジー（流動性）を改善する医薬の開発が望まれている。
発明の開示
従って本発明は、新規な血液レオロジー改善剤を提供しようとするものである。
上記の課題を解決すべく種々検討した結果、本発明者らは、ヒト組織因子に対する抗体（抗ヒトＴＦ抗体、又は抗ＴＦ抗体と称する場合がある）により、血液レオロジーを改善することを見出した。
従って本発明は、抗ヒトＴＦ抗体を含んで成る血液レオロジー改善剤を提供する。
上記の抗ヒトＴＦ抗体はポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体又は改変抗体もしくは抗体修飾物であることができる。モノクローナル抗体は一般にハイブリドーマにより生産されるが遺伝子組換えにより製造することもでき、また改変抗体及び抗体修飾物は、通常、遺伝子組換えにより製造される。改変抗体としては、キメラ抗体、例えばヒト−マウスキメラ抗体が例示され、ヒト型化抗体としては、例えば後で具体的に説明するバージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、及びｉ−ｂ２が挙げられる。抗体修飾物としては、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）_２，Ｆｖなどの抗体断片、及び抗体の可変領域を連結して１本鎖にしたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖと称する）が挙げられる。
発明の実施の形態
本発明において、血液レオロジーの改善とは、血液の流れを良くすることを意味する。
本発明において使用する抗体としては、血液のレオロジーを改善することができる抗体であればポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。また、モノクローナル抗体に基くキメラ抗体、ヒト型化抗体、シングルチェインＦｖなどを使用することもできる。ヒト型化抗体が特に好ましい。
１．抗ヒトＴＦ抗体
本発明で使用される抗ヒトＴＦ抗体は、血液のレオロジーを改善する効果を有するものであれば、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。
本発明で使用される抗ヒトＴＦ抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ヒトＴＦ抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。この抗体はヒトＴＦと結合することにより、ヒトＴＦが血液凝固亢進の状態を惹起するのを阻害する抗体である。
２．抗体産生ハイブリドーマ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ヒトＴＦ又はその一部分（断片）を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＴＦを、Ｊ．Ｈ．Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５０，ｐ．１２９−１３５（１９８７）に開示されたヒトＴＦ遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、ヒトＴＦをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＴＦタンパク質を公知の方法で精製する。この方法を、本明細書の参考例１に記載する。さらに、抗原として使用するヒトＴＦは参考例２に記載する方法によりヒト胎盤などのＴＦ含有生物材料から抽出、精製して使用することもできる。
次に、この精製ヒトＴＦタンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ヒトＴＦのＣ−末端側の膜貫通領域を除去した可溶性ＴＦを例えば遺伝子組換えにより作製することもでき、これを感作抗原として使用することもできる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０），Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７），ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９），ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５），ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０），Ｆ０（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ａｎｄ Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１），Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，（１９７８）１４８，３１３−３２３），Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＴＦに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞例えばＵ２６６と融合させ、ヒトＴＦへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる。（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てまたは一部のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるヒトＴＦを投与して抗ヒトＴＦ抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からヒトＴＦに対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／２５５８５号公報、ＷＯ ９３／１２２２７号公報、ＷＯ ９２／０３９１８号公報、ＷＯ ９４／０２６０２号公報、ＷＯ９６／３４０９６号公報、ＷＯ９６／３３７３５号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
モノクローナル抗体の製造の例を参考例２に具体的に記載する。この例においては、ＡＴＲ−２，３，４，５，７及び８と称する６種類のモノクローナル抗体を得ており、いずれも本発明において使用することができるが、ＡＴＲ−５が特に好ましい。
３．組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５参照）。
具体的には、抗ヒトＴＦ抗体を産生するハイブリドーマから、抗ヒトＴＦ抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５′−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２，Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする抗ヒトＴＦ抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗ヒトＴＦ抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
組換え抗体の製造方法の一例を参考例３に具体的に記載する。
４．改変抗体
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ １２５０２３号公報、ＷＯ ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ，Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
キメラ抗体の作製方法は参考例４に具体的に記載する。
また、ヒト型化抗体の作製方法を参考例５に具体的に記載する。この参考例においては、ヒト型化重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）として、表１及び表２に示すアミノ酸配列を有するバージョンａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ，ｉ，ｊ，ｂ１，ｄ１，ｂ３及びｄ３を用いた。

また、ヒト型化軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域として、表３に示すアミノ酸配列を有するバージョンａ，ｂ，ｃ，ｂ１及びｂ２を用いた。

そして、上記のＨ鎖Ｖ領域の種々のバージョンと、Ｌ鎖Ｖ領域の種々のバージョンを組合わせて抗原結合能、及びＴＦ中和活性について評価した結果、参考例６及び参考例７に記載する通り、「Ｈ鎖Ｖ領域バージョン」−「Ｌ鎖Ｖ領域バージョン」として表示する場合「ｂ−ｂ」、「ｉ−ｂ」、及び「ｉ−ｂ２」が特に高活性を示した。なお、これらのヒト型化抗体の抗原結合能を図１に示し、ヒトＴＦ中和活性（ＴＦのファクターＸａ産生阻害活性）を図２に示し、ヒトＴＦ中和活性（ファクターＸ結合阻害活性）を図３に示し、そしてヒトＴＦ中和活性（ＴＦの血漿凝固阻害活性）を図４に示す。
５．抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、ヒトＴＦに結合し、ヒトＴＦの活性を阻害するかぎり、抗体の断片又はその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）_２，Ｆｖ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これらの抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６，Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４９７−５１５，Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６５２−６６３，Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６６３−６６９，Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ヒトＴＦ抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
６．組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３′側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８−１１４）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９−４３８３）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの真菌細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ，ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ，Ｖｅｒｏ，ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ，ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
７．抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
８．血液レオロジー改善効果の確認
血液レオロジーは、細胞マイクロレオロジー測定装置などを利用してインピトロで末梢血の血流を測定することにより観察できる。ＬＰＳの処理により血流低下が見られるが、本発明の抗ヒトＴＦ抗体の添加により血流が改善された。従って、本発明の抗ヒトＴＦ抗体は、血液レオロジーの改善に有効であることが確認された。このような改善を必要とする疾患としては、動脈硬化症、肺塞栓症、深部静脈血栓症、慢性動脈閉塞症等があり、それらの疾患に伴って発生する血流低下を本発明の抗ヒトＴＦ抗体は、改善することができる。
この効果を、実施例に具体的に記載する。
９．投与方法および製剤
本発明の治療剤は、血液レオロジーの改善を目的として使用される。
有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗ヒトＴＦ抗体を含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
投与方法は特に限定されないが、静脈注射、点滴静脈注射等が好ましい。
本発明の抗ヒトＴＦ抗体を有効成分として含有する治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗ヒトＴＦ抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
実施例
次に、実施例により本発明をさらに具体的に記載する。
３．５ｍＬの末梢血を３ｍＬのＭｏｎｏ−Ｐｏｌｙ分離溶液に添加し、１，５００ｒｐｍ（×７００Ｇ）にて２０分間遠心した。こうして回収した単核細胞画分を５０ｍＬ ＦＡＬＣＯＮチュウブ中でリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により洗浄し、遠心分離により細胞ペレットを集め、これを、種々の濃度でリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を含有するか又は含有しない、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ‐１６４０培地に分散させた。リポポリサッカライドの濃度は、０μｇ／ｍＬ無添加群（陰性対照）及び４．０μｇ／ｍＬ添加群とした。
こうして調製した細胞懸濁液を、１００ｍｍの培養皿中、ＣＯ_２インキュベーター内で６時間インキュベートした。次に、培養皿に付着した細胞をスクレイパーにより剥離し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に細胞濃度を６×１０^５に調整した後、８００ｒｐｍ（×２００Ｇ）にて１０分間遠心分離して、細胞ペレットを回収し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、遠心分離により細胞ペレットを回収した。
次に、上記のようにしてリポポリサッカライド処理した単核細胞の血液凝固活性を調べるため、６×１０^５個の細胞を１０００μＬの全血に添加し、この混合物を、室温にて１０分間インキュベートした後、５００ｎｇの活性型第７因子（ＦＶＩＩａ）および最終濃度５ｍＭのＣａＣｌ_２を添加し、細胞マイクロレオロジー測定装置（ＭＣＦＡＮ−ＫＨ；日立原町電子工業株式会社）に適用した。この装置は、毛細血管を模倣したものであり、シリコン単結晶基板上に多数の微小Ｖ型溝を形成しその上にガラス基板を圧着して人工毛細管を形成し、ガラス基板を通して血液細胞などの流れを顕微鏡観察できるようにしたものである。結果を、単位時間当たり毛細管を流過した血液の体積（μＬ／ｓｅｃ．）により表したものを図５に示す。この図から、ポリリポサッカライドの量依存的に血液の流動性が低下することが確認された。
そこで、上記リポポリサッカライド処理（４μｇ／ｍＬ）した単核細胞と全血との混合物のインキュベーションの際に、抗‐ヒト組織因子抗体ＡＴＲ−５（参考例２において製造したもの）を、１．２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬ添加、あるいは無添加（陰性対照）とし、インキュベートした。なお、陽性対照として、リポポリサッカライド処理しない単核細胞を全血に加えた試験も行なった。次に、インキュベートした混合物の流動性を、上記のようにして、細胞マイクロレオロジー測定装置により測定した。結果を図６に示す。抗‐ヒト組織因子抗体が血液の流動性を改善することが確認された。
参考例１． 可溶型ヒトＴＦの作製法
可溶型ヒトＴＦ（ｓｈＴＦ）は以下のように作製した。
ヒトＴＦの貫通領域（２２０番目のアミノ酸）以下をＦＬＡＧペプチドＭ２に置換したものをコードする遺伝子を、哺乳動物細胞用の発現ベクター（ネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子を含む）に挿入し、ＣＨＯ細胞に導入した。ヒトＴＦのｃＤＮＡ配列はＪａｍｅｓ Ｈ．Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙらの報告（Ｃｅｌｌ（１９８７）５０，１２９−１３５）を参考にした。この可溶型ヒトＴＦの遺伝子配列とアミノ酸配列を配列番号１０１及び１０２に示した。Ｇ４１８により薬剤セレクションし、発現細胞を選抜し、さらにメトトレキサートで発現増幅をかけ、ｓｈＴＦ発現細胞を樹立した。
この細胞を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（ＧＩＢＣＯ）で培養し、ｓｈＴＦを含む培養上清を得た。同容量の４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で２倍に希釈し、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（１００ｍＬ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添加し、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液で洗浄後、ＮａＣｌの濃度を０．３Ｍとし、ｓｈＴＦをカラムから溶出した。得られたｓｈＴＦ画分に終濃度２．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加え、遠心操作（１０，０００ｒｐｍ、２０分）により夾雑蛋白質を沈殿させた。上清をＢｕｔｙｌ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（３０ｍＬ，ＴＯＳＯＨ）に添加し、２．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄した。
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）中、硫酸アンモニウム濃度を２．５Ｍから０Ｍまで直線的に下げ、ｓｈＴＦを溶出させた。ｓｈＴＦを含むピーク画分をＣｅｎｔｒｉ−Ｐｒｅｐ １０（アミコン）で濃縮した。１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＧカラム（２１．５×６００ｍｍ，ＴＯＳＯＨ）に濃縮液を添加し、ｓｈＴＦのピーク画分を回収した。これを０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌し、可溶型ヒトＴＦ（ｓｈＴＦ）とした。試料の吸光度２８０ｎｍのモル吸光係数をε＝４０，１３０、分子量を４３，２１０として、試料の濃度を算出した。
参考例２． 抗ＴＦモノクローナル抗体の作製
１．ヒトＴＦの精製
ヒト胎盤からのＴＦの精製は、Ｉｔｏらの方法（Ｉｔｏ，Ｔ．らＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４，６９１−６９６，１９９３）に準じて行った。すなわち、ヒト胎盤を１０ｍＭ塩化ベンザミジン、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル、１ｍＭジイソプロピルフルオロフォスフェートおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ，ｐＨ７．５）中でホモジナイズ後、沈殿を冷アセトンで脱脂し、得られた脱脂粉末を２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む上記緩衝液に懸濁してＴＦを可溶化した。
この上清からＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および抗ＴＦ抗体を結合させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、精製ＴＦを得た。これを限外濾過膜（ＰＭ−１０，Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、精製標品として４℃で保存した。
精製標品中のＴＦ含量は、市販の抗ＴＦモノクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）とポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を組合せたＳａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡで、組換え型ＴＦを標準にして定量した。
また精製標品の純度は、４−２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥしたものを銀染色することで確認した。
２．免疫とハイブリドーマの作製
精製ヒトＴＦ（約７０μｇ／ｍｌ）を等容量のＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と混合し、乳化した後、５週齢のＢａｌｂ／ｃ系雄性マウス（日本チャールスリバー）の腹部皮下に、ＴＦとして１０μｇ／マウスとなるように免疫した。初回免疫の１２，１８及び２５日後にはＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバントと混合したＴＦを５μｇ／マウスとなるように皮下に追加免疫し、最終免疫として３２日目にＰＢＳで希釈したＴＦ溶液を５μｇ／マウスで腹腔内投与した。
最終免疫の３日後に４匹のマウスから脾細胞を調製し、細胞数で約１／５のマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１とポリエチレングリコール法を用いて融合させた。融合細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（以下ＲＰＭＩ−培地とする）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｏｒｉｅｎｔａｌ）に懸濁し、９６穴プレートに１匹のマウスにつき４００穴播種した。融合後、１，２，３，５日目に培地の半量をＨＡＴ（大日本製薬）およびｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）を含むＲＰＭＩ−培地（以下ＨＡＴ−培地とする）に交換することで、ハイブリドーマのＨＡＴ選択を行った。
下記のスクリーニング法で選択したハイブリドーマは２回の限界希釈を行うことでクローン化した。
限界希釈は、９６穴プレート２枚に一穴あたり０．８個の細胞を播種した。検鏡により単一コロニーであることが確認できた穴について、下記に示したＴＦ結合活性とＴＦ中和活性の測定を行いクローンを選択した。得られたクローンはＨＡＴ−培地からＲＰＭＩ−培地に馴化し、馴化による抗体産生能の低下が無いことを確認したうえで、再度限界希釈を行い、完全なクローン化を行った。以上の操作により、ＴＦ／ファクターＶＩＩａ複合体とファクターＸとの結合を強く阻害する抗体６種（ＡＴＲ−２，３，４，５，７及び８）を産生するハイブリドーマが樹立できた。
３．腹水の作製および抗体の精製
樹立したハイブリドーマの腹水の作製は常法に従って行った。すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで継代したハイブリドーマ１０^６個を、あらかじめ鉱物油を２回腹腔内に投与しておいたＢａｌｂ／ｃ系雄性マウスの腹腔内に移植した。移植後１〜２週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。
腹水からの抗体の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（日本ガイシ）を装着したＣｏｎＳｅｐＬＣ１００システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて行った。
４．Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ
ＴＦを高発現することで知られているヒト膀胱癌由来細胞株Ｊ８２（Ｆａｉｒ Ｄ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１１６９２−１１６９８，１９８７）をＡＴＣＣより導入し、ＲＰＭＩ−培地中、３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度の条件で継代・維持した。
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ用プレートは、９６穴プレートにＪ８２細胞を１０^５個／穴の濃度で播種し、上記条件で１日培養後、培地を除いてリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液（ＰＦＡ）を加えて氷冷下で１０分静置することで固定化することによって作製した。ＰＦＡを除去し、ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＴｒｉｓ緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液）を加えて、使用時まで４℃で保存した。
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡは以下のように行った。すなわち、上記のように作製したプレートからＢｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液を除去し、抗ＴＦ抗体溶液もしくはハイブリドーマ培養上清を加えて室温で１．５時間反応させた。
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼを結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｚｙｍｅｄ）を１時間反応させ、洗浄後、１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を添加して１時間後に４０５ｎｍにおける吸光度を測定することで、Ｊ８２細胞に結合した抗ＴＦ抗体量を定量した。
５．ファクターＸａ活性を指標としたＴＦ中和活性測定系
５０μｌの５ｍＭＣａＣｌ_２および０．１％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ：ｐＨ７．６）に１０μｌのヒト胎盤由来トロンボプラスチン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ）と１０μｌのファクターＶＩＩａ溶液（８２．５ｎｇ／ｍｌ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を添加し、室温で１時間反応させることでＴＦ／Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ複合体を形成させた後、１０μｌの所定濃度に希釈した抗ＴＦ抗体溶液もしくはハイブリドーマ培養上清および１０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘ溶液（３．２４５μｇ／ｍｌ）（Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓｅ）を添加して４５分間反応させ、０．５Ｍ ＥＤＴＡを１０μｌ添加することで反応を止めた。ここに２ｍＭ Ｓ−２２２２溶液（第一化学薬品）を５０μｌ添加し、３０分間の４０５ｎｍにおける吸光度変化をもってＴＦのＦａｃｔｏｒ Ｘａ産生活性とした。この方法では、ＴＦ／Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ複合体とＦａｃｔｏｒ Ｘとの結合を阻害する抗体の活性は測定できる。
６．血漿凝固阻害活性測定系
市販の正常ヒト血漿（コージンバイオ）を用い、この１００μｌに適当に希釈した抗ＴＦ抗体溶液５０μｌを混和して３７℃で３分間反応させた後、５０μｌのヒト胎盤由来トロンボプラスチン溶液（１．２５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、血漿が凝固するまでの時間を血漿凝固時間測定装置（ＣＲ−Ａ：Ａｍｅｌｕｎｇ）で測定した。
７．抗体のアイソタイプの決定
ハイブリドーマの培養上清もしくは精製抗体について、マウスモノクロナール抗体アイソタイピングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて抗体のアイソタイプを確認し、結果を下に示した。

参考例３． ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング
（１）ｍＲＮＡの調製
参考例２で得たハイブリドーマＡＴＲ−５（ＩｇＧ１κ）からｍＲＮＡをＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて調製した。キット添付の処方に従い、それぞれのハイブリドーマ細胞を抽出緩衝液で完全にホモジナイズし、オリゴ（ｄＴ）−セルローススパンカラムにてｍＲＮＡを精製し、エタノール沈殿を行った。ｍＲＮＡ沈殿物を溶出緩衝液に溶解した。
（２）マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子のｃＤＮＡの作製及び増幅
（ｉ）Ｈ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領城をコードする遺伝子のクローニングは、５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２，１９８８；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）により行った。５′−ＲＡＣＥ法にはＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い、操作はキット添付の処方に従って行った。
前記のようにして調製したｍＲＮＡ約１μｇを鋳型として、キット添付のｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｉｍｅｒを加え、逆転写酵素と４２℃、６０分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。これをＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨで１６℃、１．５時間、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで１６℃、４５分間反応させることにより、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。２本鎖ｃＤＮＡをフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで１６℃で一夜反応することにより、２本鎖ｃＤＮＡの両端にｃＤＮＡ アダプターを連結した。反応混合液は１０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で５０倍に希釈した。これを鋳型としてＰＣＲによりＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を増幅させた。５′−側プライマーにはキット添付のアダプタープライマー１を、３′−側プライマーにはＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番号１）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１）を使用した。
ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖Ｖ領域に対するＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ユニットのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、３０〜５０ｐｍｏｌｅのアダプタープライマー１並びにＭＨＣ−Ｇ１プライマー、及びｃＤＮＡアダプターを連結したｃＤＮＡの反応混合物１〜５μｌを含有する。
ＰＣＲはいずれもＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
（ｉｉ）Ｌ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２，１９８８；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）により行った。５′−ＲＡＣＥ法にはＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い、操作はキット添付の処方に従って行った。前記のようにして調製したｍＲＮＡ約１μｇを鋳型としてｃＤＮＡ合成プライマーを加え、逆転写酵素と４２℃、６０分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。
これをＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨで１６℃、１．５時間、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで１６℃、４５分間反応させることにより、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。２本鎖ｃＤＮＡをフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで１６℃で一夜反応することにより、２本鎖ｃＤＮＡの両端にｃＤＮＡアダプターを連結した。反応混合液は１０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で５０倍に希釈した。これを鋳型としてＰＣＲによりＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を増幅させた。５′−側プライマーにはアダプタープライマー１を、３′−側プライマーにはＭＫＣプライマー（配列番号２）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１）を使用した。
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ユニットのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、３０〜５０ｐｍｏｌｅのアダプタープライマー１並びにＭＫＣプライマー、及びｃＤＮＡ アダプターを連結したｃＤＮＡの反応混合物１μｌを含有する。
ＰＣＲはＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
（３）ＰＣＲ生成物の精製及び断片化
前記のＰＣＲ反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＸｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃で１時間消化した。ＸｍａＩ消化混合物を２％から３％のＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ アガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、Ｈ鎖Ｖ領域として約５００ｂｐ長、Ｌ鎖Ｖ領域として約５００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（以下、ＴＥと称す）１０μｌに溶解した。
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＸｍａＩ消化ＤＮＡ断片と、ＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９プラスミドベクターとをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。
次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）（以下、ＬＢＡ寒天培地と称す）上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体を５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含有するＬＢ培地（以下、ＬＢＡ培地と称す）３ｍｌあるいは４ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列の決定を行った。
（４）マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造）（配列番号３）及びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造）（配列番号４）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
こうして得られたハイブリドーマＡＴＲ−５に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＡＴＲ−５Ｈｖ／ｐＵＣ１９と命名し、そしてＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＡＴＲ−５Ｌｖ／ｐＵＣ１９と命名した。プラスミドＡＴＲ−５Ｈｖ／ｐＵＣ１９に含まれる各マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号５及び９９に、プラスミドＡＴＲ−５Ｌｖ／ｐＵＣ１９に含まれる各マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号６及び１００に示す。
参考例４． キメラ抗体の構築
マウスＡＴＲ−５抗体Ｖ領域をヒト抗体Ｃ領域に連結したキメラＡＴＲ−５抗体を作製した。ＡＴＲ−５抗体Ｖ領域をコードする遺伝子をヒト抗体Ｃ領域をコードする発現ベクターに連結することにより、キメラ抗体発現ベクターを構築した。
（１）キメラ抗体Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域をコードする発現ベクターに連結するために、ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。５′−側プライマーｃｈ５ＨＳ（配列番号７）はＶ領域をコードするＤＮＡの５′−末端にハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７−９５０，１９８７）及び制限酵素ＳａｌＩの認識配列を有するように設計した。３′−側プライマーｃｈ５ＨＡ（配列番号８）はＪ領域をコードするＤＮＡの３′−末端にハイブリダイズし、且つ制限酵素ＮｈｅＩの認識配列を有するように設計した。
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ユニットのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、５０ｐｍｏｌｅのｃｈ５ＨＳプライマー並びにｃｈ５ＨＡプライマー、及び鋳型ＤＮＡとして１μｌのプラスミドＡＴＲ５Ｈｖ／ｐＵＣ１９を含有する。ＰＣＲはＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
ＰＣＲ反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。この消化混合物を３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ２０μｌに溶解した。
クローニングベクターには制限酵素ＮｈｅＩ、ＳａｌＩ及びＳｐｌＩ、ＢｇｌＩＩの認識配列を導入した改変ｐＵＣ１９ベクター（以下、ＣＶＩＤＥＣと称す）を用いた。上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子断片とＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化することにより調製したＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５′−側にＳａｌＩ認識配列及びＫｏｚａｋコンセンサス配列、３′−側にＮｈｅＩ認識配列を持つプラスミドをｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。
（２）キメラ抗体Ｌ鎖Ｖ領域の構築
ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域をコードする発現ベクターに連結するために、ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。５′−側プライマーｃｈ５ＬＳ（配列番号９）はＶ領域をコードするＤＮＡの５′−末端にハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７−９５０，１９８７）及び制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列を有するように設計した。３′−側プライマーｃｈ５ＬＡ（配列番号１０）はＪ領域をコードするＤＮＡの３′−末端にハイブリダイズし、且つ制限酵素ＳｐｌＩの認識配列を有するように設計した。
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ユニットのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、５０ｐｍｏｌｅのｃｈ５ＬＳプライマー並びにｃｈ５ＬＡプライマー、及び鋳型ＤＮＡとして１μｌのプラスミドＡＴＲ５Ｌｖ／ｐＵＣ１９を含有する。ＰＣＲはＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
ＰＣＲ反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。この消化混合物を３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
上記のようにして調製したマウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより調製したＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌ３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５′−側にＢｇｌＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋコンセンサス配列、３′−側にＳｐｌＩ認識配列を持つプラスミドをｃｈＡＴＲ５Ｌｖ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。
（３）キメラ抗体発現ベクターの構築
ＩＤＥＣ社より導入した抗体発現ベクターを用いてキメラ抗体発現ベクターを構築した。ベクターにはＩｇＧ１型抗体発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｖ）及びＩｇＧ４型抗体発現ベクターＮ５ＫＧ４Ｐを用いた。発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはＮ５ＫＧ４Ｐのヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域の直前にあるＳａｌＩ−ＮｈｅＩ部位にＡＴＲ−５のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を、ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域の直前にあるＢｇｌＩＩ−ＳｐｌＩ部位にＡＴＲ−５のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を連結することによって、キメラＡＴＲ−５抗体発現ベクターを作製した。
（ｉ）Ｈ鎖Ｖ領域の導入
プラスミドｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化し、次いで制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化した。この消化混合物を１．５％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ２０μｌに溶解した。
発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｖ）及びＮ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化し、次いで制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化した。この消化混合物を１．５％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約９０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ６０μｌに溶解した。
上記のようにして調製したＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳａｌＩ−ＮｈｅＩ ＤＮＡ断片とＳａｌＩ及びＮｈｅＩで消化したＮ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはＮ５ＫＧ４ＰをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。これらキメラＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）、及びｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
（ｉｉ）Ｌ鎖Ｖ領域の導入
プラスミドｃｈＡＴＲ５Ｌｖ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造）及びＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で１．５時間消化した。この消化混合物を１．５％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
プラスミドｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）及びｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造）及びＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で１．５時間消化した。この消化混合物を１．５％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約９４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ２０μｌに溶解した。
上記のようにして調製したＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳｐｌＩ−ＢｇｌＩＩ ＤＮＡ断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化したｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体を５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１ｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＰｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。これらキメラＡＴＲ−５抗体をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
（４）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
キメラ抗体の抗原結合活性及び中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、キメラ抗体を一過性に発現させた。
プラスミドｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に形質導入した。ダルベッコＰＢＳ（−）（以下、ＰＢＳと称す）中に１ｘ１０^７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．７８ｍｌに、プラスミド５０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を５％のＵｌｔｒａ Ｌｏｗ ＩｇＧウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ_２インキュベーターにて培養した。２４時間の培養の後、培養上清を吸引除去し、新たに無血清培地ＨＢＣＨＯ（アーバインサイエンティフィック）を加えた。さらに７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去した。
（５）抗体の精製
ＣＯＳ−７細胞の培養上清からキメラ抗体を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて以下のように精製した。
１ｍｌのｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗをカラムに充填し、１０倍量のＴＢＳを流すことによってカラムを平衡化した。平衡化したカラムにＣＯＳ−７細胞の培養上清をアプライした後、１０倍量のＴＢＳによってカラムを洗浄した。
次に、１３．５ｍｌの２．５ｍＭ ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を流すことによって吸着した抗体画分をカラムより溶出し、直ちに１．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることによって溶出液を中和した。
精製された抗体画分について、セントリプレップ１００（Ａｍｉｃｏｎ）を用いた限外濾過を２回行うことにより、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（以下、ＴＢＳと称す）に溶媒を置換し、最終的に約１．５ｍｌまで濃縮した。
（６）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ無血清培地（ＧＩＢＣＯ）に馴化したＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）に前記発現プラスミドを導入した。
プラスミドｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＳｓｐＩ（宝酒造）で切断して直鎖状ＤＮＡにし、フェノール及びクロロホルムで抽出の後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。直鎖状にしたプラスミドをＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＤＧ４４細胞に形質導入した。ＰＢＳ中に１ｘ１０^７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＤＧ４４細胞０．７８ｍｌに、プラスミド１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞をヒポキサンチン・チミジン（ＧＩＢＣＯ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、２枚の９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ_２インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、ヒポキサンチン・チミジン（ＧＩＢＣＯ）及び５００μｇ／ｍｌ ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地に交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、後述の抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生量の多い細胞を選別した。
参考例５． ヒト型化抗体の構築
（１）ヒト型化抗体Ｈ鎖の構築
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”の構築
ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体Ｌ３９１３０（ＤＤＢＪ，Ｇａｏ Ｌ．ら、未発表、１９９５）由来のＦＲを有するヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖バージョン“ａ”の作製のために７個のＰＣＲプライマーを使用した。ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ（配列番号１１）、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ（配列番号１２）及びｈＲ５Ｈｖ４Ｓ（配列番号１３）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ３Ａ（配列番号１４）及びｈＲ５Ｈｖ５Ａ（配列番号１５）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１８−３５ｂｐの相補的配列を有する。
ｈＲ５Ｈｖ１ＳはＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）及びＳａｌＩ認識部位を有するように、またｈＲ５Ｈｖ５ＡはＮｈｅＩ認識部位を有するように設計した。また外部プライマーｈＲ５ＨｖＰｒＳ（配列番号１６）はＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓと、ｈＲ５ＨｖＰｒＡ（配列番号１７）はＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ５Ａとホモロジーを有する。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ３Ａ、ｈＲ５Ｈｖ４Ｓ及びｈＲ５Ｈｖ５Ａ、ならびに外部プライマーｈＲ５ＨｖＰｒＳ及びｈＲ５ＨｖＰｒＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。
ＰＣＲは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、９８μｌ中に１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ユニットのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ３Ａ、ｈＲ５Ｈｖ４Ｓ及びｈＲ５Ｈｖ５Ａをそれぞれ５ｐｍｏｌｅを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーｈＲ５ＨｖＰｒＳ及びｈＲ５ＨｖＰｒＡを加え、１００μｌの系で同じ温度サイクルを２５回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
約４３０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１７μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化することにより調製したプラスミドベクターＣＶＩＤＥＣに、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い添付の処方に従って反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
ＥｃｏＴ２２Ｉ認識部位の前もしくは後に変異、欠失が認められたため、それぞれ正しい配列を有する断片を連結して再度ＣＶＩＤＥＣにサブクローニングし、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号１８に示す。また、バージョン“ａ”のアミノ酸配列を配列番号１９に示す。
（ｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”の構築
バージョン“ｂ”及び“ｃ”をＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｂ”ではＦＲ３をヒト抗体Ｚ３４９６３（ＤＤＢＪ、Ｂｏｒｒｅｔｚｅｎ Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，１２９１７−１２９２１，１９９４）由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを４個作製した。ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＲＦＦＳ（配列番号２０）及びＦ３ＲＦＢＳ（配列番号２１）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＲＦＦＡ（配列番号２２）及びＦ３ＲＦＢＡ（配列番号２３）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。
Ｆ３ＲＦＦＳとＦ３ＲＦＦＡは互いに相補的な配列を有し、両端にＢａｌＩ及びＸｈｏＩの認識配列を有する。バージョン”ｃ”ではＦＲ３をヒト抗体Ｐ０１８２５（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、Ｐｏｌｊａｋ ＲＪ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６，３４１２−３４２０，１９７７）由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを４個作製した。ＦＲ−シャッフリングベクターＦ３ＮＭＦＳ（配列番号２４）及びＦ３ＮＭＢＳ（配列番号２５）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＮＭＦＡ（配列番号２６）及びＦ３ＮＭＢＡ（配列番号２７）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。Ｆ３ＲＦＢＳとＦ３ＲＦＢＡは互いに相補的な配列を有し、両端にＸｈｏＩ及びＮｃｏＩの認識配列を有する。
Ｆ３ＲＦＦＳ、Ｆ３ＲＦＢＳ、Ｆ３ＲＦＦＡ、Ｆ３ＲＦＢＡ、Ｆ３ＮＭＦＳ、Ｆ３ＮＭＢＳ、Ｆ３ＮＭＦＡ及びＦ３ＮＭＢＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成された。Ｆ３ＲＦＦＳとＦ３ＲＦＦＡ、Ｆ３ＲＦＢＳとＦ３ＲＦＢＡをアニールさせ、それぞれＢａｌＩ及びＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化した。これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号２８に示す。また、バージョン“ｂ”のアミノ酸配列を配列番号２９に示す。
Ｆ３ＮＭＦＳとＦ３ＮＭＦＡ、Ｆ３ＮＭＢＳとＦ３ＮＭＢＡをアニールさせ、それぞれＢａｌＩ及びＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化した。これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｃ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号３０に示す。また、バージョン“ｃ”のアミノ酸配列を配列番号３１に示す。
（ｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ”及び“ｅ”の構築
バージョン“ｄ”及び“ｅ”をＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン”ｄ”ではＦＲ３をヒト抗体Ｍ６２７２３（ＤＤＢＪ、Ｐａｓｃｕａｌ Ｖ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６，１３２０−１３２８，１９９０）由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを４個作製した。ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＥＰＳ（配列番号３２）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＥＰＡ（配列番号３３）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
また外部プライマーＦ３ＰｒＳ（配列番号３４）及びＦ３ＰｒＡ（配列番号３５）はＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＥＰＳ及びＦ３ＥＰＡとホモロジーを有し、他のＦＲ３のシャッフリングにも用いることができる。バージョン“ｅ”ではＦＲ３をヒト抗体Ｚ８０８４４（ＤＤＢＪ、Ｔｈｏｍｓｅｔｔ ＡＲ．ら，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを２個作製した。ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＶＨＳ（配列番号３６）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＶＨＡ（配列番号３７）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。Ｆ３ＥＰＳ、Ｆ３ＥＰＡ、Ｆ３ＰｒＳ、Ｆ３ＰｒＡ、Ｆ３ＶＨＳ及びＦ３ＶＨＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成された。
ＰＣＲは、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＥＰＳとＦ３ＥＰＡ、又はＦ３ＶＨＳとＦ３ＶＨＡをそれぞれ５μｌ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ＵのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。
正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号３８に、バージョン“ｄ”のアミノ酸配列を配列番号３９に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｅ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号４０に、バージョン“ｅ”のアミノ酸配列を配列番号４１に示す。
（ｉｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”及び“ｇ”の構築
バージョン“ｆ”及び“ｇ”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｆ”はヒト抗体Ｌ０４３４５（ＤＤＢＪ、Ｈｉｌｌｓｏｎ ＪＬ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８，３３１−３３６，１９９３）由来のＦＲ３に、バージョン“ｇ”はＳ７８３２２（ＤＤＢＪ、Ｂｅｊｃｅｋ ＢＥ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５，２３４６−２３５１，１９９５）由来のＦＲ３に置換するためＦＲ３をコードするプライマーを２個ずつ合成した。バージョン“ｆ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＳＳＳ（配列番号４２）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＳＳＡ（配列番号４３）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
バージョン“ｇ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＣＤＳ（配列番号４４）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＣＤＡ（配列番号４５）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。Ｆ３ＳＳＳ、Ｆ３ＳＳＡ、Ｆ３ＣＤＳ及びＦ３ＣＤＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。ＰＣＲは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＳＳＳ及びＦ３ＳＳＡもしくはＦ３ＣＤＳ及びＦ３ＣＤＡをそれぞれ５μｌずつ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ＵのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。
正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｇ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｆ”アミノ酸配列を配列番号４６及び４７に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｇ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｇ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｇ”のアミノ酸配列を配列番号４８及び４９に示す。
（ｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｈ”の構築
バージョン“ｈ”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｈ”はヒト抗体Ｚ２６８２７（ＤＤＢＪ、Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｓｔｏｅｐ ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７，９９−１０７，１９９３）由来のＦＲ３に置換するためＦＲ３をコードするプライマーを２個ずつ合成した。バージョン“ｈ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＡＤＳ（配列番号５０）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＡＤＡ（配列番号５１）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
Ｆ３ＡＤＳ及びＦ３ＡＤＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。ＰＣＲは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＡＤＳ及びＦ３ＡＤＡをそれぞれ５μｌずつ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ＵのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｈ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号５２に示す。また、バージョン“ｈ”のアミノ酸配列を配列番号５３に示す。
（ｖｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”及び“ｊ”の構築
バージョン“ｉ”及び“ｊ”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｉ”はヒト抗体Ｕ９５２３９（ＤＤＢＪ、Ｍａｎｈｅｉｍｅｒ−Ｌｏｒｙ ＡＪ．，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）由来のＦＲ３に、バージョン“ｊ”はＬ０３１４７（ＤＤＢＪ、Ｃｏｌｌｅｔ ＴＡ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，１００２６−１００３０，１９９２）由来のＦＲ３に置換するためＦＲ３をコードするプライマーを２個ずつ合成した。バージョン“ｉ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＭＭＳ（配列番号５４）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＭＭＡ（配列番号５５）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
バージョン“ｊ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＢＭＳ（配列番号５６）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＢＭＡ（配列番号５７）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。Ｆ３ＭＭＳ、Ｆ３ＭＭＡ、Ｆ３ＢＭＳ及びＦ３ＢＭＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。ＰＣＲは、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＭＭＳとＦ３ＭＭＡ、又はＦ３ＢＭＳとＦ３ＢＭＡをそれぞれ５μｌずつ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ＵのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。
正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｉ”アミノ酸配列を配列番号５８及び５９に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｊ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｊ”のアミノ酸配列を配列番号６０及び６１に示す。
（ｖｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”の構築
バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ｂ”及び“ｄ”のＦＲ２を別のヒト抗体由来のＦＲ２に置換し作製した。ヒト抗体Ｐ０１７４２（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＢＡ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３１６１−３１７０，１９７０）由来のものに置換するため、ＦＲ２をコードするＤＮＡプライマーを２個作製した。ＦＲ−シャッフリングベクターＦ２ＭＰＳ（配列番号６２）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ２ＭＰＡ（配列番号６３）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。また、互いに相補的な配列を有し、両端にはＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩの認識配列を有する。
Ｆ２ＭＰＳ、Ｆ２ＭＰＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。Ｆ２ＭＰＳとＦ２ＭＰＡをアニールさせ、ＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化した。これをＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｂ１”アミノ酸配列を配列番号６４及び６５に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ１”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｄ１”のアミノ酸配列を配列番号６６及び６７に示す。
（ｖｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”の構築
バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ｂ”及び“ｄ”のＦＲ２を別のヒト抗体由来のＦＲ２に置換し作製した。ヒト抗体Ｚ８０８４４（ＤＤＢＪ、Ｔｈｏｍｓｅｔｔ ＡＲ．ら，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）由来のＦＲ２に置換するため、ＦＲ２をコードするＤＮＡプライマーを２個作製した。ＦＲ−シャッフリングベクターＦ２ＶＨＳ（配列番号６８）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ２ＶＨＡ（配列番号６９）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。また、互いに相補的な配列を有し、両端にはＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩの認識配列を有する。Ｆ２ＶＨＳ、Ｆ２ＶＨＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈに合成、精製を委託した。
Ｆ２ＶＨＳとＦ２ＶＨＡをアニールさせ、ＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化した。これをＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｂ３／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ３／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ３／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｂ３”アミノ酸配列を配列番号７０及び７１に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｄ３／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ３”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｄ３”のアミノ酸配列を配列番号７２及び７３に示す。
（２）ヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域の構築
（ｉ）バージョン”ａ”
ヒト型化ＡＴＲ５抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体Ｚ３７３３２（ＤＤＢＪ、Ｗｅｌｓｃｈｏｆ Ｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７９，２０３−２１４，１９９５）由来のフレームワーク領域を有するヒト型化抗体Ｌ鎖（バージョン”ａ”）の作製のために７本のＰＣＲプライマーを使用した。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ（配列番号７４）及びｈ５Ｌｖ４Ｓ（配列番号７５）はセンスＤＮＡ配列を、ＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ２Ａ（配列番号７６）、ｈ５Ｌｖ３Ａ（配列番号７７）及びｈ５Ｌｖ５Ａ（配列番号７８）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、各プライマーの両端に２０ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーｈ５ＬｖＳ（配列番号７９）及びｈ５ＬｖＡ（配列番号８０）はＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ及びｈ５Ｌｖ５Ａとホモロジーを有する。ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ、ｈ５Ｌｖ４Ｓ、ｈ５Ｌｖ２Ａ、ｈ５Ｌｖ３Ａ、ｈ５Ｌｖ５Ａ、ｈ５ＬｖＳ及びｈ５ＬｖＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈに合成、精製を委託した。
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ユニットのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、５ｐｍｏｌｅのＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ、ｈ５Ｌｖ２Ａ、ｈ５Ｌｖ３Ａ、ｈ５Ｌｖ４Ｓ、及びｈ５Ｌｖ５Ａを含有する。
ＰＣＲはＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルを５回行うことにより、５本のＣＤＲグラフティングプライマーをアセンブルした。この反応混合液に１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーｈ５ＬｖＳ及びｈ５ＬｖＡを加え、９４℃にて３０秒間、５２℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルを３０回行うことにより、アセンブルしたＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲ反応混合液を３％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造）及びＢｇｌＩＩ（宝酒造）により３７℃で４時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ１０μｌに溶解した。上記のようにして調製したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳｐｌＩ−ＢｇｌＩＩ ＤＮＡ断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより調製したＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５′−側にＢｇｌＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３′−側にＳｐｌＩ認識配列を持つプラスミドをｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。ヒト型化Ｌ鎖バージョン”ａ”の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号８１に示す。また、バージョン“ａ”のアミノ酸配列を配列番号８２に示す。
（ｉｉ）バージョン“ｂ”及び“ｃ”
バージョン“ｂ”及び“ｃ”を、バージョン“ａ”のＦＲ３を置換（ＦＲ−シャッフリング）することにより作製した。バージョン“ｂ”にはヒト抗体Ｓ６８６９９（ＤＤＢＪ、Ｈｏｕｇｓ Ｌ ら，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ｅｔ．，１０，１４１−１５１，１９９３）由来のＦＲ３を、バージョン“ｃ”にはヒト抗体Ｐ０１６０７（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、Ｅｐｐ Ｏ ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４，４９４３−４９５２，１９７５）由来のＦＲ３をそれぞれ使用した。
バージョン“ｂ”のＦＲ３をコードするプライマーＦ３ＳＳ（配列番号８３）とＦ３ＳＡ（配列番号８４）、あるいはバージョン“ｃ”のＦＲ３をコードするプライマーＦ３ＲＳ（配列番号８５）とＦ３ＲＡ（配列番号８６）は互いに相補的な配列を有し、両端に制限酵素ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩの認識配列を有する。Ｆ３ＳＳ、Ｆ３ＳＡ、Ｆ３ＲＳ、Ｆ３ＲＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈに合成、精製を委託した。各１００ｐｍｏｌｅのＦ３ＳＳとＦ３ＳＡ、あるいはＦ３ＲＳとＦ３ＲＡを９６℃にて２分間、５０℃にて２分間処理することによりアニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡ断片を作製した。
これら２本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物を１．５％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約３０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
上記のようにして調製したバージョン“ｂ”あるいは“ｃ”のＦＲ３をコードするＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片とＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで消化することによりＦＲ３を除去したｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
これらヒト型化抗体Ｌ鎖バージョン“ａ”のＦＲ３を置換したバージョン“ｂ”あるいはバージョン“ｃ”をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｃ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｂ”アミノ酸配列を配列番号８７および８８に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｃ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｃ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列およびバージョン“ｃ”のアミノ酸配列を配列番号８９および９０に示す。
（ｉｉｉ）バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”
バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”を、バージョン“ｂ”のＦＲ２を置換することにより作製した。バージョン“ｂ１”にはヒト抗体Ｓ６５９２１（ＤＤＢＪ、Ｔｏｎｇｅ ＤＷら，Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，５６−６２，１９９３）由来のＦＲ２を、バージョン“ｂ２”にはヒト抗体Ｘ９３６２５（ＤＤＢＪ、Ｃｏｘ ＪＰら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４，８２７−８３６，１９９４）由来のＦＲ２をそれぞれ使用した。
バージョン“ｂ１”のＦＲ２をコードするプライマーＦ２ＳＳ（配列番号９１）とＦ２ＳＡ（配列番号９２）、あるいはバージョン“ｂ２”のＦＲ２をコードするプライマーＦ２ＸＳ（配列番号９３）とＦ２ＸＡ（配列番号９４）は互いに相補的な配列を有し、両端に制限酵素ＡｆｌＩＩ及びＳｐｅＩの認識配列を有する。Ｆ２ＳＳ、Ｆ２ＳＡ、Ｆ２ＸＳ及びＦ２ＸＡはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成された。各１００ｐｍｏｌｅのＦ２ＳＳとＦ２ＳＡ、あるいはＦ２ＸＳとＦ２ＸＡを９６℃にて２分間、５０℃にて２分間処理することによりアニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡ断片を作製した。
これら２本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＡｆｌＩＩ（宝酒造）及びＳｐｅＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＡｆｌＩＩ（宝酒造）及びＳｐｅＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物を１．５％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約３０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
上記のようにして調製したバージョン“ｂ１”あるいは“ｂ２”のＦＲ２をコードするＡｆｌＩＩ−ＳｐｅＩ ＤＮＡ断片とＡｆｌＩＩ及びＳｐｅＩで消化することによりＦＲ２を除去したｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地４ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
これらヒト型化抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”のＦＲ２を置換したバージョン“ｂ１”あるいはバージョン“ｂ２”をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｈＡＴＲ５Ｌｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｌｖｂ２／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列及びバージョン“ｂ１”アミノ酸配列を配列番号９５及び９６に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ２／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ２”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列及びバージョン“ｂ２”のアミノ酸配列を配列番号９７及び９８に示す。
（３）ヒト型化抗体の発現ベクターの構築
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖とキメラＬ鎖との組合せ
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖａ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｃ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｄ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｅ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｆ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｈ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｉ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｊ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ１−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｄ１−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
（ｉｉ）ヒト型化Ｌ鎖とキメラＨ鎖との組み合わせ
抗体発現ベクターＮ５ＫＧ４Ｐを用いて、キメラＨ鎖との組み合わせでヒト型化抗体を発現させることにより、ヒト型化Ｌ鎖の評価を行った。
プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｃ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｂ２／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造）及びＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で２〜３時間消化した。消化混合物を１．５％または２％
ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
これら各バージョンのヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳｐｌＩ−ＢｇｌＩＩ ＤＮＡ断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化したｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ Ｂｒｏｔｈ（ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体をＬＢＡ培地２５０ｍｌまたは５００ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＰｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。これらキメラＨ鎖とヒト型化Ｌ鎖をコードする遺伝子を導入したプラスミドをそれぞれｃｈＨｖ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｃｈＨｖ−ｈＬｖｃ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
（ｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖とヒト型化Ｌ鎖の組合せ
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ａ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖａ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ａ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｃ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｄ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｅ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｈｖｇ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｆ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｇ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｈ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｊ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ１−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｄ１−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ３／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ３／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ３−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｄ３−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）及びｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）及びｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
（４）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
ヒト型化抗体の抗原結合活性及び中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。
構築した発現プラスミドベクターをＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に形質導入した。ＰＢＳ中に１×１０^７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．７８ｍｌに、プラスミド５０μｇあるいは２０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を５％のＵｌｔｒａ Ｌｏｗ ＩｇＧウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿あるいは１５ｃｍ培養皿を用いてＣＯ_２インキュベーターにて培養した。２４時間の培養の後、培養上清を吸引除去し、新たに無血清培地ＨＢＣＨＯ（アーバインサイエンティフィック）を加えた。さらに７２時間もしくは９６時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去した。
（５）抗体の精製
ＣＯＳ−７細胞の培養上清からの抗体の精製をＡｆｆｉＧｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳＩＩキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、あるいはｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行った。ＡｆｆｉＧｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳＩＩキットを用いた精製はキット添付の処方に従って行った。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを用いた精製は以下のように行った。
１ｍｌのｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗをカラムに充填し、１０倍量のＴＢＳを流すことによってカラムを平衡化した。平衡化したカラムにＣＯＳ−７細胞の培養上清をアプライした後、１０倍量のＴＢＳによってカラムを洗浄した。次に１３．５ｍｌの２．５ｍＭ ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を流すことによって吸着した抗体画分をカラムより溶出した。１．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることによって溶出液を中和した。
精製された抗体画分について、セントリプレップ３０もしくは１００（ａｍｉｃｏｎ）を用いた限外濾過を２〜３回行うことにより、ＴＢＳに溶媒を置換し、最終的に約１．５ｍｌまで濃縮した。
参考例６． 抗体の定量及び活性評価
（１）ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３、０．０２％ ＮａＮ_３、ｐＨ９．６）（以下、ＣＢと称す）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％ ＮａＮ_３、１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ８．１）（以下ＤＢと称す）でブロッキングの後、抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清あるいは精製抗体をＤＢにて段階希釈して各穴に加えた。
１時間室温にてインキュベートし０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むダルベッコＰＢＳ（以下ＲＢと称す）で洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＲＢで洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌとなるようにＳｉｇｍａ１０４（ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を基質バッファー（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．８）に溶解したもの（以下、基質溶液と称す）を加え、４０５／６５５ｎｍでの吸光度をｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとしてＩｇＧ４κ（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）を用いた。
（２）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレートは、次のようにして調製した。細胞はヒト膀胱癌細胞Ｊ８２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１）を用いた。細胞培養用９６穴プレートの６０穴に１×１０^６個のＪ８２細胞を播き込んだ。これをＣＯ_２インキュベーターで１日培養し（１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）、細胞を接着させた。培養液を捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄した。４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（以下、ＰＦＡ／ＰＢＳと称す）を各穴に１００μｌ加え、氷上で１０分間静置し、細胞を固相化した。
ＰＦＡ／ＰＢＳを捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄後、２５０μｌのＤＢでブロッキングした。培養上清あるいは精製抗体をＤＢにて段階希釈して１００μｌを各穴に加えた。室温にて２時間インキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌを加えた。室温にて１時間インキュベートしＲＢで洗浄ののち、基質溶液を加え、次に４０５／６５５ｎｍでの吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。
（３）中和活性の測定
マウス抗体、キメラ抗体及びヒト型化抗体の中和活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ ＡＧ）によるＦａｃｔｏｒ Ｘａ産生阻害活性を指標に測定した。すなわち、１．２５ｍｇ／ｍｌのＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓ１０μｌと適当な濃度に希釈した抗体１０μｌに緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ）６０μｌを加え、９６穴プレート中で室温で１時間反応させた。これに３．２４５μｇ／ｍｌのヒトファクターＸ（セルサス・ラボラトリーズ）及び８２．５ｎｇ／ｍｌのヒトファクターＶＩＩａ（エンザイム・リサーチ）をそれぞれ１０μｌ加え、さらに室温で１時間反応させた。
０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を５０μｌ加え、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）で４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。室温で１時間反応させ、再度４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。抗体無添加の１時間の吸光度変化を１００％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
発色基質溶液はテストチーム発色基質Ｓ−２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添付文書に従い溶解し、精製水で２倍希釈した後、ポリブレン液（０．６ｍｇ／ｍｌ ヘキサジメチリンブロマイド、ＳＩＧＭＡ）と１：１で混和し調製した。
（４）活性の評価
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とキメラＬ鎖との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体（ａ−ｃｈ）を作製し、ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、高濃度側で抗原に対する結合量が低下していた。ＦＸａ産生阻害による抗原中和能についても陽性対照のキメラ抗体（ｃｈ−ｃｈ）に比べて弱い活性であった。よってヒト型化Ｈ鎖はＦＲ−シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
（ｉｉ）ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”とキメラＨ鎖との組合せ
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”とキメラＨ鎖を組み合わせた抗体（ｃｈ−ａ）を作製し、ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、キメラ抗体と同等以上の抗原結合活性が認められた。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて弱い活性であった。よってヒト型化Ｌ鎖もＦＲ−シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
（ｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”を組み合わせた抗体（ａ−ａ）を作製し、ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、高濃度側で抗原に対する結合量が低下していた。ＦＸａ産生阻害による抗原中和能についても陽性対照のキメラ抗体に比べてかなり弱い活性であった。よってヒト型化Ｈ鎖及びＬ鎖のＦＲ−シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
（ｉｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”、“ｃ”及び“ｄ”とキメラＬ鎖との組合せ
ＦＲ−シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化Ｈ鎖とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体（それぞれ“ｂ−ｃｈ”、“ｃ−ｃｈ”、及び“ｄ−ｃｈ”）を作製し、ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、“ｄ−ｃｈ”はキメラ抗体と同等の抗原結合活性が認められ、“ｂ−ｃｈ”及び“ｃ−ｃｈ”はわずかに劣る抗原結合活性を示した。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、“ｂ−ｃｈ”はほぼ同等、“ｄ−ｃｈ”はわずかに弱い活性であった。またバージョン“ｃ−ｃｈ”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。よってヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”及び“ｄ”がヒト型化Ｈ鎖で高い活性を示すと考えられるバージョンであった。
（ｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”との組合せ
ＦＲ−シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”を組み合わせた抗体（ｂ−ａ）を作製し、ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、高濃度で抗原に対する結合量が低下していた。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、かなり弱い活性であった。よって“ｂ−ａ”が“ａ−ａ”より高い活性を示すバージョンであった。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
（ｖｉ）ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”、“ｃ”とキメラＨ鎖との組合せ
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”をキメラＨ鎖と組み合わせた抗体（それぞれ、“ｃｈ−ｂ”、“ｃｈ−ｃ”）を作製したところ、いずれの抗体も抗原結合能、抗原中和能ともにキメラ抗体と同等の活性を示した。よってバージョン“ｂ”及び“ｃ”をヒト型化抗体Ｌ鎖の候補とした。マウス抗体由来のアミノ酸残基数が１つ少ないバージョン“ｂ”の方がバージョン“ｃ”より抗原性の点で優れていると考えられる。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＨＯ細胞ＤＧ４４で発現させ精製した抗体を用い評価したもので、これ以降の評価でもこの抗体を陽性対照に用いた。
（ｖｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｂ−ｂ”及び“ｂ−ｃ”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。いずれの抗体も抗原結合能、抗原中和能ともにキメラ抗体よりわずかに劣る活性を示した。
（ｖｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”及び“ｄ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ＦＲ−シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化Ｈ鎖とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”を組み合わせた抗体（それぞれ“ｂ−ｂ”及び“ｄ−ｂ”）を作製し、ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、“ｄ−ｂ”はキメラ抗体と同等の抗原結合活性が認められ、“ｂ−ｂ”は高濃度でわずかに劣る抗原結合活性を示した。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、“ｂ−ｂ”はわずかに弱い活性で、“ｄ−ｂ”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。よって“ｂ−ｂ”は抗原活性中和能の高いバージョン、“ｄ−ｂ”は抗原結合能の高いバージョンであることが示された。
（ｉｘ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｅ”とキメラＬ鎖及びヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｅ”をキメラＬ鎖及びヒト型化バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｅ−ｃｈ”及び“ｅ−ｂ″）を作製したところ、“ｅ−ｃｈ”の抗原結合能はキメラ抗体と同等の活性を示したが、“ｅ−ｂ”は抗体の発現量が非常に低く、且つ抗原結合能も殆ど喪失していた。また“ｅ−ｃｈ”の抗原活性中和能はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。よってＨ鎖バージョン“ｅ”はＬ鎖バージョン“ｂ”との組合せが悪いと考えられた。
（ｘ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”、“ｇ”及び“ｈ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”、“ｇ”及び“ｈ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体を（それぞれ“ｆ−ｂ”、“ｇ−ｂ″及び″ｈ−ｂ”）作製したところ、“ｆ−ｂ”及び“ｈ−ｂ”の抗体は抗体の発現量が非常に低くかった。なお、バージョン“ｆ”、“ｈ”についてはキメラＬ鎖と組み合わせた抗体も作製したが、発現されなかった。“ｇ−ｂ”は低い濃度から飽和状態に達し、キメラ抗体より弱い抗原結合能を示した。“ｇ−ｂ”の抗原中和能は、キメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。
（ｘｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体を（それぞれ“ｂ１−ｂ″及び″ｄ１−ｂ”）作製したところ、ともに抗体は殆ど発現されなかった。なお、これらについてはキメラＬ鎖と組み合わせた抗体も作製したが、発現されなかった。
（ｘｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体を（それぞれ“ｂ３−ｂ″及び″ｄ３−ｂ”）作製したところ、“ｄ３−ｂ”の抗原結合能はキメラ抗体よりわずかに劣っており、“ｂ３−ｂ”の抗原結合能はさらに劣っていた。“ｂ３−ｂ″の抗原中和能は″ｂ−ｂ”より上回る活性を示したものの、キメラ抗体の活性には及ばず、“ｄ３−ｂ″は″ｂ−ｂ”と同程度の活性にとどまった。
（ｘｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”及び“ｊ”とキメラＬ鎖及びヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”及び“ｊ”をキメラＬ鎖と組み合わせた抗体（それぞれ“ｉ−ｃｈ″及び″ｊ−ｃｈ”）とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｉ−ｂ″及び″ｊ−ｂ”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。抗原結合能はいずれの抗体もキメラ抗体とほぼ同等の活性を示した。“ｊ−ｃｈ”にはキメラ抗体の活性を上回る抗原中和能が認められ、“ｊ−ｃｈ”の抗原中和能はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。“ｉ−ｂ”はキメラ抗体と同等の活性が認められ、“ｊ−ｂ”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。
（ｘｉｖ）ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１″及び″ｂ２”
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１″及び″ｂ２”をキメラＨ鎖と組み合わせた抗体（それぞれ、“ｃｈ−ｂ１″及び″ｃｈ−ｂ２”）を作製したところ、いずれの抗体もキメラ抗体と同等の抗原結合能を示した。抗原中和能については、“ｃｈ−ｂ１”ではキメラ抗体と同等の活性を示し、“ｃｈ−ｂ２”では高濃度側でキメラ抗体を若干上回る活性が認められた。バージョン“ｂ１″及び″ｂ２”ともにヒト型化抗体Ｌ鎖の候補になり得るが、より強い活性を有するという点でバージョン“ｂ２”の方が優れている。
（ｘｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ２”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ２”と組み合わせた抗体（“ｂ−ｂ２”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。抗原結合能はキメラ抗体よりわずかに劣っていた。抗原中和能は“ｂ−ｂ”の活性を上回ったものの、“ｉ−ｂ”の活性には及ばなかった。
（ｘｖｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”又は“ｂ２”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１″又は″ｂ２”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｉ−ｂ１″及び″ｉ−ｂ２”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。“ｉ−ｂ２”の抗原結合能はキメラ抗体とほぼ同等で、“ｉ−ｂ１”はわずかに劣る程度であった。また、“ｉ−ｂ１″及び″ｉ−ｂ２”の抗原中和能はキメラ抗体や“ｉ−ｂ”を上回る活性を示し、“ｉ−ｂ２”＞“ｉ−ｂ１”の順に強かった。
参考例７． ＣＨＯ細胞産生ヒト型化抗体の作製及び活性評価
（１）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
ヒト型化抗体（ｂ−ｂ、ｉ−ｂ及びｉ−ｂ２）の安定産生細胞株を樹立するため、無血清培地に馴化したＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）に抗体発現遺伝子ベクターを導入した。
プラスミドＤＮＡ、ｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＳｓｐＩ（宝酒造）で切断して直鎖状にし、フェノール及びクロロフォルム抽出した後、エタノール沈殿により精製した。エレクトロポーレーション装置（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ；Ｂｉｏ Ｒａｄ）により、直鎖状にした発現遺伝子ベクターをＤＧ４４細胞に導入した。ＤＧ４４細胞をＰＢＳに１×１０^７／ｍｌの細胞密度で懸濁し、この懸濁液約０．８ｍｌに前記のＤＮＡを１０もしくは５０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、ヒポキサンチン−チミジン（ＧＩＢＣＯ）（以下、ＨＴ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地に処理された細胞を懸濁し、２枚の９６穴平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に１００μｌ／穴となるように播種し、ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。培養開始８〜９時間後にＨＴ及び１ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を１００μｌ／穴加え、５００μｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ選択培地に変換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。３〜４日に一度１／２量の培地を新鮮な培地と交換し、選択培地への変換から約２週間経過した時点で、その４〜５日後に細胞の順調な増殖が観察された穴の培養上清の一部を回収した。この培養上清中に発現された抗体濃度を前述の抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにより測定し、抗体産生量の高い細胞を選出した。
（２）ヒト型化抗体の大量精製
前記のように選出したヒト型化抗体（“ｂ−ｂ”、“ｉ−ｂ″及び″ｉ−ｂ２″）発現ＤＧ４４細胞株を２Ｌローラーボトル（ＣＯＮＩＮＧ）を用い、５００ｍｌ／ボトルのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中で数日培養後、培養液を回収して新鮮なＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を加え、再び培養した。培養液は遠心分離により細胞破片を除去し、０．２２μｍもしくは０．４５μｍのフィルターで濾過した。これを繰り返し、それぞれ全量約２Ｌの培養上清を得た。得られた培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティーカラム（Ｐｏｒｏｓ）を接続したＣｏｎＳｅｐ ＬＣ１００システム（ミリポア）にて抗体を精製した。
（３）ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴をＣＢで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌで固相化し、２００μｌのＤＢでブロッキングの後、抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製抗体をＤＢにて段階希釈して各穴に加えた。
１時間室温にてインキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＲＢで洗浄の後、基質溶液を１００μｌ加え、４０５／６５５ｎｍでの吸光度をｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとしてＩｇＧ４κ（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）を用いた。
（４）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレートでは、次のようにして調製した。細胞はヒト膀胱癌細胞Ｊ８２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１）を用いた。細胞培養用９６穴プレートに１×１０^６個のＪ８２細胞を播き込んだ。これをＣＯ２インキュベーターで１日培養し（１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）、細胞を接着させた。培養液を捨て、ＰＢＳで各穴を２回洗浄した。ＰＦＡ／ＰＢＳを各穴に１００μｌ加え、氷上で１０分間静置し、細胞を固相化した。
ＰＦＡ／ＰＢＳを捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄後、２５０μｌのＤＢでブロッキングした。精製抗体を上測定結果をもとに、ＤＢにて１０μｇ／ｍｌより公比２で段階希釈して１００μｌを各穴に加えた。室温にて２時間インキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌを加えた。室温にて１時間インキュベートしＲＢで洗浄ののち、基質溶液を１００μｌ加え、次に４０５／６５５ｎｍでの吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。
（５）ＴＦ中和活性（ファクターＸａ産生阻害活性）の測定
ヒト型化抗体のファクターＸａ産生阻害活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ ＡＧ）によるＦａｃｔｏｒＸａ産生阻害活性を指標に測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓ １０μｌと抗体１０μｌに緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ）６０μｌを加え、９６穴プレート中で室温で１時間反応させた。抗体は緩衝液で２００μｇ／ｍｌより公比５で段階希釈した。
これに３．２４５μｇ／ｍｌのヒトファクターＸ（セルサス・ラボラトリーズ）及び８２．５ｎｇ／ｍｌのヒトファクターＶＩＩａ（エンザイム・リサーチ）をそれぞれ１０μｌ加え、さらに室温で４５分間反応させた。０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を５０μｌ加え、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）で４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。室温で３０分間反応させ、再度４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。抗体無添加の３０分間の吸光度変化を１００％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
発色基質溶液はテストチーム発色基質Ｓ−２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添付文書に従い溶解し、ポリブレン液（０．６ｍｇ／ｍｌ ヘキサジメチリンブロマイド、ＳＩＧＭＡ）と１：１で混和し調製した。
（６）ＴＦ中和活性（ファクターＸ結合阻害活性）の測定
ヒト型化抗体のファクターＸ結合阻害活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ ＡＧ）を用い、予めＴＦとＦａｃｔｏｒ ＶＩＩａの複合体を形成させ、その複合体のＦａｃｔｏｒ Ｘａ産生阻害活性を指標にファクターＸ結合阻害活性を測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓ １０μｌと８２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＦａｃｔｏｒ ＶＩＩａ（エンザイム・リサーチ）１０μｌに緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ）６０μｌを加え、９６穴プレート中で室温で予め１時間反応させた。
これに抗体溶液を１０μｌ加え、室温で５分間反応させた後、３．２４５μｇ／ｍｌのヒトＦａｃｔｏｒ Ｘ（セルサス・ラボラトリーズ）を１０μｌ加え、さらに室温で４５分間反応させた。なお抗体は緩衝液で２００μｇ／ｍｌより公比２で段階希釈した。０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を５０μｌ加え、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）で４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。室温で３０分間反応させ、再度４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。抗体無添加の３０分間の吸光度変化を１００％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
発色基質溶液はテストチーム発色基質Ｓ−２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添付文書に従い溶解し、ポリブレン液（０．６ｍｇ／ｍｌ ヘキサジメチリンブロマイド、ＳＩＧＭＡ）と１：１で混和し調製した。
（７）ＴＦ中和活性（血漿凝固阻害活性）の測定
ヒト型化抗体のＴＦ中和活性（血漿凝固阻害活性）はヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ ＡＧ）を用いたプロトロンビン時間を指標に測定した。すなわち、サンプルカップにヒト血漿（コスモ・バイオ）１００μｌを入れ、これに様々な濃度に希釈した抗体を５０μｌ加え、３７℃で３分間加温した。予め３７℃に加温しておいた１．２５ｍｇ／ｍｌのＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓを５０μｌ加え、血漿凝固を開始させた。この凝固時間はＡｍｅｌｕｎｇ ＣＲ−Ａを接続したＡｍｅｌｕｎｇ ＫＣ−１０Ａ（ともにエム・シー・メディカル）にて測定した。
抗体は８０μｇ／ｍｌより公比２で０．１％のＢＳＡを含有するＴＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＴＢＳ）にて段階希釈した。測定した抗体無添加の凝固時間を１００％のＴＦ血漿凝固活性とし、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓの濃度と凝固時間をプロットした検量線により抗体を添加した際のそれぞれの凝固時間からＴＦ残存活性を算出した。
検量線は様々なＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓの濃度とその凝固時間を測定することにより作成した。適当に希釈したＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓ、５０μｌに５０μｌのＢＳＡ−ＴＢＳを加え、３７℃で３分間加温し、予め３７℃に加温しておいたヒト血漿を１００μｌ加えて凝固を開始させ凝固時間を測定した。Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓは６．２５ｍｇ／ｍｌより公比２で２５ｍＭのＣａＣｌ２を含むハンクス緩衝液（ＧＩＢＣＯ）にて段階希釈した。横軸にＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ Ｓ濃度、縦軸に凝固時間を両対数グラフにプロットし、これを検量線とした。
（８）活性の評価
“ｂ−ｂ”、“ｉ−ｂ”及び“ｉ−ｂ２”のヒト型化抗体すべてはキメラ抗体と同等以上の活性を有していた（図１）。Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ産生阻害活性、Ｆａｃｔｏｒ Ｘ結合阻害活性及び血漿凝固阻害活性においても、ヒト型化抗体“ｂ−ｂ”、“ｉ−ｂ”及び“ｉ−ｂ２”はキメラ抗体と同等以上の活性を有しており、“ｉ−ｂ２”＞“ｉ−ｂ”＞“ｂ−ｂ”の順に活性が強かった（図２、３及び４）。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
図２は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性（ＴＦのファクターＸａ産生阻害活性）を比較したグラフである。
図３は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性（ファクターＸ結合阻害活性）を比較したグラフである。
図４は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性（ＴＦの血漿凝固阻害活性）を比較したグラフである。
図５は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）処理された単核細胞により血液の流動性が低下する事を示すグラフである。
図６は、リポポリサッカライドにより低下した血液の流動性が、抗‐ヒト組織因子抗体により改善されることを示すグラフである。

Claims (27)

1. ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る血液レオロジー改善剤。
2. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の血液レオロジー改善剤。
3. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の血液レオロジー改善剤。
4. 前記抗体が組換え型抗体である、請求項１又は３に記載の血液レオロジー改善剤。
5. 前記抗体が改変抗体である、請求項１又は４に記載の血液レオロジー改善剤。
6. 前記改変抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、請求項１，４又は５に記載の血液レオロジー改善剤。
7. 前記ヒト型化抗体が、バージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である、請求項６に記載の血液レオロジー改善剤。
8. 前記抗体が抗体修飾物である、請求項１又は４〜７のいずれか１項に記載の血液レオロジー改善剤。
9. 前記抗体修飾物が、抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）_２もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項８に記載の血液レオロジー改善剤。
10. 血液レオロジー改善剤の製造のためのヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体使用。
11. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１０に記載の使用。
12. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の使用。
13. 前記抗体が組換え型抗体である、請求項１０又は１２に記載の使用。
14. 前記抗体が改変抗体である、請求項１０又は１３に記載の使用。
15. 前記改変抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、請求項１０，１３又は１４に記載の使用。
16. 前記ヒト型化抗体が、バージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である、請求項１５に記載の使用。
17. 前記抗体が抗体修飾物である、請求項１０又は１３〜１６のいずれか１項に記載の使用。
18. 前記抗体修飾物が、抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）_２もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１７に記載の使用。
19. ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を投与することを含んで成る血液レオロジー改善方法。
20. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
22. 前記抗体が組換え型抗体である、請求項１９又は２１に記載の方法。
23. 前記抗体が改変抗体である、請求項１９又は２２に記載の方法。
24. 前記改変抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、請求項１９，２２又は２３に記載の方法。
25. 前記ヒト型化抗体が、バージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記抗体が抗体修飾物である、請求項１９又は２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記抗体修飾物が、抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）_２もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項２６に記載の方法。

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